DE69734528T2

DE69734528T2 - Durch pflanzen hergestelltes rekombinantes kollagen, verfahren zu ihrer herstellung und verwendung

Info

Publication number: DE69734528T2
Application number: DE69734528T
Authority: DE
Inventors: Veronique-Residence Sainte Madeleine Gruber; Jean-Yves Exposito; Florence Ruggiero; Jeanne Comte; Robert Garrone; Bertrand Merot; Philippe Bournat
Original assignee: Meristem Therapeutics SA
Current assignee: Meristem Therapeutics SA
Priority date: 1996-12-17
Filing date: 1997-12-17
Publication date: 2006-07-27
Anticipated expiration: 2017-12-18
Also published as: AU5563798A; US6617431B1; DE69734528D1; FR2757874B1; EP0951537A1; US20030096973A1; FR2757874A1; CA2274807A1; WO1998027202A1; EP0951537B1; ATE308614T1; JP2001507573A

Description

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Herstellung rekombinanter Kollagene durch Pflanzen, insbesondere einkettiges Kollagen des Typs I [α1 (I)₃] sowie ihre Verwendung.
Aus dem Stand der Technik ist WO 9603051 bekannt, das sich auf die Produktion von Kollagen in der Milch transgener Tiere bezieht.
Das Kollagen ist ein extrazelluläres, fasriges, tierisches Protein, das in tierischem Gewebe weit verbreitet ist (kürzlich ebenfalls bei bestimmten Pilzen entdeckt). Bestimmte Organe enthalten davon beträchtliche Mengen: Die Haut (im Bereich der Lederhaut), Sehnen, Knochen. Es handelt sich dabei nämlich um ein Polymer, dessen bemerkenswerte Eigenschaften auf jeden Fall von den Eigentümlichkeiten stammen, die von der Tripelhelix in bestimmten Domänen des Moleküls und von der Regelmäßigkeit ihrer supramolekularen Anordnung herrühren. Sie ist in die Organisation der extrazellulären Matrix involviert und umfasst etwa 20 verschiedene Moleküle, genannt „Typen", und ist mit römischen Ziffern bezeichnet (gegenwärtig von I bis XIX). Der charakteristische Tripelhelixbereich wird durch Wicklung dreier Peptide, wobei die α-Ketten, als linksgängige Helizes organisiert und verantwortlich für die einzigartige Konformation sind, als α-Helix des Kollagens gebildet. Diese spezifische Konformation resultiert aus der Wiederholung eines Aminosäuretriplets, Gly-X-Y, wobei X häufig Prolin und Y häufig Hydroprolin ist. Diese Aminosäuren sichern die Stabilität dieses Helixtyps. In einem Kollagenmolekül können die drei α-Ketten (indentifiziert durch einen Index in arabischen Ziffern), die in einer rechtsgängigen Superhelix angeordnet sind, identisch sein (α1 (oder alpha1)), aus zwei verschiedenen Arten bestehen (α1 und α2) oder alle verschieden sein (α1, α2, α3). Die Kollagenmoleküle weisen folglich helikale Domänen (oder Kollagendomänen) und nicht helikale Domänen auf. Sie assoziieren sich zu Polymeren eines gleichen oder verschiedener Typen. Auf diese Weise sind Kollagenfibrillen, die den Hauptbestandteil der Lederhaut ausmachen, hauptsächlich aus Kollagen des Typs I [α1 (I)₂ α2 (I)] zusammengesetzt, das zu Kollagen des Typs III [α1 (III)₃], des Typs V [α1 (V)₂ α2 (V)] assoziiert und umhüllt von Kollagen des Typs XII (α1 (XII)₃) und/oder XIV [α1 (XIV)₃] ist. Varianten können existieren: Z. B. ist im embryonalen Gewebe Kollagen des Typs I bestehend aus gleichen Ketten [α1 (I)₃] bekannt. Im Laufe der Biosynthese des Kollagens werden bestimmte Propyl- und Lysinreste hydroxiliert, kann die Addition von Galactose, möglicherweise komplettiert durch Glucose an bestimmen Hydroxilresten erfolgen und die klassischen N- und O-Glykosilierungen sind geeignet, an den nicht helikalen Domänen zu erfolgen. Die Erkennung der drei Ketten, die ein Molekül bilden, und der Beginn ihrer Anordnung stehen unter der Kontrolle des C-terminalen Endes (C-Propeptid). Das Kollagen des Typs I erfährt einen enzymatischen Schnitt an seinen nicht helikalen Enden, nachdem das Signalpeptid zuvor abgespalten worden war, die terminalen N- und C-Propeptide werden im Laufe der Reifung des Kollagens herausgeschnitten, wobei kurze terminate, nicht helikale Verlängerungen bestehen bleiben (die Telopeptide). Die gespaltenen Moleküle legen sich zu geordneten Polymeren zusammen (Kollagenfibrillen) und im Laufe der Zeit erfahren sie eine kreuzweise Vernetzung über Hydroxylysinreste des einen Moleküls mit den Telopeptiden eines benachbarten Moleküls. Die mechanischen und biologischen Eigenschaften des Kollagens werden seit langer Zeit ausgenützt: Einmal irreversibel vernetzt (Gerbverfahren) liefert es Leder; durch Hitze denaturiert, bringt es Gelatine und Leim hervor. Aber nicht nur im letzten Jahrzehnt lieferte Kollagen veritabel Biomaterial für pharmazeutische (blutstillende Kompressen, Schwämme, Pflaster, insbesondere Narbenbildende), medizinische (Prothesen wie etwa Herzklappen, Sehnen und Bänder, Hautersatz, Füllmaterial), zahnmedizinische (Zahlfleischimplantate) und kosmetische Verwendung (additiv, Mikrobehälter für parfümierte Substanzen).
Eine weitere, bessere Bekanntheit dieses Proteins und der Reinigungsmethoden haben zur Aufbereitung von Rinderkollagen und humanem Plazentakollagen in vordefinierter Form geführt: Gel, Schwamm, Pulver, Faden und Mikrosphäre beispielsweise. Das Engineering extrazellulärer Matrizes findet gleichfalls seine Anwendung in der Organbildung, die transfizierte Zellen enthalten, zur Anwendung in Gentherapie beispielsweise. Das hauptsächlich verwendete Kollagen ist Kollagen des Typs I (im Allgemeinen assoziiert mit Typ III) aufgrund der Fülle und der niedrigen Reinigungskosten und dessen Hauptquellen Rind (Haut ungeeignet für die Gerberei), Schaf (Haut und Därme) und Mensch (Plazenta) darstellen. Diese letzte Quelle bleibt ausschließlich pharmazeutischen und medizinischen Anwendungen vorbehalten.
Während die sehr nützlichen mechanischen und biologischen Eigenschaften des Kollagens ohne Zweifel bekannt sind, ist die Verwendung dieses Proteins aufgrund möglicher Kontaminationsrisiken durch nicht konventionelle infektiös Agenzien in Frage gestellt. Denn auch wenn die durch bakterielle oder virale Kontamination gebotenen Risiken perfekt beherrscht werden können, gilt dies nicht für Kontaminationen, die mit dem Agens des Typs Prion verbunden sind. Diese infektiösen Agenzien, die wie Proteine erscheinen, greifen in die Entwicklung animaler (Scrapie, bovine spongiforme Encephalopathie) und humaner (Creutzfeld-Jacob-Syndrom, Gerstmann-Straeussler-Syndrom, Kuru) degenerativer Encephalopatien ein. Die Zeitspanne bis zu ihrer möglichen Expression ist derart, dass formelle Kontrollen schwierig zu realisieren sind. Diese Risiken haben praktisch bereits die gesamte Vermarktung humanen Kollagens blockiert und die ordnungsgemäß erlassenen Verfügungen, die tierisches Kollagen betreffen, betreffen komplizierend auch die Reinigungsverfahren und erhöhen ihre Kosten.
Angesichts dieser Schwierigkeiten und im Hinblick auf die radikale Schädigung des Ansehens von Säugerkollagen, ist eine Lösung die Herstellung rekombinanten Kollagens, das man leicht aus einem System aufreinigen kann, das nicht geeignet ist, pathogene Risiken für den Menschen hervorzurufen und dessen Kosten für die Industrie nicht unerschwinglich sind. Die Erfinder haben deshalb eine Kollagenherstellung in Pflanzensorten erforscht und umgesetzt. Z. B. konnten wir humanes Kollagen des Typs I herstellen. Sein Molekül umfasst eine lange, ununterbrochene Tripelhelix und ist nach der Reinigung sehr wenig immunogen. Die Erfinder ließen beispielsweise die α1(I)-Kette exprimieren, um ein Molekül aus homogenen α1(I)₃-Ketten zu erhalten, die denen ähnlich ist, die in bestimmten Geweben existieren, insbesondere in embryonalen.
Tierische Zellen werden a priori besser der Expression von Säugergenen gerecht. Ihre Verwendung bereitet jedoch Probleme bei der Reifung der Proteine. Die enzymatische Ausstattung, die die posttransduktionelle Reifung realisiert, ist von einem Gewebe, einem Organ oder einer Sorte zur anderen verschieden. Z. B. wurde berichtet, dass die posttransduktionelle Reifung eines plasmatischen Proteins unterschiedlich sein kann, wenn es ausgehend von menschlichem Blut erhalten wird oder wenn es von einer rekombinanten Zelle hergestellt wird, wie Ovarzellen des chinesischen Hamsters oder aus der Milch transgener Tiere. Außerdem bringt die schwache Expressionsrate, die in Säugerzellen erreicht wird, in vitro Kulturen sehr große Volumina mit erhöhten Kosten mit sich. Die Herstellung rekombinanter Proteine aus der Milch transgener Tiere (Mäuse, Schafe und Kühe) erlaubt eine Verringerung der Herstellungskosten und Überwinden der Probleme im Bereich der Expressionsrate. Jedoch bleiben ethische Probleme und Probleme viraler und subviraler (Prionen) Kontamination.
Aus diesen Gründen könnte die Genübertragung von Säugetiergenen auf Pflanzenzellen einen Herstellungsweg für neue rekombinante Proteine in großer Menge bieten, zu einem reduzierten Herstellungspreis und ohne Risiko viraler oder subviraler Kontamination. 1983 haben zahlreiche Laboratorien entdeckt, dass es möglich ist, heterologe Gene in das Genom einer Pflanzenzelle zu transferieren und die transgenen Pflanzen ausgehend von diesen genetisch veränderten Zellen zu regenerieren. Alle Pflanzenzellen besitzen dann den genetisch veränderten Charakter, der durch sexuelle Befruchtung auf die Nachkommenschaft übertragen wird.
Dank dieser Arbeiten interessierten sich verschiedene Gruppen für die Herstellung rekombinanter Säugerproteine in Pflanzenzellen oder transgenen Pflanzen (Barta el al., 1986; Marx et al., 1982). Eines der ersten, wirklich signifikanten Ergebnisse in diesem Bereich war die Herstellung von Antikörpern in transgenen Tabakpflanzen. Um ein heterologes Protein in Samen zu exprimieren, der Speicherplatz von Proteinen bei Pflanzen ist, hat die Gruppe von Vandekerckhove die für Leu-Enkephaline kodierende Sequenz mit dem für Albumin 2S kodierenden Gen von Arabidopsis thaliana fusioniert. Mit dieser Konstruktion wurden transgene Arabidopsis-Pflanzen hergestellt, die das Leu-Enkephalin spezifisch in den Samen mit einer Expressionsrate in der Höhe von 0.1 % des Gesamtproteins exprimieren. 1990 wurde das humane Serumalbumingen in Zellen von Tabak und Kartoffeln transferiert. Unabhängig vom Ursprung des Signalpeptids (human oder pflanzlich) wurden Raten des humanen Serumalbumins in Höhe von 0.02% des Gesamtproteins erreicht, insbesondere in den Blättern von Kartoffeln. Andere rekombinante Säugerproteine wurden ebenfalls in Pflanzen produziert: Oberflächenantigene von Hepatitis B, Interferone, Mausantikörper anti-Streptokokkus mutans, Kariesagens, scFV Antikörperfragmente gegen Krebszellen, ein anti-Herpes Antikörper, Choleratoxin und der humane epidermale Wachstumsfaktor (EGF). Die Gesamtheit dieser Forschung hat zu zeigen erlaubt, dass die Herstellung rekombinanter Säugerproteine in Pflanzenzellen möglich ist, und dass die Synthesemechanismen der Proteine ausgehend von der DNA-Sequenz bei tierischen und pflanzlichen Zellen ähnlich sind. Es existieren dennoch zahlreiche Unterschiede zwischen pflanzlichen und tierischen Zellen, insbesondere im Bereich der Reifung polymannosehaltiger Glykane in komplexen Glykanen, oder außerdem im Bereich der Spaltstellen der Signalpeptide, die zudem nicht erlauben den Erhalt eines aktiven Säugerproteins zu garantieren oder ausreichend aktiv durch Transformation der Pflanzenzellen sind.
Kirivikko et al. (WO 93/07889) haben die Expression humanen Prokollagens beschrieben (Typ I und II). Ein Beispiel berichtet die Expression der alpha1- oder alpha 2-Kette des Prokollagens I oder II in den Säugerzellen HT1080. Ein anderes Beispiel beschreibt die Expression der alpha- und beta-Ketten der Prolin-4-Hydroxylase in den Sf9 Insektenzellen. Anregungen für Beispiele zur Expression rekombinanten Kollagens und P4H werden für die Bäckerhefen S. cerevisae und P. pastoris gegeben ohne Demonstration eines Resultats.
Eine Gruppe der Universität Louis Pasteur (FR 2 685 347) hat die Expression von Peptidoligomeren des Typs Pro-X-Y im Bakterium E. coli beschrieben.
Die Verwendung von Cerealien wurde von Rodriguez (WO 95/14099) für die Produktion von rekombinanten heterologen Proteinen in Samen von Cerealien im Laufe eines Mälzereiverfahrens beschrieben, währenddessen die Expression des rekombinanten Proteins induziert wird.
Moloney (WO 96/21029) beschreibt die Proteinenherstellung in Pflanzenzellen unter Bildung von Fusionsproteinen mit Oleosin.
Die Erfinder haben erforscht, dass die Verwendung von Pflanzenzellen, die mit einer geeigneten rekombinanten Nukleotidsequenz tranformiert wurden, erlauben Kollagen zu erhalten, insbesondere rekombinantes homotrimeres Kollagen des Typs I [α1 (I)]₃.
Ein anderes Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, Mittel zu schaffen, um ein solches Verfahren umzusetzen, insbesondere neue rekombinante Nukleotidsequenzen, genetisch transformierte Pflanzenzellen, genetisch transformierte Pflanzen oder Pflanzenteile (insbesondere Blätter, Stängel, Früchte, Sämerein oder Samen, Wurzeln), und Fragmente dieser Pflanzen oder Teile der genetisch transformierten Pflanzen.
Die Erfindung hat gleichfalls zum Ziel neue Kollagene zu schaffen, die von Pflanzen hergestellt werden, insbesondere homotrimeres Kollagen des Typs I [α1 (I)]₃.
Die Erfindung hat gleichfalls zum Ziel neue Proteinzusammensetzungen zu schaffen, die geeignet sind, im Rahmen der Umsetzung und der Schaffung pharmezeutischer, medizinischer, zahnmedizinischer, kosmetischer, biotechnologischer oder industrieller Zusammensetzungen verwendet zu werden.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG:
Die Erfindung betrifft:

– die Verwendung einer rekombinanten Nukleotidsequenz einerseits enthaltend eine cDNA, kodierend für eine oder mehrere Kollagenketten von Säugern, insbesondere solche, die als cDNA die Kollgenketten α1 enthalten, und andererseits Elemente, die es einer Pflanzenzelle ermöglichen, eine oder mehrere Kollagenketten zu produzieren, kodiert durch besagte cDNA, deren Promotor und Terminationsstelle der Transkription von der Transkriptionsmaschinerie der Pflanzenzelle erkannt werden, zur Transformation einer Pflanzenzelle im Hinblick auf die Gewinnung einer oder mehrerer Kollagenketten, ausgehend von diesen Zellen oder Pflanzen, die ausgehend von letzteren gewonnen werden, gegebenenfalls unter Bildung einer Tripelhelix,
– eine rekombinante Nukleotidsequenz, dadurch charakterisiert, dass sie einerseits die codierende Sequenz für eine oder mehrere Kollagenketten von Säugern enthält, insbesondere die der Kollagenkette α1 und andererseits die Elemente, die es einer Pflanzenzelle ermöglichen, eine oder mehrere Kollagenketten von Säugern, kodiert durch die besagte Sequenz, gegebenenfalls unter Bildung einer Tripelhelix, wobei Promotor und Terminationsstelle der Transkription durch die Transkriptionsmaschinerie der Pflanzenzelle erkannt werden.
– Ein Vektor, insbesondere ein Plasmid, enhaltend eine erfindungsgemäße Nukleotidsequenz, eingefügt an einer für seine Replikation nicht essentiellen Stelle.
– Eine Wirtszelle, insbesondere alle Bakterien wie Agrobacterium tumefaciens, transformiert mit dem erfindungsgemäßen Vektor,
– ein Verfahren zur Gewinnung einer oder mehrer Kollagenketten, gegebenenfalls unter Bildung einer Tripelhelix, dadurch charakterisiert, dass es umfasst:
– Transformation von Pflanzenzellen, insbesondere mit Hilfe einer erfindungsgemäßen Wirtszelle, die selbst mit einem erfindungsgemäßen Vektor transformiert ist, um auf diese Weise eine erfindungsgemäße rekombinante Sequenz in das Genom dieser Zellen einzufügen,
– die Gewinnung transformierter Pflanzen ausgehend von den oben genannten transformierten Zellen,
– die Rückgewinnung einer oder mehrer rekombinanter Kollagenketten, die in den oben genannten transformierten Zellen oder Pflanzen hergestellt werden, durch Extraktion nachfolgend durch Aufreinigung,
– eine Pflanze oder ein Teil einer Pflanze, Blätter und/oder Früchte und/oder Sämereien und/oder Pflanzenzellen, genetisch transformiert,

– eine oder mehrere rekombinante Kollagenketten, geeignet durch das erfindungsgemäße Verfahren erhalten zu werden,
– ein Kollagen (insbesondere Kollagen des Typs I, II, III, IV oder V), dadurch charakterisiert, dass es nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhalten wird,
– ein Produkt, insbesondere Gelatine, dadurch charakterisiert, dass es ausgehend von einer Kollagenkette des erfindungsgemäßen Kollagens erhalten wird,
– eine Pflanze oder ein Teil einer Pflanze, Blätter und/oder Früchte und/oder Sämereien und/oder Pflanzenzellen, die genetisch transformiert sind, dadurch charakterisiert, dass sie Kollagenketten des erfindungsge-mäßen Kollagens enthalten, wobei die Pflanzen insbesondere ausgewählt sind aus Raps, Tabak, Mais, Erbse, Tomate, Karotte, Weizen, Gerste, Kartoffel, Soja, Sonnenblume, Salat, Reis, Luzerne und Rübe.
– Die Verwendung der erfindungsgemäßen Pflanzen oder Teile der Pflanzen und/oder der erfindungsgemäßen Produkte (Kollagenketten, Kollagen) um pharmazeutische, medizinische, zahnmedizinische, kosmetische oder biotechnologische Zusammensetzungen zu erhalten,
– ein biologisches Material und eine pharmazeutische, medizinische, zahnmedizinische, kosmetische oder biotechnologische Zusammensetzung, dadurch charakterisiert, dass sie Pflanzen, Teile von Pflanzen oder Kollagenketten des erfindungsgemäßen Kollagens umfassen.

Eine erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung umfasst alle erfindungsgemäßen Zusammensetzungen, die eine Zusammensetzung bilden (oder zu ihrer Herstellung dienen), die die Vorbeugung oder Behandlung aller Pathologien erlauben, die mit einer Dysfunktion des Kollagens verbunden sind, so wie eine Kompresse zur Vernarbung von Wunden, ein blutstillender Verband, ein Verband gegen Wundliegen, ein blutstillendes Pulver oder ein Verband für Brandwunden.
Eine erfindungsgemäße medizinische Zusammensetzung umfasst insbesondere alle erfindungsgemäßen Zusammensetzungen, die eine Vorrichtung zum Einfügen von Hornhaut, einen Gerinnungsfilm zur Resektion von Organen (insbesondere Leber), ein Abdeckmaterial zur Vorbeugung von Anhaftung und von Fisteln, eine Zusammensetzung zur Herstellung vaskulärer oder kardialer Prothesen (Klappen), eine Führungshilfe zur Regeneration von Nerven, Abdeckmaterial für Knochen oder innerhalb des Körpers, ein Container zum Herauslösen aktiver Substanzen (Hormone, Wachstumsfaktoren, Antibiotika, Antikrebsmittel, antiinflammatorische Agenzien beispielsweise), eine Kompressionsvorrichtung (z. B. um Harninkontinenz zu reduzieren), Hautersatz, chirurgischen Faden, Injektionsmaterial für Schönheitschirurgie (Ausgleich von Hautvertiefungen oder Gesichtsumgestaltungen beispielsweise) bilden (oder zu ihrer Herstellung dienen).
Eine erfindungsgemäße zahnmedizinische Zusammensetzung umfasst insbesondere alle erfindungsgemäßen Zusammensetzungen, die Zahnfleischverband oder Abdeckmaterial bilden (oder zu ihrer Herstellung dienen).
Eine erfindungsgemäße kosmetische Zusammensetzung umfasst insbesondere alle erfindungsgemäßen Zusammensetzungen, die ein Additiv für eine Zubereitung (Cremen, Pomaden, Schminke, Salben) bilden (oder zu ihrer Herstellung dienen).
Eine erfindungsgemäße medizinische Zusammensetzung umfasst insbesondere alle erfindungsgemäßen Zusammensetzungen, die ein System bilden (oder zu deren Herstellung dienen) von: Herstellung von Zellkulturschalen oder -flaschen.
Die Erfindung betrifft gleichfalls ein Produkt, insbesondere Gelatine, dadurch charakterisiert, dass es ausgehend von den Kollagenketten, des Kollagens oder ihrer erfindungsgemäßen Proteinderivate erhalten wird.
Normalerweise wird die Gelatine ausgehend von Kollagen durch Erhitzen von tierischem Gewebe (insbesondere Knochen und Haut) in Wasser und anschließende Trocknung zubereitet (Parkany M., 1984). Diese Aufbereitung zerstört die Sekundärstruktur des Kollagens und führt deshalb zu wichtigen Veränderungen der Löslichkeit und der mechanischen Eigenschaften des Produkts. Die Gelatine ist der Hauptbestandteil des Leims. In kaltem Wasser quillt sie und ist unlöslich. In warmem Wasser löst sie sich und bildet eine sehr viskose Lösung, die nach dem Abkühlen geliert, wenn der Gelatinegehalt mehr als 1 % beträgt. Zur Herstellung chirurgischer Prothesen werden Lösungen mit einem Gelatinegehalt von 10 bis 35% verwendet. [0026] Die Eigenschaft der Gelatine in warmem Wasser löslich zu sein, macht sie für zahlreiche ernährungsmäßige und industrielle Anwendungen nutzbar. Sie wird oft in Form von Pulver oder feinen Blättern hergestellt. Anschließend können die gesuchten mechanischen Eigenschaften von Glycerol, Sorbitol oder vernetzenden Agenzien zugefügt werden, beispielsweise bei der Herstellung von Gelatineblöcken.
Die Gelatine ist gleichfalls im Bereich der Biomedizin einsetzbar, beispielsweise als Schwamm.
Vorteilhafterweise enthalten die erfindungsgemäßen rekombinanten Nukleotidsequenzen eine (oder mehrere) Sequenz(en), die für ein Peptid kodiert (kodieren), das für die Adressierung des rekombinanten Polypeptids in ein bestimmtes Kompartiment der Pflanzenzelle verantwortlich ist, insbesondere in das endoplasmatische Retikulum oder in die Vakuolen oder zur Außenseite der Zelle, in die Pektozellulosewand oder den extrazellulären Raum, der auch Apoplast genannt wird.
Unter den Terminatoren der Transkription, die geeignet sind für die Transformation von Pflanzenzellen im Rahmen der vorliegenden Erfindungen verwendet zu werden, kann der Terminator polyA 35S des Blumenkohlmosaikvirus (CaMV) zitiert werden oder der Terminator polyA NOS, der mit der nicht-kodierenden 3' Region des Nopalinsynthasegens des Plasmids Ti des Agrobacteriums tumefaciens korrespondiert, der Herkunft des Nopalins.
Als solches hat die Erfindung alle rekombinanten Nukleotidsequenzen zum Gegenstand, wie sie oben beschrieben sind, die stromabwärts der cDNA oder ihrer Sequenzderivate den Terminator polyA 35S des CaMV oder den Terminator polyA NOS des Agrobacteriums tumefaciens enthalten.
Unter den Transkriptionspromotoren, die geeignet sind, für die Transformation von Pflanzenzellen im Rahmen der vorliegenden Erfindungen verwendet zu werden, können zitiert werden:

– Der Promotor 35S (P35S) oder vorteilhafterweise der konstitutive zweifache Promotor 35S (Pd35S) des CaMV, wobei diese Promotoren die Expression der erfindungsgemäßen rekombinanten Polypeptide in der Gesamtheit der Pflanze erlauben, die erhalten wird, ausgehend von den erfindungsge-mäßen, transformierten Zellen und die in dem Artikel von Kay et al., 1987, beschrieben sind,
– der Promotor PCRU des Cruciferingens von Rettich, der die Expression erfindungsgemäßer rekombinanter Peptide ausschließlich in den Sämereien (oder Samen) der Pflanze erlaubt, die erhalten wird, ausgehend von den erfindungsgemäßen, transformierten Zellen und die in dem Artikel von Depigny-This et al., 1992, beschrieben sind,
– die Promotoren PGEA1 und PGEA6, die mit der nicht kodierenden 5' Region des Gens für das Reserveprotein GEA1 bzw. GEA6 in Samen von Arabidopsis thaliana korrespondieren (Gaubier et al., 1993) und die eine spezifische Expression in den Samen erlauben,
– der chimäre Promotor SuperPromotor PSP (Ni M et al., 1995), erstellt durch Fusion einer Dreifachwiederholung eines Transkriptionsaktivierungselements des Promotors des Octopinsynthasegens von Agrobacterium tumefaciens, eines Transkriptionsaktivierungselements des Promotors des Manopinsynthasegens und des Manopinsynthasepromotors von Agrobacterium tumefaciens,
– der Aktinpromotor aus Reis gefolgt von einem Aktin-Intron aus Reis (PAR-IAR), enthalten in dem Plasmid pAct1-F4, beschrieben von McElroy et al. (1991),
– der HMGW Promotor (High Molecular Weight Gluteine – Hochmolekulargewicht Glutenin) aus Gerste (Anderson O. D. et al., 1989),
– der Promotor des γZeingens aus Mais (Pγzein) enthalten in dem Plasmid pγ63, beschrieben von Reina et al. (1990), und der die Expression im Albumin der Sämerei von Mais erlaubt.

Als solches hat die Erfindung alle rekombinanten Nukleotidsequenzen wie oben beschrieben zum Gegenstand, die stromaufwärts der cDNA oder seiner Sequenzderivate, den konstitutiven zweifachen Promotor 35S (Pd35S) des CaMV oder den Promotor PCRU des Cruciferingens von Rettich oder die Promotoren PGEA1 oder PGEA6 von Arabidopsis thaliana oder den SuperPromotor PSP von Agrobacterium tumefaciens oder den Promotor PAR-IAR aus Reis, den HMGW Promotor aus Gerste oder der Promotor pγZein aus Mais enthalten.
Die Sequenzen, die für ein Adressierungspeptid kodieren, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendet werden, können pflanzlichen, humanen oder tierischen Ursprungs sein.
Unter den Sequenzen, die für ein Adressierungspeptid pflanzlichen Ursprungs kodieren, können zitiert werden:

– Die Nukleotidsequenz aus 69 Nukleotiden (gezeigt in den nachfolgenden Beispielen), die für das Präpeptid (Signalpeptid) aus 23 Aminosäuren des Sporamin A in der Süßkartoffel kodiert, wobei das Signalpeptid den Eintritt des erfindungsgemäßen rekombinanten Polypeptids in das Sekretionssystem der erfindungsgemäß transformierten Pflanzenzellen erlaubt (zur grundsätzlichen Information in das endoplasmatische Retikulum),
– die Nukleotidsequenz aus 42 Nukleotiden (gezeigt in den nachfolgenden Beispielen), die für das N-terminale Propeptid zur vakuolären Addressierung, bestehend aus 14 Aminosäuren des Sporamin A, in der Süßkartoffel kodiert, die die Akkumulation der erfindungsgemäßen rekombinanten Polypeptide in den Vakuolen der erfindungsgemäßen transformierten Pflanzenzellen erlaubt,
– die Nukleotidsequenz aus 111 Nukleotiden (gezeigt in den nachfolgenden Beispielen), die für das Präpropeptid aus 37 Aminosäuren des Sporamin A, gebildet aus dem N-terminalen Bereich in Richtung des C-terminalen Bereichs aus 23 Aminosäuren des oben genannten Signalpeptids, kodiert, gefolgt von 14 Aminosäuren des oben genannten Propeptids, wobei dieses Präpropeptid den Eintritt der erfindungsgemäßen rekombinanten Polypeptide in das Sekretionssystems und ihre Akkumulation in den Vakuolen der erfindungsgemäßen transformierten Pflanzenzellen erlaubt, die drei oben genannten Sequenzen wurden in den Artikeln von Murakami et al. 1986 und Matsuoka et al. 1991 beschrieben,
– das carboxyterminale Propeptid des Gerstenlektins wurde insbesondere in den Artikeln von Schroeder et al., 1993 und Bednarek et al., 1991 beschrieben,
– und das PRS (Pathogenesis Related Protein – Pathogenese Zugehöriges Protein, Cornelissen et al. 1986), das die Sekretion erlaubt.

