DE60036636T2 - Bovines kollagen und verfahren zur herstellung rekombinanter gelatine - Google Patents

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Description

  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft die rekombinante Synthese von Kollagenen und Gelatinen, die von Tiersequenzen abgeleitet werden. Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere neuartige Polynukleotidsequenzen, die bovine Kollagene kodieren, und die kodierten Polypeptidsequenzen und die Verwendung solcher Sequenzen in der rekombinanten Herstellung von Tierkollagenen und -gelatinen.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Der häufigste Bestandteil der extrazellulären Matrix stellt Kollagen dar. Kollagene stellen eine große Familie fibröser Proteine dar, die durch die Anwesenheit von dreisträngigen, helikalen Domänen gekennzeichnet sind. Kollagenmoleküle stellen im Allgemeinen das Ergebnis der trimeren Anordnung von Polypeptidketten dar, die (-Gly-X-Y-)n-Wiederholungen enthalten, die die Bildung der dreifach helikalen Domänen erlauben (van der Rest et al. (1991) FASER J. 5: 2814-2823).
  • Kollagen
  • Zur Zeit sind ungefähr zwanzig verschiedene Kollagentypen in Vertebraten identifiziert worden, einschließlich bovinen bzw. Rinder-, ovinen bzw. Schafs-, Schweine-, Hühner- und menschlichen Kollagenen. Im Allgemeinen werden die Kollagentypen mit römischen Ziffern nummeriert, und die Ketten, die in jedem Kollagentyp gefunden werden, werden mit arabischen Ziffern identifiziert. Detaillierte Beschreibungen der Struktur und der biologischen Funktionen der verschiedenen unterschiedlichen Typen natürlich vorkommender Kollagene sind im Stand der Technik allgemein verfügbar. (Siehe z. B. Ayad et al. (1998) The Extracellular Matrix Facts Book, Academic Press, San Diego, CA; Burgeson, R. E. und Nimmi (1992) "Collagen types: Molecular Structure and Tissue Distribution" in Clin. Orthop. 282: 250-272; Kielty, C. M. et al. (1993) "The Collagen Family: Structure, Assembly And Organization In The Extracellular Matrix", Connective Tissue And Its Heritable Disorders, Molecular Genetics, And Medical Aspects, Royce, P. M. und B. Steinmann Hrsg., Wiley-Liss, NY, S. 103-147 und Prockop, D.J. und K.I. Kivirikko (1995) "Collagens: Molecular Biology, Diseases, and Potentials for Therapy," Annu. Rev. Biochem., 64: 403-434).
  • Typ I-Kollagen stellt das wichtigste fibrilläre Kollagen der Knochen und der Haut dar, welches ungefähr 80–90% des Gesamtkollagens eines Organismus umfasst. Typ I-Kollagen stellt das wichtigste strukturelle Makromolekül dar, das in der extrazellulären Matrix von vielzelligen Organismen vorkommt, und umfasst ungefähr 20% der gesamten Proteinmasse. Typ I-Kollagen stellt ein heterotrimeres Molekül dar, welches zwei α1(I)-Ketten und eine α2(I)-Kette umfasst, die jeweils von den COL1A1- und COL1A2-Genen kodiert werden. Andere Kollagentypen sind weniger häufig als Typ I-Kollagen und weisen unterschiedliche Verbreitungsmuster auf. Zum Beispiel stellt Typ II-Kollagen das vorwiegende Kollagen im Knorpel und im Glaskörper dar, während Typ III-Kollagen in großen Mengen in Blutgefäßen und in einem geringeren Ausmaß in der Haut gefunden wird.
  • Typ II-Kollagen stellt ein homotrimeres Kollagen dar, das drei identische α1(II)-Ketten umfasst, die von dem COL2A1-Gen kodiert werden. Gereinigtes Typ II-Kollagen kann aus Geweben durch Verfahren hergestellt werden, die im Stand der Technik bekannt sind, zum Beispiel durch Verfahren, die in Miller und Rhodes (1982) Methods In Enzymology 82: 33-64 beschrieben werden.
  • Typ III-Kollagen stellt ein wichtiges fibrilläres Kollagen dar, das in der Haut und in vaskulären Geweben gefunden wird. Typ III-Kollagen stellt ein homotrimeres Kol lagen dar, das drei identische α1(III)-Ketten umfasst, die von dem COL3A1-Gen kodiert werden. Verfahren zum Reinigen des Typ III-Kollagens aus Geweben kön nen zum Beispiel in Byers et αl. (1974) Biochemistry 13: 5243-5248 und Miller und Rhodes, supra gefunden werden.
  • Typ IV-Kollagen wird in Basalmembranen eher in Form von Kissen, als in Fibrillen gefunden. Am häufigsten enthält Typ IV-Kollagen zwei α1(IV)-Ketten und eine α2(IV)-Kette. Die bestimmten Ketten, die Typ IV-Kollagen umfassen, sind gewebespezifisch. Typ IV-Kollagen kann zum Beispiel unter Verwendung der in Furuto und Miller (1987) Methods in Enzymology, 144: 41-61, Academic Press beschriebenen Verfahren gereinigt werden.
  • Typ V-Kollagen stellt ein fibrilläres Kollagen dar, das hauptsächlich in Knochen, Sehnen, der Kornea, der Haut und in Blutgefäßen gefunden wird. Typ V-Kollagen kommt sowohl in homotrimeren als auch in heterotrimeren Formen vor. Eine Form des Typ V-Kollagens stellt ein Heterotrimer aus zwei α1(V)-Ketten und einer α2(V)-Kette dar. Eine andere Form des Typ V-Kollagens stellt ein Heterotrimer aus α1(V)-, α2(V)- und α3(V)-Ketten dar. Eine weitere Form des Typ V-Kollagens stellt ein Homotrimer aus α1(V) dar. Verfahren zum Isolieren von Typ V-Kollagen aus natürlichen Quellen können zum Beispiel in Elstow und Weiss (1983) Collagen Rel. Res. 3: 181-193 und Abedin et al. (1982) Biosci. Rep. 2: 493-502 gefunden werden.
  • Typ VI-Kollagen weist eine kleine dreifach helikale Region und zwei große nicht kollagenartige übrige Abschnitte auf. Typ VI-Kollagen stellt ein Heterotrimer dar, welches α1(VI)-, α2(VI)- und α3(VI)-Ketten umfasst. Typ VI-Kollagen wird in vielen Bindegeweben gefunden. Beschreibungen, wie Typ VI-Kollagen aus natürlichen Quellen gereinigt werden kann, können zum Beispiel in Wu et al. (1987) Biochem. J. 248: 373-381 und Kielty et al. (1991) J. Cell. Sci. 99: 797-807 gefunden werden.
  • Typ VII-Kollagen stellt ein fibrilläres Kollagen dar, das in bestimmten epithelialen Geweben gefunden wird. Typ VII-Kollagen stellt ein homotrimers Molekül aus drei α1(VII)-Ketten dar. Beschreibungen, wie Typ VII-Kollagen aus Geweben gereinigt werden kann, können zum Beispiel in Lunstrum et al. (1986) J. Biol. Chem. 261: 9042-9048 und Bentz et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 3168-3172 gefunden werden.
  • Typ VIII-Kollagen kann in der Descemet-Membran in der Kornea gefunden werden. Typ VIII-Kollagen stellt ein Heterotrimer dar, das zwei α1(VIII)-Ketten und eine α2(VIII)-Kette umfasst, obwohl von anderen Kettenzusammensetzungen berichtet wurde. Verfahren für die Reinigung des Typ VIII-Kollagens aus der Natur können zum Beispiel in Benya und Padilla (1986) J. Biol. Chem. 261: 4160-4169 und Kapoor et αl. (1986) Biochemistry 25: 3930-3937 gefunden werden.
  • Typ IX-Kollagen stellt ein mit Fibrillen assoziiertes Kollagen dar, das im Knorpel und im Glaskörper gefunden wird. Typ IX-Kollagen stellt ein heterotrimeres Molekül dar, das α1(IX)-, α2(IX)- und α3(IX)-Ketten umfasst. Typ IX-Kollagen wurde als ein FACIT (Fibrillen assoziierte Kollagene mit unterbrochenen Dreifachhelices, engl.: Fibril Associated Collagens with Interrupted Triele Helices)-Kollagen klassifiziert, welches mehrere dreifach helikale Domänen besitzt, die durch nicht dreifach helikale Domänen getrennt sind. Verfahren zum Reinigen von Typ IX-Kollagen können zum Beispiel in Duance, et al. (1984) Biochem. J. 221: 885-889; Ayad et αl. (1989) Biochem. J. 262: 753-761 und Grant et al. (1988) The Control of Tissue Damage, Glauert, A. M. Hrsg., Elsevier Science Publishers, Amsterdam, S. 3-28 gefunden werden.
  • Typ X-Kollagen stellt eine homotrimere Verbindung aus α1(X)-Ketten dar. Typ X Kollagen wurde zum Beispiel aus hyertrophem Knorpel, der in Wachstumszonen gefunden wird, isoliert. (Siehe z. B. Apte et al. (1992) Eur J Biochem 206 (1): 217-24).
  • Typ XI-Kollagen kann in knorpeligen Geweben gefunden werden, die mit Typ II- und Typ IX-Kollagenen assoziiert sind, und an anderen Stellen im Körper. Typ XI-Kollagen stellt ein heterotrimeres Molekül dar, das α1(XI)-, α2(XI)- und α3(XI)- Ketten umfasst. Verfahren zum Reinigen von Typ XI-Kollagen können zum Beispiel in Grant et al., supra gefunden werden.
  • Typ XII-Kollagen stellt ein FACIT-Kollagen dar, das hauptsächlich in Assoziation mit Typ I-Kollagen gefunden wird. Typ XII-Kollagen stellt ein homotrimeres Molekül dar, das drei α1(XII)-Ketten umfasst. Verfahren zum Reinigen von Typ XII-Kollagen und Varianten davon können zum Beispiel in Dublet et al. (1989) J. Biol. Chem. 264: 13150-13156; Lunstrum et al. (1992) J. Biol. Chem. 267: 20087-20092 und Watt et al. (1992) J. Biol. Chem. 267: 20093-20099 gefunden werden.
  • Typ XIII stellt ein nicht fibrilläres Kollagen dar, das zum Beispiel in der Haut, dem Darm, Knochen, Knorpel und der gestreiften Muskulatur gefunden wird. Eine detaillierte Beschreibung des Typ XIII-Kollagens kann zum Beispiel in Juvonen et al. (1992) J. Biol. Chem. 267: 24700–24707 gefunden werden.
  • Typ XIV stellt ein FACIT-Kollagen dar, das als ein homotrimeres Molekül gekennzeichnet ist, welches α1(XIV)-Ketten umfasst. Verfahren zum Isolieren von Typ XIV-Kollagen können zum Beispel in Hubert-Foucher et al. (1992) J. Biol. Chem. 267: 15759-15764 und Watt et al., supra gefunden werden.
  • Typ XV-Kollagen ist in der Struktur homolog zu dem Typ XVIII-Kollagen. Information über die Struktur und die Isolierung von natürlichem Typ XV-Kollagen kann zum Beispiel in Myers et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10144-10148; Huebner et al. (1992) Genomics 14: 220-224; Kivirikko et al. (1994) J. Biol. Chem. 269: 4773-4779 und Muragaki, J. (1994) Biol. Chem. 264: 4042-4046 gefunden werden.
  • Typ XVI-Kollagen stellt ein Fibrillen assoziiertes Kollagen dar, welches zum Beispiel in der Haut, in Lungenfibroblasten und in Keratinozyten gefunden wird. In formation über die Struktur von Typ XVI-Kollagen und das Gen, welches Typ XVI-Kollagen kodiert, kann zum Beispiel in Pan et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 6565-6569 und Yamaguchi et al. (1992) J. Biochem. 112: 856-863 gefunden werden.
  • Typ XVII-Kollagen stellt ein hemidesmosomales Transmembran-Kollagen dar, das auch als bullöses Pemphigoid-Antigen bekannt ist. Information über die Struktur von Typ XVII-Kollagen und über das Gen, das Typ XVII-Kollagen kodiert, kann zum Beispiel in Li et al. (1993) J. Biol. Chem. 268(12): 8825-8834 und McGrath et al. (1995) Nat. Genet. 11(1): 83-86 gefunden werden.
  • Typ XVIII-Kollagen ist in der Struktur ähnlich zu Typ XV-Kollagen und kann aus der Leber isoliert werden. Beschreibungen der Strukturen und der Isolation von Typ XVIII-Kollagen aus natürlichen Quellen können zum Beispiel in Rhen und Pihlajaniemi (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 4234-4238; Oh e al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 4229-4233; Rehn et al. (1994) J. Biol. Chem. 269: 13924-13935 und Oh et al. (1994) Genomics 19: 494-499 gefunden werden.
  • Von Typ XIX-Kollagen wird angenommen, dass es ein anderes Mitglied der FACIT-Kollagenfamilie darstellt, und es wurde in mRNA gefunden, die aus Rhabdomyosarkom-Zellen isoliert wurde. Beschreibungen der Strukturen und der Isola tion von Typ XIX-Kollagen können zum Beispiel in Inoguchi et al. (1995) J. Biochem. 117: 137-146; Yoshioka et al. (1992) Genomics 13: 884-886 und Myers et al., J. Biol. Chem. 289: 18549-18557 (1994) gefunden werden.
  • Typ XX-Kollagen stellt ein neu gefundenes Mitglied der kollagenartigen FACIT-Familie dar und wurde in Hühner-Kornea identifiziert. (Siehe z. B. Gordon et al. (1999) FASER Journal 13: A1119 und Gordon et al. (1998), IOVS 39: S1128).
  • Gelatine
  • Gelatine stellt ein Derivat von Kollagen, ein Hauptstruktur- und Bindeprotein in Tieren dar. Gelatine wird aus der Denaturierung von Kollagen abgeleitet und enthält Polypeptidsequenzen, die Gly-X-Y-Wiederholungen aufweisen, wobei X und Y meistens Prolin- und Hydroxyprolin-Reste darstellen. Diese Sequenzen tragen zur dreifach helikalen Struktur bei und bewirken die Gelierfähigkeit der Gelatinepolypeptide. Zur Zeit verfügbare Gelatine wird über Verarbeiten von Tierhäuten und -knochen, typischerweise aus Rinder- und Schweine-Quellen extrahiert. Die biophysikalischen Eigenschaften der Gelatine machen sie zu einem vielseitigen Material, das in einer Vielzahl von Anwendungen und Industrien weit verwendet wird. Gelatine wird zum Beispiel in zahlreichen pharmazeutischen und medizinischen, fotografischen, industriellen, kosmetischen und Nahrungsmittel- und Getränke-Produkten und Verfahren der Herstellung verwendet. Gelatine stellt daher ein kommerziell wertvolles und vielseitiges Produkt dar.
  • Gelatine wird typischerweise aus natürlich in Rinder- und Schweine-Quellen vorkommendem Kollagen, insbesondere aus Häuten und Knochen hergestellt. In einigen Fällen kann Gelatine zum Beispiel aus Fisch-, Hühner- oder Pferde-Quellen extrahiert werden. Die Rohmaterialien der typischen Gelatineherstellung, wie Rinderhäute und -knochen, stammen von Tieren, die Gegenstand staatlich geprüfter Inspektion waren und diese als geeignet für den menschlichen Verzehr bestanden haben. Es gibt Bedenken über die Infektiösität dieses Rohmaterials aufgrund der Anwesenheit von Kontaminierungsmitteln, wie übertragbaren spongiformen Enzephalopathien (TSEs, für engl.: transmissible spongiform encephalopathies), insbesondere boviner spongiformer Enzephalopathie (BSE) und Scrapie, usw. (Siehe z. B. Rohwer, R.G. (1996), Dev Biol Stand 88: 247-256). Solche Sachverhalte sind insbesondere kritisch für Gelatine, die in pharmazeutischen und medizinischen Anwendungen verwendet wird.
  • In letzter Zeit stiegen die Bedenken über die Sicherheit dieser Materialien, von denen ein erheblicher Teil aus Rinderquellen abgeleitet wird, an, was verursachte, dass verschiedene Gelatine enthaltene Produkte in den Mittelpunkt mehrerer regulatorischer Messungen rückten, um das potenzielle Risiko der Übertragung boviner spongiformer Enzephalopathie (BSE) zu reduzieren, die mit der neuen Variante der Creuzfeldt-Jakob-Erkrankung (nvCJD), einer tödlichen neurologischen Erkrankung in Menschen, verbunden ist. Es gibt Bedenken, dass die Reinigungs schritte, die derzeit in dem Verfahren des Extrahierens der Gelatine aus Tiergeweben und -knochen verwendet werden, nicht ausreichend sein können, um die Wahrscheinlichkeit der Infektiösität aufgrund von kontaminierendem SE tragendem Gewebe (d. h. Gehirngewebe, usw.) zu entfernen. U.S.- und europäische Hersteller schreiben vor, dass Rohmaterial für Gelatine, die in tierische oder menschliche Nahrungsmittelprodukte oder in pharmazeutische, medizinische oder kosmetische Anwendungen eingeschlossen werden soll, nicht von einer wachsenden Anzahl von BSE-Ländern bezogen werden soll. Zusätzlich schreiben Bestimmungen vor, dass bestimmte Materialien, z. B. bovine Gehirngewebe, nicht in der Herstellung von Gelatine verwendet werden.
  • Derzeitige Herstellungsverfahren umfassen mehrere Reinigungs- und Säuberungsschritte und können raue und langwierige Weisen der Extraktion erfordern. Die Tierhäute und -knochen werden in einem Schmelzverfahren behandelt, und das extrahierte Material wird verschiedenen chemischen Behandlungen ausgesetzt, einschließlich verlängerter Exposition gegenüber stark sauren oder alkalischen Lösungen. Zahlreiche Reinigungsschritte können Waschen und Filtrieren und verschiedene Hitzebehandlungen umfassen. Säure-Demineralisierung und Kalkbehandlungen werden verwendet, um Unreinheiten, wie nicht kollagenartige Proteine, zu entfernen. Knochen müssen entfettet werden. Zusätzliche Wasch- und Filtrierschritte, Ionenaustausche und andere chemische und sterilisierende Behandlungen werden zu dem Verfahren hinzugefügt, um das Material weiter zu reinigen. Des Weiteren können Kontaminierungen und Unreinheiten nach der Verarbeitung noch zurückbleiben, und das sich ergebende Gelatineprodukt muss da her typischerweise geklärt, gereinigt und häufig weiterhin konzentriert werden, bevor es für die Verwendung fertiggestellt ist.
  • Kommerzielle Gelatine wird im Allgemeinen als Typ A oder Typ B klassifiziert. Diese Klassifikationen spiegeln die Extraktionsquellen vor der Behandlung wieder, die als Teil des Extraktionsverfahrens erfasst werden. Typ A wird im Allgemeinen von Säure verarbeiteten Materialien abgeleitet, üblicherweise von Schweinehäuten, und Typ B wird im Allgemeinen von alkalisch oder Kalk verarbeiteten Materia lien abgeleitet, üblicherweise von Rinderknochen (Ossein) und -häuten. In sowohl Typ A-, als auch Typ B-Extraktionsverfahren umfasst das sich ergebende Gelatineprodukt typischerweise ein Gemisch aus Gelatinemolekülen in Größen von einigen tausend bis zu mehreren hunderttausend Dalton.
  • Fischgelatine, die als gelierende und nicht gelierende Typen klassifiziert wird, und typischerweise als Typ A-Gelatine verarbeitet wird, wird auch in bestimmten kommerziellen Anwendungen verwendet. Gelierende Typen werden üblicherweise von den Häuten von Warmwasserfischen abgeleitet, während nicht gelierende Typen typischerweise von Kaltwasserfischen abgeleitet werden. Fischgelatinen weisen weit variierende Aminosäurezusammensetzungen auf und unterscheiden sich von Tiergelatinen darin, dass sie typischerweise niedrigere Anteile an Prolin- und Hydroxyprolin-Resten aufweisen. Im Gegensatz zu anderen Tiergelatinen bleiben Fischgelatinen typischerweise bei viel niedrigeren Temperaturen flüssig, selbst bei vergleichbaren durchschnittlichen Molekulargewichten. Wie bei Tiergelatine wird Fischgelatine durch Behandlung und nachfolgende Hydrolysierung der Fischhaut extrahiert. Wiederum wie bei den Tier-Extraktionsverfahren, führt das Verfahren des Extrahierens der Fischgelatine zu einem Produkt, dem die Homogenität fehlt.
  • Derzeitige Verfahren der Extraktion führen daher zu einem Gelatineprodukt, welches ein heterogenes Gemisch aus Proteinen darstellt, die Polypeptide mit Molekulargewichtsverteilungen variierender Bereiche enthalten. Es ist manchmal nötig, verschiedene Chargen des Produkts zu mischen, um ein Gelatinegemisch mit den physikalischen Eigenschaften zu erhalten, die für eine Verwendung in einer ge wünschten Anwendung geeignet sind. Es gibt daher einen Bedarf für ein verlässliches und reproduzierbares Hilfsmittel der Gelatineherstellung, dass ein homogenes Produkt mit kontrollierten Eigenschaften bereitstellt.
  • Zusätzlich gibt es insbesondere in der pharmazeutischen, kosmetischen und Nah rungsmittel- und Getränke-Industrie einen Bedarf für eine Gelatinequelle, die nicht jene darstellt, die durch die Extraktion aus Tierquellen, z. B. Rinder-, Schweineknochen und -gewebe, erhalten wird. Da derzeit verfügbare Gelatine aus Tierquel len, wie Knochen und Geweben, hergestellt wird, gibt es weiterhin Bedenken bezüglich der unerwünschten Immunogenität und Infektiösität von Gelatine enthaltenden Produkten. (Siehe z. B. Sakaguchi, M. et al., (1999) J. Aller. Clin. Immunol. 104: 695-699; Miyazawa et al. (1999) Vaccine 17: 2176-2180; Sakaguchi et al. (1999) Immunology 96: 286-290; Kelso (1999) J. Aller. Clin. Immunol. 103: 200-202; Asher (1999) Dev Biol Stand 99: 41-44 und Verdrager (1999) Lancet 354: 1304-1305). Zusätzlich wird die Verfügbarkeit eines Ersatzmaterials, welches keine Extraktion aus Tierquellen, z. B. Geweben und Knochen, durchläuft, verschiedene ethische, religiöse und soziale Vorgaben ansprechen. Ein rekombinan tes Material, welches keine Extraktion aus Tierquellen, wie Geweben und Knochen, benötigt, könnte zum Beispiel bei der Herstellung von Lebensmitteln oder anderen eingenommenen Produkten, einschließlich eingekapselten Arzneimitteln, verwendet werden, die für die Verwendung bei Personen mit diätischen Einschränkungen geeignet sind, zum Beispiel bei jenen, die Koscher- und Halal- Gesetze befolgen.
