CZ291662B6

CZ291662B6 - Způsob diagnostiky a kontroly léčení sprue nebo celiakie a orální farmaceutický prostředek pro léčení těchto chorob

Info

Publication number: CZ291662B6
Application number: CZ1999117A
Authority: CZ
Inventors: Walburga Dieterich; Tobias Ehnis; Detlef Schuppan
Original assignee: Detlef Schuppan; Walburga Dieterich
Priority date: 1996-07-18
Filing date: 1997-07-14
Publication date: 2003-04-16
Also published as: NO990190D0; DE19630557A1; BR9710500B1; SK6799A3; NO321466B1; AU718797B2; US20020076834A1; GR990300020T1; EP0912898B1; CN1138146C; CZ11799A3; HUP0202779A3; ATE210296T1; SK284410B6; HUP0202779A2; CN1225723A; ES2131038T3; DE19630557C2; HK1021025A1; HU228479B1

Abstract

Zp sob diagnostiky a kontroly l en sprue nebo celiakie, p°i n m se v t lesn²ch kapalin ch detekuj imunoreakc s tk ovou transglutamin zou, tTG, nebo jej mi imunoreaktivn mi sekvencemi nebo analogy protil tky proti tTG. Pou it tTG nebo jej ch imunoreaktivn ch sekvenc nebo analog p°i diagnostice a kontrole l en sprue nebo celiakie a jin²ch autoimunitn ch chorob. Or ln farmaceutick² prost°edek pro l en sprue nebo celiakie, kter² obsahuje tTG nebo jej imunoreaktivn sekvence nebo analogy a pop° pad farmaceuticky p°ijateln pomocn inidla.\

Description

Způsob diagnostiky a kontroly léčení sprue nebo celiakie a orální farmaceutický prostředek pro léčení těchto chorob

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká způsobu pro detekci protilátek v tělesných kapalinách pomocí imunitní reakce s tkáňovou transglutaminázou (tGT), jejími antigenními strukturami, imunoreaktivními sekvencemi nebo jejich analogy, a se sloučeninami obsahujícími tGT, její antigenní struktury, imunoreaktivní sekvence nebo jejich analogy. Způsob může být použit v diagnostice a při kontrole terapie onemocnění spojených s imunitní reakcí proti tTG, sloučeninám obsahujícím tTG a jejich antigenním strukturám, imunoreaktivním sekvencím nebo jejich analogům. Proto je vynález také zaměřen na použití tTG a výše uvedených substancí v diagnostice a kontrole terapie, výhodně v diagnostice a kontrole terapie chronických zánětlivých onemocnění nebo autoimunitních onemocnění, a výhodně v diagnostice a kontrole terapie sprue nebo celiakie. Vynález se také týká orálního farmaceutického prostředku, který obsahuje tTG, sloučeniny obsahující tTG a antigenní struktury, imunoreaktivní sekvence nebo jejich analogy jako aktivní složky a kteiý může být použit pro léčbu onemocnění spojených s imunitní reakcí proti těmto substancím, protože orální podání výše uvedených sloučenin vyvolává imunitní toleranci.

Předkládaný vynález je založen na objevu, že tkáňová transglutamináze (tTG, EC 2.3.2.13) je autoantigen u sprue nebo celiakie.

Na základě výše uvedeného objevu byla vyvinuta imunologická metoda podle předkládaného vynálezu pro detekci protilátek proti tTG a sloučeninám obsahujícím tTG.

Dosavadní stav techniky

Celiakie je onemocnění sliznice tenkého střeva, jehož první projevy jsou obvykle v průběhu pozdního dětského a batolecího věku. Pokud se odpovídající klinický obraz neobjeví před dospělostí, pak se toto onemocnění nazývá netropická sprue. Proto oba tyto termíny označují stejné onemocnění. Sprue je doprovázena zánětlivými změnami na sliznici a celkovou malabsorpcí, která vzniká v důsledku těchto změn. Ve většině případů je přítomna morfologická a klinická odpověď na léčbu bezlepkovou dietou.

Dobře známým patogenním faktorem jsou gluteny z pšenice, ječmene, žita a v určitém rozsahu i prosa, zatímco gluteny z rostlin s nižším stupněm fylogenetické příbuznosti, jako je kukuřice, rýže a sója, jsou nepatogenní. U těchto glutenů je role patogenního činidla připsána prolaminům rozpustným v alkoholech, zejména a-gliadinu.

Z tohoto důvodu se sprue vyskytuje hlavně v zemích, ve kterých je pšenice používána jako hlavní zdroj potravy (Evropa, USA, Austrálie) a její incidence je například, 0,14/1000 novorozených dětí v Dánsku, 0,7/1000 ve Španělsku, 1/1000 v Itálii, 0,45/1000 v Německu a 2,42/1000 ve Švédsku.

Nicméně, novější výzkumy ukázaly, že subklinické příznaky, tj. morfologické změny bez masivních příznaků, jsou častější, než se dosud soudilo. Tak ukázala studie provedená v Itálii v roce 1994 incidenci 3,28/1000 mezi dětmi školního věku. Riziko latentní sprue je u dalších dětí těchto pacientů až 50%.

Prodominantně latentní sprue je často doprovázena polymorfní dermatózou, tj. dermatitis herpetiformis, u které jsou pozorovány charakteristické subepidermální malé puchýřky s granulámími depozity IgA ve vrcholech dermálních papil. Biopsie tenkého střeva ukazují nepravidelnou, více nebo méně poškozenou sliznici.

-1 CZ 291662 B6

Jiné dobře určené asociace jsou mezi sprue a inzulin-dependentním diabetes mellitus, onemocněními štítné žlázy a selektivní IgG deficiencí.

Kromě mnoha dalších doprovodných klinických příznaků sprue, jako je anemie, která byla, mimo jiné, přisouzena malabsorpci vitaminu B]₂, a deficienci vitaminu K, která je důvodem pro vyšší krvácivost, má zvláštní význam značně zvýšené riziko pro gastrointestinální maligní nádory. Až u 15% pacientů se sprue obvykle ve věku nad 50 let vyvine v neoplastické onemocnění, a přibližně v 50 % se jedná o střevní T-buněčné lymfomy a v dalších 25 % se jedná o tumory 10 jícnu, orofaryngu a tenkého střeva.

Terapie sprue zahrnuje celoživotní dodržování bezlepkové diety, při které musí být vyloučeny nejen výrobky obsahující gluten z pšenice, ale také zječmene, žita a prosa. Pro pacienty toto představuje těžké omezení jak dietních zvyklostí, tak sociálních interakcí.

