JP2002502249A - ジンクフィンガータンパク質誘導体およびその方法 - Google Patents

ジンクフィンガータンパク質誘導体およびその方法

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Abstract

(57)【要約】 Cys2His2型ジンクフィンガータンパク質は多様な配列と結合するように選択しうる適応性のあるDNA結合タンパク質のクラスに該当する。典型的には、マウス転写因子Zif68やヒト転写因子Splのような、３個のジンクフィンガードメインを含むジンクフィンガータンパク質が９連続塩基対(bp)と結合する。複雑なゲノム内のユニーク部位を標的とするように一般的に適用できるクラスのタンパク質を作製するために、本発明は２つの３フィンガータンパク質を融合するポリペプチドリンカーを提供する。２種類の６フィンガータンパク質が作製され、これらは配列特異的様式で18連続塩基対のDNAと結合することが実証された。これらのタンパク質を活性化ドメインまたは抑制ドメインへの融合体として発現させると、転写が細胞内で特異的にアップまたはダウン調節される。ポリダクチルジンクフィンガータンパク質は遺伝子治療法や新規なトランスジェニック植物／動物の開発においてゲノム特異的転写スイッチとして広く適用可能である。この種のタンパク質は、ジンクフィンガー-ヌクレオチド結合性モチーフを含むプロモーターまたは他の転写制御エレメント、並びに構造遺伝子またはRNA配列からの遺伝子発現を抑制、活性化または増強するのに有用である。

Description

【発明の詳細な説明】 ジンクフィンガータンパク質誘導体およびその方法 発明の背景 １．発明の分野 本発明は一般的に遺伝子発現の調節分野に関し、特定すると、ジンクフィンガ ー-ヌクレオチド結合性タンパク質から誘導されるポリペプチドを利用すること によって、遺伝子発現を調節する方法に関する。 ２．関連技術分野の説明 転写調節は主としてタンパク質のDNAおよびRNAへの配列特異的結合によつて達 成される。DNAの配列特異的認識に関与する既知のタンパク質モチーフの中で、 亜鉛（ジンク）フィンガータンパク質はそのモジュールの特性において独特であ る。今日まで、2〜37モジュールを含有するジンクフィンガータンパク質が同定 されている。200を超えるタンパク質（それらの多くは転写因子である）がジン クフィンガードメインを保有するものとして示されている。ジンクフィンガーは 、主として、DNAの「ハシゴ(ladder)」の「横棒(rung)」にあたるDNA塩基対の特 定の配列に結合することによって、転写因子をその標的遺伝子に結合させる。 ジンクフィンガーモジュールは真核生物の多種類の転写調節性タンパク質中に 見出される長さが約30アミノ酸のモチーフである。その名前が示すように、この 核酸結合性タンパク質ドメインは亜鉛イオンを囲んで折り畳まれている。ジンク フィンガードメインはXenopus oocytesからの転写因子TFIIIAにおいて最初に認 められた(Millerら、EMBO,4:1609-1614,1985；Brownら、FEBS Lett.,186:271-27 4,1985)。このタンパク質はある共通配列の９個の不完全反復で構成されている ： (Tyr,Phe)-X-Cys-X2-4-Cys-X3-Phe-X5-Leu-X2-His-X3-4-His-X2-6（配列番号 １） 式中、Xは任意のアミノ酸である。 TFIIIAと同様に、大部分のジンクフィンガータンパク質は、各フィンガー ドメインにおいて1個の亜鉛原子と四面体を形成するように配位している、保存 されたシステインおよびヒスチジン残基を有する。酵母タンパク質ADR1、ヒト雄 性に関係するタンパク質ZFY、HIVエンハンサータンパク質およびXenopusタンパ ク質Xfin中に見られるものなどの、（システイン２個およびヒスチジン２個を含 有する）このタイプのジンクフィンガーペプチドのそれぞれの構造が高分解能NM R法によって解明されており(Kochoyanら、Biochemistry,30:3371-3386,1991；Om ichinskiらBiochemistry,29:9324-9334,1990；Leeら、Science,245:635-637,198 9)、そしてジンクフィンガーとDNAの相互作用に関する詳細なモデルが提案され た(Berg,1988；Berg,1990；Churchillら、1990)。さらに、マウスの前初期タン パク質zif268（Krox-24としても知られている）に由来する３フィンガーポリペ プチド-DNA複合体の構造がX線結晶学によって解明された(Pavletich and Pabo,S cience,252:809-817,1991)。各フィンガーは逆平行βターン１個、フィンガーチ ップ領域１個、およびzif268ジクフインガーの場合ではDNAの主溝に結合する、 短い両親媒性のαヘリックス１個を含有する。その上、保存された疎水性アミノ 酸ならびにシステインおよびヒスチジン残基による亜鉛の配位が、各フィンガー ドメインの構造を安定化している。 始原型のジンクフィンガータンパク質TFIIIAは一連の９ジンクフインガーを含 み、5S RNA遺伝子内の43bp配列と結合するが、zif268クラス（例えばKrox-20,Sp l）の調節タンパク質ははるかに大きなポリペプチド内で３個のジンクフィンガ ーしか含んでいない。このzif268のジンクフィンガー３個はそれぞれ9bp認識配 列内の３bpサブサイトを認識する。zif268によるDNAとの接触の大部分はDNAヘリ ックスの主溝中の一本のDNA鎖上のホスフェートおよびグアニン残基とのもので ある。対照的に、TFIIIAのDNAへの結合の機構はさらに複雑である。そのアミノ 末端の３ジンクフィンガーは13bp配列を認識し、主溝中で結合する。zif268と同 様に、これらのフィンガーも主として一本のDNA鎖上でグアニンとの接触をする 。zif268クラスのタンパク質とは異なって、TFIIIAのジンクフィンガー４および ６はそれ ぞれ小溝中かこれを横切って(across)結合し、フィンガー５および７〜９が主溝 と接触するように引き戻す(Clemensら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:10822-1082 6,1992)。 zif268の結晶構造は、αヘリックスの表面上の特定のヒスチジン（亜鉛と配位 していないhis残基）およびアルギニン残基がDNA認識に関与することを指示して いる。特定すると、αヘリックスの直前およびヘリックスの位置2,３および６( 保存されたヒスチジンの直前)の荷電アミノ酸がDNAのグアニンとの水素結合に関 与する。調節タンパク質Krox-20のフィンガー2ならびにSplのフィンガー1および ３と同様に、TFIIIAのフィンガー2はこれらのDNA接触位置にヒスチジンおよびア ルギニン残基を含有する。さらに、これらのジンクフィンガーのそれぞれは少な くとも配列GGGを認識する。転写因子SplおよびKrop-20間のフィンガー交換実験 で、このクラスのフィンガータンパク質に関する3-bpジンクフィンガー認識コー ドが確認された(Nardelliら、Nature,349:175-178,1989)。突然変異誘発実験で もDNA認識を特定する際のこれらのアミノ酸の重要性が示された。ジンクフィン ガーのヌクレオチド認識を特定する単純なコードを確定することが必要であろう 。こうしたコードが解読されるならば、選択されたあらゆるDNA配列に結合する ように、ジンクフィンガーポリペプチドを設計することができるはずである。こ うしたポリペプチドとその認識配列の複合体を、この配列を含有する遺伝子の転 写活性を（アップまたはダウン）調節するために利用することができるはずであ る。 RNAに結合するジンクフィンガータンパク質もまた報告されている。Clemensら (Science,260:530,1993)は、TFIIIAのフィンガー4〜7がTFIIIAの5S rRNAへの結 合の自由エネルギーの95％に寄与し、一方フィンガー1〜3が5S遺伝子のプロモー ターとの結合に同様の寄与をすることを発見した。２つの既知の5S RNA結合性タ ンパク質、TFIIIAおよびp43の比較では、共通亜鉛リガンド(ＣおよびＨ)、疎水 性アミノ酸およびフィンガー6中のトレオニン−トリプトファン−トレオニント リプレットモチーフ以外にはほとんど相同性がないことがわかる。 ジンクフィンガーを再設計するためには、新しい選択戦略を開発しなければな らず、また配列特異的ヌクレオチド認識の構造的基盤に関するその他の情報が必 要である。現行のタンパク質工学の試みでは配列および／または構造相同性に基 づく設計戦略が利用される。こうした戦略はモチーフの転移のためには十分かも 知れないが、全く知られていないモチーフに結合する新規なヌクレオチドを製造 する能力には限界がある。実際、相同性に基づく戦略を利用するジンクフィンガ ーの再設計はささやかな成功を得たのみであった(Desjarlais and Berg,Protein s,12:101,1992)。 結論として、遺伝子発現の増強または抑制のために、特異的認識部位を有する 追加のジンクフィンガーならびに新規なジンクフィンガーを設計するための新し い戦略の必要性が存在する。 発明の要約 本発明は、細胞性ヌクレオチド配列に結合してその細胞性ヌクレオチド配列の 機能を調節するジンクフィンガーモジュールを少なくとも２個含んでなる、単離 されたジンクフィンガー-ヌクレオチド結合性ポリペプチド変異体を提供する。 この変異体はDNAまたはRNAのいずれかに結合し、プロモーターからの、またはあ る構造遺伝子の転写された領域内からの転写を増強または抑制することができる 。細胞性ヌクレオチド配列としてはその細胞中に天然に存在する配列でも、細胞 中のウイルス由来のヌクレオチド配列でもよい。 別の実施形態において、本発明は、治療に有効な量のジンクフィンガー-ヌク レオチド結合性ポリペプチド誘導体または治療に有効な量のジンクフィンガー- ヌクレオチド結合性ポリペプチド誘導体をコードするヌクレオチド配列を薬学的 に許容される担体と組合せて含む医薬組成物であって、この誘導体が細胞性ヌク レオチド配列の１つと結合してその細胞性ヌクレオチド配列の機能を調節するも のを提供する。 さらに別の実施形態において、本発明は、ジンクフィンガー-ヌクレオチド結 合性モチーフを含む細胞性ヌクレオチド配列を阻害する方法であって、こ のモチーフに結合するジンクフィンガーヌクレオチド結合性ポリペプチド誘導体 をこのモチーフに接触させることを含んでなる方法を提供する。 またさらに別の実施形態において、第１の細胞性ヌクレオチド配列に結合して そのヌクレオチド配列の機能を調節するジンクフィンガー-ヌクレオチド結合性 ポリペプチド中のアミノ酸を同定し；同定されたアミノ酸のランダム置換体を含 むポリペプチド変異体をコードする発現ライブラリーを作製し；そのライブラリ ーを好適な宿主細胞中で発現させ；そして第２の細胞性ヌクレオチド配列に結合 してその第２のヌクレオチド配列の機能を調節するポリペプチド変異体を産生す るクローンを単離する；ことを含む、細胞性ヌクレオチド配列に結合する、単離 されたジンクフィンガー-ヌクレオチド結合性ポリペプチド変異体を取得する方 法を提供する。好ましくは、ポリペプチド変異体をコードする発現ライブラリー はファージディスプレーライブラリーである。 本発明は、疾患がジンクフィンガー-ヌクレオチド結合性モチーフに関係する 遺伝子発現の調節に関連する場合の、細胞増殖性疾患の患者を治療する方法であ って、ジンクフィンガー-ヌクレオチド結合性モチーフに結合するジンクフィン ガー-ヌクレオチド結合性ポリペプチド誘導体の有効量をそのジンクフィンガー- ヌクレオチド結合性モチーフに接触させて、その遺伝子の活性を調節することを 含む方法をも提供する。 さらに、本発明は、細胞性ヌクレオチド配列の機能を調節し、そしてジンクフ ィンガー-ヌクレオチド結合性モチーフに結合するタンパク質を同定する方法で あって、第１の誘導性プロモーターに機能的に連結された推定上の調節タンパク 質をコードするヌクレオチド配列ならびに第２の誘導性プロモーターおよびジン クフィンガー-ヌクレオチド結合性モチーフに機能的に連結されたリポーター遺 伝子を含む成分について、これらの成分が相互作用することができるために十分 な条件下でインキュベートを実施し、そしてこのリポーター遺伝子の発現に及ぼ す推定上の調節タンパク質の効果を測定することを含む方法を提供する。 図面の簡単な説明 図１はTFIIIAのジンクフィンガーと5S RNA遺伝子の内部プロモーターとの相互 作用のための１モデルを示す。 図2AはTFIIIAの最初の３つのアミノ末端ジンクフィンガーのアミノ酸配列を示 す。 図2Bはzfl〜３に関する最小結合部位のヌクレオチド配列を示す。 図３はzfl〜３の23bpの32Ｐ標識二本鎖オリゴヌクレオチドへの結合に関する ゲル易動度シフトアッセイを示す。 図４はzfl〜３がT7 RNAポリメラーゼによる転写をブロックすることを意味す るin vitro転写のオートラジオグラムを示す。 図５はzfl〜３のその認識配列への結合が近くに位置するT7 RNAポリメラーゼ プロモーターからの転写をブロックすることを示す。ゲル易動度シフトアッセイ におけるzfl〜３が結合したDNA分子の百分率のプロット（ｘ軸）をT7 RNAポリメ ラーゼ転写の阻害の百分率（ｙ軸）に対してプロットしている。 図６は未受精Xenopus卵から誘導されたin vitro転写システムにおける真核RNA ポリメラーゼIII転写をzfl〜３がブロックすることを示すオートラジオグラムで ある。 図７はpComb3.5中でクローン化されたzif268のジンクフィンガーに関するヌク レオチドおよび推定されるアミノ酸配列を示す。 図８はZif268タンパク質のアミノ酸配列およびファージ選択のために使用する ヘアピンDNAを示す。(A)は各ジンクフィンガーの保存状況を示す。(B)は9-bpの 共通結合部位を含有するヘアピンDNAを示す。 図９はフィンガー１、２および３の６個のランダム化残基を列記する表である 。 図10はZif268変異体A14のIPTG誘導前(レーン2)；IPTG誘導後(レーン3)：封入 体の除去後の細胞質画分(レーン4)：ジンクフィンガーペプチドを含有する封入 体(レーン5)；および突然変異Zif268(レーン6)のSDS-PAGEを示す。レーン１はＭ Ｗスタンダード（kD）である。 図11は各タンパク質に関するｋon、会合速度；ｋoff、解離速度；およびdK、 平衡解離定数を示す表である。 図12は表面プラスモン共鳴におけるリアルタイム変化による、野生型Zlf268タ ンパク質（WT）(□)およびその変異体C7（○）の解離速度（koff）を示す。 図13AおよびBはZif268-Junのヌクレオチドおよびアミノ酸配列（配列番号33お よび34）を示す。 図14AおよびBはZif268-Fosのヌクレオチドおよびアミノ酸配列（配列番号35お よび36）を示す。 図15はC7ジンクフィンガーの３フィンガー構築物のヌクレオチドおよびアミノ 酸配列（配列番号41および42）を示す。 図16Aおよび16BはTGEKPリンカーによって連結されたZif268-Zif268のヌクレオ チドおよびアミノ酸配列（配列番号43および44）を示す。 図17はゲルシフト反応を示す。図17Aはマルトース結合性タンパク質融合体(MB P)-C7-C7およびMBP-SplC-C7と各種の標的配列を含有する二重らせんDNAオリゴヌ クレオチドとの結合を示す。(A)各パネルの上部に表記した標的配列（左から右 へ；C7-C7部位、SplC-C7部位、C7部位、および(GCG)6部位）を含有する二本鎖DN AプローブをシフトさせるためにMBP-C7-C7タンパク質を使用した。タンパク質濃 度を各レーンの下部にnMで示すが、各パネルにおいて、左から右へ２倍の連続希 釈をしている。図17Bは各パネルの上部に表記したような標的配列（左から右へ ；SplC-C7部位、C7-C7部位、C7部位、およびSplC部位）を含有するプローブとの ゲルシフト反応中に滴定されたMBP-SPlC-C7タンパク質を示す。タンパク質濃度 を各レーンの下部にnMで示すが、各パネルにおいて、左から右へ２倍の連続希釈 をしている。 図18はMBP-C7-C7およびMBP-SplC-C7のDNaseIフットプリントである。MBP-C7-C 7(レーン1〜3）またはMBP-SplC-C7（レーン4〜6）のための結合部位を含有する2 20bpの放射性標識断片を1x Binding Buffer中の20ug/ml BSA(レーン2および4)ま たはその同族体結合タンパク質(300 nM、レーン３および6)とともに30分インキュベートした。次に、SureTrack Foot printing Kit(Pharmacia)を製造者の指示にしたがって使用して、DNaseIフット プリンティングを実施した。四角枠内の領域は結合部位の配列を示す。アステリ スクは3'標識鎖を示す。レーン１および４：G＋Aラダー。 図19は生細胞中の６フィンガータンパク質によって仲介される転写調節を示す 。図19A：Hella細胞を指示したリポータープラスミド2.5ugおよびC7-C7-VP16発 現プラスミド2.5ugとともに一時的に３連でトランスフェクトした。48時間後に ルシフェラーゼ活性を測定し、対照βガラクトシダーゼ活性に対して正規化した 。各カラムの上部にエラーバーによる標準偏差とともに比光単位を示す。図19B ：Hella細胞を指示したリポータープラスミド2.5ugおよびC7-C7-KRAB発現プラス ミドを含まないか、またはC7-C7-KRAB発現プラスミド１ugとともに、トランスフ ェクション試薬としてLipofectAmine(Gibco-BRL)を使用することによって、トラ ンスフェクトした。48時間後にルシフェラーゼ活性を測定し、対照βガラクトシ ダーゼ活性に対して正規化した。各カラムの上部にエラーバーとして標準偏差を 付けて比光単位数値を表記した。 発明の詳細な説明 本発明は、細胞性ヌクレオチド配列に結合してその細胞性ヌクレオチド配列の 機能を調節するジンクフィンガーモジュールを少なくとも２個含む、単離された ジンクフィンガー-ヌクレオチド結合性ポリペプチド変異体を提供する。このポ リペプチド変異体はある遺伝子の転写を増強または抑制することができ、またDN AまたはRNAに結合することができる。その上、本発明は治療に有効な量のジンク フィンガー-ヌクレオチド結合性ポリペプチド誘導体または治療に有効な量のジ ンクフィンガー-ヌクレオチド結合性ポリペプチド誘導体をコードするヌクレオ チド配列を薬学的に許容される担体と組合せて含む医薬組成物であって、この誘 導体が細胞性ヌクレオチド配列に結合してその細胞性ヌクレオチド配列の機能を 調節するもの、を提供する。本発明 は、細胞またはウイルスのヌクレオチド配列に結合するジンクフィンガー-ヌク レオチド結合性ポリペプチド変異体を取得するためのスクリーニング方法をも提 供する。 ジンクフィンガー-ヌクレオチド結合性ポリペプチド「変異体」または「誘導 体」とは、ジンクフィンガータンパク質の突然変異型または組換えによって産生 されたものを称する。変異体は、例えば一つのタンパク質からのジンクフィンガ ードメイン（群）が第２のタンパク質のジンクフィンガードメイン（群）に連結 して含まれるハイブリッドでもよい。そのドメインは野生型でも突然変異型でも よい。「変異体」または「誘導体」として、野生型ジンクフィンガータンパク質 の末端切断型で、その野生型タンパク質中のフィンガーの当初の数よりも少ない もの、が含まれる。誘導体または変異体を製造することができるジンクフィンガ ー-ヌクレオチド結合性ポリペプチドの例として、TFIIIAおよびzif268が含まれ る。 本明細書で使用する「ジンクフィンガー-ヌクレオチド結合性モチーフ」とは 、ジンクフィンガー-ヌクレオチド結合性誘導体ポリペプチドが特異性を持って 結合するヌクレオチドセグメントのあらゆる二次元または三次元構造を称する。 この定義中に含まれるのは、一般的に５またはそれ以下のヌクレオチドのヌクレ オチド配列であり、DNA二重らせんの、主溝および小溝などの三次元構造、らせ んの表面なども含まれる。このモチーフは典型的にはジンクフィンガーポリペプ チドが結合することができる好適な長さのあらゆる配列である。例えば、３フィ ンガーポリペプチドは典型的には約9〜約14塩基対を有するモチーフに結合する 。好ましくは、認識配列はゲノム内での特異性を確実にするために少なくとも約 16塩基対となる。そこで、本発明は任意の特異性のジンクフィンガー-ヌクレオ チド結合性ポリペプチドを提供するものであり、そのジンクフィンガー結合性モ チーフは実験によって設計するか、またはそのジンクフィンガータンパク質が結 合する、あらゆる配列とすることができる。モチーフはあらゆるDNAまたはRNA配 列中に見出だされ、調節配列、エキソン、イントロン、または任意の非コード配 列が含まれる。 本発明の実用においては、ジンクフィンガー-ヌクレオチド結合性変異ポリ ペプチドを取得するために、そのジンクフィンガー-ヌクレオチド結合性モチー フを知る必要はない。ジンクフィンガータンパク質ばこれまでのところ真核生物 中でのみ同定されているけれども、ジンクフィンガーの周知の特性は保存してい るが、その産生方法ならびにそのアミノ酸配列および三次元構造において現存す るジンクフィンガータンパク質とは異なっている、本発明の遺伝的に改変された 単離構築物を結合させることによって、非真核性DNAまたはRNA中、特に細菌およ びウイルスの天然プロモーター中で、ジンクフィンガー-ヌクレオチド結合性モ チーフを同定することができることを、特に本発明の範囲内として構想する。 既知の野生型ジンクフィンガータンパク質の特徴的構造は２から37程度までの モジュールの縦列反復で構成され、各反復が一対の保存されたシステインおよび 一対の保存されたヒスチジンによって亜鉛原子を四面体配位中に保持している「 フィンガー」を形成している。一般に、各フィンガーは保存された疎水性アミノ 酸をも含有し、これらが相互作用して疎水性コアを形成し、モジュールがその形 状を維持することを助けている。 本発明のジンクフィンガー-ヌクレオチド結合性ポリペプチド変異体は細胞性 ヌクレオチド配列に結合してその細胞性ヌクレオチド配列の機能を調節するジン クフィンガーモジュールを２以上、好ましくは４以上含む。用語「細胞性ヌクレ オチド配列」とは細胞中に存在するヌクレオチド配列を意味する。その配列は細 胞中に天然に存在する配列である必要はない。例えば、宿主細胞のDNA内に組み 込まれるレトロウイルスゲノムは「細胞性ヌクレオチド配列」とみなされる。細 胞性ヌクレオチト配列はDNAまたはRNAでよく、そしてイントロンおよびエキソン 、DNAおよびRNAの両方を含む。細胞および／または細胞性ヌクレオチド配列は原 核または真核生物性でよく、酵母、ウイルスまたは植物ヌクレオチド配列が含ま れる。 用語「調節」とは、ある機能の抑制、増強または誘導を称する。例えば、本発 明のジンクフィンガー-ヌクレオチド結合性ポリペプチド変異体はプロモーター 内のあるモチーフに結合することによってそのプロモーター配列を調節し、それ によってそのプロモーターの細胞性ヌクレオチド配列に機能的 に連結された遺伝子の転写を増強または抑制することができる。あるいは、調節 としてある遺伝子の転写の阻害も含まれる。それは、ジンクフィンガー-ヌクレ オチド結合性ポリペプチド変異体が、その構造遺伝子に結合してDNA依存性RNAポ リメラーゼがその遺伝子を読み取るのをブロックし、それによって遺伝子の転写 を阻害する場合である。構造遺伝子は正常細胞性遺伝子でもよく、または例えば 腫瘍遺伝子でもよい。あるいは、調節として、ある転写の翻訳の阻害も含まれる 。 遺伝子のプロモーター領域は、典型的には構造遺伝子の5'側にある調節エレメ ントを含む。遺伝子が活性化される場合、転写因子として知られているタンパク 質がその遺伝子のプロモーター領域に付着する。この集積は酵素が第２の遺伝子 セグメントをDNAからRNA中に転写することを可能にすることで、「オン・スイッ チ」とも言える。大部分の場合、生成するRNA分子はある特定のタンパク質の合 成のための鋳型として作用するが、ときにはRNA自体が最終産物となる。 プロモーター領域は正常細胞性プロモーターでもよく、または例えば腫瘍プロ モーターでもよい。腫瘍プロモーターは一般的にはウイルス由来のプロモーター である。例えば、レトロウイルスの長末端反復（LTR）は本発明のジンクフィン ガー結合性ポリヌクレオチド変異体の標的となり得るプロモーター領域である。 ヒトＴ細胞白血病ウイルス(HTLV)1および2、またはヒト免疫不全ウイルス(HIV)1 および２などの病原体が含まれる、Lentivirusグループのメンバー由来のプロモ ーターは、本発明のジンクフィンガー結合性ポリヌクレオチドによって転写調節 の標的にされ得るウイルスプロモーター領域の例である。 本発明のジンクフィンガー-ヌクレオチド結合性ポリペプチド誘導体または変 異体には、DNA、RNAまたはその両方などの細胞性ヌクレオチド配列に結合するポ リペプチドが含まれる。DNAに結合するジンクフィンガー-ヌクレオチド結合性ポ リペプチド、さらに特定するとDNAに結合するジンクフィンガードメインは、２ つのジンクフィンガードメインの間の「リンカー」領域を調べることによって、 容易に同定することができる。このリンカーアミノ酸 配列、TGEK(P)(配列番号32)はDNA配列に結合するジンクフィンガードメインの典 型的な指示配列である。したがって、リンカーアミノ酸を調べることによって、 ある特定のジンクフィンガー-ヌクレオチド結合性ポリペプチドがDNAまたはRNAの いずれに好んで結合するかを判定することができる。 １実施形態において、本発明の方法として、ジンクフィンガー-ヌクレオチド 結合性モチーフを含む細胞性ヌクレオチド配列の機能を阻害または抑制するため の方法であって、このモチーフに結合する有効な量のジンクフィンガー-ヌクレ オチド結合性ポリペプチド誘導体をこのジンクフィンガー-ヌクレオチド結合性 モチーフに接触させることを含んでなる、方法が含まれる。細胞性ヌクレオチド 配列がプロモーターの場合は、この方法はジンクフィンガー-DNA結合性モチーフ を含有するプロモーターの転写の際のトランス活性化の阻害を含む。用語「阻害 」とは、例えば、ジンクフィンガー-ヌクレオチド結合性モチーフを含有するプ ロモーターに機能的に連結された構造遺伝子の転写の活性化レベルの抑制を意味 する。その外、ジンクフィンガー-ヌクレオチド結合性ポリペプチド誘導体は構 造遺伝子内またはRNA配列内のモチーフに結合することもある。 用語「有効な量」には、ジンクフィンガー-ヌクレオチド結合性モチーフを含 有し、すでに活性化されたプロモーターの活性の減少結果に至る量、またはプロ モーターの不活性化をもたらす量、あるいは構造遺伝子の転写またはRNAの翻訳 をブロックする量、が含まれる。必要とされるジンクフィンガーを誘導するヌク レオチド結合性ポリペプチドの量は、現存するタンパク質／プロモーター複合体 中の本来のジンクフィンガー-ヌクレオチド結合性タンパク質を置換するのに必 要な量か、あるいはそのプロモーター自体との複合体の形成について、本来のジ ンクフィンガー-ヌクレオチド結合性タンパク質と競合するのに必要な量のいず れかである。同様に、構造遺伝子またはRNAをブロックするために必要とされる 量は、それぞれRNAポリメラーゼに結合してこれが遺伝子を読み取るのをブロッ クする量、または翻訳を阻害する量である。好ましくは、この方法を細胞内で実 施する。プロモーターまたは 構造遺伝子を機能的に不活性化することによって、転写または翻訳が抑制される 。ジンクフィンガー-ヌクレオチド結合性タンパク質モチーフを含有する細胞性 ヌクレオチド配列に有効な量の阻害性タンパク質を結合または「接触」させるた めの送達はレトロウイルスベクターまたはリポソームによるなどの本明細書に記 載する機構の１つによるか、あるいは当技術分野で周知のその他の方法によって 、達成することができる。 ジンクフィンガー-ヌクレオチド結合性ポリペプチド誘導体は、野生型ジンク フィンガータンパク質から切断若しくは延長によって、または部位を指向した突 然変異誘発のプロセスによる野生型由来のポリペプチドの変異体として、あるい はこれらの操作の組合せによって、誘導または製造される。 用語「切断型」とは、天然のジンクフィンガー結合性タンパク質中に見られる ジンクフィンガーの全数よりも少ない数を含有するか、または不要な配列を欠失 させた、ジンクフィンガー-ヌクレオチド結合性ポリペプチド誘導体を意味する 。例えば、本来は９ジンクフィンガーを含有するジンクフィンガー-ヌクレオチ ド結合性タンパク質、TFIIIAの切断では1〜3個のジンクフィンガーのみを有する ポリペプチドとなる。延長とは、別のジンクフィンガーモジュールが添加された ジンクフィンガーポリペプチドを称する。例えば、TFIIIAに３個のジンクフィン ガードメインを添加することによって12フィンガーに延長することができる。そ の外、切断型ジンクフィンガー-ヌクレオチド結合性ポリペプチドに２以上の野 生型ポリペプチドからのジンクフィンガーモジュールを含ませて、その結果「ハ イブリッド」ジンクフィンガー-ヌクレオチド結合性ポリペプチドとすることが できる。 用語「突然変異型」とは、タンパク質をコードするDNAのランダムまたは部位 を指向した突然変異を達成するために任意の既知の方法を実施することによって 取得した、ジンクフィンガーから誘導されるヌクレオチド結合性ポリペプチドを 称する。例えば、TFIIIAにおいて、共通配列の１以上の反復中の非保存残基を置 換するように突然変異誘発を実施することができる。切断型ジンクフィンガー- ヌクレオチド結合性タンパク質もまた突然変異させることができる。 ジンクフィンガー-ヌクレオチド結合性モチーフを含有する細胞性配列の機能 を阻害するために、本発明にしたがって切断、延長および／または突然変異誘発 することができる既知のジンクフィンガー-ヌクレオチド結合性タンパク質の例 として、TFIIIAおよびzif268が含まれる。その他のジンクフィンガー-ヌクレオ チド結合性タンパク質は当業者が知ることができるはずである。 本発明は、治療に有効な量のジンクフィンガー-ヌクレオチド結合性ポリペプ チド誘導体または治療に有効な量のジンクフィンガー-ヌクレオチド結合性ポリ ペプチド誘導体をコードするヌクレオチド配列を薬学的に許容される担体と組合 せて含む医薬組成物であって、この誘導体が細胞性ヌクレオチド配列の１つと結 合してその細胞性ヌクレオチド配列の機能を調節するもの、をも提供する。本発 明の治療方法において、本明細書に記載された各種のジンクフィンガー-ヌクレ オチド結合性ポリペプチド誘導体を１以上含有する医薬組成物が有用である。 本明細書で使用される場合の、組成物、担体、希釈剤および試薬について言及 する「薬学的に許容される」、「生理学的に寛容性の」およびこれらの文法上の変 形語は互換性を持って使用され、そしてその組成物の投与の障害になる程度の、 吐き気、めまい、胃腸の不調などの好ましくない生理学的影響結果を伴わずに、 その物質をヒトに内用または外用投与することができることを意味する。 活性成分を中に溶解または分散して含有する医薬組成物の調製は当技術分野で 十分理解されている。典型的には、こうした組成物は水性または非水性の液体溶 液または懸濁液のいずれかの無菌注射剤として調製されるが、使用前に液状の溶 液または懸濁液とするのに好適な固形剤もまた調製することができる。調製物を 乳化することもできる。 活性成分を、薬学的に許容され、かつその活性成分と適合性である賦形剤とと もに、そして本明細書に記載する治療方法での使用に好適な量で混合することが できる。好適な賦形剤は、例えば、水、塩溶液、デキストロース、グリセロール 、エタノールなど、およびこれらの組合せである。その外、所 望ならば、組成物に、活性成分の効力を増強する湿潤剤または乳化剤、ならびに pH緩衝剤などの補助物質を微量含ませることができる。 本発明の治療用医薬組成物には、その中の成分の薬学的に許容される塩を含ま せることができる。薬学的に許容される塩としては、例えば塩酸若しくはリン酸 などの無機酸、または酢酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸で形成された（ポ リペプチドの遊離アミノ基との）酸付加塩が含まれる。例えばナトリウム、カリ ウム、アンモニウム、カルシウムまたは第II鉄の水酸化物などの無機塩基、およ びイソプロピルアミン、トリメチルアミン、2-エチルアミノエタノール、ヒスチ ジン、プロカインなどの有機塩基から、遊離カルボキシル基とで形成する塩もま た誘導することができる。 生理学的に寛容性の担体は当技術分野で周知である。代表的な液状担体は活性 成分および水の外には何の物質も含まないか、あるいは生理的pH値のリン酸ナト リウムなどのバッファー、生理的塩溶液、若しくはその両方、リン酸塩緩衝化塩 溶液など、を含む無菌水性溶液である。またさらに、水性担体に２以上のバッフ ァー塩、そしてナトリウムおよびカリウムの塩化物などの塩、デキストロース、 プロピレングリコール、ポリエチレングリコールならびにその他の溶質を含ませ ることができる。 液状組成物に水とともに、そして水を排除して、その他の液相を含ませること ができる。こうしたその他の液相の代表はグリセリン、綿実油などの植物油、オ レイン酸エチルなどの有機エステル、および水−油エマルジョンである。 本発明にはジンクフィンガー-ヌクレオチド結合性ポリペプチド変異体をコー ドするヌクレオチド配列が含まれる。天然、切断型および延長型ポリペプチドを 含む本発明のジンクフィンガー-ヌクレオチド結合性ポリペプチドをコードするD NA配列はいくつかの方法によって取得することができる。例えば、当技術分野で 周知のハイブリダイゼーション操作を使用して、DNAを単離することができる。 これらとして、限定するわけではないが、以下のものが含まれる：(1)共通する ヌクレオチド配列を検出するための、ゲノムまたはcDNAライブラリーへのプロー ブのハイブリダイゼーション：(2)共通する構 造特性を検出するための、発現ライブラリーの抗体スクリーニング；および(3) ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)による合成。本発明のRNA配列は当技術分野で既知の 方法によって取得することができる(例えば、Current Protocols in Molecular Biology,Ausubelら、eds.,1989，参照)。 本発明のジンクフィンガー-ヌクレオチド結合性タンパク質をコードする特異 的DNA配列の開発は、(1)ゲノムDNAからの二本鎖DNA配列の単離;(2)目的のポリペ プチドのために必要なコドンを提供するためのDNA配列の化学的製造；および(3) 真核ドナー細胞から単離されたmRNAの逆転写による二本鎖DNA配列のin vitro合 成、によって取得することができる。後者の場合、mRNAの二本鎖DNA相補体は結 局形成されるもので、一般にcDNAと称される。組換え操作において使用するため の特異的DNA配列の開発のためのこれらの３つの方法の中で、ゲノムDNAの単離が 最も一般的でない。このことは、哺乳類ポリペプチドの微生物中の発現を得る必 要がある場合に、イントロンが存在することによって、特に当てはまる。 ジンクフィンガーから誘導されるDNA結合性ポリペプチドを取得するためには 、その所望のポリペプチド産物のアミノ酸残基の全配列が知られているならば、 DNA配列の合成が最良の方法であることが多い。所望のポリペプチドのアミノ酸 残基の全配列が知られていない場合は、DNA配列の直接の合成は不可能であり、 最良の方法はcDNA配列の形成である。目的のcDNA配列を単離するための標準的操 作法の中に、遺伝子発現が高レベルのドナー細胞中に豊富なmRNAの逆転写から誘 導されるプラスミド保有cDNAライブラリーの形成がある。ポリメラーゼ連鎖反応 技術と組合せて使用すれば、わずかな発現産物でもクローン化することができる 。ポリペプチドのアミノ酸配列の特徴的な部分が知られている場合には、変性し て一本鎖としたcDNAのクローン化コピー上で実施するDNA／DNAハイブリダイゼー ション操作において、その標的cDNA中に存在すると推定される配列と重複する標 識一本鎖若しくは二本鎖標準DNAまたはRNAプローブを使用することができる(Jay ら、Nucleic Acid Research,11:2325,1983)。 組換えクローンのスクリーニングのためには、標識された混合合成オリゴ ヌクレオチドプローブであって、各プローブが変性された二本鎖DNAの異種混合 物を含むハイブリダイゼーションサンプル中の特定のDNA配列の完全相補体の可 能性があるもの、を使用することによる、ハイブリダイゼーション操作が有用で ある。こうしたスクリーニングのためには、ハイブリダイゼーションを好ましく は一本鎖DNAまたは変性された二本鎖DNAのいずれかで実施する。ハイブリダイゼ ーションは、目的のポリペプチドに関係するmRNA配列の存在がきわめて少量の場 合に、取得源に由来するcDNAクローンの検出に特に有用である。非特異的結合を 回避する目的でストリンジェントハイブリダイゼーション条件を使用することに よって、例えば、標的DNAと混合物中のその完全な相補体である１個のプローブ とのハイブリダイゼーションによる特異的cDNAクローンのオートラジオグラフィ ー可視化が可能になる(Wallaceら、Nucleic Acid Research,9:879,1981；Maniat isら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laborato ry，1982)。 核酸ハイブリダイゼーションに頼るスクリーニング操作法では、適切なプロー ブが入手できるならば、どんな生物からのどんな遺伝子配列を単離することも可 能になる。問題のタンパク質をコードする配列の一部に対応するオリゴヌクレオ チドプローブを化学的に合成することができる。これにはアミノ酸配列の短い一 続きのオリゴヌクレオチドを知る必要がある。タンパク質をコードするDNA配列 はその遺伝コードから推定することができるが、コードの縮重を考慮しなければ ならない。配列が縮重性である場合は、混合した付加反応を実施することが可能 である。