CN1280135A - L－亮氨酸的生产方法及有关dna和微生物 - Google Patents

L－亮氨酸的生产方法及有关dna和微生物 Download PDF

Info

Publication number
CN1280135A
CN1280135A CN00120462A CN00120462A CN1280135A CN 1280135 A CN1280135 A CN 1280135A CN 00120462 A CN00120462 A CN 00120462A CN 00120462 A CN00120462 A CN 00120462A CN 1280135 A CN1280135 A CN 1280135A
Authority
CN
China
Prior art keywords
dna
leucine
ala
val
residue
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN00120462A
Other languages
English (en)
Other versions
CN1211399C (zh
Inventor
M·M·古斯雅廷纳
M·G·伦特斯
Y·I·科兹洛夫
L·V·伊万诺维斯卡雅
E·B·沃罗希洛瓦
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Ajinomoto Co Inc
Original Assignee
Ajinomoto Co Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ajinomoto Co Inc filed Critical Ajinomoto Co Inc
Publication of CN1280135A publication Critical patent/CN1280135A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN1211399C publication Critical patent/CN1211399C/zh
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/06—Alanine; Leucine; Isoleucine; Serine; Homoserine

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

生产L－亮氨酸的方法,包括以下步骤:在培养基中培养用编码L－亮氨酸的反馈抑制被脱敏的α－异丙基苹果酸合酶的DNA转化的细菌,以在培养基中产生和积累L－亮氨酸,并且由培养基中回收L－亮氨酸。

