JP2002255999A - 組換えｄｎａ合成システムにおけるヒトプロコラーゲン及びコラーゲンの合成 - Google Patents

組換えｄｎａ合成システムにおけるヒトプロコラーゲン及びコラーゲンの合成

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JP2002255999A JP2001379164A JP2001379164A JP2002255999A JP 2002255999 A JP2002255999 A JP 2002255999A JP 2001379164 A JP2001379164 A JP 2001379164A JP 2001379164 A JP2001379164 A JP 2001379164A JP 2002255999 A JP2002255999 A JP 2002255999A
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プロッコプ，ダーウィン・ジェイ
Lenna Ala-Kokko
アラ−コッコ，レンナ
Andrzej Fertala
フェルタラ，アンドルズィー
Aleksander Sieron
シエロン，アレクサンダー
Kari I Kivirikko
キビリッコ，カリ・イ
Amy Geddis
ゲッディス，エイミー
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Abstract

(57)【要約】 【課題】本発明は、繊維性コラーゲンを発現する細胞、
及び該安定細胞系由来の該コラーゲンを用いるヒトの病
気治療の方法、組換えプロコラーゲンまたは組換えコラ
ーゲンに関する。 【解決手段】本発明の組換えプロコラーゲンまたは組換
えコラーゲンは、実質上全てが少なくとも１つのヒトコ
ラーゲン遺伝子を有し、該細胞系においてコラーゲン及
びコラーゲン繊維を合成するための方法を用いることに
よって得られる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、組換えＤＮＡ合成
システムにおけるヒトプロコラーゲン及びコラーゲンの
合成に関する。
【０００２】
【従来の技術】多くの外因性遺伝子の発現は様々な組み
換え宿主−ベクターシステムにおいて容易に行うことが
できるが、タンパク質が通常多くの翻訳後プロセシング
を必要とする場合、発現は難しくなる。これが、翻訳後
酵素によるプロセシングを必要とする主要な繊維コラー
ゲンについて、完全な組み換えシステムにおける発現が
今のところ報告されていない理由のようである。Ｐｒｏ
ｃｋｏｐ及びＫｉｖｉｒｉｋｋｏ，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．
Ｍｅｄ．１９８４，３１１，３７６−３８６参照。プロ
リル４−ヒドロキシラーゼは、Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ繰り返し
配列のＹ部位にあるプロリン残基を４−ヒドロキシプロ
リンにヒドロキシル化するのに必要な酵素であるため、
おそらく細胞によるプロコラーゲン及びコラーゲンの合
成に必要な、重要な翻訳後酵素（ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓ
ｌａｔｉｏｎａｌ ｅｎｚｙｍｅ）の一つである。Ｐｒ
ｏｃｋｏｐ及びＫｉｖｉｒｉｋｋｏ，Ｎ．Ｅｎｇｌ．
Ｊ．Ｍｅｄ．１９８４，３１１，３７６−３８６。適切
な数のＹ部位にあるプロリン残基がプロリル４−ヒドロ
キシラーゼによって４−ヒドロキシプロリンにヒドロキ
シル化されない限り、新たに合成されたペプチド鎖は３
７℃において３重ヘリックス構造に折りたたまれない。
ヒドロキシル化が起こらない場合、ポリペプチドはヘリ
ックス構造をとらず、細胞から殆ど分泌されず、コラー
ゲン繊維へと自己重合できない。最近、プロリル４−ヒ
ドロキシラーゼがバキュロウイルスによって発現され
た。Ｖｕｏｒｉｏ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃｅｅｄ
ｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄ
ｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｕ．Ｓ．Ａ．，１９９
２，８９，７４６７−７４７０。
【０００３】Ｓｃｈｎｉｅｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１９８
７，８４，８８６９−８８７３及びＬｅｅ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９８９，２６４，２
０６８３−２０６８７に、Ｉ型コラーゲンの２つの鎖の
うち１つだけを合成する、２つの異なるシステムにおけ
るレスキュー実験が記載されている。Ｓｃｈｎｉｅｋｅ
らはヒト繊維コラーゲンｐｒｏα１（Ｉ）鎖の遺伝子す
なわちＣＯＬ１Ａ１遺伝子はマウス繊維芽細胞において
発現でき、鎖がＩ型コラーゲンの前駆体であるＩ型プロ
コラーゲン分子の重合に用いられると報告した。しか
し、このシステムにおいては、同分子中のｐｒｏα２
（Ｉ）鎖はマウス由来である。Ｌｅｅ らのシステムに
おいてはｐｒｏα１（Ｉ）鎖はラット由来である。従っ
て、３つの鎖すべてが外因性遺伝子由来であるプロコラ
ーゲン分子の合成はＳｃｈｎｉｅｋｅらによってもＬｅ
ｅらによっても行われていない。
【０００４】完全な組み換えシステムにおける繊維コラ
ーゲン遺伝子の発現を行えないことがタンパク質の通常
の構造−機能関係の研究及び突然変異の影響の研究を妨
げていた。Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．
Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．１９９０，４６，８９６−９
０１；Ｔｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１９９０、８７、
３８８９ー３８９３；Ｖｉｓｓｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９０，２６４，１８２６
５−１８２６７；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ １９８９，２４４，９７８−９８０；Ｆｒａｎｃｏ
ｍａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １９８
７，１，２９３−２９６；Ｋｎｏｗｌｔｏｎ ｅｔ ａ
ｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ． １９８９，４
５，６８１−６８８；Ａｈｍａｄ ｅｔ ａｌ．，Ａ
ｍ． Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．１９９０，４７，Ａ２
０６；Ｐａｌｏｔｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｌａｎ
ｃｅｔ １９８９，Ｉ，９２４−９２７；Ｋｎｏｗｌｔ
ｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．１９
９０，３２２，５２６−５３０：Ａｌａ−Ｋｏｋｋｏ
ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１９９０、８７、６５６５ー６５６８
に記載されているように特に、ＩＩ型プロコラーゲン遺
伝子の突然変異は最近、いくつかのヒトの病気と関連付
