JP5954178B2 - γ−Glu−Abuを含有する酵母及び酵母エキス、並びにそれらの製造方法 - Google Patents
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Description
すなわち、本発明は以下のとおりである。
(2)γ-Glu-Abuを乾燥重量あたり0.5%以上含有する酵母エキス。
(3)γ-Glu-Abuを乾燥重量あたり1.0%以上含有する酵母エキス。
(4)前記酵母がサッカロマイセス属又はキャンディダ属に属する酵母である、前記酵母エキス。
(5)前記酵母がサッカロマイセス・セレビシエである、前記酵母エキス。
(6)前記酵母がキャンディダ・ユティリスである、前記酵母エキス。
(7)酵母をAbu及びγ-Glu-Abuから選ばれる化合物を添加した培地で培養し、得られた菌体から酵母エキスを調製することを特徴とする、γ-Glu-Abuを含む酵母エキスの製造方法。
(8)前記培地は前記化合物を、Abuの場合は10ppm以上、γ-Glu-Abuの場合は1ppm以上添加され、前記酵母エキスはγ-Glu-Abuを乾燥重量当り0.2%以上含有する、前記方法。
(9)前記酵母がサッカロマイセス属又はキャンディダ属に属する酵母である、前記方法。
(10)前記酵母がサッカロマイセス・セレビシエである、前記方法。
(11)前記酵母がキャンディダ・ユティリスである、前記方法。
(12)前記酵母が、下記の性質のいずれか又は両方を有することを特徴とする、前記方法:
(a)γ−グルタミルシステイン合成酵素活性が増強されている、
(b)グルタチオン合成酵素活性が弱化されている。
(13)アミノ基転移酵素活性又は/及びα−ケト酪酸合成酵素活性が増強するように改変され、かつ、γ−グルタミルシステイン合成酵素活性が増強し、又は/及びグルタチオン合成酵素活性が弱化するように改変された、γ-Glu-Abu含量が高められた酵母。
(14)アミノ基転移酵素が、BAT1遺伝子によってコードされる酵素であることを特徴とする前記酵母。
(15)アミノ基転移酵素が、UGA1遺伝子によってコードされる酵素であることを特徴とする前記酵母。
(16)α−ケト酪酸合成酵素が、CHA1遺伝子によってコードされる酵素であることを特徴とする前記酵母。
(17)さらに、ペプチド分解酵素の活性が弱化されている、前記酵母。
(18)前記酵母から製造された酵母エキス。
(19)Abuを添加した酵母エキス原料に、γ−グルタミル基転移酵素を作用させることを特徴とする、γ-Glu-Abuを含む酵母エキスの製造方法。
(20)Abuの添加量は、酵母エキス原料の乾燥重量当り0.1%以上であり、前記酵母エキスはAbuを、乾燥重量当り0.2%以上含有する、前記方法。
本発明の酵母エキスは、γ-Glu-Abuを乾燥重量あたり0.2%以上含有する酵母エキスである。
本発明の酵母エキスは、γ-Glu-Abuを、乾燥重量当り0.2%以上、好ましくは0.5%以上、より好ましくは1.0%以上、特に好ましくは2.0%以上含有する。
酵母は、細胞内にγ-Glu-Abuを蓄積することができる限り、特に制限されず、サッカロミセス・セレビシエ等のサッカロミセス属、キャンディダ・ユティリス等のキャンディダ属、ピヒア・パストリス等のピヒア属、シゾサッカロミセス・ポンベ等のシゾサッカロミセス属等に属する酵母を例示することができる。中でも、酵母エキスの生産によく用いられているサッカロミセス・セレビシエやキャンディダ・ユティリスが好ましい。本発明の酵母は、1倍体でもよいし、2倍性またはそれ以上の倍数性を有するものであってもよい。
尚、酵素活性の弱化には、酵素活性が野生株よりも低い場合、及び、酵素活性を完全に欠損した場合の両方が含まれる。
まず、酵母を培地で培養する。培地は、酵母が増殖し得るものであれば特に制限されないが、実施例に記載したSD培地に限定されることなく通常工業的に用いられる培地を利用することができる。例えば、炭素源としてグルコース、蔗糖、糖蜜、エタノール、酢酸、亜硫酸パルプ廃液等を、窒素源として尿素、アンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム硝酸塩等を、或いはコーンスチープリカー、カゼイン、酵母エキス、ペプトン、大豆蛋白分解物等を、燐酸、カリウム、マグネシウム源として、燐酸、燐酸カリウム、燐酸アンモニウム、過燐酸石灰、塩化カリウム、水酸化カリウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム等を、その他微量金属として、銅、マンガン、亜鉛、鉄イオン等の無機塩等を適宜組み合わせて含む培地などを例示することができる。
培地に添加するAbu及び/又はγ-Glu-Abuは、精製品(純品)であってもよいし、必要量のAbu及び/又はγ-Glu-Abuを含有する限り、これらの化合物を含む組成物であってもよい。