Pokud je diagnóza a terapie sprue provedena včas, pak má dobrou prognózu. Nicméně, jednou vzniklé komplikace nejsou často kompletně reverzibilní. Naopak, u nerozpoznaného a neléčeného onemocnění může dojít v důsledku malabsorpce ke vzniku závažných příznaků. Konečně, je zde zvýšené riziko vzniku střevních lymfomů a jiných malignit gastrointestinálního traktu.

V současnosti představuje biopsie tenkého střeva nej lepší standard v diagnostice sprue a při sledování při bezlepkové dietě, ale stále důležitějšími se stávají neinvazivní diagnostické metody založené na imunologických markérech. Jelikož v séru pacientů trpících sprue jsou přítomny protilátky třídy IgA a IgG, které jsou namířeny proti gliadinu a proti autoantigenu endomysia, což je specifická pojivová tkáň, která, mimo jiné, obsahuje kolageny I, III a V, elastická vlákna, nekolagenní proteiny jako je fibronektin a proteoglykany, může být sérum testováno na IgG a IgA protilátky proti gliadinu pomocí ELISA, a na IgG a IgA protilátky proti endomysiu pomocí nepřímé fluorescence. Zatímco protilátky proti gliadinu nejsou dostatečně specifické pro sprue, vysoká senzitivita a specifická (97 - 100%) je popsána pro IgA Ab proti endomysiu. Nicméně, 30 pro detekci pomocí imunofluorescence jsou nutné vzorky z jícnu primátů. V současné době se provádějí pokusy o detekci protilátek proti endomysiu z pupečníkového materiálu.

V roce 1984 popsali Maury a Teppo (ancel 1984, 20: 892 - 894) 90 kDa glykoprotein bohatý na manózu (20% obsahu cukru) jako složku normální kůže s sliznice tenkého střeva. Byli schopni identifikovat cirkulující IgG imunokomplexy schopné detekovat uvedený protein u 10 z 20 pacientů sceliakií, a u 7 z 12 pacientů postižených herpetiformní dermatitidou (onemocněním, které je považováno za epidermální příznak celiakie). Popsaný 90 kDa glykoprotein je charakterizován tím, že má 90% obsah manózy, zatímco tTG je neglykosylovaný, i přes přítomnost 6 glykosylačních míst (Ichinose et al., J. Biol. Chem., 1990, 265: 13411 - 13414).

V roce 1986 vyšetřovali Maury et al., (viz Gut, 1986, 27: 147 - 152) uvedené protilátky ELISA testem se sérem pacientů postižených celiakií a kontrolním sérem. Sérum od pacientů s celiakií vykazovalo signifikantně vyšší hladiny protilátek (p < 0,001) než kontrolní sérum. Uvedené zvýšené hladiny poklesly na normální hodnoty po bezlepkové dietě. Nebyla prokázána žádná korelace s anti-retikulinovými protilátkami.

Při časné diagnostice a přísném dodržování bezlepkové diety může být onemocnění udržováno v remisi a tak může být také zvýšené riziko malignit u pacientů udržováno na normálních hodnotách. Proto existuje značná potřeba vývoje vhodného detekčního testu pro sprue. Protože 50 skupina jedinců s latentní sprue také patří do skupiny s vysokým rizikem, měly by být všichni rizikový jedinci (zejména další příbuzní), a konečně, všechny školní děti, jak je nyní bráno v úvahu v Itálii, vyšetřováni pomocí senzitivního, specifického, snadno proveditelného a levného testu.

-2CZ 291662 B6

Doposud nicméně selhaly skriningové programy v důsledku následujících problémů:

- Invazivní biopsie z duodena u bezpříznakových osob jsou nepřijatelné a nadměrně nákladné;

- ELISA detekce pomocí protilátek proti gliadinu je sotva použitelná v důsledku její nízké specificky;

- Imunofluorescenční detekce protilátek proti endomysiu třídy IgA, která je provedena na jícnu primátů, je také nákladná jako obecná skríningová metoda. Kromě toho, hodnocení je subjektivní a neumožňuje identifikaci pacientů se sprue majících deficienci IgA (2 % pacientů).

Dosud proto neexistuje neinvazivní, specifický, kvantitativní, rychlý, snadný a levný přijatelný detekční test pro sprue/celiakii a pro kontrolu léčby těchto onemocnění.

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu je způsob diagnostiky a kontroly léčení sprue nebo celiakie, jehož podstata spočívá v tom, že se v tělesných kapalinách detekují imunoreakcí s tkáňovou transglutaminázou, tTG, nebo jejími imunoreaktivními sekvencemi nebo analogy protilátky proti tTG.

Předmětem vynálezu je dále také použití tTG nebo jejích imunoreativních sekvencí nebo analogů při diagnostice a kontrole léčení sprue nebo celiakie a jiných autoimunitních chorob.

Předmětem vynálezu je také orální farmaceutický prostředek pro léčení sprue nebo celiakie, jehož podstata spočívá v tom, že obsahuje tTG nebo její imunoreaktivní sekvence nebo analogy a popřípadě farmaceuticky přijatelná pomocná činidla.

Konečně je předmětem vynálezu také použití tTG nebo jejích imunoreaktivních sekvencí nebo analogů pro výrobu orálního farmaceutického prostředku pro léčení sprue nebo celiakie.

V souvislosti s vynálezem byla na základě překvapivého zjištění, že tkáňová transglutamináza (tTG, EC 2.3.2.13) je autoantigenem u sprue, vyvinuta imunologická technika pro detekci protilátek proti tTG nebo jejím imunoreaktivním sekvencím nebo analogům z tělesných kapalin, zejména séra, kde tato metoda umožňuje nejen diagnostiku sprue nebo celiakie, ale také onemocnění doprovázených imunitní reakcí proti tTG, sloučeninám obsahujícím tTG, jeho antigenní struktury, imunoreaktivní sekvence nebo analogy.

Tkáňová transglutamináza patří do třídy transglutamináz. TG (EC 2.3.2.13) jsou enzymy katalyzující přenos acylové skupiny závislý na Ca²⁺, τ-karboxamidových skupin peptidovou vazbou vázaných glutaminových zbytků, které působí jako donory acylové skupiny. Primární proteinové lysinové zbytky působí jako akceptory acylové skupiny, takže přenosem vzniká c-(x-glutamyl)lysinová vazba. Substrátová specifícita TG s ohledem na donory acylové skupiny je velmi vysoká (v závislosti na aminokyselinové sekvenci), zatímco existuje výjimečně velké spektrum akceptorů (Folk J.E., Annu. Rev., Biochem., 1980, 49: 517-531). Tvořené kovalentní peptidové vazby jsou vysoce stabilní a rezistentní a proteázy, což vede ke zvýšené rezistenci zkříženě vázaných proteinů na chemické, enzymatické nebo fyzikální vlivy.

