CN100335631C - 三股螺旋蛋白的稳定表达 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种在酵母中生产羟化三股螺旋蛋白的方法，包括以下步骤：将编码P4Hα亚基的第一核苷酸序列、编码P4Hβ亚基的第二核苷酸序列以及一个或几个产物编码核苷酸序列导入一种合适的酵母宿主细胞，所述产物编码核苷酸序列编码一种或几种多肽或肽，这些多肽或肽在羟化以后生成所述羟化三股螺旋蛋白，所述第一、第二和产物编码核苷酸序列的每一个均可操作地与启动子序列连接；在适于表达所述第一、第二和产物编码核苷酸序列的条件下培养所述酵母宿主细胞，从而产生所述羟化三股螺旋蛋白；其中，该方法的特征在于导入所述第一、第二和产物编码核苷酸序列的步骤会导致所述第一、第二和产物编码核苷酸序列及其相应的可操作地连接的启动子序列被携带在一个或几个可复制的DNA分子上，该分子在所述培养步骤中由所述酵母宿主细胞稳定地保持并分离。还披露了用本发明方法生产的转化酵母宿主细胞和三股螺旋蛋白。

Description

三股螺旋蛋白的稳定表达

发明领域：

本发明涉及通过重组DNA技术进行的羟化三股螺旋蛋白的生产，所述蛋白如天然和合成胶原、天然和合成胶原片段、天然和合成胶原样蛋白。具体地讲，本发明涉及一种通过将编码三股螺旋蛋白及脯氨酰4-羟化酶(P4H)的DNA序列导入合适的酵母宿主细胞中而在酵母宿主细胞中生产羟化三股螺旋蛋白的方法，其中，导入的方法为使所导入的DNA序列由该酵母宿主细胞稳定地保持和分离。

发明背景：

蛋白的胶原家族是哺乳动物体内含量最大的蛋白，它构成了大部分纤维成分，例如，皮肤、骨、腱、软骨和血管。每一种胶原蛋白均由以(Gly-X-Y)_n重复序列为特征的三种多肽链(α链)组成，所述多肽链折叠成三股螺旋蛋白构象。I型胶原(常见于皮肤、腱、骨和角膜)由被称为α1(I)和α2(II)[即α1(I)₂α2(II)]的两种多肽链组成，而诸如II型[α1(II)₃]和[II型[α1(III)₃]的其它类型的胶原具有三个相同的多肽链。这些胶原蛋白可自发地聚集成原纤维，这种原纤维被结合到胞外基质中，在成熟组织中，它起着结构作用，而在发育的组织中，它起着定向作用。所述胶原原纤维在交联以后是高度不可溶的，并具有很高的抗拉强度。

胶原的生成不可溶原纤维的能力使其有希望用于多种医学目的，包括生物移植体生产、软组织增大和创伤/烧伤绷带。迄今为止，已证实其用途的大部分胶原源于动物资源，主要是牛。尽管所述源于动物的胶原已被成功地利用，但是，仍存在某些问题：这种胶原的使用会产生严重的免疫原性问题，并会传播传染病和海绵状脑炎(例如，牛海绵状脑炎(BSE))。因此，人们对开发利用重组DNA技术生产胶原或胶原片段的方法存有浓厚兴趣。而且，重组DNA技术的利用还具有这样的优点：它带来了生产合成胶原和胶原片段的潜在可能，例如，这种合成胶原可以包括外源生物活性域(即：提供额外的蛋白功能)及其它有用特性(例如，改善的生物相容性和稳定性)。

胶原蛋白的体内生物合成是一个复杂的过程，涉及很多翻译后过程。一个关键过程是由脯氨酰4-羟化酶(P4H)将位于重复的(Gly-X-Y)_n序列的Y-位置上的脯氨酰羟化成4-羟脯氨酸。业已证实，这一羟化作用有利于三股螺旋蛋白折叠的成核作用。就胶原而言，体温下的稳定性是很重要的。因此，开发有商业价值的生产重组胶原的方法需要共表达P4H和所述α链。对于哺乳动物宿主细胞来说，P4H的共表达可自发地进行，因为这类细胞能自然地表达P4H。不过，对于酵母宿主细胞来说，出于成本、方便和效率考虑，更有希望用于表达重组真核蛋白，还需要用编码P4H的DNA序列进行转化。由于P4H由大约60kDa和60kDa的α亚基和β亚基组成，用于表达重组胶原的酵母宿主细胞需要用至少3个外源DNA序列(即：编码α链、P4Hα亚基和P4Hβ亚基)转化，而且，如果克隆在3个独立的载体上或均克隆在附加型载体上则预期会出现稳定性问题。事实上，即使在连续选择压力下，很多附加型载体都会遇到稳定性问题，如果这种载体大或以较低的拷贝数存在的话。因此，本发明的一个目的是提供一种由酵母宿主细胞表达重组胶原及其它三股螺旋蛋白的方法，其中，所导入的DNA序列不依赖连续的选择压力稳定地保持和分离。

发明概述：

因此，第一方面，本发明提供了一种在酵母中生产羟化三股螺旋蛋白的方法，该方法包括以下步骤：

将编码P4Hα亚基的第一核苷酸序列、编码P4Hβ亚基的第二核苷酸序列以及一个或几个产物编码核苷酸序列导入一种合适的酵母宿主细胞，所述产物编码核苷酸序列编码一种或几种多肽或肽，这些多肽或肽在羟化以后生成所述羟化三股螺旋蛋白，所述第一、第二和产物编码核苷酸序列的每一个均可操作地与启动子序列连接；和

在适于表达所述第一、第二和产物编码核苷酸序列的条件下培养所述酵母宿主细胞，从而产生所述羟化三股螺旋蛋白；

其中，该方法的特征在于导入所述第一、第二和产物编码核苷酸序列的步骤会导致所述第一、第二和产物编码核苷酸序列及其相应的可操作地连接的启动子序列被携带在一个或几个可复制的DNA分子上，该分子在所述培养步骤中由所述酵母宿主细胞稳定地保持并分离。

第二方面，本发明提供了一种能产生羟化三股螺旋蛋白的酵母宿主细胞，所述酵母宿主细胞包括一个编码P4Hα亚基的第一核苷酸序列，一个编码P4Hβ亚基的第二核苷酸序列以及一个或几个产物编码核苷酸序列，所述产物编码核苷酸序列编码一种或几种多肽或肽，这些多肽或肽在羟化以后生成所述羟化三股螺旋蛋白，所述第一、第二和产物编码核苷酸序列的每一个均可操作地与启动子序列连接，其中所述第一、第二和产物编码核苷酸序列及其相应的可操作地连接的启动子序列被携带在一个或几个可复制的DNA分子上，该分子在所述培养步骤中由所述酵母宿主细胞稳定地保持并分离。

第三方面，本发明提供了一种按照本发明第一方面的方法生产的三股螺旋蛋白。

第四方面，本发明提供了一种含有按照本发明第一方面的方法生产的三股螺旋蛋白的生物材料或治疗产品。

发明详述：

本发明的方法需要以如下方式将所述编码P4Hα亚基和β亚基的第一核苷酸序列和第二核苷酸序列以及所述产物编码核苷酸序列导入一种合适的酵母宿主细胞：所述序列由一个或几个DNA分子携带，这些分子在培养期间由所述酵母宿主细胞稳定地保持和分离。这样，所有子代细胞都含有所述第一、第二和产物编码核苷酸序列，并因此可以确保在整个培养过程中无须使用连续的选择压力即可稳定而又有效地表达一种羟化三股螺旋蛋白产物。

本发明方法可以这样实现：(i)将一个或几个外源核苷酸序列(即所述第一、第二和产物编码核苷酸序列中的一个或几个)整合(例如，通过同源重组)到酵母宿主细胞的一个或几个染色体中，或(ii)将所述外源核苷酸序列中的一个或几个包含于一个或几个含有一个着丝粒(CEN)序列的载体中。另外，可以采用上述技术的组合形式，或者将上述技术中的一种或两种的使用与一种或两种高拷贝数质粒的使用结合起来，所述质粒包括所述外源核苷酸序列的保持器(remainder)。例如，可将所述编码P4Hα亚基和β亚基的第一核苷酸序列和第二核苷酸序列整合到一个宿主染色体中，而使所述产物编码序列包含于一个或几个含有一个CEN序列的载体上或高拷贝数载体上。

