MXPA06014796A - Proteinas de enlace cinasa c-met. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere a polipeptidos que comprenden dominios de monomeros que se enlazan a c-MET, o porciones de los mismos.

Description

PROTEÍNAS DE ENLACE CINASA C-MET CAMPO DE LA INVENCIÓN El Factor de Crecimiento del Hepatocito/Factor de Proliferación (HGF/SF) es un factor pleyotrópico derivado de mesénquima, el cual regula el crecimiento celular, motilidad celular y morfogénesis de varios tipos de células, y media las interacciones epiteliales-mesenquimales, responsables de las interacciones de tejido morfogénico durante el desarrollo embriónico y organogénesis. Aunque el HGF fue originalmente identificado como un mitógeno potente para los hepatocitos, también se ha identificado como un factor de crecimiento angiogénico .

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La Met fue primero identificada en 1980 como un oncogen y es el receptor para HGF. Se encontró que La c-Met proto-oncogen codifica un receptor de tirosina cinasa. En respuesta al tratamiento del HGF, se observaron un intervalo de actividades: fosforilación del receptor, ensamblaje de intermediarios de señalización Gab-1/Grb2, culminando en activación de cinasas tales como P13K, ERK1 y 2, y AKT. Estas actividades ayudan en el crecimiento, supervivencia, migración y neovascularización celular. La expresión inapropiada o señalización del Ref.:178447 receptor de tirosina cinasa MET y su ligando el Factor de Crecimiento del Hepatocito/Factor de Proliferación (HGF/SF) , está asociado con un fenotipo agresivo y escasa prognosis clínica por una amplia variedad de tumores humanos sólidos. Cuatro lineas de evidencia fomentan el caso para una función de la c-MET en cáncer. Primero, líneas de células humanas y de ratón que sobreexpresan ectópicamente HGF y/o MET, llegan a ser tumorigénicas y metastásicas en ratones desnudos atimicos. Segundo, la regulación ' descendente de Met o expresión del HGF en células tumorales humanas, reduce su potencial tumorigénico. Los modelos de ratón que expresan el receptor o ligando como un transgen, desarrollan varios tipos de tumor y tumores etastásicos . Tercero, un gran número de estudios muestran que el HGF y/o Met, son frecuentemente expresados en carcinomas, en otros tipos de tumores sólidos humanos y en su metástasis, y que el HGF y/o Met, de sobreexpresión o expresión igualada, a menudo se correlacionan con escasa prognosis. Además, evidencia inequívoca que implica a MET en cáncer humano, se proporciona por las mutaciones de activación que han sido descubiertas en formas tanto esporádicas como inherentes de carcinomas papilares renales.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona un polipéptido que comprende un dominio de monómero que se enlaza a c-MET. En algunas modalidades, el dominio de monómero: es un dominio de monómero que no se origina naturalmente, que consiste de 30 a 50 aminoácidos; comprende al menos un enlace disulfuro; y opcionalmente, se enlaza a un ion. En algunas modalidades, el dominio de monómero es un dominio de monómero clase A del receptor LDL. En algunas modalidades, el dominio de monómero es un dominio de monómero clase A del receptor LDL, que comprende la siguiente secuencia: EFXCXNGXCIPXXWXCDGXDDCGDXSDE, en donde X es cualquier aminoácido. En algunas modalidades, el polipéptido comprende al menos uno y no más de seis dominios de monómeros que se enlazan a c-MET. En algunas modalidades, el polipéptido comprende al menos dos dominios de monómero que se enlazan a C-MET. En algunas modalidades, el polipéptido además comprende un segundo dominio de monómero, en donde el segundo dominio de monómero tiene una especificidad de enlace para un factor sanguíneo, con ello, incrementando la vida media del suero del polipéptido, cuando el polipéptido es inyectado en un animal, comparado con la vida media del suero de un polipéptido que carece del dominio de monómero de enlace al factor sanguíneo. En algunas modalidades, el factor sanguíneo es albúmina de suero, una inmunoglobulina o un eritrocito. En algunas modalidades, el segundo dominio de monómero se enlaza a una inmunoglobulina (IgG) y el segundo dominio de monómero es un dominio de monómero clase A del receptor LDL, que comprende una secuencia seleccionada de las siguientes: CXSSGRCIPXXWVCDGXXDCRDXSDE, y CXSSGRCIPXXWLCDGXXDCRDXSDE, en donde X es cualquier aminoácido. En algunas modalidades, el segundo dominio de monómero se enlaza a la inmunoglobulina (IgG) y el segundo dominio de monómero es un dominio de monómero clase A del receptor LDL, que comprende la siguiente secuencia: [EQ]FXCRX[ST]XRC[IV]XXX [ILV]CDGXXDCXD[DN]SDE, en donde X es un aminoácido y los aminoácidos en corchetes, son aminoácidos alternativos en una posición única. En algunas modalidades, el segundo dominio de monómero comprende CHPTGQFRCRSSGRCVSPTWVCDGDNDCGDNSDEENCSAPASEPPGSL . En algunas modalidades, el segundo dominio de monómero comprende CHPTGQFRCRSSGRCVSPT VCDGDNDCGDNSDEENC. En algunas modalidades, el enlace de al menos un dominio de monómero a c-MET, inhibe la dimerización de Met. En algunas modalidades, al menos un dominio de monómero se enlaza al dominio Sema de c-MET, con ello, previniendo el enlace de ligandos Met a c-MET. En algunas modalidades, el polipéptido comprende al menos uno y no más de seis dominios de monómeros. En algunas modalidades, el polipéptido comprende al menos, dos dominios de monómeros y los dominios de monómeros están ligados por un enlazador. En algunas modalidades, el enlazador es un péptido enlazador. En algunas modalidades, el enlazador es entes 4 a 12 aminoácidos de longitud. En algunas modalidades, los dominios de monómeros son cada uno entre 35 a 45 aminoácidos. En algunas modalidades, cada dominio de monómero comprende dos enlaces disulfuro. En tales modalidades, cada dominio de monómero comprende tres enlaces disulfuro. En algunas modalidades, el ion es un ion metálico.

En algunas modalidades, el ion es un ion de calcio. En algunas modalidades, al menos uno de los dominios de monómeros se deriva de un dominio clase A del receptor LDL. En algunas modalidades, al menos uno de los dominios del monómero se deriva de un dominio similar a EGF. En algunas modalidades, el monómero comprende una secuencia de aminoácido en la cual, al menos 10% de los aminoácidos en la secuencia son cíes tina; y/o al menos 25% de los aminoácidos no son aminoácidos que se originan naturalmente.

La presente invención también proporciona métodos para identificar un polipéptido que se enlaza a c-MET. En algunas modalidades, el método comprende, seleccionar una biblioteca de polipéptidos para afinidad con c-MET; y seleccionar un polipéptido que comprende al menos, un dominio de monómero que se enlaza a c-MET, en donde el dominio de monómero; es un dominio de monómero que no se origina naturalmente; comprende al menos un enlace disulfuro; y se enlaza a un ion. En algunas modalidades, el polipéptido seleccionado comprende un dominio de monómero que comprende cualquiera de los siguientes: Cxxx [EQ] FxCxSTxRC [ IV] xxx xCDGDNDCEDxSDEx Cxxxx [EQ] FECxSTxRC [IV] xxxWxCDGxNDCEDxSDEx Cxxxx [EQ] FxCxSTxRC [ILV] PxxWxCDGxxDCEDxSDExx Cxxx [EQ] FQCxSTxRC [IV] PxxWxCDGxNDCEDSSDExxC Cxxxx [EQ] FxCxxxxxC[ILV]xxxxxxxxxxDCxDxSDEx Cxxx [EQ] FxCxSTGRCxPxx xCxGxNDCEDxSDEx Cxxxx [EQ] FXCXSTXRC [ILV] xxx xCxxxxDCxDxSDxxxxxCx Cxxx [EQ] FxCxxxxxC [ ILV] xxxWxCDGxNDCxDxSxExxxxC Cxxxx [EQ] FxCxSTxRC [ILV] PxxWxCxGxxDCxDxSDEx Cxxxx [EQ] FxCxxxxxC [ILV] xxxWxCDGxxDCxDxSDEx EFXCXNGXCIPXX XCDGXDDCGDXSDE . En algunas modalidades, la etapa de selección comprende seleccionar un polipéptido que reduce la proliferación celular mediada por HGF y/o migración. En algunas modalidades, el método además comprende seleccionar un polipéptido que inhibe el crecimiento del tumor en un animal . En algunas modalidades, el dominio de monómero comprende una secuencia de aminoácido en la cual, al menos 10% de los aminoácidos en la secuencia son cisteína; y/o al menos 25% de los aminoácidos son aminoácidos que no se originan naturalmente. En algunas modalidades, el método además comprende enlazar el dominio de monómero en el polipéptido seleccionado a un segundo dominio de monómero, para formar una biblioteca de multímeros, cada multímero comprende al menos, dos dominios de monómero; seleccionar la biblioteca de multímeros para determinar la capacidad para enlazarse a c-MET; y seleccionar un multímero que se enlaza a c-MET. En algunas modalidades, el método además comprende enlazar el dominio de monómero en un polipéptido seleccionado, a un segundo dominio de monómero para formar una biblioteca de multímeros, cada multímero comprende al menos, dos dominios de monómeros; seleccionar la biblioteca de multímeros para determinar la capacidad para enlazarse a una molécula objetivo distinta de c-MET; y seleccionar un multímero que se enlaza a la molécula objetivo. En algunas modalidades, el método además comprende una etapa de mutar al menos, un dominio de monómero, con ello, proporcionando una biblioteca que comprende dominios de monómeros mutados. En algunas modalidades, la biblioteca de dominios de monómero es expresada como uha exhibición de fago, exhibición de ribosoma o exhibición de superficie celular. En algunas modalidades, el polipéptido comprende al menos dos dominios de monómeros y los dominios de monómeros son enlazados por un enlazador. En algunas modalidades, el enlazador es un enlazador peptídico. En algunas modalidades, el enlazador es de entre 4 a 12 aminoácidos en longitud. En algunas modalidades, los dominios de monómero son cada uno entre 35 a 45 aminoácidos. En algunas modalidades, cada dominio de monómero comprende dos enlaces disulfuro. En algunas modalidades, cada dominio de monómero comprende tres enlaces disulfuro. En algunas modalidades, el ion es un ion metálico. En algunas modalidades, el ion es un ion de calcio. En algunas modalidades, al menos uno de los dominios de monómeros se deriva de un dominio clase A del receptor LDL. En algunas modalidades, al menos uno de los dominios de monómeros se deriva de un dominio similar a EGF. En algunas modalidades, el dominio de monómero comprende una secuencia de aminoácido en la cual, al menos, 10% de los aminoácidos en la secuencia son cisteína; y/o al menos 25% de los aminoácidos son aminoácidos que no se originan naturalmente. La presente invención también proporciona polinucleótidos que codifican un polipéptido que comprende un dominio de monómero que se enlaza a c-MET, en donde el dominio de monómero : es un dominio de monómero que no se origina naturalmente que consiste de 30 a 50 aminoácidos; que comprende al menos un enlace disulfuro. La presente invención también proporciona. Un polipéptido que comprende un dominio de monómero que se enlaza a la inmunoglobulina G (IgG) , en donde el dominio de monómero es un dominio de monómero clase A del receptor LDL que comprende la secuencia seleccionada de las siguientes : CXSSGRCIPXXWVCDGXXDCRDXSDE, CXSSGRCIPXXWLCDGXXDCRDXSDE, y [EQ] FXCRX [ST] XRC [ IV] XXX [ ILV] CDGXXDCXD [DN] SDE en donde X es cualquier aminoácido y aminoácidos en corchetes son aminoácidos alternativos en una posición única; y en donde el polipéptido tiene una vida media de suero incrementada, cuando el polipéptido es inyectado en un animal, comparado con la vida media del suero de un polipéptido que carece de un dominio de monómero que se enlaza a IgG. En algunas modalidades, el dominio de monómero comprende CHPTGQFRCRSSGRCVSPTWVCDGDNDCGDNSDEENCSAPASEPPGSL . En algunas modalidades, el dominio de monómero comprende CHPTGQFRCRSSGRCVSPTWVCDGDNDCGDNSDEENC. En algunas modalidades, el polipéptido comprende un segundo dominio de monómero con especificidad de enlace para una molécula distinta a IgG, en donde el segundo dominio de monómero: tiene 30-100 aminoácidos; es un dominio de monómero que no se origina naturalmente; comprende al menos, un enlace disulfuro. En algunas modalidades, el segundo dominio de monómero es un dominio clase A del receptor LDL que no se origina naturalmente. La presente invención también proporciona polinucleótidos que codifican los polipéptidos como se describe anteriormente.

DEFINICIONES A menos que se indique de otro modo, las siguientes definiciones suplantan aquellas en la técnica. "Met" también referido como "c-MET", se refiere a la tirosina cinasa del receptor de enlace-Factor de Crecimiento del Hepatocito/Factor de Proliferación (HGF/SF) . En respuesta al tratamiento del HGF, se observan un intervalo de actividades: fosforilación del receptor, ensamblaje de señalización de intermediarios Gab-1/Grb2, culminación en activación de cinasas tales como P13K, ERK1 y 2, y AKT. Estas actividades ayudan en el crecimiento, supervivencia, migración y neovascularización celular. Véase por ejemplo, Birch eier et al . , Mol . Cell Biol . 4:915-925 (2003). La secuencia de aminoácido de Met se conoce y es exhibida en la SEC ID NO:l. Véase por ejemplo, Park et al . , Proc. Nati . Acad. Sci USA 84 (18) :6379 (1987). Los términos "dominio de monómero" o "monómero", son usados intercambiablemente y en este documento, se refieren a una región discreta encontrada en una proteína o polipéptido. Un dominio de monómero forma una estructura tridimensional nativa en solución, en la ausencia de secuencias de aminoácido nativas de flanqueo. Los dominios de monómero de la invención, a menudo se enlazarán a una molécula objetivo. Por ejemplo, un polipéptido que forma una estructura tri-dimensional que se enlaza a una molécula objetivo, es un dominio de monómero. Como se usa en este documento, el término "dominio de monómero", no abarca la región que determina la complementariedad (CDR) de un anticuerpo . El término "bucle", se refiere a aquella porción de un dominio de monómero que es típicamente expuesto al ambiente por el ensamble de la estructura de andamiaje de la proteína de dominio de monómero, y la cual está involucrada en el enlace objetivo. La presente invención proporciona tres tipos de bucles que son identificados por características específicas, tales como, potencial para enlace disulfuro, puenteado entre estructuras de proteínas secundarias, y dinámicas moleculares (es decir, flexibilidad) . Los tres tipos de secuencias de bucles son una secuencia de bucle definida por cisteína, una secuencia de bucle definida por estructura, y una secuencia de bucle definida por el factor B. Como se usa en este documento, el término "secuencia de bucle definida por cisteína", se refiere a una secuencia de una secuencia que codifica el dominio de monómero que se origina naturalmente, que está unido a cada extremo por un residuo de cisteína que es conservado con respecto al menos a otro dominio de monómero que se origina naturalmente de la misma familia. Las secuencias de bucles definidas por cisteína, son identificadas por alineación de secuencia múltiple de los dominios de monómeros que se originan naturalmente, seguidos por análisis de secuencia para identificar residuos de cisteína conservados. La secuencia entre cada par constitutivo de residuos de cisteína conservados, es una secuencia de bucle definida por cisteína. La secuencia de bucle definida por cisteína, no incluye los residuos de cisteína adyacentes a cada término. Los dominios de monómero que tienen secuencias de bucle definidas por cisteína incluyen, los dominios A del receptor LDL, dominios similares a EGF, dominios sushi, dominios de Fibronectina tipo 1, y similares. De este modo, por ejemplo, en el caso de los dominios del receptor A de LDL representados por la secuencia consenso, CX6CX4CX6CX5CX8C, en donde Xß, X4, Xs y Xs cada uno representan una secuencia de bucle definida por cisteína, comprenden el número designado de aminoácidos. Como se usa en este documento, el término "secuencia de bucle definida por estructura", se refiere a una subsecuencia de una secuencia que codifica el dominio de monómero que está unida a cada extremo a las subsecuencias que cada una forma una estructura secundaria. Las estructuras secundarias para proteínas con estructuras tridimensionales conocidas, se identifican de conformidad con el algoritmo STRIDE para asignación de la estructura secundaria de proteína, como se describe en Frishman, D. and Argos, P. (1995) "Knowledge-based secondary structure assignment, " Proteins, 23(4): 566-79 (véase también //hgmp.mrc.ac.uk/Registered/Option/stride.html en la Amplia Red Mundial) . Las estructuras secundarias para proteínas con estructuras tridimensionales desconocidas o no caracterizadas, son identificadas de conformidad con el algoritmo descrito en Jones, D. T. (1999), "Protein secondary structure prediction based on position-specific scoring matrices," J. Mol. Biol. 292:195-202 (véase también McGuffin, L. J., Bryson, K., Jones, D.T. (2000) "The PSIPRED protein structure prediction server, " Bioinformatics . 16:404-405, y //bioinf. cs .ucl .ac.uk/psipred/ en la Amplia Red Mundial). Las estructuras secundarias incluyen, por ejemplo, láminas plegadas, hélices, y similares. Ejemplos de dominios de monómeros que tienen secuencias de bucle definidas por estructuras son los dominios C2, dominios Ig, dominios de factor 5/8, dominios de Fibronectina tipo 3, y similares. El término "secuencia de bucle definida por el factor B", se refiere a una subsecuencia de al menos tres residuos de aminoácidos de una secuencia que codifica el dominio de monómero en la cual, los factores B para los alfa carbonos en el bucle definido por el factor B, son entre el 25% más alto de los factores B de alfa carbono en el dominio de monómero completo. Típicamente, el factor B del alfa-carbono promedio para la subsecuencia, es al menos aproximadamente 65. Como se usa en este documento, el término "factor B" (o "factor de temperatura" o "factor Debye-Waller") , se deriva de datos de dispersión de rayos X. El factor B es un factor que puede ser aplicado al término dispersión de rayos X para cada átomo, o para grupos de átomos, que describen el grado al cual la densidad del electrón que es distribuida fuera de los factores B empleados en la práctica de la presente invención, puede ser ya sea isotrópica o anisotrópica. El término "factor B de carbono alfa promedio", se refiere a: n (S B-factorcai) n i=l en donde n corresponde al número de residuos en el bucle, y es al menos 3, y el factorco<i B es el factor B para el carbono alfa del residuo de aminoácido i del bucle. El término "multímero" es usado en este documento para indicar un polipéptido que comprende al menos, dos dominios de monómeros. Los dominios de monómeros separados en un multímero, pueden ser unidos en conjunto por un enlazador. Un multímero es también conocido como una proteína de mosaico combinatorial o una proteína de mosaico recombinante. El término "familia" y "clases de familia", son usados intercambiablemente para indicar proteínas que son agrupadas en conjunto, basadas en similitudes en sus secuencias de aminoácido. Estas secuencias similares son conservadas en general, debido a que son importantes para la función de la proteína y/o el mantenimiento de la estructura tridimensional de la proteína. Ejemplos de tales familias incluyen, la familia del dominio del Receptor A LDL, la familia similar a EGF y similares. Adicionalmente, las secuencias relacionadas que se enlazan a la misma molécula objetivo, pueden ser divididas en familias basadas en las porciones de secuencia común. El término "ligando", también referido en este documento como una "molécula objetivo", abarca una amplia variedad de sustancias y moléculas, las cuales varían desde moléculas simples a objetivos complejos. Las moléculas objetivo pueden ser proteínas, ácidos nucleicos, lípidos, carbohidratos o cualquier otra molécula capaz de reconocimiento por un dominio de polipéptido. Por ejemplo, una molécula objetivo puede incluir un compuesto químico (por ejemplo, compuestos no biológicos, tales como, por ejemplo, una molécula orgánica, una molécula inorgánica o una molécula que tiene tanto átomos orgánicos como inorgánicos, pero que excluyen polinucleótidos y proteínas), una mezcla de compuestos químicos, un arreglo de compuestos espacialmente localizados, una macromolécula biológica, una biblioteca de exhibición de péptido bacteriófago, una biblioteca de exhibición de péptido, un extracto elaborado de materiales biológicos tales como células o tejidos de bacterias, plantas, hongos o animales (por ejemplo, mamíferos) , una proteína, una toxina, una hormona peptídica, una célula, un virus o similares. Otras moléculas objetivo incluyen, por ejemplo, una célula completa, un tejido completo, una mezcla de proteínas relacionadas o no relacionadas, una mezcla de virus o cepas bacterianas o similares. Las moléculas objetivo pueden también ser definidas por la inclusión en ensayos de selección descritos en este documento, o mejorando o inhibiendo una interacción de proteína específica (es decir, un agente que inhibe selectivamente una interacción de enlace entre dos polipéptidos predeterminados) . El término "enlazador", es usado en este documento para indicar una porción o grupo de porciones que se unen o conectan a dos o más dominios de monómero separados discretos. El enlazador permite a los dominios de monómeros separados discretos, permanecer separados cuando se unen en conjunto en un multímero. La porción enlazadora es típicamente una porción sustancialmente lineal. Los enlazadores adecuados incluyen polipéptidos, ácidos nucleicos, ácidos nucleicos peptídicos y similares. Enlazadores peptídicos también incluyen porciones alquileno opcionalmente sustituidas que tienen uno o más átomos de oxígeno incorporados en la estructura de carbono. Típicamente, el peso molecular del enlazador es menos de aproximadamente 2000 daltons. Más típicamente, el peso molecular del enlazador es menos de aproximadamente 1500 daltons y es usualmente menos de aproximadamente 1000 daltons. El enlazador puede ser suficientemente pequeño para permitir a los dominios de monómeros separados discretos, cooperar, por ejemplo, en donde cada uno de los dominios de monómeros separados discretos es un multímero enlazado a la misma molécula objetivo vía sitios de enlace separados. Enlazadores ejemplares incluyen un polinucleótido que codifica un polipéptido, o un polipéptido de aminoácidos u otras porciones que no se originan naturalmente. El enlazador puede ser una porción de una secuencia nativa, una variante de la misma, o una secuencia sintética. Los enlazadores pueden comprender, por ejemplo, aminoácidos que se originan naturalmente, que no se originan naturalmente, o una combinación de ambos . El término "separado", es usado en este documento para indicar una propiedad de una porción que es independiente y permanece independiente aún cuando se forma con complejos con otras porciones, que incluyen por ejemplo, otros dominios de monómeros. Un dominio de monómero es un dominio separado en una proteína, debido a que tienen una propiedad independiente que puede ser reconocida y separada de la proteína. Por ejemplo, la habilidad de enlace ligando del dominio A en el LDLR es una propiedad independiente. Otros ejemplos separados incluyen los dominios de monómeros separados en un multímero que permanece separado de dominios independientes aún cuando se someten a complejos o unen en conjunto en el multímero por un enlazador. Otro ejemplo de una propiedad separada son los sitios de enlace en un multímero para un ligando. Como se usa en este documento, "evolución directa" se refiere a un proceso por el cual se generan variantes de polinucleótidos, expresadas y seleccionadas por una actividad (por ejemplo, un polipéptido con actividad de enlace), es un proceso recursivo. Uno o más candidatos en la selección se seleccionan y el proceso es entonces repetido usando polinucleótidos que codifican los candidatos seleccionados para generar nuevas variantes. La evolución directa involucra al menos, dos rondas de variación de generación y puede incluir, 3, 4, 5, 10, 20 o más rondas de variación de generación y selección. La variación puede ser generada por cualquier método conocido por aquellos de habilidad en la técnica, que incluyen por ejemplo, PCR propensa a error, recombinación de gen, mutagénesis química y similares. El término "intercambio", es usado en este documento para indicar recombinación entre secuencias no idénticas. En algunas modalidades, el intercambio puede incluir cruza vía recombinación homologa o vía recombinación no homologa, tal como vía sistemas cre/lox y/o flp/frt. El intercambio se puede llevar a cabo empleando una variedad de diferentes formatos, que incluyen por ejemplo, formatos de intercambio in vi tro e in vivo, formatos de intercambio in silico, formatos de intercambio que utilizan ya sea plantillas de hebra única o doble hebra, formatos de intercambio a base de cebador, formatos de intercambio a base de fragmentación de ácido nucleico, y formatos de intercambio mediados por oligonucleótidos, todos los cuales se basan en eventos de recombinación entre secuencias no idénticas, y se describen en más detalle o se referencian en este documento posteriormente, así como también otros formatos a base de recombinación similares. El término "aleatorio" como se usa en este documento, se refiere a una secuencia de polinucleótido o una secuencia de aminoácido compuesta de dos o más aminoácidos y construida por un proceso estocástico o aleatorio. La secuencia de polinucleótido o secuencia de aminoácido aleatorio, puede incluir estructura o porciones de andamiaje, las cuales pueden comprender secuencias variantes. El término "pseudoaleatorio", es usado en este documento para referirse a una serie de secuencias, polinucleótidos o polipéptidos, que tienen variabilidad limitada, de manera que el grado de variabilidad de residuo en algunas posiciones es limitado, pero cualquier posición pseudoaleatoria es permitida en al menos, algún grado de variación de residuo. Los términos "polipéptido", "péptido", y "proteína", son usados en este documento intercambiablemente para referirse a una secuencia de aminoácido de dos o más aminoácidos. El término "aminoácido", se refiere a aminoácidos que se originan naturalmente y sintéticos, así como también a análogos de aminoácido y miméticos de aminoácido que funcionan en una manera similar a los aminoácidos que se originan naturalmente. Los aminoácidos que se originan naturalmente son aquellos codificados por el código genético, así como también aquellos aminoácidos que son después modificados, por ejemplo, hidroxiprolina, ?-carboxiglutamato, y O-fosfoserina. Los análogos de aminoácido se refieren a compuestos que tienen la misma estructura química básica como un aminoácido que se origina naturalmente, es decir, un carbono que está unido a un hidrógeno, un grupo carboxilo, un grupo amino, y un grupo R, por ejemplo, homoserina, norleucina, sulfóxido de metionina, metionina metil sulfonio. Tales análogos tienen grupos R modificados (por ejemplo, norleucina) , o estructuras peptídicas modificadas, pero retienen la misma estructura química básica como un aminoácido que se origina naturalmente. "Miméticos de aminoácido" se refiere a compuestos químicos que tienen una estructura que es diferente de la estructura química general de un aminoácido, pero que funciona en una manera similar a un aminoácido que se origina naturalmente. "Sustitución conservativa de aminoácido", se refiere a la capacidad de intercambio de los residuos que tienen cadenas laterales similares. Por ejemplo, un grupo de aminoácidos que tiene cadenas laterales alifáticas es glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; un grupo de aminoácidos que tiene cadenas laterales hidroxil alifáticas es serina y treonina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen amida es asparagina y glutamina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales aromáticas es fenilalanina, tirosina y triptofano; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales básicas es lisina, arginina e histidina; y un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen azufre es cisteína y metionina. Los grupos de sustitución de aminoácidos conservativos preferidos son: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina y asparagina-glutamina . La frase "secuencia de ácido nucleico", se refiere a un polímero de hebra única o doble hebra de bases de desoxirribonucleótido o ribonucleótido leído del extremo 5' al 3' o un análogo del mismo. El término "que codifica", se refiere a una secuencia de polinucleótido que codifica uno o más aminoácidos. El término no requiere un codón de inicio o detención. Una secuencia de aminoácido puede ser codificada por cualquiera de seis estructuras lectoras diferentes proporcionadas por una secuencia de polinucleótido. El término "promotor", se refiere a regiones o secuencias localizadas en dirección 5' y/o en dirección 3' del inicio de la transcripción, que están involucradas en el reconocimiento y enlace de polimerasa de ARN y otras proteínas para iniciar la transcripción. Un "vector", se refiere a un polinucleótido, el cual cuando es independiente del cromosoma hospedero, es capaz de replicación en un organismo hospedero. Ejemplos de vectores incluyen plásmidos. Los vectores típicamente tienen un origen de replicación. Los vectores pueden comprender, por ejemplo, terminadores de transcripción y traducción, secuencias de iniciación de transcripción y traducción, y promotores empleados para la regulación de la expresión del ácido nucleico particular. El término "recombinante" cuando se usa con referencia por ejemplo, a una célula, o ácido nucleico, o proteína o vector, indica que la célula, ácido nucleico, proteína o vector, tiene un ácido nucleico nativo o proteína o que la célula se deriva de una célula así modificada. De este modo, por ejemplo, las células recombinantes expresan genes que no se encuentran con la forma nativa (no recombinante) de la célula o expresan los genes nativos que son de otro modo, anormalmente expresados, sobre-expresados o no expresados en todo.

