EA037478B1 - Генетически кодируемые внутренне неупорядоченные полимеры-"невидимки" для доставки и способы их применения - Google Patents

Генетически кодируемые внутренне неупорядоченные полимеры-"невидимки" для доставки и способы их применения Download PDF

Info

Publication number
EA037478B1
EA037478B1 EA201890417A EA201890417A EA037478B1 EA 037478 B1 EA037478 B1 EA 037478B1 EA 201890417 A EA201890417 A EA 201890417A EA 201890417 A EA201890417 A EA 201890417A EA 037478 B1 EA037478 B1 EA 037478B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
conjugate
amino acid
cancer
polypeptide
subject
Prior art date
Application number
EA201890417A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201890417A1 (ru
Inventor
Ашутош Чилкоти
Самагия Банскота
Париса Юсефпур
Джайанта Бхаттачария
Original Assignee
Дьюк Юниверсити
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Дьюк Юниверсити filed Critical Дьюк Юниверсити
Publication of EA201890417A1 publication Critical patent/EA201890417A1/ru
Publication of EA037478B1 publication Critical patent/EA037478B1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/337—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having four-membered rings, e.g. taxol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/08—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing oxygen, e.g. ethers, acetals, ketones, quinones, aldehydes, peroxides
    • A61K47/10—Alcohols; Phenols; Salts thereof, e.g. glycerol; Polyethylene glycols [PEG]; Poloxamers; PEG/POE alkyl ethers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Abstract

В данном документе представлены конъюгаты, содержащие полипептид и одну или несколько молекул лекарственного средства. Полипептид содержит один или несколько заряженных мотивов и может дополнительно содержать один или несколько незаряженных мотивов. Конъюгаты можно применять для эффективной доставки субъекту молекулы лекарственного средства.