けられたが、Ｅｌｉｍａ ａｎｄ Ｖｕｏｒｉｏ，ＦＥ
ＢＳ Ｌｅｔｔ．１９８９，２５８，１９５−１９８；
Ａｕｌｔｈｏｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ
Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１９８９，２５，６５９−６６８
に記載されているように、十分な数のヒト軟骨細胞を得
るのは難しく、かつヒト軟骨細胞は培養すると直ちに表
現型を失うため、タンパク質の生物学的機能と遺伝子の
突然変異の間の因果関係は確認しにくい。
【０００５】また、ヒト繊維コラーゲン遺伝子の発現が
行えないことにより、人間の種々の治療に使用でき、か
つ、動物由来のコラーゲンの使用によって引き起こされ
てしまう望ましくない免疫反応を引き起こさないヒト繊
維プロコラーゲン及びコラーゲンの調製は不可能だっ
た。
【０００６】しかし最近、出願人らはヒトＩ型プロコラ
ーゲン遺伝子のプロモーターを用いたマウス３Ｔ３細胞
におけるヒトＩＩ型プロコラーゲンの発現を記載した。
Ａｌａ−Ｋｏｋｋｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．１９９１，２６６，１４１７５；Ａｌａ−Ｋｏ
ｋｋｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍａｔｒｉｘ １９９０，１
０，２３４．
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明はヒト及び他の
動物由来のコラーゲン遺伝子を含む遺伝子コンストラク
トの調製を含む。遺伝子コンストラクトの１つはＩ型プ
ロコラーゲン（ＣＯＬ１Ａ１）のヒト遺伝子及びＩＩ型
プロコラーゲン（ＣＯＬ２Ａ１）のヒト遺伝子のハイブ
リッドである。コンストラクトの５’端はプロモータ
ー、エクソン１及びＣＯＬ２Ａ１遺伝子のイントロン１
に融合したＣＯＬ１Ａ１遺伝子のイントロン１を含む。
コンストラクトはＣＯＬ１Ａ１の第１イントロン中のプ
ロモーター及び推定されるエンハンサーがＣＯＬ１Ａ２
遺伝子の発現を促進し、そしてヒトＩＩ型プロコラーゲ
ンの生産を引き起こすようにデザインされる。ＣＯＬ２
Ａ１遺伝子は合計およそ２６，０００塩基対の、２つの
ＳｐｈＩ／ＳｐｈＩ遺伝子断片からなる。このコンスト
ラクトはシグナルペプチドのいくつかのコドンを除くエ
クソン１のすべてのコーディング配列及びエクソン１に
続く、オルタナティブスプライシングされたエクソンを
含む。コンストラクトのある型はｍＲＮＡのポリアデニ
ル化の補正に必要な、遺伝子の３’端由来の３，５００
塩基対のＳｐｈＩ／ＳｐｈＩ断片も含む。
【０００８】第２のコンストラクトはプロモーター、第
１エクソン、イントロン、及びコンストラクトの５’断
片としてヒトＣＯＬ１Ａ１遺伝子の第１エクソンのおよ
そ半分を有する。５’断片は唯一のＫｐｎＩ制限酵素部
位を介して、遺伝子の最初の１と半分（ｏｎｅ ａｎｄ
ｏｎｅ−ｈａｌｆ）のエクソンに含まれる配列を除く
すべてのコーディング配列を含むｃＤＮＡに結合され
る。更に、ｃＤＮＡの３’端はＥｃｏＲＩ部位を介して
ＣＯＬ１Ａ１遺伝子の３’端由来のおよそ０．５Ｋｂの
ＥｃｏＲＩ／ＥｃｏＲＩ断片に結合される。一連の付加
コンストラクトはヒトＣＯＬ１Ａ１遺伝子の全長ｃＤＮ
Ａの発現を促進するため、サイトメガロウイルスの強力
なプロモーターを用いる。すべてのコンストラクトは
５’及び３’端に特異的な制限酵素部位をもつように設
計されており、従って、ベクター配列から切り出すこと
ができる。
【０００９】本発明はコラーゲン遺伝子コンストラクト
の、選択された細胞へトランスフェクト及び発現を含
む。本発明の好ましい態様として、選択された細胞はプ
ロコラーゲン及びコラーゲンの生合成に重要な翻訳後酵
素を１つ若しくはそれ以上発現する。例えば、プロリル
４−ヒドロキシラーゼはプロコラーゲン及びコラーゲン
の生合成に重要な翻訳後酵素である。プロコラーゲンま
たはコラーゲンを、このタンパク質を合成する生物の体
温において安定な３重ヘリックス構造に折り畳むため
に、この酵素はプロコラーゲンまたはコラーゲン中の−
Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ繰り返しトリペプチド構造のＹに位置す
るおよそ１００のプロリン残基を４−ヒドロキシプロリ
ンにヒドロキシル化しなければならない。このように、
本発明の好ましい態様として、プロリル４−ヒドロキシ
ラーゼを発現する細胞が好ましい。このような細胞は天
然に翻訳後酵素を発現するものであっても、プロリル４
−ヒドロキシラーゼのような翻訳後酵素をコードする遺
伝子をトランスフェクトされていてもよい。ホニュウ類
細胞、昆虫細胞、または酵母細胞が望ましい。少なくと
も１組のプロリル４−ヒドロキシラーゼのような翻訳後
酵素をコードする遺伝子で形質転換されたホニュウ類細
胞、昆虫細胞、および酵母細胞は、本発明の別の好まし
い態様において構築されたコラーゲン遺伝子で形質転換
されてもよい。本発明はまた、培養可能で、必要な翻訳
後酵素及び分泌機構を含む、チャイニーズハムスターの
卵巣細胞のようなその他の細胞を利用することもでき
る。
【００１０】
【課題を解決するための手段】骨形成不全症（ｏｓｔｅ
ｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｍｐｅｒｆｅｃｔａ）（ＯＩ）の
ほとんどの型は２つのＩ型プロコラーゲン遺伝子のうち
の１つに起こった優性突然変異により引き起こされるこ
とが確立されてきている。また、少なくともいくつかの
閉経後骨粗鬆症（ｐｏｓｔ−ｍｅｎｏｐａｕｓａｌ ｏ
ｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ）も２つのＩ型プロコラーゲン
遺伝子の、同様な突然変異により引き起こされる。ＩＩ
型プロコラーゲン遺伝子の突然変異が軟骨異形成症（ｃ
ｈｏｎｄｒｏｄｙｓｐｌａｓｉａ）及び一群の主要な一
般的骨関節炎（ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ）のよう
なヒトの病気を引き起こすことが、更に報告されてい
る。ＩＩＩ型プロコラーゲン遺伝子（ＣＯＬ３Ａ１）の
突然変異が致死的なエーラース・ダンロス症候群（Ｅｈ
ｌｅｒｓ−Ｄａｎｌｏｓ ｓｙｄｒｏｍｅ）（ＩＶ型）
及び家族性動脈瘤のようなヒトの病気を引き起こすこと
が更に報告されている。更に、アルポート症候群として
知られている腎臓病がＩＶ型コラーゲン遺伝子のうちの
１つ（ＣＯＬ４Ａ５）の突然変異によって引き起こされ
ることが示されている。更に、コラーゲン繊維の懸濁液
の注入が括約筋（ｓｐｈｉｎｃｔｅｒｓ）のような組織
の物理的弱さに加え、美容的欠陥の治療に効果的である
ことが示されている。
【００１１】本発明はこれらの繊維性プロコラーゲンの
うちの１つがｍＲＮＡとしても、タンパク質としても発
現している細胞に関する。加えて、本発明はホニュウ類
細胞系、昆虫細胞系、または酵母細胞系で発現している
Ｉ、ＩＩ及びＩＩＩ型プロコラーゲン及び、これらのプ
ロコラーゲン遺伝子を含むトランスフェクト細胞系の確
立に関する。
【００１２】本発明は更に遺伝子コンストラクトがＨＴ
−１０８０ヒト腫瘍細胞系におけるヒト繊維性プロコラ
ーゲンの合成に用い得ることを提供する。このヒト細胞
系は基底膜の主要なコラーゲンであるＩＶ型コラーゲン
の容易な供給源である。ＩＶ型コラーゲンは繊維形成プ
ロコラーゲンまたはコラーゲンではないので、簡単なク
ロマトグラフの技法によりすべての繊維性プロコラーゲ
ンから容易に分離できる。従って、本発明は内因性のコ
