CN1281510A - 提高真菌突变体中血红素蛋白产量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生产血红素蛋白的方法,该方法包括:(a)在适合生产血红素蛋白的培养基中培养亲本真菌细胞的突变体,其中(i)所述突变体包含一或多个第一核酸序列,其中具有对编码一或多种血红素代谢酶的一或多个基因或者其控制序列的修饰,且(ii)在相同条件下培养时,所述突变体相比于亲本细胞生产的所述一或多种血红素代谢酶更少,而血红素蛋白更多;及(b)从突变细胞的培养基中回收血红素蛋白。

Description

提高真菌突变体中血红素蛋白产量的方法

发明背景

发明领域

本发明涉及在真菌中生产血红素蛋白的方法以及能生产血红素蛋白的真菌细胞。

相关技术描述

血红素是原卟啉Ⅸ与铁的螯合复合物，可作为血红素蛋白的辅基(prosthetic group)。原卟啉Ⅸ包含一个卟啉环，该卟啉环具有四个甲基、两个乙烯基和两个丙酸基的取代，获得一个铁原子后形成血红素。由甘氨酸和琥珀酰辅酶A生物合成血红素涉及八个酶促步骤，它们是由5-氨基-γ-酮戊酸合成酶(5-aminolevulinic acid synthase)(EC2.3.1.37)、胆色素原合成酶(EC4.2.1.24)、胆色素原脱氨基酶(EC4.3.1.8)、尿卟啉原Ⅲ合成酶(EC4.2.11.75)、尿卟啉原Ⅲ脱羧酶(EC4.1.1.37)、粪卟啉原Ⅲ氧化酶(EC1.3.3.3)、原卟啉原Ⅸ氧化酶(EC1.3.3.4)以及亚铁螯合酶(EC4.99.1.1)催化的。5-氨基-γ-酮戊酸合成酶催化甘氨酸和琥珀酰辅酶A缩合形成5-氨基-γ-酮戊酸(5-aminolevulinic acid)。胆色素原合成酶(也称为5-氨基-γ-酮戊酸脱水酶)可催化两个分子的5-氨基-γ-酮戊酸缩合形成胆色素原。胆色素原脱氨基酶(也称为羟甲基胆色烷合成酶或uro Ⅰ合成酶)可催化吡咯胆色素原四聚体化形成前尿卟啉原。尿卟啉原Ⅲ合成酶(也称为uro Ⅲ合成酶或uro Ⅲ共合成酶)可催化前尿卟啉原第4个环的重排，随后通过环化形成尿卟啉原Ⅲ。尿卟啉原Ⅲ脱羧酶(也称为uro D或尿卟啉原脱羧酶)可催化尿卟啉原Ⅲ的全部4条乙酸侧链的脱羧反应形成甲基，从而产生粪卟啉原Ⅲ。粪卟啉原Ⅲ氧化酶(也称为粪卟啉原酶)可催化粪卟啉原Ⅲ的A、B环上第2和4位的2个丙酸基发生氧化性脱羧反应形成乙烯基，从而产生原卟啉原Ⅸ。原卟啉原Ⅸ氧化酶可催化原卟啉原Ⅸ发生六电子氧化生成原卟啉Ⅸ。亚铁螯合酶(也称为亚铁裂解酶、血红素合成酶或原血红素亚铁裂解酶)可催化将铁插入到原卟啉中，生成血红素。

血红素的分解代谢涉及两个酶促步骤，它们是由血红素加氧酶(EC1.14.99.3)和胆绿素还原酶(EC1.3.1.24)催化的。血红素加氧酶催化血红素的氧化性裂解，形成胆绿素。胆绿素还原酶在NAD(P)H存在下催化胆绿素还原成胆红素。

脱辅基蛋白质向血红素蛋白的转化依赖于血红素生物合成途径提供的血红素的利用率。血红素蛋白的脱辅基蛋白质形式与血红素结合，形成活性血红素蛋白，其构象使血红素蛋白比脱辅基蛋白质更耐受蛋白水解攻击。若微生物产生的血红素量相比于产生的脱辅基蛋白质量更少，脱辅基蛋白质将累积并发生蛋白水解降解，从而降低活性血红素蛋白的产率。

为克服这一问题，Jensen显示向发酵培养基中添加血红素或含血红素的物质可显著提高米曲霉产生的过氧化物酶产率(WO93/19195)。虽然向发酵培养基中添加血红素可显著提高血红素蛋白的产率，但这种方法有悖常理，花费也大，并且难于大规模应用。

本发明的一个目的是提供可用于提高真菌菌株中血红素蛋白产量的改进方法，以得到商业上有意义的量。

发明概述

本发明涉及生产血红素蛋白的方法，包括：

(a)在适合血红素蛋白生产的培养基中培养亲本真菌细胞的突变体，其中(ⅰ)所述突变体包含一或多个第一核酸序列，该序列中具有对编码一或多种血红素代谢酶的一或多个基因或者其控制序列的修饰，且(ⅱ)在相同条件下培养时，所述突变体相比于亲本细胞生产的所述一或多种血红素代谢酶更少，而血红素蛋白更多；及

(c)从突变细胞的培养基中回收血红素蛋白。

本发明还涉及这样的血红素蛋白生产方法，其中所述突变真菌细胞还包含(ⅰ)指导由真菌细胞内源性的一或多个第二核酸序列编码的一种或多种血红素生物合成酶表达的一或多个第二控制序列，其中该一或多个第二控制序列与第二核酸序列可操作连接；和/或(ⅱ)一或多拷贝的编码一或多种血红素生物合成酶的一或多个第三核酸序列。

本发明还涉及其中突变真菌细胞还包含一或多拷贝的编码血红素蛋白的第四核酸序列的血红素蛋白生产方法。

本发明还涉及用于生产血红素蛋白的突变真菌细胞和所述突变真菌细胞的生产方法。

发明详述

本发明涉及生产血红素蛋白的方法，包括：

(a)在适合血红素蛋白生产的培养基中培养亲本真菌细胞的突变体，其中(ⅰ)所述突变体包含一或多个第一核酸序列，该序列中具有对编码一或多种血红素代谢酶的一或多个基因或者其控制序列的修饰，且(ⅱ)在相同条件下培养时，所述突变体相比于亲本细胞生产的所述一或多种血红素代谢酶更少，而血红素蛋白更多；及

