CN102812119A - 酵母培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及包括将酵母在柠檬酸浓度为20mM以上的液体培养基中进行培养的酵母培养方法；培养开始时的液体培养基的柠檬酸浓度为小于20mM，且包括在酵母的生长状态为延滞期或对数生长期时将液体培养基的柠檬酸浓度调整至20～200mM的前述酵母培养方法；以及包括前述任一项所述的酵母的培养方法培养得到的酵母抽提酵母提取物的酵母提取物的制造方法；包括使用选自前述中任一项所述的酵母的培养方法培养得到的酵母、以及从所述酵母制备得到的酵母提取物中的1种以上的制造物作为原料的饮食品的制造方法。根据本发明，提供能够不实施遗传修饰而提高菌体中的谷胱甘肽含量的酵母的培养方法。
Description
技术领域
本发明涉及能够提高菌体中的谷胱甘肽含量的酵母培养方法，以及从所述培养方法培养得到的酵母制造酵母提取物的方法。
本申请要求2010年3月26日于日本申请的特愿2010-073818号的优先权，其内容在此并入。
背景技术
以啤酒酵母、面包酵母为代表的属于酵母属(Saccharomyces)菌的酵母平衡良好地含有天然的B族维生素、氨基酸、以及矿物质等，除了用于啤酒、面包的制造以外，也有有效应用。例如，干燥酵母在日本长期作为医药品、食品原料以及调味料等使用，其被认为是营养价值和安全性高的原材料。此外，近年来作为酵母提取物的原料酵母也有广泛应用。
酵母提取物是从酵母的培养物制备的，其含有丰富的氨基酸等，传统上作为诸如用于赋予美味、厚味的调味料等食品添加剂而使用。特别是目前崇尚天然的情趣高涨，对作为调味料的酵母提取物的需求有增加的倾向。从富含呈味成分的酵母制备的酵母提取物可以期待作为更优良的调味料使用，因而更多含有呈味成分的酵母的开发盛行。
作为酵母菌体内的代表性含硫化合物，可以列举出谷胱甘肽和S-腺苷甲硫氨酸。谷胱甘肽是具有肝机能恢复、以及抗氧化活性等的极其有用的物质，近年来期待其作为调味料、健康食品等饮食品的添加剂、化妆品基材等，有着广泛的用途。另一方面，已知S-腺苷甲硫氨酸在各种生物体反应中作为甲基的供体发挥作用。此外，还报告有抗抑郁作用、关节病的缓和、以及肝机能恢复等效果，已知这些含硫化合物对生物体起到重要的作用。
含硫化合物通常是使用甲硫氨酸、半胱氨酸等含硫氨基酸，通过以MET基因(甲硫氨酸合成基因)群为代表的许多基因的转录及翻译产物来合成。因而，为了得到更高生产含硫化合物的酵母，广泛地对酵母具有的与这些含硫化合物的合成相关的基因实施突变，制造含硫化合物富含酵母突变株。例如、作为制造富含谷胱甘肽的酵母的方法，已经公开了(1)通过对因突变处理而能够在同时含乙硫氨酸和亚硫酸盐的培养基中生长的假丝酵母属(Candida)酵母的突变株进行需氧性培养，提高菌体中的谷胱甘肽含量的方法(参照例如专利文献1)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：特开昭59-151894号公报
发明内容
发明所要解决的问题
为了能够更低成本且高效率地工业上量产谷胱甘肽本身、富含谷胱甘肽的酵母提取物等，利用谷胱甘肽含量高的酵母是重要的。
如专利文献1所述的方法，通过从进行突变处理等而实施了遗传修饰的酵母中筛选谷胱甘肽含量更高的酵母的方法，虽然能够获得富含谷胱甘肽的酵母，但是突变处理以及筛选需要时间和劳力，此外，很多情况下未必能够得到富含谷胱甘肽的酵母。
此外，有些情况下，与重组体相比，更需要天然酵母(野生株)，因而希望开发不进行突变处理、而提高酵母中的谷胱甘肽含量的方法。例如，在将酵母本身、酵母提取物用于食用的情况下，有些情况下野生株比重组体更为理想。
本发明的目的是提供能够不实施遗传修饰而提高菌体中的谷胱甘肽含量的酵母的培养方法。
解决问题的方法
本发明人对上述课题进行了深入研究，结果发现：在培养酵母属菌等的酵母时，通过在液体培养基中添加一定量以上的柠檬酸，能够提高该酵母的谷胱甘肽含量，从而完成了本发明。
即，本发明提供：
(1)一种酵母培养方法，其包括将酵母在柠檬酸浓度为20mM以上的液体培养基中进行培养。
(2)上述(1)所述的酵母培养方法，其中，所述液体培养基的柠檬酸浓度为200mM以下。
(3)上述(1)或(2)所述的酵母培养方法，其中，培养开始时的液体培养基的柠檬酸浓度为20mM以上。
(4)上述(1)所述的酵母培养方法，其中，培养开始时的液体培养基的柠檬酸浓度为小于20mM，且包括在酵母的生长状态为延滞期或对数生长期时，将液体培养基的柠檬酸浓度调整至20~200mM。
(5)上述(1)所述的酵母培养方法，其中，培养开始时的液体培养基的柠檬酸浓度为小于20mM，且包括在培养开始后9小时以内将液体培养基的柠檬酸浓度调整至20~200mM。
(6)上述(1)~(5)中任一项所述的酵母培养方法，其中，所述酵母为酵母属(Saccharomyces)菌或假丝酵母属(Candida)菌。
(7)上述(1)~(5)中任一项所述的酵母培养方法，其中，所述酵母为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或产朊假丝酵母(Candida utilis)。
(8)提高酵母的谷胱甘肽含量的方法，其包括将酵母在柠檬酸浓度为20mM以上的液体培养基中进行培养。
(9)酵母的制造方法，其包括回收采用上述(1)~(7)中任一项所述的酵母培养方法进行培养而得到的酵母。
(10)酵母提取物的制造方法，其包括从采用上述(1)~(7)中任一项所述的酵母培养方法进行培养而得到的酵母抽提酵母提取物。