ラーゲン遺伝子産物から繊維性プロコラーゲンを簡単に
分離する方法を提供する。更に、培養中ＨＴ−１０８０
細胞は非常に速く増殖し、そして長期間維持することが
できる。
【００１３】加えて、本発明は細胞中に発現される１つ
のプロコラーゲンまたはコラーゲン遺伝子、または多く
のプロコラーゲンまたはコラーゲン遺伝子を提供する。
更に、１つのプロコラーゲンまたはコラーゲン遺伝子、
または多くのプロコラーゲンまたはコラーゲン遺伝子
を、１つ若しくはそれ以上のコピー数、細胞にトランス
フェクトし、発現させることができることが考えられ
る。本発明はこれらの細胞がヒトプロコラーゲン遺伝子
の少なくとも一つ、限定されるわけではないが、特にヒ
トＩ型プロコラーゲンのｐｒｏα１（Ｉ）プロコラーゲ
ン鎖をコードするＣＯＬ１Ａ１遺伝子を発現するようト
ランスフェクトされ得ることを提供する。本発明はさら
に、ｐｒｏα２（Ｉ）及びｐｒｏα１（Ｉ）鎖が同時に
合成され、Ｉ型プロコラーゲンの通常のヘテロ３量体分
子に重合するように、ＣＯＬ１Ａ１及びＣＯＬ２Ａ１遺
伝子の両方を細胞にトランスフェクトし、発現させ得る
ことを提供する。さらに、本発明はヒトＩＩ型プロコラ
ーゲンのｐｒｏα１（ＩＩ）鎖をコードするＣＯＬ２Ａ
１遺伝子を細胞にトランスフェクトし、発現させ得るこ
とを提供する。さらに、ヒトＩＩＩ型プロコラーゲンの
ｐｒｏα１（ＩＩＩ）鎖をコードするＣＯＬ３Ａ１遺伝
子を細胞にトランスフェクトし、発現させ得ることを提
供する。本発明の細胞中にトランスフェクトされ、発現
されるプロコラーゲンまたはコラーゲン遺伝子はすべ
て、突然変異、変異、ハイブリッド、または組み替え遺
伝子からなってもよい。このような突然変異、変異、ハ
イブリッド、または組み替え遺伝子はハイブリッド遺伝
子を切断するための独自の制限酵素認識部位を提供する
変異を含んでいてもよい。本発明の好ましい態様では、
１つ若しくはそれ以上の独自の制限酵素認識部位を提供
する変異は遺伝子にコードされているアミノ酸配列を変
化させることなく、単に、遺伝子の取り扱いに有用な独
自の制限酵素認識部位を提供する。このように、修飾遺
伝子は独自の制限酵素認識部位に並んで存在する、多く
の分離された領域またはＤ−領域から構成される。遺伝
子の、このような、遺伝子の分離された領域は本明細書
中において、カセットと言及される。例えば、図４に示
したように、カセットはＤ１からＤ４．４として表され
る。遺伝子カセットの複数コピーは本発明に含まれる本
遺伝子の別の変種である。コラーゲナーゼのような内因
性酵素に対する耐性のような所望の特性を提供する、組
み替えまたは突然変異遺伝子、またはカセットもまた、
本発明に含まれる。更に本発明は、実質上全て細胞が、
別のプロコラーゲンまたはコラーゲン遺伝子（限定はさ
れないが、好ましくはＩ、ＩＩ、ＩＩＩ型プロコラーゲ
ン遺伝子またはＩＶ型コラーゲン遺伝子である）を含
む、トランスフェクト細胞を提供する。本発明はトラン
スフェクト細胞はヒト腫瘍細胞のようなホニュウ類細
胞、限定はされないが、特にＨＴ−１０８０細胞でもよ
いことを意図する。本発明の別の態様としてトランスフ
ェクト細胞はバキュロウイルスＳｆ９細胞のような昆虫
細胞でもよい。本発明のさらに別の態様として、形質導
入細胞は出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅ
ｒｅｖｉｓｉａｅ）またはＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒ
ｉｓ細胞のような酵母細胞である。本発明の好ましい態
様では、ホニュウ類細胞、昆虫細胞、及び酵母細胞のよ
うな、天然には十分量の翻訳後酵素を生産しないような
細胞は、少なくとも１組の、プロリル４−ヒドロキシラ
ーゼのような翻訳後酵素をコードする遺伝子をトランス
フェクトされる。
【００１４】本発明は更に、実質上すべての細胞が、少
なくとも１つのトランスフェトされたコラーゲンまたは
プロコラーゲン遺伝子由来の鎖、及び、ヒトｐｒｏα１
（Ｉ）部位及び非ヒトｐｒｏα２（Ｉ）部位または非ヒ
トｐｒｏα１（Ｉ）部位及びヒトｐｒｏα２（Ｉ）部位
から成る［ｐｒｏα１（Ｉ）］2ｐｒｏα２（Ｉ）コラ
ーゲン分子以外の、内因性のヒトまたはヒト以外のコラ
ーゲンまたはプロコラーゲン遺伝子、に由来する少なく
とも１つの鎖を含む細胞を意図する。
【００１５】本発明の方法の新たな特性は、他の繊維性
プロコラーゲンをつくらない組み換え細胞培養システム
において、比較的多量のヒト繊維性プロコラーゲンを合
成できることである。内因性の繊維性プロコラーゲンま
たはコラーゲン遺伝子産物を組み換え遺伝子産物から精
製するのは非常に困難であるため、他の繊維性プロコラ
ーゲンまたはコラーゲンを合成するシステムは非実用的
である。本発明の方法を用いることにより、ヒトプロコ
ラーゲンの精製は非常に促進される。更に、本発明の方
法により合成されるタンパク質量は、当該技術分野の他
のシステムと比較して、多いことが示されている。
【００１６】本発明の他の新たな特性は、合成されたプ
ロコラーゲンが正しく折り畳まれたタンパク質であり、
プロコラーゲンまたはコラーゲンの特徴である通常の３
重ヘリックス構造を示すことである。従って、プロコラ
ーゲンはプロテアーゼによって切断することにより、安
定なコラーゲン原繊維（ｆｉｂｒｉｌｓ）及び繊維の合
成に使用し得る。
【００１７】本発明はヒト繊維性プロコラーゲンｐｒｏ
α１（Ｉ）鎖の遺伝子、すなわちＣＯＬ１Ａ１遺伝子は
マウスの繊維芽細胞中で発現でき、鎖がＩ型コラーゲン
の前駆体である、Ｉ型プロコラーゲン分子の重合に使用
されることを報告したＳｃｈｎｉｅｋｅらとは対照的で
ある。しかし、ＳｃｈｎｉｅｋｅらのシステムではＩ型
プロコラーゲン分子中にみられるｐｒｏα２（Ｉ）鎖は
マウス由来であった。従って、合成されたＩ型プロコラ
ーゲンは、ヒト及びマウス由来のハイブリッド分子であ
った。同様に、Ｌｅｅらのシステムはｐｒｏα１（Ｉ）
鎖がラット由来であるＩ型コラーゲンを合成するため
に、外因性ｐｒｏα２（Ｉ）遺伝子を発現した。本発明
は完全にトランスフェクトしたプロコラーゲン及びコラ
ーゲン遺伝子由来のプロコラーゲンまたはコラーゲンを
合成する方法を提供するが、これらの方法は完全にトラ
ンスフェクトした遺伝子由来のプロコラーゲン及びコラ
ーゲンの合成に限定するものではない。
【００１８】本発明のヒトコラーゲンの利点はこれらの
コラーゲンが人体内でアレルギー反応を引き起こさない
ことである。更に、培養細胞から調製された本発明のコ
ラーゲンは動物から得たコラーゲンより高品質であり、
より大きくより固い束の繊維を形成する。これらの高品
質タンパク質は現在利用可能な市販材料よりも長持ちす
る沈着物を組織内に形成する。現在利用可能な方法を用
いると、美容整形の目的のためにはコラーゲンの注入は
６カ月ごとに繰り返さなければならないことが知られて
いる。本発明のヒトタンパク質はヒト組織内に注入後、
より長持ちする。
【００１９】本発明の方法は美容上の皺、及び他の美容
上の欠陥を取り除くために投与される、及び尿失禁症治
療において膀胱の括約筋等の組織の張力を回復させるた
めに広く使用される、動物コラーゲンに類似した、ヒト
コラーゲンの実用的な供給源を提供する。動物コラーゲ
ンはまたセラミック及びたの材料との混合物の形で、骨
の欠陥を補うため、及び骨の成長を促進するために利用
される。動物由来のＩ型コラーゲンが商業的に使用され
ている。しかし、治療に用いるための簡便なヒトコラー
ゲン源はまだ非常に必要とされている。
【００２０】更に、本発明は軟骨の主なコラーゲンの前
駆体であるヒトＩＩ型プロコラーゲンは軟骨の損傷の治
療という特別な用途を有することを意図する。更に、本
発明の方法に従って発現されたｐｒｏα１（Ｉ）３量体
