DE69230502T3

DE69230502T3 - Synthese von humanen prokollagenen und kollagenen in rekombinanten dna-systemen

Info

Publication number: DE69230502T3
Application number: DE69230502T
Authority: DE
Inventors: Darwin J. Philadelphia PROCKOP; Leena Ala-Kokko; Andrzej Philadelphia FERTALA; Aleksander Philadelphia SIERON; Kari I. Kivirikko; Amy Philadelphia GEDDIS; Taina A. Pihlajaniemi
Original assignee: Thomas Jefferson University; Fibrogen Inc
Current assignee: Thomas Jefferson University; Fibrogen Inc
Priority date: 1991-10-23
Filing date: 1992-10-22
Publication date: 2006-05-24
Anticipated expiration: 2012-10-23
Also published as: GR3033022T3; JPH07501939A; EP0962529A1; EP0625048B2; EP0625048A4; DK0625048T4; AU4441497A; ES2143478T3; AU680606B2; DE69230502D1; JP3302017B2; US5405757A; DE69230502T2; CA2121698C; ATE188253T1; DK0625048T3; ES2143478T5; CA2121698A1; HK1010334A1; JP2002255999A

Description

RECHTE DER REGIERUNG
Die vorliegende Erfindung wurde im Zusammenhang von Forschungen bereitgestellt, die zum Teil durch die NIH-Zuschüsse AR38188 und AR39740 unterstützt wurden. Die Regierung kann an dieser Erfindung bestimmte Rechte besitzen.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die Expression vieler exogener Gene wird in einfacher Weise in einer Vielzahl rekombinanter Wirt-Vektorsysteme erhalten, welche jedoch schwierig zu erhalten ist, falls das Protein normalerweise eine extensive posttranslationale Prozessierung erfordert. Dies ist der wahrscheinliche Grund, daß die Expression in einem vollständig rekombinanten System bei keinem der fibrillären Hauptkollagene, welche die Prozessierung durch posttranslationale Enzyme erfordern, berichtet wurde; siehe Prockop und Kivirikko, N. Engl. J. Med. 1984, 311, 376–386. Die Prolyl-4-hydroxylase ist wahrscheinlich eines der wichtigsten posttranslationalen Enzyme, welches für die Synthese von Prokollagen oder Kollagen durch Zellen benötigt wird, da es erforderlich ist, um Prolylreste in der Y-Position der sich wiederholenden -Gly-X-Y-Sequenzen zu 4-Hydroxyprolin zu hydroxylieren; Prockop und Kivirikko, N. Engl. J. Med. 1984, 311, 376–386. Solange nicht eine geeignete Anzahl von Y-Position-Prolylresten zu 4-Hydroxyprolin durch die Prolyl-4-hydroxylase hydroxyliert sind, können die neu synthetisierten Ketten nicht in eine dreifach-helikale Konformation bei 37°C falten. Falls die Hydroxylierung nicht stattfindet, verbleiben die Polypeptide nicht-helikal, werden schlecht von den Zellen sekretiert und können sich nicht selbst zu Kollagenfibrillen zusammenlagern. Kürzlich wurde die Prolyl-4-hydroxylase im Baculovirus exprimiert; Vuorio, K. et al., Proceedings of the National Academy of Science U.S.A., 1992, 89, 7467–7470.
Schnieke et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1987, 84, 8869–8873, und Lee et al., J. Biol. Chem. 1989, 264, 20683–20687, beschreiben Rettungsexperimente bzw. Rescue-Experimente in zwei unterschiedlichen Systemen, die nur eine der zwei Ketten für Typ I-Prokollagen synthetisierten. Schnieke et al. berichteten, daß ein Gen für die humane fibrilläre Kollagen-proα1(I)-Kette, das COL1A1-Gen, in Mausfibroblasten exprimiert werden kann und daß die Ketten verwendet werden, um Moleküle vom Typ I-Prokollagen, dem Vorläufer des Typ I-Kollagens, aufzubauen. Jedoch stammen in diesem System die Proα2(I)-Ketten, die in demselben Molekül gefunden werden, von der Maus. Im System von Lee et al. stammen die Proα1(I)-Ketten von der Ratte. Daher wurde die Synthese eines Prokollagenmoleküls, in welchem alle drei Ketten von einem exogenen Gen stammen, weder bei Schnieke et al. noch bei Lee et al. erhalten.
Das Ausbleiben des Erhaltens der Expression von Genen fibrillärer Kollagene in einem vollständig rekombinanten System hat Versuche behindert, die normalen Struktur-Funktionsbeziehungen der Proteine zu untersuchen und die Wirkungen von Mutationen zu untersuchen. Insbesondere sind kürzlich Mutationen im Gen für Typ II-Prokollagen mit dem Auslösen mehrerer humaner Krankheiten in Verbindung gebracht worden, Anderson et al., Am. J. Hum. Genet. 1990, 46, 896–901, Tiller et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1990, 87, 3889–3893, Vissing et al., J. Biol. Chem. 1990, 264, 18265–18267, Lee et al., Science 1989, 244, 978–980, Francomano et al., Genomics, 1987, 1, 293–296, Knowlton et al., Am. J. Hum. Genet. 1989, 45, 681-688; Ahmad et al., Am. J. Hum. Genet. 1990, 47, A206, Palotie et al., The Lancet 1989, I, 924–927, Knowlton et al., N. Engt J. Med. 1990, 322, 526–530, Ala-Kokko et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1990, 87, 6565–6568, da aber geeignete Zahlen humaner Knorpelzellen schwer erhältlich sind und da humane Chondrozyten leicht ihren Phänotyp in Kultur verlieren, Elima und Vuorio, FEBS Lett. 1989, 258, 195–198, Aulthouse et al., In Vitro Dev. Biol. 1989, 25, 659–668, hat sich der kausale Zusammenhang zwischen einer Mutation im Gen und der biologischen Funktion des Proteins als schwer faßbar herausgestellt.
Auch ist es durch das Ausbleiben des Erhaltens der Expression von Genen für humane fibrilläre Kollagene unmöglich, humane fibrilläre Prokollagene und Kollagene herzustellen, die eine Anzahl therapeutischer Verwendungen beim Menschen aufweisen, und die nicht die unerwünschten Immunantworten hervorrufen, welchen bei der Verwendung von Kollagen aus tierischen Quellen begegnet worden ist.
Kürzlich jedoch beschrieben Anmelder die Expression eines humanen Typ II-Prokollagens in Maus-3T3-Zellen unter Verwendung eines Promotors des humanen Typ I-Prokollagen-Gens; Ala-Kokko et al., J. Biol. Chem., 1991, 266, 14175, Ala-Kokko et al., Matrix 1990, 10, 234.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft die Herstellung von Genkonstrukten, die Kollagen-Gene humanen Ursprungs enthalten. Eines der Genkonstrukte ist ein Hybrid aus einem humanen Gen für Typ I-Prokollagen (COL1A1) und einem humanen Gen für Typ II-Prokollagen (COL2A1). Das 5'-Ende des Konstrukts enthält den Promotor, Exon 1 und Intron 1 des COL1A1-Gens, das mit Intron 1 des COL2A1-Gens verbunden ist. Das Konstrukt ist derart ausgestaltet, daß der Promotor und der angenommene bzw. mögliche Enhancer im ersten Intron von COL1A1 die Expression des COL2A1-Gens antreiben und die Herstellung von humanem Typ II-Prokollagen bewirken. Das COL2A1-Gen besteht aus zwei Sphl/Sphl-Fragmenten des Gens mit insgesamt etwa 26.000 Basenpaaren. Dieses Konstrukt enthält alle kodierenden Sequenzen des Gens, außer der wenigen Kodons eines Signalpeptids in Exon 1 und einem alternativ gespleißten Exon, das Exon 1 folgt. Einige Versionen des Konstrukts schließen auch ein Sphl/Sphl-Fragment von 3.500 Basenpaaren vom 3'-Ende des Gens ein, das zur korrekten Polyadenylierung der mRNA benötigt wird.