Man kann gieichfalls unter den Sequenzen, die für ein Adressierungspeptid kodieren, diese zitieren, die für die Peptide KDEL, SEKDEL und HDEL kodieren und die eine Adressierung in das endoplasmatische Retikulum erlauben.
Die Erfindung hat gleichfalls alle rekombinanten Nukleotidsequenzen wie oben beschrieben zum Gegenstand, die eine kodierende Sequenz für ein vollständiges oder den Teil eines vakuolären Adressierungspeptids enthalten, insbesondere dasjenige, des Sporamin A der Süßkartoffel, wobei die für das vakuoläre Adressierungspeptid kodierende Sequenz in der rekombinanten Nukleotidsequenz zwischen der für ein Signalpeptid kodierenden Sequenz und der Sequenz, die für die besagte cDNA oder ihre Sequenzderivate kodiert, derart angeordnet ist, dass die erste N-terminale Aminosäure des vakuolären Adressierungspeptides mit der letzten C-terminalen Aminosäure des Signalpeptids verbunden ist, und dass die letzte C-terminale Aminosäure des besagten Adressierungspeptids mit der ersten N-terminalen Aminosäure des durch die cDNA oder ihre Sequenzderivate kodierten Polypeptids, in dem durch die rekombinante Nukleotidsequenz kodierten Proteins, verbunden ist.
Die Erfindung hat gleichfalls alle rekombinanten Nukleotidsequenzen wie oben beschrieben zum Gegenstand, die eine kodierende Sequenz für ein vollständiges oder einen Teil eines vakuolären Adressierungspeptids enthalten, insbesondere dasjenige des Gerstenlektins, wobei die Sequenz, die für ein vakuoläres Adressierungspeptid kodiert, in der rekombinanten Nukleotidsequenz stromabwärts der für die cDNA oder ihre Sequenzderivate kodierenden Sequenz derart angeordnet ist, dass die erste N-terminale Aminosäure des vakuolären Adressierungspeptids mit der letzten C-terminalen Aminosäure des Polypeptids, das durch die cDNA oder ihre Sequenzderivate kodiert ist, in dem durch die rekombinante Nukleotidsequenz kodierten Proteins, verbunden ist.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER
1: Immunotransfer, der ein Beispiel eines positiven Ergebnisses zeigt, das durch Aufbereiten von mit den konstrukten pBIOC706 (angezeigt 706, Pflanze Nr. 45, Spuren 2, 3) und pBIOC707 (angezeigt 707, Pflanze Nr. 2, Spuren 4, 5) transformierten Pflanzen hervorgeht. Diese Ergebnisse sind mit denen zu vergleichen, die von nicht transformierten Kontrollpflanzen erhalten werden (Spuren 6, 7). Spur 1 zeigt die elektrophoretische Wanderung der Kollagen I Kontrolle: Die Bande, die mit α2(I) korrespondiert, wandert auf Höhe der 116 KDa Bande des Molekularmassenstandards, die Bande α1(I) wandert etwas darüber. Die Spuren 2, 4, 6, entsprechen den Überständen der Extraktion im sauren Milieu, die Spuren 3, 5 und 7 entsprechen den Pellets. Das Konstrukt pBIOC706 erzeugt eine Hauptbande, die durch den Antikollagen I Antikörper erkannt wird, die genau auf Höhe der α1(I)-Kontrollbande (Spur 1) wandert; das Konstrukt pBIOC707 erzeugt eine Hauptbande, die bei 140 KDa wandert. Die Extraktionen im sauren Milieu erscheint jedoch unvollständig, da sich die gleichen Banden in den entsprechenden Pelletextraktionen wiederfinden (Spur 3 für pBIOC706, Spur 5 für pBIOC707). Die entsprechenden Spuren in den Kontrollpflanzen (Spuren 6 und 7) sind negativ.
2: Immunotransfer, der einige Beispiele positiver Pflanzen, transformiert mit den Konstrukten pBIOC706 (Pflanzen Nr. 40: Spuren 2, 3 und Nr. 45: Spuren 4, 5) und pBIOC707 (Pflanze Nr. 1: Spuren 6, 7; Pflanze Nr. 2: Spuren 8, 9; Pflanze Nr. 14: Spuren 10, 11) zeigt, extrahiert in neutralem Milieu. Spur 1 zeigt die elektrophoretische Wanderung des Kontrollkollagens I: Die Bande, die α2(I) entspricht, wandert auf Höhe der Bande von 116 KDa des Molekularmassenstandards, die Bande α1(I) wandert etwas oberhalb. Die Spuren 2, 4, 6, 8 und 10 korrespondieren mit den Überständen, extrahiert in neutralem Milieu, die Spuren 3, 5, 7, 9 und 11 korrespondieren mit den Pellets. Die Pflanzen 40 und 45 (Konstrukt PBIOC706) erzeugen zwei Hauptbanden, die vom anti-Kollagen I Antikörper erkannt werden, die jeweils auf Höhe der α1(I)-Kontrollbande (Spur 1) und bei 140 KDa wandern. Die Pflanzen 1, 2 und 14 (Konstrukt PBIOC707) erzeugen zwei Hauptbanden, die bei 140 KDa bzw. 160 KDa wandern. Die Extraktion in neutralem Milieu erscheint vollständig, da sich keine Bande in der korrespondierenden Extraktion des Pellets wiederfindet (Spuren 3 und 5 für PBIOC706, Spuren 7, 9 und 11 für PBiOC 707). Die Spuren, die mit den Kontrollpflanzen (nicht gezeigt) korrespondieren, sind negativ. Alle positiven Pflanzen zeigen das gleiche elektrophoretische Profil.
3: Immunotransfer, der die Modifikationen des elektrophoretischen Profils positiver Pflanzen, transformiert mit den Konstrukten pBIOC707 (Bezeichnung A und B) und pBIOC706 (Bezeichnung C), in Gegenwart (+) oder Abwesenheit (-) eines reduzierenden Agens (DTT) zeigt. Die Spuren 1 und 8 zeigen die elektrophoretischen Wanderungen des Kontrollkollagens I. Bezeichnung A: Pflanze Nr. 2 in saurem Milieu extrahiert. Die einzige Bande nach der Reduktion (Spur 2), die nach der Extraktion in saurem Milieu zu beobachten ist, zeigt eine etwas schnellere Wanderung in Abwesenheit eines reduzierenden Agens (Spur 3). Dieses Ergebnis vermittelt, dass die zu beobachtende Bande mit der α1(I)-Kette korrespondiert, die das N-Propeptid (Anwesenheit von Disulfidbrücken innerhalb der Ketten) umfasst. Bezeichnung B: Pflanze Nr. 2 (Spuren 4 und 5) und Pflanze Nr. 1 (Spuren 6 und 7) in neutralem Milieu extrahiert. In Abwesenheit eines reduzierenden Agens (Spuren 5 und 7) findet sich die höhere Bande, die bei Anwesenheit eines reduzierenden Agens (Spuren 4 und 6) bei 160 KDa wandert, auf Höhe der Bande 7 (3 Ketten α-assoziiert). Die Bande, die in Anwesenheit eines reduzierenden Agens bei 140 KD wandert, wandert in Abwesenheit eines reduzierenden Agens etwas schneller wie bei Bezeichnung A zu beobachten ist. Bezeichnung C: Pflanze Nr. 40 (Spuren 9 und 10) und Pflanze Nr. 45 (Spuren 11 und 12), extrahiert in neutralem Milieu. In diesem Fall ist erneut nur die Wanderung der höheren Bande in Abwesenheit eines reduzierenden Agens modifiziert und findet sich hauptsächlich, wie bei Bezeichnung B zu beobachten ist, auf Höhe der Bande γ. Diese Ergebnisse zeigen, dass die höhere Bande jedes der Konstrukte pBIOC706 und pBIOC707 das C-Propeptid umfasst. Zudem konnten die Disulfidbrücken zwischen den Ketten, die sich zwischen den C-Propeptiden des nativen Moleküls ausbilden, in der Pflanze realisiert werden. Die Brückenbildung der C-Propeptide ist dafür bekannt, dass sie ermöglicht, dass die drei Ketten in die richtige Position gebracht werden und zudem die Bildung der Tripelhelix zu initiieren. Die unteren Banden (140 KDa für das Konstrukt pBIOC707 und 120 KDa für das Konstrukt pBIOC706) könnten schließlich aus der Spaltung der C-Propeptiddomäne der rekombinanten α1(I)-Kette stammen. Diese Spaltung ist ein wichtiger Schritt in der Reifung des nativen Kollagens, da sie für die Polymerisierung der Kollagenfasern nötig ist.
4 und 5: Zeigen die Fragmente, die für die pBIOC21-Kollagenkonstrukte verwendet wurden.
6:

– Teil A: Trypsinverdau des Kollagenextrakts aus mit dem Konstrukt pBIOC706 (Pflanze 45) transformierten Pflanzen, analysiert mittels Elektrophorese auf einem Acrylamidgel 6 %. Spur 1: Kollagen unverdaut. Spur 2: Kollagen mit Trypsin bei 25 °C verdaut, die Bande, die mit dem Kollagen korrespondiert, ist immer anwesend und bestätigt eine tripelhelikale Struktur des Kollagenextrakts. Spur 3: Hitzedenaturiertes Kollagen (50°C, 20 Minuten), anschließend Trypsinverdau, wobei die mit dem Kollagen korrespondierende Bande als Zeuge der Wirksamkeit des Trypsins verschwindet, wenn das Kollagen denaturiert ist.
– Teil B: Mikrographie eines Abdrucks, erhalten durch Kontrastwechsel des gereinigten Kollagens, ausgehend von Pflanze 45. Die Kollagenmoleküle sind als Stäbchen von 280 bis 300 nm Länge und 1,4 nm Durchmesser zu sehen, charakteristisch ist die Zusammenlegung aller zentralen Domänen des Kollagens I zu einer Tribelhelix. Vergrößerung: X 75 000.

7: Konstrukt ADEFG, vollständiges proα1(I): Protein- und Nukleotidsequenz
VORBEREITUNG I: Klonierung der cDNA, die für die vollständige humane proα1(I)-Kette kodiert.
1/Vorbereitung einer MG-63 cDNA-Bank
Die MG-63 Zellen (ATCC-CRL Nr. 1427) stammen von einem humanen Osteosarkom. Etwa 28 Millionen MG-63 Zellen, kultiviert im DMEM (Dulbecco's modified Eagle medium, Sigmar TM) werden von Kulturschalen durch Behandlung mit Trypsin 0.25 %, EDTA 0.05 % (Etylendiamintetraacetat) gelöst. Die Zellen werden mit 1000 g für 10 Min. bei 4°C zentrifugiert, und das Zellpellet wird mit dem RNA-PIusTM Kit (BIOPROBE TM Systems) behandelt, das eine Aufreinigung der Gesamt-RNA erlaubt. Diese Behandlung wird nach den von BIOPROB TM gegebenen Empfehlungen durchgeführt. Eine Menge von 950 μg Gesamt-RNA wird anschließend gereinigt.
Die Poly(A)+ RNA wird durch Chromatographie über eine Oligo-dT Zellulosesäule (Boehringer Mannheim) abgetrennt, folgend der von (Aviv at al., 1972) beschriebenen Technik. Eine 0.1 N Sodasuspension, enthaltend 0,2 g Oligo-dT Zellulose wird auf eine Säule aufgebracht. Diese Säule wird anschließend mit 3 ml sterilem Milli-Q-Wasser gewaschen, anschließend mit 15 ml eines 1X Auftragpuffers (Tris-Cl 20 mM, pH 7.6; NaCl 0,5 M; EDTA 1 mM, pH 8; Natriumlaurylsarcosinat 0,1 %). Der Efflux der Säule wird so äquilibriert, dass er dann einen pH von weniger als 8 aufweist.
Zu einer Gesamt-RNA-Lösung (950 μg), inkubiert für 5 Min. bei 65 °C, wird ein Volumen 2X Auftragpuffer zugefügt (Tris-Cl 40 mM, pH 7,6; NaCl 1 M; EDTA 2 mM, pH 8; Natriumlaurylsarcosinat 0.2 %). Diese Mischung wird auf Raumtemperatur abgekühlt bevor sie auf die Oligo-dT Zellulosesäule aufgetragen wird. Das Eluat wird zurückbehalten, 5 Minuten bei 65 °C inkubiert, auf Raumtemperatur abgekühlt und wiederholt der Oligo-dT Zellulosesäule zugeführt. Die Säule wird anschließend mit 10 ml 1X Auftragpuffer (Tris-Cl 20 mM, pH 7.6; NaCl 0.5 M; EDTA 1 mM, pH 8; Natriumlaurylsarcosinat 0.1 %) gewaschen, was die Elution der Poly(A)- RNA erlaubt, während die Poly(A)+ RNA durch ihre 3' polyadenylierten Enden an der dT-Zellulose-Matrix gebunden bleibt. Zu der Poly(A)+ RNA Oligo-dT Säule wird anschließend 2 ml Lösungspuffer (Tris-Cl 10 mM, pH 7.6; EDTA 1 mM, pH 8; Laurylsulfat 0.05 %) zugefügt und das Poly(A)+ RNA Eluat wird mit 0.3 M Natriumacetat auf einen pH von 5.2 eingestellt. Zu dieser Lösung werden 2.2 Volumen Ethanol 100 zugegeben und die Poly (A)+ RNA wird für 24 Stunden bei –20 °C gefällt.
Nach der Präzipitation wird die Lösung mit 12 000 g für 30 Min. bei 4 °C zentrifugiert. Das Poly(A)+ RNA Pellet wird mit 10 ml Ethanol 70 gewaschen, lyophilisiert und in 50 μl sterilem Milli-Q-Wasser wieder aufgenommen. Die Konzentration dieser Poly(A)+ RNA Fraktion beträgt 1.2 μg/μl.
Zur Herstellung der cDNA-Bank haben wir von Amersham vertriebene Kits verwendet. Diese Kits sind:

– cDNA synthesis system plus, RPN 1256
– cDNA rapid adaptor ligation module, RPN 1712
– cDNA rapid cloning module, RPN 1716
– lambda-DNA in vitro packaging module, RPN 1717

Jeder Schritt erfolgt gemäß dem vom Hersteller gelieferten Protokoll.
Die Poly(A)+ RNA Lösung wird 5 Min. bei 65 °C inkubiert, dann auf Eis abgekühlt, um sekundäre Strukturen zu eliminieren, die in bestimmter RNA vorhanden sind. Diese Lösung wird in 2 Fraktionen aufgeteilt und anschließend erfolgt die Paarung entweder von dT Primern (12 – 18 mer) oder Zufallsprimern (Hexanucleotid) mit der Poly(A)+ RNA, wobei die Synthese des ersten DNA-Strangs (komplementär zur Matrizen-RNA) durch die reverse Transkriptase erfolgt. Zu der RNA/DNA Hybridmischung wird Ribonuclease H zugefügt und DNA Polymerase I von Escherichia coli. Die Ribonuclease H erlaubt zufälliges Schneiden des RNA-Strangs in dem RNA/DNA Komplex. Die DNA-Polymerase fügt an die freien 3'-OH Enden, die durch die Ribonuclease H erzeugt werden, Nukleotide aufgrund seiner 5'-3' Polymeraseaktivität an. Die 5'-3' Exonukleaseaktivität der DNA-Polymesse I erlaubt es Ribonukleotide an 5' zu eliminieren und die Synthese des zweiten cDNA Strangs zu verfolgen. Nach Inaktivierung der Enzyme durch Behandlung bei 70°C für 10 Minuten, erlaubt die Zugabe der T4 DNA Polymerase den Erhalt von DNA Doppelsträngen an den freien Enden aufgrund seiner 3'-5' Exonukleaseaktivität. Die EcoRI Adaptoren werden anschließend mit den offenen Enden der cDNA (komplementäre DNA) verbunden. Die freien Adaptoren werden auf einer von Amersham TM hergestellten Säule eliminiert und die mit EcoRI versehene cDNA wird in die EcoRI Stellen des Vektors lambda MOSEIox legiert. Nach der Ligation erfolgt eine in vitro Verkapselung, die der letzte Schritt bei der Herstellung der cDNA Bank ist. Etwa 800000 unabhängige cDNA-Klone werden auf diese Weise erhalten.
II/Klonierung der cDNA, die für die humane proα1(I)-Kette kodiert.
a/Vorbereitung der Bakterien ER1647, die geeignet sind, von Phagen infiziert zu werden.
Dieser Bakterienstamm ist recD-, mrcA- (Amersham TM). Diese Bakterien werden auf Platten mit L-Broth/Agar 1.5 % (L-Broth: Für 1 l, 10 g Trypton, 5 g Hefeextrakt, 10 g NaCl) unter Zusatz von Tetracyclin (50 μg/ml) gehalten. Eine ER1647 Kolonie wird in 10 ml von L-Broth/Tetracyclin (50 μg/ml) eingebracht und die Kultur wird unter Schütteln bei 37°C für 8 Stunden inkubiert. Die ER1647 Kultur wird anschließend bei 4°C für 10 Minuten mit 3000 g zentrifugiert und das Bakterienpellet wird in 2 ml kaltem MgSO₄ 10 mM resuspendiert.
b/Herstellung von Nitrocelluloserepliken
Für die Aufbereitung werden 4 Schalen (12 × 12 cm) L-Broth/Agar 1.5 % mit 25000 unabhängigen cDNA-Klonen hergestellt. Dazu werden zu 250 μl der ER1647 Bakterien, behandelt mit 10 mM MgSO₄, 25000 Phagen der cDNA-Bank zugegeben. Alles zusammen wird bei 37°C für 15 Min. inkubiert, wobei die Zeit für eine effiziente Infektion der Bakterien nötig ist. Nach Einbringen von 7 ml L-Broth/Agarosemedium 0.7 % (Sigmar TM), im flüssigen Zustand bei 45°C gehalten, wird die Mischung auf Kulturplatten aufgebracht (12 × 12 cm).
Diese Schalen werden bei 37°C für 7 – 8 Stunden inkubiert, wobei die Zeit nötig ist bis zum Erscheinen der Lyseplaques. Sie sind dann für den Transfer der DNA der Lyseplaques auf die Nitrocelluloserepliken verwendbar. Die verwendete Nitrocellulose ist Hybond-C von Amersham TM. Für jede Schale werden 2 Repliken durch einfachen Kontakt der Lyseplaque/Nitrocellulosereplik hergestellt. Die Kontaktzeit für die erste Replik beträgt 2 Min. und 4 Min. für die zweite. Die Phagen-DNA, die sich auf den Repliken befindet, wird für 4 Min. in einer Soda 0,5 M, NaCl 1,5 M Lösung denaturiert. Die Sodalösung wird dann durch zwei anschließende Bäder für 3 Min. in einer NaCl 1.5 M, Tris-Cl 0.5 M Lösung pH 7 neutralisiert. Die Nitrocellulose-repliken werden dann in einer 2X SSC (NaCl 0.3 M, Trinatriumcitrat 30 mM) Lösung gespült, auf Whatman 3MM Papier getrocknet und die denaturierte Phagen-DNA wird auf den Nitrocelluloserepliken durch Inkubation für 2 Stunden bei 80°C fixiert.
d/Vorbereitung spezifischer Sonden für humanes Kollagen Typ I
Zwei Syntheseoligonucleotide werden verwendet, um spezifische Sonden für die proα1(I)-Kette zu erhalten.
Oligonucleotid B1OC5, 5'-CTCGGGTTTCCACACGT-3', eine komplementäre Sequenz zu den Nukleotiden 152 – 178, die für die proα1(I)-Kette spezifisch ist.
Oligonucleotid BIOC7, 5'-GCAAGACAGTGATTGAA-3', Sequenz 4268 – 4274, spezifisch für die proα1(I)-Kette.
Diese Oligonukleotide werden mit ³²P markiert, unter Verwendung von Gamma P32ATP mit 3000 Ci/mmol (Amersham TM) und der T4 Polynukleotidkinase (Promega).
Diese Mischung wird 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Die Reaktion wird durch Zugabe von 1 μl EDTA 0.5 M, pH 8 abgestoppt.
d/Hybridisierung der Nitrocelluloserepliken
Die Nitrocelluloserepliken werden in 50 ml einer Prähybridisierungslösung gelegt und bei 50°C für 15 Minuten inkubiert.

Prähybridisierungslösung:
6XSSC (NaCl 0.3 M, Trinatriumcitrat 90 mM)
Laurylsulfat 0.1 %
Natriumpyrophosphat 0.05 %
Polyvinylpyrolidon 0.02 %
Bovinserumalbumin 0.02 %
Ficoll 400 0.02 %
Denaturierte Lachsspermien-DNA
von 100 μg/ml (Boehringer Mannheim)

Die beiden Sonden BIOC5 und BIOC7 werden dann zugegeben und die Hybridisierung wird für 2 Stunden bei 45°C durchgeführt. Nach der Hybridisierung durchlaufen die Nitrocelluloserepliken drei aufeinanderfolgende Bäder von 15 Minuten, um unspezifische Hybridisierung zu eliminieren.
Erstes Bad: 6XSSC (NaCl 0.9 M, Trinatriumcitrat 90 mM), Natriumpyrosphosphat 0.05 %, 15 Min. bei Raumtemperatur.
Zweites Bad: 3XSSC (NaCl 0.45 M, Trinatriumcitrat 45 mM), Natriumpyrophosphat 0.05%, 15 Min. bei Raumtemperatur.
Drittes Bad: 6XSSC (NaCl 0.9 M, Trinatriumcitrat 90 mM), Natriumpyrophosphat 0.05%, für 15 Min. bei 45°C.
Die Filter werden dann auf Plastik gelegt, von einem transparenten Plastikfilm umgeben und bei –80°C für 24 Stunden in Anwesenheit eines Films einer Autoradiografie unterzogen.
Diese Handhabung erlaubte uns, mehrere positive Klone in 2-facher Ausführung zu erhalten. Jeder positive Lyseplaque auf den zwei Repliken wird mit Hilfe einer Pasteurpipette aufgenommen und in 1 ml SM-Puffer (NaCl 100 mM, MgSO₄ 8 mM, Tris-Cl 50 mM, pH 7.5, Gelatine 0.1%) gelagert.
Eine zweite Aufbereitung erlaubte uns, verschiedene positive Klone aufzureinigen, wobei die Hybridisierungs- und Waschbedingungen der Nitrozelluloserepliken die gleichen waren wie für die erste Aufbereitung. Die bei der zweiten Aufbereitung gereinigten Klone werden in 500 μl SM aufgenommen und gelagert.
e/Automatische Subklonierung von cDNA-Klonen in ein Plasmid durch das Cre-Iox-System.
Der Bakteriophagenvektor lambda MOSEIox umfasst ein internes Plasmid, das an seinen beiden Enden durch Iox sites von 34 bp flankiert ist, die vom Bakteriophagen P1 stammen. Auf diese Weise können die Plasmidsubklone durch Infektion eines Bakterienstammes erhalten werden, der die Cre-Rekombinase P1 exprimiert, die die Iox-Sequenzen, die das interne Plasmid des Bakteriophagen lamda MOSEIox umgibt, erkennen und die das Herausschneiden des Plasmids durch spezifische Rekombination im Bereich der Iox-Sequenzen erlaubt.
In unserem Fall haben wir den Bakterienstamm BM25.8 verwendet, der für P1 und lambda-imm434kan lysogen ist, wobei diese zwei Piasmide bei Zugabe von Kanamycin (50 μg/ml) und Chloramphenicol (50 μg/ml) zu dem Kreuzungsmedium des Stammes BMB25.8 beibehalten werden.
In der Praxis werden 10 ml L-Broth, komplementiert mit Kanamycin und Chloramphenicol (50 μg/ml), mit BM25.8 Bakterin angeimpft und unter Schütteln bei 37°C inkubiert. Wenn die OD600 dieser Kultur 0,9 beträgt, wird die Inkubation gestoppt und die Bakterien können für drei Tage bei 4°C aufbewahrt werden.
Ein Aliquot der Phagensuspension des positiven cDNA-Klons (10 μl) wird mit 200 μl der BM25.8 Bakterien in Kontakt gebracht und die Mischung wird bei 37°C für 15 Min. inkubiert, um eine effiziente Infektion zu erhalten. Die Mischung wird dann in einer Schale L-Broth/Agar 1.5%, supplementiert mit Ampicillin (50 μg/ml) gelagert und die Schalen werden bei 37°C für 12 Stunden inkubiert. Die Anwesenheit des Ampicillins erlaubt die Selektion der Bakterien, die einen Bakteriophagen integriert haben und noch spezifischer diese, wo die spezifische Cre-Iox-Rekombination erfolgte, wobei das entstehende Plasmid ein Ampicillin-Resistenzgen und die Insert-cDNA erneut eine EcoRI Klonierungsstelle besitzt.
f/Charakterisierung der cDNA-Klone alpha22 und 1alpha3
Zwei der positiven komplimentären DNA-Klone werden später verwendet. Das sind die cDNA-Klone alpha 22 und 1alpha3.
Im Hinblick auf die Seqeunzierung dieser Klone werden 3 ml L-Broth, supplementiert mit Ampicillin (50 μg/ml), entweder mit alpha22 oder mit 1alpha3 angeimpft. Diese Mischungen werden unter Schütteln bei 37°C über Nacht inkubiert. [0068] Zur Aufreinigung der Plasmid-DNA wird die Kultur zuerst mit 1500 g für 10 Min. bei 4°C zentrifugiert und das Bakterienpellet wird mit dem Wizard Kit (Promega TM) behandelt, das die Aufreinigung von supercoiled Plasmid-DNA erlaubt. Diese Behandlung wird nach dem vom Hersteller vorgegebenen Protokoll durchgeführt. Etwa 10 μg Plasmid-DNA werden mit diesem Kit aufgereinigt, wenn das verwendete Plasmid das Plasmid MOSEIox ist.
Der letzte Schritt ist die Sequnzierung der beiden Enden der cDNA-Klone alpha 22 und 1alpha3, um zu bestimmen, welche Informationen sie umfassen.
Um zwei Sequenzierreaktionen durchzuführen, werden 40 μl DNA, d. h. 7 bis 8 μg, die mit dem Wizardsystem gereinigt wurden, durch Zugabe von 10 μl von 2N NaOH denaturiert und für 10 Min. bei Raumtemperatur inkubiert. Nach der Neutralisierung durch Zugabe von 12 μl 3 M Natriumacetat pH 5.2, wird die einsträngige DNA durch Zugabe von 2.5 Volumen Ethanol 100 und Inkubation bei – 20°C für 30 Min. präzipitiert. Nach der Präzipitation wird die DNA bei 4°C für 10 Min. mit 12 000 g zentrifugiert, mit 1 ml Ethanol 70 gewaschen, lyophilisiert und in 20 μl Milli-Q-Wasser wieder aufgenommen.
Die Sequenzierreaktionen werden mit dem „T7 Sequenzing" Kit (Pharmacia) durchgeführt, das die Kettenabbruchtechnik und die T7 DNA Polymerase verwendet. Das Radioelement ist [α-35S]-dATP (Amersham TM) mit 1350 Ci/mmol. Die Sequenzierreaktionen wurden nach den Empfehlungen des Herstellers durchgeführt.
Prinzip. Nach der Anlagerung des Primers an die einsträngige DNA-Matrize, wird eine Elongationsreaktion durch die T7 DNA Polymerase in Anwesenheit von dGTP, dTTP, dCTP und von 35-SdATP durchgeführt. Die Zugabe eines Überschusses von kaltem 4 dNTP sowie von ddATP (Didesoxyadenosintriphosphat) oder von ddGTP oder von ddCTP oder von ddTTP, erlaubt die getrennte Durchführung von 4 Terminationsreaktionen. Bei Inkorporation eines ddNTP blockiert die Abwesenheit der Hydroxylgruppe die Elongationsreaktion.
In unserem Fall sind die verwendeten Primer die Oligonukleotide T7 Gen 10 und T7 Terminator (Amersham TM), die sich auf dem einen oder dem anderen Teil der cDNA-Klone alpha22 und 1 alpha3 befinden.

T7 Gen Primer, 5'-TGAGGTTGTAGAAGTTCCG-3'
T7 Terminator Primer, 5'-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3'

Die Sequenzanalyse wird auf einem Polyacrylamid-Harnstoff-Gel (6%, 7 M) durchgeführt.
Sequenzgel
Die Ausgangslösung ist: 39.6 g Harnstoff, 8.25 ml 10X TBE (Trisborat 9.0 M, EDTA 20 mM pH 8), 12.32 ml Acrylamid 40% (38 g Acrylamid, 2 g Bisacrylamid, qsp 82.5 ml Milli-Q-Wasser).
Nach dem Lösen des Harnstoffs werden 400 μl Ammoniumpersulfat 10 % und 66 μl TEMED (N, N, N', N'-Tetramethylethylendiamin) zugegeben und das Gel wird gegossen. Nach dem Polymerisieren wird das Gel für 30 Min. auf 60 kW vorgeheizt. Die Proben werden dann aufgetragen und bei einer Stromstärke von 60 kW der Trennung unterzogen. Nach der Elektrophorese wird das Gel auf ein Whatman 3MM Papier transferiert, für 30 Min. unter Vakuum bei 80°C getrocknet und einer direkten Autoradiographie bei Raumtemperatur unterzogen. Das Lesen der Sequenzen erlaubte uns zu bestätigen, dass die cDNA-Klone alpha22 und 1alpha3 für die humane proα1(I)-Kette kodieren.
Genauer, der cDNA-Klon 1alpha3 umfasst 83 bp des 5' nicht-translatierten Teils und die ersten 1920 Basen, die für die humane proα1(I)-Kette kodieren. Der cDNA-Klon alpha22 umfasst die Sequenz, die für die Aminosäuren 171 bis 1454 der humanen proα1(I)-Kette kodieren und ungefähr 500 bp der 3' nicht-translatierten Region.
Die Übereinstimmung des erhaltenen Gens wird im Hinblick auf beschriebene Sequenzen verifiziert (LI S-W, 1994).
VORBEREITUNG II: Klonierung der DNA-Fragmente, die für die Herstellung der erfindungsgemäßen Konstrukte benötigt werden.
1/Fragment A
Das Fragment A besitzt vier Nukleotide (–4 bis –1) stromaufwärts des Translationsinitiationscodons ATG, wobei die Gesamtheit der Sequenz für das Signalpeptid (Nukleotide 1 bis 66) und für die Aminopropeptiddomäne (Nukleotide 67 bis 479) der humanen proα1(I)-Kette kodiert. Nukleotide 474, 475 und 477, CTT, werden durch die Basen GCA ersetzt, was die Schaffung einer NheI (GCTAGC) Restriktionsstelle in den Positionen 474 bis 479 erlaubt. Diese Schaffung der NheI Stelle schließt den Austausch der Aminosäuren Asn und Phe durch Lysin und Leucin in den Positionen 158 und 159 der humanen proα1(I)-Kette ein.
Amplifikation des Fragments A
Zwei Syntheseoligonukleotide wurden verwendet.
Sense-Oligonukleotid, BIOC85,

5'TATCCGCGGAAGCTTAGACATGTTCAGCTTTGTGGACCTCCGGCTCCTGC-3'

Dieses Oligonukleotid umfasst 5' (unterstrichene Nukleotide) die Sequenzen, die die Schaffung von zwei Restriktionsstellen, SacII (CCGCCG) und HindIII (AAGCTT) erlauben, die als Klonierungsstellen verwendet werden. Nach diesen beiden Stellen sind die Nukleotide –4 bis –1 und 1 bis 31 eingeschlossen, die spezifisch für die kodierende Sequenz der humanen proα1(I)-Kette sind.
Antisens-Oligonukleotid, BIOC 83,

5'TATTCTAGAGCTAGCTTTCCTCCGAGGCCAGGGGGTCCGGGAGGT-3'

Dieses Oligonukleotid zeigt 5' (unterstrichene Nukleotide) die Sequenzen, die die Schaffung der Restriktionsstellen XbaI (TCTAGA) und NheI (GCTAGC) erlauben. Die XbaI Stelle wird für die Klonierung des Fragments A verwendet werden, während die NheI Stelle, beschrieben im Informationsteil, dazu dient, die für die Aminopropeptiddomäne kodierende Sequenz abzugrenzen. Nach diesen beiden Stellen findet sich die zu den Nukleotiden 445 bis 474 der kodierenden Sequenz der humanen proα1(I)-Kette komplementäre Sequenz wieder.
Die verwendete Matrizen-DNA ist der cDNA Klon 1 alpha3, der 83 bp des 5' nicht-translatierten Teils und die ersten 1920 Basen, die für die humane proα1(I)-Kette kodieren, umfasst.
Um das Fragment A zu erhalten, waren die Amplifikationsbedingungen der PCR (Polymerase Chain Reaction):
Am Ende der 25 Zyklen wird eine zusätzliche Extension von 5 Min. bei 72°C durchgeführt.