Description

L—亮氨酸的生产方法及有关DNA和微生物
发明背景
本发明涉及编码突变α—异丙基苹果酸合酶的DNA。本发明也涉及具有突变α—异丙基苹果酸合酶的产L—亮氨酸微生物，以及利用这种微生物生产L—亮氨酸的方法。L—亮氨酸是一种必需氨基酸，可以用作食品或饲料营养添加剂，医学处置、药物或化学工业用试剂或材料，或用于生产赖氨酸等其他氨基酸的生长因子。
在过去，L—亮氨酸主要利用属于短杆菌属、棒杆菌属或沙雷氏菌属、产生L—亮氨酸的微生物或其突变体通过发酵方法生产(氨基酸发酵，日本科学学会出版社，pp 397—422，1986)。
使用黄色短杆菌VKPM B—2736时获得最高水平的L—亮氨酸积累。这种菌株在试验发酵罐中发酵72小时后在含蔗糖培养基中积累的L—亮氨酸浓度达26 g／L(USSR作者证书1394711)。乳发酵短杆菌34在含蔗糖培养基中产生高达34 g／L的L—亮氨酸(Appl．Environ．Microbiol．，51，p．1024(1986))。
如上所述，L—亮氨酸生成能力已被提高到一定程度，但是，仍需要开发更有效和经济的方法，以便满足未来对L—亮氨酸的日益增长的需求。
另一方面，属于埃希氏菌属的微生物由于其快速生长能力、由遗传分析获得的突出的数据和充足的遗传材料有可能被用作高效的L—亮氨酸产生菌。但是，有关使用属于埃希氏菌属的细菌生产L—亮氨酸的报导还很少。
关于埃希氏菌属的L—亮氨酸产生菌株，已知有抗β—噻吩丙氨酸的菌株，抗β—噻吩丙氨酸和β—羟基亮氨酸的菌株(日本专利公告号62—34397(1987))和抗4—氮亮氨酸或5，5，5—三氟亮氨酸的菌株(日本专利中请公开号8—70879(1996))。
但是，还未发现抗L—亮氨酸的埃希氏菌属细菌，也未发现L—亮氨酸抗性和L—亮氨酸生成能力的关系。
发明概述
本发明基于前述观点完成，目的之一是提高埃希氏菌属细菌的L—亮氨酸生成能力，提供有效和经济的生产L—亮氨酸的方法。
为了实现上述目的发明人进行了大量研究，结果发现α—异丙基苹果酸合酶(以下称为IPMS)的L—亮氨酸反馈抑制脱敏作用有助于提高L—亮氨酸生成能力，至此完成了本发明。
即，本发明提供了编码以下(A)或(B)的蛋白的DNA(以下也称为本发明的DNA)：
(A)具有序列2所示氨基酸序列的蛋白，其中具有选自以下(a)到(e)的置换：
(a)482位另一种氨基酸残基置换苏氨酸残基，
(b)386位另一种氨基酸残基置换谷氨酸残基，
(c)428位另一种氨基酸残基置换脯氨酸残基，
(d)479位另一种氨基酸残基置换甘氨酸残基，以及
(e)462位另一种氨基酸残基置换甘氨酸残基，
(B)具有蛋白(A)氨基酸序列的蛋白，其序列中有一个或几个氨基酸残基的缺失、置换、插入或增加，所述蛋白(B)具有α—异丙基苹果酸合酶活性，L—亮氨酸对该活性的反馈抑制被脱敏至与蛋白(A)相同。
优选本发明的DNA中置换选自以下(a’)到(e’)：
(a’)482位异亮氨酸残基置换苏氨酸残基，
(b’)386位赖氨酸残基置换谷氨酸残基，
(c’)428位亮氨酸残基置换脯氨酸残基，
(d’)479位半胱氨酸残基置换甘氨酸残基，以及
(e’)462位天冬氨酸残基置换甘氨酸残基。
本发明DNA的具体实施例包括具有序列1所示核苷酸序列的DNA，其中具有选自以下(ⅰ)到(ⅴ)的突变：
(ⅰ)1445位胞嘧啶突变为胸腺嘧啶，
(ⅱ)1156位鸟嘌呤突变为腺嘌呤，
(ⅲ)1283位胞嘧啶突变为胸腺嘧啶，
(ⅳ)1435位鸟嘌呤突变为胸腺嘧啶，以及
(ⅴ)1385位鸟嘌呤突变为腺嘌呤。
本发明还提供用本发明的DNA转化具有L—亮氨酸生成能力的微生物(以下也称为“本发明的微生物”)。优选本发明的微生物属于埃希氏菌属。更优选本发明的微生物是大肠杆菌。
本发明还提供生产L—亮氨酸的方法，包括以下步骤：
在培养基中培养本发明的微生物以在培养基中产生和积累L—亮氨酸，并且
由培养基中回收L—亮氨酸。
发明详述
以下详述本发明。
1．本发明的DNA
本发明的DNA在编码野生型IPMS的DNA中具有一种突变，使该DNA编码的IPMS的L—亮氨酸反馈抑制被脱敏。
术语“L—亮氨酸反馈抑制被脱敏”是指反馈抑制的程度降低。反馈抑制降低的程度可以通过测定L—亮氨酸引起的IPMS活性的降低并与野生型或亲本菌株比较来确定。
IPMS的实例包括来自埃希氏菌属的细菌，特别是来自大肠杆菌的IPMS。使L—亮氨酸反馈抑制脱敏的IPMS突变的实例包括在序列2所示氨基酸序列中以下(a)到(e)的置换：
(a)482位另一种氨基酸残基置换苏氨酸残基，
(b)386位另一种氨基酸残基置换谷氨酸残基，
(c)428位另一种氨基酸残基置换脯氨酸残基，
(d)479位另一种氨基酸残基置换甘氨酸残基，以及
(e)462位另一种氨基酸残基置换甘氨酸残基，
所述置换优选是以下(a’)到(e’)：
(a’)482位异亮氨酸残基置换苏氨酸残基，
(b’)386位赖氨酸残基置换谷氨酸残基，
(c’)428位亮氨酸残基置换脯氨酸残基，
(d’)479位半胱氨酸残基置换甘氨酸残基，以及
(e’)462位天冬氨酸残基置换甘氨酸残基。
编码野生型IPMS的DNA的实例包括编码来自埃希氏菌属细菌的IPMS的DNA。具体实例为编码序列2所示氨基酸序列的DNA，以及序列1所示核苷酸序列。在这些序列中，核苷酸序列中具有引起上述氨基酸残基置换的突变的序列都包括在本发明DNA之内。相应于置换氨基酸残基的任何密码子都可以，只要其编码相同的氨基酸残基。
本发明DNA的具体实例包括具有序列1所示核苷酸序列的DNA，其中具有选自以下(ⅰ)到(ⅴ)的突变：
(ⅰ)1445位胞嘧啶突变为胸腺嘧啶，
(ⅱ)1156位鸟嘌呤突变为腺嘌呤，
(ⅲ)1283位胞嘧啶突变为胸腺嘧啶，
(ⅳ)1435位鸟嘌呤突变为胸腺嘧啶，以及
(ⅴ)1385位鸟嘌呤突变为腺嘌呤。
此外，推测现有的IPMS序列在不同细菌种和菌株之间略有不同，但是，编码在与酶活性无关的位点具有氨基酸残基置换、缺失或插入的DNA也包括在本发明的DNA之内。换而言之，编码具有突变IPMS氨基酸序列的蛋白的DNA也包括在本发明的DNA之内，所述序列中具有一个或几个氨基酸残基的缺失、置换、插入或增加，所述蛋白具有IPMS活性，并且L—亮氨酸引起的酶活性反馈抑制被脱敏至与突变IPMS相同。这种DNA包括具有天然突变的DNA，所述天然突变如基于具有IPMS的微生物个体、种和属(突变体或变异体)间差异的突变。
获得编码突变IPMS的DNA的方法如下。
(1)制备野生型IPMS基因
含有野生型IPMS基因或具有上述另一种突变IPMS的DNA的供体微生物的优选实例为属于埃希氏菌属的微生物。具体而言，可以利用以下文献中所述的微生物(Neidhardt，F．C．et al．，大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌，美国微生物学会，Washington D．C．，1208，表1)。例如大肠杆菌菌株K—12，JM109和MC1061为具体实例。当野生型菌株用作含IPMS基因的供体微生物时，可以获得含有野生型IPMS基因的DNA。
制备含IPMS基因的DNA的实例如下描述。首先，培养具有野生型IPMS基因的大肠杆菌如菌株K—12获得培养物。培养上述微生物时，可以按照常规固体培养方法进行培养，但是，考虑到收集细菌的效率，优选采用液体培养法进行培养。所用的培养基中添加有一种或多种氮源，如酵母提取物、蛋白胨、肉提取物、玉米浆和大豆或小麦溢泌物，以及一种或多种无机盐，如磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钠、氯化镁、氯化亚铁、硫酸亚铁或硫酸锰，还可添加糖类物质或维生素等。培养基的起始pH调整至6到8较为合适。培养在30到42℃优选约37℃进行4到24小时，使用通气和搅拌的深层培养、振荡培养或静止培养等。
所获得的培养物离心，例如在3000 rpm离心5分钟，获得大肠杆菌菌株K—12的细胞沉淀。染色体DNA可以利用例如Saito和Miura的方法(Biochem．Biophys．Acta．，72，619(1963))或K．S．Kirby的方法(Biochem．J．，64，405(1956))从细胞沉淀中获得。
为了从获得的DNA中分离IPMS基因，制备染色体DNA文库。首先，染色体DNA用合适的限制酶部分消化，获得各种片段的混合物。如果切割程度可以通过切割反应时间等控制，多种限制酶均可使用。例如Sau3AI在酶浓度为1到10单位／ml、温度不低于30℃优选37℃时可以与染色体DNA反应不同时间(1分钟到2小时)，使之消化。
然后，所获得的DNA片段与在埃希氏菌属细菌细胞中可以自主复制的载体DNA连接以制备重组DNA。具体而言，让限制酶在酶浓度为1到100单位／ml、温度不低于30℃时与载体DNA作用，完全消化、切割之，所述限制酶产生的末端核苷酸序列与用于切割染色体DNA的酶Sau3AI产生的末端序列互补。然后，如上述获得的染色体DNA片段混合物与切割过的载体DNA混合，让DNA连接酶优选T4 DNA连接酶在酶浓度为l—100单位／ml、温度为4到16℃时作用至少1小时，优选4到24小时，获得重组DNA。
所得的重组DNA片段用来转化埃希氏菌属的微生物，例如大肠杆菌K—12等IPMS缺陷突变菌株，优选菌株JE7627(ponB704，dacB12，pfv+，tonA2，dapA，lysA，str，malA38，metB1，ilvH611，leuA371，proA3，lac—3，tsx—76)，以制备染色体DNA文库。转化可以通过例如D．M．Morrison的方法(酶学方法68，326(1979))或其中受体菌细胞用氯化钙处理以增加DNA通透性的方法(Mandel，M．and Higa，A．，J．Mol．Biol．，53，159(1970))实现。菌株JE7627可获自国立遗传研究所(Mishima—shi，Shizuoka—ken，Japen)。
携带IPMS基因的重组DNA的细菌菌株获自所得染色体DNA文库中具有增加的IPMS活性的菌株或由于IPMS基因缺陷引起的营养缺陷型被互补的菌株。例如，IPMS缺陷突变菌株需要L—亮氨酸。因此，当IPMS缺陷突变菌株被用作宿主时，含有IPMS基因的DNA片段可以通过以下方法获得：分离改变成为能够在不含L—亮氨酸的培养基中生长的细菌菌株，由细菌菌株中回收重组DNA。
确证具有含有IPMS基因的重组DNA的候选菌株是否确实携带有IPMS基因被克隆的重组DNA可以通过以下方法进行：由候选菌株制备细胞提取物，由其中制备粗酶溶液，证实IPMS活性是否增加。测定IPMS酶活性可以通过Kohlhaw等的方法(J．Biol．Chem．，244，2218(1969))进行。
含有IPMS基因的DNA被插入载体DNA的重组DNA可以通过例如P．Guerry等的方法(J．Baeteriol．，116，1064(1973))或D．B．Clewell的方法(J．Bacteriol．，110，667(1972))从上述细菌菌株中分离。
制备野生型IPMS基因也可以通过以下方法完成：利用Saito和Miura的方法或其他方法由染色体上具有IPMS基因的菌株制备染色体DNA，然后通过聚合酶链反应(PCR)方法(见White，T．J．et al．，Trends Genet．，5，185(1989))扩增IPMS基因。用于扩增反应的DNA引物与含有IPMS基因的全部区域或部分区域的双链DNA的两个3’末端互补。当只有部分IPMS基因被扩增时，需要使用这些DNA片段作为引物，由染色体DNA文库中筛选含有整个区域的DNA片段。当IPMS基因的全部区域被扩增时，包括含有扩增的IPMS基因的DNA片段的PCR反应溶液进行琼脂糖凝胶电泳，然后提取目标DNA片段。从而回收含有IPMS的DNA片段。
DNA引物可以根据例如大肠杆菌中已知的序列(EMBL入藏号D10483或AE000117)制备。具体而言，优选可以扩增含有编码IPMS基因的1572核苷酸的区域的引物。引物合成可以利用可商购的DNA合成仪(例如Applied Biosystems生产的DNA合成仪380型)通过常规方法进行，如磷酰亚胺(phosphoamidite)法(见TetrahedronLetters，22，1859(1981))。另外，PCR可以使用可商购的PCR仪(例如Takara Shuzo Co．，Ltd．生产的DNA热循环仪PJ2000型)和Taq DNA聚合酶(Takara Shuzo Co．，Ltd．)按照厂商推荐的方法进行。
当IPMS基因与在埃希氏菌属细菌细胞中可自主复制的载体DNA连接并引入埃希氏菌属细菌的细胞中时，对于通过PCR方法扩增IPMS基因来说，将突变引入IPMS基因的操作易于进行。使用的载体DNA、转化方法和确证IPMS基因的方法与上述操作中相同。
分离IPMS基因的报导包括Hertberg，K．M．et al．，Gene，8，135—152(1980)，Davis，M．G．et al．，J．Bacteriol．，129，1078—1090(1977)等。
当具有野生型IPMS的微生物经受诱变制备产生突变IPMS的突变菌株时，如上所述获得IPMS基因的方法可以用来获得突变基因，突变基因获自突变菌株。
(2)将突变引入IPMS基因