优选地，本发明方法是通过将所述外源核苷酸序列包含于一个或几个含有一个CEN序列的载体中而实现的。特别优选的是含有CEN序列的YAC(酵母人工染色体)载体(Cohen等，1993)和pYEUra3载体(Clontech，Cat.No6195-1)。可以通过将一个CEN序列克隆到任何合适的表达载体上生成其它含有CEN序列的载体。

当把一个或几个外源核苷酸序列包含于高拷贝数载体上时，优选的是该高拷贝数载体选自那些以每个宿主细胞20-500(优选400-500)个拷贝出现的载体。特别优选的高拷贝数载体是YEp载体。

本发明的方法可以生产羟化三股螺旋蛋白。“三股螺旋蛋白”一词被理解为是指由一种或几种多肽或肽组成的同源或异源三聚体蛋白，所述蛋白包括至少一个具有如下肽通式的片段：(Gly-X-Y)_n，其中，Gly是甘氨酸，X和Y表示相同或不同的氨基酸(Gly-X-Y三联体与Gly-X-Y三联体之间X和Y可以不同)，不过，其中的X和Y通常为脯氨酸，其中的Y在修饰以后成为羟脯氨酸(Hyp)，n为2-1500(优选10-350)，该片段与两个其它多肽或肽的相同或相似片段一起形成三股螺旋蛋白构象。因此，这一术语包括天然和合成胶原、天然和合成胶原片段、以及天然和合成胶原样蛋白(例如，巨噬细胞消除受体和肺表面活性蛋白)，而且同样包括有或没有前肽、球状域和/或间插非胶原序列、以及有或没有源于人或其它物种的天然或变体氨基酸序列的一切前胶原和胶原(例如，I-XIX型)。“三股螺旋蛋白”一词所包括的合成胶原和片段还可以包括位于其氨基和/或羧基末端或其它部位的非胶原、非三股螺旋域。

因此，适用于本发明方法的产物编码核苷酸序列可以是多种多样的。不过，所述产物编码核苷酸序列优选选自编码天然胶原及其片段的核苷酸序列，如COL1A1(D’Alessio等，1988；Westerhausen等，1991)，COL1A2(de Wet等，1987)，COL2A1(Cheah等，1985)和COL3A1(Ala-Kokko等，1989)及其片段和组合，和合成胶原及其片段。

编码天然胶原或其片段的产物编码核苷酸序列可以编码包括或排除了N-前肽区、N-端肽、C-端肽或C-前肽的片段或其各种组合。

编码合成胶原及其片段的产物编码核苷酸序列优选编码具有如下通式的多肽或肽：(A)_l-(B)_m-(Gly-X-Y)_n-(C)_o-(D)_p，其中，Gly是甘氨酸，X和Y表示相同或不同的氨基酸，Gly-X-Y三联体与Gly-X-Y三联体之间X和Y可以不同，不过，其中的Y必须≥1个脯氨酸，A和D是多肽或肽结构域，它可以包括或不包括三股螺旋形成的(Gly-X-Y)_n重复序列，B和C是间插序列，它不包括三股螺旋形成的(Gly-X-Y)_n重复序列，n是2-1500(优选为10-300)，而l，m，o和p各自独立地选自0或1。

所述产物编码核苷酸序列可以包括一个编码分泌信号的序列，以便分泌由所述产物编码核苷酸序列表达的多肽或肽。

产物编码核苷酸序列的表达可以由组成型酵母启动子序列(例如，ADH1(Hitzeman等，1981，Pihlajaniemi等，1987)，HIS3(Mahadevan&Struhl，1990)，786(作者不详，1996革新5，15)和PGK1(Tuit等，1982))启动，不过，更优选的是由诸如GAL1-10(Goff等，1984)、GAL7(St.John&Davis，1981)、ADH2(Thukral等，1991)和CUP1(Macreadie等，1989)的诱导型酵母启动子序列。

所述编码P4Hα亚基和β亚基的第一核苷酸序列和第二核苷酸序列可源于一切动物，不过，其优选源于禽类或哺乳动物，特别是人(Helaakoski等，1989)。还可以设想所述第一核苷酸序列和第二核苷酸序列可源于不同的物种。另外，编码P4Hβ亚基的第二核苷酸序列可包括一个编码内质网(ER)保留信号(例如，HDEL，KDEL，KEEL)的序列，该序列有或没有其它引导信号，以便所述P4H能在ER、细胞质或目标细胞器中表达，或者能被分泌。

所述第一和第二核苷酸序列的表达可以由上述组成型或诱导型酵母启动子序列启动。不过，据信用相同或不同的具有相同的诱导特性的启动子序列，以协调的方式实现所述α亚基和β亚基的表达是有利的，但优选使用双向启动子序列。相应地，优选用GAL1-10酵母双向启动子序列表达所述第一和第二核苷酸序列，不过，其它双向启动子序列同样适用。

可将多拷贝的第一、第二和/或产物编码核苷酸序列导入酵母宿主细胞(例如，存在于YAC载体上或整合到宿主染色体中)。以多个拷贝提供所述产物编码核苷酸序列可能是特别有利的，因此，优选将所述产物编码核苷酸序列导入高拷贝数质粒(例如，YEp质粒)。

所导入的的第一、第二和产物编码核苷酸序列可以携带在一个或几个稳定保持和分离的DNA分子上。当由一个以上的DNA分子携带时，所述DNA分子可以是宿主染色体的组合和/或含CEN序列的载体与高拷贝数载体的组合。用以下DNA分子转化适用于本发明方法的酵母宿主细胞的某些特例：

1.YEp-P3+pYEUra3-αβ，

2.YEp-P3+pYACαβ

3.YEpCEN-P3+pYEUra3-αβ

4.YEpCEN-P3+pYACαβ

5.pYAC-P3+pYACαβ

6.pYAC-P3+pYEUra3-αβ

7.pYACαβ-P3；

其中，P3表示产物编码核苷酸序列，α和β分别表示编码所述P4Hα亚基和β亚基的核苷酸序列，CEN表示导入的着丝粒序列。所述pYEUra3和pYAC载体包括CEN序列。

可以从通过包括标准层析和沉淀技术在内的技术由培养的酵母宿主细胞中纯化用本发明方法生产的三股螺旋蛋白产品(Miller&Rhodes，1982)。对胶原来说，可以使用胃蛋白酶处理和NaCl沉淀技术(Miller&Rhodes)。可将免疫亲和层析用于纯化含有合适的识别序列的结构，所述序列如能被M1或M2单克隆抗体识别的Flag序列，或三股螺旋表位，如能被抗体2G8/B1识别的表位(Glattauer等，1997)。

适用于本发明方法的酵母宿主细胞可选自某些属，这些属包括但不限于酵母属、克鲁维酵母属、裂殖酵母属、Yarrowia和毕赤酵母属。特别优选的酵母宿主细胞可选自酿酒酵母(S.cerevisiae)、乳酸克鲁维酵母(K.lactis)、粟酒裂殖酵母(S.Pombe)、Y.Lipolytica和巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)。

如上文所述，特别优选的是通过用一个或几个YAC载体转化将所述第一、第二和产物编码核苷酸序列导入酵母宿主细胞，YAC载体是线形DNA载体，它包括酵母CEN序列，至少一个通常源于酵母的自主复制信号(例如，ars)，以及端粒末端(通常也是源于酵母)。它们通常还包括一个诸如URA3、TRP1、LEU2、或HIS3的酵母选择标记，而且，在某些场合下还包括赭石抑制基因(例如，sup4-o)该基因可以在需要腺嘌呤的菌株(即：由于赭石终止密码子提前而产生的腺嘌呤基因突变)中进行红色/白色选择。更常见的是包括两个酵母选择标记，在人工染色体的每个臂上各有一个(每一个臂之间由CEN隔开)。这样可以仅选择到含有如下YACs的转化宿主，在所希望的限制克隆位点上具有感兴趣的导入序列。就是说，正确插入感兴趣的序列(例如，表达盒)可重新连接被限制的YAC的两臂，因此使得转化体成为两种标记的原养型。YACs被设计成能把大的外源核苷酸序列(即100kb或更大数量级的)导入酵母宿主细胞。本发明人将在下面证实所述YACs可用于多个外源核苷酸序列(例如，编码天然胶原和P4Hα亚基和β亚基的核苷酸序列)的稳定表达。