Ausgangslösung:
75 mM Tris-Cl pH 9,0 (bei 25°C)
20 mM (NH₄)₂SO₄
0.01 % (Gewicht/Volumen) Tween 20
1.5 mM MgCl₂
BIOC85, 0.5 μM
BIOC83, 0.5 μM
jedes dNTP, 0.2 mM
Matrize, 1 ng des cDNA-Kons 1 alpha3
(0.25 Einheiten der DNA Polymerase)

Klonierung des Fragments A
Nach der Amplifikation wird die Lösung mit einem Volumen Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (Verhältnis 50/48/2) extrahiert. Nach zwei Minuten der Zentrifugation mit 10 000 g wird die wässrige Phase aufgenommen und mit einem Volumen Chloroform/Isoamylalkohol (Verhältnis 24/1) extrahiert. Nach einer Zentrifugation für einige Sekunden mit 10 000 g wird die wässrige Phase entnommen, auf eine Konzentration von 0.2 M NaCl eingestellt und zwei Volumen Alkohol 100 zugegeben. Die DNA wird für 2 Stunden bei –20°C präzipitiert, dann bei 4°C für 10 Min. mit 12 000 g zentrifugiert. Das DNA-Pellet wird mit 1 ml Ethanol 70 gewaschen, lyophylisiert und in 34 μl sterilem Milli-Q-Wasser resuspendiert.
Zu dieser DNA-Lösung werden 4 μl Verdaupuffer C (Promega TM), 1 μl Restriktionsenzym SacII (10 U/μl; Promega TM) und 1 μl XbaI Enzym (12 U/μl; Promega) zugegeben. Der Verdau wird für 2 Stunden bei 37°C durchgeführt.
Nach dem enzymatischen Verdau werden 8 μl Stopppuffer (30% Sucrose, 0.25% Bromphenolblau) der DNA-Lösung zugegeben, die durch Elektrophorese auf einem 2% Agarosegel mit niedrigem Schmelzpunkt Nu Sieve-GTG (FMC) bei konstanter Spannung von 60 Volt analysiert wird. Der Elektrophoresepuffer ist 0.5X TBE (Trisborat 45 mM, EDTA (Ethylendiamintetraacetat) 1 mM, pH 8). Nach der Wanderung wird das Gel 15 Min. in einer 0.5X TBE Lösung, enthaltend 40 ng/ml Ethidiumbromid, gefärbt.
Die Bande, die mit Fragment A korrespondiert, wird unter UV ausgeschnitten, in 350 μl einer Tris 20 mM pH 8, EDTA 1 mM pH 8 Lösung aufgenommen und für 5 Min. bei 65°C inkubiert. Nach dem Auflösen der Agarose wird die Probe mit einem Volumen Phenol extrahiert und für 5 Min. mit 10 000 g zentrifugiert. Die wässrige Phase wird abgenommen, mit einem Volumen Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (Verhältnis 50/48/2) extrahiert und für 2 Min. mit 10 000 g zentrifugiert. Die wässerige Phase wird mit Chloroform/Isoamylalkohol (Verhältnis 24/1) extrahiert und einige Sekunde mit 10 000 g zentrifugiert. Die wässerige Phase wird abgenommen, auf eine Endkonzentration von 0.2 M NaCl eingestellt und 16 Stunden bei –20°C nach Zugabe von 2 Volumen Ethanol 100 präzipitiert.
Nach der Zentrifugation bei 4°C für 10 Min. mit 12 000 g wird das DNA-Pellet mit 1 ml Ethanol 70 gewaschen, lyophilisiert und in 20 μl sterilem Milli-Q-Wasser aufgenommen. Ein Aliquot von 2 μl sowie 500 ng der HindIII-EcoRI Fragmente des Phagen Lambda (Promega TM) werden auf einem 2% Agarose Typ II (Sigma TM) analysiert, welches uns erlaubte, die Konzentration der gereinigten Lösung des Fragments A SacII/XbaI von 30 ng/μl abzuschätzen.
Das für die Klonierung des Fragments A verwendete Plasmid ist der Vektor pBluescript II SK(+), vertrieben durch Strategene TM. Dieses Plasmid umfasst ein Ampicillinresistenzgen.
Eine Menge von 200 ng des Plasmids pBluescript II SK(+) wird einem Verdau mit den Restriktionsendonukleasen SacII und XbaI unterzogen. Dieser Verdau wird in einem Volumen von 20 μl in Anwesenheit von 2 μl Puffer C (Promega TM), 1 μl SacII Enzym (10 U/μl; Promega TM) und 1 μl XbaI Enzym (12 U/μl; Promega TM) für 2 Stunden bei 37°C durchgeführt. Nach dem Verdau werden 2 μl Auftragpuffer (30% Sucrose, 0.25% Bromophenolblau) der Mischung zugegeben und auf einem 0.8% Agarosegel Seaplague GTG (FMC, Rockland) bei einer konstanten Spannung von 60 Volt analysiert, wobei der Elektrophoresepuffer 0.5X TBE war. Nach der Elektrophorese wird das Gel für 15 Min. in einer Ethidiumbromidlösung von 40 ng/ml gefärbt. Die DNA Bande, die mit dem SacII und XbaI liniarisierten pBluescript II SK(+) korrespondiert, wird entnommen und in 350 μl einer Tris 20 mM pH 8, EDTA 1 mM pH 8 Lösung aufgenommen. Diese Probe wird für 5 Min. bei 65°C inkubiert, mit einem Volumen Phenol extrahiert und für 5 Min. mit 10 000 g zentrifugiert. Die wässerige Phase wird abgenommen, mit einem Volumen Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (Verhältnis 50/48/2) extrahier und für 2 Min. mit 10 000 g zentrifugiert. Die wässerige Phase wird mit Chloroform/Isoamylalkohol (Verhältnis 24/1) extrahiert und einige Sekunden mit 10 000 g zentrifugiert. Die wässerige Phase wird abgenommen, auf eine Endkonzentration von 0.2 M NaCl eingestellt und 16 Stunden bei –20°C nach Zugabe von zwei Volumen Ethanol 100 präzipitiert.
Nach einer Zentrifugation bei 4°C 10 Min. mit 12 000 g, wird das DNA Pellet mit 1 ml Ethanol 70 gewaschen, lyophilisiert und in 20 μl sterilem Milli-Q-Wasser wieder aufgenommen, um eine Lösung von 10 ng/μl des Plasmids pBluescript II SK(+) SacII/XbaI zu erhalten.
Die Ligation des Fragments A (SacII/XbaI) mit dem Plasmid pBluescript II SK(+) (SacII/XbaI) wird für 4 Stunden bei Raumtemperatur durchgeführt.
Die für die Transformation verwendeten Bakterien sind DH5 alpha (Gibco BRL, Paris). Der Genotyp dieses Stammes ist: supE 44Δ-IacU 169(∅80 lacZΔM15) hsdR 17 recA 1 endA 1 gyrA 96 thi- 1 relA 1. Um kompetente Bakterien zu erhalten, werden 5 ml einer Kultur in exponentieller Wachstumsphase (OD600 von 0.7) mit 1500 g für 15 Min. bei 4°C zentrifugiert. Das Bakterienpellet wird dann in 500 μl kaltem CaCl₂ 100 mM resuspendiert. Für die Transformation werden 10 μl der Ligationsmischung mit 200 μl der kompetenten DH5 alpha Bakterien gemischt und die Probe wird auf 4°C für 30 Min. gehalten. Nach einem Hitzeschock bei 42°C für 40 Sekunden werden 500 μl L-Broth (10 g Trypton, 5 g Hefeextrakt, 10 g NaCl, pro Liter Medium) zugegeben und die Mischung wird für 30 Min. bei 37°C inkubiert.
Diese Mischung sowie 20 μl von IPTG (Isopropylthio-beta-D-galactoside; 200 mM) und 20 μl von X-Gal (4 Chloro-3 indolyl-beta-D galactoside; 20 mg/ml) werden nachfolgend auf eine L-Broth-Agar Schale (L-Broth plus Agar 1.5%) supplementiert mit Ampicillin (50 μl/ml) gegeben und die Schale wird für 15 Min. bei 37°C inkubiert. Die Zugabe von IPTG und von X-Gal erlaubt die Verwendung eines Farbtests, der die Wiedererkennung eines Plasmids erlaubt, das ein Insert inkorporiert hat.
Denn der Bakterienstamm DH5 alpha ist Lac- und produziert eine nicht funktionelle Form der beta-Galaktosidase. Der Vektor pBluescript II SK(+) besitzt ein DNA Segment des Laktoseoperons von Escherichia coli, das für den aminoterminalen Teil dieses Enzyms kodiert. Die Induktion der Synthese durch IPTG erlaubt eine alpha-Komplementation, die die Aktivität dieser Galaktosidase wiederherstellt. Bei Anwesenheit eines Galactose-Analogons, dem X-Gal, produzieren die Bakterien blaue Pigmente, die die Bildung einer farbigen Bakterienkolonie bewirken. Der Vektor pBluescript II SK(+) besitzt eine multiple cloning side (umfassend die Stellen SacII/XbaI), die in dem LacZ Gen angeordnet ist. Die Insertion des Fragments A in diese Klonierungsregion hebt die alpha-Komplementation auf, was das Auftreten weißer Bakterienkolonien bewirkt.
Mehrere weiße Kolonien werden getestet. Dazu werden sie einzeln in 3 ml L-Broth supplementiert mit Ampicillin (50 μl/ml) aufgenommen und diese Kulturen werden unter Schütteln über Nacht bei 37°C inkubiert.
Zur Aufreinigung der Plasmid-DNA wird die Kultur zuallererst mit 1500 g für 10 Min. bei 4°C zentrifugiert und das Bakterienpellet wird mit dem Wizard Kit (Promega) behandelt, das die Aufreinigung von supercoild Pasmid-DNA erlaubt. Diese Handhabung erfolgt nach dem vom Hersteller vorgegebenen Protokoll. Etwa 10 μg Plasmid-DNA werden mit Hilfe dieses Kits gereinigt, wenn das verwendete Plasmid pBluescript II SK(+) ist.
Eine Aliquot (2 μl von den 60 erhaltenen) wird einem enzymatischen Verdau mit den Restriktionsendonukleasen SacII/XbaI unterzogen, um die Klonierung des Fragments A zu verifizieren. Nach der Elektrophorese wird das Gel für 15 Min. in einer Ethidiumbromidlösung von 40 ng/ml gefärbt und die Anwesenheit des Fragments A unter UV verifiziert.
Der letzte Schritt dient der Verifizierung der Unversehrtheit der Sequenz des Fragments A, da die Technik der Amplifikation durch PCR (polymerase chain reaction) Mutationen einführen kann.
Die Sequenzierreaktionen werden mit dem Kit „T7 Sequencing" Kit (Pharmacia TM) durchgeführt, das die Kettenabbruchtechnik verwendet und die T7 DNA Polymerase (vgl. Vorbereitung 1) erlaubt, die Unversehrtheit der Sequenz des Fragments A zu validieren.
2/Fragment B
Das Fragment B besitzt 3 Basen (TAA) stromaufwärts der Sequenz, die für das Signalpeptid PRS (PATHOGENESIS-RELATED PROTEIN S) (Nukleotide 1 bis 75) kodiert und die Basen 67 bis 77 der Sequenz, die für den aminoterminalen Teil der Aminopropeptiddomäne der humanen proα1(I)-Kette kodiert. Die Nukleotide 73, 74 und 77, GAG, werden durch die Basen CTC substituiert, welche die Schaffung einer NheI (GCTAGC) Restriktionsstelle in den Positionen 72 bis 77 erlauben. Diese Schaffung der NheI Stelle bewirkt die Substitution der Aminosäuren Glu und Gly durch Leucin und Alanin in den Positionen 25 und 26 der humanen proα1(I)-Kette.
Amplifikation des Fragments B
Drei Syntheseoligonukleotide (BIOC95 und BIOC93 und 045) wurden verwendet.
Matrizenoligonukleotid, 045,

5'-TAAATGAACTTCCTCAAAAGTTTCCCCTTTTATGCCTTCCTT TGTTTTGGCCAATACTTTGTAGCTGTTACTCATGCTGCC-3'

Dieses Oligonukleotid umfasst fettgedruckt die Sequenz, die mit der des Signalpeptids PRS korrespondiert (PATHOGENESIS-RELATED PROTEIN S). Es dient als DNA Matrize bei der Amplifikation durch PCR (Polymerase Chain Reaction) des Fragments B.
Sens Oligonukleotid, BIOC95,

5'-TATCCGCGGAAGCTTTAAATGAACTTCCTCAAAAGTTTCCCC-3'

Dieses Oligonukleotid umfasst 5' (unterstrichene Nukleotide) die Sequenzen, die die Schaffung von zwei Restriktionsstellen, SacII (CCGCGG) und HindIII (AAGCTT), erlauben, die als Klonierungsstellen verwendet werden. Nach diesen zwei Stellen sind die Nukleotide –3 bis –1 und 1 bis 24 eingeschlossen, die spezifisch für die das Signalpeptid PRS (PATHOGENIC-RELATED-PROTEIN S) kodierende Sequenz sind.
Antisens Oligonukleotid, BIOC93,

5'-ATGCTAGCTCTTGAGCATGAGTAACAGCTACAAAGTA-3'

Dieses Oligonukleotid zeigt 5' (unterstrichene Nukleotide) die Sequenz, die die Schaffung der NheI (GCTAGC) Restriktionsstelle erlaubt. Die NheI Stelle, beschrieben im Informationsteil, dient dazu, die für die Aminopropeptid kodierende Domäne abzugrenzen. Nach der NheI Stelle findet sich die komplementäre Sequenz zu den Nukleotiden 67 bis 71 der für die humane proα1(I)-Kette kodierenden Sequenz und zu 52 bis 75 der für das für Signalpeptid PRS (PATHOGENESIS-RELATED PROTEIN S) kodierenden Sequenz wieder.
Klonierung des Fragments B
Nach der PCR Amplifikation wird die Lösung mit einem Volumen Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (Verhältnis 50/48/2) extrahiert, wie beschrieben unter Vorbereitung II1. Das DNA-Pellet wird mit 1 ml Ethanol 70 gewaschen, lyophilisiert und in 40 μl sterilem Milli-Q-Wasser resuspendiert.
Ein Aliquot von 4 μl ebenso wie 500 ng der HindIII-EcoRI Fragmente des Phagen Lambda (Promega TM) werden auf 2% Agarosegel Typ II (Sigma TM) analysiert, was uns erlaubte, die Konzentration der gereinigten Lösung des Fragments B von 20 ng/μl abzuschätzen.
Das zum Klonieren des Fragments B verwendete Plasmid ist der Vektor pBluescript II SK(+) vertrieben durch Stratagene. Dieses Plasmid umfasst ein Ampicillin-Resistenzgen.
Eine Menge vom 200 ng des Plasmids pBluescript II SK(+) wird einem Verdau mit der Restriktionsendonuklease EcoRV (GATATC) unterzogen, das erlaubt einen liniarisierten Vektor mit freien Enden zu erhalten. Nach dem Verdau werden 80 μl TE (Tris 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8) hinzugefügt und die Lösung wird mit einem Volumen Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (Verhältnis 50/48/2) extrahiert wie unter Vorbereitung II1 beschrieben.
Nach der Zentrifugation bei 4°C für 10 Min. mit 12 000 g wird das DNA-Pellet mit 1 ml Ethanol 70 gewaschen, lyophilisiert und in 20 μl sterilem Milli-Q-Wasser aufgenommen, um eine Lösung von 10 ng/μl des Plasmids pBluescript II SK(+) EcoRV zu erhalten.
Die Ligation des Fragments B mit dem Plasmid pBluescript II SK(+) (EcoRV) wird für 4 Stunden bei Raumtemperatur durchgeführt.
Die für die Transformation verwendeten kompetenten Bakterien sind DH5 alpha (Gibco BRL, Paris), vgl. oben.
Mehrere weiße Kolonien werden getestet. Dazu werden sie einzeln in 3 ml L-Broth supplementiert mit Ampicillin (50 μg/ml) aufgenommen und diese Kulturen werden unter Schütteln über Nacht bei 37°C inkubiert.
Zur Aufreinigung der Plasmid-DNA werden die Kulturen zuallererst mit 1500 g für 10 Min. bei 4°C zentrifugiert und das Bakterienpellet wird mit dem Wizard Kit (Promega TM) nach dem vom Hersteller vorgegebenen Protokoll behandelt.
Ein Aliquot (2 μl von 60 erhaltenen) wird einem enzymatischen Verdau mit den Restriktionsendonukleasen BamHI und HindIII unterzogen, um die Klonierung des Fragments B zu verifizieren. Die Restrikionsstellen BamHI und HindIII sind auf der einen und der anderen Seite der Klonierungstelle EcoRV lokalisiert. Nach der Elektrophorese wird das Gel für 15 Min. in einer Ethidiumbromidlösung von 40 ng/ml gefärbt und die Anwesenheit des Fragments B unter UV verifiziert.
Die Sequenzierreaktionen werden mit dem „T7 Sequencing" Kit (Pharmacia TM) durchgeführt, das die Kettenabbruchtechnik verwendet und die T7 DNA Polymerase (vgl. Vorbereitung 1) erlaubt, die Unversehrtheit der Sequenz des Fragments B zu validieren.
3/Fragment C
Das Fragment C besitzt fast die gesamte Sequenz, die für die Aminopropeptiddomäne (Nukleotide 72 bis 479) der humanen proα1(I)-Kette kodiert. Die Nukleotide 73, 74 und 77, GAG, werden durch die Basen CTC ersetzt, was die Schaffung einer NheI Restriktionsstelle (GCTAGC) in den Positionen 72 bis 77 erlaubt. Diese Schaffung der NheI Stelle bewirkt die Substitution der Aminosäuren Glu und Gly durch Leucin und Alanin in den Positionen 25 und 26 der humanen proα1(I)-Kette. Die Nukleotide 474, 475 und 477, CTT, werden durch die Basen GCA ersetzt, was die Schaffung einer NheI Restriktionsstelle (GCTAGC) in den Positionen 474 bis 479 erlaubt. Die Schaffung dieser NheI Stelle bewirkt die Substitution der Aminosäuren Asn und Phe durch Lysin und Leucin in den Positionen 158 und 159 der humanen proα1(I)-Kette.
Amplifikation des Fragments C
Zwei Syntheseoligonukleotide wurden verwendet.
Sens Oligonukleotid, BIOC855,

5'-ATGCTAGCCCAAGTCGAGGGCCAAGACGAAG-3'

Dieses Oligonukleotid umfasst 5' (unterstrichene Nukleotide) die Sequenz, die die Schaffung der NheI Restriktionsstelle (GCTAGC) erlaubt, die als Klonierungsstelle verwendet wird. Die NheI Stelle, beschrieben im Informationsteil, dient dazu, die für die Aminopropeptiddomäne (aminoterminales Ende) kodierende Sequenz abzugrenzen.
Nach dieser Stelle sind die Nukleotide 78 bis 100 eingeschlossen, die spezifisch sind für die Sequenz, die für die humane proα1(I)-Kette kodiert.
Antisens Oligonukleotid, BIOC83,

5'TATTCTAGAGCTAGCTTTCCTCCGAGGCCAGGGGGTCCGGGAGGT-3'

Dieses Oligonukleotid zeigt 5' (unterstrichene Nukleotide) die Sequenzen, die die Schaffung der Restriktionsstellen XbaI (TCTAGA) und NheI (GCTAGC) erlauben. Die XbaI Stelle, verwendet für die Klonierung des Fragments A, wird im Rahmen des Fragments C nicht verwendet. Die NheI Stelle, beschrieben im Informationsteil, dient dazu, die für die Aminopropeptiddomäne (carboxyterminales Ende) kodierende Sequenz abzugrenzen. Nach diesen zwei Stellen findet sich die Sequenz wieder, die zu den Nukleotiden 445 bis 474 der für die humane proα1(I)-Kette kodierende Sequenz komplementär ist.
Die verwendete Matrizen DNA ist die cDNA des Klons 1alpha3, die 83bp des 5' nicht-translatierten Teils und die ersten 1920 Basen umfasst, die für die humane proα1(I)-Kette kodieren.
Klonierung des Fragments C
Nach der Amplifikation wird die Lösung mit einem Volumen Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (Verhältnis 50/48/2) extrahiert, wie unter Vorbereitung II1 beschrieben. Das DNA-Pellet wird mit 1 ml Ethanol 70 gewaschen, lyophilisiert und in 40 μl sterilem Milli-Q-Wasser resuspendiert.
Ein Aliquot von 4 μl sowie 500 ng der Fragmente HindIII-EcoRI des Phagen Lambda (Promega TM) werden auf einen 2% Agarosegel Typ II (Sigma TM) analysiert, was uns erlaubte, die Konzentration der Lösung des gereinigten Fragments C von 20 ng/μl abzuschätzen.
Das für die Klonierung des Fragments C verwendete Plasmid ist der Vektor pBluescript II SK(+), vertrieben durch Stratagene TM (La Jolla). Dieses Plasmid umfasst ein Ampicillin-Resistenzgen.
Eine Menge von 200 ng des Plasmids pBluescript II SK(+) wird einem Verdau mit der Restriktionsendonuklease EcoRV (GATATC) unterzogen, der erlaubt, einen linearisierten Vektor mit freien Enden zu erhalten. Nach dem Verdau werden 80 μl TE (Tris 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8) zugegeben und die Lösung wird mit einem Volumen Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (50/48/2) extrahiert, wie unter Vorbereitung II1 beschrieben.
Nach der Zentrifugation bei 4°C für 10 Min. mit 12 000 g wird das DNA-Pellet mit 1 ml Ethanol 70 gewaschen, lyophilisiert und in 20 μl sterilem Milli-Q-Wasser aufgenommen, um eine Lösung von 10 ng/μl des Plasmids pBluescript II SK(+) EcoRV zu erhalten.
Die Ligation des Fragments C mit dem Plasmid pBluscript II SK(+) (EcoRV) wird für 4 Stunden bei Raumtemperatur durchgeführt.
Die für die Transformation verwendeten kompetenten Bakterien sind DH5 alpha (Gibco BRL, Paris).
Mehrere weiße Kolonien werden getestet. Dafür werden Sie einzeln in 3 ml L-Broth supplementiert mit Ampicillin (50 μg/ml) aufgenommen und diese Kulturen werden unter Schütteln über Nacht bei 37°C inkubiert.
Zur Aufreinigung der Plasmid-DNA wird die Kultur zurallererst mit 1500 g für 10 Min. bei 4°C zentrifugiert und das Bakterienpellet wird mit dem Wizard Kit (Promega TM) behandelt, nach dem vom Hersteller mitgegebenen Protokoll.
Ein Aliquot (2 μl von 60 erhaltenen) wirid einem enzymatischen Verdau mit den Restriktionsendonukleasen BamHI und HindIII unterzogen, um die Klonierung des Fragments C zu verifizieren. Die Restriktionsstellen BamHI und HindIII sind auf der einen und der anderen Seite der Klonierungsstelle EcoRV angeordnet. Nach der Elektrophorese wird das Gel für 15 Min. in einer Ethidiumbromidlösung von 40 ng/ml gefärbt und die Anwesenheit des Fragments C wird unter UV verifiziert.
Die Sequenzierreaktionen werden mit dem „T7 Sequencing" Kit (Pharmacia TM) durchgeführt, das die Kettenabbruchtechnik verwendet und die T7 DNA Polymerase (vgl. Vorbereitung 1) erlaubt, die Unversehrtheit der Sequenz des Fragments C zu validieren.
4/Fragment D
Das Fragment D umfasst die gesamte für das Amino-Telopeptid (Nukleotide 474 bis 534) kodierende Sequenz und die Sequenz, die für den aminoterminalen Teil der helikalen Region (Nukleotide 535 bis 1920) der humanen proα1(I)-Kette kodiert. Die Nukleotide 474, 475 und 477, CTT, werden durch die Basen GCA ersetzt, was die Schaffung einer NheI Restriktionsstelle (GCTAGC) in den Positionen 474 bis 479 erlaubt. Diese Schaffung der NheI Stelle bewirkt die Substitution der Aminosäuren Asn und Phe durch Lysin und Leucin in den Positionen 158 und 159 der humanen proα1(I)-Kette. Eine DraIII Restriktionsstelle ist in den Positionen 1709 bis 1717 (CACCTGGTG) angeordnet, während ursprünglich eine BamHI Stelle im Plasmid Lambda MoSEIox (Amersham TM) am 3' Ende angeordnet ist.
Amplifikation des Fragments D
Zwei Syntheseoligonukleotide wurden verwendet.
Sens Oligonukleotid, BIOC65,

5'-TATTCTAGAGCTAGCTCCCCAGCTGTCTTATGGCTATGATGAG-3'

Dieses Oligonukleotid zeigt 5' (unterstrichene Nukleotide) die Sequenzen, die die Schaffung der Restriktionsstellen XbaI (TCTAGA) und NheI (GCTAGC) erlauben. Die XbaI Stelle wird für die Klonierung des Fragments D verwendet, während die NheI Stelle, beschrieben im Informationsteil, dazu dient, die für die Aminopropeptiddomäne kodierende Sequenz abzugrenzen. Nach diesen zwei Stellen findet sich eine Sequenz (Nukleotide 480 bis 507) wieder, die für den Anfang der Aminotelopeptiddomäne der humanen proα1(I)-Kette kodiert.
Antisens Oligonukleotid, T7 Gen 10 Primer,

5'-CTGAGGTTGTAGAAGTTCCG-3'

Dieses Oligonukleotid ist genau stromabwärts des 3' Endes des cDNA-Klons 1alhpa3 und einer Restriktionsstelle BamHI (GGATCC), die für die Klonierung des Fragments D verwendet werden wird, lokalisiert.
Die verwendete Matrizen DNA ist der cDNA-Klon 1alpha3, der 83 bp des 5' nicht-translatierten Teils und die ersten 1920 Basen, die für die humane proα1(I)-Kette kodieren, umfasst.
Klonierung des Fragments D
Nach der Amplifikation wird die Lösung mit einem Volumen Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (Verhältnis 50/48/2) extrahiert, wie unter Vorbereitung II1. Das DNA-Pellet wird mit 1 ml Ethanol 70 gewaschen, lyophilisiert und in 34 μl sterilem Milli-Q-Wasser resuspendiert.
Der Verdau mit BamH1 Xba1 wird für 2 Stunden bei 37°C in einem Endvolumen von 40 μl durchgeführt.
Nach dem enzymatischen Verdau werden 8 μl Stopppuffer (30% Sucrose, 0.25% Bromphenolblau) zu der DNA-Lösung zugegeben, die mittels Elektrophorese auf einem 0.8 % Agarosegel mit niedrigem Schmelzpunkt SeaPlaque-GTG (FMC, Rockland) bei einer konstanten Spannung von 60 Volt analysiert wird. Der Elektrophoresepuffer ist 0.5X TBE (Trisborat 45 mM, EDTA (Ethylendiamintetraacetat) 1 mM, pH 8). Nach der Wanderung wird das Gel für 15 Min. in einer 0.5X TBE Lösung, enthaltend 40 ng/ml Ethidiumbromid, gefärbt.
Die mit dem Fragment D korrespondierende Bande wird unter UV ausgeschnitten, in 350μl einer Tris 20 mM pH 8, EDTA 1 mM pH 8 Lösung aufgenommen und für 5 Min. bei 65°C inkubiert. Nach dem Auflösen der Agarose, wird die Probe mit einem Volumen Phenol extrahiert und für 5 Min. mit 10 000 g zentrifugiert. Die wässrige Phase wird abgenommen, mit einem Volumen Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (Verhältnis 50/48/2) extrahiert, wie unter Vorbereitung II1 beschrieben.
Nach der Zentrifugation bei 4°C für 10 Min. mit 12 000 g wird das DNA-Pellet mit 1 ml Ethanol 70 gewaschen, lyophilisiert und in 20 μl sterilem Milli-Q-Wasser aufgenommen. Ein Aliquot von 2 μl sowie 500 ng der HindIII-EcoRI Fragmente des Phagen Lambda (Promega TM) auf einem 0.8% Agarosegel Typ II (Sigma TM) analysiert, was uns erlaubte, die Konzentration der gereinigten Lösung des Fragments D BamHI/XbaI von 50 ng/μl abzuschätzen.
Das für die Klonierung des Fragments D verwendete Plasmid ist der Vektor pUC 18 vertrieben durch Promega (TM). Dieses Plasmid umfasst ein Ampicillin-Resistenzgen.
Eine Menge von 200 ng des Plasmids pUC 18 wird einem Verdau mit den Restriktionsendonukleasen BamHI und XbaI unterzogen. Für 2 Stunden bei 37°C. Nach dem Verdau werden 2 μl Auftragpuffer (30% Sucrose, 0.25% Bromphenolblau) zu der Mischung zugegeben und auf einem 0.8 % Agarosegel Seaplaque GTG (FMC, Rockland) analysiert. Die DNA Bande, die mit dem durch BamHI und XbaI linearisierten pUC18 korrespondiert, wird entnommen und in 350 μl einer Tris 20 mM pH 8, EDTA 1 mM pH 8 Lösung aufgenommen. Diese Probe wird für 5 Min. bei 65°C inkubiert, mit einem Volumen Phenol extrahiert und für 5 Min. mit 10 000 g zentrifugiert. Die wässrige Phase wird abgenommen, mit einem Volumen Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (Verhältnis 50/48/2) extrahiert, wie unter Vorbereitung II1 beschrieben.
Nach der Zentrifugation bei 4°C für 10 Min. mit 12 000 g wird das DNA-Pellet mit 1 ml Ethanol 70 gewaschen, lyophilisiert und in 20 μl sterilem Milli-Q-Wasser aufgenommen, um eine Lösung von 10 ng/μl des Plasmids pUC18 BamHI/XbaI zu erhalten.
Die Ligation des Fragments D (BamHI/XbaI) mit dem Plasmid pUC18 (BamHI/XbaI) wird für 4 Stunden bei Raumtemperatur durchgeführt.
Die für die Transformation verwendeten kompetenten Bakterien sind DH5 alpha (Gibco BRL, Paris).
Mehrere weiße Kolonien werden getestet. Dazu werden Sie einzeln in 3 ml L-Broth supplementiert mit Ampicillin (50 μg/ml) aufgenommen und diese Kulturen werden unter Schütteln über Nacht bei 37°C inkubiert.
Zur Aufreinigung der Plasmid-DNA wird die Kultur zuallererst mit 1500 g für 10 Min. bei 4°C zentrifugiert und das Bakterienpellet wird mit dem Wizard Kit (Promega TM) behandelt, das die Aufreinigung von supercoiled Plasmid-DNA erlaubt. Diese Handhabung erfolgt nach dem vom Hersteller mitgegebenen Protokoll. Etwa 10 μg Plasmid-DNA werden mit Hilfe dieses Kits aufgereinigt, wenn das verwendete Plasmid pUC18 ist.
Ein Aliquot (2 μl von 60 erhaltenen) wird einem enzymatischen Verdau mit den Restrikt onsendonukleasen BamHI und XbaI unterzogen, um die Klonierung des Fragments D zu verifizieren. Nach der Elektrophorese wird das Gel für 15 Min. in einer Ethidiurnbromidlösung von 40 ng/ml gefärbt und die Anwesenheit des Fragments D unter UV verifiziert.
Die Sequenzreaktionen werden mit dem „T7 Sequencing" Kit (Pharmacia TM) durchgeführt, dass die Kettenabruchtechnik verwendet und T7 DNA Polymerase (vgl. Vorbereitung 1) erlaubt, die Unversehrtheit der Sequenz des Fragments D zu validieren.
5/Fragement E
Das Fragment E ist von den Stellen DraIII (CACCTGGTG, Nukleotide 1709 bis 1717) und BamHI (GGATCC, Nukleotide 2803 bis 2808), die im cDNA-Klon alpha22 vorliegen, eingeschlossen. Dieses Fragment kodiert für die Aminsosäuren 567 bis 936, die von der zentralen helikalen Domäne der humanen proα1(I)-Kette umfasst sind.
6/Fragment F
Das Fragment F ist von den Stellen BamHI (GGATTC, Nukleotide 2803 bis 2808) und EcoRI (GAATTC, Nukleotide 4357 bis 4362), die im cDNA-Klon alpha22 vorliegen, eingeschlossen. Dieses Fragment kodiert für die Aminosäuren 936 bis 1192, die von der zentralen helikalen Domäne umfasst sind, und 1193 bis 1454 der Carboxypeptiddomäne der humanen proα1(I)-Kette.
7/Fragment G
Das Fragment G weist die Sequenz (Nukleotide 4040 bis 4392) auf, die für den carboxyterminalen Teil der Carboxypropeptiddomäne (Aminosäuren 1346 bis 1464) der humanen proα1(I)-Kette kodiert. Dieses Fragment beinhaltet zudem die Nukleotide TAA (Stoppcodon, Basen 4393 bis 4395), verbunden mit einer HinIII Restriktionsstelle (AAGCTT).
Amplifikation des Fragments G
Zwei Syntheseoligonukleotide wurden verwendet.
Sens Oligonukleotid, BIOC25,

5'-TATCTGCAGATGTGGCCATCCAGCTGACCT-3'-3'

Dieses Oligonukleotid umfasst 5' (unterstrichene Nukleotide) die Sequenz, die die Schaffung einer PstI Restriktionsstelle (CTGCAG) erlaubt, die als Klonierungsstelle verwendet wird. Nach dieser Stelle sind die Nukleotide 4040 bis 4060 eingeschlossen, die spezifisch für die humane proα1(I)-Kette kodierende Sequenz sind.
Antisens Oligonukleotid, BIOC23,

5'-TATAAGCTTACAGGAAGCAGACAGGGCCAA-3'

