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GEBIET DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung betrifft die rekombinante Synthese von Kollagenen
und Gelatinen, die von Tiersequenzen abgeleitet werden. Die vorliegende
Erfindung betrifft insbesondere neuartige Polynukleotidsequenzen,
die bovine Kollagene kodieren, und die kodierten Polypeptidsequenzen
und die Verwendung solcher Sequenzen in der rekombinanten Herstellung
von Tierkollagenen und -gelatinen.
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HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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Der
häufigste
Bestandteil der extrazellulären
Matrix stellt Kollagen dar. Kollagene stellen eine große Familie
fibröser
Proteine dar, die durch die Anwesenheit von dreisträngigen,
helikalen Domänen
gekennzeichnet sind. Kollagenmoleküle stellen im Allgemeinen das
Ergebnis der trimeren Anordnung von Polypeptidketten dar, die (-Gly-X-Y-)n-Wiederholungen enthalten, die die Bildung
der dreifach helikalen Domänen
erlauben (van der Rest et al. (1991) FASER J. 5: 2814-2823).
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Kollagen
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Zur
Zeit sind ungefähr
zwanzig verschiedene Kollagentypen in Vertebraten identifiziert
worden, einschließlich
bovinen bzw. Rinder-, ovinen bzw. Schafs-, Schweine-, Hühner- und
menschlichen Kollagenen. Im Allgemeinen werden die Kollagentypen
mit römischen
Ziffern nummeriert, und die Ketten, die in jedem Kollagentyp gefunden
werden, werden mit arabischen Ziffern identifiziert. Detaillierte
Beschreibungen der Struktur und der biologischen Funktionen der
verschiedenen unterschiedlichen Typen natürlich vorkommender Kollagene
sind im Stand der Technik allgemein verfügbar. (Siehe z. B. Ayad et
al. (1998) The Extracellular Matrix Facts Book, Academic Press,
San Diego, CA; Burgeson, R. E. und Nimmi (1992) "Collagen types: Molecular Structure
and Tissue Distribution" in
Clin. Orthop. 282: 250-272;
Kielty, C. M. et al. (1993) "The
Collagen Family: Structure, Assembly And Organization In The Extracellular
Matrix", Connective
Tissue And Its Heritable Disorders, Molecular Genetics, And Medical
Aspects, Royce, P. M. und B. Steinmann Hrsg., Wiley-Liss, NY, S. 103-147
und Prockop, D.J. und K.I. Kivirikko (1995) "Collagens: Molecular Biology, Diseases,
and Potentials for Therapy," Annu.
Rev. Biochem., 64: 403-434).
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Typ
I-Kollagen stellt das wichtigste fibrilläre Kollagen der Knochen und
der Haut dar, welches ungefähr 80–90% des
Gesamtkollagens eines Organismus umfasst. Typ I-Kollagen stellt
das wichtigste strukturelle Makromolekül dar, das in der extrazellulären Matrix
von vielzelligen Organismen vorkommt, und umfasst ungefähr 20% der
gesamten Proteinmasse. Typ I-Kollagen stellt ein heterotrimeres
Molekül
dar, welches zwei α1(I)-Ketten
und eine α2(I)-Kette
umfasst, die jeweils von den COL1A1- und COL1A2-Genen kodiert werden.
Andere Kollagentypen sind weniger häufig als Typ I-Kollagen und
weisen unterschiedliche Verbreitungsmuster auf. Zum Beispiel stellt
Typ II-Kollagen das vorwiegende Kollagen im Knorpel und im Glaskörper dar,
während
Typ III-Kollagen in großen
Mengen in Blutgefäßen und
in einem geringeren Ausmaß in
der Haut gefunden wird.
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Typ
II-Kollagen stellt ein homotrimeres Kollagen dar, das drei identische α1(II)-Ketten umfasst, die
von dem COL2A1-Gen kodiert werden. Gereinigtes Typ II-Kollagen kann aus
Geweben durch Verfahren hergestellt werden, die im Stand der Technik
bekannt sind, zum Beispiel durch Verfahren, die in Miller und Rhodes
(1982) Methods In Enzymology 82: 33-64 beschrieben werden.
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Typ
III-Kollagen stellt ein wichtiges fibrilläres Kollagen dar, das in der
Haut und in vaskulären
Geweben gefunden wird. Typ III-Kollagen stellt ein homotrimeres
Kol lagen dar, das drei identische α1(III)-Ketten umfasst, die von
dem COL3A1-Gen kodiert werden. Verfahren zum Reinigen des Typ III-Kollagens
aus Geweben kön nen
zum Beispiel in Byers et αl.
(1974) Biochemistry 13: 5243-5248 und Miller und Rhodes, supra gefunden werden.
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Typ
IV-Kollagen wird in Basalmembranen eher in Form von Kissen, als
in Fibrillen gefunden. Am häufigsten
enthält
Typ IV-Kollagen zwei α1(IV)-Ketten
und eine α2(IV)-Kette.
Die bestimmten Ketten, die Typ IV-Kollagen umfassen, sind gewebespezifisch.
Typ IV-Kollagen kann zum Beispiel unter Verwendung der in Furuto
und Miller (1987) Methods in Enzymology, 144: 41-61, Academic Press
beschriebenen Verfahren gereinigt werden.
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Typ
V-Kollagen stellt ein fibrilläres
Kollagen dar, das hauptsächlich
in Knochen, Sehnen, der Kornea, der Haut und in Blutgefäßen gefunden
wird. Typ V-Kollagen kommt sowohl in homotrimeren als auch in heterotrimeren
Formen vor. Eine Form des Typ V-Kollagens stellt ein Heterotrimer
aus zwei α1(V)-Ketten
und einer α2(V)-Kette
dar. Eine andere Form des Typ V-Kollagens stellt ein Heterotrimer
aus α1(V)-, α2(V)- und α3(V)-Ketten
dar. Eine weitere Form des Typ V-Kollagens stellt ein Homotrimer
aus α1(V)
dar. Verfahren zum Isolieren von Typ V-Kollagen aus natürlichen
Quellen können
zum Beispiel in Elstow und Weiss (1983) Collagen Rel. Res. 3: 181-193
und Abedin et al. (1982) Biosci. Rep. 2: 493-502 gefunden werden.
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Typ
VI-Kollagen weist eine kleine dreifach helikale Region und zwei
große
nicht kollagenartige übrige Abschnitte
auf. Typ VI-Kollagen stellt ein Heterotrimer dar, welches α1(VI)-, α2(VI)- und α3(VI)-Ketten
umfasst. Typ VI-Kollagen wird in vielen Bindegeweben gefunden. Beschreibungen,
wie Typ VI-Kollagen aus natürlichen Quellen
gereinigt werden kann, können
zum Beispiel in Wu et al. (1987) Biochem. J. 248: 373-381 und Kielty et
al. (1991) J. Cell. Sci. 99: 797-807 gefunden werden.
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Typ
VII-Kollagen stellt ein fibrilläres
Kollagen dar, das in bestimmten epithelialen Geweben gefunden wird.
Typ VII-Kollagen stellt ein homotrimers Molekül aus drei α1(VII)-Ketten dar. Beschreibungen,
wie Typ VII-Kollagen aus Geweben gereinigt werden kann, können zum
Beispiel in Lunstrum et al. (1986) J. Biol. Chem. 261: 9042-9048
und Bentz et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 3168-3172
gefunden werden.
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Typ
VIII-Kollagen kann in der Descemet-Membran in der Kornea gefunden
werden. Typ VIII-Kollagen stellt ein Heterotrimer dar, das zwei α1(VIII)-Ketten
und eine α2(VIII)-Kette
umfasst, obwohl von anderen Kettenzusammensetzungen berichtet wurde.
Verfahren für
die Reinigung des Typ VIII-Kollagens aus der Natur können zum
Beispiel in Benya und Padilla (1986) J. Biol. Chem. 261: 4160-4169
und Kapoor et αl.
(1986) Biochemistry 25: 3930-3937 gefunden werden.
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Typ
IX-Kollagen stellt ein mit Fibrillen assoziiertes Kollagen dar,
das im Knorpel und im Glaskörper
gefunden wird. Typ IX-Kollagen stellt ein heterotrimeres Molekül dar, das α1(IX)-, α2(IX)- und α3(IX)-Ketten
umfasst. Typ IX-Kollagen wurde als ein FACIT (Fibrillen assoziierte
Kollagene mit unterbrochenen Dreifachhelices, engl.: Fibril Associated
Collagens with Interrupted Triele Helices)-Kollagen klassifiziert,
welches mehrere dreifach helikale Domänen besitzt, die durch nicht
dreifach helikale Domänen
getrennt sind. Verfahren zum Reinigen von Typ IX-Kollagen können zum Beispiel in Duance,
et al. (1984) Biochem. J. 221: 885-889; Ayad et αl. (1989) Biochem. J. 262: 753-761
und Grant et al. (1988) The Control of Tissue Damage, Glauert, A.
M. Hrsg., Elsevier Science Publishers, Amsterdam, S. 3-28 gefunden
werden.
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Typ
X-Kollagen stellt eine homotrimere Verbindung aus α1(X)-Ketten
dar. Typ X Kollagen wurde zum Beispiel aus hyertrophem Knorpel,
der in Wachstumszonen gefunden wird, isoliert. (Siehe z. B. Apte
et al. (1992) Eur J Biochem 206 (1): 217-24).
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Typ
XI-Kollagen kann in knorpeligen Geweben gefunden werden, die mit
Typ II- und Typ
IX-Kollagenen assoziiert sind, und an anderen Stellen im Körper. Typ
XI-Kollagen stellt
ein heterotrimeres Molekül
dar, das α1(XI)-, α2(XI)- und α3(XI)- Ketten umfasst. Verfahren
zum Reinigen von Typ XI-Kollagen können zum Beispiel in Grant
et al., supra gefunden werden.
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Typ
XII-Kollagen stellt ein FACIT-Kollagen dar, das hauptsächlich in
Assoziation mit Typ I-Kollagen gefunden wird. Typ XII-Kollagen stellt
ein homotrimeres Molekül
dar, das drei α1(XII)-Ketten
umfasst. Verfahren zum Reinigen von Typ XII-Kollagen und Varianten davon können zum
Beispiel in Dublet et al. (1989) J. Biol. Chem. 264: 13150-13156;
Lunstrum et al. (1992) J. Biol. Chem. 267: 20087-20092 und Watt
et al. (1992) J. Biol. Chem. 267: 20093-20099 gefunden werden.
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Typ
XIII stellt ein nicht fibrilläres
Kollagen dar, das zum Beispiel in der Haut, dem Darm, Knochen, Knorpel
und der gestreiften Muskulatur gefunden wird. Eine detaillierte
Beschreibung des Typ XIII-Kollagens kann zum Beispiel in Juvonen
et al. (1992) J. Biol. Chem. 267: 24700–24707 gefunden werden.
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Typ
XIV stellt ein FACIT-Kollagen dar, das als ein homotrimeres Molekül gekennzeichnet
ist, welches α1(XIV)-Ketten
umfasst. Verfahren zum Isolieren von Typ XIV-Kollagen können zum
Beispel in Hubert-Foucher et al. (1992) J. Biol. Chem. 267: 15759-15764
und Watt et al., supra gefunden werden.
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Typ
XV-Kollagen ist in der Struktur homolog zu dem Typ XVIII-Kollagen.
Information über
die Struktur und die Isolierung von natürlichem Typ XV-Kollagen kann
zum Beispiel in Myers et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:
10144-10148; Huebner et al. (1992) Genomics 14: 220-224; Kivirikko
et al. (1994) J. Biol. Chem. 269: 4773-4779 und Muragaki, J. (1994)
Biol. Chem. 264: 4042-4046 gefunden werden.
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Typ
XVI-Kollagen stellt ein Fibrillen assoziiertes Kollagen dar, welches
zum Beispiel in der Haut, in Lungenfibroblasten und in Keratinozyten
gefunden wird. In formation über
die Struktur von Typ XVI-Kollagen und das Gen, welches Typ XVI-Kollagen kodiert,
kann zum Beispiel in Pan et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
89: 6565-6569 und Yamaguchi et al. (1992) J. Biochem. 112: 856-863
gefunden werden.
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Typ
XVII-Kollagen stellt ein hemidesmosomales Transmembran-Kollagen
dar, das auch als bullöses Pemphigoid-Antigen
bekannt ist. Information über
die Struktur von Typ XVII-Kollagen und über das Gen, das Typ XVII-Kollagen
kodiert, kann zum Beispiel in Li et al. (1993) J. Biol. Chem. 268(12):
8825-8834 und McGrath et al. (1995) Nat. Genet. 11(1): 83-86 gefunden
werden.
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Typ
XVIII-Kollagen ist in der Struktur ähnlich zu Typ XV-Kollagen und
kann aus der Leber isoliert werden. Beschreibungen der Strukturen
und der Isolation von Typ XVIII-Kollagen aus natürlichen Quellen können zum
Beispiel in Rhen und Pihlajaniemi (1994) Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 91: 4234-4238; Oh e al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:
4229-4233; Rehn et al. (1994) J. Biol. Chem. 269: 13924-13935 und Oh et al.
(1994) Genomics 19: 494-499 gefunden werden.
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Von
Typ XIX-Kollagen wird angenommen, dass es ein anderes Mitglied der
FACIT-Kollagenfamilie darstellt, und es wurde in mRNA gefunden,
die aus Rhabdomyosarkom-Zellen isoliert wurde. Beschreibungen der Strukturen
und der Isola tion von Typ XIX-Kollagen können zum Beispiel in Inoguchi
et al. (1995) J. Biochem. 117: 137-146; Yoshioka et al. (1992) Genomics
13: 884-886 und Myers et al., J. Biol. Chem. 289: 18549-18557 (1994)
gefunden werden.
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Typ
XX-Kollagen stellt ein neu gefundenes Mitglied der kollagenartigen
FACIT-Familie dar
und wurde in Hühner-Kornea
identifiziert. (Siehe z. B. Gordon et al. (1999) FASER Journal 13:
A1119 und Gordon et al. (1998), IOVS 39: S1128).
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Gelatine
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Gelatine
stellt ein Derivat von Kollagen, ein Hauptstruktur- und Bindeprotein
in Tieren dar. Gelatine wird aus der Denaturierung von Kollagen
abgeleitet und enthält
Polypeptidsequenzen, die Gly-X-Y-Wiederholungen aufweisen, wobei
X und Y meistens Prolin- und Hydroxyprolin-Reste darstellen. Diese
Sequenzen tragen zur dreifach helikalen Struktur bei und bewirken
die Gelierfähigkeit
der Gelatinepolypeptide. Zur Zeit verfügbare Gelatine wird über Verarbeiten
von Tierhäuten
und -knochen, typischerweise aus Rinder- und Schweine-Quellen extrahiert.
Die biophysikalischen Eigenschaften der Gelatine machen sie zu einem
vielseitigen Material, das in einer Vielzahl von Anwendungen und
Industrien weit verwendet wird. Gelatine wird zum Beispiel in zahlreichen
pharmazeutischen und medizinischen, fotografischen, industriellen,
kosmetischen und Nahrungsmittel- und Getränke-Produkten und Verfahren der Herstellung
verwendet. Gelatine stellt daher ein kommerziell wertvolles und
vielseitiges Produkt dar.
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Gelatine
wird typischerweise aus natürlich
in Rinder- und Schweine-Quellen vorkommendem Kollagen, insbesondere
aus Häuten
und Knochen hergestellt. In einigen Fällen kann Gelatine zum Beispiel
aus Fisch-, Hühner-
oder Pferde-Quellen extrahiert werden. Die Rohmaterialien der typischen
Gelatineherstellung, wie Rinderhäute
und -knochen, stammen von Tieren, die Gegenstand staatlich geprüfter Inspektion
waren und diese als geeignet für
den menschlichen Verzehr bestanden haben. Es gibt Bedenken über die
Infektiösität dieses
Rohmaterials aufgrund der Anwesenheit von Kontaminierungsmitteln,
wie übertragbaren
spongiformen Enzephalopathien (TSEs, für engl.: transmissible spongiform
encephalopathies), insbesondere boviner spongiformer Enzephalopathie
(BSE) und Scrapie, usw. (Siehe z. B. Rohwer, R.G. (1996), Dev Biol
Stand 88: 247-256). Solche Sachverhalte sind insbesondere kritisch
für Gelatine,
die in pharmazeutischen und medizinischen Anwendungen verwendet
wird.
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In
letzter Zeit stiegen die Bedenken über die Sicherheit dieser Materialien,
von denen ein erheblicher Teil aus Rinderquellen abgeleitet wird,
an, was verursachte, dass verschiedene Gelatine enthaltene Produkte in
den Mittelpunkt mehrerer regulatorischer Messungen rückten, um
das potenzielle Risiko der Übertragung boviner
spongiformer Enzephalopathie (BSE) zu reduzieren, die mit der neuen
Variante der Creuzfeldt-Jakob-Erkrankung (nvCJD), einer tödlichen
neurologischen Erkrankung in Menschen, verbunden ist. Es gibt Bedenken,
dass die Reinigungs schritte, die derzeit in dem Verfahren des Extrahierens
der Gelatine aus Tiergeweben und -knochen verwendet werden, nicht
ausreichend sein können,
um die Wahrscheinlichkeit der Infektiösität aufgrund von kontaminierendem
SE tragendem Gewebe (d. h. Gehirngewebe, usw.) zu entfernen. U.S.- und
europäische
Hersteller schreiben vor, dass Rohmaterial für Gelatine, die in tierische
oder menschliche Nahrungsmittelprodukte oder in pharmazeutische,
medizinische oder kosmetische Anwendungen eingeschlossen werden
soll, nicht von einer wachsenden Anzahl von BSE-Ländern bezogen
werden soll. Zusätzlich schreiben
Bestimmungen vor, dass bestimmte Materialien, z. B. bovine Gehirngewebe,
nicht in der Herstellung von Gelatine verwendet werden.
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Derzeitige
Herstellungsverfahren umfassen mehrere Reinigungs- und Säuberungsschritte
und können raue
und langwierige Weisen der Extraktion erfordern. Die Tierhäute und
-knochen werden in einem Schmelzverfahren behandelt, und das extrahierte
Material wird verschiedenen chemischen Behandlungen ausgesetzt, einschließlich verlängerter
Exposition gegenüber
stark sauren oder alkalischen Lösungen.
Zahlreiche Reinigungsschritte können
Waschen und Filtrieren und verschiedene Hitzebehandlungen umfassen.
Säure-Demineralisierung
und Kalkbehandlungen werden verwendet, um Unreinheiten, wie nicht
kollagenartige Proteine, zu entfernen. Knochen müssen entfettet werden. Zusätzliche
Wasch- und Filtrierschritte,
Ionenaustausche und andere chemische und sterilisierende Behandlungen
werden zu dem Verfahren hinzugefügt,
um das Material weiter zu reinigen. Des Weiteren können Kontaminierungen
und Unreinheiten nach der Verarbeitung noch zurückbleiben, und das sich ergebende
Gelatineprodukt muss da her typischerweise geklärt, gereinigt und häufig weiterhin
konzentriert werden, bevor es für
die Verwendung fertiggestellt ist.
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Kommerzielle
Gelatine wird im Allgemeinen als Typ A oder Typ B klassifiziert.
Diese Klassifikationen spiegeln die Extraktionsquellen vor der Behandlung
wieder, die als Teil des Extraktionsverfahrens erfasst werden. Typ
A wird im Allgemeinen von Säure
verarbeiteten Materialien abgeleitet, üblicherweise von Schweinehäuten, und
Typ B wird im Allgemeinen von alkalisch oder Kalk verarbeiteten
Materia lien abgeleitet, üblicherweise
von Rinderknochen (Ossein) und -häuten. In sowohl Typ A-, als
auch Typ B-Extraktionsverfahren umfasst das sich ergebende Gelatineprodukt
typischerweise ein Gemisch aus Gelatinemolekülen in Größen von einigen tausend bis
zu mehreren hunderttausend Dalton.
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Fischgelatine,
die als gelierende und nicht gelierende Typen klassifiziert wird,
und typischerweise als Typ A-Gelatine verarbeitet wird, wird auch
in bestimmten kommerziellen Anwendungen verwendet. Gelierende Typen
werden üblicherweise
von den Häuten
von Warmwasserfischen abgeleitet, während nicht gelierende Typen
typischerweise von Kaltwasserfischen abgeleitet werden. Fischgelatinen
weisen weit variierende Aminosäurezusammensetzungen
auf und unterscheiden sich von Tiergelatinen darin, dass sie typischerweise niedrigere
Anteile an Prolin- und Hydroxyprolin-Resten aufweisen. Im Gegensatz
zu anderen Tiergelatinen bleiben Fischgelatinen typischerweise bei
viel niedrigeren Temperaturen flüssig,
selbst bei vergleichbaren durchschnittlichen Molekulargewichten.
Wie bei Tiergelatine wird Fischgelatine durch Behandlung und nachfolgende
Hydrolysierung der Fischhaut extrahiert. Wiederum wie bei den Tier-Extraktionsverfahren,
führt das Verfahren
des Extrahierens der Fischgelatine zu einem Produkt, dem die Homogenität fehlt.
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Derzeitige
Verfahren der Extraktion führen
daher zu einem Gelatineprodukt, welches ein heterogenes Gemisch
aus Proteinen darstellt, die Polypeptide mit Molekulargewichtsverteilungen
variierender Bereiche enthalten. Es ist manchmal nötig, verschiedene
Chargen des Produkts zu mischen, um ein Gelatinegemisch mit den
physikalischen Eigenschaften zu erhalten, die für eine Verwendung in einer
ge wünschten
Anwendung geeignet sind. Es gibt daher einen Bedarf für ein verlässliches
und reproduzierbares Hilfsmittel der Gelatineherstellung, dass ein
homogenes Produkt mit kontrollierten Eigenschaften bereitstellt.
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Zusätzlich gibt
es insbesondere in der pharmazeutischen, kosmetischen und Nah rungsmittel-
und Getränke-Industrie
einen Bedarf für
eine Gelatinequelle, die nicht jene darstellt, die durch die Extraktion
aus Tierquellen, z. B. Rinder-, Schweineknochen und -gewebe, erhalten
wird. Da derzeit verfügbare
Gelatine aus Tierquel len, wie Knochen und Geweben, hergestellt wird,
gibt es weiterhin Bedenken bezüglich
der unerwünschten
Immunogenität
und Infektiösität von Gelatine
enthaltenden Produkten. (Siehe z. B. Sakaguchi, M. et al., (1999)
J. Aller. Clin. Immunol. 104: 695-699; Miyazawa et al. (1999) Vaccine
17: 2176-2180; Sakaguchi et al. (1999) Immunology 96: 286-290; Kelso
(1999) J. Aller. Clin. Immunol. 103: 200-202; Asher (1999) Dev Biol Stand 99:
41-44 und Verdrager (1999) Lancet 354: 1304-1305). Zusätzlich wird
die Verfügbarkeit
eines Ersatzmaterials, welches keine Extraktion aus Tierquellen,
z. B. Geweben und Knochen, durchläuft, verschiedene ethische,
religiöse
und soziale Vorgaben ansprechen. Ein rekombinan tes Material, welches
keine Extraktion aus Tierquellen, wie Geweben und Knochen, benötigt, könnte zum
Beispiel bei der Herstellung von Lebensmitteln oder anderen eingenommenen
Produkten, einschließlich
eingekapselten Arzneimitteln, verwendet werden, die für die Verwendung
bei Personen mit diätischen
Einschränkungen
geeignet sind, zum Beispiel bei jenen, die Koscher- und Halal- Gesetze befolgen.
