SK284410B6 - Spôsob in vitro diagnostiky a kontroly liečenia sprue alebo celiakie a orálny farmaceutický prostriedok na liečenie týchto chorôb - Google Patents
Spôsob in vitro diagnostiky a kontroly liečenia sprue alebo celiakie a orálny farmaceutický prostriedok na liečenie týchto chorôb Download PDFInfo
- Publication number
- SK284410B6 SK284410B6 SK67-99A SK6799A SK284410B6 SK 284410 B6 SK284410 B6 SK 284410B6 SK 6799 A SK6799 A SK 6799A SK 284410 B6 SK284410 B6 SK 284410B6
- Authority
- SK
- Slovakia
- Prior art keywords
- ttg
- sprue
- antibodies
- treatment
- detection
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
- C12N9/104—Aminoacyltransferases (2.3.2)
- C12N9/1044—Protein-glutamine gamma-glutamyltransferase (2.3.2.13), i.e. transglutaminase or factor XIII
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4713—Autoimmune diseases, e.g. Insulin-dependent diabetes mellitus, multiple sclerosis, rheumathoid arthritis, systemic lupus erythematosus; Autoantigens
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/564—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for pre-existing immune complex or autoimmune disease, i.e. systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, rheumatoid factors or complement components C1-C9
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Rehabilitation Therapy (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Diabetes (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
Abstract
Je opísaný spôsob in vitro diagnostiky a kontroly liečenia sprue alebo celiakie, pri ktorom sa v telesných kvapalinách odobraných z tela detegujú protilátky proti tTG imunoreakciou s tkanivovou transglutaminázou, tTG alebo ich imunoreaktívnymi sekvenciami alebo analógmi. Orálny farmaceutický prostriedok na liečenie sprue alebo celiakie, ktorý obsahuje tTG alebo jej imunoreaktívne sekvencie alebo analógy a prípadne farmaceuticky prijateľné pomocné činidlá.ŕ
Description
Vynález sa týka spôsobu diagnostiky a kontroly liečenia sprue alebo celiakie a orálneho farmaceutického prostriedku na liečenie týchto chorôb. Ďalej sa týka použitia tkanivovej transglutaminázy, tTG alebo ich imunoreaktívnych sekvencii alebo analógov.
Doterajší stav techniky
Celiakia je ochorenie sliznice tenkého čreva, ktorého prvé prejavy sú obyčajne počas neskorého detského a dojčenského veku. Ak sa zodpovedajúci klinický obraz neobjaví pred dospelosťou, tak sa toto ochorenie volá netropická sprue. Preto oba tieto termíny označujú rovnaké ochorenie. Sprue sprevádza zápalové zmeny na sliznici a celkovú malabsorpciu, ktorá vzniká v dôsledku týchto zmien. Vo väčšine prípadov je prítomná morfologická a klinická odpoveď na liečbu bezlepkovou diétou.
Dobre známym patogénnym faktorom sú glutény z pšenice, jačmeňa, raže a v určitom rozsahu aj prosa, pokiaľ glutény z rastlín s nižším stupňom fylogenetickej príbuznosti, ako je kukurica, ryža a sója, sú nepatogénnc. Pri týchto gluténoch je úloha patogénneho činidla pripísaná prolamínom rozpustným v alkoholoch, hlavne a-gliadínu.
Preto sa sprue vyskytuje hlavne v krajinách, v ktorých sa pšenica používa ako hlavný zdroj potravy (Európa, USA, Austrália) a jej incidenciou je napríklad 0,14/1000 novorodených deti v Dánsku, 0,7/1000 v Španielsku, 1/100 v Taliansku, 0,45/1000 v Nemecku a 2,42/1000 vo Švédsku.
Novšie výskumy ukázali, že subklinické príznaky, t. j. morfologické zmeny bez masívnych príznakov sú častejšie ako sa dosiaľ predpokladalo. Tak ukázala štúdia urobená v Taliansku v roku 1994 incidenciu 3,28/1000 medzi deťmi školského veku. Riziko latentnej sprue je u ďalších detí týchto pacientov až 50 %.
Predominantne latentná sprue je často sprevádzaná polymorfnou dermatózou, t. j. dermatisis herpetiformis, pri ktorej sú pozorované charakteristické subepidermálne malé pľuzgieriky s granulámymi depozitami IgA vo vrcholoch dermálnych papíl. Biopsie tenkého čreva ukazujú nepravidelnú, viac alebo menej poškodenú sliznicu.
Iné dobre určené asociácie sú medzi sprue a inzulíndependentným diabetes mellitus, ochoreniami štítnej žľazy a selektívnej IgA deficiencie.
Okrem mnohých ďalších sprievodných klinických príznakov sprue, ako je anémia, ktorá bola okrem iného prisúdená malabsorpcii vitamínu Bi2 a deficiencie vitamínu K, ktorá je dôvodom na vyššiu krvácavosť, má zvláštny význam značne zvýšené riziko na gastrointestinálne malígne nádory. Až u 15 % pacientov so sprue sa obyčajne vo veku nad 50 rokov vyvinie neoplastické ochorenie a približne v 50 % ide o črevné T-bunkové lymfómy a v ďalších 25 % ide o tumory hrtana, orofaryngu a tenkého čreva.
Terapia sprue zahŕňa celoživotné dodržiavanie bezlepkovej diéty, pri ktorej musia byť vylúčené nielen výrobky obsahujúce glutén z pšenice, ale tiež z jačmeňa, žita a prosa. Pre pacientov toto predstavuje ťažké obmedzenie tak diétnych zvykov, ako sociálnych interakcií.
Ak je diagnóza a terapia sprue urobená včas, potom má dobrú prognózu. Na raz vzniknuté komplikácie nie sú často kompletne reverzibilné. Naopak, pri nerozpoznanom a neliečenom ochorení môže dôjsť v dôsledku malabsorpcie k vzniku závažných príznakov. Nakoniec je tu zvýšené riziko vzniku črevných lymfómov a iných malignít gastrointestinálneho traktu.
V súčasnosti predstavuje biopsia tenkého čreva najlepší štandard v diagnostike sprue a pri sledovaní pri bezlepkovej diéte, ale stále dôležitejšími sa stávajú neinvazívne diagnostické metódy založené na imunologických markeroch. Pretože v sére pacientov trpiacich sprue sú prítomné protilátky triedy IgA a IgG, ktoré sú namierené proti gliadínu a proti autoantigénu endomýzia, čo je špecifické spojivové tkanivo, ktoré okrem iného obsahuje kolagény I, III a V, elastické vlákna, nekolagénne proteíny ako je fibronektín a proteoglykány, môže byť sérum testované na IgG a IgA protilátky proti gliadínu pomocou ELISA a na IgG a IgA protilátky proti endomýziu pomocou nepriamej fluorescencie. Pokiaľ protilátky proti gliadímu nie sú dostatočne špecifické pre sprue, vysoká senzivita a špecificita (97- 100 %) je opísaná pre IgA Ab proti endomýziu. No na detekciu pomocou imunofluorescencie sú potrebné vzorky z pažeráka primátov. V súčasnosti sa robia pokusy o detekciu protilátok proti endomýziu z pupočníkového materiálu.
V roku 1984 opísali Maury a Teppo (ancent 1984, 20: 892 - 894) 90 kDa glykoproteín bohatý na mannózu (20 % obsahu cukru) ako zložku normálnej kože a sliznice tenkého čreva. Boli schopní identifikovať cirkulujúce IgG imunikomplexy schopné detegovať uvedený protein u 10 z 20 pacientov s celiakiou a u 7 z 12 pacientov postihnutých herpetiformnou dermatitídou (ochorením, ktoré je považované za epidermálny príznak celiakie). Opísaný kDa glykoproteín je charakterizovaný tým, že má 90 % obsah mannózy, kým tTG je neglykozylovaný aj napriek prítomnosti 6 glykozilačných miest (Ichinose et al., J. Biol. Chem., 1990, 265: 13411 - 13414).
V roku 1986 vyšetrovali Maury et al., (pozri Gut, 1986, 27: 147 - 152) uvedené protilátky ELISA testom so sérom pacientov postihnutých celiakiou a kontrolným sérom. Sérum od pacientov s celiakiou malo signifikantne vyššie hladiny protilátok (p < 0,001) ako kontrolné sérum. Uvedené zvýšené hladiny poklesli na normálne hodnoty po bezlepkovej diéte. Nepreukázala sa žiadna korelácia s antiretikulinovými protilátkami.