Ein zweites Konstrukt enthält den Promotor, das erste Exon, das Intron und etwa die Hälfte des zweiten Exons des humanen COL1A1-Gens als 5'-Fragment des Konstrukts. Das 5'-Fragment wird durch eine einzelne Kpnl-Restriktionsendonukleasenspaltstelle mit einer cDNA verbunden, welche alle kodierenden Sequenzen des Gens enthält, außer denjenigen, die in den ersten eineinhalb Exons enthalten sind. Zusätzlich ist das 3'-Ende der cDNA über eine EcoRI-Spaltstelle mit einem EcoRI/EcoRI-Fragment von etwa 0,5 kB vom 3'-Ende des COL1A1-Gens verbunden. Eine Reihe zusätzlicher Konstrukte verwendet den hochwirksamen Promotor des Cytomegalievirus, um die Expression von cDNA vollständiger Länge für das humane COL1A1-Gen anzutreiben. Alle Konstrukte sind derart konstruiert worden, daß sie einzelne Restriktionsendonukleasespaltstellen an ihren 5'- und 3'-Enden aufweisen und daher aus Vektorsequenzen ausgeschnitten werden können.
Die vorliegende Erfindung umfaßt die Transfektion und Expression von Kollagen-Genkonstrukten in ausgewählten Zellen. Die Prolyl-4-hydroxylase ist ein für die Biosynthese von Prokollagenen und Kollagenen wichtiges posttranslationales Enzym. Das Enzym muß etwa 100 Prolylreste in der Y-Position der sich wiederholenden -Gly-X-Y-Tripeptidstrukturen von Prokollagenen und Kollagenen zu 4-Hydroxyprolin hydroxylieren, damit die Prokollagene oder Kollagene in eine stabile dreifach-helikale Konformation bei Körpertemperatur des das Protein synthetisierenden Organismus falten. Gemäß einem Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zum Synthetisieren von Prokollagen oder Kollagen in rekombinanten Wirtszellen bereitgestellt, umfassend das Transfizieren mindestens eines humanen Prokollagen- oder mindestens eines humanen Kollagen-Gens in Wirtszellen, und das Transfizieren mindestens eines Gens, das für das posttranslationale Enzym Prolyl-4-hydroxylase kodiert, in die Wirtszellen. Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird eine rekombinante Wirtszelle bereitgestellt, umfassend mindestens ein transfiziertes humanes Prokollagen- oder mindestens ein transfiziertes humanes Kollagen-Gen und mindestens ein transfiziertes Gen, das für das posttranslationale Enzym Prolyl-4-hydroxylase kodiert. Die Erfindung kann auch andere Zellen verwenden, die kultiviert werden können und die notwendigen posttranslationalen Enzyme und sekretorischen Mechanismen enthalten, wie Ovarienzellen des chinesischen Hamsters.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist eine photographische Aufnahme, welche die Analyse durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese in SDS der Proteine zeigt, die in Medium von HT-1080-Zellen sekretiert wurden, welche mit einem Genkonstrukt, enthaltend den Promotor, erstes Exon und das meiste des ersten Introns des humanen COL1A1-Gens, verbunden mit dem 30 kb-Fragment, welches das gesamte COL2A1, außer den ersten zwei Exons enthält, transfiziert waren. Die Zellen wurden mit [¹⁴C]-Prolin inkubiert, so daß die Mediumproteine durch Autoradiographie analysiert werden konnten (Speicherungsphosphorfilmanalysegerät). Spur 1 zeigt, daß die nicht-gereinigten Mediumproteine drei Hauptpolypeptidketten aufweisen. Die oberen zwei sind die Proα1(IV)- und Proα2(IV)-Ketten von Typ IV-Kollagen, die von Zellen synthetisiert werden, welche nicht mit dem Konstrukt transfiziert wurden (nicht gezeigt). Die dritte Bande sind die Proα1(II)-Ketten des humanen Typ II-Prokollagens, das mit Hilfe des Konstrukts synthetisiert wurde. Die Spuren 2 und 3 zeigen das gleiche Mediumprotein nach der Chromatographie des Mediums über eine Ionenaustauschersäule (DE-52, Whatman, bei pH 7,4 in Spur 2 und bei pH 7,0 in Spur 3). Das Typ II-Prokollagen erschien im Ausschlußvolumen der Ionenaustauschersäule.
2 ist eine photographische Aufnahme, die zeigt, daß das von Zellen in das Medium sekretierte, in 1 beschriebene Typ II-Prokollagen in eine korrekte native Konformation gefaltet wurde. Die Mediumproteine wurden bei den angegebenen Temperaturen mit einer hohen Konzentration an Trypsin und Chymotrypsin unter Bedingungen verdaut, bei welchen korrekt gefaltetes dreifachhelikales Prokollagen oder Kollagen der Verdauung widersteht, ungefaltetes oder nicht korrekt gefaltetes Prokollagen oder Kollagen aber zu kleinen Fragmenten verdaut wird (Bruckner und Prockop, Anal. Biochemistry 1981, 110, 360). Die Produkte des Verdaus wurden dann durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese in SDS und Fluorographie analysiert. Die Ergebnisse zeigen, daß das Typ II-Prokollagen der Verdauung bis zu 43°C, der normalen Temperatur, bei welcher Typ II-Prokollagen sich entfaltet, widersteht. Daher ist das Typ II-Prokollagen korrekt gefaltet und kann verwendet werden, um Kollagenfibrillen zu erzeugen.
3 ist eine photographische Aufnahme, welche die Analyse von Medium von HT-1080-Zellen zeigt, die mit einem Gen für COL1A1 und einem Gen für COL1A2 co-transfiziert waren. Das COL1A2 war mit einem wirksamen Neomycin-Resistenzgen verbunden, das COL1A1 war es hingegen nicht. Die Zellen wurden hinsichtlich der Expression des COL1A2-Neomycin-Resistenzgen-Konstrukts mit dem Neomycin-Analog G418 gescreent. Das Medium wurde hinsichtlich der Expression von COL1A1 durch Western-Blotting mit einem für die humane Proα1(I)-Kette spezifischen polyklonalen Antikörper analysiert. Spur 1 zeigt, daß die Mediumproteine Proα(I)-Ketten enthielten. Spur 2 ist ein zuverlässiger Standard für Typ I-Prokollagen, der Proα1(I)-Ketten und teilweise prozessierte pCα1(I)-Ketten enthält. Die Ergebnisse zeigen, daß die Zellen Prokollagen vom humanen Typ synthetisierten, welches Proα1(I)-Ketten, wahrscheinlich in Form des normalen Heterotrimers mit der Zusammensetzung aus zwei Proα(I)-Ketten und einer Proα2(I)-Kette, enthielt.
4 ist eine schematische Darstellung der cDNA für die Proα1(I)-Kette des humanen Typ I-Prokollagens, das modifiziert worden ist, um künstliche Stellen für die Spaltung durch spezifische Restriktionsendonukleasen zu enthalten.