Description

Перекрестная ссылка на родственные заявки
Настоящая заявка заявляет приоритет по предварительной заявке на патент США № 62/200726, поданной 4 августа 2015 г., которая включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.
Заявление, касающееся исследования, финансируемого из федерального бюджета
Настоящее изобретение было создано при поддержке правительства в рамках гранта 5R01EB000188 R01, присужденного Национальными институтами здравоохранения. Правительство обладает определенными правами на настоящее изобретение.
Область техники
Настоящее изобретение относится к способам доставки лекарственных средств и, более конкретно, к цвиттерионным полипептидам, конъюгированным с терапевтическими средствами. Конъюгаты характеризуются улучшенной биологической совместимостью и биоразлагаемостью. В некоторых вариантах осуществления конъюгаты могут экспрессироваться рекомбинантным путем и, таким образом, их можно точно конструировать и подвергать манипуляциям на генном уровне.
Введение
Доставка лекарственных средств или терапевтических средств, таких как малые молекулы, пептиды и белки, в их нативной форме ограничена их недостаточной стабильностью, низкой растворимостью и коротким периодом циркуляции в крови in vivo. Эти проблемы с доставкой лекарственных средств приводят к снижению терапевтической эффективности и увеличению риска нецелевой токсичности. Благодаря присоединению макромолекулярных носителей к лекарственным средствам может улучшаться их растворимость, период полувыведения из плазмы крови, опухолеспецифическое поглощение и их общий терапевтический потенциал. Для доставки лекарственных средств ранее были сконструированы различные материалы, главным образом синтетические полимеры. Один такой синтетический полимер представляет собой полиэтиленгликоль (PEG). PEG представляет собой гидрофильный и гигроскопичный полимер, образующий водную оболочку вокруг лекарственного средства, которая таким образом обеспечивает стерическое отталкивание от компонентов крови и предотвращает как его опсонизацию, так и ферментативное разрушение. Благодаря этому свойству невидимости PEG улучшается растворимость и стабильность лекарственных средств и снижается их преждевременное выведение из организма субъекта, что делает пегилирование - процесс присоединения лекарственных средств к PEG - важным способом в фармацевтической промышленности. В последние годы новый класс цвиттерионных синтетических полимеров, полимеры с чередующимися катионными и анионными группами в их мономере, продемонстрировал аналогичные свойства невидимости. Тем не менее, существуют три основных недостатка, которые ставят под сомнение надежность синтетических полимеров в качестве средств доставки лекарственных средств. Во-первых, убедительно подтверждено документальными доказательствами, что повторяющееся воздействие PEG может вызывать образование PEG-специфичных антител, которые инициируют нежелательные иммунные ответы. Во-вторых, синтетические полимеры не являются биоразлагаемыми, и их эффект после доставки лекарственных средств in vivo не является в достаточной степени ясным. В-третьих, синтетические полимеры являются полидисперсными в том смысле, что каждая партия состоит из цепей с различными значениями молекулярной массы. Эта полидисперсность, внутренне присущая синтетическим полимерам, может приводить к получению группы конъюгатов лекарственных средств с различными биологическими свойствами, в частности, в отношении периода полувыведения и иммуногенности. В данной области техники существует необходимость в эффективной доставке лекарственных средств с улучшенными биологической совместимостью, растворимостью, стабильностью и периодом полувыведения, а также пониженной токсичностью.
Краткое описание
В одном аспекте в данном документе представлены конъюгаты, содержащие (а) полипептид, содержащий один или несколько заряженных мотивов, при этом каждый заряженный мотив независимо имеет аминокислотную последовательность, состоящую из SEQ ID NO: 1 (VPX1X2G), где X1 представляет собой отрицательно или положительно заряженную аминокислоту и где Х2 представляет собой отрицательно или положительно заряженную аминокислоту, имеющую противоположный заряд; и (b) одну или несколько молекул лекарственного средства, присоединенных к полипептиду.
В некоторых вариантах осуществления полипептид содержит множество заряженных мотивов. В некоторых вариантах осуществления множество заряженных мотивов повторяется тандемно. В некоторых вариантах осуществления полипептид дополнительно содержит один или несколько незаряженных мотивов, при этом каждый незаряженный мотив независимо имеет аминокислотную последовательность, состоящую из SEQ ID NO: 3 (VPGXG), где X представляет собой любую аминокислоту, за исключением пролина. В некоторых вариантах осуществления полипептид содержит множество незаряженных мотивов. В некоторых вариантах осуществления множество незаряженных мотивов повторяется тандемно. В некоторых вариантах осуществления один или несколько незаряженных мотивов расположены между по меньшей мере двумя смежными заряженными мотивами полипептида.
В некоторых вариантах осуществления полипептид содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 2 (VPX1X2G)n, где X1 представляет собой отрицательно или положительно заряженную
- 1 037478 аминокислоту, Х2 представляет собой отрицательно или положительно заряженную аминокислоту, имеющую противоположный заряд, а n представляет собой целое число, равное 1 или больше. В некоторых вариантах осуществления полипептид содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 4 (VPGXG)n, где X представляет собой любую аминокислоту, за исключением пролина, а n представляет собой целое число, равное 1 или больше. В некоторых вариантах осуществления полипептид содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 5 (VPX1X2G)n(VPGXG)m, где X1 представляет собой отрицательно или положительно заряженную аминокислоту, Х2 представляет собой отрицательно или положительно заряженную аминокислоту, имеющую противоположный заряд, X представляет собой любую аминокислоту, за исключением пролина, а n и m независимо представляют собой целое число, равное 1 или больше. В некоторых вариантах осуществления полипептид содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 6 (VPGXG)m(VPX1X2G)n, где X1 представляет собой отрицательно или положительно заряженную аминокислоту, Х2 представляет собой отрицательно или положительно заряженную аминокислоту, имеющую противоположный заряд, X представляет собой любую аминокислоту, за исключением пролина, а n и m независимо представляют собой целое число, равное 1 или больше. В некоторых вариантах осуществления полипептид содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 7 {(VPX1X2G) (VPGXG)}b, где X1 представляет собой отрицательно или положительно заряженную аминокислоту, Х2 представляет собой отрицательно или положительно заряженную аминокислоту, имеющую противоположный заряд, X представляет собой любую аминокислоту, за исключением пролина, а b представляет собой целое число, равное 1 или больше. В некоторых вариантах осуществления X1 представляет собой отрицательно заряженную аминокислоту, и при этом Х2 представляет собой положительно заряженную аминокислоту. В некоторых вариантах осуществления X1 представляет собой положительно заряженную аминокислоту, и при этом Х2 представляет собой отрицательно заряженную аминокислоту. В некоторых вариантах осуществления отрицательно заряженная аминокислота независимо выбрана из глутаминовой кислоты и аспарагиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления положительно заряженная аминокислота независимо выбрана из лизина и аргинина. В некоторых вариантах осуществления X представляет собой любую аминокислоту, за исключением пролина. В некоторых вариантах осуществления X выбран из аргинина, гистидина, лизина, аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты, серина, треонина, аспарагина, глутамина, цистеина, селеноцистеина, глицина, аланина, валина, лейцина, изолейцина, метионина, фенилаланина, тирозина и триптофана. В некоторых вариантах осуществления X выбран из глицина и валина.
В некоторых вариантах осуществления полипептид дополнительно содержит линкер. В некоторых вариантах осуществления линкер содержит один или несколько цистеиновых остатков. В некоторых вариантах осуществления линкер содержит аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: (GGC), SEQ ID NO: ((GGC)s), SEQ ID NO: ((648)3) и SEQ ID NO: ((VPGXG)16, где X представляет собой валин или цистеин, присутствующие в соотношении 1:1). В некоторых вариантах осуществления линкер расположен на С-конце, на N-конце или как на С-, так и на N-конце полипептида. В некоторых вариантах осуществления одна или несколько молекул лекарственного средства присоединены к полипептиду с помощью линкера. В некоторых вариантах осуществления молекула лекарственного средства присоединена к полипептиду посредством тиол-реактивной группы в линкере. В некоторых вариантах осуществления одна или несколько молекул лекарственного средства выбраны из малой молекулы, нуклеотида, полинуклеотида, пептида, белка, углевода и их комбинации. В некоторых вариантах осуществления молекула лекарственного средства включает малую молекулу. В некоторых вариантах осуществления молекула лекарственного средства включает белок. В некоторых вариантах осуществления молекула лекарственного средства включает противораковое терапевтическое средство. В некоторых вариантах осуществления молекула лекарственного средства включает антитело. В некоторых вариантах осуществления молекула лекарственного средства включает паклитаксел. В некоторых вариантах осуществления молекула лекарственного средства включает Tn3 (суперагонист TRAIL). В некоторых вариантах осуществления конъюгат получают для введения субъекту. В некоторых вариантах осуществления полипептид конъюгата экспрессируется рекомбинантным путем. В некоторых вариантах осуществления конъюгат экспрессируется рекомбинантным путем.
В другом аспекте в данном документе представлены композиции, содержащие конъюгат, подробно описанный в данном документе.
В другом аспекте в данном документе представлены полинуклеотиды, кодирующие полипептид, подробно описанный в данном документе. В другом аспекте в данном документе представлены полинуклеотиды, кодирующие конъюгат, подробно описанный в данном документе. В другом аспекте в данном документе представлены векторы, содержащие полинуклеотид.
В другом аспекте в данном документе представлены способы доставки субъекту молекулы лекарственного средства, при этом способ включает введение субъекту конъюгата, подробно описанного в данном документе.
В другом аспекте в данном документе представлены способы лечения субъекта, имеющего заболевание или нарушение, при этом способ включает введение субъекту конъюгата, подробно описанного в данном документе.
- 2 037478
В другом аспекте в данном документе представлены способы определения наличия мишени в образце, при этом способ включает приведение образца в контакт с конъюгатом, подробно описанным в данном документе, в условиях, обеспечивающих возможность образования комплекса между молекулой лекарственного средства и мишенью в образце; и выявление наличия комплекса, где наличие комплекса указывает на наличие мишени в образце.
В некоторых вариантах осуществления образец получают от субъекта, и способ дополнительно включает диагностику заболевания, прогнозирование или оценку эффективности лечения субъекта. В некоторых вариантах осуществления в случае, если способ дополнительно включает оценку эффективности лечения субъекта, способ дополнительно включает модификацию лечения субъекта в случае необходимости в улучшении эффективности. В другом аспекте в данном документе представлены способы диагностики заболевания у субъекта, при этом способ включает приведение образца от субъекта в контакт с конъюгатом, подробно описанным в данном документе, в условиях, обеспечивающих возможность образования комплекса между молекулой лекарственного средства и мишенью в образце; определение уровня мишени в образце, где уровень комплекса указывает на уровень мишени в образце; и сравнение уровня мишени в образце с контрольным уровнем мишени, где уровень мишени, отличный от контрольного уровня, указывает на заболевание у субъекта. В некоторых вариантах осуществления контрольный уровень соответствует уровню у субъекта в момент времени до или в течение периода, в который субъект начал лечение, и где образец берут у субъекта в более поздний момент времени. В некоторых вариантах осуществления образец берут у субъекта в момент времени в течение периода, в который субъекта подвергают лечению, и при этом контрольный уровень соответствует уровню в отсутствие заболевания или уровню в момент времени до периода, в который субъект начал лечение. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает модификацию лечения или назначение другого вида лечения субъекту в случае, если данный вид лечения определяют как неэффективный при лечении заболевания. В некоторых вариантах осуществления конъюгат метят репортерной молекулой. В некоторых вариантах осуществления конъюгат вводят субъекту внутривенным, внутриартериальным, внутрибрюшинным или внутриопухолевым путем. В некоторых вариантах осуществления конъюгат характеризуется пониженной антигенностью по сравнению с молекулой лекарственного средства, конъюгированной с полиэтиленгликолем (PEG). В некоторых вариантах осуществления конъюгат характеризуется пониженной иммуногенностью по сравнению с молекулой лекарственного средства, конъюгированной с полиэтиленгликолем (PEG). В некоторых вариантах осуществления заболевание выбрано из рака, метаболического заболевания, аутоиммунного заболевания, сердечно-сосудистого заболевания и ортопедического нарушения. В некоторых вариантах осуществления заболевание включает рак. В некоторых вариантах осуществления рак выбран из рака молочной железы, колоректального рака, рака толстой кишки, рака легкого, рака предстательной железы, рака яичка, рака головного мозга, рака кожи, рака прямой кишки, рака желудка, рака пищевода, форм саркомы, рака трахеи, рака головы и шеи, рака поджелудочной железы, рака печени, рака яичника, рака лимфатической системы, рака шейки матки, рака вульвы, меланомы, мезотелиомы, рака почки, рака мочевого пузыря, рака щитовидной железы, рака костей, карциномы, саркомы и рака мягких тканей. В некоторых вариантах осуществления рак включает рак молочной железы.
Краткое описание графических материалов
На фиг. 1 показаны возможные варианты архитектуры и последовательности ZiPP. (А) Гомополимер. (В) Диблок-полимер. (С) Мультиблочный полимер. (D) Возможные последовательности заряженного мотива.
На фиг. 2 показано получение характеристик ZiPP. Применяемые конструкции ZiPP представляли собой 120 повторов пентапептидных цвиттерионных мотивов. (А) Анализ очищенных конструкций ZiPP посредством SDS-PAGE. (В) Иллюстративные MALDI-спектры (VPKDG)120 и (VPRDG)120 подтверждали MW очищенных конструкций ZiPP (соответственно MW=60,5 кДа, MW=63,8 кДа). (С) Результаты измерения гидродинамического радиуса с помощью динамического светорассеяния демонстрировали хорошо гидратированные ZiPP по сравнению с контрольными ELP. (D) Спектры CD ZiPP демонстрировали отрицательную эллиптичность при малой длине волны и незначительную положительную эллиптичность при большей длине волны, что является типичным для неупорядоченной структуры, такой как у ELP. (E) Нативный PAGE в геле демонстрировал, что ZiPP не взаимодействовали с альбумином.
На фиг. 3 показаны фармакокинетические характеристики ELP (VPGAG) и ZiPP в плазме крови при внутривенной инъекции. (А) Схема эксперимента. (В) Значения концентрации в плазме крови в зависимости от времени, прошедшего после инъекции. (С) Площадь под кривой (AUC) для каждого конъюгата. (D) Период полувыведения для каждого конъюгата.
На фиг. 4 показаны фармакокинетические характеристики ELP (VPGAG) и ZiPP в плазме крови при подкожной инъекции. (А) Схема эксперимента. (В) Значения концентрации в плазме крови в зависимости от времени, прошедшего после инъекции. (С) AUC для каждого конъюгата.
На фиг. 5 показано получение характеристик конъюгата ZiPP-PTX. (А) Схема конструирования наночастиц ZiPP-паклитаксел (РТХ). Паклитаксел конъюгировали химическим путем с 8 С-концевыми остатками с помощью рН-чувствительного линкера. (В) Данные динамического и статического светорассеяния после конъюгирования с РТХ демонстрируют, что ZiPP самособираются в мицеллы радиусом 58
- 3 037478 нм с числом агрегации 26 на мицеллу. Фактор формы (ρ), рассчитываемый как Rg/Rh, составлял 0,82, что означает образование сферических мицелл. MALDI-MS ZiPP и конъюгата ZiPP+PTX демонстрировала наличие 3,2-4 молекул лекарственных средств на полимерную цепь. (С) Жизнеспособность клеток в случае применения ZiPP-PTX, ELP-PTX и свободного РТХ в линии раковых клеток молочной железы MDAMB-231 с тройным негативным фенотипом после 72 ч обработки.
На фиг. 6 показаны ZiPP-илированные белки. (А) Общий вид конструкции слитого белка на основе ZiPP с (Tn3)6. (В) Анализ посредством SDS-PAGE подвергнутых аффинной очистке образцов (Tn3)6 с различными значениями длины ZiPP, которые экспрессировались рекомбинантным путем в Е. coli. (С) Анализ цитотоксичности в отношении Со1о205 (раковых клеток толстой кишки) и расчетные значения IC50.
На фиг. 7 показано получение характеристик ZiPP. Применяемые конструкции ZiPP представляли собой 80 повторов пентапептидных цвиттерионных мотивов. (А) Анализ очищенных конструкций ZiPP посредством SDS-PAGE. Маркеры длин белков на 50 и 75 кДа отмечены в качестве эталонной молекулярной массы, однако маркеры длин белков, применяемые в SDS-PAGE, получены из глобулярных белков, и, следовательно, их нельзя непосредственно сравнивать с неструктурированными ZIPP. (В) Иллюстративные MALDI-спектры (VPREG)80 и (VPKEG)80 подтверждали молекулярную массу очищенных конструкций ZIPP (соответственно MW=44,1 кДа, MW=41,8 кДа). (С) Спектры CD ZIPP демонстрировали отрицательную эллиптичность при малой длине волны и незначительную положительную эллиптичность при большей длине волны, что является типичным для неупорядоченной структуры, такой как у ELP.
Подробное описание
В данном документе представлены композиции и способы для доставки молекул лекарственного средства субъекту. Композиции и способы включают конъюгат, содержащий полипептид и молекулу лекарственного средства, присоединенную к нему. Полипептид содержит как положительно, так и отрицательно заряженные аминокислоты. Композиции и способы, подробно описанные в данном документе, могут преодолевать существовавшие ранее проблемы с доставкой лекарственных средств, в том числе ограничения относительно биологической совместимости, растворимости, стабильности и периода полувыведения, иммуногенности и антигенности. В конструкциях, подробно описанных в данном документе, может использоваться принцип гидрофильности для обеспечения водной оболочки вокруг конъюгата для стерической защиты конъюгата от разрушения. Таким образом, конъюгаты увеличивают стабильность и растворимость конъюгированных терапевтических средств и улучшают их эффективность in vivo. Конъюгаты могут обеспечивать возможность лечения заболевания благодаря эффективной доставке лекарственных средств для лечения заболевания. В некоторых вариантах осуществления, в которых лекарственное средство связывается с мишенью, конъюгаты также можно применять для выявления мишени, выявления или диагностики заболевания и/или определения эффективности лечения. Конъюгаты, подробно описанные в данном документе, также могут быть получены с помощью генной инженерии, за счет чего облегчается их конструирование и манипуляция с ними с точностью, более низкой токсичностью, лучшей биологической совместимостью и улучшенной биоразлагаемостью.
1. Определения
Подразумевается, что термины содержат(содержит), включают(включает), имеющий, имеет, может, включает(включают) и их варианты, используемые в данном документе, являются открытыми переходными фразами, терминами или словами, которые не исключают возможность наличия дополнительных действий или структур. Формы единственного числа включают ссылки на множественное число, если контекст явно не указывает на иное. Настоящее изобретение также охватывает другие варианты осуществления, содержащие варианты осуществления или элементы, представленные в данном документе, состоящие из них и по сути состоящие из них, независимо от того, изложены они явным образом или нет.
При упоминании в данном документе числовых диапазонов каждое промежуточное число в них охватывается явным образом с той же степенью точности. Например, в случае диапазона 6-9 в дополнение к 6 и 9 охватываются числа 7 и 8, а в случае диапазона 6,0-7,0 явным образом охватываются числа 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9 и 7,0.
Если не определено иное, все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют то же значение, которое обычно понимает средний специалист в данной области техники. В случае противоречий данный документ, содержащий определения, будет иметь преимущественную силу. Предпочтительные способы и материалы описаны ниже, хотя при практическом осуществлении или тестировании настоящего изобретения можно применять способы и материалы, аналогичные или эквивалентные описанным в данном документе. Все публикации, заявки на патенты, патенты и другие ссылочные материалы, упомянутые в данном документе, включены посредством ссылки во всей своей полноте. Материалы, способы и примеры, раскрытые в данном документе, являются только иллюстративными и не подразумеваются как ограничивающие.
Термин приблизительно, используемый в данном документе применительно к одному или нескольким значениям, представляющим интерес, относится к значению, близкому к указанному эталон
- 4 037478 ному значению. В определенных аспектах термин приблизительно относится к диапазону значений, находящихся в пределах 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1% или менее в любую сторону (большую или меньшую) от указанного эталонного значения, если не указано иное или если иное не очевидно из контекста (за исключением случаев, когда такое число будет превышать 100% от возможного значения).
Аминокислота, как используется в данном документе, относится к встречающимся в природе и неприродным синтетическим аминокислотам, а также к аналогам аминокислот и миметикам аминокислот, которые функционируют аналогично встречающимся в природе аминокислотам. Встречающимися в природе аминокислотами являются аминокислоты, кодируемые генетическим кодом.
Аминокислоты могут называться в данном документе по их общеизвестным трехбуквенным символам либо по однобуквенным символам, рекомендованным Комиссией по биохимической номенклатуре IUPAC-IUB. Аминокислоты содержат части, представляющие собой боковую цепь и полипептидный остов.
Используемый в данном документе термин биомаркер относится к встречающейся в природе биологической молекуле, присутствующей у субъекта в изменяющихся концентрациях, которая является пригодной в идентификации и/или классификации заболевания или состояния. Биомаркер может включать гены, белки, полинуклеотиды, нуклеиновые кислоты, рибонуклеиновые кислоты, полипептиды или другие биологические молекулы, применяемые в качестве индикатора или маркера заболевания. В некоторых вариантах осуществления биомаркер включает маркер заболевания. Например, биомаркер может представлять собой ген, экспрессия которого повышена или понижена у субъекта, имеющего заболевание. В качестве другого примера, биомаркер может представлять собой полипептид, уровень которого увеличен или уменьшен у субъекта, имеющего заболевание или риск развития заболевания. В некоторых вариантах осуществления биомаркер включает малую молекулу. В некоторых вариантах осуществления биомаркер включает полипептид.
Термины контроль, эталонный уровень и эталон используются в данном документе взаимозаменяемо. Эталонный уровень может представлять собой предварительно определенные значение или диапазон, используемые в качестве стандарта, по которому оценивают результат измерения. Контрольная группа, как используется в данном документе, относится к группе контрольных субъектов. Предварительно определенный уровень может представлять собой пороговое значение в контрольной группе. Предварительно определенный уровень может представлять собой среднее значение в контрольной группе. Пороговые значения (или предварительно определенные пороговые значения) можно определять по методике с использованием адаптивной индексной модели (AIM). Пороговые значения (или предварительно определенные пороговые значения) можно определять с помощью анализа кривых рабочих характеристик приемника (ROC) для биологических образцов, полученных от группы пациентов. Анализ ROC, общеизвестный в области биологии, заключается в определении способности теста выявлять различия между одним состоянием и другим, например, определять эффективность каждого маркера в идентификации пациента, имеющего CRC. Описание анализа ROC приведено в P.J. Heagerty et al. (Biometrics 2000, 56, 337-44), раскрытие которого включено в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. В качестве альтернативы, пороговые значения можно определять с помощью квартильного анализа биологических образцов, полученных от группы пациентов. Например, пороговое значение можно определять путем выбора значения, которое соответствует любому значению в диапазоне от 25-го до 75-го процентиля, предпочтительно значения, которое соответствует 25-му процентилю, 50-му процентилю или 75-му процентилю, и более предпочтительно 75-му процентилю. Такие статистические анализы можно выполнять с помощью любого способа, известного из уровня техники, и можно реализовывать с помощью любого количества коммерчески доступных пакетов программного обеспечения (например, от Analyse-it Software Ltd., Лидс, Великобритания; StataCorp LP, Колледж-Стейшен, Техас; SAS Institute Inc., Кэри, Северная Каролина). Здоровые или нормальные уровни или диапазоны для мишени или для активности белка можно определять в соответствии с общепринятой практикой. Контролем может являться субъект или образец, полученный от него, для которого известен статус заболевания. Субъект или образец, полученный от него, может быть здоровым, пораженным заболеванием, пораженным заболеванием до лечения, пораженным заболеванием во время лечения или пораженным заболеванием после лечения или иметь комбинацию этих характеристик.
Термин вектор экспрессии указывает на плазмиду, вирус или другое средство, известное из уровня техники, в которое можно вставить или ввести последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую желаемый белок.
Термин клетка-хозяин означает клетку, восприимчивую к трансформации, трансфекции, трансдукции, конъюгации и т.п. с помощью конструкции нуклеиновой кислоты или вектора экспрессии. Клетки-хозяева могут быть получены из растений, бактерий, дрожжей, грибов, насекомых, животных и т.п. В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин включает Escherichia coll.
Монодисперсный или монодисперсность относятся к свойству множества конъюгатов или их полипептидов, где каждый из них имеет приблизительно одинаковую молекулярную массу. Генетически кодируемый синтез конъюгата может облегчать точный контроль молекулярной массы. Молекулярная
- 5 037478 масса является фактором, который влияет на период циркуляции молекулы в крови in vivo или ее период полувыведения.
Опсонизация относится к молекулярному механизму, посредством которого молекулы, микроорганизмы или апоптотические клетки подвергаются химической модификации для усиления взаимодействий с рецепторами клеточной поверхности на фагоцитах и естественных клетках-киллерах (NK). Антиген на молекулах, микроорганизмах или апоптотической клетке покрыт опсонинами. Опсонины усиливают связывание с иммунными клетками, такими как макрофаги и нейтрофилы. Опсонизация также опосредует фагоцитоз посредством сигнальных каскадов от рецепторов клеточной поверхности.
Синтетический полимер относится к полимеру, получаемому по меньшей мере из одного мономера в ходе химического процесса. Синтетический полимер не продуцируется непосредственно в живом организме. Синтетические полимеры включают гомополимер, гетерополимер, блок-полимер, сополимер, тройной сополимер и т.п., а также их сочетания, комбинации и смеси. Примеры синтетических полимеров включают без ограничения функционализированные полимеры, такие как полимер, содержащий 5винилтетразоловые мономерные звенья и имеющий распределение молекулярных масс менее 2,0. Синтетический полимер может представлять собой или содержать один или несколько звездчатых блоксополимеров, линейных полимеров, разветвленных полимеров, гиперразветвленных полимеров, дендритных полимеров, гребенчатых полимеров, привитых полимеров, полимерных щеток, сополимеров типа бутылочного ерша и сшитых структур, таких как блок-сополимер, содержащий блок из 5винилтетразоловых мономерных звеньев. Синтетические полимеры включают без ограничения сложные полиэфиры, поли(мет)акриламиды, поли(мет)акрилаты, простые полиэфиры, полистиролы, полинорборнены и мономеры, имеющие ненасыщенные связи. Например, амфифильные гребенчатые полимеры описаны в публикации заявки на патент США № 2007/0087114 и в патенте США № 6207749, выданном Mayes et al., раскрытие каждого из которых включено в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. Амфифильные гребенчатые полимеры могут присутствовать в форме сополимеров, содержащих остов, образованный гидрофобным водонерастворимым полимером, и боковые цепи, образованные короткими гидрофильными полимерами, не связывающимися с клетками. Примеры других синтетических полимеров включают без ограничения полиалкилены, такие как полиэтилен, и полипропилен, и полиэтиленгликоль (PEG); полихлоропрен; простые поливиниловые эфиры, такие как поли(винилацетат); поливинилгалогениды, такие как поли(винилхлорид); полисилоксаны; полистиролы; полиуретаны; полиакрилаты, такие как поли(метил(мет)акрилат), поли(этил(мет)акрилат), поли(нбутил(мет)акрилат), поли(изобутил(мет)акрилат), поли(трет-бутил(мет)акрилат), поли(гексил(мет)акрилат), поли(изодецил(мет)акрилат), поли(лаурил(мет)акрилат), поли(фенил(мет)акрилат), поли(метилакрилат), поли(изопропилакрилат), поли(изобутилакрилат) и поли(октадецилакрилат); полиакриламиды, такие как поли(акриламид), поли(метакриламид), поли(этилакриламид), поли(этилметакриламид), поли(Ы-изопропилакриламид), поли(н-, изо- и трет-бутилакриламид); а также их сополимеры и смеси. Эти синтетические полимеры могут включать пригодные производные, в том числе синтетические полимеры, имеющие замещенные, добавленные химические группы, например, алкильные группы, алкиленовые группы, гидроксилирования, оксидирования и другие модификации, обычно выполняемые специалистами в данной области техники.