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Posttranslationale Enzyme
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Posttranslationale
Enzyme sind wichtig für
die Biosynthese von Kollagenen und kollagenartigen Proteinen. Zum
Beispiel wird Prolyl-4-Hydroxylase benötigt, um Prolyl-Reste in der
V-Position der sich wiederholenden -Gly-X-V-Sequenzen zu 4-Hydroxyprolin zu
hydroxylieren. (Siehe z. B. Prockop et al. (1984) N. Engl. J. Med.
311: 476-386). Hydroxyprolin spielt eine entscheidende Rolle für die Stabilisierung
der Kollagen-Dreifachhelix.
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Wirbeltier-Prolyl-4-Hydroxylase
ist ein α2β2-Tetramer. (Siehe z. B. Berg und Prockop
(1973) J. Biol. Chem. 248: 1175-1192 und Tuderman et al. (1975)
Eur. J. Biochem. 52: 9-16). Die α-Untereinheiten
(63 kDa) enthalten die katalytische Stellen, die an der Hydroxylierung
der Prolyl-Reste beteiligt sind, und sind in der Abwe senheit der β-Untereinheiten
unlöslich.
Die β-Untereinheiten
(55 kDa), die identisch mit der Protein-Disulfid-Isomerase sind,
katalysieren ein Thiol/Disulfid-Austausch-Proteinsubstrat,
was zur Bildung einer Reihe von Disulfidbindungen führt, die
wesentlich zum Etablieren eines stabilen Proteins sind. Die β-Untereinheiten behalten
50% der Protein-Disulfid-Isomerase-Aktivität, wenn sie einen Abschnitt
des Prolyl-4-Hydroxylase-Tetramers darstellen. (Siehe z. B. Pihlajaniemi
et al. (1987) Embo J. 6: 643-649; Parkkonen et al. (1988) Biochem.
J. 256: 1005-1011 und Koivu et al. (1987) J. Biol. Chem. 262: 6447-6449).
Aktive, rekombinante humane Prolyl-4-Hydroxylase wurde in Insektenzellen
durch gleichzeitiges Exprimieren der α- und β-Untereinheiten hergestellt.
(Siehe z. B. Vuori et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:
7467-7470).
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Zusätzlich zur
Prolyl-4-Hydroxylase wurden andere posttranslationale Kollagenenzyme
identifiziert und es wurde von ihnen in der Literatur berichtet,
einschließlich
von zum Beispiel C-Proteinase, N-Proteinase, Lysyloxidase und Lysylhydroxylase.
(Siehe z. B. Olsen et al. (1991) Cell Biology of Extracellular Matrix,
2. Auflage, Hay Herausgeber, Plenum Press, New York).
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Die
Expression von vielen exogenen Genen wird einfach in einer Vielzahl
von rekombinanten Wirt-Vektor-Systemen erhalten. Die Expression
wird jedoch schwierig, wenn die endgültige Bildung des Proteins
eine umfangreiche posttranslationale Verarbeitung erfordert. Zum
Beispiel ist die Prolyl-4-Hydroxylase-Aktivität ein deutig ein wesentliches
Erfordernis für
die Hydroxylierung von kollagenartigen Domänen in der Natur. Eine Ergänzung der
Prolyl-4-Hydroxylase-Aktivität
wird in Expressionssystemen benötigt,
denen eine endogene Prolyl-4-Hydroxylase-Aktivität fehlt, um Hydroxylierungssysteme
bereitzustellen, wie sie in der Natur gefunden werden.
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Die
Erfolglosigkeit, eine verlässliche
und stabile rekombinante Expression von Genen für Kollagene zu erhalten, hat
die Herstellung von Kollagenen und Gelatinen, die eine Anzahl geeigneter
Anwendungen aufweisen, verhindert. Zusätzlich sind viele Typen des
Kollagens nur in Spurenmengen, die in Geweben vorkommen, verfügbar, und
können
nicht in wesentlichen Mengen aus diesen Quellen erhalten werden.
Des Weiteren können
nicht kollagenartige Unreinheiten nach den Extraktions- und Reinigungsverfahren
zurückbleiben
oder während
dieser eingeführt
werden.
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Zusammenfassung
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Zusammenfassend,
obwohl die Eigenschaften der kommerziell verfügbaren Tierkollagene und -gelatinen
für viele
Produkte geeignet sind, stellen die Variabilität in diesen derzeit verfügbaren Materialien
und die Schwierigkeiten, die mit dem Optimieren dieser Materialien
für eine
Verwendung in verschiedenen Anwendungen verbunden sind, wenig Flexibilität bereit.
Als Ergebnis gibt es im Stand der Technik einen Bedarf für ein effizientes
System, das es erlaubt, dass das Ausgangsmaterial auf den genetischen
und molekularen Ebenen modifiziert werden kann, wodurch das Potenzial
zum Herstellen von rekombinanten Kollagenen und Gelatinen bereitgestellt
wird, die spezifisch für
verschiedene Anwendungen und Märkte
zugeschnitten und standardisiert sind. Des Weiteren haben die bestehenden
Bedenken über
die Risiken der Immunogenität
und der Infektiösität, die mit
der Verwendung der extrahierten Materialien, die derzeit verfügbar sind,
verbunden sind, einen Bedarf für
ein reines und sicheres Ersatzmaterial geschaffen.
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Die
WO 97/04123 offenbart ein
Verfahren zum Herstellen einer Kollagenverbindung in transgenen Pflanzen.
Die Verbindung ist vorzugsweise Prokollagen oder Kollagen oder Fragmente
davon von menschlichem, tierischem oder Fisch-Ursprung. Die Verbindung kann aus der
Pflanze als Kollagen oder Gelatine gewonnen werden.
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Die
FR-A-2757874 offenbart
die Verwendung einer rekombinanten Nukleotidsequenz, die eine cDNA enthält, die
für eine
oder mehrere Säugetier-Kollagenketten
oder abgeleitete Proteine und Elemente kodiert, die es einer Pflanzenzelle
ermöglichen,
die Kollagenkette(n) oder abgeleiteten Proteine, die von der cDNA
kodiert werden, herzustellen, insbesondere ein Transkriptionspromotor
und -terminator, welcher von der Transkriptionsmaschinerie der Pflanzenzelle
identifiziert wird, zum Transformieren der Pflanzenzellen, um aus
diesen Zellen oder den aus diesen erhaltenen Pflanzen die Kollagenkette(n)
oder abgeleiteten Proteine zu erhalten. Die Erfindung betrifft auch
die sich ergebenden Proteine und das transformierte Pflanzenmaterial,
sowie ihre Verwendungen.
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ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung stellt Tierkollagene und -gelatinen und Verfahren
zum Herstellen dieser Tierkollagene und -gelatinen bereit. Daher
stellt die vorliegende Erfindung in einem Aspekt ein rekombinantes bovines
Kollagenpolypeptid bereit, das die Aminosäuresequenz SEQ ID NR: 2 umfasst.
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In
bestimmten Ausführungsformen
ist das Polypeptid einzelkettig oder homotrimer oder heterotrimer. In
einem Aspekt besteht das Polypeptid aus der Aminosäuresequenz
SEQ ID NR: 2. Eine Zusammensetzung, die das Polypeptid umfasst,
wird auch bereitgestellt.
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In
einer weiteren Ausführungsform
umfasst die vorliegende Erfindung ein isoliertes und gereinigtes Polypeptid,
das die SEQ ID NR: 2 kodiert, und ein isoliertes und gereinigtes
Polynukleotid, das komplementär zu
dem Polynukleotid ist, welches die SEQ ID NR: 2 kodiert. Zusammensetzungen,
Expressionsvektoren und Wirtszellen, die das Polynukleotid umfassen,
werden auch bereitgestellt. In verschiedenen Ausführungsformen ist
die Wirtszelle eine prokaryontische Zelle oder eine eukaryontische
Zelle, insbesondere eine Tier-, Hefe-, Pflanzen-, Insekten- oder
Pilzzelle. In einigen Ausführungsformen
stellt die vorliegende Erfindung transgene nicht-menschliche Tiere
und transgene Pflanzen bereit, die das Polynukleotid umfassen. In
einem Aspekt umfasst die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum
Herstellen eines bovinen α1(I)-Kollagens,
wobei das Verfahren das Kultivieren der Wirtszelle, welche das Polynukleotid
umfasst, unter Bedingungen umfasst, die geeignet für eine Expression
des erfindungsgemäßen Polypeptids
und ein Gewin nen des Polypeptids aus der Wirtszellkultur sind.
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Verfahren
zum Herstellen rekombinanter Tiergelatinen werden auch bereitgestellt.
In einem Aspekt umfasst das Verfahren das Bereitstellen der erfindungsgemäßen rekombinanten
bovinen Kollagenpolypeptide und das Ableiten der rekombinanten Tiergelatine
davon. In einem anderen Aspekt umfasst das Verfahren das Herstellen
rekombinanter Tiergelatine direkt aus einem Polynukleotid, das die
SEQ ID NR: 2 kodiert.
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KURZBESCHREIBUNG DER FIGUREN
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Die 1A, 1B und 1C zeigen
eine Nukleinsäuresequenz
(SEQ ID NR: 1), die ein bovines α1(I)-Kollagen
kodiert.
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Die 2A, 2B, 2C und 2D zeigen
die Aminosäuresequenz
(SEQ ID NR: 2) eines bovinen α1(I)-Kollagens.
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Die 3A, 3B, 3C, 3D, 3E, 3F, 3G, 3H und 3I zeigen
die übersetzten
bovinen α1(I)-Kollagensequenzen
des offenen Leserahmens, die an bekannten humanen (HU), Maus-(MUS),
Hunde-(CANIS), Ochsenfrosch-(RANA) und Japanischen Molch-(CYNPS)Kollagensequenzen ausgerichtet
sind.
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DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
DER ERFINDUNG
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Bevor
die erfindungsgemäßen Proteine,
Nukleotidsequenzen und Verfahren beschrieben werden, wird es verstanden,
dass diese Erfindung nicht auf die besondere Methodik, die Protokolle,
die Zelllinien, die Vektoren und die Reagenzien, die beschrieben
werden, beschränkt
ist, da diese variieren können.
Es soll auch verstanden werden, dass die hier verwendete Terminologie
nur für
den Zweck des Beschreibens der besonderen Ausführungsformen ist und nicht
beabsichtigt, den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung zu beschränken.
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Es
muss erwähnt
werden, dass, so wie hier und in den beigefügten Ansprüchen verwendet, die Singularformen "einer", "eine", "eines" und "der", "die", "das" Plu ralbezüge einschließen, wenn
es der Zusammenhang nicht eindeutig anders vorgibt. Daher ist zum
Beispiel eine Bezugnahme auf "eine
Wirtszelle" eine
Bezugnahme auf eine oder mehrere solche/r Wirtszelle/n und Äquivalente
davon, die dem Fachmann bekannt sind, und eine Bezugnahme auf "einen Antikörper" ist eine Bezugnahme
auf einen oder mehrere Antikörper und Äquivalente
davon, die dem Fachmann bekannt sind, und so weiter.
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Wenn
es nicht anders definiert wird, weisen alle hier verwendeten technischen
und wissenschaftlichen Begriffe die Bedeutungen auf, wie sie der
Fachmann gängigerweise
versteht, den die Erfindung betrifft. Obwohl irgendwelche Verfahren
und Materialien, die ähnlich
oder gleich zu jenen sind, die hier beschrieben werden, bei der
Ausführung
oder dem Überprüfen der
vorliegenden Erfindung verwendet werden können, werden die bevorzugten
Verfahren, Geräte
und Materialien nun beschrieben. Alle hier erwähnten Veröffentlichungen sind für den Zweck
des Beschreibens und Offenbarens der Zelllinien, Vektoren und Methodiken,
usw., welche in den Veröffentlichungen
erwähnt
werden, die in Verbindung mit der Erfindung verwendet werden könnten. Nichts
des hier Erwähnten
darf als ein Eingeständnis
ausgelegt werden, dass die Erfindung nicht berechtigt ist, eine
solche Offenbarung aufgrund der vorausgehenden Erfindung vorwegzunehmen.
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Die
Ausführung
der vorliegenden Erfindung wird, wenn es nicht anders angegeben
ist, gängige
Verfahren der Chemie, Biochemie, Molekularbiologie, Immunologie
und Pharmakologie innerhalb des Standes der Technik einsetzen. Solche
Techniken sind vollständig
in der Literatur erklärt.
Siehe z. B. Gennaro, A.R., Hrsg. (1990) Remington's Pharmaceutical
Sciences, 18. Aufl., Mack Publishing Co.; Colowick, S. et al., Hrsg.,
Methods in Enzymology, Academic Press, Inc.; Handbook of Experimental
Immunology, Band I–IV
(D.M. Weir und C.C. Blackwell, Hrsg., 1986, Blackwell Scientific
Publications); Maniatis, T. et al., Hrsg. (1989), Molecular Cloning:
A Laborstory Manual, 2. Auflage, Band I–III, Cold Spring Harbor Laborstory
Press; Ausubel, F. M. et al., Hrsg. (1999) Short Protocols in Molecular
Biology, 4. Auflage, John Wiley & Sons;
Ream et al., Hrsg. (1998) Molecular Biology Tech niques: An Intensive
Laborstory Course, Academic Press); PCR (Introduction to Biotechniques
Series), 2. Aufl. (Newton & Graham
Hrsg., 1997, Springer Verlag).
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DEFINITIONEN
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Der
Begriff "Kollagen" betrifft irgendeinen
der bekannten Kolllagentypen, einschließlich der Kollagentypen I bis
XX, so wie irgendwelche anderen Kollagene, ob natürlich, synthetisch,
semisynthetisch oder rekombinant. Der Begriff umfasst auch Prokollagene.
Der Begriff Kollagen umfasst irgendein einzelkettiges Polypeptid,
das durch ein einzelnes Polynukleotid kodiert wird, sowie homotrimere
und heterotrimere Anordnungen von Kollagenketten. Der Begriff "Kollagen" umfasst insbesondere
Varianten und Fragmente davon und funktionelle Äquivalente und Derivate davon,
welche vorzugsweise mindestens eine strukturelle oder funktionelle
Eigenschaft des Kollagens behalten, zum Beispiel eine (Gly-X-Y)n-Domäne.
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So
betrifft zum Beispiel der Begriff "bovines α1(I)-Kollagen" ein einzelkettiges
bovines α1(I)-Kollagen, das
durch eine einzelne Polynukleotidsequenz kodiert wird, und irgendein
entsprechendes Prokollagen oder irgendein Fragment, eine Variante,
ein funktionelles Äquivalent
oder ein Derivat davon. Der Begriff "bovines Typ I-Kollagen" betrifft ein homotrimeres oder heterotrimers
Kollagen, das bovine Typ I-Kollagenketten
umfasst, und irgendein entsprechendes Prokollagen oder irgendein
Fragment, eine Variante, ein funktionelles Äquivalent oder ein Derivat
davon.
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Der
Begriff "Prokollagen" betrifft ein Prokollagen,
das irgendeinem der Kollagentypen I bis XX entspricht, sowie ein
Prokollagen, das irgendwelchen anderen Kollagenen entspricht, ob
natürlich,
synthetisch, semisynthetisch oder rekombinant, das zusätzliche
C-terminale und/oder N-terminale Propeptide oder Telopeptide besitzt,
die bei der trimeren Anordnung, der Löslichkeit, der Reinigung oder
irgendeiner anderen Funktion behilflich sind, und die anschließend nachfolgend
durch eine N-Proteinase,
C-Proteinase oder andere Enzyme, z. B. proteolytische Enzyme, die
mit der Kollagenherstellung verbunden sind, gespalten werden. Der
Begriff Prokollagen umfasst insbesondere Varianten und Fragmente
davon und funktionelle Ä quivalente
und Derivate davon, welche vorzugsweise mindestens eine strukturelle
oder funktionelle Eigenschaft des Kollagens behalten, zum Beispiel
eine (Gly-X-Y)„-Domäne.
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Der
Begriff "bovines α1(I)" betrifft ein bovines α1(I)-Kollagen
oder funktionelles Äquivalent
davon und Fragmente und Varianten davon und Polynukleotide, die
solche Polypeptide aus irgendeiner Quelle, ob natürlich, synthetisch,
semisynthetisch oder rekombinant, kodieren.
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So
wie es hier verwendet wird, betrifft "Gelatine" irgendeine Gelatine, ob durch traditionelle
Verfahren extrahiert oder rekombinanten oder biosynthetischen Ursprungs
oder irgendein Molekül,
das mindestens eine strukturelle und/oder funktionelle Eigenschaft
der Gelatine aufweist. Gelatine wird derzeit durch Extraktion aus Kollagen
erhalten, das aus tierischen (z. B. Rinder-, Schweine-, Nagetier-,
Weiner-, Pferde-, Fisch-)Quellen abgeleitet wurde, z. B. aus Knochen
und Geweben. Der Begriff Gelatine umfasst sowohl die Zusammensetzung
von mehr als einem Polypeptid, das in einem Gelatineprodukt eingeschlossen
ist, als auch ein einzelnes Polypeptid, was zu dem Gelatinematerial
beiträgt.
Daher umfasst der Begriff rekombinante Gelatine, so wie er unter
Bezugnahme auf die vorliegende Erfindung verwendet wird, sowohl
ein rekombinantes Gelatinematerial, das die erfindungsgemäßen Gelatinepolypeptide
umfasst, als auch ein einzelnes erfindungsgemäßes Gelatinepolypeptid.
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Polypeptide,
von denen Gelatine abgeleitet werden kann, stellen Polypeptide,
wie Kollagene, Prokollagene und andere Polypeptide dar, die mindestens
eine strukturelle und/oder funktionelle Eigenschaft des Kollagens
aufweisen. Ein solches Polypeptid könnte eine einzelne Kollagenkette
oder ein Kollagen-Homotrimer oder -Heterotrimer oder irgendwelche
Fragmente, Derivate, Oligomere, Polymere oder Untereinheiten davon
enthalten, die mindestens eine kollagenartige Domäne (eine
Gly-X-Y-Region) enthalten. Der Begriff umfasst insbesondere gentechnisch
hergestellte Sequenzen, die nicht in der Natur gefunden werden,
wie veränderte
Kollagenkonstrukte, usw. Ein verändertes
Kollagenkonstrukt ist ein Polynukleotid, das eine Sequenz umfasst,
die durch Deletionen, Additionen, Substitutionen oder andere Änderungen
aus dem natürlich
vorkommenden Kollagengen verändert
wurde.
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Ein "Adjuvans" ist irgendein Mittel,
das zu einem Arzneimittel oder Impfstoff hinzugefügt wird,
um seine Wirkung zu verstärken,
zu verbessern oder in einer anderen Weise zu unterstützen. Ein
Adjuvans, das in einer Impfstoffformulierung verwendet wird, könnte ein
immunologisches Mittel sein, das die Immunantwort durch Herstellen
eines nicht spezifischen Stimulators der Immunantwort verbessert.
Adjuvantien werden häufig
in Totimpfstoffen verwendet.
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Die
Begriffe "Allel" oder "Allelsequenz" betreffen alternative
Formen von genetischen Sequenzen. Allele können sich aus mindestens einer
Mutation in der Nukleinsäuresequenz
ergeben und können
zu veränderten
mRNAs oder Polypeptiden führen,
deren Struktur oder Funktion verändert
sein kann oder nicht. Irgendein gegebenes natürliches oder rekombinantes
Gen kann keine, eine oder viele Allelformen aufweisen. Gängige Mutationsänderungen,
welche zu Allelen führen,
werden im Allgemeinen natürlichen
Deletionen, Additionen oder Substitutionen von Nukleotiden zugeschrieben.
Jeder dieser Typen der Änderungen
kann alleine oder in Verbindung mit den anderen, einmal oder mehrmals
in einer gegebenen Sequenz auftreten.
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"Veränderte" Polynukleotidsequenzen
schließen
jene mit Deletionen, Insertionen oder Substitutionen von verschiedenen
Nukleotiden ein, welche zu einem Polynukleotid führen, das dasselbe oder ein
funktionell äquivalentes
Polypeptid kodiert. Eingeschlossen in diese Definition sind Sequenzen,
die Polymorphismen aufweisen, die einfach nachweisbar sind oder
nicht, unter Verwendung besonderer Oligonukleotidsonden oder durch
die Deletion einer ungenauen oder unerwarteten Hybridisierung an
Allele, mit einem Ort, der nicht der normale chromosomale Ort für die Polynukleotidsequenz
der Sache ist.
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"Veränderte" Polypeptide können Deletionen,
Insertionen oder Substitutionen von Aminosäureresten enthalten, die eine
stille Änderung
erzeugen und zu einem funktionell äquivalenten Polypeptid führen. Absichtliche
Aminosäuresubstitutionen
können
auf der Grundlage der Ähnlichkeit
in der Polarität,
Ladung, Löslichkeit, Hydrophobizität, Hydrophilizität und/oder
der amphipathischen Natur der Reste vorgenommen werden, solange
die biologische oder immunologische Aktivität des kodierten Polypeptids
beibehalten wird. Zum Beispiel können
negativ geladene Aminosäuren
Asparaginsäure
und Glutaminsäure
einschließen,
positiv geladene Aminosäuren
können
Lysin und Arginin einschließen,
und Aminosäuren
mit ungeladenen polaren Kopfgruppen, die ähnliche Hydrophilizitätswerte
aufweisen, können
Leucin, Isoleucin und Valin, Glycin und Alanin, Asparagin und Glutamin,
Serin und Threonin und Phenylalanin und Tyrosin einschließen.
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"Aminosäure-" oder "Polypeptid-"Sequenzen oder "Polypeptide" betreffen, so wie
diese Begriffe hier verwende werden, Oligopeptid-, Peptid-, Polypeptid-
oder Proteinsequenzen und Fragmente davon und natürlich vorkommende
oder synthetische Moleküle.
Polypeptid- oder Aminosäurefragmente
stellen irgendeinen Abschnitt eines Polypeptids dar, der mindestens
eine strukturelle und/oder funktionelle Eigenschaft des Polypeptids
beibehält.
In mindestens einer Ausführungsform
sind Polypeptidfragmente jene, welche mindestens eine (Gly-X-Y)n-Region
beibehalten.
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Der
Begriff "Tier", so wie er unter
Bezugnahme auf zum Beispiel "Tierkollagene" verwendet wird,
umfasst irgendwelche Kollagene, ob natürlich, synthetisch, semisynthetisch
oder rekombinant. Tierquellen schließen zum Beispiel Säugetierquellen
ein, einschließlich,
aber nicht beschränkt
auf Rinder-, Schweine-, Pferde-, Nagetier- und Schafsquellen, und
andere Tierquellen, einschließlich,
aber nicht beschränkt
auf Hühner-
und Fischquellen, und Nicht-Wirbeltierquellen.