La frase "se enlaza específicamente (o selectivamente)", a un polipéptido, cuando se refiere a un monómero o multímero, se refiere a una reacción de enlace que puede ser determinativa de la presencia del polipéptido en una población heterogénea de proteínas (por ejemplo, un lisado de tejido o célula) y otros biológicos. De este modo, bajo condiciones estándares o ensayos usados en ensayos de enlace de anticuerpo, el monómero especificado o multímero, se enlaza a una molécula objetivo particular arriba del antecedente (por ejemplo, 2X, 5X, 10X o más arriba del antecedente) , y no se enlaza en una cantidad significante a otras moléculas presentes en la muestra. Los términos "idéntico" o porcentaje de "identidad", en el contexto de dos o más ácidos nucleicos o secuencias de polipéptidos, se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que son las mismas. "Sustancialmente idéntico", se refiere a dos o más moléculas de ácido nucleico o secuencias de polipéptidos, que tienen un porcentaje especificado de residuos de aminoácido o nucleótidos que son los mismos (es decir, 60% de identidad, opcionalmente, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ó 95% de identidad sobre una región especificada, o cuando no se especifica, sobre la secuencia completa) , cuando se compara y alinea para correspondencia máxima sobre una ventana de comparación, o región designada medida usando uno de los siguientes algoritmos de comparación de secuencia, o por alineación manual e inspección visual. Opcionalmente, existe identidad o identidad sustancial sobre una región que es al menos, de aproximadamente 50 nucleótidos en longitud, o más preferiblemente, sobre una región que es de 100 a 500 ó 1000 o más nucleótidos o aminoácidos en longitud. Un polinucleótido o secuencia de aminoácido es "heterólogo" a una segunda secuencia si las dos secuencias no están ligadas en la misma manera como se encuentra en secuencias que se originan naturalmente. Por ejemplo, un promotor operablemente ligado a una secuencia codificante heteróloga, se refiere a una secuencia codificante la cual es diferente de cualquiera de las variantes alélicas que se originan naturalmente. El término, "enlazador heterólogo", cuando se usa en referencia a un multímero, indica que el multimero comprende un enlazador y un monómero que no se encuentra en la misma relación entre sí en la naturaleza (por ejemplo, forman una proteína de fusión que no se origina naturalmente) . Un "amino ácido que no se origina naturalmente" en una secuencia de proteína, se refiere a cualquier aminoácido distinto del aminoácido que se origina en la posición correspondiente en una alineación con un polipéptido que se origina naturalmente, con la probabilidad de suma más corta más baja, en donde la ventana de comparación es la longitud del dominio de monómero requerido, y cuando se compara con una secuencia que se origina naturalmente en la base de datos no redundante ("nr") de Genbank usando BLAST 2.0 como se describe en este documento. "Porcentaje de identidad de secuencia", es determinado comparando dos secuencias óptimamente alineadas sobre una ventana de comparación, en donde la porción de la secuencia de polinucleótido en la ventana de comparación, puede comprender adiciones o supresiones (es decir, aperturas) , comparadas con la secuencia de referencia (la cual no comprende adiciones o supresiones) para alineación óptima de las dos secuencias. El porcentaje es calculado determinando el número de posiciones en las cuales ocurre el residuo de aminoácido o base de ácido nucleico idéntico en ambas secuencias, para proporcionar el número de posiciones igualadas, dividiendo el número de posiciones igualadas por el número total de posiciones en la ventana de comparación y multiplicando el resultado por 100 para proporcionar el porcentaje de identidad de secuencia. Los términos "idéntico" o porcentaje de "identidad", en el contexto de dos o más ácidos nucleicos o secuencias de polipéptidos, se refiere a dos o más secuencias o subsecuencias que son las mismas o que tienen un porcentaje especificado de residuos de aminoácido o nucleótidos que son los mismos, cuando se comparan y alinean para correspondencia máxima sobre una ventana de comparación, o región designada, medida usando uno de los siguientes algoritmos de comparación de secuencia, o por alineación manual e inspección visual. Tales secuencias se dice entonces, son "sustancialmente idénticas". Esta definición también se refiere al complemento de una secuencia de prueba. Opcionalmente, existe identidad sobre una región que es al menos aproximadamente 50 aminoácidos o nucleótidos de longitud, o más preferiblemente, sobre una región que es de 75-100 aminoácidos o nucleótidos en longitud. Para comparación de secuencia, típicamente una secuencia actúa como una secuencia de referencia a la cual las secuencias de prueba son comparadas. Cuando se usa una prueba, algoritmo de comparación de secuencia, se ingresan las secuencias de referencia en un ordenador, se designan las coordenadas de subsecuencia, si es necesario, y se designan los parámetros del programa de algoritmo de secuencia. Se pueden usar parámetros de programas de omisión, o se pueden designar parámetros alternativos. El algoritmo de comparación de secuencia entonces calcula las identidades de porcentaje de secuencia para las secuencias de prueba con relación a la secuencia de referencia, basada en los parámetros del programa. Una "ventana de comparación" como se usa en este documento, incluye referencia a un segmento de cualquiera de un número de posiciones contiguas seleccionadas del grupo que consiste de 20 hasta 600, usualmente aproximadamente 50 hasta aproximadamente 200, más usualmente, aproximadamente 100 hasta aproximadamente 150 en las cuales, una secuencia puede ser comparada con una secuencia de referencia del mismo número de posiciones contiguas después que las dos secuencias son óptimamente alineadas. Los métodos de alineación de secuencias para comparación son bien conocidos en la técnica. Se puede conducir la alineación óptima de secuencias para comparación, por ejemplo, por el algoritmo de homología local de Smith and Waterman (1970) Adv. Appl . Math . 2:482c, por el algoritmo de alineación de homología de Needleman and Wunsh (1970) J. Mol . Biol . 48:442, por la búsqueda por el método de similitud de Pearson and Lipman (1988,) Proc . Nat ' l . Acad. Sci . USA 85:2444, por implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el Paquete de Software Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr. , Madison, Wl) , o por alineación manual e inspección visual (véase por ejemplo, Ausubel et al . , Current Protocols in Molecular Biology (1995 Suplemento)). Un ejemplo de un algoritmo útil es el algoritmo BLAST 2.0, el cual es descrito en Altschul et al . (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410, respectivamente. El software para realizar análisis BLAST es el públicamente disponible a través del Centro Nacional para Información de Biotecnología (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Este algoritmo involucra identificar primer pares de secuencia de alto registro (HSP) , identificando palabras cortas de longitud W en la secuencia de interrogación, la cual ya sea iguala o satisface algún registro T de umbral de valor positivo, cuando se alinea con una palabra de la misma longitud en una secuencia de base de datos. T es referido como el umbral de registro de palabra cercana (Altschul et al . , supra). Este lanzamiento de palabra cercana inicial actúa como una semilla para iniciar las búsquedas para encontrar HSP más largos que las contienen. Los lanzamientos de palabras son extendidos en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia, tan pronto como se pueda incrementar el registro de alineación cumulativa. Los registros cumulativos son calculados usando, para secuencias de nucleótidos, los parámetros M (registro inverso para un par de residuos igualados; siempre > 0) y N (registro de falta para residuos igualados; siempre <0) . Para secuencias de aminoácido, se usa una matriz de registro para calcular el registro cumulativo. La extensión de los lanzamientos de palabras en cada dirección es obstruida cuando: el registro de alineación cumulativa falla por la cantidad X de su valor máximo logrado; el registro cumulativo va a cero o por debajo, debido a la acumulación de una o más alineaciones de residuo de registro negativo; o se alcanza el final de cualquier secuencia. Los parámetros de algoritmo BLAST W, T y X, determinan la sensibilidad y velocidad de la alineación. El programa BLASTN (para secuencias de nucleótidos) usa como omisiones de una longitud de palabra (W) de 11, una expectación (E) o 10, M=5, N=-4, y una comparación de ambas hebras. Para secuencias de aminoácido, el programa BLASTP usa como omisión, una longitud de palabra de 3, y una expectación (E) de 10, y las alineaciones (B) de la matriz de registro BLOSUM62 (véase Henikoff and Henikoff (1989) Proc . Nati . Acad. Sci . USA 89:10915) de 50, expectación (E) de 10, M=5, N=-4, y una comparación de ambas hebras. El algoritmo BLAST también realiza un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias (véase por ejemplo, Karlin and Altschul (1993) Proc . Nati . Acad. Sci . USA 90:5873-5787). Una medición de similitud proporcionada por el algoritmo BLAST, es la probabilidad de suma más pequeña (P(N)), la cual proporciona una indicación de la probabilidad por la cual una igualación entre los dos nucleótidos o secuencias de aminoácido podrían ocurrir por oportunidad. Por ejemplo, un ácido nucleico es considerado similar a una secuencia de referencia si la probabilidad de suma más pequeña en una comparación del ácido nucleico de prueba al ácido nucleico de referencia, es menos de aproximadamente 0.2, más preferiblemente, menos de aproximadamente 0.01, y más preferiblemente, menos de aproximadamente 0.001.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 ilustra esquemáticamente, la alineación de la secuencia parcial de aminoácido de una variedad de dominios clase A del receptor LDL, para demostrar las cisteínas conservadas. La conectividad de cisteínas en los tres enlaces disulfuro del dominio plegado, se ilustra esquemáticamente en la secuencia consenso. Los residuos cuyas cadenas laterales contribuyen a enlaces de calcio, son designados con un asterisco en la secuencia consenso. La Figura 2A, ilustra esquemáticamente un ejemplo de un dominio A. La Figura 2A ilustra esquemáticamente, aminoácidos conservados en un dominio A de aproximadamente 40 aminoácidos de longitud. Los residuos de cisteína conservados están indicados por C, y los aminoácidos conservados cargados negativamente, están indicados por un círculo con un signo de menos ("-"). Los círculos con un "H", indican residuos hidrofóbicos conservados. La Figura 2B ilustra esquemáticamente, dos dominios A plegados conectados vía un enlazador. La Figura 2B indica dos sitios de enlace de calcio, círculos oscuros con Ca+2, y tres enlaces de disulfuro con cada dominio A plegado para un total de 6 enlaces de disulfuro . La Figura 3 indica algunos de los ligandos reconocidos por elementos que se originan naturalmente de la familia del receptor LDL, el cual incluye inhibidores, proteasas, complejos de proteasa, complejos portadores de vitamina, proteínas involucradas en el metabolismo de lipoproteína, ligandos no humanos, antibióticos, virus y otros. La Figura 4 ilustra esquemáticamente, un esquema general para identificar dominios de monómeros que se enlazan a un ligando, aislando los dominios de monómero seleccionados, creando multímeros de los dominios de monómeros seleccionados, uniendo los dominios de monómeros seleccionados en varias combinaciones y seleccionando los multímeros para identificar multímeros que comprenden más de un monómero que se enlaza a un ligando. La Figura 5 es una representación esquemática de otra estrategia de selección (selección guiada) . Un dominio de monómero con propiedades de enlace apropiadas, es identificado a partir de una biblioteca de dominios de monómeros. El dominio de monómero identificado es entonces ligado a los dominios de monómeros de otra biblioteca de dominios de monómeros, para formar una biblioteca de multímeros. La biblioteca de multímero es seleccionada para identificar un par de dominios de monómeros que se enlazan simultáneamente al objetivo. Este proceso puede entonces ser repetido hasta que se obtienen las propiedades de enlace óptimas en el multímero. Las Figuras 6A-6H representan una alineación de dominios A. En la parte superior e inferior de la figuras, las letras pequeñas (a-q) , indican residuos conservados. La Figura 7 ilustra varias conformaciones de multímero o monómero de anticuerpo posibles. En algunas modalidades, el monómero o multímero reemplaza el fragmento Fab del anticuerpo. La Figura 8 representa una conformación posible de un multímero de la invención, que comprende al menos, un dominio de monómero que se enlaza a una molécula que extiende la vida media y otros dominios de monómeros que se enlazan a una u opcionalmente dos o más moléculas objetivo. En la Figura, dos dominios de monómeros se enlazan a dos primeras moléculas objetivo. Opcionalmente, los dos dominios de monómeros pueden enlazarse a diferentes sitios en una primera molécula objetivo (no representada) . La Figura 9 muestra una comparación entre c-METFc, un monómero específico c-MET (M26) y un dímero específico de c-MET (RM12; RecM12) , con respectos a sus capacidades relativas para bloquear la proliferación inducida por HGF de células de adenocarcinoma de pulmón humano A549-SC cargado con suero. La Figura 10 ilustra la vida media del suero en monos de monómeros que se enlazan a IgG.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE IA INVENCIÓN I. INTRODUCCIÓN La presente invención proporciona proteínas que no se originan naturalmente que se enlazan a c-MET. En general, las proteínas de la presente invención comprenden un dominio que se enlaza a c-MET. Estos dominios pueden ser fácilmente identificados usando una variedad de andamiajes de polipéptidos para generar una pluralidad de variantes de polipéptidos y después seleccionando una variante que se enlaza a c-MET. La presente invención por lo tanto, también se proporciona para seleccionar una proteína que se enlaza a c-MET. Las proteínas que se enlazan a c-MET son empleadas, por ejemplo, para tratar individuos con tumores sólidos que expresan c-MET. Los polipéptidos de la invención son también empleados para detectar tejidos en los cuales la MET es expresada y pueden ser usados para dirigir moléculas a aquellos tejidos. La c-MET es inactiva en su estado de monómero de reposo y la formación de dímero resulta en la activación del receptor (a menudo aún en la ausencia de un enlace de ligando) . La forma madura del receptor consiste de una cadena OÍ solamente extracelular y una cadena ß más larga que abarca el resto del dominio extracelular, un dominio de la transmembrana y un extremo citoplásmico. El extremo citoplásmico contiene el dominio de juxtamembrana, un dominio de cinasa y sitios de ensamblaje para señalización de intermediarios. La cadena y los primeros 212 aminoácidos de la cadena ß, también conocidos como el dominio Sema (Kong-Beltran, et al , Cáncer Cell 6:75-84 (2004), son suficientes para enlazarse a HGF. El resto de la porción extracelular de la cadena ß, consiste de un dominio C rico en cisteína y cuatro repeticiones de un dominio de inmunoglobulina inusual. Por consiguiente, en algunas modalidades, los polipéptidos de la invención comprenden al menos, un dominio de monómero que inhibe la dimerización de cadenas OÍ y ß de c-MET y/o funciones como un antagonista para prevenir a los ligandos de c-MET, de enlazarse y/o activar la c-MET. Mientras la presente invención proporciona polipéptidos que comprenden dominios únicos, los multímeros de los dominios pueden también ser sintetizados y usados. En algunas modalidades, todos los dominios del multímero se enlazan a c-MET. En algunas de estas modalidades, cada uno de los dominios son idénticos y se enlazan a la misma porción (es decir, "epítope") de c-MET. Por ejemplo, en algunas modalidades, los dominios de monómeros se enlazan al dominio Sema de c-MET. En otras modalidades, al menos algunos de los dominios en el multímero, se enlazan a diferentes porciones de c-MET. En aún otras modalidades, al menos uno de los dominios del polipéptido se enlaza a una molécula o moléculas distintas de c-MET (por ejemplo, un factor sanguíneo tal como albúmina de suero, inmunoglobulina o eritrocitos) .