5 ist eine photographische Aufnahme, welche die Analyse durch nicht-denaturierende 7,5% Polyacrylamid-Gelelektrophorese (Spuren 1 bis 3) und 10% Polyacrylamid-Gelelektrophorese in SDS (Spuren 4 bis 6) von gereinigter Prolyl-4-hydroxylase aus Huhn (Spuren 1 und 4) und den Proteinen zeigt, die von Sf9-Zellen in das Medium sekretiert wurden, welche das Gen für die α-Untereinheit und die β-Untereinheit der humanen Prolyl-4-hydroxylase exprimieren und mit dem α58/β-Virus (Spuren 2 und 5) oder mit dem α59/β-Virus (Spuren 3 und 6) infiziert wurden. α58/β und α59/β unterscheiden sich durch eine Kette von 64 Basenpaaren. Die Spuren 1 bis 3 weisen Proteine auf, die unter nicht-denaturierenden Bedingungen getrennt wurden und zeigen Tetramere der zwei Arten von Untereinheiten. Die Spuren 4 bis 6 weisen die gleichen Proben auf, die unter denaturierenden Bedingungen getrennt wurden, so daß die zwei Untereinheiten als getrennte Banden erscheinen.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Es ist festgestellt worden, daß die meisten Formen von Osteogenesis imperfecta (01) von dominanten Mutationen in einem der zwei Gene für Typ I-Prokollagen hervorgerufen werden. Ebenso wird mindestens eine Untergruppe der Osteoporose nach der Menopause von ähnlichen Mutationen in den zwei Genen für Typ I-Prokollagen hervorgerufen. Des weiteren ist berichtet worden, daß Mutationen im Typ II-Prokollagen-Gen humane Krankheiten wie Chondrodysplasie und eine Untergruppe primärer allgemeiner Osteoarthritis hervorrufen. Weiter ist berichtet worden, daß Mutationen im Typ III-Prokollagen-Gen (COL3A1) humane Krankheiten wie eine tödliche Variante des Ehlers-Danlos-Syndroms (Typ IV) und familiäre Aneurysmen hervorrufen. Darüber hinaus ist gezeigt worden, daß die als Alport-Syndrom bekannte Nierenkrankheit von Mutationen in einem der Gene (COL4A5) für Typ IV-Kollagen hervorgerufen wird. Ferner ist gezeigt worden, daß Injektionen von Kollagenfasersuspensionen bei der Behandlung kosmetischer Fehler sowie der physikalischen Schwäche von Geweben wie dem Schließmuskel wirksam sind.
Die vorliegende Erfindung betrifft eine rekombinante Wirtszelle, umfassend mindestens ein transfiziertes humanes Prokollagen- oder mindestens ein transfiziertes humanes Kollagen-Gen und mindestens ein transfiziertes Gen, das für das posttranslationale Enzym Prolyl-4-hydroxylase kodiert. Außerdem betrifft die vorliegende Erfindung die Expression von Typ I-, II- und III-Prokollagenen und des posttranslationalen Enzyms Prolyl-4-hydroxylase in einer Säugerzellinie, einer Insektenzellinie oder einer Hefezellinie und die Bereitstellung transfizierter Zellinien, welche diese Prokollagen-Gene umfassen.
Die Genkonstrukte können verwendet werden, um humane fibrilläre Prokollagene in der humanen Tumorzellinie HT-1080 zu synthetisieren. Diese humane Zelllinie ist eine bequeme Quelle für Typ IV-Kollagen, dem Hauptkollagen der Basilarmembranen, gewesen. Da Typ IV-Kollagen kein Fibrillen formendes Prokollagen oder Kollagen ist, kann es leicht durch ein einfaches chromatographisches Verfahren von jedem fibrillären Prokollagen getrennt werden. Daher stellt die Erfindung Verfahren bereit, woduch ein humanes fibrilläres Prokollagen leicht von Produkten eines endogenen Kollagen-Gens getrennt werden kann. Darüber hinaus wachsen HT-1080-Zellen in Kultur extrem schnell und können für lange Zeitspannen gehalten werden.
Außerdem stellt die vorliegende Erfindung ein einzelnes Prokollagen- oder Kollagen-Gen oder eine Anzahl verschiedener Prokollagen- oder Kollagen-Gene bereit, die in einer Zelle zusammen mit dem postranslationalen Enzym Prolyl-4-hydroxylase transfiziert und exprimiert werden. Weiter wird beabsichtigt, daß ein oder mehrere Kopien eines einzelnen Prokollagen- oder Kollagen-Gens oder der Anzahl verschiedener solcher Gene in Zellen transfiziert und exprimiert werden können. Die vorliegende Erfindung stellt bereit, daß diese Zellen transfiziert werden können, so daß sie mindestens ein humanes Prokollagen-Gen, insbesondere das COL1A1-Gen, aber nicht darauf beschränkt, exprimieren, welches für die Proα1(I)-Prokollagenkette des humanen Typ I-Prokollagens kodiert. Es wird auch bereitgestellt, daß die Zellen sowohl mit COL1A1- als auch COL1A2-Genen transfiziert werden und diese exprimieren können, so daß sowohl Proα2(I)- und Proα1(I)-Ketten gleichzeitig synthetisiert werden und sich zu normalen heterotrimeren Molekülen des Typ I-Prokollagens zusammenlagern. Darüber hinaus stellt die Erfindung bereit, daß die Zellen mit dem COL2A1-Gen, das für die Proα1(II)-Kette des humanen Typ II-Prokollagens kodiert, transfiziert werden können und dieses exprimieren. Es wird weiter bereitgestellt, daß die Zellen mit dem COL3A1-Gen, daß für die Proα1(III)-Kette des Typs III-Prokollagens kodiert, transfiziert werden können und dieses exprimieren. Die Erfindung stellt auch bereit, daß jedes Prokollagen- oder Kollagen-Gen, das in Zellen transfiziert und exprimiert wird, ein variantes Gen umfassen kann. Solch ein variantes Gen kann eine Mutation einschließen, die einzelne Restriktionsspaltstellen zur Spaltung des hybriden Gens bereitstellt. In einigen bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung verändern Mutationen, die eine oder mehrere einzelne Restriktionsspaltstellen bereitstellen, die durch das Gen kodierte Aminosäuresequenz nicht, sondern stellen lediglich einzelne Restriktionsspaltstellen bereit, die zur Manipulation des Gens verwendbar sind. So wäre ein modifiziertes Gen aus einer Anzahl diskreter Bereiche, oder D-Bereiche, flankiert von einzelnen Restriktionsspaltstellen, aufgebaut. Diese diskreten Bereiche des Gens werden nachstehend als Kassetten bezeichnet. Beispielsweise sind die mit D1 bis D4.4 bezeichneten Kassetten in 4 gezeigt. Eine Vielzahl von Kopien einer Genkassette ist eine weitere Variante des vorliegenden Gens, welches von der vorliegenden Erfindung umfaßt wird. Rekombinante oder mutierte Gene oder Kassetten, die erwünschte Eigenschaften wie die Resistenz gegenüber endogenen Enzymen wie Kollagenase bereitstellen, werden auch von der vorliegenden Erfindung umfaßt. Des weiteren stellt die vorliegende Erfindung transfizierte Zellen bereit, von denen im wesentlichen alle andere Prokollagen- oder Kollagen-Gene, vorzugsweise, aber nicht beschränkt auf Typ I-, II-, III- Prokollagen-Gene oder Typ IV-Kollagen-Gene, umfassen. Die vorliegende Erfindung beabsichtigt, daß die transfizierten Zellen Säugerzellen wie humane Tumorzellen, insbesondere, aber nicht beschränkt auf HT-1080 Zellen, sein können. In anderen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind die transfizierten Zellen Insektenzellen wie Sf9-Baculovirus-Zellen. In anderen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind die transfizierten Zellen Hefezellen wie Saccharomyces cerevisiae- oder Pichia pastoris-Zellen. Gemäß der vorliegenden Erfindung werden die Zellen wie Säuger-Insekten- und Hefezellen, welche natürlicherweise keine ausreichenden Mengen posttranslationaler Enzyme erzeugen, mit mindestens einem Satz von Genen, die für das posttranslationale Enzym Prolyl-4-hydroxylase kodieren, transformiert.
Vorzugsweise umfassen im wesentlichen alle Zellen mindestens ein transfiziertes humanes Prokollagen- oder Kollagen-Gen mit mindestens einer Kette, welche von einem transfizierten Kollagen- oder Prokollagen-Gen oder -Genen abgeleitet ist, und mindestens einer Kette, welche von einem endogenen humanen oder nicht-humanen Prokollagen-Gen oder -Genen abgeleitet ist, anders als das Proα1(I)]₂Proα2(I)-Kollagenmolekül, das aus humanen Proα1(I)-Anteilen und nicht-humanen Proα2(I)-Anteilen oder nicht-humanen Proα1(I)-Anteilen und humanen Proα2(I)-Anteilen besteht.
