CN1386134A - 生产γ－谷氨酰半胱氨酸的方法 - Google Patents

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Abstract

利用一种酿酒酵母菌株生产酵母提取物,当在谷胱甘肽合酶缺陷型酿酒酵母菌株在其中的生长比野生型菌株(例如,染色体上的谷胱甘肽合酶基因编码的谷胱甘肽合酶缺乏第370位精氨酸之后的C末端结构域的酿酒酵母菌株)低的培养基中培养所述菌株时,该菌株在对数生长期可以含有1%(重量)或更多的γ－谷氨酰半胱氨酸和0.004－0.1%(重量)的谷胱甘肽。

Description

生产γ-谷氨酰半胱氨酸的方法
发明背景
发明领域
本发明涉及含高浓度γ-谷氨酰半胱氨酸的酵母和酵母提取物以及培育这种酵母的方法。用其制备的γ-谷氨酰半胱氨酸和半胱氨酸用于食品业。
相关技术描述
半胱氨酸用于增进食品香味等。已知有蛋白水解法、半人工合成法等方法生产半胱氨酸，目前主要使用的方法是蛋白水解法和半人工合成法。为了将半胱氨酸用于增进食品香味，希望找到含高浓度半胱氨酸的天然营养物质(food materials)。但目前为止几乎还没有发现这样的天然营养物质。
谷胱甘肽是半胱氨酸与谷氨酸和甘氨酸键合组成的的三肽，已知它也用于增进食品香味。半胱氨酸通过γ-谷氨酰半胱氨酸合成谷胱甘肽。但是，γ-谷氨酰半胱氨酸几乎不用于增进食品香味。
γ-谷氨酰半胱氨酸是在γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(GSH1)的作用下由半胱氨酸和谷氨酸合成。而谷胱甘肽是在谷胱甘肽合成酶(GSH2)的作用下由γ-谷氨酰半胱氨酸和甘氨酸合成。
曾报道一种称作酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)YHT178的酵母菌株，该菌株的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶基因启动子被一个强转录启动子ΔP8替代，其细胞中产生大量γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(Yasuyuki Ootake等，Bioscince and Industry，第50卷，第10期，第989-994页，1992)。此外，Ootake等人在另一篇文章中也报道，在一种谷胱甘肽合成酶缺陷菌株酿酒酵母YL1中没有检测到谷胱甘肽(Yasuyuki Ootake等，Agricultural and Biological Chemistry，第12卷，第54期，第3145-3150页，1990)。
Inoue等人报道了位于染色体上的谷胱甘肽合成酶基因被破坏(Yoshiharu Inoue等，Biochimica et Biophysica Acta，第1395期，第315-320页，1998)。认为该破坏的基因编码谷胱甘肽合成酶，其中第1-396位的氨基酸残基正确翻译，但缺失第397位开始的C末端区。Inoue等人报道，检测了所述基因被破坏的菌株的谷胱甘肽含量，但是没有检测到谷胱甘肽。
此外，尽管已知可以通过在γ-谷氨酰半胱氨酸中加入一种糖并加热得到一种香味组合物(日本专利公开(Japanese Patent Laid-openPublication(Kokai)第4-91762号)，但不知道在加热γ-谷氨酰半胱氨酸时是否释出半胱氨酸。
如上所述，已有关于增强γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的表达和破坏阻断谷胱甘肽合成酶基因的报道。但是，在所述已获得的酿酒酵母菌株中或者γ-谷氨酰半胱氨酸的含量低或者不能良好生长，因而认为它们不能完全满足工业生产所需的要求。
有报道指出，γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的表达增强的YHT178菌株在合成基本培养基中其细胞中最多可以积累1.69％的γ-谷氨酰半胱氨酸(Ootake等，Bioscience and Industry，同上)。但是，该报道没有给出所述酵母菌在该培养基中的生长率。虽然报道了所述酵母菌在营养较合成基本培养基更丰富的YPD培养基中的生长率，却不能就此说在YPD培养基中已达到工业水平所要求的生长率。
