JP5565992B2 - 酵母キャンディダ・ユティリスの形質転換法 - Google Patents
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酵母では一般的に前者の効率が高く、キャンディダ・ユティリスにおいても相同組換えにより、染色体に外来遺伝子を導入する方法、例えば、薬剤耐性マーカー、キャンディダ・ユティリス染色体DNAと相同な配列及び異種遺伝子を含んだベクターによりゲノム中に導入するキャンディダ・ユティリスの形質転換系は、既に知られている(特許文献1)。
従って、本発明は、以上のような問題点を解決し、相同組換えに依存しないキャンディダ・ユティリスの新規形質転換法を提供することを課題とするものである。
本発明者らは、鋭意研究の結果、該マーカーカセットを、カセットの内部を切断しない制限酵素で消化し直鎖状にし、キャンディダ・ユティリスの形質転換に用いることで、相同組換えに依存しない染色体への導入が可能であることを見い出し、本発明を達成したものである。
すなわち本発明は、
(1)選択マーカー遺伝子を含んでなる直鎖状のDNA断片を、宿主の染色体DNAと相同なDNA配列を用いることなく染色体上に組込むことを特徴とする、酵母キャンディダ・ユティリスの形質転換法、
(2)前記選択マーカー遺伝子が、構造遺伝子としてAP−1様転写活性化タンパク質をコードするYAP1遺伝子を含むものである、上記(1)記載の酵母キャンディダ・ユティリスの形質転換法、
(3)前記選択マーカー遺伝子が、リボソームタンパク質L31遺伝子のプロモーター(P2−1−2)、構造遺伝子としてAP−1様転写活性化タンパク質をコードするYAP1遺伝子、およびプロモーターとは異なる遺伝子由来のターミネーター成分を含むものである、上記(1)乃至(2)記載の酵母キャンディダ・ユティリスの形質転換法、
(4)前記プロモーターとは異なる遺伝子由来のターミネーター成分が、グルセルアルデヒド3リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のターミネーターである、上記(3)記載の酵母キャンディダ・ユティリスの形質転換法、
(5)前記直鎖状のDNA断片が、更に他の外来遺伝子を含んだものである、上記(1)乃至(4)のいずれか一に記載の酵母キャンディダ・ユティリスの形質転換法、
を提供するものである。
構造遺伝子としては、ロイシンやウラシル等の宿主の栄養要求性変異を相補する栄養要求性遺伝子や、シクロヘキシミドやジェネティシンなどの各種薬剤に対する耐性を宿主に付与する薬剤耐性遺伝子など、目的の遺伝子が導入された宿主を選択的に判別可能であれば何れでも良いが、形質転換効率の高いものが好ましく、例えば、先に本発明者らが報告した、AP−1様転写活性化タンパク質をコードするYAP1遺伝子(特願2004−264944号)が例示される。
宿主由来のDNA成分で構成される構造遺伝子を用いる時には、相同組換えを抑えるために、選択マーカー遺伝子のプロモーター成分とターミネーター成分を、異なる遺伝子由来のものに変えることが推奨される。
キャンディダ・ユティリスで機能する選択マーカー遺伝子として、具体的には、リボソーム蛋白質L31遺伝子由来のプロモーター成分P2−1−2、構造遺伝子として薬剤耐性遺伝子YAP1、及びグルセルアルデヒド3リン酸デヒドロゲナーゼのターミネーター成分からなるシクロヘキシミド耐性遺伝子が例示される。
実施例1 供試DNAの作製
既にキャンディダ・ユティリスで機能することを確認しているシクロヘキシミド耐性遺伝子カセット(リボソーム蛋白質L31遺伝子のプロモーターP2−1−2、構造遺伝子としてAP−1様転写活性化因子YAP1、グルセルアルデヒド3リン酸デヒドロゲナーゼのターミネーター)を用いた。本耐性遺伝子カセットは全てキャンディダ・ユティリスの染色体DNA由来なので、相同組換えを抑えるためにプロモーターとターミネーター成分の由来を変えている。