(11)饮食品的制造方法，其包括使用选自下组中的1种以上的制造物作为原料：采用上述(1)~(7)中任一项所述的酵母的培养方法培养得到的酵母、以及从所述酵母制备得到的酵母提取物。
(12)酵母提取物，其是从采用上述(1)~(7)中任一项所述的酵母培养方法进行培养而得到的酵母制备的。
(13)调味料组合物，其含有采用上述(1)~(7)中任一项所述的酵母培养方法进行培养而得到的酵母或上述(12)所述的酵母提取物。
(14)饮食品，其含有采用上述(1)~(7)中任一项所述的酵母培养方法进行培养而得到的酵母或上述(12)所述的酵母提取物。
发明效果
根据本发明的酵母的培养方法，通过在含充分量的柠檬酸的液体培养基中进行培养这样的简单步骤，能够增大酵母属菌等酵母的谷胱甘肽含量。此外，采用该培养方法培养得到的酵母的谷胱甘肽含量充分高，因而通过使用该酵母，能够简便地得到高谷胱甘肽含量的酵母提取物或饮食品。
附图说明
[图1]显示实施例1中液体培养基中每个柠檬酸浓度下的GSH含有率(%)的曲线图。
[图2A]显示实施例2中在糖蜜培养基(1)中添加的每个柠檬酸浓度下各培养物的GSH含有率(%)的曲线图。
[图2B]显示实施例2中在糖蜜培养基(1)中添加的每个柠檬酸浓度下培养结束时间点的液体培养基的pH(终pH)的曲线图。
[图3A]显示实施例5中酿酒酵母KK122株的GSH含有率以及OD600的测定结果的图。
[图3B]显示实施例5中酿酒酵母KK124株的GSH含有率以及OD600的测定结果的图。
[图4]显示实施例11中各样品中的酵母的GSH含有率(%)的测定结果的图。
[图5]显示参考例1中培养前后的各上清中的柠檬酸含量的测定结果的图。
发明的具体实施方式
在本发明以及本申请说明书中，如无特别说明，谷胱甘肽是指氧化型谷胱甘肽和还原型谷胱甘肽这两者，总谷胱甘肽含量是指氧化型谷胱甘肽以及还原型谷胱甘肽的合计含量。
在本发明以及申请说明书中，单位酵母干燥菌体重量的谷胱甘肽含量可以采用在对微生物中的谷胱甘肽含量进行定量时常规进行的方法求出。例如，单位酵母干燥菌体重量的总谷胱甘肽含量可以采用Titze等的方法(Analytical Biochemistry，Vol.27、p502、1969)来测定。该方法是利用在5,5’-二硫双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)被烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸还原型(NADPH)还原的反应中，该反应的反应速度与谷胱甘肽存在量成比例，来测定谷胱甘肽量的方法。
本发明的酵母的培养方法以将酵母在柠檬酸浓度为20mM以上的液体培养基中进行培养为特征。通过使用该培养方法培养酵母，能够提高酵母的谷胱甘肽含量，能够得到富含谷胱甘肽的酵母(谷胱甘肽含量高的酵母)。能够得到这样的谷胱甘肽富含效果(提高酵母的谷胱甘肽含量的效果)的理由不明。但如后面的实施例3所示，将其他酸添加至液体培养基时观察不到该效果，且即使在pH控制环境下通过柠檬酸的添加也能够得到该效果，可以推断这不是简单的液体培养基的pH调整效应，而是由于柠檬酸特有的某种作用，促进了谷胱甘肽的产生、或者抑制了谷胱甘肽向菌体外的排出，从而谷胱甘肽在酵母菌体内蓄积。
本发明的酵母的培养方法的1个方面是富含谷胱甘肽的酵母的制造方法，该富含谷胱甘肽的酵母的制造方法包括：通过将酵母在柠檬酸浓度为20mM以上的液体培养基中进行培养，得到含所述酵母的培养物，以及从所述培养物中回收所述酵母。
本发明的富含谷胱甘肽的酵母，是指与亲本株相比较，菌体内的谷胱甘肽含量显著增加的酵母。
此外，培养物是指包含酵母菌体以及用于培养酵母的培养基的培养物。
可用于本发明的酵母的培养方法的酵母没有特殊限制，优选酵母属菌或假丝酵母属菌。可以使用例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、奇异酵母(Saccharomyces paradoxus)、粟酒裂殖酵母(Saccharomyces mikatae)、贝酵母(Saccharomyces bayanus)、库德里阿兹威酵母(Saccharomyces kudriavzevii)、产朊假丝酵母(Candida utilis)、热带假丝酵母(Candida tropicalis)、解脂假丝酵母(Candida lypolitica)、以及清酒假丝酵母(Candida sake)等。在本发明中，优选用于酿酒酵母或产朊假丝酵母的培养，因为能够取得特别良好的谷胱甘肽富含效果。
本发明的酵母的培养方法不仅在培养野生株(天然的酵母)的情况下，在培养通过突变处理得到的突变株的情况下，也能够得到谷胱甘肽富含效果。而且，在本发明以及申请说明书中，“野生株”是指自然界本来存在的酵母、即未对基因实施人工突变处理的酵母。与此相对，“突变株”是指对基因实施人工突变处理而得到的酵母。
而且，在本发明中，对突变处理没有特殊限制，是能够使酵母等生物所具有的基因的一部分发生突变的处理即可，可以使用在制作酵母等微生物的突变株时通常采用的任何方法。例如，通过使用紫外线、电离放射线、亚硝酸、亚硝基胍、甲基磺酸乙酯(Ethylmethane sulufonate，以下简称EMS)等作为突变原对酵母进行处理，可以对酵母进行突变处理。
本发明的酵母的培养方法中使用的液体培养基的柠檬酸浓度可以是20mM以上。通过柠檬酸浓度为20mM以上，能够使得对实现谷胱甘肽富含效果而言充分量的柠檬酸与酵母作用。在本发明中，液体培养基的柠檬酸浓度优选20~200mM，更优选20~120mM，更优选20~100mM，特别优选50~100mM。在液体培养基中添加过量的柠檬酸的情况下，不但不能期待谷胱甘肽富含效果，还会存在抑制酵母的生长性等隐患，通过使液体培养基的柠檬酸浓度为200mM以下，能够在抑制对酵母的生长性的影响的同时，得到充分的谷胱甘肽富含效果。