Синтетические полимеры могут включать цвиттерионные полимеры, такие как, например, полифосфорилхолин, поликарбоксибетаин и полисульфобетаин. Синтетические полимеры могут иметь бетаиновые, карбоксибетаиновые, сульфобетаиновые, олигоэтиленгликолевые (OEG), саркозиновые или полиэтиленгликолевые (PEG) боковые цепи.
Полинуклеотид, как используется в данном документе, может быть однонитевым или двухнитевым или может содержать как двухнитевые, так и однонитевые части последовательности. Полинуклеотид может представлять собой природную или синтетическую нуклеиновую кислоту, ДНК, геномную ДНК, кДНК, РНК или гибридную молекулу, где полинуклеотид может содержать комбинации дезоксирибо- и рибонуклеотидов, и при этом комбинации оснований включают урацил, аденин, тимин, цитозин, гуанин, инозин, ксантин, гипоксантин, изоцитозин и изогуанин. Полинуклеотиды можно получать с помощью способов химического синтеза или с помощью рекомбинантных способов.
Пептид или полипептид представляет собой соединенную последовательность из двух или более аминокислот, соединенных пептидными связями. Полипептид может быть природным, синтетическим или модификацией или комбинацией природного и синтетического. Пептиды и полипептиды включают белки, такие как связывающие белки, рецепторы и антитела. Термины полипептид, белок и пептид используются в данном документе взаимозаменяемо. Первичная структура относится к аминокислотной последовательности конкретного пептида.
Вторичная структура относится к локально упорядоченным трехмерным структурам в полипептиде. Эти структуры общеизвестны как домены, например, ферментативные домены, внеклеточные домены, трансмембранные домены, поровые домены и цитоплазматические хвостовые домены. Домены представляют собой части полипептида, которые образуют компактную структурную единицу полипептида и обычно имеют длину от 15 до 350 аминокислот. Иллюстративные домены включают домены с ферментативной активностью или лигандсвязывающей активностью. Типичные домены образованы сег- 6 037478 ментами более низкого уровня организации, такими как бета-листовые и альфа-спиральные фрагменты. Третичная структура относится к полной трехмерной структуре мономера полипептида. Четвертичная структура относится к трехмерной структуре, образованной путем нековалентного связывания независимых структурных единиц с третичной структурой. Мотив представляет собой часть полипептидной последовательности и содержит по меньшей мере две аминокислоты. Мотив может иметь длину от 2 до 20, от 2 до 15 или от 2 до 10 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления мотив содержит 3, 4, 5, 6 или 7 последовательных аминокислот.
Фармакокинетические характеристики, как используется в данном документе, относится к циркуляции лекарственных средств в организме и их биодоступности, распределению и экскреции.
Рекомбинантный при использовании в отношении, например, клетки или нуклеиновой кислоты, белка или вектора указывает на то, что клетка, нуклеиновая кислота, белок или вектор были модифицированы путем введения гетерологичных нуклеиновой кислоты или белка или изменения нативных нуклеиновой кислоты или белка или что клетка получена из клетки, модифицированной таким образом. Таким образом, например, рекомбинантные клетки экспрессируют гены, не обнаруживаемые в нативной (нерекомбинантной) форме клетки, или экспрессируют нативные гены, которые в иных обстоятельствах характеризуются аномальной экспрессией, недостаточной экспрессией или вовсе не экспрессируются.
Репортер, репортерная группа, метка и выявляемая метка используются в данном документе взаимозаменяемо. Репортер способен генерировать выявляемый сигнал. Метка может генерировать сигнал, выявляемый визуальными или инструментальными средствами. Можно применять ряд репортерных групп, различающихся по физической природе передачи сигнала (например, флуоресцентная, электрохимическая, с использованием ядерного магнитного резонанса (NMR) и электронного парамагнитного резонанса (EPR)) и по химической природе репортерной группы. Различные репортеры включают вещества, генерирующие сигнал, такие как хромогены, флуоресцентные соединения, хемилюминесцентные соединения, радиоактивные соединения и т.п. В некоторых вариантах осуществления репортер включает радиоактивную метку. Репортеры могут включать фрагменты, генерирующие свет, например соединения акридиния, и фрагменты, генерирующие флуоресцентное излучение, например флуоресцеин. В некоторых вариантах осуществления сигнал от репортера представляет собой флуоресцентный сигнал. Репортер может включать флуорофор. Примеры флуорофоров включают без ограничения акрилодан (6акрилоил-1-2-диметиламинонафталин), бадан (6-бромацетил-2-диметиламинонафталин), родамин, нафталин, дансилазиридин, сложный эфир 4-[N-[(2-йодацетокси)этил]-N-метиламино]-7-нитробенз-2-окса1,3-диазола (IANBDE), 4-[N-[(2-йодацетокси)этил]-N-метиламино-7-нитробенз-2-окса-1,3-диазол (IANBDA), флуоресцеин, дифторид бордипиррометена (BODIPY), 4-нитробензо[с][1,2,5]оксадиазол (NBD), флуоресцентные красители Alexa и их производные. Производные флуоресцеина могут включать, например, 5-флуоресцеин, 6-карбоксифлуоресцеин, 3'6-карбоксифлуоресцеин, 5(6)-карбоксифлуоресцеин, 6-гесахлорфлуоресцеин, 6-тетрахлорфлуоресцеин, флуоресцеин и изотиоцианат.
Образец или тестовый образец, как используется в данном документе, может означать любой образец, в котором следует выявить или определить наличие и/или уровень мишени. Образцы могут включать жидкости, растворы, эмульсии или суспензии. Образцы могут включать медицинский образец. Образцы могут включать любую биологическую жидкость или ткань, такую как кровь, цельная кровь, фракции крови, такие как плазма крови и сыворотка крови, мышца, интерстициальная жидкость, пот, слюна, моча, слезная жидкость, синовиальная жидкость, костный мозг, спинномозговая жидкость, носовой секрет, мокрота, амниотическая жидкость, жидкость бронхоальвеолярного лаважа, промывные воды желудка, рвотные массы, каловые массы, легочная ткань, мононуклеарные клетки периферической крови, общая популяция лимфоцитов, клетки лимфатических узлов, клетки селезенки, клетки миндалин, раковые клетки, опухолевые клетки, желчь, пищеварительные соки, кожа или их комбинации. В некоторых вариантах осуществления образец содержит аликвоту. В других вариантах осуществления образец содержит биологическую жидкость. Образцы можно получать любыми способами, известными из уровня техники. Образец можно использовать непосредственно после получения от пациента или можно подвергнуть предварительной обработке, как, например, путем фильтрации, дистилляции, экстракции, концентрирования, центрифугирования, инактивации мешающих компонентов, добавления реагентов и т. п., для модификации характеристики образца некоторым образом, как обсуждается в данном документе или, в ином случае, как известно из уровня техники.
Термин чувствительность, используемый в данном документе, относится к числу истинно положительных результатов, деленному на число истинно положительных результатов, к которому прибавлено число ложноотрицательных результатов, где чувствительность (чувств.) может находиться в пределах диапазона 0 < чувств. < 1. В оптимальном случае варианты осуществления способа, приведенные в данном документе, характеризуются числом ложноотрицательных результатов, равным нулю или близким к нулю, так что ни один субъект не идентифицируется неверно как не имеющий заболевания, если на самом деле он имеет заболевание. В то же время часто делают оценку способности алгоритма предсказания правильно классифицировать отрицательные результаты, что является мерой, дополняющей чувствительность.
Термин специфичность, используемый в данном документе, относится к числу истинно отрица
- 7 037478 тельных результатов, деленному на число истинно отрицательных результатов, к которому прибавлено число ложноположительных результатов, где специфичность (специф.) может находиться в пределах диапазона 0 < специф. < 1. В оптимальном случае способы, описанные в данном документе, характеризуются числом ложноположительных результатов, равным нулю или близким к нулю, так что ни один субъект не идентифицируется неверно как имеющий заболевание, если в действительности он не имеет заболевания. Следовательно, способ, у которого как чувствительность, так и специфичность равны одному или 100%, является предпочтительным.
Под специфичным связыванием обычно подразумевается, что полипептид связывается с мишенью таким образом, что он связывается с этой мишенью более легко, чем если бы он связывался со случайной неродственной мишенью.
Невидимка или полимер-невидимка относится к конъюгату или к его полипептиду, которые могут оставаться невыявленными иммунными клетками в кровотоке в течение продолжительного периода времени. Полимеры-невидимки являются, по меньшей мере, частично устойчивыми к ферментативному разрушению конъюгата или его полипептида, как, например, под действием протеаз и опсонизации, которая является распространенным способом, используемым иммунной системой для распознавания чужеродных частиц. Соответственно полимеры-невидимки могут характеризоваться одним или несколькими из пониженной антигенности, пониженной иммуногенности, увеличенной стабильности, увеличенного периода полувыведения и увеличенной биодоступности по сравнению с другими полимерами, конъюгатами, полимерами, не являющимися невидимками, и/или конъюгатами, не являющимися невидимками. Способность задерживать, снижать или предотвращать опсонизацию, распознавание иммунной системой или выведение из организма конъюгата (или его полипептида или молекул лекарственного средства) может называться в данном документе свойством невидимости.
Субъект, как используется в данном документе, может означать млекопитающее, которое желает получить описанные в данном документе конъюгаты или слитые белки или нуждается в их получении. Субъектом может являться человек или животное, отличное от человека. Субъектом может являться млекопитающее. Млекопитающее может являться приматом или животным, отличным от примата. Млекопитающее может являться приматом, таким как человек; животным, отличным от примата, таким как, например, собака, кошка, лошадь, корова, свинья, мышь, крыса, верблюд, лама, коза, кролик, овца, хомяк и морская свинка; или приматом, отличным от человека, таким как, например, обезьяна, шимпанзе, горилла, орангутан и гиббон. Субъект может иметь любой возраст или находиться на любой стадии развития, как, например, быть взрослым, подростком или ребенком.
Мишень, как используется в данном документе, может относиться к объекту, с которым связывается молекула лекарственного средства. Мишень может включать, например, малую молекулу, белок, полипептид, полинуклеотид, углевод или их комбинацию.
Переход или фазовый переход относится к агрегации термочувствительных полипептидов. Фазовый переход происходит резко и обратимо при определенной температуре, называемой нижней критической температурой растворения (LCST) или температурой обратного перехода Tt. Ниже температуры перехода термочувствительный полипептид (или полипептид, содержащий термочувствительный полипептид) является высокорастворимым. При нагревании до температуры свыше температуры перехода термочувствительные полипептиды подвергаются гидрофобному разрушению и агрегируют, образуя отдельную гелеобразную фазу. Проведение цикла обратных переходов относится к способу очистки белков, применяемому для термочувствительных полипептидов (или полипептида, содержащего термочувствительный полипептид). Способ очистки белков может предусматривать использование поведения обратимого фазового перехода термочувствительного полипептида для циклического прохождения раствора через растворимую и нерастворимую фазы, за счет чего осуществляется удаление загрязняющих веществ.
Лечение или осуществление лечения при ссылке на защиту субъекта от заболевания означает предупреждение, подавление, сдерживание, уменьшение интенсивности или полное устранение заболевания. Предупреждение заболевания предусматривает введение композиции по настоящему изобретению субъекту до появления заболевания. Подавление заболевания предусматривает введение композиции по настоящему изобретению субъекту после индуцирования заболевания, но до появления его клинических симптомов. Сдерживание или уменьшение интенсивности заболевания предусматривает введение композиции по настоящему изобретению субъекту после появления клинических симптомов заболевания.
Практически идентичный может означать, что первая и вторая аминокислотные последовательности характеризуются по меньшей мере 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичностью на участке из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100 аминокислот.
Вариант, как используется в данном документе в отношении полинуклеотида, означает (i) часть или фрагмент эталонной нуклеотидной последовательности; (ii) последовательность, комплементарную эталонной нуклеотидной последовательности или ее части; (iii) полинуклеотид, практически идентичный эталонному полинуклеотиду или комплементарной ему последовательности или (iv) полинуклеотид, который гибридизируется в жестких условиях с эталонным полинуклеотидом, последовательностью, ком
- 8 037478 плементарной ему, или последовательностями, практически идентичными им.
Вариант может дополнительно быть определен как пептид или полипептид, который благодаря вставке, делеции или консервативной замене аминокислот отличается по аминокислотной последовательности, но сохраняет по меньшей мере один вид биологической активности. Иллюстративные примеры биологической активности включают способность связываться с конкретным антителом или полипептидом или стимулировать иммунный ответ. Вариант может означать практически идентичную последовательность. Вариант может означать ее функциональный фрагмент. Вариант также может означать несколько копий полипептида. Несколько копий могут располагаться тандемно или быть разделены линкером. Вариант также может означать полипептид с аминокислотной последовательностью, практически идентичной аминокислотной последовательности эталонного полипептида, который сохраняет по меньшей мере один вид биологической активности. В данной области техники признается, что консервативная замена аминокислоты, т.е. замена аминокислоты другой аминокислотой с аналогичными свойствами (например, гидрофильностью, относительным количеством и распределением заряженных участков), обычно предусматривает незначительное изменение. Эти незначительные изменения можно частично идентифицировать, рассматривая индекс гидропатичности аминокислот. См. Kyte et al., J. Mol. Biol. 1982, 157, 105-132. Индекс гидропатичности аминокислоты определяется на основании рассмотрения гидрофобности и заряда. Из уровня техники известно, что аминокислоты со сходными индексами гидропатичности можно заменять, и при этом по-прежнему будет сохраняться функция белка. В одном аспекте заменяют аминокислоты, имеющие значения индексов гидропатичности, составляющие ±2. Гидрофобность аминокислот также можно использовать для выявления замен, которые в результате будут давать полипептиды, сохраняющие биологическую функцию. Рассмотрение гидрофильности аминокислот применительно к полипептиду позволяет произвести расчет наибольшей локальной средней гидрофильности этого полипептида, пригодной меры, которая согласно сообщениям хорошо коррелирует с антигенностью и иммуногенностью, как обсуждается в патенте США № 4554101, в полном объеме, включенном в данный документ посредством ссылки. Замена аминокислот, имеющих сходные значения гидрофильности, может в результате давать полипептиды, сохраняющие биологическую активность, например, иммуногенность, как это понимается в данной области техники. Замены можно производить с аминокислотами, разность значений гидрофильности между которыми находится в пределах ±2. Как на индекс гидрофобности, так и на значение гидрофильности аминокислот влияет конкретная боковая цепь этой аминокислоты. Сообразно этому наблюдению понимают, что совместимость аминокислотных замен с биологической функцией зависит от относительного сходства аминокислот и, в частности, боковых цепей этих аминокислот, выявляемого на основании гидрофобности, гидрофильности, заряда, размера и других свойств.
Вариант может представлять собой полинуклеотидную последовательность, практически идентичную по всей длине полной последовательности гена или ее фрагмента. Полинуклеотидная последовательность может характеризоваться 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, или 100% идентичностью по всей длине последовательности гена или ее фрагмента. Вариант может представлять собой аминокислотную последовательность, практически идентичную по всей длине аминокислотной последовательности или ее фрагмента. Аминокислотная последовательность может характеризоваться 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичностью по всей длине аминокислотной последовательности или ее фрагмента.
Водная оболочка относится к молекулам воды, окружающим молекулу и вступающим в ионные взаимодействия с молекулой. Молекула может представлять собой, например, полипептид, ZiPP, молекулу лекарственного средства или конъюгат. Если, например, молекула находится в растворе, то между молекулой и окружающими молекулами воды образуются ионные взаимодействия, так что вокруг нее образуется водная оболочка. Например, между положительно и отрицательно заряженными аминокислотами полипептида и молекулами воды вокруг него в растворе могут образовываться ионные взаимодействия. Раствор может включать, например, плазму крови или кровь или другую биологическую жидкость субъекта. Ионные взаимодействия являются более сильными, чем водородные связи или другие силы межмолекулярного притяжения, и для их нарушения необходимо больше энергии. В некоторых вариантах осуществления водная оболочка может защищать молекулу (например, полипептид, ZiPP, молекулу лекарственного средства или конъюгат) от разрушения или опсонизации. Водная оболочка может придавать молекуле свойство невидимости.
Цвиттерионный или цвиттер-ион относится к молекуле, суммарный заряд которой равен нулю, но которая содержит отрицательные и положительные заряды на отдельных независимых атомах в молекуле. Заряженные атомы соединены одной или несколькими ковалентными связями. Полипептид может быть цвиттерионным.
2. Конгьюгат
Конъюгат содержит полипептид и одну или несколько молекул лекарственного средства, присоединенных к полипептиду. Конъюгат может дополнительно содержать по меньшей мере один линкер. Конъюгаты рассматриваются как полимеры-невидимки для доставки лекарственных средств.
- 9 037478
а) Полипептид
Полипептид содержит один или несколько заряженных мотивов. Заряженный мотив содержит одну или несколько положительно заряженных аминокислот и одну или несколько отрицательно заряженных аминокислот, где положительно заряженные аминокислоты и отрицательно заряженные аминокислоты присутствуют в соотношении 1:1. В некоторых вариантах осуществления суммарный заряд мотива является нейтральным. В некоторых вариантах осуществления заряженный мотив представляет собой цвиттерионный мотив. Положительно заряженные аминокислоты в одном мотиве могут быть одинаковыми или разными. Отрицательно заряженные аминокислоты в одном мотиве могут быть одинаковыми или разными. Как используется в данном документе, заряд аминокислоты (положительный и/или отрицательный) относится к заряду боковой цепи аминокислоты. Заряженная аминокислота является положительно и/или отрицательно заряженной при нейтральном значении рН, при физиологическом значении рН или при локальном значении рН в складке белка или при их комбинации. Заряженный мотив может дополнительно содержать одну или несколько незаряженных аминокислот. В некоторых вариантах осуществления заряженный мотив имеет аминокислотную последовательность VPX1X2G (SEQ ID NO: 1), где X1 представляет собой отрицательно или положительно заряженную аминокислоту, и где Х2 представляет собой отрицательно или положительно заряженную аминокислоту, имеющую противоположный заряд. Полипептид, содержащий один или несколько заряженных мотивов, может представлять собой цвиттерионный полипептид (ZiPP). ZiPP представляют собой в целом нейтральные полипептиды, которые содержат как аминокислоты с отрицательным зарядом, так и аминокислоты с положительным зарядом.
В некоторых вариантах осуществления полипептид содержит множество заряженных мотивов. Множество заряженных мотивов может быть повторяющимся. В некоторых вариантах осуществления полипептид содержит аминокислотную последовательность (VPXiX2G)n (SEQ ID NO: 2), где X1 представляет собой отрицательно или положительно заряженную аминокислоту, Х2 представляет собой отрицательно или положительно заряженную аминокислоту, имеющую противоположный заряд, а n представляет собой целое число, равное 1 или больше. X1 в смежных мотивах могут быть одинаковыми или разными. Х2 в смежных мотивах могут быть одинаковыми или разными. В некоторых вариантах осуществления п представляет собой целое число, меньшее или равное приблизительно 100, 200, 300, 400 или 500. В некоторых вариантах осуществления п представляет собой целое число, равное приблизительно 1, 10, 50, 100, 150 или 200 или больше. В некоторых вариантах осуществления п представляет собой целое число от приблизительно 10 до приблизительно 500, от приблизительно 10 до приблизительно 200, от приблизительно 10 до приблизительно 100, от приблизительно 10 до приблизительно 50, от приблизительно 1 до приблизительно 500, от приблизительно 1 до приблизительно 200, от приблизительно 1 до приблизительно 100 или от приблизительно 1 до приблизительно 50. В некоторых вариантах осуществления n представляет собой целое число, равное приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240,
245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 295, 300, 305, 310, 315, 320, 325, 330, 335, 340, 345, 350,
355, 360, 365, 370, 375, 380, 385, 390, 395, 400, 405, 410, 415, 420, 425, 430, 435, 440, 445, 450, 455, 460,
465, 470, 475, 480, 485, 490, 495 или 500. В некоторых вариантах осуществления полипептид, содержа- щий аминокислотную последовательность (VPX1X2G)n (SEQ ID NO: 2), где X1 представляет собой отрицательно или положительно заряженную аминокислоту, Х2 представляет собой отрицательно или положительно заряженную аминокислоту, имеющую противоположный заряд, а n представляет собой целое число, равное 1 или больше, может называться гомополимером.
В некоторых вариантах осуществления полипептид содержит один или несколько незаряженных мотивов в дополнение к одному или нескольким заряженным мотивам. Незаряженный мотив содержит незаряженные аминокислоты. В некоторых вариантах осуществления незаряженный мотив не содержит какие-либо заряженные аминокислоты. В некоторых вариантах осуществления незаряженный мотив имеет аминокислотную последовательность, состоящую из VPGXG (SEQ ID NO: 3), где X представляет собой любую аминокислоту, за исключением пролина.
Множество незаряженных мотивов может повторяться тандемно. В некоторых вариантах осуществления полипептид содержит аминокислотную последовательность (VPGXG)n (SEQ ID NO: 4) в дополнение к одному или нескольким заряженным мотивам, где X представляет собой любую аминокислоту, за исключением пролина, а n представляет собой целое число, равное 1 или больше. В некоторых вариантах осуществления n представляет собой целое число, меньшее или равное приблизительно 100, 200, 300, 400 или 500. В некоторых вариантах осуществления n представляет собой целое число, равное приблизительно 1, 10, 50, 100, 150 или 200 или больше. В некоторых вариантах осуществления n представляет собой целое число от приблизительно 10 до приблизительно 500, от приблизительно 10 до приблизительно 200, от приблизительно 10 до приблизительно 100, от приблизительно 10 до приблизительно 50, от приблизительно 1 до приблизительно 500, от приблизительно 1 до приблизительно 200, от приблизительно 1 до приблизительно 100 или от приблизительно 1 до приблизительно 50. В некоторых вариантах осуществления n представляет собой целое число, равное приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10,
- 10 037478
11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225,
230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 295, 300, 305, 310, 315, 320, 325, 330, 335,
340, 345, 350, 355, 360, 365, 370, 375, 380, 385, 390, 395, 400, 405, 410, 415, 420, 425, 430, 435, 440, 445,
450, 455, 460, 465, 470, 475, 480, 485, 490, 495 или 500. В некоторых вариантах осуществления полипеп- тиды, содержащие незаряженный мотив, имеющий аминокислотную последовательность, состоящую из (VPGXG)n (SEQ ID NO: 4), в дополнение к одному или нескольким заряженным мотивам, где X представляет собой любую аминокислоту, за исключением пролина, а n представляет собой целое число, равное 1 или больше, называются эластиноподобными полипептидами (ELP).
Мотивы полипептида могут быть расположены любым количеством возможных способов. Примеры возможных порядков расположения и архитектур показаны на фиг. 1. На фиг. 1 серый прямоугольник обозначает положительно заряженную аминокислоту, а черный прямоугольник обозначает отрицательно заряженную аминокислоту. На фиг. 1А показан пример гомополимера, в котором каждое звено представляет собой повторяющуюся последовательность пентапептида VPX1X2G (SEQ ID NO: 1), или заряженный мотив. На фиг. 1D показаны возможные последовательности VPX1X2G (SEQ ID NO: 1). На фиг. 1В показан пример диблок-полимера. В диблочной архитектуре один блок полимера образован повторяющимся заряженным мотивом, а другая часть содержит повторяющийся незаряженный мотив. На фиг. 1С показан пример мультиблочного полимера, в котором заряженные мотивы и незаряженные мотивы размещены в различных местах для увеличения разнообразия полимеров. Можно наметить конкретное количество, идентичность и порядок расположения мотивов для создания конъюгата, который может достигать оптимального уровня сольватации, создавать водную оболочку и/или создавать слой вокруг самого себя для содействия улучшению фармакокинетических характеристик терапевтических средств или молекул лекарственного средства. В некоторых вариантах осуществления полипептид характеризуется порядком расположения, придающим полипептиду или конъюгату свойство невидимости. В некоторых вариантах осуществления один или несколько незаряженных мотивов расположены между по меньшей мере двумя смежными заряженными мотивами полипептида. В некоторых вариантах осуществления полипептид содержит множество заряженных мотивов, повторяющихся тандемно, и множество незаряженных мотивов, повторяющихся тандемно. В некоторых вариантах осуществления множество заряженных мотивов, повторяющихся тандемно, расположено в С-концевом направлении от множества незаряженных мотивов, повторяющихся тандемно. В некоторых вариантах осуществления множество заряженных мотивов, повторяющихся тандемно, расположено в N-концевом направлении от множества незаряженных мотивов, повторяющихся тандемно.
В некоторых вариантах осуществления полипептид содержит аминокислотную последовательность (VPXiX2G)n(VPGXG)m (SEQ ID NO: 5), где X1 представляет собой отрицательно или положительно заряженную аминокислоту, Х2 представляет собой отрицательно или положительно заряженную аминокислоту, имеющую противоположный заряд, X представляет собой любую аминокислоту, за исключением пролина, а n и m независимо представляют собой целое число, равное 1 или больше. В некоторых вариантах осуществления n представляет собой целое число, меньшее или равное приблизительно 100, 200, 300, 400 или 500. В некоторых вариантах осуществления n представляет собой целое число, равное приблизительно 1, 10, 50, 100, 150 или 200 или больше. В некоторых вариантах осуществления n представляет собой целое число от приблизительно 10 до приблизительно 500, от приблизительно 10 до приблизительно 200, от приблизительно 10 до приблизительно 100, от приблизительно 10 до приблизительно 50, от приблизительно 1 до приблизительно 500, от приблизительно 1 до приблизительно 200, от приблизительно 1 до приблизительно 100 или от приблизительно 1 до приблизительно 50. В некоторых вариантах осуществления n представляет собой целое число, равное приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225,
230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 295, 300, 305, 310, 315, 320, 325, 330, 335,
340, 345, 350, 355, 360, 365, 370, 375, 380, 385, 390, 395, 400, 405, 410, 415, 420, 425, 430, 435, 440, 445,
450, 455, 460, 465, 470, 475, 480, 485, 490, 495, или 500. В некоторых вариантах осуществления m пред- ставляет собой целое число, меньшее или равное приблизительно 100, 200, 300, 400 или 500. В некоторых вариантах осуществления m представляет собой целое число, равное приблизительно 1, 10, 50, 100, 150 или 200 или больше. В некоторых вариантах осуществления m представляет собой целое число от приблизительно 10 до приблизительно 500, от приблизительно 10 до приблизительно 200, от приблизительно 10 до приблизительно 100, от приблизительно 10 до приблизительно 50, от приблизительно 1 до приблизительно 500, от приблизительно 1 до приблизительно 200, от приблизительно 1 до приблизительно 100 или от приблизительно 1 до приблизительно 50. В некоторых вариантах осуществления m представляет собой целое число, равное приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140,
145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245,250,
255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 295, 300, 305, 310, 315, 320, 325, 330, 335, 340, 345, 350, 355,360,
365, 370, 375, 380, 385, 390, 395, 400, 405, 410, 415, 420, 425, 430, 435, 440, 445, 450, 455, 460, 465,470,
- 11 037478
475, 480, 485, 490, 495 или 500. В некоторых вариантах осуществления полипептид, содержащий аминокислотную последовательность (VPX1X2G)n (VPGXG)m (SEQ ID NO: 5), где X1 представляет собой отрицательно или положительно заряженную аминокислоту, Х2 представляет собой отрицательно или положительно заряженную аминокислоту, имеющую противоположный заряд, X представляет собой любую аминокислоту, за исключением пролина, а n и m независимо представляют собой целое число, равное 1 или больше, может называться диблок-полимером.
В некоторых вариантах осуществления полипептид содержит аминокислотную последовательность (VPGXG)m(VPX1X2G)n (SEQ ID NO: 6), где X1 представляет собой отрицательно или положительно заряженную аминокислоту, Х2 представляет собой отрицательно или положительно заряженную аминокислоту, имеющую противоположный заряд, X представляет собой любую аминокислоту, за исключением пролина, а n и m независимо представляют собой целое число, равное 1 или больше. В некоторых вариантах осуществления n представляет собой целое число, меньшее или равное приблизительно 100, 200, 300, 400 или 500. В некоторых вариантах осуществления n представляет собой целое число, равное приблизительно 1, 10, 50, 100, 150 или 200 или больше. В некоторых вариантах осуществления n представляет собой целое число от приблизительно 10 до приблизительно 500, от приблизительно 10 до приблизительно 200, от приблизительно 10 до приблизительно 100, от приблизительно 10 до приблизительно 50, от приблизительно 1 до приблизительно 500, от приблизительно 1 до приблизительно 200, от приблизительно 1 до приблизительно 100 или от приблизительно 1 до приблизительно 50. В некоторых вариантах осуществления n представляет собой целое число, равное приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225,