进行突变如氨基酸残基置换、插入和缺失的方法的实例包括重组PCR法(Higuchi，R．，61，《PCR技术》(Erlich，H．，A．Eds．，Stochton Press(1989)))，定位诱变法(Kramer，W．and Frits，H．J．，酶学方法，154，350(1987)；Kunkel T．A．et al．，酶学方法，154，367(1987))。目标突变可以通过这些方法在目标位点产生。
此外，根据目标基因的化学合成法，可以将突变或随机突变引入目标位点。
此外，也可以使用以羟胺直接处理染色体或质粒上的IPMS基因的方法(Hashimoto，T．and Sekiguchi，M．J．Bacteriol．，159，1039(1984))或者，也可以使用通过紫外光对具有IPMS基因的埃希氏菌属细菌进行照射的方法，或基于N—甲基—N’—亚硝基胍或亚硝酸等化学剂处理的方法。根据这些方法，可以随机引入突变。
至于选择突变基因的方法，包括含有IPMS基因的DNA片段和载体DNA的重组DNA首先直接用羟胺等突变处理，然后用于转化例如大肠杆菌菌株W3110。转化菌株在含有4—氮—D，L—亮氨酸或3—羟基—D，L—亮氨酸作为L—亮氨酸类似物的M9等基本培养基上培养。携带含有野生型IPMS基因的重组DNA的菌株不能合成L—亮氨酸，生长受到抑制，因为重组DNA表达的IPMS被L—亮氨酸类似物抑制。相反，携带含有L—亮氨酸抑制被脱敏的IPMS基因的重组DNA的菌株具有上述重组DNA中的IPMS基因编码的突变酶，该酶不被L—亮氨酸类似物抑制。因此，该菌株应能在添加了L—亮氨酸类似物的基本培养基中生长。该现象也可以用来选择抗L—亮氨酸类似物生长的菌株，即携带含有抑制被脱敏的突变IPMS基因的重组DNA的菌株。
这样获得的突变基因可以作为重组DNA引入合适的宿主微生物并表达。这样可以获得携带反馈抑制被脱敏的IPMS的微生物。宿主优选埃希氏菌属微生物，具体实例如大肠杆菌。
或者，突变IPMS基因片段可以从重组DNA取出并插入另一个载体。可以用于本发明的载体DNA优选是质粒载体DNA，例如pUC19，pUC18，pBR322，pHSG299，pHSG298，pHSG399，pHSG398，RSF1010，pMW119，pMW118，pMW219和pMW218。此外，噬菌体DNA载体也可以使用。
并且，为了有效表达突变IPMS基因，在微生物中有功能的另一个启动子如lac，trp和PL可以连接在编码突变IPMS的DNA序列的上游，或者IPMS基因中所含的启动子可以原样或扩增后使用。
此外，如上所述，突变基因可以插入自主复制的载体DNA，将其插入宿主，作为染色体外DNA如质粒让宿主携带。或者，突变基因可以整合进宿主微生物的染色体，整合可以利用转导、转座子(Breg，D．E．And Berg，C．M．，Bio／Technol．，1，417(1983))、Mu噬菌体(日本专利公开号2—109985)或同源重组(微生物遗传学实验，冷泉港实验室(1972))实现。
2．本发明的微生物
本发明的微生物是用本发明的DNA转化的微生物，其具有产L—亮氨酸能力。
用本发明的DNA转化可以根据常规的已知转化方法进行。例如含有本发明DNA的片段与在宿主(待转化微生物)中有功能的载体连接，制备重组DNA，然后将重组DNA导入宿主中。载体可以根据宿主适当地选择。使用常规的已知方法将重组DNA导入。例如，可以使用用氯化钙处理受体细胞以增加DNA通透性的方法，如大肠杆菌K—12中报导的方法(Mandel，M and Higa，A．，J．Mol．Biol．，53，159(1970))，也可以使用从增殖阶段细胞制备感受态细胞以导入DNA的方法，如枯草杆菌中报导的方法(Duncan，C．H．，Wilson，G．A．andYound，F．E．，Gene，1，153，(1977))。或者，也可以使用DNA受体细胞转变成易于吸收重组DNA的原生质体或原生质球以将重组DNA导入DNA受体的方法，如枯草杆菌、放线菌和酵母中已知的方法(Chang，S and Choen，S．N．，Molec．Gen．Genet．，168，111(1979)；Bibb，M．J．，Ward，J．M．and Hopwood，O．A．，Nature，174，398(1978)；Hinnen，A．，Hicks，J．B．and Fink，G．R．，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，75，1929(1978))。电脉冲法(日本专利申请公开号2—207791)也可以使用。导入方法可以根据宿主合适地选择。具体而言，载体和方法的实例见以上1．(2)所述。
术语“具有产L—亮氨酸能力”在本文中指在培养基中积累L—亮氨酸，优选积累量达到易于从培养基中回收L—亮氨酸。
本发明的细菌优选属于埃希氏菌属。实例可以是大肠杆菌。具有产生L—亮氨酸能力的埃希氏菌属细菌的实例，可以是对β—2—噻吩丙氨酸、3—羟基亮氨酸、4—氮亮氨酸和5，5，5—三氟亮氨酸等亮氨酸类似物具有抗性的细菌，这些细菌在日本专利公开号62—34397(1987)和日本专利申请公告号8—70879(1996)中公开，也可以是通过WO 96／06926中所述的遗传工程技术繁育的细菌。
在属于埃希氏菌属的细菌中，L—亮氨酸通过固有的亮氨酸生物合成途径合成，该合成途径从L—缬氨酸生物合成系统的最终中间产物(2—酮异戊酸)分支。在属于埃希氏菌属的细菌中，缬氨酸生物合成和固有的L—亮氨酸生物合成的最后一步分别通过ilvGMEDA操纵子编码的一组酶和leuABCD操纵子编码的一组酶完成。
leuABCD操纵子包括leuA，leuB，leuC和leuD基因。其中，leuA编码IPMS，leuB编码β—异丙基苹果酸脱氢酶，leuC和leuD编码α—异丙基苹果酸异构酶。在这些酶中，IPMS催化α—酮异戊酸到α—异丙基苹果酸的合成反应，α—异丙基苹果酸异构酶催化β—异丙基苹果酸与α—异丙基苹果酸的异构化反应，β—异丙基苹果酸脱氢酶催化β—异丙基苹果酸到α—酮异己酸的脱氢反应，α—酮异己酸是L—亮氨酸生物合成的最终中间产物。
在L—亮氨酸生物合成途径的上述反应中，限速步骤是由α—异丙基苹果酸合酶催化的α—酮异戊酸到α—异丙基苹果酸的合成反应，α—异丙基苹果酸合酶受L—亮氨酸的反馈抑制。因此，用编码对反馈抑制脱敏的IPMS的DNA转化可以赋予微生物产L—亮氨酸能力，或提高微生物的产L—亮氨酸能力。
本发明的埃希氏菌属细菌的一种或多种L—亮氨酸生物合成途径酶的活性可以通过常规诱变处理或遗传工程技术提高。这种酶活性的提高可以通过导入重组DNA至埃希氏菌属细菌实现，重组DNA通过将含有全部或部分ilvGMEDA操纵子和／或leuABCD操纵子的DNA片段插入质粒、噬菌体或转座子获得。
LeuABCD操纵子核苷酸序列分析参见Nucleic Acid Res．，20，3305—3308(1992)。LeuABCD操纵子的全部序列已经在数据库(DDBJ入藏号D10483，互联网网址：http：／／222．ddbj．nig．ac．jp)中登记。含有LeuABCD操纵子的DNA片段可以使用PCR(聚合酶链反应，参见T．J．et al．，Trends Genet．，5，185(1989))扩增DNA片段获得，其中根据上述序列制备的寡核苷酸用作引物，埃希氏菌属细菌的染色体DNA用作PCR模板。或者LeuABCD操纵子也可以通过杂交法筛选埃希氏菌属细菌的染色体DNA文库获得，其中使用根据上述序列制备的寡核苷酸探针。
ilvGMEDA操纵子的整个核苷酸序列和该操纵子上游区域的核苷酸序列分别参见Nucleic Acid Res．，15，2137—2155(1987)和Gene，97，21—27(1991)。具有ilvGMEDA操纵子的DNA片段可以使用根据上述序列制备的寡核苷酸探针或引物通过PCR或杂交法获得。顺便提一句，在使用大肠杆菌K—12或其衍生物获得ilvGMEDA操纵子时，优选使用具有ilvG基因回复突变的菌株，其中恢复了读框从而恢复了乙酰羟酸合酶活性。获得ilvGMEDA操纵子的方法和在埃希氏菌属细菌细胞中扩增操纵子的方法分别在WO 96／06926和FR 2627508中详述。
3．生产L—亮氨酸的方法
L—亮氨酸可以通过以下方法有效地生产：在培养基中培养如上所述获得的细菌，在培养基中产生和积累L—亮氨酸，并由培养基中回收L—亮氨酸。
在本发明的方法中，培养埃希氏菌属细菌、由液体培养基中收集和纯化L—亮氨酸可以按照与通过细菌生产L—亮氨酸的常规发酵方法类似的方式进行。培养所用的培养基可以是合成培养基或天然培养基，只要培养基中包括碳源、氮源和矿物质即可，必要时包括适当含量的细菌生长必需的养分。碳源可以包括一种或多种碳水化合物，如葡萄糖和蔗糖，以及有机酸。根据所用细菌的同化方式，醇包括乙醇和甘油也可以使用。氮源可以使用氨和硫酸铵等各种铵盐，胺等其他含氮化合物，蛋白胨、大豆水解物或消化的发酵微生物等天然氮源。矿物质可以使用磷酸钾、硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁、硫酸锰或碳酸钙。
培养优选在好气条件下进行，如振荡培养、通气和搅拌培养，培养温度为20到40℃，优选30到38℃。培养物的pH通常为5到9，优选6．5到7．2。培养物的pH可以用氨、碳酸钙、各种酸、各种碱和缓冲液调节。通常，培养1到3天导致L—亮氨酸在液体培养基中积累。
培养后，细胞等不溶性物质通过离心和膜过滤从液体培养基中分离，然后L—亮氨酸可以通过离子交换、浓缩和沉淀收集和纯化。
本发明的微生物可以用作L—亮氨酸产生菌株或繁育L—亮氨酸产生菌株的起始来源。与现有使用微生物生产L—亮氨酸的已知方法相比，本发明可以更有效地生产L—亮氨酸。
实施例
以下参照实施例更具体地阐明本发明。
实施例1：获得编码突变IPMS的DNA
(1)获得L—亮氨酸产生菌株
产L—亮氨酸的大肠杆菌菌株通过下述选择方法获自标准实验室野生型菌株大肠杆菌K—12。大肠杆菌K—12菌株通过含有0．2 mg／mlN—甲基—N—硝基—N—亚硝基胍的诱变剂溶液在37℃处理30分钟。然后用氯化钠溶液(0．8％)洗涤两次，在含有1 mg／ml L—亮氨酸类似物4—氮亮氨酸的M9琼脂培养基上铺平板。挑取37℃温育5天后出现的菌落，检测其产L—亮氨酸能力。菌株No．9，No．68，No．58，No．55和No．15产亮氨酸。
(2)由L—亮氨酸产生菌株获得leuA基因
获得的产L—亮氨酸突变体No．55和野生型菌株大肠杆菌K—12的leuA基因使用缺陷型噬菌体Mu d5005通过体内克隆法克隆(Groisman，E．A．et al．，J．Bacteriol．，168，357(1986))。这样克隆的leuA基因的重叠片段通过PCR法扩增，分别使用示于表1的DNA引物LeuA1和leuA2、LeuA3和leuA4、LeuA5和leuA6、LeuA7和leuA8、LeuA9和leuA10。
表1：PCR引物
    N     结构(5’→3’)     序列号
 LeuA1  ccaataccgtcccccggc     3
 LeuA2  ggtgaaatacagcctgacc     4
 LeuA3  gtgatgcggttaattgcctg     5
 LeuA4  tgacctctcgttcggggcgt     6
 LeuA5  gattcagctggatttggttc     7
 LeuA6  cgacgatttgggcctggcg     8
 LeuA7  ggcatgtaccgccgccagtga     9
 LeuA8  gaagccttccgtattcatacc     10
 LeuA9  cagcttggtggcgatgtgc     11
 LeuA10  gcccgaagcgaggcgctct     12
同样的DNA引物用于扩增菌株No．9，No．68，No．58和No．15染色体leuA基因而不预先克隆。片段的核苷酸序列通过双脱氧链终止法确定。
来自菌株No．9，No．68，No．58，No．55和No．15的leuA基因含有突变，在表2中示出。
各菌株细胞在含有葡萄糖(6％)、硫酸铵(1．5％)、磷酸二氢钾(0．2％)、硫酸镁(0．1％)、白垩(2．5％)和硫胺素(0．1 mg／ml)的培养基中于32℃培养10小时。通过超声处理和硫酸铵沉淀获得的无细胞提取物用作酶制备物。IPMS比活性通过Kohlhaw等的方法(J．Biol．Chem．，244，2218(1969))测定。I50是引起酶活性50％抑制的亮氨酸浓度。在如上所述培养基中培养48小时后测定L—亮氨酸的产生。
结果总结于表2。
表2：产L—亮氨酸突变体的特性
    菌株   氨基酸置换(核苷酸置换)             IPMS   亮氨酸产生(g/l)
  比活(nmol/min/mg蛋白)   I50(mM)
    K-12(野生型)   无(无)     9   0.2     0.0
    9   Thr482→Ile(C1445→T)     25   1.4     0.8
    68   Glu386→Lys(G1156→A)     21   1.4     2.3