これには変性した二本鎖DNAの異種混合物が含まれる。こうしたスクリ ーニングのためには、好ましくはハイブリダイゼーションを一本鎖DNAまたは変 性された二本鎖DNAのいずれかで実施する。 本発明のDNA配列は基本的にあるジンクフィンガー-ヌクレオチド結合性タンパ ク質の全部または部分をコードするので、これからまたは相当するDNA配列からD NAの断片を調製し、サブクローン化し、そしてその切断型ポリペプチドを発現す ることは、今や普通のことである。あるいは、本発明 のジンクフィンガー-ヌクレオチド結合性ポリペプチドを確定する、本明細書に 開示されたDNA断片を利用することによって、既知の技術と組合せて、全ジンク フィンガー-ヌクレオチド結合性タンパク質をコードするDNA配列を決定すること が可能である。こうした技術は米国特許第4,394,443号および米国特許第4,446,2 35号に記載されており、これらを参照によりここに組み入れる。 ジンクフィンガー-ヌクレオチド結合性タンパク質に特異的な抗体を使用して 、ジンクフィンガー-ヌクレオチド結合性タンパク質または少なくとも１個のエ ピトープを有するジンクフィンガーから誘導されたポリペプチドのために、λgt 11などのcDNA発現ライブラリーを間接的にスクリーニングすることができる。ジ ンクフィンガー-ヌクレオチド結合性タンパク質cDNAの存在を指示する発現産物 を検出するために、こうした抗体をポリクローナルまたはモノクローナルとして 誘導して使用することができる。あるいは、誘導されたポリペプチドのDNA標的 への結合を、標的部位に組み込んだ放射性標識DNAによって、そして非結合標的 部位に比較した電気泳動易動度の遅延を試験することによって、アッセイするこ とができる。 切断型および／または突然変異ジンクフィンガー-ヌクレオチド結合性ポリペ プチドの同定のために使用する好ましいベクターは、アミノからカルボキシ末端 の方向に、(1)原核性分泌シグナルドメイン、(2)異種ポリペプチド、および(3) 繊維状ファージ膜アンカードメイン、を含有する融合ポリペプチドをコードし、 そして発現することができるヌクレオチド配列を含有する組換えDNA(rDNA）分子 である。このベクターはこの融合ポリペプチドを発現するためのDNA発現制御配 列、好ましくは原核制御配列を含む。 線状ファージ膜アンカーは、好ましくは、線状ファージ粒子のマトリックスと 結合することができ、それにより融合ポリペプチドをファージ表面に組み込むこ とができるcpIIIまたはcpVIIIコートタンパク質のドメインである。 分泌シグナルは、前記タンパク質をグラム陰性細菌のペリプラスム膜に向かわ せるタンパク質のリーダーペプチドドメインである。好ましい分泌シグナルは pelB分泌シグナルである。Erwinia Carotovaからの２つのpelB遺伝子産物変異体 からの分泌シグナルドメインの予測アミノ酸残基配列はLeiら(Nature，331:543- 546，1988)に記載されている。 pelBタンパク質のリーダー配列はこれまで融合タンパク質の分泌シグナルとし て使用されてきた(Betterら、Science，240:1041-1043，1988;Sastryら、Proc． Natl．Acad．Sci．USA，86:5728-5732，1989;及びMullinaxら、Proc．Natl．Aca d．Sci．USA，87:8095-8099，1990)。本発明において有用な大腸菌からのその他 の分泌シグナルポリペプチドドメインのアミノ酸残基配列はOliver、Neidhard， F.C.(ed.)，Escherichia coli and Salmonella Typhimurium，American Society for Microbiology，Washington，D.C.，1:56-69(1987)に見られる。 前記ベクターに好適な膜アンカーは線状ファージM13、fl、fd及び同等な線状 ファージから得られる。好ましい膜アンカードメインは遺伝子III及び遺伝子VII Iによりコードされたコートタンパク質に見られる。線状ファージコートタンパ ク質の膜アンカードメインはコートタンパク質のカルボキシ末端領域の部分であ り、脂質二重層膜にまたがる疎水性アミノ酸残基の領域、及び膜の細胞質表面に 通常見られ膜から離れるように延びている荷電アミノ酸残基の領域を含む。ファ ージflにおいては、遺伝子VIIIコートタンパク質の膜を跨ぐ領域は残基Trp-26か らLys-40を含み、細胞質領域は41〜52のカルボキシ末端11残基を含む(Ohkawaら 、Ｊ．Biol．Chem.，256:9951-9958，1981)。従って、好ましい膜アンカードメ インのアミノ酸残基配列は、M13線状ファージ遺伝子VIIIコートタンパク質(cpVI IIまたはCP8とも称される)から得られる。遺伝子VIIIコートタンパク質はファー ジ粒子の大部分において成熟線状ファージ上に存在し、これは通常約2500〜3000 コピーのコートタンパク質を有する。 さらに、別の好ましい膜アンカードメインのアミノ酸残基配列はM13線状ファ ージ遺伝子IIIコートタンパク質(cpIIIとも称される)から得られる。遺伝子III コートタンパク質はファージ粒子の一端において成熟線状ファージ上に存在し、 これは通常約4〜6コピーのコートタンパク質を有する。線状ファージ粒子の構造 、そのコートタンパク質、及び粒子の組み立ての詳細な説明については、Rached らの概説(Microbiol．Rev.，50:401-427 1986;及びModelら、"The Bacteriophag es: Vol 2"，R．Calendar，ed．Plenum Publishing Co.，pp．375-456，1988)を参照 されたい。 DNA発現調節配列は、構造遺伝子産物を発現するためのDNA発現シグナルのセッ トを含み、また5'及び3'エレメントを含み、これらは周知のようにシストロンに 機能的に連結し、該シストロンが構造遺伝子産物を発現できるようになっている 。5'調節配列は、上流の翻訳可能なDNA配列の5'末端に機能的に連結した転写を 開始するためのプロモーター及びリボソーム結合部位を規定する。 大腸菌中における遺伝子発現の高いレベルを得るためには、強力なプロモータ ーを使用して大量のmRNAを生成するだけではなく、リボソーム結合部位を使用し て該mRNAが効率的に翻訳されるようにしなければならない。大腸菌においては、 リボソーム結合部位は開始コドン(AUG)及び開始コドンから3〜11ヌクレオチド上 流に位置する3〜9ヌクレオチド長の配列を含む(Shineら、Nature，254:34，1975 )。シャイン・ダルガルノ(SD)配列と呼ばれる配列AGGAGGUは、大腸菌16S rRNAの3 '末端に相補的である。リボソームのmRNA及びmRNAの3'末端における前記配列へ の結合は下記のようないくつかの要因に影響される。 (i) SD配列と16S rRNAの3'末端との間の相補性の程度。 (ii)SD配列及びAUGの間の間隔及びそこに存在する可能性のあるRNA配列 (Robertsら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA，76:760，1979a;Robertsら、Pro c．Natl．Acad．Sci．USA，76:5596，1979b;Guarenteら、science，209:142 8，1980:及びGuarenteら、Cell，20:543，1980)。この間隔が系統的に変化 するプラスミド中での遺伝子の発現のレベルを測定することにより最適化で きる。異なるmRNAの比較により、位置-20〜+13(AUGのAを位置０とする)から の統計的に好ましい配列が存在することが示されている(Goldら、Annu．Rev ．Microbial.，35:365，1981)。リーダー配列は翻訳に強く影響を与えるこ とが示されている(Robertsら、1979a,b上掲)。 (iii)AUGに続くヌクレオチド配列。これはリボソーム結合に影響を与える (Taniguchiら、J．Mol．Biol.，118:533;，1978)。 3'調節配列は、フレーム内の少なくとも１つの終結(ストップ)コドンを規定し 、これは異種融合ポリペプチドを有し、かつ機能的に連結している。 好ましい実施形態においては、使用されるベクターは原核生物複製起点または レプリコン、すなわち組換えDNA分子の染色体外の自律複製と維持を、それによ り形質転換された細菌宿主細胞のような原核宿主細胞中で起こす能力を有するDN A配列を含む。そのような複製起点は当分野で周知である。好ましい複製起点は 、宿主生物中で効率のよいものである。好ましい宿主細胞は大腸菌である。大腸 菌中でのベクターの使用のために好ましい複製起点はpBR322及びその他の通常の 種類のプラスミドに存在するColE1である。pACYC及びその誘導体に存在するp15A 複製起点も好ましい複製起点である。ColE1及びp15Aレプリコンは分子生物学に おいて広く使用されており、種々のプラスミド上で利用可能で、少なくともSamb rookら、Molecular Cloning:a Laboratory Manual，2nd edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989により記載されている。 ColE1及びp15Aレプリコンは本発明において使用するのに特に好ましく、これ はそれらがそれぞれ大腸菌中でプラスミドの複製を起こす能力を有している一方 で、他方のレプリコンが同じ大膳菌細胞中で第２のプラスミドに存在しているこ とによる。言い換えれば、ColE1及びp15Aは非阻害レプリコンであり、同じ宿主 中において２種のプラスミドの維持を可能とするものである(例えばSambrookら 、上掲、pp1.3-1.4参照)。 さらに、原核生物レプリコンを含むこれらの実施形態は、その発現が選択の利 点、例えば薬剤耐性をそれにより形質転換された細菌宿主に与える遺伝子も含む 。典型的な細菌薬剤耐性遺伝子は、アンピシリン、テトラサイクリン、ネオマイ シン/カナマイシン、あるいはクロラムフェニコールに対する耐性を与えるもの である。また、ベクターは典型的には翻訳可能なDNA配列を挿入するのに都合の よい制限部位も含む。ベクターの例としては、BioRad Laboratories，(Richmond ，CA)から入手できるプラスミドpUC8、pUC9、pBR322及びpBR329、Pharmacia，(P iscataway，NJ)から入手できるpPL及びpKK223、及びpBS(Stratagene，La Jolla ，CA)等が挙げられる。 ベクターは、挿入DNAに対する指向的な結合に適したヌクレオチドの配列を介 して機能的に連結された上流及び下流の翻訳可能DNA配列を含む第１のカセット を含む。上流翻訳可能配列は本明細書において定義したような分泌シグナルをコ ードする。下流翻訳可能配列は本明細書において定義したような線状ファージ膜 アンカーをコードする。前記カセットは、好ましくは、挿入翻訳可能DNA配列(挿 入DNA)が、指向的結合に適したヌクレオチドの配列を介してカセットに指向的に 挿入されたときに生成されるジンクフィンガー誘導ポリペプチドの発現のための 発現調節配列を含む。線状ファージ膜アンカーは好ましくは線状ファージ粒子の マトリックスと結合することができ、それにより融合ポリペプチドをファージ表 面に組み込むことができるcpIIIまたはcpVIIIコートタンパク質のドメインであ る。 また、ジンクフィンガー誘導ポリペプチド発現ベクターは、第２の受容体ポリ ペプチドを発現するための第２のカセットも含む。第２のカセットは、本明細書 で定義したような分泌シグナルをコードする第２の翻訳可能DNA配列を含み、こ れはその3'末端において、カセットのリーディングフレーム中の少なくとも１つ のストップコドンを通常規定するベクターの下流DNA配列への指向的結合に適し たヌクレオチドの配列を介して機能的に連結されている。第２の翻訳可能DNA配 列はその5'末端においてDNA発現調節配列に機能的に連結され5'エレメントを形 成している。第２のカセットは、翻訳可能DNA配列(挿入DNA)が挿入されると、挿 入DNAによりコードされたポリペプチドを有する分泌シグナルの受容体を含む第 ２の融合ポリペプチドを発現することができる。本発明の目的のためには、第２ のカセットの配列は削除されている。 本明細書で使用する用語「ベクター」は、それが機能的に連結した別の核酸を 異なる遺伝子環境の間で輸送することができる核酸分子をいう。好ましいベクタ ーは、自律複製と、ベクターが機能的に連結したDNAセグメント中に存在する構 造遺伝子産物の発現が可能なものである。従ってベクターは、好ましくは前記の ようなレプリコン及び選択マーカーを含むものである。 DNA配列あるいはセグメントに関して本明細書において使用する表現「機能的 に連結した」は、１本鎖あるいは２本鎖の形態のDNAの１つの鎖に、好ましくは 通常のホスホジェステル結合により配列あるいはセグメントが共有結合されてい ることをいう。本発明の転写ユニットあるいはカセットを機能的に連結させるベ クターの選択は、当分野で周知のように、所望される機能的性質、例えば、ベク ター複製、タンパク質発現、及び形質転換させる宿主細胞に直接依存し、これら は組換えDNA分子の構築の技術に内在する制限である。 指向的結合に採用されるヌクレオチドの配列、すなわちポリリンカーは、（１ ）上流及び下流翻訳可能DNA配列の複製及び輸送のために機能的に連結し、（２ ）DNA配列のベクター中への指向的結合のための部位あるいは手段を与えるDNA発 現ベクターの領域である。典型的には、指向的ポリリンカーは、２以上の制限エ ンドヌクレアーゼ認識配列、すなわち制限部位を規定するヌクレオチドの配列で ある。制限酵素分解により、この２つの部位は粘着末端を生成し、DNA発現ベク ターに対してこれに翻訳可能DNA配列を結合することができる。好ましくは、こ れらの２つの制限部位は、制限酵素分解により非相補的な粘着末端を生成し、そ れにより翻訳可能DNA配列のカセット中への指向的挿入を可能とするものである 。１つの実施形態においては、指向的結合手段は、上流翻訳可能DNA配列、下流 翻訳可能DNA配列、あるいはその両方に存在するヌクレオチドにより与えられる 。別の実施形態においては指向的結合に適したヌクレオチドの配列が複数の指向 的クローニング手段を規定するヌクレオチドの配列を含む。指向的結合に適した ヌクレオチドの配列が多数の制限部位を規定する場合、これは多重クローニング 部位と呼ばれる。 好ましい実施形態においては、DNA発現ベクターは、取り扱いに便利なように 、本発明のジンクフィンガー-ヌクレオチド結合性ポリペプチドをコードするDNA を封入する線状ファージ粒子の形態に設計される。この実施形態においては、DN A発現ベクターはさらに線状ファージ複製起点を規定するヌクレオチド配列を含 み、適当な遺伝子相補性が提示されたときにベクターが線状ファージとして１本 鎖の複製可能な形態で複製し得、線状ファージ粒子中にパッケージされ得る。こ の特徴により、当分野で周知のスクリーニング方法を使用して、粒子及びそれに 含まれるベクターをファージ粒子の集団を含むその他の粒子から続けて分離する ためのDNA発現ベクターのファージ粒子中へのパッケージ能力が得られる。 線状ファージ複製起点はファージゲノムの領域であり、これは周知のように複 製の開始、複製の終結、及び複製により生成された複製可能な形態のパッケージ ングのための部位を有する(例えばRaschedら、Microbiol．Rev.，50:401-427， 1986;及びHoriuchi，J．Mol．Biol.，188:215-223，1986参照)。 本発明に使用する好ましい線状ファージ複製起点はM13、flまたばfdファージ 複製起点である(Shortら、Nucl．Acids Res.，16:7583-7600，1988)。好ましいD NA発現ベクターは発現ベクター修飾pCOMB3及び特にpCOMB3.5である。 ジンクフィンガー-ヌクレオチド結合性ポリペプチドをコードするDNA配列の製 造は、ジンクフィンガー-ヌクレオチド結合性ポリペプチドをコードするゲノム ポリヌクレオチドの増幅のためのプライマーであるオリゴヌクレオチドにより行 うことができる。これらの特有のオリゴヌクレオチドプライマーは、ジンクフィ ンガー-ヌクレオチド結合性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに隣接 するフランキング領域を同定することに基づいて製造することができる。これら のオリゴヌクレオチドプライマーは、ジンクフィンガー-ヌクレオチド結合性ポ リペプチドをコードするフランキングヌクレオチド配列にハイブリダイズするこ とができる配列、及びそれに相補的な配列を含み、増幅産物に点突然変異を導入 するのに使用することができる。 本発明のプライマーは、ジンクフィンガー-ヌクレオチド結合性ポリペプチド をコードするポリヌクレオチド中の有意な数の核酸についての重合の特異的な開 始を与えるように、充分な長さと適当な配列を有するオリゴヌクレオチドを含む 。具体的には、本明細書で使用する用語「プライマー」は、２以上のデオキシリ ボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを含み、好ましくはそれらを３より多く 含む配列であって、ジンクフィンガー-ヌクレオチド結合性タンパク質鎖に実質 的に相補的なプライマー延長産物の合成を開始できるが、同時に選択された残基 部位において増幅産物に突然変異を導入することもできる配列をいう。合成に影 響を与える実験条件としては、ヌクレオシド三リン酸及び重合と延長のための物 質(例えばDNAポリメラーゼ)の存在、及び適当なバッファー、温度及びpHである 。前記プライマーは増幅の効率を最大にするためには好ましくは１本鎖のもので あるが、２本鎖であってもよい。２本鎖である場合は、延長産物の調製に使用す る前に、まずプライマーを処理して２本の鎖に分離する。好ましくは、プライマ ーはオリゴデオキシリボヌクレオチドである。プライマーは、ヌクレオチドの重 合と延長のための誘導剤の存在下で延長産物の合成を開始するのに充分な長さを 有してい なければならない。プライマーの正確な長さは多くの要因に依存し、例えば温度 、バッファー、ヌクレオチド組成等が挙げられる。オリゴヌクレオチドプライマ ーは通常は15〜22、あるいはそれ以上のヌクレオチドを含むが、それより少ない ヌクレオチドを含むものであってもよい。あるいは、当分野で周知のように、ヌ クレオシド三リン酸の混合物に勾配をつけて(biased)突然変異の形成に影響を与 え、推定ジンクフィンガー-ヌクレオチド結合性ポリペプチドをコードするcDNA のライブラリーを得ることができ、これは例えば結合が転写活性化を阻害するよ うなプロモーター中のもののようなジンクフィンガー-ヌクレオチド結合性モチ ーフへの結合についての機能的アッセイによりスクリーニングすることができる 。 本発明のプライマーは、増幅されるジンクフィンガー-ヌクレオチド結合性タ ンパク質をコードするポリヌクレオチドの各鎖のセグメントと「実質的に」相補 的であるように設計される。これは、重合及びヌクレオチド延長のための物質が 作用できる条件下でプライマーが各鎖とハイブリダイズするのに十分に相補的で なければならないことを意味する。言い換えれば、プライマーは、フランキング 配列とハイブリダイズし、ジンクフィンガー-ヌクレオチド結合性タンパク質を コードするポリヌクレオチドの増幅を可能とするのに十分にフランキング配列と 相補的でなければならない。好ましくは、プライマーはフランキング配列鎖と完 全に相補的である。 本発明のオリゴヌクレオチドプライマーは、使用する反応ステップ数に対し指 数関数的な量のジンクフィンガー-ヌクレオチド結合性タンパク質をコードする ポリヌクレオチドを生成する酵素的連鎖反応である増幅プロセスに使用する。典 型的には、一方のプライマーはジンクフィンガー-ヌクレオチド結合性タンパク 質をコードするボリヌクレオチドのネガティブ（−）鎖と相補的であり、他方の プライマーはポジティブ（＋）鎖と相補的である。プライマーを変性核酸へアニ ーリングさせた後、DNAポリメラーゼＩ（クレノウ）のような酵素とヌクレオチ ドとによる延長によりジンクフィンガー-ヌクレオチド結合性タンパク質配列を 含む（＋）及び（−）鎖が新たに合成される。これらの新たに合成された配列も また鋳型であるので、変性、プライマーアニーリング及び延長のサイクルを繰り 返すことにより、プライマーにより規定される配列（即ち、ジンクフィンガー- ヌクレ オチド結合性タンパク質ポリヌクレオチド配列）が指数関数的に生成される。連 鎖反応の産物は、用いた特異的プライマーの末端に対応する末端を持つ独立した 核酸の二重鎖である。当業者であれば、標的核酸のコピー数を増加させるのに使 用できるその他の増幅方法も公知であろう。これらには、例えば連結反応活性化 転写（LAT）、リガーゼ連鎖反応（LCR）及び鎖置換活性化（SDA）が含まれるが 、PCRが好適な方法である。 本発明のオリゴヌクレオチドプライマーは、従来のホスホトリエステル及びホ スホジエステル法あるいはその自動化された態様のような任意の適当な方法で調 製することができる。そのような自動化された一態様において、ジェチルホスホ ルアミダイドを出発物質として用い、Beaucageら（Tetrahedron Letters，22:18 59-1862，1981）により記載されたように合成することができる。修飾された固 相支持体上でオリゴヌクレオチドを合成する１つの方法が米国特許4,458,066号 に記載されている。本発明に従い使用することができる１つの増幅方法は、米国 特許4,683,202号及び同4,683,195号に記載されたポリメラーゼ連鎖反応（PCR） である。 ペプチド配列の突然変異を得るために線状ファージライブラリーを利用する方 法が、Ladnerらに付与された米国特許5,223,409に開示されている。この特許の 内容は全体を引用により本明細書の一部とする。 本発明の１つの実施形態においては、公知のジンクフィンガータンパク質の１ 以上のフィンガーをコードするDNAに対しヌクレオチド置換をランダムに行い、 転写調節エレメントのような、前記遺伝子を含むDNA上での部位への結合によリ 遺伝子発現を修飾する誘導ポリペプチドを得ることができる。ジンクフィンガー を形成するアミノ酸の修飾以外にも、ジンクフィンガー誘導ポリペプチドはそれ が誘導された野性型タンパク質に含まれるフィンガーの全量より多くまたは少な く含まれるものとすることができる。 突然変異誘発を行うためには任意の部位特異的突然変異誘発の方法を採用でき るが、修飾されるジンクフィンガータンパク質のセグメントをランダム化するの に使用される方法は、好ましくは式NNSまたはNNK（及びその相補物NNM）(ここで SはGまたはCであり、KはGまたはTであり、MはCまたはA（NNKの相補物） であり、NはA、C、GまたはTである)を持つ複数のトリプレットコドンを含む縮重 オリゴヌクレオチドプライマーのプールを利用する。縮重トリプレットコドンに 加え、縮重オリゴヌクレオチドプライマーは、少なくとも１つの末端で野性型ジ ンクフィンガータンパク質をコードするDNAにハイブリダイズするように設計さ れた少なくとも１つのセグメントを含み、当分野においてオーバーラップ延長PC Rとして知られるPCR増幅の連続的なラウンドに使用してプライマープール中のプ ライマーの非縮重領域によって挟まれた縮重の特定の領域を生成する。 cDNAの特定の領域をランダム化するのに使用されるように、オーバーラップPC Rの方法は当分野において周知であり、下記実施例３においてさらに例示する。 オーバーラップPCR反応の縮重産物をプールし、好ましくはサイズ排除クロマト グラフィーまたはゲル電気泳動によってゲル精製し、その後、表面ディスプレー ファージ発現ベクターへ結合させて公知あるいは推定ジンクフィンガー-ヌクレ オチド結合性モチーフに対する後続のスクリーニングのためのライブラリーを形 成する。 縮重プライマーを、当分野においてオーバーラップ延長PCRとして知られるPCR 増幅の連続的なラウンドに使用して、推定ジンクフィンガー誘導DNA結合性ポリ ペプチドをコードするcDNAのライブラリーを作成する。通常誘導ポリペプチドは 、フィンガーの３次元構造を維持するために必要な保存された領域に対応する非 縮重領域により挟まれたDNA（通常フィンガーの先端およびα−ヘリックス領域 にある）に結合するのフィンガーの領域に対応する縮重の領域を含む。 本発明のジンクフィンガー-ヌクレオチド結合性タンパク質の特定の核酸配列 を含むか含んでいると推定される、精製されているかされていない任意の核酸標 本を上述の手順の出発核酸として利用することができる。従って前記方法は、例 えばDNA、メッセンジャーRNAを含むRNAを使用することができ、DNAあるいはRNA は１本鎖でも２本鎖でもよい。RNAを鋳型として使用しようとする場合には、酵 素及び／または鋳型をDNAに逆転写するのに最適な条件を使用する。さらに、DNA 及びRNAのそれぞれの１つの鎖を含むDNA-RNAハイブリットを利用してもよい。核 酸の混合物も使用することができ、あるいは同じかまたは異なるプライマーを用 いて本明細書の先の増幅反応で生成した核酸も使用することができる。増幅さ れる特定の核酸配列、即ちジンクフィンガー-ヌクレオチド結合性タンパク質配 列がより大きな分子の画分であるか、あるいは個々の分子として最初に存在して 、その特定の配列が核酸全体を構成していてもよい。増幅される配列は最初に純 粋な形態で存在する必要はなく、全ヒトDNAや任意の生物のDNAに含まれるような 複合混合物の微量画分でもよい。DNA源は、例えば、原核生物、真核生物、ウィ ルス及び植物を含む。 サンプルの標的核酸配列が２種の鎖を含むときは、鋳型として使用できるよう にするために核酸の鎖を分離することが必要である。鎖の分離は、別のステップ として行ってもよいし、プライマー延長産物の合成と同時に行ってもよい。この 鎖分離は、物理的、化学的あるいは酵素的手段を含む種々の適切な変性条件を用 いて行われる。用語「変性」はそのような手段を全て含む。核酸鎖を分離する１ つの物理的方法は、核酸を変性するまで加熱することを含む。典型的な熱変性は 、80℃〜105℃の範囲の温度で、約1〜10分行う。鎖分離は、ヘリカーゼとして知 られる酵素の種類からの酵素、あるいはヘリカーゼ活性を有する酵素RecAにより 、リボATP(DNAを変性することが知られている)の存在下で誘導することもできる 。ヘリカーゼを用いた核酸の鎖分離に適した反応条件は、Kuhn Hoffmann-Berlin g（CSH-Quantitative Biology，43:63，1978）に記載されており、RecAを用いる ための技術はC．Radding（Ann．Rev．Genetics，16:405-437,1982）に概説され ている。 増幅する配列を含む核酸が１本鎖の場合は、その相補配列は１または２のオリ ゴヌクレオチドプライマーを添加することにより合成される。単一のプライマー を使用する場合は、プライマー延長産物はプライマー、重合のための物質及び以 下に記載する４種のヌクレオシドトリホスフェートの存在下で合成される。生成 物は、１本鎖核酸と部分的に相補であって１本鎖核酸とハイブリダイズして長さ が異なる鎖の二重鎖を生成し、これは次いで１本鎖に分離し、２種の単一の分離 された相補鎖を生成することができる。あるいは、２種のプライマーを１本鎖核 酸に添加し、記載したように反応を行ってもよい。 核酸の相補鎖が分離されると、核酸が最初に２本鎖であったか１本鎖であった かにかかわらず、分離された鎖は別の核酸鎖の合成のための鋳型として使用でき る状態となる。この合成は、プライマーの鋳型へのハイブリダイゼーションが生 じるような条件で行う。通常、合成は緩衝化水溶液中で、好ましくはpH７〜９で 、より好ましくはpH約８で生じる。好ましくは２種のオリゴヌクレオチドプライ マーのモル過剰（ゲノム核酸の場合、通常約108：１プライマー：鋳型）を分離 された鋳型鎖を含むバッファーに添加する。しかし、本発明の方法を診断に適用 した場合には、相補鎖の量は知り得ず、相補鎖の量に対するプライマーの量は正 確には決定することができないといえる。しかし実用上は、増幅する配列が複合 的な長鎖核酸鎖の混合物に含まれる場合は、添加されるプライマーの量は通常相 補鎖（鋳型）の量に対してモル過剰となる。方法の効率を向上させるためには大 きいモル過剰が好ましい。 デオキシリボヌクレオチド三リン酸dATP、dCTP、dGTP及びdTTPを適当量、プラ イマーと共にあるいは別個に合成混合物に添加し、その結果得られた溶液を約90 ℃〜100℃で約１〜10分、好ましくは1〜4分加熱する。この加熱期間の後、溶液 をプライマーのハイブリダイゼーションに好適な温度になるまで冷却する。冷却 した混合物にプライマー延長反応を起こす適当な物質（ここでは「重合のための 物質」という）を加え、当分野において知られた条件下で反応させる。重合のた めの物質は、熱的に安定である他の試薬と共に加えてもよい。この合成（即ち増 幅）反応は、室温から重合のための物質がそれ以上では機能しなくなる温度まで の温度で行うことができる。最も簡便には反応を室温で行う。 重合のための物質は、プライマー延長産物の合成が得られるように機能する任 意の化合物あるいは系とすることができ、酵素が含まれる。この目的に好適な酵 素は、例えば大腸菌DNAポリメラーゼI、大脳菌DNAポリメラーゼのクレノウ断片 、T4 DNAポリメラーゼ、入手可能なDNAポリメラーゼ、ポリメラーゼ突然変異タ ンパク質、逆転写酵素、及び熱安定性酵素（即ち、変性を生じさせるのに十分高 い温度にさらされた後でもプライマー延長を行う酵素）等のその他の酵素を含む 。適当な酵素により、ジンクフィンガー-ヌクレオチド結合性タンパク質核酸鎖 に相補的なプライマー延長産物が生成するように適当な形態でヌクレオチドを組 合せることができる。通常、合成は各プライマーの3'末端で開始され、合成が終 了するまで鋳型鎖に沿って5'方向に進行し、種々の長さの分子を生成する。しか し、上述と同じ方法を用いて合成を5'末端で開始し、他方の方向に進行させる物 質も存在し得る。 新たに合成されたジンクフィンガー-ヌクレオチド結合性ポリペプチド鎖及び その相補核酸鎖は、上述したハイブリダイゼーション条件下で２本鎖分子を形成 し、このハイブリッドを方法の後続のステップで使用する。次のステップでは、 新たに合成された２本鎖分子を、１本鎖分子を与えるための上述の手順のいずれ かを用いた変性条件下に置く。 上記方法を１本鎖分子について繰り返す。必要であれば上述した条件下で反応 を進行させるために、重合のための追加物質、ヌクレオチド及びプライマーを添 加してもよい。同様に、合成は各オリゴヌクレオチドプライマーの一端から開始 され、鋳型の１本鎖に沿って進行し、別の核酸を生成する。このステップの後、 延長産物の半分は２つのプライマーが結合した特異的な核酸配列からなる。 変性及び延長産物合成のステップを、検出に必要な程度までジンクフィンガー -ヌクレオチド結合性タンパク質核酸配列を増幅するのに必要なだけ繰り返す。 生成される特異的核酸配列の量は、指数関数的に蓄積する。 本発明の方法により増幅された配列は、溶液中であるいは固相支持体に結合し た後、PCR、オリゴマー制限処理（Saikiら、Bio/Technology，3:1008-1012，198 5）、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド(ASO)プローブ分析(Connerら、Proc ．Natl．Acad．Sci．USA，80:278，1983)、オリゴヌクレオチド連結アッセイ（O LA）（Landegrenら、Science，241:1077，1988）等の特異的DNA配列の検出に通 常使用される方法を用いて、さらに評価、検出、クローニング、配列決定等する ことができる。DNA分析のための分子技術は概説されている（Landegrenら、Scie nce,242:229-237，1988）。好ましくは、本発明の新規なジンクフィンガー誘導D NA結合性ポリペプチドは、上述の技術により単離することができ、これらの技術 においてはプライマーは例えば置換のようなヌクレオチドの修飾により、ユニー クなジンクフィンガーが生成するようにすることが可能である(より詳しくは実 施例を参照)。 本発明において、ジンクフィンガー-ヌクレオチド結合性ポリペプチドをコー ドするヌクレオチド配列は組換え発現ベクターに挿入することができる。用語「 組 換え発現ベクター」は、ジンクフィンガー誘導ヌクレオチド結合性タンパク質遺 伝子配列の挿入あるいは導入により操作されたプラスミド、ウィルスあるいは当 分野で知られた他のビヒクルを意味する。そのような発現ベクターは、宿主に挿 入された遺伝子配列の効果的な転写を促進するプロモーター配列を含む。発現ベ クターは、典型的には、複製起点、プロモーター、並びに形質転換された細胞の 表現型選択を可能とする特異的遺伝子を含む。本発明での使用に適したベクター としては、限定するものではないが、細菌における発現のためのT7に基づく発現 ベクター（Rosenbergら、Gene 56:125，1987）、哺乳動物細胞における発現のた めのpMSXND発現ベクター（Lee及びNathans、J．Biol．Chem．263:3521，1988） 及び昆虫細胞における発現のためのバキュロウィルス誘導ベクターが挙げられる 。DNAセグメントを、調節エレメント、例えばプロモーター（例えばT7、メタロ チオネインI、ポリヘドリンプロモーター）に機能的に連結されたベクター中に 存在させることができる。 本発明の新規なジンクフィンガー-ヌクレオチド結合性ポリペプチドをコード するDNA配列は、適当な宿主細胞へのDNA導入によってin vitroで発現させること ができる。「宿主細胞」とは、その中でベクターが増殖し、そのDNAが発現され る細胞である。この用語は、対象とする宿主細胞のいかなる子孫をも含む。全て の子孫は、複製過程で突然変異が起こり得ることから、親細胞と同一ではないか もしれないことは理解されよう。しかし「宿主細胞」という言葉を使うとき、そ のような子孫をも含む。安定な導入の方法、換言すれば外来DNAを連続的に宿主 内に維持する場合の方法は当分野において知られている。 組換えDNAによる宿主細胞の形質転換は、当業者に周知の慣用の技術により行 うことができる。宿主が大腸菌のような原核生物の場合は、指数増殖相の後に収 集された細胞からDNA取込み能力のあるコンピテント細胞を調製し、その後当分 野において周知のCaCl2法で処理することができる。あるいは、MgCl2、RbClを使 用することもできる。形質転換は、宿主細胞のプロトプラストの形成後あるいは エレクトロポレーションによって行うこともできる。 宿主が真核細胞である場合、リン酸カルシウム共沈、マイクロインジェクショ ン、エレクトロポレーションといった慣用の機械的方法、リポソーム封入プラス ミドまたはウイルスベクターの挿入のようなDNAのトランスフェクション方法を 使用し得る。 ジンクフィンガー誘導ヌクレオチド結合性コード配列を発現するために、種々 の宿主−発現ベクター系を使用し得る。このようなものとしては、限定するもの ではないが、ジンクフィンガー誘導ヌクレオチド結合性ポリペプチドコード配列 を含む組換えバクテリオファージDNA、プラスミドDNAもしくはコスミドDNA発現 ベクターで形質転換された細菌のような微生物；ジンクフィンガー誘導ヌクレオ チド結合性コード配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母；ジ ンクフィンガー誘導DNA結合性コード配列を含む組換えウイルス発現ベクター（ 例えば、カリフラワーモザイクウイルス、CaMV；タバコモザイクウイルス、TMV ）を感染させた、または組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミ ド）で形質転換した植物細胞系；ジンクフィンガー誘導ヌクレオチド結合性コー ド配列を含む組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）を感染 させた昆虫細胞系；またはジンクフィンガー誘導ヌクレオチド結合性コード配列 を含む組換えウイルス発現ベクター（例えばレトロウイルス、アデノウイルス、 ワクシニアウイルス）を感染させた動物細胞系、または安定な発現のために遺伝 子操作された形質転換動物細胞系等が含まれる。グリコシル化が重要であり得る 場合は、翻訳修飾及び翻訳後修飾を与える発現系を用いてもよく、例えば、哺乳 動物、昆虫、酵母または植物の発現系が挙げられる。 使用する宿主ベクター系に応じて、多くの適切な転写及び翻訳エレメント、例 えば構成性及び誘導性プロモーター、転写エンハンサーエレメント、転写ターミ ネーター等の任意のものを発現ベクターに使用することができる(Bitterら、Met hods in Enzymology，153:516-544，1987参照)。例えば、細菌系でクローニング する場合は、バクテリオファージλのpL、plac、ptrp、ptac(ptrp-lacハイブリ ッドプロモーター)等のような誘導性プロモーターのいずれをも使用し得る。哺 乳動物細胞系でクローニングする場合は、哺乳動物細胞のゲノムから誘導される プロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）または哺乳動物のウイ ルスから誘導されるプロモーター（例えば、レトロウイルスのLTR；アデノウイ ルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス7.5Kプロモーター）を使用するこ とができる。組換えDNAまたは合成法により製造されるプロモーターも、挿入ジ ンクフィンガー-ヌクレオチド結合性ポリペプチドコード配列の転写を与えるた めに使用し得る。 細菌系においては、発現されたジンクフィンガー誘導ヌクレオチド結合性ポリ ペプチドに意図される用途に応じていくつかの発現ベクターを有利に選択するこ とができる。例えば、大量に生産しなければならない場合は、容易に精製され得 る融合タンパク質産物の高レベルの発現を導くベクターが望ましい場合がある。 タンパク質の回収に有用な切断部位を含むように遺伝子工学的に作製されたもの が好ましい。