II. MONÓMEROS Los dominios de monómeros pueden ser cadenas de polipéptidos de cualquier tamaño. En algunas modalidades, los dominios de monómeros tienen aproximadamente 25 hasta aproximadamente 500, aproximadamente 30 hasta aproximadamente 200, aproximadamente 30 hasta aproximadamente 100, aproximadamente 35 hasta aproximadamente 50, aproximadamente 35 hasta aproximadamente 100, aproximadamente 90 hasta aproximadamente 200, aproximadamente 30 hasta aproximadamente 50, o aproximadamente 30 hasta aproximadamente 150 aminoácido. De manera similar, un dominio de monómero de la presente invención, puede comprender, por ejemplo, desde aproximadamente 30 hasta aproximadamente 200 aminoácidos; desde aproximadamente 25 hasta aproximadamente 180 aminoácidos; desde aproximadamente 40 hasta aproximadamente 150 aminoácidos; desde aproximadamente 50 hasta aproximadamente 130 aminoácidos; o desde aproximadamente 75 hasta aproximadamente 125 aminoácidos. Los dominios de monómeros pueden mantener típicamente una conformación estable en solución, y son a menudo estables al calor, por ejemplo, estables a 95°C por al menos 10 minutos sin perder la afinidad de enlace. Algunas veces, los dominios de monómeros pueden plegarse independientemente en una conformación estable. En alguna modalidad, la conformación estable es utilizada por iones (por ejemplo, tales como iones de metal o calcio) . La conformación estable puede opcionalmente, contener enlaces disulfuro (por ejemplo, al menos uno, dos o tres o más enlaces disulfuro) . Los enlaces disulfuro pueden ser formados opcionalmente, entre dos residuos de cisteína. En algunas modalidades, los dominios de monómeros o variantes de dominios de monómeros son sustancialmente idénticas a las secuencias ejemplificadas.

A. Enlazadores c-MET En algunos aspectos, la invención proporciona dominios de monómeros que se enlazan a un polipéptido c-MET o una porción del mismo. Una porción de un polipéptido puede ser, por ejemplo, de al menos 5, 10, 15, 20, 30, 50, 100 o más aminoácidos contiguos del polipéptido. Se generaron un gran número de secuencias de enlace c-MET que tiene un andamiaje de dominio A. Como se describe en detalle en los ejemplos, diez familias (es decir, Familias 1-10, o "Fam 1-10") de dominios de monómeros que se enlazan a c-MET, se han identificado. Las porciones consenso generadas basadas en estas familias, indican residuos de aminoácido común entre enlazadores c-MET. La secuencia que flanquea los residuos conservados que comprenden la porción, son omitidas a partir de la porción, aunque se asume que todos los residuos que comprenden la estructura de dominio A, estarán presentes en cualquier dominio de enlace basado en las familias siguientes. Aquellos de habilidad en la técnica, apreciarán que las posiciones en donde no existe consenso (marcadas con "X"), puede ser de cualquier aminoácido. En algunas modalidades, el aminoácido en las posiciones "X" se seleccionará de aminoácidos en la posición análoga de uno de los enlazantes c-MET ejemplificados ya sea de la misma familia o de una diferente familia. La Familia 1 tiene la siguiente porción consenso: Cxxx [EQ] FxCxSTxRC [ IV] xxxWxCDGDNDCEDxSDEx Las secuencias ejemplares que comprenden la porción de la Familia 1 de c-MET, se exhiben en los ejemplos. Las referencias a monómeros de enlace c-MET o multímeros, abarcan cada secuencia de Familia 1 ejemplificada en los ejemplos. La Familia 2 tiene la siguiente porción: Cxxxx [EQ] FECxSTxRC [ IV] xxx xCDGxNDCEDxSDEx Las secuencias ejemplares que comprenden la porción de la Familia 2 de c-MET son exhibidas en los ejemplos. Las referencias a monómeros o multímero enlazados a c-MET o multímeros, abarcan cada secuencia de la Familia 2 ejemplificadas en los ejemplos. La Familia 3 tiene la siguiente porción: Cxxxx [EQ] FxCxSTxRC [ILV] PxxWxCDGxxDCEDxSDExx Secuencias ejemplares que comprenden la porción de la Familia 3 de c-MET, se exhiben en los ejemplos. Las referencias a monómeros o multímeros enlazantes a c-MET abarcan cada una de la secuencia de la Familia 3, ejemplificada en los ejemplos. La Familia 4 tiene la siguiente porción: Cxxx [EQ] FQCxSTxRC [ IV] PxxWxCDGxNDCEDSSDExxC Secuencias ejemplares que comprenden la porción de la Familia 4 de c-MET, se exhiben en los ejemplos. Las referencias a monómeros o multímeros enlazantes a c-MET, abarcan cada secuencia de la Familia 4 ejemplificada en los ejemplos . La Familia 5 tiene la siguiente porción: Cxxxx [EQ] FxCxxxxxC [ILV] xxxxxxxxxxDCxDxSDEx Secuencias ejemplares que comprenden la porción de la Familia 5 de c-MET, se exhiben en los ejemplos. Las referencias a monómeros o multímero enlazantes a c-MET abarcan cada secuencia de la Familia 5 ejemplificada en los ejemplos . La Familia 6 tiene la siguiente porción: Cxxx [EQ] FxCxSTGRCxPxxWxCxGxNDCEDxSDEx Secuencias ejemplares que comprenden la porción de la Familia c-MET se exhiben en los ejemplos. Las referencias a monómeros o multímeros enlazantes a c-MET abarcan cada secuencia de la Familia 6 ejemplificada en los ejemplos.

La Familia 7 tiene la siguiente porción: Cxxxx [EQ] FxCxSTxRC [ILV] xxx xCxxxxDCxDxSDxxxxxCx Secuencias ejemplares que comprenden la porción de la Familia 7 de c-MET se exhiben en los ejemplos. Las referencias a monómeros o multímeros enlazantes a c-MET, abarcan cada una de la secuencia de la Familia 7 ejemplificada en los ejemplos. La Familia 8 tiene la siguiente porción: Cxxx [EQ] FxCxxxxxC [ ILV] xxxWxCDGxNDCxDxSxExxxxC Las secuencias ejemplares que comprenden la porción de la Familia 8 de c-MET, son exhibidas en los ejemplos. Las referencias a monómeros o multímeros enlazantes .a c-MET, abarcan cada secuencia de la Familia 8 ejemplificada en los ejemplos. La Familia 9 tiene la siguiente porción: Cxxxx [EQ] FxCxSTxRC [ ILV] PxxWxCxGxxDCxDxSDEx Las secuencias ejemplares que comprenden la porción de la Familia 9 de c-MET, son exhibidas en los ejemplos. Las referencias a monómeros o multímeros enlazantes a c-MET, abarcan cada secuencia de la Familia 9 ejemplificada en los ejemplos. La Familia 10 tiene la siguiente porción: Cxxxx [EQ] FxCxxxxxC [ ILV] xxxWxCDGxxDCxDxSDEx la cual puede ser además condensada como: EFXCXNGXCIPXX XCDGXDDCGDXSDE Las secuencias ejemplares que comprenden el motivo de la Familia 10 de c-MET, son exhibidas en los ejemplos. Las referencias a monómeros o multímeros enlazantes a c-MET, abarcan cada secuencia de la Familia 10 ejemplificada en los ejemplos.

B. Enlazantes IgG y extensión de vida media del suero La invención además proporciona dominios que se enlazan a un factor sanguíneo (por ejemplo, albúmina de suero, inmunoglobulina, o eritrocitos) . En algunas modalidades, los dominios de monómeros se enlazan a un polipéptido de inmunoglobulina o a una porción del mismo. Se han identificado dos familias (es decir, Familias 2 y 3 del dominio A) de dominios de monómeros que se enlazan a la inmunoglobulina. La Familia 2 tiene la siguiente porción: [EQ] FXCRX [ST] XRC [ IV] XXXW [ ILV] CDGXXDCXD [DN] SDE Las secuencias ejemplares que comprenden la porción de la Familia 2 de IgG, son exhibidas en los ejemplos. Las referencias a monómeros o multímeros enlazantes a IgG, abarcan cada secuencia de la Familia 2 ejemplificada en los ejemplos . La Familia 3 tiene cualquiera de las dos siguientes porciones: CXSSGRCPXXWVCDGXXDCRDXSDE; O CXSSGRCIPXX LCDGXXDCRDXSDE Las secuencias ejemplares que comprenden la porción de la Familia 3 de IgG, son exhibidas en los ejemplos. Las referencias a monómeros o multímeros enlazantes a IgG, abarcan cada secuencia de la Familia 3 ejemplificada en los ejemplos . Los dominios de monómeros que se enlazan a células rojas de la sangre (RBC) o albúmina de suero (CSA), se describen en la Publicación de Patente Estadounidense No. 2005/0048512, e incluyen, por ejemplo: RBCA CRSSQFQCNDSRICIPGRWRCDGDNDCQDGSDETGCGDSHILPFSTPGPST RBCB CPAGEFPCKNGQCLPVTWLCDGVNDCLDGSDEKGCGRPGPGATSAPAA RBC11 CPPDEFPCKNGQCIPQDWLCDGVNDCLDGSDEKDCGRPGPGATSAPAA CSA-A8 CGAGQFPCKNGHCLPLNLLCDGVNDCEDNSDEPSELCKALT La presente invención proporciona un método para extender la vida media del suero de una proteína, que incluye por ejemplo, un multímero de la invención o una proteína de interés en un animal. La proteína de interés puede ser cualquier proteína con funcionalidad terapéutica, profiláctica o de otro modo, deseable. Este método comprende proporcionar primero, un dominio de monómero que se ha identificado como una proteína enlazante que se enlaza específicamente a un extendedor de vida media tal como una molécula o célula llevada en la sangre, tal como albúmina de suero (por ejemplo, albúmina de suero humano) , IgG, células rojas de la sangre, etc. El monómero enlazante extendedor de vida media, es entonces covalentemente enlazado a otro dominio de monómero que tiene una afinidad de enlace para la proteína de interés (por ejemplo, c-MET o un objetivo diferente) . Esta formación de complejo resulta en la extensión de vida media que protege el multímero y/o proteína (s) enlazada (s) de la degradación proteolítica y/o otra remoción del multímero y/o proteína (s) y con ello, extender la vida media de la proteína y/o multímero. Una variación de este uso de la invención incluye, el monómero enlazante extendedor de la vida media, covalentemente unido a la proteína de interés. La proteína de interés puede incluir un dominio de monómero, un multímero de dominios de monómeros, o un fármaco sintético. Alternativamente, los monómeros que se enlazan a ya sea inmunoglobulinas o eritrocitos, podrían ser generados usando el método anterior y podrían ser usados para extensión de vida media. Los multímeros que se enlazan a extendedores de vida media, son típicamente multímeros de al menos dos dominios, dominios quiméricos, o dominios mutagenizados (es decir, uno que se enlaza a Met y uno que se enlaza a la molécula llevada en la sangre o célula) . Los dominios adecuados incluyen todos aquellos descritos en este documento, que son además seleccionados y seleccionados para enlazarse a un extendedor de vida media. Los multímeros enlazantes al extendedor de vida media son generados de conformidad con los métodos para elaborar multímeros descritos en este documento, usando, por ejemplo, dominios de monómeros pre-seleccionados para determinar la actividad enlazante extendedora de vida media. La vida media del suero de una molécula, se puede extender para ser por ejemplo, al menos, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70 80, 90, 100, 150, 200, 250, 400, 500 o más horas.

C. Discusión de Dominios de Monómero Los dominios de monómeros que son particularmente adecuados para uso en la práctica de la presente invención son dominios ricos en cisteína que comprenden enlaces disulfuro. Los dominios ricos en cisteína empleados en la práctica de la presente invención, típicamente no forman una hélice a, una lámina ß, o una estructura en barril ß. Típicamente, los enlaces disulfuro promueven el plegado del dominio en una estructura tri-dimensional. Usualmente, los dominios ricos en cisteína tiene al menos, dos enlaces disulfuro, más típicamente al menos, tres enlaces disulfuro. En algunas modalidades, al menos 5, 10, 15 o 20% de los aminoácidos en un dominio de monómero son cisteínas. Los dominios pueden tener cualquier número de características. Por ejemplo, en algunas modalidades, los dominios tienen baja o ninguna inmunogenicidad en un animal (por ejemplo, un humano) . Los dominios pueden tener un tamaño menor. En algunas modalidades, los dominios son suficientemente pequeños para penetrar la piel u otros tejidos. Los dominios pueden tener un intervalo de vida media in vivo o estabilidades. Los dominios de monómeros ilustrativos adecuados para uso en la práctica de la presente invención incluyen, por ejemplo, un dominio similar a EGF, un dominio Kringle, un dominio de fibronectina tipo I, un dominio de fibronectina tipo II, un dominio de fibronectina tipo III, un dominio PAN, un dominio Gla, un dominio SRCR, un dominio Inhibidor de tripsina pancreática de Bovino/Kunitz, un dominio de inhibidor de serina proteasa tipo Kazal, un dominio Trébol (tipo P) , un dominio del Factor Willebrand tipo C, un dominio similar a Anafilotoxina, un dominio CUB, una repetición de tiroglobulina tipo I, dominio de clase A del receptor LDL, un dominio Sushi, un dominio Link, un dominio Tromboespondina tipo I, un dominio similar a inmunoglobulina, un dominio de lectina tipo C, un dominio MAM, un dominio tipo A del factor Willebrand, un dominio de Somatomedina B, un dominio de núcleo de cuatro disulfuros tipo WAP, un dominio tipo F5/8 tipo C, un dominio He opexina, un dominio SH2, un dominio SH3, un dominio EGF tipo Laminina, un dominio C2, y otros de tales dominios conocidos por aquellos de habilidad ordinaria en la técnica, así como también derivados y/o variantes de los mismos. En algunas modalidades, los dominios de monómeros adecuados (por ejemplo, dominios con la capacidad para plegarse independientemente o con alguna asistencia limitada) , se pueden seleccionar de las familias de dominios de proteínas que contienen estructuras tridimensionales de intercalado ß o barril ß, como se define por tales herramientas de análisis de secuencia computacional como Simple Modular Architecture Research Tool (SMART) , véase Shultz et al . , SMART: a web-based tool for the study of genetically mobile domains, (2000) Nucleic Acids Research 28 (1) :231-234) o CATH (véase Pearl et al . , Assigning genomic sequences to CATH, (2000) Nucleic Acids Research 28(1) :277-282) . En otra modalidad, los dominios de monómeros de la presente invención incluyen dominios distintos al dominio tipo III, un dominio anticalina y un dominio similar a Ig de CTLA-4. Algunos aspectos de estos dominios se describen en el documento WO01/64949 titulado "Protein scaffolds for antibody mimics and other binding proteins" por Lipovsek et al., publicado el 7 de septiembre de 2001, documento W099/16873 titulado "Anticalins" by Beste et al., publicado el 8 de abril de 1999 y documento WO 00/60070 titulado "A polypeptide structure for use as a scaffold" by Desmet, et al., publicado el 12 de octubre de 2000. Como se describe anteriormente, los dominios de monómeros son opcionalmente ricos en cisteína. Los dominios de monómeros ricos en cisteína adecuados incluyen, por ejemplo, el dominio de clase A del receptor LDL ("dominio A") o el dominio EGF. Los dominios de monómeros pueden también tener un agrupamiento de residuos negativamente cargados. Otras características de dominios de monómeros pueden incluir la capacidad para enlazar ligandos o la capacidad para enlazar un ion (por ejemplo, enlazando Ca2+ por el dominio A del receptor LDL) . Los dominios de monómeros que enlazan iones para mantener su estructura secundaria incluyen, por ejemplo, un dominio A, dominio EGF, EF Hand (por ejemplo, tal como aquellos encontrados en la presente en calmodulina y troponina C) , dominio de Cadherina, lectina tipo C, dominio C2, Anexina, dominio Gla, dominio de tromboespondina tipo 3, todos los cuales se enlazan a dedos de calcio y zinc (por ejemplo, tipo C2H2, tipo C3HC4 (dedos RING) , dominio de enlace a Integrasa de Zinc, dedo PHD, dedo de zinc GATA, dedo de zinc FYVE, dedo de zinc de caja B) , los cuales se enlazan a zinc. Sin pretender limitar la invención, se cree que el enlace de ion proporciona estabilidad de la estructura secundaria, mientras se proporciona suficiente flexibilidad para permitir numerosas conformaciones de enlace dependiendo de la secuencia primaria.