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"Antigenizität" betrifft die Fähigkeit
einer Substanz, wenn sie in den Körper eingeführt wird, die Immunantwort
und die Herstellung eines Antikörpers
zu stimulieren. Ein Mittel, welches die Eigenschaft der Antigenizität aufweist,
wird als antigen be zeichnet. Antigene Mittel können eine Vielzahl von Makromolekülen einschließen, wie
zum Beispiel Proteine, Lipoproteine, Polysaccharide, Nukleinsäuren, Bakterien
und bakterielle Bestandteile und Viren und virale Bestandteile,
sind aber nicht darauf beschränkt.
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Die
Begriffe "komplementär" oder "Komplementarität", so wie sie hier
verwendet werden, betreffen die natürliche Bindung von Polynukleotiden
durch Rasenpaarung. Zum Beispiel bindet die Sequenz "A-G-T" an die komplementäre Sequenz "T-C-A". Eine Komplementarität zwischen
zwei einzelsträngigen
Molekülen
kann "teilweise" sein, wenn nur einige
der Nukleinsäuren
binden, oder kann vollständig
sein, wenn eine vollständige Komplementarität zwischen
den einzelsträngigen
Molekülen
auftritt. Der Grad der Komplementarität zwischen Nukleinsäuresträngen weist
erhebliche Wirkungen auf die Effizienz und die Stärke der
Hybridisierung zwischen Nukleinsäuresträngen auf.
Dies ist von besonderer Wichtigkeit für Amplifikationsreaktionen,
die auf der Bindung zwischen Nukleinsäuresträngen beruhen und für das Design
und die Verwendung von zum Beispiel Peptidnukleinsäure (PNA,
für engl.:
peptide nucleic acid)-Molekülen.
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Eine "Deletion" stellt eine Änderung
in einer Aminosäure-
oder Nukleotidsequenz dar, die zur Abwesenheit von einem oder mehreren
Aminosäureresten
oder Nukleotiden führt.
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Der
Begriff "Derivat", betrifft, wenn
er auf Polynukleotide angewendet wird, die chemische Modifikation eines
Polynukleotids, das ein besonderes Polypeptid kodiert oder das komplementär zu einem
Polynukleotid ist, das ein besonderes Polypeptid kodiert. Solche
Modifikationen schließen
zum Beispiel das Ersetzen eines Wasserstoffs durch eine Alkyl-,
Acyl- oder Aminogruppe ein. So wie hier in Bezug auf Polypeptide
verwendet wird, betrifft der Begriff "Derivat" ein Polypeptid, das zum Beispiel durch
Hydroxylierung, Glykosylierung, Pegylierung oder durch irgendein ähnliches
Verfahren modifiziert ist. Der Begriff "Derivate" umfasst jene Moleküle, die mindestens eine strukturelle
und/oder funktionelle Eigenschaft des Moleküls umfassen, von welchem es
abgeleitet ist.
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Ein
Molekül
wird "chemisches
Derivat" eines anderen
Moleküls
genannt, wenn es zusätzliche
chemische Reste enthält,
die normalerweise nicht Teil des Moleküls darstellen. Solche Reste
können
die Löslichkeit, Absorption,
biologische Halbwertszeit und desgleichen des Moleküls verbessern.
Die Reste können
alternativ die Toxizität
des Moleküls
vermindern, irgendwelche unerwünschten
Nebenwirkungen des Moleküls
beseitigen oder abschwächen
und desgleichen. Reste, die in der Lage sind, solche Wirkungen zu
vermitteln, sind allgemein im Stand der Technik verfügbar und
können
zum Beispiel in Remington's
Pharmaceutical Sciences, supra gefunden werden. Verfahren zum Koppeln
solcher Reste an ein Molekül
sind im Stand der Technik gut bekannt.
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Ein "Bindemittel", so wie der Begriff
hier verwendet wird, stellt irgendeine inerte Substanz dar, die
als Verdünnungsmittel
oder Träger
in der Formulierung eines Arzneimittels, eines Impfstoffes oder
einer anderen pharmazeutischen Zusammensetzung verwendet wird, um
dem Arzneimittel, dem Impfstoff oder der pharmazeutischen Zusammensetzung
eine geeignete Konsistenz oder Form zu verleihen.
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Der
Begriff "funktionelles Äquivalent", so wie er hier
verwendet wird, betrifft ein Polypeptid oder Polynukleotid, das
mindestens eine funktionelle und/oder strukturelle Eigenschaft eines
besonderen Polypeptids oder Polynukleotids besitzt. Ein funktionelles Äquivalent
kann Modifikationen enthalten, die das Durchführen einer besonderen Funktion
ermöglichen.
Der Begriff "funktionelles Äquivalent" beabsichtigt, Fragmente,
Mutanten, Hybride, Varianten, Analoge oder chemische Derivate eines
Moleküls
einzuschließen.
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Ein "Fusionsprotein" stellt ein Protein
dar, in dem Peptidsequenzen aus verschiedenen Proteinen funktionsfähig verbunden
sind.
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Der
Begriff "Hybridisierung" betrifft das Verfahren,
durch welches eine Nukleinsäuresequenz
an eine komplementäre
Sequenz über
eine Basenpaarung bindet. Hy bridisierungsbedingungen können zum
Beispiel durch die Konzentrationen von Salz oder Formamid in den
Prähybridisierungs-
und Hybridisierungslösungen oder
durch die Hybridisierungstemperatur definiert werden, und sind im
Stand der Technik gut bekannt. Eine Hybridisierung kann unter Bedingungen
verschiedener Stringenz stattfinden.
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Insbesondere
kann die Stringenz durch Reduzieren der Salzkonzentration, Erhöhen der
Formamidkonzentration oder Erhöhen
der Hybridisierungstemperatur verstärkt werden. Für die Zwecke
der vorliegenden Erfindung tritt zum Beispiel eine Hybridisierung
unter Bedingungen hoher Stringenz in ungefähr 50% Formamid bei ungefähr 37°C bis 42°C auf und
unter Bedingungen reduzierter Stringenz in ungefähr 35% bis 25% Formamid bei
ungefähr
30°C bis
35°C. Insbesondere
tritt eine Hybridisierung unter Bedingungen der höchsten Stringenz
bei 42°C
in 50% Formamid, 5 × SSPE,
0,3% SDS und 200 μg/ml
gescherter und denaturierter Lachsspermien-DNA auf.
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Der
Temperaturbereich, der einem besonderen Grad der Stringenz entspricht,
kann weiterhin durch im Stand der Technik bekannte Verfahren eingeengt
werden, zum Beispiel durch Berechnen des Purin zu Pyrimidin Verhältnisses
der Nukleinsäure
von Interesse und entsprechendes Anpassen der Temperatur. Um nicht spezifische
Signale zu entfernen, können
Blots aufeinanderfolgend gewaschen werden, zum Beispiel bei Raumtemperatur
unter zunehmend stringenten Bedingungen von bis zu 0,1 × SSC und
0,5% SDS. Variationen der oben genannten Bereiche und Bedingungen
sind im Stand der Technik gut bekannt.
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"Immunogenität" bezeichnet die Fähigkeit,
eine Immunantwort in einem Organismus hervorzurufen. Ein Mittel,
das die Eigenschaft der Immunogenität aufweist, wird als immunogen
bezeichnet. Die Mittel können eine
Vielzahl von Makromolekülen
einschließen,
wie zum Beispiel Proteine, Lipoproteine, Polysaccharide, Nukleinsäuren, Bakterien
und bakterielle Bestandteile und Viren und virale Bestandteile,
sind aber nicht darauf beschränkt.
Immunogene Mittel weisen häufig
ein recht hohes Molekulargewicht auf (üblicherweise größer als 10
kDa).
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"Infektiösität" betrifft die Fähigkeit,
infektiös
zu sein, oder die Fähigkeit,
eine Infektion herzustellen, bezüglich
der Invasion und Vervielfältigung
von Mikroorganismen, wie Bakterien oder Viren innerhalb des Körpers.
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Die
Begriffe "Insertion" oder "Addition" betreffen eine Änderung
in einer Polypeptid- oder Polynukleotidsequenz, die zu der Addition
von jeweils einem oder mehreren Aminosäureresten oder Nukleotiden
führt, verglichen
mit dem natürlich
vorkommenden Molekül.
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Der
Begriff "isoliert", so wie er hier
verwendet wird, betrifft ein Molekül, das nicht nur von Proteinen, usw.
getrennt ist, die in der natürlichen
Quelle des Proteins anwesend sind, sondern auch von anderen Bestandteilen
im Allgemeinen, und betrifft vorzugsweise ein Molekül, das in
der Anwesenheit von, wenn überhaupt,
nur einem Lösungsmittel,
Puffer, Ion oder einem anderen Bestandteil, der normalerweise in
einer Lösung
desselben vorhanden ist, gefunden wird. So wie hier verwendet, umfassen
die Begriffe "isoliert" und "gereinigt" keine Moleküle, die
in ihrer natürlichen
Quelle anwesend sind.
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Der
Begriff "Mikroarray" bezeichnet irgendeine
Anordnung von Nukleinsäuren,
Aminosäuren,
Antikörpern,
usw. auf einem Substrat. Das Substrat kann irgendein geeigneter
Träger
sein, z. B. Kügelchen,
Glas, Papier, Nitrozellulose, Nylon oder irgendeine geeignete Membran,
usw. Ein Substrat kann irgendein starrer oder semistarrer Träger sein,
einschließlich
Membranen, Filtern, Scheiben, Chips, Objektträgern, Fasern, Kügelchen,
einschließlich
magnetischen oder nicht magnetischen Kügelchen, Gelen, Röhren, Platten,
Polymeren, Mikropartikeln, Kapillaren, usw., ist aber nicht darauf
beschränkt.
Das Substrat kann eine Oberfläche
zum Beschichten bereitstellen und/oder kann eine Vielzahl von Oberflächenformen
aufweisen, wie Vertiefungen, Dornen, Rinnen, Kanäle und Poren, an die die Nukleinsäuren, Aminosäuren, usw.
gebunden werden können.
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Der
Begriff "Mikroorganismus" kann Viren, Bakterien,
Chlamydien, Rickettien, Mykoplasmen, Ureaplasmen, Pilze und Parasiten,
einschließlich
infektiösen
Parasiten, wie Protozoen, einschließen, ist aber nicht darauf
beschränkt.
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Die
Begriffe "Nukleinsäure-" oder "Polynukleotid-"Sequenzen oder "Polynukleotide" betreffen Oligonukleotide,
Nukleotide oder Polynukleotide oder irgendwelche Fragmente davon
und DNA oder RNA natürlichen oder
synthetischen Ursprungs, die einzel- oder doppelsträngig sein
kann und den Sense- oder Antisense-Strang darstellen kann, Peptidnukleinsäure (PNA)
oder irgendein DNA-ähnliches
oder RNA-ähnliches
Material natürlichen
oder synthetischen Ursprungs. Polynukleotidfragmente stellen irgendeinen
Abschnitt einer Polynukleotidsequenz dar, die mindestens eine strukturelle
oder funktionelle Eigenschaft des Polynukleotids beibehält. In einer
Ausführungsform
sind Polynukleotidfragmente jene, welche mindestens eine (Gly-X-Y)n-Region kodieren. Polynukleotidfragmente
können
von Variabler Länge
sein, zum Beispiel größer als
60 Nukleotide lang, mindestens 100 Nukleotide lang, mindestens 1000
Nukleotide lang oder mindestens 10.000 Nukleotide lang.
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Der
Ausdruck "Prozent Ähnlichkeit" (% Ähnlichkeit)
betrifft den prozentualen Anteil der Sequenzähnlichkeit, die in einem Vergleich
von zwei oder mehr Polypeptid- oder
Polynukleotidsequenzen gefunden wird. Prozent Ähnlichkeit kann durch Verfahren
bestimmt werden, die im Stand der Technik gut bekannt sind. Zum Beispiel
kann die Prozent Ähnlichkeit
zwischen Aminosäuresequenzen
unter Verwendung des Clustal-Verfahrens berechnet werden. (Siehe
z. B. Higgins, D. G. und P. M. Sharp (1988) Gene 73: 237-244). Der
Clustal-Algorithmus gruppiert Sequenzen durch Überprüfen der Distanzen zwischen
allen Paaren in Kluster. Die Kluster werden paarweise ausgerichtet
und anschließend
in Gruppen. Die prozentuale Ähnlichkeit
zwischen zwei Aminosäuresequenzen,
z. B. Sequenz A und Sequenz B, wird durch Teilen der Länge von
Sequenz A, minus der Anzahl der Lückenreste in Sequenz A, minus
der Anzahl der Lückenreste
in Sequenz B, durch die Summe der Trefferreste zwischen der Sequenz
A und der Sequenz B mal Einhundert berechnet. Lücken mit niedriger oder keiner
Homologie zwischen den zwei Amino säuresequenzen werden nicht in
das Bestimmen der prozentualen Ähnlichkeit
eingeschlossen. Die Prozent Ähnlichkeit
kann durch andere Verfahren, die im Stand der Technik bekannt sind,
berechnet werden, zum Beispiel durch Variieren der Hybridisierungsbedingungen,
und kann elektronisch unter Verwendung von Programmen wie dem MEGALIGN-Programm
(DNASTAR Inc., Madison, Wisconsin) berechnet werden.
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So
wie hier verwendet, schließt
der Begriff "Pflanze" die Bezugname auf
eine oder mehrere Pflanzen ein, d. h. irgendwelche eurkaryontischen
autotrophen Organismen, wie Angiospermen und Gymnospermen, Monokotyledonen
und Dikotyledonen, usw., einschließlich Sojabohne, Baumwolle,
Alfalfa, Flachs, Tomate, Zucker, Rübe, Sonnenblume, Kartoffel,
Tabak, Mais, Weizen, Reis, Salat, Banane, Maniok, Öldistel, Ölsaat, Rübsamen,
Senf, Raps, Hanf, Algen, Seetang, usw., ist aber nicht darauf beschränkt. Der
Begriff "Pflanze" umfasst auch eine
oder mehrere Pflanzenzellen. Der Begriff "Pflanzenzellen" schließt vegetative Gewebe und Organe, wie
Samen, Suspensionskulturen, Embryonen, meristematische Regionen,
Callusgewebe, Blätter,
Wurzeln, Triebe, Gametophyten, Sporophyten, Pollen, Knollen, Wurzelknollen,
Zwiebeln, Blüten,
Früchte,
Zapfen, Mikrosporen, usw. ein, ist aber nicht darauf beschränkt.
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Der
Begriff "posttranslationales
Enzym" betrifft
irgendein Enzym, das eine posttranslationale Modifikation von zum
Beispiel irgendeinem Kollagen oder Prokollagen katalysiert. Der
Begriff umfasst zum Beispiel Prolylhydroxylase, Peptidylprolylisomerase,
Kollagen-Galactosylhydroxylysyl-Glucsoyltransferase, Hydroxylysylgalactosyltransferase,
C-Proteinase, N-Proteinase, Lysylhydroxylase und Lysyloxidase, ist
aber nicht darauf beschränkt.
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So
wie hier verwendet, betrifft der Begriff "Promotor" im Allgemeinen eine regulatorische
Region einer Nukleinsäuresequenz,
die in der Lage ist, die Transkription einer Polynukleotidsequenz
auszulösen,
zu steuern und zu vermitteln. Promotoren können zusätzlich Erkennungssequenzen
umfassen, wie strangaufwärts
oder strangabwärts
gelegene Promotorelemente, welche die Transkriptionsgeschwindigkeit
beeinflussen können.
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Der
Begriff "nicht konstitutive
Promotoren" betrifft
Promotoren, die die Transkription über ein spezifisches Gewebe
induzieren, oder in anderer Weise unter Umgebungs- oder Entwicklungskontrollen
stehen, und schließt
reprimierbare und induzierbare Promotoren, wie gewebebevorzugte,
gewebespezifische und zelltypspezifische Promotoren ein. Solche
Promotoren schließen
den AdH1-Promotor, der durch Hypoxie oder Kältestress induzierbar ist,
den Hsp70-Promotor, der durch Hitzestress induzierbar ist, und den
PPDK-Promotor, der durch Licht induzierbar ist, ein.
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Promotoren,
die "gewebebevorzugt" sind, sind Promotoren,
die vorzugsweise die Transkription in bestimmten Geweben auslösen. Promotoren,
die "gewebespezifisch" sind, sind Promotoren,
die die Transkription nur in bestimmten Geweben auslösen. "Zelltypspezifische" Promotoren sind
Promotoren, die die Expression hauptsächlich in bestimmten Zelltypen
in mindestens einem Organ, zum Beispiel in Gefäßzellen, antreiben.
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"Induzierbare" oder "reprimierbare" Promotoren sind
jene unter der Kontrolle der Umgebung, sodass die Transkription
bewirkt wird, zum Beispiel durch eine Umgebungsbedingung, wie anaerobe
Bedingungen, die Anwesenheit von Licht, biotischer Stress, usw.
oder in Antwort auf interne, chemische oder biologische Signale,
z. B. Glyceraldehydphosphatdehydrogenase, AOX1- und AOX2-Methanol
induzierbare Promotoren oder auf physikalische Beschädigung.
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So
wie hier verwendet, beftrifft der Begriff "konstitutive Promotoren" Promotoren, die
die Transkription auslösen,
steuern oder vermitteln, und die unter den meisten Umgebungsbedingungen
und Entwicklungszuständen
oder Zelldifferenzierungszuständen
aktiv sind. Beispiele für
konstitutive Promotoren schließen
den Blumenkohl-Mosaikvirus (CaMv) 35S, den 1'- oder 2'-Promotor, der von T-DNA aus Agrobacterium
tumefaciens abgeleitet ist, den Ubiquitin-1-Promotor, den Smas- Promotor, den Zimtalkoholdehydrogenase-Promotor, den
Glyceraldehyddehydrogenase-Promotor und den Nos-Promotor, usw. ein,
sind aber nicht darauf beschränkt.
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Der
Begriff "gereinigt", so wie er hier
verwendet wird, bezeichnet, dass das angegebene Molekül in der substanziellen
Abwesenheit von anderen biologischen Makromolekülen, z. B. Polynukleotiden,
Proteinen und desgleichen, vorliegt. Der Begriff bedeutet vorzugsweise,
dass das Molekül
von Interesse in einer Lösung
oder Zusammensetzung mit mindestens 80 Gew.-%, vorzugsweise mindestens
85 Gew.-%, weiter bevorzugt mindestens 95 Gew.-% und am meisten
bevorzugt mit mindestens 99,8 Gew.-% vorliegt. Wasser, Puffer und
andere kleine Moleküle,
insbesondere Moleküle,
die ein Molekulargewicht von weniger als ungefähr einem kDa aufweisen, können anwesend
sein.
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Der
Begriff "im Wesentlichen
gereinigt", so wie
er hier verwendet wird, betrifft Nuklein- oder Aminosäuresequenzen,
welche aus ihrer natürlichen
Umgebung entfernt, isoliert oder getrennt werden, und mindestens 60%
frei, vorzugsweise 75% frei und am meisten bevorzugt 90% frei von
anderen Bestandteilen sind, mit welchen sie natürlich assoziiert sind.
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Eine "Substitution" ist das Ersetzen
von einer/m oder mehreren Aminosäure/n
oder Nukleotid/en durch jeweils unterschiedliche Aminosäuren oder
Nukleotide.
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Der
Begriff "Transfektion", so wie er hier
verwendet wird, betrifft das Verfahren des Einführens eines Expressionsvektors
in eine Zelle. Verschiedene Transfektionstechniken sind im Stand
der Technik bekannt, zum Beispiel Mikroinjektion, Lipofektion oder
die Verwendung einer Genpistole.
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"Transformation", so wie es hier
verwendet wird, beschreibt ein Verfahren, durch welches exogene
Nukleinsäuresequenzen,
z. B. DNA, in eine Empfängerzelle
eindringen und sie verändern.
Eine Transformation kann unter natürlichen oder künstlichen
Bedingungen unter Verwendung verschiedener Verfahren, die im Stand
der Technik gut bekannt sind, stattfinden. Eine Transformation kann
auf irgendeinem bekannten Verfahren für die Insertion von fremden
Nukleinsäuresequenzen
in eine prokaryontische oder eukaryontische Wirtszelle beruhen.
Das Verfahren wird basierend auf dem Typ der Wirtszelle, die transformiert
werden soll, ausgewählt
und kann virale Infektion, Elektroporation, Hitzeschock, Lipofektion
und Teilchenbeschuss einschließen, ist
aber nicht darauf beschränkt.
Solche "transformierten" Zellen schließen stabil
transformierte Zellen ein, in welchen die inserierte DNA in der
Lage zur Replikation ist, entweder als ein sich autonom replizierendes
Plasmid oder als Teil des Wirtschromosoms, und schließt auch
Zellen ein, welche die inserierte Nukleinsäure vorübergehend für begrenzte Zeiträume exprimieren.
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So
wie hier verwendet, betrifft der Begriff "Impfstoff" eine Präparation aus abgetöteten oder
modifizierten Mikroorganismen, lebenden, attenuierten Organismen
oder lebenden, voll virulenten Organismen oder irgendein anderes
Mittel, einschließlich,
aber nicht beschränkt
auf Peptide, Proteine, biologische Makromoleküle oder Nukleinsäuren, natürlich, synthetisch
oder semisynthetisch, welches verabreicht wird, um eine Immunität gegenüber einer
bestimmten Erkrankung herzustellen oder künstlich anzuheben, um eine
zukünftige
Infektion mit einer ähnlichen
Einheit zu verhindern. Impfstoffe können lebende oder inaktivierte
Mikroorganismen oder Mittel, einschließlich Viren und Bakterien,
sowie eine Untereinheit, synthetisch, semisynthetisch oder auf rekombinanter
DNA basierend, darstellen.
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Impfstoffe
können
monovalent sein (ein einzelner Linien-/Mikroorganismus/Erkrankungs-Impfstoff), bestehend
aus einem Mikroorganismus oder Mittel (z. B. Poliovirus-Impfstoff)
oder aus den Antigenen von einem Mikroorganismus oder Mittel. Impfstoffe
können
auch multivalent sein, z. B. divalent, trivalent, usw. (ein kombinierter
Impfstoff), bestehend aus mehr als einem Mikroorganismus oder Mittel
(z. B. ein Masern-Mumps-Röteln-(MMR)-Impfstoff)
oder aus den Antigenen von mehr als einem Mikroorganismus oder Mittel.