而且，在不对液体培养基的pH进行控制的条件进行培养时，即使在添加柠檬酸以外的酸的情况下，与未添加的液体培养基相比，谷胱甘肽含量也稍稍升高。可以推测这是因为通过酸的添加引起的缓冲作用，液体培养基的pH得到调整所致。即，在不控制pH的情况下，液体培养基中添加的柠檬酸的一部分被用于液体培养基的pH控制。因此，存在这样的倾向，即获得同等程度的谷胱甘肽富含效果所必需的液体培养基的柠檬酸浓度，在不控制pH的培养条件下比控制pH的培养条件下更高。
因此，在不控制液体培养基的pH的情况下，本发明的酵母的培养方法中，优选以液体培养基的柠檬酸浓度60~110mM培养酵母。更优选以75~90mM培养酵母。另一方面，在将液体培养基的pH控制在4.0~6.0的情况下，本发明的酵母的培养方法中，优选以液体培养基的柠檬酸浓度20~100mM培养酵母，更优选以20~75mM培养酵母。
在本发明的酵母的培养方法中，可以使用预先进行调整使得柠檬酸浓度为20mM以上的液体培养基培养酵母，也可以在培养开始后向液体培养基中添加柠檬酸。即，可以在培养开始时以20mM以上的液体培养基的柠檬酸浓度来培养酵母，也可以在培养开始时以小于20mM的液体培养基的柠檬酸浓度(也包括完全不含柠檬酸的液体培养基)来培养酵母，并在培养开始后将液体培养基的柠檬酸浓度调整为20~200mM。
在调整液体培养基的柠檬酸浓度的方法中，可以向液体培养基中添加固体的柠檬酸来进行调整，也可以添加柠檬酸水溶液来进行调整。
在酵母属、假丝酵母属的酵母、特别是酵母属的许多菌株中，存在向液体培养基中添加柠檬酸的时期越早就能够获得越高的富含谷胱甘肽效果的倾向。通过对出芽繁盛状态的酵母作用充分浓度的柠檬酸，可以充分发挥谷胱甘肽富含效果。因此，在培养开始后调整液体培养基的柠檬酸浓度的情况下，优选在进入平台期之前、即酵母的生长状态为延滞期或对数生长期，优选培养开始后至对数生长期的中期之间，更优选培养开始后至对数生长期的前期之间进行调整。
而且，对数生长期是指在分批以及流加培养中，在以吸光度等作为指标随时间测定培养容器中的酵母的量的情况下，观察到对数增大的时期。
另一方面，在连续培养中，是指可以观察到培养容器中的酵母的量基本上一定的时期。
在分批以及流加培养中，延滞期是指培养开始后至对数生长期前的时期。
另一方面，在连续培养中，是指直至将作为目标的参数控制在一定值时为止的时期。
例如，通过在培养开始后9小时以内、优选3小时以内调整液体培养基的柠檬酸浓度，能够使出芽繁盛状态的酵母与充分浓度的柠檬酸进行作用。
作为可用于本发明的酵母的培养方法的液体培养基，可以使用在酵母能够增殖的液体培养基中、适宜添加柠檬酸使得柠檬酸浓度为20mM以上而得到的培养基。
作为被添加柠檬酸的液体培养基，还可以使用任何包含碳源、氮源、以及无机盐等的、通常可用于酿酒酵母等酵母的培养的培养基。
作为液体培养基中含有的碳源，可以使用例如选自通常的微生物培养中利用的葡萄糖、蔗糖、醋酸、乙醇、糖蜜、以及亚硫酸盐纸浆废液等中的1或2种以上的物质。此外，作为氮源，可以是含氮无机盐，也可以是含氮有机物。可以使用例如选自尿素、氨、硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、玉米浆(CSL)、酪蛋白、酵母提取物、以及蛋白胨等中的1或2种以上的物质。此外，作为无机盐，可以使用过磷酸石灰、磷酸铵等磷酸成分、氯化钾、氢氧化钾等钾成分、以及硫酸镁、氯化镁等镁成分等。此外，还可以使用锌、铜、锰、以及铁离子等的无机盐。而且，本发明的酵母的培养方法中使用的液体培养基中可以适宜添加维生素、以及核酸相关物质等。
作为本发明的酵母的培养方法中使用的液体培养基，可以是SD培养基等合成培养基，也可以是YPD培养基、糖蜜培养基等半合成培养基。此外，也可以是诸如糖蜜培养基这样的本来就含有少量柠檬酸的培养基。而且，也可以是对这些培养基进行改变而得到的培养基。而且，糖蜜培养基(糖浓度3%)因批次等而含量存在差异，但一般而言，总有机酸浓度为1~3.5g/L左右，柠檬酸浓度为50~400mg/L。即，根据柠檬酸的分子量是192，可以计算出酵母的培养中使用的糖蜜培养基通常含有0.2~2mM的柠檬酸。
而且，已知在培养酵母时，可以使用柠檬酸作为碳源。但是，由于柠檬酸会影响培养基的pH，所以一般而言不会向培养基中积极地添加柠檬酸(例如添加10mM以上的柠檬酸)。而且，如后面的参考例1所示，培养后的液体培养基中的柠檬酸量比培养前的大，这表明在本发明中，液体培养基中添加的柠檬酸未被用作碳源。而且，通过在液体培养基中添加柠檬酸，酵母中的谷胱甘肽含量增大，这是本发明人首次发现的。
对培养形式无特殊限制，只要使用液体培养基即可，可以在考虑培养规模、以及所得培养物的使用用途等的基础上，适宜确定。作为液体培养基中的培养形式，可以列举出例如分批培养、流加培养以及连续培养等。
对本发明的酵母的培养方法的培养条件无特殊限制，只要使用含指定浓度的柠檬酸的液体培养基即可，可以采用培养酵母时一般采用的条件进行培养。例如，培养温度优选20~40℃，更优选25~35℃。此外，培养基的pH优选3.5~8.0，更优选4.0~6.0。特别是在工业量产培养物的情况下，优选对培养基中的pH进行定期测定，并进行调整使得维持pH4.0~6.0。