Dieses Oligonukleotid zeigt 5' (unterstrichene Nukleotide) die Sequenz, die die Schaffung einer HindIII Restriktionsstelle (AAGGGT) erlaubt. Die zum Stoppcodon TAA komplementäre Sequenz ist fettgedruckt angegeben, gefolgt von einem komplementären Strang der Nukleotide 4373 bis 4392, der für die humane proα1(I)-Kette kodierenden Sequenz.
Die verwendete Matrizen DNA ist der cDNA Klon alpha22, der die Sequenz aufweist, die für die Aminosäuren 171 bis 1454 der humanen proα1(I)-Kette und etwa 500 bp der 3' nicht-translatierten Region kodiert.
Klonierung des Fragments G
Nach der Amplifikation wird die Lösung mit einem Volumen Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (Verhältnis 50/48/2) extrahiert. Das DNA-Pellet wird mit 1 ml Ethanol 70 gewaschen, lyophilisiert und in 35 μl sterilen Milli-Q-Wasser resuspendiert.
Der Verdau mit Pst1 wird für 2 Stunden bei 37°C in einem Endvolumen von 40 μl durchgeführt.
Nach dem enzymatischen Verdau werden 60 μl des TE-Puffers (Tris 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8) zu der DNA-Lösung zugegeben, die mit einem Volumen Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (Verhältnis 50/48/2) extrahiert wird, wie unter Vorbereitung II1 beschrieben.
Nach der Zentrifugation bei 4°C für 10 Min. mit 12 000 g wird das DNA-Pellet mit 1 ml Ethanol 70 gewaschen, lyophilisiert und in 35 μl sterilem Milli-Q-Wasser aufgenommen. Der Verdau mit HindIII wird für 2 Stunden bei 37°C in einem Endvolumen von 20 μl durchgeführt.
Nach dem enzymatischen Verdau werden 8 μl Stopppuffer (30% Sucrose 0.25% Bromphenolblau) zu der DNA-Lösung zugegeben, die mittels Elekrophorese auf einem 2% Agarosegel mit niedrigem Schmelzpunkt Nu Sieve-GTG (FMC, Rochland) analysiert wird, vgl. Vorbereitung II2.
Die Bande, die mit dem Fragment G korrespondiert, wird unter UV ausgeschnitten, in 350 μl einer Tris 20 mM pH 8, EDTA 1 mM pH 8 Lösung aufgenommen und für 5 Min. bei 65°C inkubiert. Nach dem Auflösen der Agarose wird die Probe mit 1 Volumen Phenol extrahiert und für 5 Min. mit 10 000 g zentrifugiert. Die wässrige Phase wird abgenommen, mit einem Volumen Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (Verhältnis 50/48/2) extrahiert, wie unter Vorbereitung II1 beschrieben.
Nach der Zentrifugation bei 4°C für 10 Min. mit 12 000 g wird das DNA-Pellet mit 1 ml Ethanol 70 gewaschen, lyophilisiert und in 20 μl sterilem Milli-Q-Wasser aufgenommen. Ein Aliquot von 2 μl sowie 500 ng HindIII-EcoRI Fragmente des Phagen Lambda (Promega TM) werden auf einem 2% Agarosegel Type II (Sigma TM) analysiert, was uns erlaubte, die gereinigte Lösung des Fragments G HindIII/PstI von 30 ng/μl abzuschätzen.
Das für die Klonierung des Fragments G verwendete Plasmid ist der Vektor pBluescript II SK(+), vertrieben durch Stratagene. Dieses Plasmid umfasst ein Ampicillin-Resistenzgen.
Eine Menge von 200 ng des Plasmids pBluescript II SK(+) wird einem Restriktionsendonukleaseverdau mit PstI in einem Endvolumen von 20 μl für 2 Stunden bei 37°C unterzogen. Nach dem Verdau werden 80 μl TE-Puffer (Tris 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8) zu der DNA-Lösung zugegeben, die mit 1 Volumen Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (Verhältnis 50/48/2) extrahiert wird, wie unter Vorbereitung II1 beschrieben.
Nach der Zentrifugation bei 4°C für 10 Min. mit 12 000 g wird das DNA-Pellet mit 1 ml Ethanol 70 gewaschen, lyophilisiert und in 17 μl sterilem Milli-Q-Wasser aufgenommen. Der HindIII Verdau wird für 2 Stunden bei 37°C in einem Endvolumen von 20 μl durchgeführt.
Nach dem Verdau werden 4 μl Auftragpuffer (30% Sucrose, 0.25% Bromphenolblau) zu der Mischung zugegeben und auf einem 0.8% Agarosegel Seaplaque GTG (FMC, Rockland) analysiert, vgl. Vorbereitung II4. Die DNA-Bande, die mit dem durch HindIII und PstI liniarisiertem pBluescript II SK(+) korrespondiert, wird ausgeschnittem und in 350 μl einer Tris 20 mM pH 8, EDTA 1 mM pH 8 Lösung aufgenommen. Diese Probe wird für 5 Min. bei 65°C inkubiert, mit 1 Volumen Phenol extrahiert und für 5 Min. mit 10 000 g zentrifugiert. Die wässrige Phase wird aufgenommen, mit 1 Volumen Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (Verhältnis 50/48/2) extrahiert, wie unter Vorbereitung II1 beschrieben.
Nach der Zentrifugation bei 4°C für 10 Min. mit 12 000 g wird das DNA-Pellet mit 1 ml Ethanol 70 gewaschen, lyophilisiert und in 20 μl sterilem Milli-Q-Wasser aufgenommen, und eine Lösung von 10 ng/μl des Plasmids pBluescript II SK(+) HindIII/PstI zu erhalten.
Die Ligation des Fragments G (HindIII/PstI) mit dem Plasmid pBluescript II SK(+) (HindIII/PstI) wird für 4 Stunden bei Raumtemperatur durchgeführt.
Die für die Transformation verwendeten kompetenten Bakterien sind DH5 alpha (Gibco BRL, Paris).
Mehrere weiße Kolonien werden getestet. Dazu werden sie einzeln in 3 ml L-Broth supplementiert mit Ampicillin (50 μg/ml) aufgenommen und diese Kulturen werden unter Schütteln über Nacht bei 37°C inkubiert.
Um die Plasmid-DNA aufzureinigen, wird die Kultur zuallererst mit 1500 g für 10 Min. bei 4°C zentrifugiert und das Bakterien-Pellet wird mit dem Wizard Kit (Promega TM) behandelt, gemäß dem vom Hersteller mitgegebenen Protokoll.
Ein Aliquot (2 μl von 60 erhaltenen) wird einem enzymatischem Verdau mit den Restriktionsendonukleasen HindIII und BamHI unterzogen, um die Klonierung des Fragments G zu verifizieren.
Nach der Elektrophorese wird das Gel für 15 Min. in einer Ethidiumbromidlösung von 40 ng/ml gefärbt und die Anwesenheit des Fragments G unter UV verifiziert.
Die Sequenzierreaktionen werden mit dem „T7 Sequencing" Kit (Pharmacia TM) durchgeführt, das die Kettenabbruchtechnik verwendet und die T7 DNA Polymerase (vgl. Vorbereitung 1) erlaubt, die Unversehrtheit der Sequenz des Fragments G zu validieren.
8/Fragment H
Das Fragment H weist die Sequenz (Nukleotide 4031 bis 4383) auf, die für den carboxyterminalen Teil der Carboxypropeptiddomäne (Aminosäuren 1343 bis 1461) der humanen proα1(I)-Kette kodiert. Dieses Fragment weist zudem die Nukleotide TAA (Stoppcodon, Basen 4384 bis 4386) verbunden mit einer HindIII Restriktionsstelle (AAGCTT) auf. Stromaufwärts des Stoppcodons sind die Codons Lys, Asp, Glu, Leu, eingeschlossen, Stellen für die Zurückbehaltung im endoplasmatischen Retikulum.
b/Amplification des Fragments H
Zwei Syntheseoligonukleotide werden verwendet.
Sens Oligonukleotid, BIOC25,

5'-TATCTGCAGATGTGGCCATCCAGCTGACCT-3'-3'

Dieses Oligonukleotid weist 5' (unterstrichene Nukleotide) die Sequenz auf, die die Schaffung einer PstI Restriktionsstelle (CTGCAG) erlaubt, welche als Klonierungsstelle verwendet wird. Nach dieser Stelle sind die Nukleotide 4031 bis 4051 eingschlossen, die spezifisch sind für die humane proα1(I)-Kette kodierende Sequenz.
Antisens Oligonukleotid, BIOCKDEL,

5'TATAAGCTTATAGCTCATCTTTCAGGAAGCAGACAGGGCCAACGTCGAAGC-3'