    58   Pro429→Leu(C1293→T)     29   2.5     1.0
    55   Gly479→Cys(G1435→T)     10   8.2     5.2
    15   Gly462→AspG1385→A)     9 ＞10.0     1.0
实施例2：通过转化体生产L-亮氨酸
大肠杆菌C600(leu)(Appleyard R．K．，Genetics，39，440—452(1954))用在产L—亮氨酸菌株No．9，No．68，No．58，No．55和No．15以及大肠杆菌K—12中生长的P1噬菌体转导。获得Leu’转导子并测试其产L—亮氨酸能力。数据示于表3。
表3：通过转导子生产L—亮氨酸
    供体菌株     亮氨酸产生*(g／l)
    大肠杆菌K—12     0
    9     0．55
    68     0．6
    58     0．3
    15     1．0
    55     1．3
*L—亮氨酸产生在32℃培养48小时后测定。亮氨酸产生的数据代表每一种菌株10个转导子的平均值。
序列表<110> Ajinomoto Co．， Inc．<120>L—亮氨酸的生产方法及有关DNA和微生物<130><150> RU 99114325<151> 1999—07—09<160> 12<210> 1<211> 1572<212> DNA<213>大肠杆菌<220><221> CDS<222> (1)．．(1569)<400> 1atg agc cag caa gtc att att ttc gat acc aca ttg cgc gac ggt gaa  48Met Ser Gln Gln Val Ile Ile Phe Asp Thr Thr Leu Arg Asp Gly Glu1              5                10                15cag gcg tta cag gca agc ttg agt gtg aaa gaa aaa ctg caa att gcg  96Gln Ala Leu Gln Ala Ser Leu Ser Val Lys Glu Lys Leu Gln Ile Ala20                  25                  30ctg gcc ctt gag cgt atg ggt gtt gac gtg atg gaa gtc ggt ttc ccc  144Leu Ala Leu Glu Arg Met Gly Val Asp Val Met Glu Val Gly Phe Pro35                  40                  45gtc tct tcg ccg ggc gat ttt gaa tcg gtg caa acc atc gcc cgc cag  192Val Ser Ser Pro Gly Asp Phe Glu Ser Val Gln Thr Ile Ala Arg Gln50                   55                 60gtt aaa aac agc cgc gta tgt gcg tta gct cgc tgc gtg gaa aaa gat  240Val Lys Asn Ser Arg Val Cys Ala Leu Ala Arg Cys Val Glu Lys Asp65                  70                 75                   80atc gac gtg gcg gcc gaa tcc ctg aaa gtc gcc gaa gcc ttc cgt att  288Ile Asp Val Ala Ala Glu Ser Leu Lys Val Ala Glu Ala Phe Arg Ile85                       90                 95cat acc ttt att gcc act tcg cca atg cac atc gcc acc aag ctg cgc  336His Thr Phe Ile Ala Thr Ser Pro Met His Ile Ala Thr Lys Leu Arg100                 105                 110agc acg ctg gac gag gtg atc gaa cgc gct atc tat atg gtg aaa cgc  384Ser Thr Leu Asp Glu Val Ile Glu Arg Ala Ile Tyr Met Val Lys Arg115                 120                 125gcc cgt aat tac acc gat gat gtt gaa ttt tct tgc gaa gat gcc ggg  432Ala Arg Asn Tyr Thr Asp Asp Val Glu Phe Ser Cys Glu Asp Ala Gly130                 135                   140cgt aca ccc att gcc gat ctg gcg cga gtg gtc gaa gcg gcg att aat  480Arg Thr Pro Ile Ala Asp Leu Ala Arg Val Val Glu Ala Ala Ile Asn145                 l50                 155                 160gcc ggt gcc acc acc atc aac att ccg gac acc gtg ggc tac acc atg  528Ala Gly Ala Thr Thr Ile Asn Ile Pro Asp Thr Val Gly Tyr Thr Met165                 170                175ccg ttt gag ttc gcc gga atc atc agc ggc ctg tat gaa cgc gtg cct  576Pro Phe Glu Phe Ala Gly Ile Ile Ser Gly Leu Tyr Glu Arg Val Pro180                 185                 190aac atc gac aaa gcc att atc tcc gta cat acc cac gac gat ttg ggc  624Asn Ile Asp Lys Ala Ile Ile Ser Val His Thr His Asp Asp Leu Gly195                 200                 205ctg gcg gtc gga aac tca ctg gcg gcg gta cat gcc ggt gca cgc cag  672Leu Ala Val Gly Asn Ser Leu Ala Ala Val His Ala Gly Ala Arg Gln210                  215                220gtg gaa ggc gca atg aac ggg atc ggc gag cgt gcc gga aac tgt tcc  720Val Glu Gly Ala Met Asn Gly Ile Gly Glu Arg Ala Gly Asn Cys Ser225              230              235              240ctg gaa gaa gtc atc atg gcg atc aaa gtt cgt aag gat att ctc aac  768Leu Glu Glu Val Ile Met Ala Ile Lys Val Arg Lys Asp Ile Leu Asn245                 250                 255gtc cac acc gcc att aat cac cag gag ata tgg cgc acc agc cag tta  816Val His Thr Ala Ile Asn His Gln Glu Ile Trp Arg Thr Ser Gln Leu260                 265                 270gtt agc cag att tgt aat atg ccg atc ccg gca aac aaa gcc att gtt  864Val Ser Gln Ile Cys Asn Met Pro Ile Pro Ala Asn Lys Ala Ile Val275                 280                 285ggc agc ggc gca ttc gca cac tcc tcc ggt ata cac cag gat ggc gtg  912Gly Ser Gly Ala Phe Ala His Ser Ser Gly Ile His Gln Asp Gly Val290                 295                 300ctg aaa aac cgc gaa aac tac gaa atc atg aca cca gaa tct att ggt  960Leu Lys Asn Arg Glu Asn Tyr Glu Ile Met Thr Pro Glu Ser Ile Gly305                 310                 315                 320ctg aac caa atc cag ctg aat ctg acc tct cgt tcg ggg cgt gcg gcg  1008Leu Asn Gln Ile Gln Leu Asn Leu Thr Ser Arg Ser Gly Arg Ala Ala325                 330                 335gtg aaa cat cgc atg gat gag atg ggg tat aaa gaa agt gaa tat aat  1056Val Lys His Arg Met Asp Glu Met Gly Tyr Lys Glu Ser Glu Tyr Asn340                 345                 350tta gac aat ttg tac gat gct ttc ctg aag ctg gcg gac aaa aaa ggt  1104Leu Asp Asn Leu Tyr Asp Ala Phe Leu Lys Leu Ala Asp Lys Lys Gly355                 360                 365cag gtg ttt gat tac gat ctg gag gcg ctg gcc ttc atc ggt aag cag  1152Gln Val Phe Asp Tyr Asp Leu Glu Ala Leu Ala Phe Ile Gly Lys Gln370                 375                 380caa gaa gag ccg gag cat ttc cgt ctg gat tac ttc agc gtg cag tct  1200Gln Glu Glu Pro Glu His Phe Arg Leu Asp Tyr Phe Ser Val Gln Ser385                 390                  395                400ggc tct aac gat atc gcc acc gcc gcc gtc aaa ctg gcc tgt ggc gaa  1248Gly Ser Asn Asp Ile Ala Thr Ala Ala Val Lys Leu Ala Cys Gly Glu405                 410                  415gaa gtc aaa gca gaa gcc gcc aac ggt aac ggt ccg gtc gat gcc gtc  1296Glu Val Lys Ala Glu Ala Ala Asn Gly Asn Gly Pro Val Asp Ala Val420                 425                 430tat cag gca att aac cgc atc act gaa tat aac gtc gaa ctg gtg aaa  1344Tyr Gln Ala Ile Asn Arg Ile Thr Glu Tyr Asn Val Glu Leu Val Lys435                 440                  