DE19520480C2

DE19520480C2 - Immunochemisches Testmaterial und Enzymimmunoassay zur Diagnostik von Zöliakie und verwandten Eiweißintoleranzen

Info

Publication number: DE19520480C2
Application number: DE1995120480
Authority: DE
Inventors: Thomas Dr Mothes; Awad Dr Osman; Hauke Boerner; Thomas Meergans
Original assignee: Universitaet Leipzig
Current assignee: Universitaet Leipzig
Priority date: 1995-06-03
Filing date: 1995-06-03
Publication date: 1997-04-30
Anticipated expiration: 2015-06-04
Also published as: DE19520480A1

Description

Die Erfindung betrifft ein immunochemisches Testmaterial und einen Enzymimmunoassay zur klinisch-chemischen Diagnostik der Zöliakie und anderer verwandter Eiweißintoleranzen wie der Dermatitis herpetiformis. Weiterhin wird ein Verfahren zur Gewinnung von reaktiven Antigenen, die von Antikörpern im Serum von Zöliakiepatienten spezifisch erkannt werden, und ihren Einsatz im Enzymimmunoassay aufgezeigt.

Nach der Europäischen Gesellschaft für pädiatrische Gastroenterologie und Ernährung (ESPGAN) ist für die Diagnostik der Zöliakie die Untersuchung bioptisch gewonnenen Dünndarmschleimhautmaterials ausschlaggebend (Walker-Smith, J.A., et al., Arch. Dis. Childhood 65 [1990] 909). Dieses Verfahren ist aufwendig und für die Patienten sehr belastend. Neben diesem invasiven Diagnoseverfahren hat in den letzten 10 Jahren die Bestimmung von (Auto)antikörpern im Serum der Patienten Bedeutung gewonnen. Dieses Verfahren kann zur Verlaufskontrolle der Erkrankung (Kontrolle der Einhaltung einer gliadinfreien Diät) und zum Screening in Risikogruppen eingesetzt und unter be stimmten Bedingungen eine zweite bioptische Untersuchung ersetzen. Die Antikörper werden bisher durch Bindung an Retikulinfasern von Gefrierschnitten der Rattenniere (sog. Retikulinantikörper) (Seah, P.P., et al., Lancet I [1971] 834) sowie weiterer Rattenorgane (Leber, Herz, Magen) oder durch ihre Bindung an das Extrazellulär material der Lamina muscularis mucosae von Gefrierschnitten des Affenösophagus (sog. Endomysiumantikörper) (Chorzelski, T.P., et al., Ann New York Acad Sci 420 [1983] 325; Chorzelski T.P., et al., Br. J. Dermatol. 111 [1984] 395) mittels Immun fluoreszenzmikroskopie bestimmt. Verschiedene Arbeitsgruppen berichten von einer sehr hohen Spezifität und Sensitivität dieser Methodik (Mäki, M., et al., J Pediatr. 105 [1984] 901; Beutner, E.H., et al. J. Am. Acad. Dermatol. 15 [1986] 464; Hällström, O., Gut 39 [1989] 1225, Mäki, M., et al Lancet 338 [1991] 1350; Chan, K.N., et al., J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. 18 [1994] 316). Es ist deshalb nicht ausgeschlossen und sogar wahrscheinlich, daß nach Sammlung weiterer Erfahrungen in Zukunft die Auto antikörperdiagnostik die bioptische Beurteilung von Darmschleimhaut weitgehend ab lösen kann. Die Autoantikörperdiagnostik mittels Immunfluoreszenzmikroskopie ist je doch ein subjektives Verfahren (Notwendigkeit der Unterscheidung mehr oder weniger typischer positiver Färbemuster von unspezifischen Anfärbungen), das nur von er fahrenem Personal erfolgreich durchgeführt werden kann. Insbesondere kann es bei Anwesenheit von Antikörpern gegen glatte Muskulatur zu Interferenzen kommen (Beutner, E.H., et al., in Chorzelski, T.P., et al (Eds.), Serological Diagnosis of Celiac Disease. CRC Press, Boca Raton 1990, pp. 165). Der weiter verbreitete Test zur Be stimmung von Endomysiumantikörpern ist außerdem sehr teuer (Einsatz von Dünn schnitten der Speiseröhre aus dem Affen). Wünschenswert wäre deshalb die Kenntnis der mit den Autoantikörpern reagierenden Antigene, ihre Isolierung und ihr Einsatz in einem Enzymimmunoassay.