在本发明的某些实施方案中，优选通过用一个或两个YEp载体转化将所述第一、第二和产物编码核苷酸序列中的一个或几个(但不是全部)导入所述酵母宿主细胞。YEp载体带有酵母2μ质粒的全部或部分，但至少具有复制起点(ori)。所述载体还包括诸如HIS3、LEU2、TRP1、URA3、CUP1或G418抗性的酵母选择标记，而且，通常还含有一个用于在大肠杆菌(E.coli)中操作的独立的ori，一般为ColE1，和诸如氨苄青素素抗性的标记。所述载体具有高拷贝数，例如每个细胞有20-400个拷贝，而且，通常能有效分离。在细胞分裂期间的稳定性取决于同样含有源于所述2μ质粒的REP2/STB位点的质粒。不过，稳定性不如所述宿主的内源2μ质粒好，特别是在诱导异源基因表达时。稳定性还会随着质粒大小的增加而下降(Wiseman，1991)。

在本说明书中，“包括”(comprise，comprises和comprising)一词意在涵盖特定的成分或特征或成分或特征组，包括或不包括其它成分或特征或成分或特征组。

下面将通过结合以下非限定实施例和附图的方式说明本发明。

附图的简要说明：

图1图解表示表达载体pYEUra3.2.12β#39α#5的构建(标记为pYEUra3-Mβα)。

图2表示COLIII 1.6kb DNA的核苷酸序列。

图3图解表示通过PCR分离到的人胶原III基因片段。还示出了用于以下实施例的1.6kb DNA。应当理解，可用图中示出的其它片段取代这些实施例中的COLIII 1.6kb DNA。

图4图解表示表达载体YEpFlagCOLIII 1.6kb(标记为YEpFlagC-3)的构建。

图5图解表示pYAC5βα的构建。

图6图解表示pYAC5βα-COLIII 1.6kb的构建。

图7表示合成胶原制品的构建。

图8提供了SYN-C3的核苷酸序列及其编码的多肽的氨基酸序列。

实施例：

例1：构建用于协同共表达脯氨酰-4-羟化酶的α和β亚基的酵母载体。

酵母表达载体的生产：

pYEUra3(Clontech)含有用于GAL1-10表达的双向启动子。在没有葡萄糖的条件下，通过用半乳糖诱导，pGAL1可以高水平表达由以正确取向插入MCS(多克隆位点)[XhoI、SalI、XbaI或BamHI位点]的DNA编码的一切蛋白，只要有一个ATG起始密码子。对pGAL10来说，如果待表达的DNA序列是以符合GAL10的ATG密码子读框的形式插入，而且，待表达的DNA序列是插入EcoRI位点，则会发生由半乳糖诱导的表达。

为了将EcoRI位点用于克隆，使插入片段不必符合GAL10的ATG读框的形式表达，必须修饰pYEUra3，以除去GAL10的起始密码子。所述目的是这样实现的。以pYEUra3作模板，并使用引物3465[5’CTG.TAG.Agg.atc.cCCGGG.TAC.GGA.GC-3’，其中，由小写字母所表示的核苷酸编码一个BamHI位点]和引物1440[5’TTA.TAT.Tga.att.cTC.AAA.AAT.TC3’，其中，由小写字母所表示的核苷酸编码一个EcoRI限制位点]制备PCR片段。引物1440将一个EcoRI位点导入pYEUra3，使其位于GAL10的起始ATG前面。用BamHI和EcoRI限制该PCR片段，并将其克隆到同样用BamHI和EcoRI消化过的pYEUra3上，用缺少ATG的BamHI和EcoRI片段取代含有ATG起始密码子的BamHI和EcoRI片段，以生成质粒pYEUra3.2.12。然后可将该EcoRI位点用作克隆位点，为此，必须通过使MCS位于启动子的另一端而由插入的DNA序列提供一个起始密码子，从而将其置于双向启动子pGAL1-10控制之下，并使其表达因DNA序列插入该启动子另一端的MCS位点而能由半乳糖诱导。将DNA序列克隆到MCS和EcoRI位点在用半乳糖诱导时可由所述双向启动子进行协同表达。

提取编码所述P4H的α亚基和β亚基的DNA分子：

使用引物1826[5’-TGT.AAA.ATT.AAA.gga.tcc.CAA.AG.ATG.TGG.TAT-3’，小写字母编码BamHI位点，ATG为α亚基的起始密码子]和引物1452[5’-GCCG.gga.tcc.TG.TCA.TTC.CAA.TGA.CAA.CGT-3’，小写字母编码BamHI位点，TCA翻译终止密码子]由cDNA(Clontech Human KidneyQuik Clone^TM cDNA Cat.#7112-1)PCR扩增P4H的α亚基。得到了两种同种型，并将其克隆到贮藏载体pBluescriptII SK+[StratageneCat.#212205]的BamHI位点，以得到pSK+α1(I型)和pSK+α2(II型)。在编码所述α亚基的DNA上无BamHI位点。用于分泌的信号序列存在于两种形式的BamHI片段上。

将引物对2280[5’-AC.TGG.ACG.GAT.CCC.GAG.CGC.CCC.GCC.TGC.TCC.GTG.TCC.GAC.ATG-3’]和2261[5’-G.GTT.CTC.CTT.ggt.gac.cTC.CCC.TT-3’，其中，由小写字母表示的核苷酸编码BstEII位点]用于β亚基的氨基末端部分，将引物对2260[5’-GAA.GGG.GAg.gtc.acc.AAG.GAG.AAC-3’，其中，由小写字母表示的核苷酸编码BstEII位点]和1932[5’CC.TTC.AGG.ATC.CTA.TTA.GAC.TTC.ATC.TTT.CAAC.AGC-3’]用于β亚基的羧基末端部分由cDNA(Clontech Human Kidney Quik Clone^TM cDNACat.#7112-1)PCR扩增P4H的β亚基[又被称为PDI/蛋白二硫化物异构酶][Pihlajaniemi等，1987]。用BstEII消化β亚基的以上两个PCR片段，然后再连接在一起，以生成编码完整β亚基的单一片段。然后用引物2280[5’-AC.TGG.Acg.gat.ccC.GAG.CGC.CCC.GCC.TGC.TCC.GTC.TCC.GAC.ATG-3’，其中，ggatcc编码BamHI位点，ATG为β亚基的起始密码子]和引物1932[5’-CC.TTC.Agg.atc.cTA.TTA.GAC.TTC.ATC.TTT.CAC.AGC-3’，其中，ggatcc编码BamHI位点，TTA为β亚基的翻译终止密码子]扩增该片段，再克隆到pBluescript SKII+的BamHI位点，以得到贮藏载体pSK+β。随后，用引物2698[5’-CTA.GTT.gaa.ttc.TAC.ACA.ATG.CTG.CGC.CGC.GCT.CTG.CTG-3’，其中，gaattc编码EcoRI位点，而ATG为β亚基的起始密码子]和2699[5’-GCA.ATG.gaa.ttc.TTA.TTA.CAG.TTC.GTG.CAC.AGC.TTT-3’，gaattc编码EcoRI位点，由TTA.TTA.提供两个翻译终止密码子，而由GTG将赖氨酸[K]残基换成组氨酸[H]残基，以提供一个天然酵母ER保留信号HDEL(即His.Asp.Glu.Leu)，而不是哺乳动物KDAEL ER保留信号]扩增pSK+β的BamHI片段。然后将所得到的PCR片段平端克隆到pCRScript[Stratagene，Cat.#211190]的SrfI位点，以生成pCRScriptβ。通过EcoRI消化从pCRScriptβ中回收含有β亚基的EcoRI片段，然后再将该片段克隆到pCRScript的EcoRI位点，以生成pCRScriptβEcoRI#4。