(b)从突变细胞的培养基中回收血红素蛋白。

本文将“血红素蛋白”定义为含有血红素作为辅基的一组蛋白质中的任何成员。血红素蛋白可以是含有血红素作为辅基的珠蛋白、细胞色素、氧化还原酶或任何其它蛋白质。含有血红素的珠蛋白包括血红素蛋白和肌红蛋白。含有血红素的细胞色素包括细胞色素P450、细胞色素b、细胞色素c1和细胞色素c。含有血红素的氧化还原酶包括但不限于过氧化氢酶、氧化酶、加氧酶、卤素过氧化物酶(haloperoxidase)以及过氧化物酶。在一个优选实施方案中，所述氧化还原酶是过氧化氢酶。在另一个优选实施方案中，该氧化还原酶是氧化酶。在又一个优选实施方案中，该氧化还原酶是加氧酶。在又一个优选实施方案中，该氧化还原酶是卤素过氧化物酶。在又一个优选实施方案中，该氧化还原酶是过氧化物酶。血红素蛋白可以是突变真菌细胞的天然或外源蛋白质。

在一更优选的实施方案中，所述过氧化物酶得自于鬼伞属、Arthromyces属或Phanerochaete属菌株。在一个甚至更优选的实施方案中，该过氧化物酶得自于灰盖鬼伞，如灰盖鬼伞IF08371、长根鬼伞，或Arthromyces ramosus。在另一个更优选的实施方案中，所述过氧化氢酶得自于Scytalidium属、曲霉属或腐质霉属菌株。在另一个甚至更优选的实施方案中，该过氧化氢酶得自于Scytalidium  thermophilum如Scytalidium thermophilum CBS 117.65，黑曲霉或Humicola insolens。

可利用本领域已知方法，在适于生产血红素蛋白的营养培养基中培养本发明的突变真菌细胞。例如，可在实验室或工业用发酵罐内，在合适的培养基中、允许表达和/或分离血红素蛋白的条件下经摇瓶培养、小规模或大规模发酵(包括连续、分批、分批补料或固相发酵)培养该细胞。培养是利用本领域已知方法(参见如Bennett J.W.和LaSure L.编，MoreGene Manipulations in Fungi，学术出版社，CA，1991)，在含碳、氮源和无机盐的适宜营养培养基中进行的。适当的培养基可商购，或按照公开的组成(如美国典型培养物保藏中心的目录中)配制而成。若血红素蛋白被分泌至营养培养基中，则可直接从培养基中回收。可用于真菌宿主细胞中血红素蛋白分泌的信号肽编码区可得自于例如米曲霉TAKA淀粉酶基因、黑曲霉中性淀粉酶基因、Rhizomucor miehei天冬氨酸蛋白酶基因、Humicola Lanuginosa纤维素酶基因或Rhizomucor miehei脂肪酶基因。若多肽不被分泌，则可从细胞裂解物中回收。

可通过本领域已知方法回收所产生的血红素蛋白。例如，可通过包括但不限于离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀等常规方法，从营养培养基中回收血红素蛋白。然后可通过一系列层析操作如离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析等对所回收的蛋白质进行进一步纯化。

在本发明的一个方面，通过修饰，如破坏或删除亲本真菌细胞中编码血红素代谢酶的一或多个第一核酸序列或者其调控序列，得到相同条件下培养时血红素代谢酶产量比亲本细胞减少、而血红素蛋白产量更高的突变真菌细胞，从而可以在真菌细胞中更大量地生产血红素蛋白。该第一核酸序列可以是编码血红素加氧酶或胆绿素还原酶的任何序列。

可以将血红素代谢酶在细胞中进行表达所必需的第一核酸序列修饰或使它失活来方便地构建出血红素代谢酶活性缺乏的突变真菌菌株。要进行修饰或失活的第一核酸序列可以是例如编码血红素代谢酶或其显示血红素代谢酶活性所必需的部分的核酸序列，或者是由该核酸序列的编码序列表达血红素代谢酶时所必需的核酸序列调控元件。这种调控或调节序列的例子可以是启动子序列或它的功能性部分(即足够影响血红素代谢酶表达的那部分)。其他可能被修饰的调控序列描述于本文中，包括但不限于前导序列、多聚腺苷酸化序列、肽原序列、信号肽序列和转录终止子。

可以通过对细胞进行诱变处理并挑选出其血红素代谢酶产生能力降低的细胞，从而对第一核酸序列进行修饰或失活。诱变可以是特异的或随机的，可通过例如使用合适的物理或化学诱变剂、使用合适的寡核苷酸、或对DNA序列进行PCR介导诱变而完成。另外，可利用这些诱变剂的任何组合形式进行诱变。

适用于本发明目的的物理或化学诱变剂的例子包括紫外线(UV)照射、羟胺、N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)、O-甲基羟胺、亚硝酸、甲磺酸乙酯(EMS)、亚硫酸氢钠、甲酸和核苷酸类似物。

使用这类试剂时，通常于合适的条件下，在有所选突变剂存在时培养待诱变细胞，并挑选出血红素代谢酶活性或产量呈现减少的细胞，由此完成诱变。

可以通过在编码血红素代谢酶的第一核酸序列或者其转录或翻译所必需的调控元件中导入、取代或去除1或多个核苷酸来完成血红素代谢酶生产的修饰或失活。例如，可以插入或去除一或多个核苷酸来导入终止子、去掉起始密码子或改变开放读码框。可以依照本领域已知的方法通过定点诱变或PCR诱变来达到这种修饰或失活的目的。尽管一般来说，修饰可以在体内进行，即直接对待修饰核酸序列的表达细胞进行，但优选象下面的例子一样在体外进行修饰。