Ein neues Merkmal der erfindungsgemäßen Verfahren ist, daß relativ große Menge von humanem fibrillärem Prokollagen in einem rekombinaten Zellkultursystem synthetisiert werden können, das kein anderes fibrilläres Prokollagen bildet. Systeme, die andere fibrilläre Prokollagene oder Kollagene bilden, sind wegen der extremen Schwierigkeit der Reinigung des Produktes endogener Gene für fibrilläres Prokollagen oder Kollagen von den rekombinanten Genprodukten unbrauchbar. Bei Verwendung der erfindungsgemäßen Verfahren ist die Reinigung von humanem Prokollagen stark vereinfacht. Darüber hinaus ist gezeigt worden, daß die Mengen an Protein, das durch die erfindungsgemäßen Verfahren synthetisiert wird, gegenüber anderen im Fachgebiet verwendeten Systemen groß sind.
Andere neue Merkmale der erfindungsgemäßen Verfahren sind, daß die synthetisierten Prokollagene korrekt gefaltete Proteine sind, so daß sie die normale dreifach-helikale Konformation aufweisen, die für Prokollagene und Kollagene kennzeichnend ist. Daher können die Prokollagene verwendet werden, um stabile Kollagenfibrillen und -fasern durch Spaltung der Prokollagene mit Proteasen zu erzeugen.
Die vorliegende Erfindung steht im Gegensatz zu Schnieke et al., die berichteten, daß ein Gen für die humane fibrilläre Prokollagen-Proα1(I)-Kette, das Col1A1-Gen, in Mausfibroblasten exprimiert werden kann und die Ketten zum Aufbau von Molekülen des Typ I-Prokollagens, dem Vorläufer des Typ I-Kollagens, verwendet werden. Jedoch stammen im System von Schnieke et al. die Proα2(I)-Ketten, welche im Molekül des Typ I-Prokollagens gefunden werden, von der Maus. Daher ist das synthetisierte Typ I-Prokollagen ein von Menschen und von der Maus stammendes Hybridmolekül. In ähnlicher Weise exprimierte das System von Lee et al. ein exogenes Proα2(I)-Gen, um Typ I-Prokollagen zu erzeugen, in welchem die Proα1(I)-Ketten von der Ratte stammten. Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zur Herstellung von Prokollagenen oder Kollagenen zur Verfügung, die einzig von transfizierten Prokollagen- und Kollagen-Genen abgeleitet sind, aber diese Verfahren sind nicht auf die Herstellung von Prokollagen und Kollagen, die einzig von transfizierten Genen abgeleitet sind, beschränkt.
Ein Vorteil der erfindungsgemäßen humanen Kollagene ist, daß diese Kollagene keine allergischen Reaktionen im Menschen hervorrufen. Darüber hinaus sollte das erfindungsgemäße, von Kulturzellen hergestellte Kolllagen von höherer Qualität als das Kollagen sein, das aus tierischen Quellen erhalten wird, und sollte größere und dichter gepackte Fasern bilden. Diese Proteine höherer Qualität sollten in Geweben Ablagerungen bilden, die wesentlich länger bestehen als die derzeitig im Handel erhältlichen Materialien. Es ist bekannt, daß bei Verwendung derzeitig verfügbarer Verfahren die meisten Injektionen von Kollagen für kosmetische Zwecke alle sechs Monate wiederholt werden müssen. Die humanen Proteine der vorliegenden Erfindung sollten nach der Injektion in humane Gewebe wesentlich länger bestehen.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Synthetisieren von Prokollagen oder Kollagen in rekombinanten Wirtszellen bereitgestellt, umfassend das Transfizieren mindestens eines humanen Prokollagen- oder mindestens eines humanen Kollagen-Gens in Wirtszellen, und das Transfizieren mindestens eines Gens, das für das posttranslationale Enzym Prolyl-4-hydroxylase kodiert, in die Wirtszellen.
Dieses Verfahren kann weiter Schritte des Züchtens der Zellen unter Bedingungen derart, daß die transfizierten Gene exprimiert werden, so daß Prokollagen und/oder Kollagen erzeugt wird und des Isolierens des Prokollagens und/oder Kollagens, die durch die transfizierten Prokollagen- oder Kollagen-Gene exprimiert werden, umfassen.
Gemäß noch einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird ein Verfahren zur Erzeugung einer rekombinanten Wirtszelle, die zur Herstellung von rekombinantem Prokollagen und/oder rekombinantem Kollagen verwendbar ist, bereitgestellt, umfassend das Transfizieren mindestens eines humanen Prokollagen- und/oder mindestens eines humanen Kollagen-Gens in Wirtszellen, das Transfizieren mindestens eines Gens, das für das posttranslationale Enzym Prolyl-4-hydroxylase kodiert, in die Wirtszellen.
Die Verfahren der vorliegenden Erfindung stellen eine praktikable Quelle eines humanen fibrillären Kollagens zur Verfügung, das den tierischen Kollagenen ähnlich ist, die bei Injektionen zum Entfernen kosmetischer Falten bzw. Unebenheiten und von kosmetischen Fehlern anderer Natur breit verwendet werden und die auch verwendet werden, um die Zugfähigkeit von Geweben wie dem Blasenschließmuskel bei der Behandlung urinärer Inkontinenz wiederherzustellen. Tierische Kollagene werden auch in Gemischen mit Keramiken und anderen Materialien verwendet, um Fehlstellen in Knochen zu füllen und das Knochenwachstum zu verstärken. Typ I-Kollagen aus tierischen Quellen ist gewerblich verwendet worden. Jedoch wird eine geeignete Quelle humanen Kollagens zur therapeutischen Verwendung immer noch dringend benötigt.
Humanes Typ II-Prokollagen, der Vorläufer des Hauptkolllagens des Knorpels, kann eine spezielle Verwendung bei der Reparatur von Knorpelschaden haben. Darüber hinaus wird modifiziertes humanes Typ I-Prokollagen, umfassend ein Proα1(I)-Trimer, das gemäß den Verfahren der vorliegenden Erfindung exprimiert wird, auch bereitgestellt. Ebenso wird Typ I-Prokollagen, umfassend zwei Proα1(I)- und eine Proα2(I)-Kette(n), die von transfizierten humanen Genen abgeleitet sind, bereitgestellt. Ebenso wird Typ III Prokollagen, umfassend drei Proα1(III)-Ketten, die von transfizierten humanen Genen abgeleitet sind, bereitgestellt. Außerdem werden spezifisch konstruierte Formen dieser Kollagene bereitgestellt.
Des weiteren werden Verfahren bereitgestellt, wobei mindestens eines der humanen Prokollagen-Gene ein variantes Gen ist. Außerdem stellt die vorliegende Erfindung Verfahren bereit, wobei im wesentlichen alle der Zellen, die mit mindestens einem Prokollagen-Gen transfiziert sind, Typ III- und andere Prokollagen-Gene umfassen. Des weiteren werden Verfahren bereitgestellt, wobei die transfizierten Zellen humane Tumorzellen, insbesondere HT-1080-Zellen aber nicht darauf beschränkt, sind. Es werden auch Verfahren bereitgestellt, wobei die transfizierten Zellen unabhängig voneinander im wesentlichen keine endogen abgeleiteten Kollagenmoleküle, endogen abgeleitete Typ I-Prokollagenmoleküle, endogen abgeleitete Typ II-Prokollagenmoleküle, endogen abgeleitete Typ III-Prokollagenmoleküle oder endogen abgeleitete Typ IV-Kollagenmoleküle umfassen. Es werden andere Verfahren bereitgestellt, wobei im wesentlichen alle der transfizierten Zellen mindestens ein transfiziertes humanes Prokollagen-Gen umfassen und andere Prokollagen- oder Kollagenmoleküle mit mindestens einer Kette, die von dem transfizierten Genen abgeleitet ist, exprimieren als das [proα1(I)]₂proα2(I)-Kollagen, das aus humanen Proα1(I)-Anteilen und nicht-humanen Proα2(I)-Anteilen oder nicht-humanen Proα1(I)-Anteilen und humanen Proα2(I)-Anteilen besteht. Es werden andere bevorzugte Verfahren bereitgestellt, wobei im wesentlichen alle transfizierten Zellen mindestens ein transfiziertes humanes Prokollagen-Gen umfassen und Prokollagenmoleküle mit drei Ketten exprimieren, die von dem bzw. den transfizierten Kollagen-Gen oder -Genen abgeleitet ist bzw. sind.