230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 295, 300, 305, 310, 315, 320, 325, 330, 335,
340, 345, 350, 355, 360, 365, 370, 375, 380, 385, 390, 395, 400, 405, 410, 415, 420, 425, 430, 435, 440, 445,
450, 455, 460, 465, 470, 475, 480, 485, 490, 495, или 500. В некоторых вариантах осуществления m пред- ставляет собой целое число, меньшее или равное приблизительно 100, 200, 300, 400 или 500. В некоторых вариантах осуществления m представляет собой целое число, равное приблизительно 1, 10, 50, 100, 150 или 200 или больше. В некоторых вариантах осуществления m представляет собой целое число от приблизительно 10 до приблизительно 500, от приблизительно 10 до приблизительно 200, от приблизительно 10 до приблизительно 100, от приблизительно 10 до приблизительно 50, от приблизительно 1 до приблизительно 500, от приблизительно 1 до приблизительно 200, от приблизительно 1 до приблизительно 100 или от приблизительно 1 до приблизительно 50. В некоторых вариантах осуществления m представляет собой целое число, равное приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140,
145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245,250,
255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 295, 300, 305, 310, 315, 320, 325, 330, 335, 340, 345, 350, 355,360,
365, 370, 375, 380, 385, 390, 395, 400, 405, 410, 415, 420, 425, 430, 435, 440, 445, 450, 455, 460, 465,470,
475, 480, 485, 490, 495, или 500. В некоторых вариантах осуществления полипептид, содержащий аминокислотную последовательность (VPGXG)m(VPX1X2G)n (SEQ ID NO: 6), где X1 представляет собой отрицательно или положительно заряженную аминокислоту, Х2 представляет собой отрицательно или положительно заряженную аминокислоту, имеющую противоположный заряд, X представляет собой любую аминокислоту, за исключением пролина, а n и m независимо представляют собой целое число, равное 1 или больше, может называться диблок-полимером.
В некоторых вариантах осуществления полипептид содержит аминокислотную последовательность {(VPX1X2G)(VPGXG)}b (SEQ ID NO: 7), где X1 представляет собой отрицательно или положительно заряженную аминокислоту, Х2 представляет собой отрицательно или положительно заряженную аминокислоту, имеющую противоположный заряд, X представляет собой любую аминокислоту, за исключением пролина, а b представляет собой целое число, равное 1 или больше. В некоторых вариантах осуществления b представляет собой целое число, меньшее или равное приблизительно 100, 200 или 300. В некоторых вариантах осуществления b представляет собой целое число, равное приблизительно 1, 10, 50, 100, 150 или 200 или больше. В некоторых вариантах осуществления b представляет собой целое число от приблизительно 10 до приблизительно 300, от приблизительно 10 до приблизительно 200, от приблизительно 10 до приблизительно 100, от приблизительно 10 до приблизительно 50, от приблизительно 1 до приблизительно 300, от приблизительно 1 до приблизительно 200, от приблизительно 1 до приблизительно 100 или от приблизительно 1 до приблизительно 50. В некоторых вариантах осуществления b представляет собой целое число, равное приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 295 или 300. В некоторых вариантах осуществления полипептид, содержащий аминокислотную последовательность {(VPX1X2G) (VPGXG)}b (SEQ ID NO: 7), где X1 представляет собой отрицательно или положительно заряженную аминокислоту, Х2 представляет собой отрицательно или положительно заряженную аминокислоту, имеющую противоположный заряд, X представляет собой любую аминокислоту, за исключением пролина, а b представляет собой целое число, рав
- 12 037478 ное 1 или больше, может называться мультиблочным полимером.
В некоторых вариантах осуществления X1 представляет собой отрицательно заряженную аминокислоту, а Х2 представляет собой положительно заряженную аминокислоту. В некоторых вариантах осуществления X1 представляет собой положительно заряженную аминокислоту, а Х2 представляет собой отрицательно заряженную аминокислоту. В некоторых вариантах осуществления отрицательно заряженная аминокислота независимо выбрана из глутаминовой кислоты и аспарагиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления положительно заряженная аминокислота независимо выбрана из лизина и аргинина. В некоторых вариантах осуществления X выбран из аргинина, гистидина, лизина, аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты, серина, треонина, аспарагина, глутамина, цистеина, селеноцистеина, глицина, аланина, валина, лейцина, изолейцина, метионина, фенилаланина, тирозина и триптофана. В некоторых вариантах осуществления X выбран из глицина и валина.
В некоторых вариантах осуществления полипептид является чувствительным к температуре, что может также называться термочувствительностью. Термочувствительные полипептиды могут характеризоваться фазовым переходом. Термочувствительный полипептид может придавать полипептиду и/или конъюгату характеристику фазового перехода. Фазовый переход происходит резко и обратимо при определенной температуре, называемой нижней критической температурой растворения (LCST) или температурой обратного перехода (Tt). Фазовый переход или переход также может относиться к агрегации термочувствительного полипептида. Ниже температуры перехода (LCST или Tt) термочувствительные полипептиды (или полипептиды, содержащие термочувствительный полипептид) могут быть высокорастворимыми. При нагревании до температуры выше температуры перехода термочувствительные полипептиды могут подвергаться гидрофобному разрушению и агрегировать, образуя отдельную гелеобразную фазу или нерастворимые гидрофобные агрегаты. Свойство термочувствительности полипептида можно использовать при очистке полипептида и/или конъюгата в соответствии со способом, называемым проведением цикла обратных переходов. Фазовый переход также можно инициировать с помощью космотропных солей, таких как, например, сульфат аммония. Вместе с космотропной солью можно использовать, например, хлорид натрия. Космотропную соль можно добавлять в раствор, содержащий полипептид и/или конъюгат, при этом космотропную соль добавляют до тех пор, пока полипептид и/или конъюгат не образует агрегаты или не выделится из раствора в виде осадка. Агрегаты можно осаждать путем центрифугирования и ресуспендировать во втором растворе или буфере. Агрегаты полипептида и/или конъюгата можно повторно солюбилизировать в растворе после охлаждения до температуры ниже их Tt или в случае, если космотропная соль удалена из раствора. В некоторых вариантах осуществления конъюгаты очищают без какой-либо хроматографической очистки. В некоторых вариантах осуществления конъюгаты получают рекомбинантным путем и очищают из бактериальной культуры, как, например, из Е. coli.
b) Молекула лекарственного средства
Конъюгат может содержать одну или несколько молекул лекарственного средства. Молекула лекарственного средства может представлять собой терапевтическое средство. В некоторых вариантах осуществления молекула лекарственного средства выбрана из малой молекулы, нуклеотида, полинуклеотида, белка, полипептида, углевода и их комбинации. В некоторых вариантах осуществления молекула лекарственного средства включает малую молекулу. В некоторых вариантах осуществления молекула лекарственного средства включает белок. В некоторых вариантах осуществления молекула лекарственного средства включает противораковое терапевтическое средство. В некоторых вариантах осуществления молекула лекарственного средства включает антитело. В некоторых вариантах осуществления молекула лекарственного средства включает Tn3 (суперагонист TRAIL). В некоторых вариантах осуществления молекула лекарственного средства присоединена к цистеиновому остатку полипептида конъюгата.
Конъюгат может содержать 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 молекул лекарственного средства. Конъюгат может содержать по меньшей мере приблизительно 1, по меньшей мере приблизительно 2 или по меньшей мере приблизительно 3 молекулы лекарственного средства. Конъюгат может содержать менее чем приблизительно 10, менее чем приблизительно 8 или менее чем приблизительно 5 молекул лекарственного средства. В некоторых вариантах осуществления конъюгат содержит 1 молекулу лекарственного средства. В некоторых вариантах осуществления конъюгат содержит 1 молекулу лекарственного средства на полипептид конъюгата. В некоторых вариантах осуществления конъюгат содержит 1-10 молекул лекарственного средства. В некоторых вариантах осуществления конъюгат содержит 2-5 молекул лекарственного средства.
с) Линкер
В некоторых вариантах осуществления конъюгат дополнительно содержит по меньшей мере один линкер. В некоторых вариантах осуществления конъюгат содержит более одного линкера. В таких вариантах осуществления линкеры могут быть одинаковыми или отличаться друг от друга. Конъюгат может содержать по меньшей мере 1, по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9 или по меньшей мере 10 линкеров. Конъюгат может содержать менее 20, менее 15, менее 10 или менее 5 линкеров. Конъюгат может содержать от 1 до 20, от 5 до 15 или от 1 до 5 линкеров. Линкер может быть расположен
- 13 037478 на С-конце полипептида, на N-конце полипептида или как на N-, так и на С-конце полипептида. В некоторых вариантах осуществления линкер может быть расположен в любом месте в полипептидной последовательности. Несколько линкеров могут быть расположены смежными друг к другу.
Линкер может представлять собой полипептид с любой аминокислотной последовательностью и длиной. Линкер может выступать в качестве спейсерного пептида. В некоторых вариантах осуществления линкер содержит заряженные аминокислоты. В некоторых вариантах осуществления линкер содержит незаряженные аминокислоты. В некоторых вариантах осуществления линкер является гибким. В некоторых вариантах осуществления линкер содержит один или несколько цистеиновых остатков. В некоторых вариантах осуществления линкер содержит аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 8 (GGC) , SEQ ID NO: 9 ((GGC)s), SEQ ID NO: 10 ((648)3) и SEQ ID NO: 11 ((VPGXG)1& где X представляет собой валин или цистеин, присутствующие в соотношении 1:1).
Линкер может служить местом присоединения молекулы лекарственного средства к полипептиду. Молекулу лекарственного средства можно присоединять к линкеру любыми подходящими способами, известными из уровня техники. Молекулу лекарственного средства можно присоединять к линкеру посредством тиол-реактивной линкерной группы. В некоторых вариантах осуществления одна или несколько молекул лекарственного средства присоединены к полипептиду с помощью линкера. В некоторых вариантах осуществления молекула лекарственного средства присоединена к полипептиду посредством тиол-реактивной группы в линкере.
3. Полинуклеотиды
Дополнительно представлены полинуклеотиды, кодирующие конъюгаты, подробно описанные в данном документе. Вектор может содержать полинуклеотид, кодирующий конъюгаты, подробно описанные в данном документе. Для достижения экспрессии полипептида можно субклонировать полинуклеотид, кодирующий полипептид, в вектор экспрессии, который содержит промотор для управления транскрипцией, терминатор транскрипции/трансляции и, в случае с нуклеиновой кислотой, кодирующей белок, сайт связывания рибосомы для инициации трансляции. Примером вектора является рЕТ24. Подходящие бактериальные промоторы хорошо известны из уровня техники. Дополнительно представлена клетка-хозяин, трансформированная или трансфицированная вектором экспрессии, содержащим полинуклеотид, кодирующий конъюгат, подробно описанный в данном документе. Бактериальные системы экспрессии для экспрессии белка доступны, например, в Е. coli, Bacillus sp. и Salmonella (Paiva et al. , Gene 1983, 22, 229-235; Mosbach et al., Nature 1983, 302, 543-545). Наборы для таких систем экспрессии являются коммерчески доступными.
Эукариотические системы экспрессии для клеток млекопитающих, дрожжей и клеток насекомых хорошо известны из уровня техники и также являются коммерчески доступными. В настоящем изобретении можно применять ретровирусные системы экспрессии. В некоторых вариантах осуществления конъюгат содержит полипептид, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 12. В некоторых вариантах осуществления конъюгат содержит полипептид, кодируемый полинуклеотидной последовательностью под SEQ ID NO: 13.
Конъюгат можно экспрессировать рекомбинантным путем в клетке-хозяине в соответствии с представлениями специалиста в данной области техники. Конъюгат можно очищать любыми способами, известными специалисту в данной области техники. Например, конъюгат можно очищать с помощью хроматографии, такой как жидкостная хроматография, эксклюзионная хроматография или аффинная хроматография или их комбинации. В некоторых вариантах осуществления конъюгат очищают без проведения хроматографии. В некоторых вариантах осуществления конъюгат очищают с помощью проведения цикла обратных переходов.
4. Введение
Композиция может содержать конъюгат. Конъюгаты, подробно описанные выше, можно составлять в виде композиции в соответствии со стандартными методиками, хорошо известными специалистам в области фармацевтики. Композицию можно получать для введения субъекту. Такие композиции, содержащие конъюгат, можно вводить в дозах и с помощью методик, хорошо известных специалистам в области медицины, принимая во внимание такие факторы, как возраст, пол, вес и состояние конкретного субъекта, а также путь введения.
Конъюгат можно вводить в целях профилактики или терапии. При профилактическом введении конъюгат можно вводить в количестве, достаточном для индуцирования ответа. При терапевтических применениях конъюгаты вводят субъекту, нуждающемуся в этом, в количестве, достаточном для того, чтобы вызвать терапевтический эффект. Надлежащее количество для осуществления этого определяется как терапевтически эффективная доза. Количества, эффективные для данного пути применения, будут зависеть, например, от конкретного состава конъюгата, назначенного режима, способа введения, стадии и степени тяжести заболевания, общего состояния здоровья пациента, а также мнения лечащего врача.
Конъюгат можно вводить с помощью способов, хорошо известных из уровня техники, которые описаны у Donnelly et al. (Ann. Rev. Immunol. 1997, 15, 617-648); Feigner et al. (патент США № 5580859, выданный 3 декабря 1996 г.); Feigner (патент США № 5703055, выданный 30 декабря 1997 г.) и Carson et al. (патент США № 5679647, выданный 21 октября 1997 г.), содержание всех из которых включено в дан
- 14 037478 ный документ посредством ссылки во всей своей полноте. Конъюгат можно объединять в комплекс с частицами или гранулами, которые можно вводить индивидууму, например, с помощью шприцапистолета для вакцинации. Специалисту в данной области техники должно быть известно, что выбор фармацевтически приемлемого носителя, в том числе физиологически приемлемого соединения, зависит, например, от пути введения.
Конъюгаты можно доставлять посредством ряда путей. Типичные пути доставки включают парентеральное введение, например, внутрикожную, внутримышечную или подкожную доставку. Другие пути включают пероральное введение, интраназальный, интравагинальный, чрескожный, внутривенный, внутриартериальный, внутриопухолевый, внутрибрюшинный и эпидермальный пути. В некоторых вариантах осуществления конъюгат вводят субъекту внутривенным, внутриартериальным или внутрибрюшинным путем.
Конъюгат может представлять собой жидкий препарат, такой как суспензия, сироп или эликсир. Конъюгат можно включить в состав липосом, микросфер или других полимерных матриц (как, например, с помощью способа, описанного Feigner et al., патент США № 5703055; Gregoriadis, Liposome Technology, Vol. I-III (2-oe изд. 1993), содержание которых включено в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте). Липосомы могут состоять из фосфолипидов или других липидов и могут представлять собой нетоксичные, физиологически приемлемые и метаболизируемые носители, которые являются относительно простыми в получении и введении.
Конъюгат можно применять в качестве вакцины. Вакцину можно вводить посредством электропорации, как, например, с помощью способа, описанного в патенте США № 7664545, содержание которого включено в данный документ посредством ссылки. Электропорацию можно осуществлять с помощью способа и/или устройства, описанного в патентах США №№ 6302874; 5676646; 6241701; 6233482; 6216034; 6208893; 6192270; 6181964; 6150148; 6120493; 6096020; 6068650 и 5702359, содержание которых включено в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. Электропорацию можно выполнять с помощью минимально инвазивного устройства.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат вводят в составе с контролируемым высвобождением. Конъюгат может высвобождаться, например, в циркулирующую кровь или опухоль. В некоторых вариантах осуществления конъюгат может высвобождаться в течение периода по меньшей мере приблизительно 1 дня, по меньшей мере приблизительно 2 дней, по меньшей мере приблизительно 3 дней, по меньшей мере приблизительно 4 дней, по меньшей мере приблизительно 5 дней, по меньшей мере приблизительно 6 дней, по меньшей мере приблизительно 7 дней, по меньшей мере приблизительно 1 недели, по меньшей мере приблизительно 1,5 недели, по меньшей мере приблизительно 2 недель, по меньшей мере приблизительно 2,5 недели, по меньшей мере приблизительно 3,5 недели, по меньшей мере приблизительно 4 недель или по меньшей мере приблизительно 1 месяца.
5. Выявление
Используемый в данном документе термин выявление или определение наличия относится к качественному измерению невыявляемых, низких, нормальных или высоких концентраций одного или нескольких конъюгатов, связанных с мишенью. В некоторых вариантах осуществления мишень может представлять собой биомаркер. Выявление может включать выявление in vitro, ex vivo или in vivo. Выявление может включать выявление наличия одного или нескольких конъюгатов или мишеней в противоположность отсутствию одного или нескольких конъюгатов или мишеней. Выявление также может включать количественную оценку уровня одного или нескольких конъюгатов или мишеней. Термин оценивать количественно или количественная оценка можно использовать взаимозаменяемо, и они могут относиться к способу определения относительного или абсолютного количества или содержания вещества (например, конъюгата или мишени). Любой подходящий способ выявления находится в пределах общего объема настоящего изобретения. В некоторых вариантах осуществления конъюгат содержит репортерную молекулу, присоединенную к нему для выявления. В некоторых вариантах осуществления конъюгат метят репортерной молекулой. В некоторых вариантах осуществления выявление конъюгата, связанного с мишенью, можно определять с помощью способов, включающих без ограничения определение интенсивности полосы в вестерн-блоттинге, проточную цитометрию, визуализацию с помощью радиоактивной метки, анализы связывания с клетками, анализы активности, SPR, иммунологический анализ, или с помощью различных других способов, известных из уровня техники.
В некоторых вариантах осуществления, в том числе в тех, в которых конъюгат содержит антитело для связывания и/или выявления мишени, можно использовать любой иммунологический анализ. Иммунологический анализ может представлять собой, например, твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), радиоиммунологический анализ (RIA), анализ конкурентного ингибирования, такой как прямые или обратные анализы конкурентного ингибирования, флуоресцентный поляризационный анализ или анализ конкурентного связывания. ELISA может представлять собой сэндвич-ELISA. Специфичное иммунное связывание конъюгата с мишенью можно выявлять с помощью прямых меток, присоединенных к конъюгату, или с помощью непрямых меток, таких как щелочная фосфатаза или пероксидаза хрена. В иммунологический анализ может быть включено применение иммобилизованных конъюгатов. Конъюгаты можно иммобилизовать на ряде подложек, таких как магнитные частицы или частицы хро
- 15 037478 матографической матрицы, поверхность аналитического планшета (как, например, лунки титрационного микропланшета), кусочки материала твердого субстрата и т. п. Путем покрывания твердой подложки конъюгатом или множеством конъюгатов в виде упорядоченного набора можно получить аналитическую полоску. Эту полоску затем можно погрузить в тестируемый биологический образец и затем быстро обработать в ходе стадий промывания и выявления с генерированием поддающегося измерению сигнала, такого как окрашенное пятно.
6. Способы
а) Способы доставки молекулы лекарственного средства
Настоящее изобретение относится к способу доставки субъекту молекулы лекарственного средства. Способ может включать введение субъекту конъюгата, описанного в данном документе. В некоторых вариантах осуществления конъюгат характеризуется улучшенным свойством по сравнению с молекулой лекарственного средства в отдельности или молекулой лекарственного средства, конъюгированной с синтетическим полимером, таким как полиэтиленгликоль (PEG), при этом улучшенное свойство выбрано, например, из невидимости, биологической совместимости, растворимости, стабильности, периода полувыведения, времени удержания в плазме крови, антигенности, иммуногенности, монодисперсности или их комбинации. В некоторых вариантах осуществления конъюгат легко синтезируют. В некоторых вариантах осуществления конъюгат легко очищают. В некоторых вариантах осуществления легкость синтеза и/или очистки может обуславливать улучшение соотношения затраты/эффективность для конъюгатов. В некоторых вариантах осуществления конъюгат или его полипептид является генетически кодируемым, за счет чего облегчается конструирование конъюгата с точной молекулярной массой. В некоторых вариантах осуществления молекулярная масса конъюгата определяет его период полувыведения in vivo и/или влияет на него. Возможность легкого и точного контроля молекулярной массы конъюгата может облегчать контроль периода полувыведения конъюгата in vivo. Для сравнения, контроль молекулярной массы синтетических полимеров, таких как PEG, может не быть легким. В некоторых вариантах осуществления конъюгат характеризуется пониженной антигенностью по сравнению с молекулой лекарственного средства, конъюгированной с синтетическим полимером, таким как полиэтиленгликоль (PEG). В некоторых вариантах осуществления конъюгат характеризуется пониженной иммуногенностью по сравнению с молекулой лекарственного средства, конъюгированной с синтетическим полимером, таким как полиэтиленгликоль (PEG).
b) Способы лечения заболевания
Настоящее изобретение относится к способу лечения заболевания у субъекта, нуждающегося в этом. Способ может включать введение субъекту эффективного количества конъюгата, описанного в данном документе. Заболевание может представлять собой, например, рак, метаболическое заболевание, аутоиммунное заболевание, сердечно-сосудистое заболевание или ортопедическое нарушение.
Метаболическое заболевание может наблюдаться в случаях, когда аномальные химические реакции в организме изменяют нормальный процесс метаболизма. Метаболические заболевания могут включать, например, инсулинорезистентность, неалкогольные жировые заболевания печени, сахарный диабет 2 типа, инсулинорезистентные заболевания, сердечно-сосудистые заболевания, артериосклероз, нарушения метаболизма липидов, гипергликемию, гиперинсулинемию, гиперлипидемию и нарушения метаболизма глюкозы.
Аутоиммунные заболевания обусловлены аномальным иммунным ответом организма на вещества и ткани, в обычных условиях присутствующие в организме. Аутоиммунные заболевания могут включать без ограничения волчанку, ревматоидный артрит, рассеянный склероз, инсулинозависимый сахарный диабет, тяжелую миастению, болезнь Грейвса, аутоиммунную гемолитическую анемию, аутоиммунную тромбоцитопеническую пурпуру, синдром Гудпасчера, обыкновенную пузырчатку, острую ревматическую лихорадку, постстрептококковый гломерулонефрит, узелковый полиартериит, миокардит, псориаз, целиакию, болезнь Крона, неспецифический язвенный колит и фибромиалгию.
Сердечно-сосудистые заболевания представляют собой класс заболеваний, поражающих сердце или кровеносные сосуды. Сердечно-сосудистые заболевания могут включать, например, заболевания коронарных артерий (CAD), такие как стенокардия и инфаркт миокарда (сердечный приступ), инсульт, гипертензивную кардиопатию, ревматическую болезнь сердца, кардиомиопатию, аритмию сердца, врожденный порок сердца, порок клапана сердца, кардит, аневризмы аорты, заболевание периферических артерий и венозный тромбоз.
Ортопедические нарушения или скелетно-мышечные нарушения представляют собой повреждения или боли в суставах, связках, мышцах, нервах, сухожилиях организма, а также структурах, которые поддерживают конечности, шею и спину. Ортопедические нарушения могут включать дегенеративные заболевания и воспалительные состояния, которые вызывают боль и ухудшают обычные виды деятельности. Ортопедические нарушения могут включать, например, синдром запястного канала, эпикондилит и тендинит.
Формы рака могут включать без ограничения рак молочной железы, колоректальный рак, рак толстой кишки, рак легкого, рак предстательной железы, рак яичка, рак головного мозга, рак кожи, рак прямой кишки, рак желудка, рак пищевода, формы саркомы, рак трахеи, рак головы и шеи, рак поджелудоч
- 16 037478 ной железы, рак печени, рак яичника, рак лимфатической системы, рак шейки матки, рак вульвы, меланому, мезотелиому, рак почки, рак мочевого пузыря, рак щитовидной железы, формы рака костей, формы карциномы, формы саркомы и формы рака мягких тканей. В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой рак молочной железы.
c) Способы диагностики заболевания
В данном документе представлены способы диагностики заболевания. Способы могут включать введение субъекту конъюгата, описанного в данном документе, и выявление связывания конъюгата с мишенью для определения наличия мишени у субъекта. Наличие или отсутствие мишени может указывать на заболевание у субъекта. В других вариантах осуществления способы могут включать приведение образца от субъекта в контакт с конъюгатом, описанным в данном документе, определение уровня мишени в образце и сравнение уровня мишени в образце с контрольным уровнем мишени, где уровень мишени, отличный от контрольного уровня, указывает на заболевание у субъекта. В некоторых вариантах осуществления выявленные уровни мишени, меньшие, чем контрольный уровень, могут указывать на заболевание. В некоторых вариантах осуществления выявленные уровни мишени, превышающие контрольный уровень, могут указывать на заболевание. В некоторых вариантах осуществления заболевание выбрано из рака, метаболического заболевания, аутоиммунного заболевания, сердечно-сосудистого заболевания и ортопедических нарушений, подробно описанных выше. В некоторых вариантах осуществления мишень содержит маркер заболевания или биомаркер.
d) Способы определения наличия мишени
В данном документе представлены способы определения наличия мишени в образце. Способы могут включать приведение образца в контакт с конъюгатом, описанным в данном документе, в условиях, обеспечивающих возможность образования комплекса между конъюгатом и мишенью в образце, и выявление наличия комплекса. Наличие комплекса может указывать на наличие мишени в образце. Мишень может представлять собой, например, белок или нуклеиновую кислоту. Белок может представлять собой, например, рецептор или антиген. Антиген может, например, быть ассоциированным с заболеванием. В некоторых вариантах осуществления мишень содержит биомаркер. В некоторых вариантах осуществления конъюгат метят репортерной молекулой для выявления.
В некоторых вариантах осуществления образец получают от субъекта, и способ дополнительно включает диагностику, прогнозирование или оценку эффективности лечения субъекта. Если способ включает оценку эффективности лечения субъекта, то способ может дополнительно включать модификацию лечения субъекта в случае необходимости в улучшении эффективности.
е) Способы определения эффективности лечения
В данном документе представлены способы определения эффективности лечения заболевания у субъекта, нуждающегося в этом. Способы могут включать приведение образца от субъекта в контакт с конъюгатом, подробно описанным в данном документе, в условиях, обеспечивающих возможность образования комплекса между конъюгатом и мишенью в образце, определение уровня комплекса в образце, где уровень комплекса указывает на уровень мишени в образце, и сравнение уровня мишени в образце с контрольным уровнем мишени, где в случае, если уровень мишени отличается от контрольного уровня, вид лечения определяют как эффективный или неэффективный при лечении заболевания.
Моменты времени могут включать моменты времени до появления заболевания, до применения терапии, различные моменты времени во время применения терапии и после завершения терапии или их комбинацию. При введении конъюгата субъекту конъюгат может связываться с мишенью, где наличие или отсутствие мишени указывает на наличие заболевания у субъекта в различные моменты времени. В некоторых вариантах осуществления мишень содержит маркер заболевания или биомаркер. Сравнение связывания конъюгата с мишенью в различные моменты времени может указывать на то, прогрессирует ли заболевание, перешло ли заболевание в запущенную форму, является ли терапия действенной в лечении или предупреждении заболевания, или на комбинацию этого.
В некоторых вариантах осуществления контрольный уровень соответствует уровню у субъекта в момент времени до или в течение периода, в который субъект начал лечение, и образец берут у субъекта в более поздний момент времени. В некоторых вариантах осуществления образец берут у субъекта в момент времени в течение периода, в который субъекта подвергают лечению, и контрольный уровень соответствует уровню в отсутствие заболевания или уровню в момент времени до периода, в который субъект начал лечение. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает модификацию лечения или назначение другого вида лечения субъекту в случае, если данный вид лечения определяют как неэффективный при лечении заболевания.
7. Примеры
Пример 1.
Материалы и способы
Клонирование.
Гены, отвечающие за синтез ZiPP, собирали из химически синтезированных олигомеров (IDT Inc.; Коралвилль, Айова). Олигомеры клонировали в вектор экспрессии рЕТ в Е. coli с помощью методики рекурсивного направленного лигирования путем реконструкции плазмиды (PRe-RDL) (McDaniel, J.R., et
- 17 037478 al. Biomacromolecules, 2010, 11, 944-952).