  • Posttranslationale Enzyme
  • Posttranslationale Enzyme sind wichtig für die Biosynthese von Kollagenen und kollagenartigen Proteinen. Zum Beispiel wird Prolyl-4-Hydroxylase benötigt, um Prolyl-Reste in der V-Position der sich wiederholenden -Gly-X-V-Sequenzen zu 4-Hydroxyprolin zu hydroxylieren. (Siehe z. B. Prockop et al. (1984) N. Engl. J. Med. 311: 476-386). Hydroxyprolin spielt eine entscheidende Rolle für die Stabilisierung der Kollagen-Dreifachhelix.
  • Wirbeltier-Prolyl-4-Hydroxylase ist ein α2β2-Tetramer. (Siehe z. B. Berg und Prockop (1973) J. Biol. Chem. 248: 1175-1192 und Tuderman et al. (1975) Eur. J. Biochem. 52: 9-16). Die α-Untereinheiten (63 kDa) enthalten die katalytische Stellen, die an der Hydroxylierung der Prolyl-Reste beteiligt sind, und sind in der Abwe senheit der β-Untereinheiten unlöslich. Die β-Untereinheiten (55 kDa), die identisch mit der Protein-Disulfid-Isomerase sind, katalysieren ein Thiol/Disulfid-Austausch-Proteinsubstrat, was zur Bildung einer Reihe von Disulfidbindungen führt, die wesentlich zum Etablieren eines stabilen Proteins sind. Die β-Untereinheiten behalten 50% der Protein-Disulfid-Isomerase-Aktivität, wenn sie einen Abschnitt des Prolyl-4-Hydroxylase-Tetramers darstellen. (Siehe z. B. Pihlajaniemi et al. (1987) Embo J. 6: 643-649; Parkkonen et al. (1988) Biochem. J. 256: 1005-1011 und Koivu et al. (1987) J. Biol. Chem. 262: 6447-6449). Aktive, rekombinante humane Prolyl-4-Hydroxylase wurde in Insektenzellen durch gleichzeitiges Exprimieren der α- und β-Untereinheiten hergestellt. (Siehe z. B. Vuori et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 7467-7470).
  • Zusätzlich zur Prolyl-4-Hydroxylase wurden andere posttranslationale Kollagenenzyme identifiziert und es wurde von ihnen in der Literatur berichtet, einschließlich von zum Beispiel C-Proteinase, N-Proteinase, Lysyloxidase und Lysylhydroxylase. (Siehe z. B. Olsen et al. (1991) Cell Biology of Extracellular Matrix, 2. Auflage, Hay Herausgeber, Plenum Press, New York).
  • Die Expression von vielen exogenen Genen wird einfach in einer Vielzahl von rekombinanten Wirt-Vektor-Systemen erhalten. Die Expression wird jedoch schwierig, wenn die endgültige Bildung des Proteins eine umfangreiche posttranslationale Verarbeitung erfordert. Zum Beispiel ist die Prolyl-4-Hydroxylase-Aktivität ein deutig ein wesentliches Erfordernis für die Hydroxylierung von kollagenartigen Domänen in der Natur. Eine Ergänzung der Prolyl-4-Hydroxylase-Aktivität wird in Expressionssystemen benötigt, denen eine endogene Prolyl-4-Hydroxylase-Aktivität fehlt, um Hydroxylierungssysteme bereitzustellen, wie sie in der Natur gefunden werden.
  • Die Erfolglosigkeit, eine verlässliche und stabile rekombinante Expression von Genen für Kollagene zu erhalten, hat die Herstellung von Kollagenen und Gelatinen, die eine Anzahl geeigneter Anwendungen aufweisen, verhindert. Zusätzlich sind viele Typen des Kollagens nur in Spurenmengen, die in Geweben vorkommen, verfügbar, und können nicht in wesentlichen Mengen aus diesen Quellen erhalten werden. Des Weiteren können nicht kollagenartige Unreinheiten nach den Extraktions- und Reinigungsverfahren zurückbleiben oder während dieser eingeführt werden.
  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassend, obwohl die Eigenschaften der kommerziell verfügbaren Tierkollagene und -gelatinen für viele Produkte geeignet sind, stellen die Variabilität in diesen derzeit verfügbaren Materialien und die Schwierigkeiten, die mit dem Optimieren dieser Materialien für eine Verwendung in verschiedenen Anwendungen verbunden sind, wenig Flexibilität bereit. Als Ergebnis gibt es im Stand der Technik einen Bedarf für ein effizientes System, das es erlaubt, dass das Ausgangsmaterial auf den genetischen und molekularen Ebenen modifiziert werden kann, wodurch das Potenzial zum Herstellen von rekombinanten Kollagenen und Gelatinen bereitgestellt wird, die spezifisch für verschiedene Anwendungen und Märkte zugeschnitten und standardisiert sind. Des Weiteren haben die bestehenden Bedenken über die Risiken der Immunogenität und der Infektiösität, die mit der Verwendung der extrahierten Materialien, die derzeit verfügbar sind, verbunden sind, einen Bedarf für ein reines und sicheres Ersatzmaterial geschaffen.
  • Die WO 97/04123 offenbart ein Verfahren zum Herstellen einer Kollagenverbindung in transgenen Pflanzen. Die Verbindung ist vorzugsweise Prokollagen oder Kollagen oder Fragmente davon von menschlichem, tierischem oder Fisch-Ursprung. Die Verbindung kann aus der Pflanze als Kollagen oder Gelatine gewonnen werden.
  • Die FR-A-2757874 offenbart die Verwendung einer rekombinanten Nukleotidsequenz, die eine cDNA enthält, die für eine oder mehrere Säugetier-Kollagenketten oder abgeleitete Proteine und Elemente kodiert, die es einer Pflanzenzelle ermöglichen, die Kollagenkette(n) oder abgeleiteten Proteine, die von der cDNA kodiert werden, herzustellen, insbesondere ein Transkriptionspromotor und -terminator, welcher von der Transkriptionsmaschinerie der Pflanzenzelle identifiziert wird, zum Transformieren der Pflanzenzellen, um aus diesen Zellen oder den aus diesen erhaltenen Pflanzen die Kollagenkette(n) oder abgeleiteten Proteine zu erhalten. Die Erfindung betrifft auch die sich ergebenden Proteine und das transformierte Pflanzenmaterial, sowie ihre Verwendungen.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung stellt Tierkollagene und -gelatinen und Verfahren zum Herstellen dieser Tierkollagene und -gelatinen bereit. Daher stellt die vorliegende Erfindung in einem Aspekt ein rekombinantes bovines Kollagenpolypeptid bereit, das die Aminosäuresequenz SEQ ID NR: 2 umfasst.
  • In bestimmten Ausführungsformen ist das Polypeptid einzelkettig oder homotrimer oder heterotrimer. In einem Aspekt besteht das Polypeptid aus der Aminosäuresequenz SEQ ID NR: 2. Eine Zusammensetzung, die das Polypeptid umfasst, wird auch bereitgestellt.
  • In einer weiteren Ausführungsform umfasst die vorliegende Erfindung ein isoliertes und gereinigtes Polypeptid, das die SEQ ID NR: 2 kodiert, und ein isoliertes und gereinigtes Polynukleotid, das komplementär zu dem Polynukleotid ist, welches die SEQ ID NR: 2 kodiert. Zusammensetzungen, Expressionsvektoren und Wirtszellen, die das Polynukleotid umfassen, werden auch bereitgestellt. In verschiedenen Ausführungsformen ist die Wirtszelle eine prokaryontische Zelle oder eine eukaryontische Zelle, insbesondere eine Tier-, Hefe-, Pflanzen-, Insekten- oder Pilzzelle. In einigen Ausführungsformen stellt die vorliegende Erfindung transgene nicht-menschliche Tiere und transgene Pflanzen bereit, die das Polynukleotid umfassen. In einem Aspekt umfasst die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Herstellen eines bovinen α1(I)-Kollagens, wobei das Verfahren das Kultivieren der Wirtszelle, welche das Polynukleotid umfasst, unter Bedingungen umfasst, die geeignet für eine Expression des erfindungsgemäßen Polypeptids und ein Gewin nen des Polypeptids aus der Wirtszellkultur sind.
  • Verfahren zum Herstellen rekombinanter Tiergelatinen werden auch bereitgestellt. In einem Aspekt umfasst das Verfahren das Bereitstellen der erfindungsgemäßen rekombinanten bovinen Kollagenpolypeptide und das Ableiten der rekombinanten Tiergelatine davon. In einem anderen Aspekt umfasst das Verfahren das Herstellen rekombinanter Tiergelatine direkt aus einem Polynukleotid, das die SEQ ID NR: 2 kodiert.
  • KURZBESCHREIBUNG DER FIGUREN
  • Die 1A, 1B und 1C zeigen eine Nukleinsäuresequenz (SEQ ID NR: 1), die ein bovines α1(I)-Kollagen kodiert.
  • Die 2A, 2B, 2C und 2D zeigen die Aminosäuresequenz (SEQ ID NR: 2) eines bovinen α1(I)-Kollagens.
  • Die 3A, 3B, 3C, 3D, 3E, 3F, 3G, 3H und 3I zeigen die übersetzten bovinen α1(I)-Kollagensequenzen des offenen Leserahmens, die an bekannten humanen (HU), Maus-(MUS), Hunde-(CANIS), Ochsenfrosch-(RANA) und Japanischen Molch-(CYNPS)Kollagensequenzen ausgerichtet sind.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Bevor die erfindungsgemäßen Proteine, Nukleotidsequenzen und Verfahren beschrieben werden, wird es verstanden, dass diese Erfindung nicht auf die besondere Methodik, die Protokolle, die Zelllinien, die Vektoren und die Reagenzien, die beschrieben werden, beschränkt ist, da diese variieren können. Es soll auch verstanden werden, dass die hier verwendete Terminologie nur für den Zweck des Beschreibens der besonderen Ausführungsformen ist und nicht beabsichtigt, den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung zu beschränken.
  • Es muss erwähnt werden, dass, so wie hier und in den beigefügten Ansprüchen verwendet, die Singularformen "einer", "eine", "eines" und "der", "die", "das" Plu ralbezüge einschließen, wenn es der Zusammenhang nicht eindeutig anders vorgibt. Daher ist zum Beispiel eine Bezugnahme auf "eine Wirtszelle" eine Bezugnahme auf eine oder mehrere solche/r Wirtszelle/n und Äquivalente davon, die dem Fachmann bekannt sind, und eine Bezugnahme auf "einen Antikörper" ist eine Bezugnahme auf einen oder mehrere Antikörper und Äquivalente davon, die dem Fachmann bekannt sind, und so weiter.
  • Wenn es nicht anders definiert wird, weisen alle hier verwendeten technischen und wissenschaftlichen Begriffe die Bedeutungen auf, wie sie der Fachmann gängigerweise versteht, den die Erfindung betrifft. Obwohl irgendwelche Verfahren und Materialien, die ähnlich oder gleich zu jenen sind, die hier beschrieben werden, bei der Ausführung oder dem Überprüfen der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, werden die bevorzugten Verfahren, Geräte und Materialien nun beschrieben. Alle hier erwähnten Veröffentlichungen sind für den Zweck des Beschreibens und Offenbarens der Zelllinien, Vektoren und Methodiken, usw., welche in den Veröffentlichungen erwähnt werden, die in Verbindung mit der Erfindung verwendet werden könnten. Nichts des hier Erwähnten darf als ein Eingeständnis ausgelegt werden, dass die Erfindung nicht berechtigt ist, eine solche Offenbarung aufgrund der vorausgehenden Erfindung vorwegzunehmen.
  • Die Ausführung der vorliegenden Erfindung wird, wenn es nicht anders angegeben ist, gängige Verfahren der Chemie, Biochemie, Molekularbiologie, Immunologie und Pharmakologie innerhalb des Standes der Technik einsetzen. Solche Techniken sind vollständig in der Literatur erklärt. Siehe z. B. Gennaro, A.R., Hrsg. (1990) Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. Aufl., Mack Publishing Co.; Colowick, S. et al., Hrsg., Methods in Enzymology, Academic Press, Inc.; Handbook of Experimental Immunology, Band I–IV (D.M. Weir und C.C. Blackwell, Hrsg., 1986, Blackwell Scientific Publications); Maniatis, T. et al., Hrsg. (1989), Molecular Cloning: A Laborstory Manual, 2. Auflage, Band I–III, Cold Spring Harbor Laborstory Press; Ausubel, F. M. et al., Hrsg. (1999) Short Protocols in Molecular Biology, 4. Auflage, John Wiley & Sons; Ream et al., Hrsg. (1998) Molecular Biology Tech niques: An Intensive Laborstory Course, Academic Press); PCR (Introduction to Biotechniques Series), 2. Aufl. (Newton & Graham Hrsg., 1997, Springer Verlag).
  • DEFINITIONEN
  • Der Begriff "Kollagen" betrifft irgendeinen der bekannten Kolllagentypen, einschließlich der Kollagentypen I bis XX, so wie irgendwelche anderen Kollagene, ob natürlich, synthetisch, semisynthetisch oder rekombinant. Der Begriff umfasst auch Prokollagene. Der Begriff Kollagen umfasst irgendein einzelkettiges Polypeptid, das durch ein einzelnes Polynukleotid kodiert wird, sowie homotrimere und heterotrimere Anordnungen von Kollagenketten. Der Begriff "Kollagen" umfasst insbesondere Varianten und Fragmente davon und funktionelle Äquivalente und Derivate davon, welche vorzugsweise mindestens eine strukturelle oder funktionelle Eigenschaft des Kollagens behalten, zum Beispiel eine (Gly-X-Y)n-Domäne.
  • So betrifft zum Beispiel der Begriff "bovines α1(I)-Kollagen" ein einzelkettiges bovines α1(I)-Kollagen, das durch eine einzelne Polynukleotidsequenz kodiert wird, und irgendein entsprechendes Prokollagen oder irgendein Fragment, eine Variante, ein funktionelles Äquivalent oder ein Derivat davon. Der Begriff "bovines Typ I-Kollagen" betrifft ein homotrimeres oder heterotrimers Kollagen, das bovine Typ I-Kollagenketten umfasst, und irgendein entsprechendes Prokollagen oder irgendein Fragment, eine Variante, ein funktionelles Äquivalent oder ein Derivat davon.
  • Der Begriff "Prokollagen" betrifft ein Prokollagen, das irgendeinem der Kollagentypen I bis XX entspricht, sowie ein Prokollagen, das irgendwelchen anderen Kollagenen entspricht, ob natürlich, synthetisch, semisynthetisch oder rekombinant, das zusätzliche C-terminale und/oder N-terminale Propeptide oder Telopeptide besitzt, die bei der trimeren Anordnung, der Löslichkeit, der Reinigung oder irgendeiner anderen Funktion behilflich sind, und die anschließend nachfolgend durch eine N-Proteinase, C-Proteinase oder andere Enzyme, z. B. proteolytische Enzyme, die mit der Kollagenherstellung verbunden sind, gespalten werden. Der Begriff Prokollagen umfasst insbesondere Varianten und Fragmente davon und funktionelle Ä quivalente und Derivate davon, welche vorzugsweise mindestens eine strukturelle oder funktionelle Eigenschaft des Kollagens behalten, zum Beispiel eine (Gly-X-Y)„-Domäne.
  • Der Begriff "bovines α1(I)" betrifft ein bovines α1(I)-Kollagen oder funktionelles Äquivalent davon und Fragmente und Varianten davon und Polynukleotide, die solche Polypeptide aus irgendeiner Quelle, ob natürlich, synthetisch, semisynthetisch oder rekombinant, kodieren.
  • So wie es hier verwendet wird, betrifft "Gelatine" irgendeine Gelatine, ob durch traditionelle Verfahren extrahiert oder rekombinanten oder biosynthetischen Ursprungs oder irgendein Molekül, das mindestens eine strukturelle und/oder funktionelle Eigenschaft der Gelatine aufweist. Gelatine wird derzeit durch Extraktion aus Kollagen erhalten, das aus tierischen (z. B. Rinder-, Schweine-, Nagetier-, Weiner-, Pferde-, Fisch-)Quellen abgeleitet wurde, z. B. aus Knochen und Geweben. Der Begriff Gelatine umfasst sowohl die Zusammensetzung von mehr als einem Polypeptid, das in einem Gelatineprodukt eingeschlossen ist, als auch ein einzelnes Polypeptid, was zu dem Gelatinematerial beiträgt. Daher umfasst der Begriff rekombinante Gelatine, so wie er unter Bezugnahme auf die vorliegende Erfindung verwendet wird, sowohl ein rekombinantes Gelatinematerial, das die erfindungsgemäßen Gelatinepolypeptide umfasst, als auch ein einzelnes erfindungsgemäßes Gelatinepolypeptid.
  • Polypeptide, von denen Gelatine abgeleitet werden kann, stellen Polypeptide, wie Kollagene, Prokollagene und andere Polypeptide dar, die mindestens eine strukturelle und/oder funktionelle Eigenschaft des Kollagens aufweisen. Ein solches Polypeptid könnte eine einzelne Kollagenkette oder ein Kollagen-Homotrimer oder -Heterotrimer oder irgendwelche Fragmente, Derivate, Oligomere, Polymere oder Untereinheiten davon enthalten, die mindestens eine kollagenartige Domäne (eine Gly-X-Y-Region) enthalten. Der Begriff umfasst insbesondere gentechnisch hergestellte Sequenzen, die nicht in der Natur gefunden werden, wie veränderte Kollagenkonstrukte, usw. Ein verändertes Kollagenkonstrukt ist ein Polynukleotid, das eine Sequenz umfasst, die durch Deletionen, Additionen, Substitutionen oder andere Änderungen aus dem natürlich vorkommenden Kollagengen verändert wurde.
  • Ein "Adjuvans" ist irgendein Mittel, das zu einem Arzneimittel oder Impfstoff hinzugefügt wird, um seine Wirkung zu verstärken, zu verbessern oder in einer anderen Weise zu unterstützen. Ein Adjuvans, das in einer Impfstoffformulierung verwendet wird, könnte ein immunologisches Mittel sein, das die Immunantwort durch Herstellen eines nicht spezifischen Stimulators der Immunantwort verbessert. Adjuvantien werden häufig in Totimpfstoffen verwendet.
  • Die Begriffe "Allel" oder "Allelsequenz" betreffen alternative Formen von genetischen Sequenzen. Allele können sich aus mindestens einer Mutation in der Nukleinsäuresequenz ergeben und können zu veränderten mRNAs oder Polypeptiden führen, deren Struktur oder Funktion verändert sein kann oder nicht. Irgendein gegebenes natürliches oder rekombinantes Gen kann keine, eine oder viele Allelformen aufweisen. Gängige Mutationsänderungen, welche zu Allelen führen, werden im Allgemeinen natürlichen Deletionen, Additionen oder Substitutionen von Nukleotiden zugeschrieben. Jeder dieser Typen der Änderungen kann alleine oder in Verbindung mit den anderen, einmal oder mehrmals in einer gegebenen Sequenz auftreten.
  • "Veränderte" Polynukleotidsequenzen schließen jene mit Deletionen, Insertionen oder Substitutionen von verschiedenen Nukleotiden ein, welche zu einem Polynukleotid führen, das dasselbe oder ein funktionell äquivalentes Polypeptid kodiert. Eingeschlossen in diese Definition sind Sequenzen, die Polymorphismen aufweisen, die einfach nachweisbar sind oder nicht, unter Verwendung besonderer Oligonukleotidsonden oder durch die Deletion einer ungenauen oder unerwarteten Hybridisierung an Allele, mit einem Ort, der nicht der normale chromosomale Ort für die Polynukleotidsequenz der Sache ist.
  • "Veränderte" Polypeptide können Deletionen, Insertionen oder Substitutionen von Aminosäureresten enthalten, die eine stille Änderung erzeugen und zu einem funktionell äquivalenten Polypeptid führen. Absichtliche Aminosäuresubstitutionen können auf der Grundlage der Ähnlichkeit in der Polarität, Ladung, Löslichkeit, Hydrophobizität, Hydrophilizität und/oder der amphipathischen Natur der Reste vorgenommen werden, solange die biologische oder immunologische Aktivität des kodierten Polypeptids beibehalten wird. Zum Beispiel können negativ geladene Aminosäuren Asparaginsäure und Glutaminsäure einschließen, positiv geladene Aminosäuren können Lysin und Arginin einschließen, und Aminosäuren mit ungeladenen polaren Kopfgruppen, die ähnliche Hydrophilizitätswerte aufweisen, können Leucin, Isoleucin und Valin, Glycin und Alanin, Asparagin und Glutamin, Serin und Threonin und Phenylalanin und Tyrosin einschließen.
  • "Aminosäure-" oder "Polypeptid-"Sequenzen oder "Polypeptide" betreffen, so wie diese Begriffe hier verwende werden, Oligopeptid-, Peptid-, Polypeptid- oder Proteinsequenzen und Fragmente davon und natürlich vorkommende oder synthetische Moleküle. Polypeptid- oder Aminosäurefragmente stellen irgendeinen Abschnitt eines Polypeptids dar, der mindestens eine strukturelle und/oder funktionelle Eigenschaft des Polypeptids beibehält. In mindestens einer Ausführungsform sind Polypeptidfragmente jene, welche mindestens eine (Gly-X-Y)n-Region beibehalten.
  • Der Begriff "Tier", so wie er unter Bezugnahme auf zum Beispiel "Tierkollagene" verwendet wird, umfasst irgendwelche Kollagene, ob natürlich, synthetisch, semisynthetisch oder rekombinant. Tierquellen schließen zum Beispiel Säugetierquellen ein, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Rinder-, Schweine-, Pferde-, Nagetier- und Schafsquellen, und andere Tierquellen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Hühner- und Fischquellen, und Nicht-Wirbeltierquellen.
  • "Antigenizität" betrifft die Fähigkeit einer Substanz, wenn sie in den Körper eingeführt wird, die Immunantwort und die Herstellung eines Antikörpers zu stimulieren. Ein Mittel, welches die Eigenschaft der Antigenizität aufweist, wird als antigen be zeichnet. Antigene Mittel können eine Vielzahl von Makromolekülen einschließen, wie zum Beispiel Proteine, Lipoproteine, Polysaccharide, Nukleinsäuren, Bakterien und bakterielle Bestandteile und Viren und virale Bestandteile, sind aber nicht darauf beschränkt.