Como se describe en este documento, los dominios de monómeros pueden ser seleccionados por la capacidad para enlazarse a objetivos distinto al objetivo que puede enlazarse a un dominio homólogo que se origina naturalmente. De este modo, en algunas modalidades, la invención proporciona dominios de monómeros (y multímeros que comprenden tales monómeros), que no se enlazan al objetivo o la clase o familia de proteínas objetivo que las que se pueden enlazar a un dominio que se origina naturalmente sustancialmente idéntico. Las características de un dominio de monómero pueden incluir la capacidad para plegarse independientemente y la capacidad para formar una estructura estable. De este modo, la estructura del dominio de monómero es a menudo conservada, aunque la secuencia de polinucleótido que codifica el monómero no necesita ser conservada. Por ejemplo, la estructura de dominio A es conservada entre los elementos de la familia del dominio A, mientras la secuencia de ácido nucleico del dominio A no lo es. De este modo, por ejemplo, un dominio de monómero es clasificado como un dominio A por sus residuos de cisteína y si afinidad para el calcio, no necesariamente por su secuencia de ácido nucleico. Véase, Figuras 1 y 2. Específicamente, los dominios A (algunas veces llamados "repeticiones de tipo complemento", o "dominios clase A o tipo receptor LDL") , contienen aproximadamente 30-50 o 30-65 aminoácidos. En algunas modalidades, los dominios comprenden aproximadamente 34-45 aminoácidos y en algunos casos, aproximadamente 40 aminoácidos. Dentro de los 30-50 aminoácidos, existen aproximadamente 6 residuos de cisteína. De las seis cisteínas, los enlaces disulfuro se encuentran típicamente, entre las siguientes cisteínas: Cl y C3, C2 y C5, C4 y C6. Los residuos de cisteína del dominio son disulfuros enlazados para formar una porción compacta, estable, funcionalmente independiente. Véase, la Figura 3. Los agrupamientos de estas repeticiones hacen un dominio de enlace ligando, y los agrupamientos diferenciales, pueden impartir especificidad con respecto al enlace ligando. Las secuencias de dominio A ejemplares y secuencias consenso, son representadas en las Figuras 1 y 2. Una secuencia consenso típica empleada para identificar dominios A es la siguiente: C- [VILMA] -X(5)C- [DNH]-X(3)- [DENQHT] -C-Xp^-tSTADE] - [DEH] - [DE] -X(?,5)-C, en donde el residuo en los corchetes indica los posibles residuos en una posición. "X(#)", indica el número de residuos. Estos residuos pueden ser cualquier residuo de aminoácido. Los paréntesis que contienen dos números, se refieren al rango de aminoácidos que pueden ocupar cualquier posición (por ejemplo, "[DE]-X(i,5)-C", significa que los aminoácidos DE son seguidos por 1, 2, 3, 4 ó 5 residuos, seguidos por C) . Esta secuencia consenso solamente representa la porción del dominio A que comienza en la tercera cisteína. Un segundo consenso es como sigue: C-X,3-i5)-C-X,4-i5)-C-X,6-7)-C- [N, D] -X, )- [D,E,N,Q,H, S, T] -C-X(4_6)-D-E-X(2-8)-C. El segundo consenso predice los residuos de aminoácido que expanden los seis residuos de cisteína. En algunas modalidades, las variantes del dominio A comprenden secuencias sustancialmente idénticas a cualquiera de las secuencias descritas anteriormente. Se nota que la referencia a dominio "clase A del receptor LDL", para propósitos de esta invención, no se pretende para indicar el origen o propiedades de enlace del dominio. Dominios A ejemplares adicionales incluyen la siguiente secuencia: Ca 3-15CbX3-15 c 6-7Cd ( D5N ) X4CeX4-6DEX2-8C f en donde C es cisteína, Xn- representa entre el número n y m de aminoácidos seleccionados independientemente, y (D,N), indica que la posición puede ser ya sea D o N; y en donde Ca-Cc, Cb-Ce y Cd-Cf forman enlaces disulfuro. A la fecha, al menos 190 dominios A humanos que se originan naturalmente, son identificados basados en la secuencias de ADNc. Véase por ejemplo, Figura 6. Las proteínas ejemplares que contienen dominios A que se originan naturalmente incluyen, por ejemplo, componentes complemento (por ejemplo, C6, C7, C8, C9, y Factor I), serinas proteasas (por ejemplo, enteropeptidasa, matriptasa y corina) , proteínas de la transmembrana (por ejemplo, ST7, LRP3, LRP5 y LRP6) y receptores endocíticos (por ejemplo, receptor relacionado con Sortilina, receptor LDL, VLDLR, LRP1, LRP2 y ApoER2) . Los dominios y variantes de dominios A, pueden ser fácilmente empleados en la práctica de la presente invención como dominios de monómeros y variantes de los mismos. Se puede encontrar descripción adicional de dominios A en las siguientes publicaciones y referencias citadas en este documento: Howell and Hertz, The LDL receptor gene family: signaling functions during development, (2001) Current Opinión in Neurobiology. 11:74-81; Herz (2001), supra ; Krieger, The "best " of cholesterols, the "worst " of cholesterols : A tale of two receptors, (1998) PNAS 95 : 4077-4080; Goldstein and Brown, The Cholesterol Quartet, (2001) Science. 292: 1310-1312; and, Moestrup and Verroust, Megalin-and Cubilin-Mediated Endocytosis of Protein-Bound Vi taminsr Lipids, and Hormones in Polarized Epi thelia, (2001) Ann. Rev. Nutr. 21:407-28. También se puede usar un número de otros tipos de dominios para generar dominios de monómeros enlazantes a c-MET. Dominios de monómeros EGF ejemplares incluyen la secuencia: Ca 3-l CbX3- CcX4-16CdXl-2CeX8-23Cf en donde C es cisteína, Xn-ra representa entre un número n y m de aminoácidos seleccionados independientemente; y en donde Ca-Cc, Cb-Ce y Cd-Cf forman enlaces disulfuro . Cada uno de los dominios descritos abajo, emplea motivos ejemplares (es decir, andamiajes) . Ciertas posiciones son marcadas con x, indicando que cualquier aminoácido puede ocupar la posición. Estas posiciones pueden incluir un número de diferentes posibilidades de aminoácido diferentes, con ello, permitiendo la diversidad de secuencia y de este modo, afinidad para diferentes moléculas objetivo. El uso de corchetes en porciones, indica posibles aminoácidos alternos dentro de una posición (por ejemplo, "[ekq]", indica que ya sea E, K o Q puede estar en tal posición) . El uso de paréntesis en una porción indica que las posiciones dentro de los paréntesis pueden estar presentes o ausentes (por ejemplo, "([ekq])", indica que la posición está ausente o ya sea E, K o Q puede estar en tal posición) . Cuando más de una "x" se usa en paréntesis (por ejemplo, "(xx)")/ cada x representa una posición posible. De este modo, "(xx)", indica que cero, uno o dos aminoácidos pueden estar en tal posición (es) , en donde cada aminoácido es seleccionado independientemente, OÍ representa un aminoácido aromático/hidrofóbico tal como por ejemplo, W, Y, F, o L; ß representa un aminoácido hidrofóbico tal como por ejemplo, V, I, L, A, M o F; ? representa un aminoácido polar menor tal como, por ejemplo, G, A, S, o T; d representa un aminoácido cargado tal como por ejemplo, K, R, E, Q o D; e representa un aminoácido menor tal como por ejemplo: V, A, S, o T; y 0 representa un aminoácido cargado negativamente, tal como por ejemplo, D, E, o N. Los dominios adecuados incluyen, por ejemplo, dominios de tipo tromboespondina, dominios Trébol y dominios de tiroglobulina. Los dominios de tromboespondina tipo 1 ("TSP1") , contienen aproximadamente 30-50 o 30-65 aminoácidos. En algunas modalidades, los dominios comprenden aproximadamente 35-55 aminoácidos y en algunos casos, aproximadamente 50 aminoácidos. Dentro de los 35-55 aminoácidos, existen típicamente, aproximadamente 4 a aproximadamente 6 residuos de cisteína. De los seis residuos de cisteína, los enlaces disulfuro típicamente se encuentran entre las siguientes cisteínas: Cl y C5, C2 y C6, C3 y C4. Los residuos de cisteína del dominio son disulfuros enlazados para formar una porción compacta, estable, funcionalmente independiente, que comprende hebras beta distorsionadas. Las agrupaciones de estas repeticiones hacen dominios de enlace ligando, y el agrupamiento diferencial puede impartir especificidad con respecto al enlace ligando. Las secuencias de dominio TSP1 ejemplares y secuencias consenso, son como sigue: ( 1 ) ( XXXXXX ) C?XXXC2XXXXX ( X ) XXXXXC3XXXX (XXX ) XXXXXC4XXXXXX (x ) xxxCd (x) xxxxC6; (2) (wxxWxx)C?XXxC2xxGxx (x) xRxxxC3xxxx (Pxx)xxxxxC4xxxxxx (x) xxxCd (x) xxxxCß (3) (wxxWxx) C?SXtC2xxGxx (x) xRxrxCxxxx (Pxx) XXXXXC4XXXXXX (x) XXXC5 (x) xxxxCß (4) (WxxWxx) CitStnd] [Vkaq] [Tspl] C2xx [Gq] xx (x) x [Re] x [Rktvm] x [C3vldr] xxxx ( [Pq] xx) xxxxx [C4ldae] xxxxxx (x) xxxCs (x) xxxxCß; (5) (WxxWxx) CitStnd] [Vkaq] [Tspl]C2xx [Gq] xx (x)x [Re] x [Rktvm] x [C3vldr] xxxx ( [Pq] xx) xxxxx [C4ldae] xxxxxx (x) xxxC5 (x) xxxxC6; y (6) C?[nst] [aegiklqrstv] [adenpqrst] C2 [adetgs] xgx [ikqrstv] x [aqrst]x[almrtv]xC3Xxxxxxxxx (xxxxxxx) C4xxxxxxxxx (xx) CsxxxxCß En algunas modalidades, las variantes de dominio tromboespondina tipo 1, comprenden secuencias sustancialmente idénticas a cualquiera de las secuencias descritas anteriormente . A la fecha, al menos 1677 dominios de tromboespondina que se originan naturalmente, han sido identificados basados en la secuencia de ADNc. Proteínas ejemplares que contienen los dominios de tromboespondina que se originan naturalmente incluyen por ejemplo, proteínas en la trayectoria complemento (por ejemplo, properdina, C6, C7, C8A, C8B, y C9) , proteínas de la matriz extracelular (por ejemplo, mindina, F-espondina, SCO-espondina) , proteína 2 de la superficie de circunesporozoito y proteínas TRAP de Plasmodi um. Los dominios de tromboespondina tipo 1, son además descritos en por ejemplo, Roszmusz et al . , BBRC 296:156 (2002); Higgins et aJ . , J I munol . 155:5777-85 (1995); Schultz-Cherry et al . , J. Biol . Chem. 270:7304-7310 (1995); Schultz-Cherry et al . , J. Biol . Chem. 269:26783-8 (1994); Bork, FEBS Lett 327:125-30 (1993); y Leung-Hagesteijn et al . , Cell 71 :289-99 (1992). Otro dominio de monómero ejemplar adecuado para uso en la práctica de la presente invención, es el dominio trébol. Los dominios de monómeros trébol, son típicamente aproximadamente 30-50 ó 30-65 aminoácidos. En algunas modalidades, los dominios comprenden aproximadamente 35-55 aminoácidos y en algunos casos, aproximadamente 45 aminoácidos. Dentro de los 35-55 aminoácidos, existen típicamente, aproximadamente 6 residuos de cisteína. De las seis cisteínas, los enlaces disulfuro típicamente se encuentran entre las siguientes cisteínas: Cl y C5, C2 y C4, C3 y C6. A la fecha, al menos 149 dominios trébol que se originan naturalmente han sido identificados, basados en la secuencia de ADNc. Las proteínas ejemplares que contienen dominios trébol que se originan naturalmente incluyen, por ejemplo, proteína pS2 (TFF1), péptido espasmolítico SP (TFF2), factor trébol intestinal (TFF3) , surceasa-isomaltasa intestinal y proteínas las cuales pueden ser involucradas en la defensa contra infecciones microbianas, protegiendo el epitelio (por ejemplo, Xenopus xPl, xP4, mucinas integumentarias, A.l y C.l. Los dominios trébol son además descritos en por ejemplo, Sands and Podolsky, Anu. Rev. Physiol. 58:253-273 (1996); Carr et al, PNAS USA 91:2206-2210 (1994); DeA et al, PNAS USA 91:1084-1088 (1994); Hoffman et aJ, Trends Biochem Sci 18:239-243 (1993). Las secuencias de dominio trébol ejemplar y secuencias consenso, son como sigue: ( 1 ) Ci (XX) XXXXXXXXXC2XX (X) XXXXXXXC3XXXXC4C5XXXXX (x) xxxxxCß (2 ) Ci (xx) xxxxxxrxxC2xx (x) xxxxxxxC3xxxxC4CsSxxxxx (x) xxxxxC6 (3) Ci (xx) xxxpxxRxnC2gx (x)pxitxxxC3XxxgC C5fdxxx (x) xxxpwCßf (4) Ci (xx)xxx[Pvae]xxRx[ndpm]C2[Gaiy] [ypfst] ([de]x) [pskq]x[Ivap] [Tsa] xx [qedk] C3xx [krln] [Gnk] C4C5 [Fwy] [Dnrs] [sdpnte] xx (x) xxx [pki] [Weash] Ce [Fy] (5) Ci (xx)xxx[Pvae]xxRx[ndpm]C2[Gaiy] [ypfst] ([de]x) [pskq]x[Ivap] [Tsa] xx [keqd] C3xx [krln] [Gnk] C4C5 [a] [Dnrs] [sdpnte] xx (x) xxx [pki] [Weash] C6 [Fy] (6) Ci ( [dnps] ) [adiklnprstv] [dfilmv] [adenprst] [adelprv] [ehklnqrs] [adegknsv] [kqr] [fiklqrtv] [dnpqs] C2 [agiy] [flpsvy] [dk npqs] [adfghlp] [aipv] [st] [aegkpqrs] [adegkpqs] [deiknqt]C3 [adefknqrt] [adegknqs] [gn]C4C5 [wyfh] [deinrs] [adgnpst] [aefgqlrst w] [giknsvmq] ( [afmprstv] [degklns] [afiqstv] [iknpv]w)C6 Otro dominio de monómero ejemplar adecuado para uso en la presente invención, es el dominio de tiroglobulina. Los dominios de monómero de tiroglobulina son típicamente de aproximadamente 30-85 ó 30-80 aminoácidos. En algunas modalidades, los dominios comprenden aproximadamente 35-75 aminoácidos y en algunos casos aproximadamente 65 aminoácidos. Dentro de los 35-75 aminoácidos, existen aproximadamente típicamente 6 residuos de cisteína. De las seis cisteínas, los enlaces disulfuro típicamente se encuentran entre las siguientes cisteínas: Cl y C2, C3 y C4, C5 y C6. A la fecha, al menos 251 dominios de inmunoglobulina que se originan naturalmente han sido identificados, basados en las secuencias de ADNc. La sección N-terminal de Tg contiene 10 repeticiones de un dominio de aproximadamente 65 aminoácidos los cuales se conocen como la repetición Tg tipo 1. PUBMED: 3595599, PUBMED: 8797845 Las proteínas ejemplares que contienen dominios de tiroglobulina que se originan naturalmente incluyen, por ejemplo, la cadena de variante asociada a la clase II HLA, proteínas marcadoras de carcinoma pancreático humano, nidógeno (entactina) , proteínas de enlace al factor de crecimiento similar a insulina (IGFBP) , saxifilina, inhibidor de proteinasa cisteína de huevo de salmón keta, y quistatina. Los dominios Thyr-1 y relacionados, pertenecen a la familia del inhibidor de proteinasa MEROPS 131, clan IX. Los dominios de tiroglobulina son además descritos en por ejemplo, Molina et al r Eur. J. Biochem. 240:125-133 (1996); Guncar et al , EMBO J 18:793-803 (1999); Chong and Speicher, DW 276:5804- 5813 (2001) . Las secuencias de dominio de tiroglobulina ejemplares y secuencias consenso son como sigue: (1) C ?xxxxxxxxxxxxxxx(xxxxxxxxxx)xxxxxxxxxxxC2XxxxxxxxxxC3x(x)x(xxx)xxxxC x C5Xxxx(x)xxxxxxxxxxxxxx(xx)xCß (2) C1xxxxxxxxxxxxxxx(xxxxxxxxxx)xxxxxxxyxP?C2XxxGxxxxxQC3x(x)x(xxx)xxxxC4 WCsVxxx(x)GxxxxGxxxxxxxx(xx)xC6 (3)C1xxxxxxxxxxxxsxx(xxxxxxxxxx)xxxxxxxyxPxC2XxxGxyxxxQC3x(x)s(xxx)xxgxC4WC5 Vdxx(x)GxxxxGxxxxxgxx(xx)xCß (4)C1[qerl]xxxxxxxxxxxxxx(xxxxxxxxxx)xxxxxxx[Yfhp]xPxC2XxxGx[Yf]xx[vkrl]QC3x(x[s a]xxx)xx[Gsa]xC4|WyfJC5V[Pnyfl]xx(x)Gxxxx[GdQe3xxxxxgxx(xx)xC6 (5)C?[qerl]xxxxxxxxxxxxxx(xxxxxxxxxx)xxxxxxx[(xhp]xP?C2xxxGx[a]xx[vkrl]QC3x(x[sa] xxx)xx[gas]xC [a]C5V[Dna]xx(x)Gxxxx[fg]xxxxxgxx(xx)xC6 Otro dominio de monómero ejemplar que puede ser usado en la presente invención es un dominio de laminina EGF.

Los dominios de laminina EGF son típicamente de aproximadamente 30-85 o 30-85 aminoácidos. En algunas modalidades, los dominios comprenden aproximadamente 45-65 aminoácidos y en algunos casos, aproximadamente 50 aminoácidos. Dentro de los 45-65 aminoácidos, existen típicamente aproximadamente 8 residuos de cisteína los cuales interactúan para formar 4 enlaces disulfuro. Las lamininas son un componente no colagenoso principal de membranas de basamento que median la adhesión celular, migración de crecimiento y diferenciación. Estas están compuestas de cadenas alfa, beta y gama relacionadas. Las tres cadenas forman una molécula en forma cruzada que consiste de un brazo largo y tres brazos globulares cortos. El brazo largo consiste de una estructura de bobina bobinada, contribuida por todas las tres cadenas y reticulada por los enlaces disulfuro intercadenas . Las secuencias de dominio EGF laminares ejemplares y las secuencias consenso son como sigue: (1) C?xC2XXXxxx(xxx)xxC3XXx(xxxxxx)xxxxC4xC5xxxxxxxxC6XxC7xxxxxxx(xxxx?)??? xxCs (2) C1xC2xxxxxx(xxx)xxC3xxx(xxxxxx)xxgxC4xC5xxxxxGxxC6XxC7xxxxxxx(xxxxx)?? xxxCg (3) C1xC2[ndh]xxxxx(xxx)xxC3Xxx(xxxxxx)xxgxC4xC5XxxxxGxxC6[denq]xC7Xx[gn][yf ht]xxx(xxxxx)xxxxxC8 En algunas modalidades , el dominio de monómero es el dominio de monómero Notch/LNR, un dominio de monómero DSL , un dominio de monómero Anato , un dominio de monómero beta integrina , y un dominio de monómero Ca-EGF . En algunas modalidades , el dominio de monómero Ca-EGF comprende la siguiente secuencia : DxdEC1xx(xx)xxxxC2x(xx)xxxxxC3xNxxGx-xC4x(xxx)xC5xxgxxxxxxx(xxxxx)xxxC6. En algunas modalidades , el dominio de monómero C???(??)???C2?????nGxC3xxxC4nxxxC5??DGxDC6 Notch/LNR, comprende la siguiente secuencia : En algunas modalidades, el dominio de mon?mero DSL coitprende la siguiente secuencia : C1xxxYygxxC ??fC3????d???h??C4???GxxxC5xxGWxG?xC6.

El dominio de monómero Anato comprende la siguiente secuencia : C?C2xdgxxxxx(x)xxxxC3exrxxxxxx(xx)xxC4xxxfxxCsC6.

En algunas modalidades , el dominio de monómero beta integrina comprende la siguiente secuencia : C?XxC2xxxxpxC3XwC4xxxxixxx(gx)xxxxRC5dxxxxLxxxgC6; y "x" es cualquier aminoácido . En algunas modalidades, Q.-C5, C2-C4, y C3-C6 del dominio de monómero Notch/LNR, forman enlaces disulfuro; y C1-C5, C2-C4 y C3-C6 del dominio de monómero DSL forman enlaces disulfuro . En algunas modalidades , el dominio de monómero Ca-EGF comprende la siguiente secuencia : D[ß][Dn]EC1xx(xx)xxxxC2[pdg](dx)xxxxxC xNxxG[sgt] [a]xC4x(xxx)xCsxx[Gsn][ s]x xxxxx(xxxxx)xxxC6.

En algunas modalidades , el dominio de monómero Notch/LNR comprende la siguiente secuencia : C?xx(x[ß ])xxxC2x[fs]xxx[f][Gk]xC3[nd]x[fsa]C4[fs]xx[aeg]C5x[ ]DGxDC6.

En algunas modalidades , el dominio de monómero DSL comprende la siguiente secuencia : C?xxx[a] [ah] [Gsna]xx xx[a]C3x[pae]xx[Da]xx[?l] [Hrgk] [ ak]xC4[dnsg]xxGxxxC5Xx G[a]xGxxC6. En algunas modalidades, el dominio de monómero Anato comprende la siguiente secuencia: C?C2x[Dhti][Ga]xxxx[plant](xx)xxxxC3[esqdat]x[Rlps]xxxxxx([gepa]x)xxC4Xx[avípt][F qvy]xxC5C6.

En algunas modalidades , el dominio de monómero beta integrina comprende la siguiente secuencia : C1xxC2[ß]xx[ghds][Pk]xC3[?][ a]C4xxxx[a]xxx([Gr]xx)x[?]xRC5[Dnae]xxxxL[ßk]xx[G n]Cß; OÍ se selecciona de : w, y, f , y 1 ; ß se selecciona de : v, I , 1 , a, m, y f ; ? se selecciona de : g, a, s , y t ; d se selecciona de : k, r, e, q, y d; e se selecciona de v, a, s, y t; y 0 se selecciona de : d, e, y n . En algunas modalidades , el dominio de monómero Ca-EGF comprende la siguiente secuencia : D[vüf](On]EC?xx(xx)xxxxC2[pdg](dx)xxxxxC3xNxxG[sgt][fy]xC4x(xxx)xCsXx[Gsnl[ as ]xxxxxx(xxxxx)xxxC6. En algunas modalidades, el dominio de monómero Notch/LNR comprende la siguiente secuencia: C?xx(x[yiflv])xxxC2x[dens]xxx[?de][Gk]xC3[nd]x[densa]C4l ísde]xx[aeg]C5x[wyf|DGx DC6.

En algunas modalidades, un dominio de monómero DSL comprende las siguientes secuencias: C?xxxi?wf]|?fh][Gasn]xxC2Xx[Fy]C3x| 3ae]xx[Da]xx[glast][Hrgk][ykrw]xC4[dsgn] xxxC5xxG[Wlfy]xGxxC6. En algunas modalidades, el dominio de monómero Anato comprende la siguiente secuencia: C1C2x[adehlt]gxxxxxxxx(x)[derst]C3Xxxxxxxxx(xx[aersv])C xx[apvt][lmq][eklqrtv][ade hqrsk](x)C5C6. En algunas modalidades, el dominio de monómero beta integrina comprende la siguiente secuencia: Ci [aegkqrst][kreqd]C2[il] [aelqrv] [vilas] [dghs] [k?]xC3[gast][wy]C4XXXx[fl]xxxx(xxxx[vil ar]r)C5[and][dilrt][iMpqrv][adeps][aenq]l[ qv]x[adknr][gn]C6. Los polinucleótidos que codifican los dominios de monómeros son típicamente empleados para elaborar dominios de monómero vía expresión. Los ácidos nucleicos que codifican dominios de monómeros pueden ser derivados de una variedad de diferentes fuentes. Las bibliotecas de dominios de monómeros pueden ser preparadas expresando una pluralidad de diferentes ácidos nucleicos que codifican dominios de monómeros que se originan naturalmente, dominios de monómeros alterados (es decir, variantes de dominios de monómeros), o combinaciones de los mismos. Por ejemplo, las bibliotecas pueden ser designadas en las cuales, un andamiaje de aminoácidos permanece constante (por ejemplo, un dominio del receptor LDL A, dominio EGF) , mientras los aminoácidos de intervención en el andamiaje comprenden aminoácidos generados aleatoriamente. La invención proporciona métodos para identificar dominios de monómeros que se enlazan a un ligando seleccionado o deseado o mezcla de ligandos. En algunas modalidades, los dominios de monómeros se identifican o seleccionan por una propiedad deseada (por ejemplo, afinidad de enlace) y después los dominios de monómeros deseados se forman en multímeros. Véase por ejemplo, Figura 4. Para aquellas modalidades, se puede usar cualquier método que resulta en la selección de dominios con una propiedad deseada (por ejemplo, una propiedad de enlace específico) . Por ejemplo, los métodos pueden comprender proporcionar una pluralidad de diferentes ácidos nucleicos, cada ácido nucleico codifica un dominio de monómero; traducir la pluralidad de diferentes ácidos nucleicos, con ello, proporcionando una pluralidad de diferentes dominios de monómeros; seleccionar la pluralidad de diferentes dominios de monómeros para enlace del ligando deseado o una mezcla de ligandos; e, identificar elementos de la pluralidad de diferentes dominios de monómeros que se enlazan al ligando deseado o mezcla de ligandos. Los dominios de monómero pueden ser que se originan naturalmente o alterados (variantes no naturales) .El término "que se origina naturalmente" se usa en este documento para indicar que un objeto se puede encontrar en la naturaleza. Por ejemplo, los dominios de monómeros naturales pueden incluir dominios de monómeros humanos u opcionalmente, dominios derivados de diferentes especies o fuentes, por ejemplo, mamíferos, primates, roedores, pescado, aves, reptiles, plantas, etc. Los dominios de monómeros que se originan naturalmente, se pueden obtener por un número de métodos, por ejemplo, por amplificación de PCR de ADN genómico o ADNc. Los dominios de monómeros de la presente invención, pueden ser dominios que se originan naturalmente o variantes que no se originan naturalmente. Las bibliotecas de dominios de monómeros empleadas en la práctica de la presente invención, pueden contener dominios de monómeros que se originan naturalmente, variantes de dominios de monómero que no se originan naturalmente, o una combinación de los mismos. Las variantes de dominios de monómeros pueden incluir dominios ancestrales, dominios quiméricos, dominios aleatorizados, dominios mutados y similares. Por ejemplo, los dominios ancestrales se pueden basar en un análisis filogenético. Los dominios quiméricos son dominios en los cuales una o más regiones son reemplazadas por regiones correspondientes de otros dominios de esta misma familia. Por ejemplo, los dominios quiméricos pueden ser construidos combinando secuencias de bucle a partir de dominios múltiples relacionados de la misma familia, para formar nuevos dominios con inmunogenicidad potencialmente disminuida. Aquellos expertos en la técnica reconocerán el beneficio inmunológico de construcción de monómeros de dominios de enlace modificados, combinando regiones de bucle de varios dominios relacionados de la misma familia, en lugar de crear secuencias de aminoácido aleatorias. Por ejemplo, construyendo dominios de variantes combinando secuencias de bucle o aún, secuencias de bucle múltiples que se originan naturalmente en los dominios clase A del receptor LDL humano, los dominios resultantes pueden contener nuevas propiedades enlazantes, pero no pueden contener alguna secuencia de proteína inmunogénica debido a que todos los bucles expuestos son de origen humano. La combinación de las secuencias de aminoácido de bucle en el contexto endógeno, pueden ser aplicadas a todos los constructos de monómeros de la invención. De este modo, la presente invención proporciona un método para generar una biblioteca de dominios de monómeros quiméricos derivados de proteínas humanas, el método comprende: proporcionar secuencias de bucle que corresponden al menos a un bucle a partir de cada una de al menos, dos diferentes variantes que se originan naturalmente de una proteína humana, en donde las secuencias de bucle son secuencias de polinucleótido o polipéptido; y combinar covalentemente, secuencias de bucle para generar una biblioteca de al menos, dos diferentes secuencias quiméricas, en donde cada secuencia quimérica codifica un dominio de monómero quimérico que tiene al menos, dos bucles. Típicamente, el dominio quimérico tiene al menos, cuatro bucles, y usualmente, al menos seis bucles. Como se describe anteriormente, la presente invención proporciona tres tipos de bucles que son identificados por características específicas, tales como, potencial para enlace de disulfuro, puenteado entre las estructuras de proteínas secundarias y dinámicas moleculares (es decir, flexibilidad) . Los tres tipos de secuencias de bucle son una secuencia de bucle definida por cisteína, una secuencia de bucle definida por estructura, y una secuencia de bucle definida por el factor B. Los dominios aleatorizados son dominios en los cuales, una o más regiones son aleatorizadas. La aleatorización se puede basar en aleatorización completa, u opcionalmente, aleatorización parcial basada en la distribución natural de la diversidad de secuencia. La presente invención también proporciona ácidos nucleicos recombinantes que codifican uno o más polipéptidos que comprenden una o una pluralidad de dominios de monómeros que se enlazan a c-MET. Por ejemplo, el polipéptido se puede seleccionar para comprender un dominio que no se origina naturalmente del grupo que consiste de: un dominio similar a EGF, un dominio Kingle, un dominio de fibronectina tipo I, un dominio de fibronectina tipo II, un dominio de fibronectina tipo III, un dominio PAN, un dominio Gla, un dominio SRCR, un dominio inhibidor de tripsina pancreática Bobina/Kunitz, un dominio inhibidor de proteasa serina de tipo Kazal, un dominio Trébol (tipo P) , un dominio del factor von Willebrand tipo C, un dominio similar a Anafilatoxina, un dominio CUB, una repetición de tiroglobulina tipo I, dominio clase A del receptor LDL, un dominio Sushi, un dominio Link, un dominio de Tromboespondina tipo I, un dominio similar a Inmunoglobulina, un dominio de lectina tipo C, un dominio MAM, un dominio A del factor Von Willebrand tipo A, un dominio de Somatomedina B, un dominio de núcleo de cuatro disulfuros tipo WAP, un dominio F5/8 tipo C, un dominio Hemopexina, un dominio SH2, un dominio SH3, un dominio similar a EGF tipo Laminina, un dominio C2 y variantes de uno o más de los mismos. En otra modalidad, el polipéptido que se origina naturalmente codifica un dominio de monómero. encontrado en la base de datos Pfam y/o la base de datos SMART. Todas las composiciones de la presente invención, que incluyen las composiciones producidas por los métodos de la presente invención, por ejemplo, dominios de monómeros y/o inmuno-dominios, así como también multímeros y bibliotecas de los mismos, pueden ser opcionalmente unidos a una matriz de un material de afinidad. Ejemplos de materiales de afinidad incluyen perlillas, una columna, un soporte sólido, un microarreglo, otras combinaciones de soportes de reactivos y similares.