から成るヒトＩ型プロコラーゲンの修飾された型もまた
意図する。また、トランスフェクトしたヒト遺伝子由来
の２つのｐｒｏα１（Ｉ）及び１つのｐｒｏα２（Ｉ）
鎖から成るＩ型プロコラーゲンも意図する。また、トラ
ンスフェクシトしたヒト遺伝子由来の３つのｐｒｏα１
（ＩＩＩ）鎖から成るＩＩＩ型プロコラーゲンも意図さ
れる。加えて、これらのコラーゲンの特別に設計された
型も意図する。
【００２１】少なくとも１つのヒトプロコラーゲンまた
はコラーゲン遺伝子を細胞にトランスフェトし、そして
プロコラーゲンまたはプロコラーゲン遺伝子由来の、ヒ
トｐｒｏα１（Ｉ）部位及び非ヒトｐｒｏα２（Ｉ）部
位または非ヒトｐｒｏα１（Ｉ）部位及びヒトｐｒｏα
２（Ｉ）部位から成る［ｐｒｏα１（Ｉ）］2ｐｒｏα
２（Ｉ）分子以外の分子を含む細胞を選択することから
成る、細胞内で繊維性コラーゲンを合成するための方法
が提供される。更に、少なくとも１つのプロコラーゲン
遺伝子が突然変異、変異、ハイブリッド、または組み換
え遺伝子にする方法も意図する。加えて、本発明は、少
なくとも１つのプロコラーゲン遺伝子をトランスフェク
トされた実質上全ての細胞が、ＩＩＩ型及び他のプロコ
ラーゲン遺伝子を含む方法を提供する。更に、トランス
フェクト細胞がヒト腫瘍細胞、限定されないが、とくに
ＨＴ−１０８０細胞である方法を意図する。トランスフ
ェクトされた各細胞が、実質上内因性コラーゲン分子、
内因性Ｉ型プロコラーゲン分子、内因性ＩＩ型プロコラ
ーゲン分子、内因性ＩＩＩ型プロコラーゲン分子、また
は内因性ＩＶ型プロコラーゲン分子を含まない方法も提
供する。実質上すべてのトランスフェクト細胞が少なく
とも１つのトランスフェクトしたコラーゲン遺伝子を含
み、そして少なくとも１つのトランスフェクトした遺伝
子由来の鎖をもつ、ヒトｐｒｏα１（Ｉ）部位及び非ヒ
トｐｒｏα２（Ｉ）部位または非ヒトｐｒｏα１（Ｉ）
部位及びヒトｐｒｏα２（Ｉ）部位から成る［ｐｒｏα
１（Ｉ）］2ｐｒｏα２（Ｉ）コラーゲン以外のプロコ
ラーゲンまたはプロコラーゲン分子を発現する、別の方
法を提供する。実質上すべてのトランスフェクト細胞が
少なくとも１つのトランスフェクトしたヒトプロコラー
ゲン遺伝子を含み、そしてトランスフェクシトしたコラ
ーゲン遺伝子由来の３つの鎖をもつプロコラーゲン分子
を発現する、別の好ましい方法を提供する。
【００２２】本発明は下記の実施例によって更に詳細に
記載されるが、これらに限定するものではない。
【００２３】
【実施例】実施例１ ヒトＩＩ型プロコラーゲンの合成 本発明に記載される組み換えＣＯＬ１Ａ１遺伝子のコン
ストラクトはプロモーターをもつＣＯＬ１Ａ１の５’端
断片、エクソン１、及びＣＯＬ２Ａ１遺伝子のエクソン
３から５４に融合したイントロン１を含んだ。ハイブリ
ッドコンストラクトをＨＴ−１０８０細胞にトランスフ
ェクトした。これらの細胞にネオマイシン耐性遺伝子を
共トランスフェクトし、ネオマイシンアナログであるＧ
４１８の存在下で培養した。ハイブリッドコンストラク
トをトランスフェクト細胞作成に使用した。
【００２４】ヒトＩＩ型プロコラーゲンのｍＲＮＡを合
成する一群のクローンを得た。合成されるタンパク質を
解析するため、細胞を［14Ｃ］プロリンと共にインキュ
ベートし、14Ｃラベルされた培養液タンパク質をゲル電
気泳動により解析した。図１参照。レーン１に示される
ように培養液タンパク質は通常細胞が合成するＩＶ型コ
ラーゲンのｐｒｏα１（ＩＶ）及びｐｒｏαＩＩ（Ｉ
Ｖ）鎖に加えて、期待されたｐｒｏα１（ＩＩ）鎖から
なるＩＩ型プロコラーゲンを含んだ。レーン２及び３に
示されるようにＩＩ型プロコラーゲンは１ステップのイ
オン交換クロマトグラフィーにより、容易に精製され
る。培養液中に分泌されたＩＩ型プロコラーゲンはプロ
テアーゼ−温度安定性テストによると、正しく折り畳ま
れていた。図２参照。
【００２５】実施例２ ヒトＩ型プロコラーゲンの合成 第二の実施例として、ＨＴ−１０８０細胞にＣＯＬ１Ａ
１遺伝子及びＣＯＬ１Ａ２遺伝子を共トランスフェクト
した。両遺伝子は全長ｃＤＮＡに結合したサイトメガロ
ウイルスプロモーターから成る。ＣＯＬ１Ａ２遺伝子コ
ンストラクトはネオマイシン耐性遺伝子を含むが、ＣＯ
Ｌ１Ａ１遺伝子コンストラクトは含まない。ネオマイシ
ンアナログのＧ４１８存在下での増殖を見ることによ
り、ＣＯＬ１Ａ２−ネオマイシン耐性遺伝子コンストラ
クトを発現する細胞を選んだ。次にヒトｐｒｏα１
（Ｉ）鎖に対する特異的ポリクローナル抗体により培養
液中のＣＯＬ１Ａ１の発現を調べた。結果（図３参照）
は、細胞はおそらく２つのｐｒｏα１（Ｉ）鎖及び１つ
のｐｒｏα２（Ｉ）鎖の通常のヘテロ３量体構造から成
るヒトＩ型プロコラーゲンを合成することを示した。
【００２６】表１はヒトプロコラーゲン遺伝子を含むＤ
ＮＡコンストラクトのまとめを示す。コンストラクトは
適切なプロモーター断片に加えて、遺伝子断片または遺
伝子由来のｃＤＮＡ断片の分離された断片から構築し
た。
【００２７】
【表１】
【００２８】実施例３ 細胞トランスフェクション 細胞トランスフェクト実験のためにベクターからコンス
トラクトを切り出すため、遺伝子コンストラクトを含む
コスミドプラスミドクローンを制限酵素で切断した。ネ
オマイシン耐性遺伝子を含むプラスミドベクター、Ｌａ
ｗ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．
１９８３，３，２１１０−２１１５、をＢａｍＨＩで切
断し、線状化した。２つの標本を遺伝子コンストラクト
対ネオマイシン耐性遺伝子の比がおよを１０：１になる
ように混合し、そして混合物をリン酸カルシウム共沈澱
法、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ． Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，第２版 （１９８
９）、によるＨＴ−１０８０細胞へのトランスフェクト
に使用した。１００ｍｌプレートの集密前の細胞当た
り、およそ１０μgのキメラ遺伝子コンストラクトとな
るように、リン酸カルシウム溶液中のＤＮＡを培養細胞
上に撒いた。細胞を１０％新生ウシ血清を含むＤＭＥＭ
培養液中で１０時間インキュベートした。標本に３分間
１５％グリセロール溶液を加えることによりグリセロー
ルショックを与えた。細胞を新生ウシ血清を含むＤＭＥ
Ｍ培養液に移し２４時間培養し、次にＧ４１８を４５０
μg／ｍｌ含む同培養液に移した。Ｇ４１８を含む培養
液中でのインキュベートを３日ごとに培養液を取り替
え、およそ４週間続けた。Ｇ４１８耐性細胞をプール
し、またはフォーカスをプラスチックシリンダーを用い
て単離し、副培養することにより得たクローンに分け
た。
【００２９】実施例４ ウエスタンブロッティング ＣＯＬ２Ａ１遺伝子の発現を解析するため、ＩＩ型コラ
ーゲンのＣＯＯＨ端のテロペプチドに存在するアミノ酸
配列をもつ２３残基の合成ペプチドを用いて、ウサギ中
でポリクローナル抗体を調製した。Ｃｈｅａｈ ｅｔ
ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．
Ｓ．Ａ．１９８５，８２，２５５５−２５５９参照。抗
体はウエスタンブロッティングにおいて、ヒトＩ型プロ
コラーゲンまたはコラーゲン、ヒトＩＩ型プロコラーゲ
ンまたはコラーゲン、またはネズミ科のＩ型コラーゲン
のα鎖とは反応しなかった。ＣＯＬ１Ａ１遺伝子の発現
を解析するため、ｐｒｏα１（Ｉ）鎖のＣＯＯＨ端ポリ
ペプチドと反応するポリクローナル抗体を用いた。Ｏｌ
ｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９