Die vorliegende Erfindung wird weiter durch die folgenden Beispiele erläutert, die in keiner Weise einschränkend sein sollen.
BEISPIELE
Beispiel 1 Synthese von humanem Typ II-Prokollagen
Ein rekombinantes COL1A1-Genkonstrukt, das in der vorliegenden Erfindung verwendet wurde, umfaßte ein Fragment des 5'-Endes von COL1A1 mit einem Promotor, Exon 1 und Intron 1, das mit den Exons 3 bis 54 eines COL2A1-Gens verbunden war. Das hybride Konstrukt wurde in HT-1080-Zellen transfiziert. Diese Zellen wurden mit einem Neomycin-Resistenzgen co-transfiziert und in Gegenwart des Neomycin-Analogs G418 gezüchtet. Das hybride Konstrukt wurde verwendet, um transfizierte Zellen zu erzeugen.
Es wurde eine Reihe von Klonen erhalten, welche die mRNA für humanes Typ II Prokollagen synthetisierten. Um die synthetisierten Proteine zu analysieren, wurden die Zellen mit [¹⁴C]-Prolin inkubiert, und die ¹⁴C-markierten Mediumproteine wurden durch Gelelektrophorese analysiert, siehe 1. Wie in Spur 1 gezeigt, enthielten die Mediumproteine das erwartete Typ II-Prokollagen, umfassend Proα1(II)-Ketten zusammen mit Proα1(IV) und Proα2(IV)-Ketten des Typ IV-Kollagens, das normalerweise von den Zellen synthetisiert wird. Wie in den Spuren 2 und 3 gezeigt, wurde das Typ II-Prokollagen in bequemer Weise mit einem einzelnen Schritt einer Ionenaustauschchromatographie gereinigt. Das in das Medium sekretierte Typ II-Prokollagen war anhand eines Protease-Wärmestabilitätstests korrekt gefaltet, siehe 2.
Beispiel 2 Synthese von humanem Typ I-Prokollagen
Gemäß einem zweiten Beispiel wurden HT-1080-Zellen mit einem COL1A1-Gen und einem COL1A2-Gen co-transfiziert. Beide Gene waren aus einem Cytomegalievirus-Promotor, verbunden mit einer vollständigen cDNA, zusammengesetzt. Das COL1A2-Genkonstrukt, nicht aber das COL1A1-Genkonstrukt, enthielt ein Neomycin-Resistenzgen. Die Zellen wurden hinsichtlich der Expression des COL1A2-Neomycin-Resistenzgen-Konstrukts durch Züchten in Gegenwart des Neomycin-Analogs G418 selektiert. Das Medium wurde dann hinsichtlich der Expression von COL1A1 mit einem für humane Proα1(I)-ketten spezifischen polyklonalen Antikörper untersucht. Die Ergebnisse (siehe 3) zeigten, daß die Zellen humanes Typ I-Prokollagen synthetisierten, das wahrscheinlich die normale heterotrimäre Struktur aus zwei Proα1(I)-Ketten und einer Proα2(I)-Kette aufwies.
Die Tabelle 1 zeigt eine Zusammenfassung der humane Prokollagen-Gene enthaltenden DNA-Konstrukte. Die Konstrukte waren aus diskreten Fragmenten der Gene oder cDNAs der Gene zusammen mit geeigneten Promotorfragmenten zusammengesetzt.
Beispiel 3 Zelltransfektionen
Für Zelltransfektionsexperimente wurde ein das Genkonstrukt enthaltender Cosmid-Plasmidklon mit einer Restriktionsendenuklease gespalten, um das Konstrukt aus dem Vektor freizusetzen. Es wurde ein Plasmidvektor, umfassend ein Neomycin-Resistenzgen, Law et al., Molec. Cell Biol. 1983, 3, 2110–2115, durch Spaltung mit BamHI linearisiert. Die zwei Proben wurden in einem Verhältnis von ungefähr 10:1, Genkonstrukt zu Neomycin-Resistenzgen, gemischt, und dann wurde das Gemisch für die Co-Transfektion von HT-1080-Zellen durch Calciumphosphat-Copräzipitation verwendet, Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Zweite Auflage (1989). Die DNA in der Calciumphosphatlösung wurde auf die kultivierten Zellen mit etwa 10μg chimärem Genkonstrukt pro einer 100 ml-Schale präkonfluenter Zellen gegeben. Die Zellen wurden in DMEM, enthaltend 10% Neugeborenenkälberserum, für 10 Stunden inkubiert. Die Proben wurden einem Glycerinschock durch Zugabe einer 15% Glycerinlösung für 3 Minuten unterworfen. Die Zellen wurden dann in DMEM-Medium, enthaltend Neugeborenenkälberserum, für 24 Stunden und dann in das gleiche Medium, enthaltend 430 μg/ml G418, überführt. Die Inkubation im G418 enthaltenden Medium wurde für etwa 4 Wochen mit einem Wechsel des Mediums an jedem dritten Tag fortgeführt. G418-resistente Zellen wurden entweder gesammelt, oder es wurden getrennte Klone durch Isolieren von Foci mit einem Kunststoffzylinder erhalten und subkultiviert.
Beispiel 4 Western-Blotting
Für den Test hinsichtlich der Expression des COL2A1-Gens wurden polyklonale Antikörper unter Verwendung eines synthetischen Peptids mit 23 Resten, das eine Aminosäuresequenz aufwies, welche sich im COOH-terminalen Telopeptid von Typ II-Kollagen befindet, in Kaninchen hergestellt, siehe Cheah et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1985, 82, 2555–2559. Der Antikörper reagierte anhand von Western-Blot-Analyse nicht mit Proα-Ketten von humanem Typ I-Prokollagen oder -Kollagen, humanem Typ II-Prokollagen oder -kollagen oder murinem Typ I-Prokollagen. Für den Test hinsichtlich der Expression der COL1A1-Gene wurden polyklonale Antikörper, die mit dem COOH-terminalen Polypeptid der Proα(I)-Kette reagierten, verwendet, siehe Olsen et al., J. Biol. Chem. 1991, 266, 1117–1121.
Das Kulturmedium von gesammelten Klonen oder einzelnen Klonen wurde entfernt und getrennt durch Hinzufügen von festem Ammoniumsulfat bis zu einer Sättigung von 30% präzipitiert, und die Präzipitate wurden durch Zentrifugation bei 14 000 x g gesammelt und dann gegen einen Puffer, enthaltend 0,15 M NaCl, 0,5 mM EDTA, 0,5 mM N-Ethylmaleinimid, 0,1 mM p-Aminobenzamidin und 50 mM Tris-HCl (pH 7,4 bei 4°C) dialysiert. Aliquote der Proben wurden auf 10°C für 5 Minuten in 1 % SDS, 50 mM DTT und 10% (v/v) Glycerin erhitzt und durch Elektrophorese in 6% Polyacrylamidgelen unter Verwendung eines Mini-Gel-Gerätes (Holford SE250, Holford Scientific), betrieben bei 125 V für 90 Minuten, getrennt. Die getrennten Proteine wurden aus dem Polyacrylamidgel bei 40V für 90 Minuten auf eine getragene Nitrozellulosemembran (Schleicher und Schuell) elektrotransferiert. Die transferierten Proteine wurden für 30 Minuten mit den polyklonalen Antikörpern bei einer Verdünnung von 1:500 (v/v) umgesetzt. Mit den Antikörpern reagierende Proteine wurden mit einem sekundären Anti-Kaninchen IgG Antikörper, gekoppelt mit alkalischer Phosphatase (Promega Biotech), für 30 Minuten detektiert. Die alkalische Phosphatase wurde mit NBT/BCIP (Promega Biotech), wie vom Hersteller angegeben, sichtbar gemacht.