Také značně rozšířený výskyt různých TG v různých orgánech, tkáních a plazmě a intersticiální tekutině koreluje s výskytem transglutamizami modifikovaných proteinů v krevních sraženinách, buněčných membránách, rohovatící vrstvě epidermis, vlasech, nehtech a extracelulámí matrix (Greenberg C.S. et al., FASEB J. 1991, 5: 3071 - 3077).

Popsané transglutaminázy mohou být rozděleny podle jejich fyzikálních vlastností, jejich lokalizace v těle a podle jejich primární struktury.

-3 CZ 291662 B6

Tkáňová TG (tTG) je také označována jako buněčná, erytrocytámí, endoteliální, cytoplazmatická, jatemí nebo typ II TG, a je to monomer mající molekulovou hmotnost 75 - 85 kDa.

Kompletní aminokyselinová sekvence obsahující 687 zbytků byla odvozena zcDNA. Na proteinové úrovni zde existuje 84% homologie mezi lidským enzymem a enzymem z myších makrofágů a 81% homologie mezi lidským enzymem a enzymem morčat. Často nemá výměna nukleotidů mezi těmito druhy žádný vliv na aminokyselinovou sekvenci. Aktivní centrum je vysoce konzervováno, s vyznačenou homologií proteinu mezi třemi druhy (49 z 51 zbytků je identických), a s vysokým stupněm homologie proteinu (75%) s a-podjednotkou faktoru ΧΠΙ (viz Gentile V. et al., J. Biol. Chem., 1991, 266: 478 - 483; Greenberg C.S. et al., FASEB J. 1991,5:3071 -3077).

Není zde přítomen ani signální peptid, ani glykosylace a i přes přítomnost mnoha cysteinových zbytků zde nejsou disulfídové můstky. Pomocí fluorescenční hybridizace byl gen pro lidskou transglutaminázu lokalizován na chromozom 20ql2 (Gentile, V. et al., Genomics, 1994, 20: 295 - 297). Ačkoliv mechanismus umožňování enzymu stále není znám, existuje jasný důkaz, že tTG se svým intracelulámím výskytem má významnou funkci v extracelulámí matrix (ECM). Kromě toho, není pravděpodobné, že by intracelulámí koncentrace Ca²⁺ nutná pro aktivitu tTG byla dosažena za fyziologických podmínek, zatímco dostatečně vysoké koncentrace Ca² se vyskytují extracelulámě (Gentuke V. et al., J. Cell. Biol., 1992, 119: 463 - 474).

Několik výzkumů určilo asociaci tTG s fibronektinem - proteinem ECM. Kromě fibronektinu mohou být molekuly ECM jako je nidogen, N-terminální peptid protokolagenu III, kolagen

V a XI, osteonektin, což je glykoprotein asociovaný s mikrofibrilami, dermatan-sulfatový proteoglykan s vysokou molekulovou hmotností a galestin 3 lektin, identifikovány jako specifické substráty pro tTG.

Důkazy pro významnou roli tTG při hojení ran byly také získány z imunofluorescenčních studií na kultivovaných WI38 buňkách (plicní embryonální fibroblasty), které nevykazují extracelulámí tTG aktivitu za normálních podmínek, ale existuje u nich extracelulámí depozice enzymu při arteficiální tvorbě ran. Po pravděpodobně pasivním uvolnění enzymu z poraněných buněk následuje nekovalentní vazba na ECT, zejména na fibronektin a fibrilámí kolageny a enzym je aktivní po dobu několika hodin (Upchurch, H. F. et al., J. Cell Physiol. 1991, 149: 375 - 382).

V krysím modelu, také po tvorbě poranění, bylo detekováno 5 denní zvýšení aktivity tTG (Bowness, J. M. Et al., Biochem. Biophys. Acta, 1988, 967: 234 - 240). Také při inkubaci lyzátu lidských erytrocytů s plazmou může být detekována silná afinita uvolněné tTG k fibronektinu (Loraud, L. Et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 1988, 85: 1057 - 1059). Všechny objevy ukazují, že vazby tTG na ECM má centrální úlohu v časné fázi hojení ran a zejména, že způsobuje stabilizaci fibrinu spolu s faktorem XIII, což vytváří ochrannou vrstvu a stabilní adhezivní substrát okolo poškozených buněk prostřednictvím zkřížené vazby extracelulámích proteinů. Dosud nebyl u obratlovců detekován žádný enzym schopný štěpení tTG katalyzovaných, enormně stabilních zkřížených vazeb.

Na základě zjištění, že tTG je autoantigenem u sprue je vynález také zaměřen na použití tTG, sloučenin obsahujících tTG, jeho antigenní struktury, imunologické sekvence a analogy při diagnostice a kontrole terapie onemocnění spojených s imunologickou reakcí proti uvedeným sloučeninám. Konkrétně mohou být tímto způsobem diagnostikována akutní zánětlivá onemocnění jako je pneumonie, glomerulonefritida, virová hepatitida, nebo chronická zánětlivá onemocnění jako je Crohnova nemoc, Colitis ulcerosa, nebo autoimunitní onemocnění jako je autoimunitní hepatitida, Sjogrenův syndrom, Wegenerova granulomatóza, revmatoidní artritida, ideopatická orgánová fibróza, jako je například plicní fibróza. Zejména je výhodný detekční test pro diagnostiku a kontrolu terapie sprue. Jelikož tento test může být proveden rychle a levně, umožňuje vyšetřování populace na přítomnost protilátek proti tTG.

-4CZ 291662 B6 tTG použitý podle předkládaného vynálezu může být zvířecího, syntetického nebo rekombinantního původu a totéž také platí pro sloučeniny obsahující tTG, které mohou být navíc kombinovaného původu (například zvířecího tTG spolu se syntetickým peptidem). Podle předkládaného vynálezu jsou sloučeninami obsahujícími tTG chemické sloučeniny tTG nebo jeho analogů s proteiny. Podle předkládaného vynálezu jsou tTG analogy nebo analogy těchto sloučenin obsahujících tTG všechny antigenní struktury, které reagují s protilátkami proti tTG nebo sloučeninám obsahujícím tTG, například syntetické peptidy. Imunoreaktivní sekvence jsou fragmenty tTG nebo sloučenin obsahujících tTG, které jsou vyrobeny proteolýzou, syntézou nebo genetickým zpracováním, stejně jako varianty získané výměnou aminokyselin.

Imunologická detekce podle předkládaného vynálezu je provedena podle dobře známých technik. Tak může být pro detekci protilátek u pacienta použita jakákoliv přímá (například za použití senzorového čipu) nebo nepřímá technika.

Při přímých technikách je vazba detekované protilátky na antigen určena prostřednictvím změny fyzikálních nebo chemických vlastností, takže nejsou nutné následné kroky detekce využívající značených vazebných druhů protilátek.