９１，２６６，１１１７−１１２１参照。
【００３０】プールしたクローンまたは個々のクローン
から培養液を除去し、３０％飽和になるまで固体の硫酸
アンモニウムを加えることにより別々に沈澱させ、沈澱
物を１４，０００×ｇで遠心分離して集めた。そして次
に０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．
５ｍＭ Ｎ−エチルマレイミド、０．１ｍＭ ｐ−アミ
ノベンズアミヂン及び５０ｍＭ トリス塩酸（４℃でｐ
Ｈ７．４）を含む緩衝液に対して透析した。標本の一部
を１％ＳＤＳ、５０ｍＭ ＤＴＴ及び１０％（Ｖ／Ｖ）
グリセロール中で、５分間１０℃に加熱し、ミニゲル装
置（Ｈｏｌｆｏｒｄ ＳＥ２５０，Ｈｏｌｆｏｒｄ Ｓ
ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いた６％ポリアクリルアミド
ゲル上、１２５Ｖで９０分間の電気泳動により分離し
た。分離されたタンパク質をポリアクリルアミドゲルか
らニトロセルロース膜（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ａｎｄ
Ｓｃｈｕｅｌｌ）へ４０Ｖで９０分間電気ブロットし
た。移したタンパク質を１：５００（Ｖ／Ｖ）希釈した
ポリクローナル抗体と３０分間反応させた。抗体と反応
したタンパク質はアルカリホスファターゼに結合した抗
ウサギＩｇＧ二次抗体（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃ
ｈ）により３０分間で検出させた。製造業者の説明書に
従い、アルカリホスファターゼをＮＢＴ／ＢＣＩＰ（Ｐ
ｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）により可視化した。
【００３１】実施例５ 分泌プロコラーゲンの正しい折
り畳みの証明 トランスフェクトした細胞により合成され、分泌された
プロコラーゲンが正しく折り畳まれていることを証明す
るために、培養液中のタンパク質を、正しく折り畳まれ
たプロコラーゲン及びコラーゲンのみが切断耐性となる
条件下で高濃度のプロテアーゼにより切断した。トリプ
シン及びキモトリプシンの組み合わせで切断するため
に、２５ｃｍフラスコの細胞層を、１０ｍＭ ＥＤＴＡ
及び０．１％ Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０（Ｓｉｇｍ
ａ）を含む０．５ｍｌの修飾クレブスＩＩ培養液中にか
き集めた。細胞をボルテックスミキサーに１分間かけて
激しく撹拌し、直ちに４℃に冷却した。上清を新しいチ
ューブに移した。標本を記載の温度で１０分間プレイン
キュベートし、同じ温度で２分間切断を行った。切断の
ために、１ｍｇ／ｍｌのトリプシン及び２．５ｍｇ／ｍ
ｌのα−キモトリプシン（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａ
ｎｎｈｅｉｍ）を含む修飾クレブスＩＩ培養液を０．１
体積加えた。５ｍｇ／ｍｌのダイズトリプシンインヒビ
ター（Ｓｉｇｍａ）を０．１体積加えて切断反応を停止
した。
【００３２】切断産物の解析のため、標本に１０％ＳＤ
Ｓ、５０％グリセロール及び０．０１２％ブロモフェノ
ールブルーを含む０．６２５Ｍ トリス塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ６．８）から成る５×電気泳動緩標本衝液を０．２体
積加え、直ちに沸騰水中に２分間浸した。標本に２％の
２−メルカプトエタノールを加え、沸騰水中で３分間イ
ンキュベートすることによって還元した後、標本をＳＤ
Ｓゲルにアプライした。Ｗｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕ
ｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ １９８３，２５８，７７２１−７７２８に記載
の小さな修飾をしたＬａｅｍｍｌｉ，Ｎａｔｕｒｅ １
９７９，２２７，６８０−６８５の不連続システムを用
いて、電気泳動を行った。
【００３３】実施例６ 特異的に作成したプロコラーゲ
ン及びコラーゲン 図４に示すように、ヒトＩ型プロコラーゲンのｐｒｏα
１（Ｉ）鎖の、あるゲノムＤＮＡ及びあるｃＤＮＡから
成るハイブリッド遺伝子を最初の材料とした。ハイブリ
ッド遺伝子のＤＮＡ配列を解析し、繰り返しＤ−領域間
のつなぎめをつくるアミノ酸に対応するコドンを、コー
ドするアミノ酸は変えずにハイブリッド遺伝子を切断す
るための特異的な制限酵素認識部位をつくるように修飾
した。
【００３４】Ａ．組み換えプロコラーゲンまたはコラー
ゲン ｐｒｏα１（Ｉ）のＤＩＩＩ領域をＳｒｆＩ及びＮａｅ
Ｉ制限酵素で切断する。Ｄ３領域に存在するコラーゲナ
ーゼ認識部位にあるアミノ酸をコードする塩基を、他の
アミノ酸配列をコードするように修飾する。カセットを
増幅し、遺伝子に再挿入する。適切な宿主における遺伝
子の発現の結果、コラーゲナーゼによって切断されない
Ｉ型コラーゲンができる。
【００３５】Ｂ．プロコラーゲンまたはコラーゲンの欠
損突然変異体 （ｐｒｏα１（Ｉ）鎖の）Ｄ２領域カセットを上記の遺
伝子からＳｍａＩ切断によって切り出す。遺伝子を再重
合させ、Ｄ２領域のコドンの、フレームのあった欠損を
もつ遺伝子を作成した。
【００３６】Ｃ．プロコラーゲンまたはコラーゲンの付
加突然変異体 プロコラーゲンまたはコラーゲンの所望の領域を複数コ
ピー提供するため、１つ若しくはそれ以上のＤカセット
の複数コピーを、作成した部位に挿入してもよい。
【００３７】実施例７ 組み換えＤＮＡシステムにおけ
るヒトプロリル４−ヒドロキシラーゼの発現 昆虫細胞においてプロリル４−ヒドロキシラーゼの２つ
の遺伝子を発現させるため、下記の方法を実行した。Ｓ
ｍａＩ部位にヒトプロリル４−ヒドロキシラーゼのαサ
ブユニットの全長ｃＤＮＡを含むｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐ
ｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）ベクター、ＰＡ−５８（Ｈ
ｅｌａａｋｏｓｋｉ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１９８９，８
６，４３９２−４３９６）をＳｍａＩ部位に近接してい
るＰｓｔＩ及びＢａｍＨＩで切断することにより、バキ
ュロウイルス転移ベクターｐＶＬα５８を構築した。得
られた、６１ｂｐの５’非翻訳配列、全コーディング領
域、及び５５１ｂｐの３’非翻訳配列を含むＰｓｔＩ−
ＰｓｔＩ断片及びＰｓｔＩ−ＢａｍＨＩ断片、をバキュ
ロウイルス翻訳ベクターｐＶＬ１３９２（Ｌｕｃｋｏ
ｗ，Ｖ．Ａ．ａｎｄＳｕｍｍｅｒｓ，Ｍ．Ｄ．，Ｖｉｒ
ｏｌｏｇｙ １９８９，１７０，３１−３９）のＰｓｔ
Ｉ−ＢａｍＨＩ部位にクローニングした。バキュロウイ
ルス転移ベクターｐＶＬα５９をｐＶＬ１３９２及びヒ
トプロリル４−ヒドロキシラーゼのαサブユニットをコ
ードする別のｃＤＮＡクローン、ＰＡ−５９（Ｈｅｌａ
ａｋｏｓｋｉ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，ｓｕｐｒａ）から、
同様に構築した。ｃＤＮＡクローン、ＰＡ５８とＰＡ５
９は６４ｂｐ長さが異なる。
【００３８】ｐＶＬβベクターを４４ｂｐの５’非翻訳
配列、全コーディング領域、及び２０７ｂｐの３’非翻
訳配列を含むヒトプロリル４−ヒドロキシラーゼβサブ
ユニットの全長ｃＤＮＡのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断
片、Ｓ−１３８（Ｐｉｈｌａｊａｎｉｅｍｉ，ｅｔ ａ
ｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．１９８７，６，６４３−６４９）
をＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩで切断したｐＶＬ１３９２と
結合させて作成した。組み換えバキュロウイルス転移ベ
クターを野生型Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒ
ｎｉｃａ ｎｕｃｌｅａｒ ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ
ｖｉｒｕｓ（ＡｃＮＰＶ）ＤＮＡとリン酸カルシウム
トランスフェクト法により、Ｓｆ９細胞（Ｓｕｍｍｅｒ
ｓ，Ｍ．Ｄ．ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｅ．，Ｔｅｘ．
Ａｇｒｉｃ．Ｅｘｐ．Ｓｔ．Ｂｕｌｌ．１９８７，１５
５５，１−５６）に共トランスフェクトした。４日後、
得られたトランスフェクト細胞の上清中のウイルスプー
ルを回収し、プラーク解析に用いた。組換え交叉（ｏｃ
ｃｌｕｓｉｏｎ）陰性プラークを３回プラーク精製工程
にかけ、野生型ウイルスの混入が全くない組み換えウイ
ルスを作成した。スクリーニング工程及び組み換えウイ
ルスの精製はＳｕｍｍｅｒｓ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ，ｓ
ｕｐｒａの方法に従って行った。ｐＶＬα５８、ｐＶＬ
α５９及びｐＶＬβから得られた組み換えウイルスを、
それぞれα５８ウイルス 、α５９ウイルス及びβウイ
ルスとした。
【００３９】Ｓｆ９細胞を１０％ウシ胎児血清を含むＴ
ＮＭ−ＦＨ培養液（Ｓｉｇｍａ）中２７℃で単層培養若
しくはスピナーフラスコ（Ｔｅｃｈｎｅ）中で浮遊培養
した。組み換えタンパク質を合成するため、α５８、α
５９またはβウイルスをそれぞれ単独に使用する場合、
１ｍｌあたり１０6細胞の濃度で撒いたＳｆ９細胞に５
−１０倍の組み換えウイルスを注入した。プロリル４−
ヒドロキシラーゼ４量体を製造する場合、α及びβウイ
ルスを１：１０−１０：１の割合で感染に用いた。感染
７２時間後細胞を回収し、０．０１Ｍ トリスｐＨ７．
８／０．１ＭＮａＣｌ／０．１Ｍ グリシン／１０μＭ
ジチオスレイトール／０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−
１００中でホモジェナイズし、遠心分離した。得られた
上清をＳＤＳ／１０％ＰＡＧＥまたは未変性７．５％Ｐ
ＡＧＥによって解析し、酵素活性を解析した。細胞の沈
澱物を１％ＳＤＳ中で更に可溶化し、ＳＤＳ／１０％Ｐ
ＡＧＥによって解析した。感染後２４−９６時間後の細
胞培養液もＳＤＳ／１０％ＰＡＧＥによって解析し、培
養液中への合成タンパク質の分泌の有無を分析した。こ
れらの実験に用いた細胞は無血清ＴＮＭ−ＦＨ培養液中
で培養した。
【００４０】タンパク質発現のタイムコースを調べる
際、組み換えウイルスに感染したＳｆ９細胞を感染後２
４から５０時間の間の様々な２時間［35Ｓ］メチオニン
（１０μＣｉ／μｌ；Ａｍｅｒｓｈａｍ；１Ｃｉ＝３７
Ｃｂｑ）でラベルし、そしてＳＤＳ／１０％ＰＡＧＥに
よって解析するために集めた。組み換えタンパク質の最
大蓄積を決定するために感染後２４から９６時間後の様
々な時点で細胞を回収し、ＳＤＳ／１０％ＰＡＧＥによ
って解析した。細胞の０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ可溶
画分及び１％ ＳＤＳ可溶画分を解析した。プロリル４
−ヒドロキシラーゼ活性を２−オキソ［１−14Ｃ］グル
タール酸の脱炭酸化（Ｋｉｖｉｒｉｋｋｏ，Ｋ．Ｉ．，
ａｎｄ Ｍｙｌｌｙｌａ，Ｒ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅ
ｎｚｙｍｏｌ．１９８２，８２，２４５−３０４）に基
づく方法により分析した。他の基質濃度を一定に保った
とき、一定濃度の第２の基質存在下での第１の基質濃度
を変化させることによりＫｍ値を決定した。（Ｍｙｌｌ
ｙｌａ、Ｒ．，Ｔｕｄｅｒｍａｎ，Ｌ．，ａｎｄ Ｋｉ
ｖｉｒｉｋｋｏ，Ｋ．Ｉ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．１９７７，８０，３４９−３５７）。βサブユニッ
トのタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ活性をグルタ
チオン：インスリン トランスヒドロゲナーゼ分析によ
って測定した（Ｃａｒｍｉｃｈａｅｌ ｅｔ ａｌ．，
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９７７，２５２，７１６３
−７１６７）。ヒトプロリル４−ヒドロキシラーゼのβ
サブユニットに対するモノクローナル抗体５Ｂ５（Ｈｏ
ｙｈｔｙａ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．１９８４，１４１，４７７−４８２）を用いて
ウエスタンンブロット解析を行った。ポリ（Ｌ−プロリ
ン）親和性クロマトグラフィー、ＤＥＡＥ−セルロース
クロマトグラフィー及びゲル濾過から成る工程（Ｋｉｖ
ｉｒｉｋｋｏ Ｋ．Ｉ．，ａｎｄ Ｍｙｌｌｙｌａ，
Ｒ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９８７，１
４４，９６−１１４）に従ってプロリル４−ヒドロキシ
ラーゼを精製した。
【００４１】図５は親和性カラムクロマトグラフィーに
よるタンパク質精製後の、昆虫細胞により合成されたプ
ロリル４−ヒドロキシラーゼの解析を示す。未変性ゲル
を用いたポリアクリクアミドゲル電気泳動により分析し
たところ、組み換え酵素はニワトリ胚から精製した通常
の酵素の４量体活性型と同じ移動度を示した。組み換え
酵素を還元後、α及びβサブユニットが検出された。表
２に組み換え酵素の酵素活性のデータを示した。他の基
質濃度を一定に保ったとき、一定濃度の第２の基質存在
下での第１の基質濃度を変化させることによりＫｍ値を
決定した。
【００４２】
【表２】
【００４３】記載されているように、組み換え酵素のミ
カエリス−メンテン（Ｋｍ）値はニワトリ胚由来の本物
の通常酵素の値と同じであった。トランスフェクトした
昆虫細胞は大量の活性型プロリル４−ヒドロキシラーゼ
を合成するので、大量のプロコラーゲン及びコラーゲン
の合成を得るために、プロコラーゲン及びコラーゲンを
コードする本発明の遺伝子をトランスフェクトするのに
適切な細胞である。本発明の遺伝子の細胞へのトランス
フェクトは実施例３に記載されるように行う。
【００４４】実施例８ プロリル４−ヒドロキシラーゼ
組み換え遺伝子を発現するサッカロミセス セレビシエ
（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａ
ｅ）酵母中での組み換えコラーゲン遺伝子の発現 酵母サッカロミセス セレビシア（Ｓａｃｃｈａｒｏｍ
ｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）はどの多量の発現ベ
クターとも利用できる。最も一般的に使用される発現ベ
クターのひとつは酵母及び大腸菌（E.coli）の両方にお
ける増殖の為の配列、酵母のプロモーター、及び外来遺
伝子の効率的な伝達の為のターミネーターを含む多コピ
ー２μプラスミドである。２μプラスミドに基づくその
ようなベクターの典型的な例は２ ＯＲＩ−ＳＴＢ因
子、ＧＡＬ１プロモーター、及び２μ Ｄ遺伝子ターミ
ネーターをもつｐＷＹＧ４である。このベクターのＮｃ