Pri včasnej diagnostike a prísnom dodržiavaní bezlepkovej diéty môže byť ochorenie udržiavané v remisii a tak môže byť tiež zvýšené riziko malignít u pacientov udržiavané v normálnych hodnotách. Preto existuje značná potreba vývoja vhodného detekčného testu pre sprue. Pretože skupina jedincov s latentnou sprue tiež patri do skupiny s vysokým rizikom, mali by byť všetci rizikoví jedinci (hlavne vzdialení príbuzní) a nakoniec, všetky školopovinné deti, ako sa teraz uvažuje v Taliansku, vyšetrovaní pomocou senzitívneho, špecifického, ľahko zrealizovateľného a lacného testu.
No doteraz zlyhali skríningové programy v dôsledku nasledujúcich problémov:
- invazívne biopsie z duodena u bezpríznakových osôb sú neprijateľné a nadmerne nákladné,
- ELISA detekcia pomocou protilátok proti gliadínu je sotva použiteľná pre jej nízku špecificitu,
- imunofluorescenčná detekcia protilátok proti endomýziu triedy IgA, ktorá je urobená na pažeráku primátov, je tiež nákladná ako normálna skríningová metóda. Okrem toho, hodnotenie je subjektívne a neumožňuje identifikáciu pacientov so sprue majúcich deficienciu IgA (2 % pacientov).
Preto doteraz neexistuje neinvazívny, špecifický, kvantitatívny, rýchly, ľahký a lacný prijateľný detekčný test pre sprue/celiakiu a na kontrolu liečby týchto ochorení.
Podstata vynálezu
Tento problém je vyriešený v predkladanom vynáleze. Na základe prekvapivého zistenia, že tkanivová transglutamináza (tTG, EC 2.3.2.13) je autoantigénom pri sprue, bola vyvinutá imunologická technika podľa nároku i až 6 na detekciu protilátok proti tTG a zlúčeninám obsahujúcich tTG z telesných kvapalín, hlavne zo séra, kde táto metóda umožňuje nielen diagnostiku sprue alebo celiakie, ale tiež ochorení sprevádzaných imunitnou reakciou proti tTG, zlúčeninám obsahujúcich tTG, jeho antigénne štruktúry, imunoreaktívne sekvencie alebo analógy.
Tkanivová transglutamináza patrí do triedy transglutamináz. TG (EC 2.3.2.13) sú enzýmy, katalyzujúce prenos acylovej skupiny závislý od Ca2+, T-karboxamidových skupín peptidovou väzbou viazaných glutamínových zvyškov, ktoré pôsobia ako donory acylovej skupiny. Primáme proteínové lyzínové zvyšky pôsobia ako akceptory acylovej skupiny, takže prenosom vzniká e-(T-glutamyl) lyzínová väzba. Substrátová špecificita TG s ohľadom na donory acylovej skupiny je veľmi vysoká (v závislosti od aminokyselinovej sekvencie), pokiaľ existuje výnimočne veľké spektrum akceptorov (Folk J. E., Annu. Rev. Biochem., 1980, 49: 517 - 531). Tvorené kovalentné peptidové väzby sú vysoko stabilné a rezistentné na proteázy, čo vedie k zvýšenej rezistencii skrížené viazaných proteínov na chemické, enzymatické alebo fyzikálne vplyvy.
Taktiež rozšírený výskyt rôznych TG v rôznych orgánoch, tkanivách a plazme a intersticiálnej tekutine koreluje s výskytom transglutaminázami modifikovaných proteínov v krvných zrazeninách, bunkových membránach, rohovatejúcej vrstve epidermis, vlasoch, nechtoch a extracelulárnej matrix (Greenberg C. S. et al., FASEB J. 1991, 5: 3071 až 3077).
Opísané transglutaminázy môžu byť rozdelené podľa ich fyzikálnych vlastností, ich lokalizácie v tele a podľa ich primárnej štruktúry.
Tkanivová TG (tTG) je tiež označovaná ako bunková, erytrocytáma, endoteliálna, cytoplazmatická, pečeňová alebo typ II TG, a to je monomér majúci molekulovú hmotnosť 75-85 kDa.
Kompletná aminokyselinová sekvencia obsahujúca 687 zvyškov bola odvodená z cDNA. Na proteínovej úrovni tu existuje 84 % homológie medzi ľudským enzýmom a enzýmom myších makrofágov a 81 % homológie medzi ľudským enzýmom a enzýmom morčiat. Často nemá výmena nukleotidov medzi týmito druhmi žiaden vplyv' na aminokyselinovú sekvenciu. Aktívne centrum jc vysoko konzervované, s vyznačenou homológiou proteínu medzi tromi druhmi (49 z 51 zvyškov je identických) a s vysokým stupňom homológie proteínu (75 %) s a-podjednotkou faktora XIII (pozri Gentile V. et al., J Biol. Chem., 1991, 266: 478 až 483, Greenberg C. S. et. al., FASEB J. 1991, 5: 3071 až 3077).
Tu nie je prítomný ani signálny peptid, ani glykosilácia a aj napriek prítomnosti mnohých cysteínových zvyškov tu nie sú disulfidové mostíky. Pomocou fluorescenčnej hybridizácie bol gén pre ľudskú transglutaminázu lokalizovaný na chromozóm 20ql2 (Gentile, V. et al., Genomics, 1994, 20: 295 - 297). Hoci mechanizmus uvoľňovania enzýmu stále nie je známy, existuje jasný dôkaz, že tTG so svojím intracelulárnym výskytom má významnú funkciu v extracelulámej matrix (EMC). Okrem toho, nie je pravdepodobné, že by intraceluláma koncentrácia Ca2+, potrebná pre aktivitu tTG sa dosiahla za fyziologických podmienok, pokiaľ dostatočne vysoké koncentrácie Ca 2+ sa vyskytujú ex traceluláme (Gentile V. et al., J. Celí. Biol., 1992, 119: 463 až 474).
Niekoľko výskumov určilo asociáciu tTG s fibronektínom-proteínom ECM. Okrem fibronektínu môžu byť molekuly ECM ako je nidogén, N-termálny peptid prokolagénu III, kolagén V a XI, osteonektín, čo je glykoproteín asociovaný s mikrofibrilami, drmatan-sulfátový proteoglykán s vysokou molekulovou hmotnosťou a galectín 3 lektín, identifikované ako špecifické substráty pre tTG.
Dôkazy o významnej úlohe tTG pri hojení rán boli tiež získané z imunofluorescenčných štúdií na kultivovaných WI38 bunkách (pľúcne embryonálne fibroblasty), ktoré nemajú extracelulámu tTG aktivitu za normálnych podmienok, ale existuje pri nich extraceluláma depozícia enzýmu pri artefíciálnej tvorbe rán. Pravdepodobne pasívnym uvoľnením enzýmu z poranených buniek nasleduje nekovalentná väzba na ECM, hlavne na fibronektín a fibriláme kolagény a enzým je aktívny počas niekoľkých hodín (Upchurch, H. F. et al., J Celí Physiol. 1991, 149: 375 až 382). V krysom modeli, tiež po tvorbe poranení bolo detekované 5-denné zvýšenie aktivity tTG (Bowness, J. M. et al., Biochem. Biophys. Acta, 1988, 967: 234 - 240). Tiež pri inkubácii lyzátu ľudských erytrocytov s plazmou môže byť detekovaná silná afinita uvoľnenej tTG k fibronektínu (Loraud, L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1988, 85: 1057 - 1059). Všetky objavy ukazujú, že väzba tTG na ECM má centrálnu úlohu v skorej fáze hojenia rán a hlavne, že spôsobuje stabilizáciu fibrínu spolu s faktorom XIII, čo tvorí ochrannú vrstvu a stabilný adhezívny substrát okolo poškodených buniek prostredníctvom skríženej väzby extracelulámych proteínov. Doteraz nebol pri stavovcoch detekovaný žiaden enzým schopný štiepenia tTG katalyzovaných, enormne stabilných skrížených väzieb.