III. MULTÍMEROS Los métodos para generar multímeros son una característica de la presente invención. Los multímeros comprenden al menos, dos dominios de monómeros. Por ejemplo, los multímeros de la invención pueden comprender desde 2 hasta aproximadamente 10 dominios de monómeros, desde 2 hasta aproximadamente 8 dominios de monómeros, desde aproximadamente 3 y aproximadamente 10 dominios de monómeros, aproximadamente 7 dominios de monómeros, aproximadamente 6 dominios de monómeros, aproximadamente 5 dominios de monómeros, o aproximadamente 4 dominios de monómeros. En algunas modalidades, el multímero comprende 3 o al menos, 3 dominios de monómeros. En algunas modalidades, los multímeros no tienen más de 2, 3, 4, 5, 6 7 u 8 dominios de monómeros. En vista del intervalo posible de tamaños de dominio de monómeros, los multímeros de la invención pueden ser, por ejemplo, menos de 100 kD, menos de 90 kD, menos de 80 kD, menos de 70 kD, menos de 60 kD, menos de 50 kd, menos de 40 kD, menos de 30 kD, menos de 25 kD, menos de 20 kD, menos de 15 kD, menos de 10 kD, o pueden ser más pequeños o más grandes. En algunos casos, los dominios de monómeros han sido pre-seleccionados para enlazarse a la molécula objetivo de interés (por ejemplo, Met) . En algunas modalidades, cada dominio de monómero se enlaza específicamente a una molécula objetivo (por ejemplo, c-Met) . En algunas de estas modalidades, cada monómero se enlaza a una posición diferente (análoga a un epítope) en una molécula objetivo. Los dominios de monómeros múltiples que se enlazan a la misma molécula objetivo, resultan en un efecto de avidez que resulta en la afinidad mejorada del multímero a la molécula objetivo, comparado con la afinidad de cada monómero individual. En algunas modalidades, el multímero tiene una avidez de al menos aproximadamente 1.5, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 500 o 100 veces la avidez de un dominio de monómero solo. En algunas modalidades, al menos uno, dos, tres, cuatro o más monómeros (por ejemplo todos) , de un multímero se enlazan a un ion tal como calcio u otro ion. Los multímeros pueden comprender una variedad de combinaciones de dominios de monómeros. Por ejemplo, en un multímero único, los dominios de monómeros seleccionados pueden comprender varios dominios de monómeros diferentes a partir de la misma familia de dominio de monómero, o varios dominios de monómero de diferentes familias de dominios, u opcionalmente, una combinación de ambos. Por ejemplo, los dominios de monómeros se pueden seleccionar a partir de Familias 1-10 de dominios de monómeros que se enlazan a c-Met. En algunas modalidades, al menos uno de los dominios de monómeros se selecciona de la Familia 10 de los dominios de monómero enlazantes a c-Met. Dímeros enlazantes a c-MET ejemplares (comprendidos de dos monómeros enlazantes a c-MET), son listados en los ejemplos. Los multímeros que se generan en la práctica de la presente invención, pueden ser cualquiera de los siguientes: (1) Un homo-multímero (un multímero del mismo dominio, es decir, Al-Al-Al-Al) ; (2) Un hetero-multímero de diferentes dominios de la misma clase de dominio, por ejemplo, A1-A2-A3-A4. Por ejemplo, los hetero-multímeros incluyen multímeros en donde Al, A2, A3 y A4, son diferentes variantes que no se originan naturalmente de dominios particulares del receptor clase A LDL, o en donde algunos de Al, A2, A3 y A4 son variantes que se originan naturalmente de un dominio del receptor clase A LDL. (3) Un hetero-multímero de dominios de diferentes clases de dominios de monómeros, por ejemplo, A1-B2-A2-B1. Por ejemplo, en donde Al y A2 son dos diferentes dominios de monómeros (ya sea que se originan naturalmente o que no se originan naturalmente) del receptor LDL clase A, y Bl y B2, son dos diferentes dominios de monómeros (ya sea que se originan naturalmente o que no se originan naturalmente) de la clase de dominio similar a EGF) . En otra modalidad, los dominios de monómeros comprenden multímeros con especificidades para diferentes moléculas objetivo (por ejemplo, un factor sanguíneo tal como albúmina de suero, inmunoglobulina o eritrocitos) . Por ejemplo, en algunas modalidades, los multímeros de la invención comprenden 1, 2, 3 o más dominios de monómeros que se enlazan a Met y al menos un dominio de monómero que se enlaza a una segunda molécula objetivo. Las moléculas objetivo ejemplares incluyen, por ejemplo, una molécula de suero que extiende la vida media del suero del multímero (por ejemplo, una inmunoglobulina o albúmina de suero), elementos de la familia del gen EGFR, receptores VEGF, receptor PDGF, otros receptores de tirosina cinasa, integrinas, otras moléculas implicadas en la tumorigénesis, o marcadores de tejido tumoral. Moléculas ejemplares que extienden la vida media del suero de un multímero incluyen, por ejemplo, células rojas de la sangre (es decir, eritrocitos), IgG, y albúmina de suero tal como HSA. Un multimero ejemplar incluirá un dominio de monómero de la Familia 10 de dominios de monómero enlazantes c-MET y dominio de monómero de la Familia 2 ó 3 de los dominios de monómero de enlace a inmunoglobulina . Las bibliotecas de multímeros empleadas en la práctica de la presente invención pueden contener ho o-multímeros, hetero-multímeros de diferentes dominios de monómeros (natural o no natural) de la misma clase de monómeros o hetero-multímeros de dominios de monómeros (natural o no natural) de diferentes clases de monómeros o combinaciones de los mismos. Los dominios de monómeros como se describen en este documento, también son fácilmente empleados en un heteromultímero que contiene inmuno-dominio (es decir, un multímero que tiene al menos una variante de inmuno-dominio y una variante de dominio de monómero) . De este modo, multímeros de la presente invención puede tener al menos un inmuno-dominio tal como un minicuerpo, un anticuerpo de dominio único, un fragmento variable de cadena única (ScFv) , o un fragmento Fab; y al menos un dominio de monómero, tal como, por ejemplo, un dominio similar a EGF, un dominio Kringle, un dominio de fibronectina tipo I, un dominio de fibronectina tipo II, un dominio de fibronectina tipo III, un dominio PAN, un dominio Gla, un dominio SRCR, un dominio Inhibidor de tripsina pancreática de Bovino/Kunitz, un dominio de inhibidor de serina proteasa tipo Kazal, un dominio Trébol (tipo P) , un dominio del Factor Willebrand tipo C, un dominio similar a Anafilotoxina, un dominio CUB, una repetición de tiroglobulina tipo I, dominio de clase A del receptor LDL, un dominio Sushi, un dominio Link, un dominio Tromboespondina tipo I, un dominio similar a inmunoglobulina, un dominio de lectina tipo C, un dominio MAM, un dominio tipo A del factor Willebrand, un dominio de Somatomedina B, un dominio de núcleo de cuatro disulfuros tipo WAP, un dominio tipo F5/8 tipo C, un dominio Hemopexina, un dominio SH2, un dominio SH3, un dominio EGF tipo Laminina, un dominio C2, o variantes de los mismos. Los dominios no necesitan seleccionarse antes de que los dominios se liguen para formar multímeros. Por otro lado, los dominios pueden ser seleccionados para determinar la capacidad para enlazarse a una molécula objetivo antes de ser ligadas a multímeros. De este modo, por ejemplo, un multímero puede comprender dos dominios que se enlazan a una molécula objetivo y a un tercer dominio que se enlaza a una segunda molécula objetivo. Los multímeros de la presente invención pueden tener las siguientes calidades: multivalente, multiespecífico, cadena única, estable al calor, vida media de anaquel y/o del suero extendida. Sin embargo, al menos uno, más de uno o todos los dominios de monómeros, se pueden enlazar a un ion (por ejemplo, un ion metálico o un ion de calcio) , al menos uno, más de uno o todos los dominios de monómeros se pueden derivar de los dominios del receptor A de LDL y/o dominios similares a EGF, al menos uno, más de uno o todos los dominios de monómeros pueden ser que no se originan naturalmente, y/o al menos uno, más de uno o todos los dominios de monómeros pueden comprender 1, 2, 3 ó 4 enlaces disulfuro por dominio de monómero. En algunas modalidades, los multímeros comprenden al menos dos (o al menos tres) dominios de monómeros, en donde al menos un dominio de monómero es un dominio de monómero que no se origina naturalmente y los dominios de monómero se enlazan a calcio. En algunas modalidades, los multímeros comprenden al menos 4 dominios de monómeros, en donde al menos un dominio de monómero no se origina naturalmente, y en donde: a. cada dominio de monómero es entre 30-100 aminoácidos y cada uno de los dominios de monómero comprende al menos, un enlace disulfuro; o b. cada dominio de monómero es entre 30-100 aminoácidos y se deriva de una proteína extracelular; o c. cada dominio de monómero es entre 30-100 aminoácidos y se enlaza a una proteína objetivo. En algunas modalidades, los multímeros comprenden al menos, 4 dominios de monómeros, en donde al menos un dominio de monómero no se origina naturalmente, y en donde: a. cada dominio de monómero es entre 35-100 aminoácidos; o b. cada dominio comprende al menos, un enlace disulfuro y se deriva de una proteína humana y/o una proteína extracelular. En algunas modalidades, los multímeros comprenden al menos, dos dominios de monómeros, en donde al menos un dominio de monómero no se origina naturalmente, y en donde cada dominio es: a. 25-50 aminoácidos de longitud y comprende al menos, un enlace disulfuro; o b. 25-50 aminoácidos de longitud y se deriva de una proteína extracelular; o c. 25-50 aminoácidos y se enlaza a una proteína objetivo; o d. 35-50 aminoácidos de longitud. En algunas modalidades, los multímeros comprenden al menos dos dominios de monómeros, en donde al menos un dominio de monómero no se origina naturalmente y: a. cada dominio de monómero comprende al menos un enlace disulfuro; o b. al menos un dominio de monómero se deriva de una proteína extracelular; o c. al menos un dominio de monómero se enlaza a una proteína objetivo. Los dominios de monómero y/o multímeros identificados pueden tener actividad biológica, lo cual significa incluir al menos, afinidad de enlace específica para un ligando seleccionado o deseado, y, en algunos casos, además incluirá la capacidad para bloquear el enlace de otros compuestos, para estimular o inhibir las trayectorias metabólicas, para actuar como una señal o mensajero, para estimular o inhibir la actividad celular, y similares. Los dominios de monómeros se pueden generar para funcional como ligandos para receptores en donde el ligando natural para el receptor, aún no se ha identificado (receptores orfan) . Estos ligandos orfan, se pueden crear para bloquear o activar ya sea el receptor superior al cual se enlazan. Se puede usar un ligando único, u opcionalmente, se puede usar una variedad de ligandos para seleccionar los dominios de monómeros y/o multímeros. Un dominio de monómero de la presente invención, se puede enlazar a un ligando único o una variedad de ligandos. Un multímero de la presente invención, puede tener múltiples sitios de enlace discretos para un enlace único, u opcionalmente, pueden tener sitios de enlace múltiple por una variedad de ligandos. En algunas modalidades, el multímero comprende dominios de monómeros con especificidades para diferentes proteínas. Las proteínas diferentes pueden ser relacionadas o no relacionadas. Ejemplos de proteínas relacionadas incluyen elementos de una familia de proteínas o diferentes serotipos de un virus. Alternativamente, los dominios de monómeros de un multímero, pueden dirigir diferentes moléculas en trayectorias fisiológicas (por ejemplo, diferentes proteínas de coagulación sanguínea) . En aún otras modalidades, los dominio de monómeros se enlazan a proteínas en trayectorias no relacionadas (por ejemplo, dos dominios se enlazan a factores sanguíneos, los otros dos dominios se enlazan a proteínas relacionadas con la inflamación y una quinta se enlaza a albúmina de suero) . En otra modalidad, un multímero está comprendido de dominios de monómeros que se enlazan a diferentes patógenos o contaminantes de interés. Tales multímeros son empleados como un agente de detección único, capaz de detectar la posibilidad de cualquiera de un número de patógenos o contaminantes. En algunas modalidades, los multímeros de la invención se enlazan a los mismos u otros multímeros para formar agregados. La agregación puede ser mediada por ejemplo, por la presencia de dominios hidrofóbicos en dos dominios de monómeros, resultando en la formación de interacciones no covalentes entre dos dominios de monómeros. Alternativamente, la agregación puede ser facilitada por uno o más dominios de monómeros, en un multímero que tiene especificidad de enlace para un dominio de monómero en otro multímero. Los agregados pueden también formarse debido a la presencia de péptidos de afinidad en los dominios de monómeros o multímeros. Los agregados pueden contener más dominios de enlace a la molécula objetivo que un multímero único. Los multímeros con afinidad para tanto una superficie celular objetivo como un segundo objetivo, pueden proporcionar efectos de avidez incrementada. En algunos casos, la fluidez de membrana puede ser más flexible que los enlazadores de proteínas optimizando (por auto-montaje) el espaciamiento y valencia de las interacciones. En algunos casos, los multímeros se enlazarán a dos diferentes objetivos, cada uno en una célula diferente o uno en una célula y otro en una molécula con sitios de enlace múltiple. En algunas modalidades, los monómeros o multímeros de la presente invención están ligados a otro polipéptido para formar una proteína de fusión. Cualquier polipéptido en la técnica puede ser usado como un asociado de fusión, aunque puede ser empleado si los asociados de fusión forman multímero. Por ejemplo, los monómeros o multímeros de la invención pueden, por ejemplo, ser fusionados a las siguientes ubicaciones o combinaciones de ubicaciones de un anticuerpo: 1. Al N-término de los dominios VH1 y/o VL1, opcionalmente solo después del péptido líder y antes de inicio del dominio (región de estructura 1) ; 2. Al N-término del dominio CH1 o CL1, reemplazando el dominio VH1 o VL1. 3. Al N-término de la cadena pesada, opcionalmente después del dominio CH1 y antes de los residuos de cisteína en la articulación (fusión Fc) ; 4. Al N-término del dominio CH3; 5. Al C-término del dominio CH3, opcionalmente unido al último residuo de aminoácido vía un enlazador corto; 6. Al C-término del dominio CH2, reemplazando el domino CH3; 7. Al C-término del dominio CL1 o CH1, opcionalmente después que la cisteína forma el disulfuro de intercadena; o 8. Al C-término del dominio VH1 o VL1. Véase por ejemplo, Figura 1. En algunas modalidades, uno o más dominios de monómeros o multímeros de la invención, están ligados a una molécula (por ejemplo, una proteína, ácido nucleico, molécula pequeña orgánica, etc.), empleada como un farmacéutico. Las proteínas farmacéuticas ejemplares incluyen por ejemplo, citocinas, anticuerpos, quimiocinas, factores de crecimiento, interleucinas, proteínas de la superficie celular, dominios extracelulares, receptores de la superficie celular, citotoxinas, etc. Farmacéuticos de molécula pequeña ejemplares incluyen, toxinas o agentes terapéuticos. En algunas modalidades, un metal se puede unir a los polipéptidos de la invención. Esto puede ser empleado, por ejemplo, como un agente de contraste, por ejemplo, para MRl. En algunas modalidades, el monómero o multímero se seleccionan para enlazarse a proteína específica del tejido o enfermedad. Las proteínas específicas del tejido, son proteínas que se expresan exclusivamente, o a un nivel significantemente superior, en uno o varios tejido (s) particulares comparados con otros tejidos en un animal. Como c-MET se expresa a niveles significantes en el hígado, los dominios de monómeros que se enlazan a Met, pueden ser usados para dirigir otras moléculas, que incluyen otros dominios de monómeros al hígado. Esto puede ser usado para dirigir enfermedades específicas del hígado, por ejemplo, dirigiendo moléculas tóxicas o terapéuticas al hígado. Un ejemplo de una enfermedad hepática que puede ser tratada es el carcinoma hepatocelular. Similarmente, las proteínas específicas de la enfermedad, son proteínas que se expresan exclusivamente, o a un nivel significantemente superior, en una o varias células o tejidos enfermos, comparados con otras células o tejidos no enfermos en un animal . En algunas modalidades, los monómeros o multímeros que se enlazan a la proteína objetivo, son ligados a las proteínas farmacéuticas o molécula pequeña, de manera que el complejo o fusión resultante es dirigido a la(s) célula (s) relacionadas con la enfermedad o específicas del tejido, en donde la proteína objetivo es expresada (por ejemplo, c-MET) . Los monómeros o multímeros para uso en tales complejos o fusiones, pueden ser inicialmente seleccionados para enlazarse a la proteína objetivo, y pueden ser subsecuentemente seleccionados por selección negativa contra otras células o tejidos (por ejemplo, para evitar la médula ósea de objetivo u otros tejidos que establecen el límite inferior de toxicidad de fármaco) , en donde se desea que el enlace se reduzca o elimine en otras células o tejidos no objetivos. Manteniendo el farmacéutico lejos de los tejidos sensibles, la ventana terapéutica se incrementa, de manera que una dosis superior puede ser administrada de forma segura. En otra alternativa, la selección por inmovilización in vivo, puede ser realizada en animales, inyectando una biblioteca de monómeros o multímeros en un animal y después, aislando los monómeros o multímeros que se enlazan a un tejido particular o célula de interés.

Las proteínas de fusión descritas anteriormente, pueden también incluir un péptido enlazador entre la proteína farmacéutica y el monómero o multímeros. Una secuencia enlazadora peptídica puede ser empleada para separar, por ejemplo, los componentes polipéptidos por una suficiente distancia para asegurar que cada polipéptido se pliegue en sus estructuras secundarias y terciarias. Las proteínas de fusión pueden ser preparadas en general, usando técnicas estándares, que incluyen conjugación química. Las proteínas de fusión pueden también ser expresadas como proteínas recombinantes en un sistema de expresión por técnicas estándares . Los dominios multímeros o monómeros de la invención, pueden ser producidos de conformidad con cualquiera de los métodos conocidos en la técnica. En algunas modalidades, E. coli que comprenden un plásmido pET activado que codifica los polipéptidos, son inducidos para expresar la proteína. Después de cosechar la bacteria, puede ser lisada y clarificada por centrifugación. Los polipéptidos pueden ser purificados usando elución de agarosa Ni-NTA y replegados por diálisis. Las proteínas desplegadas pueden ser neutralizadas tapando los sulfhidrilos libres con ácido yodoacético. La elución de sefarosa Q, a través de flujo de butil sefarosa, elución de sefarosa SP, elución de sefarosa DEAE, y/o elución de sefarosa CM, puede ser usada para purificar los polipéptidos. También se pueden emplear etapas de purificación de intercambio de anión y/o catión equivalente. En algunas modalidades, el polipéptido que comprende un monómero o multímero de la invención, está ligado al mismo (C-término a N-término) , por ejemplo, para estabilidad de proteína.