本発明の酵母の一形態は、アミノ基転移酵素の活性が増強された酵母である。本発明の酵母の他の形態は、α-ケト酪酸合成酵素活性が増強された酵母である。本発明の酵母の他の形態は、アミノ基転移酵素の活性及びα-ケト酪酸合成酵素活性の両方が増強された酵母である。また、アミノ基転移酵素又は/及びα−ケト酪酸合成酵素の活性が増強された酵母は、第一の発明と同様に、γ−グルタミルシステイン合成酵素(GSH1)の活性が増強されていてもよいし、グルタチオン合成酵素(GSH2)の活性が弱化されていてもよい。或いはこの2つの性質を併せ持っていてもよい。更に、細胞内のペプチドを分解するペプチド分解酵素、例えば、DUG1遺伝子、DUG2遺伝子、DUG3遺伝子、ECM38遺伝子にコードされる酵素が弱化されていても良い。
また、他の態様、例えば上記酵母において更にCHA1によりコードされるセリン(スレオニン)デアミナーゼ活性が増強された酵母は、γ-Glu-Abuを、乾燥菌体重量あたり、好ましくは0.1%以上、より好ましくは0.15%以上、より好ましくは0.2%以上、更に好ましくは0.4%以上、特に好ましくは0.5%以上含有する。尚、Abu合成能が強化された酵母を培養する際に、培地にAbu及び/又はγ-Glu-Abuを添加してもよい。
Abuにγ−グルタミル基転移酵素を作用させると、γ-Glu-Abuが生成する。したがって、Abuを含む酵母エキスに、γ−グルタミル基転移酵素を作用させることによっても、γ-Glu-Abuを含む酵母エキスが得られる。Abuを含む酵母エキスは、Abuを含む培地で培養した酵母から調製したものであってもよく、酵母エキス原料にAbuを加えたものであってもよい。
γ-Glu-Abuについて、定量的な官能評価試験によりコク味付与活性の強度を調べた。
定量的官能評価試験は以下のように実施した。グルタミン酸ナトリウム(0.05g/dl)、イノシン酸一リン酸(0.05g/dl)、及び、塩化ナトリウム(0.5g/dl)を含有する蒸留水に、被験化合物を0.001〜0.5g/dlにて混合した場合の、コク味付与活性の強度を測定した。前記グルタミン酸ナトリウム、イノシン酸一リン酸、塩化ナトリウムを含有する蒸留水に被検化合物を添加しないサンプルを無添加コントロールとした。被検化合物を溶解後に、無添加コントロールに対し酸性を呈したサンプルについては、NaOHで無添加コントロールに対しpHが±0.2の範囲内となるように合わせて使用した。
各種酵母エキス(酵母抽出物)中のAbu、γ-Glu-Abu、及びγ-Glu-Abu-Gly含量を測定した。測定には以下の方法を用いた。ペプチドを6−アミノキノリル−N−ヒドロキシスクシンイミジルカルバメート(AQC)を用いて蛍光誘導体化し、LC-MS/MSにより検出することより行った。具体的には、適当な濃度に希釈したサンプル2.5μL又は、1μMのAbu、γ-Glu-Abu、及びγ-Glu-Abu-Glyを含む標準液2.5μLに、MillQ水2.5μL、5μM内部標準物質溶液(3-methyl-His-d2、シグマ社、Gly-d2、シグマ社。いずれも安定同位体で標識されている。)5μL、硼酸緩衝液(日本ウォーターズ社製AccQ-Fluor(登録商標)試薬キット付属品)30μLを添加した。この混合物に、AQC試薬溶液(上記試薬キットの試薬粉末をアセトニトリル1mL中に溶解することにより調製)10μLを添加した。得られた混合物を10分間、55℃で加熱後、0.1%のギ酸水溶液100μLを加え、分析サンプルとした。
(2)分離カラム:Unison UK-Phenyl 内径2.0mm、長さ100mm、粒子径3μm(Imtakt社製)
(3)カラム温度:40℃
(4)移動相A:25mMギ酸水溶液をアンモニア水でpH6.0に調整した水溶液
(5)移動相B:メタノール
(6)流速:0.25mL/min
(7)溶出条件:溶出は、移動相A及び移動相Bの混合液を用いて行った。混合液に対する移動相Bの比率は以下の通り。0分(5%)、0分〜17分(5%〜40%)、17分〜17.1分(40%〜80%)、17.1分〜19分(80%)、19分〜19.1分(80%〜5%)、19.1分〜27分(5%)。
(2)検出モード:Selected Ion Monitoring(ポジティブイオンモード)
(3)選択イオン:表3
なお、γ-Glu-Abuの定量の際に、極まれにサンプルによって夾雑ピークが見られた場合は、第二のマスアナライザーでの選択イオンを、145.2、或いは、104.1を用いて定量した。
実施例1の方法を用いて、各種市販酵母エキス中のγ-Glu-Abu含量(乾燥重量当り)を測定した。また、常法により、GSH含量も測定した。結果を表4に示す。