Экспрессия и очистка ZiPP путем проведения цикла обратных переходов (ITC). ZiPP экспрессировали с вектора экспрессии рЕТ в Е. coli. Все ZiPP в водном растворе демонстрируют обратимый обратный фазовый переход. Они переходят из состояния растворимого белка в состояние нерастворимых гидрофобных агрегатов при нагревании до температуры свыше их температуры перехода (Tt). Эти же явления (разделение фаз) также можно инициировать с помощью космотропных солей. Агрегаты ZiPP можно повторно солюбилизировать в растворе после охлаждения до температуры ниже их Tt или в случае, если соль удалена из раствора. Это свойство термочувствительности ZiPP обеспечивает простой нехроматографический способ очистки белков. Данный способ очистки называют проведением цикла обратных переходов (ITC) (Meyer, D.E. and A. Chilkoti. Nat. Biotech. 1999, 17, 1112-1115; MacEwan, S.R., et al. J. Vis. Exp. 2014, 88, e51583).
В типичном варианте очистки ZiPP посредством ITC клетки Е. coli извлекают из культуры объемом 1 л путем центрифугирования и ресуспендируют в холодном PBS. Клетки затем лизируют путем ультразвукового разрушения при 4°С. Лизат Е. coli затем центрифугируют при 15000 х g с удалением клеточных стенок и другого клеточного дебриса. ZiPP представляют собой растворимые белки, присутствующие в растворимой фракции (надосадочной жидкости) клеточного лизата. К надосадочной жидкости клеточного лизата добавляют полиэтиленимин, и ее центрифугируют при 14000 х g для осаждения ДНК и любых оставшихся клеточных стенок бактерий. ZiPP затем очищают из надосадочной жидкости путем инициирования разделения фаз с помощью сульфата аммония и хлорида натрия с последующим центрифугированием при 15000 х g в течение 15 мин при 4°С. Осадок затем ресуспендируют в холодном PBS и любое нерастворимое вещество удаляют с помощью стадии центрифугирования при 4°С в течение 10 мин. Эти стадии повторяют до достижения однородности, которая подтверждается появлением одной полосы в геле для SDS-PAGE. Молекулярную массу (MW) также подтверждали с использованием устройства Voyager DE-Pro MALDI-TOF (Applied Biosystems; Фостер-Сити, Калифорния).
Неструктурированную природу ZiPP подтверждали с использованием устройства для измерения кругового дихроизма (Aviv 202). Для экспериментов на животных эндотоксин удаляют с помощью Detoxi-Gel (Thermo Scientific; Уолтем, Массачусетс).
Фармакокинетическое (PK) исследование in vivo. В данном исследовании ZiPP сравнивали с незаряженными полимерами (VPGAG)120 и (VPGAG)160. Полимеры метили флуоресцентным красителем Alexa 488 на N-конце и вводили мышам Balb/c посредством инъекции в хвостовую вену. VPGAG, биополимер аналогичной природы, но без каких-либо зарядов, применяли в качестве контроля, чтобы продемонстрировать, что любое наблюдаемое изменение фармакокинетических параметров обусловлено включением зарядов в мотив VPX1X2G. Каждая мышь получала однократную дозу ZiPP или контроля (150 мг/кг BW), инъецируемую i.v или подкожно. Образцы крови собирали (10 мкл собирали в пробирки со 100 мкл гепарина) из хвостовой вены через 40 с, 15 мин., 0,5, 2, 4, 8, 24, 48 и 72 ч после инъекции. Концентрацию меченного флуоресцентным красителем полимера в крови рассчитывали с помощью калибровочной кривой для Alexa 488. Данные временной динамики концентрации в крови анализировали с помощью стандартной двухкомпонентной PK-модели для данных PK-исследования с i.v. введением в целях установления фармакокинетических параметров.
Конъюгирование с паклитакселом (РТХ). Восемь цистеиновых остатков, расположенных с регулярными промежутками в виде мотива (VPGXG)16, при этом х представляет собой V или С в соотношении 1:1, клонировали на С-конец ZiPP. Сегмент, используемый для конъюгирования с лекарственным средством, содержал восемь цистеиновых остатков, с которыми конъюгировали несколько копий РТХ. Первый 2' ОН РТХ модифицировали левулиновой кислотой (Etrych T.S., et al. Molecular Pharmaceutics 2010, 7, 1015-1026). При данной модификации сохраняется цитотоксичность РТХ. Активированный РТХ затем конъюгировали со свободными тиольными группами с помощью кислотолабильного гидразидного линкера (линкера на основе гидразида N-ε-малеимидокапроновой кислоты (ЕМСН)) с концевой малеимидной группой, которая вступала в реакцию с тиольными группами ZiPP с образованием стабильной углерод-серной связи (Andrew MacKay, J., et al. Nat. Mater. 2009, 8, 993-999).
Получение характеристик конъюгата лекарственного средства ZiPP-PTX. Чистоту конъюгата лекарственного средства оценивали с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC). Данные HPLC оценивали количественно с использованием интегрированной площади пика при поглощении при 228 нм, которое соответствует поглощению РТХ. Соотношение конъюгирования лекарственных средств и ZiPP определяли с помощью устройства Voyager DE-Pro MALDI-MS (Applied Biosystems; Фостер-Сити, Калифорния) для времяпролетной масс-спектрометрии с матрично-активированной лазерной десорбцией/ионизацией (MALDI-TOF-MS), оснащенного азотным лазером (337 нм). Для определения гидродинамического радиуса (Rh) наночастицы ZiPP-PTX при 25°С и концентрации 25 мкМ с помощью планшет-ридера DynaPro (Wyatt Technology; Санта-Барбара, Калифорния) использовали методику динамического светорассеяния (DLS). Данные анализировали с помощью регуляризационной аппроксимации автокорреляционной функции, и процентную интенсивность переводили в массовую интенсивность с помощью модели сфер Релея. Регуляризационную аппроксимацию затем применяли для опреде
- 18 037478 ления гидродинамического радиуса в виде взвешенного по массовому проценту значения для случайной спирали. Радиус инерции рассчитывали с использованием статического светорассеяния (SLS) после конъюгирования с РТХ. Фактор формы (ρ) рассчитывали как Rg/Rh.
Цитотоксичность конъюгатов ZiPP-PTX In vitro. Исследование цитотоксичности in vitro проводили на раковых клетках молочной железы человека MDA-MB-231 с тройным негативным фенотипом. Высевали 3х103 клеток на 100 мкл среды в 96-луночных планшетах для культуры клеток Falcon™ (BD; Франклин-Лейке, Нью-Джерси) . Обеспечивали прилипание клеток в течение 16-18 часов перед обработкой свободным РТХ и ZiPP-PTX в концентрациях в диапазоне от субнаномолярных до высоких микромолярных. После 72 часов обработки лекарственным средством в каждую лунку добавляли 20 мкл реагента 3(4,5-диметил-2-ил)-5-(3-карбоксиметоксифенил)-2-(4-сульфофенил)-2Н-тетразолия (MTS) (CellTiter 96 AQueous™; Promega, Мэдисон, Висконсин) и инкубировали в течение дополнительных 2 ч. Кривую зависимости доза-эффект для свободного лекарственного средства и конъюгата ZiPP-лекарственное средство строили путем измерения поглощения в каждой лунке при 490 нм с помощью микропланшет-ридера Victor3 (Perkin Elmer; Уолтем, Массачусетс). 50% ингибирующую концентрацию IC50 определяли путем аппроксимации данных с помощью следующего уравнения (Andrew MacKay, J., et al. Nat. Mater. 2009, 8, 993-999):
где V представляет собой жизнеспособность клеток, Собработка представляет собой концентрацию лекарственного средства, а р представляет собой угол наклона кривой зависимости доза-эффект. Это значение IC50 используют для оценки действенности конъюгатов.
Пример 2. Экспрессия и очистка ZiPP
Свойство термочувствительности ZiPP обеспечивало простую нехроматографическую очистку с помощью ITC. Появление одной полосы в окрашенном медным красителем геле для SDS-PAGE подтверждало чистоту продукта (фиг. 2А). Два различных ZiPP, (VPKEG)80 (MW=44 кДа) и (VPREG)80 (MW=42 кДа), показаны в качестве иллюстративных примеров очищенных продуктов на фиг. 7А. Маркер длин белков на 50 кДа отмечен в качестве эталона MW в геле, однако маркер длины белков, применяемый в SDS-гелях, получен из глобулярных белков, и, следовательно, его нельзя непосредственно сравнивать с неструктурированными ZIPP. Для подтверждения чистоты и MW авторы настоящего изобретения анализировали очищенный продукт с помощью MALDI-TOF. MALDI-спектр продемонстрировал наличие ионов при значениях соотношения масса/заряд 21 и 42 кДа (пики 1 и 2) для (VPKEG) 80 и значениях соотношения масса/заряд 22 и 44 кДа (пики 3 и 4) для (VPREG)80 (фиг. 7В). MALDI-спектр продемонстрировал наличие ионов при значениях соотношения масса/заряд 20, 30 и 60,5 кДа для (VPKDG)120 и значениях соотношения масса/заряд 21, 32 и 63,8 кДа для (VPRDG) 120 (фиг. 2В), что подтверждало молекулярную массу очищенных конструкций ZiPP (соответственно MW=60,5 кДа, MW=63,8 кДа). Авторы настоящего изобретения также подтвердили внутренне неупорядоченную природу ZiPP путем использования спектров CD. Спектры CD на фиг. 2D и фиг. 7С продемонстрировали отрицательную эллиптичность при малой длине волны и незначительную положительную эллиптичность при большей длине волны, что является характерным для статистического клубка, который является типичным для неупорядоченной структуры, такой как у ELP, и подтверждает неструктурированную природу полимера.
(С) Измерение гидродинамического радиуса проводили с помощью динамического светорассеяния, и его результаты демонстрировали хорошо гидратированные ZiPP по сравнению с контрольными ELP (фиг. 2С). Нативный PAGE в геле демонстрировал, что ZiPP не взаимодействуют с альбумином (фиг. 2Е).
Пример 3. Фармакокинетическое исследование in vivo
Для определения фармакокинетических параметров ZiPP концентрацию в плазме крови отслеживали в течение периода 72 ч после системного введения мышам посредством инъекции в хвостовую вену или подкожной инъекции. Незаряженный полимер с сопоставимой длиной в аминокислотах применяли в качестве контроля. Схема эксперимента показана на фиг. 3А и 4А. Полимеры метили флуоресцентным красителем Alexa 488 и вводили мышам. Образцы крови собирали в различные моменты времени в течение периода до 72 ч. ELP120 (VPGAG)120 применяли в качестве контроля длины, a ELP160 (VPGAG)160 применяли в качестве контроля молекулярной массы. На фиг. 3В и 4В показана концентрация полимера в плазме крови в зависимости от времени, прошедшего после инъекции, демонстрирующая, что включение в его состав цвиттерионного мотива (в частности, содержащего K, D и Е в качестве X1 и Х2 соответственно) придавало свойство невидимости, которое, в свою очередь, обеспечивало увеличение периода циркуляции полимера по сравнению с незаряженными ELP. Концентрации в плазме крови в зависимости от времени, прошедшего после инъекции, демонстрировали, что ZIPP показывали более хорошие результаты, чем ELP. Эти полимеры соответствовали двухкомпонентной модели, и поэтому период полувыведения и площадь под кривой рассчитывали с помощью этой модели. Двухкомпонентную модель аппроксимировали по концентрации полимера в плазме крови, и в ней получали фармакокинетические параметры: площадь под кривой (AUC) (фиг. 3С и 4С) и период полувыведения (фиг. 3D). AUC рассчитывали
- 19 037478 в качестве меры общей длительности воздействия полимеров в течение периода проведения эксперимента. AUC демонстрировала, что VPKEG и VPKDG показывали значительно лучшие результаты, чем незаряженные ELP в качестве контролей длины, а также контроль молекулярной массы. Данные представлены в виде среднего значения ± SE, n=5 на фиг. 3С, и данные представлены в виде среднего значения ± SE, n=3-4 на фиг. 4С. Окончательный период полувыведения ZiPP увеличивался на 6 часов по сравнению с таковым для конструкций VPGAG (фиг. 3D).
Более того, наиболее описательный фармакокинетический параметр, общая совокупная длительность воздействия полимера в крови, измеренная по площади под кривой концентрации в плазме крови (AUC), для ZiPP был приблизительно в три раза более высоким, чем для незаряженного полипептида VPGAG с такой же длиной цепи (фиг. 3С). Результат показал, что включение в состав пептидного полимера цвиттерионного мотива и, более конкретно, заряженных остатков играет значительную роль в улучшении фармакокинетических характеристик полимера.
Пример 4. Получение характеристик конгьюгатов паклитаксел-ZiPP
Паклитаксел (РТХ) конъюгировали химическим путем с (VPGXG)16, причем X-V или С в соотношении 1:1, в трейлерном участке на С-конце 120 повторяющихся пентапептидных звеньев VPKEG. Паклитаксел конъюгировали химическим путем с 8 С-концевыми остатками с помощью рН-чувствительного линкера. Схема показана на фиг. 5А. Конъюгат полимер-лекарственное средство очищали с помощью центрифужных фильтрующих устройств Amicon Ultra-15 (MWCO: 10 кДа; Millipore; Биллерика, Массачусетс) и очищенный продукт прогоняли на установке для HPLC для подтверждения отсутствия непрореагировавших свободных лекарственных средств. HPLC-хроматограмма подтверждала чистоту конъюгата полимер-лекарственное средство, при этом количество свободных лекарственных средств было пренебрежимо малым. Очищенный конъюгат ZiPP-PTX имел 3,2-4 молекулы лекарственных средств на полимерную цепь, что подтверждалось рассчитанной с помощью MALDI-TOF-спектров разницей в MW между исходной полимерной цепью ZiPP и конъюгатом ZiPP-PTX (фиг. 5В). Более того, измерение с помощью динамического светорассеяния указывало на то, что после конъюгирования с РТХ ZiPP в действительности спонтанно самособирались в наночастицы с гидродинамическим радиусом (Rh) 58 нм. Они самособирались в мицеллы радиусом 58 нм с числом агрегации 26 на мицеллу. Фактор формы (р), рассчитываемый как Rg/Rh, составлял 0,82, что означает образование сферических мицелл.
Пример 5. Противоопухолевая эффективность конгьюгатов ZiPP-PTX in vitro
Цитотоксичность ZiPP-PTX in vitro измеряли путем изучения жизнеспособности клеток в диапазоне концентраций в зависимости от времени. В качестве модели применяли MDA-MB-231, линию раковых клеток молочной железы человека с тройным негативным фенотипом. После 72 ч обработки лекарственным средством пролиферация клеток MDA-MB-231 ингибировалась по сравнению с контролем (без лекарственного средства) (фиг. 5С). Более того, ингибирование было сравнимым с таковым у свободного лекарственного средства. Значение IC50 для свободного лекарственного средства составляло около 2 нМ, а для ZiPP-PTX составляло 12,4 нМ (концентрация применительно к лекарственному средству). Значение IC50 для ZiPP-PTX было в 6 раз более высоким, чем для свободного лекарственного средства, но такой результат является ожидаемым в среде in vitro, где свободные лекарственные средства могут легко диффундировать в клетки и из клеток с помощью переносчиков лекарственных средств, тогда как РТХ высвобождается из конъюгата лекарственное средство-полимер только в тех случаях, когда он находится внутри эндосомы. Этот процесс является медленным, поскольку наночастицы поглощаются посредством эндоцитоза, и лекарственное средство высвобождается после того, как наночастицы переместятся в поздние эндосомы, где значение рН является низким. Это низкое значение рН инициирует высвобождение РТХ из ZiPP. Эти результаты являются обнадеживающими, поскольку они указывают на то, что конъюгат РТХ-полимер является стабильным и в достаточной степени действенным для использования его в платформе in vivo. Значения IC50 представляли концентрацию лекарственного средства, которая снижала жизнеспособность клеток на 50%.
Пример 6. Конгьюгаты ZiPP-Tn3
Поливалентный каркасный белок (Tn3) является суперагонистом рецепторов 2 типа для индуцирующего апоптоз лиганда, родственного TNF (TRAIL2), и был выбран в качестве белка для присоединения к ZiPP. Общий вид конструкции слитого белка показан на фиг. 6А. Был выбран суперагонист TRAIL2, поскольку активация TRAILR2 может индуцировать апоптоз при ряде форм рака человека и, следовательно, обладает потенциалом в качестве противораковых терапевтических средств. (Tn3)6 представляет собой 6 тандемных повторов мономерного звена Tn3, которое было сконструировано Medimmune для связывания с TRAIL2 с высокой аффинностью. (Tn3)6 с ZiPP различной длины экспрессировали рекомбинантным путем в Е. coli. Анализ подвергнутых аффинной очистке образцов посредством SDS-PAGE показан на фиг. 6В. Анализ цитотоксичности в отношении Colo205 (раковых клеток толстой кишки) показал, что слитые белки обладали высокой цитотоксичностью и по своей действенности были сравнимыми со свободным белком ((Tn3)6 без присоединенного ZIPP), как показано на фиг. 6С. Значения IC50 представляли концентрацию лекарственного средства, которая снижала жизнеспособность клеток на 50%.
Вышеприведенное описание конкретных аспектов будет настолько полно раскрывать общий харак
- 20 037478 тер настоящего изобретения, чтобы другие путем применения знаний в рамках квалификации в данной области техники могли без труда модифицировать и/или адаптировать такие конкретные аспекты к различным путям применения без проведения излишних экспериментов и без отступления от общей концепции настоящего изобретения. Таким образом, подразумевается, что такие адаптации и модификации находятся в пределах значения и диапазона эквивалентов раскрытых аспектов, в основе которых лежат идеи и методологические принципы, представленные в данном документе. Следует понимать, что формулировки или терминология, представленные в данном документе, служат для целей описания, а не ограничения, так что специалист в данной области техники должен интерпретировать терминологию или формулировки настоящего описания в свете его идей и методологических принципов.
Широта и объем настоящего изобретения не должны ограничиваться каким-либо из вышеописанных приводимых в качестве примера аспектов, а должны определяться исключительно в соответствии с нижеследующей формулой изобретения и ее эквивалентами.
Все публикации, патенты, заявки на патенты и/или другие документы, цитируемые в настоящей заявке, включены посредством ссылки во всей своей полноте во всех отношениях в той же степени, как если бы каждые отдельные публикация, патент, заявка на патент и/или другой документ были отдельно указаны как включенные посредством ссылки во всех отношениях.
В целях обеспечения полноты различные аспекты настоящего изобретения изложены в следующих пронумерованных пунктах.
Пункт 1. Конъюгат, содержащий (а) полипептид, содержащий один или несколько заряженных мотивов, при этом каждый заряженный мотив независимо имеет аминокислотную последовательность, состоящую из SEQ ID NO: 1 (VPX1X2G), где X1 представляет собой отрицательно или положительно заряженную аминокислоту и где Х2 представляет собой отрицательно или положительно заряженную аминокислоту, имеющую противоположный заряд; и (b) одну или несколько молекул лекарственного средства, присоединенных к полипептиду.
Пункт 2. Конъюгат согласно пункту 1, где полипептид содержит множество заряженных мотивов.
Пункт 3. Конъюгат согласно пункту 2, где множество заряженных мотивов повторяется тандемно.
Пункт 4. Конъюгат согласно любому из предыдущих пунктов, где полипептид дополнительно содержит один или несколько незаряженных мотивов, при этом каждый незаряженный мотив независимо имеет аминокислотную последовательность, состоящую из SEQ ID NO: 3 (VPGXG), где X представляет собой любую аминокислоту, за исключением пролина.
Пункт 5. Конъюгат согласно пункту 4, где полипептид содержит множество незаряженных мотивов.
Пункт 6. Конъюгат согласно пункту 5, где множество незаряженных мотивов повторяется тандемно.
Пункт 7. Конъюгат согласно любому из пунктов 4-6, где один или несколько незаряженных мотивов расположены между по меньшей мере двумя смежными заряженными мотивами полипептида.
Пункт 8. Конъюгат согласно пункту 1, где полипептид содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 2 (VPX1X2G)n, где X1 представляет собой отрицательно или положительно заряженную аминокислоту, Х2 представляет собой отрицательно или положительно заряженную аминокислоту, имеющую противоположный заряд, а n представляет собой целое число, равное 1 или больше.
Пункт 9. Конъюгат согласно пункту 4, где полипептид содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 4 (VPGXG)n, где X представляет собой любую аминокислоту, за исключением пролина, а n представляет собой целое число, равное 1 или больше.
Пункт 10. Конъюгат согласно пункту 4, где полипептид содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 5 (VPX1X2G)n(VPGXG)m, где X1 представляет собой отрицательно или положительно заряженную аминокислоту, Х2 представляет собой отрицательно или положительно заряженную аминокислоту, имеющую противоположный заряд, X представляет собой любую аминокислоту, за исключением пролина, а n и m независимо представляют собой целое число, равное 1 или больше.
Пункт 11. Конъюгат согласно пункту 4, где полипептид содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 6 (VPGXG)m(VPX1X2G)n, где X1 представляет собой отрицательно или положительно заряженную аминокислоту, Х2 представляет собой отрицательно или положительно заряженную аминокислоту, имеющую противоположный заряд, X представляет собой любую аминокислоту, за исключением пролина, а n и m независимо представляют собой целое число, равное 1 или больше.
Пункт 12. Конъюгат согласно пункту 4, где полипептид содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 7 {(VPX1X2G) (VPGXG)}b, где X1 представляет собой отрицательно или положительно заряженную аминокислоту, Х2 представляет собой отрицательно или положительно заряженную аминокислоту, имеющую противоположный заряд, X представляет собой любую аминокислоту, за исключением пролина, а b представляет собой целое число, равное 1 или больше.
Пункт 13. Конъюгат согласно любому из пунктов 1-12, где X1 представляет собой отрицательно заряженную аминокислоту, и где Х2 представляет собой положительно заряженную аминокислоту.
Пункт 14. Конъюгат согласно любому из пунктов 1-12, где X1 представляет собой положительно заряженную аминокислоту и где Х2 представляет собой отрицательно заряженную аминокислоту.
Пункт 15. Конъюгат согласно любому из предыдущих пунктов, где отрицательно заряженная ами
- 21 037478 нокислота независимо выбрана из глутаминовой кислоты и аспарагиновой кислоты.
Пункт 16. Конъюгат согласно любому из предыдущих пунктов, где положительно заряженная аминокислота независимо выбрана из лизина и аргинина.
Пункт 17. Конъюгат согласно любому из пунктов 4-16, где X представляет собой любую аминокис лоту, за исключением пролина.
Пункт 18. Конъюгат согласно пункту 17, где X выбран из аргинина, гистидина, лизина, аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты, серина, треонина, аспарагина, глутамина, цистеина, селеноцистеина, глицина, аланина, валина, лейцина, изолейцина, метионина, фенилаланина, тирозина и триптофана.
Пункт 19. Конъюгат согласно пункту 18, где X выбран из глицина и валина.
Пункт 20. Конъюгат согласно любому из предыдущих пунктов, где полипептид дополнительно со держит линкер.
Пункт 21. Конъюгат согласно пункту 20, где линкер содержит один или несколько цистеиновых ос татков.
Пункт 22. Конъюгат согласно любому из пунктов 20-21, где линкер содержит аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: (GGC) , SEQ ID NO: ((GGC)8), SEQ ID NO: ((G4S)3) и SEQ ID NO: ((VPGXG)i6, где Х представляет собой валин или цистеин, присутствующие в соотношении 1:1).
Пункт 23. Конъюгат согласно любому из пунктов 20-22, где линкер расположен на С-конце, на Nконце или как на С-, так и на N-конце полипептида.
Пункт 24. Конъюгат согласно любому из пунктов 20-23, где одна или несколько молекул лекарст венного средства присоединены к полипептиду с помощью линкера.
Пункт 25. Конъюгат согласно любому из пунктов 20-24, где молекула лекарственного средства присоединена к полипептиду посредством тиолреактивной группы в линкере.
Пункт 26. Конъюгат согласно любому из предыдущих пунктов, где одна или несколько молекул лекарственного средства выбраны из малой молекулы, нуклеотида, полинуклеотида, пептида, белка, углевода и их комбинации.
Пункт 27. Конъюгат согласно пункту 26, где молекула лекарственного средства включает малую молекулу.
Пункт 28. Конъюгат согласно пункту 26, где молекула лекарственного средства включает белок.
Пункт 29. Конъюгат согласно любому из пунктов 1-25, где молекула лекарственного средства включает противораковое терапевтическое средство.
Пункт 30. Конъюгат согласно любому из пунктов 1-25, где молекула лекарственного средства включает антитело.
Пункт 31. Конъюгат согласно любому из пунктов 1-25, где молекула лекарственного средства включает паклитаксел.
Пункт 32. Конъюгат согласно любому из пунктов 1-25, где молекула лекарственного средства включает Tn3 (суперагонист TRAIL).
Пункт 33. Конъюгат согласно любому из предыдущих пунктов, где конъюгат получен для введения субъекту.
Пункт 34. Конъюгат согласно любому из предыдущих пунктов, где полипептид конъюгата экспрессируется рекомбинантным путем.
Пункт 35. Конъюгат согласно пункту 28, где конъюгат экспрессируется рекомбинантным путем.
Пункт 36. Композиция, содержащая конъюгат согласно любому из предыдущих пунктов.
Пункт 37. Полинуклеотид, кодирующий полипептид согласно любому из пунктов 1-35.
Пункт 38. Полинуклеотид, кодирующий конъюгат согласно пункту 28.
Пункт 39. Вектор, содержащий полинуклеотид согласно пункту 37 или пункту 38.
Пункт 40. Способ доставки субъекту молекулы лекарственного средства, при этом способ включает введение субъекту конъюгата согласно любому из пунктов 1-35.
Пункт 41. Способ лечения субъекта, имеющего заболевание или нарушение, при этом способ включает введение субъекту конъюгата согласно любому из пунктов 1-35.
Пункт 42. Способ определения наличия мишени в образце, при этом способ включает приведение образца в контакт с конъюгатом согласно любому из пунктов 1-35 в условиях, обеспечивающих возможность образования комплекса между молекулой лекарственного средства и мишенью в образце; и выявление наличия комплекса, где наличие комплекса указывает на наличие мишени в образце.
Пункт 43. Способ согласно пункту 42, где образец получают от субъекта, и способ дополнительно включает диагностику заболевания, прогнозирование или оценку эффективности лечения субъекта.
Пункт 44. Способ согласно пункту 43, где в случае, если способ дополнительно включает оценку эффективности лечения субъекта, способ дополнительно включает модификацию лечения субъекта в случае необходимости в улучшении эффективности.
Пункт 45. Способ диагностики заболевания у субъекта, при этом способ включает приведение образца от субъекта в контакт с конъюгатом согласно любому из пунктов 1-35 в условиях, обеспечивающих возможность образования комплекса между молекулой лекарственного средства и мишенью в образце; определение уровня мишени в образце, где уровень комплекса указывает на уровень мишени в
- 22 037478 образце; и сравнение уровня мишени в образце с контрольным уровнем мишени, где уровень мишени, отличный от контрольного уровня, указывает на заболевание у субъекта.
Пункт 46. Способ согласно пункту 45, где контрольный уровень соответствует уровню у субъекта в момент времени до или в течение периода, в который субъект начал лечение, и где образец берут у субъекта в более поздний момент времени.
Пункт 47. Способ согласно пункту 45, где образец берут у субъекта в момент времени в течение периода, в который субъекта подвергают лечению, и где контрольный уровень соответствует уровню в отсутствие заболевания или уровню в момент времени до периода, в который субъект начал лечение.
Пункт 48. Способ согласно любому из пунктов 45-47, при этом способ дополнительно включает модификацию лечения или назначение другого вида лечения субъекту в случае, если данный вид лечения определяют как неэффективный при лечении заболевания.
Пункт 49. Способ согласно любому из пунктов 40-48, где конъюгат метят репортерной молекулой.
Пункт 50. Способ согласно любому из пунктов 40-49, где конъюгат вводят субъекту внутривенным, внутриартериальным, внутрибрюшинным или внутриопухолевым путем.
Пункт 51. Способ согласно любому из пунктов 40-50, где конъюгат характеризуется пониженной антигенностью по сравнению с молекулой лекарственного средства, конъюгированной с полиэтиленгликолем (PEG).
Пункт 52. Способ согласно любому из пунктов 40-50, где конъюгат характеризуется пониженной иммуногенностью по сравнению с молекулой лекарственного средства, конъюгированной с полиэтиленгликолем (PEG).
Пункт 53. Способ согласно любому из пунктов 40-52, где заболевание выбрано из рака, метаболического заболевания, аутоиммунного заболевания, сердечно-сосудистого заболевания и ортопедического нарушения.
Пункт 54. Способ согласно пункту 53, где заболевание включает рак.
Пункт 55. Способ согласно пункту 54, где рак выбран из рака молочной железы, колоректального рака, рака толстой кишки, рака легкого, рака предстательной железы, рака яичка, рака головного мозга, рака кожи, рака прямой кишки, рака желудка, рака пищевода, форм саркомы, рака трахеи, рака головы и шеи, рака поджелудочной железы, рака печени, рака яичника, рака лимфатической системы, рака шейки матки, рака вульвы, меланомы, мезотелиомы, рака почки, рака мочевого пузыря, рака щитовидной железы, рака костей, карциномы, саркомы и рака мягких тканей.
Пункт 56. Способ согласно пункту 55, где рак включает рак молочной железы.
Последовательности
SEQ ID NO: 1
VPXiX2G, где X1 представляет собой отрицательно или положительно заряженную аминокислоту и где Х2 представляет собой отрицательно или положительно заряженную аминокислоту, имеющую противоположный заряд.
SEQ ID NO: 2 (VPX1X2G)n, где X1 представляет собой отрицательно или положительно заряженную аминокислоту, Х2 представляет собой отрицательно или положительно заряженную аминокислоту, имеющую противоположный заряд, а n представляет собой целое число, равное 1 или больше.
SEQ ID NO: 3
VPGXG, где X представляет собой любую аминокислоту, за исключением пролина.
SEQ ID NO: 4 (VPGXG)n, где X представляет собой любую аминокислоту, за исключением пролина, а n представляет собой целое число, равное 1 или больше.
SEQ ID NO: 5 (VPX1X2G)n(VPGXG)m, где X1 представляет собой отрицательно или положительно заряженную аминокислоту, Х2 представляет собой отрицательно или положительно заряженную аминокислоту, имеющую противоположный заряд, X представляет собой любую аминокислоту, за исключением пролина, а n и m независимо представляют собой елое число, равное 1 или больше.
SEQ ID NO: 6 (VPGXG)m(VPX1X2G)n, где X1 представляет собой отрицательно или положительно заряженную аминокислоту, Х2 представляет собой отрицательно или положительно заряженную аминокислоту, имеющую противоположный заряд, X представляет собой любую аминокислоту, за исключением пролина, а n и m независимо представляют собой целое число, равное 1 или больше.
SEQ ID NO: 7 {(VPXiX2G) (VPGXG)}b, где X1 представляет собой отрицательно или положительно заряженную аминокислоту, Х2 представляет собой отрицательно или положительно заряженную аминокислоту, имеющую противоположный заряд, X представляет собой любую аминокислоту, за исключением пролина, а b представляет собой целое число, равное 1 или больше.
SEQ ID NO: 8 GGC
SEQ ID NO: 9 (GGC)8
- 23 037478
SEQ ID NO: 10 (648)3
SEQ ID NO: 11 (VPGXG)i6, где X представляет собой валин или цистеин, присутствующие в соотношении 1:1.
SEQ ID NO: 12
Иллюстративный полипептид
VPKDGVPKDGVPKDGVPKDGVPKDG
SEQ ID NO: 13
Полинуклеотид, кодирующий иллюстративный полипептид
GTC CCG aaa gac GGT GTT CCG aag gac GGC GTG CCT aaa gat GGT GTT CCG aag gac GGG GTG CCA aaa gat GGG