445tac agc ctg acc gcc aaa ggc cac ggt aaa gat gcg ctg ggt cag gtg  1392Tyr Ser Leu Thr Ala Lys Gly His Gly Lys Asp Ala Leu Gly Gln Val450                 455                 460gat atc gtc gct aac tac aac ggt cgc cgc ttc cac ggc gtc ggc ctg  1440Asp Ile Val Ala Asn Tyr Asn Gly Arg Arg Phe His Gly Val Gly Leu465                 470                 475                  480gct acc gat att gtc gag tca tct gcc aaa gcc atg gtg cac gtt ctg  1488Ala Thr Asp Ile Val Glu Ser Ser Ala Lys Ala Met Val His Val Leu485                 490                  495aac aat atc tgg cgt gcc gca gaa gtc gaa aaa gag ttg caa cgc aaa  1536Asn Asn Ile Trp Arg Ala Ala Glu Val Glu Lys Glu Leu Gln Arg Lys            500                 505                510gct caa cac aac gaa aac aac aag gaa acc gtg tga     1572Ala Gln His Asn Glu Asn Asn Lys Glu Thr Val515           520<210> 2<211>523<212> PRT<213>大肠杆菌<400>2Met Ser Gln Gln Val Ile Ile Phe Asp Thr Thr Leu Arg Asp Gly Glu1              5                   10                  15Gln Ala Leu Gln Ala Ser Leu Ser Val Lys Glu Lys Leu Gln Ile Ala20                 25                   30Leu Ala Leu Glu Arg Met Gly Val Asp Val Met Glu Val Gly Phe Pro35                  40                   45Val Ser Ser Pro Gly Asp Phe Glu Ser Val Gln Thr Ile Ala Arg Gln50                  55                  60Val Lys Asn Ser Arg Val Cys Ala Leu Ala Arg Cys Val Glu Lys Asp65                  70                  75               80Ile Asp Val Ala Ala Glu Ser Leu Lys Val Ala Glu Ala Phe Arg Ile85                 90               95His Thr Phe Ile Ala Thr Ser Pro Met His Ile Ala Thr Lys Leu Arg100                 105             110Ser Thr Leu Asp Glu Val Ile Glu Arg Ala Ile Tyr Met Val Lys Arg115                 120              125Ala Arg Asn Tyr Thr Asp Asp Val Glu Phe Ser Cys Glu Asp Ala Gly130                 135              140Arg Thr Pro Ile Ala Asp Leu Ala Arg Val Val Glu Ala Ala Ile Asn145                 150             155                     160Ala Gly Ala Thr Thr Ile Asn Ile Pro Asp Thr Val Gly Tyr Thr Met165             170                     175Pro Phe Glu Phe Ala Gly Ile Ile Ser Gly Leu Tyr Glu Arg Val Pro180             185                      190Asn Ile Asp Lys Ala Ile Ile Ser Val His Thr His Asp Asp Leu Gly195             200                     205Leu Ala Val Gly Asn Ser Leu Ala Ala Val His Ala Gly Ala Arg Gln210                  215                220Val Glu Gly Ala Met Asn Gly Ile Gly Glu Arg Ala Gly Asn Cys Ser225                  230                235                240Leu Glu Glu Val Ile Met Ala Ile Lys Val Arg Lys Asp Ile Leu Asn245                 250                 255Val His Thr Ala Ile Asn His Gln Glu Ile Trp Arg Thr Ser Gln Leu260                 265                 270Val Ser Gln Ile Cys Asn Met Pro lle Pro Ala Asn Lys Ala Ile Val275                 280                 285Gly Ser Gly Ala Phe Ala His Ser Ser Gly Ile His Gln Asp Gly Val290                 295                  300Leu Lys Asn Arg Glu Asn Tyr Glu Ile Met Thr Pro Glu Ser Ile Gly305                 310                  315                320Leu Asn Gln Ile Gln Leu Asn Leu Thr Ser Arg Ser Gly Arg Ala Ala325                 330                  335Val Lys His Arg Met Asp Glu Met Gly Tyr Lys Glu Ser Glu Tyr Asn340                 345                 350Leu Asp Asn Leu Tyr Asp Ala Phe Leu Lys Leu Ala Asp Lys Lys Gly355                 360                 365Gln Val Phe Asp Tyr Asp Leu Glu Ala Leu Ala Phe Ile Gly Lys Gln370                 375                 380Gln Glu Glu Pro Glu His Phe Arg Leu Asp Tyr Phe Ser Val Gln Ser385                 390                 395                 400Gly Ser Asn Asp Ile Ala Thr Ale Ale Val Lys Leu Ala Cys Gly Glu405                  410                415Glu Val Lys Ala Glu Ala Ala Asn Gly Asn Gly Pro Val Asp Ala Val420                 425                 430Tyr Gln Ala Ile Asn Arg Ile Thr Glu Tyr Asn Val Glu Leu Val Lys435                 440                 445Tyr Ser Leu Thr Ala Lys Gly His Gly Lys Asp Ala Leu Gly Gln Val450                 455                 460Asp Ile Val Ala Asn Tyr Asn Gly Arg Arg Phe His Gly Val Gly Leu465                 470                 475                 480Ala Thr Asp Ile Val Glu Ser Ser Ala Lys Ala Met Val His Val Leu485                 490                  495Asn Asn Ile Trp Arg Ala Ala Glu Val Glu Lys Glu Leu Gln Arg Lys500                 505                  510Ala Gln His Asn Glu Asn Asn Lys Glu Thr Val515                 520<210> 3<211> 18<212> DNA<213>人工序列<220><223>合成DNA<400> 3ccaataccgt cccccggc                                        18<210> 4<211> 19<212> DNA<213>人工序列<220><223>合成DNA<400> 4ggtgaaatac agcctgacc                                        19<210> 5<211> 20<212> DNA<213>人工序列<220><223>合成DNA<400> 5gtgatgcggt taattgcctg                                     20<210> 6<211> 20<212> DNA<213>人工序列<220><223>合成DNA<400> 6tgacctctcg ttcggggcgt                                         20<210> 7<211> 20<212> DNA<213>人工序列<220><223>合成DNA<400> 7gattcagctg gatttggttc                                       20<210> 8<211> 19<212> DNA<213>人工序列<220><223>合成DNA<400> 8cgacgatttg ggcctggcg                                        19<210> 9<211> 21<212> DNA<213>人工序列<220><223>合成DNA<400> 9ggcatgtacc gccgccagtg a                                     21<210> 10<211> 21<212> DNA<213>人工序列<220><223>合成DNA<400>10gaagccttcc gtattcatac c                                     21<210> 11<211> 19<212> DNA<213>人工序列<220><223>合成DNA<400> 11cagcttggtg gcgatgtgc                                      19<210> 12<211> 19<212> DNA<213>人工序列<220><223>合成DNA<400> 12gcccgaagcg aggcgctct                                        19