进一步，所报道的谷胱甘肽合成酶基因被破坏的YL1菌株中γ-谷氨酰半胱氨酸含量低至0.533％，不能应用于工业实际生产中(Ootake等，Agric.Biol.Chem.，同上)。另外，Chris等人指出，既然YL1菌株的表型与一种谷胱甘肽合成酶被部分减弱的菌株相似，那么其谷胱甘肽合成酶也没有完全消除(Chris M.Grant等，Molecular Biology ofthe Cell，第8卷，第1699-1707页，1997)。但是，既然YL1菌株在含谷胱甘肽和不含谷胱甘肽的培养基中生长其对数期增殖能力显著不同，那么它与本发明中谷胱甘肽合成酶减弱菌株有本质的不同。
此外，曾报道当检测由Inoue等人(同上)制备的谷胱甘肽合成酶基因破坏菌株的谷胱甘肽含量时，没有检测到谷胱甘肽。
                       发明概述
在如上所述的技术背景下，本发明的目的即提供一种如半胱氨酸一样可以实际应用于增进食品香味的天然营养物质，更准确地说，提供一种酵母菌以及利用该酵母菌生产的酵母提取物，所述酵母菌可用于甚至是工业水平的生产中而且积累大量的γ-谷氨酰半胱氨酸。
本发明的发明者们发现，当加热γ-谷氨酰半胱氨酸时释出半胱氨酸，因此设想如果加热含γ-谷氨酰半胱氨酸的天然营养物质，就可以产生一种如含半胱氨酸的天然营养物质一样使用的天然营养物质。所以，以培育出高含量γ-谷氨酰半胱氨酸的酵母菌株为目标，发明者们试图破坏谷胱甘肽合成酶基因。但是没有获得满意的结果。发明者们进一步努力研究，结果成功获得高含量γ-谷氨酰半胱氨酸和良好生长的菌株。这样完成了本发明。
也就是说，本发明提供以下几项：(1)一种酿酒酵母菌株，当在谷胱甘肽合成酶缺陷型酿酒酵母菌株在其中的生长率比野生型菌株低的培养基中培养该菌株时，其在对数生长期可以包含1％(重量)或更多的γ-谷氨酰半胱氨酸和0.004-0.1％(重量)的谷胱甘肽。(2)根据(1)中所述的酿酒酵母菌株，其中谷胱甘肽合成酶缺陷型酿酒酵母菌株在其中的生长率比野生型菌株低的所述培养基是不包含谷胱甘肽的培养基，或者不包含谷胱甘肽、γ-谷氨酰半胱氨酸、L-半胱氨酸和胱氨酸的培养基。(3)根据(2)中所述的酿酒酵母菌株，其中所述培养基是基本培养基。(4)一种酿酒酵母菌株，其中染色体上谷胱甘肽合成酶基因编码的谷   胱甘肽合成酶缺少从第370位精氨酸开始的一段C末端区。(5)通过在合适的培养基中培养(1)至(4)中任一项的酿酒酵母菌株并利用获得的细胞生产出的酵母提取物。(6)一种培育含γ-谷氨酰半胱氨酸的酿酒酵母菌株的方法，包括以下步骤：构建重组酿酒酵母菌株，其谷胱甘肽合成酶基因通过基因重组技术加以修饰；筛选重组菌株，当在谷胱甘肽合成酶缺陷型酿酒酵母菌株在其中的生长率比野生型菌株低的培养基中培养所述菌株时，其在对数生长期包含0.004-0.1％(重量)的谷胱甘肽。本发明的酿酒酵母菌株产生超过一定量的γ-谷氨酰半胱氨酸且在一种诸如不含谷胱甘肽的工业用培养基中生长良好。所以，该菌株可用于有效生产含γ-谷氨酰半胱氨酸的酵母提取物。
                         附图简述
图1图示在pH 3加热处理时γ-谷氨酰半胱氨酸释放出半胱氨酸。PCA代表吡咯烷酮羧酸(pyrolidonecarboxylic acid)，总半胱氨酸代表半胱氨酸总量，而γ-Glu-Cys代表γ-谷氨酰半胱氨酸(图2同)。
图2图示在pH 5加热处理时γ-谷氨酰半胱氨酸释放出半胱氨酸。
图3图示GSH2Mdash/pYES2dash质粒的构建，该质粒包含用于替换的减弱型谷胱甘肽合成酶基因的盒(盒2)。
图4图解示意用盒2替换谷胱甘肽合成酶基因。
图5图示Nα3菌株在SD培养基或含1mM谷胱甘肽的SD培养基(含所需量的尿嘧啶)上的生长情况(OD660)。
图6图示Nα2菌株和Nα3菌株在SD培养基(含所需量的尿嘧啶)上的生长情况。
                    发明详述