此外，优选一边进行通气以及搅拌，一边进行培养。通气的量和搅拌的条件可以在考虑培养的容量和时间、以及菌的初始浓度的基础上，适宜确定。例如，通气可以以0.2~2V.V.M.(体积每体积每分钟)左右、搅拌可以以50~800rpm左右来进行。
通过本发明的酵母的培养方法，能够培养谷胱甘肽含量高的酵母。例如，通过采用本发明的酵母的培养方法进行培养，与用柠檬酸浓度小于20mM的液体培养基(包括完全不含柠檬酸的液体培养基)进行培养的情况相比，可以使干燥酵母菌体中所含的谷胱甘肽含量增大10%以上。
而且，干燥菌体重量是指将菌体干燥后的重量。在求出干燥后的菌体重量的方法中，例如，首先通过对酵母的培养物进行离心分离处理，将菌体作为沉淀回收。将回收的菌体通过离心分离操作水洗2次后，测定105℃干燥5小时后的重量，从而求出干燥菌体重量。
即，通过本发明的包括将酵母在柠檬酸浓度为20mM以上的液体培养基中进行培养的酵母的培养方法，能够获得含富含谷胱甘肽的酵母的培养物，并能够采用公知方法从所述培养物回收所述酵母。
对从所述培养物回收酵母的方法无特殊限制，可以采用从酵母的培养物回收酵母时通常使用的任何回收方法。作为从所述培养物回收酵母的方法，可以列举出例如对酵母的培养物进行离心分离处理的方法等。
通过从采用本发明的酵母的培养方法得到的培养物回收酵母，可以制造谷胱甘肽含量非常高的酵母。此外，本发明的酵母提取物可以通过从采用本发明的酵母的培养方法培养得到的酵母抽提酵母提取物来制备。因此，可以从采用本发明的酵母的培养方法制造的酵母制备谷胱甘肽含量高的酵母提取物，从而进行制造。如前述，谷胱甘肽是具有各种生理活性的物质。即，仅仅通过应用本发明的酵母的培养方法替代传统的培养方法，就可以制造附加价值高于传统的酵母、酵母提取物。
对来自采用本发明的酵母的培养方法培养得到的酵母的酵母提取物的制备无特殊限制，可以采用在制备酵母提取物时通常使用的任何制备方法。作为所述制备方法，有例如利用酵母菌体内本来具有的蛋白质分解酶等对菌体进行可溶化的自溶法，添加微生物、植物来源的酶制剂将菌体可溶化的酶分解法，通过在热水中浸渍一定时间使菌体可溶化的热水抽提法，添加各种酸或者碱使菌体可溶化的酸碱分解法，通过进行1次以上的冻结以及融解来破碎菌体的冻融法，以及通过物理刺激来破碎菌体的物理破碎法等。作为物理破碎法中使用的物理刺激，有例如超声波处理、高压下的匀浆、以及通过与玻璃珠等固形物混合来进行磨碎等。
此外，通过将采用本发明的酵母的培养方法得到的培养物进行干燥处理，能够得到谷胱甘肽含量高的干燥酵母菌体。对于对所述培养物进行干燥处理的方法无特殊限制，可以采用在制备干燥酵母菌体时通常使用的任何制备方法。作为所述制备方法，有例如：冻干法、喷雾干燥法、以及滚筒干燥法等。而且，通过将所得干燥酵母菌体加工成粉末状，能够得到可操作性良好的谷胱甘肽含量高的干燥酵母菌末。
此外，可以从采用本发明的酵母的培养方法得到的培养物获得含有谷胱甘肽的分级物。作为从培养物对含有谷胱甘肽的分级物进行分级的方法，可以采用通常使用的方法中的任何方法。例如，通过将采用热水抽提或菌体破碎抽提等得到的抽提物，用加载有与含硫化合物之间的亲和性高的物质的亲和柱进行分级，能够浓缩纯化至高浓度含有谷胱甘肽的级分。
采用本发明的酵母的培养方法得到的富含谷胱甘肽的酵母、所述酵母的干燥酵母菌体、从所述酵母制备的酵母提取物、以及所述酵母提取物粉末可以作为调味料组合物。而且，所述调味料组合物可以仅由本发明的酵母提取物等组成，也可以除了本发明的酵母提取物等之外，还含有稳定剂、以及防腐剂等其他成分。
所述调味料组合物可以像其他调味料组合物那样，适宜用于各种饮食品。
而且，采用本发明的酵母的培养方法得到的富含谷胱甘肽的酵母、所述酵母的干燥酵母菌体、从所述酵母制备的酵母提取物、以及所述酵母提取物粉末可以作为原料直接包含在饮食品中。由此，能够有效率地制造高浓度含有谷胱甘肽的饮食品。作为这些饮食品，可以是通常能够添加干燥酵母、酵母提取物、以及包含它们的调味料组合物的饮食品，可以列举出例如酒精饮料、清凉饮料、发酵食品、调味料、汤类、面包类、以及点心类等。此外，所述培养物等还可以通过加工成软胶囊剂、硬胶囊剂以及片剂等，而作为滋补品等被摄取食用。
具体地，在饮食品的制造步骤中，通过像其他原料那样添加上述富含谷胱甘肽的酵母、所述酵母的干燥酵母菌体、从所述酵母制备的酵母提取物、以及所述酵母提取物粉末等，能够制造高浓度含有谷胱甘肽的饮食品。
实施例
下面给出实施例对本发明进行更具体的说明，但本发明不受以下实施例的限定。而且，以下实施例中，有些情况下也将“单位干燥菌体重量的总谷胱甘肽含量(%(w/w))”说成“GSH含有率(%)”。
此外，在以下实施例所使用的酵母中，酿酒酵母YNN27株、酿酒酵母BY4742株、酿酒酵母NCYC506株、以及粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)JCM1846株为野生株。
酿酒酵母AB9株<MATa/αgpi 10/gpi 10ura3/URA3leu2/LEU2>是编码α1,2-甘露糖基转移酶的基因具有突变，向培养基中释放甘露聚糖蛋白质的突变株(参照例如国际公开2006/025295号小册子)。酿酒酵母AB9株保藏于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(茨城县筑波市东1-1-1)(保藏号：FERM BP-10390)(原保藏的保藏日：2004年7月13日、国际保藏移交日：2005年8月3日)。
酿酒酵母AB13株是如下获得的富含谷胱甘肽突变株。首先，对酿酒酵母的野生株进行EMS处理，从所得突变株中选择出谷胱甘肽含量高于亲本株的突变株。然后，对该选择出的突变株进行EMS处理，从所得突变株中选择出谷胱甘肽含量高于亲本株的突变株。通过将该步骤重复2次以上，得到了酿酒酵母AB13、KK101株、KK122株、以及KK124株。