次に、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)の標準菌株であるS288C株に含まれるγ-Glu-Abu含量を測定した。また、同時に前駆体であるAbuの培地への添加効果も検証した。なお、S288C株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構生物遺伝資源部門(NRBC:NITE Biological Resource Center。〒292-0818 千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8)にNBRC1136の番号で保存されており、分譲を受けることができる。また、同株は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, United States of America)にもATCC26108の番号で保存されており、分譲を受けることができる。
グルコース 2%
Nitrogen Base 1倍濃度
(10倍濃度Nitrogen Baseは、1.7gのBacto Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids and Ammonium Sulfate (Difco社)と5gの硫酸アンモニウムを混合したものを100mlの滅菌水に溶解し、pHを5.2程度に調整し、フィルター濾過滅菌したもの)
次に、S288C株を培養する際における、培地へのγ-Glu-Abu添加効果を検証した。S288C株をSD培地(500ml容坂口フラスコ中50ml)に1エーゼ分植菌し、30℃で120rpmの速度で24時間振とう培養した。得られた培養液の吸光度を測定し、初発OD660が0.01になるように(なお、吸光度は、BECKMAN COULTER社のDU640 SPECTROPHTOMETERを用いて測定した。)、SD培地(2L容バッフルフィン付き三角フラスコ中400ml)、最終濃度で10ppmのγ-Glu-Abuを含むSD培地、又は最終濃度で100ppmのγ-Glu-Abuを含むSD培地に植菌し、30℃で120rpmの速度にて回転方式で19時間振とう培養した。得られた培養液から、実施例3と同様にしてエキス分を抽出し、各化合物の菌体内含有量を測定した。
次に、S288C株を培養する際における、培地へのγ-Glu-Abuの追添効果を検証した。S288C株をSD培地(500ml容坂口フラスコ中50ml)に1エーゼ分植菌し、30℃で120rpmの速度で24時間振とう培養した。得られた培養液の吸光度を測定し、初発OD660が0.01になるように(なお、吸光度は、BECKMAN COULTER社のDU640 SPECTROPHTOMETERを用いて測定した。)SD培地(2L容バッフルフィン付き三角フラスコ中400ml)に植菌し、30℃で120rpmの速度にて回転方式で18時間振とう培養した。培地にγ-Glu-Abuを追添する実験区では、各々最終濃度で10ppm又は100ppmになるようにγ-Glu-Abuを添加し、又、コントロールでは何も添加せずに、更に培養を1時間継続した(トータルの培養時間は19時間)。得られた培養液から、実施例3と同様にしてエキス分を抽出し、各化合物の菌体内含有量を測定した。
表7に示す通り、γ-Glu-Abuの追添した場合でも、実施例4と同様に、培地中のγ-Glu-Abuの菌体内への取込、蓄積が可能なことが判明した。また、実施例3、4と同様に、γ-Glu-Abuだけでなくγ-Glu-Abu-Glyも蓄積した。
実施例3〜5で抽出したエキスの固形分含量を測定し、菌体乾燥重量あたりのγ-Glu-Abu含量から、エキス固形分あたりのγ-Glu-Abu含量を計算した。その結果、市販酵母エキスよりもγ-Glu-Abu含量が大幅に上昇していることがわかった。
次に、キャンディダ・ユティリス(Candida utilis)の標準株であるNBRC10707株、及びNBRC0988へのAbu添加効果を検証した。これらの菌株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構生物遺伝資源部門(NRBC:NITE Biological Resource Center。〒292-0818 千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8)にNBRC10707株、及びNBRC0988の番号で保存されており、分譲を受けることができる。
実施例3の結果より、酵母細胞内でAbuを基質とした何らかの酵素反応によりγ-Glu-Abuが生成することがわかったため、γ−グルタミルシステイン合成酵素の副反応の可能性を検証した。
キャンディダ・ユティリスATCC22023株のγ−グルタミルシステイン合成酵素をコードするGSH1遺伝子の発現プラスミドpET-GSH1を以下の手順で構築し、エシェリヒア・コリに導入した。前記菌株は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, United States of America)にもATCC22023の番号で保存されており、分譲を受けることができる。
まず、酵母用GSH1発現プラスミドpAUR-GSH1を、タカラバイオに委託し、以下の手順で構築した。
続いて、エシェリヒア・コリ用GSH1発現プラスミドpET-GSH1を以下の手順で構築した。