そのようなベクターとしては、限定するものではないが、ハイブリ ッドジンクフィンガー-lacZタンパク質が生産されるようにジンクフィンガー-ヌ クレオチド結合性タンパク質コード配列をlacZコード領域とインフレームでベク ター中に結合し得る大腸菌発現ベクターpUR278(Rutherら、EMBO J.，2:1791，19 83);pINベクター(Inouye & Inouye，Nucleic Acid Res．13;3101-3109，1985;Va n Heeke & Schuster，J．Biol．Chem．264:5503-5509，1989)等が挙げられる。 酵母においては、構成性または誘導性プロモーターを含む多数のベクターを使 用し得る。概説は、Current Protocols in Molecular Biology，Vol．2，1988， Ed．Ausubelら、Greene Publish．Assoc．& Wiley Interscience．Ch．13;Grant ら、1987，Expression and Secretion Vectors for Yeast，Methods in Enzymol ogy，Eds．Wu & Grossman，31987，Acad．Press，N.Y.，Vol．153，pp.516-544; Glover，1986，DNA Cloning，Vol II，IRL Press，Wash.，D.C.，Ch．3;及びBit ter，1987，HeterologousGene Expression in Yeast，Methods in Enzynmlogy， Eds．Berger & Kimmel，Acad．Press，N.Y.，Vol．152，pp．673-684;及びThe M olecular Biology of the Yeast Saccharomyces，1982，Eds．Strathernら、Col d Spring Harbor Press，Vols．Ｉ及びIIを参照されたい。ADHまたはLEU２のよ うな構成性酵母プロモーターまたはGALのような誘導性プロモーターを使用する ことができる(Cloning in Yeast，Ch．3，R．Rothstein，DNA Cloning Vol．11 ，A Practical Approach，Ed．DM Glover．1986，IRL Press，Wash.，D.C.)。あ るいは、外来DNA配列の酵母染色体への組み込みを促進するベクターを使用する ことができる。 植物発現ベクターを使用する場合は、ジンクフィンガー-ヌクレオチド結合性 ポ リペプチドコード配列の発現は、多くのプロモーターの任意のものにより誘導す ることができる。例えばCaMVの35SRNA及び19SRNAプロモーターのようなウイルス プロモーター(Brissonら、Nature，310:511-514，1984)、またはTMVに対するコ ートタンパク質プロモーター（Takamatsuら、EMBO J.，6:307-311，1987）を使 用し得る。あるいは、RUBISCOの小サブユニットのような植物プロモーター(Coru zziら、EMBO J．3:1671-1680，1984;Broglieら、Science 224:838-843，1984); 熱ショックプロモーター、例えば、ダイズhsp17.5-Eまたはhsp17.3-B(Gurleyら 、Mol．Cell Biol.，6:559-565，1986)を使用してもよい。これらの構築物は、T iプラスミド、Riプラスミド、植物ウイルスベクター、直接DNA形質転換、マイク ロインジェクション、エレクトロポレーション等を用いて植物細胞に導入するこ とができる。このような技術の概説については、例えばWeissbach & Weissbach ，Methods for Plant Molecular Biology，Academic Press，NY，Section VIII ，pp．421-463，1988:及びGrierson & Corey，Plant Molecular Biology，2d Ed .，Blackie，London，Ch．7-9．1988を参照。 本発明のタンパク質の発現に使用することのできる別の発現系は、昆虫系であ る。そのようの系の１つにおいては、Autographa californica核ポリヘドロシス ウイルス(AcNPV)が外来遺伝子を発現するためのベクターとして使用される。こ のウイルスはSpodoptera frugiperda細胞中で増殖する。ジンクフィンガー-ヌク レオチド結合性ボリペプチドコード配列を、ウイルスの非必須領域(Spodoptera frugiperdaの場合は例えばポリヘドリン遺伝子)にクローニングし、AcNPVプロモ ーター（例えばポリヘドリンプロモーター）の制御下に置く。ジンクフィンガー -ヌクレオチド結合性ポリペプチドコード配列がうまく挿入できれば、ポリヘド リン遺伝子が不活性化され、非閉塞(non-occluded)組換えウイルス(すなわちポ リヘドリン遺伝子によりコードされたタンパク質コートを欠くウイルス)が生産 される。その後、これらの組換えウイルスを使用して、挿入した遺伝子を発現さ せる細胞に感染させる(例えばSmithら、J．Biol．46:584，1983;Smith，米国特 許第4,215,051号)。 真核生物系、好ましくは哺乳動物発現系は、発現された哺乳動物タンパク質の 翻訳後修飾が起こることを可能とする。従って、一次転写産物の適当なプロセシ ング、グリコシル化、リン酸化、そして有利には遺伝子産物の分泌のための細胞 機構を有する真核細胞、例えば哺乳動物細胞が、ジンクフィンガー誘導-ヌクレ オチド結合性ポリペプチドの発現のための好ましい宿主である。そのような宿主 細胞系としては、限定するものではないが、CHO、VERO、BHK、HeLa、COS、MDCK 、-293及びWI38が挙げられる。 発現を起こす組換えウイルスまたはウイルスエレメントを利用する哺乳動物細 胞系を遺伝子工学的に作製することができる。例えば、アデノウイルス発現ベク ターを使用する場合は、ジンクフィンガー誘導ヌクレオチドのコード配列を、ア デノウイルス転写／翻訳調節複合体、例えば、後期プロモーター及び３分節リー ダー配列に結合することができる。その後、このキメラ遺伝子をin vitroまたは in vivo組換えによりアデノウイルスゲノムに挿入することができる。ウイルス ゲノムの非必須領域（例えば領域E1またはE3）への挿入により、生存可能で、感 染した宿主内でジンクフィンガーポリペプチドを発現することができる組換えウ イルスが得られる(例えばLogan & Shenk，Proc Natl．Acad．Sci USA 81:3655-3 659，1984)。あるいは、ワクシニアウイルス7.5Kプロモーターを使用してもよい (例えばMackettら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA，79:7415-7419，1982;Mackett ら、J．Virol．49:857-864，1984;Panicaliら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA，7 9 :4927-4931，1982を参照)。特に、染色体外エレメントとして複製する能力を有 するウシパピローマウイルス系のベクターが有利である(Sarverら、Mol．Cell． Biol．1:486，1981)。このDNAをマウス細胞に導入した後、短時間でこのプラス ミドは細胞当たり約100〜200コピーに複製される。挿入されたcDNAの転写は、プ ラスミドの宿主染色体への組み込みは必要なく、それにより高レベルの発現が得 られる。これらのベクターは、プラスミド中にneo遺伝子のような選択マーカー ませることにより安定な発現に使用することができる。あるいは、ジンクフィン ガー-ヌクレオチド結合性タンパク質遺伝子を宿主細胞内に導入し発現を誘導す ることのできるベクターとして使用するためにレトロウイルスゲノムを修飾する ことができる(Cone & Mulligan，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 81:6349-6353，1 984)。 また、限定するものではないが、メタロチオニンIIAプロモーター及び熱ショ ックプロモーター等の誘導性プロモーターを用いて、高レベルの発現を得ること もできる。 組換えタンパク質の長期にわたる高収量の生産のためには、安定な発現が好ま しい。ウイルスの複製起点を含む発現ベクターを用いるのではなく、適当な発現 調節因子（例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、 ポリアデニル化部位等）により制御されるcDNA及び選択マーカーで宿主細胞を形 質転換することができる。組換えプラスミド中の選択マーカーは選択に対する耐 性を付与し、細胞がそれらの染色体にプラスミドを安定に組み込み、増殖してフ ォーカスを形成することを可能とし、細胞系へクローニングおよび拡大増殖させ ることができる。例えば、外来DNAの導入に続いて、遺伝子操作された細胞を富 栄養化培地で1〜2日間増殖させ、その後選択培地に切り換える。多くの選択系を 使用することができ、限定するものではないが、例えば単純ヘルペスウイルスチ ミジンキナーゼ(Wiglerら、Cell 11:223，1977)、ヒポキサンチン−グアニンホ スホリボシルトランスフェラーゼ(Szybalska & Szybalski，Proc．Natl．Acid． Sci．USA，48:2026，1962)、及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(L owyら、Cell，22:817，1980)遺伝子が挙げられ、これらはそれぞれtk-、hgprtま たはaprt細胞で使用することができる。また、代謝拮抗物質耐性付与遺伝子を選 択の基礎として使用することができ、そのような遺伝子として、メトトレキセー トに対する耐性を付与するdhfr(Wiglerら、Natl．Acad．Sci．USA，77:3567，19 80;O'Hareら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA，78:1527，1981);マイコフェノール 酸に対する耐性を付与するgpt(Mulligan & Berg，Proc．Natl．Acad．Sci．USA ，78:2072，1981);アミノグリコシドG-418に対する耐性を付与するneo(Colberre -Garapinら、J．Mol．Biol.，150:1，1981);及びヒグロマイシンに対する耐性を 付与するhygro(Santerreら、Gene，30:147，1984)が挙げられる。近年、別の選 択遺伝子が記載されており、すなわち、細胞がトリプトファンの代わりにインド ールを利用できるようにするtrpB;細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノールを 利用できるようにするhisD(Hartman & Mulligan，Proc．Natl．Acad．Sci．USA ，85:804，1988);及びオルニチンデカルボキシラーゼインヒビター、2-(ジフル オロメチル)-DL-オルニチン、DFMOに対する耐性を付与するODC(オルニチ ンデカルボキシラーゼ)(McConlogue L.，Current Communications in Molecular Biology，Cold Spring Harbor Laboratory ed.，1987)である。 本発明によって提供された、微生物で発現させたタンパク質もしくはその断片 の単離と精製は、調製用クロマトグラフィー、およびモノクローナル抗体もしく はポリクローナル抗体を用いることを含む免疫学的分離法などの従来法によって 行うことができる。本発明で提供される抗体は、本発明のジンクフィンガー-ヌ クレオチド結合性タンパク質と免疫学的に反応する。異なるエピトープ特異性を 有するプールされたモノクローナル抗体から本質的になる抗体、および個別のモ ノクローナル抗体調製品が提供される。モノクローナル抗体はタンパク質の断片 を含有する抗原から当業界では良く知られた方法によって作られる(Kohlerら，N ature，256:495，1975;分子生物学における今日のプロトコールCurrent Protoco ls in Molecular Biology，Ausubelら編，1989)。 本発明はまた、ジンクフィンガー-ヌクレオチド結合性モチーフを含んでいる 細胞性ヌクレオチド配列が関わっている細胞増殖性の障害の治療のための遺伝子 治療をも提供する。そのような治療法では、その治療的効果はジンクフィンガー -ヌクレオチド結合性ポリペプチドポリヌクレオチドを増殖性障害を有する動物 の細胞中に導入することによって得られている。ジンクフィンガー-ヌクレオチ ド結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドの送達は、例えばキメラウイ ルスなどの組換え発現ベクターもしくはコロイド性分散システムを用いて行うこ とができる。 「細胞増殖性障害」という用語は、しばしば周囲の組織とは異なる形態学的な 外観を示す悪性のおよび非悪性の細胞の集合を意味する。細胞増殖性障害はおそ らく遺伝子発現レベルの増加もしくは減少をまねく転写障害であろう。その障害 の原因は細胞起源もしくはウイルス起源であろう。ジンクフィンガー-ヌクレオ チド結合性ポリペプチドを用いる遺伝子治療は、ウイルスが誘発する、例えばヒ トの細胞増殖性障害の治療に用いることができ、また植物でも用いることができ る。植物細胞を、例えばウイルスに対して抵抗性とするために、療法を予防的な ものにすることができ、あるいはウイルス産物の産生を防ぐことにより細胞内で 確立 した感染を改善するための治療的なものとすることができる。 ジンクフィンガー-ヌクレオチド結合性ポリペプチドをコードするポリヌクレ オチドは、例えば肺、乳房、リンパ球系、消化管、および泌尿生殖器などの各種 の臓器系の悪性腫瘍、ならびに大多数の大腸癌、腎細胞癌、前立腺癌、肺の非小 細胞癌、小腸癌、及び食道癌などの悪性腫瘍を含む腺癌の治療に有用である。ジ ンクフィンガー-ヌクレオチド結合性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチ ドは、乾癬、尋常性天疱瘡、ベーチェット症候群、および脂質性組織球増殖症な どの非悪性の細胞増殖性疾患の治療にも有用である。本質的には、プロモーター 、構造遺伝子、もしくはRNAを含んでいるジンクフィンガー-ヌクレオチド結合性 モチーフの活性化と病因論的に見て関連しているいかなる疾患も、ジンクフィン ガー由来のヌクレオチド結合ポリペプチドの誘導体もしくは変異体をコードする ポリヌクレオチドによる治療に感受性を有するものと考えられる。 遺伝子治療に用いることのできる各種のウイルスベクターとしてはアデノウイ ルス、ヘルペスウイルス、ワクシニア、もしくは、好ましくはレトロウイルスな どのRNAウイルスがある。好ましくは、レトロウイルスベクターはマウスまたは 鳥類のレトロウイルスから由来したものである。単一の外来遺伝子を挿入しうる レトロウイルスベクターの例としては次のものが挙げられるが、それらに限定さ れない：モロニーマウス白血病ウイルス(MoMuLV)、ハーヴェイマウス肉腫ウイル ス(HaMuSV)、マウス乳癌ウイルス(MuMTV)、およびラウス肉腫ウイルス(RSV)。多 数の他のレトロウイルスベクターは複数の遺伝子を取り込むことができる。これ らのベクターはすべて、形質導入された細胞の同定および発生ができるように、 選択可能なマーカーの遺伝子を移送もしくは取り込むことができる。対象のジン クフィンガー由来DNA結合性ポリペプチド配列をウイルスベクター中に、例えば 特定の標的細胞上の受容体へのリガンドをコードする別の遺伝子とともに挿入す ることによって、そのベクターは標的特異的なものとなる。レトロウイルスベク ターは、例えばあるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを挿入することに よって標的特異的なものに作ることができる。好ましいターゲティングはレトロ ウイルスベクターを標的とする抗体を用いることによって作ることができる。当 業者であれば実験を行わなくとも、ジンクフィンガー-ヌクレオチド結合性タン パ ク質ポリヌクレオチドを含んでいるレトロウイルスベクターの標的特異的送達を 可能とするためにレトロウイルスゲノム内に挿入することのできる特定のポリヌ クレオチド配列がわかるかもしくは容易に探り当てることができるであろう。 組換えレトロウイルスは不完全なものであるので、感染性のあるベクター粒子 を作成するためには助力を必要とする。その助力は例えばLTR内にある制御配列 のコントロールのもとにレトロウイルスの構造遺伝子のすべてをコードするプラ スミドを含んでいるヘルパー細胞系を用いることによって提供されうる。これら のプラスミドはパッケージングメカニズムがカプシド形成のためにRNA転写物を 認識することができるようにするヌクレオチド配列を欠いている。パッケージン グシグナルを欠失しているヘルパー細胞系としては例えばΨ2、PA317、およびPA 12が挙げられるがそれらに限定されない。これらの細胞系ではパッケージされる ゲノムはないので空のウイルス粒子を産生する。レトロウイルスベクターはパッ ケージングシグナルが天然のままであるが構造遺伝子が他の対象とする遺伝子に 置き換えられているような細胞に導入されれば、そのベクターはパッケージされ てベクターウイルス粒子が産生される。大量のキメラレトロウイルス粒子を産生 させる目的で、この方法で産生させたベクターウイルス粒子をNIH 3T3細胞など の組織細胞系に感染させるために用いることができる。 ジンクフィンガー由来DNA結合性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド を標的に送達させるためのもう一つのシステムはコロイド分散システムである。 コロイド分散システムとしては巨大分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア 、ビーズ、ならびに油中水型乳剤、ミセル、混合ミセル、およびリポソームなど の脂質ベースのシステムがある。本発明で好ましいコロイドシステムはリポソー ムである。リポソームはin vitroおよびin vivoでの送達ベヒクルとして有用な 人工的な膜小胞である。大きな単層小胞(LUV)、その大きさは0.2-4.0umの範囲に あるが、それは大きな巨大分子を含んだ水性バッファーを大きなパーセンテージ で被包することができることが示されている。RNA、DNAおよび天然のウイルス粒 子を被包してその水性の内部に入れ、生物学的に活性な形で細胞に送達させるこ とができる(Fraleyら，Trends Biochem．Sci.，6:77，1981)。リポソームは哺乳 類細胞に加えて植物、酵母、及び細菌細胞中でのポリヌクレオチド送達のために も用いられてきた。リポソームを効率的な遺伝子移送ベヒクルとするためには下 記の特性があるべきである:(1)対象となる遺伝子の生物学的活性を減弱させるこ となくその遺伝子を高効率で被包すること;(2)標的でない細胞に比べて標的細胞 に対しより優先的かつ実質的な結合を形成すること;(3)小胞の水性内容物を標的 細胞の細胞質へ高効率で送達すること;および(4)遺伝情報の正確かつ効果的な発 現(Manninoら，Biotechniques，6:682，1988)。 リポソームの組成は通常はリン脂質、特に相転移温度の高いリン脂質の組み合 わせであり、通常はステロイド、特にコレステロールと組み合わせる。その他の リン脂質もしくはその他の脂質も用いることができる。リポソームの物理的特性 はpH、イオン強度、および２価の陽イオンの存在によって変わる。 リポソームの製造に有用な脂質の例としては、ホスファチジルグリセロール、 ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミ ンなどのホスファチジル化合物、スフィンゴ脂質、セレブロシド、およびガング リオシドなどがある。とりわけ有用なものはジアシルホスファチジルグリセロー ルで、それは脂質部分に14-18個の炭素原子があり、とりわけ16-18個の炭素原子 のものが有用であり、その分子は飽和されている。リン脂質の実例を挙げれば卵 のホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、およびジステ アロイルホスファチジルコリンが挙げられる。 リポソームによるターゲッティングは解剖学的および作用機作の要素に基づい て分類されている。解剖学的分類は選択性のレベルに基づいたもので、例えば臓 器特異的、細胞特異的、細胞内装置特異的などである。作用機作に基づくターゲ ッティングはそれが受動的であるかもしくは能動的であるかによって区別される 。受動的ターゲッティングは、リポソームが洞様毛細血管を含んでいる臓器の網 内系(RES)に分布するという本来の性質を利用するものである。他方、能動的タ ーゲッティングは、リポソームをモノクローナル抗体、糖、糖脂質、もしくはタ ンパク質などの特定のリガンドとカプリングさせるか、または天然に起こる局在 部位以外の臓器および細胞のタイプに対するターゲッティングができるようにす るためにリポソームの組成もしくはサイズを変えることによって、リポソームを 改変することである。 標的を定めた送達システムの表面は各種のやり方で改変することができる。リ ポソーム性標的送達システムの場合には、脂質基は標的を狙うリガンドをリポソ ームの二重層に安定な形で維持させておくために脂質二重層に取り込むことがで きる。脂質鎖と標的を狙うリガンドとを結びつけるために各種の連結基を用いる ことができる。 一般的には、標的送達システムの表面に結合された化合物は、その標的送達シ ステムが所望の細胞を見つけ出しその上に「ホームイン」することができるよう なリガンドおよび受容体である。リガンドは別の化合物、例えば受容体と結合す るいかなる化合物であっても良い。 一般的には、特定のエフェクター分子と結合する膜表面タンパク質は受容体と 呼ばれる。本発明においては、抗体は好ましい受容体である。抗体はリポソーム が特定の細胞表面のリガンドを標的として狙うように用いられる。例えば、ある 種の抗原は腫瘍細胞上に特異的に発現されており、それは腫瘍関連抗原(TAA)と 呼ばれているが、抗体-ジンクフィンガー-ヌクレオチド結合性タンパク質-含有 リポソームが悪性腫瘍を標的として狙うようにするためにそれらの抗原を用いる ことができる。ジンクフィンガー-ヌクレオチド結合性タンパク質遺伝子産物は その作用において、細胞タイプに関しては区別して作用することはできないので 、標的送達システムはランダムに非特異的なリポソームを注入することに比べは るかに改善されたものとなる。リポソームの二重層にポリクローナルもしくはモ ノクローナル抗体のいずれかを共有結合で結合させるためには多数の方法を用い ることができる。抗体を用いて標的を狙うリポソームには、モノクローナルもし くはポリクローナル抗体、またはFabもしくはF(ab')2などのそれらの抗体のフラ グメントを、それらが標的細胞上の抗原性エピトープに効率的に結合しうるもの である限りは用いることができる。リポソームはまた、ホルモンもしくはその他 の血清中の因子に対する受容体を発現している細胞を標的とすることもできる。 別の実施形態においては、本発明は、細胞性のヌクレオチド配列と結合する、 単離ジンクフィンガー-ヌクレオチド結合性ポリペプチド変異体を得る方法を提 供するが、その方法はまず第一に、第一の細胞性ヌクレオチド配列と結合しその ヌクレオチド配列の機能を調節するジンクフィンガー-ヌクレオチド結合性ポリ ペプチド内のアミノ酸を同定することからなる。第二に、第一ステップで同定さ れたアミノ酸をランダムに置き換えたポリペプチド変異体をコードする発現ライ ブラリーを作成する。第三に、そのライブラリーを適当な宿主細胞で、その宿主 細胞は当業者であれば自明のものであるが、その宿主細胞で発現させ、最後に、 第二のヌクレオチド配列と結合しその機能を調節するようなポリペプチド変異体 を産生する１つのクローンを単離する。本発明には上述の方法で産生されたジン クフィンガー-ヌクレオチド結合性ポリペプチド変異体をも含む。 好ましくは、本明細書の実施例に述べられているファージ表面発現システムが ライブラリーとして用いられる。ファージライブラリーは、ジチオスレイトール などの還元剤で処理されることによりファージ表面上での発現産物の適切な折リ 畳みが得られる。そのライブラリーは、ジンクフィンガー-ヌクレオチド結合性 ポリペプチド変異体をコードし、好ましくは本方法の第一ステップで決定したア ミノ酸に対応する位置の配列の縮重トリプレットコドンを含むプライマーを用い たPCRによってランダマイズされたポリヌクレオチド配列から作られる。それら の縮重トリプレットコドンはNNSもしくはNNKの式で表すことの出来るもので、S はGもしくはCを、KはGもしくはTを示し、NはA,C,G,もしくはTからなる群から独 立に選択されたものである。 細胞性ヌクレオチド配列の機能の調節としては、とりわけそのヌクレオチド配 列がプロモーターである場合には、細胞性ヌクレオチド配列に機能しうる形で連 結された遺伝子の転写の増強もしくは抑制である。また、調節には構造遺伝子ま たはウイルスDNAもしくはRNA配列内部のヌクレオチド配列の転写の抑制も含まれ る。また、調節にはmRNAの翻訳の阻害も含まれる。 さらに、本発明は、細胞増殖性障害を治療する方法を開示しており、それはジ ンクフィンガー-ヌクレオチド結合性モチーフを含むヌクレオチド配列の機能を 細胞内で調節するために、ジンクフィンガー-ヌクレオチド結合性ポリペプチド をコードするポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクターをex vivoで細胞内へ 導入することによるものである。細胞増殖性障害は上述したような種々の障害か らなるものであり、それらは典型的には遺伝子の転写レベルの減弱もしくは増加 を伴うものである。本発明の方法はそのような遺伝子発現がプロモーター、構造 遺 伝子、もしくはRNAのいずれのレベルで起こっているものであろうとも、その発 現を調節するための技法を提供する。本方法は、障害を有する対象からの組織サ ンプルの採取、組織サンプルからの造血細胞もしくはその他の細胞の単離、なら びにジンクフィンガー-ヌクレオチド結合性タンパク質をコードするDNAおよび所 望により標的特異的遺伝子を含んでいる組換え発現ベクターを単離した細胞と接 触させることからなる。所望により、細胞を対象に再導入する前に、細胞増殖を 刺激するために、その細胞を例えばインターロイキン-2などの増殖因子で処理す ることができる。再導入された場合にはその細胞はそれが単離されたもとの細胞 群を特異的に標的とする。このような方法で、ジンクフィンガー-ヌクレオチド 結合性ポリペプチドの抑制転移活性(trans-repressing activity)は対象の体内 での望ましくない細胞増殖を阻害もしくは抑制するために用いることができる。 ある特定の場合においては細胞内でのヌクレオチド配列の調節は細胞性ヌクレオ チド配列と機能しうる形で連結された遺伝子の転写の抑制もしくは増強を意味し ている。好ましくはその対象はヒトである。 組換えレトロウイルスベクターの別の用法は、ウイルスを含有する細胞の皮膚 移植による宿主へのポリヌクレオチド配列の導入からなるものである。強力なハ ウスキーピング遺伝子プロモーターが転写をドライブするために用いられている 場合には繊維芽細胞由来の細胞を用いて、埋め込まれた外来遺伝子の長期にわた る発現を行うことができる。例えばジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)遺伝子プロ モーターを用いることができる。繊維芽細胞などの細胞は、例えば末端切断型お よび/または変異誘発性化されたジンクフィンガー-ヌクレオチド結合性タンパク 質のような対象の遺伝子を、例えば腫瘍関連抗原(TAA)のような特異的ターゲッ ティングができるようにする遺伝子、および強力なプロモーターとともに含有す るレトロウイルス構築物を含んでいるウイルス粒子で感染させることができる。 感染した細胞を、レシピエントの皮膚の結合組織中に移植しうるコラーゲンのマ トリクス中に包埋させることができる。レトロウイルスが増殖しそのマトリクス から逃れて出ていくにつれてそれは特異的に標的細胞集団に感染する。このよう なやり方で移植によって細胞増殖性障害を示している細胞内での抑制転移ジンク フィンガー-ヌクレオチド結合性ポリペプチドの産生量が増加する結果となる。 本発明の新規ジンクフィンガー-ヌクレオチド結合性タンパク質は、プロモー ター、構造遺伝子、もしくはRNAレベルのいずれにおいても転写活性化もしくば 翻訳を調節するものであるが、これは植物種においても同様に用いることができ る。ある植物が例えば特定の細菌性もしくはウイルス性病原体に対して抵抗性と なるようにトランスジェニック植物を作ることができる。植物に核酸を移送し発 現させる方法は当業界では良く知られている。（Hiattら，米国特許第5,202,422 号、これは参照により本明細書に組み入れているが、例えばこれを参照せよ。） さらなる実施形態においては、本発明は、対象のジンクフィンガー-ヌクレオ チド結合性モチーフと結合するジンクフィンガー-ヌクレオチド結合性ポリペプ チドから由来する調節ポリペプチドを同定する方法を提供するが、その方法は、 第一の誘導性プロモーターに機能しうる形で連結された推定される調節タンパク 質をコードするヌクレオチド配列、および第二の誘導性プロモーターに機能しう る形で連結されたレポーター遺伝子およびジンクフィンガー-ヌクレオチド結合 性モチーフを含む構成成分をインキュベートすることを含むものであり、そのイ ンキュベーションはそれらの構成成分が相互作用するのに十分な条件下で行われ 、レポーター遺伝子の発現で推定される調節タンパク質の効果を測定するもので ある。 「調節」という用語は、ジンクフィンガー-ヌクレオチド結合性モチーフを含 んでいるプロモーターからの発現が過剰に活性化された場合の阻害もしくは抑制 、またはそのようなプロモーターの活性化が低すぎる場合にそのプロモーターか らの発現を増加もしくは増強させることを意味する。アラビノースプロモーター などの第一の誘導性プロモーターは、推定される調節ポリペプチドをコードする ヌクレオチド配列に機能しうる形で連結される。ラクトースプロモーターなどの 第二の誘導性プロモーターはジンクフィンガー由来のDNA結合性モチーフに機能 しうる形で連結されその後にベーターガラクトシダーゼなどのレポーター遺伝子 が付けられる。構成要素のインキュベーションはin vitroもしくはin vivoで行 うことができる。in vivoでのインキュベーションとしては、大腸菌(E.coli)な どの原核細胞もしくは細胞などの真核細胞がある。アッセイを進めることができ るような条件としてはアラビノースおよびラクトースなどの物質の存在下でのイ ン キュベーションが挙げられ、それらはそれぞれ第一および第二の誘導性プロモー ターを活性化することによって、推定されるトランス−調節(trans-modulating) タンパク質をコードするヌクレオチド配列の発現ができるようにする。推定され る調節タンパク質が第二の誘導性プロモーターと機能しうる形で連結しているジ ンクフィンガー-ヌクレオチド結合性モチーフに結合しているかどうか、および その活性に影響を与えているかどうかはレポーター遺伝子の発現によって計測さ れる。例えばレポーター遺伝子がβ-ガラクトシダーゼ遺伝子である場合には、 青色もしくは白色のプラークの存在が、推定される調節タンパク質がそのプロモ ーターからの遺伝子の発現を増強しているのかもしくは阻害しているのかをそれ ぞれ示している。プロモーターからの発現機能を評価するために一般的に用いら れているその他のアッセイ法としては、クロラムフェニコールアセチルトランス フェラーゼ(CAT)アッセイを含むが、それらは当業者には知られたものである。 原核細胞システムおよび真核細胞システムはともに用いることができる。 本発明は新規のジンクフィンガー-ヌクレオチド結合性ポリペプチド誘導体も しくは変異体を同定し、そのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を同定 するために有用である。その方法では野生型ジンクフィンガータンパク質のフィ ンガーを、それらがそのタンパク質でもともと認識されるような配列以外のヌク レオチド配列(それがDNAもしくはRNAのいずれであっても)を認識するように、変 えることを要する。例えば、既知のジンクフィンガータンパク質を、ヒト免疫不 全症ウイルス(HIV)のプロモーター領域(LTR)を認識し、それに結合し、不活化さ せるような新規のジンクフィンガー-ヌクレオチド結合性ポリペプチドを産生す るように調節することがおそらく望ましいであろう。タンパク質を同定した後、 その部位から通常は活性化される転写を抑制するようなそのタンパク質の末端切 断型が産生される。HIVにおいてはプロモーター内でジンクフィンガー-ヌクレオ チド結合性モチーフの標的となる部位はCTG-TTG-TGTである。例えばzif268の３ つのフィンガーは実施例の中で述べているように変異誘発性化される。それらの フィンガーは同一のタンパク質上で独立に変異誘発性化されるか(1つずつ)、ま たは独立にもしくは「ピース別に」３種類の異なるzif268分子が変異誘発性化さ れた後に再連結される。これらの２つの方法のうちの１つが好ましいとはいえ、 代替法では３つのフィンガーを同時に変異誘発性とすることができるであろう。 変異誘発後、ファージディスプレイライブラリーを構築し、対象の結合部位を含 む適切なオリゴヌクレオチドでスクリーンする。フィンガーが同一タンパク質上 で独立に変異誘発性化されている場合には、シーケンシャルライブラリーが構築 され、各ライブラリー構築後にパニングが行われる。例えば、zif268ではフィン ガー3のライブラリーが構築され、フィンガー3に特異的なオリゴとともにパニン グされる；このスクリーンで陽性を示したクローンを集めフィンガー2ライブラ リーを作るために用いる(フィンガー3ライブラリーDNAを鋳型として用いて);パ ニングはフィンガー32特異的オリゴを用いて行われる；陽性クローンからDNAを 集め、フィンガー1ライブラリーの構築のための鋳型として用いる；最後に３つ の新しいフィンガーを持つタンパク質の選択をフィンガー321特異的オリゴを用 いて行う。この方法で、HIVプロモーターを認識し、それに結合し、それからの 転写を抑制する新規のジンクフィンガー由来DNA結合性タンパク質が同定される 。この新タンパク質の各種のフィンガーの末端切断、突然変異、もしくは拡張を 引き続いて行うことにより、HIVプロモーターからの転写を抑制するタンパク質 が得られる。 本発明は、実施例7-13において、Zif268の調節の説明を上述のとおり提供して いる。それ故、別の実施形態においては、本発明は、HIV配列と結合しそのHIV配 列、例えばHIVプロモーター配列の機能を調節する少なくとも２つのジンクフィ ンガーモジュールからなる新規のジンクフィンガー-ヌクレオチド結合性ポリペ プチド変異体を提供する。 新規のジンクフィンガー-ヌクレオチド結合性タンパク質を同定することによ り、これらのタンパク質が結合するプロモーターからの遺伝子発現の調節が可能 となる。例えば、細胞増殖性障害がジンクフィンガー-ヌクレオチド結合性モチ ーフを含有するプロモーターの過剰な活性化に伴うものである場合には、アンチ センスポリヌクレオチド配列もしくは結合抗体などの抑制剤を細胞内に、ジンク フィンガー-ヌクレオチド結合性タンパク質変異体の添加に替わる方法として導 入することができる。また別に、細胞増殖性障害がプロモーターの活性化の低下 に伴うものである場合には、センスポリヌクレオチド配列(そのDNAをコードする 鎖)もしくはジンクフィンガー-ヌクレオチド結合性ポリペプチドを細胞内に導入 することができる。 主要なアミノ酸配列に小さい変更を加えることにより、ここに記載のジンクフ ィンガー由来結合性タンパク質と実質的に同等な活性を有するタンパク質を作る ことができる。そのような変更は部位指向性の変異誘発のような方法によるか、 もしくは自発的に起こりうる。これらの変更によって産生されたタンパク質は、 それらにジンクフィンガー-ヌクレオチド結合性タンパク質活性がある限りはす べて本明細書に含まれる。 別の実施形態において、本発明のジンクフィンガータンパク質は、延長された 標的配列を認識してこれに結合するように操作することができる。たとえば、約 ２から20のジンクフィンガーZif(2)からZif(20)、好ましくは約２から12のジン クフィンガーを含むジンクフィンガータンパタ質を、タンパク質のbZIPファミリ ーの始原型メンバーである、Jun/Fosタンパク質のロイシンジッパードメインに 融合させることができる(O'Sheaら、Science，254:539，1991)。また別の方法と して、ジンクフィンガータンパク質を、ヘテロ二量体を形成することができ、か つ二量化ドメインを含む他のタンパク質と融合させることができる。このような タンパク質は当業者に公知である。 Jun/Fosロイシンジッパーについて例示の目的で記載するが、これはヘテロ二 量体を優先的に形成し、12から72塩基対の認識を可能にする。これ以後は、Jun/ Fosとはこれらのタンパク質のロイシンジッパードメインを指す。ジンクフィン ガータンパク質は、タンパク質を連結するために当業界で通常用いられる方法に より、Junと融合し、そして独立してFosと融合する。精製の後、Zif-JunおよびZ if-Fos構築物(それぞれ配列番号33、34および35、36)、タンパク質を混合してZi f-Jun/Zif-Fosヘテロ二量体が自然に形成されるようにする。別の方法では、こ れらのタンパク質をコードする遺伝子の同時発現によって、in vivoでZif-Jun/Z if-Fosヘテロ二量体が形成される。このヘテロ二量体とN-末端核局在化信号との 融合によって、核への発現をターゲッティングすることが可能になる(Calderon ら、Cell，41:499，1982)。