下文详细介绍本分明。
如上所述，本分明首先是基于这样的发现：当加热γ-谷氨酰半胱氨酸时产生半胱氨酸。如果在pH 1-7于50-120℃加热γ-谷氨酰半胱氨酸3至300分钟，γ-谷氨酰半胱氨酸分解成半胱氨酸和PCA(吡咯烷酮羧酸)，所以总体上可以得到高产量的半胱氨酸。术语“半胱氨酸”以下用来指L-半胱氨酸和胱氨酸，胱氨酸即L-半胱氨酸的氧化型二硫化物。
基于上述发现培育出本发明的酿酒酵母菌株以用于增进食品香味等。当在谷胱甘肽合成酶缺陷型酿酒酵母菌株在其中的生长率较野生型菌株低的培养基中培养本发明的酿酒酵母菌株时，其在对数生长期包含1％(相对于固体组分的重量百分比)或更多的γ-谷氨酰半胱氨酸。在本发明中，γ-谷氨酰半胱氨酸或谷胱甘肽的含量是指γ-谷氨酰半胱氨酸或谷胱甘肽相对于细胞固体组分重量(例如在105℃加热4小时后的细胞干重)的含量(％)。
进一步，当在谷胱甘肽合成酶缺陷型酿酒酵母菌株在其中的生长率较野生型菌株低的培养基中培养本发明的酿酒酵母菌株时，它在对数生长期可以含有1％(重量)或更多酸、优选1.7％(重量)或更多的γ-谷氨酰半胱氨，以及含有0.004-0.1％(重量)、优选0.004-0.01％(重量)的谷胱甘肽。如下文的实施例介绍，本发明的酿酒酵母菌株产生痕量谷胱甘肽，而且在不含谷胱甘肽的培养基中生长得比谷胱甘肽合成酶缺陷型菌株好。在该说明书中，具有微弱谷胱甘肽合成酶活性从而使得在上述培养基中产生0.004-0.1％(重量)的谷胱甘肽的菌株(例如本发明的酿酒酵母菌株)也可称作“谷胱甘肽合成酶减弱菌株”，。另一方面，“谷胱甘肽合成酶缺陷型菌株”是指谷胱甘肽合成酶活性基本缺乏而且在基本培养基中不能生成谷胱甘肽的菌株。此外，本发明中，术语“对数生长期”是指培养过程中培养物酿酒酵母细胞数量相对培养时间按对数比例增长的培养阶段。在整个对数生长期中γ-谷氨酰半胱氨酸含量不一定总是1％(重量)或更高，只要在对数生长期中的任一点达到1％(重量)或更高含量、优选在液体培养基的吸光度等于对数生长期后的平稳期吸光度的1/2或更高的对数生长期达到1％(重量)或更高γ-谷氨酰半胱氨酸含量。
本发明的酿酒酵母菌株产生超过一定量的γ-谷氨酰半胱氨酸且在工业用培养基例如上述不含谷胱甘肽的培养基中生长良好。所以，它具有良好的γ-谷氨酰半胱氨酸生产率/单位时间，适于高效生产含γ-谷氨酰半胱氨酸的酵母提取物。此外，可以通过加热所得的酵母提取物生产含高浓度半胱氨酸的酵母提取物。
谷胱甘肽合成酶缺陷型酿酒酵母菌株在其中的生长率较野生型菌株(即具有谷胱甘肽合成酶活性且生成谷胱甘肽的菌株)低的培养基实例包括例如不含谷胱甘肽的培养基和不含谷胱甘肽、γ-谷氨酰半胱氨酸、L-半胱氨酸和胱氨酸的培养基。可特别提及诸如SD培养基的各种基本培养基。当本发明的酿酒酵母菌株除了上述特征外还表现出辅源营养(auxotrophy)，应根据需要在上述培养基中加入对应于该辅源营养的营养成分，例如，除半胱氨酸外的各种氨基酸、核苷酸、维生素等。
本发明酿酒酵母菌株的具体实例包括产生如下所述的谷胱甘肽合成酶的酿酒酵母菌株：该谷胱甘肽合成酶缺失从370位的精氨酸残基开始的C末端区，即缺失第370位及其后的氨基酸残基的谷胱甘肽合成酶。
根据前述Inoue等人的报道(Yoshiharu Inoue等，Biochimica etBiophysica Acta，第1395期，第315-320页，1998)，认为含1-396位氨基酸残基但是缺失第397位及其后氨基酸残基的谷胱甘肽合成酶失去其活性。所以，预测如果用一个终止密码子替代谷胱甘肽合成酶结构基因中第396位及其上游的任一氨基酸残基的密码子，那么表达产物没有谷胱甘肽合成酶活性。但是，如下文实施例所述，用一个终止密码子替代谷胱甘肽合成酶基因的第370位密码子而得到的基因替代菌株生成痕量的谷胱甘肽，因而表明它具有微弱的谷胱甘肽合成酶活性。
基于以上发现，可以通过减弱细胞的谷胱甘肽合成酶活性而得到本发明的酿酒酵母菌株。为了减弱谷胱甘肽合成酶活性，可以采用以下各种方法：使谷胱甘肽合成酶基因的启动子由所述基因的合适启动子变成源于另一个基因的较弱的启动子；通过修饰谷胱甘肽合成酶基因的启动子或编码区减弱谷胱甘肽合成酶的表达或活性或者两者都减弱；减弱该基因的转录因子的活性等。