ｏＩ部位はプロリル４−ヒドロキシラーゼのα若しくは
βサブユニット遺伝子の挿入に使用するＡＴＧを含む。
別の例として、発現ベクターは天然の２μ ＯＲＩ、Ｓ
ＴＢ、ＲＥＰ１及びＲＥＰ２、ＧＡＬ７プロモーターを
もち、ＦＬＰターミネーターを使用するｐＷＹＧ７Ｌを
用いることもできる。このベクターではプロリル４−ヒ
ドロキシラーゼのα若しくはβサブユニットの遺伝子
は、５’端のＢａｍＨＩ若しくはＮｃｏＩ部位でポリリ
ンカーに挿入される。プロリル４−ヒドロキシラーゼ遺
伝子を含むベクターを、細胞壁を除去し、カルシウム及
びポリエチレングリコール処理によりＤＮＡを取り込む
スフェロプラストにした後、若しくは未処理の細胞をリ
チウムイオンで処理した後、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
に形質転換した。または、ＤＮＡをエレクトロポーレー
ションによって導入することもできる。ロイシン、トリ
プトファン、ウラシルまたはヒスチジン要求性の宿主酵
母細胞を用い、ＬＥＵ２、ＴＲＰ１、ＵＲＡ３、ＨＩＳ
３、またはＬＥＵ２−Ｄのような選択マーカー遺伝子を
利用して、形質転換体を選択できる。ガラクトースプロ
モーターによるプロリル４−ヒドロキシラーゼ遺伝子の
発現はガラクトースの付加により素早い誘導がかかるよ
うに非抑制、非誘導糖の存在下で培養増殖させ；グルコ
ース培養液中で培養増殖し、そして遠心分離によりグル
コースを除去し、そしてガラクトース培養液中に懸濁す
る前に細胞を洗い；そしてグルコース及びガラクトース
を含む培養液中で培養増殖し、ガラクトース誘導がかか
る前にグルコースを優先的に代謝させることにより誘導
できる。安定な３重ヘリックス構造に折り畳まれ、従っ
て通常の生物学的機能を有するのに必要な折り畳みを伴
うように、プロリル４−ヒドロキシラーゼにより適切に
ヒドロキシル化されたコラーゲンまたはプロコラーゲン
の発現を得るため、プロリル４−ヒドロキシラーゼの両
サブユニットの遺伝子及び所望のコラーゲンまたはプロ
コラーゲン遺伝子を細胞に取り込ませるように、さらに
形質転換細胞の処置を上記のように行う。
【００４５】実施例９ プロリル４−ヒドロキシラーゼ
組み換え遺伝子発現Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ酵母
における組み換えコラーゲン遺伝子の発現 プロリル４−ヒドロキシラーゼ及びプロコラーゲンまた
はコラーゲン遺伝子の発現は、大規模工程において組み
換えタンパク質を多量に生産するという特別な利点をも
つと思われるＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓのような
非サッカロミセス酵母においても可能である。メチロト
ローフＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおける典型的な発現はア
ルコールオキシダーゼをコードし、厳密に制御されるＡ
ＯＸ１遺伝子由来のプロモーターによって得られ、培養
液中にメタノールを加えることによりプロモーターに制
御される組み換えタンパク質の高発現を誘導できる。
Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓは本来プラスミドをもたないので
この酵母は染色体組み込み用に設計された発現ベクター
とともに扱い、ＨＩＳ４などの遺伝子を選択に用いる。
同じ細胞を更に処理することにより、組み替えタンパク
質がプロリル４−ヒドロキシラーゼによって適切にヒド
ロキシル化され、従って繊維型をとるタンパク質の通常
の生物学的機能に必要な、安定なヘリックスに折り畳ま
れ得る条件下で、本明細書に記載のプロコラーゲン及び
コラーゲン遺伝子の発現を行う。
【００４６】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Thomas Jefferson University <120> SYNTHESIS OF HUMAN PROCOLLAGENS AND COLLAGENS IN RECOMBINANT DNA <130> 012989 <150> US 780,899 <151> 1991-10-23 <160> 7 <210> 1 <211> 4 <212> PRT <213> Human <400> 1 Arg Tyr His Asp 1 <210> 2 <211> 12 <212> DNA <213> Human <400> 2 agg tac cat gac 12 Arg Tyr His Asp 1 <210> 3 <211> 4 <212> PRT <213> Human <400> 3 Phe Pro Gly Ala 1 <210> 4 <211> 4 <212> PRT <213> Human <400> 4 Leu Pro Gly Pro 1 <210> 5 <211> 12 <212> DNA <213> Human <400> 5 ctc cct ggt cct 12 Leu Pro Gly Pro 1 <210> 6 <211> 12 <212> DNA <213> Human <400> 6 ctg ccc ggg cct 12 Leu Pro Gly Pro 1 <210> 7 <211> 4 <212> PRT <213> Human <400> 7 Ala Ala Gly Arg 1
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は最初の２つのエクソンを除くＣＯＬ２Ａ
１をすべて含む３０Ｋｂの断片に結合したヒトＣＯＬ１
Ａ１遺伝子のプロモーター、最初のエクソン及び最初の
イントロンの大部分を含む遺伝子コンストラクトをトラ
ンスフェクトされたＨＴ−１０８０細胞から培養液中に
分泌されたタンパク質のＳＤＳポリアクリルアミド電気
泳動による解析を示す写真である。培養液タンパク質を
オートラジオグラフィー（ｓｔｏｒａｇｅ ｐｈｏｓｐ
ｈｏｒ ｆｉｌｍ ａｎａｌｙｚｅｒ）で解析出来るよ
うに、細胞を［14Ｃ］プロリンとともにインキュベート
した。レーン１は未精製培養液タンパク質が３つの主要
ポリペプチド鎖から成ることを示す。上側の２つはコン
ストラクトをトランスフェクトされていない細胞によっ
て合成されるＩＶ型コラーゲンのｐｒｏα１（ＩＶ）及
びｐｒｏα２（ＩＶ）鎖である（示されていない）。３
番目のバンドはコンストラクトから合成されたヒトＩＩ
型プロコラーゲンのｐｒｏα１（ＩＩ）鎖である。レー
ン２及び３は培養液をイオン交換カラム（ＤＥ−５２，
Ｗｈａｔｍａｎ，レーン２はｐＨ７．４レーン３はｐＨ
７．０）によるクロマトグラフィーにかけた後の同じ培
養液タンパク質である。ＩＩ型プロコラーゲンはイオン
交換カラムの排出体積（ｖｏｉｄ ｖｏｌｕｍｅ）中に
現れる。
【図２】図２は図１に示される細胞から培養液中に分泌
されたＩＩ型プロコラーゲンが正しい本来の構造に折り
畳まれたことを示す写真である。正しく折り畳まれた３
重ヘリックスプロコラーゲンまたはコラーゲンは切断耐
性を示すが、折り畳まれていない、若しくは不正確に折
り畳まれたプロコラーゲンまたはコラーゲンは小さな断
片に切断されてしまう条件下で、培養液タンパク質を高
濃度のトリプシン及びキモトリプリンにより、示した温
度において切断した（Ｂｒｕｃｋｎｅｒ及びＰｒｏｃｋ
ｏｐ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９８
１，１１０，３６０）。次に切断産物をＳＤＳポリアク
リルアミド電気泳動及びフルオログラフィーによって解
析した。結果は、通常、ＩＩ型プロコラーゲンが折り畳
まれない温度である４３℃までは、ＩＩ型プロコラーゲ