  • Die Begriffe "komplementär" oder "Komplementarität", so wie sie hier verwendet werden, betreffen die natürliche Bindung von Polynukleotiden durch Rasenpaarung. Zum Beispiel bindet die Sequenz "A-G-T" an die komplementäre Sequenz "T-C-A". Eine Komplementarität zwischen zwei einzelsträngigen Molekülen kann "teilweise" sein, wenn nur einige der Nukleinsäuren binden, oder kann vollständig sein, wenn eine vollständige Komplementarität zwischen den einzelsträngigen Molekülen auftritt. Der Grad der Komplementarität zwischen Nukleinsäuresträngen weist erhebliche Wirkungen auf die Effizienz und die Stärke der Hybridisierung zwischen Nukleinsäuresträngen auf. Dies ist von besonderer Wichtigkeit für Amplifikationsreaktionen, die auf der Bindung zwischen Nukleinsäuresträngen beruhen und für das Design und die Verwendung von zum Beispiel Peptidnukleinsäure (PNA, für engl.: peptide nucleic acid)-Molekülen.
  • Eine "Deletion" stellt eine Änderung in einer Aminosäure- oder Nukleotidsequenz dar, die zur Abwesenheit von einem oder mehreren Aminosäureresten oder Nukleotiden führt.
  • Der Begriff "Derivat", betrifft, wenn er auf Polynukleotide angewendet wird, die chemische Modifikation eines Polynukleotids, das ein besonderes Polypeptid kodiert oder das komplementär zu einem Polynukleotid ist, das ein besonderes Polypeptid kodiert. Solche Modifikationen schließen zum Beispiel das Ersetzen eines Wasserstoffs durch eine Alkyl-, Acyl- oder Aminogruppe ein. So wie hier in Bezug auf Polypeptide verwendet wird, betrifft der Begriff "Derivat" ein Polypeptid, das zum Beispiel durch Hydroxylierung, Glykosylierung, Pegylierung oder durch irgendein ähnliches Verfahren modifiziert ist. Der Begriff "Derivate" umfasst jene Moleküle, die mindestens eine strukturelle und/oder funktionelle Eigenschaft des Moleküls umfassen, von welchem es abgeleitet ist.
  • Ein Molekül wird "chemisches Derivat" eines anderen Moleküls genannt, wenn es zusätzliche chemische Reste enthält, die normalerweise nicht Teil des Moleküls darstellen. Solche Reste können die Löslichkeit, Absorption, biologische Halbwertszeit und desgleichen des Moleküls verbessern. Die Reste können alternativ die Toxizität des Moleküls vermindern, irgendwelche unerwünschten Nebenwirkungen des Moleküls beseitigen oder abschwächen und desgleichen. Reste, die in der Lage sind, solche Wirkungen zu vermitteln, sind allgemein im Stand der Technik verfügbar und können zum Beispiel in Remington's Pharmaceutical Sciences, supra gefunden werden. Verfahren zum Koppeln solcher Reste an ein Molekül sind im Stand der Technik gut bekannt.
  • Ein "Bindemittel", so wie der Begriff hier verwendet wird, stellt irgendeine inerte Substanz dar, die als Verdünnungsmittel oder Träger in der Formulierung eines Arzneimittels, eines Impfstoffes oder einer anderen pharmazeutischen Zusammensetzung verwendet wird, um dem Arzneimittel, dem Impfstoff oder der pharmazeutischen Zusammensetzung eine geeignete Konsistenz oder Form zu verleihen.
  • Der Begriff "funktionelles Äquivalent", so wie er hier verwendet wird, betrifft ein Polypeptid oder Polynukleotid, das mindestens eine funktionelle und/oder strukturelle Eigenschaft eines besonderen Polypeptids oder Polynukleotids besitzt. Ein funktionelles Äquivalent kann Modifikationen enthalten, die das Durchführen einer besonderen Funktion ermöglichen. Der Begriff "funktionelles Äquivalent" beabsichtigt, Fragmente, Mutanten, Hybride, Varianten, Analoge oder chemische Derivate eines Moleküls einzuschließen.
  • Ein "Fusionsprotein" stellt ein Protein dar, in dem Peptidsequenzen aus verschiedenen Proteinen funktionsfähig verbunden sind.
  • Der Begriff "Hybridisierung" betrifft das Verfahren, durch welches eine Nukleinsäuresequenz an eine komplementäre Sequenz über eine Basenpaarung bindet. Hy bridisierungsbedingungen können zum Beispiel durch die Konzentrationen von Salz oder Formamid in den Prähybridisierungs- und Hybridisierungslösungen oder durch die Hybridisierungstemperatur definiert werden, und sind im Stand der Technik gut bekannt. Eine Hybridisierung kann unter Bedingungen verschiedener Stringenz stattfinden.
  • Insbesondere kann die Stringenz durch Reduzieren der Salzkonzentration, Erhöhen der Formamidkonzentration oder Erhöhen der Hybridisierungstemperatur verstärkt werden. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung tritt zum Beispiel eine Hybridisierung unter Bedingungen hoher Stringenz in ungefähr 50% Formamid bei ungefähr 37°C bis 42°C auf und unter Bedingungen reduzierter Stringenz in ungefähr 35% bis 25% Formamid bei ungefähr 30°C bis 35°C. Insbesondere tritt eine Hybridisierung unter Bedingungen der höchsten Stringenz bei 42°C in 50% Formamid, 5 × SSPE, 0,3% SDS und 200 μg/ml gescherter und denaturierter Lachsspermien-DNA auf.
  • Der Temperaturbereich, der einem besonderen Grad der Stringenz entspricht, kann weiterhin durch im Stand der Technik bekannte Verfahren eingeengt werden, zum Beispiel durch Berechnen des Purin zu Pyrimidin Verhältnisses der Nukleinsäure von Interesse und entsprechendes Anpassen der Temperatur. Um nicht spezifische Signale zu entfernen, können Blots aufeinanderfolgend gewaschen werden, zum Beispiel bei Raumtemperatur unter zunehmend stringenten Bedingungen von bis zu 0,1 × SSC und 0,5% SDS. Variationen der oben genannten Bereiche und Bedingungen sind im Stand der Technik gut bekannt.
  • "Immunogenität" bezeichnet die Fähigkeit, eine Immunantwort in einem Organismus hervorzurufen. Ein Mittel, das die Eigenschaft der Immunogenität aufweist, wird als immunogen bezeichnet. Die Mittel können eine Vielzahl von Makromolekülen einschließen, wie zum Beispiel Proteine, Lipoproteine, Polysaccharide, Nukleinsäuren, Bakterien und bakterielle Bestandteile und Viren und virale Bestandteile, sind aber nicht darauf beschränkt. Immunogene Mittel weisen häufig ein recht hohes Molekulargewicht auf (üblicherweise größer als 10 kDa).
  • "Infektiösität" betrifft die Fähigkeit, infektiös zu sein, oder die Fähigkeit, eine Infektion herzustellen, bezüglich der Invasion und Vervielfältigung von Mikroorganismen, wie Bakterien oder Viren innerhalb des Körpers.
  • Die Begriffe "Insertion" oder "Addition" betreffen eine Änderung in einer Polypeptid- oder Polynukleotidsequenz, die zu der Addition von jeweils einem oder mehreren Aminosäureresten oder Nukleotiden führt, verglichen mit dem natürlich vorkommenden Molekül.
  • Der Begriff "isoliert", so wie er hier verwendet wird, betrifft ein Molekül, das nicht nur von Proteinen, usw. getrennt ist, die in der natürlichen Quelle des Proteins anwesend sind, sondern auch von anderen Bestandteilen im Allgemeinen, und betrifft vorzugsweise ein Molekül, das in der Anwesenheit von, wenn überhaupt, nur einem Lösungsmittel, Puffer, Ion oder einem anderen Bestandteil, der normalerweise in einer Lösung desselben vorhanden ist, gefunden wird. So wie hier verwendet, umfassen die Begriffe "isoliert" und "gereinigt" keine Moleküle, die in ihrer natürlichen Quelle anwesend sind.
  • Der Begriff "Mikroarray" bezeichnet irgendeine Anordnung von Nukleinsäuren, Aminosäuren, Antikörpern, usw. auf einem Substrat. Das Substrat kann irgendein geeigneter Träger sein, z. B. Kügelchen, Glas, Papier, Nitrozellulose, Nylon oder irgendeine geeignete Membran, usw. Ein Substrat kann irgendein starrer oder semistarrer Träger sein, einschließlich Membranen, Filtern, Scheiben, Chips, Objektträgern, Fasern, Kügelchen, einschließlich magnetischen oder nicht magnetischen Kügelchen, Gelen, Röhren, Platten, Polymeren, Mikropartikeln, Kapillaren, usw., ist aber nicht darauf beschränkt. Das Substrat kann eine Oberfläche zum Beschichten bereitstellen und/oder kann eine Vielzahl von Oberflächenformen aufweisen, wie Vertiefungen, Dornen, Rinnen, Kanäle und Poren, an die die Nukleinsäuren, Aminosäuren, usw. gebunden werden können.
  • Der Begriff "Mikroorganismus" kann Viren, Bakterien, Chlamydien, Rickettien, Mykoplasmen, Ureaplasmen, Pilze und Parasiten, einschließlich infektiösen Parasiten, wie Protozoen, einschließen, ist aber nicht darauf beschränkt.
  • Die Begriffe "Nukleinsäure-" oder "Polynukleotid-"Sequenzen oder "Polynukleotide" betreffen Oligonukleotide, Nukleotide oder Polynukleotide oder irgendwelche Fragmente davon und DNA oder RNA natürlichen oder synthetischen Ursprungs, die einzel- oder doppelsträngig sein kann und den Sense- oder Antisense-Strang darstellen kann, Peptidnukleinsäure (PNA) oder irgendein DNA-ähnliches oder RNA-ähnliches Material natürlichen oder synthetischen Ursprungs. Polynukleotidfragmente stellen irgendeinen Abschnitt einer Polynukleotidsequenz dar, die mindestens eine strukturelle oder funktionelle Eigenschaft des Polynukleotids beibehält. In einer Ausführungsform sind Polynukleotidfragmente jene, welche mindestens eine (Gly-X-Y)n-Region kodieren. Polynukleotidfragmente können von Variabler Länge sein, zum Beispiel größer als 60 Nukleotide lang, mindestens 100 Nukleotide lang, mindestens 1000 Nukleotide lang oder mindestens 10.000 Nukleotide lang.
  • Der Ausdruck "Prozent Ähnlichkeit" (% Ähnlichkeit) betrifft den prozentualen Anteil der Sequenzähnlichkeit, die in einem Vergleich von zwei oder mehr Polypeptid- oder Polynukleotidsequenzen gefunden wird. Prozent Ähnlichkeit kann durch Verfahren bestimmt werden, die im Stand der Technik gut bekannt sind. Zum Beispiel kann die Prozent Ähnlichkeit zwischen Aminosäuresequenzen unter Verwendung des Clustal-Verfahrens berechnet werden. (Siehe z. B. Higgins, D. G. und P. M. Sharp (1988) Gene 73: 237-244). Der Clustal-Algorithmus gruppiert Sequenzen durch Überprüfen der Distanzen zwischen allen Paaren in Kluster. Die Kluster werden paarweise ausgerichtet und anschließend in Gruppen. Die prozentuale Ähnlichkeit zwischen zwei Aminosäuresequenzen, z. B. Sequenz A und Sequenz B, wird durch Teilen der Länge von Sequenz A, minus der Anzahl der Lückenreste in Sequenz A, minus der Anzahl der Lückenreste in Sequenz B, durch die Summe der Trefferreste zwischen der Sequenz A und der Sequenz B mal Einhundert berechnet. Lücken mit niedriger oder keiner Homologie zwischen den zwei Amino säuresequenzen werden nicht in das Bestimmen der prozentualen Ähnlichkeit eingeschlossen. Die Prozent Ähnlichkeit kann durch andere Verfahren, die im Stand der Technik bekannt sind, berechnet werden, zum Beispiel durch Variieren der Hybridisierungsbedingungen, und kann elektronisch unter Verwendung von Programmen wie dem MEGALIGN-Programm (DNASTAR Inc., Madison, Wisconsin) berechnet werden.
  • So wie hier verwendet, schließt der Begriff "Pflanze" die Bezugname auf eine oder mehrere Pflanzen ein, d. h. irgendwelche eurkaryontischen autotrophen Organismen, wie Angiospermen und Gymnospermen, Monokotyledonen und Dikotyledonen, usw., einschließlich Sojabohne, Baumwolle, Alfalfa, Flachs, Tomate, Zucker, Rübe, Sonnenblume, Kartoffel, Tabak, Mais, Weizen, Reis, Salat, Banane, Maniok, Öldistel, Ölsaat, Rübsamen, Senf, Raps, Hanf, Algen, Seetang, usw., ist aber nicht darauf beschränkt. Der Begriff "Pflanze" umfasst auch eine oder mehrere Pflanzenzellen. Der Begriff "Pflanzenzellen" schließt vegetative Gewebe und Organe, wie Samen, Suspensionskulturen, Embryonen, meristematische Regionen, Callusgewebe, Blätter, Wurzeln, Triebe, Gametophyten, Sporophyten, Pollen, Knollen, Wurzelknollen, Zwiebeln, Blüten, Früchte, Zapfen, Mikrosporen, usw. ein, ist aber nicht darauf beschränkt.
  • Der Begriff "posttranslationales Enzym" betrifft irgendein Enzym, das eine posttranslationale Modifikation von zum Beispiel irgendeinem Kollagen oder Prokollagen katalysiert. Der Begriff umfasst zum Beispiel Prolylhydroxylase, Peptidylprolylisomerase, Kollagen-Galactosylhydroxylysyl-Glucsoyltransferase, Hydroxylysylgalactosyltransferase, C-Proteinase, N-Proteinase, Lysylhydroxylase und Lysyloxidase, ist aber nicht darauf beschränkt.
  • So wie hier verwendet, betrifft der Begriff "Promotor" im Allgemeinen eine regulatorische Region einer Nukleinsäuresequenz, die in der Lage ist, die Transkription einer Polynukleotidsequenz auszulösen, zu steuern und zu vermitteln. Promotoren können zusätzlich Erkennungssequenzen umfassen, wie strangaufwärts oder strangabwärts gelegene Promotorelemente, welche die Transkriptionsgeschwindigkeit beeinflussen können.
  • Der Begriff "nicht konstitutive Promotoren" betrifft Promotoren, die die Transkription über ein spezifisches Gewebe induzieren, oder in anderer Weise unter Umgebungs- oder Entwicklungskontrollen stehen, und schließt reprimierbare und induzierbare Promotoren, wie gewebebevorzugte, gewebespezifische und zelltypspezifische Promotoren ein. Solche Promotoren schließen den AdH1-Promotor, der durch Hypoxie oder Kältestress induzierbar ist, den Hsp70-Promotor, der durch Hitzestress induzierbar ist, und den PPDK-Promotor, der durch Licht induzierbar ist, ein.
  • Promotoren, die "gewebebevorzugt" sind, sind Promotoren, die vorzugsweise die Transkription in bestimmten Geweben auslösen. Promotoren, die "gewebespezifisch" sind, sind Promotoren, die die Transkription nur in bestimmten Geweben auslösen. "Zelltypspezifische" Promotoren sind Promotoren, die die Expression hauptsächlich in bestimmten Zelltypen in mindestens einem Organ, zum Beispiel in Gefäßzellen, antreiben.
  • "Induzierbare" oder "reprimierbare" Promotoren sind jene unter der Kontrolle der Umgebung, sodass die Transkription bewirkt wird, zum Beispiel durch eine Umgebungsbedingung, wie anaerobe Bedingungen, die Anwesenheit von Licht, biotischer Stress, usw. oder in Antwort auf interne, chemische oder biologische Signale, z. B. Glyceraldehydphosphatdehydrogenase, AOX1- und AOX2-Methanol induzierbare Promotoren oder auf physikalische Beschädigung.
  • So wie hier verwendet, beftrifft der Begriff "konstitutive Promotoren" Promotoren, die die Transkription auslösen, steuern oder vermitteln, und die unter den meisten Umgebungsbedingungen und Entwicklungszuständen oder Zelldifferenzierungszuständen aktiv sind. Beispiele für konstitutive Promotoren schließen den Blumenkohl-Mosaikvirus (CaMv) 35S, den 1'- oder 2'-Promotor, der von T-DNA aus Agrobacterium tumefaciens abgeleitet ist, den Ubiquitin-1-Promotor, den Smas- Promotor, den Zimtalkoholdehydrogenase-Promotor, den Glyceraldehyddehydrogenase-Promotor und den Nos-Promotor, usw. ein, sind aber nicht darauf beschränkt.
  • Der Begriff "gereinigt", so wie er hier verwendet wird, bezeichnet, dass das angegebene Molekül in der substanziellen Abwesenheit von anderen biologischen Makromolekülen, z. B. Polynukleotiden, Proteinen und desgleichen, vorliegt. Der Begriff bedeutet vorzugsweise, dass das Molekül von Interesse in einer Lösung oder Zusammensetzung mit mindestens 80 Gew.-%, vorzugsweise mindestens 85 Gew.-%, weiter bevorzugt mindestens 95 Gew.-% und am meisten bevorzugt mit mindestens 99,8 Gew.-% vorliegt. Wasser, Puffer und andere kleine Moleküle, insbesondere Moleküle, die ein Molekulargewicht von weniger als ungefähr einem kDa aufweisen, können anwesend sein.
  • Der Begriff "im Wesentlichen gereinigt", so wie er hier verwendet wird, betrifft Nuklein- oder Aminosäuresequenzen, welche aus ihrer natürlichen Umgebung entfernt, isoliert oder getrennt werden, und mindestens 60% frei, vorzugsweise 75% frei und am meisten bevorzugt 90% frei von anderen Bestandteilen sind, mit welchen sie natürlich assoziiert sind.
  • Eine "Substitution" ist das Ersetzen von einer/m oder mehreren Aminosäure/n oder Nukleotid/en durch jeweils unterschiedliche Aminosäuren oder Nukleotide.
  • Der Begriff "Transfektion", so wie er hier verwendet wird, betrifft das Verfahren des Einführens eines Expressionsvektors in eine Zelle. Verschiedene Transfektionstechniken sind im Stand der Technik bekannt, zum Beispiel Mikroinjektion, Lipofektion oder die Verwendung einer Genpistole.
  • "Transformation", so wie es hier verwendet wird, beschreibt ein Verfahren, durch welches exogene Nukleinsäuresequenzen, z. B. DNA, in eine Empfängerzelle eindringen und sie verändern. Eine Transformation kann unter natürlichen oder künstlichen Bedingungen unter Verwendung verschiedener Verfahren, die im Stand der Technik gut bekannt sind, stattfinden. Eine Transformation kann auf irgendeinem bekannten Verfahren für die Insertion von fremden Nukleinsäuresequenzen in eine prokaryontische oder eukaryontische Wirtszelle beruhen. Das Verfahren wird basierend auf dem Typ der Wirtszelle, die transformiert werden soll, ausgewählt und kann virale Infektion, Elektroporation, Hitzeschock, Lipofektion und Teilchenbeschuss einschließen, ist aber nicht darauf beschränkt. Solche "transformierten" Zellen schließen stabil transformierte Zellen ein, in welchen die inserierte DNA in der Lage zur Replikation ist, entweder als ein sich autonom replizierendes Plasmid oder als Teil des Wirtschromosoms, und schließt auch Zellen ein, welche die inserierte Nukleinsäure vorübergehend für begrenzte Zeiträume exprimieren.
  • So wie hier verwendet, betrifft der Begriff "Impfstoff" eine Präparation aus abgetöteten oder modifizierten Mikroorganismen, lebenden, attenuierten Organismen oder lebenden, voll virulenten Organismen oder irgendein anderes Mittel, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Peptide, Proteine, biologische Makromoleküle oder Nukleinsäuren, natürlich, synthetisch oder semisynthetisch, welches verabreicht wird, um eine Immunität gegenüber einer bestimmten Erkrankung herzustellen oder künstlich anzuheben, um eine zukünftige Infektion mit einer ähnlichen Einheit zu verhindern. Impfstoffe können lebende oder inaktivierte Mikroorganismen oder Mittel, einschließlich Viren und Bakterien, sowie eine Untereinheit, synthetisch, semisynthetisch oder auf rekombinanter DNA basierend, darstellen.
  • Impfstoffe können monovalent sein (ein einzelner Linien-/Mikroorganismus/Erkrankungs-Impfstoff), bestehend aus einem Mikroorganismus oder Mittel (z. B. Poliovirus-Impfstoff) oder aus den Antigenen von einem Mikroorganismus oder Mittel. Impfstoffe können auch multivalent sein, z. B. divalent, trivalent, usw. (ein kombinierter Impfstoff), bestehend aus mehr als einem Mikroorganismus oder Mittel (z. B. ein Masern-Mumps-Röteln-(MMR)-Impfstoff) oder aus den Antigenen von mehr als einem Mikroorganismus oder Mittel.
  • Lebendimpfstoffe werden aus lebenden Mikroorganismen hergestellt. Attenuierte Impfstoffe sind Lebendimpfstoffe, die aus Mikroorganismen hergesellt werden, welche eine physikalische Veränderung (wie eine Bestrahlung oder eine Temperaturbehandlung) oder eine fortlaufende Passage in Labortierwirten oder in infizierten Gewebe-/Zellkulturen durchlaufen haben, wobei solche Behandlungen avirulente Linien herstellen oder Linien mit reduzierter Virulenz, die aber die Fähigkeit beibehalten, eine schützende Immunität zu induzieren. Beispiele für lebend attenuierte Impfstoffe schließen Masern, Mumps, Röteln und Hundestaupe ein. inaktivierte Impfstoffe sind Impfstoffe, in welchen die infektiösen mikrobiellen Bestandteile zerstört wurden, z. B. durch eine chemische oder physikalische Behandlung (wie Formalin, Beta-Propiolacton oder Gammastrahlen), ohne die Antigenizität oder Immunogenität der viralen Hülle oder der äußeren Membranproteine des Bakteriums zu beeinflussen. Beispiele für inaktivierte oder Untereinheit-Impfstoffe schließen Influenza-, Hepatitis A- und Poliomyelitis-(IPV)Impfstoffe ein.