此外，以下的实施例中用于酵母的培养的半合成培养基、YPD培养基、SD培养基、以及糖蜜培养基{(1)、(2)}的组成、向其中添加的痕量元素以及维生素溶液的组成分别如表1~7所示。
[表1]
| 半合成培养基 | 浓度(g/L) |
| KH2PO4 | 2.00 |
| MgSO4·7H2O | 0.50 |
| ミ一ストパウダ一N | 0.59 |
| (NH4)2SO4 | 5.00 |
| 痕量元素(mL) | 10.00 |
| 维生素溶液(mL) | 12.00 |
| 葡萄糖 | 30.00 |
| pH | 6.800 |
| 缓冲剂 | 柠檬酸钠 |
[表2]
| 痕量元素 | 浓度(g/L) |
| EDTA·2Na·2H2O | 15.0 |
| ZnSO4·7H2O | 5.75 |
| MnCl2·4H2O | 0.32 |
| CuSO4·5H2O | 0.50 |
| CoCl2 | 0.26 |
| Na2MoO4·2H2O | 0.48 |
| CaCl2 | 2.20 |
| FeSO4·7H2O | 2.80 |
[表3]
| 维生素溶液 | 浓度(g/L) |
| 生物素 | 0.05 |
| 泛酸钙 | 1.00 |
| 烟酸 | 1.00 |
| 肌醇 | 25.0 |
| 盐酸硫胺素 | 1.00 |
| 盐酸吡哆醇 | 1.00 |
| 对氨基苯甲酸 | 0.20 |
[表4]
| YPD培养基 | 基准值浓度(g/L) |
| 细菌用酵母提取物 | 10.00 |
| 细菌用蛋白胨 | 20.00 |
| 葡萄糖 | 20.00 |
| pH | 6.800 |
[表5]
| SD培养基 | 基准值浓度(g/L) |
| 氮碱基，无AA | 6，70 |
| 葡萄糖 | 20.00 |
| pH | 6.800 |
[表6]
| 糖蜜培养基(1) | 基准值浓度(g/L) |
| KH2PO4 | 0.80 |
| MgSO4 | 0.80 |
| 尿素 | 2.00 |
| (NH4)2SO4 | 5.00 |
| 糖蜜(％：糖浓度) | 30.00 |
| pH | 6.800 |
[表7]
| 糖蜜培养基(2) | 基准值浓度(g/L) |
| KH2PO4 | 0.80 |
| MgSO4·7H2O | 0.28 |
| 废糖蜜 | 180.00 |
| 85％磷酸 | 1.68 |
| 10％氨水 | 8.20 |
| pH | 5.800 |
<实施例1>
对于酿酒酵母KK101株，使用半合成培养基，采用本发明的酵母的培养方法进行酵母的培养，测定了培养后的酵母的GSH含有率(%)。
首先，将于-80℃甘油中保存的KK101株涂布在YPD琼脂培养基上，30℃培养3天。然后，将1环量的在YPD琼脂培养基上生长的酵母接种于含3mL的YPD培养基的13mL容量助管(Assist Tube)中，30℃搅拌速度200rpm振荡培养1~3天。将所得培养液作为前培养液，用于以下的主培养。
将150μL的前培养液分别接种在含15mL的半合成培养基的200mL容量带挡板三角烧瓶中，所述半合成培养基中添加有0~100mM的柠檬酸，30℃搅拌速度200rpm振荡培养48小时。
对于所得培养物中的菌体中含有的总谷胱甘肽量，按照Titze等的方法(Analytical Biochemistry，Vol.27、p502、1969)进行了测定，通过除以干燥菌体重量，计算出GSH含有率(单位干燥菌体重量的总谷胱甘肽含量)。具体地，首先，对于所得培养物，6000rpm×5分钟、4℃进行离心分离处理，将回收的酵母菌体用纯化水洗涤2次。在该酵母菌体中添加2mL的纯化水进行悬浮后，将该悬浮液500μL装入铝皿中，105℃干燥5小时以上，再于干燥器中放置1小时以上后，测定干燥重量，以此作为干燥菌体重量。另一方面，将悬浮液500μL在热水浴中煮沸5分钟后，立即用在冰浴中冷却，15000rpm×5分钟、4℃进行离心分离处理，将回收的上清作为用于谷胱甘肽定量的样品。对于混合有1mM的EDTA的0.5M磷酸钾缓冲液(pH7.0)2.5mL，加入5μL的谷胱甘肽还原酶和500μL的NADPH，将所得溶液加入4mL容量处理池(disposal cell)中，在即将测定前，加入10μL的样品和100μL的DTNB，颠倒混合，用分光光度计从测定反应开始起30秒的412nm处的吸收的增加。使用预先通过浓度已知的谷胱甘肽存在下得到的测定值求出的标准曲线，根据所得测定值计算出谷胱甘肽量，以此作为培养物中的总谷胱甘肽量。通过用该总谷胱甘肽量除以另行测定的干燥菌体重量，计算出GSH含有率(%)。
图1是显示液体培养基中每个柠檬酸浓度下的GSH含有率(%)的图。由该果可知：通过在液体培养基中添加柠檬酸，GSH含有率(%)增大。GSH含有率(%)柠檬酸浓度依赖性地增大，在本实施例的条件下，柠檬酸浓度90mM时得到最大值。
<实施例2>
对于酿酒酵母AB13株，使用糖蜜培养基(1)，采用本发明的酵母的培养方法进行酵母的培养，测定了培养后的酵母的GSH含有率(%)。
将像实施例1那样制备的150μL的前培养液(1)分别接种于含15mL糖蜜培养基(1)的200mL容量带挡板三角烧瓶中，所述糖蜜培养基(1)中添加了柠檬酸，以使添加的柠檬酸的浓度为0~60mM。30℃、搅拌速度200rpm振荡培养48小时。因糖蜜培养基中本来就含有数mM的柠檬酸，故实际的糖蜜培养基中的柠檬酸浓度比添加的柠檬酸浓度高出若干。将像实施例1那样测定了培养后的酵母的GSH含有率(%)。而且，还测定了培养结束时间点的液体培养基的pH。