使基因失活或产量减少的方便方法的例子是基于基因取代或基因破坏技术。例如，在基因破坏方法中，在体外将相当于目标内源基因或基因片段的核酸序列进行诱变，从而产生缺陷的核酸序列，然后将该序列转化到宿主细胞中，产生缺陷型基因。经过同源重组，缺陷型核酸序列将取代内源基因或基因片段。可能比较理想的是缺陷基因或基因片段还编码标记，以便用该标记选择出编码血红素代谢酶的基因已经被修饰或破坏的转化子。

可选择地，利用成熟的反义技术，用与血红素代谢酶编码序列互补的核苷酸序列使编码血红素代谢酶的第一核酸序列修饰或失活。更具体地说，可以导入与编码血红素代谢酶的第一核酸序列互补的核苷酸序列，该序列在细胞中可以进行转录并能与细胞中产生的血红素代谢酶mRNA杂交，从而减少或消除细胞的血红素代谢酶产量。在能使得互补的反义核苷酸序列与血红素代谢酶mRNA杂交的条件下，翻译出的血红素代谢酶量就会减少或消除。

与第一核酸序列互补的核酸序列可来源于任何微生物。该核酸序列来源的选择取决于突变真菌细胞，但优选真菌来源，如酵母和丝状真菌。优选的丝状真菌来源包括但不限于枝顶孢属(Acremonium)、曲霉属、镰孢属、腐质霉属、毁丝霉属、毛霉属、脉孢菌属、青霉属、Phanerochaete属、梭孢壳属、Tolypocladium属及木霉属。优选的酵母来源包括但不限于假丝酵母属、克鲁维酵母属、毕赤酶母属、酵母属、裂殖酵母属和Yarrowia属内各种。此外，该核酸序列可以是真菌细胞的天然序列。

或者，与第一核酸序列互补的核酸序列可以是下述序列之一或多个：

1．血红素加氧酶基因：

a．人(Yoshida等人，1988，欧洲生物化学杂志，171：457-461；Shibahara等人，1989，欧洲生物化学杂志，179：557-563)；

b．大鼠(Shibara等人，1985，美国国家科学院院报，82：7865-7869；Muller等人，生物化学杂志，262：6795-6802)；

c．Cyanidium  caldarin(Cornejo和Beale，1988，生物化学杂志，263：11915-11921)；

d．集胞蓝细菌属之种(Synechocystis sp.)(Cornejo等人，1998，植物杂志15：99-107)；和

e．鸡(Lu等人，1998，基因207：177-186)

2．胆绿素还原酶基因：

a．人(Maines等人，1996，欧洲生物化学杂志，235：372-381；Komuro等人，1996，生物化学与生物物理学学报，1309：89-99)；

b．大鼠(McCoubrey等人，1995，基因，160：235-240)；和

c．集胞蓝细菌属之种(Schluchter和Glazer，1997，生物化学杂志272：13562-13569)。

在本发明方法中，相同条件下培养时，突变真菌细胞与相应的亲本细胞相比，其产生的血红素代谢酶至少少10％，优选至少少25％，更优选至少少50％，还更优选至少少75％，最优选至少少95％。更进一步地，相同条件下培养时，突变真菌细胞与相应的亲本细胞相比，其产生的血红素蛋白至少多10％，优选至少多25％，更优选至少多50％，还更优选至少多75％，最优选至少多95％。

在本发明的另一方面，突变细胞还包含可指导该突变真菌细胞内源性的一或多个第二核酸序列编码的一或多种血红素生物合成酶表达的一或多个第二控制序列，其中所述一或多个第二控制序列与第二核酸序列可操作连接。

可通过本领域熟知方法将控制序列和/或核酸序列导入突变真菌细胞中。例如，可通过同源或非同源重组将这些序列导入并整合至宿主基因组中，其中这些序列的一或多拷贝被整合到单个和/或多个靶序列中。或者，可将这些序列以未整合表达载体如自身复制型染色体外质粒形式导入和保持。本领域中将核酸序列导入真菌细胞的标准方法包括以已知方式进行的原生质体形成、原生质体转化以及被转化原生质体的细胞壁再生(参见EP238023和Malardier等，1989，基因，78：147-156)。优选利用含有核酸构建体的整合载体转化细胞，所述核酸构建体含有控制序列和/或编码血红素生物合成酶的核酸序列，其中该构建体便利地整合到丝状真菌细胞的宿主基因组中，优选染色体中。本文中术语“核酸构建体”意指单链或双链核酸分子，它分离自天然存在的基因，或是已被修饰而包含了以自然界并不存在的方式联合并置的数段核酸。

该第二核酸序列优选是编码选自下述的血红素生物合成酶的任何核酸序列：5-氨基-γ-酮戊酸合成酶、胆色素原合成酶、胆色素原脱氨基酶、尿卟啉原合成酶、尿卟啉原脱羧酶、粪卟啉原氧化酶、原卟啉原氧化酶或亚铁螯合酶，其中第二核酸序列是亲本真菌细胞的内源序列。术语“内源”在本文中指起源于亲本真菌细胞。

术语“控制序列”在本文中是指包括可指导第二核酸序列的编码序列在突变真菌细胞中、与控制序列相容的条件下表达的所有组分。表达应理解为多肽生产中涉及的任何步骤，包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。控制序列可以是编码血红素生物合成酶的第二核酸序列的天然序列，或可得自其它来源，或可以是天然和外源控制序列的组合。外源控制序列可简单替换或添加到天然控制序列中，以获得与编码序列正常相连的天然控制序列相比更高水平的目的血红素生物合成酶表达。这类控制序列包括但不限于前导序列、多聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列以及转录终止子。为了能在控制序列的指导下进行表达，将根据本发明所用的第二核酸序列与控制序列可操作连接，从而在与控制序列相容的条件下获得第二核酸序列编码序列的表达。术语“编码序列”在本文中定义为置于上述控制序列的控制之下时可转录成mRNA并翻译成血红素生物合成酶的序列。编码序列的边界由位于mRNA 5’-末端、开放阅读框上游的ATG翻译起始密码子和位于mRNA 3’-末端、开放阅读框下游的转录终止子序列确定。编码序列包括但不限于DNA、cDNA及重组核酸序列。术语“可操作连接”在本文中指其中控制序列相对于DNA序列的编码序列所处的位置使得该控制序列能指导多肽生产的构型。