活性化ドメインもまた、転写の活性化因子を生産 するために１つのまたはそれぞれのロイシンジッノパー融合構築物に組み入れる ことができる(Sadowskiら、Gene，118:137，1992)。次いで、これらの二量化構 築物は、転写の特異的活性化または抑制を可能にする。これらのヘテロ二量化Zi f構築物は、パリンドローム配列（JunおよびFosの両方のフィンガーが同じDNA/R NA配列を認識する場合）または延長された非対称の配列（JunおよびFosのフィン ガーが異なるDNA/RNA配列を認識する場合）の認識を可能にするので有利である 。たとえば、 のようなパリンドローム配列が、Zif268-Fos/Zif268-Jun二量体によって認識さ れる(xはいかなる数でもよい)。サブサイト間の間隔は、ZifとJunまたはFosジッ パードメインとの融合の部位およびZifとジッパードメインの間のリンカーの長 さによって決定される。サブサイトの間隔は当業者に周知の結合部位選択法によ って決定される(Thiesenら、Nucleic Asids Research，18:3203，1990)。延長さ れた非対称の配列の認識の例を、Zif(C7)6-Jun/Zif-268-Fos二量体によって示す 。このタンパク質はJunと結合したC7型の６フィンガー（実施例11）およびFosと 結合したZif268の３フィンガーからなり、延長された配列： を認識する。 金属キレート錯体によるDNAまたはRNAの酸化または加水分解による開裂を、当 業者に公知の方法によっておこなうことができる。別の実施形態では、Zifタン パク質へのキレート基の付着が、該タンパク質の最初のメチオニン(Met)と第１ のチロシン(Tyr)の間へのシステイン(Cys)残基の取り込みによって好適に促進さ れる。Cysは、次に当業者に公知のキレート化剤、たとえば文献に記載されてい るEDTA誘導体(Sigmanら、Biochemistry，29:9097，1990)によってアルキル化さ れる。あるいはまた、残基から構成されるアミノ末端はCu＋2をキレート化する ことが文献に記載されているので(Mackら、J．Am．Chem．Soc.，110:7572，1988 )、配列Gly-Gly-Hisをほとんどのアミノ末端残基と同様にして作ることができる 。好ましい金属イオンにはCu＋2、Ce＋3(TakasakiおよびChin、J．Am．Chem．So c.，116:1121，1994)、Zn＋2、Cd＋2、Pb＋2、Fe＋2(Schnaithら、Proc．Natl． Acad．Sci.，USA，91:569，1994)、Fe＋3、Ni＋2、Ni＋3、La＋3、Eu＋3(Hallら 、Chemistry and Biology，1:185，1994)、Cd＋3、Tb＋3、Lu＋3、Mn＋2、Mg＋2 が含まれる。キレート化した金属による開裂は通常O2、過酸化水素H2O2のような 酸化剤、ならびにチオールおよびアスコルビン酸塩のような還元剤の存在下でお こなう。開裂の部位および鎖（＋または−部位）は実験によって決定され(Mack ら、J．Am．Chem．Soc.，110:7572，1988)、第１のフィンガーの前のMetとTyrの 間のCysの位置に依存する。タンパク質Met(AA)Tyr-(Zif)1-12において、キレー トはMet-(AA)x1Cys-キレート-(AA)x2-Tyr-(Zif)1-12となり、ここで、AAはいか なるアミノ酸でもよく、xはアミノ酸の数である。Zif-Jun/Zif-Fos型の二量化Zi f構築物は、標的のオリゴヌクレオチド内の２つの部位での開裂、または１つの 長い標的部位での開裂に好ましい。二本鎖の開裂が望まれる場合には、Junおよ びFosを含むタンパク質の両方をキレート化剤で標識して、当業者に公知の方法 によって開裂をおこなう。この場合、制限酵素によって作られる物と類似したず れた二本鎖の切断が生じる。 変異誘発およびフィンガー１の特異性または親和性が変化したZif268タンパク 質の変異体を選択した後、フィンガーの多コピーを有するタンパク質を、TGEKP リンカー配列を用いて当業者に公知の方法により構築することができる。たとえ ば、C7フィンガーを以下のスキームに従って構築することができる。 ここで、最後のリンカーの配列は、末端にあり、２つのフィンガーを１つにする 結合に関与しないので、変化することがある。このタンパク質は、オリゴヌクレ オチドヘアピンCCT-CGC-CGC-CGC-GGG-TTT-TCC-CGC-GCC-CCC GAG G(配列番号40) 中の設計された標的配列GCG-GCG-GCG（配列番号32）に9nMの親和性で結合するが 、これと比較して、GCG-TGG-GCG配列をコードするオリゴヌクレオチドについ ては300nMの親和性であった(表面プラスモン共鳴の研究によって決定した)。利 用するフィンガーは同一である必要はなく、混合され、所望の標的配列を認識す るタンパク質を生産するように組み合わせてよい。これらはまたロイシンジッパ ー（たとえば、Fos/Jun）または他のヘテロ二量体と共に利用されて延長された 配列を認識するタンパク質を生産してもよい。 フィンガー１のポリマーの製造に加えて、３フィンガーZif268全体およびそれ を修飾した物を、共通リンカーTGEKPを用いて融合して、延長された認識部位を 有するタンパク質を製造することができる。たとえば、タンパク質Zif268-Zif26 8は、TGEKPリンカーを用いて天然の該タンパク質をそれ自体と融合させて製造す ることができる。このタンパク質は今度は配列GCG-TGG-GCG-GCG-TGG-GCGと結合 する。このように、Zif268または当業者に公知の他のジンクフィンガータンパク 質の３フィンガー内での修飾物は、それら同士が互いに融合して延長された配列 を認識するようなタンパク質を形成することができる。これらの新規のジンクタ ンパク質はまた、必要ならばロイシンジッパーと組み合わせて使用してもよい。 以上、本発明について十分に説明したが、本発明の趣旨および範囲を逸脱する ことなく、さまざまな変更および修正をおこなうことができることは当業者には 自明のことであろう。実施例 ９つのTFIIIAジンクフィンガー(Clemensら、Proc．Nat'l Acad．Sci.，USA，8 9 :10822，1992)のうち３つを含む組換えポリペプチドを、TFIIIAのcDNAからのポ リメラーゼ連鎖反応(PCR)増幅およびE．coliでの発現によって生成させた。zfl- 3と呼ぶこととする組換えタンパク質を、イオン交換クロマトグラフィーにより 精製し、Dnase Iフットプリント法と合成オリゴヌクレオチドへの結合を組み合 わせることにより(Liaoら、J．Mol．Biol.，223:857，1992)、その5S遺伝子内の 結合部位を決定した。この実施例は、このポリペプチドの、活性なRNAポリメラ ーゼプロモーターの近くに位置するその認識配列との結合がin vitroでそのプロ モーターの活性を阻害することを示す実験を提供する。このような試験系を提供 するために、13塩基対のzfl-3の認識配列を含む26塩基対のオリゴヌク レオチドを、T7 RNAポリメラーゼのプロモーター配列の近くのプラスミドpUC19 のポリリンカー領域にクローニングした。本発明者らの組換えzfl-3の調製物のD NA結合活性は、結合部位を含むオリゴヌクレオチドを用いたゲル移動度シフト分 析によって決定した。さらに、in vitroでの転写を、T7 RNAポリメラーゼを用い て、DNA結合滴定で用いたものと同量のzfl-3ポリペプチドの存在下または不存在 下でおこなった。zfl-3が結合したそれぞれのDNA分子に関して、そのDNA分子は 転写に対して不活性になる。したがって、これらの実施例において、標的配列の すぐ近くに結合することによりプロモーターの活性を完全に遮断するジンクフィ ンガーポリペプチドが製造された。 実施例１ ジンクフィンガータンパク質による配列特異的遺伝子標的 A. zif268の結晶構造から、α-ヘリックスの表面上、フィンガーの先端、およ びヘリックスの2、3、および６位（保存されたヒスチジンの直前）の特定のヒス チジン（亜鉛が配位していないhis残基）およびアルギニン残基が、DNAのグアニ ンへの水素結合に関与していることは明白である。ジンクフィンガー複合体の構 造の数は増加し続けているので、異なるアミノ酸および異なる位置が塩基特異的 な認識に関与していると思われる。図２（パネルA）に、TFIIIAの３つのアミノ 末端のフィンガーの配列を示し、これらの位置の基本的なアミノ酸に下線を引い た。調節タンパク質zif268(Krox-20)のフィンガー２ならびにSplのフィンガー１ および３と同様に、TFIIIAのフィンガー２はこれらのDNA接触位置にヒスチジン およびアルギニン残基を含み、さらに、これらのジンクフィンガーのそれぞれは 5S遺伝子プロモーター内の配列GGG(図２、パネルB)を最小限で認識する。 これら３つのTFIIIAジンクフィンガーを含む組換えポリペプチドを、TFIIIAの cDNAからのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)による増幅およびE．coliでの発現によっ て生成させた(Clemensら、前掲)。このポリペプチドの、活性RNAポリメラーゼプ ロモーターの近くに位置するその認識配列への結合がin vitroでそのプロモータ ーの活性を阻害するかどうかを決定するために実験を設計した。以下の実験はそ のような試験システムを提供するためにおこなわれた。13塩基対のzfl -3の認識配列を含む23塩基対のオリゴヌクレオチド(Liaoら、1992、前掲)を、T7 RNAポリメラーゼのプロモーター配列の近くの、プラスミドpBluescript SK＋(S tratagen，La Jolla，CA)のポリリンカー領域にクローニングした。親プラスミ ドを制限酵素EcoRVで消化し、子ウシ腸アルカリホスファターゼによる脱リン酸 後、リン酸化した23塩基対のオリゴヌクレオチドをT4 DNAリガーゼを用いた連結 反応によって挿入した。連結反応の生成物をDH5α E．coli細胞の形質転換に用 いた。23塩基対のインサートを含むクローンをminiprep DNAの制限消化によって 同定した。クローン化が成功したことはDNA配列分析によっても確認された。組 換えzfl-3の調製物のDNA結合活性もまた、zfl-3の結合部位を含むコーン(cone) に由来する56塩基対の放射性標識されたEcoRI/XhoI制限断片を用いた、および放 射線標識された23塩基対のオリゴヌクレオチドを用いた、ゲル移動度シフト分析 によって決定した。ゲルシフトアッセイは文献に記載された方法でおこなった(L iaoら、前掲；Friedら、Nucl．Aclds.，Res.，9:6505，1981)。後者の分析の結 果を図３に示す。結合反応物(20μl)には、１μgの同じ23塩基対の配列を含む未 標識のプラスミドDNAも加えた。レーン2-12では、示された量のzfl-3も反応物に 加えた。周囲温度で30分間インキュベートした後、サンプルを、88mMのトリス- ホウ酸塩（pH8.3）緩衝液中の6%の未変性ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動 した。それぞれの反応において、微量の放射線標識されたオリゴヌクレオチドを 、一定量(１μg)のzfl-3結合部位を含むプラスミドDNAと共に用いた。レーン2-1 2の反応には、zfl-3ポリペプチドを量を増大させて加えた。ゲルのオートラジオ グラムを示す。結果は、放射線標識されたDNAへのzfl-3の結合が電気泳動の移動 度の遅延を引き起こしたことを示している。zfl-3が結合した放射線標識されたD NA分子の割合（％）はまた、結合した未標識のプラスミドDNA分子の割合（％） を反映している。 in vitroの転写実験を、同一の量のzfl-3結合部位を含むプラスミドDNAによる DNA結合滴定で用いたのと同量のzfl-3ポリペプチドの存在下または不存在下で、 T7 RNAポリメラーゼを用いておこなった。それぞれの反応物は、容量25μl中に 、ベクターのEcoRV部位に挿人した23塩基対のzfl-3の結合部位を含むPvuII-消化 pBluescriptSK＋DNA 1μg、Rnasin 40ユニット、ATP＋UTP＋CTP 0.6mM、 GTP 20μM、α-32P-GTP 10μCiおよびT7 RNAポリメラーゼ(Stratagene)10ユニッ トを含むものであった。反応緩衝液はStratageneから入手した。37℃で１時間イ ンキュベートした後、転写産物をフェノール抽出により精製し、エタノール沈殿 により濃縮し、変性ポリアクリルアミドゲル上で分析した。T7転写を、ランオフ 転写物への放射性ヌクレオチドの取り込みによってモニターした。図４には、得 られた転写産物の変性ポリアクリルアミドゲル分析のオートラジオグラムを示す 。この実験において、プラスミドDNAは制限酵素PvuIIによって切断され、ランオ フ転写物の予想される長さは245塩基であった。反応物へのzfl-3ポリペプチドの 添加は、T7 RNAポリメラーゼによる転写を抑制した。 図５には、DNAゲル移動度シフトアッセイにおけるzfl-3が結合したDNA分子の 割合（％）(x-軸)対同量のzfl-3によるT7 RNAポリメラーゼの転写の阻害の割合 （％）(y-軸)をプロットしたグラフを示す。それぞれのデータの点が２つのアッ セイで用いられたzfl-3の同一の量に対応することに注目されたい。２つのデー タの組が１対１で対応することは明白である。T7転写はランオフ転写物への放射 性ヌクレオチドの取り込みによってモニターした。転写物をゲル電気泳動、オー トラジオグラフィーおよびデンシトメトリーによって定量した。ゲル移動度シフ トアッセイを同様の様式で定量した。zfl-3が結合した各DNA分子に関して、DNA 分子は転写に対して不活性にする。したがって、この実験において、ジンクフィ ンガーポリペプチドは標的配列の近くに結合することによりプロモーターの活性 を完全に遮断した。 B. 先の実験は原核生物のRNAポリメラーゼを用いておこなわれたので、以下の 実験は、ジンクフィンガーポリペプチドzfl-3が真核生物のRNAポリメラーゼの活 性をも遮断できるかどうかを決定するためにおこなった。これを試験するために 、アフリカツメガエルの未受精卵から調製した転写抽出物(Hartlら、J．Cell Bi ol.，120:613，1993)およびアフリカツメガエル5S RNA遺伝子鋳型を用いた。こ れらの抽出物は、RNAポリメラーゼIIIによる5S RNAおよびtRNAの転写において高 度に活性である。試験鋳型として、天然の状態でTFIIIAおよびzfl-3の結合部位 を含む5S RNA遺伝子を用いた。それぞれの反応は、25μlの反応液中に、 卵ホモジネートの高速の上清10μl、9ngのTFIIIA、0.6mMのヌクレオシド三リン 酸(ATP、UTP、CTP)、10μCiのα-32P-GTPならびに20μMのGTPを含むものであっ た。すべての反応物は180ngのアフリカツメガエルの体細胞型5S RNA遺伝子の単 一コピーを含むプラスミドDNAを含み、レーン２および３の反応物は300ngのアフ リカツメガエルtRNAmet遺伝子を含有するプラスミドをも含んでいた。アフリカ ツメガエル卵抽出物およびTFIIIAを加える前に、0.2および0.4μgのzfl-３をそ れぞれレーン２および３の反応物に加えた。レーン２の実験で用いたzfl-3の量 は、別々の結合反応で全ての5S遺伝子含有DNAに結合するのに十分であった。15 分間インキュベーとしてzfl-3をその認識配列に結合させた後、他の反応成分を 加えた。２時間インキュベートした後、転写産物をフェノール抽出で精製し、エ タノール沈殿で濃縮し、変性ポリアクリルアミドゲル上で分析した。オートラジ オグラムを図６に示す。図６にはまた、ジンクフィンガータンパク質を加えない 対照反応の結果も示す(レーン１)。対照として、レーン２および３ではさらに、 TFIIIAおよびzfl-3の結合部位を欠くtRNA遺伝子の鋳型を含んでいた。5S RNA転 写はzfl-3によって抑制されたが、tRNA転写は影響を受けなかった。これらの結 果は、zfl-3が真核生物RNAポリメラーゼIII転写複合体のアセンブリを遮断する ことを証明し、この効果が、TFIIIAに由来する組換えジンクフィンガータンパク 質の結合部位を含むDNA分子に特異的であることを示している。 TFIIIAの初めの３つのジンクフィンガーを含むタンパク質について、2D、3D、 および4D NMR法を用いて３次元溶液構造を決定した。この目的のために、タンパ ク質をE．coliで発現し精製して、13Cおよび15Nで均一に標識した。NMR構造から 、個々のジンクフィンガーがα-ヘリックスに対して詰め込まれた小さいβ-シー トを有する基準のフィンガー構造に折り込まれていることがわかった。フィンガ ーは溶液中で完全に独立してはいないが、フィンガー間の希薄な相互作用の証拠 がある。同様の技術を用いて、zfl-3と、5S RNA遺伝子上のその特異的な結合部 位に対応する13塩基対のオリゴヌクレオチドとの複合体の3D構造を決定し、TFII IAジンクフィンガーによる配列特異的ヌクレオチド認識の分子的基礎に関する基 本的な情報を得るために用いた。さらに、この情報はあらかじめ選択された標的 遺伝子を調節するための新規のジンクフィンガーに由来するヌクレオチド結 合性タンパク質を設計するために用いられる。同様のNMR法を適用して、標的遺 伝子の選択性を向上し、結合親和性を増加させるための構造に基づくアプローチ の一部として、設計されたジンクフィンガータンパク質とその標的遺伝子の間に 形成された複合体の詳細な構造を決定することができる。 実施例２ 新規のジンクフィンガー-ヌクレオチド結合タンパク質の単離 ジンクフィンガー変異体の大きなライブラリーを迅速に分類するために、最初 に抗体ライブラリーについて開発されたファージ表面ディスプレー系(Barbasら 、METHODS，2:119，1991)を用いた。この目的のために、ジンクフィンガーを選 択するためにpComb3を修飾した。抗体の軽鎖プロモーターおよびクローニング配 列を取り出して、新しいベクター、pComb3.5を製造した。zif268の３フィンガー のタンパク質をPCRによって修飾し、pComb3.5に挿入した。ファージが配列に依 存する様式でDNAと結合することを実証する固相アッセイによって決定されるよ うに、ジンクフィンガーはファージ上に機能的にディスプレーされる。ライブラ リーの構築を容易にするために、部位特異的変異誘発をおこなって、Nsil部位を フィンガー１と２の間に挿入した。さらに、zif268は、その結合を簡便にモニタ ーすることを可能にするデカペプチドタグと融合させると機能的である。最初の ライブラリーは、オーバーラップPCR(Barbasら、Proc．Natl．Acad．Sci.，USA ，89:4457，1992)を用いて、認識に関与するα-ヘリックスのアミノ末端側の６ 残基がNNKドーピング戦略によって変化して縮退を生じるような、フィンガー３ 変異体を作るように構築した。この第３のフィンガーは通常GCG３塩基対サブサ イトに結合した。AAAサブサイトへの結合に基づいて選択することにより、選択 された配列に見られる共通パターンが明らかになった。 zif268含有プラスミド、pZif89(Pavletichら，Sclence 252:809，1991)をジン クフィンガー改変用のzif268DNAの起源として用いた。簡単に言うと、pZif89を 、下記のプライマー： を用いてPCRにより増幅した後、プラスミドpComb3.5にクローニングした。 PCR反応は、オリゴヌクレオチドプライマーZFおよびZRをそれぞれ１μg、dNTP (dATP、dCTP、dGTP、dTTP)、1.5mM MgCla、Taqポリメラーゼ(５単位)、10ngの鋳 型pZif89、ならびに10μlの10×PCR緩衝液（Perkin-Elmer社）を含む100μlの反 応液中で行った。Perkin-Elmer Cetus9600 Gene Amp PCRシステムサーモサイク ラーにおいて30サイクルのPCR増幅を行った。増幅サイクルは94℃における変性1 分間、54℃におけるアニーリング1分間、72℃における伸長2分間から成っていた 。得られたPCR増幅産物を下記のようにしてゲル精製し、XhoI/SpeIで消化し、pC omb3.5にライゲートした。pComb3.5は、そのlacZプロモーターを含むL鎖領域が 除去されたpComb3(Barbasら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，88:7978，1991)の 変異体である。簡単に述べると、pComb3をNheIで消化し、クレノウ処理し、XbaI で消化し、再ライゲートしてpComb3.5を形成させた。Surf ZapTM（Stratagene， カリフォルニア州ラヨラ(La Jolla)）のような、pComb3.5の変わりに用いること ができるその他の同様のベクターは、当業者には公知であろう。 次いで、zif268を含むファージミドpComb3.5をここに記載したようにしてPCR 増幅に使用して、zif268のジンクフィンガーにヌクレオチド置換を導入し、特異 的認識配列に結合し、所与のプロモーター配列への結合後、転写を増大または抑 制する新規ジンクフィンガーを製造した。 特定の配列認識特異性および遺伝子発現能の調節を有する新規ジンクフィンガ ーの製造方法は、下記の工程： １．まず、第1ジンクフィンガー（例えばzif268のジンクフィンガー3）をオー バーラップPCRの使用によりランダム化する工程； ２．ランダム化ジンクフィンガーを含む、オーバーラップPCRから得られた増 幅産物をpComb3.5にもう一度ライゲートしてランダム化ライブラリーを形成する 工程； ３．ライブラリーからバクテリオファージコートタンパク質III-固定化(ancho red)ジンクフィンガーを発現させた後、表面タンパク質発現ファージを特異的ジ ンクフィンガー認識配列に対してパンニングして(pan)、いくつかの特異的ラン ダム化ジンクフィンガーを選択する工程；ならびに ４．配列特異的ジンクフィンガーを選択した後、対応するファージミドを配列 決定し、それからアミノ酸残基配列を誘導する工程 を含む。 実施例３ ランダム化ジンクフィンガーの調製 上記の、pComb3.5におけるzif268のジンクフィンガーをランダム化するために 、２つの別個のPCR増幅をここに記載したようにして各フィンガーに対して行っ たあと、第3オーバーラップPCR増幅を行って２つの先の増幅産物をアニーリング させ、次いで第3増幅を行った。鋳型pComb3.5のzif268のジンクフィンガーのヌ クレオチド配列を図７に示し、配列番号４に記載する。ジンクフィンガー3にお いてランダム化されたヌクレオチド位置は、セリンを除くヌクレオチド217位か ら始まリ、237位で終わった。フィンガー３において、その明示した部位におけ る鋳型zif268配列は、合計8個のアミノ酸残基をコードした。改変されることに なる、pComb3.5におけるフィンガー3のかかるアミノ酸残基配列は、Arg-Ser-Asp -Glu-Arg-Lys-Arg-His（配列番号５）である。下線を付したアミノ酸は、ランダ ム化された残基を示すものである。 BZF3およびZF36Kと呼ばれる縮重オリゴヌクレオチドプライマーならびに下記 のヌクレオチド式を有する非縮重プライマーR3BおよびFTX3を含むオリゴヌクレ オチドのプール（Operon Technologies，カリフォルニア州アラメダ（Alameda） によって合成されたもの）を、pComb3.5におけるzif268のジンクフィンガー3を ランダム化するのに用いた。ランダム化ヌクレオチドを導入するための６個のト リプレットコドンとしては、繰り返し配列NNM(NNKの相補体)が挙げられ、ここで MはGまたはCであり得るものであり、NはA、C、GまたはTであり得る。 第1のPCR増幅によりpComb3.5ファージミドベクタークローンにおいてジンクフ ィンガー3断片の5'領域の増幅が生じた。この領域を増幅するために、下記のプラ イマー対を用いた。ヌクレオチド配列5'-GCA ATT AAC CCT CAC TAA AGG G-33（ 配 列番号６）を有する5'オリゴヌクレオチドプライマーFTX3は、zif268の領域5'（ ベクター配列を含む）に対応し、その最初の2個のヌクレオチドを含むフィンガ ー3の非コード鎖にハイブリダイズした。ヌクレオチド配列5'-GGC AAA CTT CCT CCC ACA AAT-3'（配列番号７）を有する3'オリゴヌクレオチドプライマーBZF3は 、ヌクレオチド216で始まり、ヌクレオチド196で終わるフィンガー3のコード鎖 にハイブリダイズした。 PCR反応は、オリゴヌクレオチドプライマーFTX3とBZF3をそれぞれ１マイクロ グラム(μg)、200ミリモル（mM）のdNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)、1.5mM MgCl2 、Taqポリメラーゼ（５単位）(Perkin-Elmer社，コネチカット州ノーウォーク( Norwalk))、10ナノグラム（ng）の鋳型pComb3.5 zif268、および市販の10μlの1 0×PCR緩衝液（Perkin-Elmer社）を含む100マイクロリットル（μl）の反応液中 で行った。次いで、Perkin-Elmer Cetus9600 GeneAmp PCRシステムサーモサイク ラーにおいてPCR増幅を30サイクル行った。増幅サイクルは94℃における変性30 秒間、50℃におけるアニーリング30秒間、72℃における伸長1分間から成ってい た。十分な量の増幅産物を得るために、同一のPCR反応を30回行った。 次いで、得られたPCR増幅産物を、"Molecular Cloning:A Laboratory Manual" ，Sambrookら編，Cold Spring Harbor，NY(1989)に記載された標準電気溶出技術 を用いて、1.5％アガロースゲルにてゲル精製した。簡単に述べると、消化され たPCR増幅ジンクフィンガードメインをゲル電気泳動した後、所定の大きさのDNA 断片を含むゲルの領域を切除し、透析膜に電気溶出し、エタノール沈殿させ、10 mMトリス-HCl、pH7.5および1mMEDTAを含む緩衝液に最終濃度50ng/mlになるまで 再懸濁した。 次に、第1の反応から得られた精製PCR増幅産物を第2のPCR反応の産物とともに 下記に示すように、オーバーラップ伸長PCR反応に用いることにより、その2つの 産物を、ランダム化ジンクフィンガーを含む再構築zif268に組み換えた。 第2のPCR反応により、上記産物とオーバーラップし、フィンガー3の3'を伸長 するzif268フィンガー3の3'末端の増幅が生じた。フィンガー3のコード化８アミ ノ酸残基配列のランダム化のためにこの領域を増幅するため、下記のプライマー 対を用いた。5'コードオリゴヌクレオチドプライマープールはZF36Kと呼ばれ、 式5 '-ATT TGT GGG AGG AAG TTT GCC NNK AGT NNK NNK NNK NNK NNK CAT ACC AAA AT C CAT TTA-3'（配列番号８）(ヌクレオチド196〜255)で示されるヌクレオチド配 列を有していた。3'非コードプライマーR3Bは、配列5'-TTG ATA TTC ACA AAC GA A TGG-3'（配列番号９）を有する遺伝子III(gIII)の3'末端のコード鎖にハイブ リダイズした。プライマープールの２つの明示した末端間の領域は、15マーNNK 縮重で示される。第2のPCR反応は、上記のオリゴヌクレオチドプライマーをそれ ぞれ１μg含む上記のような100μlの反応液中で、pComb3.5鋳型の第2アリコート にて行った。得られたPCR産物は、長さ８アミノ酸残基のランダム化zif268フィ ンガー3領域の多様な集団をコードしていた。次いで、この産物を上記のように してゲル精製した。 ２つのPCR増幅のアニーリング反応のために、第1および第2のPCR反応から得ら れたゲル精製産物をそれぞれ１μgずつ混合し、上記のように35サイクルのPCRの ためにプライマーの不存在下で融合した。次に、得られた融合産物を、最終PCR 反応においてプライマー対としてFTX3およびR3Bオリゴヌクレオチドプライマー をそれぞれ１μgずつ用いて増幅させ、オーバーラップ伸長により完全zif268断 片を形成させた。オーバーラップPCR増幅を、上記のその他のPCR増幅について記 載したようにして行った。 十分な量の増幅産物を得るために、同一のオーバーラップPCR反応を30回行っ た。得られた断片は5'から3'に伸長し、6アミノ酸残基をコードするフィンガー3 をランダム化していた。まず、30反応のそれぞれにおいて長さ約450塩基対（bp ）のランダム化zif268増幅産物をプールし、次いで上記のようにゲル精製し、Xh oIおよびSpeIで切断し、その後pComb3.5表面展示(display)ファージミド発現ベ クターに再ライゲートして特異的ジンクフィンガーの選択用のジンクフィンガー 認識配列オリゴに対してスクリーニングするためのライブラリーを作製した。発 現ベクターライブラリーの作製におけるライゲーション手順およびzif268ランダ ム化pComb3.5クローンのその後の発現は実施例４に記載したようにして行った。 ヌクレオチド置換は、その他のジンクフィンガーにて同様に行い得る。例えば 、zif268においては、フィンガー1および2を、その他の結合部位が同定され得る ように改変してもよい。ジンクフィンガー2の改変のために、プライマーFIX3（ 上 記したもの）およびZFNsi-B、5'-CAT GCA TAT TCG ACA CTG GAA-3'（配列番号10 ）(ヌクレオチド100〜120)を第1のPCR反応に使用し、R3B（上記したもの）およ びZF2r6F（5'-CAG TGT CGA ATA TGC ATG CGT AAC TTC(NNK)6ACC ACC CAC ATC CG C ACC CAC-3'）(配列番号11)（ヌクレオチド103〜168）を第2のPCR反応に使用す る。フィンガー1の改変のために、RTX3（上記）およびZFI6rb（5'-CTG GCC TGT GTG GAT GCG GAT ATG(MNN)5CGA MNN AGA AAA GCG GCG ATC GCA GGA-3'）(配列番 号12)（ヌクレオチド28〜93）を第1の反応に使用し、ZFIF（5'-CAT ATC CGC ATC CAC ACA GGC CAG-3'）(配列番号13)（ヌクレオチド70〜93）およびR3B（上記） を第2の反応に使用する。オーバーラップ反応は、フィンガー3について上記した ようなFTX3およびR3Bを利用する。好ましくは、各フィンガーは、1つの反応につ き３つ全てが改変されるのとは対照的に、一つのタンパク質分子上で別個に、連 続的に改変される。zif268のフィンガー1のヌクレオチド改変は、ヌクレオチド4 9〜72によってコードされる下線を付されたアミノ酸RSDELTRH（配列番号14）を 含む。zif268のフィンガー2のヌクレオチド改変は、SRSDHL（配列番号15）を含 み、これはヌクレオチド130〜147によってコードされる(図７参照)。 実施例４ ランダム化ジンクフィンガーを有する ファージミドディスプレイされた配列の調製 zif268配列を含むファージミドpComb3.5は、上記のように、ファージディスプ レイされた固定化タンパク質の発現をもたらすファージミド発現ベクターである 。原型のpComb3発現ベクターは、コンビナトリアルFabライブラリーのクローニ ングのためにバクテリオファージコートタンパク質3上で発現した抗体タンパク 質を固定化させるようにデザインされた。XhoIおよびSpeI部位を、フレームワー ク１で始まり、フレームワーク4により伸長する領域からなる完全PCR増幅Ｈ鎖(F d)配列をクローニングするために付与する。繊維状ファージの遺伝子IIIは、細 菌膜におけるファージアセンブリプロセスにおいて押し出される前に発現し、E. coliのペリプラズムに面している内膜上に蓄積するこの406残基マイナーファ ージコートタンパク質cpIII(cp3)をコードする。 この系においては、第1のシストロンは、融合タンパク質zif268-cpIIIに機能 的に連結されたペリプラズム分泌シグナル（pelBリーダー）をコードする。pelB リーダーの存在により、ランダム化ジンクフィンガーを含む融合タンパク質の細 菌細胞質から細胞周辺腔への分泌が促進される。 このプロセスにより、zif268-cpIIIはpelBリーダー配列により細胞周辺腔に送 達され、その後切断された。ランダム化ジンクフィンガーはcpIII膜アンカード メインにより膜に固定化された。pComb3.5と呼ばれるファージミドベクターによ り、ジンクフィンガータンパク質の表面ディスプレイが可能になった。XhoI/Spe I部位の存在により、pComb3.5ベクターにおけるランダム化zif268 PCR産物のXho I/SpeI消化物の挿入が可能になった。したがって、実施例３において調製された zif268突然変異誘発ヌクレオチド配列のライゲーションにより、PCR増幅したフ ィンガー3からなる完全zif268断片のインフレームライゲーションが生じた。pCo mb3.5発現ベクターのクローニング部位は、以前に報告された、Huseら，Science ，246:1275-1281(1989)およびPerssonら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，88，24 32-2436(1991)に記載されているようなマウスおよびヒトPCRプライマーと適合し 得るものである。細胞周辺腔に発現タンパク質を誘導するリーダー配列であるpe lBのヌクレオチド配列は、Huseら（上記のとおり）により報告されたとおりであ る。 また、上記ベクターは、Shineら，Nature，254:34，1975に記載されたような リボソーム結合部位も含んでいた。ColE1およびF1起点ならびにβ-ラクタマーゼ 遺伝子を含むファージミドベクターpBluescriptの配列は、Shortら，Nuc．Acids Res.，16:7583-7600(1988)によって以前記載されており、完全配列についてはG enBankアクセッション番号52330を有する。空のベクターのXhoI部位とSpeI部位 の間に位置するその他の制限部位、SalI、AccI、HincII、ClaI、HindIII、EcoRV 、PstIおよびSmaIは、Shortら（上記のとおり）によって記載されたようなpBlue scriptの51塩基対stuffer断片から得た。規則正しい二次構造を持たないフレキ シブルな5アミノ酸残基つなぎ鎖(tether)配列をコードするヌクレオチド配列は 、発現された融合タンパク質における相互作用が最小になるようにFabおよびc p3ヌクレオチドドメイン間に並置されていた。 したがって、得られたコンビナトリアルベクターpComb3.5は、融合タンパク質 zif268/cp3を発現するためのカセットを有するDNA分子から成っていた。また、 該ベクターは、5'から3'方向に示された下記の機能的に連結されたエレメント： LacZプロモーター／オペレーター配列からなるカセット；NotI制限部位；リボソ ーム結合部位；pelBリーダー；スペーサー領域；5'XhoIおよび3'SpeI制限部位に 面したクローニング領域；つなぎ鎖配列；および終結コドンを伴うバクテリオフ ァージcp3をコードする配列についてのヌクレオチド残基配列も含んでいた。原 型の２つのカセット（H鎖およびL鎖）間に位置するNheI制限部位；発現調節リボ ソーム結合部位を伴う第2のLacZプロモーター／オペレーター配列；pelBリーダ ー；スペーサー領域；発現調節終結配列を伴う5'SacIおよび3'XbaI制限部位に面 したクローニング領域ならびに第2のNotI制限部位をpComb3から欠失させてpComb 3.5を作製した。当業者は、SurfZapTMベクター(Stratagene，ラヨラ，CA)のよう な本発明の方法に利用することができる同様のベクターを知っているであろう。 上記の発現ベクターにおいて、zif268/cp3融合タンパク質はlacプロモーター ／オペレーター配列の調節下に配置され、膜における機能的アセンブリのために pelBリーダー配列によって細胞周辺腔に誘導される。ベクターにおいてファージ F1遺伝子間領域を含有せしめることにより、ヘルパーファージの助けにより1本 鎖ファージミドのパッケージングが可能になった。ヘルパーファージ重感染を用 いることにより、cp3の二つの形態の発現が可能になった。したがって、正常な ファージ形態形成は、ビリオンへの組み込みに対するFd/cp3融合物とヘルパーフ ァージの天然cp3の競合により乱された。得られるパッケージされたファージミ ドは、感染に必要な天然cp3ならびに選択のためにディスプレイされるコード化 融合タンパク質を有していた。感染性N-末端ドメインを有する融合物は宿主細胞 を感染に対して抵抗性にするので、ファージミドアプローチにはC-末端ドメイン との融合物が必要とされた。 上記のpComb3および3.5発現ベクターは、本発明においてランダム化ジンクフ ィンガータンパク質の製造に用いられるディスプレイファージミド発現ベクター の基本的な構築物を形成するものである。 実施例５ ファージミドライブラリー構築 ランダム化ジンクフィンガーを表示する発現タンパク質を得るために、ファー ジミドライブラリーを構築した。このライブラリーにより、実施例３に記載され たようにジンクフィンガーがランダム化された組換え分子の表面発現がもたらさ れた。 実施例３で調製されたPCR産物を発現させるためのファージミドライブラリー の調製のために、このPCR産物をまずXhoIおよびSpeIで消化し、同様に消化され た原型（すなわちランダム化されていない）pComb3.5ファージミド発現ベクター に別個にライゲートした。XhoIおよびSpeI部位は上記のようにpComb3.5ベクター に存在していた。ライゲーションによりzif268のベクターへの機能的連結が得ら れ、cp3遺伝子の5'側に位置していた。増幅産物を、もともとH鎖可変ドメイン配 列を有している鋳型pComb3.5発現ベクターに挿入したので、H鎖ドメインクロー ニング部位のみが置換されてpComb3.5発現ベクターの残りの部分は未変化のまま であった。