Untersuchungen zur Isolierung von Bindegewebskomponenten, die spezifisch von den Endomysium- und Retikulinantikörpern erkannt werden, sind bisher rar. Aus Schweine leber und -niere wurde nach Homogenisation und Waschen mit Kochsalzlösungen ein Sediment erhalten, aus dem sich mit Wasser eine Fraktion extrahieren ließ (sog. "nichtkollagene Retikulinkomponenten" (NCRC)) (Pras, M, und Glynn, L.E., Br. J. Exp. Path. 54 [1973] 449). Antikörper, die gegen diese NCRC erzeugt wurden, produzierten in der Immunfluoreszenz ein typisches Färbemuster, das dem durch Retikulinanti körpern erzeugtem Muster ähnlich war. Außerdem absorbierten NCRC aus den Seren von Zöliakiepatienten Retikulinantikörper (Pras, M., et al., Immunology 27 [1974] 469). Dieser Effekt scheint jedoch auf eine unspezifische Reaktion der NCRC mit Immun globulinen zurückzuführen sein, weil der Titer anderer Autoantikörper auch verringert wurde (Unsworth, D.J., et al., Clin. Exp. Immunol. 57 [1984] 609). NCRC aus mensch licher Leber wurden elektrophoretisch aufgetrennt und ihre Reaktivität mit mensch lichen Antiseren getestet. Über eine Reaktion mit definierten Komponenten der NCRC durch Retikulinantikörper-positive Seren wurde jedoch nicht berichtet (Scott, D.L, et al., IRCS Med. Sci. 14 [1986] 254). Weiterführende Untersuchungen über NCRC wurden seitdem nicht veröffentlicht.

Ausgehend von embryonaler humaner Lunge wurde mittels chromatographischer Methoden eine Gruppe von 6 Bindegewebsproteinen isoliert (sog. "coeliac disease autoantigen proteins", (CDAP)), die in der Lage waren, spezifisch mit den aus dem Serum von Zöliakiepatienten gewonnenen Antikörpern der Klasse IgA zu reagieren (Mäki, M., et al., Lancet 338 [1991] 724). Nach Immobilisierung dieser Proteine an einer Affinitätssäule wurden Endomysium- und Retikulinantikörper fast vollständig ab sorbiert, während andere Antikörper, die gegen Gliadin gerichtet waren, nicht ge bunden wurden. Dies weist auf eine Kreuzreaktivität bzw. möglicherweise auf eine Identität der erhaltenen Proteine mit den Antigenen der Endomysium- bzw. Retikulin antikörper hin. Später wurde auch über eine Isolierung von 4 Antigenen aus humanen Fibroblastenkulturen mit ähnlichen Eigenschaften berichtet (Marttinen, A., und Mäki, M., Pediatr. Res. 34 [1993] 420). Deren Erkennbarkeit durch ARA- bzw. EmA-positive Seren wurde mittels Enzymimmunoassay jedoch bisher nur an einer sehr kleinen Zahl von Patienten und Kontrollpersonen getestet (je 10), so daß statistische Aussagen über die Verwendbarkeit im Rahmen der Zöliakiediagnostik nicht möglich sind.