  • Untereinheit-Impfstoffe sind aus Schlüsselmakromolekülen aus z. B. dem viralen, bakteriellen oder einem anderen Mittel, welches für das Auslösen einer Immunantwort verantwortlich ist, aufgebaut. Diese Bestandteile können in einer Anzahl von Wegen erhalten werden, zum Beispiel durch Reinigung aus Mikroorganismen, Erzeugen unter Verwendung rekombinanter DNA-Technologie, usw. Untereinheit-Impfstoffe können synthetische Mimetika von irgendeinem infektiösen Mittel enthalten. Untereinheit-Impfstoffe können Makromoleküle, wie bakterielle Proteintoxine (z. B. Tetanus, Diphtherie), virale Proteine (z. B. aus dem Influenzavirus), Polysaccharide aus eingekapselten Bakterien (z. B. aus Haemophilus influenzae und Streptococcus pneumonia) und virusähnlichen Teilchen, die durch rekombinante DNA-Technologie hergestellt wurden (z. B. Hepatitis B-Oberflächenantigen), usw. einschließen.
  • Synthetische Impfstoffe sind Impfstoffe, die aus kleinen synthetischen Peptiden aufgebaut sind, welche die Oberflächenantigene von Pathogenen vortäuschen, und die immunogen sind, oder können Impfstoffe sein, die mit der Hilfe von re kombinanten DNA-Techniken hergestellt werden, einschließlich vollständigen Viren, deren Nukleinsäuren modifiziert wurden.
  • Semisynthetische Impfstoffe oder Konjugat-Impfstoffe bestehen aus Polysaccharid-Antigenen aus Mikroorganismen, die an Protein-Trägermoleküle angeheftet sind.
  • DNA-Impfstoffe enthalten rekombinante DNA-Vektoren, die Antigene kodieren, welche bei einer Expression des kodierten Antigens in den Wirtszellen, welche die DNA aufgenommen haben, humorale oder zelluläre Immunantworten gegen die kodierten Antigene induzieren.
  • Es wurden Impfstoffe für eine Vielzahl von infektiösen Mitteln entwickelt. Die vorliegende Erfindung ist auf rekombinante Gelatinen gerichtet, die in Impfstoffformulierungen verwendet werden können, unabhängig von dem beteiligten Mittel, und sind daher nicht auf die Verwendung in den Impfstoffen beschränkt, die hier exemplarisch spezifisch beschrieben werden. Impfstoffe schließen Impfstoffe für das Vacciniavirus (Pocken), das Poliovirus (Salk und Sabin), Mumps, Masern, Röteln, Diphtherie, Tetanus, Varicella-Zoster (Windpocken/Gürtelrose), Pertussis (Keuchhusten), Bacille Calmette-Guerin (BCG, Tuberkulose), Haemophilus influenzae Meningitis, Tollwut, Cholera, das japanische Enzephalitis Virus, Salmonella typhi, Shigellen, Hepatitis A, Hepatitis B, das Adenovirus, Gelbfieber, Hand-Fuß-Mund-Krankheit, das Herpes simplex Virus, das respiratorisch-syncytiale Virus, das Rotavirus, Denguefieber, das West-Nil-Virus, das Truthahn-Herpes Virus (Marek- Krankheit), Influenza und Anthrax ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Der Begriff Impfstoff, so wie er hier verwendet wird, schließt Bezugnahme auf Impfstoffe gegen verschiedene infektiöse und Autoimmunerkrankungen und Krebse ein, die entwickelt wurden oder werden, zum Beispiel Impfstoffe gegen verschiedene infektiöse und Autoimmunerkrankungen und Krebse, z. B. Impfstoffe gegen HIV, HCV, Malaria und Impfstoffe gegen Brust-, Lungen-, Darm-, Nieren-, Blasen- und Eierstockkrebse.
  • Eine Polypeptid- oder Aminosäure-"Variante" stellt eine Aminosäuresequenz dar, welche durch eine oder mehrere Aminosäuren aus einer bestimmten Aminosäuresequenz verändert wird. Eine Polypeptidvariante kann konservative Änderungen aufweisen, worin eine substituierte Aminosäure ähnliche strukturelle oder chemische Eigenschaften zu der ersetzten Aminosäure aufweist, z. B. Ersetzen von Leucin mit Isoleucin. Eine Variante kann auch nicht konservative Änderungen aufweisen, in welchen die substituierte Aminosäure physikalische Eigenschaften aufweist, die sich von jenen der ersetzten Aminosäure unterscheiden, z. B. Ersetzen von einem Glycin mit einem Tryptophan. Analoge geringere Variationen können auch Aminosäuredeletionen oder -insertionen oder beides einschließen. Vorzugsweise behalten Aminosäurevarianten bestimmte strukturelle oder funktionelle Eigenschaften eines bestimmten Polypeptids bei. Anleitung beim Bestimmen, welche Aminosäurereste substituiert, inseriert oder deletiert werden können, kann zum Beispiel unter Verwendung von Computerprogrammen gefunden werden, die im Stand der Technik gut bekannt sind, wie die LASERGENE-Software (DNASTAR Inc., Madison, WI).
  • Eine Polynukleotidvariante stellt eine Variante einer besonderen Polynukleotidsequenz dar, die vorzugsweise mindestens ungefähr 80%, weiter bevorzugt mindestens ungefähr 90% und am meisten bevorzugt mindestens ungefähr 95% Polynukleotidsequenz-Ähnlichkeit zu der besonderen Polynukleotidsequenz aufweist. Es wird vom Fachmann erkannt werden, dass als Ergebnis der Degeneriertheit des genetischen Codes eine Vielzahl von variablen Polynukleotidsequenzen, die ein besonderes Protein kodieren, hergestellt werden kann, wobei einige eine minimale Homologie zu den Polynukleotidsequenzen von irgendeinem bekannten oder natürlich vorkommenden Gen aufweisen.
  • Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung stellt die Herstellung von rekombinanten Tierkollagen und -gelatinen bereit. Diese Tierkollagene und -gelatinen stellen Vorteile gegenüber derzeit verfügbaren Materialien bereit, indem sie als gut charakterisierte und reine Proteine hergestellt werden. Verfahren zum Herstellen dieser Tierkollagene und -gelatinen werden auch bereitgestellt. Die Tierkollagene und -gelatinen werden vom bovinen Typ I-Kollagen abgeleitet. Spezifisch werden bovine α1(I)-Kollagene und -Gelatinen bereitgestellt.
  • Die vorliegende Erfindung stellt die Herstellung von relativ großen Mengen einzelner Typen von Tierkollagen bereit, das in rekombinanten Zellkultursystemen synthetisiert wird, die nicht irgendwelche anderen Kollagentypen erzeugen. Die vorliegende Erfindung stellt Tierkollagen Typ I bereit, das im Wesentlichen frei von irgendwelchen anderen Kollagentypen ist. Unter Verwendung der erfindungsgemäßen Verfahren ist die Reinigung des Kollagens stark vereinfacht.
  • Die vorliegende Erfindung ist weiterhin auf Vektoren und Plasmide gerichtet, die in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden. Diese Vektoren und/oder Plasmide umfassen ein Polynukleotid, welches das gewünschte Kollagen, nötige Promotoren und andere Sequenzen, die für die einwandfreie Expression solcher Polypeptide nötig sind, kodiert. Das Polynukleotid, das ein Kollagen kodiert, wird vorzugsweise aus Tierquellen erhalten. Tierquellen schließen nicht-menschliche Säugetierquellen, wie Rinder-, Schafs- und Schweinequellen ein. In einer Ausführungsform schließen die Vektoren und Plasmide weiterhin mindestens ein Polynukleotid ein, das ein oder mehrere posttranslationale/s Enzym/e oder funktionelle Äquivalente davon kodiert. Das Polynukleotid, das ein oder mehrere posttranslationale/s Enzym/e kodiert, kann von irgendeiner der oben erwähnten Arten abgeleitet sein. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Kollagen kodierende Polynukleotid von derselben Art abgeleitet, wie das Polynukleotid, das das posttranslationale Enzym kodiert.
  • In einer weiteren Ausführungsform wird mindestens ein Polynukleotid, das ein posttranslationales Enzym, wie Prolyl-4-Hydroxylase, C-Proteinase, N-Proteinase, Lysyloxidase oder Lysylhydroxylase kodiert, in Zellen inseriert, die nicht natürlicherweise posttranslationale Enzyme herstellen, wie Hefezellen, oder die natürlicherweise nicht ausreichende Mengen von posttranslationalen Enzymen herstel len können, wie einige Säugetier- und Insektenzellen. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das posttranslationale Enzym Prolyl-4-Hydroxylase, wobei die Polynukleotide, die eine α-Untereinheit der Prolyl-4-Hydroxylase kodieren und die Polynukleotide, die eine β-Untereinheit der Prolyl-4-Hydroxylase kodieren in eine Zelle inseriert werden, um ein biologisch aktives Prolyl-4-Hydroxylase-Enzym herzustellen.
  • Die vorliegende Erfindung umfasst spezifisch die Verwendung von irgendeiner Verbindung, biologisch oder chemisch, die den erfindungsgemäßen rekombinanten Tierkollagenen und -gelatinen eine Hydroxylierung verleiht, z. B. eine Prolinhydroxylierung und/oder einer Lysinhydroxylierung, usw., wie gewünscht. Dies schließt zum Beispiel Prolyl-4-Hydroxylase aus irgendeiner Art, endogen oder exogen bereitgestellt, einschließlich verschiedener Isoformen der Prolyl-4-Hydroxylase und irgendwelcher Varianten oder Fragmente oder Untereinheiten der Prolyl-4-Hydroxylase ein, die die gewünschte Aktivität aufweisen, ob nativ, synthetisch oder semisynthetisch, und andere Hydroxylasen, wie Prolyl-3-Hydroxylase, usw. (Siehe z. B. U.S. Patent Nr. 5,928,922 ). In einer Ausführungform wird die Prolylhydroxylase-Aktivität durch eine Prolylhydroxylase verliehen, die aus derselben Art abgeleitet wird, wie das Polynukleotid, das das rekombinan te Kollagen oder die Gelatine kodiert, oder ein Polypeptid kodiert, von welchem rekombinante Gelatine abgeleitet werden kann. In einer weiteren Ausführungsform stammt die Prolyl-4-Hydroxylase aus einem Tier und das kodierende Polynukleotid ist von einer Sequenz aus demselben Tier abgeleitet.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Herstellen von rekombinanten Tierkollagenen und -gelatinen bereit. Zur Eindeutigkeit muss erwähnt werden, dass, während die erfindungsgemäßen Verfahren der Herstellung im Allgemeinen auf die Herstellung von Kollagenen gerichtet sind, die Herstellungsverfahren auf die Herstellung von Gelatinen direkt aus veränderten Kollagenkonstrukten und auf die Herstellung von Polypeptiden, aus denen Gelatinen abgeleitet werden können, angewandt werden können. In einer Ausführungsform umfasst das Verfahren das Einführen, unter Bedingungen, die für eine Expression geeignet sind, eines Ex pressionsvektors, der das erfindungsgemäße Tierkollagen kodiert, und eines zweiten Expressionsvektors, der ein posttranslationales Enzym kodiert, in eine Wirtszelle, und das Isolieren des Kollagens. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das posttranslationale Enzym Prolylhydroxylase. (Siehe z. B. U.S. Patent Nr. 5,593,859 ).
  • In einem Aspekt sind die erfindungsgemäßen Kollagenzusammensetzungen weniger als vollständig glykosyliert oder weniger als vollständig hydroxyliert. Zum Beispiel kann das erfindungsgemäße Kollagen deglykosyliert, unglykosyliert, teil weise glykosyliert und teilweise hydroxyliert sein. In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung umfassen die Kollagenzusammensetzungen einen Typ Kollagen und sind im Wesentlichen frei von irgendeinem anderen Typ von Kollagen.
  • Es werden rekombinante Polypeptide offenbart, einschließlich Fusionsprodukten, die aus chimären Genen hergestellt werden, in denen zum Beispiel relevante Epitope des Kollagens für therapeutische und andere Verwendungen hergestellt werden können. Des Weiteren werden irgendwelche Modifikationen, die an den Kollagenen oder Gelatinen oder Zusammensetzungen davon vorgenommen werden oder irgendwelche Abbauprodukte davon offenbart. Solche Modifikationen schließen zum Beispiel Verarbeiten von Tierkollagenen oder kollagenartigen Proteinen und Gelatine ein.
  • Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin Gelatinezusammensetzungen bereit. Spezifisch stellt die vorliegende Erfindung Gelatinezusammensetzungen bereit, die von den erfindungsgemäßen Kollagenen abgeleitet werden. In einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Zusammensetzung aus einer Gelatine aufgebaut, die aus einem Kollagentyp, der im Wesentlichen frei von irgendeinem anderen Kollagentyp ist, abgeleitet wird. In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung umfasst die Gelatinezusammensetzung denaturierte Dreifachhelices.
  • Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin Verfahren zum Herstellen einer Gelatine durch Exprimieren des erfindungsgemäßen Kollagens und Ableiten der Gelatine davon bereit. Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin die direkte Expression von rekombinanter Tiergelatine aus einem Polynukleotid, das SEQ ID NR: 2 kodiert, bereit. (Siehe z. B. selber Inhaber, gleichzeitig anhängende Anmeldung US 2005/229264). Spezifischer umfasst das Verfahren das Inserieren eines Expressionsvektors, der mindestens ein Polynukleotid umfasst, das ein erfindungsgemäßes Tierkollagen kodiert, und eines Expressionsvektors, der mindestens ein Polynukleotid umfasst, das ein posttranslationales Kollagenenzym oder eine Untereinheit davon kodiert, in eine Zelle, das Gewinnen des Kollagens und das Ableiten der Gelatine von dem Kollagen.
  • In einigen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung können die Gelatinezusammensetzungen direkt aus dem isolierten Kollagen oder aus Biomasse oder Kulturmedien erhalten werden. Verfahren, Abläufe und Techniken des Herstellens von Gelatinezusammensetzungen aus Kollagen schließen Denaturieren der dreifach helikalen Struktur des Kollagens unter Verwendung von Detergenzien, Hitze oder Denaturierungsmitteln ein. Zusätzlich schließen diese Verfahren, Abläufe und Techniken Behandlungen mit starkem Alkali oder starken Säuren, Hitzeextraktion in einer wässrigen Lösung, Ionenaustauschchromatographie, Kreuzstromfiltration und Hitzetrocknung und andere Verfahren ein, die im Stand der Technik bekannt sind, die auf Kollagen angewendet werden können, um die Gelatinezusammensetzungen herzustellen, sind aber nicht darauf beschränkt. Dieselben Verfahren, Abläufe und Techniken können auf Biomasse oder Kulturmedien angewendet werden, um die erfindungsgemäßen Gelatinezusammensetzungen herzustellen.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin Tierkollagene. Die vorliegende Erfindung stellt ein bovines Typ I-Kollagen bereit, spezifisch wird ein bovines α1(I)-Kollagen bereitgestellt.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch Polynukleotide bereit, die das erfindungsgemäße bovine α1(I)-Kollagen kodieren. Die Erfindung stellt weiterhin Polynukleotide bereit, die komplementär zu den kodierenden Polynukleotiden sind. Die vorliegende Erfindung stellt auch Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen rekombinanten bovinen Typ I-Kollagene bereit.
  • In einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung können die Expressionsvektoren, die die erfindungsgemäßen Polynukleotide umfassen, in Wirtszellen inseriert werden, um die bovinen Typ I-Kollagene oder -Gelatinen herzustellen. In einem Verfahren wird ein Expressionsvektor, der ein erfindungsgemäßes Polynukleotid umfasst, in Wirtszellen zusammen mit einem Expressionsvektor exprimiert, der ein Polynukleotid umfasst, das ein erfindungsgemäßes Polypeptid mit einem Expressionsvektor kodiert, der ein Polynukleotid umfasst, das ein posttranslationales Enzym kodiert. In einer Ausführungsform ist das posttranslationale Enzym Prolyl-4-Hydroxylase, die ein α-Untereinheit und eine β-Untereinheit umfasst.
  • Die erfindungsgemäßen rekombinanten Tierkollagene und -gelatinen beschränken die menschliche Exposition gegenüber verschiedenen Kontaminierungen, die in Tiergeweben anwesend sein können, die derzeit als Rohmaterial in der Herstellung von Kollagenen und von Kollagen abgeleiteten Materialien, wie Gelatine, verwendet werden. Darüber hinaus sind die erfindungsgemäßen Kollagene und Gelatinen reproduzierbarer als die Kollagene oder Gelatinen, die derzeit aus rohen Tierquellen erhalten werden.
  • Erfindungsgemäß können kodierende Polynukleotidsequenzen, sowie gut charakterisierte Proteine mit vorhersagbaren Funktionen verwendet werden, um rekombinante Moleküle zu erzeugen, die die Expression der erfindungsgemäßen Polypeptide in geeigneten Wirtszellen steuern.
  • Nukleinsäuresequenzen, die Kollagene kodieren, wurden im Stand der Technik im Allgemeinen beschrieben. (Siehe z. B. Fuller und Boedtker (1981) Biochemistry 20: 996-1006; Sandell et al. (1984) J. Biol. Chem. 259: 7826-34; Kohno et al. (1984) J. Biol. Chem. 259: 13668-13673, French et al. (1985) Gene 39: 311-312; Metsaranta et al. (1991) J. Biol. Chem. 266: 16862-16869; Metsaranta et al., (1991) Biochim Biophys Acta 1089: 241-243; Wood et al. (1987) Gene 61: 225-230; Glumoff et al. (1994) Biochim Biophys Acta 1217: 41-48; Shirai et al. (1998) Matrix Biology 17: 85-88; Tromp et al. (1988) Biochem J. 253: 919-912; Kuivaniemi et al. (1988) Biochem J. 252: 633-640; und Ala-Kokko et al. (1989) Biochem J. 260: 509-516).
  • In einer Ausführungsform kodiert die Polynukleotidsequenz die bovine α1(I)-Kollagen-Aminosäuresequenz SEQ ID NR: 2.
  • Veränderte Polynukleotidsequenzen, die verwendet werden können, schließen Deletionen, Additionen oder Substitutionen von verschiedenen Nukleotidresten ein, die zu einer Sequenz führen, die dasselbe oder ein funktionell äquivalentes Genprodukt kodieren. Das Genprodukt selber kann Deletionen, Additionen oder Substitutionen von Aminosäureresten enthalten, und dennoch zu einem funktionell äquivalenten Polypeptid führen.
  • Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen können gentechnisch verändert werden, um die kodierende Sequenz für eine Vielzahl von Zwecken zu ändern, einschließlich Änderungen, die die Verarbeitung und Expression des Genprodukts modifizieren, sind aber nicht darauf beschränkt. Zum Beispiel können alternative sekretorische Signale für das native sekretorische Signal substituiert werden und/oder Mutationen können unter Verwendung von Techniken, die im Stand der Technik gut bekannt sind, eingeführt werden, z. B. zielgerichtete Mutagenese, Inserieren neuer Restriktionsstellen, Verändern der Glykosylierungsmuster, Phosphorylierung, usw. In einer Ausführungsform können die erfindungsgemäßen Polynukleotide an der stillen Position von irgendeinem Aminosäure-Codon-Triplet modifiziert werden, um der Codonpräferenz des bestimmten Wirtsorganismus besser zu entsprechen.
  • In einer anderen Ausführungsform kann ein erfindungsgemäßes Polynukleotid an eine heterologe Sequenz ligiert werden, um ein Fusionsprotein zu kodieren. Zum Beispiel kann ein Fusionsprotein gentechnisch hergestellt werden, um eine Spalt stelle zu enthalten, die zwischen einer erfindungsgemäßen bovinen α1(I)-Kollagensequenz und der heterologen Proteinsequenz liegt, sodass das α1(I)-Kollagen von dem heterologen Rest abgespalten werden kann.
  • Polynukleotidvarianten können auch gemäß im Stand der Technik gut bekannten Verfahren erzeugt werden. In einem Verfahren werden Polynukleotide über zielgerichtete Mutagenese verändert. Dieses Verfahren verwendet Oligonukleotidsequenzen, die die Polynukleotidsequenz der gewünschten Aminosäurevariante kodieren, sowie ein ausreichend benachbart liegendes Nukleotid auf beiden Seiten der geänderten Aminosäure, um eine stabile Doppelhelix auf beiden Seiten der veränderten Stelle zu bilden. Im Allgemeinen sind die Techniken der zielgerichteten Mutagenese dem Fachmann gut bekannt, und diese Technik ist beispielhaft durch Veröffentlichungen, wie zum Beispiel Edelmann et al. (1983) DNA, 2: 183, dargestellt. Ein vielseitiges und effizientes Verfahren zum Herstellen von stellenspezifischen Änderungen in einer Polynukleotidsequenz wird z. B. von Zoller und Smith (1982) Nucleic Acids Res. 10: 6487-6500 beschrieben.
  • Wie im Stand der Technik bekannt ist, verändern Nukleinsäuremutationen nicht notwendigerweise die Aminosäuresequenz, die durch eine Polynukleotidsequenz kodiert wird, während besondere Restriktionsstellen bereitgestellt werden, die für eine Manipulation des Moleküls geeignet sind. Daher kann das modifizierte Molekül aus einer Anzahl von einzelnen Regionen oder D-Regionen aufgebaut sein, die von besonderen Restriktionsstellen flankiert werden. Diese einzelnen Regionen des Moleküls werden hier als Kassetten bezeichnet. Moleküle, die aus Mehrfachkopien einer Kassette gebildet werden, sind durch die vorliegende Offenbarung eingeschlossen. Rekombinante oder mutante Nukleinsäuremoleküle oder Kassetten, welche die gewünschten Eigenschaften bereitstellen, wie eine Resistenz gegenüber endogenen Enzymen, wie Kollagenase, sind auch durch die vorliegende Offenbarung eingeschlossen. (Siehe z. B. Maniatis et al., supra und Ausubel et al., supra).
  • Es wird vom Fachmann erkannt werden, dass, als Ergebnis der Degeneriertheit des genetischen Codes, eine Vielzahl von Polynukleotidsequenzen, welche die erfindungsgemäßen Polypeptide kodieren, hergestellt werden können, wobei einige eine minimale Homologie zu den Nukleotidsequenzen von irgendeinem bekannten oder natürlich vorkommenden Gen aufweisen. Daher umfasst die Erfindung jede und jede mögliche Variation der Nukleotidsequenz, die durch Auswählen von Kombinationen, basierend auf möglichen Codonauswahlen erzeugt werden könnte. Diese Kombinationen werden in Übereinstimmung mit dem genetischen Standard-Tripletcode vorgenommen.