組換えクローンからの発現では、発現タンパク質はランダム化ジンク フィンガーを含んでいた。 本発明のランダム化ジンクフィンガーのそれぞれを発現させるためのファージ ミドライブラリーは、下記の手順で調製した。PCR産物インサートを含む環化ベ クターを作製するために、640ngの消化PCR産物を２μgの線状化pComb3.5ファー ジミドベクターと混合し、10ユニットのBRLリガーゼ（Gaithersburg，MD）を加 えたBRLリガーゼ緩衝液を用いて反応容量150μlで室温にて一晩ライゲーション を進行させた。５つの別個のライゲーション反応を行ってランダム化ジンクフィ ンガーを有するファージライブラリーのサイズを増大させた。ライゲーション反 応後、２μlの20mg/mlグリコーゲン、15μlの3M酢酸ナトリウム（pH5.2）および 300μlのエタノールを混合することによって環化DNAを-20℃にて2時間沈殿させ た。次いでDNAを4℃にて15分間マイクロ遠心分離することによってペレット化し た。DNAペレットを冷70％エタノールで洗浄し、減圧乾燥した。ペレットを10μl の水に再懸濁し、300μlのE.coli XL1-Blue細胞にエレクトロポレ ーションすることによって形質転換し、ファージライブラリーを作製した。 形質転換後、突然変異誘発フィンガー3を発現しているファージを単離するた めに、ファージを、下記の配列(配列番号16)： を有するヘアピンオリゴ上でパンニングするために下記のようにして誘導した。 太字の配列は、新しいジンクフィンガー3結合部位（以前はGCG）を示すものであ り、下線を付した配列はフィンガー2部位を示し、二重下線を付した配列はフィ ンガー1結合部位を示す。 形質転換されたE.coliは、3mlのSOC培地（SOCは、20グラム(g)のバクトートリ プトン(bacto-tryptone)、5gの酵母抽出物および１リットルの水に0.5gのNaClを 溶かした溶液を混合し、pHを7.5に調整し、zif268-cpIIIの発現の誘導に使用す る直前に20mlのグルコースを混合することによって調製した。）中で増殖させ、 混合し、培養物を220rpmで37℃にて1時間振とうした。このインキュベーション の後、20μg/mlのカルベニシリンおよび10μg/mlのテトラサイクリンを含む10ml のSB（SBは、30gのトリプトン、20gの酵母抽出物、および１リットル当たり10g のMops緩衝液を、pHを７に調製しながら混合することによって調製した。）を混 合し、混合物をさらに１時間、300rpmで振とうした。得られた混合物を、50μg/ mlのカルベニシリンおよび10μg/mlのテトラサイクリンを含む100mlのSBに混合 し、1時間振とうし、その後ヘルパーファージVCSM13（1012pfu）を混合し、混合 物を37℃にてさらに2時間振とうした。その後、70μg/mlのカナマィシンを混合 し、30℃にて一晩保持した。より低温であるほど、ファージの表面におけるzif2 68の発現は良好であった。上清を遠心分離（JA10ローターにおいて4℃ にて4000rpmで15分間）によって清浄にした。ファージを、4％(w/v)ポリエチレ ングリコール8000および3％(w/v)のNaClを混合することによって沈殿させ、氷上 に30分間保持し、遠心分離した(JA10ローターにおいて4℃にて9000rpmで20分間 ）。ファージペレットを2mlの緩衝液（5mMのDTT、10mMのトリス-HCl、pH7.56、9 0mMのKCl、90mMのZnCl2、1mMのMgCl2）に再懸濁し、ペレット破片になるまで3分 間マイクロ遠心分離し、新しいチューブに移して下記のような次のスクリーニン グのために-20℃で保存した。ファージ表面におけるポリペプチドのリフォール ディングのためにDTTを加えた。 力価測定コロニー形成単位（cfu）を測定するために、ファージ（パッケージ されたファージミド）をSBで希釈し、その1μlを、10μg/mlのテトラサイクリン を含むSB中で増殖させた新鮮な（AOD600=1）E.coli XL1-Blue細胞50μlの感染に 用いた。ファージおよび細胞を室温で15分間保持し、次いでLB/カルベニシリン プレート上に直接プレーティングした。ランダム化ジンクフィンガー3ライブラ リーは合計５×107PFUから成っていた。ファージライブラリーの多重パンニング 上記のように、ファージライブラリーを、被覆マイクロタイタープレート上で 変更結合部位を含むヘアピンオリゴに対してパンニングして、新規ジンクフィン ガーについて選択した。 使用したパンニング手順は、何サイクルかの認識および複製から構成され、最 初にParmleyおよびSmithによって記載されたもの（Parmleyら，Gene，73:305-31 8，1988;Barbasら，1991，上記のとおり）の改変型であった。5サイクルのパン ニングを行って配列特異的結合クローンを富化した。この手順のために、マイク ロタイタープレート(Costar3690)の4個のウェルを１μgのオリゴで37℃にて一晩 乾燥することによって被覆するか、またはオリゴをEDC/NHS活性化を用いてBSAに 共有結合させてプレートを被覆し、360μgのアセチル化BSA(Boehringer Manheim )、577μgのオリゴ、40mMのNHS、および100mMのEDCを合計1.8mlの容量で混合し 、室温で一晩インキュベートした。プレートを50μl／プレートを用いて被覆し 、4℃で一晩インキュベートした。ウェルを水で２回洗浄し、BSAの3％(w/v)PBS 溶液でウェルを完全に満たし、プレートを37℃で1時間保持す ることによってブロッキングした。ブロッキング溶液を振って出した後、上記で 調製したファージ懸濁液50μl(典型的には1012pfu)を各ウェルに混合し、プレー トを37℃で2時間保持した。 ファージを除去し、プレートを水で1回洗浄した。次いで各ウェルをTBS/Tween （50mMトリス-HCl(pH7.5)、150mM NaCl、0.5％ Tween20）で室温にて1時間にわ たつて10回洗浄した。洗浄は、ピペットで液を上下させてウェルを洗浄すること から成り、洗浄操作の合間は、いつもウェルをTBS/Tweenで完全に満たされた状 態にした。プレートを蒸留水でもう一度洗浄し、溶離緩衝液（１mg/mlのBSAを含 む固体グリシンでpH2.2に調整した0.1M HCl）50μlを各ウェルに加えて室温に10 分間保持することによって付着したファージを溶離させた。溶離緩衝液をピペッ トで数回上下させ、除去し、用いた溶離緩衝液50μl当たり2Mのトリス塩基３μl で中和した。 溶離したファージを用いて新鮮な（OD600=1）E.coli XL1-Blue細胞2mlに室温 で15分間感染させ、その後20μg/mlのカルベニシリンおよび10μg/mlのテトラサ イクリンを含むSB10mlを混合した。プレートから溶離したファージ（パッケージ されたファージミド）の数を測定するために、20μl、10μlおよび1/10μlのア リコートをプレーティング用に培養物から取り出した。培養物を37℃で1時間振 とうし、その後50μg/mlのカルベニシリンおよび10μg/mlのテトラサイクリンを 含むSB 100mlに加えて1時間振とうした。次いで、ヘルパーファージVCSM13(1012 pfu)を加えて、培養物をさらに2時間振とうした。その後、70μg/mlのカナマイ シンを加えて培養物を37℃で一晩インキュベートした。ファージ調製およびその 後のパンニングを上記のようにして繰り返した。 各パンニングサイクル後、ファージのパーセント収率を測定した。ここで、％ 収率＝（溶離したファージの数／加えたファージの数）×100である。最初のフ ァージ投入割合は、各パンニングサイクルについて約1011cfuになるまで選択プ レートにて力価測定することによって測定した。最終ファージ生産割合は、上記 のような対数期XL1-Blue細胞2mlに感染させ、選択プレート上にアリコートをプ レーティングすることによって測定した。この操作から、新規結合配列オリゴに 対する結合能についてクローンをFabライブラリーから選択した。選択されたク ローンは、ランダム化ジンクフィンガー３ドメインを有していた。 ランダム化ジンクフィンガー3ライブラリーの連続パンニングから得られた結 果により、新規フィンガー3部位を認識する5個の結合配列が判明した。天然部位 GCGをAAAに変更し、表1に示した下記の配列がAAAに結合することを確認した。 表１ 結合配列 1RSD ERK RHは天然フィンガー3結合配列である。 実施例６ プロモーターのジンクフィンガー活性化の同定のための 同時形質転換アッセイ 作製した新規ジンクフィンガーの機能的特性を評価するために、E.coliを基本 とするin vivo系を案出した。この系は、適合性レプリコンcolE1およびp15を有 する２つのプラスミドを利用するものである。ジンクフィンガーの細胞質発現は colE1プラスミドにおけるアラビナーゼプロモーターによってもたらされる。p15 レプリカ含有プラスミドは、βガラクトシダーゼの断片を発現するプラスミドに おいてリプレッサー結合部位の代わりにジンクフィンガー結合部位を含む。第2 のプラスミドにおけるかかる部位へのジンクフィンガーの結合は、βガラクトシ ダーゼの産生を遮断し、よって新規ジンクフィンガーは通常の青/白選択を用い る機能についてのこのin vivoアッセイで評価することができる。例えば、アラ ビノースおよびラクトースの存在下でジンクフィンガー遺伝子は発現し、タンパ ク質産物はジンクフィンガー結合部位に結合し、ラクトースプロモーターを抑制 する 。したがって、β−ガラクトシダーゼは産生されず、白色プラークが存在する。 制限部位に関してpComb3.5と適合するこの系は、新規フィンガーの迅速な特性付 けを容易にするものである。さらに、このアプローチを拡大することにより、新 規転写調節因子の遺伝子選択が可能になる。 野生型ジンクフィンガー−ヌクレオチド結合タンパク質を突然変異誘発する別 の方法には、PCR技術を用いるセグメンタルシャッフリングが含まれ、これによ り遺伝子のコレクション間の遺伝子セグメントのシャッフリングが可能となる。 好ましくは、遺伝子は相同性を有する限定的な領域、および連続配列同一性を有 する少なくとも15塩基対を含む。ベクターpComb3.5におけるジンクフィンガー遺 伝子のコレクションは、PCR技術の鋳型として用いられる。PCRの4サイクルは、 例えば94℃にて1分間の変性、および50℃にて15秒間のアニーリングによリ行わ れる。別の実験においては、PCRは、94℃、1分、50℃、30秒；94℃、1分、50℃ 、1分；94℃、1分、50℃、15秒、72℃、1秒で行われる。実験は全て同じ鋳型（1 0ng混合物）を使用する。実験は、各条件下で2セットの反応を行うように行われ る。各セットは上部鎖プライマーまたは下部鎖プライマーのみを有し、かかるプ ライマーにより異なる長さの1本鎖DNAが作製される。例えば、FTX3、ZFIFおよび FZF3プライマーを別個のセットで用いることにより、1本鎖産物を得ることがで きる。次いでこれらの反応から得られた産物をプールし、さらに5'および3'末端 プライマー（例えばFTX3およびR3B）を加え、混合物を94℃1分、50℃15秒、72℃ 1分30秒のPCRにさらに35サイクルかける。その後、得られた混合物はXhoI/SpeI 消化によりクローニングされ得る。新たなシャッフル化ジンクフィンガーは、最 適ジンクフィンガーコレクションの選択用の任意の遺伝子パーケージ上でのジン クフィンガーのディスプレイをパンニングすることによって、上記のようにして 選択することができる。この技術は、少なくとも15bpの連続配列同一性を有する 遺伝子の任意のコレクションに適用し得る。また、プライマーを、NNKの例を用 いて上記のように規定した範囲までドープ処理して、プライマー結合領域に突然 変異を誘導してもよい。反応時間は鋳型の長さおよび用いるプライマーの数に依 存して変動し得る。 実施例７ zif268 の特異性の改変 試薬、株およびベクター 制限エンドヌクレアーゼは、New England BiolabsまたはBoehringer Mannheim から入手した。T4 DNAリガーゼはGIBCO BRLの製品を用いた。Taqポリメラーゼお よびVentポリメラーゼは、Promegaから購入した。ヘパリン−セファロースCL-6B 培地はPharmacia製のものを用いた。オリゴヌクレオチドはOperon Technologies （Alameda，CA）製のものを用いるか、あるいは実験室においてGene Assembler Plus（Pharmacia LKB）にて調製した。pZif89はPavletich博士およびPabo博士（ Palvletich，Science，252:809-817，1991）から頂いたものである。Escherichi a coli BL21(DE3)pLysSおよびプラスミドpET3aはNovagen製のものであり、Esche richia coli XLI-Blue、ファージVCSM13、ファージミドベクターpComb3、および pAraHAは記載されたとおりである(Barbas IIIら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA ，88:7978-7982，1991;Barbas IIIら，Methods:A Companion to Methods in Enz ymology，2:119-124，1991)。プラスミド構築 野生型ジンクフィンガータンパク質をコードする遺伝子を、ポリメラーゼ連鎖 反応（PCR）により増幅され、複数の制限部位（XhoI/SacI/およびXbaI/SpeI）が 付加されたpzif89（Pavletich，上記のとおり）の野生型Zif268遺伝子を含むDNA 断片の挿入によってSalmonella typhimurium araBプロモーターの調節下に配置 した。その後、得られたプラスミドベクターを免疫スクリーニングのために選択 されたジンクフィンガー遺伝子をサブクローニングするのに使用した。このベク ターにおいて、ジンクフィンガータンパク質は、抗デカペプチドモノクローナル 抗体を用いて検出され得るそのC-末端における赤血球凝集素デカペプチドタグと の融合物として発現する（図8A）(Fieldら，Mol．& Cell．Biol．8:2159-2165， 1988)。Zif268タンパク質は、各ジンクフィンガーの保存特性を示すように一直 線に配列されている。αヘリックスおよび逆平行βシートが示されている。各フ ィンガー配列において下線を付された6アミノ酸残基は、ライブラリー構築にお いてランダム化された。zif268タンパク質のC-末端をデカペプチドタグを含む断 片と融合させた。融合の位置を矢印で示す。 ファージミドpComb3を、NheIおよびXbaIで消化することによって改変して抗体 L鎖フラグメントを除去し、クレノウ断片を入れて、バックボーンを自己ライゲ ートしてプラスミドpComb3.5を得た。Zif268 PCR断片を上記のようにpComb3.5に 挿入した。ライブラリー構築におけるバックグラウンドの問題を排除するために 、野生型ZIf268遺伝子を1.1kbの非機能性stufferにSacIおよびXbaIを用いて置換 した。得られたプラスミドをSacIおよびXbaIで消化してstufferを切り出し、pCo mb3.5バックボーンをゲル精製してライブラリー構築用のベクターとして用いた 。ジンクフィンガーライブラリー ３つのジンクフィンガーライブラリーを、前に実施例３に記載した条件を用い てPCRオーバーラップ伸長によって構築した。簡単に述べると、フィンガー1ライ ブラリーに対して、プライマー対A（5'-GTC CAT AAG ATT AGC GGA TCC-3'）(配 列番号29)とZfl6rb（配列番号12）(ここで、NはA、T、GまたはCであり、MはAま たはCである)、ならびにB（5'-GTG AGC GAG GAA GCG GAA GAG-3'）(配列番号30) とZflf（配列番号13）を用いることにより、鋳型としてプラスミドpAra-Zif268 を用いてZif268遺伝子の断片を増幅した。２個のPCR断片を等モル比で混合し、 その混合物をオーバーラップ伸長用の鋳型として用いた。次いで、組換え断片を プライマーAおよびBを用いてPCR増幅させ、得られた産物をSacIおよびXbaIで消 化し、ゲル精製した。各ライゲーション反応について、280ngの消化断片を室温 にて一晩1.8μgのpComb3.5ベクターにライゲートした。反応を12回行い、DNAを エタノール沈殿させてE.coli XLI-Blueにエレクトロポレートした。フィンガー2 および3のライブラリーは、フィンガー1ライブラリー構築において使用したPCR プライマーZfl6rbおよびZflFを、フィンガー2ライブラリーについてはZfnsi-B（ 配列番号10）およびZF2r6F（配列番号11）(ここでKはGまたはTである)、フィン ガー3ライブラリーについてはBZF3（配列番号７）およびZF36K（配列番号８）に 置き換えた以外は同様の方法で構築した。それらのライブラリーにおいて、フィ ンガー1および3のαヘリックス-1、２、３、４、５、６位、フィンガー2の-2、- １、１、２、３、４位に対応する6アミノ酸残基がランダム化された(図8A)。ジンクフィンガーのin vitro選択 コンセンサスまたは変更Zif268結合部位のどちらかを含む34-ヌクレオチドヘ アピンDNAを、ジンクフィンガー選択に用いた(図８)。コンセンサス結合部位はZ 268N(5'-CCT GCG TGG GCG CCC TTTT GGG CGC CCA CGC AGG-3')（配列番号31）と 示されている。フィンガー1についての変更部位は、TGT（5'-CCT GCG TGG TGT C CC TTTT GGG ACA CAA CGC AGG-3'）であり、フィンガー2についてはTTG（5'-CCT GCG TTG GCG CCC TTTT GGG CGC CAA CGC AGG-3'）であり、フィンガー3につい てはCTG(5'-CCT CTG TGG GCG CCC TTTT GGG CGC CCA CAG AGG-3')である。オリ ゴヌクレオチドは、その5'末端にある第1級n-ヘキシルアミノ基で合成した。100 mMの1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩(EDCI)およ び40mMのN-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）を含む溶液中で30μMのDNAを３μM のアセチル化BSAと室温にて5時間または一晩混合することによってDNA-BSA結合 体を調製した。ウェル当たり、25μlのPBS緩衝液（10mMリン酸カリウム、160mM NaCl、pH7.4）に4.9μgのDNA-BSA結合体を加えたもので予備被覆したマイクロタ イターウェルに、1％BSAを含む50μlの亜鉛緩衝液（10mMトリス-Cl、pH7.5、90m M KCl、1mM MgCl2、90μM ZnCl2、1mM MgCl2および5mM DTT）に1012コロニー形 成単位のZif268ファージを加えたものを加えた。37℃にて2時間インキュベート した後、ファージを除去し、選択の第1サイクルのためにプレートを0.5％Tween を含むTBS緩衝液（50mMトリス-Clおよび150mM NaCl、pH7.5）で1回洗浄した。プ レートをサイクル2のために5回洗浄し、さらなるサイクルのために10回洗浄した 。結合したファージを溶離緩衝液（0.1M HCl、pH2.2(グリシンで調整)、および1 ％BSA）で抽出し、その後の選択のためのファージの産生のためにE.coli XL 1-B lue細胞の感染に用いた。免疫スクリーニング ５または６サイクルのパンニング後に選択された突然変異ジンクフィンガー遺 伝子をpAraHAベクターにXhoIおよびSpeI制限部位を用いてサブクローニングした 。典型的には、20クローンを一度にスクリーニングした。細胞を、30μg/mlのク ロラムフェニコールを含む6mlのSB培地（BarbasIIIら、上記のとおり）中で37℃ にて後期−対数期(OD600 0.8〜1)まで増殖させた。ジンクフィンガータンパク質 の発現を、1％のアラビノースを添加することにより誘導した。細胞を、誘導の ３〜12時間後に採取した。細胞ペレットを0.5mMのフェニルメチルスルホニルフ ロリ ド（PMSF）を含む600μlの亜鉛緩衝液に再懸濁した。細胞を6サイクルの凍結-解 凍で溶解させ、上清を12,000gで5分間遠心分離することにより透明にした。細胞 上清のアリコート50μlを、1.1μgのDNA-BSA結合体で予備被覆したマイクロタイ ターウェルに加えた。37℃にて1時間後、プレートを蒸留水で10回洗浄し、アル カリホスファターゼ結合抗デカペプチド抗体をプレートに加えた。37℃にて30分 後、プレートを10回洗浄してp-ニトロフェニルホスフェートを加えた。次いでプ レートをマイクロプレートオートリーダーを用いて405nmで監視した。ジンクフィンガータンパク質の過剰発現および精製 pET発現系(Studierら，Methods Enzymol.，185:60-89，1990)を用いることに よりジンクフィンガータンパク質を過剰産生させた。Zif268遺伝子をPCR後にNde IおよびBamHI消化ベクターpET3aに導入した。続いて、Zif268遺伝子を、680bpの 非機能性stuffer断片で置換した。得られたstuffer断片を含むpETプラスミドを 、stufferをSpeIおよびXhoI部位を用いてジンクフィンガー遺伝子に置換するこ とによってその他のジンクフィンガー遺伝子のクローニングに用いた。ジンクフ ィンガー遺伝子をコードするpETプラスミドを化学的形質転換によりBL21(DE3)pL ysSに導入した。細胞を、50μg/mlのカルベニシリンおよび30μg/mlのクロラム フェニコールを含有するSB培地中で中期-対数期（OD600 0.4〜0.6）まで増殖さ せた。0.7mlのIPTGを培地に加えることにより、タンパク質発現を誘導した。典 型的には、500mlの培養物を誘導の3時間後に採取した。細胞ペレットを、1mMのP MSFを含有する亜鉛緩衝液に再懸濁し、細胞を0℃で5分間音波処理することによ り溶解した。6mMのMgCl2を添加した後、細胞溶解物を10μg/mlのDNアーゼIとと もに氷上で20分間インキュベートした。ジンクフィンガータンパク質を含有する 封入体を25,000gで30分間遠心分離することにより回収し、６Mの尿素および0.5m MのPMSFを含有する亜鉛緩衝液10mlに、4℃で穏やかに混合しながら３〜12時間か けて再懸濁し、可溶化した。抽出物を30,000ｇで30分間遠心分離することによっ て透明にして、0.2μmの低タンパク質結合フィルターで濾過した。全タンパク質 抽出物を亜鉛緩衝液で平衡化したヘパリン-セファロースFPLCカラム（1.6×4.5c m）に加えた。タンパク質を０〜0.7M NaCLグラジエントで溶離させた。ジンクフ ィンガータンパク質を含有する画分をSDS-PAGEにより同定し、プールした。タン パク質濃度を標 準としてBSA（画分V）を用いるBradford法により測定した(Bradford，Anal．Bio chem.，72:248-254，1976)。精製タンパク質の収量は、細胞培養物１リットル当 たり７〜19mgであった。タンパク質はSDS-PAGEで判定したところ、90％以上均質 であった。速度論的分析 Zif268ペプチドとそのDNAターゲット間の相互作用についての速度定数を、BIA core装置(Pharmacia)を用いる表面プラズモン共鳴に基づく分析によって測定し た(Malmqvist，Curr．Opinion in Immuno.，5:282-286，1993)。センサーチップ の表面をEDCIとNHSの混合物で15分間活性化した。次いで、10mMの酢酸ナトリウ ム（pH4.5）に200μg/mlの濃度で加えたアフィニティ精製ストレプトアビジン（ Pierce）の溶液40μlを５μl/分の速度で注入した。典型的には、5000〜6000共 鳴単位のストレプトアビジンをチップ上に固定化した。過剰のエステル基をIMの エタノールアミン30μlで失活させた。ビオチニル化オリゴヌクレオチド(50μg/ ml)を0.3Mの塩化ナトリウムに加えた溶液40μlを注入することによりチップ上に オリゴヌクレオチドを固定化した。通常、1500〜3000共鳴単位のオリゴマーが固 定化された。会合速度(kon)を、タンパク質と表面との結合の速度を亜鉛緩衝液 中で10〜200μg/mlの範囲の5種類のタンパク質濃度で調べることによって測定し た。解離速度(koff)を、会合期後20μl/分まで流速を増大させることによって測 定した。koff値は３つの測定値の平均である。konおよびkoff値は、Biacore（登 録商標）速度計算ソフトウェアを用いて計算した。平衡解離定数は、速度定数か ら推定した。 実施例９ 改変型ジンクフィンガーのファージミド展示 ライブラリーデザインおよび選択 Zif268タンパク質のファージ展示(phage display)は、実施例２〜６に記載し たようなファージミド展示系pComb3の改変によって得られた。pzif89由来のZif2 68配列を、pComb3.5のXhoIおよびSpeI部位間に挿入するためにPCRによって作製 した。実施例４に記載したように、上記部位における挿入によって、Zif268と繊 維状ファージコートタンパク質III、pIII、遺伝子のカルボキシル末端セグメン トとの 融合物が得られた。ジンクフィンガータンパク質を展示するファージをマイクロ タイターウェルに固定化されたターゲットDNA配列とともにインキュベートし、 洗浄し、溶離し、溶離ファージの力価測定をすることからなる単独パンニング実 験を利用することにより、ファージ表面に展示されたタンパク質の機能的特性を 調べた。 対照実験においては、Zif268を展示するファージをパンニング実験において調 べて、そのコンセンサス結合部位またはTFIIAの最初の３つのフィンガーの結合 部位を有するターゲット配列を結合させた。これらの実験から、Zif268展示ファ ージは、適当なターゲットDNA配列をTFIIIA配列またはBSAの9倍以上結合すると いうことが示され、フィンガー複合体の配列特異的結合はファージ展示中に維持 されるということが示された。Zn2+およびDTTが結合緩衝液に含まれない場合、 ファージ結合は4倍の低下が示された。二つの報告は、Zif268がファージ表面上 で展示され得るということを実証するものである(Rebarら，Science，263:671-6 73，1994;Jamiesonら，Biochem.，33:5689-5695，1994)。 同様の実験においては、TFIIIAの最初の３つのフィンガーがファージの表面に 展示され、特異的結合活性が維持されることも示された。DNAの固定化は、アミ ノ標識化される単一のオリゴヌクレオチド内にフィンガーの2本鎖DNAターゲット を提示する安定なヘアピン配列のデザインにより促進された（図8B）(Antaoら， Nucleic Acids Research，19:5901-5905，1991)。野生型Zif268の9bpコンセンサ ス結合部位(5'-GCGTGGGCG-3'、囲んだとおり)を含有するヘアピンDNAをファージ 展示ジンクフィンガータンパク質のアフィニティ選択に用いた。さらに、アフィ ニティ選択のために野生型Zif268 3-bpサブサイトをコンセンサスHIV-IDNA配列 の3-bpのサブサイト(subsites)（枠で囲んだもの）で置換した。 アミノリンカーによりヘアピン配列をアセチル化BSAに共有結合することがで き、次いで選択実験のためにポリスチレンマイクロタイターウェルに吸着させる ことにより固定化した。ビオチニル化ヘアピン配列は、ストレプトアビジン被覆 プレートへの固定化後の選択に同様に十分に作用した。 Zif268の３つのフィンガーのそれぞれについてのライブラリーを、以前記載さ れたオーバーラップPCR突然変異誘発戦略を用いて別個に構築した(BarbasIIIら ， Proc．Natl．Acad．Sci．USA，89:4457-4461，1992および実施例２〜６)。日常 的に構築することができるライブラリーのサイズにおける制約のため、ランダム 化を6個の位置に限定した(BarbasIII，Curr．Opinion in Biotech，4:526-530， 1993)。DNAのジンクフィンガータンパク質認識は、DNAの主溝におけるタンパク 質の逆平行配列を含み、すなわち、アミノ末端領域はターゲット配列との3'接触 に関与しているが、カルボキシル末端は5'接触に関与している(図8B)。所与のフ ィンガー/DNAサブサイト複合体内で、接触は逆平行ののままであり、Zif268のフ ィンガー1においては、ヘリックスの-1位および6位におけるArgのグアニジニウ ム基はそれぞれGCGターゲット配列の3'および5'グアニンと水素結合する。ヘリ ックス3位残基の側鎖によるトリプレットサブサイト配列内の中心塩基との接触 は、Zif268のフィンガー2、GLIのフィンガー4および5、ならびにTTKのフィンガ ー1および2において観察される。ジンクフィンガー/DNA複合体の３つの報告され た結晶構造内で、直接塩基接触が4を除く-1〜6残基の側鎖間で観察された(Pavle tich，上記のとおり；Pavletich，Science，261:1701-1707，1993;Fairallら，N ature，366:483-487，1993)。 これらの観察に基づいて、ヘリックス-1、2、3、4、5および6位に対応する残 基をフィンガー1および3ライブラリーにおいてランダム化した。1位のSerは、一 般的にジンクフィンガー配列におけるこの位置に十分保存され、Zif268では完全 に保存されるので(Jacobs，EMBO J.，11:4507-4517，1992)、これらの実験にお いて保存された。フィンガー2ライブラリーにおいては、ヘリックス-2、-1、1、 2、3および4位をランダム化して、異なる突然変異誘発戦略を探求した。ここで は、Zif268およびGLI構造の両方から-2位がリン酸基接触に関与していることが 判明しており、-2位はドメインの残部に影響を与えるものであるので、-2位が調 べられる。ターゲット配列TTGは野生型TGG部位の5'チミジンを保持するので、残 基5および6を固定した。 エレクトロポレーションによるライゲートされるDNAの導入により、フィンガ ーライブラリー１、２および３に対して、それぞれ２×109、６×108、および７ ×108の独立の形質転換体からなるライブラリーが構築された。各ライブラリー により、野生型配列の二つの残存フィンガーに関して突然変異誘発フィンガーの 展示が得られた。 実施例10 選択されたフィンガーの配列分析 規定のターゲットを結合させるためのジンクフィンガーの改変の可能性を調べ て、遺伝子治療におけるそれらの可能性を調べるために、HIV-1ゲノム内の保存 配列をターゲット配列として選択した。転写開始出発部位に対し106〜121位にあ るHIV-1 HXB2クローンの5'リーダー配列は、HIV-1ゲノム内のいくつかの保存領 域の一つを示すものである(Yuら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，90:6340-6344 ，1993;Myersら，1992)。これらの実験では、図8Bに示した９塩基対領域113〜12 1を標的にした。 天然コンセンサスまたはHIV-1ターゲット配列の結合に対する選択の後、機能 的ジンクフィンガーを免疫スクリーニングアッセイで迅速に同定した。pAraHA誘 導体における選択されたタンパク質の発現により、突然変異Zif268タンパク質と モノクローナル抗体によって認識されるペプチドタグ配列との融合物が得られた (図8A)。結合は、粗細胞溶解物を用いてELISA方式で判定した。特異性の定量的 評価も、親和性における少なくとも4倍の相違に感受性のあるかかる方法を用い て得ることができる。各選択から得られたいくつかの陽性クローンを配列決定し た。それを図９に示す。フィンガー1および3の6個のランダム化残基はαヘリッ クス領域における-1、2、3、4、5および6位にあり、フィンガー2においては-2、 -1、1、2、3および4位にある(図９)。3個のヌクレオチドは、各フィンガーの親 和性選択に用いた結合部位を示すものである。詳細に調べたタンパク質を、クロ ーン名称で示す。 コンセンサス結合部位GCGによるフィンガー1の選択により、-1位のLysおよび6 位のArgに対する強い選択が示された。-1位と2位間の同時変異は、これらの位置 にそれぞれLys、Cysを含む3つのクローンにおいて観察される。クローンC7は、 配列決定された12クローンの中の３つにおけるその発生に基づいた選択において 優先的に富化された。この領域におけるHIV-1ターゲット配列、TGTに対する選択 により、-1位における水素結合側鎖を有する残基に対する選択および3位におけ るGlnに対する適度の選択による配列の多様性が判明した。コンセンサスTGGサブ サイ トに対するフィンガー2選択により、-1の芳香族残基に対する選択が示されたが 、HIV-1ターゲットTTGに対する選択により、かかる位置における塩基性残基に対 する選択が示された。3位におけるSerの優先性は、チミジンの認識に関連があり 得る。チミジンとSerとの接触は、GLIおよびTTK構造において観察されている(Pa vletich，上記のとおり；Fairallら，上記のとおり)。コンセンサス残基に対し てのその他の適度な選択は表内に見ることができる。翻訳中、Glnとしてのアン バーコドンTAGの読み取りが生じるE.coliのsupE株を利用する選択を行つた。図 ９に示した51配列の中で、14クローンが1個のアンバーコドンを保有していた。 アンバーコドンを1個よりも多く保有しているクローンはなかった。supE株にお けるアンバー終止コドンの抑制に対する選択は、その他のDNA結合タンパク質ラ イブラリーにおいて示されており、この残基はDNA結合タンパク質における接触 残基としてしばしば用いられるのでライブラリーの質を向上させると考えられる (Huangら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，91:3969-3973，1994)。遊離システイ ンを含むフィンガーに対する選択も示されており、実験プロトコルを反映するも のと考えられる。ファージをZn2+およびDTTを含む緩衝液中でインキュベートし て、適正に折りたたまれたフィンガーを有するファージの数を最大にした。遊離 システインに対する選択は、多分凝集または不適正なフォールディングにより、 その他のタンパク質のファージ展示ライブラリーにおいて以前示されている(Low manら，J．Mol．Biol.，234:564-578，1993)。 さらに特性付けするために、ジンクフィンガータンパク質の高レベル発現をT7 プロモーター（図10）を用いて行った(Studierら、上記のとおり)。図10におい て、タンパク質は15％SDS-PAGEにより分離し、クーマシーブリリアントブルーで 染色した。レーン１：分子量標準(kDa)。レーン２：IPTG誘導前の細胞抽出物。 レーン３：IPTG誘導後の細胞抽出物。レーン４：遠心分離による封入体除去後の 細胞質画分。レーン５：ジンクフィンガーペプチドを含む封入体。レーン６：ヘ パリン-セファロースFPLCにより精製した突然変異Zif268ペプチド。クローンC10 、F8およびG3は、それぞれアンバーコドンを保有しており、アンバーコドンはか かる系における発現の前にGlnをコードするCAGに変換される。 実施例11 親和性および特異性の特性付け 変更特異性または親和性の機構への洞察を得るために、結合の速度論を表面プ ラズモン共鳴（SPR）におけるリアルタイムの変化を用いて測定した(Malmqvist ，上記のとおり)。11タンパク質の速度定数および平衡解離定数の計算値を図11 に示す。調べたジンクフィンガータンパク質それぞれは、クローン名称で示す( その配列に対するもの。図9参照。)。各フィンガーの選択に用いたターゲットDN A部位を太字で示す。野生型タンパク質に対するコンセンサス結合部位も太字で 示す。非ヘアピン2本鎖DNA（下線を付したもの）は、2本の1本鎖DNAをアニーリ ングすることにより調製した。各タンパク質についての、kon,会合速度；koff, 解離速度；Kd，平衡解離定数を示す。 そのコンセンサス配列にデザインされたヘアピンまたはテトラチミジンループ のない線状2本鎖の状態で結合しているZif268についての平衡解離定数の計算値 は、実質的に同一であり、これはタンパク質によって認識される2本鎖配列のコ ンホメーションがヘアピン内のコンホメーションにおいて乱されないということ を示唆するものである。そのコンセンサスに結合しているZif268についての6.5n Mという値は、異なる長さおよび配列のオリゴヌクレオチド内のそのコンセンサ ス配列に結合しているかかるタンパク質について電気泳動移動度アッセイを用い て報告された0.5〜6nMの範囲にある(Pavletich，上記のとおり；Rebar，上記の とおり；Jamiesonら，上記のとおり)。 特異性の測定として、各タンパク質の親和性を天然コンセンサス配列および1 個のフィンガーサブサイトが変化している突然変異配列への結合について測定し た。図11は、表面プラズモン共鳴におけるリアルタイム変化による野生型Zif268 タンパク質（WT）およびその変異体C7の解離速度（koff）の測定を示すものであ る。装置の応答ｒは、［タンパク質-DNA］複合体に比例している。［タンパク質 ］＝０である場合dr/dt＝koff rであるので、koff＝ln(rtl/rtn)/(tn-tl)（ここ で、rtnは時間tnにおける応答である。)である。各タンパク質についての単独実 験の結果を示す。３つの実験を行って図11に示した値を得た。クローンC7は、野 生型配列GCGを結合する親和性が13倍向上している。親和性のかかる向上に対す る主な寄与は、複合体の解離速度が5倍遅くなるということである(図12)。C7タ ンパ ク質の特異性も、HIV-1ターゲット配列に関して9倍向上している。