Podle předkládaného vynálezu je výhodné detekovat protilátky proti tTG pomocí imunotestu, výhodně imunotestu na pevné fázi, s přímým nebo nepřímým navázáním reakčního činidla na snadno detekovatelnou označenou substanci. Výhodněji může být detekce provedena za použití ELISA nebo RIA nebo imunofluorescenčního testu. Techniky použité při takových metodách detekce jsou odborníkům v oboru dobře známé.

V ELISA je například antigen, v tomto případě tTG, navázán přímo nebo nepřímo na nosič jako je například polystyren. Po inkubaci s detekovanou protilátkou, například ze séra pacientů, jsou protilátky navázané na antigen detekovány přímo nebo nepřímo pomocí substancí s navázaným enzymem. Těmito substancemi mohou být protilátky, fragmenty protilátek nebo vysokoafinitní ligandy, jako je avidin, který se váže na biotinovou značku. Jako enzymy je možné použít například peroxidázu, alkalickou fosfatázu, β-galaktosidázu, ureasu nebo gulokosaoxidázu. Navázané enzymy, a tak i navázané protilátky, mohou být kvantifikovány, například, pomocí přidání chromatogenního substrátu.

V RIA je antigen, například tTG, navázán podobně přímo nebo nepřímo na nosič jako je například polystyren. Po inkubaci se detekovanou protilátkou, například ze séra pacientů, jsou protilátky navázané na antigen detekovány pomocí radioaktivně značených substancí, například substancí značených I¹²⁵. Těmito substancemi mohou být protilátky, fragmenty protilátek nebo vysokoafinitní ligandy, jako je avidin, který se váže na biotinovou značku. Navázaná radiaktivita může být kvantifikována pomocí vhodného měřicího přístroje.

V imunofluorescenčním testu jsou protilátky navázané na antigen detekovány podle stejného principu, pomocí fluorescenčním činidlem značených substancí, například substancí značených fluorescein-izothiokyanatanem (FITC). Těmito substancemi mohou být protilátky, fragmenty protilátek nebo vysokoafinitní ligandy, jako je avidin, který se váže na biotinovou značku. Množství navázaného fluorescenčního barviva je potom kvantifikováno pomocí vhodného měřicího přístroje.

Podle předkládaného vynálezu je také možné detekovat protilátky u pacienta v aglutinačním testu nebo v testu gelové difiize. Tyto detekční testy jsou také odborníkům v oboru dobře známé. Tak v testu gelové difúze je roztok antigenu nebo protilátek například umístěn do těsně sousedících jamek agaru nebo agarózových ploten. V tomto případě může být roztok antigenu například roztok tTG a roztok protilátky může být například krevní sérum. Jak substance difundují pryč ze svých jamek, vytváří se koncentrační gradienty od jamek. Pokud překrývající se koncentrace protilátky a antigenu v gelu spadají do specifických poměrů a roztok protilátky obsahuje protilátku proti antigenu, pak se v gelu tvoří detekovatelné sraženiny.

-5CZ 291662 B6

V aglutinačním testu jsou částice nesoucí antigen (například tTG), vyrobené například z latexu nebo polystyrenu, křížené vázány s protilátkami, například ze séra. Tvořené agreganty mohou být detekovány například pomocí turbidimetrické analýzy.

Podle předkládaného vynálezu je zejména výhodné provedení detekce v séru pacientů se sprue pomocí IgA-specifické nebo IgG specifické ELISA. Bylo zjištěno, že nově vyvinutá detekce IgA protilátek v séru pacientů se sprue pomocí ELISA založené na tTG se výjimečně dobře hodí pro diagnostiku a kontrolu terapie sprue díky své vysoké senzitivitě a specificitě. Tato skutečnost je také zřejmá při sledování léčených pacientů (pokles titru v průběhu terapei). Srovnání dat z ELISA podle předkládaného vynálezu s imunofluorescenčním hodnocením třetích osob (detekce IgA anti-endomysium) vykazuje dobrou konformitu. Neshody se vyskytují zejména při nízkém titru protilátek, nicméně, jsou důsledkem toho, že nepřímá fluorescence byla dosud považována za vrcholný standart. Mimo jiné je toto způsobeno subjektivitou hodnocení a nespecifickými souběžnými reakcemi, které se vyskytují u této dřívější v oboru známé techniky.

Odpovídající detekce založená na protilátkách jiných tříd, například IgG protilátkách, je vhodná pro identifikaci sprue u pacientů s deficitem IgA a pro vyšetřování jiných onemocnění spojených s imunitní reakcí proti tTG.

Jiné vylepšení této detekční techniky je dosaženo při použití přečištěné tTG od morčat, lidské tTG, sekvencí nebo analogů získaných proteolýzou nebo genetických zpracováním, stejně jako při použití syntetických imunogenních tTG peptidů v testovacím systému. ELISA pro diagnostiku a sledování jiných onemocnění spojených s imunitní reakcí proti tTG bude popsán v příkladu

3.3.

Vynález je také zaměřen na orální farmaceutický prostředek podle nároku 9 pro léčbu onemocnění spojených s imunitní reakcí proti tTG, sloučeninám obsahujícím tTG, jeho antigenním strukturám, imunoreaktivním sekvencím a nebo analogům. Výhodně je prostředek pro orální podání tableta nebo kapsle, kdy je orální tolerance vytvořena podáváním tTG, sloučenin obsahujících tTG, jeho antigenních struktur, imunoreaktivních sekvencí a nebo analogů. Na jedné straně je uvedené orální tolerance dosaženo orálním podáváním autoantigenu, a na druhé straně zde existuje takzvaný „příbuzný efekt“: pokud je autoantigen indukující onemocnění neznámý, pak může být v některých případech v orální terapii použit jiný antigen kontaktující imunitní systém v cílovém orgánu. Tento antigen je potom schopen lokální stimulace supresorových T buněk specifických pro antigen, což vede k potlačení systémové imunitní odpovědi. Pouze vyšší dávky antigenu indukují anergii autoreaktivních T buněk.

Orální tolerance je praktický způsob pro léčbu různých autoimunitních onemocnění.

Farmaceutické činidlo podle předkládaného vynálezu je výhodně použito při léčbě sprue, ale může být také použito pro jiná chronická zánětlivá střevní onemocnění a autoimunitní hepatitidu.

Podle předkládaného vynálezu jsou tTG, sloučeniny obsahující tTG, jeho antigenní struktury, imunoreaktivní sekvence a nebo analogy podávány v dávce 0,01 - 100 mg/kg tělesné hmotnosti.