Na základe zistení, že tTG je autoantigénom pri sprue, je vynález tiež zameraný na použitie tTG, zlúčenín obsahujúcich tTG, jeho antigénne štruktúry, imunologické sekvencie a analógy pri diagnostike a kontrole terapie ochorení, spojených s imunologickou reakciou proti uvedeným zlúčeninám. Konkrétne môžu byť týmto spôsobom diagnostikované akútne zápalové ochorenia ako je pneumónia, glomerulone -fritída, vírusová hepatitída alebo chronické zápalové ochorenia ako je Crohnova choroba, Colitis ulcerosa alebo autoimunitné ochorenia ako je autoimunitná hepatitída, Sjogrenov syndróm, Wegenerova granulomatóza, reumatoidná artritída, idiopatická orgánová fibróza, ako je napríklad pľúcna fibróza. Hlavne je výhodný detekčný test na diagnostiku a kontrolu terapie sprue. Pretože tento test môže byť urobený rýchlo a lacno, umožňuje vyšetrovanie populácie na prítomnosť protilátok proti tTG.
tTG použitý podľa predkladaného vynálezu môže byť zvieracieho, syntetického alebo rekombinantného pôvodu a to isté platí pre zlúčeniny obsahujúce tTG, ktoré môžu byť navyše kombinovaného pôvodu /napríklad zvierací tTG spolu so syntetickým peptidom/. Podľa predkladaného vynálezu sú zlúčeniny obsahujúce tTG chemické zlúčeniny tTG alebo jeho analógov s proteínmi. Podľa predkladaného vynálezu sú tTG analógy alebo analógy týchto zlúčenín obsahujúcich tTG všetky antigénne štruktúry, ktoré reagujú s protilátkami proti tTG alebo zlúčeninám obsahujúcich tTG, napríklad syntetické peptidy. Imunoreaktívne sekvencie sú fragmenty tTG alebo zlúčenín obsahujúcich tTG, ktoré sú vyrobené protcolýzou syntézou alebo genetickým spracovaním, rovnako ako varianty získané výmenou aminokyselín.
Imunologická detekcia podľa predkladaného vynálezu je urobená podľa dobre známych techník. Tak môže byť pre detekciu protilátok u pacienta použitá akákoľvek pria
SK 284410 Β6 ma (napríklad s použitím senzorového čipu) alebo nepriama technika.
Pri priamych technikách je väzba detekovanej protilátky na antigén určená prostredníctvom zmeny fyzikálnych alebo chemických vlastností, takže nie sú potrebné následné kroky detekcie, využívajúce značené väzbové druhy protilátok.
Podľa predkladaného vynálezu je výhodné detegovať protilátky proti tTG pomocou imunotestu, výhodne imunotestu na pevnej fáze s priamym alebo nepriamym naviazaním reakčného činidla na ľahko detegovateľnú označenú substanciu. Výhodnejšie môže byť detekcia urobená s použitím ELISA alebo RIA, alebo imunofluorescenčného testu. Techniky použité pri takýchto metódach detekcie sú odborníkom v odbore dobre známe.
V ELISA je napríklad antigén, v tomto prípade tTG, naviazaný priamo alebo nepriamo na nosič ako je napríklad polystyrén. Po inkubácii s detegovanou protilátkou, napríklad zo séra pacientov, sú protilátky naviazané na antigén detegované priamo alebo nepriamo pomocou substancií s naviazaným enzýmom. Týmito substanciami môžu byť protilátky, fragmenty protilátok alebo vysokoafinitné ligandy, ako je avidín, ktorý sa viaže na biotínovú značku. Ako enzýmy možno použiť napríklad peroxidázu, alkalickú fosfatázu, /?-galaktosidázu, ureázu alebo glukózaoxidázu. Naviazané enzýmy a tak aj naviazané protilátky, môžu byť kvantifikované, napríklad pomocou pridania chromogénneho substrátu.
V RIA je antigén, napríklad tTG, naviazaný podobne priamo alebo nepriamo na nosič, ako je napríklad polystyrén. Po inkubácii s detegovanou protilátkou, napríklad zo séra pacientov, sú protilátky naviazané na antigén, detegované pomocou rádioaktívne označených substancií, napríklad substancií označených I125. Týmito substanciami môžu byť protilátky, fragmenty protilátok alebo vysokoafinitné ligandy, ako je avidín, ktorý sa viaže na biotínovú značku. Naviazaná rádioaktivita môže byť kvantifikovaná pomocou vhodného meracieho pristroja.
V imunofluorescenčnom teste sú protilátky naviazané na antigén detegované podľa rovnakého princípu pomocou fluorescenčného činidla označených substancií, napríklad substancií označených fluoresceín-izotiokyanatánom (FITC). Týmito substanciami môžu byť protilátky, fragmenty protilátok alebo vysokoafinitné ligandy, ako je avidín, ktorý sa viaže na biotínovú značku. Množstvo naviazaného fluorescenčného farbiva je potom kvantifikované pomocou vhodného meracieho prístroja.
Podľa predkladaného vynálezu je tiež možno detegovať protilátky u pacienta v aglutinačnom teste alebo v teste gélovcj difúzie. Tieto detekčné testy sú tiež odborníkom v odbore dobre známe. Tak v teste gélovej difúzie je roztok antigénu alebo protilátok, napríklad umiestnený do tesne susediacich jamôk agaru alebo agarozových platní. V tomto prípade môže byť roztok antigénu napríklad roztok tTG a roztok protilátky môže byť napríklad krvné sérum. Keď substancie difundujú preč zo svojich jamiek, tvoria sa koncentračné gradienty od jamiek. Ak prekrývajúce sa koncentrácie protilátky a antigénu v géli spadajú do špecifických pomerov a roztok protilátky obsahuje protilátku proti antigénu, potom sa v géli tvoria detegovateľné zrazeniny.
V aglutinačnom teste sú častice nesúce antigén (napríklad tTG), vyrobené napríklad z latexu alebo polystyrénu, krížené viazané s protilátkami, napríklad zo séra. Tvorené agregáty môžu byť detegované napríklad pomocou turbidimetrickej analýzy.
Podľa predkladaného vynálezu je hlavne výhodné realizovanie detekcie v sére pacientov so sprue pomocou IgA špecifickej alebo IgG špecifickej ELISA. Bolo zistené, že novo vyvinutá detekcia IgA protilátok v sére pacientov so sprue pomocou ELISA založenej na tTG sa výnimočne dobre hodí na diagnostiku a kontrolu terapie sprue vďaka svojej vysokej senzitivite a špecificite. Táto skutočnosť je tiež jasná pri sledovaní liečených pacientov (pokles titru počas terapie). Porovnávanie dát z ELISA podľa predkladaného vynálezu s imunofluorescenčným hodnotením tretích osôb (detekcia IgA anti-endomýzium) má dobrú konformitu. Nezhody sa vyskytujú hlavne pri nízkom titre protilátok, no sú dôsledkom toho, že nepriama fluorescencia bola dosiaľ považovaná za vrcholný štandard. Okrem iného je toto spôsobené subjektivitou hodnotenia a nešpecifickými súbežnými reakciami, ktoré sa vyskytujú pri tejto skoršej v odbore známej technike.
Zodpovedajúca detekcia založená na protilátkach iných tried, napríklad IgG protilátkach, je vhodná na identifikáciu sprue u pacientov s deficitom IgA a na vyšetrovanie iných ochorení spojených s imunitnou reakciou proti tTG.
Iné vylepšenie tejto detekčnej techniky je dosiahnuté pri použití prečistenej tTG od morčiat, ľudskej tTG, sekvencií alebo analógov získaných proteolýzou alebo genetickým spracovaním, rovnako ako pri použití syntetických imunogénnych tTG peptidov v testovacom systéme. ELISA na diagnostiku a sledovanie iných ochorení spojených s imunitnou reakciou proti tTG bude opísaný v príklade 3.3.
Vynález je tiež zameraný na orálny farmaceutický prostriedok podľa nároku 10 na liečbu ochorení spojených s imunitnou reakciou proti tTG, zlúčeninám obsahujúcim tTG, jeho antigénnym štruktúram, imunoreaktívnym sekvenciám alebo analógom. Výhodne je prostriedok na orálne podanie tableta alebo kapsula, kedy je orálna tolerancia vytvorená podávaním tTG, zlúčenín obsahujúcich tTG alebo jeho antigénnych štruktúr, imunoreaktívnych sekvencií alebo analógov. Na jednej strane je uvedená orálna tolerancia dosiahnutá orálnym podávaním autoantigénu a na druhej strane tu existuje takzvaný príbuzný efekt: ak je autoantigén indukujúci ochorenie neznámy, potom môže byť v niektorých prípadoch v orálnej terapii použitý iný antigén kontaktujúci imunitný systém v cieľovom orgáne. Tento antigén je potom schopný lokálnej stimulácie supresorových T buniek špecifických pre antigén, čo vedie k potlačeniu systémovej imunitnej odpovede. Len vyššie dávky antigénu indukujú anergiu autoreaktívnych T buniek.