举例来说，所述谷胱甘肽合成酶基因序列可以通过以下常用的突变法来修饰：紫外线照射、用诸如N-甲基-N-亚硝基胍(NTG)、甲磺酸乙酯(EMS)、亚硝酸和吖啶的突变剂处理、或者采用基因重组技术替换基因。
可按如下步骤进行基因的替换(见图4)：以重组DNA转化酿酒酵母菌株，该重组DNA包含经过修饰从而使编码的谷胱甘肽合成酶具有微弱活性的谷胱甘肽合成酶基因(减弱型谷胱甘肽合成酶基因)，如第370位密码子变为密码子的谷胱甘肽合成酶基因，所述转化使得该减弱型谷胱甘肽合成酶基因与染色体上的谷胱甘肽合成酶基因发生重组。在这种情况下，若根据宿主的表型诸如辅源营养，在质粒中加入标记基因，那么可使操作变得很简单。进一步，利用质粒制备了上述重组DNA后，如果该重组DNA经限制性内切酶消化后成线性且去除其在酿酒酵母菌中起作用的复制控制区段，那么可有效获得所述重组DNA整合入染色体的菌株。
在重组DNA如上所述掺入染色体的菌株中，重组DNA与染色体上原有的谷胱甘肽合成酶基因序列发生重组，普通的谷胱甘肽合成酶基因和减弱型谷胱甘肽合成酶基因的2个融合基因插入至染色体中，从而使重组DNA的其他部分(载体部分和标记基因)插入两者之间。因此，在这种状态下普通的谷胱甘肽合成酶基因起作用。
然后，为了在所述染色体DNA上仅保留缺失型的谷胱甘肽合成酶基因，通过两个谷胱甘肽合成酶基因的重组将一个拷贝谷胱甘肽合成酶基因连同载体部分(包括标记基因)一起从所述染色体DNA上去掉。这时，或者是染色体DNA上保留普通的谷胱甘肽合成酶基因，而将减弱型谷胱甘肽合成酶基因切除；或者相反，染色体DNA上保留减弱型谷胱甘肽合成酶基因，而将普通的谷胱甘肽合成酶基因切除。因为两种情况标记基因都被切除，因此可通过检测对应于标记基因的表型特征确认二次重组的发生。进而，可通过PCR扩增谷胱甘肽合酶基因并研究其结构从而选出基因被破坏的需要菌株。
可以通过用于酵母的常用转化方法转化酿酒酵母，例如原生质体法、KU法、KUR法、电穿孔法等。
诸如启动子的表达调节序列也可以通过以上近似的方法进行修饰。本发明的酿酒酵母菌株除了具有微弱的谷胱甘肽合成酶活性，还可以具有增强的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性。
本发明的酿酒酵母菌株或用于制备该菌株的母体菌株可以是单倍体、双倍体或更高的多倍体。
可以通过以下步骤获得本发明的酿酒酵母菌株：在谷胱甘肽合成酶缺陷型酿酒酵母菌株生长率较野生型菌株低的培养基中培养如上所述修饰的酿酒酵母菌株，然后筛选出在对数生长期含0.004-0.1％(重量)谷胱甘肽的重组菌株。
可以通过在一种合适的培养基中培养本发明的酿酒酵母菌株并利用获得的细胞生产含γ-谷氨酰半胱氨酸的酵母提取物。进一步通过加热所获得的酵母提取物，可以生产高含量半胱氨酸的酵母提取物。
用于生产酵母提取物的培养基没有特别的限制，只要本发明的酿酒酵母菌株在该培养基中生长良好且有效产生γ-谷氨酰半胱氨酸。特别是因为本发明的酿酒酵母菌株甚至在不含谷胱甘肽的培养基上也能生长良好，因此可以使用工业上常用的培养基。根据所用菌株的特征需要还可以在所述培养基中加入必需的营养物。
制备酵母提取物的培养条件和程序可以与常规的培养酿酒酵母以及制备酵母提取物的制备方法相似。所述酵母提取物可以通过热水处理抽提酵母细胞后获得的抽提物或处理消化酵母细胞来制备。
实施本发明的最佳方式
下文将参考以下实施例更具体地解释本发明。<1>热处理使γ-谷氨酰半胱氨酸释放半胱氨酸
在98℃下加热浓度为1mmol的还原型γ-谷氨酰半胱氨酸水溶液(pH调节为3-5)，检测不同时间的产物。结果如图1和图2所示，发现加热使γ-谷氨酰半胱氨酸分解为半胱氨酸和吡咯烷酮羧酸(在图1和图2中以“PCA”表示)，从而获得高产量的半胱氨酸。<2>构建谷胱甘肽合成酶基因破坏的菌株
然后，构建谷胱甘肽合成酶基因破坏的菌株。(1)分离尿嘧啶辅源营养的酿酒酵母