构建包括编码P4H的α亚基和β亚基的片段的酵母表达载体：

从pCRScriptβEcoRI#4的EcoRI消化产物中以EcoRI片段形式获得所述β亚基的片段。将该EcoRI片段克隆到pYEUra3.2.12的EcoRI位点，以生成质粒pYEUra3.2.12β#39。用BamHI将源于pSK+α1的α亚基片段从pSKα1上重新切除，并克隆到pYEUra3.2.12β#39的BamHI位点，以生成pYEUra3.2.12β#39α#5(图1)。所述β亚基片段是受pGAL10控制，而α亚基片段是受pGAL1控制。这是一种双向启动子，它使得脯氨酰-4-羟化酶的两个亚基能够进行诱导的协调表达。两种片段均提供一个天然ATG翻译起始密码子。所编码的β亚基具有自身的分泌信号和位于所述蛋白的羧基末端的HDEL内质网保留(ER)序列。尽管所编码的具有其自身信号序列的α亚基没有ER保留信号，不过它可以通过与β亚基的相互作用而得以保留。

例2：胶原片段和脯氨酰-4-羟化酶(α和β亚基)在酵母中的协同共表达和III型羟化胶原的合成。

通过PCR制备1.6kbp的重组胶原片段，所使用的引物1989[正向引物5’-gct.agc.aag.ctt.GGA.GCT.CCA.GGC.CCA.CTT.GGG.ATT.GCT.GGG-3’]和1903[反向引物5’-tcg.cga.tct.aga.TTA.TAA.AAA.GCA.AAC.AGG.GCC.AAC.GTC.CAC.ACC-3’]与III型胶原αI链(COL3A1)的一部分同源。用于提取III型胶原α1链片段的模板是用获自cDNA文库[HL1123nλMax1 Clontech Lot#1245，人肾cDNA 5’-片段文库]的Witzard纯化DNA制备的。

所分离的1.6kbp片段的实际大小为1635bp，包括1611bp的COL3A1DNA，在其两侧各有一个源于所述引物的12bp片段。1611bp的COL3A1 DNA相当于全长编码序列的核苷酸#2713-4826(即：密码子#905-1442)，因此，包括了α-螺旋片段的一部分，C-端肽的全部，C-前肽的全部和终止密码子^*1。在图2中提供了COL3A1 DNA的核苷酸序列。在图3中示出了由COL3A1 DNA覆盖的片段。在所述1.6kbp片段的5’末端添加一个NheI[GCTAGC]位点和一个HindIII[AAGCTT]位点，在其3’末端添加一个XbaI[TCTAGA]位点和NruI[TCGCGA]位点[其中，其5’末端是沿该读框的正向，即所衍生编码序列的氨基末端，而3’末端源于所述反向引物，相当于该基因的3’末端以及所衍生氨基酸序列的羧基末端]。由此赋予所述胶原片段便携性。

将所述1.6kbp片段克隆到YEpFlag1[IBI产品目录#13400]的SmaI位点上，使其编码序列融入载体表达Flag蛋白的读框。这样使得当生长于乙醇上时所导入的胶原基因片段可以融合蛋白形式符合读框地表达。平端克隆是这样进行的：在20℃下，在有SmaI的条件下连接SmaI消化的载体序列[凝胶纯化]和1.6kbp PCR片段[凝胶纯化，非磷酸化]，以防止载体自身的重新环化，和降低假阳性转化体的水平。在用于克隆的胶原DNA片段上没有SmaI，NheI，HindIII，XbaI或NruI位点。

通过限制酶分析筛选源于大肠杆菌氨苄青霉素抗性菌落的DNA的小规模小量制备物[用Bio101柱及所介绍的该柱的使用方法制备]。为了制备供分析用的适量DNA，需要10ml培养物而不是1ml培养物，因为YEpFlag质粒在大肠杆菌中不是以高拷贝数出现。

所述融合蛋白为以下形式：用于定向至ER并定型酵母分泌途径的酵母α因子信号序列，具有kex 2-内肽酶裂解位点的酵母α因子前肽，导致所有α因子氨基酸残基被切除，并生成一个由游离的Flag标记的氨基末端，用于检测和标记融合蛋白(8个氨基酸残基)、连接肽(4个氨基酸残基)、胶原螺旋(255个氨基酸残基)、胶原C-端肽[C-tel](25个氨基酸残基)和C-前肽[C-pro](255个氨基酸残基)的Flag肽(有助于三股螺旋的形成)。期望的Flag-标记蛋白由547个氨基酸残基组成，期望分子量MW为约60kDa。

所述融合蛋白在YEpFlag1中的表达受ADH2启动子的控制，该启动子受葡萄糖抑制，但在有乙醇(葡萄糖代谢的副产品)的条件下有活性。由于在所述载体中存在酵母2μ质粒的复制起点，在单个的酵母转化体中存在该载体的多个拷贝，这样，在生长期间由于消耗而解除了葡萄糖抑制以后，会导致所述1.6kbp PCR胶原片段高水平表达。该克隆方案的特有特征是，将所述1.6kbp PCR胶原片段以错误取向插入后就不会生成融合产物，因为终止密码子前面的亮氨酸残基是由AAT编码的。反向插入就产生了一个终止密码子TAA错误插入的结果是在该蛋白终止之前仅在Flag序列之后增加一个亮氨酸编码密码子[终止密码子TAA反过来就是AAT]。

所述Flag-标记融合蛋白在融合点上的氨基酸序列为N-Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-[Flag]-Ala-Ser-Lys-Leu-[接头]-Gly-Ala-Pro-Gly-Pro-Leu-Gly-Ile-Ala-[α-螺旋]。

通过用电击或乙酸锂转化或原生质球再生将所述YEpFlag胶原结构[以下称之为YEpFlagCOLIII 1.6kb；图4]导入色氨酸原养型酵母菌株，例如，BJ3503[pep4::HIS3 prb-1.6R HIS3 lys2-208 trp1-101 ura3-52gal2 can1]，BJ5462[α ura3-52 trp1 leu2-1 his3-200 pep4::HIS3prb-1.6R can1 GAL]，(YGSG)HRY1-5Dα[αhis4-519 ura3-52leu2-3 leu2-112 trp1 pep4-3]或KRYD1[BJ3505xBJ5462二倍体]。获得色氨酸营养缺陷型转化体，按照YEpFlag表达系统[IBI产品目录#13400]中提供的方案转入YPHSM，YEPM或YEPD或YEPGal，YEPE，然后在选择性培养基[缺乏色氨酸]中生长至高细胞密度。在接种后生长至3-9天时制备1ml培养物等分试样，并通过在台式离心机上以13000rpm的速度离心分离沉淀和上清液。将所有酵母沉淀重新悬浮于含有PMSF[0.002M]的100μl凝胶加样缓冲液[5XSDS]中，剧烈涡旋2分钟，并煮沸5分钟。从所述沉淀中保留900μl上清液，向其中加入100μl 5XSDS/0.002M PMSF，并以处理沉淀的方式进行处理。通过Western印迹分析分析沉淀和上清液20μl等分试样，该分析是在将酵母SDS-PAGE总蛋白或上清液(培养基)转移到硝酸纤维素上并在印迹装置中对该滤膜进行预杂交之后完成的。Western印迹分析是用α-Flag Mab M1[抗N-末端游离Flag](国际生物技术公司(Eastman Kodak)产品目录号：IB13001)或M2[抗Flag](国际生物技术公司(Eastman Kodak)产品目录号：IB13010)进行的。

Western印迹证实了一个大约60kDa的蛋白带的存在。这是含有Flag-螺旋-C-tel-C-pro的蛋白融合体的预计大小。在迁延温育以后，Flag效应抗体可在培养基中检测到融合产物的存在。用M1抗体对沉淀和培养基上清液进行检测证实α因子前导序列被完全切除了。未观察到具有α因子前片段(糖基化或未糖基化)的前体形式。

获自未转化酵母宿主的蛋白未获得能与M1或M2杂交的相当于60kDa的带。在使用仅用YEpFlag(无插入片段)转化的酵母时，在沉淀中得到了杂交带，但只是用M2Mab得到的。这些带相当于未分泌的带有C-末端Flag的α-前片段及其各种糖基化形式。在上清液中未检测到Flag，但这是预料中的，因为它仅有8个氨基酸长。在有葡萄糖的条件下，未观察到由ADH2启动子启动的任何结构的表达。