Orálna tolerancia je praktický spôsob na liečbu rôznych autoimunitných ochorení.
Farmaceutické činidlo podľa predkladaného vynálezu je výhodne použité pri liečbe sprue, ale môže sa tiež použiť pre iné chronické zápalové črevné ochorenia a autoimunitnú hepatitídu.
Podľa predkladaného vynálezu sú tTG zlúčeniny, obsahujúce tTG, jeho antigénne štruktúry, imunoreaktívne sekvencie alebo analógy v dávke 0,01 - 100 mg/kg telesnej hmotnosti.
Farmaceutické činidlá podľa predkladaného vynálezu môžu prípadne obsahovať farmaceutický prijateľné pomocné činidlá, ako sú plnidlá, klzné činidlá, činidlá podporujúce rozpadavosť, spojivá alebo činidlá upravujúce uvoľňovanie, ako sú bežne používané vo farmácii. Pomer farmaceutických pomocných činidiel môže byť rôzny, podľa vybraného obsahu aktívneho činidla a v každom prípade je od 0,1 % do 20 % hmotnosti.
Konkrétne, výhody dosiahnuté pomocou predkladaného vynálezu je možno pozorovať v detekčnom teste pre sprue a na kontrolu terapie sprue, kde tento test je neinvazívny, vysoko špecifický a je zameraný priamo na činidlo spojené s ochorením. Ďalej je hlavná výhoda tohto vyvinutého testu
SK 284410 Β6 tá, že je rýchly, ľahký a lacný, rovnako ako to, že existuje možnosť štandardizácie medzi rôznymi laboratóriami. Preto test umožňuje účinné vyšetrovanie populácie na prítomnosť protilátok proti tTG.
Také potenciálne kvantitatívne hodnotenie je pre objektivitu dát získaných v teste, lepšie v porovnaní s hodnotením pomocou imunofluorescencie, ktoré obsahuje subjektívnu zložku. Okrem toho, imunofluorescenčné hodnotenie je, hlavne pri nízkych titroch, ovplyvnené nežiaducim spôsobom nešpecifickými súbežnými reakciami. Pri použití špecifického autoantigénu v teste môžu byť v najvyššej možnej miere eliminované nešpecifické reakcie na materiáli, získanom z pažeráka primátov alebo pupočníka.
Pretože test je použiteľný na triedu IgA protilátok, rovnako ako na iné triedy protilátok, sú tiež identifikovaní pacienti s deficitom IgA. Detekcia založená na protilátkach proti tTG je tiež vhodná na identifikáciu, vyšetrovanie a kontrolu terapie iných ochorení spojených s imunitnou reakciou proti tTG.
Tiež je možné - dôsledkom identifikácie tTG ako autoantigénu pri sprue - použiť tento autoantigén alebo jeho imunoreaktívne epitopy (sekvencie, analógy alebo syntetické peptidy produkované proteolýzou alebo genetickým spracovaním) v orálnej terapii sprue a iných ochorení spojených s imunitnou reakciou proti tTG.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Príklad 1
Izolácia a charakterizácia autoantigénu
1.1. Imunofluorescenia, APAAP farbenie
Farbenie bolo robené na rôznych bunkových líniách fixovaných v 100 % metanolu počas 2 minút pri - 20 °C.
Pri imunofluorescentnej detekcii boli prípravky inkubované so sérom od pacientov so sprue a s kontrolným sérom v príslušnom poradí, boli premyté a urobila sa detekcia pomocou TRITC-značenej králičej protilátky proti ľudskému IgA (Schuppan et al., J. Biol. Chem. 1990, 265: 8823 až 32).
Značenie APAAP bolo urobené po inkubácii buniek so sérom od pacientov so sprue, po premytí a následnej detekcii pomocou APAAP komplexu (Cordell, J. L. et. al., J. Histochem. Cytochem. 1984, 32: 219 - 229).
V týchto testoch majú HT1080 (bunky ľudského fíbrosarkomu), WI138 (ľudské pľúcne embryonálne fibroplasty), Hepl a Hep2 (bunky hepatocclulámeho karciómu) rovnaké pozitívne cytoplazmatické signály zo sérami od pacientov, pokiaľ normálne séra alebo séra dopredu ošetrené ľudským IgA nemajú žiadne označenie. Ľudské fíbroplasty predkožky, ľudské radbomyosarkomové bunky (RD) krysie Ito/krysí Morris hepatómovej a psej MDCK bunky mali len veľmi slabé až negatívne reakcie.
1.2. Metabolické značenie buniek a imunoprecipitácia autoantigénu
Charakterizácia a izolácia autoantigénu bola urobená pomocou HT10780 buniek.
Bunky boli kultivované s L-alanyl-L-glutamínom, 10 % fetálnym teľacím sérom (FCS, Gibco), 100 U/ml penicilínu a 100 gg/ml streptomycínu (Seromed) v Dulbecco modifikovanom Eagle médiu (DMEM, Gibco) pri 37 °C a 8 % CO2. Pre metabolické značenie boli bunky prenesené na kultivačné platne s priemerom 5 cm a po dosiahnutí asi 90 % konfluencie boli uchovávané v médiu bez metionínu a FCS a potom bolo médium nahradené 3 ml média bez
FCS, ktoré obsahovalo 35S-metionín (0,2 mCi. Expre35S35S, NEN-Dupont). Po 16-20 hodinách inkubácie bol odstránený supematant. Bunky boli premyté fosfátovým pufrom (PBS, Seromed) a potom boli lyzované v 3 ml lyzačného pufra (50 mM tris-HCl, 150 mM NaCl, 0,5 % Tritón X-100, 0,5 % 1GEPAL CA-630 neionického detergenčného činidla (Sigma), CompleteR inhibítora proteas (Boehringer), pH 7,5). Potom bola urobená imunoprecipitácia pomocou CNBr-aktivovanej Separoza 4B (Pharmacia) tak v médiu, ako v lyzáte buniek.
Aktivácia a väzba na Separózu bola urobená podľa návodu výrobcu. Po napučaní a premytí v 1 mM HC1, pH 2,5 bola Scparóza aktivovaná CNBr inkubovaná s králičou protilátkou proti ľudskému IgA (Dianova, 2,4 mg protilátky na ml Separózy) v 0,1 M NaHCO3 0,5 M NaCl, pH 8,3 pri 4 °C cez noc. Nenaviazané protilátky boli odstránené premytím vo väzobnom pufri a neobsadené väzobné miesta boli nasýtené pridaním 1 M etanolamínu, pH 9,0, pri izbovej teplote, 2 hodiny. Potom bola Separóza premytá 3x striedavo (každý raz lOx objemom) 0,1 M octanom sodným, 0,5 M NaCl, pH 4,0 a 0,1 M Tris-HCl, 0,5 M NaCl, pH 8,0 a potom nasledovala inkubácia Separózy so sérami od pacientov so sprue a od zdravých osôb, vo väzobnom pufri (50 mM Tris- HC1, 150 mM NaCl, 1 mM CaCl2 1 mM MgCl2, pH 8,0) pri teplote 4 °C cez noc. Nadbytok sérových protilátok bol odstránený trojitým premytím väzobným pufrom.
Každý raz bol 1 ml HT1080 média alebo lyzátu buniek (približne 5 x I04 buniek) metabolický značených buniek inkubovaný s 50 /xl C14B Separózy (Pharmacia) počas 30 minút pri izbovej teplote, na odstránenie nešpecifický sa viažucich proteínov. Po centrifugácii (10000 x g, 5 minút, 4 °C) bol každý supematant inkubovaný za trepania pri 4 °C cez noc s 50 μΐ Separózy, na ktorú boli dopredu naviazané IgA od pacientov a kontrolných osôb.
Pelety separózy boli potom premyté každý raz 3 x 1 ml premývacieho pufra (10 mM Tris-HCl, 1 % IGEPAL CA-630 (Sigma), 0,5 % deoxycholátu sodného, 0,1 % laryl síranu sodného. CompleteR (Boehringer) pH 8,0) a potom 1 ml 10 mM Tris-HCl pH 8,0. Potom boli pelety umiestnené do SDS testovacieho pufra, boli inkubované počas 5 minút pri 95 °C za redukčných alebo neredukčných podmienok, bola urobená separácia na 10 - 12,5 % SDS polyakrylamidovom géli (Lammli. U. K., Nqture 1970, 227: 680 až 685) a bola urobená detekcia pomocou autorádiografíe (obr. I).