Beispiel 5 Nachweis der korrekten Faltung der sekretierten Prokollagene
Um zu zeigen, daß die von den transfizierten Zellen synthetisierten und in das Medium sekretierten Prokollagene korrekt gefaltet waren, wurden die Mediumproteine mit hohen Konzentrationen von Proteasen unter Bedingungen verdaut, bei welchen nur korrekt gefaltete Prokollagene und Kollagene dem Verdau widerstehen. Für den Verdau mit einer Kombination von Trypsin mit Chymotrypsin wurde die Zellschicht aus einem 25 cm-Kolben in 0,5 ml modifiziertes Krebs II-Medium, enthaltend 10 mM EDTA und 0,1% Nonidet P-40 (Sigma), geschabt. Die Zellen wurden kräftig in einem Vortex-Mixer für 1 Minute geschüttelt und sofort auf 4°C abgekühlt. Der Überstand wurde in neue Röhrchen überführt. Die Probe wurde bei der angegebenen Temperatur für 10 Minuten vorinkumbiert, und der Verdau wurde bei der gleichen Temperatur für 2 Minuten durchgeführt. Für den Verdau wurden 0,1 Volumen des modifizierten Krebs II-Mediums, enthaltend 1 mg/ml Trypsin und 2,5 mg/ml α-Chymotrypsin (Boehringer Mannheim), zugegeben. Der Verdau wurde durch Zugabe von 0,1 Volumen 5 mg/ml Sojabohnen-Trypsininhibitor (Sigma) gestoppt.
Für die Analyse der Verdauungsprodukte wurde die Probe schnell in kochendes Wasser für 2 Minuten eingetaucht, mit der gleichzeitigen Zugabe von 0,2 Volumen 5 × Elektrophorese-Probenpuffer, der aus 10% SDS, 50% Glycerin und 0,012% Bromphenolblau in 0,625 M Tris-HCl-Puffer (pH 6,8) zusammengesetzt. Die Proben wurden auf SDS-Gele mit vorheriger Reduktion durch Inkubation für 3 Minuten in kochendem Wasser nach der Zugabe von 2% 2-Mercaptoethanol aufgetragen. Die Elektrophorese wurde unter Verwendung des diskontinuierlichen Systems von Laemmli, Nature 1979, 227, 680–685, mit geringen von de Wet et al., Journal of Biological Chemistry 1983, 258, 7721–7728, beschriebenen Modifikationen durchgeführt.
Beispiel 6 Spezifisch konstruierte Prokollagene und Kollage
Wie in der 4 gezeigt, war ein Hybridgen, bestehend aus etwas genomischer DNA und etwas cDNA für die Proα(I)-Kette von humanem Typ I-Prokollagen das Ausgangsmaterial. Die DNA-Sequenz des Hybridgens wurde analysiert und die Kodons für Aminosäuren, welche die Verbindungen zwischen den sich wiederholenden D-Perioden bildeten, wurden derart modifiziert, daß sich die kodierten Aminosäuren nicht veränderten, aber einzelne Stellen für die Spaltung des Hybridgens durch Restriktionsendonukleasen erzeugt wurden.
A. Rekombinantes Prokollagen oder Kollagen
Die D3-Periode von Proα(I) wurde unter Verwendung der Restriktionsnukleasen Srfl und Nael ausgeschnitten. Die Basen, welche für die Aminosäuren kodieren, die sich in der Kollagenase-Erkennungsstelle befinden, welche in der D3-Periode vorliegt, werden derart modifiziert, daß sie für eine unterschiedliche Aminosäuresequenz kodieren. Die Kassette wird amplifiziert und wieder in das Gen eingefügt. Die Expression des Gens in einer geeigneten Wirtszelle ergibt ein Typ I-Kollagen, das nicht durch Kollagenase gespalten werden kann.
B. Prokollagen- oder Kollagen-Deletionsmutanten
Eine D2-Perioden-Kassette (der Proα(I)-Kette) wird aus dem vorstehend beschriebenen Gen durch Verdau mit Smal ausgeschnitten. Das Gen wird wieder zusammengesetzt, um ein Gen mit einer spezifischen, den Leserahmen nicht verschiebenden Deletion der Kodons für die D2-Periode bereitzustellen.
C. Prokollagen- oder Kollagen-Additionsmutanten
Eine Vielzahl von Kopien von einer oder mehreren D-Kassetten kann in die konstruierten Stellen eingefügt werden, um eine Vielzahl von Kopien gewünschter Bereiche von Prokollagen oder Kollagen bereitzustellen.
Beispiel 7 Expression von humaner Prolyl-4-Hydroxylase in einem rekombinanten DNA-System
Um die Expression der zwei Gene für Prolyl-4-Hydroxylase in Insektenzellen zu erhalten, wurden die folgenden Verfahren durchgeführt. Der Baculovirus-Transfervektor pVLα58 wurde durch Verdauen eines pBluescript (Stratagen)-Vektors, enthaltend die cDNA vollständiger Länge für die α-Untereinheit der humanen Prolyl-4-Hydroxylase, PA-58 (Helaakoski, T. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1989, 86, 4392-4396) in der Smal-Stelle, mit PstI und BamHI, den Spaltstellen, welche die Smal- Stelle nahe flankieren, konstruiert. Die resultierenden PstI-PstI und PstI-BamHI-Fragmente, enthaltend 61 Bp der 5'-nicht-translatierten Sequenz, den gesamten kodierenden Bereich und 551 Bp der 3'-nicht-translatierten Sequenz wurden in die PstI-BamHI-Stelle für den Baculovirus-Transfervektor pVL1392 kloniert (Luckow, V.A. und Summers, M.D., Virology 1989, 170, 31–39). Der Baculovirus-Transfervektor pVLα59 wurde in ähnlicher Weise aus pVL1392 und einem anderen cDNA-Klon, PA-59 (Helaakoski, T. et al., supra), der für die α-Untereinheit der humanen Prolyl-4-Hydroxylase kodiert, konstruiert. Die cDNA-Klone PA-58 und PA-59 unterscheiden sich durch eine Kette von 64 Bp.
Der Vektor pVLβ wurde durch Ligation eines EcoRI-BamHI-Fragments einer vollständigen cDNA für die β-Untereinheit der humanen Prolyl-4-Hydroxylase, S-138 (Pihlajaniemi, T. et al., EMBO J. 1987, 6, 643–649), enthaltend 44 Bp der 5'-nicht-translatierten Sequenz, den gesamten kodierenden Bereich und 207 Bp der 3'-nicht-translatierten Sequenz, mit EcoRI/BamHI-verdautem pVL1392, konstruiert. Die rekombinanten Baculovirus-Transfervektoren wurden in Sf9-Zellen (Summers, M.D. und Smith, G.E., Tex. Agric. Exp. St. Bull. 1987, 1555, 1–56) mit Wildtyp-DNA des Autographa Californica Nukleären Polyhedrosisvirus durch Calciumphosphat-Transfektion co-transfiziert. Der resultierende virale Pool im Überstand der transfizierten Zellen wurde vier Tage später gesammelt und für den Plaque-Test verwendet. Rekombinante Occlusions-negative Plaques wurden drei Runden der Plaque-Reinigung unterworfen, um rekombinante Viren zu erzeugen, die vollständig frei von kontaminierendem Wildtypvirus sind. Das Screening-Verfahren und die Isolierung der rekombinanten Viren verfolgte im wesentlichen durch das Verfahren von Summers und Smith, supra.