Farmaceutická činidla podle předkládaného vynálezu mohou případně obsahovat farmaceuticky přijatelná pomocná činidla, jako jsou plnidla, kluzná činidla, činidla podporující rozpadavost, pojivá nebo činidla upravující uvolňování, jak jsou běžně používána ve farmacii. Poměr farmaceutických pomocných činidel může být různý, podle vybraného obsahu aktivního činidla, a v každém případě je od 0,1 % do 20 % hmotnostních.

Konkrétně, výhody dosažené pomocí předkládaného vynálezu je možné pozorovat v detekčním testu pro sprue a pro kontrolu terapie sprue, kde tento test je neinvazivní, vysoce specifický, a je zaměřen přímo na činidlo spojené s onemocněním. Dále, hlavní výhoda tohoto vyvinutého testu

-6CZ 291662 B6 je ta, zeje rychlý, snadný a levný, stejně jako to, že existuje možnost standardizace mezi různými laboratořemi. Proto test umožňuje účinné vyšetřování populace na přítomnost protilátek proti tTG.

Také potenciální kvantitativní hodnocení je, v důsledku objektivity dat získaných v testu, lepší ve srovnání s hodnocením pomocí imunofluorescence, které obsahuje subjektivní složku. Kromě toho, imunofluorescenční hodnocení je, zejména při nízkých titrech, ovlivněno nežádoucím způsobem nespecifickými souběžnými reakcemi. Při použití specifického autoantigenu v testu mohou být v nej vyšší možné míře eliminovány nespecifické reakce na materiálu získané z jícnu primátů nebo pupečníku.

Protože test je použitelný na třídu IgA protilátek, stejně jako na jiné třídy protilátek, jsou také identifikováni pacienti s deficitem IgA. Detekce založená na protilátkách proti tTG je také vhodná pro identifikaci, vyšetřování a kontrolu terapie jiných onemocnění spojených s imunitní reakcí proti tTG.

Též je možné - v důsledku identifikace tTG jako autoantigenu u sprue - použít tento autoantigen nebo jeho imunoreaktivních epitopů (sekvencí, analogů nebo syntetických peptidů produkovaných proteolýzou nebo genetickým zpracováním) v orální terapii sprue a jiných onemocnění spojených s imunitní reakcí proti tTG.

Přehled obrázků na výkresech

Na obr. 1 je uvedené zobrazení autoantigenu v SDS-PAGE po imunoprecipitaci (IP).

Na obr. 2 je uvedeno proteázové trávení autoantigenu endoproteázou Asp-N.

Na obr. 3 a) je uveden test IgA ELISA se séry od pacientů se sprue před a po bezlepkové dietě (ředění séra 1/400).

Na obr. 3 b) je uveden test IgA ELISA s kontrolními séry (ředění séra 1/200).

Na obr. 4 je uveden test IgG ELISA se séry od pacientů se sprue před a po bezlepkové dietě (ředění séra 1/400).

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1 - izolace a charakterizace autoantigenu

1.1. Imunofluorescence, APAAP barvení

Barvení byla provedena na různých buněčných liniích fixovaných ve 100% methanolu po dobu 2 minut při -20 °C.

Při imunofluorescentní detekci byly přípravky inkubovány se sérem od pacientů se sprue as kontrolním sérem, v příslušném pořadí, byly promyty a byla provedena detekce pomocí TRITC-značené králičí protilátky proti lidskému IgA (Schuppan et al., J. Biol. Chem. 1990, 265: 8823-32).

APAAP značení bylo provedeno po inkubaci buněk se sérem od pacientů se sprue, po promytí a následné detekci pomocí APAAP komplexu (Cordell, J.L. et al., J. Histochem. Cytochem. 1984, 32:219-229).

-7CZ 291662 B6

V těchto testech vykazují HT1080 (buňky lidského fibrosarkomu), WI138 (lidské plicní embryonální fibroblasty), Hepl a Hep2 (buňky hepatocelulámího karcinomu) stejně pozitivní cytoplazmatické signály se séry od pacientů, zatímco normální séra nebo séra předem ošetřená lidským IgA nevykazují žádné značení. Lidské fibroblasty předkožky, lidské rhabdomyosarkomové buňky (RD)/krysí Morris hepatomové a psí MDCK buňky vykazovaly pouze velmi slabé až negativní reakce.

1.2. Metabolické značení buněk a imunoprecipitace autoantigenu

Charakterizace a izolace autoantigenu byla provedena pomocí HT10780 buněk.

Buňky byly kultivovány s L-alanyl-L-glutaminem, 10% fetálním telecím sérem (FCS, Gibco), lOOU/ml penicilinu a 100 pg/ml streptomycinu (Secomed) vDulbecco modifikovaném Eagle médiu (DMEM, Gibco) při 37 °C a 8% CO₂. Pro metabolické značení byly buňky přeneseny na kultivační plotny o průměru 5 cm a po dosažení asi 90% konfluence byly uchovávány v médiu bez methioninu a FCS a potom bylo médium nahrazeno 3 ml média bez FCS, které obsahovalo ³⁵S-methionin (0,2 mCi. Expre³⁵S³⁵S, NEN-Dupont). Po 16-20 hodinách inkubace byl odstraněn supematant. Buňky byly promyty fosfátovým pufrem (PBS, Seromed) a potom byly lyžovány ve 3 ml lyzačním pufru (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0,5% Triton X-100, 0,5% IGEPAL CA-630 neionického detergenčního činidla (Sigma), Complete^R inhibitoru proteáz (Boehringer), pH 7,5). Potom byla provedena imunoprecipitace pomocí CNBr-aktivované Sepharosa 4B (Pharmacia) jak v médiu, tak v lyzátu buněk.

Aktivace a vazba na Sepharosu byla provedena podle návodu výrobce. Po nabobtnání a promytí v 1 mM HCI, pH 2,5, byla Sepharosa aktivovaná CNBr inkubována s králičí protilátkou proti lidskému IgA (Dianova, 2,4 mg protilátky na ml Sepharosy) v 0,1 M NaHCČh, 0,5 M NaCl, pH 8,3, při 4 °C přes noc. Nenavázané protilátky byly odstraněny promytím na vazebném pufru a neobsazená vazebná místa byla nasycena přidáním 1 M ethanolaminu, pH 9,0, při pokojové teplotě, 2 hodiny. Potom byla Sepharosa promyta 3x střídavě (pokaždé lOx objemem) 0,1 M octanem sodným, 0,5 M NaCl, pH 4,0 a 0,1 M Tris-HCl, 0,5 M NaCl, pH 8,0 a potom následovala inkubace Sepharosy se séry od pacientů se sprue a od zdravých osob, ve vazebném pufru (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1 mM CaCI₂, 1 mM MgCl₂, pH 8,0) při 4 °C přes noc. Nadbytek sérových protilátek byl odstraněn trojím promytím vazebným pufrem.