图2A以及图2B是显示在糖蜜培养基(1)中添加的每个柠檬酸浓度下各培养物的GSH含有率(%)〔图2A〕以及培养结束时间点的液体培养基的pH(终pH)〔图2B〕的图表。由该结果可知，对于糖蜜培养基(1)而言，通过添加10mM以上的柠檬酸，酵母的GSH含有率(%)也比添加前增大10%以上。此外，通过添加柠檬酸，培养结束时间点的液体培养基的pH上升，在添加的柠檬酸量为20mM以上的情况下，稳定在pH5.2左右。
<实施例3>
对于使用添加了各种酸的半合成培养基培养酿酒酵母KK101株的情况，测定了培养后的酵母的GSH含有率(%)，并考察了液体培养基中的各种酸对酵母的谷胱甘肽含量的影响。
将像实施例1那样制备的150μL的前培养液分别接种于含半合成培养基15mL的200mL容量带挡板三角烧瓶中，所述半合成培养基中添加了表8所述的各种盐，使得浓度如表中所述。30℃、搅拌速度200rpm振荡培养48小时。
将像实施例1那样测定了培养后的酵母的GSH含有率(%)。而且，还测定了培养结束时间点的液体培养基的pH(终pH)以及OD600。测定结果如表8~10所示。
[表8]
[表9]
[表10]
由该结果可知：对于磷酸以外的酸，通过在液体培养基中添加50mM以上的酸，可将液体培养基的pH调整至4.0~6.0，以及在该添加量范围酸的添加量不太影响液体培养基的pH。对于磷酸可知：液体培养基的pH依赖于添加量而升高，添加量的影响大。
此外，在使用任何液体培养基的情况下，培养结束时的OD600的值为30左右，可知：液体培养基中添加的酸的种类、量对酵母的生长性的影响小。
另一方面，对于柠檬酸以外的酸，GSH含有率均为2.8%左右，无特别差异。而且，在磷酸浓度为50mM的液体培养基中，GSH含有率为2.4%，低于其他，推测这是因为液体培养基的pH小于4。与此相对，在含有柠檬酸的液体培养基中，确认有GSH含有率柠檬酸含量依赖性地升高的倾向。
这些结果表明：通过用含柠檬酸培养基培养酵母而获得的富含谷胱甘肽的效果是柠檬酸特有的效果。而且，在液体培养基的柠檬酸浓度为50mM的情况、与添加50mM以上的其他酸的情况下，GSH含有率与液体培养基的终pH基本上等同，因此可以推断在使用半合成培养基的情况下，为了使得柠檬酸浓度为50mM而添加的柠檬酸中的大部分被用于液体培养基的pH的调整。
<实施例4>
对于酿酒酵母KK101株，使用调整了pH的状态且添加了柠檬酸的液体培养基，采用本发明的酵母的培养方法进行酵母的培养，测定了培养后的酵母的GSH含有率(%)。
将像实施例1那样制备的150μL的前培养液分别接种于含半合成培养基15mL的200mL容量带挡板三角烧瓶中，所述半合成培养基中添加了琥珀酸和柠檬酸，使得琥珀酸浓度以及柠檬酸浓度如表11所述。30℃、搅拌速度200rpm振荡培养48小时。将像实施例1那样测定了培养后的酵母的GSH含有率(%)。
而且，还测定了培养结束时间点的液体培养基的pH(终pH)。测定结果如表11所示。
根据该结果，通过以通过添加琥珀酸将液体培养基的pH调整至5.5~6.0的状态、并在液体培养基中添加柠檬酸，与无添加时相比，GSH含有率飞跃性地增大。具体地，柠檬酸浓度为0mM(无添加)时，GSH含有率为2.8%；而柠檬酸浓度为50mM时，GSH含有率为3.7%，增大了30%以上。另一方面，柠檬酸浓度为75mM以及90mM时均为4.3％，比无添加时的GSH含有率增大了50%以上。
与实施例3的结果相比较，即使在液体培养基中的柠檬酸浓度相同的情况下，一起添加了琥珀酸的本实施例中，GSH含有率高。通过该比较也可以说，实施例3中，液体培养基中添加的柠檬酸的一部分用于控制液体培养基的pH。
即，这些结果表明：通过在pH控制在4.0~6.0的液体培养基中添加柠檬酸，与pH未控制在4.0~6.0而在液体培养基中添加柠檬酸的情况相比，能够以更少的柠檬酸添加量得到更高的谷胱甘肽富含效果。
[表11]
<实施例5>
对于酿酒酵母KK122株以及KK124株，在使用发酵罐调整pH的培养条件下，采用本发明的酵母的培养方法进行酵母的培养，测定了培养后的酵母的GSH含有率(%)。
首先，采用与实施例1相同的方法分别制备酿酒酵母KK122株以及KK124株的前前培养液。将各前前培养液100μL接种于含10mL的YPD培养基的200mL容量带挡板三角烧瓶中，30℃、搅拌速度200rpm振荡培养1天。所得培养液作为前培养液，用于以下的主培养。
将10mL的各前培养液接种于含半合成培养基或添加了柠檬酸钠以使得柠檬酸浓度为90mM的半合成培养基(含90mM柠檬酸培养基)1L的2L容发酵罐中。以初始pH6.8、搅拌速度300rpm、通气量1V.V.M.、30℃的条件，通气搅拌培养48小时。培养中，用1N氢氧化钠溶液进行调整，使得pH的下限值为6.0。从培养开始每12小时进行取样，测定了OD600。此外，对于培养开始后24、36以及48小时取样的样品，也像实施例1那样测定了GSH含有率。
3A以及3B为显示酿酒酵母KK122株〔图3A〕以及KK124株〔图3B〕的GSH含有率以及OD600的测定结果的图。图中，棒状图为GSH含有率(%)的结果，折线图为OD600的结果。此外，“90mM柠檬酸”表示用90mM含柠檬酸培养基进行培养的结果，“0mM柠檬酸(无添加)”表示用半合成培养基进行培养的结果。根据该结果，对于酿酒酵母KK122株以及KK124株，也像酿酒酵母KK101株那样，通过在含有柠檬酸的液体培养基中进行培养，GSH含有率升高。此外，对于这两株而言，用90mM含柠檬酸培养基进行培养的情况与用半合成培养基进行培养的情况相比，OD600图的斜率均小一些，而培养结束时间点的OD600值同等程度。由此可以确认：通过在液体培养基中添加柠檬酸，虽然观察到生长开始晚一些，但最终酵母能够像未添加柠檬酸的情况一样进行培养，可以说柠檬酸的添加对酵母的生长性的影响小。