Claims (50)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Конъюгат для улучшения фармакокинетических и фармакодинамических характеристик одной или более молекул лекарственного средства, где конъюгат содержит:
    (a) полипептид, содержащий от 50 до 500 заряженных мотивов, при этом каждый заряженный мотив независимо имеет аминокислотную последовательность, состоящую из SEQ ID NO: 1 (VPXjX2G), где X1 представляет собой отрицательно или положительно заряженную аминокислоту и где Х2 представляет собой отрицательно или положительно заряженную аминокислоту, имеющую противоположный заряд; и (b) одну или несколько молекул лекарственного средства, присоединенных к полипептиду.
  2. 2. Конъюгат по п.1, где заряженные мотивы повторяются тандемно.
  3. 3. Конъюгат по любому из предыдущих пунктов, где полипептид дополнительно содержит от 1 до 500 незаряженных мотивов, при этом каждый незаряженный мотив независимо имеет аминокислотную последовательность, состоящую из SEQ ID NO: 3 (VPGXG), где X представляет собой любую аминокислоту, за исключением пролина.
  4. 4. Конъюгат по п.3, где незаряженные мотивы повторяются тандемно.
  5. 5. Конъюгат по любому из пп.3-4, где незаряженные мотивы расположены между по меньшей мере двумя смежными заряженными мотивами полипептида.
  6. 6. Конъюгат по п.3, где полипептид содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 5 (VPXiX2G)n (VPGXG)m, где X1 представляет собой отрицательно или положительно заряженную аминокислоту, Х2 представляет собой отрицательно или положительно заряженную аминокислоту, имеющую противоположный заряд, X представляет собой любую аминокислоту, за исключением пролина, а n и m независимо представляют собой целое число, равное 1 или больше.
  7. 7. Конъюгат по п.3, где полипептид содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 6 (VPGXG)m (VPX1X2G)n, где Х1 представляет собой отрицательно или положительно заряженную аминокислоту, Х2 представляет собой отрицательно или положительно заряженную аминокислоту, имеющую противоположный заряд, X представляет собой любую аминокислоту, за исключением пролина, а n и m независимо представляют собой целое число, равное 1 или больше.
  8. 8. Конъюгат по п.3, где полипептид содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 7 {(VPX1X2G) (VPGXG)}b, где X1 представляет собой отрицательно или положительно заряженную аминокислоту, Х2 представляет собой отрицательно или положительно заряженную аминокислоту, имеющую противоположный заряд, X представляет собой любую аминокислоту, за исключением пролина, а b представляет собой целое число, равное 1 или больше.
  9. 9. Конъюгат по любому из пп.1-8, где X1 представляет собой отрицательно заряженную аминокислоту и где Х2 представляет собой положительно заряженную аминокислоту.
  10. 10. Конъюгат по любому из пп.1-8, где Х1 представляет собой положительно заряженную аминокислоту и где Х2 представляет собой отрицательно заряженную аминокислоту.
  11. 11. Конъюгат по любому из предыдущих пунктов, где отрицательно заряженная аминокислота независимо выбрана из глутаминовой кислоты и аспарагиновой кислоты.
  12. 12. Конъюгат по любому из предыдущих пунктов, где положительно заряженная аминокислота независимо выбрана из лизина и аргинина.
  13. 13. Конъюгат по любому из пп.3-12, где X представляет собой любую аминокислоту, за исключением пролина.
  14. 14. Конъюгат по п.13, где X выбран из аргинина, гистидина, лизина, аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты, серина, треонина, аспарагина, глутамина, цистеина, селеноцистеина, глицина, аланина, валина, лейцина, изолейцина, метионина, фенилаланина, тирозина и триптофана.
  15. 15. Конъюгат по п.14, где X выбран из глицина и валина.
  16. 16. Конъюгат по любому из предыдущих пунктов, где полипептид дополнительно содержит линкер.
  17. 17. Конъюгат по п.16, где линкер содержит один или несколько цистеиновых остатков.
  18. 18. Конъюгат по любому из пп.16, 17, где линкер содержит аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 8 (GGC), SEQ ID NO: 9 ((GGC)8), SEQ ID NO: 10 ((G4S)3) и SEQ ID NO: 11 ((VPGXG)16, где X представляет собой валин или цистеин, присутствующие в соотношении 1:1.
    - 24 037478
  19. 19. Конъюгат по любому из пп.16-18, где линкер расположен на С-конце, на N-конце или как на С-, так и на N-конце полипептида.
  20. 20. Конъюгат по любому из пп.16-19, где одна или несколько молекул лекарственного средства присоединены к полипептиду с помощью линкера.
  21. 21. Конъюгат по любому из пп.16-20, где молекула лекарственного средства присоединена к полипептиду посредством тиол-реактивной группы в линкере.
  22. 22. Конъюгат по любому из предыдущих пунктов, где одна или несколько молекул лекарственного средства выбраны из малой молекулы, нуклеотида, полинуклеотида, пептида, белка, углевода и их комбинации.
  23. 23. Конъюгат по п.22, где молекула лекарственного средства включает малую молекулу.
  24. 24. Конъюгат по п.22, где молекула лекарственного средства включает белок.
  25. 25. Конъюгат по любому из пп.1-21, где молекула лекарственного средства включает противораковое терапевтическое средство.
  26. 26. Конъюгат по любому из пп.1-21, где молекула лекарственного средства включает антитело.
  27. 27. Конъюгат по любому из пп.1-21, где молекула лекарственного средства включает паклитаксел.
  28. 28. Конъюгат по любому из пп.1-21, где молекула лекарственного средства включает Tn3 (суперагонист TRAIL).
  29. 29. Конъюгат по любому из предыдущих пунктов, где конъюгат получен для введения субъекту.
  30. 30. Конъюгат по любому из предыдущих пунктов, где полипептид конъюгата экспрессируется рекомбинантным путем.
  31. 31. Конъюгат по п.24, где конъюгат экспрессируется рекомбинантным путем.
  32. 32. Композиция для улучшения фармакокинетических и фармакодинамических характеристик одной или более молекул лекарственного средства, где композиция содержит конъюгат по любому из предыдущих пунктов.
  33. 33. Полинуклеотид, кодирующий полипептид по любому из пп.1-31.
  34. 34. Полинуклеотид, кодирующий конъюгат по п.24.
  35. 35. Вектор для получения полипептида конъюгата с улучшенными фармакокинетическими и фармакодинамическими характеристиками одной или более молекул лекарственного средства, где вектор содержит полинуклеотид по п.33 или 34.
  36. 36. Способ доставки субъекту молекулы лекарственного средства, при этом способ включает введение субъекту конъюгата по любому из пп.1-31.
  37. 37. Способ лечения субъекта, имеющего заболевание или нарушение, при этом способ включает введение субъекту конъюгата по любому из пп. 1-31.
  38. 38. Способ определения наличия мишени в образце, при этом способ включает приведение образца в контакт с конъюгатом по любому из пп.1-31 в условиях, обеспечивающих возможность образования комплекса между молекулой лекарственного средства и мишенью в образце; и выявление наличия комплекса, где наличие комплекса указывает на наличие мишени в образце.
  39. 39. Способ диагностики заболевания у субъекта, при этом способ включает приведение образца от субъекта в контакт с конъюгатом по любому из пп.1-31 в условиях, обеспечивающих возможность образования комплекса между молекулой лекарственного средства и мишенью в образце;
    определение уровня мишени в образце, где уровень комплекса указывает на уровень мишени в образце; и сравнение уровня мишени в образце с контрольным уровнем мишени, где уровень мишени, отличный от контрольного уровня, указывает на заболевание у субъекта.
  40. 40. Способ по п.39, где контрольный уровень соответствует уровню у субъекта в момент времени до или в течение периода, в который субъект начал лечение, и где образец берут у субъекта в более поздний момент времени.
  41. 41. Способ по п.39, где образец берут у субъекта в момент времени в течение периода, в который субъекта подвергают лечению, и где контрольный уровень соответствует уровню в отсутствие заболевания или уровню в момент времени до периода, в который субъект начал лечение.
  42. 42. Способ по любому из пп.39-41, при этом способ дополнительно включает модификацию лечения или назначение другого вида лечения субъекту в случае, если данный вид лечения определяют как неэффективный при лечении заболевания.
  43. 43. Способ по любому из пп.36-42, где конъюгат метят репортерной молекулой.
  44. 44. Способ по любому из пп.36-43, где конъюгат вводят субъекту внутривенным, внутриартериальным, внутрибрюшинным или внутриопухолевым путем.
  45. 45. Способ по любому из пп.36-44, где конъюгат характеризуется пониженной антигенностью по сравнению с молекулой лекарственного средства, конъюгированной с полиэтиленгликолем (PEG).
  46. 46. Способ по любому из пп. 36-44, где конъюгат характеризуется пониженной иммуногенностью по сравнению с молекулой лекарственного средства, конъюгированной с полиэтиленгликолем (PEG).
  47. 47. Способ по любому из пп.36-46, где заболевание выбрано из рака, метаболического заболевания,
    - 25 037478 аутоиммунного заболевания, сердечно-сосудистого заболевания и ортопедического нарушения.
  48. 48. Способ по п.47, где заболевание включает рак.
  49. 49. Способ по п.48, где рак выбран из рака молочной железы, колоректального рака, рака толстой кишки, рака легкого, рака предстательной железы, рака яичка, рака головного мозга, рака кожи, рака прямой кишки, рака желудка, рака пищевода, форм саркомы, рака трахеи, рака головы и шеи, рака поджелудочной железы, рака печени, рака яичника, рака лимфатической системы, рака шейки матки, рака вульвы, меланомы, мезотелиомы, рака почки, рака мочевого пузыря, рака щитовидной железы, рака костей, карциномы, саркомы и рака мягких тканей.
  50. 50. Способ по п.49, где рак включает рак молочной железы.
EA201890417A 2015-08-04 2016-08-04 Генетически кодируемые внутренне неупорядоченные полимеры-"невидимки" для доставки и способы их применения EA037478B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562200726P 2015-08-04 2015-08-04
PCT/US2016/045655 WO2017024182A1 (en) 2015-08-04 2016-08-04 Genetically encoded intrinsically disordered stealth polymers for delivery and methods of using same