Po každé byl 1 ml HT1080 média nebo lyzátu buněk (přibližně 5 x 10⁴ buněk) metabolicky značených buněk předem inkubován s 50 μΙ C14B Sepharosy (Pharmacia) po dobu 30 minut při pokojové teplotě, pro odstranění nespecificky se vázajících proteinů. Po centrifugaci (10000 x g, 5 minut, 4 °C) byl každý supematant inkubován za třepání při 4 °C přes noc s 50 μΐ Sepharosy, na kterou byly předem navázány IgA od pacientů a kontrolních osob. Pelety Sepharosy byly potom promyty pokaždé 3 x 1 ml promývacího pufru (10 mM Tris-HCl, 1% IGEPAL CA-630 (Sigma), 0,5% deoxycholatu sodného, 0,1% laryl síranu sodného. Complete^R (Boehringer) pH 8,0), a potom 1 ml 10 mM Tris-HCl, pH 8,0. Potom byly pelety umístěny do SDS testovacího pufru, byly inkubovány po dobu 5 minut při 95 °C za redukčních nebo neredukčních podmínek, byla provedena separace na 10 - 12,5% SDS polyakrylamidovém gelu (Lammli, U.K., Nátuře 1970, 227: 680 - 685) a byla provedena detekce pomocí autoradiografie (obr. 1).

V dalším vyšetřování bylo zjištěno, že protein s vysokou molekulovou hmotností navázaný v médiu je fibronektin, který mimo jiné, je nespecificky navázán na Sepharosu.

Nicméně, s buňkami asociovaný protein o hmotnosti 80 kDA může být vysrážen tímto způsobem ze všech 30 dosud použitých sér od pacientů se sprue, zatímco nemůže být vysrážen z 15 kontrolních sér, včetně normálních sér, sér od pacientů s Colitis ulcerosa a Sjogrenovým syndromem. Z této skutečnosti byl vyvozen závěr, že tento protein představuje základní autoantigen před sprue.

-8CZ 291662 B6

Pomocí protonového barvení gelů pomocí dusičnanu stříbrného (Henkeshoven, J. et al., Electroforesis 1985, 6: 103 - 112), byl tenký proteinový proužek přiřazen k autoradiograficky viditelnému 85 kDa proužku.

1.3. Izolace a přečištění 85 kDA autoantigenu

Pro izolaci většího množství autoantigenu bylo kultivováno celkem 65 kultivačních ploten (každá 175 cm²) s HT1080 buňkami. Krátkou dobu před dosažením konfluence bylo médium nahrazeno médiem bez FCS a potom následovala inkubace po dobu dalších 16-20 hodin v CO₂ inkubátoru. Lýza a imunoprecipitace, v příslušném pořadí, byly provedeny technikami popsanými výše. Sepharosová peleta byla inkubována v celkem 4,5 ml SDS testovacího pufru s 2% DL-dithiotreitolem (Sigma) po dobu 5 minut při 95 °C pro oddělení navázaných proteinů a potom byla vyšetřována v analytickém SDS polyakrylamidovém gelu.

Pro další přečištění autoantigenu byla imunosraženina separována pomocí vylučovací elektroforesy následujícím způsobem, za použití Prep Cell (Model 491 BIO-RAD): 4,5 ml proteinové směsi bylo umístěno na vrchol okrouhlého gelu (zevní průměr: 3 cm), který se skládal z 6,5 cm separačního gelu (8% polyakrylamid, pH 8,8) a 1,5 cm odběrového gelu (4% polyakrylamid, pH 6,8) a byla provedena separace pomocí elektroforesy. Jednotlivé proteiny byly odebírány ve vymývacím pufru (25 mM Tris-HCl, 0,1 M glycin, 0,01% SDS, pH 8,3) jako frakce po 1,2 ml (0,8 ml/min). Eluované frakce byly vyšetřovány v SDS-PAGE a frakce obsahující požadovaný protein byly kombinovány a koncentrovaly se na celkový objem přibližně 1 ml pomocí ultrafiltrace (Amicon Centriprep-50, při 1000 x g).

1.4. Trávení autoantigenu proteázou

Z několika testovaných proteáz byla určena endoproteináza Asp-N (sekvenční čistoty, Boehringer Mannheim) jako vhodná proteáza pro fragmentaci, protože umožňuje významným způsobem reprodukovatelný charakter štěpení s relativně dobře separovatelnými fragmenty. Koncentrace enzym/substrát byla upravena na 1:1000 a trávení bylo provedené po dobu 30 minut při 37 °C.

1.5. Přenos na DPVF membránu

Po trávení přečištěného antigenu byly peptidové fragmenty separovány na preparativním 10% Tricine gelu (Schagger, H. et al., Anal. Biochem. 1987, 1966: 368 - 379), (Obr. 2) a byly přeneseny při 4 °C na PVDF membránu (polyvinylidendifluorid, Immobilon™, Millipre) semi-suchou „fastblot“ technikou za použití elektrodových ploten obsahujících grafit (Fastblot B32/33, Biometra). Na anodovou desku byly umístěny následující vrstvy: 1) filtrační papír namočený v anodovém pufru 1 (300 mM Tris-HCl, 20% methanol, pH 10,4), 2) filtrační papír namočený v anodovém pufru 2 (30 mM Tris-HCl, 20% methanol, pH 10,4), 3) PVDF membrána aktivovaná v methanolu a uvedená do rovnováhy v anodovém pufru 2, 4) Tricine gel, 5) dva filtrační papíry namočené v katodovém pufru (25 mM Tris-HCl, 40 mM kyselina ε-amino-nkapronová, 20% methanol, pH 9,4), 6) katodová deska. Přenos byl proveden během 35 minut při 180 mA.

Potom byla PVDF membrána barvena v 0,1% Coomassioe Blue Serva R-250, 50% methanolu po dobu 5 minut, byla odbarvena 50% methanolem, 10% kyselinou octovou, byla důkladně promyta destilovanou vodou a byla sušena vzduchem. Charakteristické proužky tráveného autoantigenu o 10 kDa, 14 kDa, 16 kDA a 25 kDa byly pečlivě vystřiženy a bylo provedeno první sekvencování na N konci.

-9CZ 291662 B6

1.6. Edmanova degradace (Podle Edman a Henschen: Needleman, S.B., Protein Sequence Determination, SpringerVerlag, Berlin, 1975,232-279).