Dieses Oligonukleotid zeigt 5' (unterstrichene Nukleotide) die Sequenz, die die Schaffung einer HindIII Restriktionsstelle (AAGCTT) erlaubt. Fettgedruckt ist die Sequenz angezeigt, die komplementär zu dem Stoppcodon TAA und den Aminosäuren KDEL ist, gefolgt von dem komplementären Strang der Nukleotide 4353 bis 4383, der für die humane proα1(I)-Kette kodierenden Sequenz.
Die verwendete Matrizen DNA ist der cDNA-Klon alpha22, der 110bp des 5' nicht-translatierenden Teils und die ersten 1911 Basen aufweist, die für die humane proα1(I)-Kette kodieren.
Klonierung des Fragments H
Nach der Amplifikation wird die Lösung mit einem Volumen Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (Verhältnis 50/48/2) extrahiert, wie unter Vorbereitung II1 beschrieben.
Das DNA-Pellet wird mit 1 ml Ethanol 70 gewaschen, lyophilisiert und in 35 μl sterilem Milli-Q-Wasser resuspendiert.
Der Verdau mit PstI wird für 2 Stunden bei 37°C in einem Endvolumen von 40 μl durchgeführt.
Nach dem enzymatischen Verdau werden 60 μl des TE-Puffers (Tris 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8) zu der DNA-Lösung zugegeben, die mit 1 ml Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (Verhältnis 50/48/2) extrahiert wird, wie unter Vorbereitung II1 beschrieben.
Nach der Zentrifugation bei 4°C für 10 Min. mit 12 000 g wird das DNA-Pellet mit 1 ml Ethanol 70 gewaschen, lyophilisiert und in 35 μl sterilem Milli-Q-Wasser resuspendiert. Der Verdau mit HindIII wird für 2 Stunden bei 37°C in einem Endvolumen von 40 μl durchgeführt.
Nach dem enzymatischen Verdau werden 8 μl Stopppuffer (30% Sucrose, 0.25% Bromphenolblau) zu der DNA-Lösung zugegeben, die mittels Elektrophorese auf einem 2% Agarosegel mit niedrigem Schmelzpunkt Nu Sieve-GTG (FMC-Rockland) analysiert wird, wie unter Vorbereitung II1 beschrieben.
Die Bande, die mit dem Fragment H korrrespondiert, wird unter UV ausgeschnitten, in 350 μl einer Tris 20 mM, pH 8, EDTA 1 mM pH 8 aufgenommen und für 5 Min. bei 65°C inkubiert. Nach dem Auflösen der Agarose wird die Probe mit einem Volumen Phenol extrahiert und für 5 Min. mit 10 000 g zentrifugiert. Die wässrige Phase wird aufgenommen, mit 1 Volumen Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (Verhältnis 50/48/2) extrahiert, wie unter Vorbereitung II1 beschrieben.
Nach der Zentrifugation bei 4°C für 10 Min. mit 12 000 g wird das DNA-Pellet mit 1 ml Ethanol 70 gewaschen, lyophilisiert und in 20 μl sterilem Milli-Q-Wasser wieder aufgenommen. Ein Aliquot von 2 μl sowie 500 ng der HindIII-EcoRI Fragmente des Phagen Lambda (Promega TM) werden auf einem 2% Agarosegel Type II (Sigma TM) analysiert, was uns erlaubte, die Konzentration der gereinigten Lösung des Fragments H HindIII/PstI von 20 ng/μl abzuschätzen.
Das für die Klonierung des Fragments H verwendete Plasmid ist der Vektor pBluescript II SK(+) vertrieben durch Stratagene TM. Dieses Plasmid weist ein Ampicillin-Resistenzgen auf.
Eine Menge von 200 ng des Plasmids pBluescript II SK(+) wird einem Restriktionsendonukleaseverdau mit PstI unterzogen. In einem Volumen von 20 μl für 2 Stunden bei 37°C. Nach dem Verdau werden 80 μl TE-Puffer (Tris 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8) der DNA-Lösung zugegeben, die mit einem Volumen Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (Verhältnis 50/48/2) extrahiert wird, wie unter Vorbereitung II1 beschrieben.
Nach der Zentrifugation bei 4°C für 10 Min. mit 12 000 g wird das DNA-Pellet mit 1 ml Ethanol 70 gewaschen, lyophilisiert und in 17 μl sterilem Milli-Q-Wasser aufgenommen. Der Verdau mit HindIII wird für 2 Stunden bei 37°C in einem Endvolumen von 20 μl durchgeführt.
Nach dem Verdau werden 4 μl Auftragpuffer (30% Sucrose, 0.25% Bromphenolblau) der Mischung zugegeben und auf dem 0.8% Agarosegel Seaplaque GTG (FMC, Rockland) analysiert, vgl. Vorbereitung II4. Die DNA-Bande, die mit dem HindIII und PstI linearisierten pBluescript II SK(+) korrespondiert, wird ausgeschnitten und in 350 μl einer Tris 20 mM pH 8 EDTA 1 mM pH 8 Lösung aufgenommen. Diese Probe wird für 5 Min. bei 65°C inkubiert, mit einem Volumen Phenol extrahiert und für 5 Min. mit 10 000 g zentrifugiert. Die wässrige Phase wird abgenommen, mit einem Volumen Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (Verhältnis 50/48/2) extrahier, wie unter Vorbereitung II1 beschrieben.
Nach der Zentrifugation bei 4°C für 10 Min. mit 12 000 g wird das DNA-Pellet mit 1 ml Ethanol 70 gewaschen, lyophilisiert und in 20 μl sterilem Milli-Q-Wasser aufgenommen, um eine Lösung von 10 ng/μl des Plasmids pBluescript II SK(+) Hind III/PstI zu erhalten.
Die Ligation des Fragments H (HindIII/PstI) mit dem Plasmid pBluescript II SK(+) (HindIII/PstI) wird für 4 Stunden bei Raumtemperatur durchgeführt. [0211] Die für die Transformation verwendeten kompetenten Bakterien sind DH5 alpha (Gibco BRL, Paris).
Mehrere weiße Kolonien werden getestet. Dazu werden sie einzeln in 3 ml L-Broth supplementiert mit Ampicillin (50 μg/ml) aufgenommen und diese Kulturen werden unter Schütteln über Nacht bei 37°C inkubiert.
Zur Aufreinigung der Plasmid-DNA wird die Kultur zuallererst mit 1500 g für 10 Min. bei 4°C zentrifugiert und das Bakterien-Pellet wird mit dem Wizard Kit (Promega TM) nach dem vom Hersteller mitgegebenen Protokoll behandelt.
Ein Aliquot (2 μl von 60 erhaltenen) wird einem enzymatischen Verdau mit den Restriktionsendonukleasen HindIII und BamHI unterzogen, um die Klonierung des Fragements H zu verifizieren. Nach der Elektrophorese wird das Gel für 15 Min. in einer Ethidiumbromidlösung von 40 ng/ml gefärbt und die Anwesenheit des Fragments H unter UV verifiziert.
Der letzte Schritt ist die Verifikation der Unversehrtheit der Sequenz des Fragments H, da die Technik der Amplifikation mittels PCR (Polymerase Chain Reaction) Mutationen einführen kann. Die Sequenzierreaktionen werden mit dem „T7 Sequencing" Kit (Pharmacia TM) durchgeführt, das die Kettenabbruchmethode verwendet und die T7 DNA-Polymerase (vgl. Vorbereitung 1) erlaubt, die Unversehrtheit der Sequenz des Fragments G zu verifizieren.
BEISPIEL 1
Konstruktion chimärer Gene, die für das rekombinante Protein des humanen Kollagens kodieren und die Expression in den Blättern des Tabaks und Samen des Tabaks oder des Raps erlauben.
1/Erhalt der Fragmente FG und FH
Dieser Schritt besteht darin, das Fragment BamHI/EcoRI von 1554 bp (Nukleotide 2803 bis 4357) des Klons alpha22 zwischen die Stellen BamHI (des Vektors bBluescript II SK(+)) und EcoRI (Fragment G oder H) des Klons pBluescript II SK(+)-Fragment G oder H zu klonieren. Dies resultiert im Erhalt der Klone pBluescript II SK(+)-FG und pBluescript II SK(+)-FH, die zwischen den Stellen BamHI und HindIII die Sequenz aufweisen, die für die Aminosäuren 936 bis 1192 der zentralen helikalen Domäne kodiert, die Gesamtheit der Carboxypropeptiddomäne (Aminosäuren 1193 bis 1464) der humanen proα1(I)-Kette und das Stoppcodon TAA, verbunden mit der Restriktionsstelle HindIII. Im Fall des Klons pBluescript II SK(+)- Fragment FH sind vier Codons, die für die Sequenz KDEL (Lys, Asp, Glu, Leu) spezifisch sind, zwischen die für die Carboxypropeptiddomäne kodierende Sequenz und das Stoppcodon TAA eingefügt.
Klonierung des Fragments F (BamHI/EcoRI) mit dem EcoRI/HindIII Teil des Fragments G oder H.
Etwa 1 μg des cDNA-Klons alpha22 wird mit der Restriktionsendonuklease BamHI für 90 Min. bei 37°C verdaut. Die verwendeten Konditionen sind: 1 μg alpha22, 2 μl Verdaupuffer E (Promega TM), 1 μl der Restriktionsendonuklease BamHI (12 U/μl; Promega TM), qsp 20 μl H₂O milli-Q. Der Verdau wird für 2 Stunden bei 37°C durchgeführt.
Nach dem enzymatischen Verdau werden 80 μl TE-Puffer (Tris 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8) der DNA-Lösung zugefügt, die mit einem Volumen Phenol/Chloroform/Isoamlylalkohol (Verhältnis 50/48/2) extrahiert wird, wie unter Vorbereitung II1 beschrieben.
Nach Zentrifugation bei 4°C für 10 Min. mit 12 000 g wird das DNA-Pellet mit 1 ml Ethanol 70 gewaschen, lyophilisiert und in 35 μl sterilem Milli-Q-Wasser wieder aufgenommen. Der Verdau mit PstI wird für 2 Stunden bei 37°C in einem Endvolumen von 40 μl durchgeführt.
Nach dem enzymatischen Verdau werden 8 μl Stopppuffer (30% Sucrose, 0.25% Bromphenolblau) der DNA-Lösung zugegeben, die mittels Elektrophorese auf einem 1% Agarosegel mit niedrigem Schmelzpunkt Seaplaque-GTG (FMC, Rockland) bei konstanter Spannung von 60 Volt analysiert wird. Der Elektrophoresepuffer ist 0,5X TBE (Trisborat 45 mM, EDTA (Ethylendiamintetraacetat) 1 mM pH 8). Nach der Wanderung wird das Gel für 15 Min. in einer 0.5X TBE Lösung, die 40 ng/ml Ethidiumbromid enthält, gefärbt.
Die Bande, die mit dem Fragment BamHI/EcoRI von 1554 bp korrespondiert, wird unter UV ausgeschnitten, in 350 μl einer Tris 10 mM pH 8, EDTA 1 mM pH 8 Lösung aufgenommen und für 5 Min. bei 65°C inkubiert. Nach dem Auflösen der Agarose wird die Probe mit einem Volumen Phenol extrahiert und für 5 Min. mit 10 000 g zentrifugiert. Die wässrige Phase wird abgenommen, mit einem Volumen Phenol/Chloroform/Isoamlyalkohol (Verhältnis 50/48/2) extrahiert, wie unter Vorbereitung II1 beschrieben.
Nach der Zentrifugation bei 4°C für 10 Min. mit 10 000 g wird das DNA-Pellet mit 1 ml Ethanol 70 gewaschen, lyophilisiert und mit 20 μl sterilem Milli-Q-Wasser wieder aufgenommen. Ein Aliquot von 2 μl sowie 500 ng der HindIII-EcoRI Fragmente des Phagen Lambda (Promega TM) werden auf einem 1% Agarosegel Typ II (Sigma TM) analysiert, was uns erlaubte, die Konzentration der gereinigten Lösung des Fragments BamHI/EcoRI des cDNA-Klons alpha22 von 12 ng/μl abzuschätzen.
Das für die Klonierung des Fragments BamHI/EcoRI des cDNA-Klons alpha22 verwendete Plasmid ist der Klon pBluescript II SK(+)-Fragment G oder H, verdaut mit den Enzymen BamHI und EcoRI. Dieser Klon weist ein Ampicillin-Resistenzgen auf. [0224] Eine Menge von 500 ng des Plasmids pBluescript II SK(+)-Fragment G oder H wird einem Restriktionsendonukleaseverdau mit BamHI unterzogen. In einem Volumen von 20 μl für 2 Stunden bei 37°C. Nach dem Verdau werden 80 μl TE-Puffer (Tris 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8) der DNA-Lösung zugegeben, die mit einem Volumen Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (Verhältnis 50/48/2) extrahiert wird, wie unter Vorbereitung II1 beschrieben.
Nach der Zentrifugation bei 4°C für 10 Min. mit 12 000 g wird das DNA-Pellet mit 1 ml Ethanol 70 gewaschen, lyophilisiert und in 17 μl sterilem Milli-Q-Wasser wieder aufgenommen: Der Verdau mit EGRI wird für 2 Stunden bei 37°C in einem Endvolumen von 20 μl durchgeführt.
Nach dem Verdau werden 4 μl Auftragpuffer (30% Sucrose, 0.25% Bromphenolblau) der Mischung zugegeben und auf dem 0,8% Agarosegel Seaplaque GTG (FMC Rockland) analysiert, vgl. Vorbereitung II4. Die DNA-Bande, die mit dem pBluescript II SK(+)-Fragment G oder H, verdaut mit BamHI und EcoRI korrespondiert, wird ausgeschnitten und in 350 μl einer Tris 20 mM pH 8, EDTA 1 mM pH 8 Lösung aufgenommen. Diese Probe wird für 5 Min. bei 65°C inkubiert, mit einem Volumen Phenol extrahiert und 5 Min. mit 10 000 g zentrifugiert. Die wässrige Phase wird abgenommen, mit einem Volumen Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (Verhältnis 50/48/2) extrahiert, wie unter Vorbereitung II1 beschrieben.
Nach der Zentrifugation bei 4°C für 10 Min. mit 12 000 g wird das DNA-Pellet mit 1 ml Ethanol 70 gewaschen, lyophilisiert und in 20 μl sterilem Milli-Q-Wasser wieder aufgenommen, um eine Lösung von 20 ng/μl des Plasmids pBluescript II SK(+)-Fragment G oder H (BamHI/EcoRI) zu erhalten.
Die Ligation des Fragments BamHI/EcoRI des cDNA-Klons alpha22 mit dem Klon pBluescript II SK(+)-Fragment G oder H (BamHI/EcoRI) wird für 4 Stunden bei Raumtemperatur durchgeführt.
Die für die Transformation verwendeten kompetenten Bakterien sind DH5 alpha (Gibco BRL, Paris).
Mehrere weiße Kolonien werden getestet. Dazu werden sie einzeln in 3 ml L-Broth supplementiert mit Ampicillin (50 μg/ml) aufgenommen und diese Kulturen werden unter Schütteln über Nacht bei 37°C inkubiert.
Zur Aufreinigung der Plasmid-DNA wird die Kultur zuallererst mit 1500 g für 10 Min. bei 4°C zentrifugiert und das Bakterien-Pellet wird mit dem Wizard Kit (Promega TM) behandelt, gemäß dem vom Hersteller mitgegebenen Protokoll.
Ein Aliquot (2 μl von 60 erhaltenen) wird einem enzymatischen Verdau mit den Restriktionsendonukleasen HindIII und BamHI unterzogen, um die Klonierung des Fragments BamHI/EcoRI des cDNA-Klons alpha22 in den Klon pBluescript II SK(+)-Fragment G oder H (BamHI/EcoRI) zu verifizieren. Die HindIII Restriktionsstelle ist mit dem Stoppcodon TAA 3' von der EcoRI-Stelle verbunden.
Nach der Elektrophorese wird das Gel für 15 Min. in einer Ethidiumbromid-Lösung von 40 ng/ml gefärbt und die Anwesenheit des Fragments BamHI/HindIII von 1596 bp im Fall des Fragments FG und von 1608 bp im Fall des Fragments FH unter UV verifiziert.
Die Sequenzierreaktionen wurden mit dem „T7 Sequencing" Kit (Pharmacia TM) durchgeführt, das die Kettenabbruchmethode verwendet und T7 DNA-Polymerase erlaubt, die Unversehrtheit der Klone pBluescript II SK(+)-Fragment FG und pBluescript II SK(+)-Fragment FH zu validieren.
2/Erhalt des Fragments DE
Diese Schritt besteht darin, das Fragment DraIII/BamHI (Nukleotide 1714 bis 2803) von 1089 bp des Klons alpha22 zwischen die Stellen DraIII (des Fragments D) und BamHI (des Plasmids pUC18) des Klons pUC18-Fragments D zu klonieren. Dies resultiert in dem Erhalt des Klons pUC18-DE, der zwischen den Stellen XbaI und BamHI die Sequenz aufweist, die für die Aminosäuren 160 bis 179 der Aminotelopeptiddomäne kodiert, die Aminosäuren 180 bis 936 der zentralen helikalen Region der humanen proα1(I)-Kette.
Klonierung des Fragments E (DraIII/BamHI) mit dem DraIII/BamHI Teil des Fragments D.
Etwa 1 μg des cDNA-Klons alpha22 wird mit der Restriktionsendonuklease BamHI für 90 Min. bei 37°C inkubiert.
Nach dem enzymatischen Verdau werden 80 μl TE-Puffer (Tris 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8) der DNA-Lösung zugegeben, die mit einem Volumen Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (Verhältnis 50/48/2) extrahiert wird und für 2 Min. mit 10 000 g zentrifugiert wird. Die wässrige Phase wird mit Chloroform/Isoamylalkohol (Verhältnis 24/1) extrahiert und einige Sekunden mit 10 000 g zentrifugiert. Die wässrige Phase wird entnommen, auf eine Endkonzentration von 0.2 M NaCl eingestellt und für 16 Stunden bei –20°C nach Zugabe von 2 Volumen Ethanol 100 präzipitiert.
Nach der Zentrifugation bei 4°C für 10 Min. mit 12 000 g wird das DNA-Pellet mit 1 ml Ethanol 70 gewaschen, lyophilisiert und in 35 μl sterilem Milli-Q-Wasser wieder aufgenommen. Der Verdau mit DraIII wird für 2 Stunden bei 37°C in einem Endvolumen von 40 μl durchgeführt.
Nach dem enzymatischen Verdau werden 8 μl Stopppuffer (30% Sucrose, 0.25% Bromphenolblau) der DNA-Lösung zugegeben, die mittels Elektrophorese auf einem 1 % Agarosegel mit niedrigem Schmelzpunkt Seaplaque-GTG (FMC, Rockland) analysiert wird, vgl. Beispiel I1.
Die Bande, die mit dem Fragment DraIII/BamHI von 1089 bp des cDNA-Klons alpha22 korrespondiert wird unter UV ausgeschnitten, in 350 μl einer Tris 20 mM pH 8, EDTA 1 mM pH 8 Lösung aufgenommen und für 5 Min. bei 65°C inkubiert. Nach dem Auflösen der Agarose wird die Probe mit einem Volumen Phenol extrahiert und für 5 Min. mit 10 000 g zentrifugiert. Die wässrige Phase wird abgenommen und mit einem Volumen Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (Verhältnis 50/48/2) extrahiert, vgl. Vorbereitung II1.
Nach der Zentrifugation bei 4°C für 10 Min. mit 12 000 g wird das DNA-Pellet mit 1 ml Ethanol 70 gewaschen, lyophilisiert und in 20 μl sterilem Milli-Q-Wasser aufgenommen. Ein Aliquot von 2 μl sowie 500 ng der HindIII-EcoRI Fragmente des Phagen Lambda (Promega TM) werden auf einem 2% Agarosegel Typ II (Sigma TM) analysiert, was uns erlaubte, die Konzentration der gereinigten Lösung des Fragments DraIII/BamHI des cDNA-Klons alpha22 von 20 ng/μl abzuschätzen.
Das für die Klonierung des Fragments DraIII/BamHI des cDNA-Klons alpha22 verwendete Plasmid ist der Klon pUC18-Fragment D, verdaut mit den Enzymen DraIII und BamHI. Dieser Klon weist ein Ampicillin-Resistenzgen auf.
Eine Menge von 500 ng des Plasmids pUC 18-Fragment D wird einem Restriktionsendonukleaseverdau mit BamHI unterzogen. In einem Volumen von 20 μl für 2 Stunden bei 37°C. Nach dem Verdau werden 80 μl des TE-Puffers (Tris 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8) der DNA-Lösung zugegeben, die mit einem Volumen Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (Verhältnis 50/48/2) extrahiert wird, vgl. Vorbereitung II1. [0244] Nach der Zentrifugation bei 4°C für 10 Min. mit 12 000 g wird das DNA-Pellet mit 1 ml Ethanol 70 gewaschen, lyophilisiert und in 17 μl sterilem Milli-Q-Wasser wieder aufgenommen. Der Verdau mit DraIII wird für 2 Stunden bei 37°C in einem Endvolumen von 20 μl durchgeführt.
Nach dem Verdau werden 4 μl Auftragpuffer (30% Sucrose, 0.25% Bromphenolblau) der Mischung zugegeben und auf einem 0.8% Agarosegel Seaplaque GTG (FMC, Rockland) analysiert. Die DNA-Bande, die mit dem pUC18-Fragment D, verdaut mit DraIII und BamHI, korrespondiert, wird ausgeschnitten und in 350 μl einer Tris 20 mM pH 8, EDTA 1 mM pH 8 Lösung aufgenommen. Diese Probe wird für 5 min. bei 65°C inkubiert, mit einem Volumen Phenol extrahiert und für 5 Min. mit 10 000 g zentrifugiert. Die wässerige Phase wird abgenommen, mit einem Volumen Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (Verhältins 50/48/2) extrahiert, vgl. Vorbereitung II1.
Nach der Zentrifugation bei 4°C für 10 Min. mit 12 000 g wird das DNA-Pellet mit 1 ml Ethanol 70 gewaschen, lyophilisiert und in 20 μl sterilem Milli-Q-Wasser wieder aufgenommen, um eine Lösung von 20 ng/μl des Plasmids pUC 18-Fragment D (DraIII/BamHI) zu erhalten.
Die Ligation des Fragments DraIII/BamHI des cDNA-Klons alpha22 mit dem Klon pUC18-Fragment D (DraIII/BamHI) wird für 4 Stunden bei Raumtemperatur durchgeführt.
Die für die Transformation verwendeten kompetenten Bakterien sind DH5 alpha (Gibco BRL, Paris).
Mehrere weiße Kolonien werden getestet. Dazu werden sie einzeln in 3 ml L-Broth supplementiert mit Ampicillin (50 μg/ml) aufgenommen und diese Kulturen werden unter Schütteln über Nacht bei 37°C inkubiert.
Zur Aufreinigung der Plasmid-DNA wird die Kultur zuallererst mit 1500 g für 10 Min. bei 4°C zentrifugiert und das Bakterienpellet mit dem Wizard Kit (Promega TM) behandelt, gemäß dem vom Hersteller mitgegebenen Protokoll.
Ein Aliquot (2 μl von 60 erhaltenen) wird einem enzymatischen Verdau mit den Restriktionsendonukleasen XbaI und BamHI unterzogen, um die Klonierung des Fragments DraIII/BamHI des cDNA-Klons alpha22 in den Klon pUC 18-Fragment D (DraIII/BamHI) zu verifizieren. Die Restriktionsstelle XbaI befindet sich 5' des Klons pUC 18-Fragment D. Nach der Elektrophorese wird das Gel für 15 Min. in einer Ethidiumbromidlösung von 40 ng/ml gefärbt und die Anwesenheit des Fragments BamHI/XbaI von 2336 bp unter UV verifiziert.
Die Sequenzierreaktionen werden mit dem „T7 Sequencing" Kit (Pharmacia TM) durchgeführt, das die Kettenabbruchmethode verwendet und die T7 DNA Polymerase erlaubt, die Unversehrtheit des Klons pUC18-Fragment DE zu verifizieren.
3/Erhalt der Fragmente DEFG und DEFH
Dieser Schritt besteht darin, das Fragment XbaI/BamHI (Nukleotide 474 bis 2803) von 2329 bp des Klons pUC 18-Fragment DE zwischen die Stellen XbaI (des Plasmids pBluescript II SK(+)) und BamHI (des Fragments FG oder FH) des Klons pBluescript II SK(+)-Fragment FG oder FH zu klonieren. Dies resultiert in dem Erhalt der Klone pBluescript II SK(+)-Fragment DEFG und pBluescript II SK(+)-Fragment DEFH, die zwischen den Stellen XbaI und HindIII die Sequenz aufweisen, die für die Aminosäuren 160 bis 179 der Aminotelopeptiddomäne kodieren, die gesamte zentrale helikale Region (Aminosäuen 108 bis 1192), die gesamte Carboxypropeptiddomäne (Aminosäuren 1193 bis 1464 der humanen proα1(I)-Kette) und das Stop- codon TAA, verbunden mit der Restriktionsstelle HindIII. Im Fall des Klons pBluescript II SK(+)-Fragment DEFH sind 4 Codons, die für die Sequenz KDEL (Lys, Asp, Glu, Leu) spezifisch sind, zwischen die für die Carboxypropeptiddomäne kodierende Sequenz und das Stoppcodon TAA eingefügt.
Klonierung des Fragments DE (XbaI/BamHI) mit dem BamHI/HindIII Teil des Fragments FG oder FH.
Etwa 1 μg des Klons pUC18-Fragment DE wird mit der Restriktionsendonuclease BamHI für 90 Min. bei 37°C inkubiert.
Nach dem enzymatischen Verdau werden 80 μl TE-Puffer (Tris 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8) der DNA-Lösung zugegeben, die mit einem Volumen Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (Verhältnis 50/48/2) extrahiert wird, vgl. Vorbereitung II1.
Nach der Zentrifugation bei 4°C für 10 Min. mit 12 000 g wird das DNA Pellet mit 1 ml Ethanol 70 gewaschen, lyophilisiert und in 35 μl sterilem Milli-Q-Wasser wieder aufgenommen. Der Verdau mit XbaI wird für 2 Stunden bei 37°C in einem Endvolumen von 20 μl durchgeführt.
Nach dem enzymatischen Verdau werden 8 μl Stopppuffer (30% Sucrose, 0.25% Bromphenolblau) der DNA-Lösung zugegeben, die mittels Elektrophorese auf einem 1 % Agarosegel mit niedrigem Schmelzpunkt Seaplaque-GTG (FMC, Rockland) analysiert wird, Beispiel I1.
Die mit dem Fragment XbaI/BamHI von 2329 bp korrespondierende Bande wird unter UV ausgeschnitten, in 350 μl einer Tris 20 mM pH 8, EDTA 1 mM pH 8 Lösung aufgenommen und für 5 Min. bei 65°C inkubiert. Nach dem Auflösen der Agarose wird die Probe mit einem Volumen Phenol extrahiert und für 5 Min. mit 10 000 g zentrifugiert. Die wässerige Phase wird abgenommen, mit einem Volumen Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (Verhältnis 50/48/2) extrahiert, vgl. Vorbereitung II1.
Nach der Zentrifugation bei 4°C für 10 Min. mit 12 000 g wird das DNA-Pellet mit 1 ml Ethanol 70 gewaschen, lyophilisiert und in 20 μl sterilem Milli-Q-Wasser wieder aufgenommen. Ein Aliquot von 2 μl sowie 500 ng der HindIII-EcoRI Fragmente des Phagen Lambda (Promega TM) werden auf einem 1 % Agarosgel Typ II (Sigma TM) analysiert, was uns erlaubte, die Konzentration der gereinigten Lösung des Fragments XbaI/BamHI des Klons pUC18-Fragment DE von 20 ng/μl abzuschätzen. [0260] Das für die Klonierung des Fragments XbaI/BamHI des Klons pUC18-Fragment DE verwendete Plasmid ist der Klon pBluescript II SK(+)-Fragment FG oder FH, verdaut mit den Enzymen XbaI und BamHI. Dieser Klon weist ein Ampicillin-Resistenzgen auf.
Eine Menge von 500 ng des Plasmids pBluescript II SK(+)-Fragment FG oder FH wird einem Restriktionsendonukleaseverdau mit BamHI unterzogen. Für 2 Stunden bei 37°C. Nach dem Verdau werden 80 μl TE-Puffer (Tris 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8) der DNA-Lösung zugegeben, die mit einem Volumen Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (Verhältnis 50/48/2) extrahiert wird, vgl. Vorbereitung III.
Nach der Zentrifugation bei 4°C für 10 Min. mit 12 000 g wird das DNA-Pellet mit 1 ml Ethanol 70 gewaschen, lyophilisiert und in 17 μl sterilem Milli-Q-Wasser aufgenommen. Der Verdau mit XbaI wird für 2 Stunden bei 37°C durchgeführt.
Nach dem Verdau werden 4 μl Auftragpuffer (30% Sucrose, 0.25% Bromphenolblau) der Mischung zugegeben und auf einem 0.8% Agarosegel Seaplaque GTG (FMC, Rockland) analysiert. Die DNA-Bande, die mit pBluescript II SK(+)-Fragment FG oder FH, verdaut mit XbaI und BamHI, korrespondiert, wird entnommen und in 350 μl einer Tris 20 mM pH 8, EDTA 1 mM pH 8 Lösung aufgenommen. Diese Probe wird für 5 Min. bei 65°C inkubiert, mit einem Volumen Phenol extrahiert und für 5 Min. mit 10 000 g zentrifugiert. Die wässerige Phase wird abgenommen, mit einem Volumen Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (Verhältnis 50/48/2) extrahiert, vgl. Vorbereitung II1.
Nach der Zentrifugation bei 4°C für 10 Min. mit 12 000 g wird das DNA-Pellet mit 1 ml Ethanol 70 gewaschen, lyophilisiert und in 20 μl sterilem Milli-Q-Wasser wieder aufgenommen, um eine Lösung von 20 ng/μl des Plasmids pBluescript II SK(+)-Fragment FG oder FH (XbaI/BamHI) zu erhalten.
Die Ligation des Fragments XbaI/BamHI des Klons pUC18-Fragment DE mit dem Klon pBluescript II SK(+)-Fragment FG oder FH (XbaI/BamHI) wird für 4 Stunden bei Raumtemperatur durchgeführt.
Die für die Transformation verwendeten kompetenten Bakterien sind DH5 alpha (Gibco BRL, Paris).
Mehrere weiße Kolonien werden getestet. Dazu werden sie einzeln in 3 ml L-Broth supplementiert mit Ampicillin (50 μg/ml) aufgenommen und diese Kulturen werden unter Schütteln über Nacht bei 37°C inkubiert.
Zur Aufreinigung der Plasmid-DNA wird die Kultur zuallererst mit 1500 g für 10 Min. bei 4°C zentrifugiert und das Bakterienpellet wird mit dem Wizard Kit (Promega TM) behandelt, nach dem vom Hersteller vorgegebenen Protokoll.
Ein Aliquot (2 μl von 60 erhaltenen) wird einem enzymatischen Verdau mit den Restriktionsendonukleasen XbaI und HindIII unterzogen, um die Klonierung des Fragments XbaI/BamHI des Klons pUC18-Fragment DE in den Klon pBluescript II SK(+)-Fragment FG oder FH (BamHI/HindIII) zu verifizieren. Nach der Elektrophorese wird das Gel für 15 Min. in einer Ethidiumbromidlösung von 40 ng/ml gefärbt und die Anwesenheit des Fragments XbaI/HindIII von etwa 3900 bp unter UV verifiziert.
Dies Sequenzierreaktionen werden mit dem „T7 Sequencing" Kit (Pharmacia TM) durchgeführt, das die Kettenabbruchmethode verwendet und T7 DNA Polymerase erlaubt, die Unversehrtheit der Klone pBluescript II SK(+)-Fragment DEFG und pBluescript II SK(+)-Fragment DEFH zu verifizieren.
4/Erhalt der Fragmente ADEFG und ADEFH der vollständigen cDNA-Klone, die für die humane proα1(I)-Kette spezifisch sind.
Dieser Schritt besteht aus der Klonierung des Fragments SacII/NheI (Nucleotide –4 bis 479) von 495 bp des Klons pBluescript II SK(+)-Fragment A zwischen die Stellen SacII (des Plasmids pBluescript II SK(+)) und NheI (des Fragments DEFG oder DEFH) des Klons pBluescript II SK(+)-Fragment DEFG oder DEFH. Dies führt zum Erhalt der Klone pBluescript II SK(+)-Fragment ADEFG und pBluescript II SK(+)-Fragment ADEFH, die zwischen den Stellen SacII und HindIII die Sequenz aufweisen, die für die gesamte humane proα1(I)-Kette kodiert und das Stoppcodon TAA, verbunden mit der HindIII Restriktionsstelle. Eine andere HindIII Stelle befindet sich genau hinter der SacII-Stelle, was das Herausnehmen der Fragmente ADEFG und ADEFH durch einfachen Verdau mit der Restriktionsendonuklease HindIII erlaubt. Im Fall des Klons pBluescript II SK(+)-Fragment ADEFH sind 4 Codons, die spezifisch für die Sequenz KDEL (Lys, Asp, Glu, Leu) sind, zwischen die für die Carboxypropeptiddomäne kodierende Sequenz und das Stop codon TAA eingefügt. Die NheI-Stelle bringt die Substitution der Aminosäuren Asn und Phe durch Lysin und Leucin in den Positionen 158 und 159 der humanen proα1(I)-Kette mit sich.
Klonierung des Fragments A (SacII/NheI) mit dem NheI/HindIII Teil des Fragments DEFG oder DEFH.
Etwa 1 μg des Klons pBluescript II SK(+)-Fragment A wird mit der Restriktionsendonuklease SacII für 90 Min. bei 37°C verdaut.
Nach dem enzymatischen Verdau werden 80 μl TE Pfuffer (Tris 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8) der DNA-Lösung zugegeben, die mit einem Volumen Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (Verhältins 50/48/2) extrahiert wird, vgl. Vorbereitung II1.
Nach der Zentrifugation bei 4°C für 10 Min. mit 12 000 g wird das DNA-Pellet mit 1 ml Ethanol 70 gewaschen, lyophilisiert und in 35 μl sterilem Milli-Q-Wasser aufgenommen. Dieser DNA-Lösung werden 4 μl Verdaupuffer B (Promega TM), 1 μl Restriktionsendonuklease NheI (12 U/μl; Promega TM) zugegeben. Der Verdau wird für 2 Stunden bei 37°C durchgeführt.
Nach dem enzymatischen Verdau werden 8 μl Stopppuffer (30% Sucrose, 0.25 Bromphenolblau) der DNA-Lösung zugegeben, die mittels Elektrophorese auf einem 2% Agarosegel mit niedrigem Schmelzpunkt NueSieve-GTG (FMC, Rockland) bei konstanter Spannung von 60 Volt analysiert wird. Der Elektrophoresepuffer ist 0.5X TBE (Trisborat 45 mM, EDTA (Ethylendiamintetraacetat) 1 mM, pH 8). Nach der Wanderung wird das Gel für 15 Min. in einer 0.5X TBE Lösung, die 40 ng/ml Ethidiumbromid enthält, gefärbt.
Die Bande, die mit dem Fragment SacII/NheI von 495 bp korrespondiert, wird unter UV ausgeschnitten, in 350 μl einer Tris 20 mM pH 8, EDTA 1 mM pH 8 Lösung aufgenommen und für 5 Min. bei 65°C inkubiert. Nach dem Auflösen der Agarose wird die Probe mit einem Volumen Phenol extrahiert und für 5 Min. mit 10 000 g zentrifugiert. Die wässerige Phase wird abgenommen, mit einem Volumen Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (Verhältins 50/48/2) extrahiert, vgl. Vorbereitung II1.
Nach der Zentrifugation bei 4°C für 10 Min. mit 12 000 g wird das DNA-Pellet mit 1 ml Ethanol 70 gewaschen, lyophilisiert und in 20 μl sterilem Milli-Q-Wasser aufgenommen. Ein Aliquot von 2 μl sowie 500 ng HindIII-EcoRI Fragmente des Phagen Lambda (Promega TM) werden auf einem 2% Agarosegel Typ II (Sigma TM) analysiert, was uns erlaubte, die Konzentration der gereinigten Lösung des Fragments SacII/NheI des Klons pBluescript II SK(+)-Fragment A von 5 ng/μl abzuschätzen.
Das für die Klonierung des Fragments SacII/NheI des Klons pBluescript II SK(+)-Fragment A verwendete Plasmid ist der Klon pBluescript II SK(+)-Fragment DEFG oder DEFH, verdaut mit den Enzymen SacII und NheI. Dieser Klon weist ein Ampicillin-Resistenzgen auf.
Eine Menge von 500 ng des Plasmids pBluescript II SK(+)-Fragment DEFG oder DEFH wird einem Verdau mit der Restriktionsendonuklease SacII unterzogen. In einem Volumen von 20 μl für 2 Stunden bei 37°C. Nach dem Verdau werden 80 μl TE-Puffer (Tris 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8) der DNA-Lösung zugegeben, die mit einem Volumen Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (Verhältins 50/48/2) extrahiert wird, vgl. Vorbereitung II1.
Nach der Zentrifugation bei 4°C für 10 Min. mit 12 000 g wird das DNA-Pellet mit 1 ml Ethanol 70 gewaschen, lyophilisiert und in 17 μl sterilem Milli-Q-Wasser wieder aufgenommen. Der Verdau mit Nhcl wird für 2 Stunden bei 37°C durchgeführt.
Nach dem Verdau werden 4 μl Auftragpuffer (30% Sucrose, 0.25% Bromphenolblau) der Mischung zugegeben und auf einem 0.8% Agarosegel Seaplague GTG (FMC, Rockland) analysiert, vgl. Vorbereitung II4. Die DNA-Bande, die mit pBluescript II SK(+)-Fragment DEFG oder DEFH, verdaut mit SacII und NheI, korrespondiert, wird isoliert und in 350 μl einer Tris 20 mM pH 8, EDTA 1 mM pH 8 Lösung aufgenommen. Diese Probe wird für 5 Min. bei 65°C inkubiert, mit einem Volumen Phenol extrahiert und für 5 Min. mit 10 000 g zentrifugiert. Die wässerige Phase wird abgenommen, mit einem Volumen Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (Verhältnis 50/48/2) extrahiert, vgl. Vorbereitung II1.
Nach der Zentrifugation bei 4°C für 10 Min. mit 12 000 g wird das DNA-Pellet mit 1 ml Ethanol 70 gewaschen, lyophilisiert und in 20 μl sterilem Milli-Q-Wasser wieder aufgenommen, um eine Lösung von 20 ng/μl des Plasmids pBluescript II SK(+)-Fragment DEFG oder DEFH (SacII/NheI) zu erhalten.
Die Ligation des Fragments SacII/NheI des Klons pBluescript II SK(+)-Fragment A mit dem Klon pBluescript II SK(+)-Fragment DEFG oder DEFH (SacII/NheI) erfolg für 4 Stunden bei Raumtemperatur.
Die für die Transformation verwendeten kompetenten Bakterien sind DH5 alpha (Gibco BRL, Paris).
Mehrere weiße Kolonien werden getestet. Dazu werden sie einzeln in 3 ml L-Broth supplementiert mit Ampicillin (50 μg/ml) aufgenommen und diese Kulturen werden unter Schütteln über Nacht bei 37°C inkubiert.
Zur Aufreinigung der Plasmid-DNA wird die Kultur zuallererst mit 1500 g für 10 Min. bei 4°C zentrifugiert und das Bakterienpellet wird mit dem Wizard Kit (Promega TM) behandelt, nach dem vom Hersteller mitgegebenen Protokoll.
Ein Aliquot (2 μl von 60 erhaltenen) wird einem enzymatischen Verdau mit der Restriktionsendonuklease HindIII unterzogen, um die Klonierung des Fragments SacII/NheI des Klons pBluescript II SK(+)-Fragment A in den Klon pBluescript II SK(+)-Fragment DEFG oder DEFH (NheI/HindIII) zu verifizieren. Das Auftreten eines HindIII Fragments von 4400 bp validiert diese Klonierungen. Nach der Elektrophorese wird das Gel für 15 Min. in einer Ethidiumbromidlösung von 40 ng/ml gefärbt und die Anwesenheit des Fragments HindIII/HindIII von 4400 bp unter UV verifiziert.
Die Sequenzierreaktionen werden mit dem „T7 Sequencing" Kit (Pharmacia TM) durchgeführt, das die Kettenabbruchmethode verwendet und T7 DNA Polymerase erlaubt, die Unversehrtheit der Klone pBluescript II SK(+)-Fragment ADEFG und pBluescript II SK(+)-Fragment ADEFH zu bestätigen.
Zur Erinnerung, der Klon pBluescript II SK(+)-Fragment ADEFG umfasst zwischen diesen zwei HindIII Stellen die gesamte für die humane proα1(I)-Kette kodierende Sequenz.
Der Klon pBluescript II SK(+)-Fragment ADEFH umfasst zwischen diesen zwei HindIII Stellen die gesamte für die humane proα1(I)-Kette kodierende Sequenz. Zudem bringt er im carboxyterminalen Teil dieser Kette die Sequenz für die. Zurückhaltung im endoplasmatischen Retikulum Lys-Asp-Glu-Leu hervor.
5/Erhalt des Fragments BDEFG cDNA-Klon, der für das Signalpeptid PRS von Pflanzen und die gesamte humane proα1(I)-Kette mit Ausnahme der Amino-Propeptiddomäne kodiert.
Dieser Schritt besteht darin, das Fragment SacII/NheI (Nukleotide – 3 bis 75) von 90 bp des Klons pBluescript II SK(+)-Fragment B zwischen die Stellen SacII (des Plasmids pBluescript II SK(+)) und NheI (des Fragments DEFG) des Klons pBluescript II SK(+)-Fragment DEFG zu klonieren. Dies führt zum Erhalt des Klons pBluescript II SK(+)-Fragment BDEFG, der zwischen den Stellen SacII und HindIII die Sequenz aufweist, die für das Signalpeptid PRS von Pflanzen, die gesamte humane proα1(I)-Kette mit Ausnahme der Aminopropeptiddomäne und das Stoppcodon TAA, verbunden mit der Restriktionsstelle HindIII, kodiert. Eine andere HindIII Stelle ist genau nach der SacII Stelle angeordnet, was das Herausnehmen des Fragments BDEFG durch einfachen Verdau mit der Restriktionsendonuklease HindIII erlaubt. Die NheI Stelle bewirkt die Substitution der Aminosäuren Glu und Gly durch ein Leucin und ein Alanin in den Positionen 25 und 26 der humanen proα1(I)-Kette.
Das Signalpeptid PRS (Pathogenesis-Related Protein S) von Pflanzen ersetzt das eigene Signalpeptid der humanen proα1(I)-Kette.
Klonierung des Fragments B (SacII/NheI) mit dem NheI/HindIII Teil des Fragments DEFG.
Etwa 2 μg des Klons pBluescript II SK(+)-Fragment B werden mit der Restriktionsendonuklease SacII für 90 Min. bei 37°C verdaut.
Nach dem enzymatischen Verdau werden 80 μl TE-Puffer (Tris 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8) der DNA-Lösung zugegeben, die mit einem Volumen Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (Verhältnis 50/48/2) extrahiert wird, vgl. Vorbereitung II1.
Nach der Zentrifugation bei 4°C für 10 Min. mit 12 000 g wird das DNA-Pellet mit 1 ml Ethanol 70 gewaschen, lyophilisiert und in 34 μl sterilem Milli-Q-Wasser aufgenommen. Der Verdau mit Nhcl wird für 2 Stunden bei 37°C durchgeführt.
Nach dem enzymatischen Verdau werden 8 μl Stopppuffer (30% Sucrose, 0.25% Bromphenolblau) der DNA-Lösung zugegeben, die mittels Elektrophorese auf einem 2% Agarosegel mit niedrigem Schmelzpunkt NueSieve-GTG (FMC, Rockland) analysiert wird, vgl. Vorbereitung II1.
Die Bande, die mit dem Fragment SacII/NheI von 90 bp korrespondiert, wird unter UV ausgeschnitten, in 350 μl einer Tris 20 mM pH 8, EDTA 1 mM pH 8 Lösung aufgenommen und für 5 Min. bei 65°C inkubiert. Nach dem Auflösen der Agarose wird die Probe mit einem Volumen Phenol extrahiert und für 5 Min. mit 10 000 g zentrifugiert. Die wässerige Phase wird abgenommen, mit einem Volumen Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (Verhältnis 50/48/2) extrahiert, vgl. Vorbereitung II1.
Nach der Zentrifugation bei 4°C für 10 Min. mit 12 000 g wird das DNA-Pellet mit 1 ml Ethanol 70 gewaschen, lyophilisiert und in 20 μl sterilem Milli-Q-Wasser wieder aufgenommen. Ein Aliquot von 2 μl sowie 500 ng der HindIII/EcoRI Fragmente des Phagen Lambda (Promega TM) werden auf einem 2% Agarosegel Typ II (Sigma TM) analysiert, was uns erlaubte, die Konzentration der gereinigten Lösung des Fragments SacII/NheI des Klons pBluescript II SK(+)-Fragment B von 1 ng/μl abzuschätzen.
Das für die Klonierung des Fragments SacII/NheI des Klons pBluescript II SK(+)-Fragment B verwendete Plasmid ist der Klon pBluescript II SK(+)-DEFG, verdaut mit den Enzymen SacII und NheI. Dieser Klon weist ein Ampicillin-Resistenzgen auf.
Eine Menge von 500 ng des Plasmids pBluescript II SK(+)-Fragment DEFG wird einem Restriktionsendonukleaseverdau mit SacII unterzogen. In einem Volumen von 20 μl für 2 Stunden bei 37°C. Nach dem Verdau werden 80 μl von TE-Puffer (Tris 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8) einer DNA-Lösung zugegeben, die mit einem Volumen Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (Verhältnis 50/48/2) extrahiert wird, vgl. Vorbereitung II1.
Nach der Zentrifugation bei 4°C für 4 Min. mit 12 000 g wird das DNA-Pellet mit 1 ml Ethanol 70 gewaschen, lyophilisiert und in 17 μl sterilem Milli-Q-Wasser aufgenommen. Der Verdau mit Nhcl wird für 2 Stunden bei 37°C durchgeführt.
Nach dem Verdau werden 4 μl Auftragpuffer (30% Sucrose, 0.25% Bromphenolblau) der Mischung zugegeben und auf einem 0.8% Agarosegel Seaplaque GTG (FMC, Rockland) analysiert, vgl. Vorbereitung II4. Die DNA-Bande, die mit dem pBluescript II SK(+)-Fragment DEFG, verdaut mit SacII und NheI, korrespondiert, wird isoliert und in 350 μl einer Tris 20 mM pH 8, EDTA 1 mM pH 8 Lösung aufgenommen. Diese Probe wird 5 Min. bei 65°C inkubiert, mit einem Volumen Phenol extrahiert und für 5 Min. mit 10 000 g zentrifugiert. Die wässerige Phase wird abgenommen, mit einem Volumen Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (Verhältnis 50/48/2) extrahiert, vgl. Vorbereitung II1.
Nach der Zentrifugation bei 4°C für 10 Min. mit 12 000 g wird das DNA-Pellet mit 1 ml Ethanol 70 gewaschen, lyophilisiert und in 20 μl sterilem Milli-Q-Wasser wieder aufgenommen, um eine Lösung von 20 ng/μl des Plasmids pBluescript II SK(+)-Fragment DEFG (SacII/NheI) zu erhalten.
Die Ligation des Fragments SacII/NheI des Klons pBluescript II SK(+)-Fragment B mit dem Klon pBluescript II SK(+)-Fragment DEFG (SacII/NheI) erfolgt für 4 Stunden bei Raumtemperatur.
Die für die Transformation verwendeten kompetenten Bakterien sind DH5 alpha (Gibco BRL, Paris).
Mehrere weiße Kolonien werden getestet. Dazu werden sie einzeln in 3 ml L-Broth supplementiert mit Ampicillin (50 μg/ml) aufgenommen und diese Kulturen werden unter Schütteln über Nacht bei 37°C inkubiert.
Zur Aufreinigung der Plasmid-DNA wird die Kultur zuallererst mit 1500 g für 10 Min. bei 4°C zentrifugiert und das Bakterienpellet mit dem Wizard Kit (Promega TM) behandelt, nach dem vom Hersteller vorgegebenen Protokoll.
Ein Aliquot (2 μl von 60 erhaltenen) wird einem enzymatischen Verdau mit der Restriktionsendonuklease HindIII unterzogen, um die Klonierung des Fragments SacII/NheI des Klons pBluescript II SK(+)-Fragment B in den Klon pBluescript II SK(+)-Fragment DEFG (NheI/HindIII) zu verifizieren. Das Auftreten eines HindIII Fragments von 4000 bp bestätigt diese Klonierung. Nach der Elektrophorese wird das Gel 15 Min. in einer Ethidiumbromidlösung von 40 ng/ml gefärbt und die Anwesenheit des HindIII/HindIII Fragments von 4000 bp unter UV verifiziert.
Die Sequenzierreaktionen werden mit dem „T7 Sequencing" Kit (Pharmacia TM) durchgeführt, das die Kettenabbruchtechnik verwendet und T7 DNA Polymerase erlaubt, die Unversehrtheit des Klons pBluescript II SK(+)-Fragment BDEFG zu bestätigen.
Zur Erinnerung, der Klon pBluescript II SK(+)-Fragment BDEFG umfasst zwischen diesen zwei HindIII Stellen die für das Signalpeptid PRS von Pflanzen kodierende Sequenz und die gesamte humane proα1(I)-Kette mit Ausnahme der Aminopropeptiddomäne.
Die Schaffung der NheI Stelle bewirkt die Substitution der Aminosäuren Glu und Gly durch Leucin und Alanin in den Positionen 25 und 26 der humanen proα1(I)-Kette.
6/Erhalt des Fragments BCDEFG, cDNA-Klon, der für das Signalpeptid PRS von Pflanzen und die gesamte humane proα1(I)-Kette kodiert.
Dieser Schritt besteht darin, das Fragment NheI/NheI (Nukleotide 72 bis 479) von 402 bp des Klons pBluescript II SK(+)-Fragment C in die NheI Stelle (des Fragments BDEFG) des Klons pBluescript II SK(+)-Fragment BDEFG zu klonieren. Dies führt zum Erhalt des Klons pBluescript II SK(+)-Fragment BCDEFG, der zwischen den Stellen SacII und HindIII die Sequenz aufweist, die für das Signalpeptid PRS von Pflanzen, die gesamte humane proα1(I)-Kette und das Stoppcodon TAA, verbunden mit der Restriktionsstelle HindIII, kodiert. Eine andere HindIII Stelle ist direkt nach der SacII Stelle lokalisiert, was das Herausnehmen des Fragments BCDEFG durch einfachen Verdau mit der Restriktionsendonuklease HindIII erlaubt. Die NheI Stellen führen zur Substitution der Aminosäuren Glu und Gly durch ein Leucin und ein Alanin in den Positionen 25 und 26 der humanen proα1(I)-Kette und zur Substitution der Aminosäuren Asn und Phe durch ein Lysin und ein Leucin in den Positionen 158 und 159 der humanen proα1(I)-Kette.
Das Signalpeptid PRS von Pflanzen ersetzt das eigene Signalpeptid der humanen proα1(I)-Kette.
Klonierung des Fragments C (NheI/NheI) in die NheI Stelle des Fragments BDEFG.
Etwa 1 μg des Klons pBluescript II SK(+)-Fragment C wird mit der Restriktionsendonuklease NheI für 90 Min. bei 37°C verdaut.
Nach dem enzymatischen Verdau werden 4 μl Stopppuffer (30% Sucrose, 0.25 % Bromphenolblau) der DNA-Lösung zugegeben, die mittels Elektrophorese auf einem 2% Agarosegel mit niedrigem Schmelzpunkt NueSieve-GTG (FMC, Rockland) analysiert wird, vgl. Vorbereitung II1.
Die Bande, die mit dem Fragment NheI/NheI von 402 bp korrespondiert, wird unter UV ausgeschnitten, in 350 μl einer Tris 20 mM pH 8, EDTA 1 mM pH 8 Lösung aufgenommen und für 5 Min. bei 65°C inkubiert. Nach dem Auflösen der Agarose, wird die Probe mit einem Volumen Phenol extrahiert und 5 Min. mit 10 000 g zentrifugiert. Die wässerige Phase wird abgenommen, mit einem Volumen Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (Verhältnis 50/48/2) extrahiert, vgl. Vorbereitung II1.
Nach der Zentrifugation bei 4°C für 10 Min. mit 12 000 g wird das DNA Pellet mit 1 ml Ethanol 70 gewaschen, lyophilisiert und in 20 μl sterilem Milli-Q-Wasser wieder aufgenommen. Ein Aliquot von 2 μl sowie 500 ng der HindIII-EcoRI Fragmente des Phagen Lambda (Promega TM) werden auf einem 2% Agarosegel Typ II (Sigma TM) analysiert, was uns erlaubte, die Konzentration der gereinigten Lösung des NheI/NheI Fragments des Klons pBluescript II SK(+)-Fragment C von 5 ng/μl abzuschätzen.
Das für die Klonierung des Fragments NheI/NheI des Klons pBluescript II SK(+)-Fragment C verwendete Plasmid ist der Klon pBluescript II SK(+)-Fragment BDEFG, linearisiert mit dem Enzym NheI. Dieser Klon weist ein Ampicillin-Resistenzgen auf.
Eine Menge von 250 ng des Plasmids pBluescript II SK(+)-Fragment BDEFG wird einem Restriktionsendonukleaseverdau mit NheI unterzogen. In einem Volumen von 20 μl für 2 Stunden bei 37°C. Nach dem Verdau werden 80 μl TE-Puffer (Tris 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8) der DNA-Lösung zugegeben, die mit einem Volumen Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (Verhältnis 50/48/2) extrahiert wird, vgl. Vorbereitung II1. [0320] Nach der Zentrifugation bei 4°C für 10 Min. mit 12 000 g wird das DNA Pellet mit 1 ml Ethanol 70 gewaschen, lyophilisiert und in 17 μl sterilem Milli-Q-Wasser wieder aufgenommen. Dieser DNA-Lösung werden 2 μl 10X Calf-intestine-phosphatase Puffer (CIP, Promega TM), 1 μl CIP (1 U/μl; Promega TM) zugegeben. Die Dephosphorylierung wird für eine Stunde bei 37°C durchgeführt. Dieser Schritt erlaubt es, die Autoligation dieses Klons während des Ligationsschritts zu verhindern. [0321] Nach dem Verdau werden 80 μl TE-Puffer (Tris 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8) der DNA-Lösung zugegeben, die mit einem Volumen Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (Verhältnis 50/48/2) extrahiert wird, vgl. Vorbereitung II1.
Nach der Zentrifugation bei 4°C für 10 Min. mit 12 000 g wird das DNA Pellet mit 1 ml Ethanol 70 gewaschen, lyophilisiert und in 20 μl sterilem Milli-Q-Wasser aufgenommen, um eine Lösung von 10 ng/μl des Plasmids pBluescript II SK(+)-Fragment BDEFG (NheI, dephosphoryliert) zu erhalten.
Die Ligation des Fragments NheI/NheI des Klons pBluescript II SK(+)-Fragment C mit dem Klon pBluescript II SK(+)-Fragment BDEFG (NheI, desphosphoryliert) wird für 4 Stunden bei Raumtemperatur durchgeführt.
Die für die Transformation verwendeten kompetenten Bakterien sind DH5 alpha (Gibco BRL, Paris).
Mehrere weiße Kolonien werden getestet. Dazu werden sie einzeln in 3 ml L-Broth supplementiert mit Ampicillin (50 μg/ml) aufgenommen und diese Kulturen werden unter Schütteln über Nacht bei 37°C inkubiert.
Zur Aufreinigung der Plasmid-DNA wird die Kultur zuallererst mit 1500 g für 10 Min. bei 4°C zentrifugiert und das Bakterienpellet wird mit dem Wizard Kit (Promega TM) behandelt, nach dem vom Hersteller vorgegebenen Protokoll.
Eine Aliquot (2 μl von 60 erhaltenen) wird einem enzymatischen Verdau mit der Restriktionsendonuklease NheI unterzogen, um die Klonierung des NheI/NheI Fragments des Klons pBluescript II SK(+)-Fragment C in den Klon pBluescript II SK(+)-Fragment BDEFG (NheI) zu verifizieren. Das Auftreten eines NheI-Fragments von 402 bp bestätigt diese Klonierungen. Nach der Elektrophorese wird das Gel für 15 Min. mit einer Ethidiumbromidlösung von 40 ng/ml gefärbt und die Anwesenheit des NheI-Fragments von 402 bp unter UV verifiziert.
Die Sequenzierreaktionen werden mit dem „T7 Sequencing"-Kit (Pharmacia TM) durchgeführt, das die Kettenabbruchmethode verwendet und T7-Polymerase erlaubt, die Unversehrtheit des Klons pBluescript II SK(+)-Fragment BCDEFG zu bestätigen.
Zur Erinnerung, der Klon pBluescript II SK(+)-Fragment BCDEFG umfasst zwischen diesen zwei HindIII Stellen die Sequenz, die für das Signalpeptid PRS von Pflanzen und die gesamte humane proα1(I)-Kette kodiert.
Die Schaffung der Nhe Stellen bewirkt die Substitution der Aminosäuren Glu und Gly durch ein Leucin und ein Alanin in den Positionen 25 und 26 der humanen proα1(I)-Kette und die Substitution der Aminosäuren Asn und Phe durch ein Lysin und ein Leucin in den Positionen 158 und 159 der humanen proα1(I)-Kette.
7/Erhalt von 4 humanen rekombinanten gBIOC21- Kollagenkonstrukten.
Die Konstruktion verschiedener Plasmide mittels Verwendung rekombinanter DNA-Techniken führt zu pBIOC4. Das binäre Plasmid stammt von pGA442 (An, 1986). Das Plasmid, das von pBIOC4 stammt und die Expressionskassette „PD35S-T35S" enthält, ist das Plasmid pBIOC21.
Die verschiedenen Elemente, die es erlauben, diese Konstrukte nachzubilden, sind beispielsweise in der Beschreibung der Patentanmeldung WO9633277 enthalten, die durch Referenz eingefügt ist.
Vier humane rekombinante pBIOC21-Kollagenkonstrukte werden durch Überführen von 4 Konstrukten des Plasmids pBluescript II SK(+) in das Plasmid pBIOC21 erhalten.
Das Plasmid pBIOC21 wird verwendet, um die Expression rekombinanten Kollagens in den Blättern und den Samen des Tabaks und Raps zu ermöglichen. Es enthält folgende regulative Sequenzen:

a) den konstitutiven zweifachen Promotor 35S (PC35S) des Blumenkohl-Mosaik-Virus (CaMV). Er korrespondiert mit einer Verdopplung der Transkriptionsaktivierungssequenz, die stromaufwärts des TATA-Elements des natürlichen 35S-Promotors angeordnet ist.
b) die Transkriptionsterminationsequenz, den Terminator PolyA 35S, die mit der 3' nicht-kodierenden Sequenz der Sequenz des zirkulären doppelsträngigen DNA-Virus des CaMV korrespondiert, der das 35S-Transkript produziert.