第二控制序列可以是适当的启动子序列，即可被突变真菌细胞识别而使第二核酸序列表达的核酸序列。启动子序列含有可介导血红素生物合成酶表达的转录和翻译控制序列。启动子可以是在选定的突变真菌细胞内具有转录活性的任何启动子序列，可得自突变真菌细胞的天然或外源基因。

可指导第二核酸序列在丝状真菌细胞中转录的适当启动子的实例有得自编码米曲霉TAKA淀粉酶、Rhizomucor miehei天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、Rhizomucor miehei脂肪酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉磷酸丙糖异构酶、构巢曲霉乙酰胺酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶(WO96/00787)等的基因的启动子、NA2-tpi(来源于黑曲霉中性α-淀粉酶和米曲霉磷酸丙糖异构酶编码基因的启动子的杂合体)，和其突变的、截短的和杂合的启动子。

指导第二核酸序列在酵母细胞中转录的合适启动子的例子有得自酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)基因、酿酒酵母半乳糖激酶基因(GAL1)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(ADH2/GAP)以及酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶基因的启动子。Romanos等，1992，酵母(Yeast)8：423-488中描述了可用于酵母细胞的其它有用启动子。

第二控制序列也可以是适当的转录终止序列，即可被突变真菌细胞识别而终止转录的一段序列。该终止序列与编码血红素生物合成酶的第二核酸序列的3’末端可操作连接。终止序列可以是编码血红素生物合成酶的第二核酸序列的天然或外源序列。在选定的突变真菌细胞内有功能的任何终止子在本发明中很可能有用处。

优选用于丝状真菌宿主细胞的终止子可得自米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合成酶、黑曲霉α-葡糖苷酶及尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶编码基因。

酵母宿主细胞的优选终止子得自编码酿酒酵母烯醇酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)或酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶的基因。Romanos等，1992(出处同前)中描述了可用于酵母宿主细胞的其它有用终止子。

第二控制序列也可能是适当的前导序列，即mRNA中对突变真菌细胞的翻译具有重要作用的非翻译区。前导序列与编码血红素生物合成酶的第二核酸序列的5’末端可操作连接。前导序列可能是第二核酸序列的天然或外源序列。在选定的突变真菌细胞内有功能的任何前导序列很可能在本发明中也是有用的。

用于丝状真菌细胞的优选前导序列得自编码米曲霉TAKA淀粉酶和米曲霉磷酸丙糖异构酶的基因。用于酵母细胞的合适前导序列得自酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)基因、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶基因、酿酒酵母α-因子基因及酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(ADH2/GAP)。

第二控制序列也可以是多聚腺苷酸化序列，即与第二核酸序列的3’末端可操作连接、并且转录时能被突变真菌细胞识别而将多腺苷酸残基加到转录mRNA上的一段序列。多聚腺苷酸化序列可以是编码血红素生物合成酶的第二核酸序列的天然或外源序列。在选定的突变真菌细胞中有功能的任何多聚腺苷酸化序列很可能在本发明中也是有用的。

特别优选用于丝状真菌细胞的多聚腺苷酸化序列得自编码米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合成酶及黑曲霉α-葡糖苷酶的基因。Guo和Sherman，1995，分子细胞生物学(Molecular Cellular Biology)15：5983-5990中描述了可用于酵母细胞的多聚腺苷酸化序列。

第二控制序列也可以是信号肽编码区，其编码与血红素生物合成酶氨基末端相连的氨基酸序列，使血红素生物合成酶定位于特定细胞区室中。信号肽编码区可以是编码血红素生物合成酶的第二核酸序列的天然或外源序列。第二核酸序列编码序列的5’末端可能本身含有信号肽编码区，该信号肽编码区与编码该定位血红素生物合成酶的编码区区段在翻译读框内自然连接。或者，该编码序列的5’末端可含有相对于该定位血红素生物合成酶编码序列部分为外源的信号肽编码区的核酸。信号肽编码区可得自粗糙脉孢菌ATP酶基因(Viebrock等人，1982，EMBO杂志，1：565-571)或酿酒酵母细胞色素c过氧化物酶基因(Kaput等人，1982，生物化学杂志，257：15054-15058)。然而，能够在选定的突变真菌细胞中促使血红素生物合成酶定位的任何信号肽编码区在本发明中均可使用。

可用于丝状真菌细胞的有效信号肽编码区是得自于米曲霉TAKA淀粉酶基因、黑曲霉中性淀粉酶基因、Rhizomucor miehei天冬氨酸蛋白酶基因、Humicola Lanuginosa纤维素酶基因或Rhizomucor miehei脂肪酶基因的信号肽编码区。

用于酵母细胞的有效信号肽编码区可得自于编码酿酒酵母α-因子、Rhizomucor miehei天冬氨酸蛋白酶及酿酒酵母转化酶的基因。Romanos等(1992，出处同前)描述了有用的其它信号肽编码区。

第二控制序列也可以是编码位于具生物化学活性的成熟多肽氨基末端的氨基酸序列的前肽编码区，所获得的多肽公知为酶原或多肽原(或在某些情形下为酶原)。酶原通常是没有活性的，通过肽原的催化或自身催化切割可从酶原转变为成熟的活性多肽。本文将有生物化学活性的多肽限定为以可发挥其天然对应物的生物化学活性的活性形式生产的血红素生物合成酶。该前肽序列可以是编码血红素生物合成酶的第二核酸序列的天然或外源序列。编码前肽的核酸序列可得自编码酿酒酵母α-因子和嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)漆酶的基因。