V ďalšom vyšetrovaní bolo zistené, že proteín s vysokou molekulovou hmotnosťou naviazaný v médiu je fíbronektín, ktorý okrem iného je nešpecifický naviazaný na Separózu.
No s bunkami asociovaný proteín s hmotnosťou 80 kDa môže byť vyzrážaný týmto spôsobom zo všetkých 30 doteraz použitých sér od pacientov so sprue, no nemôže byť vyzrážaný z 15 kontrolných sér, včítane normálnych sér, sér od pacientov s Colitis ulcerosa a Sjorgenovým syndrómom. Z tejto skutočnosti bol vyvodený záver, že tento proteín predstavuje základný autoantigén pri sprue.
Pomocou proteínového farbenia gélov pomocou dusičnanu strieborného (Henkenshoven, J. et al., Electroforesis 1985, 6: 103 - 112), bol tenký proteínový prúžik priradený k autorádiograficky viditeľnému 85 kDa prúžiku.
1.3. Izolácia a prečistenie 85 kDA autoantigénu
Na izoláciu väčšieho množstva autoantigénu bolo kultivované celkom 65 kultivačných platní (každá 175 cm2) s HT1080 bunkami. Krátky čas pred dosiahnutím konfluencie bolo médium nahradené médiom bez FCS a potom na
SK 284410 Β6 sledovala inkubácia počas ďalších 16-20 hodín v CO2 inkubátore. Lýza a imunoprecipitácia, v príslušnom poradí, boli urobené opísanými technikami. Sepharosová peleta bola inkubovaná v celkovo 4,5 ml SDS testovacieho pufra s 2 % DL-ditiotreitolom (Sigma) počas 5 minút pri 95 °C na oddelenie naviazaných proteínov a potom bola vyšetrovaná v analytickom SDS polyakrylamidovom géli.
Na ďalšie prečistenie autoantigénu bola imunozrazenina separovaná pomocou vylučovacej elektroforézy nasledujúcim spôsobom, pri použití Prep Celí (Model 491 BIORAD): 4,5 ml proteínovej zmesi bolo umiestnené na vrchol okrúhleho gélu (vonkajší priemer: 3 cm), ktorý sa skladal z
6.5 cm separačného gélu (8 % polyakrylamid, pH 8,8) a
1.5 cm odberového gélu (4 % polyakrylamid, pH 6,8) a bola urobená separácia pomocou elektroforézy. Jednotlivé proteíny boli odoberané vo vymývacom pufri (25 mM Tris-HC1, 0,1 M glycín, 0,01 % SDS, pH 8,3) ako frakcia po 1,2 ml (0,8 ml/min.). Eluované frakcie boli vyšetrované v SDS-PAGE a frakcie obsahujúce požadovaný proteín boli kombinované a koncentrovali sa na celkový objem približne 1 ml pomocou ultrafiltrácie (Amicon Centriprep-50, pri 1000 x g).
1.4. Trávenie autoantigénu proteázou
Z niekoľkých testovaných proteáz bola určená endoproteináza Asp-N (sekvenčnej čistoty, Boehringer Mannheim) ako vhodná proteáza pre fragmentáciu, pretože umožňuje významným spôsobom reprodukovateľný charakter štiepenia s relatívne dobre separovateľnými fragmentmi. Koncentrácia enzým/substrát bola upravená na 1 : 100 a trávenie bolo urobené počas 30 minút pri 37 °C.
1.5. Prenos na PDVF membránu
Po trávení prečisteného antigénu boli peptidové fragmenty separované na preparatívnom 10 % Tricine géli (Schagger, H. et al., Anál. Biochem. 1987,166: 368 - 379), (obr. 2) a boli prenesené pri 4 °C na PVDF membránu (polyvinylidendifluorid, Iiranobilon™, Millipore) semisuchou fastbolt technikou pri použití elektródových platní obsahujúcich grafit (Fastblot B32/33, Biometra). Na anódovú dosku boli umiestnené nasledujúce vrstvy: 1. filtračný papier namočený v anódovom pufri 1 (300 mM Tris-HCl, 20 % metanol, pH 10,4), 2. filtračný papier namočený v anódovom pufri 2 (30 mM tris-HCI, 20 % metanol, pH 10,4), 3. PVDF membrána aktivovaná v metanole a uvedená do rovnováhy v anódovom pufri 2, 4. Tricine gél, 5. dva filtračné papiere namočené v katódovom pufri (25 mM Tris-HCI, 40 mM kyselina -amino-n-kaprónová, 20 % metanol, pH 9,4), 6. katódová doska. Prenos bol urobený počas 35 minút pri 180 mA.
Potom bola PVDF membrána farbená v 0,1 % Coomassie Blue Serva R-250, 50 % metanolu počas 5 minút, bola odfarbená 50 % metanolom, 10 % kyselinou octovou, bola dôkladne premytá destilovanou vodou a bola sušená vzduchom. Charakteristické prúžiky tráveného autoantigénu o 10 kDa, 16 kDa a 25 kDa boli starostlivo vystrihnuté a bolo urobené prvé sekvencovanie na N konci.
1.6. Edmanova degradácia (Podľa Edman a Henschen: Needleman, S. B., Protein Sequence Determination, Springer Verlag, Berlín, 1975, 232 - 279).
Sekvencovanie s použitím Applied Biosystems 4778 - Sequenator viedlo k zisku troch aminokyselinových sekvencií, ktoré boli porovnávané so Swiss Prot 31 databázou (pomocou PC/GENES, IntelliGenetics). Z tohto porovnávania mohlo byť s minimálnym nesúladom urobené prira denie troch fragmentov k ľudskej tkanivovej transglutamináze (tTG, EC 2.3.2.13, proteín glutamín r-glutamyltransferáza). Dôkazy sú uvedené pomocou ,jednopísmenného kódu“; X znamená neidentifikované:
t- Transglutamináza: 28 - REKLWRRGQPWF kDa fragment: REKLWRRGQPF (S) t-Transglutamináza: 581 - DLYLENPEIKIRILG 14 kDa fragment: DLYLENPEIXIXILG t-Transglutamináza: 438 -DITHTYKYPE 16 kDa fragment: DITLTYQYP (V)
Žiadna nejednoznačná sekvencia nemohla byť priradená k 25 kDa fragmentu, pretože tento fragment bol peptidovou zmesou.
Príklad 2
Potvrdenie tkanivovej transglutaminázy (tTG) ako autoantigénu pri sprue
2.1. Imunoprecipitácia morčacej tTG
Pretože je komerčne dostupná a má homológiu sekvencie (> 80 %) s ľudskou tTG, bola tTG z pečene morčiat (Sigma) najskôr separovaná gélovou elektroforézou, na overenie jej čistoty. Okrem ďalších niekoľko iných proteínov predstavuje tTG, približne s 50 %, jeden z hlavných prúžikov.
Hoci sa ľudská tTG majúca 687 aminokyselín líši od morčacieho proteínu majúceho 690 aminokyselín len mierne, majú tieto dva proteíny značne odlišné migračné charakteristiky v SDS polyakrylamidovom géli. Pokiaľ proteín zvieracieho pôvodu sa objaví v 75 - 80 kDa, ako sa očakáva, ľudský proteín má významne pomalšiu migráciu zodpovedajúcu molekulovej hmotnosti 85 kDa, ako je opísané v literatúre (Gentile, V. et al., J. Biol. Chem. 1991, 266: 487 - 483), aj napriek zjavne chýbajúcej N-glykozylácii.
Reaktivita ľudskej autoproti látky zo séra pacientov so sprue z morčacej tTG bola testovaná v imunoprecipitačnom teste. V tomto teste sa 4, Aig tTG (Sigma) v 500 μΙ lyzačného pufra a 0,5 % hovädzí sérový albumín mixovali pri 4 °C cez noc s IgA od pacientov so sprue naviazaným na 4B Separózu, premyli sa, uviedli sa do varu v SDS testovacom pufri za redukčných podmienok a separovali sa na 10 % polyakrylamidovom géli (cf., 4.1.2.) Tu sa vyskytovalo špecifické vyzrážanie očakávaného prúžíka (m. h. 80 kDa), ale žiadne vyzrážanie kontaminujúcich zložiek.