应用常规方法由天然分离的酿酒酵母获得单倍体Nα菌株。用含有尿嘧啶的SDFOA平板(含最终浓度为2％的纯化琼脂、50mg/L的尿嘧啶和1g/L的5-氟乳清酸水合物的SD培养基)由Nα菌株获得尿嘧啶辅源营养型Nα1菌株。如下文所述，因为URA3基因与所述尿嘧啶辅源营养缺陷型Nα1菌株互补，所以认为所述菌株是URA3基因突变菌株。
(SD培养基的组成)
葡萄糖             2％
氮碱               1倍浓度
(通过下述方法制备10倍浓度的氮碱：将1.7g不含氨基酸和硫酸铵的Bacto酵母氮碱(Difco)及5g硫酸铵的混合物溶解于100ml无菌水中，调节溶液pH约为5.2，将所述溶液用滤器过滤除菌)(2)制备谷胱甘肽合酶缺陷盒
以所述Nα1菌株为母体菌株构建谷胱甘肽合成酶基因破坏的菌株。
首先，以Nα1菌株的染色体DNA为模板通过PCR扩增自谷胱甘肽合成酶(GSH2)基因上游区至末端区的区段。如下进行PCR：以含有下列组成的反应溶液于94℃反应1分钟，然后重复以下循环30次：94℃反应30秒、60℃反应40秒以及74℃反应1分钟30秒。
(PCR用反应溶液的组成)
染色体DNA溶液                       1μl
10×PCR缓冲溶液                     10μl
10mM dNTPs                          10μl
10pmol/μl GAL11F(SEQ ID NO：1)     1μl
10pmol/μl GSH2R3(SEQ ID NO：2)     1μl
纯水                                76μl
KOD Dash(TOYOBO)*                  1μl
总量                                100μl
(*：用于PCR的聚合酶)
按照厂家说明，将上述扩增的GSH2基因片段与pGEM-T Easy质粒(Promega)连接获得GSH2/pGEM。
另外，用包含所述基因的pYES2质粒(Invitrogen)为模板通过PCR获得作为筛选基因标记的URA3基因。如下进行PCR：以含有下列组分的反应溶液于94℃反应1分钟，然后重复94℃反应30秒、52℃反应30秒和74℃反应40秒的循环30次。
(PCR用反应溶液的组成)
10ng/μl pYES2                          1μl
10×PCR缓冲溶液                         10μl
10mM dNTPs                              10μl
10pmol/μl URA3F2(SEQ ID NO：3)         1μl
10pmol/μl URA3R2(SEQ ID NO：4)         1μl
纯水                                    76μl
KOD Dash                                1μl
总量                                    100μl
然后，用限制性内切酶MunI消化GSH2/pGEM，其末端为平头末端。使其末端经限制性内切酶SmaI末端平端化的URA3基因片段与上述消化末端连接，制得URA3-GSH2/pGEM。以该URA3-GSH2/pGEM为模板，并以含有对应于所述GSH2基因末端区的序列为引物进行PCR以制备盒1。如下进行PCR：以含有下列组分的反应溶液于94℃反应1分钟，然后重复94℃反应30秒、56℃反应30秒和74℃反应1分钟的循环30次。
(PCR用反应溶液的组成)
10ng/μl URA3-GSH2/pGEM                      1μl
10×PCR缓冲溶液                              10μl
10mM dNTPs                                   10μl
10pmol/μl GAL11F(SEQ ID NO：1)              1μl
10pmol/μl GSH2R(SEQ ID NO：5)               1μl