ンは切断耐性であることを示した。従って、ＩＩ型プロ
コラーゲンは正しく折り畳まれており、コラーゲン繊維
の合成に使用できる。
【図３】図３はＣＯＬ１Ａ１遺伝子及びＣＯＬ１Ａ２遺
伝子を共トランスフェクトしたＨＴ−１０８０細胞の培
養液の解析を示す写真である。ＣＯＬ１Ａ２は活性ネオ
マイシン耐性遺伝子に結合させたが、ＣＯＬ１Ａ１は結
合させなかった。ネオマイシンのアナログであるＧ４１
８を用いてＣＯＬ１Ａ２−ネオマイシン耐性遺伝子コン
ストラクトの発現細胞をスクリーニングした。ヒトｐｒ
ｏα１（Ｉ）鎖特異的ポリクローナル抗体を用いたウエ
スタンブロッティングにより培養液中のＣＯＬ１Ａ１発
現を解析した。レーン１は培養液タンパク質がｐｒｏα
（Ｉ）鎖を含むことを示す。レーン２はｐｒｏα１
（Ｉ）鎖及び部分的にプロセシングされたｐＣα１
（Ｉ）鎖を含むＩ型プロコラーゲンの信頼できる標準で
ある。結果は、細胞が合成したｐｒｏα１（Ｉ）を含む
ヒトＩ型プロコラーゲンはおそらく、２つのｐｒｏα
（Ｉ）鎖及び１つのｐｒｏα２（Ｉ）鎖から成る、通常
のヘテロ３量体型になっていることを示す。
【図４】図４は特異的な制限酵素によって切断される人
工的部位を含むように修飾したヒトＩ型プロコラーゲン
のｐｒｏα１（Ｉ）鎖のｃＤＮＡの構成図を示す。
【図５】図５は精製したニワトリプロリル４−ヒドロキ
シラーゼ（レーン１及び４）及びヒトプロリル４−ヒド
ロキシラーゼのα−サブユニット及びβ−サブユニット
遺伝子を発現し、かつα５８／βウイルス（レーン２及
び５）またはα５９／βウイルス（レーン３及び６）に
感染したＳｆ９細胞から培養液中に分泌されたタンパク
質の未変性７．５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動
（レーン１−３）及び１０％ＳＤＳポリアクリルアミド
ゲル電気泳動（レーン４−６）による解析を示す写真で
ある。α５８／β及びα５９／βは６４塩基対長さが異
なる。レーン１−３は未変性条件下で分離したタンパク
質であり、２種のサブユニットの４量体を示す。レーン
４−６は変性条件下の同じタンパク質であり、２つのサ
ブユニットが分離したバンドとしてあらわれている。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 19/10 Ａ６１Ｐ 21/00 21/00 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ // Ｃ１２Ｎ 15/09 Ａ６１Ｋ 37/12 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (72)発明者 アラ−コッコ，レンナ フィンランド国 エスエフ−90530 オウ ル，トイボンティエ 25 ア５ 17 (72)発明者 フェルタラ，アンドルズィー アメリカ合衆国ペンシルバニア州19107, フィラデルフィア，ウォールナット・スト リート 1000 (72)発明者 シエロン，アレクサンダー アメリカ合衆国ペンシルバニア州19107, フィラデルフィア，サウス・サーティーン ス・ストリート 201，ナンバー 901 (72)発明者 キビリッコ，カリ・イ フィンランド国 エスエフ−90230 オウ ル 23，ラアムサンティエ 14 ベ１ (72)発明者 ゲッディス，エイミー アメリカ合衆国ペンシルバニア州19107, フィラデルフィア，サウス・エイス・スト リート 233，アパートメント ６ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 DA03 DA12 EA02 EA06 HA15 4B064 AG01 AG26 CA02 CA06 CA10 CA12 CA19 CA20 CC24 DA03 4C084 AA01 AA02 AA06 AA07 BA02 BA08 BA22 CA18 CA53 DC50 NA06 ZA36 ZA81 ZA94 ZA96 ZA97 4H045 AA10 BA10 CA41 EA15 EA20 EA28 FA74 GA15 GA23 GA26

Claims (11)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】（ａ）ヒトのプロコラーゲン又はコラーゲ
    ンをコードする少なくとも一つのトランスフェクトされ
    た配列、並びに（ｂ）プロリル ４−ヒドロキシラーゼ
    又はそのサブユニットをコードする少なくとも一つのト
    ランスフェクトされた配列含む組換え宿主細胞によって
    産生された組換えプロコラーゲンまたは組換えコラーゲ
    ン。
  2. 【請求項２】（ａ）ヒトプロコラーゲンまたはコラーゲ
    ンをコードする少なくとも一つの配列を前記宿主細胞に
    トランスフェクトし；そして（ｂ）プロリル ４−ヒド
    ロキシラーゼ又はそのサブユニットをコードする少なく
    とも一つの配列を前記宿主細胞にトランスフェクトす
    る、ここにおいて、前記宿主細胞はプロコラーゲンまた
    はコラーゲンを産生することが可能であることを含む、
    組換えプロコラーゲンおよび／または組換えコラーゲン
    の産生に有用な宿主細胞を作成する方法によって産生さ
    れた、組換えプロコラーゲンまたは組換えコラーゲン。
  3. 【請求項３】宿主細胞においてプロコラーゲンまたはコ
    ラーゲンを産生する方法によって産生された組換えプロ
    コラーゲンまたは組換えコラーゲンであって、当該方法
    は、前記宿主細胞はヒトのプロコラーゲン又はコラーゲ
    ンをコードする少なくとも一つの配列、及びプロリル
    ４−ヒドロキシラーゼ又はそのサブユニットをコードす
    る少なくとも一つの配列によってトランスフェクトされ
    ており、 （ａ）上記宿主細胞をプロコラーゲンおよび／またはコ
    ラーゲンの発現を可能にする条件下で培養し；そして
    （ｂ）プロコラーゲンおよび／またはコラーゲンを単離
    することを含む、前記組換えプロコラーゲンまたは組換
    えコラーゲン。
  4. 【請求項４】完全にはグリコシル化されていない、組換
    えプロコラーゲンまたは組換えコラーゲン。
  5. 【請求項５】完全にはリシル−ヒドロキシル化されてい
    ない、組換えプロコラーゲンまたは組換えコラーゲン。
  6. 【請求項６】完全にはプロリル−ヒドロキシル化されて
    いない、組換えプロコラーゲンまたは組換えコラーゲ
    ン。
  7. 【請求項７】一つの特定の型のプロコラーゲンまたはコ
    ラーゲンのみからなり、他のすべての型のプロコラーゲ
    ンまたはコラーゲンを実質的に含まない、組換えプロコ
    ラーゲンまたは組換えコラーゲン。
  8. 【請求項８】Ｉ型でない他のすべての型のプロコラーゲ
    ンまたはコラーゲンを実質的に含まない、組換えＩ型プ
    ロコラーゲンまたは組換えＩ型コラーゲン。
  9. 【請求項９】ＩＩ型でない他のすべての型のプロコラー
    ゲンまたはコラーゲンを実質的に含まない、組換えＩＩ
    型プロコラーゲンまたは組換えＩＩ型コラーゲン。
  10. 【請求項１０】ＩＩＩ型でない他のすべての型のプロコ
    ラーゲンまたはコラーゲンを実質的に含まない、組換え
    ＩＩＩ型プロコラーゲンまたは組換えＩＩＩ型コラーゲ
    ン。
  11. 【請求項１１】ＩＶ型でない他のすべての型のプロコラ
    ーゲンまたはコラーゲンを実質的に含まない、組換えＩ
    Ｖ型プロコラーゲンまたは組換えＩＶ型コラーゲン。
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