<实施例6>
对于各种酵母属菌，使用半合成培养基，采用本发明的酵母的培养方法进行酵母的培养，测定了培养后的酵母的GSH含有率(%)。根据实施例3的结果，以柠檬酸浓度为50mM的情况作为基准(对照)，在观察到GSH含有率柠檬酸浓度依赖性地增大的情况下，可以确认实现了本发明的富含谷胱甘肽效果。
首先，采用像实施例1那样的方法，分别制备了表12所述的菌株的前培养液。然后，将150μL的各前培养液分别接种于含半合成培养基15mL的200mL容量带挡板三角烧瓶中，所述半合成培养基中添加了柠檬酸，使得柠檬酸为50~150mM。30℃、搅拌速度200rpm振荡培养48小时。将像实施例1那样测定了培养后的酵母的GSH含有率(%)。
测定结果如表12所示。根据该结果，不仅是作为突变株的酿酒酵母KK101株、KK122株、KK124株、以及AB13株，对于作为野生株的酿酒酵母YNN27株、BY4742株、以及NCYC506株中的任何株，柠檬酸浓度为75~150mM的情况与50mM的相比，GSH含有率均提高10%以上。这些结果表明：本发明的酵母的培养方法不限于特定的突变株，在应用于野生株时，也能够得到本发明的富含谷胱甘肽效果。
[表12]
<实施例7>
对于各种酵母属菌，使用YPD培养基，采用本发明的酵母的培养方法进行酵母的培养，测定了培养后的酵母的GSH含有率(%)。在观察到GSH含有率柠檬酸浓度依赖性地增大的情况下，可以确认实现了本发明的富含谷胱甘肽效果。
首先，采用像实施例1那样的方法，分别制备了表13所述的菌株的前培养液。然后，将150μL的各前培养液分别接种于含YPD培养基15mL的200mL容量带挡板三角烧瓶中，所述YPD培养基中适当添加了柠檬酸，使得柠檬酸浓度为0~90mM。30℃、搅拌速度200rpm振荡培养48小时。将像实施例1那样测定了培养后的酵母的GSH含有率(%)。
测定结果如表13所示。由该结果可以确认：酿酒酵母的各菌株，无论是突变株还是野生株，在YPD培养基中均能实现本发明的谷胱甘肽富含效果。
[表13]
<实施例8>
对于酵母属以外的酵母，也采用本发明的酵母的培养方法进行酵母的培养，测定了培养后的酵母的GSH含有率(%)。具体地，将产朊假丝酵母1561株用含有柠檬酸的YPD培养基进行培养，测定了GSH含有率。
首先，采用像实施例1那样的方法，制备了产朊假丝酵母1561株的前培养液。然后，将15μL的各前培养液分别接种于含YPD培养基15mL的200mL容量带挡板三角烧瓶中(接种倍率0.1%)，所述YPD培养基中适当添加了柠檬酸，使得柠檬酸浓度为0~62.5mM。30℃、搅拌速度200rpm振荡培养40小时。将像实施例1那样测定了培养后的酵母的GSH含有率(%)。
测定结果如表14所示。根据该结果可以确认：在产朊假丝酵母1561株中也能够像酵母属菌那样得到本发明的富含谷胱甘肽效果。
[表14]
<实施例9>
对于属于假丝酵母属的其他菌株的酵母，也采用本发明的酵母的培养方法进行酵母的培养，测定了培养后的酵母的GSH含有率(%)。具体地，对于产朊假丝酵母1560株使用含有柠檬酸的糖蜜培养基(2)进行培养，测定了GSH含有率。
首先，采用像实施例1那样的方法，制备了产朊假丝酵母1560株的前培养液。然后，将45μL的各前培养液分别接种于含糖蜜培养基(2)15mL的200mL容量带挡板三角烧瓶中(接种倍率0.3%)，所述糖蜜培养基(2)中适当添加了柠檬酸，使得柠檬酸浓度为0~62.5mM。30℃、搅拌速度200rpm振荡培养24小时。将像实施例1那样测定了培养后的酵母的GSH含有率(%)。
测定结果如表15所示。根据该结果可以确认：在产朊假丝酵母1560株中，也可以像酵母属菌那样得到本发明的富含谷胱甘肽的效果。
[表15]
<实施例10>
对于酵母属菌，使用SD培养基，采用本发明的酵母的培养方法进行酵母的培养，测定了培养后的酵母的GSH含有率(%)。在观察到GSH含有率柠檬酸浓度依赖性地增大的情况下，视为可确认实现了本发明的谷胱甘肽富含效果。
首先，采用像实施例1那样的方法，分别制备表16所述的菌株的前培养液。然后，将150μL的各前培养液分别接种于装有适当添加了柠檬酸的YPD培养基15mL的200mL容量带挡板三角烧瓶中，使得柠檬酸浓度为50~150mM。30℃、搅拌速度200rpm振荡培养48小时。将像实施例1那样测定了培养后的酵母的GSH含有率(%)。
测定结果如表16所示。根据该结果可以确认，对于酿酒酵母的各菌株，无论突变株还是野生株，在SD培养基中也可以得到本发明的谷胱甘肽富含效果。根据这些结果可以说，本发明的谷胱甘肽富含效果并不特别受限于使用的液体培养基的组成，通过添加充分量的柠檬酸，使用任何培养基均可得到效果。
[表16]
<实施例11>
通过在培养开始后将液体培养基的柠檬酸浓度调整至20mM以上，采用本发明的酵母的培养方法进行酵母的培养，测定了培养后的酵母的GSH含有率(%)。根据实施例3的结果，以培养开始时间点的柠檬酸浓度为50mM的情况作为基准(对照)，在GSH含有率高于此的情况下，可以确认实现了本发明的富含谷胱甘肽效果。
采用像实施例1那样的方法，分别制备了酿酒酵母KK101株、KK122株、KK124株以及AB13株的前培养液。