Die Diagnose der Zöliakie ist auch über Methoden zur Bestimmung von Gliadinanti körpern bekannt (Volta, U. et al., Digestion 30 (1984) 4, 263-270). Inzwischen hat sich gezeigt, daß die Gliadinantikörper eine viel geringere Spezifität für die Diagnose der Zöliakie besitzen als die Autoantikörper wie Retikulin- oder Endomysiumantikörpern. Die in der zitierten Arbeit ebenfalls beschriebene Methode zur Bestimmung der Retikulinantikörper ist kein Enzymimmunoassay, sondern ein Immunfluoreszenz verfahren, das die bereits aufgeführten Nachteile aufweist.

Schließlich ist ein Verfahren bekannt, bei dem ein epitheliales Glycoprotein, das aus einem Patienten mit massiver cutaner Hyalinosis ermittelt wurde, als Antigen für einen Enzymimmunoassay eingesetzt wird (Teppo, A. M. und Maury, C. P., J. Immunol. Methods 74 (1984) 2, 327-336). Mit diesem Enzymimmunoassay können ebenfalls Antikörper in den Seren von Patienten bestimmt werden. Die Beziehung der mensch lichen Antikörper, die das beschriebene Antigen erkennen, mit den Retikulinantikörpern und Endomysiumantikörpern ist jedoch nicht bekannt.

Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, ein immunochemisches Testmaterial und einen Enzymimmunoassay aufzubauen, das mit hoher Sicherheit und unter Anwendung bekannter Labortechniken die Diagnostik der Zöliakie und anderer verwandter Eiweißintoleranzen wie der Dermatitis herpetiformis ermöglicht. Weiterhin ist ein Verfahren zur Gewinnung der für das Testmaterial erforderlichen reaktiven Antigene anzugeben, die von Antikörpern im Serum von Zöliakiepatienten spezifisch erkannt werden.

Die Aufgabe wird durch ein immunochemisches Testmaterial nach Anspruch 1, das erfindungsgemäß eine Komponente oder ein Gemisch aus mehreren antigenen Komponenten aus Affendünn darm, Rattenleber und Schafslunge enthält, und durch einen Enzymimmunoassay nach Anspruch 12 gelöst.

In vorteilhafter Weise wird der Affendünndarm von Rhesusaffen oder Orang-Utans ein gesetzt.

Es hat sich als besonders günstig erwiesen, wenn Komponenten mit einem Molekular gewicht von 30 und 32 kDa aus dem Darm des Rhesusaffen, von 35 bis 45 kDa aus dem Darm des Orang-Utans, von 48 kDa aus der Schafslunge und aus der Ratten leber enthalten sind.

Der Aufbau des erfindungsgemäßen Testmaterials und des Enzymimmunoassays geht von den Kenntnissen über die Reaktivität der Endomysium- und Retikulinantikörper aus, daß diese nicht ein einziges Antigen, sondern eine Gruppe unterschiedlicher, möglicherweise ähnlicher Antigene erkennen. Mit einem einzelnen Antigen oder mit Antigenen aus einem Organ einer Tierspezies sind deshalb wahrscheinlich nicht alle Zöliakiepatienten zu erfassen. Im Enzymimmunoassay werden daher antigene Komponenten aus Affendünndarm, Rattenleber und Schafslunge im Gemisch eingesetzt.

Zur Herstellung der Komponenten des Testmaterials wird ein Verfahren vorge schlagen, bei dem erfindungsgemäß gefriergetrocknete Extrakte aus Affendünndarm, Schafslunge und Rattenleber mittels SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese aufgetrennt werden. Die Komponenten mit einem Molekulargewicht von 30 und 32 kDa aus dem Darm des Rhesusaffen, von 35 bis 45 kDa aus dem Darm des Orang-Utans, von 48 kDa aus der Schafslunge und aus der Rattenleber werden mittels Elektroelution aus den Gelen oder mittels präparativer Elektrophorese gewonnen. Diese Komponenten ergeben nach Blotten auf Nitrozellulose und Inkubation mit IgA-Endomysium- bzw. IgA-Retikulinantikörper-positiven Seren (EAS) zu 73% (Rhesusaffe), 82% (Orang-Utan), 61% (Ratte) bzw. 58% (Schaf) eine positive Reaktion mit monoklonalen Antikörpern gegen humanes IgA (Anti-IgA) und nach Inkubation mit IgA-Endomysium- bzw. IgA-Retikulinantikörper-negativen Seren von Kontrollpersonen (KS) zu maximal 4% eine falsch-positive Reaktion mit Anti-IgA. Da die identifizierten Antigene eine überlappende Spezifität besitzen, können nach Beurteilung der Reaktivität der Seren mit allen 4 Antigenen 97% der EAS erkannt werden, und nur 5% der KS liefern eine falsch-positive Reaktion.