在本发明的另一方面中，突变真菌细胞还包含一或多拷贝的编码WO97/47746中所述一或多种血红素生物合成酶的一或多个第三核酸序列。第三核酸序列可以是编码选自下述的血红素生物合成酶的任何核酸序列：5-氨基-γ-酮戊酸合成酶、胆色素原合成酶、胆色素原脱氨基酶、尿卟啉原合成酶、尿卟啉原脱羧酶、粪卟啉原氧化酶、原卟啉原氧化酶或亚铁螯合酶。第三核酸序列可来源于任何微生物。第三核酸序列来源的选择取决于突变真菌细胞，但优选真菌来源，如酵母和丝状真菌。优选的丝状真菌来源包括但不限于枝顶孢属(Acremonium)、曲霉属、镰孢属、腐质霉属、毁丝霉属、毛霉属、脉孢菌属、青霉属、Phanerochaete属、梭孢壳属、Tolypocladium属及木霉属内的种。优选的酵母来源包括但不限于假丝酵母属、克鲁维酵母属、毕赤酶母属、酵母属、裂殖酵母属和Yarrowia属内的种。此外，第三核酸序列可以是突变真菌细胞的天然序列。

第三核酸序列可以是下述序列中的一种或多种：1．5-氨基-γ-酮戊酸合成酶基因：

a．酿酒酵母(Urban-Grimal等，1986，欧洲生物化学杂志，156：511-59)；

b．构巢曲霉(Bradshaw等，1993，现代遗传学，23：501-507)；

c．类球红细菌(Tai等，1988，基因，70：139-152)；

d．荚膜红细菌(Hornberger等，1990，分子普通遗传学，211：371-378)；

e．大肠杆菌(Drolet等，1989，分子普通遗传学，216：347-352)；以及

f．米曲霉(WO97/47736)。

2．胆色素原合成酶基因：

a．酿酒酵母(Myers等，1987，生物化学杂志，262：16822-16829)；

b．金黄色葡萄球菌(Kafala和Sasarman，1994，加拿大微生物学杂志，40：651-657)；

c．类球红细菌(Delaunay等，1991，细菌学杂志，173：2712-2715)；

d．大肠杆菌(Echelard等，1988，分子普通遗传学，214，503-508)；

e．枯草芽孢杆菌(Hansson等，1991，细菌学杂志，173：2590-2599)；以及

f．米曲霉(WO97/47736)。

3．胆色素原脱氨基酶基因：

a．酿酒酵母(Keng等，1992，分子普通遗传学，234：233-243)；

b．人(Yoo等，1993，基因组，15：221-29；Raich等，1986，核酸研究，14：5955-5968)；

c．大肠杆菌(Thomas和Jordan，1986，核酸研究，14：6215-6226)；以及

d．枯草芽孢杆菌(Petricek等，1990，细菌学杂志，172：2250-2258)。

4．尿卟啉原Ⅲ合成酶基因：

a．酿酒酵母(Amillet和Labbe-Bois，1995，酵母，11：419-424)；

b．枯草芽孢杆菌(Hansson等，1991，细菌学杂志，173：2590-2599)；以及

c．大肠杆菌(Jordan等，1987，核酸研究，15：10583)。

5．尿卟啉原Ⅲ脱羧酶基因：

a．酿酒酵母(Garey等，1992，欧洲生物化学杂志，205：1011-1016)；以及

b．人(Romeo等，1986，生物化学杂志，261：9825-9831)。

6．粪卟啉原Ⅲ氧化酶基因：

a．人(Martasek等，1994，美国国家科学院院报，911：3024-3028)；

b．大肠杆菌(Troup等，1994，细菌学杂志，176：673-680)；以及

c．酿酒酵母(Zaagorec等，1986，生物化学杂志，263：9718-9724)。

7．原卟啉原Ⅸ氧化酶基因：

a．人(Taketani等，1995，基因组，29：698-703)；

b．枯草芽孢杆菌(Dailey等，1994，生物化学杂志，269：813-815)；以及

c．大肠杆菌(Sasarman等，1993，加拿大微生物学杂志，39：155-161)。

8．亚铁螯合酶基因：

a．酿酒酵母(Labbe-Bois，1990，生物化学杂志，265：72878-72883)；

b．牛(Shibuya等，1995，生物化学与生物物理学学报，1231：117-120)；

c．大豆慢生根瘤菌(Frustaci和O’Brian，1993，应用环境微生物学，59：2347-2351)；

d．大肠杆菌(Frustaci和O’Brian，1993，细菌学杂志，175：2154-2156)；以及

e．枯草芽孢杆菌(Hansson和Hederstedt，1992，细菌学杂志，174：88081-88093)。

在一个更优选的实施方案中，所说的第三核酸序列得自曲霉属之种。在一个甚至更优选的实施方案中，所说的第三核酸序列得自无花果曲霉、臭曲霉、日本曲霉、黑曲霉、构巢曲霉或米曲霉。在另一个更优选的实施方案中，第三核酸序列得自酵母属之种。在一个甚至更优选的实施方案中，第三核酸序列得自酿酒酵母、卡尔酵母、糖化酵母、Saccharomycesdouglassi，克鲁弗酵母、诺地酵母或Saccharomyces oviformis。

在一个优选实施方案中，第三核酸序列与WO97/47746所述的一或多个第三控制序列可操作连接。第三控制序列可以是编码血红素生物合成酶的第三核酸序列的天然序列，也可以部分或全部来源于外源。外源控制序列可简单地替换天然控制序列，以使得与天然控制序列和编码序列正常相连时相比其目的血红素生物合成酶产量更高。第三控制序列可以是上述有关第二控制序列时例举的控制序列中的任何一种。

在本发明的另一方面，突变真菌细胞含有一或多拷贝的一或多个第二控制序列和一或多拷贝的一或多个第三核酸序列。优选地，该第三核酸序列与一或多个第三控制序列可操作连接。

第二控制序列、第三核酸序列和/或第三控制序列可包含在同一核酸构建体中，也可包含在不同的核酸构建体中。每一核酸构建体都可含有整合元件以用于指导通过同源重组而整合至真菌宿主基因组的精确位点。为了提高在精确位点发生整合的可能性，整合元件优选地应含有足够长的核酸，如100-1500个碱基对，优选400-1500个碱基对，最优选为800-1500个碱基对，该核酸与相应的靶序列高度同源以提高同源重组的概率。整合元件可以是与突变真菌细胞的基因组内靶序列同源的任何序列。另外，整合元件可以是非编码核酸序列或编码核酸序列。另一方面，也可通过非同源重组将每种核酸构建体整合至突变真菌细胞的基因组中。