この耐性遺伝子カセットの両端にHindIIIサイトをPCRにより付加した。用いたプライマーは以下の通りである。
5'-GGAAGCTTTCTAGAAAAGGTAAAAGATCA-3'
5'-GGAAGCTTACGTGTAATACCTCAGGAGTC-3'
この選択マーカー遺伝子カセットをクローニングベクターpBluescriptIISKの HindIIIサイトに連結してpRI256を作製した(図1)。このベクターは、酵母キャンディダ・ユティリスで機能する複製起点を持たないので、染色体に組込まれない限り世代を越えて安定に保持されない。
宿主としてはキャンディダ・ユティリスAHU3053株を用いた。この酵母の形質転換は以下のように酢酸リチウム法(Yeast, 11, 355-360, 1995)により行うことが可能である。
一夜培養した酵母細胞をYPD培地(グルコース2%、ポリペプトン2%、酵母エキス1%)100mlに接種して、30℃でOD600nmが0.5となるまで振盪培養した。細胞を遠心分離により回収し10mlの滅菌した蒸留水と、続いて5mlのLiTE溶液(10×溶液を希釈して使用:10×TE=0.1M Tris・HCl/0.01M EDTA,pH7.5;10×LiAc=1M 酢酸リチウム,酢酸にてpH7.5に調整)とでそれぞれ一度ずつ洗浄した。洗浄した菌体は遠心分離により回収し1mlのLiTE溶液に再度懸濁した。
10μlの下記に示すDNA溶液と5μlのキャリアーDNA(サケ精子DNAを変性させたもの、10mg/ml)、および上記細胞懸濁液50μlを加えて、さらに制限酵素に適した10×反応緩衝液を終濃度が1×となるように添加し、よく混和して、30℃、30分間振盪した。これにLiTEPEG(1volの10×TE;1volの10×LiAc;8volの50%PEG4000)を細胞溶液の7倍量添加してボルテックスで良く懸濁した。この細胞溶液を、30℃、30分間インキュベートした後、42℃で15分間ヒートショックをかけた。細胞を遠心分離により回収し、滅菌蒸留水で一度洗浄後、YPD培地を用いて30℃で1時間振盪培養してから、全量を4μg/mlの濃度のシクロヘキシミドを含むYPD培地に塗沫し、30℃3日間培養した。
形質転換効率は各種要因によって大きく作用されふれ幅が大きい。よって、以下の形質転換試験は少なくとも2連で3回以上行い、その平均値を表記した。
QIAGEN plasmid midi kitにより調製したpRI256の0〜9.4μgを20Uの HindIII(Roche製の高濃度品)で、37℃、2時間消化し、この反応液を全量(10μl)酢酸リチウム法による形質転換に供した。形質転換後生育したコロニーサイズにばらつきが見られたので、生育途中で耐性を失った可能性のある直径0.5mm未満の小さいコロニーはカウントから除外した。
表1に示すように、DNA無添加や制限酵素無処理のサンプルでは数個のコロニーしか生育しないのに対し、pRI256とHindIIIを加えたサンプルでは10倍以上のコロニーが生育した。またDNA濃度依存的にシクロヘキシミド耐性が増加した。効率的には3μgがもっとも高く以後はこの濃度で行った。
HindIII濃度が高くなるにつれコロニー形成率は低下し、2U〜40Uの範囲では2Uで最も高く、3μgDNAあたり81株が生育した。このことから供試DNAが切断されていれば十分であることが推察された。
pRI256をHindIII(10U/サンプル)で、37℃、2時間消化した反応液(溶液1)を3当分し、制限酵素を失活させたもの(溶液2)、失活させた後に10U/サンプル濃度のHindIIIを再添加したもの(溶液3)をそれぞれ調製し、形質転換効率を調べた。ここで制限酵素の失活処理は、エタノール沈殿により回収したDNAに200μlのプロテアーゼK(0.01M Tris・HCl,pH7.5;0.05M EDTA;1%SDS;100μg/ml濃度のプロテアーゼK)を添加し、37℃、1時間反応した後、二度のフェノール・クロロホルム抽出を行ったものである。DNAは再度エタノール沈澱により回収し、一部の吸光度(A260nm)を測定して回収率を確認した。