Claims (7)

1．编码以下(A)或(B)的蛋白的DNA：
(A)具有序列2所示氨基酸序列的蛋白，其中具有选自以下(a)到(e)的置换：
(a)482位另一种氨基酸残基置换苏氨酸残基，
(b)386位另一种氨基酸残基置换谷氨酸残基，
(c)428位另一种氨基酸残基置换脯氨酸残基，
(d)479位另一种氨基酸残基置换甘氨酸残基，以及
(e)462位另一种氨基酸残基置换甘氨酸残基，
(B)具有蛋白(A)氨基酸序列的蛋白，其序列中有一个或几个氨基酸残基的缺失、置换、插入或增加，所述蛋白(B)具有α—异丙基苹果酸合酶活性，L—亮氨酸对该活性的反馈抑制被脱敏至与蛋白(A)相同。
2．权利要求1的DNA，其中所述置换选自以下(a’)到(e’)：
(a’)482位异亮氨酸残基置换苏氨酸残基，
(b’)386位赖氨酸残基置换谷氨酸残基，
(c’)428位亮氨酸残基置换脯氨酸残基，
(d’)479位半胱氨酸残基置换甘氨酸残基，以及
(e’)462位天冬氨酸残基置换甘氨酸残基。
3．权利要求2的DNA，其具有序列1所示核苷酸序列，其中具有选自以下(ⅰ)到(ⅴ)的突变：
(ⅰ)1445位胞嘧啶突变为胸腺嘧啶，
(ⅱ)1156位鸟嘌呤突变为腺嘌呤，
(ⅲ)1283位胞嘧啶突变为腺嘌呤，
(ⅳ)1435位鸟嘌呤突变为胸腺嘧啶，以及
(ⅴ)1385位鸟嘌呤突变为腺嘌呤。
4．一种微生物，其已用权利要求1到3任一项的DNA转化并具有产生L—亮氨酸的能力。
5．权利要求4的微生物，其属于埃希氏菌属。
6．权利要求5的微生物，其为大肠杆菌。
7．生产L—亮氨酸的方法，包括以下步骤：
在培养基中培养权利要求4到6任一项的微生物以在培养基中产生和积累L—亮氨酸，并且
由培养基中回收L—亮氨酸。
CNB001204629A 1999-07-09 2000-07-10 L－亮氨酸的生产方法及有关dna和微生物 Expired - Lifetime CN1211399C (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU99114325/13A RU2201454C2 (ru) 1999-07-09 1999-07-09 Мутантная альфа-изопропилмалат синтаза (ipms), днк, кодирующая мутантную ipms, способ получения штамма escherichia coli, способ получения l-лейцина
RU99114325 1999-07-09