2.2. Potvrdenie tTG ako autoantigénu vo Wester blot teste
Po separácii 2 ug morčacej tTG na SDS géli a po prenose do nitrocelulózy bola škvrna blokovaná v PVS, 2 % nízkotučnom odstredenom mliečnom prášku, 0,3 % Tween 20, pH 7,3, pri 4 °C cez noc. Potom nasledovala 1 hodinová inkubácia so sérom od pacientov so sprue (1/200) v rovnakom pufri, tri kroky premytia a jednohodinová inkubácia s králičími protilátkami proti ľudskému IgA s naviazanou alkalickou fosfatázou (1/500). Škvrny boli premyté v PBS a vyvíjali sa Nitra Blue Tetrazolium a 5-bróm-4-chlór-3-indolyfosfátu ako substrátu (Blake, M.S- et al., Anál. Biochem. 1984, 136: 175 - 179). 75 - 80 kDa prúžik dával jednoznačne pozitívny signál so sérom od pacientov so sprue, čo je ďalším dôkazom, že sérum pacientov so sprue obsahuje protilátky triedy IgA proti tTG, pokiaľ kontrolné séra nedávali žiaden signál.
2.3. Potvrdenie tTG ako endomyziálneho autoantigénu pomocou nepriamej fluorescencie
Tkanivové rezy z pažeráka od primátov (Euroimmun, Germany) boli použité v nepriamej detekcii IgA protilátok
SK 284410 Β6 proti endomýziu v sére od pacientov so sprue a pri preukázaní ich inhibície tTG. Po pre-inkubácii 10 gl séra od pacientov riedeného 1/320 v PBS s 0,5 alebo 10 gg tTG od morčiat (Sigma) a 10 gg BSA (Sigma) počas 1 hodiny pri teplote miestnosti bola ich inkubácia s uvedenými rezmi hrtana urobená počas 1 hodiny pri teplote miestnosti v zvlhčenej atmosfére. Sérum od pacientov so sprue (1/320) a sérum od zdravých jedincov (1/50) bolo použité ako pozitívna a negatívna kontrola, v príslušnom poradí. Po trojitom premytí rezov v PBS/0,2 % BSA a sušení vzduchom bola urobená detekcia autoantigénu TRITC-označenou králičou protilátkou proti ľudskému IgA (Dianova), ktorá bola riedená 1/50 v PBS, počas 1 hodiny pri teplote miestnosti. Nadbytok protilátky bol odstránený postupným premytím PBS/0,2 % BSA, PBS a destilovanou vodou.
Sérum od pacientov malo jasné farbenie ECM protilátkami triedy IgA, kde toto farbenie bolo inhibované pridaním stúpajúcich koncentrácií tTG, ale nie pre-inkubáciou s BSA. Kontroly využívajúce séra od zdravých jedincov nemali akékoľvek farbenie rezov pažeráka.
Príklad 3
Vývoj ELISA špecifického pre sprue s IgA protilátkami pre diagnostiku a sledovanie sprue gg morčacej transglutaminázy (Sigma T-5398) a 100 gl PBS bolo pipetou vnesené do každej jamky polystyrénových mikroplatní (Greiner Labortechnik, 96 jamiek) a bola urobená inkubácia počas 2 hodín pri 37 °C za mierneho rotačného pohybu. Nenaviazaná tTG bola odstránená premytím v PBS (3 x 200 gl) a voľné väzobné miesta v jamkách boli blokované 1 % hovädzím sérovým albumínom (Sigma) v 250 gl PBS pri 4 °C cez noc. Po premytí PBS (0,1 % Tween 20/3 x 200 gl) boli jamky inkubované s postupnými riedeniami séra v PBS (0,1 % Tween 20/100 gl) počas hodiny pri teplote miestnosti za mierneho rotačného pohybu, boli premyté PBS (0,1 % Tween 20/3 x 200 gl) a potom bola urobená inkubácia králičou protilátkou proti ľudskému IgA konjugovanou s peroxidázou ((Dianova) 1/400 v 100 gl PBS/Tween 20) počas 1 hodiny pri teplote miestnosti. Po premytí PBS (3-krát) bola urobená minútová inkubácia pri teplote miestnosti v tme, pomocou 200 gl 0,1 M citrátového pufra, 17,6 mM H2O2, 5,5 mM ofenyléndiamínhydrochloridu (Sigma), pH 4,2 a následná detekcia vytvoreného zafarbenia v ELISA čitači (MRX, Dynatech, Laboratories) pri 450 nm.
sér od pacientov so sprue bolo testované pred a po liečbe bezlepkovou diétou, t. j. v aktívnej a neaktívnej fáze ochorenia. Bolo zistené, že test je vysoko senzitívny, s dobrou koreláciou s hodnotami aktívnej fázy sprue. Terapeutický úspech ako výsledok dodržiavania diéty sa odrazil v znížení IgA protilátok proti tTG. Vysoká senzitivita bola jasná pri nízkej extincii (základnej hladiny) kontrolných sér od zdravých jedincov, od pacientov s colitis ulccrosa, pečeňovou cirhózou, rôznymi nádormi, Sjorgenovým syndrómom atď. (obr. 3).
3.2. Vývoj ELISA využívajúceho protilátky iných tried na diagnostiku a sledovanie sprue, napríklad protilátkami IgG
Pretože asi 2 % pacientov so sprue má deficit IgA, boli séra testované na senzitivitu a špecificitu IgG protilátok proti tTG. ELISA test bol urobený rovnakým spôsobom ako v 3.1., len protilátka proti ľudskému IgA s naviazanou peroxidázou (Dianova) bola nahradená protilátkou proti ľudskému IgG (Dianova). S prihliadnutím na ich senzitivitu zodpovedali hodnoty od pacientov so sprue pred a po bezlepkovej diéte hodnotám získaným pri použití IgA protilátok.
Niektoré z kontrolných sér mali mierne zvýšené hodnoty, čo zodpovedá zisteniam získaným skôr, že špecificita protilátok proti endomýziu je redukovaná v nepriamej imunofluorescencii triedy IgG (obr. 4).
3.3. Vývoj ELISA testu pre diagnostiku a sledovanie iných ochorení spojených s imunitnou reakciou proti tTG, napríklad protilátkami triedy IgG
ELISA test bol urobený rovnakým spôsobom ako v 3.2.
Séra od pacientov s chronickými zápalovými alebo autoimunitnými ochoreniami (Colitis ulcerosa (C. U.), Crohnova choroba, akútna autoimunitná hepatitída) mali mierne až stredne zvýšené hodnoty.
Tak je pomocou IgG špecifického ELISA testu na autoprotilátky proti tTG možná diagnostika a kontrola terapie u pacientov trpiacich chorobami spojenými s imunitnou reakciou proti tTG.
Príklad 4
Nová funkcia tkanivovej transglutaminázy (tTG) v skríženej väzbe gliadínu
Hoci je pre reakcie katalyzovanej tTG dostupné široké spektrum akceptorov acylovej skupiny, len niekoľko molekúl môže pôsobiť ako donor acylovej skupiny. V in vitro pokuse môže byť stanovená tTG sprostredkovaná inkorporácia rádioaktívne označeného putresceínu do gliadínu a tak funkcia gliadínu ako donorového substrátu tTG. V 160 gl pufri (0,1 M Tris-HCl, 150 mM NaCl, 5mM CaCl2 pH 7,5) boli 1 gg substrátu (gliadínu alebo kontrolných proteínov ako je albumín), 2 gCi (3H)-putresceínu a 1 gg tTG (z morčiat, Sigma) inkubované počas 2 hodín pri 37 °C. Reakcia bola ukončená pridaním 100 gl 50 % kyseliny trichlórovej (TCA) a proteíny boli zrážané pri 4 °C cez noc. Po centrifugácii boli pelety premyté 10 % TCA, boli rozpustené v SDS testovacom pufri a buď boli separované v SDS-PAGE, alebo boli použité pri scintilačnom odčítaní. Pokiaľ žiadna inkorporácia putresceínu nemohla byť určená pri kontrolách, mal gliadín jasnú inkorporáciu (3H)-putresceínu tak pri scintilačnom odčítaní, ako v SDS-PAE, čo je dôkazom, že gliadín je výborným substrátom pre tTG.