Klonierung der Fragmente (HindIII/HindIII) der pBluescript-Konstrukte in die HindIII-Klonierungsstelle des pBIOC21-Vektors.
Etwa 1 μg des Klons pBluescript II SK(+)-Fragment ADEFG oder ADEFH oder BDEFG oder BCDEFG wird mit der Restriktionsendonuklease HindIII für 90 Min. bei 37°C verdaut.
Nach dem enzymatischen Verdau werden 4 μl Stopppuffer (30% Sucrose, 0.25 % Bromphenolblau) der DNA-Lösung zugegeben, die mittels Elektrophorese auf einem 0.8% Agarosegel mit niedrigem Schmelzpunkt SeaPlaque-GTG (FMC, Rockland) analysiert wird, vgl. Vorbereitung II4.
Die Bande, die mit dem HindIII/HindIII Fragment von 4400 bp korrespondiert, wird unter UV ausgeschnitten, in 350 μl einer Tris 20 mM pH 8, EDTA 1 mM pH 8 aufgenommen und für 5 Min. bei 65°C inkubiert. Nach dem Auflösen der Agarose, wird die Probe mit einem Volumen Phenol extrahiert und für 5 Min. mit 10 000 g zentrifugiert. Die wässrige Phase wird abgenommen, mit einem Volumen Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (Verhältnis 50/48/2) extrahiert, vgl. Vorbereitung II1.
Nach der Zentrifugation bei 4°C für 10 Min. mit 12 000 g wird das DNA-Pellet mit 1 ml Ethanol 70 gewaschen, lyophilisiert und in 20 μl sterilem Milli-Q-Wasser wieder aufgenommen. Ein Aliquot von 2 μl sowie 500 ng der HindIII-EcoRI Fragmente des Phagen Lamda (Promega TM) werden auf einem 0.8 % Agarosegel Typ II (Sigma TM) analysiert, was uns erlaubte, die Konzentration der gereinigten Lösung des Fragments HindIII/HindIII des Klons pBluescript II SK(+)-Fragment ADEFG oder ADEFH oder BDEFG oder BCDEFG auf 25 ng/μl abzuschätzen.
Das für die Klonierung des HindIII/HindIII Fragments des Klons pBluescript II SK(+)-Fragment ADEFG oder ADEFH oder BDEFG oder BCDEFG verwendete Plasmid ist der Klon pBIOC21, linearisiert durch das Enzym HindIII. Dieser Klon weist ein Tetracyclin-Resistenzgen auf.
Eine Menge von 1 μg des Plasmids pB1OC21 wird einem Restriktionsendonukleaseverdau mit HindIII unterzogen. In einem Volumen von 20 μl für 2 Stunden bei 37°C. Nach dem Verdau werden 80 μl TE-Puffer (Tris 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8) der DNA-Lösung zugegeben, die mit einem Volumen Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (Verhältnis 50/48/2) extrahiert wird, vgl. Vorbereitung II1.
Nach der Zentrifugation bei 4°C für 10 Min. mit 12 000 g wird das DNA-Pellet mit 1 ml Ethanol 70 gewaschen, lyophilisiert und in 17 μl sterilem Milli-Q-Wasser wieder aufgenommen. Zu dieser DNA-Lösung werden 2 μl 10X Calf-intestine-phosphatase Puffer (CIP, Promega TM), 1 μl CIP (1 U/μl; Promega TM) zugegeben.
Die Dephosphorylierung wird für 1 Stunde bei 37°C durchgeführt. Dieser Schritt erlaubt, die Autoligation dieses Klones während des Ligationsschritts zu verhindern.
Nach dem Verdau werden 80 μl TE-Puffer (Tris 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8) der DNA-Lösung zugegeben, die mit einem Volumen Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (Verhältnis 50/48/2) extrahiert wird, vgl. Vorbereitung II1.
Nach der Zentrifugation bei 4°C für 10 Min, mit 12 000 g wird das DNA Pellet mit 1 ml Ethanol 70 gewaschen, lyophilisiert und in 20 μl sterilem Milli-Q-Wasser wieder aufgenommen, um eine Lösung von 40 ng/μl des Plasmid pBIOC21 (HindIII, desphophoryliert) zu erhalten.
Die Ligation des HindIII/HindIII Fragments des Klons pBluescript II SK(+)-Fragment ADEFG oder ADEFH oder BDEFG oder BCDEFG mit dem Klon pBIOC21 (HindIII, dephosphoryliert) erfolgt für 4 Stunden bei Raumtemperatur.
Die für die Transformation verwendeten kompetenten Bakterien sind DH5 alpha (Gibco BRL, Paris).
Mehrere weiße Kolonien werden getestet. Dazu werden sie einzeln in 3 ml L-Broth supplementiert mit Tetracyclin (40 μg/ml) aufgenommen und diese Kulturen werden unter Schütteln über Nacht bei 37°C inkubiert.
Zur Aufreinigung der Plasmid-DNA wird die Kultur zuallererst mit 1500 g für 10 Min. bei 4°C zentrifugiert und das Bakterienpellet wird mit dem Wizard Kit (Promega TM) behandelt, nach dem vom Hersteller vorgegebenen Protokoll. Etwa 1 bis 2 μg der Plasmid-DNA werden mit Hilfe dieses Kits aufgereinigt, wenn das verwendete Plasmid pBIOC21 ist.
Ein Aliquot (5 μl von 60 erhaltenen) wird einem enzymatischen Verdau mit der Restriktionsendonuklease KpnI unterzogen, um die Orientierung des klonierten HindIII Fragments des Klons pBluescript II SK(+)-Fragment ADEFG oder ADEFH oder BCDEFG im Klon pBIOC21 (HindIII) zu verifizieren. Das Auftreten eines KpnI Fragments von 950 bp ist spezifisch für eine korrekte Orientierung. Dieses KpnI Fragment von 950 bp resultiert aus einer KpnI Restriktionsstelle in Position 2.8 kb des Vektors pBIOC21 und einer KpnI-Stelle in Position 137 der für die humane proα1(I)-Kette kodierenden Sequenz. Nach der Elektrophorese wird das Gel für 15 Min. in einer Ethidiumbromidlösung von 40 ng/ml gefärbt und die Anwesenheit des KpnI Fragments von 950 bp unter UV verifiziert.
Im Fall des Konstrukts pBIOC21-Fragment BDEFG haben wir das Enzym NheI verwendet und sein Restriktionsmuster mit dem Vektor pBIOC21-Fragment BCDEFG, verdaut mit NheI verglichen. Der einzige Unterschied ist die Anwesenheit eines zusätzlichen NheI/NheI Fragments im Fall des Vektors pBIOC21-Fragment BCDEFG.
Die Sequenzierreaktionen wurden mit dem „T7 Sequencing"-Kit (Pharmacia TM) durchgeführt, das die Kettenabbruchmethode verwendet und die T7-DNA-Polymerase erlaubt, die Unversehrtheit der 4 erhaltenen pBIOC21-Konstrukte zu bestätigen.
Die Sequenzen der 4 Konstrukte werden nun angegeben. In jedem Fall ist das Signalpeptid PRS von Pflanzen oder der humanen proα1(I)-Kette unterstrichen, die Substitutionen der Aminosäuren, die auf die Schaffung einer oder zweier NheI Restriktionsstellen zurückzuführen sind, sind fettgedruckt angegebenen ebenso wie die Sequenz zur Zurückhaltung im endoplasmatischen Retikulum KDEL. Die Erkennungsstellen der Amino- und Carboxyproteinasen sind in Relief angezeigt.
Die so erhaltenen pBIOC21-Kollagenkonstrukte (5 und 6) werden wie folgt benannt:

– pBIOC704 für das Konstrukt enthaltend das Fragment ADEFG
– pBiOC705 für das Konstrukt enthaltend das Fragment ADEFH
– pBIOC706 für das Konstrukt enthaltend das Fragment BDEFG
– pBIOC707 für das Konstrukt enthaltend das Fragment BCDEFG

Die Plasmid-DNA der binären Plasmide pBIOC704, pBIOC705, pBIOC706 und pBIOC707, wurde durch direkte Transformation in den Stamm LBA4404 von Agrobacterium tumefaciens nach dem Verfahren von Holster (1978) eingeführt. Die Validität der erhaltenen Klone wird durch enzymatischen Verdau der eingeführten Plasmid-DNA verifiziert.
Wiederherstellung der Aminosäuren Asn und Phe in den Positionen 158 und 159 der humanen proα1(I)-Kette in den Klonen ADEFG, ADEFH und BCDEFG.
Alle diese Klone sind in dem Vektor pBluescript II SK(+) (Stratagene, TM) enthalten. Dazu werden die Sequenzen, die zwischen den Stellen KpnI (Basen 137 bis 142) und DraIII (Basen 1709 bis 1720) diese Konstrukte umfassen, durch die Sequenz KpnI-DraIII des cDNA-Klons 1alpha3 ausgetauscht. Dieser Vorgang bewirkt die Wiederherstellung der Aminosäuren 158 und 159 der proα1(I)-Kette (Asn und Phe). Dieser Vorgang wurde durchgeführt, da Morikawa (1980) gezeigt haben, dass die Position 159 (Phe), die drei Aminosäuren stromaufwärts der Spaltstelle Pro-Gln lokalisiert ist, eine wichtige Rolle für die Abschaltung der proα1(I)-Kette durch die Aminoproteinase zu spielen scheint.
1/Eliminierung der KpnI Restriktionsstelle des Vektors pUC18
Der Vektor pUC18 wurde verwendet, da er keine interne DraIII Restriktionsstelle besitzt, im Unterschied zum Vektor pBluescript II SK(+). Die Eliminierung der KpnI Restriktionsstelle erlaubt die Verwendung der Enzyme DraIII und KpnI im Hinblick auf den Austausch der rekombinanten KpnI-DraIII Fragmente der Klone ADEFG oder ADEFH oder BCDEFG durch das KpnI-DraIII Wildtypfragment des cDNA-Klons 1alpha3.
Dazu werden 100 ng des Vektors pUC18 mit der Restriktionsendonuklease KpnI (Promega TM) nach Empfehlung des Herstellers verdaut. Der mit KpnI linearisierte Vektor wurde anschließend mit der Mung Bean Nuklease (Promega, TM) nach Empfehlungen des Herstellers behandelt, um einen Vektor pUC18 KpnI mit freien Enden zu erhalten. Die Ligationsschritte, die Transformation und die Sequenzierung der erhaltenen Klone wurden wie im Teil Vorbereitung II gezeigt, durchgeführt.
2/Transfer der Fragmente ADEFG, ADEFH und BCDEFG in den Vektor pUC18minus KpnI
Dazu werden 200 ng der Konstrukte pBluescript II SK(+)-ADEFG oder ADEFH oder BCDEFG mit der Restriktionsendonuklease HindIII (Promega, TM) nach Empfehlung des Herstellers verdaut.
Nach dem enzymatischen Verdau werden 4 μl Stopppuffer (30% Sucrose, 0.25% Bromphenolblau) der DNA-Lösung zugegeben, die mittels Elektrophorese auf einem 0.8 % Agarosegel mit niedrigem Schmelzpunkt SeaPlaque-GTG (FMC, TM) bei konstanter Spannung von 60 Volt analysiert wird. Der Elektrophoresepuffer ist 0.5X TBE (Trisborat 45 mM, EDTA (Ethylendiamintetraacetat) 1 mM, pH 8). Nach der Wanderung wird das Gel für 15 Min. in einer 0.5X TBE Lösung, die 40 ng/ml Ethidiumbromid enthält, gefärbt.
Die Bande, die mit dem Fragment ADEFG oder ADEFH oder BCDEFG korrespondiert, wird unter UV ausgeschnitten, in 350 μl eine Tris 20 mM pH 8, EDTA 1 mM pH 8 aufgenommen und für 5 Min. bei 65°C inkubiert. Nach dem Auflösen der Agarose, wird die Probe mit einem Volumen Phenol extrahiert und 5 Min. mit 10 000 g zentrifugiert. Die wässrige Phase wird abgehoben, mit einem Volumen Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (Verhältnis 50/48/2) extrahiert und für 2 Min. mit 10 000 g zentrifugiert. Die wässrige Phase wird mit Chloroform/Isoamylalkohol (Verhältnis 24/1) extrahiert und einige Sekunden mit 10 000 g zentrifugiert. Die wässrige Phase wird abgenommen, auf eine Endkonzentration von 0.2 M NaCl eingestellt und 16 Stunden bei –20°C nach Zugabe von zwei Volumen Ethanol 100 gefällt.
Nach der Zentrifugation bei 4°C für 10 Min. mit 12 000 g wird das DNA Pellet mit 1 ml Ethanol 70 gewaschen, lyophilisiert und in 20 μl sterilem Milli-Q-Wasser wieder aufgenommen. Ein Aliquot von 2 μl sowie 500 ng der HindIII-EcoRI Fragmente des Phagen Lambda (Promega, TM) werden auf einem 0,8 % Agarosegel TypII (Sigma, TM) analysiert, was uns erlaubte, die Konzentration der gereinigten Lösung des Fragments D BamHI/XbaI von 5 ng/μl abzuschätzen.
Das für die Klonierung des HindIII Fragments des Klons pBluescript II SK(+)-Fragment ADEFG oder ADEFH oder BCDEFG verwendete Plasmid ist der Klon pUC18minus KpnI, linearisiert durch das Enzym HindIII. Dieser Klon weist ein Ampicillin-Resistenzgen auf.
Eine Menge von 250 ng des Plasmids pUC18minus KpnI wird einem Restriktionsendonukleaseverdau mit HindIII, nach den Empfehlungen des Herstellers, unterzogen. Nach diesem Verdau wird die DNA mit der Calf-intestine-phosphatase (CIP, Promega, TM), nach den Empfehlungen des Herstellers, behandelt. Dieser Schritt erlaubt, die Autoligation dieses Klons während des Ligationschritts zu verhindern.
Nach dem Verdau werden 80 μl TE-Puffer (Tris 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8) zu der DNA-Lösung zugegeben, die mit einem Volumen Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (Verhältnis 50/48/2) extrahiert wird und für 2 Min. mit 10 000 g zentrifugiert wird. Die wässrige Phase wird mit Chloroform/Isoamylalkohol (Verhältnis 24/1) extrahiert und einige Sekunden mit 10 000 g zentrifugiert. Die wässrige Phase wird entnommen, auf eine Endkonzentration von 0.2 M NaCl eingestellt und 16 Stunden bei –20°C nach Zugabe von zwei Volumen Ethanol 100 präzipitiert.
Nach der Zentrifugation bei 4 °C für 10 Min. mit 12 000 g wird das DNA Pellet mit 1 ml Ethanol 70 gewaschen, lyophilisiert und in 20 μl sterilem Milli-Q-Wasser wieder aufgenommen, um eine Lösung von 10 ng/μl des Plasmids pUC18minus KpnI (HindIII, dephosphoryliert) zu erhalten.
Die Ligation des HindIII Fragments des Klons pBluescript II SK(+)-Fragment ADEFG oder ADEFH oder BCDEFG mit dem Vektor pUC18minus KpnI (HindIII, dephosphoryliert) wird für 4 Stunden bei Raumtemperatur durchgeführt.
Die für die Transformation verwendeten kompetenten Bakterien sind DH5 alpha (Gibco BRL, TM).
Mehrere weiße Kolonien werden getestet. Dazu werden Sie einzeln in 3 ml L-Broth supplementiert mit Ampicillin (50 μg/ml) aufgenommen und diese Kulturen werden unter Schütteln über Nacht bei 37°C inkubiert.
Zur Aufreinigung der Plasmid-DNA wird die Kultur zuallererst mit 1500 g für 10 Min. bei 4°C zentrifugiert und das Bakterienpellet wird mit dem Wizard Kit (Promega, TM) behandelt, das die Aufreinigung von supercoild Plasmid-DNA erlaubt. Diese Handhabung erfolgt nach dem vom Hersteller vorgegebenen Protokoll. Etwa 10 μg der Plasmid-DNA werden mit Hilfe dieses Kits gereinigt, wenn das verwendete Plasmid pUC18 ist.
Ein Aliquot (2 μl von 60 erhaltenen) wird einem enzymatischen Verdau mit der Restriktionsendonuklease HindIII unterzogen, um die Klonierung des Fragments HindIII des Klons pBluescript II SK(+)-Fragment ADEFG oder ADEFH oder BCDEFG in den Klon pUC18minus KpnI (HindIII) zu verifizieren. Nach der Elektrophorese wird das Gel für 15 Min. in einer Ethidiumbromidlösung von 40 ng/ml gefärbt und die Anwesenheit des HindIII Fragments von 4400 bp unter UV verifiziert.
Die Sequenzierreaktionen werden mit dem „T7 Sequencing" Kit (Pharmacia TM) durchgeführt, das die Kettenabbruchmethode verwendet und T7 DNA Polymerase (vgl. Vorbereitung 1) erlaubt, die Vollständigkeit der Klonierung zu validieren.
3/Austausch der rekombinanten KpnI-DraIII Fragmente der Klone ADEFG, ADEFH und BCDEFG durch das Wildtyp KpnI-DraIII Fragment des cDNA-Klons 1alpha3.
Dazu werden 500 ng des cDNA-Klons 1alpha3 mit den Restriktionsendonucleasen KpnI (Promega, TM) und DraIII (Boehringer Mannheim) nach den Empfehlungen des Herstellers verdaut.
Nach dem enzymatischen Verdau werden 4 μl Stopppuffer (30% Sucrose, 0.25% Bromophenolblau) zu der DNA-Lösung zugegeben, die mittels Elektrophorese auf einem 0.8 % Agarosegel mit niedrigem Schmelzpunkt SeaPlaque-GTG (FMC, Rockland, TM) bei konstanter Spannung von 60 Volt analysiert wird. Der Elektrophoresepuffer ist 0.5X TBE (Trisborat 45 mM, EDTA (Ethylendiamintetraacetat) 1 mM, pH 8). Nach der Wanderung wird das Gel für 15 Min. in einer 0.5X TBE Lösung, die 40 ng/ml Ethidiumbromid enthält, gefärbt.
Die Bande, die mit dem Fragment KpnI-DraIII korrespondiert, wird unter UV ausgeschnitten, in 350 μl einer Tris 20 mM pH 8, EDTA 1 mM pH 8 Lösung aufgenommen und für 5 Min. bei 65°C inkubiert. Nach dem Auflösen der Agarose, wird die Probe mit einem Volumen Phenol extrahiert und für 5 Min. mit 10 000 g zentrifugiert. Die wässrige Phase wird abgenommen, mit einem Volumen Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (Verhältnis 50/48/2) extrahiert und für 2 Min. mit 10 000 g zentrifugiert. Die wässrige Phase wird mit Chloroform/Isoamylalkohol (Verhältnis 24/1) extrahiert und einige Sekunden mit 10 000 g zentrifugiert. Die wässrige Phase wird abgehoben, auf eine Endkonzentration von 0.2 M NaCl eingestellt und 16 Stunden bei –20°C nach Zugabe von 2 Volumen Ethanol 100 präzipitiert.
Nach der Zentrifugation bei 4°C für 10 Min. mit 12 000 g wird das DNA Pellet mit 1 ml Ethanol 70 gewaschen, lyophilisiert und in 20 μl sterilem Milli-Q-Wasser aufgenommen. Ein Aliquot von 2 μl sowie 500 ng der HindIII-EcoRI Fragmente des Phagen Lambda (Promega, TM) werden auf einem 0.8 % Agarosegel TypII (Sigma) analysiert, was uns erlaubte, die Konzentration der gereinigten Lösung des Fragments KpnI-DraIII des cDNA-Klons 1alpha3 von 5 ng/μl abzuschätzen.
Das für die Klonierung des KpnI-DraIII Fragments des cDNA-Klons 1alpha3 verwendete Plasmid ist der Klon pUC18minus KpnI-Fragment ADEFG oder ADEFH oder BCDEFG, verdaut mit den Enzymen KpnI-DraIII. Dieser Klon weist ein Ampicillin-Restistenzgen auf.
Eine Menge von 250 ng des Plasmids pUC18minus KpnI-Fragment ADEFG oder ADEFH oder BCDEFG wird einem Verdau mit den Restriktionsenonucleasen KpnI und DraIII nach den Empfehlungen des Herstellers unterzogen.
Nach dem enzymatischen Verdau werden 4 μl Stopppuffer (30 % Sucrose, 0.25 % Bromphenolblau) zu der DNA-Lösung zugegeben, die mittels Elektrophorese auf einem 0.8 % Agarosegel mit niedrigem Schmelzpunkt SeaPlaque-GTG (FMC, TM) bei konstanter Spannung von 60 Volt analysiert wird. Der Elektrophoresepuffer ist 0.5X TBE (Trisborat 45 mM, EDTA (Ethylendiamintetraacetat) 1 mM, pH 8). Nach der Wanderung wird das Gel für 15 Min. in einer 0.5X TBE Lösung, die 40 ng/ml Ethidiumbromid enthält, gefärbt.
Die Bande, die mit dem Vektor pUC18minus KpnI-Fragment ADEFG oder ADEFH oder BCDEFG KpnI-DraIII korrespondiert, wird unter UV ausgeschnitten, in 350 μl einer Tris 20 mM pH 8, EDTA 1 mM pH 8 Lösung aufgenommen und für 5 Min. bei 65°C inkubiert. Nach dem Auflösen der Agarose, wird die Probe mit einem Volumen Phenol extrahiert und 5 Min. mit 10 000 g zentrifugiert. Die wässrige Phase wird abgenommen, mit einem Volumen Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (Verhältnis 50/48/2) extrahiert und 2 Min. mit 10 000 g zentrifungiert. Die wässrige Phase wird mit Chloroform/Isoamylalkohol (24/1) extrahiert und einige Sekunden mit 10 000 g zentrifugiert. Die wässrige Phase wird abgenommen, auf eine Endkonzentration von 0,2 M NaCl eingestellt und 16 Stunden bei –20°C nach Zugabe von zwei Volumen Ethanol 100 präzipitiert.
Nach der Zentrifugation bei 4°C für 10 Min. mit 12 000 g wird das DNA Pellet mit 1 ml Ethanol 70 gewaschen, lyophilisiert und in 20 μl sterilem Milli-Q-Wasser aufgenommen. Ein Aliquot von 2 μl sowie 500 ng der HindIII-EcoRI Fragmente des Phagen Lambda (Promega, TM) werden auf einem 0.8 % Agarosegel TypII (Sigma) analysiert, was uns erlaubte, die Konzentration der gereinigten Lösung des Vektors pUC18minus KpnI-Fragment ADEFG oder ADEFH oder BCDEFG KpnI-DraIIs von 8 ng/μl abzuschätzen.
Die Ligation des KpnI-DraIII Fragments des cDNA-Klons 1alpha3 mit dem Vektor pUC18minus KpnI-Fragment ADEFG oder ADEFH oder BCDEFG KpnI-DraIII wird für 4 Stunden bei Raumtemperatur durchgeführt.
Die für die Transformation verwendeten kompetenten Bakterien sind DH5 alpha (Gibco BRL, TM).
Mehrere weiße Kolonien werden getestet. Dazu werden Sie einzeln in 3 ml L-Broth supplementiert mit Ampicillin (50 μg/ml) aufgenommen und diese Kulturen werden unter Schütteln über Nacht bei 37°C inkubiert.
Zur Aufreinigung der Plasmid-DNA wird die Kultur zuallererst mit 1500 g für 10 Min. bei 4°C zentrifugiert und das Bakterienpellet wird mit dem Wizard Kit (Promega, TM) behandelt, das die Aufreinigung von supercoild Plasmid-DNA erlaubt. Diese Handhabung erfolgt nach dem vom Hersteller vorgegebenen Protokoll. Etwa 10 μg Plasmid-DNA werden mit Hilfe dieses Kits aufgereinigt, wenn das verwendete Plasmid pUC18 ist.
Ein Aliquot (2 μl von 60 erhaltenen) werden einem enzymatischen Verdau mit der Restriktionsendonuklease NheI unterzogen, um die Klonierung des KpnI-DraIII Fragments des cDNA-Klons 1alpha3 in den Klon pUC18minus KpnI-Fragment ADEFG oder ADEFH oder BCDEFG KpnI-DraIII zu verifizieren. Der Austausch des rekombinanten KpnI-DraIII Fragments durch das Wildtypfragment bewirkt die Eliminierung der Restriktionsstelle NheI. Nach der Elektrophorese wird das Gel 15 Min. in einer Ethidiumbromidlösung von 40 ng/ml gefärbt und die Eliminierung der NheI Restriktionsstelle unter UV verifiziert.
Die Sequenzierreaktionen werden mit dem „T7 Sequencing" Kit (Pharmacia TM) durchgeführt, das die Kettenabbruchmethode verwendet, und T7 DNA Polymerase (vgl. Vorbereitung 1) erlaubt, die Vollständigkeit der Klonierung zu validieren.
Die erhaltenen Fragmente sind ADEFGphe159, ADEFHphe159 und BCDEFGphe159.
4/Erhalt der humanen rekombinanten pBIOC21-Kollagen phe 159 Konstrukte
Dieser Schritt führt dazu, dass die 3 Konstrukte des Plasmids pUC18minus KpnI in das Plasmid pBIOC21 eingefügt werden.
Das Plasmid pBIOC21 wird verwendet, um die Expression des rekombinanten Kollagens in den Blättern von Tabak oder Raps zu ermöglichen. Es trägt folgende regulative Sequenzen:

a) den konstitutiven zweifachen Promotor 35S (PD35S) des CaMV. Er korrespondiert mit einer Verdoppelung der Transkriptionsaktivierungssequenz, die stromaufwärts des TATA Elements des natürlichen Promotors 35S angeordnet ist.
b) Die Transkiriptionsterminationsstelle, den Terminator polyA 35S, die mit der 3' nicht-kodierenden Sequenz der zirkulären doppelsträngigen Sequenz des DNA Blumenkohlmosaikvirus korrespondiert, der das 35S Transkript produziert.

Die Konstruktion verschiedener Plasmide unter Verwendung rekombinanten DNA Techniken führt zu pBIOC4. Das binäre Plasmid stammt von pGA442 (An, 1986). Das Plasmid, das von pBIOC4 stammt und die Expressionskassette „PD35S-T35S" enthält, ist das Plasmid pBIOC21.
Die verschiedenen Elemente, die die Reproduktion dieser Konstrukte erlauben, sind beispielsweise in der Beschreibung der Patentanmeldung WO9633277 enthalten, die durch Referenz eingefügt ist.
Klonierung der Fragmente (HindIII/HindIII) der Konstrukte pUC18minus KpnI in die HindIII Klonierungsstelle des Vektors pBIOC21.
Etwa 1 μg des Klons pUC18minus KpnI-Fragment ADEFGphe159, ADEFHphe159 oder BCDEFGphe159 wird mit der Restriktionsendonuklease HindIII nach den Empfehlungen des Herstellers verdaut.
Nach dem enzymatischen Verdau werden 4 μl Stopppuffer (30 % Sucrose, 0.25 % Bromphenolblau) zu der DNA-Lösung zugegeben, die mittels Elektrophorese auf einem 0.8% Agarosegel mit niedrigem Schmelzpunkt SeaPlaque-GTG (FMC, Rockland) bei konstanter Spannung von 60 Volt analysiert wird. Der Elektrophoresepuffer ist 0.5X TBE (Trisborat 45 mM, EDTA (Ethylendiamintetraacetat) 1 mM, pH 8). Nach der Wanderung wird das Gel für 15 Min. in einer 0.5X TBE Lösung, die 40 ng/ml Ethidiumbromid enthält, gefärbt.
Die Bande, die mit dem HindIII/HindIII Fragment von 4400 bp korrespondiert, wird unter UV ausgeschnitten, in 350 μl einer Tris 20 mM pH 8, EDTA 1 mM pH 8 Lösung aufgenommen und für 5 Min. bei 65°C inkubiert. Nach dem Auflösen der Agarose, wird die Probe mit einem Volumen Phenol extrahiert und für 5 Min. mit 10 000 g zentrifugiert. Die wässrige Phase wird abgenommen, mit einem Volumen Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (Verhältnis 50/48/2) extrahiert und für 2 Min. mit 10 000 g zentrifugiert. Die wässrige Phase wird mit Chloroform/Isoamylalkohol (Verhältnis 24/1) extrahiert und einige Sekunden mit 10 000 g zentrifugiert. Die wässrige Phase wird abgenommen, auf eine Endkonzentration von 0.2 M NaCl eingestellt und 16 Stunden bei –20°C nach Zugabe von 2 Volumen Ethanol 100 präzipitiert.
Nach der Zentrifugation bei 4°C für 10 Min. mit 12 000 g wird das DNA Pellet mit 1 ml Ethanol 70 gewaschen, lyophilisiert und in 20 μl sterilem Milli-Q-Wasser aufgenommen. Ein Aliquot von 2 μl sowie 500 ng der HindIII/EcoRI Fragmente des Phagen Lambda (Promega TM) werden auf einem 0.8% Agarosegel Typ II (Sigma TM) analysiert, was uns erlaubte, die Konzentration der gereinigten Lösung des HindIII/HindIII Fragments des Klons pUC18minus KpnI-Fragment ADEFGphe159 oder ADEFHphe159 oder BCDEFGphe159 von 25 ng/μl abzuschätzen.
Das für die Klonierung des HindIII/HindIII Fragments des Klons pUC18minus KpnI-Fragment ADEFGphe159 oder ADEFHphe159 oder BCDEFGphe159 verwendete Plasmid ist der Klon pBIOC21, liniarisiert mit dem Enzym HindIII. Dieser Klon weist ein Tetracyclin-Resistenzgen auf.
Eine Menge von 1 μg des Plasmids pBIOC21 wird einem Restriktionsendonukleaseverdau mit HindIII unterzogen. Dieser Verdau wird in einem Volumen von 20 μl, in Anwesenheit von 2 μl Puffer B (Promega TM), 1 μl HindIII Enzym (12 U/μl; Promega TM) für 2 Stunden bei 37°C durchgeführt. Nach dem Verdau werden 80 μl TE-Puffer (Tris 10 mM EDTA 1 mM pH 8) der DNA-Lösung zugefügt, die mit einem Volumen Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (Verhältnis 50/48/2) extrahiert und für 2 Min. mit 10 000 g zentrifugiert wird. Die wässrige Phase wird mit Chloroform/Isoamylalkohol (Verhältnis 24/1) extrahiert und einige Sekunden mit 10 000 g zentrifugiert. Die wässrige Phase wird abgenommen, auf eine Endkonzentration von 0,2 M NaCl eingestellt und 16 Stunden bei –20°C nach Zugabe von zwei Volumen Ethanol präzipitiert.
Nach der Zentrifugation bei 4°C für 10 Min. mit 10 000 g wird das DANN Pellet mit 1 ml Ethanol 70 gewaschen, lyophilisiert und in 17 μl sterilem Milli-Q-Wasser wieder aufgenommen. Zu dieser DNA-Lösung werden 2 μl 10X Calf-intestine-phosphatase Puffer (CIP, Promega, TM), 1 μl CIP (1 U/μl; Promega, TM) zugegeben. Die Dephosphorylierung wird für 1 Stunde bei 37°C durchgeführt. Dieser Schritt erlaubt, die Autoligation dieses Klons während des Ligationsschritts zu vemeiden.
Nach dem Verdau werden 80 μl TE-Puffer (Tris 10 mM, EDTA 1 mM pH 8) zu der DNA-Lösung zugefügt, die mit einem Volumen Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (Verhältnis 50/48/2) extrahiert wird und für 2 Min. mit 10 000 g zentrifugiert wird. Die wässrige Phase wird mit Chloroform/Isoamylalkohol (Verhältnis 24/1) extrahiert und einige Sekunden mit 10 000 g zentrifugiert. Die wässrige Phase wird abgenommen, auf eine Endkonzentration von 0,2 M NaCl eingestellt und 16 Std. bei –20°C nach Zugabe von zwei Volumen Ethanol 100 präzipitiert.
Nach der Zentrifugation bei 4°C für 10 Min. mit 12 000 g wird das DNA Pellet mit 1 ml Ethanol 70 gewaschen, lyophilisiert und in 20 μl sterilem Milli-Q-Wasser aufgenommen, um eine Lösung von 40 ng/μl des Plasmids pBIOC21 (HindIII, dephosphoryliert) zu erhalten.
Die Ligation des HindIII/HindIII Fragments des Klons pUC18minus KpnI-Fragment ADEFGphe159 oder ADEFHphe159 oder BCDEFGphe159 mit dem Klon pBIOC21 (HindIII, dephosphoryliert) wird 4 Stunden bei Raumtemperatur durchgeführt. [0403] Die für die Transformation verwendeten kompetenten Bakterien sind DH5 alpha (Gibco BRL, Paris).
Mehrere weiße Kolonien werden getestet. Dazu werden sie einzeln in 3 ml L-Broth supplementiert mit Tetracyclin (40 μg/ml) aufgenommen und diese Kulturen werden unter Schütteln über Nacht bei 37°C inkubiert.
Für die Aufreinigung der Plasmid-DNA wird die Kultur zuallererst mit 1500 g für 10 Min. bei 4°C zentrifugiert und das Bakterienpellet wird mit dem Wizard Kit (Promega, TM) behandelt, der die Aufreinigung von supercoiled Plasmid-DNA erlaubt. Diese Handhabung wird nach dem vom Hersteller vorgegebenen Protokoll durchgeführt. Etwa 1-2 μg Plasmid-DNA werden mit Hilfe dieses Kits aufgereinigt, wenn das verwendete Plasmid pBIOC21 ist.
Ein Aliquot (5 μl von 60 erhaltenen) wird einem enzymatischem Verdau mit der Restriktionsendonuklease KpnI unterzogen, um die Orientierung des klonierten HindIII Fragments des Klons pUC18minus KpnI-Fragment ADEFGphe159 oder ADEFHphe159 oder BCDEFGphe159 im Klon pBIOC21 (HindIII) zu verifizieren. Das Auftreten eines KpnI Fragments von 950 bp ist spezifisch für eine korrekte Orientierung. Dieses KpnI Fragment von 950 bp stammt von der KpnI Restriktionsstelle in Position 2,8 kb des Vektors pBIOC21 und der KpnI Stelle in Position 137 der für die humane proα1(I)-Kette kodierenden Sequenz. Nach der Elektrophorese wird das Gel für 5 Min. in einer Ethidiumbromidlösung von 40 ng/ml gefärbt und die Anwesenheit des KpnI Fragments von 950 bp unter UV verifiziert.
Die Sequenzierreaktionen werden mit dem „T7 Sequencing" Kit (Pharmacia TM) durchgeführt, das die Kettenabbruchmethode verwendet und T7-Polymerase (vgl. Vorbereitung 1) erlaubt, die Vollständigkeit der Klonierung zu validieren.
Die so erhaltenen pBIOC21-Kollagenkonstrukte werden wie folgt bezeichnet:

– pBIOC708 für das Konstrukt enthaltend das Fragment ADEFGphe159
– pBIOC709 für das Konstrukt enthaltend das Fragment ADEFHphe159
– pBIOC710 für das Konstrukt enthaltend das Fragment BCDEFHphe159

BEISPIEL 2
Konstruktion chimärer Gene, die für das humane rekombinante Kollagen kodieren und die die Expression in den Sämerein von Mais erlauben.
Die konstitutive Expression der cDNA, die für die proα1(I)-Kette des humanen Kollagens kodiert, in den Sämereien von Mais, benötigt folgende regulative Sequenzen:

1. den Promotor des Zeingens von Mais (Pzein), enthalten im Plasmid p63. Er erlaubt eine Expression im Albumen der Sämereien von Mais;
2. die Transkriptionsterminationssequenz, Terminator polyA NOS, die mit der 3' nicht-kodierenden Region des Nopalinsynthasegens des Ti-Plasmids von Agrobacterium tumefaciens Nopalinstamm, korrespondiert.