IV. ENLAZADORES Los dominios enlazadores se pueden unir por un enlazador para formar un multímero. Por ejemplo, un enlazador puede ser posicionado entre cada dominio de monómero discreto separado en un multímero. Se puede realizar la unión de los dominios de monómeros seleccionados vía un enlazador, usando una variedad de técnicas conocidas en el arte. Por ejemplo, el montaje combinatorial de polinucleótidos que codifica los dominios de monómeros seleccionados, se puede lograr por digestión de restricción y re-ligación, por reacciones traslapadas de auto-cebación, basadas en PCR u otros métodos recombinantes. El enlazador puede ser unido a un monómero antes de que el monómero sea identificado por su capacidad para enlazarse a un multímero objetivo o después que el monómero se ha seleccionado para determinar la capacidad para enlazarse a un multímero objetivo. El enlazador puede ser uno sintético, que se origina naturalmente, o una combinación de ambos. Por ejemplo, el enlazador sintético puede ser un enlazador aleatorizado, por ejemplo, tanto en secuencia como en tamaño. En un aspecto, el enlazador aleatorizado puede comprender una secuencia completamente aleatorizada, u opcionalmente, el enlazador aleatorizado se puede basar en secuencias enlazadoras naturales. El enlazador puede comprender, por ejemplo, una porción no polipéptido, un polinucleótido, un polipéptido o similares. Un enlazador puede ser rígido, o flexible, o una combinación de ambos. La flexibilidad del enlazador puede ser una función de la composición de tanto el enlazador como los dominios de monómeros que interactúan con el enlazador. El enlazador une dos dominios de monómeros seleccionados, y mantiene los dominios de monómeros como dominios de monómero discretos separados. El enlazador puede permitir a los dominios de monómeros discretos separados, cooperar aún manteniendo las propiedades separadas tales como sitios de enlace separados múltiples para el mismo ligando en un multímero, o por ejemplo, sitios de enlace separados múltiples para diferentes ligandos en un multímero. La elección de un enlazador adecuado para un caso específico en donde dos o más dominios de monómeros (es decir, cadenas de polipéptidos) , están conectadas, puede depender de una variedad de parámetros que incluyen, por ejemplo, la naturaleza de los dominios de monómeros, la estructura y naturaleza del objetivo al cual el multímero de polipéptido debe enlazarse y/o la estabilidad del enlazador peptídico hacia la proteólis y oxidación. La presente invención proporciona métodos para optimizar la elección del enlazador, una vez que se han identificado los dominios/variantes de monómero deseadas. En general, las bibliotecas de multímeros que tienen una composición que se fija con respecto a la composición de dominio de monómero, pero son variables en composición enlazadora y longitud, pueden ser fácilmente aparentes y seleccionadas como se describe anteriormente. Una descripción más detallada de enlazadores se puede encontrar en por ejemplo, la Publicación de Patente Estadounidense No. 2005/0048512.

V. IDENTIFICACIÓN DE MONÓMEROS O MULTÍMEROS CON AFINIDAD PARA UNA MOLÉCULA OBJETIVO Aquellos expertos en la técnica, pueden fácilmente identificar dominios de monómeros con una propiedad deseada (por ejemplo, afinidad de enlace) . Para aquellas modalidades, se puede usar cualquier método que resulta en la selección de dominios con una propiedad deseada (por ejemplo, propiedad de enlace específico) . Por ejemplo, los métodos pueden comprender proporcionar una pluralidad de diferentes ácidos nucleicos, cada ácido nucleico que codifica un dominio de monómero; traducir la pluralidad de diferentes ácidos nucleicos, con ello, proporcionando una pluralidad de diferentes dominios de monómeros; seleccionar la pluralidad de diferentes dominios de monómeros para enlazarse al ligando deseado o a una mezcla de ligandos; e, identificar elementos de la pluralidad de diferentes dominios de monómeros que se enlazan al ligando deseado o mezcla de ligandos. Además, cualquier método de mutagénesis, tal como mutagénesis dirigida al sitio y mutagénesis aleatoria (por ejemplo, mutagénesis química), se puede usar para producir dominios de monómeros, por ejemplo, para una biblioteca de dominio de monómero. En algunas modalidades, la PCR con tendencia al error es empleada para crear variantes. Los métodos adicionales incluyen alinear una pluralidad de dominios de monómeros que se originan naturalmente; y, diseñar el dominio de monómero que no se origina naturalmente, manteniendo los aminoácidos conservados e insertando, suprimiendo o alterando aminoácidos alrededor de los aminoácidos conservados para generar el dominio de monómero que no se origine naturalmente. En una modalidad, los aminoácidos conservados comprenden cisteínas. En otra modalidad, la etapa de insertar usa aminoácidos aleatorios u, opcionalmente, la etapa de inserción usa porciones de los dominios de monómeros que se originan naturalmente. Las porciones podrían idealmente, codificar bucles de dominios a partir de la misma familia. Los aminoácidos son insertados o intercambiados usando oligonucleótidos sintéticos, o por intercambio, o por enzimas de restricción a base de recombinación. Los dominios quiméricos humanos de la presente invención, son empleados para aplicaciones terapéuticas en donde se desea la inmunogenicidad mínima. La presente invención proporciona métodos para generar bibliotecas de dominios quiméricos humanos. Las bibliotecas de monómeros quiméricos humanos, pueden ser construidas combinando las secuencias de bucle de diferentes variantes de un dominio de monómero humano, como se describe anteriormente. Las secuencias de bucle que son combinadas, pueden ser bucles definidos por secuencias, bucles definidos por estructura, bucles definidos por el factor B, o una combinación de cualquiera de dos o más de los mismos. Alternativamente, se puede generar una biblioteca de dominio quimérico humano, modificando dominios de monómeros humanos que se originan naturalmente al nivel de aminoácido, comparado con el nivel superior. En algunas modalidades, para minimizar el potencial para inmunogenicidad, solamente aquellos residuos que se originan naturalmente en secuencias de proteínas a partir de la misma familia de dominios de monómeros humanos, son utilizados para crear las secuencias quiméricas. Esto se puede lograr proporcionando una alineación de secuencia de al menos dos dominios de monómeros humanos a partir de la misma familia de dominios de monómeros, identificando residuos de aminoácido en las posiciones correspondientes en las secuencias de dominio de monómero humano, que difieren entre los dominios de monómeros humanos, generando dos o más dominios de monómeros quiméricos humanos, en donde cada secuencia de dominio de monómero quimérico humano, consiste de residuos de aminoácido que corresponden en tipo y posición, a residuos a partir de dos dominios de monómeros humanos de la misma familia de dominios de monómeros humanos. Las bibliotecas de dominios de monómeros quiméricos humanos, se pueden emplear para identificar dominios de monómeros quiméricos humanos que se enlazan a un objetivo de interés: seleccionando la biblioteca de dominios de monómeros quiméricos humanos para enlazarse a una molécula objetivo, e identificar un dominio quimérico humano que se enlaza a la molécula objetivo. Las secuencias de dominio de monómero humano que se originan naturalmente, adecuados, empleadas en la etapa de alineación de secuencia inicial, incluyen aquellas que corresponden a cualquiera de los dominios de monómeros que se originan naturalmente, descritos en este documento. Los dominios de bibliotecas de variantes de monómeros humanos de la presente invención (sean generados variando bucles o residuos de aminoácido únicos) , pueden ser preparados por métodos conocidos por aquellos que tienen habilidad ordinaria en la técnica. Los métodos particularmente adecuados para generar estas bibliotecas, son formados de combinación dividida y formatos de síntesis de trinucleótidos como se describe en el documento WO 01/23401. En algunas modalidades, los dominios de monómeros de la invención, se seleccionan para inmunogenicidad potencial por: proporcionar una secuencia de proteína candidata; comparar la secuencia de proteína candidata a una base de datos de secuencias de proteína humana; identificar porciones de la secuencia de proteína candidata que corresponden a porciones de secuencias de proteínas humanas de la base de datos; y determinar la extensión de la correspondencia entre la secuencia de proteína candidata y las secuencias de proteína humana a partir de la base de datos. En general, la mayor extensión de la correspondencia entre la secuencia de proteína candidata y una o más de las secuencias de proteína humana a partir de la base de datos, el más bajo potencial para inmunogenicidad se predice comparado con una proteína candidata que tiene poca correspondencia con algunas de las secuencias de proteína humana a partir de la base de datos. Una base de datos de las secuencias de proteína humana que son adecuadas para uso en la práctica del método de la invención para seleccionar proteínas candidatas, se puede encontrar en ncbi.nlm.nih.gov/blas/Blast.cgi en la Amplia Red Mundial (además, se puede usar el siguiente sitio de la red para investigar igualaciones casi exactas, cortas: cbi.nlm.nih.gov/blas/Blast.cgi?CMD=Web&LAYOUT=TwoWindows&AUTO _FORMAT=Semiaut?&ALIGNMENTS=50&ALIGNMENT_VIEW=Pairwise&CLIENT =web&DATABASE=nr&DESCRIPTIONS=100&ENTREZ_QUERY= (none) &EXPECT= 1OOO&FORMAT_OBJECT=A1ignment&FORMAT_TYPE=HTML&NCBI_GI=on&PAGE =Nucleotides&PROGRAM=blastn&SERVICE=plain&SET_DEFAULTS.x=29&S ET_DEFAULTS . y=6&SHOW_OVERVIEW=on&WORD_SIZE=7&END_OF_HTTPGET=Y es&SHOW_LINKOUT=yes en al Amplia Red Mundial) . El método es particularmente empleado en la determinación de si una secuencia cruzada en una proteína quimérica, tal como, por ejemplo, un dominio de monómero quimérico, es probablemente causa de un evento inmunogénico. Si la secuencia cruzada corresponde a una porción de una secuencia encontrada en la base de datos de las secuencias de proteína humana, se cree que la secuencia cruzada es menos probable que ocasiona un evento inmunogénico. La información que pertenece a porciones de secuencias de proteína humana de la base de datos, se puede usar para designar una biblioteca de proteína de proteínas quiméricas similares a la humana. Tales bibliotecas pueden ser generadas usando información pertinente a "secuencias cruzadas" que salen en proteínas humanas que se originan naturalmente. El término "secuencia cruzada", se refiere en este documento, a una secuencia que se encuentra en su totalidad en al menos, una proteína humana que se origina naturalmente, en la cual, se encuentran las porciones de la secuencia en dos o más de las proteínas que se originan naturalmente. De este modo, la recombinación de las últimas dos o más proteínas que se originan naturalmente, podría generar una proteína quimérica en la cual, la porción quimérica de la secuencia, que actualmente corresponde a una secuencia se encuentra en otra proteína que se origina naturalmente. La secuencia cruzada contiene una unión quimérica de dos posiciones de residuos de aminoácidos consecutivos en los cuales, la primera posición de aminoácido está ocupada por un residuo de aminoácido idéntico en tipo y posición encontrado en una primera y segunda secuencia de proteína humana que se origina naturalmente, pero no en una tercera secuencia de proteína que se origina naturalmente. La segunda posición de amino ácido está ocupada por un residuo de aminoácido idéntico en tipo y posición encontrada en una segunda secuencia de proteína humana que se origina naturalmente, pero no la primera secuencia de proteína humana que se origina naturalmente. En otras palabras, la "segunda" secuencia de proteína humana que se origina naturalmente, corresponde a la proteína humana que se origina naturalmente, en la cual, la secuencia cruzada aparece en su totalidad, como se describe anteriormente. En algunas modalidades, una biblioteca de proteínas quiméricas similares a humanas es generada: identificando secuencias de proteína humana a partir de una base de datos que corresponde a proteínas a partir de la misma familia de proteínas; alinear las secuencias de proteína humana a partir de la misma familia de proteínas a una secuencia de proteína de referencia; identificar una serie de subsecuencias derivadas de diferentes secuencias de proteínas humanas de la misma familia, en donde cada subsecuencia porta una región para identificar con al menos, otra subsecuencia derivada de una secuencia diferente de proteína humana que se origina naturalmente; identificar una unión quimérica de una primera, segunda y tercera subsecuencia, en donde cada subsecuencia se deriva de una diferente secuencia de proteína humana que se origina naturalmente, y en donde la unión quimérica comprende dos posiciones de residuos de aminoácido consecutivos en los cuales, la primera posición de aminoácido está ocupada por un residuo de aminoácido común a la primera y segunda secuencia de proteína humana que se origina naturalmente, pero no a la tercera secuencia proteína humana que se origina naturalmente, y la segunda posición de aminoácido está ocupada por un residuo de aminoácido común a la segunda y tercera secuencia de proteína humana que se origina naturalmente, y generar moléculas de proteína quimérica similares a humanas, cada una que corresponde en secuencia a dos o más subsecuencias de la serie de subsecuencias, y cada una comprende una o más de las dos uniones quiméricas identificadas. De este modo, por ejemplo, si la primea secuencia de proteína humana que se origina naturalmente es A-B-C, y la segunda es B-C-D-E, y la tercera es D-E-F, entonces, la unión quimérica es C-D. Alternativamente, si la primera secuencia de proteína humana que se origina naturalmente es D-E-F-G, y la segunda es B-C-D-E-F, y la tercera es A-B-C-D, entonces, la unión quimérica es D-E. Las moléculas de proteína quimérica similar a la humana, pueden ser generadas en una variedad de formas. Por ejemplo, los oligonucleótidos que comprenden secuencias que codifican las uniones quiméricas, pueden ser recombinadas con oligonucleótidos que corresponden en secuencia a dos o más subsecuencias a partir de la serie descrita anteriormente de subsecuencias, para generar una proteína quimérica similar a la humana, y bibliotecas de la misma. Las secuencias de referencia usadas para alinear las proteínas humanas que se originan naturalmente, son una secuencia a partir de la misma familia de proteínas humanas que se originan naturalmente, o una quimera u otra variante de proteínas en la familia. Los ácidos nucleicos que codifican fragmentos de dominios de monómeros que se originan naturalmente, pueden también ser mezclados y/o recombinados (por ejemplo, usando fragmentos químicamente o enzimáticamente producidos) , para generar dominios de monómeros modificados, de longitud completa. Los fragmentos y el dominio de monómero, pueden también ser recombinados manipulando dominios que codifican ácidos nucleicos o fragmentos de los mismos. Por ejemplo, se pueden usar ligaciones a un constructo de ácido nucleico que codifica fragmentos del dominio de monómero, para generar un dominio de monómero alterado. Los dominios de monómeros alterados pueden también ser generados, proporcionando una colección de oligonucleótidos sintéticos (por ejemplo, traslapando oligonucleótidos) , que codifican secuencias conservadas, aleatorias, pseudoaleatorias o definidas, de una secuencia peptídica, que son entonces insertadas por ligación en un sitio predeterminado en un polinucleótido que codifica un dominio de monómero. De manera similar, la diversidad de secuencia de uno o más dominios de monómeros, puede ser expandida mutando el (los) dominio (s) de monómeros con mutagénesis dirigida al sitio, mutación aleatoria, mutación pseudoaleatoria, mutación quernal definida, mutación a base de colon y similares. Las moléculas de ácido nucleico resultantes, pueden ser propagadas en un hospedero para clonación y amplificación. En algunas modalidades, los ácidos nucleicos son intercambiados. La presente invención también proporciona un método para recombinar una pluralidad de ácidos nucleicos que codifican dominios de monómeros y seleccionar la biblioteca resultante para dominios de monómeros que se enlazan al ligando deseado o mezcla de ligandos o similares. Los ácidos nucleicos de dominio de monómero seleccionados, pueden también ser cruzados posteriormente, intercambiando con las secuencias de polinucleótido que codifican las secuencias neutrales (es decir, que tienen efecto funcional insustancial en enlace) , tal como por ejemplo, por reticulación posterior con una secuencia que se origina naturalmente o tipo nativa, sustancialmente idéntica a una secuencia seleccionada para producir dominios de monómeros funcionales similares a nativos. En general, durante la reticulación posterior, se aplica selección subsecuente para retener la propiedad, por ejemplo, enlace al ligando. En algunas modalidades, la biblioteca de monómero se prepara por intercambio. En tal caso, los dominios de monómeros son aislados y cambiados para recombinar combinatoriamente, las secuencias de ácido nucleico que codifican los dominios de monómeros (la recombinación puede ocurrir entre o dentro de los dominios de monómeros, o ambos) . La primera etapa involucra identificar un dominio de monómero que tiene la propiedad deseada, por ejemplo, afinidad para un cierto ligando. Mientras se mantienen los aminoácidos conservados durante la recombinación, las secuencias de ácido nucleico que codifican los dominios de monómeros pueden ser recombinadas, o recombinadas y unidas en multímeros. Una ventaja significante de la presente invención es que ligandos conocidos, o ligandos desconocidos, se pueden usar para seleccionar dominios de monómeros y/o multímeros. No se requiere información previa con respecto a la estructura de ligando, para aislar los dominios de monómeros de interés de los multímeros de interés. Los dominios de monómeros y/o multímeros identificados, pueden tener actividad biológica, lo cual significa incluir al menos afinidad de enlace específica para un ligando deseado o seleccionado, y, en algunos casos, además incluirá la capacidad para bloquear el enlace de otros compuestos, para estimular o inhibir las trayectorias metabólicas, para actuar como una señal o mensajero, para estimular o inhibir la actividad celular, y similares. Los dominios de monómeros pueden ser generados para funcionar como ligandos para receptores, en donde el ligando natural para el receptor, no ha sido identificado aún (receptores orfan) . Estos ligandos orfan se pueden crear para ya sea bloquear o activar el receptor al cual se enlazan. Se puede usar un ligando único, u opcionalmente, una variedad de ligandos se puede usar para seleccionar los dominios de monómeros y/o multímeros. Un dominio de monómero de la presente invención, se puede enlazar a un ligando único o a una variedad de ligandos. Un multímero de la presente invención puede tener múltiples sitios de enlace discretos para un ligando único, u opcionalmente, puede tener sitios de enlace múltiple para una variedad de ligandos. La invención también incluye composiciones que se producen por métodos de la presente invención. Por ejemplo, la presente invención incluye dominios de monómeros seleccionados o identificados a partir de una biblioteca y/o bibliotecas que comprenden dominios de monómeros producidos por los métodos de la presente invención. La presente invención también proporciona bibliotecas de dominios de monómeros y bibliotecas de ácidos nucleicos que codifican dominios de monómeros. Las bibliotecas pueden incluir, por ejemplo, aproximadamente 100, 250, 500 o más ácidos nucleicos que codifican dominios de monómeros, o la biblioteca puede incluir, por ejemplo, aproximadamente 100, 250, 500 o más polipéptidos que codifican dominios de monómeros. Las bibliotecas pueden incluir dominios de monómeros que contienen la misma estructura de cisteína, por ejemplo, dominios A o dominios similares a EGF. En algunas modalidades, las variantes son generadas recombinando dos o más secuencias diferentes a partir de la misma familia de dominios de monómeros (por ejemplo, el dominio del receptor clase A de LDL) . Alternativamente, dos o más dominios de monómeros diferentes a partir de diferentes familias, se pueden combinar para formar un multímero. En algunas modalidades, los multímeros son formados de monómeros o variantes de monómeros de al menos, una se las siguientes clases de familia: un dominio similar a EGF, un dominio Kringle, un dominio de fibronectina tipo I, un dominio de fibronectina tipo II, un dominio de fibronectina tipo III, un dominio PAN, un dominio Gla, un dominio SRCR, un dominio Inhibidor de tripsina pancreática de Bovino/Kunitz, un dominio de inhibidor de serina proteasa tipo Kazal, un dominio Trébol (tipo P) , un dominio del Factor Willebrand tipo C, un dominio similar a Anafilotoxina, un dominio CUB, una repetición de tiroglobulina tipo I, dominio de clase A del receptor LDL, un dominio Sushi, un dominio Link, un dominio Tromboespondina tipo I, un dominio similar a inmunoglobulina, un dominio de lectina tipo C, un dominio MAM, un dominio tipo A del factor Willebrand, un dominio de Somatomedina B, un dominio de núcleo de cuatro disulfuros tipo WAP, un dominio tipo F5/8 tipo C, un dominio Hemopexina, un dominio SH2, un dominio SH3, un dominio EGF tipo Laminina, un dominio C2, y derivados de los mismos. En otra modalidad, el dominio de monómero y el dominio de monómero diferente, puede incluir uno o más dominios encontrados en la base de datos Pfam y/o la base de datos SMART. Las bibliotecas producidas por los métodos anteriores, una o más célula (s) que comprenden uno o más elementos de la biblioteca, y uno o más fagos que comprenden uno o más elementos de la biblioteca, también están incluidas en la presente invención. Opcionalmente, se puede generar una serie de datos de cadenas de ácido nucleico que codifican dominios de monómeros, por ejemplo, mezclando una primera cadena que codifica un dominio de monómero, con una o más cadenas que codifican un dominio de monómero diferente, con ello, produciendo una serie de datos de cadenas de ácido nucleico que codifican dominios de monómeros, que incluyen aquellos descritos en este documento. En otra modalidad, el dominio de monómero y el dominio de monómero diferente, puede incluir uno o más dominios encontrados en la base de datos Pfam y/o la base de datos SMART. Los métodos pueden comprender además, insertar la primera cadena que codifica el dominio de monómero y una o más segundas cadenas que codifican el dominio de monómero diferente en un ordenador y generar un (as) cadena (s) de multímeros o biblioteca (s) de las mismas en el ordenador. Las bibliotecas pueden ser seleccionadas por una propiedad deseada tal como enlace de un ligando deseado o mezcla de ligandos. Por ejemplo, elementos de la biblioteca de dominios de monómeros, pueden ser exhibidos y preseleccionados para enlazarse a un ligando conocido o desconocido o una mezcla de ligandos. Las secuencias de dominio de monómero pueden entonces ser mutagenizadas (por ejemplo, recombinadas, químicamente alteradas, etc.), o de otro modo, alteradas y los nuevos dominios de monómeros pueden ser seleccionados nuevamente para enlazarse al ligando o a la mezcla de ligandos con una afinidad mejorada. Los dominios de monómeros seleccionados, pueden ser combinados o unidos para formar multímeros, los cuales pueden entonces ser seleccionados para una afinidad mejorada o avidez o especificidad alterada para el ligando o la mezcla de ligandos. La especificidad alterada puede significar que la especificad es ampliada, por ejemplo, enlazando los virus múltiples relacionados, u opcionalmente, la especificidad alterada puede significar que la especificidad es estrechada, por ejemplo, enlazándose con una región específica de un ligando. Aquellos de habilidad en la técnica, reconocerán que existe un número de métodos disponibles para calcular la avidez. Véase, por ejemplo, Mammen et al . , Angew Chem Int . Ed. 37:2754-2794 (1998); Muller et al . , Anal . Biochem. 261:149-158 (1998) .