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Lebendimpfstoffe
werden aus lebenden Mikroorganismen hergestellt. Attenuierte Impfstoffe
sind Lebendimpfstoffe, die aus Mikroorganismen hergesellt werden,
welche eine physikalische Veränderung
(wie eine Bestrahlung oder eine Temperaturbehandlung) oder eine
fortlaufende Passage in Labortierwirten oder in infizierten Gewebe-/Zellkulturen
durchlaufen haben, wobei solche Behandlungen avirulente Linien herstellen
oder Linien mit reduzierter Virulenz, die aber die Fähigkeit
beibehalten, eine schützende
Immunität
zu induzieren. Beispiele für
lebend attenuierte Impfstoffe schließen Masern, Mumps, Röteln und
Hundestaupe ein. inaktivierte Impfstoffe sind Impfstoffe, in welchen
die infektiösen
mikrobiellen Bestandteile zerstört
wurden, z. B. durch eine chemische oder physikalische Behandlung
(wie Formalin, Beta-Propiolacton oder Gammastrahlen), ohne die Antigenizität oder Immunogenität der viralen
Hülle oder
der äußeren Membranproteine
des Bakteriums zu beeinflussen. Beispiele für inaktivierte oder Untereinheit-Impfstoffe
schließen
Influenza-, Hepatitis A- und Poliomyelitis-(IPV)Impfstoffe ein.
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Untereinheit-Impfstoffe
sind aus Schlüsselmakromolekülen aus
z. B. dem viralen, bakteriellen oder einem anderen Mittel, welches
für das
Auslösen
einer Immunantwort verantwortlich ist, aufgebaut. Diese Bestandteile
können
in einer Anzahl von Wegen erhalten werden, zum Beispiel durch Reinigung
aus Mikroorganismen, Erzeugen unter Verwendung rekombinanter DNA-Technologie,
usw. Untereinheit-Impfstoffe
können synthetische
Mimetika von irgendeinem infektiösen
Mittel enthalten. Untereinheit-Impfstoffe können Makromoleküle, wie
bakterielle Proteintoxine (z. B. Tetanus, Diphtherie), virale Proteine
(z. B. aus dem Influenzavirus), Polysaccharide aus eingekapselten
Bakterien (z. B. aus Haemophilus influenzae und Streptococcus pneumonia)
und virusähnlichen
Teilchen, die durch rekombinante DNA-Technologie hergestellt wurden
(z. B. Hepatitis B-Oberflächenantigen),
usw. einschließen.
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Synthetische
Impfstoffe sind Impfstoffe, die aus kleinen synthetischen Peptiden
aufgebaut sind, welche die Oberflächenantigene von Pathogenen
vortäuschen,
und die immunogen sind, oder können
Impfstoffe sein, die mit der Hilfe von re kombinanten DNA-Techniken
hergestellt werden, einschließlich
vollständigen
Viren, deren Nukleinsäuren
modifiziert wurden.
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Semisynthetische
Impfstoffe oder Konjugat-Impfstoffe bestehen aus Polysaccharid-Antigenen
aus Mikroorganismen, die an Protein-Trägermoleküle angeheftet sind.
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DNA-Impfstoffe
enthalten rekombinante DNA-Vektoren, die Antigene kodieren, welche
bei einer Expression des kodierten Antigens in den Wirtszellen,
welche die DNA aufgenommen haben, humorale oder zelluläre Immunantworten
gegen die kodierten Antigene induzieren.
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Es
wurden Impfstoffe für
eine Vielzahl von infektiösen
Mitteln entwickelt. Die vorliegende Erfindung ist auf rekombinante
Gelatinen gerichtet, die in Impfstoffformulierungen verwendet werden
können,
unabhängig von
dem beteiligten Mittel, und sind daher nicht auf die Verwendung
in den Impfstoffen beschränkt,
die hier exemplarisch spezifisch beschrieben werden. Impfstoffe
schließen
Impfstoffe für
das Vacciniavirus (Pocken), das Poliovirus (Salk und Sabin), Mumps,
Masern, Röteln,
Diphtherie, Tetanus, Varicella-Zoster (Windpocken/Gürtelrose),
Pertussis (Keuchhusten), Bacille Calmette-Guerin (BCG, Tuberkulose),
Haemophilus influenzae Meningitis, Tollwut, Cholera, das japanische
Enzephalitis Virus, Salmonella typhi, Shigellen, Hepatitis A, Hepatitis
B, das Adenovirus, Gelbfieber, Hand-Fuß-Mund-Krankheit, das Herpes simplex Virus,
das respiratorisch-syncytiale Virus, das Rotavirus, Denguefieber,
das West-Nil-Virus, das Truthahn-Herpes Virus (Marek- Krankheit), Influenza
und Anthrax ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Der Begriff Impfstoff,
so wie er hier verwendet wird, schließt Bezugnahme auf Impfstoffe
gegen verschiedene infektiöse
und Autoimmunerkrankungen und Krebse ein, die entwickelt wurden
oder werden, zum Beispiel Impfstoffe gegen verschiedene infektiöse und Autoimmunerkrankungen
und Krebse, z. B. Impfstoffe gegen HIV, HCV, Malaria und Impfstoffe gegen
Brust-, Lungen-, Darm-, Nieren-, Blasen- und Eierstockkrebse.
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Eine
Polypeptid- oder Aminosäure-"Variante" stellt eine Aminosäuresequenz
dar, welche durch eine oder mehrere Aminosäuren aus einer bestimmten Aminosäuresequenz
verändert
wird. Eine Polypeptidvariante kann konservative Änderungen aufweisen, worin
eine substituierte Aminosäure ähnliche
strukturelle oder chemische Eigenschaften zu der ersetzten Aminosäure aufweist,
z. B. Ersetzen von Leucin mit Isoleucin. Eine Variante kann auch
nicht konservative Änderungen
aufweisen, in welchen die substituierte Aminosäure physikalische Eigenschaften
aufweist, die sich von jenen der ersetzten Aminosäure unterscheiden,
z. B. Ersetzen von einem Glycin mit einem Tryptophan. Analoge geringere
Variationen können
auch Aminosäuredeletionen oder
-insertionen oder beides einschließen. Vorzugsweise behalten
Aminosäurevarianten
bestimmte strukturelle oder funktionelle Eigenschaften eines bestimmten
Polypeptids bei. Anleitung beim Bestimmen, welche Aminosäurereste
substituiert, inseriert oder deletiert werden können, kann zum Beispiel unter
Verwendung von Computerprogrammen gefunden werden, die im Stand
der Technik gut bekannt sind, wie die LASERGENE-Software (DNASTAR
Inc., Madison, WI).
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Eine
Polynukleotidvariante stellt eine Variante einer besonderen Polynukleotidsequenz
dar, die vorzugsweise mindestens ungefähr 80%, weiter bevorzugt mindestens
ungefähr
90% und am meisten bevorzugt mindestens ungefähr 95% Polynukleotidsequenz-Ähnlichkeit
zu der besonderen Polynukleotidsequenz aufweist. Es wird vom Fachmann
erkannt werden, dass als Ergebnis der Degeneriertheit des genetischen
Codes eine Vielzahl von variablen Polynukleotidsequenzen, die ein
besonderes Protein kodieren, hergestellt werden kann, wobei einige
eine minimale Homologie zu den Polynukleotidsequenzen von irgendeinem
bekannten oder natürlich
vorkommenden Gen aufweisen.
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Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung stellt die Herstellung von rekombinanten Tierkollagen
und -gelatinen bereit. Diese Tierkollagene und -gelatinen stellen
Vorteile gegenüber
derzeit verfügbaren
Materialien bereit, indem sie als gut charakterisierte und reine
Proteine hergestellt werden. Verfahren zum Herstellen dieser Tierkollagene und
-gelatinen werden auch bereitgestellt. Die Tierkollagene und -gelatinen
werden vom bovinen Typ I-Kollagen abgeleitet. Spezifisch werden
bovine α1(I)-Kollagene und -Gelatinen
bereitgestellt.
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Die
vorliegende Erfindung stellt die Herstellung von relativ großen Mengen
einzelner Typen von Tierkollagen bereit, das in rekombinanten Zellkultursystemen
synthetisiert wird, die nicht irgendwelche anderen Kollagentypen
erzeugen. Die vorliegende Erfindung stellt Tierkollagen Typ I bereit,
das im Wesentlichen frei von irgendwelchen anderen Kollagentypen
ist. Unter Verwendung der erfindungsgemäßen Verfahren ist die Reinigung
des Kollagens stark vereinfacht.
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Die
vorliegende Erfindung ist weiterhin auf Vektoren und Plasmide gerichtet,
die in den erfindungsgemäßen Verfahren
verwendet werden. Diese Vektoren und/oder Plasmide umfassen ein
Polynukleotid, welches das gewünschte
Kollagen, nötige
Promotoren und andere Sequenzen, die für die einwandfreie Expression
solcher Polypeptide nötig
sind, kodiert. Das Polynukleotid, das ein Kollagen kodiert, wird
vorzugsweise aus Tierquellen erhalten. Tierquellen schließen nicht-menschliche
Säugetierquellen,
wie Rinder-, Schafs- und Schweinequellen ein. In einer Ausführungsform
schließen
die Vektoren und Plasmide weiterhin mindestens ein Polynukleotid
ein, das ein oder mehrere posttranslationale/s Enzym/e oder funktionelle Äquivalente
davon kodiert. Das Polynukleotid, das ein oder mehrere posttranslationale/s
Enzym/e kodiert, kann von irgendeiner der oben erwähnten Arten
abgeleitet sein. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Kollagen
kodierende Polynukleotid von derselben Art abgeleitet, wie das Polynukleotid,
das das posttranslationale Enzym kodiert.
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In
einer weiteren Ausführungsform
wird mindestens ein Polynukleotid, das ein posttranslationales Enzym,
wie Prolyl-4-Hydroxylase, C-Proteinase, N-Proteinase, Lysyloxidase
oder Lysylhydroxylase kodiert, in Zellen inseriert, die nicht natürlicherweise
posttranslationale Enzyme herstellen, wie Hefezellen, oder die natürlicherweise
nicht ausreichende Mengen von posttranslationalen Enzymen herstel len
können,
wie einige Säugetier-
und Insektenzellen. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das posttranslationale
Enzym Prolyl-4-Hydroxylase, wobei die Polynukleotide, die eine α-Untereinheit
der Prolyl-4-Hydroxylase kodieren und die Polynukleotide, die eine β-Untereinheit
der Prolyl-4-Hydroxylase kodieren in eine Zelle inseriert werden,
um ein biologisch aktives Prolyl-4-Hydroxylase-Enzym herzustellen.
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Die
vorliegende Erfindung umfasst spezifisch die Verwendung von irgendeiner
Verbindung, biologisch oder chemisch, die den erfindungsgemäßen rekombinanten
Tierkollagenen und -gelatinen eine Hydroxylierung verleiht, z. B.
eine Prolinhydroxylierung und/oder einer Lysinhydroxylierung, usw.,
wie gewünscht.
Dies schließt
zum Beispiel Prolyl-4-Hydroxylase aus irgendeiner Art, endogen oder
exogen bereitgestellt, einschließlich verschiedener Isoformen
der Prolyl-4-Hydroxylase
und irgendwelcher Varianten oder Fragmente oder Untereinheiten der
Prolyl-4-Hydroxylase ein, die die gewünschte Aktivität aufweisen,
ob nativ, synthetisch oder semisynthetisch, und andere Hydroxylasen,
wie Prolyl-3-Hydroxylase,
usw. (Siehe z. B.
U.S. Patent
Nr. 5,928,922 ). In einer Ausführungform wird die Prolylhydroxylase-Aktivität durch
eine Prolylhydroxylase verliehen, die aus derselben Art abgeleitet
wird, wie das Polynukleotid, das das rekombinan te Kollagen oder
die Gelatine kodiert, oder ein Polypeptid kodiert, von welchem rekombinante
Gelatine abgeleitet werden kann. In einer weiteren Ausführungsform
stammt die Prolyl-4-Hydroxylase aus einem Tier und das kodierende
Polynukleotid ist von einer Sequenz aus demselben Tier abgeleitet.
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Die
vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Herstellen von rekombinanten
Tierkollagenen und -gelatinen bereit. Zur Eindeutigkeit muss erwähnt werden,
dass, während
die erfindungsgemäßen Verfahren der
Herstellung im Allgemeinen auf die Herstellung von Kollagenen gerichtet
sind, die Herstellungsverfahren auf die Herstellung von Gelatinen
direkt aus veränderten
Kollagenkonstrukten und auf die Herstellung von Polypeptiden, aus
denen Gelatinen abgeleitet werden können, angewandt werden können. In
einer Ausführungsform
umfasst das Verfahren das Einführen,
unter Bedingungen, die für
eine Expression geeignet sind, eines Ex pressionsvektors, der das
erfindungsgemäße Tierkollagen
kodiert, und eines zweiten Expressionsvektors, der ein posttranslationales
Enzym kodiert, in eine Wirtszelle, und das Isolieren des Kollagens.
In einer bevorzugten Ausführungsform
ist das posttranslationale Enzym Prolylhydroxylase. (Siehe z. B.
U.S. Patent Nr. 5,593,859 ).
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In
einem Aspekt sind die erfindungsgemäßen Kollagenzusammensetzungen
weniger als vollständig glykosyliert
oder weniger als vollständig
hydroxyliert. Zum Beispiel kann das erfindungsgemäße Kollagen
deglykosyliert, unglykosyliert, teil weise glykosyliert und teilweise
hydroxyliert sein. In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung
umfassen die Kollagenzusammensetzungen einen Typ Kollagen und sind
im Wesentlichen frei von irgendeinem anderen Typ von Kollagen.
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Es
werden rekombinante Polypeptide offenbart, einschließlich Fusionsprodukten,
die aus chimären Genen
hergestellt werden, in denen zum Beispiel relevante Epitope des
Kollagens für
therapeutische und andere Verwendungen hergestellt werden können. Des
Weiteren werden irgendwelche Modifikationen, die an den Kollagenen
oder Gelatinen oder Zusammensetzungen davon vorgenommen werden oder
irgendwelche Abbauprodukte davon offenbart. Solche Modifikationen
schließen
zum Beispiel Verarbeiten von Tierkollagenen oder kollagenartigen
Proteinen und Gelatine ein.
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Die
vorliegende Erfindung stellt weiterhin Gelatinezusammensetzungen
bereit. Spezifisch stellt die vorliegende Erfindung Gelatinezusammensetzungen
bereit, die von den erfindungsgemäßen Kollagenen abgeleitet werden.
In einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Zusammensetzung
aus einer Gelatine aufgebaut, die aus einem Kollagentyp, der im
Wesentlichen frei von irgendeinem anderen Kollagentyp ist, abgeleitet
wird. In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung umfasst
die Gelatinezusammensetzung denaturierte Dreifachhelices.
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Die
vorliegende Erfindung stellt weiterhin Verfahren zum Herstellen
einer Gelatine durch Exprimieren des erfindungsgemäßen Kollagens
und Ableiten der Gelatine davon bereit. Die vorliegende Erfindung
stellt weiterhin die direkte Expression von rekombinanter Tiergelatine
aus einem Polynukleotid, das SEQ ID NR: 2 kodiert, bereit. (Siehe
z. B. selber Inhaber, gleichzeitig anhängende Anmeldung US 2005/229264).
Spezifischer umfasst das Verfahren das Inserieren eines Expressionsvektors,
der mindestens ein Polynukleotid umfasst, das ein erfindungsgemäßes Tierkollagen
kodiert, und eines Expressionsvektors, der mindestens ein Polynukleotid
umfasst, das ein posttranslationales Kollagenenzym oder eine Untereinheit
davon kodiert, in eine Zelle, das Gewinnen des Kollagens und das
Ableiten der Gelatine von dem Kollagen.
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In
einigen Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung können
die Gelatinezusammensetzungen direkt aus dem isolierten Kollagen
oder aus Biomasse oder Kulturmedien erhalten werden. Verfahren,
Abläufe und
Techniken des Herstellens von Gelatinezusammensetzungen aus Kollagen
schließen
Denaturieren der dreifach helikalen Struktur des Kollagens unter
Verwendung von Detergenzien, Hitze oder Denaturierungsmitteln ein.
Zusätzlich
schließen
diese Verfahren, Abläufe
und Techniken Behandlungen mit starkem Alkali oder starken Säuren, Hitzeextraktion
in einer wässrigen
Lösung,
Ionenaustauschchromatographie, Kreuzstromfiltration und Hitzetrocknung
und andere Verfahren ein, die im Stand der Technik bekannt sind,
die auf Kollagen angewendet werden können, um die Gelatinezusammensetzungen
herzustellen, sind aber nicht darauf beschränkt. Dieselben Verfahren, Abläufe und
Techniken können
auf Biomasse oder Kulturmedien angewendet werden, um die erfindungsgemäßen Gelatinezusammensetzungen
herzustellen.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft weiterhin Tierkollagene. Die vorliegende
Erfindung stellt ein bovines Typ I-Kollagen bereit, spezifisch wird
ein bovines α1(I)-Kollagen bereitgestellt.
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Die
vorliegende Erfindung stellt auch Polynukleotide bereit, die das
erfindungsgemäße bovine α1(I)-Kollagen
kodieren. Die Erfindung stellt weiterhin Polynukleotide bereit,
die komplementär
zu den kodierenden Polynukleotiden sind. Die vorliegende Erfindung
stellt auch Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen rekombinanten
bovinen Typ I-Kollagene bereit.
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In
einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung können die
Expressionsvektoren, die die erfindungsgemäßen Polynukleotide umfassen,
in Wirtszellen inseriert werden, um die bovinen Typ I-Kollagene oder
-Gelatinen herzustellen. In einem Verfahren wird ein Expressionsvektor,
der ein erfindungsgemäßes Polynukleotid
umfasst, in Wirtszellen zusammen mit einem Expressionsvektor exprimiert,
der ein Polynukleotid umfasst, das ein erfindungsgemäßes Polypeptid
mit einem Expressionsvektor kodiert, der ein Polynukleotid umfasst,
das ein posttranslationales Enzym kodiert. In einer Ausführungsform
ist das posttranslationale Enzym Prolyl-4-Hydroxylase, die ein α-Untereinheit
und eine β-Untereinheit
umfasst.
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Die
erfindungsgemäßen rekombinanten
Tierkollagene und -gelatinen beschränken die menschliche Exposition
gegenüber
verschiedenen Kontaminierungen, die in Tiergeweben anwesend sein
können,
die derzeit als Rohmaterial in der Herstellung von Kollagenen und
von Kollagen abgeleiteten Materialien, wie Gelatine, verwendet werden.
Darüber
hinaus sind die erfindungsgemäßen Kollagene
und Gelatinen reproduzierbarer als die Kollagene oder Gelatinen,
die derzeit aus rohen Tierquellen erhalten werden.
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Erfindungsgemäß können kodierende
Polynukleotidsequenzen, sowie gut charakterisierte Proteine mit
vorhersagbaren Funktionen verwendet werden, um rekombinante Moleküle zu erzeugen,
die die Expression der erfindungsgemäßen Polypeptide in geeigneten
Wirtszellen steuern.
-
Nukleinsäuresequenzen,
die Kollagene kodieren, wurden im Stand der Technik im Allgemeinen
beschrieben. (Siehe z. B. Fuller und Boedtker (1981) Biochemistry
20: 996-1006; Sandell et al. (1984) J. Biol. Chem. 259: 7826-34;
Kohno et al. (1984) J. Biol. Chem. 259: 13668-13673, French et al.
(1985) Gene 39: 311-312; Metsaranta et al. (1991) J. Biol. Chem.
266: 16862-16869; Metsaranta et al., (1991) Biochim Biophys Acta
1089: 241-243; Wood et al. (1987) Gene 61: 225-230; Glumoff et al.
(1994) Biochim Biophys Acta 1217: 41-48; Shirai et al. (1998) Matrix
Biology 17: 85-88; Tromp et al. (1988) Biochem J. 253: 919-912;
Kuivaniemi et al. (1988) Biochem J. 252: 633-640; und Ala-Kokko
et al. (1989) Biochem J. 260: 509-516).
-
In
einer Ausführungsform
kodiert die Polynukleotidsequenz die bovine α1(I)-Kollagen-Aminosäuresequenz SEQ ID NR: 2.
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Veränderte Polynukleotidsequenzen,
die verwendet werden können,
schließen
Deletionen, Additionen oder Substitutionen von verschiedenen Nukleotidresten
ein, die zu einer Sequenz führen,
die dasselbe oder ein funktionell äquivalentes Genprodukt kodieren.
Das Genprodukt selber kann Deletionen, Additionen oder Substitutionen
von Aminosäureresten
enthalten, und dennoch zu einem funktionell äquivalenten Polypeptid führen.
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Die
erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen
können
gentechnisch verändert
werden, um die kodierende Sequenz für eine Vielzahl von Zwecken
zu ändern,
einschließlich Änderungen,
die die Verarbeitung und Expression des Genprodukts modifizieren,
sind aber nicht darauf beschränkt.
Zum Beispiel können
alternative sekretorische Signale für das native sekretorische
Signal substituiert werden und/oder Mutationen können unter Verwendung von Techniken,
die im Stand der Technik gut bekannt sind, eingeführt werden,
z. B. zielgerichtete Mutagenese, Inserieren neuer Restriktionsstellen,
Verändern
der Glykosylierungsmuster, Phosphorylierung, usw. In einer Ausführungsform
können
die erfindungsgemäßen Polynukleotide
an der stillen Position von irgendeinem Aminosäure-Codon-Triplet modifiziert
werden, um der Codonpräferenz
des bestimmten Wirtsorganismus besser zu entsprechen.
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In
einer anderen Ausführungsform
kann ein erfindungsgemäßes Polynukleotid
an eine heterologe Sequenz ligiert werden, um ein Fusionsprotein
zu kodieren. Zum Beispiel kann ein Fusionsprotein gentechnisch hergestellt
werden, um eine Spalt stelle zu enthalten, die zwischen einer erfindungsgemäßen bovinen α1(I)-Kollagensequenz und
der heterologen Proteinsequenz liegt, sodass das α1(I)-Kollagen von dem
heterologen Rest abgespalten werden kann.
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Polynukleotidvarianten
können
auch gemäß im Stand
der Technik gut bekannten Verfahren erzeugt werden. In einem Verfahren
werden Polynukleotide über
zielgerichtete Mutagenese verändert.
Dieses Verfahren verwendet Oligonukleotidsequenzen, die die Polynukleotidsequenz
der gewünschten
Aminosäurevariante kodieren,
sowie ein ausreichend benachbart liegendes Nukleotid auf beiden
Seiten der geänderten
Aminosäure,
um eine stabile Doppelhelix auf beiden Seiten der veränderten
Stelle zu bilden. Im Allgemeinen sind die Techniken der zielgerichteten
Mutagenese dem Fachmann gut bekannt, und diese Technik ist beispielhaft durch
Veröffentlichungen,
wie zum Beispiel Edelmann et al. (1983) DNA, 2: 183, dargestellt.
Ein vielseitiges und effizientes Verfahren zum Herstellen von stellenspezifischen Änderungen
in einer Polynukleotidsequenz wird z. B. von Zoller und Smith (1982)
Nucleic Acids Res. 10: 6487-6500 beschrieben.