可利用本领域熟知的分子生物学技术，将核酸构建体插入适当的载体中，或将第三核酸序列直接插入已含有控制序列的载体中。载体可以是能便利地进行重组DNA操作并能使核酸序列表达的任何一种载体。载体的选择通常取决于该载体与欲导入该载体的突变真菌细胞之间的相容性。载体可以是自主复制型载体，即在染色体外完整存在、并能独立于染色体复制而进行复制的载体，诸如质粒、染色体外元件、微小染色体或人工染色体。或者，载体也可以是导入突变真菌细胞时能整合至基因组中并与其整合入的染色体一起复制的一种载体。载体系统可以是单个载体或质粒，也可以是合在一起含有待导入真菌细胞基因组内的总DNA的两个或多个载体或质粒。

本发明的载体优选地含有能便于对转化细胞进行筛选的一个或多个选择标记。选择标记是其产物能提供对杀生物剂或对病毒的抗性、重金属抗性、赋予营养缺陷体原养型等的基因。丝状真菌细胞适用的选择标记包括但并不限于amdS、pyrG、argB、niaD、sC、trpC、bar和hygB。酵母细胞适用的标记包括但不限于ADE2、HIS3、IEU2、LYS2、MET3、TRPl和URA3。在曲霉细胞中，优选使用构巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG标记，以及吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的bar标记。此外，也可通过共转化完成筛选，如WO91/17243所述，其中选择标记包含于另一个载体中。

本领域普通技术人员熟知用于连接核酸构建体、启动子、终止子和其它元件以及将它们插入至含有复制必需信息的适当载体中的方法(参见如Sambrook等，分子克隆，实验室手册，第二版，冷泉港，纽约，1989)。

在本发明方法中，突变真菌细胞还包括一或多拷贝的一或多个编码血红素蛋白的第四核酸序列。第四核酸序列可与第二控制序列、第三核酸序列及第三控制序列包含在同一载体中，它们也可包含在不同载体中。优选第四核酸序列与第四控制序列可操作连接。上文就第二控制序列而列举的控制序列也适用于第四控制序列。

在本发明方法中，营养培养基中还可包括血红素源、其类似物或者一或多种血红素生物合成途径中间体。有关血红素类似物和生产途径中间体的一览表参见Porphyrin Products Inc.(Logan，UT)的产品小册子。比如，若将编码血红素生物合成途径中的一种酶的核酸序列导入突变真菌细胞，则在此之前的一个或多个步骤中的一或多种生产途径中间体可能变得具有限速性。在此情形下，可将一或多种生产途径中间体补加到培养基中。为将这些生产途径中间体导入细胞，可以使用一种能使细胞膜半通透化的酶，如NOVOZYM234^TM(Novo Nordisk A/S)。

在本发明方法中，营养培养基中还可包括铁源。或者，营养培养基中还可包括能诱导卟啉合成的其它任何金属离子。参见如Mamet等，1996，生物金属，9：73-77。

本发明也涉及可用于生产血红素蛋白的突变真菌细胞，该细胞具有对一或多个编码一或多种血红素代谢酶的第一核酸序列或其控制序列的修饰，其中在相同条件下培养时，突变细胞相比于亲本细胞生产的一或多种血红素代谢酶更少，而血红素蛋白更多。

本发明的突变真菌细胞还包含可指导细胞内源的一或多个第二核酸序列所编码的一或多种血红素生物合成酶表达的一个或多个第二控制序列，以及/或者一或多拷贝的编码一或多种血红素生物合成酶的一或多个第三核酸序列。这些序列可整合至突变真菌细胞的基因组中，或可包含在染色体外自主复制型载体中。

本发明的突变真菌细胞还可含有一或多拷贝的编码血红素蛋白的一或多个第四核酸序列，其中所述一或多个第四核酸序列与可指导细胞中血红素蛋白表达的第四控制序列可操作连接；编码血红素蛋白的第四核酸序列被整合至细胞基因组中，或包含于染色体外自主复制型载体中。

本发明还涉及生产突变真菌细胞的方法，包括对亲本真菌细胞中的编码血红素代谢酶的一或多个第一核酸序列或者其控制序列进行修饰，如破坏或删除，从而在相同条件下培养时，突变真菌细胞相比于亲本细胞生产的血红素代谢酶更少，而血红素蛋白更多。

本发明方法中真菌细胞的选择很大程度上取决于控制序列、编码血红素生物合成酶和血红素蛋白的核酸序列的来源。

在一个优选的实施方案中，真菌宿主细胞是一种酵母细胞。“酵母”在本文中包括产子囊酵母(内孢霉目)、产担子酵母，和属于半知菌类(芽孢纲)的酵母。产子囊酵母分成蚀精霉科和酵母科两个科。后者包括四个亚科：裂殖酵母亚科(Schizosaccharomycoideae)(例如裂殖酵母属)、拿逊酵母亚科(Nadsonioideae)、油脂酵母亚科(Lipomycoideae)和酵母亚科(Saccharomycoideae)(例如毕赤酵母属、克鲁维酵母属和酵母属)。产担子酵母包括白冬孢酵母属(Leucosporidim)、红冬孢酵母属(Rhodosporidium)、锁掷酵母属(Spordiobolus)、Filobasidium和Filobasidiella。属于半知菌类的酵母分成两个科：掷孢酵母科(Sporobolomycetaceae)(例如，Sorobolomyces属和布勒弹孢酵母属)和隐球酵母科(Cryptococcaceae)(例如假丝酵母属)。因为酵母的分类在将来可能会改变，为了本发明的目的，应按照《酵母的生物学和活性》(Skinner，F.APassmore，S.M和Davenport，R.R编，Soc.App.Bactoriol，论文集系列No.9，1980)中所述定义酵母。酵母的生物学和遗传学加工在本领域里已广为人知(见例如《酵母的生物化学和遗传学》，Bacil，MHorecker，B.JStopani，A.O.M.编，第2版，1987；《酵母》，Rose，A.H.和Harrison，J.S.编，第2版，1987；《酵母属酵母的分子生物学》，Strathern等编，1981)。