上記のようにして得られたエシェリヒア・コリRosetta2(DE3)pLysS/pET-GSH1を100μg/mlのアンピシリン及び30μg/mlのクロラムフェニコールを含む3mLのLB培地の入った試験管に接種し、37℃で16時間振とう培養した。得られた培養液のうち2mlを、100mlのLB培地が入った坂口フラスコに接種した。37℃で2時間振とう培養後、終濃度が0.5mmol/Lになるようにイソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド(IPTG)を添加して、さらに30℃で4時間培養した。培養液を遠心分離して湿菌体を取得した。
上記で取得した精製組換え型GSH1 24.6μg、100mmol/LのTris-HCl(pH8.0)、12.5mmol/LのAbu、12.5mmol/Lのグルタミン酸、12.5mmol/Lのアデノシン三リン酸(ATP)、12.5mmol/Lの硫酸マグネシウム、2mmol/Lのジチオスレイトール(DTT)からなる200μlの反応液(pH8.0)をそれぞれ調製し、37℃で16時間反応を行った。
(1)HPLC:HITACHI L-2000シリーズ
(2)分離カラム:Synergi 4μHydro-RP 80A、内径4.6mm、長さ250mm、粒子径4μm(Phenomenex社製)
(3)カラム温度:40℃
(4)移動相A:50mMリン酸バッファー(pH2.5)
(5)移動相B:アセトニトリル
(6)流速:1.0ml/min
(7)溶出条件:溶出は、移動相A及び移動相Bの混合液を用いて行った。混合液に対する移動相Bの比率は以下の通りである。0分(0%)、0分〜5分(0%〜2.5%)、5分〜15分(2.5%)、15分〜30分(2.5%〜40%)、30分〜30.1分(40%〜0%)、30.1分〜50分(0%)。
(8)検出:UV210nm
この結果より、酵母のGSH1はAbuを基質として認識することが判明した。
上記実施例8の検討により、GSH1がAbu及びGluを基質とした酵素反応を担うことがin vitroの酵素反応により明らかとなったので、次に、この反応が酵母細胞内で実際に起きているかを検証した。
ウラシル要求株は、以下に示すように、URA3遺伝子を除いたURA3近傍DNAをサッカロマイセス・セレビシエ野生型株1倍体(Matα型)株に導入し、URA3遺伝子を破壊することによって取得した。
まず、配列番号13(atagcatgct cataaaattg ataaggaga)及び14(atagaattca ggacgtcatt agtggcgaa)のプライマーを用い、サッカロマイセス・セレビシエ野生株の染色体DNAを鋳型とするPCRによりURA3ローカスを増幅した(熱変性 94℃, 10 sec、アニーリング50℃, 10 sec、伸張 72℃, 1 min、25 cycle)。得られたDNA断片をエタノール沈殿により精製後、SphI及びEcoRIで消化し、プラスミドpUC19のSphI-EcoRI部位に挿入し、pUC19-URA3を得た。次に、配列番号15(atactgcaga taatcgatta attttttttt ctttc)及び16(atactgcaga agtagataat tacttcctt)に示すプライマーを用いてサッカロマイセス・セレビシエ野生株の染色体DNAよりADH1プロモーター領域を増幅した。このDNA断片をPstIで消化し、PstIで消化及び、CIAP処理を行ったpUC19-URA3のPstI部位に挿入し、pUC19-ADH1p-URA3を得た。なお、ADH1pが正しくURA3遺伝子と順方向に挿入されていることを当該近傍領域のシークエンスにより確認した。同様に、配列番号17(atagacgtct aatttttttt tctttc)及び18(atagacgtct gttttatatt tgttgtaaa)に示すプライマーを用いて増幅したADH1プロモーターをAatIIで消化し、AatIIで消化及び、CIAP処理を行ったpUC19-ADH1p-URAのAatII部位に挿入し、pUC19-ADH1p-URA3-ADH1pを得た。なお、ADH1pが正しくURA3遺伝子と順方向に挿入されていることを当該近傍領域のシークエンスにより確認した。
5’端にGSH1の上流配列をもつ配列番号19のプライマー(TATTGCCCCAGTGTTCCCTCAACAACCTTGGTAGTTGGAGCGCAATTAGCGTATCCTGTACCATACTAATTCTCTTCTGCTCTTAACCCAACTGCACAGA)、及びGSH1遺伝子の開始コドンから始まる一部のORF内配列を持つ配列番号20のプライマー(ATACCTTCATCCCTTATGTGTTCATTGTACGTCCTAGACTCAAACCACTGCAAAGGCGTGCCCAAAGCTAAGAGTCCCATTGTATATGAGATAGTTGATT)を用い、pUC19-ADH1p-URA3-ADH1pを鋳型にPCRを行い(熱変性 94℃, 10 sec、アニーリング 60℃, 10 sec、伸張 72℃, 4 min)、ADH1プロモーターに挟まれたURA3を持つDNA断片を調製した。このDNA断片でura3△0株を形質転換し、SD平板培地に塗布し得られる形質転換体から、GSH1プロモーターがADH1プロモーター−URA3−ADH1プロモーターに置換された株を取得した。