还可将YEpFlagCOLIII 1.6kb共导入(共转化)诸如BJ5462和KRDY1的酵母菌株，该菌株可与pYEUra3[Clontech][pYEUra3及其衍生物含有双向GAL1-10启动子。ADH2和GAL1-10启动子都受葡萄糖的抑制。GAL1-10启动子受半乳糖诱导]或pYEUra3.2.12[所述Clontech亲代载体的一种改进形式，它能将基因克隆到EcoRI位点，而且不必使所导入的基因处于正确读框内]或pYEUra3.2.12β#39[其中，编码β亚基(相当于脯氨酰-4-羟化酶的蛋白二硫化物异构酶)的DNA被克隆到pYEUra3.2.12的EcoRI位点，置于GAL10启动子的控制之下]或pYEUra3.2.12β#39α#5[其中，编码P4H的α亚基的DNA被克隆到pYEUra3.2.12β#39的BamHI位点，置于GAL10启动子的控制之下]一起生长在半乳糖上。

在缺乏色氨酸或尿嘧啶或同时缺乏色氨酸和尿嘧啶的培养基上选择转化子。与处理上面所获得的携带YEpFlag或YEpFlagCOLIII 1.6kb的色氨酸转化体的方法一样，先让转化体生长于选择培养基中，再生长于YPHSM、YEPM、YEPD、YEPG或YEPE中，并在4天之后加入半乳糖，使其终浓度为2％、0.5％或0.2％。按上述方法通过Western印迹分析分析总酵母蛋白或上清液，所不同的是，还使用了第三种MAb[抗β亚基的5B5](Dako公司，产品目录号M877)。

与上文处理由单质粒转化获得的转化体的情形一样，在用MAb M1或M2筛选时，Western印迹分析证实了在由YEpFlagCOLIII 1.6kb转化的trp-或trp-ura-酵母中存在大约60kDa的带，而YepFlag转化子没有该带。

只有在用半乳糖进行诱导以后、而且只有当半乳糖的浓度为0.2-0.5％而不是2％的情况下，在用抗β亚基MAb 5B5筛选时，分析还证实了在由pYEUra3.2.12β#39或pYEUra3.2.12β#39α#5或由其加上YepFlag或YEpFlagCOLIII 1.6kb转化的ura-或ura-trp-(但不是trp-)酵母中存在大约60kDa的带。β亚基的预计大小也是60kDa。在单用pYEUra3.2.12β#39或pYEUra3.2.12β#39α#5转化的尿嘧啶营养缺陷型酵母中，用M1或M2检测不到该带。

在实验时，没有用于检测由存在于pYEUra3.2.12β#39α#5上的双向启动子GAL1、10启动的α亚基表达的抗体，但由于GAL1和GAL10的启动子通常是共诱导的，而且在酵母中是受同一个UAS(上游激活序列)控制，因此，推测在已证实有β亚基表达的地方α亚基也会转录和表达。为了验证这一推测，在用0.2％半乳糖进行诱导并在YPHSM上至少生长四天以后，检测pYEUra3.2.12β#39α#5/YEpFlagCOLIII 1.6kb共转化体产生功能性P4H的能力。在明确证实Flag胶原表达以后加入半乳糖，其表达是通过Western印迹中酵母蛋白与M1或M2的阳性反应和抗β亚基的MAb 5B5的反应的缺乏证实的。在用半乳糖诱导以后(16hr)，再次检测了蛋白，分别证实了M1或M2效应带和5B5效应带的存在。在进行SDS-PAGE之后，将蛋白转移到PVDF膜上，并将该膜切成条。对含有源于相应于60kDa效应部位的部分的膜条进行水解和氨基酸分析。氨基酸分析证实了在用0.2％半乳糖诱导以后，在用YEpFlagCOLIII 1.6kb和pYEUra3.2.12β#39α#5共转化的酵母共转化体材料中存在羟脯氨酸，在有或没有半乳糖的条件下，在源于对照样品的蛋白中均未检测到羟脯氨酸。

所用的培养基含有源于牛蛋白水解物的胨，但在生长于该培养基上的全酵母或任何单一转化(仅有一个载体)的酵母中均未发现羟脯氨酸。只有在酵母共转化体的60kDa带中，而且只有在加入半乳糖时才能检测到羟脯氨酸。其中Flag检测胶原得到表达的未诱导转化体[无半乳糖]在转移以后，在其从PVDF上切除的60kDa带中不含任何羟脯氨酸。羟脯氨酸仅存在于60kDa部分，而不存在于该印迹的其它部分。

所述确切证据是，在用半乳糖诱导pYEUra3.2.12β#39α#5以后，在酵母中生成了一种产物，该产物能羟化共表达Flag-标记胶原片段上的脯氨酸残基。上述活性不存在于未转化的酵母或用pYEUra3.2.12β#39转化的酵母[无α亚基]或生长于乙醇或葡萄糖上的未诱导酵母中。

上述在酵母中共表达生产羟化胶原的方法的一个突出优点是，在共转化体中三个基因可以协调表达。另一个优点是，α和β亚基本身是协调表达的。第三个优点是，αβ表达载体(即pYEUra3.2.12β#39α#5)含有一个着丝粒序列，而且其行为如同一个微型染色体。因此，该载体是非常稳定的，而且不需要选择压力来保持其稳定性。在酵母中取消选择压力似乎不会影响YEpFlag胶原结构的稳定性，因为它具有很高的拷贝数量，但显而易见的是，如果α、β和胶原片段被分别克隆在多拷贝载体上的话，仅有在缺乏选择压力的条件下保持单一质粒的能力是重要的，而不是平衡选择压力对三种独立质粒的影响重要。另外，用一个双向启动子同步表达α和β亚基优于用不同启动子、在不同质粒上、以不同量表达它们。所述α亚基可能需要合成等量或较大量的β亚基，以便正确组装成功能性P4H(α₂β₂)酶，而且，协调表达似乎是确保上述目的实现的有效机制。

*¹[III型胶原α1链的密码子编号：ATG，1号密码子；1号密码子-24号密码子，信号序列；25号密码子-116号密码子，α-螺旋序列；117号密码子-130号密码子，N端肽序列；131号密码子-1161号密码子，α-螺旋序列；1162号密码子-1186号密码子，C-端肽；1187号密码子-1441号密码子，C-前肽；1442号密码子，终止]和[III型胶原α1链的相应的核苷酸编号：1-72号核苷酸，信号序列；73-348号核苷酸，N-前肽序列；349-390号核苷酸，N-端肽；391-3983号核苷酸，α-螺旋区；3984-4058号核苷酸，C-端肽；4059-4623号核苷酸，C-前肽序列；4824-4826号核苷酸，终止密码子]。

例3：用酵母人工染色体[YACs]进行脯氨酰-4-羟化酶[P4H]的α和β亚基的协调表达

用BamHI消化pYAC5[11454bp](Kuhn和Ludwig，1994)，以释放出位于2个端粒末端之间的HIS3基因[1210bp]，并用SalI-NruI消化以产生两个片段[左臂：片段1，5448bp和右臂：片段2，4238bp]，对这两个片段进行凝胶纯化。片段1是BamHI-端粒末端-大肠杆菌起点-β-内酰胺酶基因[氨苄青霉素抗性]-TRP1-ARS1-CEN4-tRNAsup-o-SalI。片段2是BamHI-端粒末端-URA3-NruI。

用SalI-EcoRV消化pYEUra3.2.12β#39α#5，以生成SalI-XbaI-BamHI-α-ATG-BamHI-pGAL1-10-EcoRI-ATG-β-EcoRI-SmaI-EcoRV形式的P4H表达框片段[4864bp]，对其进行凝胶纯化。将这一受半乳糖诱导型双向启动子控制的编码P4H的α和β亚基的表达框片段与用BamHI-SalI-NruI消化pYAC5所产生的片段1和2连接在一起，并将连接混合物用于通过乙酸锂转化方法转化以下酵母菌株：BJ2407[a/αprb1-11222/prb1-1122 prc1-407/prc1-407 pep4-3/pep4-3 leu2/leu2trp1/trp1 ura3-52]，KRYD1[a/αura3-52/ura3-52 trp1-Δ101/trp1lys2-208/LYS2 HIS3/his3Δ200 gal2/GAL2 can1/can1pep4::HIS3/pep4::HIS3 prb1Δ1.6R/prb1Δ1.6R]，GY1[αleu2 ade1trp1 ura3]，JHRY1-5Dα[αhis4-519 ura3-52 leu2-3 leu2-112 trp1pep4-3]，和YPH150[α/a ura3-52/ura3-52 lys2-801a/ lys2-801aade1-101o/ ade1-101o leu2Δ1/ leu2Δ1 trp1-Δ63/ trp1-Δ63 his3Δ200/ his3Δ200]。还用由BamHI消化过的pYAC5和未消化过的pYAC5转化酵母菌株。