Die beschriebenen Komponenten werden mittels Elektroelution oder präparativer Elektrophorese gewonnen, gegen Wasser dialysiert und lyophilisiert. Die lyophilisierten Antigene werden in Garbonatpuffer gelöst, die Lösungen aller 4 Antigene zu gleichen Anteilen gemischt und Aliqoute des Gemischs in die Kavitäten einer Mikrotiterplatte aufgetragen. Die weitere Methodik entspricht den an sich bekannten konventionellen Enzymimmunoassays.

Wenn Affendarm nicht verfügbar ist, kann alternativ anstelle des Gemisches aus Anti genen aus Affen-, Schafs- und Rattenorganen auch ein Gemisch aus den Antigenen der Schafslunge und der Rattenleber eingesetzt werden. Die Sensitivität des Test liegt dann allerdings nur bei bei 87%.

Mit der Anwendung der beschriebenen Antigene ist die Durchführung eines Enzym immunoassays zur Bestimmung von Antikörperspezies in den Seren von Zöliakie patienten möglich, deren Vorkommen mit der Gegenwart von IgA-Endomysium- und lgA-Retikulinantikörpern korreliert. Die Methode des Enzymimmunoassays besitzt dem zufolge eine mit der fluoreszenzmikroskopischen Technik vergleichbare Spezifität und Sensitivität für Zöliakie und Dermatitis herpetiformis, ist aber einfacher durchzuführen und im Gegensatz zur Immunfluoreszenzmikroskopie objektiv und quantitativ auswert bar.

Die Erfindung wird im folgenden in einem Ausführungsbeispiel erläutert.

Das immunochemische Testmaterial besteht aus einem Gemisch mit den Komponenten aus

1. dem Affendünndarm vom Rhesusaffen mit einem Molekulargewicht von 30 und 32 kDa und vom Orang-Utan mit einem Molekulargewicht von 35 bis 45 kDa,
2. der Rattenleber mit einem Molekulargewicht von 48 kDa und
3. der Schafslunge mit einem Molekulargewicht von 48 kDa,

wobei jede Komponente im gleichen Verhältnis im Gemisch enthalten ist.

Die für den Aufbau des Testmaterials erforderlichen Komponenten werden durch die im folgenden beschriebenen Verfahren erhalten.

1. Fraktion aus Affendünndarm

Proximaler Affendünndarm (10 g) wird in 20 ml eiskalter CaCl₂-Lösung (50 mMol/l) homogenisiert und durch Gaze filtriert. Die nach 16stündiger Inkubation bei 4°C im Filtrat gebildeten Fasern werden gewaschen (5 min Rühren in Waschpuffer 1 (25 mmol NaCl/l, 2,5 mmol D,L-Histidin/l; pH 7,8)) und bei 300 × g abzentrifugiert. Der Wasch vorgang wird dreimal wiederholt. Anschließend wird das Sediment im Waschpuffer I 30 min bei 37°C inkubiert und weitere fünfmal gewaschen. Das erhaltene Sediment wird in destilliertem Wasser, das auf pH 7,5 eingestellt wurde, erneut 10 min ge waschen und anschließend bei 300 × g sedimentiert. Das Sediment wird dreimal 30 min bei Raumtemperatur in einer 1%igen SDS-Lösung inkubiert und die nach Zentrifu gation bei 300 × g erhaltenen Überstände vereinigt, gegen Wasser dialysiert und lyo philisiert.