この結果は、 その他の接触または向上した接触が複合体においてなされるということを示唆す るものである。タンパク質C9の研究は、特異性向上の異なる機構を示すものであ る。この場合、GCG部位に対するC9の全体的な親和性はZif268と等しいが、特異 性は、TGTターゲット部位への結合について、この複合体の解離速度(off-rate) の上昇によりZif268の3倍向上する。タンパク質F8およびF15の特性付けは、フィ ンガ−1の3塩基対認識サブサイトがTGTに完全に変化され得るものであり、新規 フィンガーはこの部位を結合するように選択され得るものであるということを示 すものである。 フィンガー2ドメインにおいて改変され、TTGサブサイトを結合するように選択 されたタンパク質の特性付けにより、かかるフィンガーの特異性は改変に従うも のであることが分かる。タンパク質G4およびG6は、そのコンセンサスターゲット を結合するZif268に等しい親和性で新規サブサイトを有するオリゴヌクレオチド を結合する。これらのタンパク質が結合するように選択されたターゲットに対す るかかるタンパク質の特異性は、1個の塩基対が異なる天然結合部位と比較して 、かかるオリゴヌクレオチドに対する親和性が約4倍良好であるということによ り示される。この区別のレベルは、フィンガー1突然変異体について報告された ものと同様である(Jamiesonら、上記のとおり)。フィンガー3改変タンパク質A14 は天然フィンガー3サブサイトを結合するように選択され、Zif268よりもほんの2 倍だけ低い親和性でこの部位に結合する。タンパク質A14は、認識サブサイトに おいて天然タンパク質由来の配列と根本的に異なるということに留意されたい。 特性付けされた11タンパク質の中の10個における配列特異性は、複合体の安定性 の相違から生じた。1個のタンパク質G6のみが会合速度(on-rate)における劇的な 変化により特異性を得た。タンパク質の電荷の変化による会合速度の変化を調べ たところ、相関は示されなかった。 実施例12 二量体ジンクフィンガー構築 本発明のジンクフィンガータンパク質は、延長されたターゲット配列を認識し 、それに結合するように操作することができる。例えば、約２〜12個のジンクフ ィンガーZif(2)〜Zif(12)を含むジンクフィンガータンパク質は、タンパク質のb ZIPファミリーの基本型メンバーであるJun/Fosタンパク質のロイシンジッパード メインに融合され得る(O'Sheaら，Science，254:539，1991)。また、ジンクフィ ンガータンパク質は、ヘテロ二量体形成能があり、二量体化ドメインを含むその 他のタンパク質に融合され得る。そのようなタンパク質は当業者には公知である 。 Jun/Fosロイシンジッパーは、優先的にヘテロ二量体を形成し、12〜72塩基対 の認識が可能である。今後、Jun/Fosをこれらのタンパク質のロイシンジッパー ドメインという。ジンクフィンガータンパク質を、当技術分野でタンパク質の連 結に一般的に用いられる方法によりJunに融合し、別個にFosに融合する。精製後 、Zif-JunおよびZif-Fos構築物（それぞれ図13および14を参照）を混合して自発 的にZif-Jun/Zif-Fosヘテロ二量体を形成させる。また、これらのタンパク質を コードする遺伝子を共発現させることにより、Zif-Jun/Zif-Fosヘテロ二量体の 生成がin vivoで生じる。N-末端核局在化シグナルとの融合により、発現を核に ターゲッティングすることができる(Calderonら，Cell，41:499，1982)。活性化 ドメインをロイシンジッパー融合構築物の一つまたはそれぞれに組み込んで転写 のアクチベーターを産生してもよい(Sadowskiら，Gene，118:137，1992)。その 後これらの二量体構築物は転写の特異的活性化または抑制が可能である。これら のヘテロ二量体Zif構築物は、パリンドローム配列(JunおよびFosの両方における フィンガーが同一のDNA/RNA配列を認識する場合)または延長された非対称配列（ JunおよびFosにおけるフィンガーが異なるDNA/RNA配列を認識する場合）の認識 が可能であるので都合がよい。例えば、ノベリンドローム配列 は、Zif268-Fos/Zif268 Jun二量体により認識される(ｘは任意の数である)。サ ブサイト間の間隔は、ZifとJunまたはFosジッノペードメインとの融合の部位な らびにZifとジッパードメイン間のリンカーの長さによって決定される。サブサ イト間 隔は、当業者に一般的な結合部位選択法により決定される(Thiesenら，Nucleic Acids Research，18:3203，1990)。延長された非対称配列の認識の例は、Zif(C7 )6-Jun/Zif-268-Fos二量体によって示される。このタンパク質は、Junに連結さ れたC7型（実施例11）の6フィンガーおよびFosに連結されたZif268の3フィンガ ーからなり、延長された配列： を認識する。 実施例13 Zif268 の第1フィンガーの繰り返しを利用する多フィンガータンパク質の構築 突然変異誘発およびフィンガー1の特異性または親和性が改変されたZif268タ ンパク質の変異体の選択後(実施例７参照)、フィンガーの多コピーを有するタン パク質を、TGEKPリンカー配列を用いて当技術分野で公知の方法により構築し得 る。例えば、C7フィンガーは、スキーム： （YACPVESCDRRFSKSADLKHIRIHTGEKP）1-11（最後のリンカーの配列は、末端にあ リ、２つのフィンガーの連結に関与していないので変化を受ける）にしたがって 構築され得る。３フィンガーC7構築の例を図15に示す。このタンパク質は、オリ ゴヌクレオチドヘアピンCCT-CGC-CGC-CGC-GGG-TTT-TCC-CGC-GCC-CCC GAGG中のデ ザインされたターゲット配列GCG-GCG-GCG（配列番号32）と９nMの親和性で結合 し、一方GCG-TGG-GCG配列をコードするオリゴヌクレオチドについては親和性300 nMである(表面プラズモン共鳴試験により測定された)。C7フィンガーの２〜12コ ピーを含むタンパク質が構築されており、ELISAによって測定したところ、それ らの推定ターゲットに対して特異性を有することが明らかにされた(例えば実施 例7参照)。利用されるフィンガーは同一である必要はなく、所望のターゲット配 列を認識 するタンパク質を産生するように混合され、適合され得る。これらを、ロイシン ジッパー(例えばFos/Jun)とともに利用することにより延長された配列認識を有 するタンパク質が産生され得る。 フィンガー1のポリマーを産生することに加えて、３フィンガーZif268全体と それについての改変体を、コンセンサスリンカーTGEKPを用いて融合して延長認 識部位を有するタンパク質を産生させ得る。例えば、図16に、天然タンパク質を TGEKPリンカーを用いてそれ自体に融合させたタンパク質Zif268-Zif268の配列を 示す。このタンパク質は、ELISAにより示されたように、配列GCG-TGG-GCG-GCG-T GG-GCGと結合する。したがって、Zif268の３つのフィンガー内の改変により互い に融合されて、延長された配列を認識するタンパク質が形成され得る。これらの 新規ジンクタンパク質は、実施例12に記載したように、所望によりロイシンジッ パーと組み合わせて用いてもよい。 実施例14 リンカーペプチドのデザイン Zif268-DNA複合体についての配位体(coodinates)は、ブルックヘブン(Brookha ven)タンパク質データバンクから入手した。モデル構築はINSIGHTII（Biosym Te chnologies，サンディエゴ，カリフォルニア）を用いて行った。６フィンガー結 合部位（18bp）を有する連続20bp2本鎖DNA分子をZif268複合体におけるDNA鎖に 対する配位から構築した(Pavletich，N.P.&Pabo，C.O．(1991)Science 252，809 -817)。3フィンガータンパク質の2つの分子を、モデル化DNA上にZif268-DNA複合 体をオーバーラップすることによって、各9bpハーフサイト上に再導入した。F3 αヘリックスをF4の第1β鎖に連結するのに必要なリンカー長さが、天然リンカ ーペプチドTGQKPおよびTGEKPの長さと一致することは明白である。したがって、 ペプチドリンカーTGEKPは、F3およびF4それぞれのC-およびN-末端から余分な残 基を切り取った後、F3とF4間に構築された。リンカーは、Zif268の2個の天然リ ンカー領域に観察される配置および水素結合特性を維持するように構築した。 2個の3フィンガータンパク質分子がリンカーペプチドで連結される可能性を調 べるために、コンピュータモデリング試験を上記の3ジンクフィンガーZif268-DN A複合体の構造に基づいて行った。Zif268のフィンガー3(F3)を第2のZif268分子 の フィンガー１（今後はフィンガー4；F4と呼ぶ）に連結することによってモデル 化された6フィンガー-DNA複合体は、6フィンガータンパク質の構築に用いられる 適合性リンカーペプチドの長さおよび配列を決定するのに役立つ。このモデルの 研究は、F3とF4の間にThr-Gly-Glu-Lys-Pro(TGEKP)ペンタペプチドリンカーを有 する6フィンガータンパク質を産生することが可能であり、このポリダクチルタ ンパク質が18ヌクレオチド部位、5'-GCGTGGGCGGCGTGGGCG-3'を含むDNAと最も結 合しそうであるということを示唆するものであった。このペンタペプチドは、天 然タンパク質中のジンクフィンガードメインを連結することが最も一般的に見出 されているコンセンサスペプチドを構成する。3個よりも多いジンクフィンガー ドメインを含む天然タンパク質が全く一般的であるとしても、3個よりも多い連 続ジンクフィンガードメインを有するDNAと結合することが示されている天然ジ ンクフィンガータンパク質はないので、モデルの構築の前には、コンセンサスペ プチドTGEKPはこの延長配列にわたってDNAの周期性と一致したジンクフィンガー ドメインの周期性を維持するには不十分であると考えられた。Zif268構造におい て観察された構築TGEKPリンカーと天然リンカーとの比較研究により、このリン カーは、デザインされ得る新しいリンカー配列と同じくらい最適なリンカーペプ チドであるということが示された。この広範な部位の結合においては、モデル化 された6フィンガータンパク質は、ヘリックスの約2回転のためのDNAの主溝に続 く。DNAの主溝内のそのような広範な連続結合は、どの公知のDNA結合タンパク質 でも観察されなかった。プラスミド構築 。6フィンガータンパク質、C7-C7を、2個のC7タンパク質をTGEKP リンカーペプチドで連結することによって構築した。2個のC7DNA断片を、鋳型と してpET3a-C7を用いる２つの異なるプライマーのセットによるポリメラーゼ連鎖 反応（PCR）により作製し(Wu，H.，Yang，W.P．& Barbas，C.F.I.(1995)Proc．N atl．Acad．Sci．USA 92，344-348)、5’C7は、5'末端と3'末端に、それぞれXho IとCfr101部位が隣接し、3’C7は、Cfr101とSpeI部位が隣接していた。5’C7の 作製用のプライマー対は、５'-および であり、3’C7については、5'- および である。次いで、これらの2個のC7 DNA断片を、pGEX-2Tクローニング部位BamHI とEcoRIの間に導入されたXhoIおよびSpeI部位で改変したpGEX-2T(Pharmacla)ベ クターにライゲートした。2個のC7断片間のCfr101酵素部位は、TGEKPリンカーペ プチドの一部であるアミノ酸TGをコードする。C7-C7配列の忠実度をDNA配列決定 により測定した。次に、C7-C7DNA断片をpGEX-2T構築物からXhoI/SpeIで切り出し 、C7-C7マルトース融合タンパク質の発現用の改変型pMal-c2(New England Biola bs)細菌発現ベクターにクローニングした。トランスフェクション実験のために 、C7-C7 DNA断片をBamHI/EcoRI切断により取り出し、真核細胞発現ベクター、pc DNA3（Invitrogen，サンディエゴ，CA）の対応部位にライゲートした。C7-C7タ ンパク質の作製のように、SplC-C7タンパク質を、それぞれ、XhoI/Cfr101および CfrI01/SpeIが隣接するSplC(17)およびC7のPCR産物を連結することによって作製 した。次いで、SplC-C7断片をpcDNA3真核細胞発現ベクターまたはpMal-c2細菌発 現ベクターにライゲートした。SplC-C7タンパク質のDNA配列をDNA配列決定によ り確認した。 活性化についてのレポーター遺伝子アッセイのために、レポーター遺伝子を、 pGL3-プロモーター(Promega)のSV40プロモーターの上流にあるNheI部位に個々の 結合部位の6個のフォワードタンデム反復配列を挿入することによって構築した 。抑制についてのレポーター遺伝子アッセイにおいては、C7-C7結合部位の6個の フォワードタンデムコピーをpGL3-control(Promega)のNheI部位にあるSV40プロ モーターの上流に置いた。ジンクフィンガータンパク質の発現および精製 。タンパク質を、マルトース融合 および精製系(New England Biolabs)を用いてマルトース結合タンパク質との融 合物として過剰発現させた。マルトース融合タンパク質を、アミロース樹脂充填 アフィニティカラムを用いて製造業者の指示にしたがって精製した。融合タンパ ク質は、クーマシーブルー染色SDS/PAGEゲルにより示されたように、90％以上均 質であると測定された。タンパク質濃度をアミノ酸分析により測定した。ゲル移動度シフトアッセイ 。ゲル移動度シフトアッセイに用いるプローブを産生 するために、各鎖の5'末端にTCGA突出部を含む2本鎖オリゴヌクレオチドを、α3 2 P-dATPで標識化した。2本鎖領域内の一次鎖の配列は、 であった。各結合反応に対し、1.2μgのポリ(dI-dC)、30pMの標識化オリゴをC7- C7マルトース融合タンパク質(MBP-C7-C7)またはSplC-C7マルトース融合タンパク 質(MBP-SplC-C7)とともに20μlの１×結合緩衝液（10mMトリス-Cl、pH7.5、100m M KCl、1mM MgCl2、1mM DTT、0.1mM ZnCl2、10％グリセロール、0.02％NP-40、0 .02％BSA）中で、室温にて30分間インキュベートした。次いで、反応混合物を５ ％未変性ポリアクリルアミドゲルに0.5×TBE緩衝液とともに室温で流した。放射 能シグナルをPhosphorImager（Molecular Dynamics）で定量し、X線フィルム上 に記録した。次にデータをKaleidaGraphプログラム（Synergy Software，リーデ ィング，PA）を用いて適合させ、平衡解離定数を得た。DN アーゼIフットプリント分析 。DNアーゼIフットプリントを、Sure Track Footp rintingキット(Pharmacia)を用いて製造業者の指示にしたがって行った。2個の2 2obp DNA断片は、単一のC7-C7を含んでおり、SplC-C7結合部位は、PCR融合反応 により合成し、次いでpcDNA3ベクターにクローニングした。2個のプライマーセ ット および C7-C73>5,5'- 2)C7-C75>3,5'- を、鋳型としてのpGL-3プロモーター（Invltrogen、CA）とともに用いることに より、C7-C7フットプリントプローブの2個のオーバーラップサブ断片を作製した 。次いで、2個のPCR産物を鋳型として、プライマーとしてのEcoRIfootFおよびNo tI footBとともに用いることにより、220bpのC7-C7フットプリントプローブを作 製した。SplC-C7結合部位を含むフットプリントプローブを、C7-C73>5およびC7- C75>3オリゴの代わりにオリゴSplC-C73>5,5'- SplC-C75>3 G-3'を用いた以外はC7-C7プローブと同様の方法で構築した。次いで、C7-C7また はSplC-C7に対する結合部位を含むpcDNA3ベクターをEcoRIおよびNotIで消化した 。220bpの断片をゲル精製して、クレノウポリメラーゼおよび32P-dATPを用いて 末端標識化した。NotI部位にはチミンが存在しないので、EcoRI部位で伸長した 鎖のみが放射能標識化される。約2.3×104cpm（0.1pM）を、１×結合緩衝液（10 mMトリス-Cl、pH7.5、100mM KCl、1mM MgCl2、1mM DTT、0.1mM ZnCl2、10％グリ セロール、0.02％NP-40、0.02％BSA）に20μg/mlのBSAまたは精製結合タンパク 質（300nM）を加えた溶液および60μg/mlのポリ(dI-dC)DNA含む結合反応液50μl 中で用いた。最適結合条件をゲルシフトアッセイから決定した。この反応液を、 1UのDNアーゼIを加える前に室温にて30分間インキュベートした。ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイ 。レポーター遺伝子アッセイ実験のた めに、2.5μgの個々のレポーターDNAおよび2.5μgのC7-C7-VP16発現プラスミド を、リン酸カルシウム法(Brasier，A.R.，Tate，J.E．& Habener，J.F.(1989)Bi o Techniques 7，1116−1122)により、前日に6ウェル培養皿の1ウェル当たり３ ×1 05個に継代したHeLa細胞にトランスフェクトした。18時間後、細胞を洗浄し、10 ％新生児ウシ血清(Gibco-BRL)を含むダルベッコ修飾イーグル培地を補充した。2 日後、細胞を洗浄し、溶解して、ルシフェラーゼアッセイ系を有するWallac's 9 6ウェルLB96ルミノメーター(Promega)を用いてルシフェラーゼ活性を測定した。 内部β-ガラクトシダーゼ活性対照を、β-ガラクトシダーゼレポーター遺伝子ア ッセイ系（Tropix，MA）を用いることにより測定した。2 個の6フィンガータンパク質の親和性および特異性の特性付け 。本発明者らのモ デルを試験するために、本発明者らは2個の6フィンガータンパク質を構築した。 C7-C7と呼ばれる第1のタンパク質においては、2コピーのC7、ファージディスプ レー選択したZif268変異体（上記のとおり）をTGEKPペプチドにより連結した。 第2の6フィンガータンパク質、SplC-C7は、３フィンガーSpl転写因子SplCのデザ イン化変異体(Shi,Y．& Berg，J.M．(1995)Chem．Blol．2，83-89)と3フィンガ ーC7とを結合したものである。C7、SplC、C7-C7およびSplC-C7タンパク質を、マ ルトース結合タンパク質（MBP）との融合物としてESherichia coli中で過剰発現 させ、精製した。これらのタンパク質の親和性および特異性を、電気泳動移動度 シフトアッセイにより測定した(図17)。これらの試験の結果を表2に示す。 6フィンガータンパク質C7-C7およびSplC-C7は、18bpのターゲット配列、5'-GC GTGGGCGGCGTGGGCG-3'および5'-GCGTGGGCGGGGGCGGGG-3'と、それぞれ3フィンガー C7またはSplCタンパク質に比べて68〜74倍増強された親和性で結合する。C7-C7 タンパク質の特異性を調べるために、本発明者らは、一つのハーフサイトにおい て4bpの差異を含むプローブ（SplC-C7プローブ；5'-GCGTGGGCGGGGGCGGGG-3'）な らびにフィンガー2および5結合部位のそれぞれにおいて2bpの差異を含むプロー ブ（(GCG)6プローブ；5'-GCGGCGGCGGCGGCGGCG-3'）へのその結合を試験した。こ れらの試験により、デザイン化ターゲットプローブはSplC-C7プローブに対して5 倍の優先性および(GCG)6プローブに対しては37倍の優先性が判明した。このこと ならびに9bpのC7ハーフサイト、5'-GCGTGGGCG-3'を含むプローブを用いた結合試 験は、結合部位を横切って広がる突然変異は、結合部位の一末端で生じるものよ リも結合に対して破壊的であることを示すものである。この挙動は、所与のフィ ンガー結合部位内の突然変異は両方の隣接フィンガーの最適結合様式を獲得する 能 力に作用するので、ポリダクチルタンパク質について予想される。同様の結果が SplC-C7タンパク質についても得られた(表２)。C7-C7およびSplC-C7タンパク質 の結合をさらに調べるために、DNアーゼIフットプリントアッセイを行った(図18 )。これらの試験により、両方のMBP融合物が、配列特異的に結合している18bp部 位よりもわずかに大きいDNA結合部位を保護するということが示された。これは 、タンパク質のN末端におけるMBP融合およびタンパク質のC末端におけるデカペ プチドエピトープタグによる立体的遮断によるものと考えられる。転写活性化および抑制 。生細胞における6フィンガータンパク質の特異性を調べ るために、本発明者らは、C7-C7およびSplC-C7タンパク質を、SV40ラージT抗原 （Pro-Lys-Lys-Arg-Lys-Val）(Kalderon，D.，Roberts，B.L.，Richardson，W.D ．& Smith，A.E.(1984)Cell 39，499-509)由来の核局在化シグナルならびに単純 ヘルペスウイルスVP16タンパク質由来の転写活性化ドメインに融合する真核細胞 発現ベクターを構築した。これらのプラスミドを、SV40プロモーター（pGL3-プ ロモーター）の調節下でホタルルシフェラーゼ遺伝子を発現するレポータープラ スミドと共にヒトHeLa細胞系に同時トランスフェクトした。レポータープラスミ ドは、SV40プロモーターの上流にC7-C7、SplC-C7、C7および(GCG)6結合部位を配 置して構築した。C7-C7タンパク質を用いたこれらの試験結果を図19に示す。C7- C7およびSplC-C7の両方が用量依存性様式でプロモーターの活性を刺激した。C7- C7の場合、C7-C7結合部位を含むプラスミドに対して、バックグラウンドの＞300 倍の発現の刺激が観察され、一方、同様の濃度のタンパク質は、C7およびSplC-C 7を含むプラスミドの発現を約3倍だけ刺激した。このタンパク質のin vivo特異 性は、適正な結合部位を有するレポータープラスミドが結合部位の変異体を含む プラスミドの約100倍の活性化を有することにより示され、これは、表1に記載さ れたin vitro結合アッセイにおいて測定されたものより約５〜10倍上回っている 。この増強された特異性は、in vitro結合アッセイで用いられたC7-C7融合タン パク質のN末端におけるマルトース結合タンパク質により生じた相互作用による ものであり得る。完全に折りたたまれた状態にある精製タンパク質を得ることの 困難性も、in vitroアッセイにおける特異性の低下に寄与し得る。 本発明を好ましい実施態様に関して説明したが、種々の変更が本発明の精神か ら逸脱することなくなされ得るということは理解されるべきである。したがって 、本発明は、下記の特許請求の範囲によってのみ限定される。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 14/47 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ， ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，Ｌ Ｓ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ， ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，Ｅ Ｅ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，Ｍ Ｄ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ， ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，Ｕ Ｚ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ガッテスフィールド，ジョエル，エム. アメリカ合衆国 92122 カリフォルニア 州，サンディエゴ，マンゴー ドライブ 14269 (72)発明者 ライト，ピーター，イー. アメリカ合衆国 92037 カリフォルニア 州，ラ ホヤ，ルー ミシェル 7721

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 1. 細胞性ヌクレオチド配列と結合して該細胞性ヌクレオチド配列の機能を調節 するジンクフィンガーモジュールを少なくとも２個含んでなる、単離されたジ ンクフィンガー-ヌクレオチド結合性ポリペプチド変異体。 2. 前記調節が該細胞性ヌクレオチド配列と機能的に連結された遺伝子の転写の 増強である、請求項１に記載の変異体。 3. 前記調節が該細胞性ヌクレオチド配列と機能的に連結された遺伝子の転写の 抑制である、請求項１に記載の変異体。 4. zif268およびTFIIIAよりなる群から選択されるジンクフィンガー-ヌクレオ チド結合性ポリペプチドから誘導される、請求項１に記載の変異体。 5. 細胞性ヌクレオチド配列がDNAである、請求項１に記載の変異体。 6. 細胞性ヌクレオチド配列がRNAである、請求項１に記載の変異体。 7. 前記ポリペプチドがジンクフィンガー間にリンカー領域を含み、前記リンカ ーがアミノ酸配列TGEKPを有する、請求項１に記載の変異体。 8. 細胞性ヌクレオチド配列が構造遺伝子のヌクレオチド配列である、請求項１ に記載の変異体。 9. 細胞性ヌクレオチド配列がプロモーターのヌクレオチド配列である、請求項 １に記載の変異体。 10．前記プロモーターが腫瘍プロモーターである、請求項９に記載の変異体。 11．前記プロモーターがウイルスプロモーターである、請求項10に記載の変異体 。 12．細胞性ヌクレオチド配列がレトロウイルスのヌクレオチド配列である、請求 項１に記載の変異体。 13．レトロウイルスがヒトＴ細胞白血病ウイルス(HTLV)である、請求項12に記載 の変異体。 14．レトロウイルスがHTLV-1またはHTLV-2である、請求項13に記載の変異体。 15．レトロウイルスがヒト免疫不全ウイルス(HIV)である、請求項12に記載の変 異体。 16．レトロウイルスがHIV-1またはHIV-2である、請求項15に記載の変異体。 17．細胞性ヌクレオチド配列が腫瘍遺伝子のヌクレオチド配列である、請求項１ に記載の変異体。 18．細胞性ヌクレオチド配列が植物の細胞性ヌクレオチド配列である、請求項１ に記載の変異体。 19．請求項１に記載のジンクフィンガー-ヌクレオチド結合性ポリペプチド変異 体をコードするヌクレオチド配列。 20．請求項１に記載のジンクフィンガー-ヌクレオチド結合性ポリペプチド変異 体を含有する組換え発現ベクター。 21．治療に有効な量のジンクフィンガー-ヌクレオチド結合性ポリペプチド誘導 体または治療に有効な量のジンクフィンガー-ヌクレオチド結合性ポリペプチ ド誘導体をコードするヌクレオチド配列を、薬学的に許容される担体と共に含 有する医薬組成物であって、該誘導体が細胞性ヌクレオチド配列と結合して該 細胞性ヌクレオチド配列の機能を調節するものである、上記医薬組成物。 22．前記調節が該細胞性ヌクレオチド配列と機能的に連結された遺伝子の転写の 増強である、請求項21に記載の医薬組成物。 23．前記調節が該細胞性ヌクレオチド配列と機能的に連結された遺伝子の転写の 抑制である、請求項21に記載の医薬組成物。 24．ジンクフィンガー-ヌクレオチド結合性ポリペプチド誘導体が末端切断され た野生型ジンクフィンガー-ヌクレオチド結合性ドメインである、請求項21に 記載の医薬組成物。 25．ジンクフィンガー結合性ポリペプチド誘導体が変異型ポリペプチドである、 請求項21に記載の医薬組成物。 26．ジンクフィンガー-ヌクレオチド結合性モチーフを含む細胞性ヌクレオチド 配列を阻害する方法であって、該モチーフに結合する有効量のジンクフィンガ ー-ヌクレオチド結合性ポリペプチド誘導体を該モチーフに接触させることを 含んでなる、上記方法。 27．ジンクフィンガー結合性ポリペプチド誘導体が末端切断されたジンクフィン ガータンパク質である、請求項26に記載の方法。 28．ジンクフィンガーポリペプチド誘導体が変異型ポリペプチドである、請求項 26に記載の方法。 29．細胞性ヌクレオチド配列がDNAである、請求項26に記載の方法。 30．細胞性ヌクレオチド配列がRNAである、請求項26に記載の方法。 31．細胞性ヌクレオチド配列が構造遺伝子のヌクレオチド配列である、請求項２ ６に記載の方法。 32．細胞性ヌクレオチド配列がプロモーターのヌクレオチド配列である、請求項 26に記載の方法。 33．細胞性ヌクレオチド配列が腫瘍遺伝子のヌクレオチド配列である、請求項２ ６に記載の方法。 34．細胞性ヌクレオチド配列が植物の細胞性ヌクレオチド配列である、請求項２ ６に記載の方法。 35．ジンクフィンガー結合性ポリペプチド誘導体が変異型ボリペプチドである、 請求項31に記載の方法。 36．ジンクフィンガー-ヌクレオチド結合性モチーフを伴う細胞性ヌクレオチド 配列の調節と関連した細胞増殖性疾患の患者を治療する方法であって、ジンク フィンガー-ヌクレオチド結合性モチーフと結合して該細胞性ヌクレオチド配 列の活性を調節する有効量のジンクフィンガー-ヌクレオチド結合性ポリペプ チド誘導体を、該ジンクフィンガー-ヌクレオチド結合性モチーフに接触させ ることを含んでなる、上記方法。 37．ジンクフィンガー-ヌクレオチド結合性ポリペプチド誘導体をコードするポ リヌクレオチド配列を含有する発現ベクターが前記患者の細胞に導入される、 請求項36に記載の方法。 38．発現ベクターがウイルスである、請求項37に記載の方法。 39．前記調節が該細胞性ヌクレオチド配列と機能的に連結された遺伝子の転写の 増強である、請求項36に記載の方法。 40．前記調節が該細胞性ヌクレオチド配列と機能的に連結された遺伝子の転写の 抑制である、請求項36に記載の方法。 41．細胞性ヌクレオチド配列と結合して該細胞性ヌクレオチド配列の機能を調 節するジンクフィンガーモジュールを少なくとも４個含んでなる、単離されたジ ンクフィンガー-ヌクレオチド結合性ポリペプチド変異体。 42．細胞性ヌクレオチド配列と結合して該細胞性ヌクレオチド配列の機能を調節 するジンクフィンガーモジュールを少なくとも６個含んでなる、請求項１に記載 の単離されたジンクフィンガー-ヌクレオチド結合性ポリペプチド変異体。 43．前記ポリペプチドが18連続塩基対を有する細胞性ヌクレオチド配列と結合す る、請求項１に記載の単離されたジンクフィンガー-ヌクレオチド結合性ポリペ プチド変異体。 44．前記ポリペプチドが９塩基対の結合部位を２つ含む細胞性ヌクレオチド配列 と結合する、請求項１に記載の単離されたジンクフィンガー-ヌクレオチド結合 性ポリペプチド変異体。 45．２つの９塩基対結合部位がさまざまな数のヌクレオチドにより分離されてい る、請求項44に記載の単離されたジンクフィンガー-ヌクレオチド結合性ポリペ プチド変異体。 46．２つの９塩基対結合部位が連続している、請求項44に記載の単離されたジン クフィンガー-ヌクレオチド結合性ポリペプチド変異体。 47．前記ヌクレオチド配列と機能的に連結している転写活性化ドメインをさらに 含む、請求項19に記載のヌクレオチド配列。 48．転写活性化ドメインが単純ヘルペスウイルスのVP16タンパク質である、請求 項47に記載のヌクレオチド配列。 49．前記ヌクレオチド配列と機能的に連結しているリプレッサードメインをさら に含む、請求項19に記載のヌクレオチド配列。 50．リプレッサードメインがクルッペル関連ボックスAドメイン(KRAB-A)である 、請求項49に記載のヌクレオチド配列。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010512745A (ja) * 2006-12-14 2010-04-30 ダウ アグロサイエンシィズ エルエルシー 最適化された非正準ジンクフィンガータンパク質
WO2021029391A1 (ja) * 2019-08-09 2021-02-18 国立研究開発法人産業技術総合研究所 人工遺伝子及び遺伝子変異方法

Families Citing this family (368)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050084885A1 (en) * 1994-01-18 2005-04-21 The Scripps Research Institute Zinc finger protein derivatives and methods therefor
US6140466A (en) 1994-01-18 2000-10-31 The Scripps Research Institute Zinc finger protein derivatives and methods therefor
US7285416B2 (en) * 2000-01-24 2007-10-23 Gendaq Limited Regulated gene expression in plants
GB9824544D0 (en) 1998-11-09 1999-01-06 Medical Res Council Screening system
USRE45721E1 (en) 1994-08-20 2015-10-06 Gendaq, Ltd. Relating to binding proteins for recognition of DNA
US7262055B2 (en) 1998-08-25 2007-08-28 Gendaq Limited Regulated gene expression in plants
US20030104361A1 (en) * 1997-09-29 2003-06-05 Susan Weininger Method of detection of nucleic acids with a specific sequence composition
US6171820B1 (en) 1995-12-07 2001-01-09 Diversa Corporation Saturation mutagenesis in directed evolution
GB9710809D0 (en) 1997-05-23 1997-07-23 Medical Res Council Nucleic acid binding proteins
FR2767135B1 (fr) 1997-08-06 2002-07-12 Genset Sa Recepteur complexe lsr, activite, clonage, et application au diagnostic, a la prevention et/ou au traitement de d'obesite et des risques ou complications associes
US6410248B1 (en) 1998-01-30 2002-06-25 Massachusetts Institute Of Technology General strategy for selecting high-affinity zinc finger proteins for diverse DNA target sites
JP4309051B2 (ja) * 1998-03-02 2009-08-05 マサチューセッツ インスティテュート オブ テクノロジー 改善したリンカーを有するポリジンクフィンガータンパク質
DE69932813D1 (de) 1998-03-17 2006-09-28 Gendaq Ltd Nukleinsäurebindungsproteine
ATE397064T1 (de) 1998-11-04 2008-06-15 Serono Genetics Inst Sa Genomische und vollständige cdna sequenzen von menschlichem adipozyten spezifischem apm1 und biallelische marker davon
US7013219B2 (en) * 1999-01-12 2006-03-14 Sangamo Biosciences, Inc. Regulation of endogenous gene expression in cells using zinc finger proteins
US7070934B2 (en) 1999-01-12 2006-07-04 Sangamo Biosciences, Inc. Ligand-controlled regulation of endogenous gene expression
US6599692B1 (en) * 1999-09-14 2003-07-29 Sangamo Bioscience, Inc. Functional genomics using zinc finger proteins
US6534261B1 (en) 1999-01-12 2003-03-18 Sangamo Biosciences, Inc. Regulation of endogenous gene expression in cells using zinc finger proteins
US6453242B1 (en) * 1999-01-12 2002-09-17 Sangamo Biosciences, Inc. Selection of sites for targeting by zinc finger proteins and methods of designing zinc finger proteins to bind to preselected sites
ES2323445T3 (es) 1999-02-10 2009-07-16 Serono Genetics Institute S.A. Marcadores polimorficos del gen lsr.