VI. SELECCIÓN DE DOMINIOS DE MONÓMEROS QUE SE ENLAZAN A C-MET Se pueden conducir selecciones preliminares, seleccionando agentes capaces de enlazarse a c-MET, como al menos uno de los agentes así identificados son probablemente, modulares de c-MET (por ejemplo, antagonistas o agonistas) . Los ensayos de enlace usualmente involucran contacto de una proteína c-MET (o un fragmento de la misma, tal como un fragmento que comprende la rodamina SEMA o la cadena ) , con uno o más de los agentes de prueba (es decir, monómeros o multímeros de la invención) y permitir suficiente tiempo para que la proteína y agentes de prueba formen un complejo de enlace. Cualquiera de los complejos de enlace formados se puede detectar usando cualquiera de un número de técnicas analíticas establecidas. Los ensayos de enlace de proteína incluyen, pero no se limitan a, ensayos de enlace inmunohistoquímico, citometría de flujo u otros ensayos. La proteína c-MET utilizada en tales ensayos, puede ser naturalmente expresada, clonada o sintetizada. Los métodos similares se pueden usar para identificar dominios de monómeros o multímeros que se enlazan a IgG. Los métodos de selección de la invención, se pueden realizar como ensayos in vi tro o a base de células. Los ensayos a base de célula, se pueden realizar en cualquiera de las células en las cuales se expresa el c-MET. Los ensayos a base de célula, pueden involucrar células completas o fracciones de células que contienen un receptor c-MET para seleccionar enlace de agente o modulación de actividad de c-MET por el agente. Los tipos de células ejemplares que pueden ser usados de conformidad con los métodos de la invención incluyen, por ejemplo, cualquiera de las células de mamífero, así como también células fúngicas, que incluyen levaduras, y células bacterianas. Las células pueden ser células primarias o células tumorales u otros tipos de líneas de células inmortales. Por su puesto, la c-MET puede ser expresada en líneas que no contienen c-MET endógenamente. Los ensayos de actividad c-MET, pueden también ser usados para identificar un modulador (antagonista o agonista) de c-MET. En estas modalidades, uno o más agentes de prueba son contactados a una célula que expresa c-MET, y después probados para determinar la actividad de c-MET. Las actividades c-MET ejemplares incluyen, actividad de cinasa constitutiva o independiente de HGF. Véase por ejemplo, Christensen et al . , Cáncer Res. 63:7345-7355 (2003). En otras modalidades, los eventos moleculares en dirección 3' , pueden ser monitoreados para determinar la actividad de señalización. Por ejemplo, c-MET induce crecimiento celular (proliferación y supervivencia) , motilidad celular, invasión y cambios de morfología. Además, la c-MET indirectamente, media la fosforilación de Gab-1, Akt, transductor de señal y activador de la transcripción 3, fosfolipasa C ?, y cinasa de adhesiones focales, entre otras. Véase por ejemplo, Christensen et al . , Cáncer Res . 63:7345-7355 (2003).

En algunas modalidades, los ensayos de actividad también se usaron para confirmar que los monómeros o multímeros antagonistas identificados (es decir, que compiten con HGF) , carecen de actividad agonista (es decir, que no activan a c-MET en la ausencia de HGF u otro agonista) . Los agentes que son inicialmente identificados por cualquiera de los métodos de selección mencionados anteriormente, pueden ser además, probados para validar la actividad aparente. Tales estudios pueden ser conducidos con modelos animales adecuados. El formato básico de tales métodos, involucra administrar un compuesto de plata identificado durante una selección inicial a un animal que sirve como un modelo para humanos y después, determinar si el c-MET es en efecto, modulado y/o la enfermedad o condición es aliviada. Los modelos animales utilizados en los estudios de validación en general, son mamíferos de cualquier clase. Ejemplos específicos de animales adecuados incluyen, pero no se limitan a, primates, ratones y ratas. La selección de dominios de monómeros que se enlazan a c-MET, a partir de una biblioteca de dominios, puede ser realizada por una variedad de procedimientos. Por ejemplo, un método para identificar dominios de monómeros, los cuales tienen una propiedad deseada (por ejemplo, que se enlazan a c-MET o IgG) , involucra traducir una pluralidad de ácidos nucleicos, en donde cada ácido nucleico codifica un dominio de monómero, seleccionar los polipéptidos codificados por la pluralidad de ácidos nucleicos, e identificar aquellos dominios de monómeros que, por ejemplo, se enlazan a un ligando deseado o mezcla de ligandos, con ello, produciendo un dominio de monómero seleccionado. Los dominios de monómeros seleccionados expresados por cada uno de los ácidos nucleicos, pueden ser probados por su capacidad para enlazarse al ligando por métodos conocidos en la técnica (es decir, análisis de selección por inmovilización, cromatografía de afinidad, FACS) . Como se mencionó anteriormente, la selección de dominios de monómeros se puede basar en el enlace a un ligando, tal como c-MET, o un fragmento del mismo u otra molécula objetivo (por ejemplo, lípido, carbohidrato, ácido nucleico y similares) . Otras moléculas pueden opcionalmente, ser incluidas en los métodos, junto con los iones objetivo, por ejemplo, tales como Ca2+. Cuando un dominio de monómero de la invención se selecciona basado en su capacidad para enlazarse a un ligando, las bases de selección pueden incluir selección basada en una relación de disociación lenta, la cual es usualmente predictiva de alta afinidad. La valencia del ligando puede también ser variada para controlar la afinidad de enlace promedio de dominios de monómeros seleccionados. El ligando se puede unir a una superficie o un sustrato a densidades variantes, tales como incluyendo un compuesto competidor, por dilución o por otro método conocido por aquellos expertos en la técnica. La alta densidad (valencia) del ligando predeterminado, se puede usar para enriquecer dominios de monómeros que tienen afinidad relativamente baja, mientras una baja densidad (valencia), puede enriquecerse preferencialmente para dominios de monómeros de afinidad superior. Se puede usar una variedad de reportes de vectores o sistemas de exhibición, para expresar ácidos nucleicos que codifican los dominios de monómeros y/o multímeros de la presente invención, y probar para determinar una actividad deseada. Por ejemplo, un sistema de exhibición de fago, es un sistema en el cual los dominios de monómeros son expresados como proteínas de fusión en la superficie del fago (Pharmacia, Milwaukee Wis) . La exhibición del fago puede involucrar la presentación de una secuencia de polipéptido que codifica dominios de monómeros en la superficie de un bacteriófago filamentoso, típicamente, como una fusión con una proteína de revestimiento de bacteriófago. En general en estos métodos, cada artículo de fago o célula, sirve como un elemento de biblioteca individual que exhibe especies únicas de polipéptido exhibido, además del fago natural o secuencia de proteína celular. Los ácidos nucleicos son clonados en el ADN de fago en un sitio el cual resulta en la transcripción de una proteína de fusión, una porción la cual es codificada por la pluralidad de los ácidos nucleicos. El fago que contiene una molécula de ácido nucleico, se somete a replicación y transcripción en la célula. La secuencia líder de la proteína de fusión, dirige el transporte de la proteína de fusión a la punta de la partícula del fago. De este modo, la proteína de fusión que es parcialmente codificada por el ácido nucleico, es exhibida en la partícula del fago para detección y selección por los métodos descritos anteriormente y posteriormente. Por ejemplo, la biblioteca de fago puede ser incubada con un ligando predeterminado tal como c-MET o un fragmento de la mismo, de manera que las partículas del fago las cuales presentan una secuencia de proteína de fusión que se enlaza al ligando, pueden ser diferencialmente divididas de aquellas que no presentan secuencias de polipéptido que se enlazan al ligando predeterminado. Por ejemplo, la separación puede ser proporcionada inmovilizando el ligando predeterminado. Las partículas del fago (es decir, elementos de biblioteca) , los cuales se unen al ligando inmovilizado, son entonces recuperadas y replicadas para amplificar la subpoblación de fago seleccionada para una ronda subsecuente de enriquecimiento de afinidad y replicación de fago. Después de varias rondas de enriquecimiento de afinidad y replicación de fago, los elementos de la biblioteca del fago que son de este modo seleccionados, son aislados y la secuencia de nucleótido que codifica la secuencia de polipéptido exhibida, se determina, con ello, identificando la(s) secuencia (s) de polipéptido (s) que se enlazan al ligando predeterminado. Tales métodos son además descritos en las Publicaciones de patentes PCT Nos. 91/17271, 91/18980, y 91/19818 y 93/08278. Ejemplos de otros sistemas de exhibición incluyen exhibición de ribosoma, una exhibición ligada al nucleótido (véase por ejemplo, Patentes Estadounidenses Nos. 6,281,344; 6,194,550, 6,207,446, 6,214,553, y 6,258,558), exhibición de polisoma, exhibiciones de la superficie celular y similares. La exhibición de superficie celular incluye una variedad de células, por ejemplo, E. coli, células de levadura y/o mamífero. Cuando se usa una célula como una exhibición, los ácidos nucleicos, por ejemplo, obtenidos por amplificación por PCR, seguidos por digestión, son introducidos en la célula y traducidos. Opcionalmente, los polipéptidos que codifican los dominios de monómeros o los multímeros de la presente invención, pueden ser introducidos, por ejemplo, por inyección en la célula. Las bibliotecas de monómeros y multímeros de la invención, se pueden seleccionar por una propiedad deseada, tal como enlace de un ligando deseado (por ejemplo, c-MET) , o mezcla de ligandos. Por ejemplo, elementos de la biblioteca de los dominios de monómeros, pueden ser exhibidos y preseleccionados para enlazarse a un ligando conocido o desconocido o mezcla de ligandos. Las secuencias de dominio de monómeros, pueden ser entonces mutagenizadas (por ejemplo, recombinadas, químicamente alteradas, etc.), o de otro modo, alteradas y se pueden seleccionar nuevos dominios de monómeros nuevamente para enlazarse al ligando o la mezcla de ligandos con una afinidad mejorada. Los dominios de monómeros seleccionados, pueden ser combinados o unidos para formar multímeros, los cuales pueden entonces, ser seleccionados para una afinidad o avidez mejorada o especificidad alterada para el ligando o la mezcla de ligandos. La especificidad alterada puede significar que la especificidad es ampliada, por ejemplo, por enlace de ligandos múltiples relacionados, u opcionalmente, la especificidad alterada puede significar que la especificidad es estrechada, por ejemplo, por enlace con una región específica de un ligando. Aquellos de habilidad en la técnica, reconocerán que existe un número de métodos disponibles para calcular la avidez. Véase por ejemplo, Mammen et al , Angew Chem Int . Ed. 37:2754-2794 (1998); Muller et al . , Anal . Bi ochem . 261:149-158 (1998). Aquellos de habilidad en la técnica, reconocerán que se pueden repetir las etapas para generar variación y selección por una propiedad deseada (es decir, realizar recursivamente) , para optimizar resultados. Por ejemplo, en una biblioteca de exhibición de fago u otro formato similar, se puede realizar una primera selección de una biblioteca a rigurosidad relativamente inferior, con ello, es posible seleccionarla como muchas partículas asociadas con una molécula objetivo. Las partículas seleccionadas pueden entonces ser aisladas y los polinucleótidos que codifican el monómero o multímero, pueden ser aislados de las partículas. Las variantes adicionales pueden también ser generadas a partir de estas secuencias y subsecuentemente, seleccionadas en afinidad superior. Todas las composiciones de la presente invención, por ejemplo, los dominios de monómeros así como también multímeros y bibliotecas de los mismos, pueden ser opcionalmente unidos a una matriz de un material de afinidad. Ejemplos de material de afinidad incluyen perlillas, una columna, un soporte sólido, un microarreglo, otras combinaciones de soportes reactivos, y similares. Cuando se desean multímeros capaz de enlazarse a objetivos relativamente grandes, pueden ser generados por un método de selección "andador". Este método se lleva a cabo proporcionando una biblioteca de dominios de monómeros y seleccionando la biblioteca de dominios de monómeros para determinar la afinidad a una primera molécula objetivo. Una vez que se identifica al menos un monómero que se enlaza al objetivo, tal monómero es covalentemente ligado a una nueva biblioteca o a cada elemento restante de la biblioteca original de dominios de monómeros. Esta nueva biblioteca de multímeros (dímeros) , es entonces seleccionada para multímeros que se enlazan al objetivo con una afinidad incrementada, y se puede identificar un multímero que se enlaza al objetivo con una afinidad incrementada. El método de selección de monómero "andador", proporciona una forma para ensamblar un multímero que está compuesto de monómeros que pueden actuar aditivamente o aún, sinergísticamente entre sí, dando las restricciones de longitud enlazadora. Esta técnica de andador es muy útil cuando se seleccionan para y de montajes de multímeros que son capaces de enlazarse a proteínas objetivo, grandes con alta afinidad. El método andador puede ser repetido para agregar más monómeros con ello, resultando en un multímero que comprende 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, ó más monómeros ligados en conjunto. En algunas modalidades, el multímero seleccionado comprende más de dos dominios. Tales multímeros pueden ser generados en una forma de etapas, por ejemplo, en donde la adición de cada nuevo dominio es probada individualmente y el efecto de los dominios es probado en una forma secuencial. Véase por ejemplo, Figura 5. En una modalidad alterna, los dominios son ligados para formar multímeros que comprenden más de dos dominios y se seleccionan para enlace sin conocimiento previo de como multímeros más pequeños, o alternativamente, como cada dominio se enlazan.

Los métodos de la presente invención también incluyen métodos para involucrar monómeros o multímeros. La recombinación intra-dominio puede ser introducida en monómeros a través del monómero completo o tomando porciones de diferentes monómeros para formar nuevas unidades recombinadas . Se puede lograr la recombinación interdominio (por ejemplo, recombinación de diferentes monómeros o entre multímeros), o recombinación de módulos (por ejemplo, monómeros múltiples con un multímero) . La recombinación inter-biblioteca está también contemplada. Los métodos para involucrar monómeros o multímeros, pueden comprender, por ejemplo, cualquiera o todas las siguientes etapas: proporcionar una pluralidad de diferentes ácidos nucleicos, en donde cada ácido nucleico codifica un dominio de monómero; traducir la pluralidad de diferentes ácidos nucleicos, los cuales proporcionan una pluralidad de diferentes dominios de monómeros; seleccionar la pluralidad de diferentes dominios de monómeros para enlazarse a los ligandos deseados (por ejemplo, c-MET) , o mezcla de ligandos; identificar elementos de la pluralidad de dominios de monómeros diferentes que se enlazan al ligando deseado o mezcla de ligandos, los cuales proporcionan dominios de monómeros seleccionados; unir los dominios de monómeros seleccionados con al menos un enlazador, para generar al menos un multímero, en donde al menos un multímero comprende al menos dos de los dominios de monómeros seleccionados y al menos, un enlazador; y, seleccionar al menos un multímero para una afinidad o avidez mejorada o especificidad alterada para el ligando deseado o mezcla de ligandos, comparada con los dominios de monómeros seleccionados. Se puede introducir variación en ya sea monómeros o multímeros. Un ejemplo de mejoramiento de monómeros incluye, recombinación intra-dominio en la cual, dos o más porciones del monómero (por ejemplo, tres, cuatro, cinco o más) , son amplificadas separadamente bajo condiciones para introducir variación (por ejemplo, por intercambio u otro método de recombinación) en los productos de amplificación resultantes, con ello, sintetizando una biblioteca de variantes para diferentes porciones del monómero. Localizando los extremos 5' de los cebadores medios en una secuencia "traslapante" o "media", que ambos fragmentos de PCR tienen en común, las bibliotecas de lado "izquierdo" y lado "derecho" resultantes, pueden ser combinadas por PCR traslapado para generar nuevas variantes de la combinación original de monómeros. Estas nuevas variantes pueden entonces ser seleccionadas para determinar las propiedades deseadas, por ejemplo, seleccionadas por inmovilización contra un objetivo o seleccionadas por un efecto funcional. Los cebadores "medios", pueden ser seleccionados para corresponder a cualquier segmento del monómero, y típicamente se basarán en el andamiaje o uno o más aminoácidos consensos dentro del monómero (por ejemplo, cisteínas tales como aquellas encontradas en dominios A) . De manera similar, los multímeros pueden ser creados introduciendo la variación al nivel de monómero y después, recombinando las bibliotecas de variantes de monómeros. A gran escala, los multímeros (únicos o combinaciones) con propiedades deseadas, puede ser recombinados para formar multímeros más grandes. En algunos casos, se introduce variación (típicamente de manera sintética) , en los monómeros o en los enlazadores para formar bibliotecas. Esto se puede lograr, por ejemplo, con dos diferentes multímeros que se enlazan a dos diferentes objetivos, con ello, seleccionando eventualmente un multímero con una porción que se enlaza a un objetivo y una porción que se enlaza a un segundo objetivo. Se puede introducir variación adicional insertando enlazadores de diferente longitud y composición entre dominios. Esto permite la selección de enlazadores óptimos entre dominios. En algunas modalidades, la longitud óptima y composición de enlazadores, permitirá enlace óptimo de dominios. En algunas modalidades, los dominios con una afinidad (es) de enlace particulares, son ligados vía diferentes enlazadores y se seleccionan enlazadores óptimos en un ensayo de enlace. Por ejemplo, se seleccionan dominios para determinar propiedades de enlace deseadas y después, se forman en una biblioteca que comprende una variedad de enlazadores. La biblioteca puede entonces ser seleccionada para identificar enlazadores óptimos. Alternativamente, se pueden formar bibliotecas de multímeros, en donde no se conoce el efecto de dominio o enlazador en el enlace de molécula objetivo. Los métodos de la presente invención también incluyen generar uno o más multímeros seleccionados, proporcionando una pluralidad de dominios de monómeros. La pluralidad de dominios de monómeros se selecciona para enlazar un ligando deseado o mezcla de ligandos. Se identifican elementos de la pluralidad de dominios que se enlazan al ligando deseado o mezcla de ligandos, con ello, proporcionando dominios con una afinidad deseada. Los dominios identificados se unen con al menos un enlazador para generar el multímero, en donde cada multímero comprende al menos dos de los dominios seleccionados y al menos un enlazador; y, se seleccionan los multímeros para una afinidad o avidez mejorada o especificidad alterada para el ligando deseado o mezcla de ligandos comparada con los dominios seleccionados, con ello, identificando uno o más multímeros seleccionados . Se pueden generar bibliotecas de multímeros, en algunas modalidades, combinando dos o más bibliotecas o monómeros o multímeros en un procedimiento a base de recombinasa, en donde cada elemento de biblioteca comprende como sitio de recombinación (por ejemplo, un sitio lox) . Una combinación más grande de elementos de biblioteca molecularmente diversos, en principio, alberga más variantes con propiedades deseadas, tales como afinidades de enlace objetivo superior y actividades funcionales. Cuando se construyen bibliotecas en vectores fagos, los cuales pueden ser transformados en tamaños de bibliotecas E. coli (109 -1010) , se limitan por la eficiencia de transformación de E. coli . Un sistema de sitio de recombinasa/recombinante (por ejemplo, el sistema Cre-loxP) y recombinación in vivo, se pueden explotar para generar bibliotecas que no son limitadas en tamaño por la eficiencia de transformación de E. coli . Por ejemplo, el sistema Cre-loxP, puede ser usado para generar bibliotecas de dímeros con 1010, 1011, 1012, 1013 o diversidad mayor. En algunas modalidades, se usa E. coli como un hospedero para una biblioteca de monómero naive y un fago filamentoso que porta una segunda biblioteca de monómero naive. El tamaño de biblioteca en este caso, está limitado solamente por el número de fagos infectivos (que portan una biblioteca) y el número de células E. coli que se pueden infectar (que llevan la otra biblioteca) . Por ejemplo, infectar células E. coli 1010 (ÍL a OD600=1) con fagos >1012, podría producir tanto como 1012 combinaciones de dímeros.