Die resultierenden rekombinanten Viren aus pVLα58, pVLα59 und pvLβ wurden als α58-Virus, α59-Virus bzw. β-Virus bzeichnet.
Sf9-Zellen wurden in TNM-FH-Medium (Sigma), angereichert mit 10% fötalem Rinderserum, bei 27°C entweder als Monoschicht oder in Suspension in Schüttelkolben (Techne) gezüchtet. Um rekombinante Proteine herzustellen, wurden Sf9-Zellen in einer Dichte von 10⁶ Zellen pro ml ausplattiert, mit einer Multiplizität von 5 bis 10 mit rekombinanten Viren injiziert, wenn das α58-, α59- oder β-Virus allein verwendet wurde. Die α- und β-Viren wurden für die Infektion in Verhältnissen von 1:10 bis 10:1 verwendet, wenn das Prolyl-4-Hydroxylase-Tetramer hergestellt wurde. Die Zellen wurden 72 Stunden nach der Infektion geerntet, in 0,01 M Tris, pH 7,8/0,1 M NaCl/0,1 M Glycin/10 μM Dithiothreitol/0,1% Triton X-100 homogenisiert und zentrifugiert. Die resultierenden Überstände wurden durch SDS/10% PAGE oder nicht-denaturierende 7,5% PAGE analysiert und hinsichtlich Enzymaktivitäten getestet. Die Zellrückstände wurden weiter in 1 % SDS solubilisiert und durch SDS/10% PAGE analysiert. Das Zellmedium bei 24 bis 96 Stunden nach Infektion wurde auch durch SDS/10% PAGE analysiert, um jegliche Sekretion des resultierenden Proteins in das Medium nachzuweisen. Die Zellen wurden in diesen Experimenten in TNM-FH-Medium ohne Serum gezüchtet.
Wenn der Zeitverlauf der Proteinexpressionen untersucht wurde, wurden die mit rekombinanten Viren infizierten Sf9-Zellen mit [³⁵S]-Methionin (10 μCi/μl; Amersham; 1 Ci=37 CBq) für zwei Stunden bei verschiedenen Zeitpunkten zwischen 24 und 50 Stunden nach der Infektion markiert und für die Analyse durch SDS/10% PAGE gesammelt. Um die maximale Anreicherung von rekombinantem Protein zu bestimmen, wurden Zellen bei verschiedenen Zeitpunkten von 24 bis 96 Stunden nach der Infektion geerntet und durch SDS/10% PAGE analysiert. Sowohl die in 0,1 % Triton X-100 als auch in 1 % SDS löslichen Fraktionen der Zellen wurden analysiert. Die Prolyl-4-Hydroxylase-Aktivität wurde durch ein Verfahren getestet, das auf der Decarboxylierung von 2-Oxo[1-¹⁴C]glutarat basiert (Kivirikko, K.I., und Myllyla, R., Methods Enzymol. 1982, 82, 245–304). Die Km-Werte wurden durch Variieren der Konzentrationen eines Substrats in Gegenwart festgelegter Konzentrationen des zweiten bestimmt, während die Konzentrationen der anderen Substrate konstant gehalten wurden (Myllyla, R., Tuderman, L., und Kivirikko, K.I., Eur. J. Biochem. 1977, 80, 349–357). Die Proteindisulfid-Isomeraseaktivität der β-Untereinheit wurde durch den Glutathion:Insulin-Transhydrogenasetest (Carmichael et al., J. Biol. Chem. 1977, 252, 7163–7167) gemessen. Die Western-Blot-Analyse wurde unter Verwendung eines monoklonalen Antikörpers, 5B5, gegen die β- Untereinheit der humanen Prolyl-4-Hydroxylase durchgeführt (Hoyhtya, M. et al., Eur. J. Biochem. 1984, 141, 477–482). Die Prolyl-4-Hydroxylase wurde durch ein Verfahren, bestehend aus Poly(L-Prolin)-Affinitätschromatographie, DEAE-Zellulose-Chromatographie und Gelfiltration, gereinigt (Kivirikko, K.I., und Myllyla, R., Methods Enzymol. 1987, 144, 96–114).
Die 5 zeigt die Analyse der von den Insektenzellen synthetisierten Prolyl-4-Hydroxylase nach Reinigung des Proteins durch Affinitätssäulenchromatographie. Bei der Untersuchung durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese in einem nicht-denaturierenden Gel co-migrierte das rekombinante Enzym mit der tetrameren und aktiven Form des normalen, aus Hühnerembryonen gereinigten Enzyms. Nachdem das gereinigte rekombinante Enzym reduziert wurde, wurden die α- und β-Untereinheiten nachgewiesen. Die Tabelle 2 zeigt Daten der enzymatischen Aktivität des rekombinanten Enzyms. Die Km-Werte wurden durch Variieren der Konzentration eines Substrats in Gegenwart festgelegter Konzentrationen des zweiten gemessen, während die Konzentration der anderen Substrate konstant gehalten wurden.
TABELLE 2
Wie gezeigt, waren die Michaelis-Menten (Km)-Werte für das rekombinante Enzym die gleichen wie für das authentische normale Enzym aus Hühnerembryonen. Da die transfizierten Insektenzellen große Mengen aktiver Prolyl-4-hydroxylase synthetisieren, sind sie geeignete Zellen, um mit Genen der vorliegenden Erfindung, die für Prokollagene und Kollagene kodieren, transfiziert zu werden, um die Synthese großer Mengen der Prokollagene und Kollagene zu erreichen. Die Transfektion der Zellen mit Genen der vorliegenden Erfindung wird, wie in Beispiel 3 beschrieben, durchgeführt.
Beispiel 8 Expression rekombinanter Kollagen-Gene in Saccharomyces cerevisiae-Hefen, die rekombinante Gene für Prolyl-4-Hydroxylase exprimieren
Die Hefe Saccharomyces cerevisiae kann mit irgendeinem der großen Anzahl von Expressionsvektoren verwendet werden. Einer der meisten üblicherweise verwendeten Expressionsvektoren ist das Multi-Kopie-2μ-Plasmid, das Sequenzen für die Vermehrung sowohl in Hefe als auch in E.coli, einen Hefe-Promotor- und -Terminator für die wirksame Übertragung des fremden Gens enthält. Übliche Beispiele solcher auf 2 μ-Plasmiden basierenden Vektoren sind pWYG4, welcher die 2 μ-ORI-, STB-Elemente, den GAL1-Promotor und den 2μ-D-Genterminator aufweist. In diesem Vektor wird eine Ncol-Klonierungsstelle, enthaltend das ATG, verwendet, um das Gen entweder für die α- oder die β-Untereinheit der Prolyl-4-hydroxylase einzufügen. Als ein weiteres Beispiel kann der Expressionsvektor pWYG7L sein, der den intakten 2μ-ORI, STB, REP1 und REP2, den GAL7-Promotor aufweist und den FLP-Terminator verwendet. In diesen Vektor wird das Gen entweder für die α- oder die β-Untereinheit der Prolyl-4-hydroxylase in den Polylinker mit seinen 5'-Enden in eine BamHI- oder Ncol-Spaltstelle eingefügt. Der das Prolyl-4-hydroxylasegen enthaltende Vektor wird in S. cerevisiae transformiert, entweder nach dem Entfernen der Zellwand, um Spheroblasten herzustellen, die DNA bei Behandlung mit Calcium und Polyethylenglycol aufnehmen oder durch Behandlung intakter Zellen mit Lithiumionen. In einer anderen Ausführungsform kann die DNA durch Elektroporation eingeschleust werden. Die Transformanten können durch Verwendung von Wirtshefezellen, die auxotroph gegenüber Leucin, Tryptophan, Uracil oder Histidin sind, zusammen mit selektierbaren Markergenen wie LEU2, TRP1, URA3, HIS3 oder LEU2-D, selektiert werden. Die Expression der Prolyl-4-hydroxylasegene, die durch die Galactose-Promotoren angetrieben wird, kann durch Wachsen der Kultur auf einem nicht-hemmenden, nicht-induzierenden Zucker, so daß eine sehr schnelle Induktion der Zugabe von Galactose folgt, durch Wachsen der Kultur in Glucose-Medium und danach Entfernen der Glucose durch Zentrifugation und Waschen der Zellen vor dem Resuspendieren in Galactose-Medium, und durch Wachsen der Zellen in einem Medium, das sowohl Glucose als auch Galactose enthält, so daß die Glucose bevorzugt verstoffwechselt wird, bevor die Galactose-Induktion stattfinden kann, induziert werden. Weitere Manipulationen der transformierten Zellen werden wie vorstehend beschrieben durchgeführt, um Gene für beide Untereinheiten der Prolyl-4-hydroxylase und gewünschte Kollagen- und Prokollagen-Gene in die Zellen einzufügen, um die Expression von Kollagen und Prokollagen zu erreichen, das hinreichend durch die Prolyl-4-hydroxylase hydroxyliert ist, um in eine stabile dreifach-helikale Konformation zu falten und daher von der erforderlichen Faltung begleitet ist, die mit der normalen biologischen Funktion zusammenhängt.