  • Die Erfindung umfasst auch die Herstellung von Polynukleotidsequenzen, welche die erfindungsgemäßen Polypeptide kodieren, vollständig durch synthetische Chemie. Nach der Herstellung kann die synthetische Sequenz in irgendeinen der vielen verfügbaren Expressionsvektoren und Zellsysteme inseriert werden, unter Verwendung von Reagenzien, die im Stand der Technik gut bekannt sind. Darüber hinaus kann die synthetische Chemie verwendet werden, um Mutationen in eine Polynukleotidsequenz, die das erfindungsgemäße Kollagen kodiert, einzuführen.
  • Eine PCR kann auch verwendet werden, um erfindungsgemäße Varianten zu erzeugen. Wenn kleine Mengen der Matrizen-Nukleinsäure als Ausgangsmaterial verwendet werden, kann ein/können Primer, der/die sich leicht in der Sequenz von der entsprechenden Region in der Matrizen-Nukleinsäure unterscheidet/n, die gewünschte Aminosäurevariante erzeugen. Eine PCR-Amplifikation führt zu einer Population von Produkt-Polynukleotidfragmenten, die sich von der Polynukleotidmatrize, die das Kollagen kodiert, an der durch den Primer spezifizierten Position unterscheiden. Die Produktfragmente ersetzen die entsprechende Region in dem Plasmid, wobei die gewünschte Nukleinsäure- oder Aminosäurevariante erzeugt wird.
  • Aufgrund der innewohnenden Degeneriertheit des genetischen Codes werden andere Polynukleotidsequenzen, die im Wesentlichen dieselben oder funktionell äquivalente Polypeptidsequenzen kodieren, durch die vorliegende Offenbarung ein geschlossen, und es sind alle Degenerationsvarianten und Codon optimierten Sequenzen spezifisch vorgesehen. Kodierende Polynukleotidsequenzen, die natürlich, synthetisch, semisynthetisch oder rekombinant sind, können in der Ausführung der beanspruchten Erfindung verwendet werden.
  • Wenn sie natürlich hergestellt werden, stellen Kollagene Strukturproteine dar, die eine oder mehrere Kollagenuntereinheit/en umfassen, die zusammen mindestens eine dreifach helikale Domäne bilden. Eine Vielzahl von Enzymen wird verwendet, um die Kollagenuntereinheiten in Prokollagen oder andere Vorläufermoleküle und anschließend in reifes Kollagen umzuwandeln. Solche Enzyme schließen zum Beispiel Prolyl-4-Hydroxylase, C-Proteinase, N-Proteinase, Lysyloxidase, Lysylhydroxylase, usw. ein.
  • Die Prolyl-4-Hydroxylase ist ein α2β2-Tetramer und spielt eine zentrale Rolle in der Biosynthese von allen Kollagenen, 4-Hydroxyprolinreste stabilisieren die Faltung der neu synthetisierten Polypeptidketten in stabile dreifach helikale Moleküle. (Siehe z. B. Prockop et al. (1995) Annu. Rev. Biochem. 64: 403-434; Kivirikko et al. (1992) "Post-Translational Modifications of Proteins", S. 1-51 und Kivirikko et al. (1989) FASER J. 3: 1609-1617). Zusätzlich war die Menge der Expression von Typ III-Kollagen niedriger in der Abwesenheit von rekombinanter Prolyl-4-Hydroxylase, als in seiner Anwesenheit. Humane Isoformen der Prolyl-4-Hydroxylase wurden kloniert und charakterisiert. (Siehe z. B. Helaakoski et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. 92: 4427-4431; US Patent Nr. 5,928,922 ).
  • Die Lysylhydroxylase, ein α2-Homodimer, katalysiert die posttranslationale Modifikation des Kollagens, um Hydroxylysin in Kollagenen zu bilden. Siehe im Allgemeinen Kivirikko et al. (1992) "Post-Translational Modifications of Proteins", Harding, J.J., und Crabbe, M.J.C., Hrsg., CRC Press, Boca Raton, FL und Kivirikko (1995) Principles of Medical Biology, Band 3 Cellular Organelles and the Extracellular Matrix, Bittar, E.E. und Bittar, N., Hrsg., JAI Press, Greenwich, Großbritannien. Isoformen der Lysylhydroxylase wurden kloniert und identifiziert. (Siehe z. B. Passoja et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. 95 (18): 10482-10486 und Valtavaara et al. (1997) J. Biol. Chem. 272(11): 6831-6834).
  • Die C-Proteinase verarbeitet das zusammengebaute Prokollagen durch Abspalten der C-terminalen Enden der Prokollagene, die beim Zusammenbau der Dreifachhelix des Kollagenmoleküls behilflich sind, aber keinen Teil davon bilden. (Siehe z. B. Kadler et al. (1987) J. Biol. Chem. 262: 15969-15701 und Kadler et al. (1990) Ann. NY Acad. Sci. 580: 214-224).
  • Die N-Proteinase verarbeitet das zusammengebaute Prokollagen durch Abspalten der N-terminalen Enden der Prokollagene, die beim Zusammenbau der Kollagen-Dreifachhelix behilflich sind, aber keinen Teil davon bilden. (Siehe z. B. Hojima et al. (1994) J. Biol. Chem. 269: 11381-11390).
  • Die Lysyloxidase stellt ein extrazelluläres Kupferenzym dar, das die oxidative Desaminierung der α-Aminogruppe in bestimmten Lysin- und Hydroxylysinresten katalysiert, um ein reaktives Aldehyd zu bilden. Diese Aldehyde durchlaufen anschließend eine Aldolkondensation, um Aldole zu bilden, die die Kollagenfibrillen vernetzen. Die Information über die DNA- und Proteinsequenz der Lysyloxidase kann zum Beispiel in Kivirikko (1995), supra; Kagan (1994) Path. Res. Pract. 190: 910-919; Kenyon et al. (1993) J. Biol. Chem. 268(25). 18435-18437, Wu et al. (1992) J. Biol. Chem. 267(34): 24199-24206; Mariani et al. (1992) Matrix 12(3): 242-248 und Hamalainen et al. (1991) Genomics 11(3): 508-516 gefunden werden.
  • Die Nukleinsäuresequenzen, die eine Anzahl dieser posttranslationalen Enzyme kodieren, wurden beschrieben. (Siehe z. B. Vuori et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 7467-7470 und Kessler et al. (1996) Science 271: 360-362). Die Nukleinsäuresequenzen, die verschiedene posttranslationale Enzyme kodieren, können auch gemäß den oben im Allgemeinen beschriebenen Verfahren bestimmt werden und schließen die Verwendung von geeigneten Sonden und Nukleinsäure-Bibliotheken ein.
  • Die rekombinanten Tiergelatinen können von den erfindungsgemäßen Tierkollagenen unter Verwendung einer Vielzahl von im Stand der Technik bekannten Verfahren abgeleitet werden. (Siehe z. B. Veis, A. (1965) International Review of Connective Tissue Research, 3: 113-200). Zum Beispiel stellt eine gängige Eigenschaft der derzeitigen Verfahren die Denaturierung der Sekundärstruktur des Kollagenproteins, und in der Mehrzahl der Beispiele, eine Änderung in entweder der Primär- oder Tertiärstruktur des Kollagens dar. Daher können die erfindungsgemäßen Tierkollagene unter Verwendung verschiedener Verfahren, die von dem Typ der gewünschten Gelatine abhängen, verarbeitet werden.
  • Rekombinante Tiergelatinen können von dem erfindungsgemäßen, rekombinant hergestellten Kollagen durch eine Vielzahl von im Stand der Technik bekannten Verfahren abgeleitet werden. Zum Beispiel kann Gelatine direkt aus einer Zellmasse oder aus Kulturmedien durch Ausnutzen der Löslichkeit der Gelatine bei erhöhten Temperaturen und seinen Stabilitätsbedingungen eines niedrigen oder hohen pH-Werts, einer niedrigen oder hohen Salzkonzentration und hohen Temperaturen abgeleitet werden. Verfahren, Abläufe und Techniken zum Herstellen von Gelatinezusammensetzungen aus Kollagen schließen Denaturieren der dreifach helikalen Struktur des Kollagens unter Verwendung von Detergenzien, Hitze oder verschiedenen Denaturierungsmitteln, die im Stand der Technik gut bekannt sind, ein. Zusätzlich können verschiedene Schritte, die an der Extraktion der Gelatine aus Tier- oder Schlachthausquellen beteiligt sind, einschließlich Behandlung mit Kalk oder Säuren, Hitzeextraktion in wässriger Lösung, Ionenaustauschchromatographie, Kreuzstromfiltration und verschiedene Verfahren des Trocknens verwendet werden, um die Gelatine aus rekombinantem Kollagen abzuleiten.
  • Expression
  • Die erfindungsgemäßen Verfahren zum Herstellen von Tierkollagenen und -gelatinen können in einer Vielzahl von rekombinanten Systemen, die dem Fachmann zur Verfügung stehen, angewendet werden. Eine Anzahl dieser rekombi nanten Systeme wird hier beschrieben, obwohl es verstanden werden soll, dass die Anwendung der erfindungsgemäßen Verfahren nicht auf die unten als Beispiel dargestellten Systeme beschränkt ist.
  • Um die erfindungsgemäßen rekombinanten Tierkollagene und -gelatinen oder die Polypeptide, aus denen die rekombinanten Gelatinen abgleitet werden können, zu exprimieren, wird das kodierende Polynukleotid in einen geeigneten Expressionsvektor inseriert, d. h. einen Vektor, der die nötigen Elemente für die Transkription und Translation der inserierten kodierenden Sequenz, oder im Fall eines viralen RNA-Vektors, die nötigen Elemente für eine Replikation und Translation enthält.
  • Verfahren, die dem Fachmann gut bekannt sind, können verwendet werden, um die Expressionsvektoren zu konstruieren, die die erfindungsgemäßen Polynukleotide und geeignete transkriptionelle/translationelle Kontrollsignale enthalten. Diese Verfahren schließen Standardtechniken der DNA-Klonierung ein, z. B. rekombinante in vitro-Techniken, synthetische Techniken und in vivo Rekombination/genetische Rekombination. (Siehe zum Beispiel die Techniken, die in Maniatis et al., supra und Ausubel et al., supra beschrieben sind).
  • Die Expressionselemente der verschiedenen Systeme variieren in ihrer Stärke und ihren Spezifitäten. Abhängig vom verwendeten Wirts-Nektorsystem kann irgendeines einer Anzahl der geeigneten Transkriptions- und Translationselemente, einschließlich von konstitutiven und induzierbaren Promotoren in dem Expressionsvektor verwendet werden. Zum Beispiel können, wenn in bakteriellen Systemen kloniert wird, induzierbare Promotoren, wie pL des Bakteriophagen γ, plac, ptrp, ptac (ptrp-lac-Hybridpromotor) und desgleichen verwendet werden, wenn in Insektenzellsystemen kloniert wird, können Promotoren, wie der Baculovirus-Polyhedronpromotor verwendet werden, wenn in Pflanzenzellsystemen kloniert wird, können Promotoren, die aus dem Genom der Pflanzenzellen (z. B. Hitzeschockpromotoren, der Promotor für die kleine Untereinheit der RUBISCO, der Promotor für das Chlorophyll a/b-Bindungsprotein) oder aus Pflanzenviren (z. B. der 35S RNA-Promotor des CaMV; der Hüllprotein-Promotor des TMV) abgeleitet werden, verwendet werden, wenn in Säugetierzellsystemen kloniert wird, können Promotoren, die aus dem Genom der Säugetierzellen (z. B. der Metallothionein-Promotor) oder aus Säugetierviren (z. B. der späte Adenovirus-Promotor, der Vaccinia-Virus 7,5 K-Promotor) abgeleitet werden, verwendet werden, wenn Zelllinien erzeugt werden, die Mehrfachkopien einer Kollagen-DNA enthalten, können SV40-, BPV- und EBV-basierte Vektoren mit einem geeigneten selektierbaren Marker verwendet werden.
  • Spezifische Initiationssignale können auch für eine effiziente Translation der inserierten Sequenzen benötigt werden. Diese Signale schließen das ATG-Startcodon und benachbarte Sequenzen ein. In den Fällen, in denen das gesamte Kollagengen, einschließlich seines eigenen Startcodons und seiner benachbarten Sequenzen in den geeigneten Expressionsvektor inseriert wird, kann es sein, dass keine zusätzlichen translationellen Kontrollsignale benötigt werden. In Fällen, in denen nur ein Abschnitt einer Kollagen kodierenden Sequenz inseriert wird, müssen jedoch exogene translationelle Kontrollsignale, einschließlich des ATG-Startcodons, bereitgestellt werden. Darüber hinaus muss das Startcodon phasengleich mit dem Leserahmen der Kollagen kodierenden Sequenz sein, um die Translation des gesamten inserts sicherzustellen. Diese exogenen translationellen Kontrollsignale und Startcodons können vielfältigen Ursprungs sein, sowohl natürlich, als auch synthetisch. Die Effizienz der Expression kann durch den Einschluss geeigneter Transkriptions-Enhancerelemente, Transkriptions-Terminatoren, usw. verstärkt werden. (Siehe z. B. Bittner et al. (1987) Methods in Enzymol. 153: 516-544).
  • Die erfindungsgemäßen Polypeptide können als sezernierte Proteine exprimiert werden. Wenn die gentechnisch hergestellten Zellen, die für die Expression der Proteine verwendet werden, nicht-menschliche Wirtszellen darstellen, ist es häufig vorteilhaft, das sekretorische Signalpeptid des Kollagenproteins durch ein alternatives sekretorisches Signalpeptid zu ersetzen, das effizienter von der Steuerungsmaschinerie der Sekretion der Wirtszelle erkannt wird. Die geeignete sekretorische Signalsequenz ist insbesondere wichtig beim Erhalten einer optimalen Pilzexpression von Säugetiergenen. Siehe zum Beispiel z. B. Brake et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 4642. Andere Signalsequenzen für prokaryontische, Hefe-, Pilz-, Insekten- oder Säugetierzellen sind im Stand der Technik gut bekannt, und der Fachmann könnte eine geeignete Signalsequenz für die Wirtszelle der Wahl einfach auswählen.
  • Die erfindungsgemäßen Vektoren können sich in der Wirtszelle autonom replizieren oder können sich in das Wirtschromosom integrieren. Geeignete Vektoren mit autonom replizierenden Sequenzen sind für eine Vielzahl von Bakterien, Hefe- und verschiedene virale Replikationssequenzen für sowohl Prokaryonten, als auch Eukaryonten gut bekannt. Die Vektoren können sich in das Wirtszellgenom integrieren, wenn sie eine Nukleinsäuresequenz aufweisen, die homolog zu einer Sequenz ist, die in der genomischen DNA der Wirtszelle gefunden wird.
  • In einer Ausführungsform umfassen die erfindungsgemäßen Expressionsvektoren einen selektierbaren Marker, der ein Produkt kodiert, das für die Wirtszelle nötig ist, um unter bestimmten Bedingungen zu wachsen und zu überleben. Typische Selektionsgene schließen Gene ein, die Proteine kodieren, die eine Resistenz gegen ein Antibiotikum oder ein anderes Toxin (z. B. Tetracyclin, Ampicillin, Neomycin, Methotrexat, usw.) verleihen, Proteine, die eine auxotrophe Anforderung der Wirtszelle ergänzen, usw. Andere Beispiele der Selektionsgene schließen die Herpes simplex-Virus-Thymidin-Kinase-(Wigler et al. (1977) Cell 11: 223), die Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase-(Szybalska et al. (1962) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48: 2026) und die Adenin-Phosphoribosyltransferase-(Lowy et al. (1980) Cell 22: 817) Gene ein, die jeweils in tk, hgprt oder aprt-Zellen eingesetzt werden können.
  • Eine Antimetabolitresistenz kann als Grundlage der Selektion verwendet werden, wie bei der Verwendung von dhfr, was eine Resistenz gegen Methotrexat verleiht, gpt, was eine Resistenz gegen Mycophenolsäure verleiht, neo, was eine Resistenz gegen Aminoglykosid G-418 verleiht und hygro, was eine Resistenz gegen Hygromycin verleiht. (Siehe z. B. Wigler et al. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 3567; O'Hare et al. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 1527, Mulligan et al. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2072; Colberre-Garapin et al. (1981) J. Mol. Biol. 150: 1 und Santerre et al. (1984) Gene 30: 147). Zusätzlich selektierbare Gene schließen trpB, was den Zellen erlaubt, Indol anstelle von Tryptophan zu verwenden, hisD, was den Zellen erlaubt, Histinol anstelle von Histidin zu verwenden und odc (Ornithindecarboxylase), was eine Resistenz gegen den Ornithindecarboxylaseinhibitor 2-(Difluormethyl)-DL-ornithin, DFMO, verleiht, ein. (Siehe z. B. Hartman et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 8047 und McConlogue L., In: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laborstory, Hrsg. (1987)).
  • Elemente, die für die erfindungsgemäßen Expressionsvektoren nötig sind, schließen Sequenzen zum Initiieren der Transkription, z. B. Promotoren und Enhancer, ein. Promotoren stellen nicht translatierte Sequenzen dar, die strangaufwärts vom Startcodon des Strukturgens liegen, die die Transkription der Nukleinsäure unter ihrer Kontrolle kontrollieren. Induzierbare Promotoren stellen Promotoren dar, die ihren Grad der Transkriptionsinitiation in Antwort auf eine Änderung in den Kulturbedingungen ändern, z. B. die Anwesenheit oder Abwesenheit eines Nährstoffs. Der Fachmann würde eine große Anzahl von Promotoren kennen, die in Wirtszellen erkannt werden würden, die für die vorliegende Erfindung geeignet sind. Diese Promotoren sind funktionsfähig mit der DNA, die das Kollagen kodiert, über das Entfernen des Promotors aus seinem nativen Gen und Platzieren der Kollagen kodierenden DNA 3' der Promotorsequenz verbunden.
  • Promotoren, die in der vorliegenden Verwendung geeignet sind, schließen den Lactosepromotor, den alkalische Phosphatasepromotor, den Tryptophanpromotor, Hybridpromotoren, wie den tac-Promotor, den Promotor für die 3-Phosphoglyceratkinase, andere Promotoren glykolytischer Enzyme (Hexokinase, Pyruvatdecarboxylase, Phosphofructosekinase, Glucose-6-Phosphatisomerase, usw.), den Promotor für die Alkoholdehydrogenase, den Metallothionein-Promotor, den Maltosepromotor, den Galactosepromotor, Promotoren für die Viren Polyoma, Geflügelpocken, Adenovirus, boviner Papillomavirus, Vogel-Sarkom-Virus, Cytomegalovirus, Retroviren, SV40 und Promotoren aus Zieleukaryonten, einschließ lich des Glucoamylasepromotors aus Aspergillus, des Aktinpromotors oder eines Immunglobinpromotors aus einem Säugetier und native Kollagenpromotoren, ein, sind aber nicht darauf beschränkt. (Siehe z. B. de Boer et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 21-25; Hitzeman et al. (1980) J. Biol. Chem. 255: 2073; Fiers et al. (1978) Nature 273: 113; Mulligan und Berg (1980) Science 209: 1422-1427; Pavlakis et al. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 7398-7402; Greenway et al. (1982) Gene 18: 355-360; Gray et al. (1982) Nature 295: 503-508; Reyes et al. (1982) Nature 297: 598-601; Canaai und Berg (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 5166-5170; Gorman et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 6777-6781 und Nunberg et al. (1984) Mol. and Cell. Biol. 11(4): 2306-2315).
  • Die Transkription der kodierenden Sequenz vom Promotor wird häufig durch Inserieren einer Enhancersequenz in den Vektor verstärkt. Enhancer stellen ciswirkende Elemente dar, mit üblicherweise ungefähr 10 bis 300 bp, die wirken können, um die Geschwindigkeit der Transkriptionsinitiation an einem Promotor zu verstärken. Viele Enhancer sind sowohl für Eukaryonten, als auch für Prokaryonten bekannt, und der Fachmann könnte einen geeigneten Enhancer für die Wirtszelle von Interesse auswählen. (Siehe z. B. Yaniv (1982) Nature 297: 17-18).
  • Zusätzlich kann eine Wirtszelllinie gewählt werden, die die Expression der inserierten Sequenzen moduliert, oder das Genprodukt in der spezifischen gewünschten Art modifiziert und verarbeitet. Solche Modifikationen (z. B. Glykosylierung) und Verarbeitung (z. B. Spaltung) der Proteinprodukte kann wichtig für die Funktion des Proteins sein. Verschiedene Wirtszellen weisen charakteristische und spezifische Mechanismen für die posttranslationale Verarbeitung und Modifikation der Proteine auf. Geeignete Zelllinien oder Wirtssysteme können gewählt werden, um die richtige Modifikation und Verarbeitung des zu exprimierenden fremden Proteins sicherzustellen. Für diesen Zweck können eukaryontische Wirtszellen verwendet werden, die die zelluläre Maschinerie für eine einwandfreie Verarbeitung des Primärtranskripts, eine Glykosylierung und Phosphorylierung des Genprodukts besitzen. Solche Säugetierwirtszellen schließen CHO, VERO, BHK, HeLa, COS, MDCK, 293, WI38, usw. ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Zusätzlich können Wirtszellen gentechnisch verändert werden, um verschiedene Enzyme zu exprimieren, um die einwandfreie Verarbeitung des kodierten Polypeptids sicherzustellen. Zum Beispiel kann das Gen für die Prolyl-4-Hydroxylase zusammen mit einem Polynukleotid exprimiert werden, das ein Kollagen oder Fragmente oder Varianten davon kodiert, um eine einwandfreie Hydroxylierung zu erreichen.