Sekvencování za použití Applied Biosystems 4778 - Sequenator vedlo k zisku tří aminokyselinových sekvencí, které byly srovnávány se Swiss Prot 31 databází (pomocí PC/GENES, IntellieGenetics). Z tohoto srovnání mohlo být s minimálním nesouladem provedeno přiřazení tří fragmentů k lidské tkáňové transglutamináze (ťTG, EC 2.3.2.13, protein glutamin γ-glutamyltransferáza). Důkazy jsou uvedeny pomocí ,jednopísmeného kódu“; X znamená neidentifikováno:

t-Transglutamináza: 28'-REKLVVRRGQPWF kDa fragment: REKLFVVRRGQPF (S) t-Transglutamináza: 581 '-DLYLENPEIKIRILG kDa fragment: DLYLENPEIXIXILG t-Transglutamináza: 438-DITHTYKYPE kDa fragment: DITLTYQYP (V)

Žádná nejednoznačná sekvence nemohla být přiřazena k 25 kDA fragmentu, protože tento fragment byl peptidovou směsí.

Příklad 2 - Potvrzení tkáňové transglutaminázy (ťTG) jako autoantigenu u sprue

2.1. Imunoprecipitace morčecí tTG

Protože je komerčně dostupná a má homologii sekvence (>80%) s lidskou tTG, byla tTG z jater morčat (Sigma) nejprve separována gelovou elektroforesou, pro ověření její čistoty. Kromě dalších několika jiných proteinů představuje tTG, s přibližně 50%, jeden z hlavních proužků.

Ačkoliv se lidská tTG mající 687 aminokyselin liší od morčecího proteinu majícího 690 aminokyselin pouze mírně, vykazují tyto dva proteiny značně odlišné migrační charakteristiky v SDS polyakrylamidovém gelu. Zatímco protein zvířecího původu se objeví v 75 - 80 kDa, jak je očekáváno, lidský protein má významně pomalejší migraci odpovídající molekulové hmotnosti 85 kDa, jak je popsáno v literatuře (Gentile, V. et al., J. Biol. Chem. 1991,266: 478 - 483), i přes zjevně chybějící N-glykosylaci.

Reaktivita lidské autoprotilátky ze séra pacientů se sprue s morčecí tTG byla testována v imunoprecipitačním testu. V tomto testu se 4 pg tTG (Sigma) v 500 μΐ lyzačního pufru a 0,5% hovězí sérovým albumin třepaly při 4°C přes noc slgA od pacientů se sprue navázaným na 4B Sepharosu, promyly se, uvedly se do varu v SDS testovacím pufru za redukčních podmínek a separovaly se na 10% polyakiylamidovém gelu (cf., 4.1.2). Zde se vyskytovalo specifické vysrážení očekávaného proužku (m.h. 80 kDa), ale žádné vysrážení kontaminujících složek.

2.2. Potvrzení tTG jako autoantigenu ve Western bot testu

Po separaci 2 pg morčecí tTG na SDS gelu a po přenosu do nitrocelulózy byla skvrna blokována v PVS, 2% nízkotučném odstředěném mléčném prášku, 0,3% Tween 20, pH 7,3, při 4 °C přes noc. Potom následovala 1 hodinová inkubace se sérem od pacientů se sprue (1/200) ve stejném pufru, tři kroky promytí a jednohodinová inkubace s králičími protilátkami proti lidskému IgA s navázanou alkalickou fosfatázou (1/500). Skvrny byly promyty v PBS a vyvíjely se v nitro Blue

-10CZ 291662 B6

Tetrazolium a 5-brom-4-chlor-3-indolylfosfatu jako substrátu (Blake, M.S. et al., Anal. Biochem. 1984,136: 175- 179).

- 80 kDa proužek dával jednoznačně pozitivní signál se sérem od pacientů se sprue, což je dalším důkazem, že sérum pacientů se sprue obsahuje protilátky třídy IgA proti tTG, zatímco kontrolní séra nedávala jakýkoliv signál.

2.3. Potvrzení tTG jako endomysiálního autoantigenu pomocí nepřímé fluorescence

Tkáňové řezy z jícnu od primátů (Euroimmun, Germany) byly použity v nepřímé detekci IgA protilátek proti endomysiu v séru od pacientů se sprue a při průkazu jejich inhibice tTG. Po preinkubaci 10 μΐ séra od pacientů ředěného 1/320 v PBS s 0,5 nebo 10 pg tTG od morčat (Sigma) a 10 pg BSA (Sigma) po dobu 1 hodiny při pokojové teplotě byla jejich inkubace s uvedenými řezy jícnu provedena po dobu 1 hodiny při pokojové teplotě ve zvlhčené atmosféře. Sérum od pacientů se sprue (1/320) a sérum od zdravých jedinců (1/50) byly použity jako pozitivní a negativní kontrola, v příslušném pořadí. Po trojím promytí řezů vPBS/0,2% BSA a sušení vzduchem byla provedena detekce autoantigenu TRITC-značenou králičí protilátkou proti lidskému IgA (Dianova), která byla ředěna 1/50 v PBS, po dobu 1 hodiny při pokojové teplotě. Nadbytek protilátky byl odstraněn postupným promytím PBS/0,2% BSA, PBS a destilovanou vodou.

Sérum od pacientů vykazovalo jasné barvení ECM protilátkami třídy IgA, kde toto barvení bylo inkubováno přidáním stoupajících koncentrací tTG, ale nikoliv pre-inkubací s BSA. Kontroly používající séra od zdravých jedinců nevykazovaly jakékoliv barvení řezů jícnu.

Příkiad 3 - Vývoj ELISA specifického pro sprue s IgA protilátkami pro diagnostiku a sledování sprue pg morčecí transglutaminázy (Sigma T-5398) a 100 pl PBS bylo pipetou vneseno do každé jamky polystyrénových mikroploten (Greiner Labortechnik, 96 jamek) a byla provedena inkubace po dobu 2 hodin při 37 °C za mírného rotačního pobytu. Nenavázaná tTG byla odstraněna promytím v PBS (3 x 200 pl) a volná vazebná místa v jamkách byla blokována 1% hovězím sérovým albuminem (Sigma) ve 250 pl PBS při 4 °C přes noc. Po promytí PBS (0,1% Tween 20 (3 x 200 pl) byly jamky inkubovány s postupnými ředěními séra v PBS/0,1% Tween 20 (100 pl) po dobu hodiny při pokojové teplotě za mírného rotačního pohybu, byly promyty PBS/0,1% Tween 20 (3 x 200 pl) a potom byla provedena inkubace s králičí protilátkou proti lidskému IgA konjugovanou s peroxidázou (Dianova) (1/400 ve 100 pl PBS/Tween 20) po dobu 1 hodiny při pokojové teplotě. Po promytí PBS (3—krát) byla proveden 30 minutová inkubace při pokojové teplotě ve tmě, pomocí 200 pl 0,1 M citratového pufru, 17,6 mM H2O2, 5,5 mM o-fenylendiaminhydrochloridu (Sigma), pH 4,2 a následná detekce vytvořeného zabarvení v ELISA čtečce (MRX, Dynatech Lagboratories) při 450 nm.

sér od pacientů se sprue bylo testováno přes a po léčbě bezlepkovou dietou, tj. v aktivní a neaktivní fázi onemocnění. Bylo zjištěno, že test je vysoce senzitivní, s dobrou korelací s hodnotami aktivní fáze sprue. Terapeutický úspěch jako výsledek dodržování diety se odrazil ve snížení IgA protilátek proti tTG. Vysoká senzitivita byla zřejmá při nízké extinkci (základní hladiny) kontrolních sér od zdravých jedinců, od pacientů s olitis ulcerosa, jatemí cirhózou, různými nádory, Sjogrenovým syndromem atd. (obr. 3).