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201890417A1 EA201890417A1 (ru) 2018-08-31
EA037478B1 true EA037478B1 (ru) 2021-04-01

Family

ID=57943998

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201890417A EA037478B1 (ru) 2015-08-04 2016-08-04 Генетически кодируемые внутренне неупорядоченные полимеры-"невидимки" для доставки и способы их применения

Country Status (12)

Country Link
US (1) US11458205B2 (ru)
EP (1) EP3331557B1 (ru)
JP (1) JP6882782B2 (ru)
KR (1) KR20180033586A (ru)
CN (1) CN108463244B (ru)
AU (1) AU2016301391B2 (ru)
BR (1) BR112018002342A2 (ru)
CA (1) CA2994279A1 (ru)
EA (1) EA037478B1 (ru)
MX (1) MX2018001511A (ru)
WO (1) WO2017024182A1 (ru)
ZA (1) ZA201800939B (ru)

Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10392611B2 (en) 2013-05-30 2019-08-27 Duke University Polymer conjugates having reduced antigenicity and methods of using the same
US10364451B2 (en) 2013-05-30 2019-07-30 Duke University Polymer conjugates having reduced antigenicity and methods of using the same
US10385115B2 (en) 2015-03-26 2019-08-20 Duke University Fibronectin type III domain-based fusion proteins
MX2018001511A (es) 2015-08-04 2018-08-01 Univ Duke Polimeros furtivos desordenados de forma intrinseca codificados geneticamente para suministro y metodos para usar los mismos.
US11752213B2 (en) 2015-12-21 2023-09-12 Duke University Surfaces having reduced non-specific binding and antigenicity
WO2017210476A1 (en) 2016-06-01 2017-12-07 Duke University Nonfouling biosensors
CN109890833A (zh) 2016-09-14 2019-06-14 杜克大学 用于递送亲水性药物的基于三嵌段多肽的纳米粒子
US11155584B2 (en) 2016-09-23 2021-10-26 Duke University Unstructured non-repetitive polypeptides having LCST behavior
US11648200B2 (en) 2017-01-12 2023-05-16 Duke University Genetically encoded lipid-polypeptide hybrid biomaterials that exhibit temperature triggered hierarchical self-assembly
US11554097B2 (en) 2017-05-15 2023-01-17 Duke University Recombinant production of hybrid lipid-biopolymer materials that self-assemble and encapsulate agents
US11680083B2 (en) 2017-06-30 2023-06-20 Duke University Order and disorder as a design principle for stimuli-responsive biopolymer networks
WO2020028806A1 (en) 2018-08-02 2020-02-06 Duke University Dual agonist fusion proteins
WO2020077136A1 (en) * 2018-10-10 2020-04-16 University Of Washington Fusion products and bioconjugates containing mixed charge peptides
US11512314B2 (en) 2019-07-12 2022-11-29 Duke University Amphiphilic polynucleotides
WO2021252391A1 (en) * 2020-06-09 2021-12-16 Academia Sinica Methods and vectors for enhancing expression and/or inhibiting degradation of protein

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110119778A1 (en) * 2007-11-30 2011-05-19 Michael Liss Steganographic embedding of information in coding genes
WO2011123813A2 (en) * 2010-04-02 2011-10-06 Amunix Operating Inc. Binding fusion proteins, binding fusion protein-drug conjugates, xten-drug conjugates and methods of making and using same
US20130330335A1 (en) * 2010-03-23 2013-12-12 Iogenetics, Llc Bioinformatic processes for determination of peptide binding