GSH1プロモーターがADH1プロモーター−URA3−ADH1プロモーターに置換された株を、ウラシル添加SD培地で一晩培養し、適量を5-FOA平板培地に塗布した。生育するコロニーから、導入されたADH1プロモーター間の相同組換えにより、URA3が除去され、GSH1プロモーターがADH1プロモーターに置換した株AG1-ura3△0を取得した。さらに、野生型ゲノムを鋳型に、配列番号21(AGTTACAGCAATGAAAGAGCAGAGCGAGAG)及び22(ATTACTGCTGCTGTTCCAGCCCATATCCAA)のプライマーを用いて増幅したDNAを前記株に導入することにより、URA3が野生型に復元し、GSH1プロモーターがADH1プロモーターに置換している株を取得した。本菌株をAG1株と命名した。一方、同様にura3△0株であるAJ14956に、野生型ゲノムを鋳型に、配列番号23(AGTTACAGCAATGAAAGAGCAGAGCGAGAG)及び24(ATTACTGCTGCTGTTCCAGCCCATATCCAA)のプライマーを用いて増幅したDNAを導入することにより、URA3が野生型に復元した株を得た。同株を、Control株と命名した。
次に、Control株及びAG1株をSD培地(500ml容坂口フラスコ中50ml)に1エーゼ分植菌し、30℃で120rpmの速度で24時間振とう培養した。得られた培養液の吸光度を測定し、初発OD660が0.01になるように、各種濃度のAbuを含むSD培地(500ml容坂口フラスコ中50ml)に植菌し、30℃で120rpmの速度で19時間振とう培養した。得られた培養液から、20 ODunits分の菌体を遠心分離により採取した。以後は、実施例3と同様の操作により、エキス分を抽出し、各化合物の菌体内含有量を測定した。
その結果、下記表に示すように、AG1株ではControl株よりもγ-Glu-Abu含量が大幅に上昇していた。このことより、細胞内でもGSH1がAbuを基質として認識し、γ-Glu-Abuを生成することが判明した。なお、AG1株をAbuを含まないSD培地で培養したときは、菌体内のγ-Glu-Abuは定量限界以下であったことから、単に、GSH1の発現を強化しただけでは細胞内のγ-Glu-Abu含量が増加するわけではなく、Abuの供給が重要であることも判明した。
Candida utilisのGSH1発現強化株へのAbu添加効果も、実施例7と同様に確認できる。具体的には、Candida utilis NBRC0988を親株に、公知のCre-loxP系を用いて、染色体上のURA3遺伝子を欠失させたウラシル要求性のCUD4F株を取得できる(Shigeru Ikushima et al 2009, Biosci.Biotechnolo.Biochem.,73(4),879-884)。なお、遺伝子操作に必要な遺伝子配列情報は、WO95/32289、U.Gueldenerらの論文(Nucleic Acids Research, 2002, Vol.30, No.6 e23)、Gritz.L and Davis Jの論文(Gene 25, 179-188(1983))などに記載されている為、これら配列情報をもとに各種ツールを作製してもよい。
実施例3、4、5の結果より、酵母細胞内ではγ-Glu-Abuを基質とした何らかの酵素反応により蓄積したγ-Glu-Abuの一部がγ-Glu-Abu-Glyに代謝されることがわかったため、グルタチオン合成酵素の副反応の可能性を検証した。
サッカロマイセス・セレビシエS288C株のグルタチオン合成酵素をコードするGSH2遺伝子の発現プラスミドpET-GSH2を以下の手順で構築し、エシェリヒア・コリに導入した。
まず、酵母用発現プラスミドpAUR-GSH2を、タカラバイオに委託し、以下の手順で構築した。
続いて、エシェリヒア・コリ用GSH2発現プラスミドpET-GSH2を以下の手順で構築した。
日本バイオサービス社より、サッカロマイセス・セレビシエS288C株のGSH2遺伝子の塩基配列(配列番号31)を基に作製したプライマーC(配列番号35)およびプライマーD(配列番号36)を購入した。プライマーCは、サッカロマイセス・セレビシエS288C株の染色体DNAのGSH2遺伝子の開始コドンを含む領域の5’末端にNdeI認識配列を含む塩基配列を付加したものである。プライマーDは、上記のpAUR-GSH2のGSH2遺伝子の終止コドンの外側の塩基配列と相補的な塩基配列の5'末端にXhoI認識配列を含む塩基配列を付加したものである。