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Wie
im Stand der Technik bekannt ist, verändern Nukleinsäuremutationen
nicht notwendigerweise die Aminosäuresequenz, die durch eine
Polynukleotidsequenz kodiert wird, während besondere Restriktionsstellen
bereitgestellt werden, die für
eine Manipulation des Moleküls
geeignet sind. Daher kann das modifizierte Molekül aus einer Anzahl von einzelnen
Regionen oder D-Regionen aufgebaut sein, die von besonderen Restriktionsstellen
flankiert werden. Diese einzelnen Regionen des Moleküls werden
hier als Kassetten bezeichnet. Moleküle, die aus Mehrfachkopien
einer Kassette gebildet werden, sind durch die vorliegende Offenbarung
eingeschlossen. Rekombinante oder mutante Nukleinsäuremoleküle oder
Kassetten, welche die gewünschten
Eigenschaften bereitstellen, wie eine Resistenz gegenüber endogenen
Enzymen, wie Kollagenase, sind auch durch die vorliegende Offenbarung
eingeschlossen. (Siehe z. B. Maniatis et al., supra und Ausubel et
al., supra).
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Es
wird vom Fachmann erkannt werden, dass, als Ergebnis der Degeneriertheit
des genetischen Codes, eine Vielzahl von Polynukleotidsequenzen,
welche die erfindungsgemäßen Polypeptide
kodieren, hergestellt werden können,
wobei einige eine minimale Homologie zu den Nukleotidsequenzen von
irgendeinem bekannten oder natürlich
vorkommenden Gen aufweisen. Daher umfasst die Erfindung jede und
jede mögliche Variation
der Nukleotidsequenz, die durch Auswählen von Kombinationen, basierend
auf möglichen
Codonauswahlen erzeugt werden könnte.
Diese Kombinationen werden in Übereinstimmung
mit dem genetischen Standard-Tripletcode vorgenommen.
-
Die
Erfindung umfasst auch die Herstellung von Polynukleotidsequenzen,
welche die erfindungsgemäßen Polypeptide
kodieren, vollständig
durch synthetische Chemie. Nach der Herstellung kann die synthetische Sequenz
in irgendeinen der vielen verfügbaren
Expressionsvektoren und Zellsysteme inseriert werden, unter Verwendung
von Reagenzien, die im Stand der Technik gut bekannt sind. Darüber hinaus
kann die synthetische Chemie verwendet werden, um Mutationen in
eine Polynukleotidsequenz, die das erfindungsgemäße Kollagen kodiert, einzuführen.
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Eine
PCR kann auch verwendet werden, um erfindungsgemäße Varianten zu erzeugen. Wenn
kleine Mengen der Matrizen-Nukleinsäure als Ausgangsmaterial verwendet
werden, kann ein/können
Primer, der/die sich leicht in der Sequenz von der entsprechenden
Region in der Matrizen-Nukleinsäure
unterscheidet/n, die gewünschte
Aminosäurevariante
erzeugen. Eine PCR-Amplifikation führt zu einer Population von
Produkt-Polynukleotidfragmenten, die sich von der Polynukleotidmatrize,
die das Kollagen kodiert, an der durch den Primer spezifizierten
Position unterscheiden. Die Produktfragmente ersetzen die entsprechende
Region in dem Plasmid, wobei die gewünschte Nukleinsäure- oder
Aminosäurevariante
erzeugt wird.
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Aufgrund
der innewohnenden Degeneriertheit des genetischen Codes werden andere
Polynukleotidsequenzen, die im Wesentlichen dieselben oder funktionell äquivalente
Polypeptidsequenzen kodieren, durch die vorliegende Offenbarung
ein geschlossen, und es sind alle Degenerationsvarianten und Codon
optimierten Sequenzen spezifisch vorgesehen. Kodierende Polynukleotidsequenzen,
die natürlich,
synthetisch, semisynthetisch oder rekombinant sind, können in
der Ausführung
der beanspruchten Erfindung verwendet werden.
-
Wenn
sie natürlich
hergestellt werden, stellen Kollagene Strukturproteine dar, die
eine oder mehrere Kollagenuntereinheit/en umfassen, die zusammen
mindestens eine dreifach helikale Domäne bilden. Eine Vielzahl von
Enzymen wird verwendet, um die Kollagenuntereinheiten in Prokollagen
oder andere Vorläufermoleküle und anschließend in
reifes Kollagen umzuwandeln. Solche Enzyme schließen zum
Beispiel Prolyl-4-Hydroxylase, C-Proteinase, N-Proteinase, Lysyloxidase,
Lysylhydroxylase, usw. ein.
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Die
Prolyl-4-Hydroxylase ist ein α
2β
2-Tetramer und spielt eine zentrale Rolle
in der Biosynthese von allen Kollagenen, 4-Hydroxyprolinreste stabilisieren
die Faltung der neu synthetisierten Polypeptidketten in stabile
dreifach helikale Moleküle.
(Siehe z. B. Prockop et al. (1995) Annu. Rev. Biochem. 64: 403-434;
Kivirikko et al. (1992) "Post-Translational
Modifications of Proteins",
S. 1-51 und Kivirikko et al. (1989) FASER J. 3: 1609-1617). Zusätzlich war
die Menge der Expression von Typ III-Kollagen niedriger in der Abwesenheit
von rekombinanter Prolyl-4-Hydroxylase, als in seiner Anwesenheit.
Humane Isoformen der Prolyl-4-Hydroxylase wurden kloniert und charakterisiert.
(Siehe z. B. Helaakoski et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. 92:
4427-4431;
US Patent Nr. 5,928,922 ).
-
Die
Lysylhydroxylase, ein α2-Homodimer,
katalysiert die posttranslationale Modifikation des Kollagens, um
Hydroxylysin in Kollagenen zu bilden. Siehe im Allgemeinen Kivirikko
et al. (1992) "Post-Translational Modifications
of Proteins", Harding,
J.J., und Crabbe, M.J.C., Hrsg., CRC Press, Boca Raton, FL und Kivirikko (1995)
Principles of Medical Biology, Band 3 Cellular Organelles and the
Extracellular Matrix, Bittar, E.E. und Bittar, N., Hrsg., JAI Press,
Greenwich, Großbritannien.
Isoformen der Lysylhydroxylase wurden kloniert und identifiziert.
(Siehe z. B. Passoja et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. 95 (18):
10482-10486 und Valtavaara et al. (1997) J. Biol. Chem. 272(11):
6831-6834).
-
Die
C-Proteinase verarbeitet das zusammengebaute Prokollagen durch Abspalten
der C-terminalen Enden der Prokollagene, die beim Zusammenbau der
Dreifachhelix des Kollagenmoleküls
behilflich sind, aber keinen Teil davon bilden. (Siehe z. B. Kadler
et al. (1987) J. Biol. Chem. 262: 15969-15701 und Kadler et al. (1990)
Ann. NY Acad. Sci. 580: 214-224).
-
Die
N-Proteinase verarbeitet das zusammengebaute Prokollagen durch Abspalten
der N-terminalen Enden der Prokollagene, die beim Zusammenbau der
Kollagen-Dreifachhelix
behilflich sind, aber keinen Teil davon bilden. (Siehe z. B. Hojima
et al. (1994) J. Biol. Chem. 269: 11381-11390).
-
Die
Lysyloxidase stellt ein extrazelluläres Kupferenzym dar, das die
oxidative Desaminierung der α-Aminogruppe
in bestimmten Lysin- und Hydroxylysinresten katalysiert, um ein
reaktives Aldehyd zu bilden. Diese Aldehyde durchlaufen anschließend eine
Aldolkondensation, um Aldole zu bilden, die die Kollagenfibrillen
vernetzen. Die Information über
die DNA- und Proteinsequenz der Lysyloxidase kann zum Beispiel in
Kivirikko (1995), supra; Kagan (1994) Path. Res. Pract. 190: 910-919;
Kenyon et al. (1993) J. Biol. Chem. 268(25). 18435-18437, Wu et
al. (1992) J. Biol. Chem. 267(34): 24199-24206; Mariani et al. (1992)
Matrix 12(3): 242-248 und Hamalainen et al. (1991) Genomics 11(3):
508-516 gefunden werden.
-
Die
Nukleinsäuresequenzen,
die eine Anzahl dieser posttranslationalen Enzyme kodieren, wurden
beschrieben. (Siehe z. B. Vuori et al. (1992) Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 89: 7467-7470 und Kessler et al. (1996) Science 271: 360-362).
Die Nukleinsäuresequenzen,
die verschiedene posttranslationale Enzyme kodieren, können auch
gemäß den oben
im Allgemeinen beschriebenen Verfahren bestimmt werden und schließen die Verwendung
von geeigneten Sonden und Nukleinsäure-Bibliotheken ein.
-
Die
rekombinanten Tiergelatinen können
von den erfindungsgemäßen Tierkollagenen
unter Verwendung einer Vielzahl von im Stand der Technik bekannten
Verfahren abgeleitet werden. (Siehe z. B. Veis, A. (1965) International
Review of Connective Tissue Research, 3: 113-200). Zum Beispiel
stellt eine gängige
Eigenschaft der derzeitigen Verfahren die Denaturierung der Sekundärstruktur
des Kollagenproteins, und in der Mehrzahl der Beispiele, eine Änderung
in entweder der Primär-
oder Tertiärstruktur
des Kollagens dar. Daher können
die erfindungsgemäßen Tierkollagene
unter Verwendung verschiedener Verfahren, die von dem Typ der gewünschten
Gelatine abhängen,
verarbeitet werden.
-
Rekombinante
Tiergelatinen können
von dem erfindungsgemäßen, rekombinant
hergestellten Kollagen durch eine Vielzahl von im Stand der Technik
bekannten Verfahren abgeleitet werden. Zum Beispiel kann Gelatine
direkt aus einer Zellmasse oder aus Kulturmedien durch Ausnutzen
der Löslichkeit
der Gelatine bei erhöhten
Temperaturen und seinen Stabilitätsbedingungen
eines niedrigen oder hohen pH-Werts, einer niedrigen oder hohen
Salzkonzentration und hohen Temperaturen abgeleitet werden. Verfahren,
Abläufe
und Techniken zum Herstellen von Gelatinezusammensetzungen aus Kollagen
schließen
Denaturieren der dreifach helikalen Struktur des Kollagens unter
Verwendung von Detergenzien, Hitze oder verschiedenen Denaturierungsmitteln,
die im Stand der Technik gut bekannt sind, ein. Zusätzlich können verschiedene
Schritte, die an der Extraktion der Gelatine aus Tier- oder Schlachthausquellen
beteiligt sind, einschließlich
Behandlung mit Kalk oder Säuren,
Hitzeextraktion in wässriger
Lösung,
Ionenaustauschchromatographie, Kreuzstromfiltration und verschiedene
Verfahren des Trocknens verwendet werden, um die Gelatine aus rekombinantem
Kollagen abzuleiten.
-
Expression
-
Die
erfindungsgemäßen Verfahren
zum Herstellen von Tierkollagenen und -gelatinen können in
einer Vielzahl von rekombinanten Systemen, die dem Fachmann zur
Verfügung
stehen, angewendet werden. Eine Anzahl dieser rekombi nanten Systeme
wird hier beschrieben, obwohl es verstanden werden soll, dass die
Anwendung der erfindungsgemäßen Verfahren
nicht auf die unten als Beispiel dargestellten Systeme beschränkt ist.
-
Um
die erfindungsgemäßen rekombinanten
Tierkollagene und -gelatinen oder die Polypeptide, aus denen die
rekombinanten Gelatinen abgleitet werden können, zu exprimieren, wird
das kodierende Polynukleotid in einen geeigneten Expressionsvektor
inseriert, d. h. einen Vektor, der die nötigen Elemente für die Transkription
und Translation der inserierten kodierenden Sequenz, oder im Fall
eines viralen RNA-Vektors, die nötigen Elemente
für eine
Replikation und Translation enthält.
-
Verfahren,
die dem Fachmann gut bekannt sind, können verwendet werden, um die
Expressionsvektoren zu konstruieren, die die erfindungsgemäßen Polynukleotide
und geeignete transkriptionelle/translationelle Kontrollsignale
enthalten. Diese Verfahren schließen Standardtechniken der DNA-Klonierung
ein, z. B. rekombinante in vitro-Techniken, synthetische Techniken
und in vivo Rekombination/genetische Rekombination. (Siehe zum Beispiel
die Techniken, die in Maniatis et al., supra und Ausubel et al.,
supra beschrieben sind).
-
Die
Expressionselemente der verschiedenen Systeme variieren in ihrer
Stärke
und ihren Spezifitäten. Abhängig vom
verwendeten Wirts-Nektorsystem kann irgendeines einer Anzahl der
geeigneten Transkriptions- und Translationselemente, einschließlich von
konstitutiven und induzierbaren Promotoren in dem Expressionsvektor
verwendet werden. Zum Beispiel können,
wenn in bakteriellen Systemen kloniert wird, induzierbare Promotoren,
wie pL des Bakteriophagen γ,
plac, ptrp, ptac (ptrp-lac-Hybridpromotor) und desgleichen verwendet
werden, wenn in Insektenzellsystemen kloniert wird, können Promotoren,
wie der Baculovirus-Polyhedronpromotor
verwendet werden, wenn in Pflanzenzellsystemen kloniert wird, können Promotoren,
die aus dem Genom der Pflanzenzellen (z. B. Hitzeschockpromotoren,
der Promotor für
die kleine Untereinheit der RUBISCO, der Promotor für das Chlorophyll
a/b-Bindungsprotein) oder aus Pflanzenviren (z. B. der 35S RNA-Promotor
des CaMV; der Hüllprotein-Promotor
des TMV) abgeleitet werden, verwendet werden, wenn in Säugetierzellsystemen
kloniert wird, können
Promotoren, die aus dem Genom der Säugetierzellen (z. B. der Metallothionein-Promotor) oder aus
Säugetierviren
(z. B. der späte
Adenovirus-Promotor, der Vaccinia-Virus 7,5 K-Promotor) abgeleitet
werden, verwendet werden, wenn Zelllinien erzeugt werden, die Mehrfachkopien
einer Kollagen-DNA enthalten, können
SV40-, BPV- und EBV-basierte Vektoren mit einem geeigneten selektierbaren
Marker verwendet werden.
-
Spezifische
Initiationssignale können
auch für
eine effiziente Translation der inserierten Sequenzen benötigt werden.
Diese Signale schließen
das ATG-Startcodon und benachbarte Sequenzen ein. In den Fällen, in
denen das gesamte Kollagengen, einschließlich seines eigenen Startcodons
und seiner benachbarten Sequenzen in den geeigneten Expressionsvektor
inseriert wird, kann es sein, dass keine zusätzlichen translationellen Kontrollsignale
benötigt
werden. In Fällen,
in denen nur ein Abschnitt einer Kollagen kodierenden Sequenz inseriert
wird, müssen
jedoch exogene translationelle Kontrollsignale, einschließlich des
ATG-Startcodons, bereitgestellt werden. Darüber hinaus muss das Startcodon
phasengleich mit dem Leserahmen der Kollagen kodierenden Sequenz
sein, um die Translation des gesamten inserts sicherzustellen. Diese
exogenen translationellen Kontrollsignale und Startcodons können vielfältigen Ursprungs
sein, sowohl natürlich,
als auch synthetisch. Die Effizienz der Expression kann durch den
Einschluss geeigneter Transkriptions-Enhancerelemente, Transkriptions-Terminatoren,
usw. verstärkt
werden. (Siehe z. B. Bittner et al. (1987) Methods in Enzymol. 153:
516-544).
-
Die
erfindungsgemäßen Polypeptide
können
als sezernierte Proteine exprimiert werden. Wenn die gentechnisch
hergestellten Zellen, die für
die Expression der Proteine verwendet werden, nicht-menschliche Wirtszellen
darstellen, ist es häufig
vorteilhaft, das sekretorische Signalpeptid des Kollagenproteins
durch ein alternatives sekretorisches Signalpeptid zu ersetzen,
das effizienter von der Steuerungsmaschinerie der Sekretion der
Wirtszelle erkannt wird. Die geeignete sekretorische Signalsequenz
ist insbesondere wichtig beim Erhalten einer optimalen Pilzexpression
von Säugetiergenen.
Siehe zum Beispiel z. B. Brake et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 81: 4642. Andere Signalsequenzen für prokaryontische, Hefe-, Pilz-,
Insekten- oder Säugetierzellen
sind im Stand der Technik gut bekannt, und der Fachmann könnte eine
geeignete Signalsequenz für
die Wirtszelle der Wahl einfach auswählen.
-
Die
erfindungsgemäßen Vektoren
können
sich in der Wirtszelle autonom replizieren oder können sich in
das Wirtschromosom integrieren. Geeignete Vektoren mit autonom replizierenden
Sequenzen sind für
eine Vielzahl von Bakterien, Hefe- und verschiedene virale Replikationssequenzen
für sowohl
Prokaryonten, als auch Eukaryonten gut bekannt. Die Vektoren können sich
in das Wirtszellgenom integrieren, wenn sie eine Nukleinsäuresequenz
aufweisen, die homolog zu einer Sequenz ist, die in der genomischen
DNA der Wirtszelle gefunden wird.
-
In
einer Ausführungsform
umfassen die erfindungsgemäßen Expressionsvektoren
einen selektierbaren Marker, der ein Produkt kodiert, das für die Wirtszelle
nötig ist,
um unter bestimmten Bedingungen zu wachsen und zu überleben.
Typische Selektionsgene schließen
Gene ein, die Proteine kodieren, die eine Resistenz gegen ein Antibiotikum
oder ein anderes Toxin (z. B. Tetracyclin, Ampicillin, Neomycin,
Methotrexat, usw.) verleihen, Proteine, die eine auxotrophe Anforderung
der Wirtszelle ergänzen,
usw. Andere Beispiele der Selektionsgene schließen die Herpes simplex-Virus-Thymidin-Kinase-(Wigler
et al. (1977) Cell 11: 223), die Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase-(Szybalska
et al. (1962) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48: 2026) und die Adenin-Phosphoribosyltransferase-(Lowy
et al. (1980) Cell 22: 817) Gene ein, die jeweils in tk–,
hgprt– oder aprt–-Zellen
eingesetzt werden können.
-
Eine
Antimetabolitresistenz kann als Grundlage der Selektion verwendet
werden, wie bei der Verwendung von dhfr, was eine Resistenz gegen
Methotrexat verleiht, gpt, was eine Resistenz gegen Mycophenolsäure verleiht,
neo, was eine Resistenz gegen Aminoglykosid G-418 verleiht und hygro,
was eine Resistenz gegen Hygromycin verleiht. (Siehe z. B. Wigler
et al. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 3567; O'Hare et al. (1981)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 1527, Mulligan et al. (1981) Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 78: 2072; Colberre-Garapin et al. (1981) J.
Mol. Biol. 150: 1 und Santerre et al. (1984) Gene 30: 147). Zusätzlich selektierbare
Gene schließen
trpB, was den Zellen erlaubt, Indol anstelle von Tryptophan zu verwenden,
hisD, was den Zellen erlaubt, Histinol anstelle von Histidin zu
verwenden und odc (Ornithindecarboxylase), was eine Resistenz gegen
den Ornithindecarboxylaseinhibitor 2-(Difluormethyl)-DL-ornithin,
DFMO, verleiht, ein. (Siehe z. B. Hartman et al. (1988) Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 85: 8047 und McConlogue L., In: Current Communications
in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laborstory, Hrsg. (1987)).
-
Elemente,
die für
die erfindungsgemäßen Expressionsvektoren
nötig sind,
schließen
Sequenzen zum Initiieren der Transkription, z. B. Promotoren und
Enhancer, ein. Promotoren stellen nicht translatierte Sequenzen
dar, die strangaufwärts
vom Startcodon des Strukturgens liegen, die die Transkription der
Nukleinsäure unter
ihrer Kontrolle kontrollieren. Induzierbare Promotoren stellen Promotoren
dar, die ihren Grad der Transkriptionsinitiation in Antwort auf
eine Änderung
in den Kulturbedingungen ändern,
z. B. die Anwesenheit oder Abwesenheit eines Nährstoffs. Der Fachmann würde eine
große
Anzahl von Promotoren kennen, die in Wirtszellen erkannt werden
würden,
die für
die vorliegende Erfindung geeignet sind. Diese Promotoren sind funktionsfähig mit
der DNA, die das Kollagen kodiert, über das Entfernen des Promotors
aus seinem nativen Gen und Platzieren der Kollagen kodierenden DNA
3' der Promotorsequenz
verbunden.
-
Promotoren,
die in der vorliegenden Verwendung geeignet sind, schließen den
Lactosepromotor, den alkalische Phosphatasepromotor, den Tryptophanpromotor,
Hybridpromotoren, wie den tac-Promotor, den Promotor für die 3-Phosphoglyceratkinase,
andere Promotoren glykolytischer Enzyme (Hexokinase, Pyruvatdecarboxylase,
Phosphofructosekinase, Glucose-6-Phosphatisomerase, usw.), den Promotor
für die
Alkoholdehydrogenase, den Metallothionein-Promotor, den Maltosepromotor,
den Galactosepromotor, Promotoren für die Viren Polyoma, Geflügelpocken,
Adenovirus, boviner Papillomavirus, Vogel-Sarkom-Virus, Cytomegalovirus,
Retroviren, SV40 und Promotoren aus Zieleukaryonten, einschließ lich des
Glucoamylasepromotors aus Aspergillus, des Aktinpromotors oder eines
Immunglobinpromotors aus einem Säugetier
und native Kollagenpromotoren, ein, sind aber nicht darauf beschränkt. (Siehe
z. B. de Boer et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 21-25;
Hitzeman et al. (1980) J. Biol. Chem. 255: 2073; Fiers et al. (1978)
Nature 273: 113; Mulligan und Berg (1980) Science 209: 1422-1427;
Pavlakis et al. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 7398-7402; Greenway
et al. (1982) Gene 18: 355-360; Gray et al. (1982) Nature 295: 503-508;
Reyes et al. (1982) Nature 297: 598-601; Canaai und Berg (1982)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 5166-5170; Gorman et al. (1982) Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 79: 6777-6781 und Nunberg et al. (1984) Mol. and
Cell. Biol. 11(4): 2306-2315).
-
Die
Transkription der kodierenden Sequenz vom Promotor wird häufig durch
Inserieren einer Enhancersequenz in den Vektor verstärkt. Enhancer
stellen ciswirkende Elemente dar, mit üblicherweise ungefähr 10 bis
300 bp, die wirken können,
um die Geschwindigkeit der Transkriptionsinitiation an einem Promotor
zu verstärken.
Viele Enhancer sind sowohl für
Eukaryonten, als auch für
Prokaryonten bekannt, und der Fachmann könnte einen geeigneten Enhancer
für die
Wirtszelle von Interesse auswählen.
(Siehe z. B. Yaniv (1982) Nature 297: 17-18).
-
Zusätzlich kann
eine Wirtszelllinie gewählt
werden, die die Expression der inserierten Sequenzen moduliert,
oder das Genprodukt in der spezifischen gewünschten Art modifiziert und
verarbeitet. Solche Modifikationen (z. B. Glykosylierung) und Verarbeitung
(z. B. Spaltung) der Proteinprodukte kann wichtig für die Funktion
des Proteins sein. Verschiedene Wirtszellen weisen charakteristische
und spezifische Mechanismen für die
posttranslationale Verarbeitung und Modifikation der Proteine auf.