然后，对于各菌株，分别如下进行培养。首先，将150μL的前培养液分别接种于5个含半合成培养基15mL的200mL容量带挡板三角烧瓶中。对于其中的2个烧瓶，分别添加柠檬酸，以使得柠檬酸浓度分别为50mM或90mM(初期添加50mM样品、以及初期添加90mM样品)。将这5个烧瓶于30℃、搅拌速度200rpm进行振荡培养。培养开始3小时后，对于未添加柠檬酸的3个烧瓶中的1个，添加柠檬酸，使得柠檬酸浓度为90mM，原条件继续进行培养(3小时后添加90mM样品)。而且，培养开始6小时后，对于未添加柠檬酸的余下的2个烧瓶中的1个，添加柠檬酸，以使得柠檬酸浓度为90mM，按照原样继续进行培养(6小时后添加90mM样品)。最后，在培养开始9小时后，对于未添加柠檬酸的余下的1个烧瓶，添加柠檬酸，以使得柠檬酸浓度为90mM(9小时后添加90mM样品)，原条件继续进行培养。培养开始48小时后，对于全部烧瓶结束培养，得到了5个样品。对于各菌株同样进行的培养操作，得到了合计20个样品。
图4为显示测定各样品中的酵母的GSH含有率(%)的结果的图。
而且，GSH含有率(%)的测定像实施例1那样进行。根据该结果可以确认：在全部菌株中，与柠檬酸的添加时期无关，添加了90mM的柠檬酸的样品的GSH含有率比初期添加50mM样品高。总之，根据这些结果可知确认：即使在培养开始后将液体培养基的柠檬酸浓度调整为对于实现本发明的谷胱甘肽富含效果而言充分的浓度的情况下，也能提高酵母的谷胱甘肽含量。此外，各菌株间多少存在差异，但基本上对于任何菌株而言，均是初期添加90mM样品的GSH含有率最高，且观察到柠檬酸的添加时期越晚GSH含有率越低的倾向。因此，可以认为：在培养开始后调整柠檬酸浓度的情况下，优选至少培养开始后9小时以内、即酵母的出芽繁盛的时期进行。
<参考例1>
考察了液体培养基中添加的柠檬酸是否作为碳源被同化。
首先，采用像实施例1那样的方法，制备了酿酒酵母KK101株的前培养液。
将150μL的前培养液接种于含下述培养基15mL的200mL容量带挡板三角烧瓶中：
添加了柠檬酸钠、使得柠檬酸浓度为50mM的半合成培养基(50mM含柠檬酸培养基)、添加了柠檬酸钠、使得柠檬酸浓度为90mM的半合成培养基(含90mM柠檬酸培养基)、或添加了磷酸钾、使得磷酸浓度为100mM的半合成培养基(含100mM磷酸培养基)。30℃、搅拌速度200rpm振荡培养48小时。酵母接种后培养前，预先采集部分培养上清，与培养结束后的上清一样，测定了这些上清中的柠檬酸的含量。柠檬酸量的测定使用市售试剂盒(商品名：F-试剂盒柠檬酸、Roche公司制造)，采用F-kit法进行。
图5为显示培养前后的各上清中的柠檬酸含量的测定结果的图。图中，“50mM柠檬酸钠”表示用50mM含柠檬酸培养基进行培养的结果，“90mM柠檬酸钠”表示用90mM含柠檬酸培养基进行培养的结果，“100mM磷酸钾”表示用100mM含磷酸培养基进行培养的结果。根据这些结果，在使用任何液体培养基的情况下，上清中的柠檬酸含量均是培养后比培养前增大一些。这可以认为是在培养过程中酵母生成了柠檬酸。即，这些结果表明，酵母未同化液体培养基中的柠檬酸，液体培养基中添加的柠檬酸未作为碳源被利用。
工业实用性
通过本发明的酵母的培养方法，可以简便地提高酵母属菌等酵母的谷胱甘肽含量，因此该培养方法特别可用于食品领域等。
保藏号
FERM BP-10390
Claims (14)
1.一种酵母培养方法，其包括将酵母在柠檬酸浓度为20mM以上的液体培养基中进行培养。
2.权利要求1所述的酵母培养方法，其中，所述液体培养基的柠檬酸浓度为200mM以下。
3.权利要求1或2所述的酵母培养方法，其中，培养开始时的液体培养基的柠檬酸浓度为20mM以上。
4.权利要求1所述的酵母培养方法，其中，培养开始时的液体培养基的柠檬酸浓度为小于20mM，且包括在酵母的生长状态为延滞期或对数生长期时将液体培养基的柠檬酸浓度调整至20~200mM。
5.权利要求1所述的酵母培养方法，其中，培养开始时的液体培养基的柠檬酸浓度为小于20mM，且包括在培养开始后9小时以内将液体培养基的柠檬酸浓度调整至20~200mM。
6.权利要求1~5中任一项所述的酵母培养方法，其中，所述酵母是酵母属(Saccharomyces)菌或假丝酵母属(Candida)菌。
7.权利要求1~5中任一项所述的酵母培养方法，其中，所述酵母是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或产朊假丝酵母(Candida utilis)。
8.提高酵母的谷胱甘肽含量的方法，其包括将酵母在柠檬酸浓度为20mM以上的液体培养基中进行培养。
9.酵母的制造方法，其包括回收采用权利要求1~7中任一项所述的酵母培养方法进行培养而得到的酵母。
10.酵母提取物的制造方法，其包括从采用权利要求1~7中任一项所述的酵母培养方法进行培养而得到的酵母抽提酵母提取物。
11.饮食品的制造方法，其包括使用选自下组中的1种以上的制备物作为原料：采用权利要求1~7中任一项所述的酵母培养方法进行培养而得到的酵母，以及从所述酵母制备得到的酵母提取物。
12.酵母提取物，其是从采用权利要求1~7中任一项所述的酵母培养方法进行培养而得到的酵母制备的。
13.调味料组合物，其含有采用权利要求1~7中任一项所述的酵母培养方法进行培养而得到的酵母、或权利要求12所述的酵母提取物。
14.饮食品，其含有采用权利要求1~7中任一项所述的酵母培养方法进行培养而得到的酵母、或权利要求12所述的酵母提取物。
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