US7030215B2 (en) 1999-03-24 2006-04-18 Sangamo Biosciences, Inc. Position dependent recognition of GNN nucleotide triplets by zinc fingers
US6794136B1 (en) 2000-11-20 2004-09-21 Sangamo Biosciences, Inc. Iterative optimization in the design of binding proteins
US20030104526A1 (en) 1999-03-24 2003-06-05 Qiang Liu Position dependent recognition of GNN nucleotide triplets by zinc fingers
GB9915126D0 (en) * 1999-06-30 1999-09-01 Imp College Innovations Ltd Control of gene expression
AU782115B2 (en) * 1999-09-22 2005-07-07 Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. Cell based assay
US7329728B1 (en) * 1999-10-25 2008-02-12 The Scripps Research Institute Ligand activated transcriptional regulator proteins
DE60023936T2 (de) 1999-12-06 2006-05-24 Sangamo Biosciences Inc., Richmond Methoden zur verwendung von randomisierten zinkfingerprotein-bibliotheken zur identifizierung von genfunktionen
US20020058617A1 (en) 2000-01-14 2002-05-16 Joachim Fruebis OBG3 globular head and uses thereof for decreasing body mass
US6989367B2 (en) 2000-01-14 2006-01-24 Genset S.A. OBG3 globular head and uses thereof
US6566332B2 (en) 2000-01-14 2003-05-20 Genset S.A. OBG3 globular head and uses thereof for decreasing body mass
US7338787B2 (en) 2000-01-14 2008-03-04 Serono Genetics Institute S.A. Nucleic acids encoding OBG3 globular head and uses thereof
US7151201B2 (en) 2000-01-21 2006-12-19 The Scripps Research Institute Methods and compositions to modulate expression in plants
EP1276869A2 (en) * 2000-01-21 2003-01-22 The Scripps Research Institute Methods and compositions to modulate expression in plants
ATE355368T1 (de) * 2000-01-24 2006-03-15 Gendaq Ltd Nucleinsäure bindende polypeptide gekennzeichnet durch flexible linker verbundene nucleinsäuredomäne
WO2001053478A2 (en) * 2000-01-24 2001-07-26 Gendaq Limited Methods for regulating transcription in plants by introduction of engireed zinc finger polypeptides
EP1254369B1 (en) * 2000-02-08 2010-10-06 Sangamo BioSciences, Inc. Cells for drug discovery
IL150841A0 (en) * 2000-02-09 2003-02-12 Hokuriku Pharmaceutical 1h-imidazopyridine derivatives
WO2001059094A2 (en) * 2000-02-11 2001-08-16 The Salk Institute For Biological Studies Method of regulating transcription in a cell by altering remodeling of cromatin
US20020061512A1 (en) * 2000-02-18 2002-05-23 Kim Jin-Soo Zinc finger domains and methods of identifying same
US7923542B2 (en) 2000-04-28 2011-04-12 Sangamo Biosciences, Inc. Libraries of regulatory sequences, methods of making and using same
WO2001083819A2 (en) 2000-04-28 2001-11-08 Sangamo Biosciences, Inc. Methods for designing exogenous regulatory molecules
CA2407745C (en) 2000-04-28 2011-11-22 Sangamo Biosciences, Inc. Databases of regulatory sequences; methods of making and using same
AU2001257421A1 (en) 2000-04-28 2001-11-12 Sangamo Biosciences, Inc. Pharmacogenomics and identification of drug targets by reconstruction of signal transduction pathways based on sequences of accessible regions
DE60136272D1 (de) 2000-04-29 2008-12-04 Univ Iowa Res Found Diagnostika und therapeutika für makula degeneration erkrankungen
US20040039175A1 (en) * 2000-05-08 2004-02-26 Yen Choo Modulation of viral gene expression by engineered zinc finger proteins
GB0016890D0 (en) * 2000-07-11 2000-08-30 Univ Glasgow Herpes zinc finger motifs
US7011972B2 (en) 2000-07-18 2006-03-14 The Scripps Research Institute Fusion polypeptide comprising two ligand binding domains
EP1303608A2 (en) * 2000-07-21 2003-04-23 Syngenta Participations AG Zinc finger domain recognition code and uses thereof
AU2002211703A1 (en) * 2000-10-13 2002-04-22 Crosslink Genetics Corporation Artificial transcriptional factors and methods of use
US6905816B2 (en) * 2000-11-27 2005-06-14 Intelligent Medical Devices, Inc. Clinically intelligent diagnostic devices and methods
US7067317B2 (en) * 2000-12-07 2006-06-27 Sangamo Biosciences, Inc. Regulation of angiogenesis with zinc finger proteins
US7026462B2 (en) * 2000-12-07 2006-04-11 Sangamo Biosciences, Inc. Regulation of angiogenesis with zinc finger proteins
DK1353941T3 (da) * 2001-01-22 2013-06-17 Sangamo Biosciences Inc Modificerede zinkfingerbindingsproteiner
AU2002225187A1 (en) * 2001-01-22 2002-07-30 Sangamo Biosciences, Inc. Zinc finger polypeptides and their use
US20050089932A1 (en) * 2001-04-26 2005-04-28 Avidia Research Institute Novel proteins with targeted binding
US20050048512A1 (en) * 2001-04-26 2005-03-03 Avidia Research Institute Combinatorial libraries of monomer domains
US20040175756A1 (en) * 2001-04-26 2004-09-09 Avidia Research Institute Methods for using combinatorial libraries of monomer domains
DE60228082D1 (de) 2001-05-31 2008-09-18 Novartis Ag Nten und neue liganden und pharmazeutische zusammensetzungen
CA2457095A1 (en) * 2001-08-17 2003-02-27 Toolgen, Inc. Zinc finger domain libraries
EP1421177A4 (en) * 2001-08-20 2006-06-07 Scripps Research Inst ZINC FINGER FASTENING DOMAINS FOR CNN
US8735153B2 (en) 2001-09-24 2014-05-27 Sangamo Biosciences, Inc. Modulation of stem cells using zinc finger proteins
US20040259258A1 (en) * 2001-12-07 2004-12-23 Kim Jin-Soo Regulation of prokaryotic gene expression with zinc finger proteins
CN100463962C (zh) 2001-12-07 2009-02-25 图尔金株式会社 嵌合蛋白质的表型筛选
US7262054B2 (en) * 2002-01-22 2007-08-28 Sangamo Biosciences, Inc. Zinc finger proteins for DNA binding and gene regulation in plants
EP1476547B1 (en) * 2002-01-23 2006-12-06 The University of Utah Research Foundation Targeted chromosomal mutagenesis using zinc finger nucleases
AU2003215094B2 (en) * 2002-02-07 2008-05-29 The Scripps Research Institute Zinc finger libraries
ATE531796T1 (de) * 2002-03-21 2011-11-15 Sangamo Biosciences Inc Verfahren und zusammensetzungen zur verwendung von zinkfinger-endonukleasen zur verbesserung der homologen rekombination
US6803379B2 (en) * 2002-06-04 2004-10-12 Jose A. Fernandez-Pol Pharmacological agents and methods of treatment that inactivate pathogenic prokaryotic and eukaryotic cells and viruses by attacking highly conserved domains in structural metalloprotein and metalloenzyme targets
US7361635B2 (en) 2002-08-29 2008-04-22 Sangamo Biosciences, Inc. Simultaneous modulation of multiple genes
AU2003260973A1 (en) * 2002-09-05 2004-03-29 Toolgen, Inc. Bioinformatics analysis of cellular effects of artificial transcription factors
EP2806025B1 (en) 2002-09-05 2019-04-03 California Institute of Technology Use of zinc finger nucleases to stimulate gene targeting
US20070178454A1 (en) * 2002-10-21 2007-08-02 Joung J K Context sensitive paralell optimization of zinc finger dna binding domains
US20060246440A1 (en) * 2002-10-23 2006-11-02 Joung J K Methods for producing zinc finger proteins that bind to extended dna target sequences
CN100398652C (zh) * 2002-12-09 2008-07-02 图尔金株式会社 调节性锌指蛋白
CN101018864A (zh) 2002-12-26 2007-08-15 先正达合作有限公司 细胞增殖相关多肽及其应用
US20060007386A1 (en) * 2003-02-21 2006-01-12 Extellus Usa Flat top tunable filter with integrated detector
US8071285B1 (en) 2003-05-14 2011-12-06 Carl Henry Lawyer Zinc finger protein derivatives and methods of using same
US11311574B2 (en) 2003-08-08 2022-04-26 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for targeted cleavage and recombination
US7888121B2 (en) * 2003-08-08 2011-02-15 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for targeted cleavage and recombination
US20120196370A1 (en) 2010-12-03 2012-08-02 Fyodor Urnov Methods and compositions for targeted genomic deletion
US7638306B2 (en) * 2003-08-08 2009-12-29 Fermalogic, Inc. Process of increasing cellular production of biologically active compounds
CA2534296C (en) 2003-08-08 2013-03-26 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for targeted cleavage and recombination
US8409861B2 (en) * 2003-08-08 2013-04-02 Sangamo Biosciences, Inc. Targeted deletion of cellular DNA sequences
US7407776B2 (en) 2003-09-19 2008-08-05 Sangamo Biosciences, Inc. Engineered zinc finger proteins for regulation of gene expression
US7972854B2 (en) 2004-02-05 2011-07-05 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for targeted cleavage and recombination
ES2315859T3 (es) * 2004-04-08 2009-04-01 Sangamo Biosciences, Inc. Metodos y composiciones para tratar afecciones neuropaticas y neurodegenerativas.
JP4564052B2 (ja) * 2004-04-08 2010-10-20 サンガモ バイオサイエンシズ インコーポレイテッド 心筋収縮能調節用の方法及び組成物
US20060063231A1 (en) * 2004-09-16 2006-03-23 Sangamo Biosciences, Inc. Compositions and methods for protein production
EP2166098B1 (en) 2004-10-05 2013-11-06 SunGene GmbH Constitutive expression cassettes for regulation of plant expression
EP1655364A3 (en) 2004-11-05 2006-08-02 BASF Plant Science GmbH Expression cassettes for seed-preferential expression in plants
EP2163631B1 (en) 2004-11-25 2013-05-22 SunGene GmbH Expression cassettes for guard cell-preferential expression in plants
EP1666599A3 (en) 2004-12-04 2006-07-12 SunGene GmbH Expression cassettes for mesophyll- and/or epidermis-preferential expression in plants
EP2072620B1 (en) 2004-12-08 2013-05-08 SunGene GmbH Expression casstettes for vascular tissue-preferential expression in plants
EP1669456A3 (en) 2004-12-11 2006-07-12 SunGene GmbH Expression cassettes for meristem-preferential expression in plants
MX2007008568A (es) 2005-01-14 2008-01-11 Univ Guelph Gen y proteina de deteccion de azucar regulados por nitrogeno y modulacion de los mismos.
US8884098B2 (en) 2005-02-09 2014-11-11 Basf Plant Science Gmbh Expression cassettes for regulation of expression in monocotyledonous plants
WO2006089950A2 (en) 2005-02-26 2006-08-31 Basf Plant Science Gmbh Expression cassettes for seed-preferential expression in plants
EP2314614B1 (en) 2005-02-28 2015-11-25 Sangamo BioSciences, Inc. Anti-angiogenic methods and compositions
BRPI0614070A2 (pt) 2005-05-10 2018-07-31 Basf Plant Science Gmbh cassetes de expressão, sequência de nucleotídeos isolada, seqüência sintética reguladora de transcrição, métodos para proporcionar uma seqüência sintética de nucleotídeos reguladora de transcrição, e um cassete de expressão, vetor, organismo não-humano ou célula hospedeira transgênico(a), e, célula de planta ou planta transgênica
SG10201508995QA (en) 2005-07-26 2015-11-27 Sangamo Biosciences Inc Targeted integration and expression of exogenous nucleic acid sequences
WO2007024997A2 (en) * 2005-08-22 2007-03-01 Fermalogic, Inc. Methods of increasing production of secondary metabolites
AU2006287553A1 (en) 2005-09-08 2007-03-15 Chromatin, Inc. Plants modified with mini-chromosomes
WO2007106603A2 (en) * 2006-01-06 2007-09-20 The Scripps Research Institute Specific labeling of proteins with zinc finger tags and use of zinc-finger-tagged proteins for analysis
CA2641198A1 (en) * 2006-02-09 2007-08-16 Sangamo Biosciences, Inc. Method for treating peripheral arterial disease with zinc finger proteins
CA2650414A1 (en) * 2006-05-19 2007-11-29 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for inactivation of dihydrofolate reductase
EP2213731B1 (en) 2006-05-25 2013-12-04 Sangamo BioSciences, Inc. Variant foki cleavage half-domains
US7951925B2 (en) 2006-05-25 2011-05-31 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for gene inactivation
US9428756B2 (en) 2006-08-11 2016-08-30 Dow Agrosciences Llc Zinc finger nuclease-mediated homologous recombination
KR100812110B1 (ko) * 2006-10-24 2008-03-12 한국과학기술원 징크 핑거 단백질과 원핵 생물의 전사 인자를 포함하는인공 전사 인자의 제조 및 이의 이용
WO2008060510A2 (en) 2006-11-13 2008-05-22 Sangamo Biosciences, Inc. Zinc finger nuclease for targeting the human glucocorticoid receptor locus
CA2675926A1 (en) 2007-02-16 2008-08-21 Basf Plant Science Gmbh Nucleic acid sequences for regulation of embryo-specific expression in monocotyledonous plants
CA2584934A1 (en) 2007-04-17 2008-10-17 University Of Guelph Nitrogen-regulated sugar sensing gene and protein and modulation thereof
DE602008003684D1 (de) 2007-04-26 2011-01-05 Sangamo Biosciences Inc Gezielte integration in die ppp1r12c-position
EA022877B1 (ru) 2007-05-23 2016-03-31 Зингента Партисипейшнс Аг Полинуклеотид гена стрелкования b сахарной свеклы и его применение
US8912392B2 (en) 2007-06-29 2014-12-16 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods for altering the genome of a monocot plant cell
WO2009009086A2 (en) * 2007-07-12 2009-01-15 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for inactivating alpha 1,6 fucosyltransferase (fut 8) gene expression
US8563314B2 (en) 2007-09-27 2013-10-22 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for modulating PD1
CA2937438C (en) 2007-09-27 2020-07-07 Dow Agrosciences Llc Engineered zinc finger proteins targeting 5-enolpyruvyl shikimate-3-phosphate synthase genes
US11235026B2 (en) 2007-09-27 2022-02-01 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for modulating PD1
US9506120B2 (en) * 2007-09-27 2016-11-29 Sangamo Biosciences, Inc. Rapid in vivo identification of biologically active nucleases
US8936936B2 (en) * 2007-10-25 2015-01-20 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for targeted integration
JP2011518555A (ja) * 2008-04-14 2011-06-30 サンガモ バイオサイエンシーズ， インコーポレイテッド 標的組込みのための線形ドナーコンストラクト
JP5746016B2 (ja) * 2008-04-30 2015-07-08 サンバイオ，インコーポレイティド Ｄｎａメチル化における改変を伴う神経再生細胞連邦政府の援助に関する申告適用なし
US9394531B2 (en) * 2008-05-28 2016-07-19 Sangamo Biosciences, Inc. Compositions for linking DNA-binding domains and cleavage domains
CA2763147C (en) * 2008-06-04 2018-07-24 Cellera, Inc. Alkaline membrane fuel cells and apparatus and methods for supplying water thereto
CA2893175C (en) 2008-06-10 2016-09-06 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for generation of bax- and bak-deficient cell lines
CN102123778B (zh) * 2008-08-14 2014-10-29 李伟德 利用离心力的动态过滤装置
CA2734235C (en) 2008-08-22 2019-03-26 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for targeted single-stranded cleavage and targeted integration
WO2010053518A2 (en) 2008-10-29 2010-05-14 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for inactivating glutamine synthetase gene expression
US20110023153A1 (en) * 2008-12-04 2011-01-27 Sigma-Aldrich Co. Genomic editing of genes involved in alzheimer's disease
US20110023159A1 (en) * 2008-12-04 2011-01-27 Sigma-Aldrich Co. Ovine genome editing with zinc finger nucleases
US20110023148A1 (en) * 2008-12-04 2011-01-27 Sigma-Aldrich Co. Genome editing of addiction-related genes in animals
US20110023150A1 (en) * 2008-12-04 2011-01-27 Sigma-Aldrich Co. Genome editing of genes associated with schizophrenia in animals
US20110023143A1 (en) * 2008-12-04 2011-01-27 Sigma-Aldrich Co. Genomic editing of neurodevelopmental genes in animals
US20110023147A1 (en) * 2008-12-04 2011-01-27 Sigma-Aldrich Co. Genomic editing of prion disorder-related genes in animals
US20110023149A1 (en) * 2008-12-04 2011-01-27 Sigma-Aldrich Co. Genomic editing of genes involved in tumor suppression in animals
US20110016543A1 (en) * 2008-12-04 2011-01-20 Sigma-Aldrich Co. Genomic editing of genes involved in inflammation
US20110023145A1 (en) * 2008-12-04 2011-01-27 Sigma-Aldrich Co. Genomic editing of genes involved in autism spectrum disorders
US20110016542A1 (en) * 2008-12-04 2011-01-20 Sigma-Aldrich Co. Canine genome editing with zinc finger nucleases
US20110023158A1 (en) * 2008-12-04 2011-01-27 Sigma-Aldrich Co. Bovine genome editing with zinc finger nucleases
US20110023141A1 (en) * 2008-12-04 2011-01-27 Sigma-Aldrich Co. Genomic editing of genes involved with parkinson's disease
US20110023140A1 (en) * 2008-12-04 2011-01-27 Sigma-Aldrich Co. Rabbit genome editing with zinc finger nucleases
US20110016540A1 (en) * 2008-12-04 2011-01-20 Sigma-Aldrich Co. Genome editing of genes associated with trinucleotide repeat expansion disorders in animals
US20110023152A1 (en) * 2008-12-04 2011-01-27 Sigma-Aldrich Co. Genome editing of cognition related genes in animals
US20110016539A1 (en) * 2008-12-04 2011-01-20 Sigma-Aldrich Co. Genome editing of neurotransmission-related genes in animals
US20110023139A1 (en) * 2008-12-04 2011-01-27 Sigma-Aldrich Co. Genomic editing of genes involved in cardiovascular disease
US20110023144A1 (en) * 2008-12-04 2011-01-27 Sigma-Aldrich Co. Genomic editing of genes involved in amyotrophyic lateral sclerosis disease
US20110023146A1 (en) * 2008-12-04 2011-01-27 Sigma-Aldrich Co. Genomic editing of genes involved in secretase-associated disorders
EP3156494B8 (en) 2008-12-04 2018-09-19 Sangamo Therapeutics, Inc. Genome editing in rats using zinc-finger nucleases
US20110016541A1 (en) * 2008-12-04 2011-01-20 Sigma-Aldrich Co. Genome editing of sensory-related genes in animals
US20110016546A1 (en) * 2008-12-04 2011-01-20 Sigma-Aldrich Co. Porcine genome editing with zinc finger nucleases
US20110023156A1 (en) * 2008-12-04 2011-01-27 Sigma-Aldrich Co. Feline genome editing with zinc finger nucleases
US20110023157A1 (en) * 2008-12-04 2011-01-27 Sigma-Aldrich Co. Equine genome editing with zinc finger nucleases
US20110023154A1 (en) * 2008-12-04 2011-01-27 Sigma-Aldrich Co. Silkworm genome editing with zinc finger nucleases
US20110023151A1 (en) * 2008-12-04 2011-01-27 Sigma-Aldrich Co. Genome editing of abc transporters
US20110030072A1 (en) * 2008-12-04 2011-02-03 Sigma-Aldrich Co. Genome editing of immunodeficiency genes in animals
AR074783A1 (es) 2008-12-17 2011-02-09 Dow Agrosciences Llc Metodos y composiciones para expresar uno o mas productos de un acido nucleico exogeno integrado al locus zp15 de una celula vegetal
EP2393506B1 (en) 2009-02-04 2018-03-28 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for treating neuropathies
US8304368B2 (en) * 2009-02-23 2012-11-06 Cellera, Inc. Catalyst coated membrane (CCM) and catalyst film/layer for alkaline membrane fuel cells and methods of making same
JP5932632B2 (ja) 2009-03-20 2016-06-15 サンガモ バイオサイエンシーズ， インコーポレイテッド 改変された亜鉛フィンガータンパク質を使用したｃｘｃｒ４の修飾
JP6215533B2 (ja) * 2009-04-09 2017-10-18 サンガモ セラピューティクス， インコーポレイテッド 幹細胞への標的組込み
US8772008B2 (en) * 2009-05-18 2014-07-08 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for increasing nuclease activity
EP2449135B1 (en) 2009-06-30 2016-01-06 Sangamo BioSciences, Inc. Rapid screening of biologically active nucleases and isolation of nuclease-modified cells
WO2011005849A1 (en) 2009-07-08 2011-01-13 Cellular Dynamics International, Inc. Modified ips cells having a mutant form of human immunodeficiency virus (hiv) cellular entry gene
US9234016B2 (en) * 2009-07-28 2016-01-12 Sangamo Biosciences, Inc. Engineered zinc finger proteins for treating trinucleotide repeat disorders
DK2462230T3 (en) * 2009-08-03 2015-10-19 Recombinetics Inc METHODS AND COMPOSITIONS FOR TARGETED RE-MODIFICATION
NZ619886A (en) * 2009-08-11 2015-03-27 Sangamo Biosciences Inc Organisms homozygous for targeted modification
CA2770880C (en) 2009-08-24 2018-10-16 Cellera, Inc. Systems and methods of securing immunity to air co2 in alkaline fuel cells
BR112012009668B1 (pt) 2009-10-22 2022-08-16 Dow Agrosciences Llc Proteína de dedo de zinco que não ocorre naturalmente e proteína de fusão compreendendo a mesma
US8956828B2 (en) 2009-11-10 2015-02-17 Sangamo Biosciences, Inc. Targeted disruption of T cell receptor genes using engineered zinc finger protein nucleases
CA2793596A1 (en) 2009-12-30 2011-07-07 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods and compositions for targeted polynucleotide modification
EA031322B1 (ru) * 2010-01-22 2018-12-28 Дау Агросайенсиз Ллс Клетка или клеточная линия для экспрессии экзогенных нуклеотидных последовательностей и применение клетки или клеточной линии
PT2534173T (pt) 2010-02-08 2019-10-31 Sangamo Therapeutics Inc Semidomínios de clivagem manipulados
CA2788850C (en) 2010-02-09 2019-06-25 Sangamo Biosciences, Inc. Targeted genomic modification with partially single-stranded donor molecules
US8771985B2 (en) 2010-04-26 2014-07-08 Sangamo Biosciences, Inc. Genome editing of a Rosa locus using zinc-finger nucleases
EP3636766A1 (en) 2010-05-03 2020-04-15 Sangamo Therapeutics, Inc. Compositions for linking zinc finger modules
CA2798988C (en) 2010-05-17 2020-03-10 Sangamo Biosciences, Inc. Tal-effector (tale) dna-binding polypeptides and uses thereof
KR20130132247A (ko) 2010-06-07 2013-12-04 셀레라 인코포레이티드 막전해질 연료전지의 촉매/막 표면 부착을 위한 화학 결합
WO2012012667A2 (en) 2010-07-21 2012-01-26 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for modification of a hla locus
BR112013001685B1 (pt) 2010-07-23 2021-10-13 Sigma-Aldrich Co. Llc Método para editar pelo menos uma sequência cromossômica endógena em uma célula pela inserção de uma sequência na sequência cromossômica
EP2622090B1 (en) 2010-09-27 2019-06-19 Sangamo Therapeutics, Inc. Compositions for inhibiting viral entry into cells
WO2012051343A1 (en) 2010-10-12 2012-04-19 The Children's Hospital Of Philadelphia Methods and compositions for treating hemophilia b
JP2014513520A (ja) 2010-12-29 2014-06-05 シグマ−アルドリッチ・カンパニー、エルエルシー Ａｄｍｅおよび毒物学的プロセスに関与するタンパク質の乱された発現を有する細胞
US9267123B2 (en) 2011-01-05 2016-02-23 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for gene correction
MX2013010197A (es) 2011-03-18 2013-09-26 Basf Plant Science Co Gmbh Promotores para regular la expresion en plantas.