Geeignete Zelllinien oder Wirtssysteme können gewählt werden, um die richtige
Modifikation und Verarbeitung des zu exprimierenden fremden Proteins
sicherzustellen. Für
diesen Zweck können
eukaryontische Wirtszellen verwendet werden, die die zelluläre Maschinerie
für eine
einwandfreie Verarbeitung des Primärtranskripts, eine Glykosylierung
und Phosphorylierung des Genprodukts besitzen. Solche Säugetierwirtszellen
schließen
CHO, VERO, BHK, HeLa, COS, MDCK, 293, WI38, usw. ein, sind aber
nicht darauf beschränkt.
Zusätzlich
können Wirtszellen
gentechnisch verändert
werden, um verschiedene Enzyme zu exprimieren, um die einwandfreie
Verarbeitung des kodierten Polypeptids sicherzustellen. Zum Beispiel
kann das Gen für
die Prolyl-4-Hydroxylase zusammen mit einem Polynukleotid exprimiert
werden, das ein Kollagen oder Fragmente oder Varianten davon kodiert,
um eine einwandfreie Hydroxylierung zu erreichen.
-
Für eine Langzeitherstellung
mit hoher Ausbeute von rekombinanten Proteinen wird eine stabile
Expression bevorzugt. Zum Beispiel können Zelllinien, die die erfindungsgemäßen Kollagene
stabil exprimieren, gentechnisch hergestellt werden. Eher als Expressionsvektoren
zu verwenden, die virale Replikationsursprünge enthalten, können Wirtszellen
mit Kollagen kodierender DNA, die von geeigneten Expressionskontrollelementen
kontrolliert wird (z. B. Promotor, Enhancer, Sequenzen, Transkriptionsterminatoren,
Polyadenylierungsstellen, usw.) und einem selektierbaren Marker
transformiert werden. Der Einführung
der fremden DNA folgend, können
die gentechnisch veränderten
Zellen für
1–2 Tage
in einem angereicherten Medium wachsen und anschließend in
ein selektives Medium gebracht werden. Der selektierbare Marker
in dem rekombinanten Plasmid verleiht eine Resistenz gegen die Selektion
und erlaubt den Zellen, das Plasmid stabil in ihre Chromosomen zu
integrieren und zu wachsen, um Kolonien zu bilden, die wiederum
kloniert und in Zelllinien expandiert werden können. Daher können die
erfindungsgemäßen Verfahren
vorteilhafterweise verwendet werden, um Zelllinien gentechnisch
herzustellen, die ein gewünschtes
Tierkollagen oder Fragmente oder Varianten davon exprimieren.
-
Zum
Beispiel kann die Expression der erfindungsgemäßen Polypeptide, die durch
die Galactosepromotoren angetrieben wird, durch Züchten der
Kultur auf einem nicht reprimierenden, nicht induzierenden Zucker,
sodass eine sehr schnelle Induktion der Zugabe der Galactose folgt,
durch Züchten
der Kultur in Glucosemedium und anschließend Entfernen der Glucose
durch Zentrifugation und Waschen der Zellen vor der Resuspension
in einem Galactosemedium und durch Züchten der Zellen in einem Medium,
das sowohl Glucose als auch Galactose enthält, so dass die Glucose vorzugsweise
metabolisiert wird, bevor die Galactoseinduktion stattfinden kann,
induziert werden.
-
Die
Vektoren, die die erfindungsgemäßen Polypeptide
exprimieren, und die Vektoren, die die Polynukleotide exprimieren,
die irgendwelche gewünschten
posttranslationalen Enzyme kodieren, können in Wirtszellen eingeführt werden,
um die kodierten Polypeptide unter Verwendung von Techniken, die
dem Fachmann bekannt sind, herzustellen. Zum Beispiel werden Wirtszellen
mit den oben beschriebenen Expressionsvektoren transfiziert oder
infiziert oder transformiert und in Nährmedien, die zum Selektieren
der Transduktanten oder Transformanten, die den Kollagen kodierenden
Vektor enthalten, geeignet sind, kultiviert. Eine Zelltransfektion
kann durch eine Vielzahl von Verfahren, die dem Fachmann zur Verfügung stehen,
durchgeführt
werden, wie zum Beispiel durch Calciumphosphatpräzipitations-, Elektroporations-,
und Lipofectionstechniken. (Siehe z. B. Maniatis et al., supra,
Ohta T. (1996) Nippon Rinsho 54(3): 757-764; Trotter und Wood (1996)
Mol Biotechnol 6(3): 329-334; Mann und King (1989) J Gen Virol 70:
3501-3505 und Hartig et al. (1991) Biotechniques 11(3): 310).
-
In
einer Ausführungsform
wird ein Verfahren betrachtet, in welchem mehr als einer der Expressionsvektoren,
die die erfindungsgemäßen Polynukleotide
kodieren, in Zellen inseriert wird, sodass z. B. trimere Kollagene
synthetisiert werden können.
-
In
einem anderen erfindungsgemäßen Verfahren
wird die Herstellung von homotrimerem Kollagen betrachtet.
-
Wirtszellen,
die die kodierende Sequenz enthalten und das biologisch aktive Genprodukt
exprimieren, können
durch irgendeine Anzahl von im Stand der Technik bekannten Techniken
identifiziert werden. Solche Techniken schließen zum Beispiel das Nachweisen
der Bildung von Nukleinsäure-Hybridisationskomplexen, das
Nachweisen der Anwesenheit oder Abwesenheit von Markergenfunktionen,
durch Untersuchen der Transkriptionsmenge, wie durch die Expression
von mRNA-Transkripten in der Wirtszelle gemessen, und Nachweisen
des Genpro dukts, wie durch einen Immunassay oder durch die biologische
Aktivität
gemessen, ein.
-
In
dem ersten Ansatz kann die Anwesenheit des erfindungsgemäßen Polynukleotids
zum Beispiel durch den Nachweis von DNA-DNA oder DNA-RNA Hybridisationskomplexen
nachgewiesen werden oder durch die Amplifikation unter Verwendung
von Sonden, die Nukleotidsequenzen umfassen, die homolog zu der Tierkollagen
kodierenden Sequenz oder Abschnitten oder Derivaten davon sind.
Amplifikationsbasierte Assays umfassen die Verwendung von Oligonukleotiden
oder Oligomeren, die auf Sequenzen basieren, die homolog zu der
kodierenden Sequenz von Interesse sind, um Transformanten, die die
kodierenden Polynukleotide enthalten, nachzuweisen.
-
In
dem zweiten Ansatz wird der/das rekombinante Expressionsvektor/Wirtssystem
basierend auf der Anwesenheit oder Abwesenheit von bestimmten Markergenfunktionen
(z. B. Thymidinkinase-Aktivität,
Resistenz gegenüber
Antibiotika, Resistenz gegenüber
Methothrexat, Transformationsphänotyp,
Einschlusskörperbildung
in Baculovirus, usw.) identifiziert und ausgewählt. Zum Beispiel, wenn die
kodierende Sequenz in eine Markergensequenz des Vektors inseriert
wird, können
die rekombinanten Zellen, die die kodierende Sequenz enthalten,
durch die Abwesenheit der Markergenfunktion identifiziert werden.
Alternativ kann ein Markergen in eine Tandemanordnung mit der kodierenden
Sequenz gebracht werden, unter der Kontrolle desselben oder eines
anderen Promotors, der verwendet wird, um die Expression der kodierenden
Sequenz zu kontrollieren. Die Expression des Markers in Antwort
auf eine Induktion oder Selektion weist auf eine Expression der
kodierenden Sequenz hin.
-
In
dem dritten Ansatz kann die transkriptionelle Aktivität der kodierenden
Region durch Hybridisierungsassays untersucht werden. Zum Beispiel
kann RNA isoliert werden und durch einen Northern Blot analysiert werden,
unter Verwendung einer Sonde, die homolog zu der kodierenden Sequenz
oder bestimmten Abschnitten davon ist. Alternativ können Gesamt-Nukleinsäuren der
Wirtszelle extrahiert werden und auf eine Hybridisierung mit solchen
Sonden untersucht werden.
-
In
dem vierten Ansatz kann die Expression eines Proteinprodukts immunologisch
untersucht werden, zum Beispiel durch Western-Blots, Immunassays,
wie eine Radioimmunpräzipitation,
Enzym verbundene Immunassays und desgleichen.
-
In
einer Ausführungsform
werden die erfindungsgemäßen Tierkollagene
in das Kulturmedium sezerniert und können bis zur Homogenität durch
verschiedene Verfahren, die im Stand der Technik bekannt sind, gereinigt
werden, zum Beispiel durch eine Chromatographie. In einer Ausführungsform
werden die erfindungsgemäßen rekombinanten
Tierkollagene durch eine Größenausschluss-Chromatographie gereinigt.
Jedoch können
auch andere Reinigungstechniken, die im Stand der Technik bekannt
sind, verwendet werden, einschließlich Ionenaustausch-Chromatographie
und Umkehrphasen-Chromatographie. (Siehe z. B. Maniatis et al.,
supra, Ausubel et al., supra und Scopes (1994) Protein Purification:
Principles and Practice, Springer-Verlag New York, Inc., NY).
-
Die
erfindungsgemäßen Verfahren
können,
obwohl sie nicht in der Anwendung darauf beschränkt sind, in den unten aufgeführten Expressionssystemen
verwendet werden.
-
Prokaryontisch
-
In
prokaryontischen Systemen, wie bakteriellen Systemen, kann eine
Anzahl von Expressionsvektoren vorteilhafterweise abhängig von
der Verwendung, die für
das exprimierte Polypeptid beabsichtigt ist, ausgewählt werden.
Wenn zum Beispiel große
Mengen der erfindungsgemäßen Tierkollagene
und -gelatinen hergestellt werden sollen, wie für die Erzeugung von Antikörpern, können Vektoren,
die die Expression von großen Mengen
der Fusionsproteinprodukte, die einfach gereinigt werden, wünschenswert
sein. Solche Vektoren schließen
den E. coli Expressionsvektor pUR278 (Ruther et al. (1983) EMBO
J. 2: 1791), in welchem die kodierende Sequenz in den Vektor im
Leserahmen mit der lac Z-kodierenden Region ligiert werden kann,
sodass ein hybrides AS-lac Z-Protein hergestellt wird, pIN-Vektoren
(Inouye et al. (1985) Nucleic Acids Res. 13: 3101-3109 und Van Heeke
et al. (1989) J. Biol. Chem. 264: 5503-5509) und desgleichen ein,
sind aber nicht darauf beschränkt.
pGEX-Vektoren können
auch verwendet werden, um fremde Polypeptide als Fusionsproteine
mit Glutathion-S-Transferase (GST) zu exprimieren. Im Allgemeinen
sind solche Fusionsproteine löslich und
können
einfach aus lysierten Zellen durch eine Absorption an Glutathion-Agarose-Kügelchen,
gefolgt von einer Flution in der Anwesenheit von freiem Glutathion
gereinigt werden. Die pGEX-Vektoren
werden entworfen, um Thrombin- oder Faktor Xa-Proteasespaltstellen
einzuschließen,
sodass das klonierte Polypeptid von Interesse aus dem GST-Rest freigesetzt
werden kann.
-
Hefe
-
In
einer Ausführungsform
werden die erfindungsgemäßen Polypeptide
in einem Hefe-Expressionssystem hergestellt. In Hefe kann eine Anzahl
von Vektoren, die konstitutive oder induzierbare Promotoren enthalten,
die im Stand der Technik bekannt sind, verwendet werden. (Siehe
z. B. Ausubel et al., supra, Band 2, Kapitel 13; Grant et al. (1987)
Expression and Secretion Vectors for Yeast, in Methods in Enzymology,
Hrsg. Wu & Grossman,
Acad. Press, N.Y. 153: 516-544; Glover (1986) DNA Cloning, Band
II, IRL Press, Wash., D.C., Kapitel 3; Bitter (1987) Heterologous
Gene Expression in Yeast, in Methods in Enzymology, Hrsg. Berger & Kimmel, Acad.
Press, N.Y. 152: 673-684 und The Molecular Biology of the Yeast
Saccharomyces, Hrsg. Strathern et al., Cold Spring Harbor Press,
Band I und II (1982)).
-
Die
erfindungsgemäßen Polypeptide
können
unter Verwendung von Wirtszellen, zum Beispiel aus der Hefe Saccharomyces
cerevisiae, exprimiert werden. Diese besondere Hefe kann mit irgendeinem
einer großen
Anzahl von Expressionsvektoren verwendet werden. Gängig eingesetzte
Expressionsvektoren sind Shuttle-Vektoren,
die den 2 μ-Replikationsursprung
für die
Vermehrung in Hefe und den Col E1-Ursprung für E. coli für eine effiziente Transkription
des fremden Gens enthalten. Ein typisches Beispiel solcher Vektoren,
die auf 2 μ-Plasmiden
basieren, stellt pWYG4 dar, welcher die 2 μ-ORI-STB Elemente, den GAL1-10-Promotor
und den 2 μ-D-Genterminator
aufweist. In diesem Vektor wird eine NcoI Klonierungsstelle verwendet,
um das Gen für
das zu exprimierende Polypeptid zu inserieren, und um das ATG-Startcodon
bereitzustellen. Ein anderer Expressionsvektor ist pWYG7L, der intakte
2α ORI,
STB, REP1 und REP2 und den GAL1-10-Promotor aufweist und den FLP-Terminator
verwendet. In diesem Vektor wird das kodierende Polynukleotid in
den Polylinker mit seinen 5'-Enden
an einer BamHI- oder
NcoI-Stelle inseriert. Der Vektor, der das inserierte Polynukleotid enthält, wird
in S. cerevisiae transformiert, entweder nach dem Entfernen der
Zellwand, und Spheroplasten herzustellen, die die DNA bei einer
Behandlung mit Calcium und Polyethylenglykol aufnehmen, oder durch eine
Behandlung der intakten Zellen mit Lithiumionen.
-
Alternativ
kann die DNA durch eine Elektroporation eingeführt werden. Die Transformanten
können ausgewählt werden,
zum Beispiel unter Verwendung von Wirtshefezellen, die auxotrophisch
für Leucin,
Tryptophan, Uracil oder Histidin sind, zusammen mit selektierbaren
Markergenen, wie LEU2, TRP1, URA3, HIS3 oder LEU2-D.
-
In
einer Ausführungsform
der Erfindung werden die erfindungsgemäßen Polynukleotide in Wirtszellen aus
der Hefe Pichia eingeführt.
Arten von nicht-Saccharomyces
Hefe, wie Pichia pastoris, scheinen spezielle Vorteile beim Herstellen
hoher Ausbeuten von rekombinantem Protein in großmaßstäbigen Verfahren aufzuweisen.
Zusätzlich
ist ein Pichia-Expressionskit von der Invitrogen Corporation (San
Diego, CA) verfügbar.
-
Es
gibt eine Anzahl von Methanol empfindlichen Genen in methylotrophen
Hefen, wie Pichia pastoris, wobei die Expression von jedem durch
Methanol empfindliche regulatorische Regionen kontrolliert wird,
die auch als Promotoren bezeichnet werden. Irgendwelche von solchen
Methanol empfindlichen Promotoren sind für die Verwendung in der Ausführung der
vorliegenden Erfindung geeignet. Beispiele für spezifische regulatorische
Regionen schließen
den AOX1-Promotor, den AOX2-Promotor, die Dihydroxyacetonsynthase
(DAS), den P40-Promotor und den Promotor für das Katalasegen aus P. pastoris,
usw. ein.
-
In
anderen Ausführungsformen
umfasst die vorliegende Erfindung die Verwendung der methylotrophen
Hefe Hansenula polymorpha. Wachstum auf Methanol führt zur
Induktion von Schlüsselenzymen
des Methanolmetabolismus, wie MOX (Methanoloxidase), DAS (Dihydroxyacetonsynthase)
und FMHD (Formatdehydrogenase). Diese Enzyme können bis zu 30–40% des
gesamten Zellproteins ausmachen. Die Gene, die die MOX-, DAS- und
FMDH-Herstellung kodieren, werden durch starke Promotoren kontrolliert,
die durch das Wachstum auf Methanol induziert werden und durch Wachstum
auf Glucose reprimiert werden. Irgendeiner oder alle drei von diesen
Promotoren können
verwendet werden, um eine Expression großer Mengen der heterologen
Gene in H. polymorpha zu erhalten. Daher wird in einem Aspekt der
Erfindung ein Polynukleotid, das ein Tierkollagen oder Fragmente
oder Varianten davon kodiert, in einen Expressionsvektor unter der
Kontrolle eines induzierbaren H. polymorpha-Promotors kloniert.
Wenn eine Sekretion des Produkts gewünscht wird, wird ein Polynukleotid,
das eine Signalsequenz für
die Sekretion in Hefe kodiert, im Leserahmen mit dem Polynukleotid
fusioniert. In einer anderen Ausführungsform enthält der Expressionsvektor
vorzugsweise ein auxotrophes Markergen, wie URA3 oder LEU2, das
verwendet werden kann, um den Mangel eines auxotrophen Wirtes zu
ergänzen.
-
Der
Expressionsvektor wird anschließend
verwendet, um H. polymorpha-Wirtszellen
unter Verwendung von Techniken, die dem Fachmann bekannt sind, zu
transformieren. Eine nützliche
Eigenschaft der H. polymorpha-Transformation stellt die spontane
Integration von bis zu 100 Kopien des Expressionsvektors in das
Genom dar. In den meisten Fällen
bildet das integrierte Polynukleotid Multimere, die eine Kopf-Schwanz(engl.:
head-to-tail)-Anordnung aufweisen. Für das integrierte fremde Polynukleotid
wurde gezeigt, dass es in mehreren rekombinanten Linien mitotisch
stabil ist, selbst unter nicht selektiven Bedingungen. Dieses Phänomen der
Integration vieler Kopien trägt
weiterhin zu dem hohen Produktivitätspotenzial des Systems bei.
-
Pilze
-
Filamentöse Pilze
können
auch verwendet werden, um die erfindungsgemäßen Polypeptide herzustellen.
Vektoren zum Exprimieren und/oder Sezernieren von rekombinanten
Proteinen in filamentösen
Pilzen sind gut bekannt, und der Fachmann könnte diese Vektoren verwenden,
um die erfindungsgemäßen rekombinanten
Tierkollagene zu exprimieren.
-
Pflanze
-
In
einem Aspekt umfasst die vorliegende Erfindung die Herstellung von
Tierkollagenen und -gelatinen in Pflanzen und Pflanzenzellen. In
den Fällen,
in denen Pflanzen-Expressionsvektoren verwendet werden, kann die
Expression von Sequenzen, die die erfindungsgemäßen Kollagene kodieren, durch
irgendeinen aus einer Anzahl von Promotoren angetrieben werden.
Zum Beispiel können
virale Promotoren, wie die 35S RNA- und 19S RNA-Promotoren des CaMV
(Brisson et al. (1984) Nature 310: 511-514) oder der Hüllprotein-Promotor
des TMV (Takamatsu et al. (1987) EMBO J. 6: 307-311) verwendet werden,
alternativ können
Pflanzenpromotoren, wie die kleine Untereinheit der RUBISCO (Coruzzi
et al. (1984) EMBO J. 3: 1671-1680; Broglie et al. (1984) Science
224: 838-843) oder Hitzeschock-Promotoren, z. B. Sojabohnen-hsp17.5-E
oder hsp17.3-B (Gurley et al. (1986) Mol. Cell. Biol. 6: 559-565)
verwendet werden. Diese Konstrukte können in Pflanzenzellen durch
eine Vielzahl von Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, wie
durch Verwenden von Ti-Plasmiden, Ri-Plasmiden, Pflanzen-Virusvektoren, direkter
DNA-Transformation, Mikroinjektion, Elektroporation, usw. eingeführt werden.
Für Übersichten über solche
Techniken siehe zum Beispiel Weissbach & Weissbach, Methods for Plant Molecular
Biology, Academic Press, NY, Sektion VIII, S. 421-463 (1988); Grierson & Corey, Plant
Molecular Biology, 2. Aufl., Blackie, London, Kapitel 7–9 (1988);
Transgenic Plants: A Production Sys tem for Industrial and Pharmaceutical
Proteins, Owen und Pen, Hrsg., John Wiley & Sons, 1996; Transgenic Plants, Galun
und Breiman Hrsg., Imperial College Press, 1997 und Applied Plant
Biotechnology, Chopra, Malik und Bhat, Hrsg., Science Publishers,
Inc., 1999.
-
Pflanzenzellen
stellen natürlicherweise
nicht ausreichende Mengen von posttranslationalen Enzymen her, um
effizient stabiles Kollagen herzustellen. Daher stellt die vorliegende
Erfindung bereit, dass, wo eine Hydroxylierung gewünscht ist,
Pflanzenzellen, die verwendet werden, um die erfindungsgemäßen Tierkollagene zu
exprimieren, mit den nötigen
posttranslationalen Enzymen ergänzt
werden, um ausreichend stabiles Kollagen herzustellen. In einer
bevorzugten Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung ist das posttranslationale Enzym Prolyl-4-Hydroxylase.
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Verfahren
zum Herstellen der erfindungsgemäßen Tierkollagene
oder -gelatinen in Pflanzensystemen können durch Bereitstellen einer
Biomasse aus Pflanzen oder Pflanzenzellen erreicht werden, worin
die Pflanzen oder Pflanzenzellen mindestens eine kodierende Sequenz
umfassen, die funktionsfähig
mit einem Promotor verbunden ist, um die Expression des Polypeptids
zu bewirken, und das Polypeptid wird anschließend aus der Biomasse extrahiert.
Alternativ kann das Polypeptid ein nicht-extrahiertes sein, d. h.
es wird in das Endosperm usw. exprimiert.
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Pflanzen-Expressionsvektoren
und Reportergene sind im Allgemeinen im Stand der Technik bekannt. (Siehe
z. B. Gruber et al. (1993) in Methods of Plant Molecular Biology
and Biotechnology, CRC Press). Typischerweise umfasst der Expressionsvektor
ein Nukleinsäurekonstrukt,
das zum Beispiel rekombinant oder synthetisch erzeugt wurde, und
umfasst einen Promotor, der in einer Pflanzenzelle funktionsfähig ist,
worin ein solcher Promotor funktionsfähig mit einer Nukleinsäuresequenz
verbunden ist, die ein Tierkollagen oder Fragmente oder Varianten
davon kodiert, oder ein posttranslationales Enzym, das wichtig für die Biosynthese
des Kollagens ist.
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Promotoren
treiben die Menge der Proteinexpression in Pflanzen an. Um eine
gewünschte
Menge der Proteinexpression in Pflanzen herzustellen, kann die Expression
unter der Steuerung eines Pflanzenpromotors stattfinden. Promotoren,
die für
eine erfindungsgemäße Verwendung
geeignet sind, sind allgemein im Stand der Technik verfügbar. (Siehe
z. B. PCT Veröffentlichung
Nr.