  • Für eine Langzeitherstellung mit hoher Ausbeute von rekombinanten Proteinen wird eine stabile Expression bevorzugt. Zum Beispiel können Zelllinien, die die erfindungsgemäßen Kollagene stabil exprimieren, gentechnisch hergestellt werden. Eher als Expressionsvektoren zu verwenden, die virale Replikationsursprünge enthalten, können Wirtszellen mit Kollagen kodierender DNA, die von geeigneten Expressionskontrollelementen kontrolliert wird (z. B. Promotor, Enhancer, Sequenzen, Transkriptionsterminatoren, Polyadenylierungsstellen, usw.) und einem selektierbaren Marker transformiert werden. Der Einführung der fremden DNA folgend, können die gentechnisch veränderten Zellen für 1–2 Tage in einem angereicherten Medium wachsen und anschließend in ein selektives Medium gebracht werden. Der selektierbare Marker in dem rekombinanten Plasmid verleiht eine Resistenz gegen die Selektion und erlaubt den Zellen, das Plasmid stabil in ihre Chromosomen zu integrieren und zu wachsen, um Kolonien zu bilden, die wiederum kloniert und in Zelllinien expandiert werden können. Daher können die erfindungsgemäßen Verfahren vorteilhafterweise verwendet werden, um Zelllinien gentechnisch herzustellen, die ein gewünschtes Tierkollagen oder Fragmente oder Varianten davon exprimieren.
  • Zum Beispiel kann die Expression der erfindungsgemäßen Polypeptide, die durch die Galactosepromotoren angetrieben wird, durch Züchten der Kultur auf einem nicht reprimierenden, nicht induzierenden Zucker, sodass eine sehr schnelle Induktion der Zugabe der Galactose folgt, durch Züchten der Kultur in Glucosemedium und anschließend Entfernen der Glucose durch Zentrifugation und Waschen der Zellen vor der Resuspension in einem Galactosemedium und durch Züchten der Zellen in einem Medium, das sowohl Glucose als auch Galactose enthält, so dass die Glucose vorzugsweise metabolisiert wird, bevor die Galactoseinduktion stattfinden kann, induziert werden.
  • Die Vektoren, die die erfindungsgemäßen Polypeptide exprimieren, und die Vektoren, die die Polynukleotide exprimieren, die irgendwelche gewünschten posttranslationalen Enzyme kodieren, können in Wirtszellen eingeführt werden, um die kodierten Polypeptide unter Verwendung von Techniken, die dem Fachmann bekannt sind, herzustellen. Zum Beispiel werden Wirtszellen mit den oben beschriebenen Expressionsvektoren transfiziert oder infiziert oder transformiert und in Nährmedien, die zum Selektieren der Transduktanten oder Transformanten, die den Kollagen kodierenden Vektor enthalten, geeignet sind, kultiviert. Eine Zelltransfektion kann durch eine Vielzahl von Verfahren, die dem Fachmann zur Verfügung stehen, durchgeführt werden, wie zum Beispiel durch Calciumphosphatpräzipitations-, Elektroporations-, und Lipofectionstechniken. (Siehe z. B. Maniatis et al., supra, Ohta T. (1996) Nippon Rinsho 54(3): 757-764; Trotter und Wood (1996) Mol Biotechnol 6(3): 329-334; Mann und King (1989) J Gen Virol 70: 3501-3505 und Hartig et al. (1991) Biotechniques 11(3): 310).
  • In einer Ausführungsform wird ein Verfahren betrachtet, in welchem mehr als einer der Expressionsvektoren, die die erfindungsgemäßen Polynukleotide kodieren, in Zellen inseriert wird, sodass z. B. trimere Kollagene synthetisiert werden können.
  • In einem anderen erfindungsgemäßen Verfahren wird die Herstellung von homotrimerem Kollagen betrachtet.
  • Wirtszellen, die die kodierende Sequenz enthalten und das biologisch aktive Genprodukt exprimieren, können durch irgendeine Anzahl von im Stand der Technik bekannten Techniken identifiziert werden. Solche Techniken schließen zum Beispiel das Nachweisen der Bildung von Nukleinsäure-Hybridisationskomplexen, das Nachweisen der Anwesenheit oder Abwesenheit von Markergenfunktionen, durch Untersuchen der Transkriptionsmenge, wie durch die Expression von mRNA-Transkripten in der Wirtszelle gemessen, und Nachweisen des Genpro dukts, wie durch einen Immunassay oder durch die biologische Aktivität gemessen, ein.
  • In dem ersten Ansatz kann die Anwesenheit des erfindungsgemäßen Polynukleotids zum Beispiel durch den Nachweis von DNA-DNA oder DNA-RNA Hybridisationskomplexen nachgewiesen werden oder durch die Amplifikation unter Verwendung von Sonden, die Nukleotidsequenzen umfassen, die homolog zu der Tierkollagen kodierenden Sequenz oder Abschnitten oder Derivaten davon sind. Amplifikationsbasierte Assays umfassen die Verwendung von Oligonukleotiden oder Oligomeren, die auf Sequenzen basieren, die homolog zu der kodierenden Sequenz von Interesse sind, um Transformanten, die die kodierenden Polynukleotide enthalten, nachzuweisen.
  • In dem zweiten Ansatz wird der/das rekombinante Expressionsvektor/Wirtssystem basierend auf der Anwesenheit oder Abwesenheit von bestimmten Markergenfunktionen (z. B. Thymidinkinase-Aktivität, Resistenz gegenüber Antibiotika, Resistenz gegenüber Methothrexat, Transformationsphänotyp, Einschlusskörperbildung in Baculovirus, usw.) identifiziert und ausgewählt. Zum Beispiel, wenn die kodierende Sequenz in eine Markergensequenz des Vektors inseriert wird, können die rekombinanten Zellen, die die kodierende Sequenz enthalten, durch die Abwesenheit der Markergenfunktion identifiziert werden. Alternativ kann ein Markergen in eine Tandemanordnung mit der kodierenden Sequenz gebracht werden, unter der Kontrolle desselben oder eines anderen Promotors, der verwendet wird, um die Expression der kodierenden Sequenz zu kontrollieren. Die Expression des Markers in Antwort auf eine Induktion oder Selektion weist auf eine Expression der kodierenden Sequenz hin.
  • In dem dritten Ansatz kann die transkriptionelle Aktivität der kodierenden Region durch Hybridisierungsassays untersucht werden. Zum Beispiel kann RNA isoliert werden und durch einen Northern Blot analysiert werden, unter Verwendung einer Sonde, die homolog zu der kodierenden Sequenz oder bestimmten Abschnitten davon ist. Alternativ können Gesamt-Nukleinsäuren der Wirtszelle extrahiert werden und auf eine Hybridisierung mit solchen Sonden untersucht werden.
  • In dem vierten Ansatz kann die Expression eines Proteinprodukts immunologisch untersucht werden, zum Beispiel durch Western-Blots, Immunassays, wie eine Radioimmunpräzipitation, Enzym verbundene Immunassays und desgleichen.
  • In einer Ausführungsform werden die erfindungsgemäßen Tierkollagene in das Kulturmedium sezerniert und können bis zur Homogenität durch verschiedene Verfahren, die im Stand der Technik bekannt sind, gereinigt werden, zum Beispiel durch eine Chromatographie. In einer Ausführungsform werden die erfindungsgemäßen rekombinanten Tierkollagene durch eine Größenausschluss-Chromatographie gereinigt. Jedoch können auch andere Reinigungstechniken, die im Stand der Technik bekannt sind, verwendet werden, einschließlich Ionenaustausch-Chromatographie und Umkehrphasen-Chromatographie. (Siehe z. B. Maniatis et al., supra, Ausubel et al., supra und Scopes (1994) Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag New York, Inc., NY).
  • Die erfindungsgemäßen Verfahren können, obwohl sie nicht in der Anwendung darauf beschränkt sind, in den unten aufgeführten Expressionssystemen verwendet werden.
  • Prokaryontisch
  • In prokaryontischen Systemen, wie bakteriellen Systemen, kann eine Anzahl von Expressionsvektoren vorteilhafterweise abhängig von der Verwendung, die für das exprimierte Polypeptid beabsichtigt ist, ausgewählt werden. Wenn zum Beispiel große Mengen der erfindungsgemäßen Tierkollagene und -gelatinen hergestellt werden sollen, wie für die Erzeugung von Antikörpern, können Vektoren, die die Expression von großen Mengen der Fusionsproteinprodukte, die einfach gereinigt werden, wünschenswert sein. Solche Vektoren schließen den E. coli Expressionsvektor pUR278 (Ruther et al. (1983) EMBO J. 2: 1791), in welchem die kodierende Sequenz in den Vektor im Leserahmen mit der lac Z-kodierenden Region ligiert werden kann, sodass ein hybrides AS-lac Z-Protein hergestellt wird, pIN-Vektoren (Inouye et al. (1985) Nucleic Acids Res. 13: 3101-3109 und Van Heeke et al. (1989) J. Biol. Chem. 264: 5503-5509) und desgleichen ein, sind aber nicht darauf beschränkt. pGEX-Vektoren können auch verwendet werden, um fremde Polypeptide als Fusionsproteine mit Glutathion-S-Transferase (GST) zu exprimieren. Im Allgemeinen sind solche Fusionsproteine löslich und können einfach aus lysierten Zellen durch eine Absorption an Glutathion-Agarose-Kügelchen, gefolgt von einer Flution in der Anwesenheit von freiem Glutathion gereinigt werden. Die pGEX-Vektoren werden entworfen, um Thrombin- oder Faktor Xa-Proteasespaltstellen einzuschließen, sodass das klonierte Polypeptid von Interesse aus dem GST-Rest freigesetzt werden kann.
  • Hefe
  • In einer Ausführungsform werden die erfindungsgemäßen Polypeptide in einem Hefe-Expressionssystem hergestellt. In Hefe kann eine Anzahl von Vektoren, die konstitutive oder induzierbare Promotoren enthalten, die im Stand der Technik bekannt sind, verwendet werden. (Siehe z. B. Ausubel et al., supra, Band 2, Kapitel 13; Grant et al. (1987) Expression and Secretion Vectors for Yeast, in Methods in Enzymology, Hrsg. Wu & Grossman, Acad. Press, N.Y. 153: 516-544; Glover (1986) DNA Cloning, Band II, IRL Press, Wash., D.C., Kapitel 3; Bitter (1987) Heterologous Gene Expression in Yeast, in Methods in Enzymology, Hrsg. Berger & Kimmel, Acad. Press, N.Y. 152: 673-684 und The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, Hrsg. Strathern et al., Cold Spring Harbor Press, Band I und II (1982)).
  • Die erfindungsgemäßen Polypeptide können unter Verwendung von Wirtszellen, zum Beispiel aus der Hefe Saccharomyces cerevisiae, exprimiert werden. Diese besondere Hefe kann mit irgendeinem einer großen Anzahl von Expressionsvektoren verwendet werden. Gängig eingesetzte Expressionsvektoren sind Shuttle-Vektoren, die den 2 μ-Replikationsursprung für die Vermehrung in Hefe und den Col E1-Ursprung für E. coli für eine effiziente Transkription des fremden Gens enthalten. Ein typisches Beispiel solcher Vektoren, die auf 2 μ-Plasmiden basieren, stellt pWYG4 dar, welcher die 2 μ-ORI-STB Elemente, den GAL1-10-Promotor und den 2 μ-D-Genterminator aufweist. In diesem Vektor wird eine NcoI Klonierungsstelle verwendet, um das Gen für das zu exprimierende Polypeptid zu inserieren, und um das ATG-Startcodon bereitzustellen. Ein anderer Expressionsvektor ist pWYG7L, der intakte 2α ORI, STB, REP1 und REP2 und den GAL1-10-Promotor aufweist und den FLP-Terminator verwendet. In diesem Vektor wird das kodierende Polynukleotid in den Polylinker mit seinen 5'-Enden an einer BamHI- oder NcoI-Stelle inseriert. Der Vektor, der das inserierte Polynukleotid enthält, wird in S. cerevisiae transformiert, entweder nach dem Entfernen der Zellwand, und Spheroplasten herzustellen, die die DNA bei einer Behandlung mit Calcium und Polyethylenglykol aufnehmen, oder durch eine Behandlung der intakten Zellen mit Lithiumionen.
  • Alternativ kann die DNA durch eine Elektroporation eingeführt werden. Die Transformanten können ausgewählt werden, zum Beispiel unter Verwendung von Wirtshefezellen, die auxotrophisch für Leucin, Tryptophan, Uracil oder Histidin sind, zusammen mit selektierbaren Markergenen, wie LEU2, TRP1, URA3, HIS3 oder LEU2-D.
  • In einer Ausführungsform der Erfindung werden die erfindungsgemäßen Polynukleotide in Wirtszellen aus der Hefe Pichia eingeführt. Arten von nicht-Saccharomyces Hefe, wie Pichia pastoris, scheinen spezielle Vorteile beim Herstellen hoher Ausbeuten von rekombinantem Protein in großmaßstäbigen Verfahren aufzuweisen. Zusätzlich ist ein Pichia-Expressionskit von der Invitrogen Corporation (San Diego, CA) verfügbar.
  • Es gibt eine Anzahl von Methanol empfindlichen Genen in methylotrophen Hefen, wie Pichia pastoris, wobei die Expression von jedem durch Methanol empfindliche regulatorische Regionen kontrolliert wird, die auch als Promotoren bezeichnet werden. Irgendwelche von solchen Methanol empfindlichen Promotoren sind für die Verwendung in der Ausführung der vorliegenden Erfindung geeignet. Beispiele für spezifische regulatorische Regionen schließen den AOX1-Promotor, den AOX2-Promotor, die Dihydroxyacetonsynthase (DAS), den P40-Promotor und den Promotor für das Katalasegen aus P. pastoris, usw. ein.
  • In anderen Ausführungsformen umfasst die vorliegende Erfindung die Verwendung der methylotrophen Hefe Hansenula polymorpha. Wachstum auf Methanol führt zur Induktion von Schlüsselenzymen des Methanolmetabolismus, wie MOX (Methanoloxidase), DAS (Dihydroxyacetonsynthase) und FMHD (Formatdehydrogenase). Diese Enzyme können bis zu 30–40% des gesamten Zellproteins ausmachen. Die Gene, die die MOX-, DAS- und FMDH-Herstellung kodieren, werden durch starke Promotoren kontrolliert, die durch das Wachstum auf Methanol induziert werden und durch Wachstum auf Glucose reprimiert werden. Irgendeiner oder alle drei von diesen Promotoren können verwendet werden, um eine Expression großer Mengen der heterologen Gene in H. polymorpha zu erhalten. Daher wird in einem Aspekt der Erfindung ein Polynukleotid, das ein Tierkollagen oder Fragmente oder Varianten davon kodiert, in einen Expressionsvektor unter der Kontrolle eines induzierbaren H. polymorpha-Promotors kloniert. Wenn eine Sekretion des Produkts gewünscht wird, wird ein Polynukleotid, das eine Signalsequenz für die Sekretion in Hefe kodiert, im Leserahmen mit dem Polynukleotid fusioniert. In einer anderen Ausführungsform enthält der Expressionsvektor vorzugsweise ein auxotrophes Markergen, wie URA3 oder LEU2, das verwendet werden kann, um den Mangel eines auxotrophen Wirtes zu ergänzen.
  • Der Expressionsvektor wird anschließend verwendet, um H. polymorpha-Wirtszellen unter Verwendung von Techniken, die dem Fachmann bekannt sind, zu transformieren. Eine nützliche Eigenschaft der H. polymorpha-Transformation stellt die spontane Integration von bis zu 100 Kopien des Expressionsvektors in das Genom dar. In den meisten Fällen bildet das integrierte Polynukleotid Multimere, die eine Kopf-Schwanz(engl.: head-to-tail)-Anordnung aufweisen. Für das integrierte fremde Polynukleotid wurde gezeigt, dass es in mehreren rekombinanten Linien mitotisch stabil ist, selbst unter nicht selektiven Bedingungen. Dieses Phänomen der Integration vieler Kopien trägt weiterhin zu dem hohen Produktivitätspotenzial des Systems bei.
  • Pilze
  • Filamentöse Pilze können auch verwendet werden, um die erfindungsgemäßen Polypeptide herzustellen. Vektoren zum Exprimieren und/oder Sezernieren von rekombinanten Proteinen in filamentösen Pilzen sind gut bekannt, und der Fachmann könnte diese Vektoren verwenden, um die erfindungsgemäßen rekombinanten Tierkollagene zu exprimieren.
  • Pflanze
  • In einem Aspekt umfasst die vorliegende Erfindung die Herstellung von Tierkollagenen und -gelatinen in Pflanzen und Pflanzenzellen. In den Fällen, in denen Pflanzen-Expressionsvektoren verwendet werden, kann die Expression von Sequenzen, die die erfindungsgemäßen Kollagene kodieren, durch irgendeinen aus einer Anzahl von Promotoren angetrieben werden. Zum Beispiel können virale Promotoren, wie die 35S RNA- und 19S RNA-Promotoren des CaMV (Brisson et al. (1984) Nature 310: 511-514) oder der Hüllprotein-Promotor des TMV (Takamatsu et al. (1987) EMBO J. 6: 307-311) verwendet werden, alternativ können Pflanzenpromotoren, wie die kleine Untereinheit der RUBISCO (Coruzzi et al. (1984) EMBO J. 3: 1671-1680; Broglie et al. (1984) Science 224: 838-843) oder Hitzeschock-Promotoren, z. B. Sojabohnen-hsp17.5-E oder hsp17.3-B (Gurley et al. (1986) Mol. Cell. Biol. 6: 559-565) verwendet werden. Diese Konstrukte können in Pflanzenzellen durch eine Vielzahl von Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, wie durch Verwenden von Ti-Plasmiden, Ri-Plasmiden, Pflanzen-Virusvektoren, direkter DNA-Transformation, Mikroinjektion, Elektroporation, usw. eingeführt werden. Für Übersichten über solche Techniken siehe zum Beispiel Weissbach & Weissbach, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, NY, Sektion VIII, S. 421-463 (1988); Grierson & Corey, Plant Molecular Biology, 2. Aufl., Blackie, London, Kapitel 7–9 (1988); Transgenic Plants: A Production Sys tem for Industrial and Pharmaceutical Proteins, Owen und Pen, Hrsg., John Wiley & Sons, 1996; Transgenic Plants, Galun und Breiman Hrsg., Imperial College Press, 1997 und Applied Plant Biotechnology, Chopra, Malik und Bhat, Hrsg., Science Publishers, Inc., 1999.
  • Pflanzenzellen stellen natürlicherweise nicht ausreichende Mengen von posttranslationalen Enzymen her, um effizient stabiles Kollagen herzustellen. Daher stellt die vorliegende Erfindung bereit, dass, wo eine Hydroxylierung gewünscht ist, Pflanzenzellen, die verwendet werden, um die erfindungsgemäßen Tierkollagene zu exprimieren, mit den nötigen posttranslationalen Enzymen ergänzt werden, um ausreichend stabiles Kollagen herzustellen. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das posttranslationale Enzym Prolyl-4-Hydroxylase.
  • Verfahren zum Herstellen der erfindungsgemäßen Tierkollagene oder -gelatinen in Pflanzensystemen können durch Bereitstellen einer Biomasse aus Pflanzen oder Pflanzenzellen erreicht werden, worin die Pflanzen oder Pflanzenzellen mindestens eine kodierende Sequenz umfassen, die funktionsfähig mit einem Promotor verbunden ist, um die Expression des Polypeptids zu bewirken, und das Polypeptid wird anschließend aus der Biomasse extrahiert. Alternativ kann das Polypeptid ein nicht-extrahiertes sein, d. h. es wird in das Endosperm usw. exprimiert.
  • Pflanzen-Expressionsvektoren und Reportergene sind im Allgemeinen im Stand der Technik bekannt. (Siehe z. B. Gruber et al. (1993) in Methods of Plant Molecular Biology and Biotechnology, CRC Press). Typischerweise umfasst der Expressionsvektor ein Nukleinsäurekonstrukt, das zum Beispiel rekombinant oder synthetisch erzeugt wurde, und umfasst einen Promotor, der in einer Pflanzenzelle funktionsfähig ist, worin ein solcher Promotor funktionsfähig mit einer Nukleinsäuresequenz verbunden ist, die ein Tierkollagen oder Fragmente oder Varianten davon kodiert, oder ein posttranslationales Enzym, das wichtig für die Biosynthese des Kollagens ist.
  • Promotoren treiben die Menge der Proteinexpression in Pflanzen an. Um eine gewünschte Menge der Proteinexpression in Pflanzen herzustellen, kann die Expression unter der Steuerung eines Pflanzenpromotors stattfinden. Promotoren, die für eine erfindungsgemäße Verwendung geeignet sind, sind allgemein im Stand der Technik verfügbar. (Siehe z. B. PCT Veröffentlichung Nr. WO 91/19806 ). Beispiele für Promotoren, die erfindungsgemäß verwendet werden können, schließen nicht konstitutive Promotoren oder konstitutive Promotoren ein. Diese Promotoren schließen den Promotor für die kleine Untereinheit der Ribulose-1,5-bisphosphatcarboxylase; Promotoren aus Tumor induzierenden Plasmiden von Agrobacterium tumefaciens, wie die RUBISCO-Nopalinsynthase(NOS)- und Octopinsynthase-Promotoren, bakterielle T-DNA-Promotoren, wie mas- und ocs-Promotoren und virale Promotoren, wie die Blumenkohl-Mosaikvirus (CaMV) 19S- und 35S-Promotoren oder den Braunwurz-Mosaikvirus 35S-Promotor ein, sind aber nicht darauf beschränkt.
  • Die erfindungsgemäßen Polynukleotidsequenzen können unter der transkriptionellen Kontrolle eines konstitutiven Promotors stehen, welcher die Expression des Kollagens oder des posttranslationalen Enzyms in den meisten Geweben einer Pflanze steuert. In einer Ausführungsform steht die Polynukleotidsequenz unter der Kontrolle des Blumenkohl-Mosaikvirus (CaMV) 35S-Promotors. Die doppelsträngige Caulimovirus-Familie hat die einzige wichtigste Promotorexpression für eine transgene Expression in Pflanzen bereitgestellt, insbesondere den 35S-Promotor. (Siehe z. B. Kay et al. (1987) Science 236: 1299). Zusätzliche Promotoren aus dieser Familie, wie der Braunwurz-Mosaikvirus-Promotor, usw., wurden im Stand der Technik beschrieben und können auch erfindungsgemäß verwendet werden. (Siehe z. B. Sanger et al. (1990) Plant Mol. Biol. 14: 433-443; Medberry et al. (1992) Plant Cell 4: 195-192 und Yin und Beachy (1995) Plant J. 7: 969-980).
  • Die Promotoren, die in den erfindungsgemäßen Polynukleotidkonstrukten verwendet werden, können modifiziert werden, wenn es gewünscht ist, um ihre Kontrolleigenschaften zu beeinflussen. Zum Beispiel kann der CaMV-Promotor an den Abschnitt des RUBISCO-Gens ligiert werden, der die Expression der RUBISCO in Abwesenheit von Licht reprimiert, um einen Promotor zu erzeugen, der in Blättern, aber nicht in Wurzeln aktiv ist. Der sich ergebende chimäre Promotor kann wie hier beschrieben wird, verwendet werden.