Die verschiedenen Elemente, die die Reproduktion der Konstrukte erlauben, sind beispielsweise in der Beschreibung der Patentanmeldung WO9633277 enthalten, die durch Referenz eingefügt ist.
Ausgehend von den Plasmiden, wurden die Fragmente ADEFG, ADEFH, BDEFG und BCDEFG durch Verdau mit HindIII isoliert, mittels Elektrophorese auf einem 0,8% Agarosegel aufgereinigt, elektroeluiert, der alkoholischen Präzipitation unterworfen und getrocknet. Dann wurden diese DNA Fragmente mit dem Klenow-Enzym (New England Biolabs TM) nach den Empfehlungen des Herstellers behandelt, einer Phenol-Chloroform Extraktion, einer Alkoholpräzipitation unterzogen und werden in 10 μl H₂O wieder aufgenommen.
Das Plasmid p63 wurde mit SacI und BamHI zweifach verdaut, mittels Elektrophorese auf einem 0.8% Agarosegel aufgereinigt, elekroeluiert, einer Alkoholpräzipitation unterworfen und getrocknet. Dann wurde es mit dem Enzym T4 Polymerase (New England Biolabs TM) behandelt und mit dem Enzym Calf-intestine-phosphatase (Boehringer Mannheim) dephosphoryliert, nach den Empfehlungen des Herstellers.
Jedes Fragment ADEFG, ADEFH, BDEFG, BCDEFG, erhalten wie oben beschrieben, wurde mit dem Plasmid p63, das wie oben beschrieben behandelt wurde, ligiert.
Die Ligation und die Transformation der kompetenten Bakterien Escherichia coli Stamm DH5α wurden nach den Standardverfahren durchgeführt. Die erhaltenen Plasmide wurden als pBIOC700, pBIOC701, pBIOC702 bzw. pBIOC703 bezeichnet und enthalten die Fragmente ADEFG, ADEFG, BDEFG bzw. BCDEFG.
Die Aminosäuren Asn und Phe in den Positionen 158 und 159 der humanen proα1(I)-Kette wurden in den Klonen ADEFG, ADEFH und BCDEFG wieder hergestellt, um ADEFGphe159, ADEFHphe159 bzw. BCDEFHphe159 zu erhalten. Diese Modifikationist im Beispiel 1 beschrieben.
Ausgehend von den Plasmiden wurden die Fragmente ADEFGphe159, ADEFHphe159 und BCDEFHphe159 durch Verdau mit HindIII isoliert, durch Elektrophorese auf einem 0.8% Agarosegel aufgereinigt, elektroeluiert, der Alkoholpräzipitation unterworfen und in 10 μl H₂O wieder aufgenommen. Die so aufbereiteten Fragmente wurden mit dem Plasmid p63, das wie oben beschrieben behandelt wurde, ligiert. Die erhaltenen Plasmide werden als pBIOC711, pBIOC712 und pBIOC713 bezeichnet, und enthalten die Fragmente ADEFGphe15, ADEFHphe159 bzw. BCDEFHphe159.
BEISPIEL 3
Erhalt transgener Rapspflanzen
Die Samen des Frühlingsrapses (Brassica napus cv WESTAR oder Limagrain-Linie) werden für 40 Minunten in einer 15% Domestos TM Lösung desinfiziert. Nach vier Spülungen mit sterilem Wasser werden die Samen zum Keimen gebracht, mit 20 Samen pro Topf von 7 cm Durchmesser und 10 cm Höhe, auf mineralischem Medium von Murahige und Skoog (Sigma M 5519) mit 30 g/l Saccharose und verfestigt mit einem Agargel von 5 g/l. Diese Töpfe werden in einen Kultivierungsraum bei 26°C gestellt, mit einer Photoperiode von 16h/8h und mit einer Lichtintensität der Größe 80μE m^-2S^-1.
Nach fünf Tagen der Keimung werden die Keimblätter durch Schneiden jedes Stils etwa 1 mm oberhalb des Keimblattknotens steril entfernt.
Parallel dazu wird eine Vorkultur vom Agrobacterium tumefaciens Stamm LBA4404, der die Plasmide enthält, in einem 50 ml Erlenmeyerkolben gezogen, für 36 h bei 28°C in 10 ml 2YT Bakterienmedium, komplementiert mit den Antibiotika, die für die Selektionierung des verwendeten Stammes geeignet sind.
1 % dieser Vorkultur dient zum Animpfen einer neuen Bakterienkultur, die unter den gleichen Bedingungen gehalten wird. Nach 14 h wird die Kultur für 15 Min. mit 3000 g zentrifugiert und die Bakterien werden in einem dem flüssigen Keimmedium äquivalenten Volumen aufgenommen. Diese Suspension wird auf Petrischalen von 5 cm Durchmesser zu 5 ml/Schale verteilt.
Das abgetrennte Ende des Blattstils wird einige Sekunden in die so bereitete Agrobakterienlösung getaucht, dann wird der Stil einige Millimeter in das Regenerationsmedium eingedrückt. Dieses Medium hat die gleiche Grundzusammensetzung wie das Keimmedium mit mehr als 4 mg/l Benzylaminopurin (BAP), einem Phytohormon, das die Neubildung von Blattknospen begünstigt. Zehn Explantate (Keimblatt mit Stil) werden auf einer Petrischale von 9 cm Durchmesser kultiviert.
Nach zwei Tagen der Kultivierung unter den gleichen Umweltbedingungen wie während der Keimung, werden die Explantate auf Phytatray-Schalen (Sigma TM, Referenz P1552) umgesetzt, die das vorhergehende Medium enthalten, komplementiert mit einem selektiven Agens: 45 mg/l Kanamycinsulfat und einem Bakteriostatikum: Mischung zu 1/6 (pro Gewicht) aus dem Salz der Kaliumklavulansäure und zu 5/6 aus dem Natriumsalz des Amoxicillins (Augmentin TM, injizierbar) von 600 mg/l.
Zweimal in Folge, in Intervallen von drei Wochen, werden die Explanate steril auf ein neues Medium mit den gleichen Bedingungen umgesetzt.
Die grünen Blattknospen, die am Ende der zweiten oder dritten Umsetzung erscheinen, werden von den Explanaten separiert und einzeln in transparenten Töpfen von 5 cm Durchmesser und 10 cm Höhe kultiviert, die ein Medium enthalten, das identisch zu dem vorhergehenden ist, aber kein BAP enthält. Nach drei Wochen Kultivierung wird der Schaft der transformierten Blattknospe abgetrennt und die Blattknospe wird in einen Topf mit frischem Medium umgesetzt. Nach drei bis vier Wochen sind die Wurzeln so weit entwickelt, dass die Keimlinge in einem Phytotron akklimatisiert werden können. Die Blattknospen, die nicht grün oder mit Wurzeln versehen sind, werden eliminiert. Diese Keimlinge werden dann in Blumentöpfe mit 7 cm Seitenwandhöhe umgesetzt, die mit Wasser gesättigter Erde (Norm NF U44551: 40% brauner Torf, 30% gedämpfte Heide und 30% Sand) gefüllt sind. Nach zwei Wochen der Akklimatisierung im Phytotron (Temperatur 21°C, Photoperiode 16h/8h und 84% relative Feuchtigkeit) werden die Keimlinge in Töpfe mit 12 cm Durchmesser umgetopft, die mit der gleichen angereicherten Erde gefüllt sind, und später dann in ein Gewächshaus (Klasse S2) gebracht, das auf 18°C eingestellt ist, mit täglich zwei zweiminütigen Wasserberieselungen.
Wenn die Schoten reif sind, werden sie geerntet, getrocknet, dann gewolft. Die erhaltenen Samen dienen zur Bestimmung der biochemischen Aktivität. Die Selektion der transgenen Nachkommenschaft erfolgt durch Keimung auf einem Medium, das Kanamycinsulfat von 100 bis 150 mg/l (gemäß des Genotyps) enthält. Die Durchführungsbedingungen sind identisch mit den oben beschrieben, abgesehen davon, dass die Keimung in Glasrohren mit einem einzigen Samen pro Glasrohr erfolgt. Nur die Keimlinge, die während der ersten drei Wochen sekundäre Wurzeln bilden, werden im Phytotron akklimatisiert bevor sie in das Gewächshaus überführt werden.
BEISPIEL 4
Erhalt transgener Tabakpflanzen
Die für die Transformationsexperimente verwendeten Tabakpflanzen (Nicotiana tabacum var Xanthi NC und PBD6) werden in vitro auf Medium basierend auf Murashige et Skoog (1962) kultiviert, das mit Vitaminen nach Gamborg et al. (1968, Sigma Referenz M0404), Saccharose zu 20 g/l und Agar zu 8 g/l versetzt ist. Der pH-Wert des Mediums wird mit einer Kaliumlösung, die zuvor bei 120°C für 20 Min. autoklaviert wurde, auf 5,8 eingestellt. Die Tabakkeimlinge werden durch internodale Ableger alle 30 Tage auf diesem Multiplikationsmedium MS20 pikiert.
Alle in vitro Kulturen werden in einem klimatisierten Bereich gehalten, unter den nachfolgend definierten Bedingungen:

– Lichtintensität von 30 μE. m^-2.S^-1;
– Photoperiode von 16 h;
– Thermoperiode von 26°C tagsüber, 24°C nachts.

Die verwendete Transformationstechnik entstammt der von Horsch et al. (1985).
Eine Vorkultur von Agrobacterium tumefaciens Stamm LBA4404, die die Plasmide enthält, wird für 48 h bei 28°C unter Schütteln in einem LB-Medium unter Zugabe geeigneter Antibiotika (Rifampicin und Tetracyclin) gezogen. Die Vorkultur wird dann 50-fach mit dem gleichen Medium verdünnt und unter den gleichen Bedingungen kultiviert. Nach einer Nacht wird die Kultur zentrifugiert (10 Min., 3000 g), die Bakterien werden in einem dem flüssigen MS30-Medium (30 g/l Saccharose) äquivalenten Volumen aufgenommen und diese Suspension wird 10-fach verdünnt.
Explantate von etwa 1 cm² werden aus den oben beschriebenen Blättern der Keimlinge ausgeschnitten. Sie werden dann für 1 h mit der Bakteriensuspension in Kontakt gebracht, dann rasch auf Filterpapier getrocknet und auf ein Kokulturmedium gelegt (MS30 fest).
Nach zwei Tagen werden die Explantate auf Petrischalen mit Regenerationsmedium MS30 transferiert, das ein Selektionsagens, das Kanamycin (200 mg/l), ein Bakteriostatikum, das Augmentin (400 mg/l), und Hormone, die zur Induktion der Blattknospung benötigt werden (BAP, 1 mg/l und ANA, 0,1 mg/l), enthält. Ein Umpflanzen der Explantate erfolgt nach 2 Wochen der Kultivierung auf dem gleichen Medium. Nach 2 weiteren Wochen werden die Blattknospen auf Petrischalen mit Entwicklungsmedium, zusammengesetzt aus MS20 Medium, versetzt mit Kanamycin und Augmentin, umgesetzt. Nach 14 Tagen wird die Hälfte der Blattknospen umgesetzt. Die Wurzelbildung benötigt etwa 20 Tage, danach können die Keimlinge durch internodalen Blattknospen kloniert oder in das Gewächshaus überführt werden.
BEISPIEL 5
Erhalt transgener Maispflanzen
a) Erhalt und Verwendung der Maisschwiele als Ziel der genetischen Transformation.
Die genetische Transformation des Maises, unabhänig von der verwendeten Methode (Elektroporation; Agrobacterium, Microfasern, Partikelkanone), erfordert allgemein die Verwendung undifferenzierter Zellen in rascher Teilung, die die Fähigkeitgkeit haben, sich zu gesamten Pflanzen zu regenerieren. Dieser Zelltyp bildet die leicht zerreibbare embryogene Schwiele (bezeichnet als Typ II) von Mais.
Diese Schwielen werden aus unreifen Embryonen des Genotyps H1 II oder (A188 × B73) nach der Methode und auf dem von Armstrong (1994) beschriebenen Medien, erhalten. Die so erhaltenen Schwielen werden vermehrt und durch sukzessives Umpflanzen alle 14 Tage auf Initiationsmedium gehalten.
Die Keimlinge werden dann, ausgehend von diesen Schwielen durch Modifikation des hormonalen und osmotischen Gleichgewichts der Zellen nach der von Vain et al. (1998) beschrieben Methode, regeneriert. Die Pflanzen werden dann im Gewächshaus akklimatisiert, wo sie gekreuzt oder selbstbefruchtet werden können.
b) Verwendung der Partikelkanone zur kinetischen Transformation von Mais.
Der vorhergehende Absatz beschreibt den Erhalt und die Regeneration, der für die Transformation benötigten Zelllinien; dort wird eine Methode zur genetischen Transformation beschrieben, die zur stabilen Integration der modifizierten Gene in das Pflanzengenom führt. Diese Methode beruht auf der Verwendung einer Partikelkanone; die Zielzellen sind Fragmente der Schwielen, beschrieben unter Paragraph 1. Diese Fragmente mit einer Oberfläche von 10 bis 20 mm² wurden 4 h vor dem Beschießen, wobei 16 Fragmente pro Schale im Zentrum der Petrischale angeordnet sind, die ein Kulturmedium enthält, das identisch mit dem Initiationsmedium ist, versetzt mit 0,2 M Mannitol und 0,2 M Sorbitol, vorbereitet. Die Plasmide, die die einzuführenden Gene tragen, werden auf einer Qiagen TM Säule aufgereinigt nach den Anweisungen des Herstellers. Dann werden sie mit Wolframpartikeln (M10), nach dem Protokoll beschrieben von Klein (Nature (1987) 327:70-73), gefällt. Die so eingehüllten Partikel werden mit Hilfe der Kanone auf die Zielzellen geschossen.
Die Schalen mit den so beschossenen Schwielen werden anschließend verschlossen, dann bei Dunkelheit bei 27°C kultiviert. Das erste Umpflanzen findet 24 h danach statt, dann alle 14 Tage für 3 Monate auf mit dem Initiationsmedium identischen Mediums, versetzt mit einem Selektionsagens, das von der Art und Konzentration variieren kann, abhängig von dem verwendeten Gen (siehe Paragraph 3). Die verwendbaren Selektionsagenzien bestehen allgemein aus aktiven Zusammensetzungen bestimmter Herbizide (Basta, Round up) und bestimmter Antibiotika (Hygromycin, Kanamycin ...).
Nach drei Monaten oder früher erhält man Schwielen, deren Wachstum nicht durch das Selektionsagens inhibiert wird, wobei diese Zellverbindungen gewöhnlich und hauptsächlich aus der Teilung einer Zelle resultieren, die in ihr genetisches Erbgut eine oder mehrere Kopien eines Selektionsgens integriert hat. Die Häufigkeit des Erhalts solcher Schwielen ist etwa 0.8 Schwielen pro beschossener Schale.
Diese Schwielen werden identifiziert, individualisiert, amplifiziert, dann so kultiviert, dass sie Keimlinge regenerieren (vgl. Paragraph a). Um jede Interferenz mit nicht transformierten Zellen zu vermeiden, werden alle Behandlungsschritte auf Kulturmedien durchgeführt, das ein Selektionsagens enthält.
Die auf diese Weise regenerierten Pflanzen werden akklimatisiert, dann im Gewächshaus kultiviert, wo sie gekreuzt oder selbstbefruchtet werden können.
BEISPIEL 6: Extraktion und Aufarbeitung
Extraktion aus den erfindungsgemäß genetisch transformierten Tabakpflanzen
45 Pflanzen, nummeriert von 1 bis 22, wenn sie mit dem Konstrukt pBIOC707 (umfassend das N-Propeptid, die wichtige Tripelhelix und das C-Propeptid) transfiziert wurden, nummeriert von 23 bis 45, wenn sie mit dem Konstrukt pBIOC706 (umfassend die wichtige Tripelhelix und das C-Propeptid) transfiziert wurden, werden abgeschnitten, gewogen und in flüssigem Stickstoff eingefroren. Die verschiedenen Pflanzen werden dann in flüssigem Stickstoff mit Hilfe eines Homogenisators für 2 Min. zerkleinert, um ein feines Pulver zu erhalten, das dann bis zu seiner Verwendung bei – 20°C gelagert wird.
Extraktion mit Essigsäure:
Das von jeder Pflanze erhaltene Pulver, einschließlich nicht-transformierter Kontrollpflanzen, wird in einer Lösung von 0.5 M Essigsäure, die 200 mM NaCl und Proteaseinhibitoren enthält: 1 mM Phenylmethylsulfonid (PMSF), 1 mM N-Ethylmaleimid (NEM), 2.5 mM Ethylendiamintetraacetat (EDTA), aufgenommen, mit 1 g Pulver auf 4 ml Lösung. Die Mischung wird bei 4°C für 60 Stunden geschüttelt. Danach erfolgt Zentrifugation jeder Probe mit 20 000 g (Rotor 12148, Sigma TM) für 30 Min. bei 4°C. Die Pellets werden zweimal mit destilliertem Wasser gewaschen und bei –20°C gelagert. Eine Fraktion des Überstands (100 μl) wird entnommen, um die Gesamtproteinmenge zu bestimmen. Der restliche Überstand wird bei –20°C gelagert.
Bestimmung der Gesamtproteinmenge:
Die entnommenen Fraktionen, 100 μl für die Extraktion in säurelöslichem und 20 μl für die Extraktion in neutralem Puffer, werden unter Verwendung einer fertigen Coomassielösung bestimmt. Die Bestimmung erfolgt auf einer Microtiterplatte und das Lesen erfolgt mit einem Plaque Reader (SLT Lab Instruments, Austria) bei einer Wellenlänge von 620 nm. Eine Eichkurve wird mit einer 100 μg/ml BSA-Lösung durchgeführt mit 0 bis 10 μg/Well: 0, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 μl werden in jedes Well eingebracht und, wenn nötig auf 100 μl final ergänzt. Die verschiedenen Proben werden gleichfalls in die Wells eingebracht und wenn erforderlich auf 100 μl mit Extraktionspuffer aufgefüllt. Als Referenz für die Eichkurve dient 100 μl destilliertes Wasser und für die Proben 100 μl Extraktionspuffer. 100 μl Reagenz werden dann zu jedem Well zugegeben und sofort gelesen. Die erhaltenen Werte jeder Referenz werden von den erhaltenen Werten der Eichkurve bzw. der Proben abgezogen. Eine Eichkurve wird gezeichnet und die Proteinkonzentration der Proben wird von dieser Kurve abgelesen.
Identifizieren der Positiven:
Die Identifizierung erfolgt auf zwei Arten:

1. Identifizieren der Pflanzen (nach Zerkleinerung und Extraktion) durch Gelelektrophorese gefolgt von Immunotransfer. Das verwendete Kontrollkollagen ist Kollagen I, extrahiert aus humanem oder bovinem Gewebe mittels Essigsäure und gereinigt durch Salzpräzipitation. Die molekulare Form des Kollagens I, die am häufigsten in den Geweben vertreten ist, ist die heterotrimere, die zwei α1 und α2-Ketten umfasst: [α1(I) 2α2(I)]. In diesem Fall wandert die α1 Kette von Interesse etwas oberhalb von 116 KDa, sie enthält nur die wichtige Tripelhelix und die Telopeptide, die N- und C-Propeptide sind während der Reifung des Kollagens abgespalten worden und sind deshalb nicht mehr vorhanden.
2. Identifizieren der Positiven durch indirekte Immunofluoreszenz auf gefrorenen Schnitten verschiedener Pflanzen.

In beiden Fällen wird ein polyklonaler Antikörper aus Kaninchen verwendet, der für Kollagen I spezifisch ist, er erkennt humanes und bovines Kollagen I und ohne Unterschied die α1(I)- und α2(I)-Ketten (Referenz 20121, Pasteur Institut, Lyon); ein anderer Antikörper kann gleichfalls verwendet werden: Es handelt sich dabei um einen monoklonalen Antikörper Sp1D8 (Hybridoma Bank, USA), der gegen die Spaltstelle des N-Propetids des Typs I gerichtet ist. Diese beiden Antikörper können für denaturiertes Kollagen I (nach Gelelektrophorese und Proteintransfer) und für natives Kollagen (bei Immunofluoreszenz) verwendet werden.
1. Identifizierung nach Analyse der Pflanzen durch Elektrophorese gefolgt von Immunotransfer.
Analytische Methode
Die Identifizierung wird mit mit Essigsäure gewonnen Extrakten durchgeführt. Die Überstände und Pellets werden analysiert.
Elektrophorese:
Überstände:
500 μl der Überstande, d. h. 15 bis 25 μg Gesamtprotein, werden durch Zugabe von 50 μl Trichloracetat 100% für 30 Minuten bei Raumtemperatur gefällt. Die Proben werden mit 20 000 g für 15 Min. bei 4°C zentrifugiert, die Pellets zweimal mit kaltem Ethanol 100% gewaschen. Die Präzipitate werden dann in 20 μl Auftragpuffer (Tris-HCl 60 mM pH 6,8, enthaltend 2% Sodiumdodecylsulfat, 10% Glycerin, 0.002% Bromphenolblau) in Anwesenheit eines reduzierenden Agens, dem Dithiothreitols (DTT), in einer Endkonzentration von 10 mM aufgenommen, dann für 3 Minuten bei 100°C denaturiert.
Pellets:
Die Pellets, gewaschen mit destilliertem Wasser um die Anwesenheit von Säure und Salz aus dem Extraktionspuffer zu vermeiden, werden in 50 μl destilliertem Wasser aufgenommen. 10 μl der Suspension werden entnommen, zu denen 20 μl 3-fach konzentrierter Auftragpuffer (Tris-HCl 180 mM pH 6.8, enthalten 6% Sodiumdodecylsulfat, 30% Glycerin, 0.006% Bromphenolblau) in Anwesenheit eines reduzierenden Agens, dem Dithiothreitol (DTT), in einer Endkonzentration von 10 mM, zugegeben wird, dann für 3 Minuten bei 100°C denaturiert.
Die verschiedenen Proben werden auf ein 6% Acrylamidgel in einer Tris-HCl 0.4 M pH 8.8 Lösung, enthaltend 0.1 % Sodiumdodecylsulfat, mit einem 4% Gel in einer Tris-HCl 0.4 M pH 6,8 Lösung, enthaltend 0.1% Sodiumedodecylsulfat, aufgetragen. Auf jedem Gel werden drei Taschen für den Molekularmassenstandard (6H Sigma TM), das Kontrollkollagen I (bovin oder human, 3 μg/Tasche) bzw. Kontrollproben nicht-transformierter Pflanzen reserviert. Die Wanderung erfolgt in einem Migrationspuffer von 0.025 M Tris, 0.2 M Glycin, enthaltend 0.1 % Sodiumdodecylsulfat, bei einer Spannung von 100 Volt für das Sammelgel, die auf 200 Volt für das Trenngel erhöht wird.
Immunotransfer:
Nach der Wanderung werden die Gele auf eine Poly(vinylidenfluorid)-Membran (Immobilon-P, Millipore TM) aufgebracht, die vorab mit Methanol 100% befeuchtet wurde, dann in CAPS Transferpuffer (10 mM Cyclohexylamino-1-Propansulfonsäure, pH 11, Methanol 5%) getränkt wurde. Die Gesamtheit Gel plus Membran wird in ein Transfergerät (Biorad TM) gesteckt und einer Spannung von 60 Volt für 16 Stunden unterzogen, unter Kühlung durch ein Zirkulationssystem von kaltem Wasser.
Um die Effizienz des Transfers zu verifizieren, werden die Gele mit Coomassieblau R-250 (Lösung von 0.2% in Methanol 40% und Säure 10%) für 30 Minuten gefärbt. Sie werden anschließend selektiv mit einer Lösung von Methanol 15% und Essigsäure 7.5% entfärbt und die nicht transferierten oder teilweise transferierten Proteine werden durch die Anwesenheit einer Bande, die im Gel aufzufinden ist, angezeigt. Zudem werden die Membranen mit Ponceau S (0.2% in Essigsäure 1 %) für 10 Minuten gefärbt, dann in destilliertem Wasser entfärbt. Die verschiedenen Proteine, die korrekt transferiert wurden, werden angezeigt, die Spur, die mit dem Molekularmassenstandard korrespondiert, wird ausgeschnitten, an Luft getrocknet und zwischen zwei Blättern Filterpapier aufbewahrt. Die restliche Membran wird vollständig entfärbt.
Die Membranen werden anschließend für eine Stunde mit 10% Trockenmilchpulver gesättigt, dann kurz in Tris-HCl 25 mM pH 7.4, NaCl 150 mM, KCl 2.5 mM (TBS) gespült. Die Membranen werden dann mit polyklonalen Antikörpern, die gegen die wichtige Tripelhelix des bovinen Kollagens I gerichtet sind, hergestellt in Kaninchen, mit TBS-Puffer im Verhältnis 1:400 verdünnt, enthaltend 0.5% Tween 20 (TTBS), 1 % bovines Serumalbumin, für 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Nach der Inkubation mit den Antikörpern werden die Membranen 6 mal für 5 Minuten in TTBS gespült, dann mit dem auf 1:2000 verdünnten Konjugat (anti-IgG des Kaninchens in Schwein hergestellt, verbunden mit alkalischer Phosphatase, Dako TM, Dänemark) für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die Membranen werden erneut mit TTBS (6 mal für 5 Minuten) gespült, dann mit Hilfe der Reagenzien des APColor Kits (Biorad TM) entwickelt. Die Spuren zeigen eine oder mehrere Banden mit einer Molekularmasse, die den Positiven entspricht, die Nummern der korrespondierenden Pflanzen werden verzeichnet. Alle Positiven werden einer zweiten Identifizierung (Gel + Immunotransfer) unterzogen.
Ergebnisse:
pBIOC706

– Das Konstrukt pBIOC706 zeigt 40% Positive durch Ausbilden einer Hauptbande, die auf Höhe der Kontroll-α1(I)-Kette läuft. Dieses Ergebnis zeigt, dass das C-Propeptid (etwa 30 KDa) der rekombinanten α1(I)-Kette abgespalten wurde. Die Spuren, die mit der nicht-transformierten Kontrollpflanze korrespondieren, zeigen keine solche Bande, die durch den Antikörper Anti-Kollagen I entsteht.
– Die Pflanzen 23, 25, 28, 32, 36, 38, 39, 40, 45 werden als positiv identifiziert, die Pflanzen 40 und 45 werden als die Produktivsten bestimmt, da sie in den Überständen anwesend und in den Pellets abwesend sind.

pBIOC707

– Das Konstrukt pBIOC707 zeigt 27 Positive durch Ausbilden einer Hauptbande, die oberhalb der Kontroll-α1(I)-Kette läuft, die mit einer Molekularmasse von etwa 140 KDa korrespondiert. Die erwartete Molekularmasse der gesamten rekombinanten Kette beträgt etwa 160 KDa, so dass dieses Resultat vermittelt, dass das N-Propeptid (etwa 20 KDa) oder das C-Propeptid (etwa 30 KDa) der rekombinanten α1(I)-Kette abgespalten wurde. Die Spuren, die mit der nicht-transformierten Kontrollpflanze korrespondieren, zeigen keine solche Bande, die durch den Antikörper Anti-Kollagen I entsteht.
– Die Pflanzen 1, 2, 14, 16, 17, 19 werden als positiv identifiziert, die Pflanzen 1, 2, 14 werden als die Produktivsten bestimmt, da sie in den Überständen anwesend und in den Pellets abwesend sind (2).

2. Immunofluoreszenz Analytische Methode
Die Pflanzenblätter werden von einem Kälteeinschlussmedium umgeben (Tissue-Tek, Miles, USA) und werden auf die Gefrierplatine des Cryostaten bei –30°C gefroren.
Die histologischen Objektträger, behandelt mit Aminoalkylsilan, werden nach dem folgenden Protokoll vorbereitet:

– Eintauchen in eine 3-Aminopropyltriethoxysilanlösung 2 % in Aceton, 5 Sekunden
– waschen mit Aceton, 2X 1 Minute
– waschen mit destilliertem Wasser
– trocknen über Nacht bei 42°C.

Gefrierschnitte von 7 μm werden von allen Pflanzen mit Hilfe eines Kryostaten hergestellt und auf die behandelten Objektträger aufgebracht. Die Objektträger werden dann wie folgt behandelt:

– Spülen der Objektträger mit Phosphatpuffer (PBS für Phosphat Saline Puffer, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Natriumphosphat pH 7.2).
– Blockieren unspezifischer Stellen durch Inkubation der Objektträger in PBS enthaltend 1 % bovines Serumalbumin (BSA).
– Inkubation mit den Antikörpern Anti-Kollagen I (Referenz 20121, Pasteur Institut, Lyon), verdünnt auf 1:50 in PBS-BSA 1% für 2 Stunden bei Raumtemperatur. Kontrollobjektträger, bei denen die Antikörper Anti-Kollagen I ausschließlich durch PBS oder durch einen polyklonalen Antikörper spezifisch für Kollagen IV ersetzt werden, werden hergestellt.
– Spülen mit PBS, 3 mal 10 Minuten.
– Inkubieren mit dem Konjugat (Anti-IgG des Kaninchens hergestellt in Schaf, verbunden mit Fluorescinisothiocyanat, Biosys TM, Frankreich), verdünnt auf 1:300 in PBS-BSA 1 % für 1 Stunde bei Raumtemperatur. Während der Inkubation und bis zur Betrachtung der Objektträger werden sie im Dunklen gehalten.
– Spülen in PBS, 3 mal 10 Minuten.
– Behandlung der Objektträger mit Eriochrome Black T 0.3% in PBS, um die Autofluoreszenz der Proben zu maskieren, für 1 Minute.
– Intensives Spülen mit PBS.
– Aufbringen von Deckgläsern auf die Objektträger mit einem Tropfen PBS-Glycerol 1:1.

Das Betrachten erfolgt unter einem Epifluoreszenzmikroskop Zeiss TM Universal ausgerüstet mit einem Filter Zeiss TM angeregt mit BP 430-490.
Ergebnisse
Das Betrachten der Objektträger erlaubt uns folgende Schlüsse:

– Die von Chloroplasten gebildeten Anhäufung autofluoreszieren rot, aber stören die Beobachtung der gelb-grünen Fluoreszenz der positiven Pflanzen nicht.
– Eine gelb-grüne Autofluoreszenz wird gleichfalls bei besonderen, abgegrenzten Strukturen der Pflanze (Kanäle) beobachtet. Die positiven Pflanzen sind dennoch durch die Anwesenheit kleiner, stark gefärbter Anhäufungen in den Zellen leicht zu identifizieren. Man bemerkt gleichfalls in den Pflanzen, die mit dem Konstrukt pBIOC706 (α1 + C-pro) korrespondieren, ein diffuses filamentöses Netz, das in einem extrazellulären Teil des Blattes lokalisiert scheint.
– Man stellt eine perfekte Übereinstimmung zwischen den positiven Pflanzen, bestimmt durch die Methode Gel + Transfer sowie durch die Immunofluoreszenz fest, vor allem bei den extrem Positiven, d. h. 1, 2, 14, 40 und 45.