上記で得られたエシェリヒア・コリBL21(DE3)/pET-GSH2を100μg/mlのアンピシリンを含む3mLのLB培地の入った試験管に接種し、37℃で16時間振とう培養した。得られた培養液のうち2mlを100mlのLB培地が入った試験管に接種した。37℃で2時間振とう培養後、終濃度が0.5mmol/Lになるようにイソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド(IPTG)を添加して、さらに30℃で4時間培養した。培養液を遠心分離して湿菌体を取得した。
上記で取得した精製Gsh2を用い、γ-Glu-Abuを基質としたγ-Glu-Abu-Glyの生成可能性を検討した。下記組成の反応液を調製し、30℃で22hrの酵素反応を行った。
〔反応液組成〕
精製Gsh2 300μg/500μl
Tris-HCl(pH8.0) 100 mmol/L
γ-Glu-Abu 10mmol/L
グリシン 10mmol/L
アデノシン三リン酸(ATP) 10mmol/L
MgCl2 10mmol/L
ジチオスレイトール(DTT) 0.1mmol/L
実施例11の結果から、γ-Glu-Abuは酵母のグルタチオン合成酵素の基質となり、γ-Glu-Abu-Glyを生成することが明らかとなった。一方、実施例4、5の結果から、細胞内に取り込まれたγ-Glu-Abuの一部は、γ-Glu-Abu-Glyに変換されるが、γ-Glu-Abuも蓄積されることが示された。これらの結果より、酵母野生株のGSH2の活性では、菌体内に蓄積したγ-Glu-Abuの全てをγ-Glu-Abu-Glyに代謝することはできないが、その活性を弱めた方が、よりγ-Glu-Abuを蓄積しやすくなると考えられた。そこで、GSH2の破壊株へのAbu添加効果を検証した。
実施例10で、Candida utilisのURA3破壊に用いたのと同様に、cre-loxp系を用いた手法で、一部プライマー配列を変更することにより、Candida utilis CUDF4株のGSH2を破壊した株を取得できる。
Saccharomyces cerevisiaeの代謝経路は非常によく研究されているが、Abuを生合成する酵素は知られていない。しかし、発明者らは、他の微生物での検討時に、アミノ基転移酵素の基質認識が比較的曖昧であったことに鑑み、その他のアミノ基転移酵素として報告されている酵素が、AKB(α-ケトブチレート(α−ケト酪酸))をAbuに変換する活性を保有しているのではないかと推測した。そこで、BCAA(分岐鎖アミノ酸)のアミノ基転移反応を担うと報告されているBAT1の高発現株及び、GABA(γ-アミノ酪酸)のアミノ基転移反応を担うと報告されているUGA1の高発現株を育種した。
まず、常法に従い、酵母-大腸菌シャトルベクターであるプラスミドpYES2(インビトロジェン社)に酵母の構成発現プロモーターであるADH1pを導入した。具体的には、酵母野生株より調製したゲノムを鋳型として、配列番号45(ATAACCGGTGGGTGTACAATATGGACTTC)及び46(ATAAAGCTTTGTATATGAGATAGTTGATT)のプライマーを用いてPCRによりADH1のプロモーター領域を増幅した(熱変性 94℃, 10 sec、アニーリング50℃, 10 sec、伸張 72℃, 1 min、25 cycle)。得られたDNA断片をエタノール沈殿により精製後、制限酵素HindIII及びAgeIで消化し、プラスミドpYES2のHindIII-AgeI部位に挿入し、pYES2-ADH1pを得た。
BAT1及びUGA1の塩基配列を、各々配列番号51及び53に示す。また、これらの遺伝子によりコードされるアミノ酸配列を、各々配列番号52及び54に示す。
実施例9と同様の手法により、S288C株のura3遺伝子のORF領域を欠失させたS288Cura3△0株を育種した。
1)で構築した各発現ベクターで、各々2)で育種したS288Cura3△0を形質転換することにより、各遺伝子を高発現する菌株を育種した。具体的には、Zymo Research社のFrozen EZ Yeast Transformation IIキットを用いて、S288Cura3△0のコンピテントセルを作製し、各発現ベクターを導入することによりS288C/pYES2-ADH1p株、S288C/pYES2-ADH1p-BAT1株、S288C/pYES2-ADH1p-UGA1株を取得した。
上記の各菌株を実施例3と同様にSD培地で培養評価した。結果を表13に示す。
上記検討により、アミノ基転移酵素の高活性化、特にBAT1の高活性化により細胞内のAbu含有化合物の増加効果が見られた為、GSH1高発現との組合せ効果を検討した。実施例9で取得したウラシル要求性株のAG1-ura3△0を、実施例14で作製したpYES2-ADH1p-BAT1で形質転換し、BAT1及びGSH1の高発現株である、AG1/pYES2-ADH1p-BAT1株を育種した。この株を実施例3と同様にして、SD培地で培養し、菌体内のγ-Glu-Abu含量及び、抽出エキス固形分あたりのγ-Glu-Abu含量を算出した。その結果、AG1/pYES2-ADH1p-BAT1株は、乾燥菌体重量あたりで1813ppmのγ-Glu-Abuを含有しており、また、同菌体から抽出したエキス分には、乾燥固形分あたりで約4560ppmのγ-Glu-Abuを含有していた。