WO 91/19806 ). Beispiele
für Promotoren,
die erfindungsgemäß verwendet
werden können,
schließen
nicht konstitutive Promotoren oder konstitutive Promotoren ein.
Diese Promotoren schließen
den Promotor für
die kleine Untereinheit der Ribulose-1,5-bisphosphatcarboxylase; Promotoren aus
Tumor induzierenden Plasmiden von Agrobacterium tumefaciens, wie
die RUBISCO-Nopalinsynthase(NOS)- und Octopinsynthase-Promotoren,
bakterielle T-DNA-Promotoren, wie mas- und ocs-Promotoren und virale Promotoren, wie
die Blumenkohl-Mosaikvirus (CaMV) 19S- und 35S-Promotoren oder den Braunwurz-Mosaikvirus
35S-Promotor ein, sind aber nicht darauf beschränkt.
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Die
erfindungsgemäßen Polynukleotidsequenzen
können
unter der transkriptionellen Kontrolle eines konstitutiven Promotors
stehen, welcher die Expression des Kollagens oder des posttranslationalen
Enzyms in den meisten Geweben einer Pflanze steuert. In einer Ausführungsform
steht die Polynukleotidsequenz unter der Kontrolle des Blumenkohl-Mosaikvirus
(CaMV) 35S-Promotors. Die doppelsträngige Caulimovirus-Familie hat
die einzige wichtigste Promotorexpression für eine transgene Expression
in Pflanzen bereitgestellt, insbesondere den 35S-Promotor. (Siehe z. B. Kay et al. (1987)
Science 236: 1299). Zusätzliche
Promotoren aus dieser Familie, wie der Braunwurz-Mosaikvirus-Promotor,
usw., wurden im Stand der Technik beschrieben und können auch
erfindungsgemäß verwendet
werden. (Siehe z. B. Sanger et al. (1990) Plant Mol. Biol. 14: 433-443;
Medberry et al. (1992) Plant Cell 4: 195-192 und Yin und Beachy
(1995) Plant J. 7: 969-980).
-
Die
Promotoren, die in den erfindungsgemäßen Polynukleotidkonstrukten
verwendet werden, können modifiziert
werden, wenn es gewünscht
ist, um ihre Kontrolleigenschaften zu beeinflussen. Zum Beispiel
kann der CaMV-Promotor an den Abschnitt des RUBISCO-Gens ligiert
werden, der die Expression der RUBISCO in Abwesenheit von Licht
reprimiert, um einen Promotor zu erzeugen, der in Blättern, aber
nicht in Wurzeln aktiv ist. Der sich ergebende chimäre Promotor
kann wie hier beschrieben wird, verwendet werden.
-
Konstitutive
Pflanzenpromotoren, die allgemeine Expressionseigenschaften, die
im Stand der Technik bekannt sind, aufweisen, können mit den erfindungsgemäßen Expressionsvektoren
verwendet werden. Diese Promotoren werden häufig in den meisten Pflanzengeweben
exprimiert und schließen
zum Beispiel den Aktinpromotor und den Ubiquitinpromotor ein. (Siehe
z. B. McElroy et al. (1990) Plant Cell 2: 163-171 und Christensen
et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18: 675-689).
-
Alternativ
kann das erfindungsgemäße Polypeptid
in einem spezifischen Gewebe, Zelltyp oder unter genaueren Umgebungsbedingungen
oder unter Entwicklungskontrolle exprimiert werden. Promotoren,
die die Expression in diesen Fällen
steuern, sind als induzierbare Promotoren bekannt. In dem Fall,
in dem ein gewebespezifischer Promotor verwendet wird, ist die Proteinexpression
besonders hoch in dem Gewebe, aus welchem die Extraktion des Proteins
erwünscht
ist. Abhängig
von dem gewünschten
Gewebe kann die Expression auf das Endosperm, die Aleuronschicht,
den Embryo (oder seine Teile, wie Scutellum und Keimblätter), das Perikarp,
den Stamm, die Blätter,
die Knollen, die Wurzeln, usw. gelenkt werden. Beispiele bekannter
gewebespezifischer Promotoren schließen den knollenspezifischen
Klasse I Patatin-Promotor, die Promotoren, die mit Kartoffelknollen-ADPGPP-Genen verbunden
sind, den Sojabohnen-Promotor von β-Conglycinin (7S-Protein), der
die samenspezifische Transkription antreibt und auf samenspezifische
Promotoren aus den Zein-Genen des Maisendosperms ein. (Siehe z.
B. Bevan et al. (1986) Nucleic Acids Res. 14: 4625-38; Muller et
al. (1990) Mol. Gen. Genet. 224: 136-46; Bray (1987) Planta 172:
364-370 und Pedersen et al. (1982) Cell 29: 1015-26).
-
In
einer bevorzugten Ausführungsform
werden die erfindungsgemäßen Polypeptide
in Samen durch samenbasierte Herstellungstechniken hergestellt,
unter Verwendung von zum Beispiel Raps, Mais, Sojabohnen, Reis und
Gerstensaat. In einem solchen Verfahren wird das Produkt zum Beispiel
während
der Samenkeimung gewonnen. (Siehe z. B. PCT Veröffentlichungen Nummern
WO 9940210 ;
WO 9916890 ;
WO 9907206 ;
US Patent Nr. 5,866,121 ;
US Patent Nr. 5,792,933 und alle darin
zitierten Referenzen).
-
Promotoren,
die verwendet werden können,
um die Expression der Polypeptide zu steuern, können heterolog oder nicht heterolog
sein. Diese Promotoren können
auch verwendet werden, um die Expression von Antisense-Nukleinsäuren anzutreiben,
um die Konzentration und Zusammensetzung der erfindungsgemäßen Tierkollagene
in einem gewünschten
Gewebe zu reduzieren, zu erhöhen
oder zu verändern.
-
Andere
Modifikationen, die vorgenommen werden können, um die Transkription
der erfindungsgemäßen Polypeptide
in einer Pflanze oder in Pflanzenzellen zu erhöhen und/oder zu maximieren,
sind Standard und dem Fachmann bekannt. Zum Beispiel kann ein Vektor,
der eine Polynukleotidsequenz umfasst, die ein/e rekombinantes Tierkollagen
oder -gelatine oder ein Polypeptid, von welchem die rekombinante
Tiergelatine abgeleitet werden kann, oder ein Fragment oder eine
Variante davon, die funktionsfähig
mit einem Promotor verbunden ist, weiterhin mindestens einen Faktor
umfassen, der die Transkriptionsgeschwindigkeit des Kollagens oder
von verwandten posttranslationalen Enzymen modifiziert, einschließlich, aber
nicht beschränkt
auf eine Peptidexport-Signalsequenz, Codon-Usage, Introns, Polyadenylierung und
Transkriptionsterminationsstellen. Verfahren zum Modifizieren von
Konstrukten, um Expressionsmengen in Pflanzen zu erhöhen, sind
im Stand der Technik allgemein bekannt. (Siehe z. B. Rogers et al.
(1985) J. Biol. Chem. 260: 3731 und Cornejo et al. (1993) Plant
Mol Biol 23: 567-58).
Beim gentechnischen Herstellen eines Pflanzensystems, das die Geschwindigkeit
der Transkription der erfindungsgemäßen Kollagene und verwandter
posttranslationaler Enzyme beeinflusst, können verschiedene Faktoren,
die im Stand der Technik bekannt sind, einschließlich regulatorischer Sequenzen,
wie positiv oder negativ wirkender Sequenzen, Enhancer und Silencer,
sowie die Chromatinstruktur die Geschwindigkeit der Transkription
in Pflanzen beeinflussen.
-
Die
vorliegende Erfindung stellt bereit, dass mindestens einer dieser
Faktoren beim Exprimieren der hier beschriebenen rekombinanten Tierkollagene
und -gelatinen verwendet werden kann.
-
Die
Vektoren, die die erfindungsgemäßen Polynukleotide
umfassen, werden typischerweise ein Markergen umfassen, das Pflanzenzellen
einen selektierbaren Phänotyp
verleiht. Üblicherweise
wird das selektierbare Markergen eine Antibiotikumsresistenz mit
geeigneten Genen kodieren, einschließlich von mindestens einem
Satz der Gene, die eine Resistenz gegen das Antibiotikum Spectinomycin
kodieren, des Streptomycinphosphotransferase-(SPT)-Gens, das für eine Streptomycinresistenz
kodiert, des Neomycinphosphotransferase-(NPTH)-Gens, das eine Kanamycin-
oder Geneticinresistenz kodiert, der Hygromycin-Resistenz, der Gene,
die für
eine Resistenz gegen Herbizide kodieren, die wirken, um die Wirkung
der Acetolactatsynthase (ALS) zu inhibieren, insbesondere die Herbizide
des Sulfonylharnstoff-Typs (z. B. das Acetolactatsynthase-(ALS)-Gen,
das Mutationen enthält,
die zu einer solchen Resistenz führen,
insbesondere die S4- und/oder Hra-Mutationen), der Gene, die für eine Resistenz
gegen Herbizide kodieren, die wirken, um die Wirkung der Glutaminsynthase
zu inhibieren, wie Phosphinotricin oder Basta (z. B. das bar-Gen)
oder anderer ähnlicher, im
Stand der Technik bekannter Gene. Das bar-Gen kodiert eine Resistenz
gegen das Herbizid Basta, das nptII-Gen kodiert eine Resistenz gegen
die Antibiotika Kanamycin und Geneticin und das ALS-Gen kodiert
eine Resistenz gegen das Herbizid Chlorsulfuron.
-
Typische
Vektoren, die für
eine Expression von fremden Genen in Pflanzen geeignet sind, sind
im Stand der Technik gut bekannt, einschließlich, aber nicht beschränkt auf
Vektoren, die von dem Tumor induzierenden (Ti) Plasmid von Agrobacterium
tumefaciens abgeleitet sind. Diese Vektoren stellen Pflanzen-Integrationsvektoren
dar, die bei einer Transformation einen Abschnitt der DNA in das
Genom der Wirtspflanze integrieren. (Siehe z. B. Rogers et al. (1987)
Meth. In Enzymol. 153: 253-277; Schardl et al. (1987) Gene 61: 1-11
und Berger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86: 8402-8406).
-
Vektoren,
die Sequenzen umfassen, die die erfindungsgemäßen Polypeptide kodieren, und
Vektoren, die posttranslationale Enzyme oder Untereinheiten davon
umfassen, können
zusammen in die gewünschte Pflanze
eingeführt
werden. Verfahren zum Transformieren von Pflanzenzellen stehen im
Stand der Technik zur Verfügung,
zum Beispiel direkter Gentransfer, in vitro Protoplastentransformation,
Pflanzenvirus vermittelte Transformation, Liposomen vermittelte
Transformation, Mikroinjektion, Elektroporation, Agrobacterium vermittelte
Transformation und Teilchenbeschuss. (Siehe z. B. Paszkowski et
al. (1984) EMBO J. 3: 2717-2722;
U.S. Patent
Nr. 4,684,611 ;
europäische Anmeldung
Nr. 0 67 553 ;
U.S.
Patent Nr. 4,407,956 ;
U.S.
Patent Nr. 4,536,475 ; Crossway et al. (1986) Biotechniques
4: 320-334, Riggs et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 5602-5606;
Hinchee et al. (1988) Biotechnology 6: 915-921 und
U.S. Patent Nr. 4,945,050 ). Standardverfahren
für die
Transformation von z. B. Reis, Weizen, Mais, Hirse und Gerste sind
im Stand der Technik beschrieben. (Siehe z. B. Christou et al. (1992)
Trends in Biotechnology 10: 239 und Lee et al. (1991) Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 88: 6389). Weizen kann durch Techniken transformiert werden,
die jenen ähnlich
sind, die für das
Transformieren von Mais oder Reis eingesetzt werden. Darüber hinaus
beschreiben Casas et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 11212
ein Verfahren zum Transformieren von Hirse, während Wan et al. (1994) Plant.
Physi ol. 104:37 ein Verfahren zum Transformieren von Gerste lehren.
Geeignete Verfahren für
eine Mais-Transformation werden von Fromm et al. (1990) Bio/Technology
8: 833 und von Gordon-Kamm et al., supra bereitgestellt.
-
Zusätzliche
Verfahren, die verwendet werden können, um Pflanzen zu erzeugen,
die erfindungsgemäße Tierkollagene
herstellen, sind im Stand der Technik gut etabliert. (Siehe z. B.
U.S. Patent Nr. 5,959,091 ,
U.S. Patent Nr. 5,859,347 ;
U.S. Patent Nr. 5,763,241 ;
U.S. Patent Nr. 5,659,122 ;
U.S. Patent Nr. 5,593,874 ;
U.S. Patent Nr. 5,495,071 ;
U.S. Patent Nr. 5,424,412 ;
U.S. Patent Nr. 5,362,865 ,
U.S. Patent Nr. 5,229,112 ;
U.S. Patent Nr. 5,981,841 ;
U.S. Patent Nr. 5,959,179 ;
U.S. Patent Nr. 5,932,439 ;
U.S. Patent Nr. 5,869,720 ;
U.S. Patent Nr. 5,804,425 ,
U.S. Patent Nr. 5,763,245 ;
U.S. Patent Nr. 5,716,837 ;
U.S. Patent Nr. 5,689,052 ;
U.S. Patent Nr. 5,633,435 ;
U.S. Patent Nr. 5,631,152 ,
U.S. Patent Nr. 5,627,061 ;
U.S. Patent Nr. 5,602,321 ;
U.S. Patent Nr. 5,589,612 ,
U.S. Patent Nr. 5,510,253 ;
U.S. Patent Nr. 5,503,999 ;
U.S. Patent Nr. 5,378,619 ;
U.S. Patent Nr. 5,349,124 ;
U.S. Patent Nr. 5,304,730 ,
U.S. Patent Nr. 5,185,253 ;
U.S. Patent Nr. 4,970,168 ; europäische Veröffentlichung
Nr.
EPA 00709462 ;
europäische
Veröffentlichung
Nr.
EPA 00578627 ;
europäische
Veröffentlichung
Nr.
EPA 00531273 ;
europäische
Veröffentlichung
Nr.
EPA 00426641 ;
PCT Veröffentlichung
Nr.
WO 99/31248 ; PCT
Veröffentlichung
Nr.
WO 98/58069 ; PCT
Veröffentlichung
Nr.
WO 98/45457 ; PCT
Veröffentlichung
Nr.
WO 98/31812 ; PCT
Veröffentlichung
Nr.
WO 98/08962 ; PCT
Veröffentlichung
Nr.
WO 97/48814 ; PCT
Veröffentlichung
Nr.
WO 97/30582 und
PCT Veröffentlichung
Nr.
WO 97/17459 ).
-
Insekt
-
Ein
anderes alternatives Expressionssystem, das gemäß den erfindungsgemäßen Verfahren
verwendet wird, stellt ein Insektensystem dar. Baculoviren sind
sehr effiziente Expressionsvektoren für die Herstellung in großem Maßstab von
verschiedenen rekombinanten Proteinen in Insektenzellen. Die Verfahren,
wie sie zum Beispiel in Luckow et al. (1989) Virology 170: 31-39
und Gruenwald, S. und Heitz, J. (1993) Baculovirus Expression Vector
System: Procedures & Methods
Manual, Pharmingen, San Diego, CA beschrieben werden, können eingesetzt
werden, um Expressionsvektoren zu konstruieren, die eine Kollagen
kodierende Sequenz für
die erfindungsgemäßen Kollagene
und die geeigneten transkriptionellen/translationellen Kontrollsignale enthalten.
Zum Beispiel kann die rekombinante Herstellung von Proteinen in
Insektenzellen durch eine Infektion von Baculovirus-Vektoren, die das
Polypeptid kodieren, erreicht werden. In einem Aspekt der vorliegenden Erfindung
kann die Herstellung von rekombinanten Polypeptiden mit stabilen
Dreifachhelices die Koinfektion von Insektenzellen mit drei Baculoviren
umfassen, wobei eines das zu exprimierende Tierkollagen kodiert
und jeweils eines die α-Untereinheit
und die β-Untereinheit
der Prolyl-4-Hydroxylase kodiert. Dieses Insektenzellsystem erlaubt
die Herstellung von rekombinanten Proteinen in großen Mengen.
In einem solchen System wird das Autographe californica nukleäre Polyhedrosisvirus
(AcNPV) als Vektor verwendet, um fremde Gene zu exprimie ren. Das
Virus wächst
in Spodoptera frugiperda-Zellen. Die kodierende Sequenz für die erfindungsgemäßen Polypeptide
können
in nicht essenzielle Regionen (zum Beispiel das Polyhedron-Gen)
des Virus kloniert werden und unter die Kontrolle eines AcNPV-Promotors
gebracht werden (zum Beispiel der Polyhedron-Promotor). Eine erfolgreiche Insertion
einer kodierenden Sequenz wird zu einer Inaktivierung des Polyhedron-Gens
und zur Herstellung von nicht eingeschlossenem rekombinantem Virus
(d. h. einem Virus, dem die Proteinhülle fehlt, die das Polyhedron-Gen
kodiert) führt.
Diese rekombinanten Viren werden anschließend verwendet, um Spodoptera
frugiperda-Zellen zu infizieren, in welchen das inserierte Gen exprimiert
wird. (Siehe z. B. Smith et al. (1983) J. Virol. 46: 584 und
U.S. Patent Nr. 4,215,051 ).
Weitere Beispiele für
dieses Expressionssystem können
zum Beispiel in Ausubel et al., supra gefunden werden.
-
Tier
-
In
Tier-Wirtszellen kann eine Anzahl von Expressionssystemen verwendet
werden. In den Fällen,
in denen ein Adenovirus als ein Expressionsvektor verwendet wird,
können
die erfindungsgemäßen Polynukleotidsequenzen
an einen Adenovirus-Transkriptions-/Translations-Kontrollkomplex
ligiert werden, z. B. den späten
Promotor und die dreiteilige Leader-Sequenz. Dieses chimäre Gen kann
anschließend
in das Adenovirus-Genom durch eine in vitro oder in vivo Rekombination
inseriert werden. Eine Insertion in eine nicht essenzielle Region
des viralen Genoss (z. B. die Region E1 oder E3) wird zu einem rekombinanten
Virus führen,
das lebensfähig
und in der Lage ist, die kodierten Polypeptide in infizierten Wirten
zu exprimieren. (Siehe z. B. Logan & Shenk, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
81: 3655-3659 (1984)).
Alternativ kann der Vaccinia-7.5K-Promotor verwendet werden. (Siehe
z. B. Mackett et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 7415-7419;
Mackett et al. (1982) J. Virol. 49: 857-864 und Panicali et al.
(1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 4927-4931).
-
Ein
bevorzugtes Expressionssystem in Säugetier-Wirtszellen stellt
das Semliki-Forest-Virus
dar. Eine Infektion von Säugetier-Wirtszellen,
zum Beispiel Baby hamster-Nieren(BHK für engl.: baby hamster kidney)-Zellen
und chinesische Hamster Ovar(CHO)-Zellen kann sehr hohe rekombinante
Expressionsmengen ergeben. Das Semliki-Forest-Virus ist ein bevorzugtes
Expressionssystem, da das Virus einen breiten Wirtsbereich aufweist,
sodass eine Infektion von Säugetier-Zelllinien möglich sein
wird. Spezifischer wird erwartet, dass die Verwendung des Semliki-Forest-Virus
in einem weiten Bereich von Wirten verwendet werden kann, da das
System nicht auf einer chromosomalen Integration basiert und daher
einen schnellen Weg darstellen wird, um Modifikationen der rekombinanten
Tierkollagene in Studien zu erreichen, die sich auf das Identifizieren
von Struktur-Funktions-Beziehungen
und das Überprüfen der
Wirkungen verschiedener Hybridmoleküle richten. Verfahren zum Konstruieren
von Semliki-Forest-Virus-Vektoren zur Expression von exogenen Proteinen
in Säugetier-Wirtszellen
werden zum Beispiel in Olkkonen et al. (1994) Methods Cell Biol
43: 43-53 beschrieben.
-
Nicht-menschliche
transgene Tiere können
auch verwendet werden, um die erfindungsgemäßen Polypeptide zu exprimieren.
Solche Systeme können
durch funktionsfähiges
Verbinden des erfindungsgemäßen Polynukleotids
mit einem Promotor, zusammen mit anderen benötigten oder optionalen regulatorischen
Sequenzen konstruiert werden, die in der Lage sind, eine Expression
in Milchdrüsen
zu bewirken. Ebenso können die
benötigten
oder optionalen posttranslationalen Enzyme gleichzeitig in den Zielzellen
unter Einsetzung geeigneter Expressionssysteme hergestellt werden.
Verfahren zum Verwenden von nicht-menschlichen transgenen Tieren,
um Proteine rekombinant herzustellen, sind im Stand der Technik
bekannt. (Siehe z. B.
U.S. Patent Nr.
4,736,866 ;
U.S. Patent
Nr. 5,824,838 ;
U.S.
Patent Nr. 5,487,992 und
U.S.
Patent Nr. 5,614,396 ).
-
Verwendung von Kollagenen
und Gelatinen
-
Die
erfindungsgemäßen rekombinanten
Kollagene und Gelatinen sind für
eine Vielzahl von Anwendungen geeignet. Kollagen wird weit in vielzähligen Anwendungen
der medizinischen, pharmazeutischen, Nahrungsmittel- und kosmetischen
Industrie verwendet. Zum Beispiel stellt Kollagen einen wichtigen
Bestandteil von arteriellen Verschlüssen, Knochentransplantaten,
Arzneimittelabgabesystemen, Hautimplantaten, Arterienklemmen und
Inkontinenzimplantaten dar. In Behandlungen von Autoimmunstörungen,
wie rheumatoider Arthritis, wurde Kollagen in Studien auf sein Potenzial überprüft, eine
orale Toleranz zu induzieren. Kollagen wird auch in Nahrungsmittelprodukten
verwendet, wie Wursthüllen
und anderen Kollagen basierten Hüllen,
die von zum Beispiel Schweine-, Rinder- und Schafsquellen abgeleitet
werden. In Gesundheits- und Schönheitsanwendungen
kann Kollagen zum Beispiel in Kosmetika oder Gesichts- und Hautprodukten,
wie Feuchtigkeitscremen, gefunden werden. Zur Zeit werden verschiedene
Kollagene, die in verschiedenen Anwendungen verwendet werden, aus
Tierquellen unter Verwendung enzymatischer und chemischer Verfahren
abgeleitet. Zum Beispiel wird kommerziell verfügbares bovines Kollagen aus
Rindergeweben und -knochen isoliert und umfasst ein Gemisch aus
hauptsächlich
den Typen I- und III-Kollagen. Diese Form des Kollagens wird auch
als ein injizierbares Hilfsmittel bei Menschen verwendet.
-
Gelatine
kommt in der Herstellung oder als Bestandteil von verschiedenen
pharmazeutischen und medizinischen Produkten und Hilfsmitteln vor,
einschließlich
pharmazeutischen Stabilisatoren, z. B. Arzneimittel und Impfstoff,
Plasma- Streckmitteln,
Schwämmen,
harten und weichen Gelatinekapseln, Zäpfchen, usw.