在一个较优选的实施方案中，酵母细胞是假丝酵母属、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、酵母属、裂殖酵母属或Yarrowia属细胞。

在一个最优选的实施方案中，酵母细胞是卡尔酵母、酿酒酵母、糖化酵母、Saccharomyces douglasii、克鲁弗酵母、诺地酵母或Saccharomyces oviformis细胞。在另一个最优选的实施方案中，酵母细胞是乳酸克鲁维酵母。在另一个最优选的实施方案中，酵母细胞是Yarrowia lipolytica细胞。

在另一个优选实施方案中，真菌宿主细胞是一种丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门(Oomycota)亚支的所有丝状真菌形式(由Hawksworth等定义，1995，出处同前)。丝状真菌的特征在于有由壳多糖、纤维素、葡聚糖、脱乙酰壳多糖、甘露聚糖和其他复杂多糖组成的菌丝壁。其营养生长是通过菌丝的延长进行的，碳分解代谢是专性需氧的。相比之下，酵母(例如酿酒酵母)的营养生长是通过单细胞菌体的出芽进行的，碳的分解代谢可能是发酵性的。在一个更优选的实施方案中，丝状真菌宿主细胞是枝顶孢属、曲霉属、镰孢属、腐质霉属、毛霉属、毁丝霉属、脉孢菌属、青霉属、梭孢壳属、Tolypocladium属及木霉属细胞。

在一个甚至更优选的实施方案中，该丝状真菌细胞是曲霉属细胞。在另一个更优选的实施方案中，该丝状真菌细胞是枝顶孢属细胞。在另一个更优选的实施方案中，该丝状真菌细胞是镰孢属细胞。在另一个更优选的实施方案中，该丝状真菌细胞是腐质霉属细胞。在另一个更优选的实施方案中，该丝状真菌细胞是毛霉属细胞。在另一个更优选的实施方案中，该丝状真菌细胞是毁丝霉属细胞。在另一个更优选的实施方案中，该丝状真菌细胞是脉孢菌属细胞。在另一个更优选的实施方案中，该丝状真菌细胞是青霉属细胞。在另一个更优选的实施方案中，该丝状真菌细胞是梭孢壳属细胞。在另一个更优选的实施方案中，该丝状真菌细胞是Tolypocladium属细胞。在另一个更优选的实施方案中，该丝状真菌细胞是木霉属细胞。

在一个最优选的实施方案中，该丝状真菌细胞是泡盛曲霉细胞、臭曲霉细胞、日本曲霉细胞、构巢曲霉、黑曲霉或米曲霉细胞。在另一个最优选的实施方案中，该丝状真菌细胞是杆孢状镰孢(Fusariumbactridioides)、Fusarium cerealis，Fusarium crookwellense、大刀镰孢、禾本科镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、Fusarium sulphureum，Fusariumtoruloseum， Fusarium trichothecioides或Fusarium venenatum细胞。在一个最优选的实施方案中，该丝状真菌亲本细胞是Fusarium venenatum(Nirenberg sp.nov.)在另一个最优选的实施方案中，该丝状真菌细胞是Humicola insolens细胞或Humicola lanuginosa细胞。在另一个更优选的实施方案中，该丝状真菌细胞是嗜热毁丝霉(Myceliophthorathermophila)细胞。在另一个最优选的实施方案中，该丝状真菌细胞是米黑毛霉(Mucor miehei)细胞。在另一个最优选的实施方案中，该丝状真菌细胞是粗糙脉孢菌细胞。在另一个最优选的实施方案中，该丝状真菌细胞是产紫青霉细胞。在另一个最优选的实施方案中，该丝状真菌细胞是Thielavia terrestris细胞。在另一个最优选的实施方案中，该木霉属细胞是Trichoderma harzianum，康宁木霉、Trichodermalongiblachiatum、Trichoderma reesei，或绿色木霉细胞。

可通过包括原生质体形成、原生质体转化以及细胞壁再生的方法以已知方式转化真菌细胞。EP238023和Yelton等，1984，美国国家科学院学报，81：1470-1474中描述了转化曲霉属宿主细胞的合适操作。Malardier等，1989，基因，78：147-156或WO96/00787中描述了转化镰孢的合适方法。可利用Becker和Guarente描述于酶学方法，194卷，酵母遗传学与分子生物学指南(Abelson，J.N.和Simon，M.I.编)，182-187页(Academic Press，IncNew York)；Ito等，1983，细菌学杂志，153：163；和Hinnen等，1978，美国国家科学院学报，75：1920中记载的操作转化酵母。

本文所述和要求权利的发明并不局限于本文所公开的具体实施方案的范围，因为这些实施方案仅仅旨在阐明本发明的几个方面。任何等价的实施方案都在本发明的范围之内。实际上，根据前文的描述，除了本文所示和所述的以外，本发明的多种修饰对于本领域技术人员而言都是显而易见的，这种修饰也欲包括在所附权利要求书的范围内。有冲突时，以本发明公开内容，包括定义为准。

本文提及很多参考文献，它们的公开内容都全文列入本文作为参考。

Claims (46)

1．一种生产血红素蛋白的方法，包括：

(a)在适合生产血红素蛋白的培养基中培养亲本真菌细胞的突变体，其中(ⅰ)所述突变体包含一或多个第一核酸序列，其中具有对编码一或多种血红素代谢酶的一或多个基因或者其控制序列的修饰，且(ⅱ)在相同条件下培养时，所述突变体相比于亲本细胞生产的所述一或多种血红素代谢酶更少，而血红素蛋白更多；及