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN1280135A true CN1280135A (zh) 2001-01-17
CN1211399C CN1211399C (zh) 2005-07-20

Family

ID=20222131

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNB001204629A Expired - Lifetime CN1211399C (zh) 1999-07-09 2000-07-10 L－亮氨酸的生产方法及有关dna和微生物

Country Status (6)

Country Link
US (1) US6403342B1 (zh)
EP (2) EP1568776B1 (zh)
JP (1) JP4501014B2 (zh)
CN (1) CN1211399C (zh)
DE (2) DE60025976T2 (zh)
RU (1) RU2201454C2 (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104662169A (zh) * 2012-08-22 2015-05-27 于利奇研究中心有限公司 制备含有编码在其反馈抑制中减弱或者消除的酶的基因的载体的方法及其用于制备氨基酸和核苷酸的用途
CN110540976A (zh) * 2019-08-29 2019-12-06 天津科技大学 一种异丙基苹果酸合成酶及其应用
CN114085800A (zh) * 2016-12-28 2022-02-25 Cj第一制糖株式会社 新型异丙基苹果酸合酶变异体及使用其生产l-亮氨酸的方法
US11866737B2 (en) 2019-08-29 2024-01-09 Tianjin University Of Science And Technology 2-isopropylmalate synthetase and engineering bacteria and application thereof

Families Citing this family (55)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2230114C2 (ru) * 2001-11-30 2004-06-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" Мутантная глутаминсинтетаза, фрагмент днк, штамм escherichia coli - продуцент l-глутамина и способ получения l-аминокислот
RU2243260C2 (ru) 2002-06-25 2004-12-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" Способ получения l-лейцина (варианты), штамм escherichia coli 505/pacyc-tyr b - продуцент l-лейцина
JP2009118740A (ja) 2006-03-03 2009-06-04 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
EP2004803A2 (en) 2006-03-23 2008-12-24 Ajinomoto Co., Inc. A method for producing an l-amino acid using bacterium of theenterobacteriaceae family with attenuated expression of a gene coding for small rna
JP2009165355A (ja) 2006-04-28 2009-07-30 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸を生産する微生物及びｌ−アミノ酸の製造法
EP2021458A1 (en) 2006-05-23 2009-02-11 Ajinomoto Co., Inc. A method for producing an l-amino acid using a bacterium of the enterobacteriaceae family
JP2010017082A (ja) 2006-10-10 2010-01-28 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
RU2006143864A (ru) 2006-12-12 2008-06-20 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) (RU) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА ENTEROBACTERIACEAE, В КОТОРОЙ ОСЛАБЛЕНА ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ cynT, cynS, cynX, ИЛИ cynR, ИЛИ ИХ КОМБИНАЦИИ
JP2010041920A (ja) 2006-12-19 2010-02-25 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
EP2116595B1 (en) 2007-01-22 2017-04-05 Ajinomoto Co., Inc. An l-amino acid-producing microorganism and a method for producing an l-amino acid
JP2010088301A (ja) 2007-02-01 2010-04-22 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
JP2010110216A (ja) 2007-02-20 2010-05-20 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸または核酸の製造方法
JP2010110217A (ja) 2007-02-22 2010-05-20 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸生産菌及びｌ−アミノ酸の製造法
EP2192170B1 (en) 2007-09-04 2017-02-15 Ajinomoto Co., Inc. Amino acid-producing microorganism and method of producing amino acid
RU2396336C2 (ru) 2007-09-27 2010-08-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ, ПРИНАДЛЕЖАЩЕЙ К РОДУ Escherichia
JP2011067095A (ja) 2008-01-10 2011-04-07 Ajinomoto Co Inc 発酵法による目的物質の製造法
CN102348806A (zh) 2008-01-23 2012-02-08 味之素株式会社 L-氨基酸的生产方法
RU2008105793A (ru) 2008-02-19 2009-08-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) (RU) Способ конструирования оперонов, содержащих трансляционно сопряженные гены, бактерия, содержащая такой оперон, способ продукции полезного метаболита и способ мониторинга экспрессии гена
WO2010027045A1 (ja) 2008-09-08 2010-03-11 味の素株式会社 Ｌ－アミノ酸を生産する微生物及びｌ－アミノ酸の製造法
EP2346991B1 (en) * 2008-10-18 2016-12-28 The Regents of The University of California Production of c5-c8 alcohols using evolved enzymes and metabolically engineered microorganisms
EP2382320B1 (en) 2009-01-23 2018-04-18 Ajinomoto Co., Inc. Process for producing l-amino acids employing bacteria of the enterobacteriacea family in a culture medium with controlled glycerol concentration
EP2406385A2 (en) * 2009-03-11 2012-01-18 DSM IP Assets B.V. Preparation of adipic acid
EP2460883A4 (en) 2009-07-29 2013-01-16 Ajinomoto Kk PROCESS FOR THE PREPARATION OF L-AMINO ACID
RU2460793C2 (ru) 2010-01-15 2012-09-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) Способ получения l-аминокислот с использованием бактерий семейства enterobacteriaceae
JP2013074795A (ja) 2010-02-08 2013-04-25 Ajinomoto Co Inc 変異型ｒｐｓＡ遺伝子及びＬ−アミノ酸の製造法
RU2471868C2 (ru) 2010-02-18 2013-01-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) Мутантная аденилатциклаза, днк, кодирующая ее, бактерия семейства enterobacteriaceae, содержащая указанную днк, и способ получения l-аминокислот
RU2482188C2 (ru) 2010-07-21 2013-05-20 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АРГИНИНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИЙ РОДА Escherichia, В КОТОРОЙ ИНАКТИВИРОВАН ОПЕРОН astCADBE
RU2501858C2 (ru) 2010-07-21 2013-12-20 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА Enterobacteriaceae
JP2014036576A (ja) 2010-12-10 2014-02-27 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
RU2011134436A (ru) 2011-08-18 2013-10-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") Способ получения l-аминокислоты с использованием бактерии семейства enterobacteriaceae, обладающей повышенной экспрессией генов каскада образования флагелл и клеточной подвижности
WO2013053824A1 (en) 2011-10-11 2013-04-18 Metabolic Explorer New biosynthesis pathway for prenol in a recombinant microorganism
RU2012112651A (ru) 2012-04-02 2013-10-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") САМОИНДУЦИРУЕМАЯ ЭКСПРЕССИОННАЯ СИСТЕМА И ЕЕ ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛЕЗНЫХ МЕТАБОЛИТОВ С ПОМОЩЬЮ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА Enterobacteriaceae
BR112014021439B1 (pt) * 2012-04-27 2021-12-21 Evonik Technochemie Gmbh Polipeptídeo de isopropilmalato sintase e a sequência de nucleotídeos que o codifica, vetor, microrganismo do gênero corynebacterium e uso do mesmo, bem como processo fermentativo para a produção de kic ou l-leucina
RU2013118637A (ru) 2013-04-23 2014-10-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА ENTEROBACTERIACEAE, В КОТОРОЙ РАЗРЕГУЛИРОВАН ГЕН yjjK
EP2868745B1 (en) 2013-05-13 2017-06-21 Ajinomoto Co., Inc. Method for manufacturing an L-amino acid
JP2016165225A (ja) 2013-07-09 2016-09-15 味の素株式会社 有用物質の製造方法
RU2013140115A (ru) 2013-08-30 2015-03-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА Enterobacteriaceae, В КОТОРОЙ НАРУШЕНА ЭКСПРЕССИЯ КЛАСТЕРА ГЕНОВ znuACB
JP2016192903A (ja) 2013-09-17 2016-11-17 味の素株式会社 海藻由来バイオマスからのｌ−アミノ酸の製造方法
RU2013144250A (ru) 2013-10-02 2015-04-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА Enterobacteriaceae, В КОТОРОЙ ОСЛАБЛЕНА ЭКСПРЕССИЯ ГЕНА, КОДИРУЮЩЕГО ФОСФАТНЫЙ ТРАНСПОРТЕР
JP5958653B2 (ja) 2013-10-02 2016-08-02 味の素株式会社 アンモニア制御装置およびアンモニア制御方法
WO2015060314A1 (ja) 2013-10-21 2015-04-30 味の素株式会社 Ｌ－アミノ酸の製造法
JP6519476B2 (ja) 2013-10-23 2019-05-29 味の素株式会社 目的物質の製造法
RU2014105547A (ru) 2014-02-14 2015-08-20 Адзиномото Ко., Инк. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА ENTEROBACTERIACEAE, ИМЕЮЩЕЙ СВЕРХЭКСПРЕССИРУЕМЫЙ ГЕН yajL
RU2015120052A (ru) 2015-05-28 2016-12-20 Аджиномото Ко., Инк. Способ получения L-аминокислоты с использованием бактерии семейства Enterobacteriaceae, в которой ослаблена экспрессия гена gshA
EP3420096A1 (en) 2016-02-25 2019-01-02 Ajinomoto Co., Inc. A method for producing l-amino acids using a bacterium of the family enterobacteriaceae overexpressing a gene encoding an iron exporter
CN106754807B (zh) * 2016-12-29 2020-10-30 廊坊梅花生物技术开发有限公司 生产l-亮氨酸菌株和生产l-亮氨酸的方法
JP7066977B2 (ja) 2017-04-03 2022-05-16 味の素株式会社 Ｌ－アミノ酸の製造法
EP3861109A1 (en) 2018-10-05 2021-08-11 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing target substance by bacterial fermentation
BR112021014194A2 (pt) 2019-02-22 2021-12-28 Ajinomoto Kk Método para a produção de um l-aminoácido
JP2022526181A (ja) 2019-04-05 2022-05-23 味の素株式会社 Ｌ－アミノ酸の製造方法
JP2022550084A (ja) 2019-09-25 2022-11-30 味の素株式会社 細菌の発酵によるｌ－アミノ酸の製造方法
KR102360900B1 (ko) * 2020-05-20 2022-02-09 씨제이제일제당 (주) 신규한 폴리펩티드 및 이를 이용한 l-류신의 생산 방법
KR102527102B1 (ko) * 2021-03-05 2023-04-28 씨제이제일제당 주식회사 이소프로필말레이트 신타제 변이체 및 이를 이용한 l-류신의 생산 방법
JP2024075803A (ja) * 2021-03-29 2024-06-05 ＧｒｅｅｎＥａｒｔｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅ株式会社 改変型α－イソプロピルマレートシンターゼ
EP4392551A1 (en) 2021-08-25 2024-07-03 Metabolic Explorer Dehydrogenase mutants and applications thereof in amino acid synthesis