-
Die
Film bildenden Eigenschaften der Gelatine werden in verschiedenen
Film-Beschichtungssystemen
eingesetzt, die spezifisch für
pharmazeutische orale, feste Dosierungsformen entworfen sind, einschließlich Kapseln
und Tabletten mit kontrollierter Freisetzung.
-
Gelatine
in verschiedenen essbaren Formen wurde lange in der Nahrungsmittel- und Getränkeindustrie
verwendet. Gelatine dient als Emulgator und Verdickungsmittel in
verschiedenen geschlagenen Garnierungen, sowie in Suppen und Soßen. Gelatine
wird als Flockungsmittel beim Klären
und Schönen
verschiedener Ge tränke,
einschließlich
von Weinen und Fruchtsäften
verwendet. Gelatine wird in verschiedenen Niedrig- und reduzierten
Fettprodukten als Verdickungsmittel und Stabilisator verwendet und
kommt anderswo als Fettersatzstoff vor. Gelatine wird auch weit
bei der Mikroeinkapselung von Aromastoffen, Farben und Vitaminen
verwendet. Gelatine kann auch als ein Proteinergänzungsmittel in verschiedenen
Hochenergie- und Nährstoffgetränken und
Nahrungsmitteln verwendet werden, wie jenen, die in der Gewichtsabnahme-
und athletischen Industrie verbreitet sind. Als ein Filmbildner
wird Gelatine beim Beschichten von Früchten, Fleisch, Feinkostartikeln
und in verschiedenen Süßwarenprodukten,
einschließlich
Bonbons und Gummi, usw. verwendet.
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In
der kosmetischen Industrie kommt Gelatine in einer Vielzahl von
Haarpflege- und
Hautpflegeprodukten vor. Gelatine wird als Verdickungsmittel und
Substanz gebendes Mittel in einer Anzahl von Shampoos, Schaumfestigern,
Cremes, Lotionen, Gesichtsmasken, Lippenstiften, Manikürelösungen und
Produkten und anderen kosmetischen Hilfsmitteln und Anwendungen
verwendet. Gelatine wird auch in der kosmetischen Industrie bei
der Mikroeinkapselung und Verpackung von verschiedenen Produkten
verwendet.
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Gelatine
wird in einem weiten Bereich von industriellen Anwendungen verwendet.
Zum Beispiel wird Gelatine weit als Klebstoff und Haftmittel in
verschiedenen Herstellungsverfahren verwendet. Gelatine kann in verschiedenen
Haftmittel- und Klebeformulierungen verwendet werden, wie bei der
Herstellung von rückbefeuchtbaren
gummierten Papier-Verpackungsklebebändern, beim Holzkleben, bei
der Papierbindung von verschiedenen Klassen von Kartonagepappen
und -papieren und in verschiedenen Anwendungen, welche haftende
Oberflächen
bereitstellen, die durch Rückbefeuchtung
reaktiviert werden können.
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Gelatine
dient als lichtempfindliche Beschichtung in verschiedenen elektronischen
Geräten
und wird als lichtundurchlässige
Basis in verschiedenen fotolithografischen Verfahren verwendet,
zum Beispiel in der Farbfernseher- und Videokamera-Herstellung. In der
Halbleiterherstellung wird Gelatine beim Konstruieren von Leadframes
und beim Beschichten verschiedener Halbleiterelemente verwendet.
Gelatine wird in verschiedenen Druckverfahren verwendet und bei
der Herstellung von Papieren mit spezieller Qualität, wie das, welches
für Anleihen-
und Aktienzertifikate, usw. verwendet wird.
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Gelatine
wird in einer Vielzahl von fotografischen Anwendungen verwendet,
z. B. als ein Träger
für verschiedene
aktive Bestandteile in fotografischen Lösungen, einschließlich den
Lösungen,
die in der Röntgen- und
fotografischen Filmentwicklung verwendet werden. Gelatine, die lange
in verschiedenen Fotogravurtechniken verwendet wurde, ist auch als
Bestandteil verschiedener Typen von Film eingeschlossen und wird
sehr häufig
in der Silberhalogenid-Chemie in verschiedenen Schichten von Film-
und Papierprodukten verwendet. Der Silber-Gelatine-Film kommt in
Form des Mikrofiche-Films und in anderen Formen der Informationsspeicherung
vor. Gelatine wird als selbst verschließendes Element von verschiedenen
Filmen, usw. verwendet.
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Gelatine
war auch eine wertvolle Substanz für die Verwendung in verschiedenen
Laboranwendungen. Zum Beispiel kann Gelatine in verschiedenen Zellkulturanwendungen
verwendet werden, wobei sie eine geeignete Oberfläche für die Zellanheftung
und das Wachstum bereitstellt, z. B. Platten- oder Flaschenbeschichtung,
oder wobei sie eine Oberfläche
für die
Zellanheftung und das Wachstum bereitstellt. Hydrolysierte oder Gelatine
mit niedriger Gelierungsstärke
wird als biologischer Puffer in verschiedenen Verfahren verwendet, zum
Beispiel in Beschichtungs- und Blockierungslösungen, die in Assays, wie
Enzym gekoppelten Immunadsorptionsassays (ELISA), oder anderen Immunassays
verwendet werden. Gelatine wird auch als Bestandteil in verschiedenen
Gelen für
biochemische und elektrophoretische Analysen verwendet, einschließlich enzymografischer
Gele.
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BEISPIELE
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Die
folgenden Beispiele werden einzig zum Darstellen der beanspruchten
Erfindung bereitgestellt. Die vorliegende Erfindung ist jedoch im
Schutzumfang durch die beispielhaften Ausführungsformen nicht beschränkt, welche
nur als Darstelllungen der einzelnen Aspekte der Erfindungen gedacht
sind. In der Tat werden verschiedene Modifikationen der Erfindung
zusätzlich
zu jenen hier beschriebenen dem Fachmann aus der vorhergehenden
Beschreibung und den beigefügten
Zeichnungen offensichtlich werden.
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Beispiel 1: Sequenzierung von bovinem
Prokollagen Typ Iα1
-
Die
Experimente wurden durchgeführt,
um α1(I)-Kollagen-Genfragmente
durch eine PCR aus einer kommerziellen cDNA-Bibliothek des glatten
Muskels einer Rinderaorta (Stratagene #936705) zu erzeugen, die eine
erfolgreiche Quelle für
bovine Kollagen (I) Alpha 2-Genfragmente in anfänglichen PCR-Experimenten darstellte.
In diesem anfänglichen
Screeningverfahren wurden PCR-Primer aus der bovinen mRNA-Sequenz (Shirai
et al. (1998) Matrix Biology 17: 85-88) des Kollagens (I) α2 entworfen,
und PCR-Amplifikationen wurden durchgeführt, und DNA-Fragmente wurden
erhalten. Obwohl gezeigt wurde, dass die kommerzielle Bibliothek die
vollständige
kodierende Region des bovinen Kollagen (I) Alpha 2-Gens enthielt,
zeigten sich Versuche, Fragmente des bovinen α1(I)-Kollagen-Gens unter Verwendung
einer Vielzahl von humanen α1(I)-Kollagensequenz-PCR-Primern
zu erzeugen, als nicht erfolgreich. Eine alternative Quelle für einen
cDNA-Pool, welcher wahrscheinlich ein bovines α1(I)-Kollagentranskript enthielt,
wurde gesucht.
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Eine
bovine ATCC-Hautzelllinie (CRL-6054; Haut, normal, bovin) wurde
auf ungefähr
60% Konfluenz gezüchtet,
und die Gesamt-RNA wurde isoliert (Qiagen RNeasy). Ein cDNA-Pool
wurde aus der sich ergebenden RNA durch eine RT-PCR (Clontech RT-for-PCR-Reagenzien)
hergestellt. Dieser cDNA-Pool wurde als Matrizenquelle für die nachfolgenden
PCR-Experimente von sich überlappenden
Genfragmenten verwendet.
-
Die
Primer wurden aus einer bekannten humanen α1(I)-Kollagen mRNA-Sequenz entworfen
und verwendet, um überlappende
Segmente des offenen Leserahmens (ORF für engl.: open reading frame)
des Gens zu amplifizieren. (Mackay et al. (1993) Human Molecular
Genetics 2(8): 1155-1160). Die PCR-Primer wurden gentechnisch hergestellt,
um Fragmente zu amplifizieren, die in der dreifach helikalen kodierenden
Region des humanen α1(I)-Kollagengens
liegen und sind in Tabelle 1 dargestellt. Tabelle
1
-
Die
Primer wurden verwendet, um vier überlappende bovine PCR-Fragmente
zu erhalten, die den dreifach helikalen Abschnitt des bovinen α1(I)-Kollagengens
abdecken. Die PCR (Clontech, Advantage GC-Rich cDNA PCR Kit; alle
PCR-Primer wurden @ 100 pmol in jeder Reaktion verwendet) wurde
unter Verwendung eines Thermocyclers (Hybaid, ungekühlt) unter
den folgenden Bedingungen durchgeführt:
Schritt
1: | 94°C für 4 Minuten |
Schritt
2: | 28
Zyklen von: |
| 68°C für 3 Minuten |
| 94°C für 30 Sekunden |
| 60°C für 30 Sekunden |
Schritt
3: | 68°C für 10 Minuten |
| 30°C für 1 Sekunde |
| bei
Raumtemperatur gehalten |
-
Alle
PCR-Produkte wurden anfänglich
durch eine Gelelektrophorese gescreent, und jene mit der vorhergesagten
Größe wurden
durch eine Agarosegel-Elektrophorese
und/oder eine Säulenreinigung
(Qiagen Qiaquick) gereinigt. Um die Sequenzierung zu erleichtern,
wurden die ausgewählten
PCR-Fragmente in einen Vektor (pCRII-TOPO Kit, Invitrogen) kloniert.
Viele Klone von jedem PCR-Fragment
wurden mit externen Vektor-Sequenzierungsprimern (M13 Forward und
Reverse) unter Verwendung eines ABI 373 Sequenzierautomaten (ABI
PRISMO BigDyeTM Terminator Cycle Sequencing
Kit, Perkin-Elmer) sequenziert. Die erhaltenen Sequenzdaten wurden
unter der Verwendung der SEQMAN-Software (DNASTAR) analysiert, und
eine Konsensussequenz für
die klonierten Fragmente wurde bestimmt.
-
Die
sich ergebende bovine α1(I)-Kollagensequenz,
die erhalten wurde, wurde verwendet, um interne Sequenzierungsprimer
für bovines
Kollagen zu entwerfen, welche anschließend verwendet wurden, um die Sequenzierung
von diesen bovinen Klonen zu vervollständigen. Diese Primer wurden
mit Hilfe der Primer-Design-Software
(RightPrimer, BioDisk) entworfen und sind in Tabelle 2 dargestellt. Tabelle
2
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Nach
dem Herstellen der bovinen PCR-Produkte mit den acht humanen SSCP-Primern, die in Tabelle 1
gezeigt sind (SEQ ID NR: 13 bis 20), wurden drei zusätzliche
PCR-Fragmente amplifiziert, die die anfänglichen bovinen Klone überlappen
und die sich bis zu den vermeintlichen Enden (durch Analogie mit
der humanen α1(I)-Kollagensequenz)
des ORF erstrecken. Die für
diese Amplifikation verwendeten PCR-Primer sind in Tabelle 3 dargestellt. Tabelle
3
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Die
sich ergebenden DNA-Fragmente wurden kloniert und sequenziert, und
eine Konsensussequenz wurde für
einen Großteil
des ORF des Gens durch Paaren der folgenden Primer etabliert: H
AVR II (SEQ ID NR: 43) mit SSCP 1REV (SEQ ID NR: 14); H EAR 1 F
(SEQ ID NR. 44) mit H NOT1 REV (SEQ ID NR: 45) und SSCP 4F (SEQ
ID NR: 19) mit H NOT1 REV (SEQ ID NR: 45).
-
Um
die 5'- und 3'-Enden des cDNA-Klons
zu erhalten, wurden verschachtelte (engl.: nested) PCR-Primer aus
der bovinen Sequenz durch die RACE (schnelle Amplifikation von cDNA-Enden)-Methodik
(SMART RACE cDNA Amplification Kit, Clontech) entworfen und mit
der Hilfe einer Primerdesign-Software. Für eine er höhte Spezifität wurden
die Primer entworfen, um besonders hohe Schmelztemperaturen aufzuweisen.
Die entworfenen Primer sind in Tabelle 4 dargestellt. Tabelle
4
-
Die
oben beschriebene bovine Gesamt-mRNA wurde weiterhin verwendet,
um neue cDNA-Pools mit den nötigen
externen Priming-Stellen für
eine Verwendung als PCR-Matrizen herzustellen. Die PCR-Produkte wurden
an sowohl den 5'-
als auch den 3'-Enden
des Gens erhalten, durch Verwenden von: (1) Touchdown-PCR-Techniken, (2)
den neu entworfenen bovinen RACE-PCR-Primern und (3) den in dem
Kit bereitgestellten Materialien. Zwei Touchdown-PCR-Programme wurden
in einem Peltier gekühlten
Thermocycler unter Verwendung des/der folgenden Protokolls und Bedingungen
verwendet: 72°C–68°C Touchdown-Programm
I:
Schritt
1: | 8
Zyklen mit den folgenden Bedingungen: |
| 94°C für 10 Sekunden |
| 72°C für 10 Sekunden,
jeder Zyklus danach um 0,5°C
abgesenkt |
| 72°C für 3 Minuten |
Schritt
2: | 28
Zyklen der folgenden Bedingungen: |
| 94°C für 10 Sekunden |
| 68°C für 10 Sekunden |
| 72°C für 3 Minuten |
| 72°C für 10 Minuten |
| 4°C GEHALTEN |
68°C–64°C Touchdown-Programm
II:
Schritt
1: | 8
Zyklen der folgenden Bedingungen: |
| 94°C für 10 Sekunden |
| 68°C für 10 Sekunden,
jeder Zyklus danach um 0,5°C
abgesenkt |
| 72°C für 3 Minuten |
Schritt
2: | 28
Zyklen der folgenden Bedingungen: |
| 94°C für 10 Sekunden |
| 64°C für 10 Sekunden |
| 72°C für 3 Minuten |
| 72°C für 10 Minuten |
| 4°C GEHALTEN |
-
Die
sich ergebenden Fragmente wurden mit einer 1,2% Agarosegel-Elektrophorese untersucht,
und eine nachfolgende Klonierung und Sequenzierungsanalyse wurde
durchgeführt.
Die sich aus beiden Programmen ergebenden PCR-Produkte wurden verwendet.
Die sich ergebenden Sequenzen überlappten
die zuvor klonierten bovinen α1(I)-Kollagensequenzen
und kodierten die 5'-
und 3'-Enden des ORF, sowie
die angrenzenden untranslatierten cDNA-Regionen. Die Nukleotidsequenz
für bovines
Prokollagen Typ I α1
ist in den 1A bis 1C (SEQ
ID NR: 1) gezeigt. Die entsprechende Aminosäuresequenz wird in den 2A bis 2D (SEQ
ID NR: 2) beschrieben.
-
Wie
in den 3A bis 3I gezeigt,
wurden die translatierten bovinen Kollagen-ORF-Sequnzen mit bekannten
humanen (HU), Maus-(MUS), Hunde-(CANIS),
Ochsenfrosch-(RANA) und japanischen Molch-(CYNPS)-Sequenzen ausgerichtet.
Die translatierte bovine Sequenz läßt sich auch an den veröffentlichten
Aminosäuresequenz-Fragmenten
der dreifach helikalen Wiederholungsdomänen des bovinen α1(I)-Kollagens
ausrichten. (Siehe z. B. Miller (1984) Extracellular Matrix Biochemistry,
Hrsg., Piez, et al., Elsevier Science Publishing, New York, S. 41-81
und SWISSPROT Datenbankzugangsnummer p02453). Zahlreiche Unterschiede
zwischen der vorhergesagten bovinen α1(I)-Kollagen-Proteinsequenz,
die durch die vorliegende Erfindung bereitgestellt wird, und zuvor
bekannten bovinen Proteinsequenzen wurden beobachtet. Einige dieser
Unterschiede schließen
Substitutionen von Aminosäuren
ein, die typischerweise durch eine Proteinsequenzierung schwierig
zu unterscheiden sind (d. h. Glutamin/Glutaminsäure und Asparaginsäure/Asparagin).
Die hier als SEQ ID NR: 1 offenbarte Polynukleotidsequenz legt nahe,
dass diese bekannten bovinen α1(I)-Kollagen-Proteinsequenzen
Fehler einschließen
können
und daher zum Beispiel für
eine Verwendung bei der Kon struktion eines synthetischen Gens durch
Aminosäurerücktranslation,
das ein authentisches bovines α1(I)-Kollagengen
kodiert, ausgeschlossen werden können.
-
Beispiel 2: Herstellung von Tierkollagenen
und -gelatinen in transgenen Pflanzen
-
Die
cDNAs, die ein erfindungsgemäßes Tierkollagen,
eine α-Untereinheit
der Prolyl-4-Hydroxylase und eine β-Untereinheit der Prolyl-4-Hydroxylase
kodieren, werden in einen geeigneten Pflanzen-Expressionsvektor
kloniert, der die nötigen
Elemente enthält,
um ein fremdes Protein einwandfrei zu exprimieren. Solche Elemente
können
zum Beispiel ein Signalpeptid, einen Promotor und einen Terminator
einschließen.
(Siehe z. B. Rogers et al., supra; Schardl et al., supra; Berger
et al., supra). Zum Beispiel wurden pVL-Vektoren im Stand der Technik
beschrieben. (Siehe z. B. A. Lamberg et al. (1996) J. Biol. Chem.
271: 11988-11995). Diese rekombinanten pVL-Vektoren werden als eine
Genquelle für
die Konstruktion von Pflanzen-Expressionsvektoren unter Verwendung
gängiger
Verfahren, die im Stand der Technik bekannt sind, verwendet. Um
das Kollagen in einer Pflanze oder in Pflanzenzellen zu exprimieren,
werden die Nukleinsäuresequenzen
funktionsfähig
mit zum Beispiel einem CaMV 35S-Promotor verbunden. Die Nukleinsäuresequenzen,
die eine α-Untereinheit oder β-Untereinheit
der Prolyl-4-Hydroxylase kodieren, werden funktionsfähig mit
einem CaMV 35S-Promotor verbunden, und können auf demselben Plasmid
oder auf unterschiedlichen Plasmiden anwesend sein, um eine biologisch
aktive Prolyl-4-Hydroxylase herzustellen.
-
Die
Expressionsvektoren werden in Pflanzen oder in Pflanzenzellen unter
Verwendung von im Stand der Technik gut bekannten Transformationstechniken
transformiert. Die Expressionsklone werden zum Beispiel durch Northern-
und Western-Blotten ausgewählt
und können
in einem Fermenter kultiviert werden, um eine Zellmasse für eine Reinigung
des rekombinanten Kollagens zu erzeugen.
-
Die
Expression der α-Untereinheit
und der β-Untereinheit
der Prolyl-4-Hydroxylase und des Tierkollagens wird gescreent, zum
Beispiel durch Immunblotten unter Verwendung einer Exraktion von
dreihundert (300) mg Zellpellets in 10 mM Tris, pH-Wert 7,8, 100
mM NaCl, 100 mM Glycin, 10 μM
DTT, 0,1% Triton X100, 2 μM
Leupeptin und 0,25 mM PMSF. Die Proteine in dem Extrakt werden mit
einer 4-20% SDS-PAGE
getrennt und auf eine Nitrozellulosemembran übertragen, um mit Antikörpern gegen
die α-Untereinheit
und β-Untereinheit
der Prolyl-4-Hydroxylase
und das Tierkollagen sondiert zu werden.
-
Um
das rekombinante Tierkollagen, das in Pflanzen oder Pflanzenzellen
hergestellt wurde, zu charakterisieren, wird das folgende Protokoll
durchgeführt:
- 1. Suspendieren und Homogenisieren der Zellpellets
in 1 M NaCl, 0,05 M Tris, pH-Wert 7,4 und Rühren für 1 Stunde bei 4°C. Sammeln
des Überstands
durch Zentrifugation bei 4°C,
- 2. Hinzufügen
von 7,5 ml Essigsäure
zu dem Überstand
und Inkubieren bei 4°C
für 2 Stunden.
Sammeln des Pellets durch Zentrifugation bei 4°C,
- 3. Zweimaliges Waschen des Pellets mit 2 M NaCl, 0,05 M Tris,
pH-Wert 7,4,
- 4. Wiederum Lösen
in 2 M Harnstoff, 0,2 M NaCl, 0,05 M Tris, pH-Wert 7,4,
- 5. Dialysieren gegen 2 M Harnstoff, 0,2 M NaCl, 0,05 M Tris,
pH-Wert 7,4,
- 6. Durch eine DEAE-Zellulosesäule laufen lassen. Sammeln
des Durchflusses,
- 7. Hinzufügen
von Essigsäure
bis 0,5 M und Hinzufügen
von NaCl bis 0,9 M und Inkubieren für 2 Stunden bei 4°C,
- 8. Sammeln der Pellets durch Zentrifugation,
- 9. Resuspendieren des Pellets in 0,5 M Essigsäure und
Rühren über Nacht
bei 4°C,
- 10. Spalten des Pellets mit 0,1 mg/ml Pepsin für 2 Stunden,
- 11. Hinzufügen
von gesättigtem
Tris-Puffer und Einstellen des pH-Werts auf 7,4,
- 12. Inkubieren über
Nacht, um das Pepsin zu inaktivieren,
- 13. Hinzufügen
von NaCl bis 0,9 M und Essigsäure
bis 0,5 M, Inkubieren für
2 Stunden bei 4°C,
- 14. Sammeln des Pellets durch Zentrifugation bei 4°C,
- 15. Waschen des Pellets mit 2 M NaCl, 0,05 M Tris, pH-Wert 7,4,
- 16. Lösen
in 2 M Harnstoff, 150 M NaCl und 0,05 M Tris, pH-Wert 7,4, und
- 17. Erhitzen der Probe bei 56°C
für 5 min
und anschließend
Laden auf eine Bio-Gel
TSK 40-Säule,
die von einem HPLC-System betrieben wird.
-
Das
sich ergebende gereinigte Kollagen wird durch eine Analyse der Aminosäurezusammensetzung charakterisiert.
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Verschiedene
Modifikationen und Variationen der beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren
und Systeme werden dem Fachmann offensichtlich sein, ohne vom Schutzumfang
der beigefügten
Ansprüche
abzuweichen. Obwohl die Erfindung in Verbindung mit spezifisch bevorzugten
Ausführungsformen
beschrieben wurde, sollte es verstanden werden, dass die Erfindung,
so wie beansprucht, nicht übermäßig auf
solche spezifischen Ausführungsformen
beschränkt
werden sollte. In der Tat werden verschiedene Modifikationen der
beschriebenen Weisen zum Ausführen
der Erfindung dem Fachmann der Molekularbiologie oder verwandten
Gebieten offensichtlich sein. SEQUENZPROTOKOLL