Skratky:
Ab: protilátka
APAAP: alkalická fosfatáza anti-alkalická fosfatáza BSA: hovädzí sérový albumín cm: centimeter
DMEM: Dulbeccovo modifikované Eagle médium EC: enzýmovc spracovanie
ELISA: enzýmovo viazaný imunosorbentný test
ECM: extracelulámy matrix
FCS: fetálne teľacie sérum h: hodina
H2O2: peroxid vodíka
HLA: ľudské lymfocytáme antigény
IEL: intraepitelové lymfocyty
Ig: imunoglobulín kDa: kilodalton
M: mol mA: miliampér
MHC: hlavný histokompatibilný komplex min: minúta mM: milimól
Mr: relatívna molekulová hmotnosť gg: mikrogram gl: mikroliter
PAGE: polyakrylamidová gélová elektrofosforéza
PBS: | fosfátový pufer |
PLA2: | fosfolipáza A2 |
PVDF: | polyvinylidendifluorid |
SDS: | dodecyl síran sodný |
TCA: | kyselina trichlóroctová |
TGF: Tris: | transformujúci rastový faktor Tris(hydroxymetyl)aminometán |
tTG: | tkanivová transglutamináza |
PATENTOVÉ NÁROKY
Claims (9)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Spôsob in vitro diagnostiky a kontroly liečenia sprue alebo celiakie, vyznačujúci sa tým, že sa v telesných kvapalinách odobratých z tela detekujú protilátky proti tTG imunoreakciou s tkanivovou transglutaminázou, tTG alebo ich imunoreaktívnymi sekvenciami alebo analógmi.
- 2. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že sa detekujú ľudské iGA a/alebo IgG protilátky.
- 3. Spôsob podľa nároku 1 alebo 2, vyznačujúci sa tým, že tTG je ľudského, zvieracieho, syntetického alebo rekombinantného pôvodu.
- 4. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 3, vyznačujúci sa tým, že sa detekcia uskutočňuje pomocou známeho imunotestu, výhodne s priamym alebo nepriamym naviazaním jedného reaktantu na dobre detekovateľnú značiacu substanciu.
- 5. Spôsob podľa nároku 4, vyznačujúci sa tým, že sa detekcia uskutočňuje na pevnej fáze.
- 6. Spôsob podľa nároku 4, vyznačujúci sa tým, že sa detekcia uskutočňuje pomocou ELISA, RIA alebo imunofluorescenčného testu.
- 7. Použitie tTG alebo ich imunoreaktívnych sekvencií alebo analógov pri in vitro diagnostike a kontrole liečenia sprue alebo celiakie.
- 8. Orálny farmaceutický prostriedok na použitie na liečenie sprue alebo celiakie, vyznačujúci sa tým, že obsahuje tTG alebo jej imunoreaktívne sekvencie alebo analógy a prípadne farmaceutický prijateľné pomocné činidlá.
- 9. Použitie tTG alebo ich imunoreaktívnych sekvencií alebo analógov na výrobu orálneho farmaceutického prostriedku na liečenie sprue alebo celiakie.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE19630557A DE19630557C2 (de) | 1996-07-18 | 1996-07-18 | Verfahren zum Nachweis von Antikörpern aus Körperflüssigkeiten durch eine Immunreaktion mit Gewebe-Transglutaminase (tTG) sowie die Verwendung von tTG in Diagnose und Therapie |
PCT/EP1997/003740 WO1998003872A2 (de) | 1996-07-18 | 1997-07-14 | IMMUNOLOGISCHES NACHWEISVERFAHREN VON ANTIKÖRPERN, DIE GEGEN GEWEBE-TRANSGLUTAMINASE (tTG) GERICHTET SIND, VERWENDUNG VON tTG ZUR DIAGNOSE UND THERAPIEKONTROLLE SOWIE ORALES PHARMAZEUTISCHES MITTEL ENTHALTEND tTG |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
SK6799A3 SK6799A3 (en) | 2000-05-16 |
SK284410B6 true SK284410B6 (sk) | 2005-03-04 |
Family
ID=7801172
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
SK67-99A SK284410B6 (sk) | 1996-07-18 | 1997-07-14 | Spôsob in vitro diagnostiky a kontroly liečenia sprue alebo celiakie a orálny farmaceutický prostriedok na liečenie týchto chorôb |
Country Status (22)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US6319726B1 (sk) |
EP (1) | EP0912898B1 (sk) |
CN (1) | CN1138146C (sk) |
AT (1) | ATE210296T1 (sk) |
AU (1) | AU718797B2 (sk) |
BR (1) | BR9710500B1 (sk) |
CA (1) | CA2260769C (sk) |
CZ (1) | CZ291662B6 (sk) |
DE (2) | DE19630557C2 (sk) |
DK (1) | DK0912898T3 (sk) |
ES (1) | ES2131038T3 (sk) |
GR (1) | GR990300020T1 (sk) |
HK (1) | HK1021025A1 (sk) |
HU (1) | HU228479B1 (sk) |
IL (1) | IL128042A (sk) |
NO (1) | NO321466B1 (sk) |
NZ (1) | NZ333744A (sk) |
PL (1) | PL189091B1 (sk) |
PT (1) | PT912898E (sk) |
SI (1) | SI9720044B (sk) |
SK (1) | SK284410B6 (sk) |
WO (1) | WO1998003872A2 (sk) |
Families Citing this family (38)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AU3596199A (en) * | 1998-05-06 | 1999-11-23 | Kobenhavns Universitet | Treatment of celiac disease |
DE60011622T2 (de) * | 1999-06-28 | 2005-09-08 | Immundiagnostik Ag | Diagnose der glutensensibilitätsenteropathie und anderer autoimmunerkrangungen |
US6703208B1 (en) | 1999-10-20 | 2004-03-09 | Immco Diagnostics | Immunological assay for detection of antibodies in celiac disease |
AU1966201A (en) * | 1999-10-20 | 2001-04-30 | Immco Diagnostics | Immunological assay for detection of antibodies in celiac disease |
CU22968A1 (es) * | 2000-06-07 | 2004-07-14 | Ct Ingenieria Genetica Biotech | Procedimiento para la detección de anticuerpos anti transglutaminasa con utilidad en el diagnóstico de la enfermedad celíaca |
GB0103024D0 (en) * | 2001-02-07 | 2001-03-21 | Rsr Ltd | Assay for Autoantibodies to tissue transglutaminase |
FI20010868A0 (fi) * | 2001-04-25 | 2001-04-25 | Markku Maeki | Menetelmä ja välineet gluteenin indusoimien tautien havaitsemiseksi |
KR100488131B1 (ko) * | 2001-07-07 | 2005-05-06 | (주)푸드바이오테크 | 알레르기 진단용 단백질 칩과 알레르기 유발원의 검출방법 및 알레르기 유발 항체의 검출 방법 |
GB0117870D0 (en) * | 2001-07-21 | 2001-09-12 | Univ Nottingham Trent | Method of diagnosis and kit of parts therefor |
DK1572127T4 (da) | 2002-02-14 | 2014-11-24 | Univ Leland Stanford Junior | Enzymbehandling af fødevarer til cøliaki |
US8143210B2 (en) * | 2002-02-14 | 2012-03-27 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Enzyme treatment of foodstuffs for celiac sprue |
US7320788B2 (en) * | 2002-02-14 | 2008-01-22 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Enzyme treatment of foodstuffs for Celiac Sprue |
US7202216B2 (en) * | 2002-05-14 | 2007-04-10 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Drug therapy for celiac sprue |
US7265093B2 (en) * | 2002-05-14 | 2007-09-04 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Drug therapy for Celiac Sprue |
EP1507549A4 (en) * | 2002-05-14 | 2009-07-01 | Univ Leland Stanford Junior | MEDICAMENT THERAPY AGAINST CELIAC SPRUE |
US7462688B2 (en) * | 2002-05-14 | 2008-12-09 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Peptides for diagnostic and therapeutic methods for celiac sprue |
CA2502700C (en) * | 2002-11-20 | 2017-01-17 | Chaitan Khosla | Diagnostic method for celiac sprue |
US7579313B2 (en) * | 2003-11-18 | 2009-08-25 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Transglutaminase inhibitors and methods of use thereof |
US7534426B2 (en) * | 2004-04-26 | 2009-05-19 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Glutenase enzyme assays |
US7563864B2 (en) * | 2004-04-26 | 2009-07-21 | Celiac Sprue Research Foundation | Prolyl endopeptidase mediated destruction of T cell epitopes in whole gluten |
US7628985B2 (en) * | 2004-04-26 | 2009-12-08 | The Board Of Regents Of The Leland Stanford Junior University | Therapeutic enzyme formulations and uses thereof in celiac sprue and/or dermatitis herpetoformis |
US20080038760A1 (en) * | 2004-06-08 | 2008-02-14 | Method For Decting Anti-Transglutaminase Antibodies | Method for Detecting Anti-Transglutaminase Antibodies |