2. Fraktion aus Rattenleber bzw. Schafslunge

Rattenleber bzw. Schafslunge (40 g) werden in 100 ml Waschpuffer II (50 mmol Tris/HCl/l, 150 mmol NaCl/l) homogenisiert und bei 12 000 × g zentrifugiert. Das Sedi ment wird achtmal mit Waschpuffer II gewaschen, zwischen den einzelnen Wasch schritten wird jeweils bei 12 000 × g sedimentiert. Die fünfte bis achte Waschfraktion des Schafslungenextrakts werden gepoolt, dialysiert und gefriergetrocknet. Das nach achtmaligem Waschen erhaltene Sediment aus der Rattenleber wird in destilliertem Wasser homogenisiert und bei 34 000 × g zentrifugiert. Der Überstand wird lyo philisiert.

3.

Mittels präparativer SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese oder SDS-Polyacrylamidgel elektrophorese und nachfolgender Elektroelution werden die von den Antikörpern der Zöliakiepatienten erkannten Antigene aus dem Rhesusaffen (30 und 32 kDa), dem Orang-Utan (35-45 kDa), dem Schaf und der Ratte (je 45 kDa) isoliert, gegen Wasser dialysiert und lyophilisiert.

4.

Die lyophilisierten Antigene werden in Carbonatpuffer (50 mMol/l; pH 9,75) gelöst (100 µg/ml). Die Lösungen aller 4 Antigene werden zu gleichen Anteilen gemischt und pro Kavität einer Mikrotiterplatte ICN, Kat.-Nr. 76-381-04; 96-wells) 50 µl der Antigen lösung aufgetragen. Die Antigenlösung wird über Nacht bei 4°C in den Kavitäten in kubiert und am nächsten Morgen abgeschüttet. Die weitere Methodik entspricht kon ventionellen Enzymimmunoassays: Blockierung, Inkubation mit Patientenseren (1 : 100 verdünnt), Nachweis der Bindung von IgA durch einen monoklonalen Antikörper, der gegen humanes IgA gerichtet und mit alkalischer Phosphatase konjugiert ist. Nach Entwicklung mit einem Farbstoff kann die Reaktion photometrisch ausgewertet werden.

Claims

1. Immunochemisches Testmaterial zur Diagnostik von Zöliakie und verwandten Eiweißintoleranzen, das eine Komponente oder ein Gemisch mehrerer Komponenten

A. aus dem Affendünndarm vom Rhesusaffen,
B. aus dem Affendünndarm vom Orang-Utan,
C. aus der Rattenleber und
D. aus der Schafslunge

enthält.

2. Immunochemisches Testmaterial nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Komponente A aus dem Affendünndarm vom Rhesusaffen ein Molekularge wicht von 30 und 32 kDa besitzt.

3. Immunochemisches Testmaterial nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Komponente B aus dem Affendünndarm vom Orang-Utan ein Molekulargewicht von 35 bis 45 kDa besitzt.

4. Immunochemisches Testmaterial nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Komponente C aus der Rattenleber ein Molekulargewicht von 48 kDa besitzt.

5. Immunochemisches Testmaterial nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Komponente D aus der Schafslunge ein Molekulargewicht von 48 kDa besitzt.

6. Immunochemisches Testmaterial nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß der Enzymimmunoassay die Komponenten C und D enthält.