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS579796B2 (zh) * 1974-03-15 1982-02-23
JPS6234397A (ja) 1985-08-08 1987-02-14 Mitsubishi Electric Corp ダイナミツクメモリ装置
CA2152885C (en) 1994-06-30 2007-05-01 Tetsuo Nakano Process for producing l-leucine
RU2140450C1 (ru) * 1997-10-29 1999-10-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") Штамм бактерий escherichia coli продуцент l-лейцина (варианты)
WO1999028446A2 (en) * 1997-12-02 1999-06-10 E.I. Du Pont De Nemours And Company Branched chain amino acid biosynthetic enzymes
NL1007731C2 (nl) * 1997-12-08 1999-06-09 Hoogovens Staal Bv Werkwijze en inrichting voor het vervaardigen van een ferritisch gewalste stalen band.

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104662169A (zh) * 2012-08-22 2015-05-27 于利奇研究中心有限公司 制备含有编码在其反馈抑制中减弱或者消除的酶的基因的载体的方法及其用于制备氨基酸和核苷酸的用途
CN114085800A (zh) * 2016-12-28 2022-02-25 Cj第一制糖株式会社 新型异丙基苹果酸合酶变异体及使用其生产l-亮氨酸的方法
CN110540976A (zh) * 2019-08-29 2019-12-06 天津科技大学 一种异丙基苹果酸合成酶及其应用
US11866737B2 (en) 2019-08-29 2024-01-09 Tianjin University Of Science And Technology 2-isopropylmalate synthetase and engineering bacteria and application thereof

Also Published As

Publication number Publication date
RU2201454C2 (ru) 2003-03-27
EP1568776A2 (en) 2005-08-31
DE60025976T2 (de) 2006-11-23
US6403342B1 (en) 2002-06-11
CN1211399C (zh) 2005-07-20
JP2001037494A (ja) 2001-02-13
DE60040178D1 (de) 2008-10-16
EP1568776A3 (en) 2005-10-19
EP1067191A2 (en) 2001-01-10
DE60025976D1 (de) 2006-04-20
EP1067191A3 (en) 2003-03-19
EP1568776B1 (en) 2008-09-03
EP1067191B1 (en) 2006-02-15
JP4501014B2 (ja) 2010-07-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN1280135A (zh) L－亮氨酸的生产方法及有关dna和微生物
EP0685555B1 (en) L-Isoleucine producing bacterium and method for preparing L-Isoleucine through fermentation
JP4088982B2 (ja) 発酵法によるｌ−アミノ酸の製造法
CN1082092C (zh) 物质的生产方法
RU2588657C2 (ru) Микроорганизм для продуцирования одновременно l-аминокислоты и рибофлавина и способ производства l-аминокислоты и рибофлавина с его применением
CN1210397C (zh) 生产苏氨酸和异亮氨酸的方法
CN1346402A (zh) L－氨基酸生产菌以及用于生产l－氨基酸的方法
CN1165193A (zh) 发酵产生l-谷氨酸的方法
CN1446920A (zh) L－氨基酸的生产方法
KR101059380B1 (ko) Ｌ-트레오닌의 생산 방법
CN1421527A (zh) 新的突变谷氨酰胺合成酶和产生氨基酸的方法
CN1128295A (zh) 发酵生产l-谷氨酸的方法
CN1974760A (zh) 具有提高l－赖氨酸生产能力的棒状杆菌属微生物及使用其生产l－赖氨酸的方法
CN1280184A (zh) 生产l－赖氨酸的棒状菌和制备l－赖氨酸的方法
CN1305002A (zh) 发酵生产l－氨基酸的方法
CN1182246C (zh) 突变体ilvH基因和制备L-缬氨酸的方法
CN1974761A (zh) 具有改善的l－赖氨酸生产力的棒杆菌属微生物和利用棒杆菌微生物生产l－赖氨酸的方法
CN1084388C (zh) 用于产生有旋光力的化合物的方法
FR2844277A1 (fr) Bacterie produisant un l-aminoacide et procede de production de ce l-aminoacide
KR100815041B1 (ko) 아미노산 생산의 대사 공학
US20090298135A1 (en) Method for fermentative production of L-methionine
CN105555953A (zh) 新型突变体鸟氨酸脱羧酶蛋白和其用途
RU2395580C2 (ru) Способ конструирования бактерии-продуцента (2s,3r,4s)-4-гидрокси-l-изолейцина, бактерия-продуцент (2s,3r,4s)-4-гидрокси-l-изолейцина и способ продукции (2s,3r,4s)-гидрокси-l-изолейцина или его соли
JP3975470B2 (ja) 発酵法によるｌ−イソロイシンの製造法
CN1293184C (zh) 生产l－亮氨酸的方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CX01 Expiry of patent term

Granted publication date: 20050720

CX01 Expiry of patent term