纯水                                         76μl
KOD Dash                                     1μl
总量                                         100μl(3)获取谷胱甘肽合成酶基因缺陷菌株
以上述制备的盒1破坏所述Nα1菌株的谷胱甘肽合成酶基因。预培养所述Nα1菌株，将所述培养物在50ml YPD培养基中传代培养，直至其达到对数生长期。将所述培养细胞悬浮于1M山梨糖醇中并与盒1混合，然后通过电穿孔法进行转化。在含1mM谷胱甘肽的SD平板上培养转化体菌株，筛选生长菌株。如下所述通过PCR和检测细胞中的谷胱甘肽含量，筛选出谷胱甘肽合成酶基因被盒1替代的菌株，获得Nα2菌株。
在上述制备的Nα2菌株中，在谷胱甘肽合成酶基因编码区的第11个密码子后插入源自URA3基因片段的序列。所以，谷胱甘肽合成酶基因只正确编译了至第11个氨基酸残基的序列。<3>谷胱甘肽合成酶减弱菌株的构建
然后，制备替代为减弱型谷胱甘肽合成酶基因的菌株。(1)制备替代用减弱型谷胱甘肽合成酶基因的盒
通过PCR扩增Nα1菌株的谷胱甘肽合成酶基因片段。如下进行PCR：以含有下列组分的反应溶液于98℃反应10秒，然后重复98℃反应10秒、60℃反应30秒和72℃反应1分钟的循环30次。
(PCR用反应溶液的组成)
酵母染色体                                1μl
Pyrobest DNA聚合酶(Takara Shuzo)          0.5μl
10×PCR缓冲溶液                           10μl
10mM dNTPs                                8μl
20pmol/μl GSH2F7(SEQ ID NO：6)           2μl
20pmol/μl GSH2R7(SEQ ID NO：7)           2μl
纯水                                      76.5μl
总量                                      100μl
上述扩增的基因片段经过纯化，通过在含下列组分的反应溶液中于72℃进行酶反应10分钟将腺嘌呤核苷酸加至该扩增片段的末端。
(反应溶液的组成)
基因片段溶液                              5μl
10×PCR缓冲溶液(不含MgCl2)               10μl
25mM MgCl2                               3μl
2.5mM dATP                                5μl
Taq DNA聚合酶(Takara Shuzo)               0.5μl
纯水                                      31.5μl
总量                                      50μl
按照厂家说明，将上述反应产物与pGEM-T Easy质粒(Promega)连接获得质粒GSH2dash/pGEM。
然后，将GSH2dash/pGEM中包含的对应于谷胱甘肽合酶基因第370位氨基酸残基的密码子利用位点特异性诱变替换为一个终止密码子。按照厂家说明使用QuickChangeTM位点特异性诱变试剂盒(STRATAGENE)完成上述过程。以GSH2M-F1(SEQ ID NO：8)和GSH2M-R1(SEQ ID NO：9)作为引物。这样，就制备出质粒GSH2Mdash/pGEM。
另外，制备对应于质粒pYES2(Invitrogen)但其2μori被去除的的质粒。用限制性内切酶SspI和NheI消化pYES2，得到平头末端，将上述产物连接后得到质粒pYES2dash。用限制性内切酶SacI和SphI消化pYES2dash和GSH2Mdash/pGEM，由pYES2dash得到含URA3基因的片段，而从GSH2Mdash/pGEM得到突变的谷胱甘肽合成酶基因片段，然后将这些片段连接。这样，制备出GSH2Mdash/pYES2dash质粒。用限制性内切酶MunI消化GSH2Mdash/pYES2dash得到盒2(图3)。(2)构建含取代的减弱型谷胱甘肽合成酶基因的菌株