Family Cites Families (186)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4500707A (en) 1980-02-29 1985-02-19 University Patents, Inc. Nucleosides useful in the preparation of polynucleotides
US4458066A (en) 1980-02-29 1984-07-03 University Patents, Inc. Process for preparing polynucleotides
US4554101A (en) 1981-01-09 1985-11-19 New York Blood Center, Inc. Identification and preparation of epitopes on antigens and allergens on the basis of hydrophilicity
US4668777A (en) 1981-03-27 1987-05-26 University Patents, Inc. Phosphoramidite nucleoside compounds
US4415732A (en) 1981-03-27 1983-11-15 University Patents, Inc. Phosphoramidite compounds and processes
US4973679A (en) 1981-03-27 1990-11-27 University Patents, Inc. Process for oligonucleo tide synthesis using phosphormidite intermediates
US4976734A (en) 1985-10-31 1990-12-11 Uab Research Foundation Stimulation of chemotaxis by chemotactic peptides
US5153319A (en) 1986-03-31 1992-10-06 University Patents, Inc. Process for preparing polynucleotides
US5250516A (en) 1986-04-17 1993-10-05 Uab Research Foundation Bioelastomeric materials suitable for the protection of burn areas or the protection of wound repair sites from the occurrence of adhesions
US5336256A (en) 1986-04-17 1994-08-09 Uab Research Foundation Elastomeric polypeptides as vascular prosthetic materials
US5120643A (en) 1987-07-13 1992-06-09 Abbott Laboratories Process for immunochromatography with colloidal particles
US5602244A (en) 1988-05-26 1997-02-11 Competitive Technologies, Inc. Polynucleotide phosphorodithioate compounds
US5278302A (en) 1988-05-26 1994-01-11 University Patents, Inc. Polynucleotide phosphorodithioates
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
US5362623A (en) 1991-06-14 1994-11-08 The John Hopkins University Sequence specific DNA binding by p53
ES2259800T3 (es) 1990-06-11 2006-10-16 Gilead Sciences, Inc. Procedimientos de uso de ligandos de acido nucleico.
US5545130A (en) 1992-04-08 1996-08-13 Genetronics, Inc. Flow through electroporation method
US5534408A (en) 1993-09-24 1996-07-09 University Of Massachusetts Medical Center 2-deoxystreptamine aminoglycoside inhibition of HIV RRE/Rev binding
WO1994009792A1 (en) 1992-10-23 1994-05-11 University Of Massachusetts Medical Center Small molecule inhibition of rna/ligand binding
US5702359A (en) 1995-06-06 1997-12-30 Genetronics, Inc. Needle electrodes for mediated delivery of drugs and genes
US5679647A (en) 1993-08-26 1997-10-21 The Regents Of The University Of California Methods and devices for immunizing a host against tumor-associated antigens through administration of naked polynucleotides which encode tumor-associated antigenic peptides
US5919455A (en) 1993-10-27 1999-07-06 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
US6933366B2 (en) 1996-12-27 2005-08-23 Tripep Ab Specificity exchangers that redirect antibodies to bacterial adhesion receptors
US5763548A (en) 1995-03-31 1998-06-09 Carnegie-Mellon University (Co)polymers and a novel polymerization process based on atom (or group) transfer radical polymerization
US6541580B1 (en) 1995-03-31 2003-04-01 Carnegie Mellon University Atom or group transfer radical polymerization
US5869326A (en) 1996-09-09 1999-02-09 Genetronics, Inc. Electroporation employing user-configured pulsing scheme
EP1017794A1 (en) 1997-02-06 2000-07-12 Novo Nordisk A/S Polypeptide-polymer conjugates having added and/or removed attachment groups
US6974669B2 (en) 2000-03-28 2005-12-13 Nanosphere, Inc. Bio-barcodes based on oligonucleotide-modified nanoparticles
US6216034B1 (en) 1997-08-01 2001-04-10 Genetronics, Inc. Method of programming an array of needle electrodes for electroporation therapy of tissue
US6241701B1 (en) 1997-08-01 2001-06-05 Genetronics, Inc. Apparatus for electroporation mediated delivery of drugs and genes
US6055453A (en) 1997-08-01 2000-04-25 Genetronics, Inc. Apparatus for addressing needle array electrodes for electroporation therapy
US6120493A (en) 1998-01-27 2000-09-19 Genetronics, Inc. Method for the introduction of therapeutic agents utilizing an electroporation apparatus
US6208893B1 (en) 1998-01-27 2001-03-27 Genetronics, Inc. Electroporation apparatus with connective electrode template
US7087244B2 (en) 2000-09-28 2006-08-08 Battelle Memorial Institute Thermogelling oligopeptide polymers
US6296831B1 (en) 1998-04-10 2001-10-02 Battelle Memorial Institute Stimulus sensitive gel with radioisotope and methods of making
US6841617B2 (en) 2000-09-28 2005-01-11 Battelle Memorial Institute Thermogelling biodegradable aqueous polymer solution
AU752942B2 (en) 1998-04-13 2002-10-03 Massachusetts Institute Of Technology Comb copolymers for regulating cell-surface interactions
US6153655A (en) 1998-04-17 2000-11-28 Enzon, Inc. Terminally-branched polymeric linkers and polymeric conjugates containing the same
US6302874B1 (en) 1998-07-13 2001-10-16 Genetronics, Inc. Method and apparatus for electrically assisted topical delivery of agents for cosmetic applications
US6192270B1 (en) 1998-08-14 2001-02-20 Genetronics, Inc. Apparatus and method for the delivery of drugs and genes into tissue
US6150148A (en) 1998-10-21 2000-11-21 Genetronics, Inc. Electroporation apparatus for control of temperature during the process
US6413587B1 (en) 1999-03-02 2002-07-02 International Business Machines Corporation Method for forming polymer brush pattern on a substrate surface
WO2000056774A1 (en) 1999-03-19 2000-09-28 Duke University Methods of using bioelastomers
US7163712B2 (en) 2000-03-03 2007-01-16 Duke University Microstamping activated polymer surfaces
US20050255554A1 (en) 2000-03-20 2005-11-17 Ashutosh Chilkoti Fusion peptides isolatable by phase transition
US6852834B2 (en) 2000-03-20 2005-02-08 Ashutosh Chilkoti Fusion peptides isolatable by phase transition
US7351376B1 (en) 2000-06-05 2008-04-01 California Institute Of Technology Integrated active flux microfluidic devices and methods
US6660247B1 (en) 2000-06-23 2003-12-09 Battelle Memorial Institute Multiple stimulus reversible hydrogels
US6649138B2 (en) 2000-10-13 2003-11-18 Quantum Dot Corporation Surface-modified semiconductive and metallic nanoparticles having enhanced dispersibility in aqueous media
CA2425648A1 (en) 2000-10-19 2002-04-19 Epimmune Inc. Hla class i and ii binding peptides and their uses
US7264810B2 (en) 2001-01-19 2007-09-04 Cytos Biotechnology Ag Molecular antigen array
US6528287B2 (en) 2001-02-13 2003-03-04 Nestor D. Tomycz Recombinant human serum transferrins containing peptides for inducing apoptosis in HIV-1 infected cells
AU2002307151A1 (en) 2001-04-06 2002-10-21 Carnegie Mellon University A process for the preparation of nanostructured materials
US6960437B2 (en) 2001-04-06 2005-11-01 California Institute Of Technology Nucleic acid amplification utilizing microfluidic devices
ES2474192T3 (es) 2001-05-25 2014-07-08 Duke University Moduladores de agentes farmacol�gicos
EP1423514A2 (en) 2001-09-05 2004-06-02 WHATMAN plc Stable storage of proteins
US7179785B2 (en) 2001-11-21 2007-02-20 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compounds that bind to p185 and methods of using the same
JP4355210B2 (ja) 2001-11-30 2009-10-28 フルイディグム コーポレイション 微小流体デバイスおよび微小流体デバイスの使用方法
US7314974B2 (en) 2002-02-21 2008-01-01 Monsanto Technology, Llc Expression of microbial proteins in plants for production of plants with improved properties
US7245963B2 (en) 2002-03-07 2007-07-17 Advisys, Inc. Electrode assembly for constant-current electroporation and use
US20040101852A1 (en) 2002-11-21 2004-05-27 Isis Pharmaceuticals Inc. Modulation of CGG triplet repeat binding protein 1 expression
AU2003221582A1 (en) 2002-05-03 2003-11-17 Millenium Biologix Inc. Connective tissue stimulating peptides
JP4638735B2 (ja) 2002-06-24 2011-02-23 タフツ ユニバーシティー 絹糸生体材料およびその使用方法
KR101476067B1 (ko) 2002-09-06 2014-12-23 인설트 테라페틱스, 인코퍼레이티드 공유결합된 치료제 전달을 위한 사이클로덱스트린-기초 중합체
US8129330B2 (en) 2002-09-30 2012-03-06 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Polymer conjugates with decreased antigenicity, methods of preparation and uses thereof
US6918284B2 (en) 2003-03-24 2005-07-19 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Interconnected networks of single-walled carbon nanotubes
CA2519241A1 (en) 2003-04-01 2004-11-11 Genentech, Inc. Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor
CN1878470A (zh) 2003-09-17 2006-12-13 马克罗珀尔生物外科公司 在周围血管疾病和相关病症的治疗中使用再生细胞的方法
WO2005062977A2 (en) 2003-12-23 2005-07-14 The Regents Of The University Of California Prostate cancer specific internalizing human antibodies
CN103045601B (zh) 2004-04-22 2015-04-01 雷加多生物科学公司 改良的凝血因子调节物
WO2006004778A2 (en) 2004-06-30 2006-01-12 Dentsply International Inc. Implant with a biofunctionalized surface and method for its production
US7884185B2 (en) 2004-07-28 2011-02-08 University Of Delaware Hydrogels and uses thereof
WO2006020719A2 (en) 2004-08-11 2006-02-23 Arqule, Inc. Aminoacid conjugates of beta - lapachone for tumor targeting
WO2006110292A2 (en) 2005-03-25 2006-10-19 The Regents Of The University Of California Temperature-triggered immobilization and purification of antibodies
US7635594B2 (en) 2005-05-09 2009-12-22 Theranos, Inc. Point-of-care fluidic systems and uses thereof
CA2613355C (en) * 2005-06-24 2014-04-22 Duke University A direct drug delivery system based on thermally responsive biopolymers
CA2619361C (en) 2005-08-25 2015-10-20 University Of Washington Super-low fouling sulfobetaine and carboxybetaine materials and related methods
US7713689B2 (en) 2005-09-15 2010-05-11 Duke University Non-fouling polymeric surface modification and signal amplification method for biomolecular detection
US8334257B2 (en) 2005-12-20 2012-12-18 Duke University Methods and compositions for delivering active agents with enhanced pharmacological properties
US20130172274A1 (en) * 2005-12-20 2013-07-04 Duke University Methods and compositions for delivering active agents with enhanced pharmacological properties
US7709227B2 (en) 2006-01-04 2010-05-04 Phasebio Pharmaceuticals, Inc. Multimeric ELP fusion constructs
US8841414B1 (en) 2006-01-27 2014-09-23 University Of Mississippi Medical Center Targeted delivery of therapeutic peptides by thermally responsive biopolymers
EP1996236A2 (en) 2006-03-22 2008-12-03 National Institute of Immunology Novel bioconjugates as therapeutic agent and synthesis thereof
WO2007134245A2 (en) * 2006-05-12 2007-11-22 Wisconsin Alumni Research Foundation Elastin-like polymer delivery vehicles
BR122018002612B8 (pt) 2006-06-13 2021-07-27 Helix Biomedix Inc tetrapeptídeo capaz de induzir a produção das proteínas da matriz extracelular e composição o compreendendo
AU2007265628B2 (en) 2006-06-23 2012-12-06 Perkinelmer Health Sciences, Inc. Methods and devices for microfluidic point-of-care immunoassays
EP2032255B1 (en) 2006-06-23 2010-11-10 STMicroelectronics Srl Assembly of a microfluidic device for analysis of biological material
GB0614780D0 (en) * 2006-07-25 2006-09-06 Ucb Sa Biological products
CN103230598A (zh) 2006-09-06 2013-08-07 费斯生物制药公司 融合肽治疗组合物
US8846624B2 (en) 2006-09-11 2014-09-30 Emory University Modified protein polymers
US8101403B2 (en) 2006-10-04 2012-01-24 University Of Washington Method and device for rapid parallel microfluidic molecular affinity assays
EP2066691A1 (de) 2006-11-08 2009-06-10 Basf Se Verwendung von natürlichen, rekombinanten und synthetischen resilinen in der kosmetik
US20080276935A1 (en) 2006-11-20 2008-11-13 Lixiao Wang Treatment of asthma and chronic obstructive pulmonary disease with anti-proliferate and anti-inflammatory drugs
EP2139992A4 (en) 2007-03-30 2011-08-10 Univ Duke METHOD FOR MODULATING THE ACTIVITY OF A NUCLEIC ACID MOLECULE
AU2008281913B2 (en) 2007-07-31 2013-11-07 Affibody Ab New albumin binding compositions, methods and uses
US8366652B2 (en) 2007-08-17 2013-02-05 The Invention Science Fund I, Llc Systems, devices, and methods including infection-fighting and monitoring shunts
WO2009026233A2 (en) 2007-08-17 2009-02-26 Northwestern University Self assembling peptide systems and methods
ES2319061B1 (es) 2007-09-11 2010-02-10 Biomedal, S.L. Metodo de conservacion de peptidos o proteinas.
CA2934220C (en) 2007-10-02 2019-11-05 Theranos, Inc. Modular point-of-care devices and uses thereof
WO2009067584A1 (en) 2007-11-20 2009-05-28 Duke University Methods and compositions for modulating drug-polymer architecture, pharmacokinetics and biodistribution
AU2008338530A1 (en) 2007-12-14 2009-06-25 Minitube Of America, Inc. Gender-specific separation of sperm cells and embryos
US8796184B2 (en) 2008-03-28 2014-08-05 Sentilus, Inc. Detection assay devices and methods of making and using the same
EP3412300A1 (en) 2008-06-27 2018-12-12 Duke University Therapeutic agents comprising elastin-like peptides
KR101026468B1 (ko) 2008-09-10 2011-04-01 한국전자통신연구원 생분자 검출 장치 및 검출 방법
WO2010054699A1 (en) 2008-11-17 2010-05-20 Affibody Ab Conjugates of albumin binding domain
CA2742842A1 (en) 2008-11-17 2010-05-20 Enzon Pharmaceuticals, Inc. Releasable conjugates for nucleic acids delivery systems
NZ602824A (en) 2008-12-05 2014-05-30 Abraxis Bioscience Llc Sparc binding peptides and uses thereof
GB0913775D0 (en) 2009-08-06 2009-09-16 Medical Res Council Multispecific peptides
WO2010096422A1 (en) 2009-02-17 2010-08-26 Duke University Biomolecule polymer conjugates and methods for making the same
US8586347B2 (en) 2010-09-15 2013-11-19 Mbio Diagnostics, Inc. System and method for detecting multiple molecules in one assay
CN102802657A (zh) 2009-06-11 2012-11-28 诺沃-诺迪斯克有限公司 用于治疗2型糖尿病的glp-1和fgf21组合
USPP21973P3 (en) 2009-06-23 2011-06-14 Cellfor Inc. Loblolly pine tree named ‘CF LP1-7696’
EP2287221A1 (en) 2009-07-16 2011-02-23 Stichting Katholieke Universiteit meer in het bijzonder Radboud Universiteit Nijmegen Method for the preparation of high molecular weight oligo(alkylene glycol) functionalized polyisocyanopeptides
AU2010286940A1 (en) 2009-08-26 2012-03-08 Immunotope, Inc. Cytotoxic T-lymphocyte-inducing immunogens for prevention, treatment, and diagnosis of cancer
US8506963B2 (en) 2009-09-22 2013-08-13 Shanghai Cancer Institute Anti-EFGRv3 monoclonal antibody
US8602051B2 (en) 2009-12-10 2013-12-10 Brent W. Proper Trap-primer system for floor drains
US8961977B2 (en) 2010-02-12 2015-02-24 University Of Rochester Antigenic mimics of discontinuous epitopes of pathogen recognized by broadly neutralizing antibodies
WO2011123830A2 (en) 2010-04-02 2011-10-06 Amunix Operating Inc. Alpha 1-antitrypsin compositions and methods of making and using same
JP2011220803A (ja) 2010-04-08 2011-11-04 Mitsumi Electric Co Ltd 電界効果トランジスタ素子を具備するバイオセンサ
WO2011130324A1 (en) 2010-04-13 2011-10-20 Medimmune, Llc Fibronectin type iii domain-based multimeric scaffolds
CN106691462B (zh) 2010-05-17 2020-11-10 申提留斯控股有限公司 检测装置和相关使用方法
EP2418284A1 (en) 2010-08-13 2012-02-15 ERA Biotech, S.A. Protein body-inducing polypeptide sequences
US9090869B2 (en) 2010-06-10 2015-07-28 Kyushu Institute Of Technology Temperature responsive sheet that displays reversible properties and cell sheet production method using same
US8470967B2 (en) 2010-09-24 2013-06-25 Duke University Phase transition biopolymers and methods of use
KR20130103562A (ko) 2010-11-01 2013-09-23 펩타임드, 인코포레이티드 암을 치료하기 위한 펩티드 표적화 시스템의 조성물
WO2012162426A1 (en) 2011-05-23 2012-11-29 The University Of North Carolina At Chapel Hill Methods and compositions for heptameric targeting ligands
KR101357117B1 (ko) 2011-06-28 2014-02-06 비앤엘델리팜 주식회사 폴리에틸렌글라이콜 또는 이의 유도체로 페길화된 엑센딘-4 유사체, 이의 제조방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 당뇨병 예방 또는 치료용 약학적 조성물
TW201315742A (zh) 2011-09-26 2013-04-16 Novartis Ag 治療代謝病症之雙功能蛋白質
US9775803B2 (en) 2011-10-19 2017-10-03 Samsung Electronics Co., Ltd. Liposome comprising elastin-like polypeptide and tumor cell targeting material and use thereof
US20130102003A1 (en) 2011-10-21 2013-04-25 Decimadx, Llc Point-of-Care Immunoassay for Quantitative Small Analyte Detection
WO2013065009A1 (en) 2011-11-01 2013-05-10 National Institute Of Immunology A sortase-click reaction suite for synthesis of multivalent dendrimeric protein assembly
CA2856967A1 (en) 2011-11-28 2013-06-06 Phasebio Pharmaceuticals, Inc. Therapeutic agents comprising insulin amino acid sequences
WO2013106715A1 (en) 2012-01-13 2013-07-18 Allergan, Inc. Crosslinked hyaluronic acid-collagen gels for improving tissue graft viability and soft tissue augmentation
US20130197359A1 (en) 2012-02-01 2013-08-01 Samsung Electronics Co., Ltd. Solid lipid nanoparticles including elastin-like polypeptides and use thereof
SG11201500682WA (en) 2012-09-07 2015-02-27 Sanofi Sa Fusion proteins for treating a metabolic syndrome
CA2899170C (en) 2013-01-30 2022-08-02 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Compositions and methods of use in treating metabolic disorders
JP2014156428A (ja) 2013-02-15 2014-08-28 Univ Of Tokyo 抗体結合タンパク質
US8980864B2 (en) 2013-03-15 2015-03-17 Moderna Therapeutics, Inc. Compositions and methods of altering cholesterol levels
KR102109188B1 (ko) 2013-04-01 2020-05-11 삼성전자주식회사 양이온성 지질을 포함하는 온도민감성 리포좀 및 그의 용도
US10392611B2 (en) 2013-05-30 2019-08-27 Duke University Polymer conjugates having reduced antigenicity and methods of using the same
US10364451B2 (en) 2013-05-30 2019-07-30 Duke University Polymer conjugates having reduced antigenicity and methods of using the same
WO2014194244A1 (en) 2013-05-30 2014-12-04 Duke University Enzyme-catalyzed synthesis of site-specific and stoichiometric biomolecule-polymer conjugates
WO2015011231A1 (en) 2013-07-25 2015-01-29 Universitat Rovira I Virgili Method and system for the multiplex identification of analytes in fluids
US9777041B2 (en) 2013-09-09 2017-10-03 New York University Protein nanofibers from self-assembling pentamers
CA2926215A1 (en) 2013-10-06 2015-04-09 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Modified pseudomonas exotoxin a
CA2929277C (en) 2013-11-01 2018-01-16 Yale University Delivery vehicles comprising il-2 and losartan
US10449267B2 (en) 2013-11-13 2019-10-22 Massachusetts Institute Of Technology Self-assembling underwater adhesives
WO2015120091A1 (en) 2014-02-04 2015-08-13 Duke University Systems and devices for protease detection based on engineered polymers and biopolymers and methods of use
WO2015120287A2 (en) 2014-02-06 2015-08-13 Yale University Compositions and methods of use thereof for making polypeptides with many instances of nonstandard amino acids
WO2015130846A2 (en) 2014-02-25 2015-09-03 Duke University Compositions and methods for the site-specific modification of polypeptides
US10131690B2 (en) 2014-04-25 2018-11-20 Phi Pharma Sa C6S specific transporter molecules
BR102014014502B1 (pt) 2014-06-13 2020-09-15 Ouro Fino Saúde Animal Ltda Vetor de expressão
CN104877127B (zh) 2015-06-23 2017-11-10 厦门赛诺邦格生物科技股份有限公司 一种八臂聚乙二醇衍生物、制备方法及其修饰的生物相关物质
CN104725628B (zh) 2014-10-01 2018-04-17 厦门赛诺邦格生物科技股份有限公司 一种含可降解基团的单一官能化支化聚乙二醇、制备方法及其生物相关物质
WO2016065300A1 (en) 2014-10-24 2016-04-28 Eshoo Mark W Microfluidic cartridge
WO2016065273A1 (en) 2014-10-24 2016-04-28 The University Of Chicago Heat-inducible self-assembling protein domains
EP3227348A4 (en) 2014-12-04 2018-07-18 The Trustees of Columbia University in the City of New York Biodegradable thermo-responsive polymers and uses thereof
US9702847B2 (en) 2014-12-30 2017-07-11 Avails Medical, Inc. Systems and methods for detecting a substance in bodily fluid
US9804170B2 (en) 2015-02-09 2017-10-31 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies to polyethylene glycol
US9956300B2 (en) 2015-03-18 2018-05-01 Duke Univerity Hydrogels formed from polypeptide micelles and methods of use thereof
US10385115B2 (en) 2015-03-26 2019-08-20 Duke University Fibronectin type III domain-based fusion proteins
US10064954B2 (en) 2015-06-23 2018-09-04 Nian Wu Polymer-cyclodextrin-lipid conjugates
EP3314027A4 (en) 2015-06-29 2019-07-03 Caris Science, Inc. THERAPEUTIC OLIGONUCLEOTIDES
WO2017015132A1 (en) 2015-07-20 2017-01-26 Sentilus Holdco, Llc Chips, detectors, and methods of making and using the same
MX2018001511A (es) 2015-08-04 2018-08-01 Univ Duke Polimeros furtivos desordenados de forma intrinseca codificados geneticamente para suministro y metodos para usar los mismos.
WO2017027384A1 (en) 2015-08-07 2017-02-16 Poc Medical Systems, Inc. Microfluidic devices and methods of use thereof
US9678037B2 (en) 2015-10-08 2017-06-13 The Regents Of The University Of Michigan Two-dimensional material-based field-effect transistor sensors
WO2017066484A2 (en) 2015-10-13 2017-04-20 Carter Daniel C Nsp10 self-assembling fusion proteins for vaccines, therapeutics, diagnostics and other nanomaterial applications
PL3368507T3 (pl) 2015-10-28 2023-03-27 Acuitas Therapeutics Inc. Nowe preparaty lipidów i nanocząstek lipidowych do dostarczania kwasów nukleinowych
US10633662B2 (en) 2015-11-10 2020-04-28 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and compositions for modulating AAV infection
US9496239B1 (en) 2015-12-11 2016-11-15 International Business Machines Corporation Nitride-enriched oxide-to-oxide 3D wafer bonding
US20180369399A1 (en) 2015-12-21 2018-12-27 Duke University Polymer conjugates having reduced antigenicity and methods of using the same
CN108884458A (zh) 2016-03-31 2018-11-23 味之素株式会社 丝心蛋白样蛋白质改造体及细胞培养方法
EP4043010A1 (en) 2016-05-06 2022-08-17 Phasebio Pharmaceuticals, Inc. Elp fusion proteins for controlled and sustained release
AU2017350488B2 (en) 2016-10-26 2022-06-23 Acuitas Therapeutics Inc. Lipid nanoparticle mRNA vaccines
EP3558341A1 (en) 2016-12-22 2019-10-30 Sanofi Fgf21 compound / glp-1r agonist combinations with optimized activity ratio
US11684584B2 (en) 2016-12-30 2023-06-27 Genevant Sciences Gmbh Branched peg molecules and related compositions and methods
US20190359983A1 (en) 2017-02-02 2019-11-28 Caris Science, Inc. Targeted oligonucleotides
US11554097B2 (en) 2017-05-15 2023-01-17 Duke University Recombinant production of hybrid lipid-biopolymer materials that self-assemble and encapsulate agents
EP3639003A4 (en) 2017-06-14 2021-03-17 Emulate, Inc. EFFECTS OF SPACE TRAVEL ON HUMAN BRAIN CELLS
US11680083B2 (en) 2017-06-30 2023-06-20 Duke University Order and disorder as a design principle for stimuli-responsive biopolymer networks
WO2019103744A1 (en) 2017-11-22 2019-05-31 Hewlett-Packard Development Company, L.P. Temperature-cycling microfluidic devices
WO2019147954A1 (en) 2018-01-26 2019-08-01 Duke University Albumin binding peptide-drug (aibiped) conjugates and methods of making and using same
US20190292549A1 (en) 2018-03-22 2019-09-26 Northeastern University Poly(ethylene glycol) brushes for efficient rna delivery
JP2021534402A (ja) 2018-08-17 2021-12-09 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 単分散流体容積を有する粒子包含小滴系
WO2020160472A1 (en) 2019-02-01 2020-08-06 Sentilus Holdco, Llc High-sensitivity assay

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110119778A1 (en) * 2007-11-30 2011-05-19 Michael Liss Steganographic embedding of information in coding genes
US20130330335A1 (en) * 2010-03-23 2013-12-12 Iogenetics, Llc Bioinformatic processes for determination of peptide binding
WO2011123813A2 (en) * 2010-04-02 2011-10-06 Amunix Operating Inc. Binding fusion proteins, binding fusion protein-drug conjugates, xten-drug conjugates and methods of making and using same

Also Published As

Publication number Publication date
EA201890417A1 (ru) 2018-08-31
WO2017024182A1 (en) 2017-02-09
AU2016301391A1 (en) 2018-02-22
JP6882782B2 (ja) 2021-06-02
AU2016301391B2 (en) 2022-07-28
US11458205B2 (en) 2022-10-04
KR20180033586A (ko) 2018-04-03
BR112018002342A2 (pt) 2018-12-11
MX2018001511A (es) 2018-08-01
CN108463244B (zh) 2022-05-27
EP3331557B1 (en) 2021-04-07
JP2018525989A (ja) 2018-09-13
CA2994279A1 (en) 2017-02-09
ZA201800939B (en) 2019-05-29
EP3331557A4 (en) 2019-03-13
CN108463244A (zh) 2018-08-28
EP3331557A1 (en) 2018-06-13
US20180228908A1 (en) 2018-08-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2016301391B2 (en) Genetically encoded intrinsically disordered stealth polymers for delivery and methods of using same
US10385115B2 (en) Fibronectin type III domain-based fusion proteins
US20180369399A1 (en) Polymer conjugates having reduced antigenicity and methods of using the same
RU2596392C2 (ru) Антитела против сиглека-15 для лечения заболевания, связанного с потерей костной массы
US10392611B2 (en) Polymer conjugates having reduced antigenicity and methods of using the same
JP2004532839A (ja) マクロファージ遊走阻止因子レセプターとしてのｍｈｃクラスｉｉ不変鎖ポリペプチド使用のための方法及び組成物
Herrmann et al. An effective cell-penetrating antibody delivery platform
JP2004533825A5 (ru)
US20220098248A1 (en) Unstructured non-repetitive polypeptides having lcst behavior
AU2021231786A1 (en) Proteins with predictable liquid-liquid phase separation
WO2005090570A1 (en) Therapeutic compositions and methods for treating diseases that involve angiogenesis
US20090214540A1 (en) Protein involved in cancer
Moreno Exploring the Interface Between Therapeutically Relevant Polymers
WO2024038144A1 (en) Agents that inhibit ccn ligand-induced signalling for treating disease
WO2005105143A2 (en) Vaccines and antibodies against ltk for therapy of cancers.
CN116143902A (zh) SIRPα变体及其应用
WO2005023300A2 (en) Method for treating, preventing and/or diagnosing cancer, related to the use of mal2 polypeptide
GB2572008A (en) Murine antibodies
WO2006000753A2 (en) Use of flj40787, a protein involved in colon, colorectal, ovarian, lung and/or liver cancer
GB2455634A (en) Treatment of cancer
WO2006003427A1 (en) A protein involved in carcinoma
AU2005238281A1 (en) A protein involved in cancer