固形分あたりにGSHを約8%となるように試薬のGSH(和光純薬工業株式会社)を添加した酵母エキスの1%水溶液を調製し、NaOHを用いてそのpHを7.0に調製した。この溶液に、粉末のAbuを水溶液中の最終濃度で800ppm、1600ppm、又は8000ppmになるように添加し、被検サンプルを作製した。また、Abuを添加しない酵母エキス水溶液をコントロールとした。これらの被検サンプルにγ-GTP(シグマ社 γ-Glutamyltranspeptidase from equine kidney、コードG9270-100UN)を0.05mg/mlになるように添加し、37℃で120分間酵素反応を行った。反応液は、速やかに氷冷し、γ-Glu-Abu含量を測定した。また、反応液の一部を用いて固形分含量を測定し、酵素反応により生成したγ-Glu-Abuの固形分あたりの含量を算出した。
まず、下記の手順にて官能評価用のサンプルを調製した。実施例4と同様にして、S288C株をSD培地(500ml容坂口フラスコ中50ml)に1エーゼ分植菌し、30℃で120rpmの速度で24時間振とう培養した。得られた培養液の吸光度を測定し、初発OD660が0.01になるように(なお、吸光度は、BECKMAN COULTER社のDU640 SPECTROPHTOMETERを用いて測定した。)、SD培地(2L容バッフルフィン付き三角フラスコ中400ml×4本)、又は、γ-Glu-Abuを終濃度で200ppm含有するSD培地(2L容バッフルフィン付き三角フラスコ中400ml×4本)に植菌し、30℃で120rpmの速度にて回転方式で19時間振とう培養した。実施例4と同様にして得られた菌体よりエキス分を抽出し、エキス中のγ-Glu-Abu濃度及び、エキスの固形分含量を求めた。その結果、γ-Glu-Abuを添加区から調製したエキス中のγ-Glu-Abu濃度は約1,000ppmであり、固形分濃度は約0.59%であった(抽出物1)。一方、無添加区から調製したエキスの固形分濃度は約1.00%であった(抽出物2)。
・サンプル1:コントロールサンプルに、γ-Glu-Abuが約40ppmとなるように抽出物1を添加した水溶液
・サンプル2:コントロールサンプルに、抽出物2を、サンプル1に添加した抽出物1の固形分濃度と同じになるように添加した水溶液
γ−グルタミルシステイン(γ-GC)を蓄積するサッカロマイセス・セレビシエAJ14892株(特開2008-61525)をSD培地(500ml容坂口フラスコ中50ml×4本)に1エーゼ分植菌し、30℃で120rpmの速度で48時間振とう培養した。得られた培養液の吸光度を測定し、初発OD660が0.1になるようにSD培地(2L容バッフルフィン付き三角フラスコ中400ml×4本)に植菌し、30℃で120rpmの速度にて回転方式で振とう培養した。培養時間は、残糖及び吸光度を経時的に測定し、ほぼS288CをSD培地で19時間培養した時の吸光度1.8前後と同じになるように、約42時間培養した。実施例4と同様にして、菌体よりエキス分を抽出し、エキスの固形分含量を求めたところ約0.71%であった(抽出物3)。またこの時の抽出物3溶液中のγ-GC含量は、約390ppmであった。このようにして、固形分あたりのγ-GC含量が約5.5%の抽出物3を調製した。
次に、これらサンプルのコク味を下記方法にて、専門のパネラー6名で評価した。
・サンプル3:コントロールサンプルに、抽出物3を、サンプル1に添加した抽出物1の固形分濃度と同じになるように添加した水溶液
・サンプル4:コントロールサンプルに、市販のGSH高含有酵母エキス(興人(株)アロマイルドUG8)を、サンプル1に添加した抽出物1の固形分濃度と同じになるように添加した水溶液
次に、α−ケト酪酸生成能の強化効果を検討した。従来、α−ケト酪酸が酵母細胞内でAbuの前駆体となることは知られていなかったが、アミノ基転移酵素を活性化することにより酵母細胞内でのAbu生成能が高まったことから、α−ケト酪酸合成能を強化することにより細胞内でのAbu生成能が高まるか否かを検討した。
まず、実施例13で作製したpYES2-ADH1pにセリン(スレオニン)デアミナーゼをコードするCHA1のORF領域を挿入する為に、CHA1の増幅産物をpT7ベクターにサブクローニングした。具体的には、サッカロマイセス・セレビシエ野生株より調製したゲノムを鋳型として、配列番号55(ATAAAGCTTAACCAGCGAGATGTCG)及び56(CTCTCTAGAGGGCAAATTGATGCTTC)のプライマーを用いて、CHA1のORF領域をPCRにより増幅した。得られたCHA1増幅産物は、制限酵素HindIII及びXbaIで消化し、pT7ベクターのHindIII-XbaI部位に挿入し、pT7-CHA1を得た。