表3に示すように、失活処理により若干の効率の低下が見られたがそれでもなお失活前の75%もの高い形質転換効率が維持されており、またHindIIIの追添加による効率の改善も見られなかったことから、供試DNAが切断されていれば細胞に導入された後の染色体への組込みに制限酵素は必要ないことが示された。
また、pRI256をXhoIやSmaI、またはApaIで消化すると、マーカー遺伝子(2.6kbp)にベクター(3.0kbp)を加えた全長5.6kbpが供試DNAとなり、本形質転換法で、少なくともこのサイズのDNAの組込みが可能であることも明らかとなった。
サザン解析によりマーカー遺伝子カセットの染色体への組込み様式を確認した。
HindIII消化したpRI256をキャンディダ・ユティリスAHU3053株に導入して得られるシクロヘキシミド耐性株18株よりゲノムDNAを抽出してYAP1をプローブとしたサザンハイブリダイゼーションを行った。コントロールとしては親株のAHU3053株のゲノムDNAとpRI256を用いた。
図2は供試DNAを、(A)HindIIIまたはカセット内部を切断しない、(B)XhoIで消化した、ものである。シクロヘキシミド耐性カセット両端のHindIIIサイトは人工的に付加したものであり、オリジナルな染色体上には存在しないため、相同組換えによりカセットが染色体に組み込まれるとHindIIIサイトは消失する。
染色体をHindIIIで消化した場合(図2−A)、形質転換体18株中、17株についてシクロヘキシミド耐性カセットと同一の2.6kbpのバンドを検出した。これにより非常に高い確率でカセットの両端の形状を維持したまま、すなわち非相同組換えにより、染色体に組み込まれることが明かとなった。しかも他と比べこのバンドのシグナルの強度は高く耐性カセットが複数コピー含まれることを示しており、この組込みがメインであることが予想される。
また、全ての株でその他に親株にはないバンド(染色体上のYAP1以外のバンド)が1〜4本検出された。これらは末端のHindIIIサイト(5’−AAGCTT−3’)を失ったもので、HindIII配列に組込まれて再生される過程で配列が変化したものか、AGCT配列を持つコンパーティブルな配列に組込まれたか、もしくはHindIIIサイトとは異なる場所に組込まれたものと考えられる。後者の場合には相同組換えで組込まれた可能性も否定できない。これについて(データは掲載しないが)、カセットを構成する各成分のDNAについてその前後の配列を基に作成したプライマーにより、形質転換体のゲノムを鋳型にして、ロングPCRを行ったが、全ての株で各成分と同サイズのバンドが増幅するのみで、各構成成分の染色体上の遺伝子座に何らかのDNAが挿入されたことにより生じるバンドシフトは確認できなかった。
ベクターを1箇所切断するXhoIで消化すると多様なバンドパターンを示した。中にはベクターと同サイズの5.6kbpのバンドも存在したが、染色体を切断しないとベクターと同サイズのシグナルは検出されないので、選択マーカー遺伝子は染色体上のさまざまな箇所に挿入されていると推察される。
以上から形質転換で生じたシクロヘキシミド耐性株は、選択マーカー遺伝子カセットが主に相同組換えに依存せずに染色体に導入された形質転換体であることが示された。
Claims (1)
- 構造遺伝子を含む選択マーカー遺伝子を含んでなる直鎖状のDNA断片を、宿主の染色体DNAと相同なDNA配列を用いることなく、且つ、宿主酵母染色体への組込み時に制限酵素に依存せずに、染色体上に組込むことを特徴とする、酵母キャンディダ・ユティリスの形質転換法。
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