获得所有菌株的Ura⁺Trp⁺共转化体，其中，pYAC5的两个片段各自携带TRP1[SalI-CEN4-TRP1-BamHI][片段1]或URA3[NruI-URA3-BamHI][片段2]作为转化在YAC的每一个臂上的选择标记，通过将P4H表达框插入SalI-EcoRV位点把这两个片段连接在一起。该载体被命名为pYAC5βα(图5)。该载体为如下形式：BamHI-端粒-URA3-NruI/EcoRV[两个位点均被破坏]-β-ATG-pGAL10-1-ATG-α-SalI-tRNAsup-CEN4-ARS1-TRP1-AMPr-起点-端粒-BamHI。CEN4序列的存在意味着该载体在复制期间的行为如同一个稳定的染色体，并且在有丝分裂和减数分裂时每个细胞至少分配一个拷贝[与pYEUra3.2.12β#39α#5的情况相同]。着丝粒末端意味着该载体是线形的和稳定的。

将转化体和对照[仅有pYAC5(环状)，用BamHI消化使pYAC5线形化]影印在覆盖选择培养基[缺乏尿嘧啶和色氨酸的SD完全培养基]或加富培养基[YEpD]的硝酸纤维素滤膜上，并在30℃下温育2-5天，直到铺满。将滤膜转移到含有半乳糖[2％]而不是葡萄糖的选择培养基或含有半乳糖[2％]的加富培养基以及葡萄糖培养基平板上，并在30℃下生长2-72小时。在培养结束时，将菌落裂解于0.1％SDS-0.2N NaOH-0.1％β-巯基乙醇上，用水洗涤，并用Blotto封闭。通过让处理过的滤膜与对α亚基专一的Mab[Mab 9-47H10](ICN生物药品公司，产品目录号631633)和对β亚基专一的Mab[Mab 5B5]杂交证实P4H的α亚基和β亚基的产生。用pYAC5βα转化的并用半乳糖诱导的菌落被证实能与抗P4H亚基的MAb杂交，表明可由双向GAL1-10启动子协调产生α和β。对照滤膜和对照酵母不会对P4H MAbs产生反应。生长在葡萄糖[双向GAL1-10启动子的一种抑制剂]上的带有pYAC5βα的酵母转化体也不会产生阳性反应。

在含有缺少ura和trp选择培养基的10ml液体培养基或加富培养基[含有葡萄糖、甘油或棉子糖]中鉴定上述筛选方法中的阳性转化体。将等分试样转移到含有0.2-2％半乳糖的诱导培养基[选择或加富培养基]中。其中的葡萄糖是碳源，在诱导之前在无菌水中洗涤细胞沉淀。在30℃下继续生长2-20小时，然后收集细胞沉淀，悬浮于加样缓冲液中，在SDS-PAGE上分离全酵母蛋白，并进行Western印迹。用blotto封闭滤膜，并与抗P4H的两个亚基的MAbs杂交。只有含有pYAC5βα的并用半乳糖诱导过的酵母转化体能产生预期的60kDaα和β亚基带。这表明P4H表达框业已功能性插入到pYAC5里。将P4H表达框插入到pYAC里具有双重优点：[1]与pYEUra3.2.12β#39α#5的情形一样，CEN序列的存在意味着在除去生长于加富培养基中的选择压力后该载体可稳定保持在该系统中，这可以通过提高细胞密度而提高产量，和[2]pYAC5βα结构可在随后将多个不同的三股螺旋蛋白表达框插入。

例4：胶原/三股螺旋蛋白片段在多拷贝质粒上的协调表达和P4H亚基在含有pYAC5βα的酵母转化体中的表达。

用YEpFlagCOLIII 1.6kb或单用YEpFlag转化含有pYAC5βα或pYAC5的酵母宿主菌株。所产生的含有胶原的载体是环状的和多拷贝的。在这种情况下，由于YEpFlagCOLIII 1.6kb和pYAC结构均含有相同的选择标记，通过用抗Flag的MAbs[M1或M2]与菌落杂交可以鉴定产生Flag标记的胶原的酵母转化体。筛选菌落是否携带额外拷贝的bla基因[多拷贝]，该筛选是这样进行的：通过PADAC测定鉴定能产生大量β-内酰胺酶的菌落(Macreadie等1994)。在其它例子中所述多拷贝质粒可以使用除URA3或TRP1以外的不同选择标记，这些标记存在于YAC的每一个壁上。按照例1所述方法对携带pYAC5βα和YEpFlagCOLIII 1.6kb的各种共转化体类型进行分析，分析其胶原产生，P4H亚基产生，和P4H活性。然后对含有pYAC5βα+YEpFlagCOLIII 1.6kb的共转化体按上面实施例的方法进行筛选，寻找羟化胶原，以确定Western印迹中的60kDa带，该带相当于抗α和β以及Flag的MAbs，以上操作是在诱导以后进行的。仅在用半乳糖诱导以后才鉴定到α和β亚基。仅在诱导P4H的α和β亚基之后才鉴定到羟化蛋白。

例5：将胶原表达框导入pYAC5和pYAC5βα。

通过用ScaI消化将YEpFlag线性化，所述内切酶可以裂解β-内酰胺酶的氨苄青霉素抗性基因[bla]上的单一识别位点，在1.6kb的胶原插入片段上不存在ScaI位点，所以可将ScaI用于将YEpFlagCOLIII 1.6kb线性化。将线性DNA用于转化含有pYAC5或pYAC5βα的酵母。通过同抗Flag的MAbs[M1或M2]进行的菌落杂交鉴定能产生Flag标记的胶原的酵母转化体。还鉴定到了带有额外拷贝bla基因[多拷贝]的菌落。通过PEDAC测定发现能产生较大量的β-内酰胺酶的菌落，已将一个拷贝的YEpFlagCOLIII 1.6kb插入到宿主菌株的pYAC5或pYAC5βα中，相当于对Mabs M1或M2呈阳性的菌落。提高了的β-内酰胺酶活性是由基因扩增所致，这种扩增是由于位于YEpFlagCOLIII 1.6kb上的线性化bla基因和位于pYAC上的bla基因之间的同源重组而产生的。通过插入YEpFlagCOLIII 1.6kb载体的pYAC5或pYAC5βα中所产生的新的质粒被命名为pYAC-COLIII 1.6kb和pYAC5βα-COLIII 1.6kb(图6)。进行表达实验，只有在YAC[pYACβα-COLIII 1.6kb上含有所有三个基因，并且用半乳糖诱导过P4H的菌株能产生羟化胶原。

例6：合成胶原蛋白的克隆和表达。

披露了一种制备“合成/新型”胶原蛋白的方法，该方法包括在体外组建编码肽GPP.GPP.GXY的寡核苷酸重复序列(其中XY＝LA，ER，PA或AP)。对合成胶原序列进行工程操作，使其含有高百分比的酪氨酸残基，因为该残基已被证实为能赋予胶原分子热稳定性。对XY位置上的残基对选择是特定的(即LA，ER，PA或AP)，因为从统计学上看它们以较大的量出现在原纤胶原中。

可以把编码GPP.GPP.GXY的合成寡核苷酸的混合物连接在一起，以形成不同长度的DNA片段，该DNA片段编码具有不同分子大小和不同物理特征的合成胶原蛋白。可将这些合成基因片段克隆到各种表达载体中，以便随后在酵母中产生胶原产物。在图7示出了构建编码胶原的合成寡核苷酸的方法的简图，其中仅以说明的形式示出了XY为ER，LA，AP，PA。

通过将所述寡核苷酸连接在一起合成了所述合成寡核苷酸，并制备了含有各种长度基因片段的若干文库(最大可见DNA长度大约为1000bp，编码大约350个氨基酸残基的多肽)。