-11 CZ 291662 B6

3.2. Vývoj ELISA využívajícího protilátky jiných tříd pro diagnostiku a sledování sprue, například s protilátkami IgG

Protože asi 2 % pacientů se sprue má deficit IgA, byla séra testována na senzitivitu a specificitu IgG protilátek proti tTG. ELISA test byl proveden stejným způsobem jako v 3.1., pouze protilátka proti lidskému IgA s navázanou peroxidázou (Dianova) byla nahrazena protilátkou proti lidskému IgG (Dianova). S ohledem na jejich senzitivitu odpovídaly hodnoty od pacientů se sprue přes a po bezlepkové dietě hodnotám získaným při použití IgA protilátek.

Některá z kontrolních sér vykazovala mírně zvýšené hodnoty, což odpovídá dřívějším zjištěním, že specificita protilátek proti endomysiu je redukována v nepřímé imunofluorescenci třídy IgG (obr. 4).

3.3. Vývoj ELISA testu pro diagnostiku a sledování jiných onemocnění spojených s imunitní reakcí proti tTG, například s protilátkami třídy IgG

ELISA test byl proveden stejným způsobem jako v 3.2.

Séra od pacientů s chronickými zánětlivými nebo autoimunitními onemocněními (Colitis ulcerosa (C.U.), Crohnova nemoc, akutní autoimunitní hepatitida) vykazovala mírně až středně zvýšené hodnoty.

Tak je pomocí IgG specifického ELISA testu pro autoprotilátky proti tTG možná diagnostika a kontrola terapie u pacientů trpících chorobami spojenými s imunitní reakcí proti tTG.

Příklad 4 - Nová funkce tkáňové transglutaminázy (tTG) v zkřížené vazbě gliadinu

Ačkoliv je pro reakci katalyzované tTG dostupné široké spektrum akceptorů acylové skupiny, pouze několik molekul může působit jako donor acylové skupiny. V in vitro pokusu může být stanovena tTG zprostředkovaná inkorporace radioaktivně značeného putresceinu do gliadinu a tak funkce gliadinu jako donorového substrátu tTG. Ve 160 μΐ pufru (0,1 M Tris-HCl, 150 mM NaCl, 5 mM CaCl₂, pH 7,5) byly 1 pg substrátu (gliadinu nebo kontrolních proteinů jako je albumin), 2 pCi (³H)-putrescienu a 1 pg tTG (z morčat, Sigma) inkubovány po dobu 2 hodin při 37 °C. Reakce byla ukončena přidáním 100 pL 50% kyseliny trichloroctové (TCA) a proteiny byly sráženy při 4 °C přes noc. Po centrifugaci byly pelety promyty 10% TCA, byly rozpuštěny v SDS testovacím pufru a scintilačním odečítání. Zatímco žádné inkorporace putrasceinu nemohla být určena u kontrol, vykazoval gliadin jasnou inkorporaci (³H)-putresceinu jak při scintilačním odečtu, tak v SDS-PAE, což je důkazem, že gliadin je výborným substrátem pro tTG.

Zkratky:

Ab: protilátka

APAAP: alkalická fosfatáza anti-alkalická fosfatáza BSA: hovězí sérový albumin cm: centimetr

DMEM: Dulbeccovo modifikované Eagle médium

EC:	enzymové zpracování
ELISA:	enzymově vázaný imunosorbentní test
ECM:	extracelulámí matrix
FCS:	fetální telecí sérum
h:	hodina
H₂O₂:	peroxid vodíku
HLA:	lidské lymfocytámí antigeny

- 12CZ 291662 B6

IEL:	intraepitelové lymfocyty
Ig^;	imunoglobulin
kDa M:	kilodalton mol
mA:	miliampér
MHC:	hlavní histokompatibilní komplex
min:	minuta
mM:	milimol
M_r:	relativní molekulová hmotnost
Pg:	mikrogram
μΐ:	mikrolitr
PAGE:	polyakiylamidová gelová elektroforesa
PBS:	fosfátový pufr
PLA₂:	fosfolipáza A₂
PVDF:	polyvinylidendifluorid
SDS:	dodecyl síran sodný
TCA:	kyselina trichloroctová
TGF:	transformující růstový faktor
Tris:	Tris(hydroxymethyl)aminomethan
tTG:	tkáňová transglutamináza

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims

1. Způsob diagnostiky a kontroly léčení sprue nebo celiakie, vyznačující se tím, že se v tělesných kapalinách detekují imunoreakcí s tkáňovou transglutaminázou, tTG, nebo jejími imunoreaktivními sekvencemi nebo analogy protilátky proti tTG.

2. Způsob podle nároku 1,vyznačující se tím, že se detekují lidské IgA a/nebo IgG protilátky.

3. Způsob podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že tTG je lidského, zvířecího, syntetického nebo rekombinantního původu.

4. Způsob podle jakéhokoliv z nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že detekce se provádí pomocí známého imunotestu, výhodně s přímým nebo nepřímým navázáním jednoho reaktantu na dobře detekovatelnou značící substanci.

5. Způsob podle nároku 4, vyznačující se tím, že se detekce provádí na pevné fázi.

6. Způsob podle nároku 4, vyznačující se tím, že se detekce provádí pomocí ELISA, RIA nebo imunofluorescenčního testu.

7. Použití tTG nebo jejích imunoreaktivních sekvencí nebo analogů při diagnostice a kontrole léčení sprue nebo celiakie a jiných autoimunitních chorob.

8. Orální farmaceutický prostředek pro léčení sprue nebo celiakie, vyznačující se tím, že obsahuje tTG nebo její imunoreaktivní sekvence nebo analogy a popřípadě farmaceuticky přijatelná pomocná činidla.

9. Použití tTG nebo jej ích imunoreaktivních sekvencí nebo analogů pro výrobu orálního farmaceutického prostředku pro léčení sprue nebo celiakie.