CN103842511A (zh) 2011-03-23 2014-06-04 先锋国际良种公司 产生复合转基因性状基因座的方法
EP2694554A1 (en) 2011-04-08 2014-02-12 Gilead Biologics, Inc. Methods and compositions for normalization of tumor vasculature by inhibition of loxl2
BR112013025567B1 (pt) 2011-04-27 2021-09-21 Amyris, Inc Métodos para modificação genômica
CN104080914A (zh) 2011-06-21 2014-10-01 先锋国际良种公司 产生雄性不育植物的组合物和方法
US8980583B2 (en) 2011-06-30 2015-03-17 Sigma-Aldrich Co. Llc Cells deficient in CMP-N-acetylneuraminic acid hydroxylase and/or glycoprotein alpha-1,3-galactosyltransferase
EP2737063B1 (en) 2011-07-25 2016-06-01 Sangamo BioSciences, Inc. Methods and compositions for alteration of a cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (cftr) gene
ES2961613T3 (es) 2011-09-21 2024-03-12 Sangamo Therapeutics Inc Métodos y composiciones para la regulación de la expresión transgénica
WO2013059507A1 (en) 2011-10-20 2013-04-25 University Of Iowa Research Foundation N-demethyase genes and uses thereof
AU2012328682B2 (en) 2011-10-27 2017-09-21 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for modification of the HPRT locus
US9458205B2 (en) 2011-11-16 2016-10-04 Sangamo Biosciences, Inc. Modified DNA-binding proteins and uses thereof
CN110438083A (zh) 2012-01-11 2019-11-12 西格马-奥尔德里奇有限责任公司 具有简单糖型的重组蛋白的产生
JP6023218B2 (ja) 2012-01-27 2016-11-09 サンバイオ，インコーポレイティド 血管新生及び血管発生を調節するための方法及び組成物
JP6309461B2 (ja) 2012-02-28 2018-04-11 シグマ−アルドリッチ・カンパニー・リミテッド・ライアビリティ・カンパニーＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．， ＬＬＣ ヒストンアセチル化の標的化
KR102084539B1 (ko) 2012-02-29 2020-03-04 상가모 테라퓨틱스, 인코포레이티드 헌팅턴병을 치료하기 위한 방법 및 조성물
JP6352250B2 (ja) 2012-05-02 2018-07-04 ダウ アグロサイエンシィズ エルエルシー リンゴ酸デヒドロゲナーゼの標的改変
WO2013169802A1 (en) 2012-05-07 2013-11-14 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for nuclease-mediated targeted integration of transgenes
EP2861740A1 (en) 2012-06-15 2015-04-22 University of Iowa Research Foundation Caffeine responsive promoters and regulatory genes
HUE051612T2 (hu) 2012-07-11 2021-03-01 Sangamo Therapeutics Inc Eljárások és készítmények lizoszomális tárolási betegségek kezelésére
US10648001B2 (en) 2012-07-11 2020-05-12 Sangamo Therapeutics, Inc. Method of treating mucopolysaccharidosis type I or II
EP2872154B1 (en) 2012-07-11 2017-05-31 Sangamo BioSciences, Inc. Methods and compositions for delivery of biologics
KR102474010B1 (ko) 2012-08-29 2022-12-02 상가모 테라퓨틱스, 인코포레이티드 유전적 병태를 치료하기 위한 방법 및 조성물
EP2893022B1 (en) 2012-09-04 2020-05-13 The Scripps Research Institute Chimeric polypeptides having targeted binding specificity
US9937205B2 (en) 2012-09-04 2018-04-10 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Inhibition of diacylglycerol kinase to augment adoptive T cell transfer
EP3406715B1 (en) 2012-09-07 2023-12-13 Corteva Agriscience LLC Fad3 performance loci and corresponding target site specific binding proteins capable of inducing targeted breaks
UA119135C2 (uk) 2012-09-07 2019-05-10 ДАУ АГРОСАЙЄНСІЗ ЕлЕлСі Спосіб отримання трансгенної рослини
UA118090C2 (uk) 2012-09-07 2018-11-26 ДАУ АГРОСАЙЄНСІЗ ЕлЕлСі Спосіб інтегрування послідовності нуклеїнової кислоти, що представляє інтерес, у ген fad2 у клітині сої та специфічний для локусу fad2 білок, що зв'язується, здатний індукувати спрямований розрив
DK2906684T3 (da) 2012-10-10 2020-09-28 Sangamo Therapeutics Inc T-celle-modificerende forbindelser og anvendelser deraf
WO2014089212A1 (en) 2012-12-05 2014-06-12 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for regulation of metabolic disorders
RU2015128052A (ru) 2012-12-13 2017-01-19 Дау Агросайенсиз Ллс Точный таргетинг генов в отношении конкретного локуса кукурузы
EP3919505B1 (en) 2013-01-16 2023-08-30 Emory University Uses of cas9-nucleic acid complexes
DK2963113T3 (da) 2013-02-14 2020-02-17 Univ Osaka Fremgangsmåde til isolering af specifik genomregion under anvendelse af molekyle, der binder specifikt til endogen dna-sekvens
US10227610B2 (en) 2013-02-25 2019-03-12 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for enhancing nuclease-mediated gene disruption
WO2014153470A2 (en) 2013-03-21 2014-09-25 Sangamo Biosciences, Inc. Targeted disruption of t cell receptor genes using engineered zinc finger protein nucleases
KR102223568B1 (ko) 2013-04-05 2021-03-04 다우 아그로사이언시즈 엘엘씨 식물의 게놈 내의 외인성 서열의 통합을 위한 방법 및 조성물
WO2014182700A1 (en) 2013-05-10 2014-11-13 Sangamo Biosciences, Inc. Delivery methods and compositions for nuclease-mediated genome engineering
CN116083487A (zh) 2013-05-15 2023-05-09 桑格摩生物治疗股份有限公司 用于治疗遗传病状的方法和组合物
WO2015031619A1 (en) 2013-08-28 2015-03-05 Sangamo Biosciences, Inc. Compositions for linking dna-binding domains and cleavage domains
EP3057432B1 (en) 2013-10-17 2018-11-21 Sangamo Therapeutics, Inc. Delivery methods and compositions for nuclease-mediated genome engineering in hematopoietic stem cells
CN116836957A (zh) 2013-10-17 2023-10-03 桑格摩生物科学股份有限公司 用于核酸酶介导的基因组工程改造的递送方法和组合物
NZ719494A (en) 2013-11-04 2017-09-29 Dow Agrosciences Llc Optimal maize loci
BR102014027436B1 (pt) 2013-11-04 2022-06-28 Dow Agrosciences Llc Molécula de ácido nucleico recombinante, e método para a produção de uma célula vegetal transgênica
EP3862434A1 (en) 2013-11-04 2021-08-11 Dow AgroSciences LLC Optimal soybean loci
AU2014341929B2 (en) 2013-11-04 2017-11-30 Corteva Agriscience Llc Optimal maize loci
CN105934524A (zh) 2013-11-11 2016-09-07 桑格摩生物科学股份有限公司 用于治疗亨廷顿氏病的方法和组合物
PT3492593T (pt) 2013-11-13 2021-10-18 Childrens Medical Center Regulação da expressão de genes mediada por nucleases
EP3757116A1 (en) 2013-12-09 2020-12-30 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for genome engineering
CN106029886B (zh) 2013-12-19 2021-02-05 阿迈瑞斯公司 基因组整合的方法
EP3102673B1 (en) 2014-02-03 2020-04-15 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for treatment of a beta thalessemia
EP3110454B1 (en) 2014-02-24 2020-11-18 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for nuclease-mediated targeted integration
SG11201607038TA (en) 2014-03-04 2016-09-29 Sigma Aldrich Co Llc Viral resistant cells and uses thereof
ES2879373T3 (es) 2014-03-18 2021-11-22 Sangamo Therapeutics Inc Métodos y composiciones para la regulación de la expresión de proteínas de dedo de zinc
US20150301028A1 (en) 2014-04-22 2015-10-22 Q-State Biosciences, Inc. Analysis of compounds for pain and sensory disorders
US9522936B2 (en) 2014-04-24 2016-12-20 Sangamo Biosciences, Inc. Engineered transcription activator like effector (TALE) proteins
RU2691102C2 (ru) 2014-05-08 2019-06-11 Сангамо Байосайенсиз, Инк. Способы и композиции для лечения болезни хантингтона
AU2015259191B2 (en) 2014-05-13 2019-03-21 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for prevention or treatment of a disease
BR112016028023A2 (pt) 2014-05-30 2017-08-22 Univ Leland Stanford Junior Composições e métodos de administração de tratamentos para infecções virais latentes
WO2015188056A1 (en) 2014-06-05 2015-12-10 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for nuclease design
CA2954201A1 (en) 2014-07-08 2016-01-14 Vib Vzw Means and methods to increase plant yield
US20170142942A1 (en) 2014-07-14 2017-05-25 Washington State University Nanos knock-out that ablates germline cells
US11278572B2 (en) 2014-07-18 2022-03-22 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Reducing CXCR4 expression and/or function to enhance engraftment of hematopoietic stem cells
US9816074B2 (en) 2014-07-25 2017-11-14 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for modulating nuclease-mediated genome engineering in hematopoietic stem cells
WO2016014837A1 (en) 2014-07-25 2016-01-28 Sangamo Biosciences, Inc. Gene editing for hiv gene therapy
US9616090B2 (en) 2014-07-30 2017-04-11 Sangamo Biosciences, Inc. Gene correction of SCID-related genes in hematopoietic stem and progenitor cells
PL3194570T3 (pl) 2014-09-16 2021-12-20 Sangamo Therapeutics, Inc. Sposoby i kompozycje do inżynierii genomowej w której pośredniczy nukleaza i korekty hematopoetycznych komórek macierzystych
US10889834B2 (en) 2014-12-15 2021-01-12 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for enhancing targeted transgene integration
EP3247366A4 (en) 2015-01-21 2018-10-31 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for identification of highly specific nucleases
US10048275B2 (en) 2015-03-13 2018-08-14 Q-State Biosciences, Inc. Cardiotoxicity screening methods
WO2016161446A1 (en) 2015-04-03 2016-10-06 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Composition and methods of genome editing of b-cells
US10179918B2 (en) 2015-05-07 2019-01-15 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for increasing transgene activity
MX2017014446A (es) 2015-05-12 2018-06-13 Sangamo Therapeutics Inc Regulacion de expresion genica mediada por nucleasa.
CA2986583A1 (en) 2015-05-21 2016-11-24 Q-State Biosciences, Inc. Optogenetics microscope
US10117911B2 (en) 2015-05-29 2018-11-06 Agenovir Corporation Compositions and methods to treat herpes simplex virus infections
US20160346360A1 (en) 2015-05-29 2016-12-01 Agenovir Corporation Compositions and methods for cell targeted hpv treatment
US9957501B2 (en) 2015-06-18 2018-05-01 Sangamo Therapeutics, Inc. Nuclease-mediated regulation of gene expression
WO2017011519A1 (en) 2015-07-13 2017-01-19 Sangamo Biosciences, Inc. Delivery methods and compositions for nuclease-mediated genome engineering
LT3331355T (lt) 2015-08-06 2024-07-25 The Curators Of The University Of Missouri Kiaulių reprodukcinio ir respiracinio sindromo virusui (prrsv) atsparios kiaulės ir ląstelės, turinčios modifikuotus cd163 genus
CA2998500A1 (en) 2015-09-23 2017-03-30 Sangamo Therapeutics, Inc. Htt repressors and uses thereof
JP6976249B2 (ja) 2015-11-23 2021-12-08 サンガモ セラピューティクス， インコーポレイテッド 免疫を工学操作するための方法および組成物
AU2016369490C1 (en) 2015-12-18 2021-12-23 Sangamo Therapeutics, Inc. Targeted disruption of the T cell receptor
CA3008382A1 (en) 2015-12-18 2017-06-22 Sangamo Therapeutics, Inc. Targeted disruption of the mhc cell receptor
BR112018014288A2 (pt) 2016-01-15 2018-12-18 Univ Minnesota métodos e composições para o tratamento de doença neurológica
EP3411056A4 (en) 2016-02-02 2019-10-02 Sangamo Therapeutics, Inc. COMPOUNDS FOR NETWORKING DNA BINDING DOMAINS AND SPLITTING DOMAINS
WO2017143071A1 (en) 2016-02-18 2017-08-24 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for gene editing in stem cells
JP2019515654A (ja) 2016-03-16 2019-06-13 ザ ジェイ． デヴィッド グラッドストーン インスティテューツ 肥満及び／又は糖尿病を処置するための方法及び組成物、並びに候補処置薬剤を識別するための方法及び組成物
CA3016504A1 (en) 2016-03-23 2017-09-28 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Methods for enhancing the efficiency of gene editing
US11293033B2 (en) 2016-05-18 2022-04-05 Amyris, Inc. Compositions and methods for genomic integration of nucleic acids into exogenous landing pads
AU2017295720B2 (en) 2016-07-13 2021-07-22 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Methods, compositions and kits for increasing genome editing efficiency
SG11201900447SA (en) 2016-07-21 2019-02-27 Maxcyte Inc Methods and compositions for modifying genomic dna
EP3490556A4 (en) 2016-07-27 2020-04-15 Case Western Reserve University CONNECTIONS AND METHOD FOR PROMOTING MYELINIZATION
JP7066126B2 (ja) 2016-08-09 2022-05-13 ブイアイビー ブイゼットダブリュ セルロースシンターゼ阻害剤および突然変異体植物
JP7203014B2 (ja) 2016-08-24 2023-01-12 サンガモ セラピューティクス， インコーポレイテッド 工学操作されたヌクレアーゼを使用した遺伝子発現の調節
CN110418841A (zh) 2016-08-24 2019-11-05 桑格摩生物治疗股份有限公司 工程化的靶特异性核酸酶
US10960085B2 (en) 2016-09-07 2021-03-30 Sangamo Therapeutics, Inc. Modulation of liver genes
AU2017338827B2 (en) 2016-10-03 2023-08-31 Juno Therapeutics, Inc. HPV-specific binding molecules
CA3039014A1 (en) 2016-10-04 2018-04-12 Precision Biosciences, Inc. Co-stimulatory domains for use in genetically-modified cells
US11219695B2 (en) 2016-10-20 2022-01-11 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for the treatment of Fabry disease
CA3041668A1 (en) 2016-10-31 2018-05-03 Sangamo Therapeutics, Inc. Gene correction of scid-related genes in hematopoietic stem and progenitor cells
US11504389B2 (en) 2016-12-01 2022-11-22 Sangamo Therapeutics, Inc. Tau modulators and methods and compositions for delivery thereof
ES2968892T3 (es) 2016-12-08 2024-05-14 Univ Case Western Reserve Métodos y composiciones para aumentar la producción de mielina funcional
US20180179553A1 (en) 2016-12-14 2018-06-28 Ligandal, Inc. Compositions and methods for nucleic acid and/or protein payload delivery
US20190390241A1 (en) 2017-01-24 2019-12-26 Sigma-Aldrich Co. Llc Viral resistant cells and culture systems
BR112019021993A2 (pt) 2017-04-20 2020-05-12 Oregon Health & Science University Correção de gene humano
AU2018256877B2 (en) 2017-04-28 2022-06-02 Acuitas Therapeutics, Inc. Novel carbonyl lipids and lipid nanoparticle formulations for delivery of nucleic acids
CN110869497A (zh) 2017-05-03 2020-03-06 桑格摩生物治疗股份有限公司 修饰囊性纤维化跨膜传导调节蛋白（cftr）基因的方法和组合物
WO2018208837A1 (en) 2017-05-08 2018-11-15 Precision Biosciences, Inc. Nucleic acid molecules encoding an engineered antigen receptor and an inhibitory nucleic acid molecule and methods of use thereof
US11512287B2 (en) 2017-06-16 2022-11-29 Sangamo Therapeutics, Inc. Targeted disruption of T cell and/or HLA receptors
EP3645038A1 (en) 2017-06-30 2020-05-06 Precision Biosciences, Inc. Genetically-modified t cells comprising a modified intron in the t cell receptor alpha gene
EP4269560A3 (en) 2017-10-03 2024-01-17 Precision Biosciences, Inc. Modified epidermal growth factor receptor peptides for use in genetically-modified cells
JP2020537515A (ja) 2017-10-03 2020-12-24 ジュノー セラピューティクス インコーポレイテッド Ｈｐｖ特異的結合分子
US20200299658A1 (en) 2017-11-01 2020-09-24 Precision Biosciences, Inc. Engineered nucleases that target human and canine factor viii genes as a treatment for hemophilia a
SG11202004003YA (en) 2017-11-09 2020-05-28 Sangamo Therapeutics Inc Genetic modification of cytokine inducible sh2-containing protein (cish) gene
MA50942A (fr) 2017-12-01 2020-10-07 Encoded Therapeutics Inc Protéines de liaison à l'adn modifiées
WO2019143675A1 (en) 2018-01-17 2019-07-25 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Dna-pk inhibitors
WO2019143677A1 (en) 2018-01-17 2019-07-25 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Quinoxalinone compounds, compositions, methods, and kits for increasing genome editing efficiency
US12005127B2 (en) 2018-01-17 2024-06-11 Vertex Pharmaceuticals Incorporated DNA-PK inhibitors
WO2019157324A1 (en) 2018-02-08 2019-08-15 Sangamo Therapeutics, Inc. Engineered target specific nucleases
KR20210019993A (ko) 2018-04-05 2021-02-23 주노 쎄러퓨티크스 인코퍼레이티드 Τ 세포 수용체 및 이를 발현하는 조작된 세포
EP3775237A1 (en) 2018-04-05 2021-02-17 Juno Therapeutics, Inc. T cells expressing a recombinant receptor, related polynucleotides and methods
BR112020020245A2 (pt) 2018-04-05 2021-04-06 Editas Medicine, Inc. Métodos de produzir células expressando um receptor recombinante e composições relacionadas
WO2019204226A1 (en) 2018-04-16 2019-10-24 University Of Massachusetts Compositions and methods for improved gene editing
US11421007B2 (en) 2018-04-18 2022-08-23 Sangamo Therapeutics, Inc. Zinc finger protein compositions for modulation of huntingtin (Htt)
US11690921B2 (en) 2018-05-18 2023-07-04 Sangamo Therapeutics, Inc. Delivery of target specific nucleases
AU2019326408A1 (en) 2018-08-23 2021-03-11 Sangamo Therapeutics, Inc. Engineered target specific base editors
WO2020061161A1 (en) 2018-09-18 2020-03-26 Sangamo Therapeutics, Inc. Programmed cell death 1 (pd1) specific nucleases
EP3898661A1 (en) 2018-12-21 2021-10-27 Precision BioSciences, Inc. Genetic modification of the hydroxyacid oxidase 1 gene for treatment of primary hyperoxaluria
MX2021008358A (es) 2019-01-11 2021-09-30 Acuitas Therapeutics Inc Lipidos para la administracion de agentes activos en nanoparticulas lipidicas.
CN112805026A (zh) 2019-02-06 2021-05-14 桑格摩生物治疗股份有限公司 用于治疗i型黏多糖贮积症的方法
US20220145330A1 (en) 2019-02-10 2022-05-12 The J. David Gladstone Institutes, a testamentary trust established under the Will of J. David Glads Modified mitochondrion and methods of use thereof
MX2021012152A (es) 2019-04-02 2021-11-03 Sangamo Therapeutics Inc Metodos para el tratamiento de beta-talasemia.
CN113993999B (zh) 2019-04-03 2022-11-22 精密生物科学公司 包含microRNA适应的shRNA(shRNAmiR)的遗传修饰的免疫细胞
US20220204994A1 (en) 2019-04-05 2022-06-30 Precision Biosciences, Inc. Methods of preparing populations of genetically-modified immune cells
AU2020262281A1 (en) 2019-04-23 2021-11-04 Sangamo Therapeutics, Inc. Modulators of chromosome 9 open reading frame 72 gene expression and uses thereof
KR20220016474A (ko) 2019-05-01 2022-02-09 주노 쎄러퓨티크스 인코퍼레이티드 변형된 ｃｄ247 유전자 자리로부터 키메라 수용체를 발현하는 세포, 관련 폴리뉴클레오타이드 및 방법
AU2020265741A1 (en) 2019-05-01 2021-11-25 Editas Medicine, Inc. Cells expressing a recombinant receptor from a modified TGFBR2 Locus, related polynucleotides and methods
US11781248B2 (en) 2019-06-13 2023-10-10 Allogene Therapeutics, Inc. Anti-TALEN antibodies and uses thereof
WO2020257684A1 (en) 2019-06-20 2020-12-24 University Of Massachusetts Compositions and methods for improved gene editing
WO2021016608A1 (en) 2019-07-25 2021-01-28 Precision Biosciences, Inc. Compositions and methods for sequential stacking of nucleic acid sequences into a genomic locus
EP4017526A1 (en) 2019-08-20 2022-06-29 Precision BioSciences, Inc. Lymphodepletion dosing regimens for cellular immunotherapies
WO2021035170A1 (en) 2019-08-21 2021-02-25 Precision Biosciences, Inc. Compositions and methods for tcr reprogramming using fusion proteins
WO2021067864A1 (en) 2019-10-02 2021-04-08 Sangamo Therapeutics, Inc. Zinc finger protein transcription factors for treatment of prion disease
CN114466867A (zh) 2019-10-02 2022-05-10 桑格摩生物治疗股份有限公司 用于抑制α-突触核蛋白表达的锌指蛋白转录因子
WO2021087305A1 (en) 2019-10-30 2021-05-06 Precision Biosciences, Inc. Cd20 chimeric antigen receptors and methods of use for immunotherapy
EP4051787A1 (en) 2019-11-01 2022-09-07 Sangamo Therapeutics, Inc. Gin recombinase variants
CA3160096A1 (en) 2019-12-06 2021-06-10 Bruce J. Mccreedy Jr. Methods for cancer immunotherapy
EP4093754A1 (en) 2020-01-22 2022-11-30 Sangamo Therapeutics, Inc. Zinc finger protein transcription factors for repressing tau expression
WO2021158915A1 (en) 2020-02-06 2021-08-12 Precision Biosciences, Inc. Recombinant adeno-associated virus compositions and methods for producing and using the same
US20230151342A1 (en) * 2020-02-28 2023-05-18 The Broad Institute, Inc Zinc finger degradation domains
EP4127139A1 (en) 2020-03-27 2023-02-08 Mendus B.V. Ex vivo use of modified cells of leukemic origin for enhancing the efficacy of adoptive cell therapy
US20230263121A1 (en) 2020-03-31 2023-08-24 Elo Life Systems Modulation of endogenous mogroside pathway genes in watermelon and other cucurbits
US20230212613A1 (en) 2020-05-06 2023-07-06 Cellectis S.A. Methods for targeted insertion of exogenous sequences in cellular genomes
CN115715203A (zh) 2020-05-06 2023-02-24 塞勒克提斯公司 对细胞进行基因修饰以递送治疗性蛋白质的方法
US20230183664A1 (en) 2020-05-11 2023-06-15 Precision Biosciences, Inc. Self-limiting viral vectors encoding nucleases
CN115835873A (zh) 2020-05-13 2023-03-21 朱诺治疗学股份有限公司 用于产生表达重组受体的供体分批细胞的方法
JP2023531531A (ja) 2020-06-26 2023-07-24 ジュノ セラピューティクス ゲーエムベーハー 組換え受容体を条件付きで発現する操作されたｔ細胞、関連ポリヌクレオチド、および方法
US11976019B2 (en) 2020-07-16 2024-05-07 Acuitas Therapeutics, Inc. Cationic lipids for use in lipid nanoparticles
WO2022035793A1 (en) 2020-08-10 2022-02-17 Precision Biosciences, Inc. Antibodies and fragments specific for b-cell maturation antigen and uses thereof
EP4204545A2 (en) 2020-08-25 2023-07-05 Kite Pharma, Inc. T cells with improved functionality
KR20230074519A (ko) 2020-09-25 2023-05-30 상가모 테라퓨틱스, 인코포레이티드 핵염기 편집을 위한 아연 핑거 융합 단백질
WO2022076547A1 (en) 2020-10-07 2022-04-14 Precision Biosciences, Inc. Lipid nanoparticle compositions
EP4232461A1 (en) 2020-10-23 2023-08-30 ELO Life Systems, Inc. Methods for producing vanilla plants with improved flavor and agronomic production
CN116802203A (zh) 2020-11-04 2023-09-22 朱诺治疗学股份有限公司 从经修饰的恒定cd3免疫球蛋白超家族链基因座表达嵌合受体的细胞、相关多核苷酸和方法
CN117042600A (zh) 2020-11-16 2023-11-10 猪改良英国有限公司 具有经编辑的anp32基因的抗甲型流感动物
WO2022165111A1 (en) 2021-01-28 2022-08-04 Precision Biosciences, Inc. Modulation of tgf beta signaling in genetically-modified eukaryotic cells
JP2024510989A (ja) 2021-03-12 2024-03-12 メンドゥス・ベスローテン・フェンノートシャップ ワクチン接種方法及びｃｄ４７遮断薬の使用
WO2022226316A1 (en) 2021-04-22 2022-10-27 Precision Biosciences, Inc. Compositions and methods for generating male sterile plants
MX2024002927A (es) 2021-09-08 2024-05-29 Flagship Pioneering Innovations Vi Llc Metodos y composiciones para modular un genoma.
WO2023064872A1 (en) 2021-10-14 2023-04-20 Precision Biosciences, Inc. Combinations of anti-bcma car t cells and gamma secretase inhibitors
AU2022371430A1 (en) 2021-10-19 2024-05-30 Precision Biosciences, Inc. Gene editing methods for treating alpha-1 antitrypsin (aat) deficiency
WO2023081900A1 (en) 2021-11-08 2023-05-11 Juno Therapeutics, Inc. Engineered t cells expressing a recombinant t cell receptor (tcr) and related systems and methods
KR20240103014A (ko) 2021-11-09 2024-07-03 암젠 인크 항체 펩티드 접합체 생성 방법
WO2023091910A1 (en) 2021-11-16 2023-05-25 Precision Biosciences, Inc. Methods for cancer immunotherapy
WO2023105244A1 (en) 2021-12-10 2023-06-15 Pig Improvement Company Uk Limited Editing tmprss2/4 for disease resistance in livestock
WO2023122722A1 (en) 2021-12-22 2023-06-29 Sangamo Therapeutics, Inc. Novel zinc finger fusion proteins for nucleobase editing
WO2023131616A1 (en) 2022-01-05 2023-07-13 Vib Vzw Means and methods to increase abiotic stress tolerance in plants
WO2023131637A1 (en) 2022-01-06 2023-07-13 Vib Vzw Improved silage grasses
WO2023144199A1 (en) 2022-01-26 2023-08-03 Vib Vzw Plants having reduced levels of bitter taste metabolites
WO2023168397A1 (en) 2022-03-04 2023-09-07 Sigma-Aldrich Co. Llc Metabolic selection via the asparagine biosynthesis pathway
WO2024013514A2 (en) 2022-07-15 2024-01-18 Pig Improvement Company Uk Limited Gene edited livestock animals having coronavirus resistance
WO2024073686A1 (en) 2022-09-30 2024-04-04 Sigma-Aldrich Co. Llc Metabolic selection via the serine biosynthesis pathway
WO2024073692A1 (en) 2022-09-30 2024-04-04 Sigma-Aldrich Co. Llc Metabolic selection via the glycine-formate biosynthesis pathway
WO2024100604A1 (en) 2022-11-09 2024-05-16 Juno Therapeutics Gmbh Methods for manufacturing engineered immune cells
WO2024161021A1 (en) 2023-02-03 2024-08-08 Juno Therapeutics Gmbh Methods for non-viral manufacturing of engineered immune cells
WO2024206821A1 (en) 2023-03-31 2024-10-03 Briacell Therapeutics Corp. Methods for enhancing the immunogenicity of cellular vaccines

Family Cites Families (48)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4458066A (en) 1980-02-29 1984-07-03 University Patents, Inc. Process for preparing polynucleotides
DE3410650A1 (de) 1984-03-23 1985-10-03 Kernforschungsanlage Jülich GmbH, 5170 Jülich Mit mikroorganismen bewachsene poroese anorganische traeger, verfahren zur immobilisierung von mikroorganismen und dafuer geeignete traegerkoerper
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US5455170A (en) 1986-08-22 1995-10-03 Hoffmann-La Roche Inc. Mutated thermostable nucleic acid polymerase enzyme from Thermus species Z05
US5317090A (en) * 1987-12-16 1994-05-31 Institut Pasteur Steroid/thyroid hormone receptor-related gene, which is inappropriately expressed in human hepatocellular carcinoma, and which is a retinoic acid receptor
US5324819A (en) 1988-04-08 1994-06-28 Stryker Corporation Osteogenic proteins
US5340739A (en) * 1988-07-13 1994-08-23 Brigham & Women's Hospital Hematopoietic cell specific transcriptional regulatory elements of serglycin and uses thereof
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
WO1990007517A1 (en) * 1988-12-23 1990-07-12 The Salk Institute For Biological Studies Receptor transcription-repression activity compositions and methods
US5198346A (en) * 1989-01-06 1993-03-30 Protein Engineering Corp. Generation and selection of novel DNA-binding proteins and polypeptides
US5096815A (en) * 1989-01-06 1992-03-17 Protein Engineering Corporation Generation and selection of novel dna-binding proteins and polypeptides
US4990607A (en) * 1989-03-14 1991-02-05 The Rockefeller University Alteration of gene expression in plants
JPH04505012A (ja) * 1989-03-17 1992-09-03 ザ・ソーク・インスティチュート・フォー・バイオロジカル・スタディーズ ホルモン応答要素組成物およびアッセイ
US5202422A (en) 1989-10-27 1993-04-13 The Scripps Research Institute Compositions containing plant-produced glycopolypeptide multimers, multimeric proteins and method of their use
WO1991007509A1 (en) * 1989-11-13 1991-05-30 Massachusetts Institute Of Technology Localization and characterization of the wilms's tumor gene
US5578482A (en) 1990-05-25 1996-11-26 Georgetown University Ligand growth factors that bind to the erbB-2 receptor protein and induce cellular responses
CA2090407A1 (en) 1990-09-21 1992-03-22 Ronald M. Evans Functional antagonism between proto-oncoprotein c-jun and hormone receptors
US5348864A (en) 1991-01-25 1994-09-20 E. R. Squibb & Sons, Inc. Mouse vav proto-oncogene DNA and protein sequences
US5871907A (en) 1991-05-15 1999-02-16 Medical Research Council Methods for producing members of specific binding pairs
US5324818A (en) * 1991-08-21 1994-06-28 The Regents Of The University Of Michigan Proteins useful in the regulation of κB-containing genes
US5243041A (en) * 1991-08-22 1993-09-07 Fernandez Pol Jose A DNA vector with isolated CDNA gene encoding metallopanstimulin
US5302519A (en) 1991-09-09 1994-04-12 Fred Hutchinson Cancer Research Center Method of producing a Mad polypeptide
US5270170A (en) 1991-10-16 1993-12-14 Affymax Technologies N.V. Peptide library and screening method
US5792640A (en) 1992-04-03 1998-08-11 The Johns Hopkins University General method to clone hybrid restriction endonucleases using lig gene
US5487994A (en) 1992-04-03 1996-01-30 The Johns Hopkins University Insertion and deletion mutants of FokI restriction endonuclease
US5436150A (en) 1992-04-03 1995-07-25 The Johns Hopkins University Functional domains in flavobacterium okeanokoities (foki) restriction endonuclease
US5916794A (en) 1992-04-03 1999-06-29 Johns Hopkins University Methods for inactivating target DNA and for detecting conformational change in a nucleic acid
US5356802A (en) 1992-04-03 1994-10-18 The Johns Hopkins University Functional domains in flavobacterium okeanokoites (FokI) restriction endonuclease
US5324638A (en) * 1992-05-13 1994-06-28 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Brain transcription factor, nucleic acids encoding same and uses thereof
US6140466A (en) 1994-01-18 2000-10-31 The Scripps Research Institute Zinc finger protein derivatives and methods therefor
WO1995019431A1 (en) * 1994-01-18 1995-07-20 The Scripps Research Institute Zinc finger protein derivatives and methods therefor
US6242568B1 (en) * 1994-01-18 2001-06-05 The Scripps Research Institute Zinc finger protein derivatives and methods therefor
AU3331595A (en) 1994-08-18 1996-03-14 Ariad Pharmaceuticals, Inc. Composite dna-binding proteins and materials and methods relating thereto
USRE45721E1 (en) 1994-08-20 2015-10-06 Gendaq, Ltd. Relating to binding proteins for recognition of DNA
DE4435919C1 (de) 1994-10-07 1995-12-07 Deutsches Krebsforsch Zinkfinger-DNA, -Protein und ihre Verwendung
US5871902A (en) 1994-12-09 1999-02-16 The Gene Pool, Inc. Sequence-specific detection of nucleic acid hybrids using a DNA-binding molecule or assembly capable of discriminating perfect hybrids from non-perfect hybrids
US5702914A (en) 1994-12-21 1997-12-30 The Salk Institute For Biological Studies Use of reporter genes for retinoid receptor screening assays having novel retinoid-associated response elements
ATE544776T1 (de) 1994-12-29 2012-02-15 Massachusetts Inst Technology Chimäre dna-bindeproteine
US5789538A (en) * 1995-02-03 1998-08-04 Massachusetts Institute Of Technology Zinc finger proteins with high affinity new DNA binding specificities
WO1996032475A2 (en) 1995-04-12 1996-10-17 University Of Washington Methods for preparing dna-binding proteins
WO1997027213A1 (en) 1996-01-23 1997-07-31 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods for screening for transdominant effector peptides and rna molecules
FR2752734B1 (fr) 1996-09-02 1998-11-06 Cird Galderma Utilisation de retinoides pour la preparation d'un medicament destine a traiter les affections liees a une surexpression de vegf
US5939538A (en) 1996-10-25 1999-08-17 Immusol Incorporated Methods and compositions for inhibiting HIV infection of cells by cleaving HIV co-receptor RNA
DE19718249A1 (de) 1997-04-30 1998-11-05 Basf Ag Myc-bindende Zinkfinger-Proteine, ihre Herstellung und ihre Verwendung
GB9710809D0 (en) 1997-05-23 1997-07-23 Medical Res Council Nucleic acid binding proteins
GB9710807D0 (en) 1997-05-23 1997-07-23 Medical Res Council Nucleic acid binding proteins
US6599692B1 (en) 1999-09-14 2003-07-29 Sangamo Bioscience, Inc. Functional genomics using zinc finger proteins

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010512745A (ja) * 2006-12-14 2010-04-30 ダウ アグロサイエンシィズ エルエルシー 最適化された非正準ジンクフィンガータンパク質
WO2021029391A1 (ja) * 2019-08-09 2021-02-18 国立研究開発法人産業技術総合研究所 人工遺伝子及び遺伝子変異方法

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