例7：构建在酵母中稳定表达的合成羟化三股螺旋蛋白

根据其已知的结合和活化血小板的能力选择一段III型胶原[通过靠近-Gly-Leu-Ala-Gly-Ala-Pro-Gly-Leu-Arg的整联蛋白结合位点进行]。在其N-末端一侧包括一个由5个GXY-X-Y重复组成的片段，而在其C-末端一侧包括7个GXY-X-Y重复，以产生包含在所述合成片段中的基本重复单位。该重复的序列为GGKGDAGAPGERGPP-GLAGAPGIR-GGAGPPGPEGGKGAAGPPGPP。这相当于COL3A1基因[Met＝1]里的残基637-681(核苷酸1909-2043)。在该DNA的5’末端包括一个EcoRI和NheI位点，以便由NheI位点形成一个起始甲硫氨酸。因此其氨基末端的序列为MGAPGAP，其中，GAPGAP是天然序列，该序列位于COL3A1中的重复序列旁侧。通过接头将所述重复与第二种重复连接，由此引入一个Bsp120I位点，供以后操作使用，并在第一和第二重复单位之间提供GGP序列。通过一个接头将所述第二个重复和第三个重复连接，由此引入一个DssHII位点[也是为了以后的操作]并产生氨基酸序列GAR。第三个重复的旁侧有两个额外的GPP三联体，一个GCC三联体以及最终的GLEGPRG。这是包含能提供XhoI、SacI和NheI位点的序列的结果。包含这些位点使得在以后阶段的克隆具有较大的灵活性。由NheI位点提供了一个符合读框的终止密码子。

所述合成片段是通过PCR由抗COL3A1的引物以三个片段形式开始的。片段1为EcoRI-NheI-Met-[GAP]2-[重复]1-Bsp120I。用于该目的的引物是5’-aattccatgggtgctccaggtgctcc-3’[上游][引物U101]和5’-ggcc-acctggtggacctggtgg-3’][下游][引物D101]。第二个PCR片段是使用引物5’-ggcccggtggtaagggtgacgc-3’[上游][引物102]和5’-cgcgc-acctggtggacctgg-3’][下游][引物D102]。第三个重复所使用的引物对是5’-cgcgc-ggtggtaagggtgacgctgg-3’[上游][引物U103]和5’-acaaccctggtggacctggtggacctggtggacctgggtgg-3’[下游][D103]。对来自PCR反应的以上三个片段进行凝胶纯化，并连接在一起。将来自连接混合物的DNA用作另一轮PCR的模板，该PCR使用引物U101和位于3’末端的新的引物[5’-ctagccccgcggaccctcgagaccacaacaaccctggtgg-3’][下游][引物D104]。产生一个大约为500bp的带，并进行凝胶纯化，用EcoRI-NheI消化，并同同样用EcoRI-NheI消化过的pYX141(Ingenous产品目录号MBV-025-10)[LEU2-CEN-p786]连接，然后转入大肠杆菌。通过PCR筛选转化体，使用用于第二个片段的引物，对源于阳性菌落的DNA进行少量制备，并通过用EcoRI-NheI消化进行筛选，寻找大约500bp插入片段的存在。这种贮存质粒被命名为pYX-SYN-C3-1。将该EcoRI-NheI片段转入pYX243[2u-LEU2-pGAL](Ingenous产品目录号MBV-035-10)中，以产生pYX-SYN-C3-2，并将该质粒导入酵母宿主细胞中，该细胞包括编码携带的P4Hα和β亚基的核苷酸序列[pYEUra3.3.12β#39α#5或pYACαβ]。用半乳糖诱导以后的表达是通过使用MAb 2G8/B1(Werkmeister&Ramshaw，1991)测定的，所使用的抗体能识别序列GLAGAPGLR。还要将源于pYX-SYN-C3-2的EcoRI-SacII片段导入YEpFlag的EcoRI-SacII片段，以产生YEpFlag-SYN-C3，该质粒也被导入酵母宿主细胞，该细胞在用半乳糖诱导时能表达P4H。通过Western印迹分析在用半乳糖诱导过的酵母中检测到大约为18kDa的产物[SYN-C3的预期大小]。

在图8中提供了SYN-C3的核苷酸序列，同时还提供了其编码产物的氨基酸序列。

例8：使用除酿酒酵母以外的酵母。

GAL1-10启动子能在克鲁维酵母中起作用，而ADH2启动子能在粟酒裂殖酵母中以组成形式表达。通过将所述表达框转移到合适载体中，其它的酵母宿主也可以使用。例如，已在某些场合下证实了乳酸克鲁维酵母具有对重组产物的较弱的蛋白裂解活性。另外，巴斯德毕赤酵母可被用于将αβ的表达框多次整合到其染色体中。

为了在巴斯德毕赤酵母表达，将在前面的实施例中所披露的编码合成三股螺旋蛋白[SYN-C3]的核苷酸序列插入巴斯德毕赤酵母载体pPIC9(Invitrogen，产品目录号K1710-01)中的EcoRI-NotI位点[pPIC-SYN-C3]。用BglII或SalI消化该质粒，然后将其导入巴斯德毕赤酵母，在这里它整合到分别相应于BglII或SalI的AOX1或HIS4位点。将编码P4Hα和β亚基的核苷酸序列也导入巴斯德毕赤酵母，对于β亚基来说使用pHIL-D2(Invitrogen，产品目录号K1710-01)的EcoRI位点，并整合到HIS4位点，对于α亚基来说使用pHIL-S1 Invitrogen，产品目录号K1710-01)的MH1位点，随后整合到HIS4。所有三个表达框都是受AOX1启动子的控制，并由甲醇诱导。

例9：通过利用具有不同背景的酵母由GAL1-10启动子增强脯氨酰-4-羟化酶α和β亚基的表达，以便控制半乳糖诱导的表达。

可将质粒pYEUra3.2.12β#39α#5[编码P4H的α和β亚基，受GAL1-10双向启动子的控制]导入具有以下基因型的酵母宿主细胞：a或α，ura3trp1 egd1 btt1。在这些细胞中，EGD1和BTT1基因产物的缺乏，导致了由诸如GAL2、GAL4、GAL7、GAL1-10、MEL1的GAL4独立型启动子启动的高水平半乳糖诱导表达(Hu&Ronne，1994)。

用于增强表达的另一种机制是使用携带多拷贝GAL4正转录激活物的酵母宿主细胞(Johnston&Hopper，1982)，由它本身控制半乳糖的诱导。这会导致增强的表达，因为不存在用于GAL1-10启动子的转录激活物方面的限制。类似地，所述酵母宿主细胞可含有多拷贝的SGE1基因(Amakasu等1993)，这也会导致由半乳糖诱导启动子进行的增强转录。

也可以使用所述背景的各种组合，即egd1 btt1 SGE1^mc或egd1 btt1GAL4^mc或egd1 btt1 SG1^mc GAL4^mc[其中mc表示多拷贝]。

例10：用除ADH2以外的启动子表达胶原。

可以Nh1I或HindIII-XbaI或NruI片段的形式切除YEpFlagCOL1.6kb的胶原编码核苷酸序列，将其插入其它融合载体中，使其受其它启动子的控制。另外，例如可以NaeI或SacI-BglII或XdaI或SpeI或SnaBI或NotI的形式切除pADH2α信号-A-前片段-Flag胶原表达框，并将其导入合适载体中，如YEplac181(Gietz&Sugino，1988)或pMH158(Heuterspreute，1985)，以便以不同的拷贝数和宿主背景表达或导入具有CEN序列的载体中。另外，CEN序列本身可以导入YEpFlag载体。还可以用NruI将所述表达框以不带有ADH2启动子的形式切除，并导入合适载体的合适启动子后面。

作为ADH2启动子的替代物，可以使用CUP1启动子在诸如pYELC5的载体中表达胶原编码核苷酸序列(Macreadie等，1989)。该启动子是通过添加铜(即硫酸铜)诱导的，并具有在共表达期间增强诱导环境和增强P4H活性的优点。可以使用的第二个启动子是TIP1启动子，该启动子是通过冷休克诱导的。这里，无需进行羟化即可提高表达胶原的稳定性，其做法是通过将生长的酵母从30℃转移到18℃来诱导表达。

本发明方法提供了用酵母宿主细胞稳定表达三股螺旋蛋白的方式。本发明的产物可以是天然和合成胶原，天然和合成胶原片段以及天然和合成胶原样蛋白。合成产物可能具有增强的或新的功能(例如，含有源于丝连蛋白(fibrorectin)和层粘连蛋白的RGD和/或YIGSR序列)。所述产物可用于多种目的，包括生物移植物生产，软和硬组织增大，创伤/烧伤绷带，用于尿失禁和胃回流的括约肌增大，牙周疾病，血管移植物，药物输送系统，用于天然因子的细胞输送系统和神经再生中的导管。