(b)从突变体的培养基中回收血红素蛋白。

2．权利要求1的方法，其中第一核酸序列编码血红素加氧酶。

3．权利要求1的方法，其中第一核酸序列编码胆绿素还原酶。

4．权利要求1的方法，其中所述突变体还包含：

(ⅰ)指导由该细胞内源性的一个或多个第二核酸序列编码的一种或多种血红素生物合成酶表达的一或多个第二控制序列，其中该一或多个第二控制序列与第二核酸序列可操作连接；和/或

(ⅱ)一或多拷贝的编码一或多种血红素生物合成酶的一或多个第三核酸序列。

5．权利要求4的方法，其中所述突变体仅含有一或多个第二控制序列。

6．权利要求5的方法，其中第二控制序列选自前导序列、多聚腺苷酸化序列、启动子、前肽编码区、信号肽编码区和转录终止子。

7．权利要求5的方法，其中所述一或多个控制序列得自真菌菌株。

8．权利要求4的方法，其中所述突变体仅含有一或多拷贝的一或多个第三核酸序列。

9．权利要求8的方法，其中所述一或多个第三核酸序列与可指导该第三核酸序列表达的一或多个第三控制序列可操作连接。

10．权利要求8的方法，其中所述一或多个第三核酸序列得自真菌菌株。

11．权利要求8的方法，其中所述一或多个第三核酸序列编码选自下组的一或多种酶：5-氨基-γ-酮戊酸合成酶、胆色素原合成酶、胆色素原脱氨基酶、尿卟啉原合成酶、尿卟啉原脱羧酶、粪卟啉原氧化酶、原卟啉原氧化酶和亚铁螯合酶。

12．权利要求8的方法，其中所述一或多个第三核酸序列编码5-氨基-γ-酮戊酸合成酶。

13．权利要求8的方法，其中所述一或多个第三核酸序列编码胆色素原合成酶。

14．权利要求8的方法，其中所述一或多个第三核酸序列编码胆色素原脱氨基酶。

15．权利要求8的方法，其中所述一或多个第三核酸序列编码尿卟啉原合成酶。

16．权利要求8的方法，其中所述一或多个第三核酸序列编码尿卟啉原脱羧酶。

17．权利要求8的方法，其中所述一或多个第三核酸序列编码粪卟啉原氧化酶。

18．权利要求8的方法，其中所述一或多个第三核酸序列编码原卟啉原氧化酶。

19．权利要求8的方法，其中所述一或多个第三核酸序列编码亚铁螯合酶。

20．权利要求4的方法，其中所述突变体包含一或多拷贝的第二控制序列和一或多拷贝的第三核酸序列。

21．权利要求1的方法，其中所述突变体还包含一或多拷贝的编码血红素蛋白的第四核酸序列。

22．权利要求1的方法，其中营养培养基中包含有血红素或血红素类似物源。

23．权利要求1的方法，其中营养培养基中包含有铁源。

24．权利要求1的方法，其中所述血红素蛋白是氧化还原酶。

25．权利要求24的方法，其中所述氧化还原酶是过氧化氢酶、氧化酶、加氧酶、卤素过氧化物酶或过氧化物酶。

26．权利要求25的方法，其中所述氧化还原酶是过氧化氢酶。

27．权利要求25的方法，其中所述氧化还原酶是氧化酶。

28．权利要求25的方法，其中所述氧化还原酶是加氧酶。

29．权利要求25的方法，其中所述氧化还原酶是卤素过氧化物酶。

30．权利要求25的方法，其中所述氧化还原酶是过氧化物酶。

31．权利要求30的方法，其中所述过氧化物酶得自于鬼伞属、Arthromyces属或Phanerochaete属内的种。

32．权利要求31的方法，其中所述过氧化物酶得自于鬼伞属菌株。

33．权利要求32的方法，其中所述过氧化物酶得自于灰盖鬼伞菌株。

34．权利要求32的方法，其中所述过氧化物酶得自于长根鬼伞菌株。

35．权利要求1的方法，其中所述血红素蛋白是亲本真菌细胞的天然蛋白质。

36．权利要求1的方法，其中所述血红素蛋白是亲本真菌细胞的外源蛋白质。

37．权利要求1的方法，其中所述亲本真菌细胞是丝状真菌细胞或酵母细胞。

38．权利要求37的方法，其中所述丝状真菌细胞是枝顶孢属、曲霉属、镰孢属、腐质霉属、毁丝霉属、毛霉属、脉孢菌属、青霉属、梭孢壳属、Tolypocladium属或木霉属细胞。

39．权利要求38的方法，其中所述丝状真菌细胞是曲霉细胞。

40．权利要求39的方法，其中所述曲霉细胞是米曲霉细胞。

41．权利要求39的方法，其中所述曲霉细胞是黑曲霉细胞。

42．权利要求37的方法，其中所述酵母细胞是假丝酵母属、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、酵母属、裂殖酵母属或Yarrowia属细胞。

43．可用于生产血红素蛋白的突变真菌细胞，该细胞中含有对编码一或多种血红素代谢酶的一或多个基因或者其控制序列具有修饰的一或多个第一核酸序列，在相同条件下培养时，该突变真菌细胞相比于其亲本细胞生产的一或多种血红素代谢酶更少，而血红素蛋白更多。

44．权利要求43的突变真菌细胞，其中还包含：

(ⅰ)可指导细胞内源性的一或多个第二核酸序列所编码的一或多种血红素生物合成酶表达的一个或多个第二控制序列，其中所述一或多个第二控制序列与所述一或多个第二核酸序列可操作连接；和/或

(ⅱ)一或多拷贝的编码一或多种血红素生物合成酶的一或多个第三核酸序列。

45．权利要求43的突变细胞，其中还含有一或多拷贝的编码血红素蛋白的第四核酸序列。

46．生产突变真菌细胞的方法，包括对包含亲本真菌细胞中编码一或多种血红素代谢酶的一或多个基因或者其控制序列的一或多个第一核酸序列进行修饰，从而在相同条件下培养时，突变真菌细胞相比于亲本细胞生产的所述一或多种血红素代谢酶更少，而血红素蛋白更多。