CHA1の塩基配列を、配列番号57に示す。また、この遺伝子によりコードされるアミノ酸配列を、配列番号58に示す。
次に、GSH分解に関与すると報告されている酵素遺伝子DUG2の破壊効果を検証した。DUG2の塩基配列を配列番号61に、同遺伝子がコードするアミノ酸配列を配列番号62に示す。
まず、DUG2の開始コドンより上流80塩基を付加した配列番号63のプライマー(TTAAGTGAAAAACTATTTCGAGAAACCGAACAACCCTGTAAGGAAAAGTGAAAAACGAGGGCAGAAGTAATTGTGAAATCGTTCATCATCTCATGGATCT)、及びDUG2の終止コドンより下流80塩基を付加した配列番号64のプライマー(ACTAATTATCATTAGGTAGAGGCCTACATATGCAAATTGGGTATATATTAAGCACTTTAAAATCAATTGTTTGTAGTTGTAGATTCCCGGGTAATAACTG)を用い、野生型株のURA3遺伝子を増幅した。PCRの条件は、熱変性(94℃、10 sec)、アニーリング(50℃、10 sec)、伸張(72℃、2 min)、25 cycleとした。得られたDNA断片でAG1-ura3△0株を形質転換し、ウラシルを含有しないSD培地に塗布した。生育した形質転換体からAG1-ura3△0のdug2D株(以下、AG1-dug2△0株)を得た。AG1株及びAG1-dug2△0株を実施例9と同様にして100ppmのAbuを含むSD培地で培養した。その結果、AG1-dug2△0株の方が、より多くのγ-Glu-Abuを含有することがわかった。GSHを分解する酵素の破壊は、γ-Glu-Abuの蓄積に有益であることが示唆された。
Claims (20)
- γ-Glu-Abuを乾燥重量あたり0.2%以上含有する酵母エキス。
- γ-Glu-Abuを乾燥重量あたり0.5%以上含有する酵母エキス。
- γ-Glu-Abuを乾燥重量あたり1.0%以上含有する酵母エキス。
- 前記酵母がサッカロマイセス属又はキャンディダ属に属する酵母である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の酵母エキス。
- 前記酵母がサッカロマイセス・セレビシエである、請求項1〜3のいずれか一項に記載の酵母エキス。
- 前記酵母がキャンディダ・ユティリスである、請求項1〜3のいずれか一項に記載の酵母エキス。
- 酵母をAbu及びγ-Glu-Abuから選ばれる化合物を添加した培地で培養し、得られた菌体
から酵母エキスを調製することを特徴とする、γ-Glu-Abuを含む酵母エキスの製造方法。 - 前記培地は前記化合物を、Abuの場合は10ppm以上、γ-Glu-Abuの場合は1ppm以上添加され、前記酵母エキスはγ-Glu-Abuを乾燥重量当り0.2%以上含有する、請求項7に記載の方法。
- 前記酵母がサッカロマイセス属又はキャンディダ属に属する酵母である、請求項7又は8に記載の方法。
- 前記酵母がサッカロマイセス・セレビシエである、請求項7又は8に記載の方法。
- 前記酵母がキャンディダ・ユティリスである、請求項7又は8に記載の方法。
- 前記酵母が、下記の性質のいずれか又は両方を有することを特徴とする、請求項7〜1
1のいずれか一項に記載の方法:
(a)γ−グルタミルシステイン合成酵素活性が増強されている、
(b)グルタチオン合成酵素活性が弱化されている。 - 分岐鎖アミノ酸トランスアミナーゼ活性、γ−アミノ酪酸トランスアミナーゼ活性、又は/及びセリン(スレオニン)デアミナーゼ活性が増強するように改変され、かつ、γ−グルタミルシステイン合成酵素活性が増強し、又は/及びグルタチオン合成酵素活性が弱化するように改変された、γ-Glu-Abu含量が高められた酵母。
- 前記分岐鎖アミノ酸トランスアミナーゼが、BAT1遺伝子によってコードされる酵素であることを特徴とする請求項13に記載の酵母。
- 前記γ−アミノ酪酸トランスアミナーゼが、UGA1遺伝子によってコードされる酵素であることを特徴とする請求項13又は14に記載の酵母。
- 前記セリン(スレオニン)デアミナーゼが、CHA1遺伝子によってコードされる酵素であることを特徴とする請求項13〜15のいずれか一項に記載の酵母。
- さらに、ペプチド分解酵素の活性が弱化されている、請求項13〜16のいずれか一項に記載の酵母。
- 請求項13〜17のいずれか一項に記載の酵母を培地で培養し、得られた菌体から酵母エキスを調製することを特徴とする、酵母エキスの製造方法。
- Abuを添加した酵母エキス原料に、γ−グルタミル基転移酵素を作用させることを特徴
とする、γ-Glu-Abuを含む酵母エキスの製造方法。 - Abuの添加量は、酵母エキス原料の乾燥重量当り0.1%以上であり、前記酵母エキスはAbuを、乾燥重量当り0.2%以上含有する、請求項19に記載の方法。
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