用上述获得的盒2取代Nα1菌株的谷胱甘肽合成酶基因(图4)。预培养所述Nα1菌株，将所述培养物在50ml YPD培养基中传代培养，直至其达到对数生长期。将所述培养细胞悬浮于1M山梨糖醇中并与盒2混合，然后通过电穿孔法转化细胞。在含1mM谷胱甘肽的SD平板上培养转化体菌株，筛选生长菌株。通过PCR确认盒2插入染色体上的目标位点结合，获得的菌株称为Nα3中间体菌株。
然后，为了在染色体上仅保留所述减弱型谷胱甘肽合成酶基因，进行如下步骤的操作，见图4。在YPD培养基中培养所述Nα3中间体菌株，将该培养产物接种至含1mM谷胱甘肽的SDFOA平板上。检测该平板上生长菌株的谷胱甘肽合成酶基因序列以确认所述目标位点的序列被正确取代。这样，得到Nα3菌株。<4>培养Nα2菌株和Nα3菌株并生产γ-谷氨酰半胱氨酸
考察上述获得的Nα2菌株和Nα3菌株在对数生长期的增殖能力。在YPD培养基中预培养Nα2菌株和Nα3菌株，将两种培养物都接种至50ml的SD培养基(含50mg/L的尿嘧啶)或含1mM谷胱甘肽的SD培养基(含50mg/L的尿嘧啶)中，于30℃振摇培养。结果见图5和图6。如图5所示，Nα3菌株在不含谷胱甘肽的培养基中的增殖能力和在含谷胱甘肽的培养基中的增殖能力比较无明显差异。此外，在不含谷胱甘肽的培养基中Nα3菌株在对数生长期比Nα2菌株生长得更好(图6)。
然后，考察Nα2菌株和Nα3菌株在对数生长期单位时间内γ-谷氨酰半胱氨酸和谷胱甘肽的产量。在YPD培养基中预培养Nα2菌株和Nα3菌株，将两种培养物分别都接种至50ml的SD培养基(含需要量尿嘧啶)中，于30℃振摇培养。
如下检测γ-谷氨酰半胱氨酸和谷胱甘肽产量。通过离心两种培养物收集细胞，用蒸馏水清洗细胞两次，然后用70℃的热水抽提细胞10分钟，以获得细胞内含物。将所述细胞内含物离心，然后检测得到的上清液中γ-谷氨酰半胱氨酸和谷胱甘肽的含量。进而使预定量培养基含有的酵母细胞加至滤纸上，于105℃加热4小时。然后，称重残留的细胞，以该重量作为干细胞重量。单位干重的细胞中γ-谷氨酰半胱氨酸和谷胱甘肽的含量见表1。
                         表1
    检测前的培养时间** γ-谷氨酰半胱氨酸(％)     谷胱甘肽(％)
1号Nα2菌株     约2.6小时        1.752       0
2号Nα2菌株     约5.3小时        1.748       0
1号Nα3菌株     约1.5小时        1.101     0.0043
2号Nα3菌株     约3.8小时        1.117     0.0045
由以上结果计算出每种菌株的单位时间γ-谷氨酰半胱氨酸产量。为了证明Nα3菌株优于Nα2菌株，将Nα2菌株中γ-谷氨酰半胱氨酸含量较高的菌株(1号Nα2菌株)和Nα3菌株中γ-谷氨酰半胱氨酸含量较低的菌株(1号Nα3菌株)两者的结果作比较计算。也就是说，计算Nα2菌株的最大值和Nα3菌株的最小值。结果，Nα2菌株的产量为0.116mg/小时，Nα3菌株的产量为0.124mg/小时。说明书的氨基酸和核苷酸序列表
                               序列表<110>味之素株式会社(Ajinomoto Co.，Inc.)