Extraktion mit neutralem Puffer:
Um die Extraktion zu verbessern, erfolgt gleichfalls für Gewebekollagen und Prokollagen (Kollagenmolekül, das noch die N- und C-Propeptide besitzt) eine Extraktion der Pellets der Positiven der vorhergehenden Extraktion: 1, 2, 14, 40 und 45 in neutralem Milieu.
Die bei der Extraktion in saurem Milieu jeder Pflanze anfallenden Reste, einschließlich die der nicht-transformierten Kontrollpflanzen, werden zweimal mit destillierten Wasser gewaschen, bevor sie in Tris-HCl 50 mM pH 7.4 Puffer, enthaltend 150 mM NaCl und Proteaseinhibitoren: 1 mM Phenylmethylsulfonid (PMSF), 1 mM N-ethylmaleimid (NEM), 2.5 mM Ethylendiamintetraacetat (EDTA), aufgenommen werden, mit 1 g des Pulvers auf 4 ml Lösung. Die Mischung wird bei 4°C für 60 Stunden geschüttelt. Danach erfolgt Zentrifugation jeder Probe mit 20 000 g (Rotor 12148, Sigma TM) für 30 Minuten bei 4°C. Die Pellets werden zweimal mit destilliertem Wasser gewaschen und bei –20°C gelagert. Eine Fraktion der Überstände (20 μl) wird entnommen, um eine Bestimmung der Gesamtproteinmenge durchzuführen. Die restlichen Überstände werden bei –20°C gelagert.
Analytische Methode
vgl. oben
Ergebnisse
1. Spuren, die mit den mit dem Konstrukt pBIOC706 tranformierten Pflanzen korrespondieren:
Man findet bei den Pflanzen 40 und 45, die bei den Überständen nach Extraktion in saurem Milieu beobachtete Hauptbande, die auf Höhe der α1-Kette des Kontrollkollagens 1 wandert, jedoch zudem eine weitere Bande gleicher Intensität, die etwa bei 140 KDa wandert. Dieses Ergebnis zeigt das Vorhandensein der vollständigen rekombinaten α1(I)-Kette, die mit dem Konstrukt pBIOC706 korrespondiert. In der Tat korrespondiert die höhere Bande mit der für die rekombinante α1(I)-Kette, umfassend das C-Propeptid, erwarteten Molekularmasse.
2. Spuren, die mit den mit dem Konstrukt pBIOC707 transformierten Pflanzen korrespondieren:
Man findet für jede Pflanze (1, 2 und 14) die Hauptbande wieder, die in den Überständen nach Extraktion im sauren Milieu beobachtet wurde und bei etwa 140 KDa wandert, aber zudem eine weitere Bande von gleicher Intensität, die bei etwa 160 KDa wandert. Dieses Ergebnis zeigt das Vorhandensein der vollständigen rekombinanten α1(I)-Kette des Konstrukts pBIOC707. In der Tat korrespondiert die obere Bande mit der für die rekombinante α1(I)-Kette, umfassend die N- und C-Propeptide, erwarteten Molekularmasse.
Die Spuren der beiden Konstrukte pBIOC706 und pBIOC707, die mit den Pellets nach Extraktion und Zentrifugation der Proben korrespondieren, zeigen keine Bande mehr, die durch den Antikörper Anti-Kollagen I entsteht, was die Effizienz der Extraktion in neutralem pH (3) demonstriert.
BEISPIEL 7: KONFORMITÄT DES KOLLAGENS
Bestimmung des Vorhandenseins der N- und C-terminalen Propeptide in den rekombinanten α1(I)-Ketten bei Extraktion in saurem Milieu:
Die Extraktion der mit dem Konstrukt pBIOC707 transformierten Pflanzen in saurem pH erlaubt nur die Extraktion einer einzigen Bande, die etwas oberhalb der α1(I)-Kontrollbande wandert. Die erwartete Molarmasse des gesamten rekombinanten Polypeptids beträgt 160 KDa, die Hypothese einer Spaltung während der Reifung der rekombinanten α1(I)-Kette wird in Betracht gezogen. Gleiches gilt für das Konstrukt pBIOC706, für das eine Hauptbande in Höhe der α1(I)-Kontrollbande beobachtet wird. Diese Wanderung lässt sich nur durch Abspaltung eines Teils der rekombinanten Kette erklären. Um unsere Hypothese zu bestätigen, nach der die erhaltenen Hauptbanden der Konstrukte pBIOC706 und pBIOC707, die mit den rekombinanten α1(I)-Ketten korrespondieren, deren C-Propeptid im Laufe der Herstellung der Kollagenketten abgespalten wird, erfolgt ein Elektrophoresegel in reduzierendem Milieu, das nicht für jede positive Pflanze jedes Konstrukts durchgeführt wird, und eine anschließende Analyse nach Immunotransfer. In der Tat umfasst das N-Propeptid, wenn es korrekt repliziert wird, Brückenbildungen innerhalb der Ketten zwischen Cysteinen, während die Cysteine des C-Propeptids Brücken zwischen den Ketten ausbilden, ein Prozess, der die Bildung der Tripelhelix initiiert.
Analytische Methode
mal 500 μl der Pflanzen 2 (positiv für das Konstrukt pBIOC707) und 40 (positiv für das Konstrukt pBIOC706) werden durch Zugabe von 50 μl Trichloracetat 100% (TCA) für 30 Minuten bei Raumtemperatur gefällt. Die Proben werden mit 20 000 g für 15 Minuten bei 4°C zentrifugiert (Rotor 12148, Sigma TM), die Pellets werden zwei mal mit kaltem Ethanol 100% gewaschen. Die Präzipitate werden dann in 20 μl Auftragpuffer (Tris-HCl 60 mM pH 6.8, enthaltend 2% Sodiumdodecylsulfat, 10% Glycerin, 0,002% Bromphenolblau) aufgenommen, alternierend eine Spur in Anwesenheit von 10 mM DTT final und eine Spur ohne DTT, dann werden sie für 3 Minuten bei 100°C denaturiert. Die Gele werden nach dem Immunotransfer analysiert.
Ergebnisse
Nach dem Transfer und dem Nachweis mit den Antikörpern Anti-Kollagen I (Referenz 20121, Pasteuer Institut, Lyon) beobachtet man, dass die rekombinante Kette der Pflanze 2 in Anwesenheit des reduzierenden Agens etwas langsamer läuft als die rekombinante Kette in Abwesenheit des reduzierenden Agens. Dieser leichte Unterschied in der Wanderung wird bei der rekombinanten Kette der Pflanze 40 (Konstrukt mit deletiertem N-Propeptid) nicht beobachtet. Man leitet davon ab, dass dieser Unterschied in der Wanderung auf die korrekte Faltung des N-Peptids zurückzuführen ist, die Brückenbildungen innerhalb der Kette zwischen den Cysteinen erlaubt. Das C-Propeptid wäre demnach in diesen zwei rekombinanten Polypeptiden nicht vorhanden (4, Teil A).
Vorhandensein einer Brückenbildung zwischen den Ketten zwischen den Cysteinen des C-Propeptids:
Ein Elektrophoresegel wird in Anwesenheit oder Abwesenheit eines reduzierenden Agens mit Proben durchgeführt, die bei neutralem pH extrahiert wurden, für die zwei Hauptbanden erhalten wurden, wovon die obere das C-Propeptid umfassen muss. In der Tat wandert diese obere Bande bei der erwarteten Molekularmasse des nicht gespaltenen Polypeptids, bei dem es sich um das Konstrukt pBIOC706 (wichtige Tripelhelix + C-Propeptid) oder pBIOC707 (N-Propeptid + wichtige Tripelhelix + C-Propeptid) handelt, von 140 KDa bzw. 160 KDa. Im Falle einer Brückenbildung zwischen den Cysteinen der drei Ketten, die den für die Initiation der Tripelhelixbildung wichtigen Schritt darstellt, muss die Wanderung der oberen, nicht reduzierten Bande auf Höhe der γ Banden des Kontrollkollagenes I erfolgen, die mit der Wanderung der drei assoziierten Ketten korrespondiert (etwa 300 KDa).
Analytische Methode
Die Assays wurden mit den Pflanzen 1, 2, und 14 (Konstrukt pBIOC707) und den Pflanzen 40 und 45 (Konstrukt pBIOC706) durchgeführt, die in neutralem Puffer extrahiert wurden. Zwei mal 150 μl jeder Probe, d. h. 7.5 μg bis 11 μg Gesamtprotein pro Probenansatz, werden entnommen und mit 15 μl Trichloracetat 100% (TCA) präzipitiert wie vorher angegeben. Eine Reihe von Proben wird dann in 20 μl Auftragpuffer in Abwesenheit eines reduzierenden Agens aufgenommen, die andere Serie in 20 μl Auftragpuffer in Anwesenheit von 10 mM DTT. Auf jedem Gel werden zwei Taschen für die Molekularmassenstandards (6H Sigma TM), Kontrollkollagen I (bovin oder human 3 μg/Tasche) reserviert. Die Wanderung erfolgt in Migrationspuffer 0.025 M Tris-0.2 M Glycin, enthaltend 0.1 % Sodiumdodecylsulfat bei einer Spannung von 100 Volt im Sammelgel, die auf 200 Volt im Trenngel erhöht wird.
Immunotransfer:
Vgl. oben im Teil Identifizierung durch Analyse der Pflanzen durch Elektrophorese gefolgt von Immunotransfer.
Ergebnisse
1. Spuren, die mit den mit dem Konstrukt pBIOC707 transformierten Pflanzen korrespondieren.
In Anwesenheit des reduzierenden Agens findet man für jede Pflanze 1, 2 und 14 zwei Hauptbanden, wobei eine bei etwa 140 KDa wandert, die andere bei etwa 160 KDa. In Abwesenheit des reduzierenden Agens wandert die Bande von 140 KDa etwas schneller (Brückenbildung innerhalb der Kette zwischen den Cysteinen, die im N-Pro enthalten sind, was ihm eine kompaktere Struktur verleiht, und deshalb in reduzierter, nicht gefalteter Form in dem Gel schneller wandert). Die Bande von 160 KDa in Abwesenheit des reduzierenden Agens verschwindet, und es erscheint eine Hauptbande, die bei etwa 300 KDa wandert (etwas oberhalb der γ Bande des Kontrollkollagens I). Dieses Ergebnis zeigt die Anwesenheit der Brückenbildung zwischen den Ketten zwischen den Cysteinen des C-Propeptids der rekombinanten α1(I)-Kette (4, Teil B).
2. Spuren, die mit den mit dem Konstrukt pBIOC706 transformierten Pflanzen korrespondieren.
In Anwesenheit des reduzierenden Agens findet man für die Pflanzen 40 und 45 zwei Hauptbanden, wovon eine auf Höhe der α1(I)-Kette des Kontrollkollagens I wandert, die andere bei etwa 140 KDa. In Abwesenheit des reduzierenden Agens ist die Wanderung der niedrigeren Bande unverändert (dies bestätigt die Abwesenheit des C-Propeptids). Die Bande von 140 KDa verschwindet teilweise in Abwesenheit des reduzierenden Agens und es erscheint hauptsächlich eine Bande, die bei etwa 300 KDa wandert (auf Höhe der γ Bande des Kontrollkollagens I). Dieses Ergebnis zeigt die Anwesenheit von Brückenbildung zwischen den Ketten zwischen den Cysteinen des C-Propeptids der rekombinanten α1(I)-Kette (4, Teil C).
BEISPIEL 8: Bildung der Tripelhelix
Proteolytischer Verdau
Ein Verdau, durchgeführt mit Trypsin oder Pepsin, erlaubt es, die Bildung einer Tripelhelix und damit des Homotrimärs [α1(I)]3 zu bestätigen. In der Tat sind die N- und C-terminalen Enden empfindlich gegen Proteasen, während der zentrale Bereich des Moleküls, wenn die Tripelhelix gebildet ist, resistent ist. Die Bedingungen des Verdaus, die den Verdau des denaturierten Kollagens I erlauben, ohne das native Kollagen I zu beeinträchtigen, werden angegeben. Die Proben, die in neutralem Milieu extrahiert wurden, werden mit Trypsin in einem Enzym-Substrat-Verhältnis von 1:20 bei 35°C für 10 Minuten verdaut. Die Reaktion wird durch Zugabe von 10% TCA final abgestoppt, gefolgt von zwei Waschungen mit kaltem Ethanol 100%. Die Proben werden in Probenpuffer, enthaltend 10 mM DTT, aufgenommen, auf 100°C für 3 Minuten erhitzt und auf ein 6% Elektrophoresegel aufgetragen. Die Gele werden mit Coomassieblau gefärbt oder immunotransferiert und mit Antikörpern Anti-Kollagen I (Referenz 20121, Pasteuer Institut, Lyon) sichtbar gemacht, wie vorher angegeben. Die Pflanzen, in denen eine Tripelhelix ausgebildet wurde, erlauben die Beobachtung einer einzelnen Bande, die auf Höhe der α1(I)-Kontrollkette wandert.
Die Bildung der Tripelhelix kann gleichfalls durch Verwendung von Pepsin nachgewiesen werden. In diesem Fall werden die Proben gegen 0.5 M Essigsäure, 200 mM NaCl, pH 2.5 dialysiert, dann einem Pepsinverdau unterzogen. Die verwendeten Bedingungen des Verdaus sind die gleichen, die den vollständigen Verdau des denaturierten Kontrollkollagens I erlauben. Die Reaktion wird durch Neutralisierung des Verdaumediums abgestoppt. Die Proben werden dann mit 10% TCA final präzipitiert und wie oben angegeben behandelt.
Man kann den Proteaseverdau gleichfalls dazu verwenden, die Denaturierungstemperatur des rekombinanten Kollagens und damit die Stabilität der in den Pflanzen gebildeten Tripelhelix bestimmen. Dazu werden die Proben mit Trypsin bei steigenden Temperaturen verdaut (bei 25°C bis 45°C), dann werden sie wie oben angegeben, behandelt. Das Erscheinen von Banden, die mit dem proteolytischen Verdau korrespondieren, zeigt die Denaturierungstemperatur des rekombinanten Kollagens an. Die Temperatur des nativen Kollgens I beträgt 41°C; die des rekombinanten Homotrimers α1(I), das in eukariontischen Zellen entsteht, ist der des Kontrollkollagens I ähnlich, aber das Homotrimer wird auf alle Fälle ab einer Temperatur von 38°C teilweise gespalten (Geddis et al., 1993).
Nach dem Trypsinverdau des Kollagens, das aus den mit den Konstrukten pBIOC707 und pBIOC706 transformierten Pflanzen extrahiert wurde, wie vorhergehend beschrieben, wird das Fortbestehen einer Bande beobachtet, die auf Höhe der α1(I)- Kette des Kontrollkollagens I wandert. Dieses Ergebnis zeigt, dass das homotrimäre Kollagen, das aus den transformierten Pflanzen extrahiert wurde, als Tripelhelix gefaltet ist (1, Teil A).
Kontrastwechsel
Die Bildung der Tripelhelix kann gleichfalls durch Beobachtung von Repliken der erhaltenen Moleküle nach Kontrastwechsel im Elektronentransmissionsmikroskop bestätigt werden. In der Tat zeigt sich das Kollagenmolekül, wenn es in die Tripelhelix gefaltet ist, in einer charakteristischen Stäbchenform von 300 nm Länge und 1.4 nm Durchmesser. Die einzelnen α1(I)-Ketten sind mit dieser Technik nicht identifizierbar. Die Proben in einer Konzentration von 10 bis 20 μg/ml werden gegen 200 mM Ammoniumbicarbonat über Nacht bei 4°C dialysiert, dann im Verhältnis 1:1 mit Glycerin gemischt. 5 μl werden auf ein Blatt frisch gespaltenen Glimmers von 1 cm² aufgebracht, dann in den Evaporator (Med 10, Balzers TM) gebracht. Etwa 2 nm Platin-Kohlenstoff werden auf die Proben in einem Winkel von 8° bei einem Druck von 2 × 10^-6 Torr gedampft, gefolgt von einer Kohlenstoffevaporation bei 90° für einige Sekunden. Die Repliken werden durch Penetration bei 45° von den Glimmern in einem Behälter mit filtriertem, destillierten Wasser befreit und auf die Gitterelektroden des Elektronenmikroskops (600 mesh, Kupfer) gelegt. Die Beobachtung erfolgt mit einem Transmissionsmikroskop (CM120, Philipps TM).
Die Bildung einer Tripelhelix wird durch die Beobachtungen des gereinigten Kollagens aus positiven Pflanzen nach Kontrastwechsel im Elektronenmikroskop bestätigt. Die beobachteten Moleküle zeigen sich in charakteristischer Stäbchenform von 300 nm Länge (6, Teil B). Man stellt das Fehlen einer globulären Domäne an einem der beiden Enden der Tripelhelix fest, was die Abspaltung des C-Propeptids bestätigt.
BEISPIEL 9:
Ultrastruktur der transformierten Pflanzen:
Ein Fragment eines Blattes jeder positiv transformierten Pflanze und einer nicht-transformierten Kontrolle wird in einer Fixiermischung aus Glutaraldehyd 2%, Paraformaldehyd 0.5% in Citratphosphatpuffer 0.1 M pH 6.8 für 8 Stunden bei Raumtemperatur fixiert. Während der Fixierung und falls nötig darüber hinaus, werden die Proben zum Entgasen in eine Vakuumglocke gestellt. Die Proben werden mehrere male für 15 Minuten in Citratphosphatpuffer gespült, dann in einer 2% Osmiumsäurelösung in 0.1 M Citratphosphatpuffer für 2 Stunden bei Raumtemperatur postfixiert. Die Proben werden anschließend durch aufeinanderfolgende Bäder in Ethanol 30% bis 100% dehydriert. Der absolute Ethanol wird durch ein reines Propylenoxidbad ersetzt, das zwei mal erneuert wird. Die in den Bädern erfolgende Substitution schließt eine Mischung von reinem Propylenoxid und Epoxidharz ein, aus 1 auf 3 Volumen, dann 1:1 und schließlich 3:1. Die Imprägnierung erfolgt über Nacht mit reinem Epoxidharz und kann durch Wechsel der Bäder bis zur vollständigen Einbettung der Proben fortgesetzt werden. Die Proben sind dann in Kapseln eingeschlossen und werden für 30 Tage bei 60°C polymerisiert. Ultradünne Schnitte werden hergestellt, die mit 7% Uranylacetat in Methanol für 10 Minuten, dann mit Bleicitrat für 5 Minuten kontrastiert werden. Die Beobachtungen werden an einem Elektronentransmissionsmikroskop durchgeführt (CM120, Phillips TM).
BEISPIEL 10
Aufreinigung des rekombinanten Kollagens
Das rekombinante Kollagen wurde aus Pflanzenextrakten unter Verwendung der ihnen eigenen physiko-chemischen Eigenschaften aufgereinigt. Säure präzipitiert eine große Zahl von Proteinen und erhaltene elekrophoretische Profile von Extrakten von kontrollierten Pflanzen in saurem Milieu zeigen, dass wenige endogene Proteine extrahiert werden. Darüber hinaus ist das Chlorophyll in den Extrakten nicht anwesend. Bei Kollagen, das in Säure löslich ist, wurden die verschiedenen Extrakte gegen 0.5 M Essigsäure dialysiert, wenn sie nicht direkt in saurem Milieu extrahiert wurden. Nach der Zentrifugation, um unlösliches Material zu eliminieren, wird das Kollagen durch fraktionierte Präzipitation mit Salz in saurem Milieu: aus 0.7 M NaCl in 0.5 M Essigsäure gereinigt, dann nach der Zentrifugation wird der Überstand filtriert, mit 0.9 M NaCl in 0.5 M Essigsäure präzipitiert, dann erneut zentrifugiert, um das Präzipitat als Pellet zu erhalten. Die beiden Präzipitate bei 0.7 und 0.9 M, die die Proben enthalten, werden in 0.5 M Essigsäure aufgenommen, dann werden sie einer Elektrophorese auf 6% Acrylamid unterzogen. Die Reinheit der Fraktionen wird nach der Färbung des Gels mit Commassieblau abgeschätzt. Die Proben, die als nicht ausreichend rein eingeschätzt werden, können einem zweiten Präzipitationszyklus mit Salz, nach Dialyse der Fraktion in 0.5 M Essigsäure, um Spuren des verbleibenden Salzes zu eliminieren, unterzogen werden. In dem Fall, bei dem ein zusätzlicher Reinigungsschritt nötig wird, wird eine Ionenaustauschchromatographie durchgeführt, wobei die Elution mit einem Gradienten von 0 bis 0.5 M NaCl erfolgt und die Fraktionen einem Elektrophoresegel unterzogen werden, wie vorhergehend angegeben.
Die Ergebnisse zeigen, dass der größte Teil der Pflanzenproteine durch einen Präzipitationsschritt mit 0.4 M NaCl elimiiert wird. Nach der Präzipitation mit 0.7 M NaCl, dann mit 0.9 M NaCl wie in Beispiel 10 angegeben, wird beobachtet, dass das homotrimäre Kollagen zu 80 bis 90% rein in dem 0.9 M NaCl Präzipitat vorliegt.
Eine Heparinbindungsstelle, die sich auf dem heterogenen Kollagen befindet, wird in der Literatur beschrieben (San Antonio et coll., 1994, J. Cell Biol., 125:1179-1188). Solche Stellen sind für die Bindung von Proteoglykanen, die sich auf der extrazellulären Matrix befinden, aber ebenso für die Adhäsion von Zellen über membranäre Proteoglykanrezeptoren verantwortlich. Diese Interaktionen erlauben zudem die Kohäsion des kollagenen Netzes zu sichern. Das Fortbestehen dieser Stelle im Homotrimer wird durch Fixierung des Homotrimers auf einer Heparinaffinitätssäule unter physiologischen Bedingungen des pH (7.4) und der Ionenstärke (0.15 M NaCl) analysiert. Dieses Verfahren kann als zweiter Reinigungsschritt dienen.
BEISPIEL 11:
Aminosäurezusammensetzung und Mikrosequenzierung:
Die verschiedenen, nach der Extraktion der transformierten Pflanzen erhaltenen Produkte werden unter Vakuum mit 6 N HCl bei 115°C für 24 Stunden in einem PicoTag System (Waters, TM) hydrolisiert. Die Aminosäurezusammensetzung wird mit Hilfe eines automatischen Analysegerätes Beckmann TM bestimmt. Diese Analyse erlaubt insbsondere den Gehalt an hydroxyliertem Prolin, die Hydroxylierung des Prolins garantiert die Stabilität der Tripelhelix, zu verifizieren.
Die Microsequenzierung erfolgt nach der Edmanmethode mit einem Gerät, das die automatische N-terminale Sequenzierung der Proteine erlaubt (Applied Biosystems 473 A Protein Sequenzer TM). Die rekombinanten Kollagene oder Prokollagene können auf das Geräte auf zwei Arten geladen werden:

– Nach der Reinigung liegen die Proteine in Form einer konzentrierten Lösung vor. Die Proteine sind durch hydrophobe Bindungen mit einer mit Polybren behandelten Glasfaserpastille verbunden. Die Glasfaserpastille wird direkt in das Gerät eingeführt.
– Nach der Elektrophorese und dem Elektrotransfer werden die Banden von Interesse nach Färbung mit 0.02% Ponceaurot in 0.1 % Essigsäure und Entfärbung in filtriertem, destilliertem Wasser gefunden, die Banden werden mit dem Skalpell ausgeschnitten, dann in eine an dem Gerät befestigte Zelle eingeführt.

Nach dem Prinzip des Edman-Abbaus setzt jeder Zyklus eine Aminosäure in Form eines Phenylthiohydantoin-Aminosäurekomplexes frei. Sie werden sukzessive und automatisch auf eine inverse Phase Hochdruckchromatographiesäule (HPLC) aufgebracht und durch UV-Absorbierung bei 269 nm detektiert. Durch Vergleich ihrer Retentionszeiten mit dem Spektrum der Standards bestimmt man anschließend Zyklus für Zyklus die N-terminale Sequenz des zu analysierenden Proteins.
Das durch Präzipitation mit 0.9 M NaCl erhaltene Kollagen wird einem weiteren Reinigungsschritt unterzogen (inverse Phase (C8) Säulenchromatographie für HPLC), bevor die Analyse der Aminosäuren durchgeführt wird. Die erhaltene Analyse ist mit der konform, die ausgehend von der cDNA der humanen α1(I)-Kette vorhergesagt wurde, insbesondere die charakteristischen Reste des Kollagens, wie Glycin und Prolin:
Andererseits, um zu verfizieren, ob die Abspaltung des Signalpeptids der Pflanze, das in den Konstrukten pBIOC707 und pBIOC706 vorhanden ist, korrekt erfolgte, aber gleichzeitig um sicherzustellen, dass keine proteolytische Degradation am N-terminalen Ende im Verlauf der Extraktion erfolgte, wird jede untere Bande, die auf dem Elektrophoresegel für das Kollagen, extrahiert aus den mit dem Konstrukt pBIOC707 und pBIOC706 transformierten Pflanzen, beobachtet wird, einer N-terminalen Sequenzierung durch Edmann-Abbau nach dem Elektrotansfer unterzogen.
Die erhaltenen Sequenzen sind: ELAPQLSY für das Kollagen, das mit dem Konstrukt pBIOC706 korrespondiert und AQVEGQDE für das Konstrukt pBIOC707. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Abspaltung des Signapeptids effektiv erfolgt und bestätigt andererseits, dass die N-terminalen Enden (das N-Telopeptid des Konstrukts pBIOC706 und N-Propeptid des Konstrukt pBIOC707) intakt sind. Darüber hinaus zeigt die Gesamtheit der Ergebnisse (Beispiele 6, 7, 8 und 11), dass das Kollagen, das aus den reifen Pflanzen extrahiert wird mit einem homotrimeren Kollagen korrespondiert, von dem das C-Propetid abgespaltet wurde.
Beispiel 12: Akkumulation des Kollagens in den reifen Pflanzen
Die jungen transformierten Pflanzen, die sich als positiv im Immunotransfer gezeigt haben, werden zur Reife geführt. Die Blätter der Pflanzen werden geerntet und entweder direkt eingeforen, dann bei Kälte zermahlen, oder lyophilisiert. Welche Methode auch immer zur Lagerung der Blätter (gefrieren oder lyophilisieren) angewendet wurde, wird das Kollagen mühelos in saurem Milieu unter den in Beispiel 6 beschriebenen Bedingungen extrahiert. Nach der Extraktion findet man eine einzige Hauptbande für jeden Extrakt, der von den mit dem Konstrukt pBIOC707 und pBIOC706 transformierten Pflanzen erhalten wurde, wieder. In jedem dieser Fälle korrespondiert diese Bande mit dem Homotrimer nach der Abspaltung des C-Propetids (siehe Beispiel 6). Andererseits wird gezeigt, dass sich das Kollagen in den reifen Pflanzen anhäufen und so eine bedeutende Menge an Kollagen pro Gramm Nassgewicht erzeugen kann. Eine junge Pflanze (z.B. Pflanze 45) kann einen Extrakt, der etwa 6 – 8 μg/ml des homotrimeren Kollagens enthält, liefern, während dieselbe Pflanze im reifen Zustand die Extraktion von 40 – 50 μg/ml, d. h. 0.5 mg/g Nassgewicht, erlaubt. Man bezeichnet als Prokollagen das Kollagenmolekül, das die N- und C-Propeptide enthält, als pN-Kollagen und pC-Kollagen die Moleküle, die entweder die eine oder die andere terminale Domäne umfassen. Schließlich ist das Kollagen die molekulare Form, die nur eine tripelhelikale Domäne aufweist und in den tierischen Geweben der reifen Form entspricht. Folglich werden die extrahierten Produkte als pN-Kollagen (Konstrukt pBIOC707) und Kollagen (Konstrukt pBIOC) identifiziert.
Beispiel 13: Fibrillogenese und Adhäsionstest
Das gereinigte Kollagen wird auf 0.2 – 0.5 mg/ml mit 0.1 M Essigsäure verdünnt, dann gegen Salinephoshatpuffer (PBS), pH 7.4 bei 4°C über Nacht dialysiert. Die Probe wird dann in ein Wasserbad gegeben und die Temperatur wird schrittweise bis auf 30°C erhöht und diese Temperatur wird für 2 Stunden gehalten. Die Bildung der Fasern wird im Elektronenmikroskop anhand von Negativ- oder Positivfärbung der Proben beobachtet. Die Kinetik der Faserbildung wird mit Hilfe eines Spektrophotometers turbidimetrisch verfolgt, wobei die Faserbildung die optische Dichte verändert (Wood et Keech, 1960, Biochem, J., 75:588-598).
Das Kollagen I ist ein adhäsives Protein, d. h. dass zahlreiche zelluläre Typen geeignet sind, es zu erkennen und sich auf spezifische Weise, durch Vermittung membranärer Rezeptoren, darauf anzuheften. Es ist möglich, die adhäsiven Eigenschaften eines Proteins mit Hilfe eines kolorimetrischen Tests zu überprüfen, der auf Microtiterplatten durchgeführt wird (Aumailley et coll. 1989, Exp. Cell. Res. 181, 463-474).
Das extrahierte Kollagen wird über Nacht bei 4°C an Microtiterplatten absorbiert, dann mit der Zellsupension bei 37°C für 20 bis 30 Minuten in Kontakt gebracht. Die nicht-adhärenten Zellen werden durch Waschen eliminiert, die adhärenten Zellen werden mit Glutaraldehyd 1% fixiert, dann mit 0.1% Kristallviolett gefärbt. Nach intensivem Waschen der Platten, wird die Färbung, die durch die adherenten Zellen fixiert wird, mit Triton X100 solubilisiert. Die Platten werden bei 570 nM in einem ELISA-Lesegerät gelesen, wobei der Wert der optischen Dichte die Funktion der Zahl der adherenten Zellen ist.
REFERENZEN

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Claims

Verwendung einer rekombinierten Nucleotidsequenz einerseits enthaltend eine cDNA, kodierend für eine oder mehrere Kollagenketten von Säugern und andererseits Elemente, die es einer Pflanzezelle ermöglichen, eine oder mehrere Kollagenketten zu produzieren, kodiert durch besagte cDNA, deren Promotor und Terminationsstelle der Transkription von der Transkriptionsmaschine-rie der Pflanzenzelle erkannt werden, zur Umwandlung einer Pflanzenzelle im Hinblick auf die Gewinnung einer oder mehrerer Kollagenketten, ausgehend von diesen Zellen oder Pflanzen, die ausgehend von letzteren gewonnen werden.
Rekombinierte Nucleotidsequenz, dadurch charakterisiert, dass sie einerseits die kodierende Sequenz für eine oder mehrere Kollagenketten von Säugern enthält und andererseits Elemente, die es einer Pflanzenzelle ermöglichen eine oder mehrere Kollagenketten zu produzieren, kodiert durch besagte Sequenz, deren Promotor und Terminationsstelle der Transkription durch die Transkriptionsmaschi-nerie der Pflanzenzelle erkannt werden.
Vektor enthaltend eine Nucleotidsequenz gemäß Anspruch 2, eingefügt an einer für seine Replikation nicht essentiellen Stelle.
Vektor gemäß Anspruch 3, dadurch charakterisiert, dass er ein Plasmid ist, enthaltend eine Nucleotidsequenz gemäß Anspruch 2, eingefügt an einer für seine Replikation nicht essentiellen Stelle.
Wirtszelle, transformiert mit einen Vektor gemäß Anspruch 3 oder 4.
Wirtzelle gemäß Anspruch 5, ausgewählt aus Bakterien wie Agrobacterium tumefaciens.
Verfahren zur Gewinnung einer oder mehrerer Kollagenketten, dadurch charakterisiert, dass es umfasst: – die Transformation einer Pflanzenzelle mit Hilfe einer Wirtszelle gemäß Anspruch 5 oder 6, selbst transformiert mit einem Vektor gemäß Anspruch 3 oder 4 auf die Weise, dass in das Genom dieser Zellen eine rekombinierte Sequenz gemäß Anspruch 2 eingefügt wurde, – die Gewinnung transformierter Pflanzen ausgehend von den oben genannten transformierten Zellen – die Rückgewinnung einer oder mehrerer rekombinanter Kollagenketten hergestellt in den oben genannten transformierten Zellen oder Pflanzen, durch Extraktion, nachfolgend durch Aufreinigung.
Pflanzen oder Pflanzenteile, Blätter und/oder Früchte und/oder Samen und/oder Zellen der Pflanzen, genetisch transformiert, dadurch charakterisiert, dass sie eine (oder mehrere) rekombinierte Nucleotidsequenz(en) gemäß Anspruch 2 enthalten, die stabil in ihr Genom eingefügt ist (sind), oder rekombinantes Kollagen exprimieren, kodiert durch besagte Nucleotidsequenzen, wobei diese Pflanzen ausgewählt sind aus der Gruppe Raps, Tabak, Mais, Erbse, Tomate, Karotte, Weizen, Gerste, Kartoffel, Soja, Sonnenblume, grüner Salat, Reis, Luzerne und Rübe.
Rekombinante Kollagenkette, dadurch charakterisiert, dass sie gemäß dem Verfahren nach Anspruch 7 erhältlich ist.
Kollagen, dadurch charakterisiert, dass es erhältlich ist gemäß dem Verfahren nach Anspruch 7 und ein Homotrimer ist, und dass das Propeptid gespalten wird.
Kollagenprodukt bestehend aus Kollagenketten oder Kollagen gemäß der Ansprüche 9 oder 10.
Gelatine bestehend aus Kollagenketten gemäß der Ansprüche 9 oder 10.
Biomaterial und pharmazeutische, medizinische, zahnmedizinische, kosmetische oder biotechnologische Zusammensetzung umfassend ein Produkt gemäß Anspruch 11.
Pflanzen oder Pflanzenteile, Blätter und/oder Früchte und/oder Samen und/oder Pflanzenzellen, genetisch transformiert, dadurch charakterisiert, dass sie Kollagenketten oder Kollagen gemäß der Ansprüche 10 oder 11 enthalten, wobei diese Pflanzen ausgewählt sind aus der Gruppe Raps, Tabak, Mais, Erbse, Tomate, Karotte, Weizen, Gerste, Kartoffel, Soja, Sonnenblume, grüner Salat, Reis, Luzerne und Rübe.
Verwendung von Pflanzen oder Pflanzenteilen gemäß Anspruch 8 oder 14 und/oder von Produkten gemäß der Ansprüche 9 bis 12, um eine pharmazeutische, medizinische, zahnmedizinische, kosmetische oder biotechnologische Zusammensetzung zu gewinnen.