Beispiel 9 Expression rekombinanter Kollagen-Gene in Pichia pastoris-Hefen, die rekombinante Gene für Prolyl-4-hydroxylase exprimieren
Die Expression der Gene für Prolyl-4-hydroxylase und Prokollagene oder Kollagene kann auch in nicht-Saccharomyces-Hefen wie Pichia pastoris erfolgen, die besondere Vorteile bei der Erzeugung hoher Ausbeuten rekombinanter Proteine bei Verfahren in großem Maßstab aufweisen. Üblicherweise wird die Expression im methylotrophen P. pastoris durch den Promotor des streng regulierten AOX1-Gens erreicht, das für Alkohol-Oxidase kodiert, und induziert werden kann, um große Mengen rekombinanten Proteins zu ergeben, was durch den Promotor nach der Zugabe von Methanol zu den Kulturen angetrieben wird. Da P. pastoris keine nativen Plasmide enthält, wird die Hefe mit Expressionsvektoren verwendet, die zur chromosomalen Integration konstruiert sind, und Gene wie HIS4 werden zur Selektion verwendet. Durch nachfolgende Manipulationen der gleichen Zellen, wird die Expression von vorstehend beschriebenen Genen für Prokollagene und Kollagene unter Bedingungen erreicht, bei denen das rekombinante Protein hinreichend durch Prolyl-4-hydroxylase hydroxyliert ist und daher in eine stabile Helix falten kann, die für die normale biologische Funktion der Proteine bei der Bildung von Fibrillen erforderlich ist.
Sequenzprotokoll

Claims

Rekombinante Wirtszelle, umfassend mindestens ein transfiziertes humanes Prokollagen- oder mindestens ein transfiziertes humanes Kollagen-Gen und mindestens ein transfiziertes Gen, das für das posttranslationale Enzym Prolyl-4-hydroxylase kodiert.
Rekombinante Wirtszelle nach Anspruch 1, wobei die Wirtszellen natürlicherweise keine wesentliche Menge Kollagen oder Typ I-, II- oder III-Prokollagen erzeugen.
Rekombinante Wirtszelle nach Anspruch 1 oder 2, wobei das transfizierte Kollagen- oder Prokollagen-Gen aus der Gruppe, bestehend aus COL1A1, COL1A2, COL2A1 und COL3A1, ausgewählt ist.
Rekombinante Wirtszelle nach Anspruch 1 oder 2, wobei eines der transfizierten humanen Prokollagen-Gene das COL1A1-Gen ist, das für die Proα1(I)-Kette des humanen Typ I-Prokollagens kodiert.
Rekombinante Wirtszelle nach Anspruch 1 oder 2, wobei eines der transfizierten humanen Prokollagen-Gene das COL1A2-Gen ist, das für die Proα2(I)-Kette des humanen Typ I-Prokollagens kodiert.
Rekombinante Wirtszelle nach Anspruch 1 oder 2, wobei eines der transfizierten humanen Prokollagen-Gene das COL2A1-Gen ist, das für die Proα1(II)-Kette des humanen Typ II-Prokollagens kodiert.
Rekombinante Wirtszelle nach Anspruch 1 oder 2, wobei eines der transfizierten humanen Prokollagen-Gene das COL3A1-Gen ist, das für die Proα1(III)-Kette des humanen Typ III-Prokollagens kodiert.
Rekombinante Wirtszelle nach Anspruch 1 oder 2, wobei mindestens eines der transfizierten Kollagen- oder Prokollagen-Gene ein variantes Gen ist.
Rekombinante Wirtszellen nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die Wirtszellen Säugerzellen sind.
Rekombinante Wirtszellen nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die Wirtszellen Insektenzellen sind.
Rekombinante Wirtszellen nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die Wirtszellen Hefezellen sind.
Verfahren zum Synthetisieren von Prokollagen oder Kollagen in rekombinanten Wirtszellen, umfassend: (a) Transfizieren mindestens eines human Prokollagen- oder mindestens eines humanen Kollagen-Gens in Wirtszellen, und (b) Transfizieren mindestens eines Gens, das für das posttranslationale Enzym Prolyl-4-hydroxylase kodiert, in die Wirtszellen.
Verfahren nach Anspruch 12, weiter umfassend die Schritte: (c) Züchten der Zellen unter Bedingungen derart, daß die transfizierten Gene exprimiert werden, so daß Prokollagen und/oder Kollagen erzeugt werden, und (d) Isolieren des Prokollagens und/oder Kollagens, die durch die transfizierten Prokollagen- oder Kollagen-Gene exprimiert werden.
Verfahren zur Erzeugung einer rekombinanten Wirtszelle, die zur Herstellung von rekombinantem Prokollagen und/oder rekombinantem Kollagen ver wendbar ist, umfassend: (a) Transfizieren mindestens eines humanen Prokollagen- und/oder mindestens eines humanen Kollagen-Gens in Wirtszellen, (b) Transfizieren mindestens eines Gens, das für das posttranslationale Enzym Prolyl-4-hydroxylase kodiert, in die Wirtszellen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 14, wobei die Wirtszellen natürlicherweise keine wesentliche Mengen Kollagen oder Typen I-, II- oder III-Prokollagen erzeugen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 15, wobei eines der transfizierten humanen Prokollagen-Gene das COL1A1-Gen ist, das für die Pro-α1(I)-Kette des humanen Typ I-Prokollagens kodiert.
Verfahren nach Anspruch 16, umfassend den Schritt des Transfizierens der Wirtszelle mit dem COL1A2-Gen, das für die Pro-α2(I)-Kette des humanen Typ I-Prokollagens kodiert.
Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 15, wobei eines der transfizierten humanen Prokollagen-Gene das COL2A1-Gen ist, das für die Pro-α1(II)-Kette des humanen Typ II-Prokollagens kodiert.
Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 15, wobei eines der transfizierten humanen Prokollagen-Gene das COL3A1-Gen ist, das für die Pro-α1(III)-Kette des humanen Typ III-Prokollagens kodiert.
Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 15, wobei mindestens eines der transfizierten Kollagen- oder Prokollagen-Gene ein variantes Gen ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 20, wobei die rekombinanten Wirtszellen Säugerzellen sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 20, wobei die rekombinanten Wirtszellen Insektenzellen sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 20, wobei die rekombinanten Wirtszellen Hefezellen sind.