  • Konstitutive Pflanzenpromotoren, die allgemeine Expressionseigenschaften, die im Stand der Technik bekannt sind, aufweisen, können mit den erfindungsgemäßen Expressionsvektoren verwendet werden. Diese Promotoren werden häufig in den meisten Pflanzengeweben exprimiert und schließen zum Beispiel den Aktinpromotor und den Ubiquitinpromotor ein. (Siehe z. B. McElroy et al. (1990) Plant Cell 2: 163-171 und Christensen et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18: 675-689).
  • Alternativ kann das erfindungsgemäße Polypeptid in einem spezifischen Gewebe, Zelltyp oder unter genaueren Umgebungsbedingungen oder unter Entwicklungskontrolle exprimiert werden. Promotoren, die die Expression in diesen Fällen steuern, sind als induzierbare Promotoren bekannt. In dem Fall, in dem ein gewebespezifischer Promotor verwendet wird, ist die Proteinexpression besonders hoch in dem Gewebe, aus welchem die Extraktion des Proteins erwünscht ist. Abhängig von dem gewünschten Gewebe kann die Expression auf das Endosperm, die Aleuronschicht, den Embryo (oder seine Teile, wie Scutellum und Keimblätter), das Perikarp, den Stamm, die Blätter, die Knollen, die Wurzeln, usw. gelenkt werden. Beispiele bekannter gewebespezifischer Promotoren schließen den knollenspezifischen Klasse I Patatin-Promotor, die Promotoren, die mit Kartoffelknollen-ADPGPP-Genen verbunden sind, den Sojabohnen-Promotor von β-Conglycinin (7S-Protein), der die samenspezifische Transkription antreibt und auf samenspezifische Promotoren aus den Zein-Genen des Maisendosperms ein. (Siehe z. B. Bevan et al. (1986) Nucleic Acids Res. 14: 4625-38; Muller et al. (1990) Mol. Gen. Genet. 224: 136-46; Bray (1987) Planta 172: 364-370 und Pedersen et al. (1982) Cell 29: 1015-26).
  • In einer bevorzugten Ausführungsform werden die erfindungsgemäßen Polypeptide in Samen durch samenbasierte Herstellungstechniken hergestellt, unter Verwendung von zum Beispiel Raps, Mais, Sojabohnen, Reis und Gerstensaat. In einem solchen Verfahren wird das Produkt zum Beispiel während der Samenkeimung gewonnen. (Siehe z. B. PCT Veröffentlichungen Nummern WO 9940210 ; WO 9916890 ; WO 9907206 ; US Patent Nr. 5,866,121 ; US Patent Nr. 5,792,933 und alle darin zitierten Referenzen).
  • Promotoren, die verwendet werden können, um die Expression der Polypeptide zu steuern, können heterolog oder nicht heterolog sein. Diese Promotoren können auch verwendet werden, um die Expression von Antisense-Nukleinsäuren anzutreiben, um die Konzentration und Zusammensetzung der erfindungsgemäßen Tierkollagene in einem gewünschten Gewebe zu reduzieren, zu erhöhen oder zu verändern.
  • Andere Modifikationen, die vorgenommen werden können, um die Transkription der erfindungsgemäßen Polypeptide in einer Pflanze oder in Pflanzenzellen zu erhöhen und/oder zu maximieren, sind Standard und dem Fachmann bekannt. Zum Beispiel kann ein Vektor, der eine Polynukleotidsequenz umfasst, die ein/e rekombinantes Tierkollagen oder -gelatine oder ein Polypeptid, von welchem die rekombinante Tiergelatine abgeleitet werden kann, oder ein Fragment oder eine Variante davon, die funktionsfähig mit einem Promotor verbunden ist, weiterhin mindestens einen Faktor umfassen, der die Transkriptionsgeschwindigkeit des Kollagens oder von verwandten posttranslationalen Enzymen modifiziert, einschließlich, aber nicht beschränkt auf eine Peptidexport-Signalsequenz, Codon-Usage, Introns, Polyadenylierung und Transkriptionsterminationsstellen. Verfahren zum Modifizieren von Konstrukten, um Expressionsmengen in Pflanzen zu erhöhen, sind im Stand der Technik allgemein bekannt. (Siehe z. B. Rogers et al. (1985) J. Biol. Chem. 260: 3731 und Cornejo et al. (1993) Plant Mol Biol 23: 567-58). Beim gentechnischen Herstellen eines Pflanzensystems, das die Geschwindigkeit der Transkription der erfindungsgemäßen Kollagene und verwandter posttranslationaler Enzyme beeinflusst, können verschiedene Faktoren, die im Stand der Technik bekannt sind, einschließlich regulatorischer Sequenzen, wie positiv oder negativ wirkender Sequenzen, Enhancer und Silencer, sowie die Chromatinstruktur die Geschwindigkeit der Transkription in Pflanzen beeinflussen.
  • Die vorliegende Erfindung stellt bereit, dass mindestens einer dieser Faktoren beim Exprimieren der hier beschriebenen rekombinanten Tierkollagene und -gelatinen verwendet werden kann.
  • Die Vektoren, die die erfindungsgemäßen Polynukleotide umfassen, werden typischerweise ein Markergen umfassen, das Pflanzenzellen einen selektierbaren Phänotyp verleiht. Üblicherweise wird das selektierbare Markergen eine Antibiotikumsresistenz mit geeigneten Genen kodieren, einschließlich von mindestens einem Satz der Gene, die eine Resistenz gegen das Antibiotikum Spectinomycin kodieren, des Streptomycinphosphotransferase-(SPT)-Gens, das für eine Streptomycinresistenz kodiert, des Neomycinphosphotransferase-(NPTH)-Gens, das eine Kanamycin- oder Geneticinresistenz kodiert, der Hygromycin-Resistenz, der Gene, die für eine Resistenz gegen Herbizide kodieren, die wirken, um die Wirkung der Acetolactatsynthase (ALS) zu inhibieren, insbesondere die Herbizide des Sulfonylharnstoff-Typs (z. B. das Acetolactatsynthase-(ALS)-Gen, das Mutationen enthält, die zu einer solchen Resistenz führen, insbesondere die S4- und/oder Hra-Mutationen), der Gene, die für eine Resistenz gegen Herbizide kodieren, die wirken, um die Wirkung der Glutaminsynthase zu inhibieren, wie Phosphinotricin oder Basta (z. B. das bar-Gen) oder anderer ähnlicher, im Stand der Technik bekannter Gene. Das bar-Gen kodiert eine Resistenz gegen das Herbizid Basta, das nptII-Gen kodiert eine Resistenz gegen die Antibiotika Kanamycin und Geneticin und das ALS-Gen kodiert eine Resistenz gegen das Herbizid Chlorsulfuron.
  • Typische Vektoren, die für eine Expression von fremden Genen in Pflanzen geeignet sind, sind im Stand der Technik gut bekannt, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Vektoren, die von dem Tumor induzierenden (Ti) Plasmid von Agrobacterium tumefaciens abgeleitet sind. Diese Vektoren stellen Pflanzen-Integrationsvektoren dar, die bei einer Transformation einen Abschnitt der DNA in das Genom der Wirtspflanze integrieren. (Siehe z. B. Rogers et al. (1987) Meth. In Enzymol. 153: 253-277; Schardl et al. (1987) Gene 61: 1-11 und Berger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86: 8402-8406).
  • Vektoren, die Sequenzen umfassen, die die erfindungsgemäßen Polypeptide kodieren, und Vektoren, die posttranslationale Enzyme oder Untereinheiten davon umfassen, können zusammen in die gewünschte Pflanze eingeführt werden. Verfahren zum Transformieren von Pflanzenzellen stehen im Stand der Technik zur Verfügung, zum Beispiel direkter Gentransfer, in vitro Protoplastentransformation, Pflanzenvirus vermittelte Transformation, Liposomen vermittelte Transformation, Mikroinjektion, Elektroporation, Agrobacterium vermittelte Transformation und Teilchenbeschuss. (Siehe z. B. Paszkowski et al. (1984) EMBO J. 3: 2717-2722; U.S. Patent Nr. 4,684,611 ; europäische Anmeldung Nr. 0 67 553 ; U.S. Patent Nr. 4,407,956 ; U.S. Patent Nr. 4,536,475 ; Crossway et al. (1986) Biotechniques 4: 320-334, Riggs et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 5602-5606; Hinchee et al. (1988) Biotechnology 6: 915-921 und U.S. Patent Nr. 4,945,050 ). Standardverfahren für die Transformation von z. B. Reis, Weizen, Mais, Hirse und Gerste sind im Stand der Technik beschrieben. (Siehe z. B. Christou et al. (1992) Trends in Biotechnology 10: 239 und Lee et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 6389). Weizen kann durch Techniken transformiert werden, die jenen ähnlich sind, die für das Transformieren von Mais oder Reis eingesetzt werden. Darüber hinaus beschreiben Casas et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 11212 ein Verfahren zum Transformieren von Hirse, während Wan et al. (1994) Plant. Physi ol. 104:37 ein Verfahren zum Transformieren von Gerste lehren. Geeignete Verfahren für eine Mais-Transformation werden von Fromm et al. (1990) Bio/Technology 8: 833 und von Gordon-Kamm et al., supra bereitgestellt.
  • Zusätzliche Verfahren, die verwendet werden können, um Pflanzen zu erzeugen, die erfindungsgemäße Tierkollagene herstellen, sind im Stand der Technik gut etabliert. (Siehe z. B. U.S. Patent Nr. 5,959,091 , U.S. Patent Nr. 5,859,347 ; U.S. Patent Nr. 5,763,241 ; U.S. Patent Nr. 5,659,122 ; U.S. Patent Nr. 5,593,874 ; U.S. Patent Nr. 5,495,071 ; U.S. Patent Nr. 5,424,412 ; U.S. Patent Nr. 5,362,865 , U.S. Patent Nr. 5,229,112 ; U.S. Patent Nr. 5,981,841 ; U.S. Patent Nr. 5,959,179 ; U.S. Patent Nr. 5,932,439 ; U.S. Patent Nr. 5,869,720 ; U.S. Patent Nr. 5,804,425 , U.S. Patent Nr. 5,763,245 ; U.S. Patent Nr. 5,716,837 ; U.S. Patent Nr. 5,689,052 ; U.S. Patent Nr. 5,633,435 ; U.S. Patent Nr. 5,631,152 , U.S. Patent Nr. 5,627,061 ; U.S. Patent Nr. 5,602,321 ; U.S. Patent Nr. 5,589,612 , U.S. Patent Nr. 5,510,253 ; U.S. Patent Nr. 5,503,999 ; U.S. Patent Nr. 5,378,619 ; U.S. Patent Nr. 5,349,124 ; U.S. Patent Nr. 5,304,730 , U.S. Patent Nr. 5,185,253 ; U.S. Patent Nr. 4,970,168 ; europäische Veröffentlichung Nr. EPA 00709462 ; europäische Veröffentlichung Nr. EPA 00578627 ; europäische Veröffentlichung Nr. EPA 00531273 ; europäische Veröffentlichung Nr. EPA 00426641 ; PCT Veröffentlichung Nr. WO 99/31248 ; PCT Veröffentlichung Nr. WO 98/58069 ; PCT Veröffentlichung Nr. WO 98/45457 ; PCT Veröffentlichung Nr. WO 98/31812 ; PCT Veröffentlichung Nr. WO 98/08962 ; PCT Veröffentlichung Nr. WO 97/48814 ; PCT Veröffentlichung Nr. WO 97/30582 und PCT Veröffentlichung Nr. WO 97/17459 ).
  • Insekt
  • Ein anderes alternatives Expressionssystem, das gemäß den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wird, stellt ein Insektensystem dar. Baculoviren sind sehr effiziente Expressionsvektoren für die Herstellung in großem Maßstab von verschiedenen rekombinanten Proteinen in Insektenzellen. Die Verfahren, wie sie zum Beispiel in Luckow et al. (1989) Virology 170: 31-39 und Gruenwald, S. und Heitz, J. (1993) Baculovirus Expression Vector System: Procedures & Methods Manual, Pharmingen, San Diego, CA beschrieben werden, können eingesetzt werden, um Expressionsvektoren zu konstruieren, die eine Kollagen kodierende Sequenz für die erfindungsgemäßen Kollagene und die geeigneten transkriptionellen/translationellen Kontrollsignale enthalten. Zum Beispiel kann die rekombinante Herstellung von Proteinen in Insektenzellen durch eine Infektion von Baculovirus-Vektoren, die das Polypeptid kodieren, erreicht werden. In einem Aspekt der vorliegenden Erfindung kann die Herstellung von rekombinanten Polypeptiden mit stabilen Dreifachhelices die Koinfektion von Insektenzellen mit drei Baculoviren umfassen, wobei eines das zu exprimierende Tierkollagen kodiert und jeweils eines die α-Untereinheit und die β-Untereinheit der Prolyl-4-Hydroxylase kodiert. Dieses Insektenzellsystem erlaubt die Herstellung von rekombinanten Proteinen in großen Mengen. In einem solchen System wird das Autographe californica nukleäre Polyhedrosisvirus (AcNPV) als Vektor verwendet, um fremde Gene zu exprimie ren. Das Virus wächst in Spodoptera frugiperda-Zellen. Die kodierende Sequenz für die erfindungsgemäßen Polypeptide können in nicht essenzielle Regionen (zum Beispiel das Polyhedron-Gen) des Virus kloniert werden und unter die Kontrolle eines AcNPV-Promotors gebracht werden (zum Beispiel der Polyhedron-Promotor). Eine erfolgreiche Insertion einer kodierenden Sequenz wird zu einer Inaktivierung des Polyhedron-Gens und zur Herstellung von nicht eingeschlossenem rekombinantem Virus (d. h. einem Virus, dem die Proteinhülle fehlt, die das Polyhedron-Gen kodiert) führt. Diese rekombinanten Viren werden anschließend verwendet, um Spodoptera frugiperda-Zellen zu infizieren, in welchen das inserierte Gen exprimiert wird. (Siehe z. B. Smith et al. (1983) J. Virol. 46: 584 und U.S. Patent Nr. 4,215,051 ). Weitere Beispiele für dieses Expressionssystem können zum Beispiel in Ausubel et al., supra gefunden werden.
  • Tier
  • In Tier-Wirtszellen kann eine Anzahl von Expressionssystemen verwendet werden. In den Fällen, in denen ein Adenovirus als ein Expressionsvektor verwendet wird, können die erfindungsgemäßen Polynukleotidsequenzen an einen Adenovirus-Transkriptions-/Translations-Kontrollkomplex ligiert werden, z. B. den späten Promotor und die dreiteilige Leader-Sequenz. Dieses chimäre Gen kann anschließend in das Adenovirus-Genom durch eine in vitro oder in vivo Rekombination inseriert werden. Eine Insertion in eine nicht essenzielle Region des viralen Genoss (z. B. die Region E1 oder E3) wird zu einem rekombinanten Virus führen, das lebensfähig und in der Lage ist, die kodierten Polypeptide in infizierten Wirten zu exprimieren. (Siehe z. B. Logan & Shenk, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3655-3659 (1984)). Alternativ kann der Vaccinia-7.5K-Promotor verwendet werden. (Siehe z. B. Mackett et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 7415-7419; Mackett et al. (1982) J. Virol. 49: 857-864 und Panicali et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 4927-4931).
  • Ein bevorzugtes Expressionssystem in Säugetier-Wirtszellen stellt das Semliki-Forest-Virus dar. Eine Infektion von Säugetier-Wirtszellen, zum Beispiel Baby hamster-Nieren(BHK für engl.: baby hamster kidney)-Zellen und chinesische Hamster Ovar(CHO)-Zellen kann sehr hohe rekombinante Expressionsmengen ergeben. Das Semliki-Forest-Virus ist ein bevorzugtes Expressionssystem, da das Virus einen breiten Wirtsbereich aufweist, sodass eine Infektion von Säugetier-Zelllinien möglich sein wird. Spezifischer wird erwartet, dass die Verwendung des Semliki-Forest-Virus in einem weiten Bereich von Wirten verwendet werden kann, da das System nicht auf einer chromosomalen Integration basiert und daher einen schnellen Weg darstellen wird, um Modifikationen der rekombinanten Tierkollagene in Studien zu erreichen, die sich auf das Identifizieren von Struktur-Funktions-Beziehungen und das Überprüfen der Wirkungen verschiedener Hybridmoleküle richten. Verfahren zum Konstruieren von Semliki-Forest-Virus-Vektoren zur Expression von exogenen Proteinen in Säugetier-Wirtszellen werden zum Beispiel in Olkkonen et al. (1994) Methods Cell Biol 43: 43-53 beschrieben.
  • Nicht-menschliche transgene Tiere können auch verwendet werden, um die erfindungsgemäßen Polypeptide zu exprimieren. Solche Systeme können durch funktionsfähiges Verbinden des erfindungsgemäßen Polynukleotids mit einem Promotor, zusammen mit anderen benötigten oder optionalen regulatorischen Sequenzen konstruiert werden, die in der Lage sind, eine Expression in Milchdrüsen zu bewirken. Ebenso können die benötigten oder optionalen posttranslationalen Enzyme gleichzeitig in den Zielzellen unter Einsetzung geeigneter Expressionssysteme hergestellt werden. Verfahren zum Verwenden von nicht-menschlichen transgenen Tieren, um Proteine rekombinant herzustellen, sind im Stand der Technik bekannt. (Siehe z. B. U.S. Patent Nr. 4,736,866 ; U.S. Patent Nr. 5,824,838 ; U.S. Patent Nr. 5,487,992 und U.S. Patent Nr. 5,614,396 ).
  • Verwendung von Kollagenen und Gelatinen
  • Die erfindungsgemäßen rekombinanten Kollagene und Gelatinen sind für eine Vielzahl von Anwendungen geeignet. Kollagen wird weit in vielzähligen Anwendungen der medizinischen, pharmazeutischen, Nahrungsmittel- und kosmetischen Industrie verwendet. Zum Beispiel stellt Kollagen einen wichtigen Bestandteil von arteriellen Verschlüssen, Knochentransplantaten, Arzneimittelabgabesystemen, Hautimplantaten, Arterienklemmen und Inkontinenzimplantaten dar. In Behandlungen von Autoimmunstörungen, wie rheumatoider Arthritis, wurde Kollagen in Studien auf sein Potenzial überprüft, eine orale Toleranz zu induzieren. Kollagen wird auch in Nahrungsmittelprodukten verwendet, wie Wursthüllen und anderen Kollagen basierten Hüllen, die von zum Beispiel Schweine-, Rinder- und Schafsquellen abgeleitet werden. In Gesundheits- und Schönheitsanwendungen kann Kollagen zum Beispiel in Kosmetika oder Gesichts- und Hautprodukten, wie Feuchtigkeitscremen, gefunden werden. Zur Zeit werden verschiedene Kollagene, die in verschiedenen Anwendungen verwendet werden, aus Tierquellen unter Verwendung enzymatischer und chemischer Verfahren abgeleitet. Zum Beispiel wird kommerziell verfügbares bovines Kollagen aus Rindergeweben und -knochen isoliert und umfasst ein Gemisch aus hauptsächlich den Typen I- und III-Kollagen. Diese Form des Kollagens wird auch als ein injizierbares Hilfsmittel bei Menschen verwendet.
  • Gelatine kommt in der Herstellung oder als Bestandteil von verschiedenen pharmazeutischen und medizinischen Produkten und Hilfsmitteln vor, einschließlich pharmazeutischen Stabilisatoren, z. B. Arzneimittel und Impfstoff, Plasma- Streckmitteln, Schwämmen, harten und weichen Gelatinekapseln, Zäpfchen, usw.
  • Die Film bildenden Eigenschaften der Gelatine werden in verschiedenen Film-Beschichtungssystemen eingesetzt, die spezifisch für pharmazeutische orale, feste Dosierungsformen entworfen sind, einschließlich Kapseln und Tabletten mit kontrollierter Freisetzung.
  • Gelatine in verschiedenen essbaren Formen wurde lange in der Nahrungsmittel- und Getränkeindustrie verwendet. Gelatine dient als Emulgator und Verdickungsmittel in verschiedenen geschlagenen Garnierungen, sowie in Suppen und Soßen. Gelatine wird als Flockungsmittel beim Klären und Schönen verschiedener Ge tränke, einschließlich von Weinen und Fruchtsäften verwendet. Gelatine wird in verschiedenen Niedrig- und reduzierten Fettprodukten als Verdickungsmittel und Stabilisator verwendet und kommt anderswo als Fettersatzstoff vor. Gelatine wird auch weit bei der Mikroeinkapselung von Aromastoffen, Farben und Vitaminen verwendet. Gelatine kann auch als ein Proteinergänzungsmittel in verschiedenen Hochenergie- und Nährstoffgetränken und Nahrungsmitteln verwendet werden, wie jenen, die in der Gewichtsabnahme- und athletischen Industrie verbreitet sind. Als ein Filmbildner wird Gelatine beim Beschichten von Früchten, Fleisch, Feinkostartikeln und in verschiedenen Süßwarenprodukten, einschließlich Bonbons und Gummi, usw. verwendet.
  • In der kosmetischen Industrie kommt Gelatine in einer Vielzahl von Haarpflege- und Hautpflegeprodukten vor. Gelatine wird als Verdickungsmittel und Substanz gebendes Mittel in einer Anzahl von Shampoos, Schaumfestigern, Cremes, Lotionen, Gesichtsmasken, Lippenstiften, Manikürelösungen und Produkten und anderen kosmetischen Hilfsmitteln und Anwendungen verwendet. Gelatine wird auch in der kosmetischen Industrie bei der Mikroeinkapselung und Verpackung von verschiedenen Produkten verwendet.
  • Gelatine wird in einem weiten Bereich von industriellen Anwendungen verwendet. Zum Beispiel wird Gelatine weit als Klebstoff und Haftmittel in verschiedenen Herstellungsverfahren verwendet. Gelatine kann in verschiedenen Haftmittel- und Klebeformulierungen verwendet werden, wie bei der Herstellung von rückbefeuchtbaren gummierten Papier-Verpackungsklebebändern, beim Holzkleben, bei der Papierbindung von verschiedenen Klassen von Kartonagepappen und -papieren und in verschiedenen Anwendungen, welche haftende Oberflächen bereitstellen, die durch Rückbefeuchtung reaktiviert werden können.