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本发明领域技术人员可以理解，可以在不超出本发明广义的构思和范围的前提下对以特定实施方案形式示出的本发明进行多种改变和/或改进。因此，从各个角度讲本发明的实施方案应被示为说明性的而不是限定性的。

Claims (36)

1.一种在酵母中生产羟化三股螺旋蛋白的方法，该方法包括以下步骤：

将以下成分导入一种合适的酵母宿主细胞：

与在所述酵母宿主细胞中有功能的启动子可操作地连接的编码P4Hα亚基的第一核苷酸序列，

与在所述酵母宿主细胞中有功能的启动子可操作地连接的编码P4Hβ亚基的第二核苷酸序列，

与在所述酵母宿主细胞中有功能的启动子可操作地连接的编码合成肽的第三核苷酸序列，所述肽具有以下通式，并且在羟化以后生成所述羟化三股螺旋蛋白：

(A)_l(B)_m(GlyXY)_n(C)_o(D)_p，

其中，(GlyXY)_n表示三股螺旋形成重复序列，

其中Gly表示甘氨酸，

其中X和Y可相同或不同，各自表示一个氨基酸，且其中在GlyXY三联体与GlyXY三联体之间，由X和Y表示的每一个氨基酸可以不同，不过，其中三股螺旋形成重复序列(GlyXY)_n中的至少一个Y必须是脯氨酸，

其中A和D各自表示包括三股螺旋形成重复序列(GlyXY)_n的肽结构域，

其中B和C各自表示不包括三股螺旋形成重复序列(GlyXY)_n的非胶原序列，

其中，n是2-1500的整数，其中，l，m，o和p各自选自0和1，前提是m和o中至少一个是1；

并且在适于表达所述第一、第二和第三核苷酸序列的条件下培养所述酵母宿主细胞，从而产生所述羟化三股螺旋蛋白；

其中，在所述培养步骤中所述第一、第二和第三核苷酸序列由所述酵母宿主细胞稳定地保持并分离。

2.如权利要求1的方法，其中，n是10～350。

3.如权利要求1的方法，其中，所述第一和第二核苷酸序列是由双向启动子序列表达的。

4.如权利要求3的方法，其中，所述双向启动子序列是酵母GAL1-10启动子序列。

5.如权利要求1的方法，其中，所述第一和第二核苷酸序列是源于禽类或哺乳类。

6.如权利要求5的方法，其中，所述第一和第二核苷酸序列是源于人类。

7.如权利要求1的方法，其中，所述第一、第二和第三核苷酸序列各自包括编码分泌信号的核苷酸序列，使所表达的P4H和肽由酵母宿主细胞分泌。

8.如权利要求1的方法，其中，将所述第一、第二和第三核苷酸序列导入酵母宿主细胞，使其出现在相同或不同载体上，其中所述载体含有着丝粒序列。

9.如权利要求1的方法，其中，所述第一、第二和第三核苷酸序列的至少一个出现在相同载体上，且所述载体含有着丝粒序列，并且所述第一、第二和第三核苷酸序列的至少一个出现在高拷贝数载体上，所述高拷贝数载体可以是相同载体或两种不同载体。

10.如权利要求8的方法，其中，所述含有着丝粒序列的载体是YAC载体。

11.如权利要求9的方法，其中，所述含有着丝粒序列的载体是YAC载体。

12.如权利要求9的方法，其中，所述高拷贝数载体是YEp质粒。

13.如权利要求11的方法，其中，所述第一、第二和第三核苷酸序列存在于单一YAC载体上。

14.如权利要求1的方法，其中所述三股螺旋形成重复序列(GlyXY)_n包括至少一个整联蛋白结合位点。

15.如权利要求14的方法，其中所述整联蛋白结合位点包含氨基酸序列-Gly-Leu-Ala-Gly-Ala-Pro-Gly-Leu-Arg。

16.如权利要求1的方法，其中，所述酵母宿主细胞选自克鲁维酵母属、酵母属、裂殖酵母属、Yarrowia和毕赤酵母属。

17.如权利要求1的方法，其中，m和o各自为1，而l和p各自选自0和1。

18.一种能产生羟化三股螺旋蛋白的酵母宿主细胞，所述酵母宿主细胞包括

与在所述酵母宿主细胞中有功能的启动子可操作地连接的编码P4Hα亚基的第一核苷酸序列，

与在所述酵母宿主细胞中有功能的启动子可操作地连接的编码P4Hβ亚基的第二核苷酸序列，

与在所述酵母宿主细胞中有功能的启动子可操作地连接的编码合成肽的第三核苷酸序列，所述肽具有以下通式，并且在羟化以后生成所述羟化三股螺旋蛋白：

(A)_l(B)_m(G1yXY)_n(C)_o(D)_p，

其中，(GlyXY)_n表示三股螺旋形成重复序列，

其中Gly表示甘氨酸，

其中X和Y可相同或不同，各自表示一个氨基酸，且其中在GlyXY三联体与GlyXY三联体之间，由X和Y表示的每一个氨基酸可以不同，不过，其中三股螺旋形成重复序列(GlyXY)_n中的至少一个Y必须是脯氨酸，

其中A和D各自表示包括三股螺旋形成重复序列(GlyXY)_n的肽结构域，

其中B和C各自表示不包括三股螺旋形成重复序列(GlyXY)_n的非胶原序列，

其中，n是2-1500的整数，其中，l，m，o和p各自选自0和1，前提是m和o中至少一个是1；并且

其中，在所述酵母宿主细胞的培养过程中所述第一、第二和第三核苷酸序列各自由所述酵母宿主细胞稳定地保持并分离。

19.如权利要求18的酵母宿主细胞，其中，m和o各自为1，而l和p各自选自0和1。

20.如权利要求18的酵母宿主细胞，其中，所述第一和第二核苷酸序列是由双向启动子序列表达的。

21.如权利要求20的酵母宿主细胞，其中，所述双向启动子序列是GAL1-10启动子序列。

22.如权利要求21的酵母宿主细胞，其中，所述第一和第二核苷酸序列是源于禽类或哺乳类。

23.如权利要求22的酵母宿主细胞，其中，所述第一和第二核苷酸序列是源于人类。

24.如权利要求18的酵母宿主细胞，其中，所述第一、第二和第三核苷酸序列各自包括编码分泌信号的核苷酸序列，使所表达的P4H和肽由酵母宿主细胞分泌。

25.如权利要求18的酵母宿主细胞，其中，将所述第一、第二和第三核苷酸序列导入酵母宿主细胞，使其出现在相同或不同载体上，其中所述载体含有着丝粒序列。

26.如权利要求18的酵母宿主细胞，其中，所述第一、第二和第三核苷酸序列的至少一个出现在相同载体上，且所述载体含有着丝粒序列，并且所述第一、第二和第三核苷酸序列的至少一个出现在高拷贝数载体上，所述高拷贝数载体可以是相同载体或两种不同载体。

27.如权利要求25的酵母宿主细胞，其中，所述含有着丝粒序列的载体是YAC载体。

28.如权利要求26的酵母宿主细胞，其中，所述含有着丝粒序列的载体是YAC载体。

29.如权利要求26的酵母宿主细胞，其中，所述高拷贝数载体是YEp质粒。

30.如权利要求27的酵母宿主细胞，其中，所述第一、第二和第三核苷酸序列存在于单一YAC载体上。

31.如权利要求28的酵母宿主细胞，其中，所述第一、第二和第三核苷酸序列存在于单一YAC载体上。

32.如权利要求18的酵母宿主细胞，其中所述三股螺旋形成重复序列(GlyXY)_n包括至少一个整联蛋白结合位点。

33.如权利要求32的酵母宿主细胞，其中所述整联蛋白结合位点包含氨基酸序列-Gly-Leu-Ala-Gly-Ala-Pro-Gly-Leu-Arg。

34.如权利要求18的酵母宿主细胞，其中，所述酵母宿主细胞选自克鲁维酵母属、酵母属、裂殖酵母属、Yarrowia和毕赤酵母属。

35.一种按权利要求1所述方法生产的羟化三股螺旋蛋白。

36.一种含有按权利要求1所述方法生产的羟化三股螺旋蛋白的生物材料或治疗产品。

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