7. Verfahren zur Herstellung eines immunochemischen Testmaterials nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Komponenten aus Affen dünndarm, Schafslunge und Rattenleber mittels Extraktion, Elektrophorese und Elektroelution oder präparativer Elektrophorese gewonnen, dialysiert, lyophilisiert und anschließend die erhaltenenen lyophilisierten Antigene in Carbonatpuffer gelöst werden.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die gefriergetrockneten Extrakte aus Affendünndarm, Schafslunge und Rattenleber mittels SDS-Polyacryl amidgelelektrophorese aufgetrennt, die Komponenten mit einem Molekulargewicht von 30 und 32 kDa aus dem Darm des Rhesusaffen, von 35 bis 45 kDa aus dem Darm des Orang-Utans, von 48 kDa aus der Schafslunge und aus der Rattenleber mittels Elektroelution aus den Gelen oder mittels präparativer Elektrophorese ge wonnen und anschließend mit IgA-Endomysium bzw. IgA-Retikulinantikörper positiven Seren inkubiert werden.

9. Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß etwa 10 g proxi maler Affendünndarm in 20 ml eiskalter CaCl₂-Lösung (50 mMol/l) homogenisiert und durch Gaze filtriert wird, die nach 16stündiger Inkubation bei 4°C im Filtrat ge bildeten Fasern gewaschen (5 min Rühren in Waschpuffer 1 (25 mmol NaCl/l, 2,5 mmol D,L-Histidin/l; pH 7,8) und bei 300 × g abzentrifugiert werden, wobei der Waschvorgang dreimal wiederholt wird, anschließend das erhaltene Sediment im Waschpuffer I 30 min bei 37°C inkubiert und weitere fünfmal gewaschen wird, schließlich das Sediment in destilliertem Wasser, das auf pH 7,5 eingestellt wurde, erneut 10 min gewaschen und anschließend bei 300 × g sedimentiert wird und an schließend dreimal 30 min bei Raumtemperatur in einer 1%igen SDS-Lösung in kubiert wird und die nach Zentrifugation bei 300 × g erhaltenen Überstände ver einigt, gegen Wasser dialysiert und lyophilisiert werden.

10. Verfähren nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß etwa 40 g Rattenleber bzw. Schafslunge in 100 ml Waschpuffer II (50 mmol Tris/HCl/l, 150 mmol NaCl/l) homogenisiert und bei 12 000 × g zentrifugiert werden, anschließend das erhaltene Sediment achtmal mit Waschpuffer II gewaschen wird, wobei zwischen den einzelnen Waschschritten jeweils bei 12 000 × g sedimentiert wird und

- zur Herstellung des Extraktes aus Rattenleber das nach achtmaligem Waschen erhaltene Sediment aus der Rattenleber in destilliertem Wasser homogenisiert und bei 34 000 × g zentrifugiert wird und der Überstand anschließend lyo philisiert wird;
- zur Herstellung des Extraktes aus Schafslunge die fünfte bis achte Wasch fraktion des Schafslungenextrakts gepoolt, dialysiert und gefriergetrocknet werden.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß die lyophilisierten Antigene in Carbonatpuffer (50 mMol/l; pH 9,75) gelöst werden (100 µg/ml), die Lösungen eines, mehrerer oder aller 4 Antigene zu gleichen Anteilen gemischt und pro Kavität einer Mikrotiterplatte 50 µl der Antigenlösung aufgetra gen werden und nunmehr die Antigenlösung über Nacht bei 4°C in den Kavitäten inkubiert und am nächsten Morgen abgeschüttet und blockiert wird.

12. Enzymimmunoassay zur Diagnostik von Zöliakie und verwandter Eiweiß intoleranzen unter Verwendung eines immunochemischen Testmaterials nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die lyophilisierten Antigene in Carbonatpuffer gelöst, die entstandenen Lösungen der verschiedenen Antigene zu gleichen Teilen gemischt und in die Kavitäten einer Mikrotiterplatte aufgetragen, über Nacht bei 4°C inkubiert und danach abgeschüttet werden und zur Diagnostik von Zöliakie und verwandter Eiweißintoleranzen die so erhaltene Mikrotiterplatte in an sich bekannter Weise entsprechend der Methodik für konventionelle Enzymimmunoassays behandelt und die Reaktion nach Entwicklung mit einem Farbstoff photometrisch ausgewertet wird.