  • Gelatine dient als lichtempfindliche Beschichtung in verschiedenen elektronischen Geräten und wird als lichtundurchlässige Basis in verschiedenen fotolithografischen Verfahren verwendet, zum Beispiel in der Farbfernseher- und Videokamera-Herstellung. In der Halbleiterherstellung wird Gelatine beim Konstruieren von Leadframes und beim Beschichten verschiedener Halbleiterelemente verwendet. Gelatine wird in verschiedenen Druckverfahren verwendet und bei der Herstellung von Papieren mit spezieller Qualität, wie das, welches für Anleihen- und Aktienzertifikate, usw. verwendet wird.
  • Gelatine wird in einer Vielzahl von fotografischen Anwendungen verwendet, z. B. als ein Träger für verschiedene aktive Bestandteile in fotografischen Lösungen, einschließlich den Lösungen, die in der Röntgen- und fotografischen Filmentwicklung verwendet werden. Gelatine, die lange in verschiedenen Fotogravurtechniken verwendet wurde, ist auch als Bestandteil verschiedener Typen von Film eingeschlossen und wird sehr häufig in der Silberhalogenid-Chemie in verschiedenen Schichten von Film- und Papierprodukten verwendet. Der Silber-Gelatine-Film kommt in Form des Mikrofiche-Films und in anderen Formen der Informationsspeicherung vor. Gelatine wird als selbst verschließendes Element von verschiedenen Filmen, usw. verwendet.
  • Gelatine war auch eine wertvolle Substanz für die Verwendung in verschiedenen Laboranwendungen. Zum Beispiel kann Gelatine in verschiedenen Zellkulturanwendungen verwendet werden, wobei sie eine geeignete Oberfläche für die Zellanheftung und das Wachstum bereitstellt, z. B. Platten- oder Flaschenbeschichtung, oder wobei sie eine Oberfläche für die Zellanheftung und das Wachstum bereitstellt. Hydrolysierte oder Gelatine mit niedriger Gelierungsstärke wird als biologischer Puffer in verschiedenen Verfahren verwendet, zum Beispiel in Beschichtungs- und Blockierungslösungen, die in Assays, wie Enzym gekoppelten Immunadsorptionsassays (ELISA), oder anderen Immunassays verwendet werden. Gelatine wird auch als Bestandteil in verschiedenen Gelen für biochemische und elektrophoretische Analysen verwendet, einschließlich enzymografischer Gele.
  • BEISPIELE
  • Die folgenden Beispiele werden einzig zum Darstellen der beanspruchten Erfindung bereitgestellt. Die vorliegende Erfindung ist jedoch im Schutzumfang durch die beispielhaften Ausführungsformen nicht beschränkt, welche nur als Darstelllungen der einzelnen Aspekte der Erfindungen gedacht sind. In der Tat werden verschiedene Modifikationen der Erfindung zusätzlich zu jenen hier beschriebenen dem Fachmann aus der vorhergehenden Beschreibung und den beigefügten Zeichnungen offensichtlich werden.
  • Beispiel 1: Sequenzierung von bovinem Prokollagen Typ Iα1
  • Die Experimente wurden durchgeführt, um α1(I)-Kollagen-Genfragmente durch eine PCR aus einer kommerziellen cDNA-Bibliothek des glatten Muskels einer Rinderaorta (Stratagene #936705) zu erzeugen, die eine erfolgreiche Quelle für bovine Kollagen (I) Alpha 2-Genfragmente in anfänglichen PCR-Experimenten darstellte. In diesem anfänglichen Screeningverfahren wurden PCR-Primer aus der bovinen mRNA-Sequenz (Shirai et al. (1998) Matrix Biology 17: 85-88) des Kollagens (I) α2 entworfen, und PCR-Amplifikationen wurden durchgeführt, und DNA-Fragmente wurden erhalten. Obwohl gezeigt wurde, dass die kommerzielle Bibliothek die vollständige kodierende Region des bovinen Kollagen (I) Alpha 2-Gens enthielt, zeigten sich Versuche, Fragmente des bovinen α1(I)-Kollagen-Gens unter Verwendung einer Vielzahl von humanen α1(I)-Kollagensequenz-PCR-Primern zu erzeugen, als nicht erfolgreich. Eine alternative Quelle für einen cDNA-Pool, welcher wahrscheinlich ein bovines α1(I)-Kollagentranskript enthielt, wurde gesucht.
  • Eine bovine ATCC-Hautzelllinie (CRL-6054; Haut, normal, bovin) wurde auf ungefähr 60% Konfluenz gezüchtet, und die Gesamt-RNA wurde isoliert (Qiagen RNeasy). Ein cDNA-Pool wurde aus der sich ergebenden RNA durch eine RT-PCR (Clontech RT-for-PCR-Reagenzien) hergestellt. Dieser cDNA-Pool wurde als Matrizenquelle für die nachfolgenden PCR-Experimente von sich überlappenden Genfragmenten verwendet.
  • Die Primer wurden aus einer bekannten humanen α1(I)-Kollagen mRNA-Sequenz entworfen und verwendet, um überlappende Segmente des offenen Leserahmens (ORF für engl.: open reading frame) des Gens zu amplifizieren. (Mackay et al. (1993) Human Molecular Genetics 2(8): 1155-1160). Die PCR-Primer wurden gentechnisch hergestellt, um Fragmente zu amplifizieren, die in der dreifach helikalen kodierenden Region des humanen α1(I)-Kollagengens liegen und sind in Tabelle 1 dargestellt. Tabelle 1
    Figure 00690001
  • Die Primer wurden verwendet, um vier überlappende bovine PCR-Fragmente zu erhalten, die den dreifach helikalen Abschnitt des bovinen α1(I)-Kollagengens abdecken. Die PCR (Clontech, Advantage GC-Rich cDNA PCR Kit; alle PCR-Primer wurden @ 100 pmol in jeder Reaktion verwendet) wurde unter Verwendung eines Thermocyclers (Hybaid, ungekühlt) unter den folgenden Bedingungen durchgeführt:
    Schritt 1: 94°C für 4 Minuten
    Schritt 2: 28 Zyklen von:
    68°C für 3 Minuten
    94°C für 30 Sekunden
    60°C für 30 Sekunden
    Schritt 3: 68°C für 10 Minuten
    30°C für 1 Sekunde
    bei Raumtemperatur gehalten
  • Alle PCR-Produkte wurden anfänglich durch eine Gelelektrophorese gescreent, und jene mit der vorhergesagten Größe wurden durch eine Agarosegel-Elektrophorese und/oder eine Säulenreinigung (Qiagen Qiaquick) gereinigt. Um die Sequenzierung zu erleichtern, wurden die ausgewählten PCR-Fragmente in einen Vektor (pCRII-TOPO Kit, Invitrogen) kloniert. Viele Klone von jedem PCR-Fragment wurden mit externen Vektor-Sequenzierungsprimern (M13 Forward und Reverse) unter Verwendung eines ABI 373 Sequenzierautomaten (ABI PRISMO BigDyeTM Terminator Cycle Sequencing Kit, Perkin-Elmer) sequenziert. Die erhaltenen Sequenzdaten wurden unter der Verwendung der SEQMAN-Software (DNASTAR) analysiert, und eine Konsensussequenz für die klonierten Fragmente wurde bestimmt.
  • Die sich ergebende bovine α1(I)-Kollagensequenz, die erhalten wurde, wurde verwendet, um interne Sequenzierungsprimer für bovines Kollagen zu entwerfen, welche anschließend verwendet wurden, um die Sequenzierung von diesen bovinen Klonen zu vervollständigen. Diese Primer wurden mit Hilfe der Primer-Design-Software (RightPrimer, BioDisk) entworfen und sind in Tabelle 2 dargestellt. Tabelle 2
    Figure 00700001
  • Nach dem Herstellen der bovinen PCR-Produkte mit den acht humanen SSCP-Primern, die in Tabelle 1 gezeigt sind (SEQ ID NR: 13 bis 20), wurden drei zusätzliche PCR-Fragmente amplifiziert, die die anfänglichen bovinen Klone überlappen und die sich bis zu den vermeintlichen Enden (durch Analogie mit der humanen α1(I)-Kollagensequenz) des ORF erstrecken. Die für diese Amplifikation verwendeten PCR-Primer sind in Tabelle 3 dargestellt. Tabelle 3
    Figure 00710001
  • Die sich ergebenden DNA-Fragmente wurden kloniert und sequenziert, und eine Konsensussequenz wurde für einen Großteil des ORF des Gens durch Paaren der folgenden Primer etabliert: H AVR II (SEQ ID NR: 43) mit SSCP 1REV (SEQ ID NR: 14); H EAR 1 F (SEQ ID NR. 44) mit H NOT1 REV (SEQ ID NR: 45) und SSCP 4F (SEQ ID NR: 19) mit H NOT1 REV (SEQ ID NR: 45).
  • Um die 5'- und 3'-Enden des cDNA-Klons zu erhalten, wurden verschachtelte (engl.: nested) PCR-Primer aus der bovinen Sequenz durch die RACE (schnelle Amplifikation von cDNA-Enden)-Methodik (SMART RACE cDNA Amplification Kit, Clontech) entworfen und mit der Hilfe einer Primerdesign-Software. Für eine er höhte Spezifität wurden die Primer entworfen, um besonders hohe Schmelztemperaturen aufzuweisen. Die entworfenen Primer sind in Tabelle 4 dargestellt. Tabelle 4
    Figure 00710002
    Figure 00720001
  • Die oben beschriebene bovine Gesamt-mRNA wurde weiterhin verwendet, um neue cDNA-Pools mit den nötigen externen Priming-Stellen für eine Verwendung als PCR-Matrizen herzustellen. Die PCR-Produkte wurden an sowohl den 5'- als auch den 3'-Enden des Gens erhalten, durch Verwenden von: (1) Touchdown-PCR-Techniken, (2) den neu entworfenen bovinen RACE-PCR-Primern und (3) den in dem Kit bereitgestellten Materialien. Zwei Touchdown-PCR-Programme wurden in einem Peltier gekühlten Thermocycler unter Verwendung des/der folgenden Protokolls und Bedingungen verwendet: 72°C–68°C Touchdown-Programm I:
    Schritt 1: 8 Zyklen mit den folgenden Bedingungen:
    94°C für 10 Sekunden
    72°C für 10 Sekunden, jeder Zyklus danach um 0,5°C abgesenkt
    72°C für 3 Minuten
    Schritt 2: 28 Zyklen der folgenden Bedingungen:
    94°C für 10 Sekunden
    68°C für 10 Sekunden
    72°C für 3 Minuten
    72°C für 10 Minuten
    4°C GEHALTEN
    68°C–64°C Touchdown-Programm II:
    Schritt 1: 8 Zyklen der folgenden Bedingungen:
    94°C für 10 Sekunden
    68°C für 10 Sekunden, jeder Zyklus danach um 0,5°C abgesenkt
    72°C für 3 Minuten
    Schritt 2: 28 Zyklen der folgenden Bedingungen:
    94°C für 10 Sekunden
    64°C für 10 Sekunden
    72°C für 3 Minuten
    72°C für 10 Minuten
    4°C GEHALTEN
  • Die sich ergebenden Fragmente wurden mit einer 1,2% Agarosegel-Elektrophorese untersucht, und eine nachfolgende Klonierung und Sequenzierungsanalyse wurde durchgeführt. Die sich aus beiden Programmen ergebenden PCR-Produkte wurden verwendet. Die sich ergebenden Sequenzen überlappten die zuvor klonierten bovinen α1(I)-Kollagensequenzen und kodierten die 5'- und 3'-Enden des ORF, sowie die angrenzenden untranslatierten cDNA-Regionen. Die Nukleotidsequenz für bovines Prokollagen Typ I α1 ist in den 1A bis 1C (SEQ ID NR: 1) gezeigt. Die entsprechende Aminosäuresequenz wird in den 2A bis 2D (SEQ ID NR: 2) beschrieben.
  • Wie in den 3A bis 3I gezeigt, wurden die translatierten bovinen Kollagen-ORF-Sequnzen mit bekannten humanen (HU), Maus-(MUS), Hunde-(CANIS), Ochsenfrosch-(RANA) und japanischen Molch-(CYNPS)-Sequenzen ausgerichtet. Die translatierte bovine Sequenz läßt sich auch an den veröffentlichten Aminosäuresequenz-Fragmenten der dreifach helikalen Wiederholungsdomänen des bovinen α1(I)-Kollagens ausrichten. (Siehe z. B. Miller (1984) Extracellular Matrix Biochemistry, Hrsg., Piez, et al., Elsevier Science Publishing, New York, S. 41-81 und SWISSPROT Datenbankzugangsnummer p02453). Zahlreiche Unterschiede zwischen der vorhergesagten bovinen α1(I)-Kollagen-Proteinsequenz, die durch die vorliegende Erfindung bereitgestellt wird, und zuvor bekannten bovinen Proteinsequenzen wurden beobachtet. Einige dieser Unterschiede schließen Substitutionen von Aminosäuren ein, die typischerweise durch eine Proteinsequenzierung schwierig zu unterscheiden sind (d. h. Glutamin/Glutaminsäure und Asparaginsäure/Asparagin). Die hier als SEQ ID NR: 1 offenbarte Polynukleotidsequenz legt nahe, dass diese bekannten bovinen α1(I)-Kollagen-Proteinsequenzen Fehler einschließen können und daher zum Beispiel für eine Verwendung bei der Kon struktion eines synthetischen Gens durch Aminosäurerücktranslation, das ein authentisches bovines α1(I)-Kollagengen kodiert, ausgeschlossen werden können.
  • Beispiel 2: Herstellung von Tierkollagenen und -gelatinen in transgenen Pflanzen
  • Die cDNAs, die ein erfindungsgemäßes Tierkollagen, eine α-Untereinheit der Prolyl-4-Hydroxylase und eine β-Untereinheit der Prolyl-4-Hydroxylase kodieren, werden in einen geeigneten Pflanzen-Expressionsvektor kloniert, der die nötigen Elemente enthält, um ein fremdes Protein einwandfrei zu exprimieren. Solche Elemente können zum Beispiel ein Signalpeptid, einen Promotor und einen Terminator einschließen. (Siehe z. B. Rogers et al., supra; Schardl et al., supra; Berger et al., supra). Zum Beispiel wurden pVL-Vektoren im Stand der Technik beschrieben. (Siehe z. B. A. Lamberg et al. (1996) J. Biol. Chem. 271: 11988-11995). Diese rekombinanten pVL-Vektoren werden als eine Genquelle für die Konstruktion von Pflanzen-Expressionsvektoren unter Verwendung gängiger Verfahren, die im Stand der Technik bekannt sind, verwendet. Um das Kollagen in einer Pflanze oder in Pflanzenzellen zu exprimieren, werden die Nukleinsäuresequenzen funktionsfähig mit zum Beispiel einem CaMV 35S-Promotor verbunden. Die Nukleinsäuresequenzen, die eine α-Untereinheit oder β-Untereinheit der Prolyl-4-Hydroxylase kodieren, werden funktionsfähig mit einem CaMV 35S-Promotor verbunden, und können auf demselben Plasmid oder auf unterschiedlichen Plasmiden anwesend sein, um eine biologisch aktive Prolyl-4-Hydroxylase herzustellen.
  • Die Expressionsvektoren werden in Pflanzen oder in Pflanzenzellen unter Verwendung von im Stand der Technik gut bekannten Transformationstechniken transformiert. Die Expressionsklone werden zum Beispiel durch Northern- und Western-Blotten ausgewählt und können in einem Fermenter kultiviert werden, um eine Zellmasse für eine Reinigung des rekombinanten Kollagens zu erzeugen.
  • Die Expression der α-Untereinheit und der β-Untereinheit der Prolyl-4-Hydroxylase und des Tierkollagens wird gescreent, zum Beispiel durch Immunblotten unter Verwendung einer Exraktion von dreihundert (300) mg Zellpellets in 10 mM Tris, pH-Wert 7,8, 100 mM NaCl, 100 mM Glycin, 10 μM DTT, 0,1% Triton X100, 2 μM Leupeptin und 0,25 mM PMSF. Die Proteine in dem Extrakt werden mit einer 4-20% SDS-PAGE getrennt und auf eine Nitrozellulosemembran übertragen, um mit Antikörpern gegen die α-Untereinheit und β-Untereinheit der Prolyl-4-Hydroxylase und das Tierkollagen sondiert zu werden.
  • Um das rekombinante Tierkollagen, das in Pflanzen oder Pflanzenzellen hergestellt wurde, zu charakterisieren, wird das folgende Protokoll durchgeführt:
    • 1. Suspendieren und Homogenisieren der Zellpellets in 1 M NaCl, 0,05 M Tris, pH-Wert 7,4 und Rühren für 1 Stunde bei 4°C. Sammeln des Überstands durch Zentrifugation bei 4°C,
    • 2. Hinzufügen von 7,5 ml Essigsäure zu dem Überstand und Inkubieren bei 4°C für 2 Stunden. Sammeln des Pellets durch Zentrifugation bei 4°C,
    • 3. Zweimaliges Waschen des Pellets mit 2 M NaCl, 0,05 M Tris, pH-Wert 7,4,
    • 4. Wiederum Lösen in 2 M Harnstoff, 0,2 M NaCl, 0,05 M Tris, pH-Wert 7,4,
    • 5. Dialysieren gegen 2 M Harnstoff, 0,2 M NaCl, 0,05 M Tris, pH-Wert 7,4,
    • 6. Durch eine DEAE-Zellulosesäule laufen lassen. Sammeln des Durchflusses,
    • 7. Hinzufügen von Essigsäure bis 0,5 M und Hinzufügen von NaCl bis 0,9 M und Inkubieren für 2 Stunden bei 4°C,
    • 8. Sammeln der Pellets durch Zentrifugation,
    • 9. Resuspendieren des Pellets in 0,5 M Essigsäure und Rühren über Nacht bei 4°C,
    • 10. Spalten des Pellets mit 0,1 mg/ml Pepsin für 2 Stunden,
    • 11. Hinzufügen von gesättigtem Tris-Puffer und Einstellen des pH-Werts auf 7,4,
    • 12. Inkubieren über Nacht, um das Pepsin zu inaktivieren,
    • 13. Hinzufügen von NaCl bis 0,9 M und Essigsäure bis 0,5 M, Inkubieren für 2 Stunden bei 4°C,
    • 14. Sammeln des Pellets durch Zentrifugation bei 4°C,
    • 15. Waschen des Pellets mit 2 M NaCl, 0,05 M Tris, pH-Wert 7,4,
    • 16. Lösen in 2 M Harnstoff, 150 M NaCl und 0,05 M Tris, pH-Wert 7,4, und
    • 17. Erhitzen der Probe bei 56°C für 5 min und anschließend Laden auf eine Bio-Gel TSK 40-Säule, die von einem HPLC-System betrieben wird.
  • Das sich ergebende gereinigte Kollagen wird durch eine Analyse der Aminosäurezusammensetzung charakterisiert.
  • Verschiedene Modifikationen und Variationen der beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren und Systeme werden dem Fachmann offensichtlich sein, ohne vom Schutzumfang der beigefügten Ansprüche abzuweichen. Obwohl die Erfindung in Verbindung mit spezifisch bevorzugten Ausführungsformen beschrieben wurde, sollte es verstanden werden, dass die Erfindung, so wie beansprucht, nicht übermäßig auf solche spezifischen Ausführungsformen beschränkt werden sollte. In der Tat werden verschiedene Modifikationen der beschriebenen Weisen zum Ausführen der Erfindung dem Fachmann der Molekularbiologie oder verwandten Gebieten offensichtlich sein. SEQUENZPROTOKOLL
    Figure 00770001
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Claims (20)

  1. Rekombinantes bovines Kollagenpolypeptid, umfassend die Aminosäuresequenz SEQ ID NR.: 2.
  2. Polypeptid nach Anspruch 1, wobei das Polypeptid einzelkettig ist.
  3. Polypeptid nach Anspruch 1, wobei das Polypeptid homotrimer ist.
  4. Polypeptid nach Anspruch 1, wobei das Polypeptid heterotrimer ist.
  5. Polypeptid nach Anspruch 1, wobei das Polypeptid aus der Aminosäuresequenz SEQ ID NR.: 2 besteht.
  6. Zusammensetzung, umfassend ein Polypeptid nach einem der vorhergehenden Ansprüche.
  7. Isoliertes und gereinigtes Polynukleotid, welches SEQ ID NR.: 2 kodiert.
  8. Isoliertes und gereinigtes Polynukleotid, welches komplementär zum Polynukleotid nach Anspruch 7 ist.
  9. Zusammensetzung, umfassend das Polynukleotid nach Anspruch 7.
  10. Expressionsvektor, umfassend das Polynukleotid nach Anspruch 7.
  11. Wirtszelle, umfassend das Polynukleotid nach Anspruch 7.
  12. Wirtszelle nach Anspruch 11, wobei die Wirtszelle eine prokaryontische Wirtszelle ist.
  13. Wirtszelle nach Anspruch 11, wobei die Wirtszelle eine eukaryontische Wirtszelle ist.
  14. Wirtszelle nach Anspruch 11, wobei die Wirtszelle ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einer Tierzelle, einer Hefezelle, einer Pflanzenzelle, einer Insektenzelle und einer Pilzzelle.
  15. Transgenes, nicht-menschliches Tier, umfassend das Polynukleotid nach Anspruch 7.
  16. Transgene Pflanze, umfassend das Polynukleotid nach Anspruch 7.
  17. Verfahren zum Herstellen eines bovinen α1(I)-Kollagens, wobei das Verfahren umfaßt: (a) Kultivieren der Wirtszelle nach Anspruch 11 unter für die Expression des Polypeptids geeigneten Bedingungen und (b) Gewinnen des Polypeptids aus der Wirtszellenkultur.
  18. Verfahren zum Herstellen von rekombinanter Gelatine, wobei das Verfahren umfaßt: (a) zur Verfügung stellen von rekombinanten tierischen bovinen α1(I)-Kollagen-Polypeptiden nach einem der Ansprüche 1 bis 5, und (b) Erhalten von rekombinanter Tiergelatine davon.
  19. Verfahren zum Herstellen von rekombinanter Tierigelatine, wobei das Verfahren das Herstellen von rekombinanter boviner Gelatine direkt von einem Polynukleotid, welches SEQ ID NR.: 2 kodiert, umfaßt.
  20. Polynukleotid nach Anspruch 7, wobei das Polynukleotid SEQ ID NR.: 1 umfaßt oder daraus besteht.
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