<120>生产γ-谷氨酰半胱氨酸的方法<130>B751SMOP1193<140><141>2001-05-24<150>JP 2000-155121<151>2000-05-25<160>9<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：用于PCR的引物<400>1tatgaagact gtacagtctc c                                         21<210>2<211>34<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：用于PCR的引物<400>2ccggggagct cagctaaatg gtgtacttcg ctac                            34<210>3<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：用于PCR的引物<400>3attaacccgg gttgattcgg taatctccg                                   29<210>4<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：用于PCR的引物<400>4attaacccgg ggttttttag ttttgctggc                                   30<210>5<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：用于PCR的引物<400>5agctaaatgg tgtacttcgc tac                                          23<210>6<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：用于PCR的引物<400>6cagattccga gtttactgga                                              20<210>7<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：用于PCR的引物<400>7agaaggaatg agcctaaaac agc                                          23<210>8<211>38<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：用于PCR的引物<400>8ggcagggaag gcaagtagct ggcattaagt gagccctc                         38<210>9<211>38<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：用于PCR的引物<400>9gagggctcac ttaatgccag ctacttgcct tccctgcc                         38

Claims (6)

1.一种酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株，当在谷胱甘肽合成酶缺陷型酿酒酵母菌株在其中的生长率比野生型菌株低的培养基中培养该菌株时，其在对数生长期可含有1％(重量)或更多的γ-谷氨酰半胱氨酸和0.004-0.1％(重量)的谷胱甘肽。
2.根据权利要求1的酿酒酵母菌株，其中谷胱甘肽合成酶缺陷型酿酒酵母菌株在其中的生长率比野生型菌株低的所述培养基是不含谷胱甘肽的培养基或者不含谷胱甘肽、γ-谷氨酰半胱氨酸、L-半胱氨酸和胱氨酸的培养基。
3.根据权利要求2的酿酒酵母菌株，其中所述培养基是一种基本培养基。
4.一种酿酒酵母菌株，其中染色体上的谷胱甘肽合成酶基因编码的谷胱甘肽合成酶缺失从第370位精氨酸残基开始的C末端区。
5.一种酵母提取物，它是通过在合适的培养基中培养权利要求1至4任一项的酿酒酵母菌株并利用所获得的细胞制得的。
6.一种培育含γ-谷氨酰半胱氨酸的酿酒酵母菌株的方法，该方法包括以下步骤：
构建其中谷胱甘肽合成酶基因通过基因重组技术加以修饰的重组酿酒酵母菌株；筛选以下这样的重组菌株：当在谷胱甘肽合成酶缺陷型酿酒酵母菌株在其中的生长率比野生型菌株低的培养基中培养该菌株时，其在对数生长期含有0.004-0.1％(重量)的谷胱甘肽。
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