US20090305303A1 (en) * | 2006-07-25 | 2009-12-10 | Cecile Besson Duvanel | immunochromatography device for the diagnosis of diseases in a sample |
US8058019B2 (en) * | 2007-01-26 | 2011-11-15 | Ga Generic Assays Gmbh | Method for assaying antibodies in body fluids by immune reaction with glycoprotein 2 (GP2) from zymogenic granules of the pancreas for the differential diagnosis of inflammatory intestinal diseases and chronic pancreatitis |
AU2008229448B2 (en) * | 2007-03-16 | 2013-01-24 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Combination enzyme therapy for digestion of dietary gluten |
ATE511651T1 (de) | 2007-04-06 | 2011-06-15 | Zedira Gmbh | Transglutaminase 6 als diagnostischer indikator für autoimmunerkrankungen |
HU0900199D0 (en) * | 2009-04-01 | 2009-06-29 | Debreceni Egyetem | Diagnosis of gluten-induced autoimmune diseases |
FR2949782B1 (fr) * | 2009-09-04 | 2015-10-16 | Isp Investments Inc | Peptide activateur de la transglutaminase et composition cosmetique ou pharmaceutique le contenant. |
WO2013119845A1 (en) | 2012-02-07 | 2013-08-15 | Vibrant Holdings, Llc | Substrates, peptide arrays, and methods |
DE102012007510A1 (de) | 2012-04-17 | 2013-10-17 | Aesku.Diagnostics GmbH & Co. KG | Verfahren zur Präsymptomatischen Diagnostik von Zöliakie und Glutensensitivität |
HUE043698T2 (hu) | 2012-04-17 | 2019-09-30 | Aeneas Gmbh & Co Kg | Eljárás cöliákia és gluténérzékenység tünetek elõtti diagnosztizálására |
US10006909B2 (en) | 2012-09-28 | 2018-06-26 | Vibrant Holdings, Llc | Methods, systems, and arrays for biomolecular analysis |
US10286376B2 (en) | 2012-11-14 | 2019-05-14 | Vibrant Holdings, Llc | Substrates, systems, and methods for array synthesis and biomolecular analysis |
JP5981667B2 (ja) | 2013-02-15 | 2016-08-31 | ヴィブラント ホールディングス リミテッド ライアビリティ カンパニー | 増幅された電気化学発光検出のための方法および組成物 |
CN104090102B (zh) * | 2014-06-13 | 2016-08-17 | 江南大学 | 冷冻鱼糜中微生物谷氨酰胺转胺酶elisa检测方法 |
JP6887945B2 (ja) | 2014-09-10 | 2021-06-16 | ヴィブラント ホールディングス リミテッド ライアビリティ カンパニー | セリアック病に関するペプチドマイクロアレイおよび新規バイオマーカー |
WO2018218250A2 (en) | 2017-05-26 | 2018-11-29 | Vibrant Holdings, Llc | Photoactive compounds and methods for biomolecule detection and sequencing |
CN110055235A (zh) * | 2019-05-14 | 2019-07-26 | 深圳市亚辉龙生物科技股份有限公司 | 用于转谷氨酰胺酶抗体检测的抗原及其制备方法、试剂盒及检测方法 |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
PL155894B1 (en) * | 1987-12-23 | 1992-01-31 | Przed Zagraniczne W Polsce Pla | Test for assessing gluten-dependent enteropathies |
DE3829524A1 (de) * | 1988-08-31 | 1990-03-01 | Behringwerke Ag | Verwendung von transglutaminasen als immunsuppressiva |
DE19520480C2 (de) | 1995-06-03 | 1997-04-30 | Univ Leipzig | Immunochemisches Testmaterial und Enzymimmunoassay zur Diagnostik von Zöliakie und verwandten Eiweißintoleranzen |
US5716794A (en) * | 1996-03-29 | 1998-02-10 | Xybernaut Corporation | Celiac antigen |
-
1996
- 1996-07-18 DE DE19630557A patent/DE19630557C2/de not_active Revoked
-
1997
- 1997-07-14 IL IL128042A patent/IL128042A/en not_active IP Right Cessation
- 1997-07-14 CA CA002260769A patent/CA2260769C/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-07-14 PL PL97331203A patent/PL189091B1/pl unknown
- 1997-07-14 SI SI9720044A patent/SI9720044B/sl unknown
- 1997-07-14 PT PT97939994T patent/PT912898E/pt unknown
- 1997-07-14 HU HU0202779A patent/HU228479B1/hu unknown
- 1997-07-14 DK DK97939994T patent/DK0912898T3/da active
- 1997-07-14 WO PCT/EP1997/003740 patent/WO1998003872A2/de active IP Right Grant
- 1997-07-14 NZ NZ333744A patent/NZ333744A/xx not_active IP Right Cessation
- 1997-07-14 CZ CZ1999117A patent/CZ291662B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1997-07-14 CN CNB971965269A patent/CN1138146C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1997-07-14 AT AT97939994T patent/ATE210296T1/de active
- 1997-07-14 BR BRPI9710500-7A patent/BR9710500B1/pt not_active IP Right Cessation
- 1997-07-14 EP EP97939994A patent/EP0912898B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1997-07-14 SK SK67-99A patent/SK284410B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1997-07-14 DE DE59705683T patent/DE59705683D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1997-07-14 ES ES97939994T patent/ES2131038T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1997-07-14 AU AU42011/97A patent/AU718797B2/en not_active Expired
-
1999
- 1999-01-01 GR GR990300020T patent/GR990300020T1/el unknown
- 1999-01-13 US US09/229,716 patent/US6319726B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-01-15 NO NO19990190A patent/NO321466B1/no not_active IP Right Cessation
- 1999-12-22 HK HK99106049A patent/HK1021025A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2001
- 2001-08-08 US US09/925,076 patent/US20020076834A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
SK284410B6 (sk) | Spôsob in vitro diagnostiky a kontroly liečenia sprue alebo celiakie a orálny farmaceutický prostriedok na liečenie týchto chorôb | |
Dieterich et al. | Identification of tissue transglutaminase as the autoantigen of celiac disease | |
Sárdy et al. | Epidermal transglutaminase (TGase 3) is the autoantigen of dermatitis herpetiformis | |
Koop et al. | Detection of autoantibodies against tissue transglutaminase in patients with celiac disease and dermatitis herpetiformis | |
EP2395100B1 (en) | Novel diagnostic marker for type 1 diabetes mellitus | |
US9334487B2 (en) | Methods for diagnosing rheumatoid arthritis | |
Elli et al. | Immunological effects of transglutaminase-treated gluten in coeliac disease | |
Ligier et al. | A new antibody in rheumatoid arthritis targeting glycated IgG: IgM anti-IgG-AGE. | |
EP2161284B1 (en) | Citrulinated fibrin-filaggrin chimeric polypeptide capable of detecting the antibodies generated in rheumatoid arthritis | |
Dørum et al. | A quantitative analysis of transglutaminase 2-mediated deamidation of gluten peptides: implications for the T-cell response in celiac disease | |
Leung et al. | Osteopontin fragments with intact thrombin-sensitive site circulate in cervical cancer patients | |
Karska et al. | Calreticulin-the potential autoantigen in celiac disease | |
US20150247850A1 (en) | Gp2 isoforms and their use in autoantibody capture | |
Van De Water et al. | The role of T cells in primary biliary cirrhosis | |
WO2023109384A1 (zh) | 去唾液酸糖蛋白受体片段sH2a作为标志物的应用 | |
EP2757373A1 (en) | Method for measuring anti-wt1 antibody | |
US6703208B1 (en) | Immunological assay for detection of antibodies in celiac disease | |
Cronin et al. | A significant step in the celiac puzzle | |
Engineer et al. | Bovine gingival lysate: a novel substrate for rapid diagnosis of autoimmune vesiculo‐bullous diseases: A preliminary observation | |
US11340235B2 (en) | GP2 isoforms and their use in autoantibody capture | |
TWI744777B (zh) | 一種類風溼關節炎自體抗體結合的胜肽及其應用 | |
KR101966515B1 (ko) | 아쿠아포린 5에 대한 자가항체를 특이적으로 인식하는 에피토프 펩타이드 및 그 용도 | |
WO2001029090A1 (en) | Immunological assay for detection of antibodies in celiac disease | |
WO2019015814A1 (en) | USE OF CHITINASE-3 PROTEIN-1 (CHI3L1) AS AUTO-ANTIGEN IN AUTOIMMUNE DISORDERS OF THE DIGESTIVE SYSTEM | |
JPH01502132A (ja) | 膵臓チモーゲンの遊離活性化ペプチドの免疫分析による診断、厳密な予測および監視 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MK4A | Expiry of patent |
Expiry date: 20170714 |