Se puede realizar selección de multímeros usando una variedad de técnicas que incluyen aquellas mencionadas anteriormente para identificar dominios de monómeros. Otros métodos de selección incluyen, por ejemplo, una selección basada en una especificidad de afinidad o avidez mejorada o alterada para el ligando, comparada con los dominios de monómeros seleccionados. Por ejemplo, una selección se puede basar en enlace selectivo a tipos celulares específicos, o a una serie de células relacionadas o tipos de proteínas (por ejemplo, diferentes serotipos de virus) . La optimización de la propiedad seleccionada para, por ejemplo, avidez de un ligando, se puede lograr entonces recombinando los dominios, así como también, manipulando secuencias de aminoácido de dominios de monómeros individuales o los dominios enlazadores o la secuencia de nucleótido que codifica tales dominios, como se mencionó en la presente invención. Se puede realizar un método para identificar multímeros exhibiendo los multímeros. Como con los dominios de monómeros, los multímeros son opcionalmente expresados o exhibidos en una variedad de sistemas de exhibición, por ejemplo, exhibición de fago, exhibición de ribosoma, exhibición de polisoma, exhibición ligada a nucleótido (véase por ejemplo, Patentes Estadounidenses Nos. 6,281,344; 6,194,550, 6,207,446, 6,214,553, y 6,258,558) y/o exhibición de la superficie celular, como se describe anteriormente. Las exhibiciones de la superficie celular pueden incluir, pero no se limitan a, células de E. coli, levadura o mamífero. Además, se pueden seleccionar por inmovilización, bibliotecas de exhibición de multímeros con sitios de enlace múltiple, para determinar especificidad de avidez o afinidad o alterada para un ligando o para múltiples ligandos. Se pueden seleccionar monómeros o multímeros para actividad de enlace objetivo en células de levadura, usando un ensayo de selección de dos híbridos. En este tipo de selección, la biblioteca de monómero o multímero a ser seleccionada, es clonada en un vector que dirige la formación de una proteína de fusión entre cada monómero o multímero de la biblioteca y un fragmento activador transcripcional de levadura (es decir, Gal4) . Las secuencias que codifican la proteína "objetivo", son clonadas en un vector que resulta en la producción de una proteína de fusión entre el objetivo y el resto de la proteína Gal4 (el dominio de enlace de ADN) . Un tercer plásmido contiene un gen reportero en dirección 3' de la secuencia de ADN del sitio de enlace Gal4. Un monómero que puede enlazarse a la proteína objetivo se lleva con el dominio de activación Gal4, de este modo reconstituyendo una proteína Gal4 funcional. Esta proteína Gal4 funcional unida al sitio enlazante en la dirección 5' del gen reportero, resulta en la expresión del gen reportero y selección del monómero o multímero como una proteína de enlace objetivo. (véase Chien et. al. (1991) Proc. Nati . Acad. Sci (USA) 88:9578; Fields S. and Song 0. (1989) Nature 340: 245). El uso de un sistema de dos híbridos para seleccionar bibliotecas, se describe además en las Patentes Estadounidenses Nos. 5,811,238 (véase también Silver S.C. and Hunt S.W. (1993) Mol . Biol . Rep. 17:155; Durfee et al. (1993) Genes Devel . 7:555; Yang et al. (1992) Science 257:680; Luban et al. (1993) Cell 73:1067; Hardy et al. (1992) Genes Devel . 6:801; Bartel et al. (1993) Biotechniques 14:920; y Vojtek et al. (1993) Cell 74:205). Otro sistema de selección útil para llevar a cabo la presente invención es el sistema de selección interactivo E. coli/BCCP (Germino et al. (1993) Proc . Nat . Acad. Sci . (U.S.A.) 90:993; Guarente L. (1993) Proc. Nat . Acad. Sci . (U.S.A.) 90:1639). Otras variaciones incluyen el uso de compuestos de enlace múltiples, de manera tal que los dominios de monómeros, multímeros o bibliotecas de estas moléculas, pueden ser simultáneamente seleccionados para una multiplicidad de ligandos o componentes que tienen diferente especificidad de enlace. Los ligandos o compuestos predeterminados múltiples, pueden ser concomitantemente seleccionados en una biblioteca única, o seleccionados secuencialmente contra un número de dominios de monómeros o multímeros. En una variación, los ligandos o compuestos múltiples, cada uno codificado en una perlilla separada (o subserie de perlillas), se puede mezclar e incubar con dominios de monómeros, multímeros o bibliotecas de estas moléculas bajo condiciones de enlace adecuadas. La colección de perlillas, que comprenden ligandos o compuestos múltiples, puede entonces ser usada para aislar, por selección de afinidad, dominios de monómeros seleccionados, multímeros seleccionados o elementos de bibliotecas. En general, las rondas de selección de afinidad subsecuente pueden incluir la misma mezcla de perlillas, subseries de tomas, o perlillas que contienen solamente uno o dos ligandos o compuestos individuales. Este procedimiento proporciona selección eficiente, y es compatible con el procesamiento en lotes, automatización de laboratorio y métodos de selección de alto rendimiento. En otra modalidad, los multímeros pueden ser simultáneamente seleccionados para determinar la habilidad para enlazarse a múltiples ligandos, en donde cada ligando comprende una etiqueta diferente. Por ejemplo, cada ligando puede ser etiquetado con una etiqueta fluorescente diferente, contactada simultáneamente con un multímero o biblioteca de multímero. Los multímeros con la afinidad deseada son entonces definidos (por ejemplo, por distribución FACS), basada en la presencia de las etiquetas ligadas a las etiquetas deseadas. Se pueden seleccionar bibliotecas de ya sea dominios de monómeros o multímeros (referidos en la siguiente discusión por conveniencia como "agentes de afinidad") (es decir, selección por inmovilización) , simultáneamente contra ligandos múltiples en un número de diferentes formatos. Por ejemplo, se pueden seleccionar ligandos múltiples en una mezcla simple, en un arreglo, exhibido en una célula o tejido (por ejemplo, una célula o tejido proporciona numerosas moléculas que se pueden unir por los dominios de monómero o multímeros de la invención), y/o inmovilizados. Las bibliotecas de agentes de afinidad pueden opcionalmente, ser exhibidas en sistemas de exhibición de fago o levadura. De manera similar, si se desea, los ligandos (por ejemplo, codificados en una biblioteca de ADNc) , pueden ser exhibidos en un sistema de exhibición de fago o levadura. Inicialmente, la biblioteca del agente de afinidad es seleccionada por inmovilización contra los ligandos múltiples. Opcionalmente, los "lanzamientos" resultantes son seleccionados por inmovilización contra los ligandos una o más veces para enriquecer la población resultante de agentes de afinidad. Si se desea, se puede determinar la identidad de los agentes de afinidad individual y/o ligandos. En algunas modalidades, los agentes de afinidad son exhibidos en el fago. Los agentes de afinidad identificados como enlazantes en la selección inicial, son divididos en una primera y segunda porción. La primera porción es infectada en la bacteria, resultando en ya sea placas o colonias bacterianas, dependiendo del tipo de fago usado. Los fagos expresados son inmovilizados y después probados con ligandos exhibidos en el fago seleccionado como se describe posteriormente. La segunda porción se acopla a perlillas o de otro modo, se inmoviliza y se contacta una biblioteca de exhibición de fago que contiene al menos, algunos de los ligandos en la mezcla original, con la segunda porción inmovilizada. Los fagos que se enlazan a la segunda porción son subsecuentemente eluidos y contactados con el fago inmovilizado descrito en el párrafo anterior. Se detectan las interacciones de fago-fago (por ejemplo, usando un anticuerpo monoclonal específico para el fago que expresa el ligando) y se pueden aislar polinucleótidos de fagos resultantes. En algunas modalidades, se determina la identidad de un par de agente de afinidad-ligando. Por ejemplo, cuando tanto el agente de afinidad como el ligando son exhibidos en un fago o levadura, el ADN del par se puede aislar y secuenciar. En algunas modalidades, se amplifican los polinucleótidos específicos para el ligando y agente de afinidad. Los cebadores de amplificación para cada reacción pueden incluir secuencias al 5' que son complementarias, de manera tal que se fusionan los productos de amplificación resultante, con ello, formando un polinucleótido híbrido que comprende un polinucleótido que codifica al menos, una porción del agente de afinidad y al menos, una porción del ligando. El híbrido resultante puede ser usado para probar bibliotecas de polinucleótidos de afinidad de agente o ligando (por ejemplo, codificado por ADNc) , para identificar tanto agente de afinidad como ligando. Los métodos descritos anteriormente, pueden ser fácilmente combinados con "andadores" para generar simultáneamente e identificar, multímeros múltiples, cada uno de los cuales se enlaza a un ligando en una mezcla de ligandos. En estas modalidades, una primera biblioteca de agentes de afinidad (dominios de monómeros o multímeros), son seleccionadas por inmovilización, contra ligandos múltiples y los agentes de afinidad eluidos son ligados a la primera o una segunda biblioteca de agentes de afinidad para formar una biblioteca de agentes de afinidad multiméricos (por ejemplo, que comprende 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o más monómeros), los cuales son subsecuentemente seleccionados por inmovilización contra los ligandos múltiples. Este método puede ser repetido para continuar generando agentes de afinidad multiméricos más grandes. Incrementar el número de dominios de monómeros, puede resultar en afinidad y avidez incrementada por un objetivo particular. Por ejemplo, los inventores han encontrado que trímeros de dominios de monómeros que se enlazan a CD28, tienen una afinidad superior que los dímeros, los cuales en cambio, tienen una afinidad superior que los dominios de monómeros que se enlazan a CD28 solos. Por su puesto, en cada etapa, la selección por inmovilización es opcionalmente repetida para enriquecer enlazadores significantes. En algunos casos, el andador se facilitará insertando sitios de recombinación (por ejemplo, sitios lox), en los extremos de monómeros y bibliotecas de monómeros recombinantes por un evento mediado por recombinasa. Los multímeros seleccionados de los métodos anteriores, pueden además, ser manipulados por ejemplo, por recombinación o intercambio de los multímeros seleccionados (la recombinación puede ocurrir entre o con multímeros o ambos), imitando los multímeros seleccionados y similares.

Esto resulta en multímeros alterados, los cuales pueden ser seleccionados y seleccionados para elementos que tienen una propiedad mejorada, comparados con el multímero seleccionad, con ello, produciendo multímeros alterados seleccionados. En vista de la descripción de este documento, puede ser claro que se pueden seguir los siguientes procesos. Los dominios de monómeros que se originan naturalmente o que no se originan naturalmente, pueden ser recombinados o se pueden formar variantes. Opcionalmente, los dominios inicialmente o después, se seleccionan para aquellas secuencias que son menos probablemente inmunogénicas en el hospedero para el cual son propuestos. Opcionalmente, una biblioteca de fago que comprende los dominios recombinados, es seleccionada por inmovilización por una afinidad deseada. Se pueden seleccionar dominios de monómeros o multímeros expresados por el fago por IC50 para un objetivo. Se pueden seleccionar multímero hetero u homo-méricos . Los polipéptidos seleccionados pueden ser seleccionados por su afinidad a cualquier objetivo, que incluye, por ejemplo, objetivos hetero u homo-multiméricos . Los enlazadores, multímeros o multímeros seleccionados producidos por los métodos indicados anteriormente y posteriormente, son características de la presente invención. Se proporcionan bibliotecas que contienen multímeros, por ejemplo, bibliotecas que contienen aproximadamente 100, 250, 500 o más elementos producidos por los métodos de la presente invención o seleccionados por los métodos de la presente invención. En algunas modalidades, uno o más elementos que comprenden células de las bibliotecas, están también incluidos. Las bibliotecas de los polipéptidos recombinantes, también son una característica de la presente invención, por ejemplo, una biblioteca que comprende aproximadamente 100, 250, 500 o más polipéptidos diferentes recombinantes . Las composiciones de la presente invención, se pueden unir a una matriz de un material de afinidad, por ejemplo, los polipéptidos recombinantes. Ejemplos de materiales de afinidad incluyen, por ejemplo, perlillas, una columna, un soporte sólido y/o similares.

VII. MÉTODOS DE TRATAMIENTO TERAPÉUTICOS Y PROFILÁCTICOS La presente invención también incluye métodos para tratar terapéuticamente o profilácticamente, una enfermedad o trastorno administrando in vivo o ex vivo, uno o más ácidos nucleicos o polipéptidos de la invención descrita anteriormente (o composiciones que comprenden un excipiente farmacéuticamente aceptable y uno o más de tales ácidos nucleicos o polipéptidos) a un sujeto, que incluye por ejemplo, un mamífero, que incluye un humano, primate, ratón, cerdo, vaca, cabra, conejo, rata, cobayo, hámster, caballo, oveja; o un vertebrado no mamífero, tal como un pájaro (por ejemplo, un pollito o pato), pescado o invertebrado. Los antagonistas c-MET, que incluyen dominios de monómeros que se enlazan a c-MET o multímeros de la invención, son empleados en el tratamiento de cánceres humanos que expresan c-MET. Un compendio de cánceres humanos conocidos por expresar c-MET y/o su HGF de ligando, se puede encontrar en la Tabla 1, p. 929 de Birchmeier, C, Birchmeier, W., Gherardi, E. & Vande Woude, G. F. Met, metástasis, motility and more. Nat Rev Mol Cell Biol 4, 915-25 (2003) . Los antagonistas de c-MET, son de valor terapéutico en todos estos cánceres. Más particularmente, los antagonistas de c-MET son empleados en cubrir una necesidad médica significante no cubierta en cáncer pancreático, mesotelioma, mieloma, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de pulmón (NSCLC) , cáncer de ovario, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de colon, glioblastoma y osteosarcoma. Otros cánceres ejemplares incluyen, cáncer de vejiga, mama, cervical, colorectal, osofageal, gástrico, renal, hepático, pulmonar, nasofaríngeo, vesícula biliar, próstata o de toroides, osteosarcoma, sarcoma sinovial, rabdomiosarcoma, MFH/fibrosarcoma, sarcoma Kaposi, mieloma múltiple, linfomas, leucemia de células T de adulto, glioblastomas, astrocitomas, melanoma, y tumor de Wilm. Los individuos pueden ser tratados por ejemplo, una vez semanalmente por inyecciones intravenosas de una formulación insoluble de un antagonista c-MET compuesto de dominios de monómeros o multímeros que se enlazan a c-MET de la invención, opcionalmente en combinación con una o más entidades terapéuticas adicionales, por ejemplo, ya sea biológicas o quimioterapéuticas. En un aspecto de la invención, en los métodos ex vivo, una o más células o una población de células de interés del sujeto (por ejemplo, células de tumor, muestra de tejido tumoral, células de órgano, células sanguíneas, células de la piel, pulmón, corazón, músculo, cerebro, mucosas, hígado, intestino, bazos, estómago, sistema linfático, cerviz, vagina, próstata, boca, lengua, etc.), se obtienen o remueven del sujeto y contactan con una cantidad de un dominio de monómero seleccionado y/o multímero de la invención, que es efectivo en el tratamiento profilácticamente o terapéuticamente la enfermedad, trastorno u otra condición. Las células contactadas son entonces regresadas o suministradas al sujeto en el sitio a partir del cual fueron obtenidas o en otro sitio de interés (por ejemplo, incluyendo aquellas definidas anteriormente) , en el sujeto a ser tratado. Si se desea, las células contactadas pueden ser injertadas en un tejido, órgano o sitio del sistema de interés (que incluye todos los descritos anteriormente) en el sujeto usando técnicas de injerto bien conocidas y estándares o, por ejemplo, suministrando a la sangre o sistema linfático, usando suministro estándar o técnicas de transfusión. La invención también proporciona métodos in vivo en los cuales, una o más células o una población de células de interés del sujeto, son contactadas directamente o indirectamente, con una cantidad de un dominio de monómero seleccionado y/o multímero de la invención, efectivo para tratar profilácticamente o terapéuticamente la enfermedad, trastorno u otra condición. En los formatos de contacto/administración directos, el dominio de monómero seleccionado y/o multímero, es típicamente administrado o transferido directamente a las células a ser tratadas o al sitio del tejido de interés (por ejemplo, células tumorales, muestra de tejido tumoral, células de órganos, células sanguíneas, células de la piel, pulmón, corazón, músculo, cerebro, mucosa, hígado, intestino, bazo, estómago, sistema linfático, cerviz, vagina, próstata, boca, lengua, etc.), por cualquiera de una variedad de formatos, que incluye administración tópica, inyección (por ejemplo, usando una aguja o jeringa), o suministro de disparo de gen o vacuna, empujándolo en un sitio de tejido, órgano o piel. Se puede suministrar el dominio de monómero seleccionado y/o multímero, por ejemplo, intramuscularmente, intradérmicamente, subdermalmente, subcutáneamente, oralmente, intraperitonealmente, intratecalmente, intravenosamente, o colocado dentro de una cavidad del cuerpo (que incluye, por ejemplo, durante cirugía), o por inhalación o administración vaginal o rectal. En formatos de contacto/administración directa in vivo, el dominio de monómero y/o multímero seleccionado, es típicamente administrado o transferido indirectamente a las células para ser tratados o al sitio de tejido de interés, que incluye aquellos descritos anteriormente (tales como, por ejemplo, células de la piel, sistemas de órganos, sistema linfático o sistema de células de la sangre, etc.), poniendo en contacto o administrando el polipéptido de la invención, directamente a una o más células o población de células a partir de las cuales se puede facilitar el tratamiento. Por ejemplo, las células tumorales dentro del cuerpo del sujeto, pueden ser tratadas poniendo en contacto las células del sistema linfático o sanguíneo, piel, o un órgano, con una cantidad suficiente del dominio de monómero seleccionado y/o multímero, de manera que ocurre el suministro del dominio de monómero y/o multímero seleccionado al sitio de interés (por ejemplo, tejido, órgano, o células de interés o sistema linfático o sanguíneo dentro del cuerpo) y resulta un tratamiento terapéutico o profiláctico efectivo. Tal contacto, administración, o transferencia, es típicamente elaborado usando una o más de las rutas o modos de administración descritos anteriormente. En otro aspecto, la invención proporciona métodos ex vivo en los cuales, una o más células de interés o una población de células de interés del sujeto (por ejemplo, células tumorales, muestra de tejido tumoral, células de órganos, células de la sangre, células de la piel, pulmón, corazón, músculo, cerebro, mucosas, hígado, intestino, bazo, estómago, sistema linfático, cerviz, vagina, próstata, boca, lengua, etc.), se obtienen o remueven del sujeto y se transforman contactando una o más células o población de células con un constructo de polinucleótido que comprende una secuencia de ácido nucleico de la invención, que codifica un polipéptido biológicamente activo de interés (por ejemplo, un dominio de monómero y/o multímero seleccionado) , que es efectivo para tratar profilácticamente o terapéuticamente la enfermedad, trastorno u otra condición. Una o más células o población de células, son contactadas con una cantidad suficiente del constructo de polinucleótido y un promotor que controla la expresión de dicha secuencia de ácido nucleico de manera tal que ocurre la absorción del constructo de polinucleótido (y promotor) en la(s) célula (s) y resulta en suficiente expresión de la secuencia de ácido nucleico objetivo de la invención, para producir una cantidad del polipéptido biológicamente activo, que codifica un dominio de monómero y/o multímero seleccionado, efectivo para tratar profilácticamente o terapéuticamente la enfermedad, trastorno o condición. El constructo de polinucleótido puede incluir una secuencia promotora (por ejemplo, secuencias promotoras CMV) , que controla la expresión de la secuencia de ácido nucleico de la invención y/o, si se desea, una o más secuencias de nucleótidos adicionales que codifican al menos, uno o más de otros polipéptidos de la invención, una citocina, adyuvante, o molécula co-estimulatoria, u otros polipéptidos de interés. Después de la transfección, las células transformadas son regresadas, suministradas, o transferidas al sujeto en el sitio o sistema de tejido a partir del cual se obtuvieron o en otro sitio (por ejemplo, células tumorales, muestra de tejido tumoral, células de órganos, células sanguíneas, células de la piel, pulmón, corazón, músculo, cerebro, mucosa, hígado, intestino, bazo, estómago, sistema linfático, cerviz, vagina, próstata, boca, lengua, etc.), para ser tratados en el sujeto. Si se desea, las células pueden ser injertadas en un sistema de tejido, piel, órgano o cuerpo, de interés en el sujeto usando técnicas de injerto estándares y bien conocidas o suministradas en el sistema sanguíneo o linfático usando técnicas de suministro o transfusión estándares. Tal suministro, administración o transferencia de células transformadas, es típicamente elaborado usando una o más de las rutas o modos de administración descritos anteriormente. La expresión del ácido nucleico objetivo ocurre naturalmente o puede ser inducida (como se describe en mayor detalle abajo) , y una cantidad del polipéptido codificado es expresada suficiente y efectiva para tratar la enfermedad o condición en el sitio o sistema de tejido. En otro aspecto, la invención proporciona métodos in vivo en los cuales una o más células de interés o una población de células del sujeto (por ejemplo, que incluyen aquellas células y sistemas de células y sujetos descritos anteriormente), son transformadas en el cuerpo del sujeto contactando la(s) célula (s) o población de célula (s) con (o administrando o transfiriendo a la(s) célula (s) o población de células usando una o más de las rutas o modos de administración descritos anteriormente) , un constructo de polinucleótido que comprende una secuencia de ácido nucleico de la invención que codifica un polipéptido biológicamente activo de interés (por ejemplo, un dominio de monómero y/o multímero seleccionado) , que es efectivo para tratar profilácticamente o terapéuticamente la enfermedad, trastorno u otra condición. El constructo de polinucleótido puede ser administrado directamente o transferido a la(s) célula (s) que sufren de la enfermedad o trastorno (por ejemplo, por contacto directo usando una o más de las rutas o modos de administración descritos anteriormente) . Alternativamente, el constructo de polinucleótido puede ser indirectamente administrado o transferido a la(s) célula (s) que sufren de la enfermedad o trastorno contactando primero directamente la(s) célula (s) no enfermas u otras células enfermas usando una o más de las rutas o modos de administración descritos anteriormente, con una cantidad suficiente del constructo de polinucleótido que comprende la secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido biológicamente activo, y un promotor que controla la expresión de la secuencia de ácido nucleico, de manera tal que ocurre la absorción del constructo de polinucleótido (y promotor) en la(s) célula (s) y resulta suficiente expresión de la secuencia de ácido nucleico de la invención, para producir una cantidad del polipéptido biológicamente activo efectivo para tratar profilácticamente o terapéuticamente la enfermedad o trastorno, y con ello, el constructo de polinucleótido o el polipéptido expresado resultante, es transferido naturalmente o automáticamente desde el sitio, sistema, tejido u órgano de suministro inicial, del cuerpo del sujeto al sitio, tejido, órgano o sistema enfermo del cuerpo del sujeto (por ejemplo, vía la sangre o sistema linfático) . La expresión del ácido nucleico objetivo ocurre naturalmente, o puede ser inducida (como se describe en mayor detalle abajo) , de manera tal que una cantidad del polipéptido expresado es suficiente y efectiva para tratar la enfermedad o condición en el sitio o sistema de tejido. El constructo de polinucleótido puede incluir una secuencia promotora (por ejemplo, secuencia promotora CMV) , que controla la expresión de la secuencia de ácido nucleico y/o, si se desea, una o más secuencias de nucleótidos adicionales que codifican al menos, uno o más de otros polipéptidos de la invención, una citocina, adyuvante o molécula co-estimulatoria, u otro polipéptido de interés. En cada uno de los métodos de tratamiento in vivo y ex vivo, como se describe anteriormente, una composición que comprende un excipiente y el polipéptido o ácido nucleico de la invención puede ser administrado o suministrado. En un aspecto, una composición que comprende un excipiente farmacéuticamente aceptable y un polipéptido o ácido nucleico de la invención es administrado o suministrado al sujeto como se describe anteriormente en una cantidad efectiva para tratar la enfermedad o trastorno. En otro aspecto, en cada método de tratamiento in vi vo o ex vivo descrito anteriormente, la cantidad de polinucleótido administrado a la(s) célula (s) o sujeto, puede ser una cantidad de manera tal que ocurre la absorción de dicho polinucleótido en una o más células del sujeto, para producir una cantidad de un polipéptido biológicamente activo efectivo para mejorar una respuesta inmune en el sujeto, incluyendo una respuesta inmune inducida por un inmunógeno (por ejemplo, antígeno) . En otro aspecto, para tal método, la cantidad de polipéptido administrado a la(s) célula (s) o sujeto, puede ser una cantidad suficiente para mejorar una respuesta inmune en el sujeto, que incluye aquella inducida por un inmunógeno (por ejemplo, antígeno) . En aún otro aspecto, un método de tratamiento in vivo o in vivo en el cual un constructo de polinucleótido (o composición que comprende un constructo de polinucleótido) , se usa para suministrar un polipéptido biológicamente activo a un sujeto, la expresión del constructo de polinucleótido puede ser inducida usando un sistema de expresión de encendido y apagado de gen inducible. Ejemplos de tales sistemas de expresión de encendido y apagado del gen incluyen, el Sistema de Expresión de Gen Tet-On™ y Sistema de Expresión de Gen Tet-Off™ (véase por ejemplo, Clontech Catálogo 2000, pg, 110-111, para una descripción detallada de cada uno de tales sistemas), respectivamente. Otros sistemas de expresión de encendido y apagado de gen inducibles o controlables, son conocidos por aquellos de habilidad ordinaria en la técnica. Con tal sistema, la expresión del ácido nucleico objetivo del constructo de polinucleótido se puede regular en una manera precisa, reversible y cuantitativa. Se puede inducir la expresión del gen del ácido nucleico objetivo, por ejemplo, después que las células transfectadas estables que contienen el constructo de polinucleótido que comprende el ácido nucleico objetivo, son suministradas o transferidas en o para hacer contacto en el sitio de tejido, órgano o sistema de interés. Tales sistemas son de beneficio particular en los métodos de tratamiento y formatos en los cuales, es ventajoso suministrar o controlar precisamente, la expresión del ácido nucleico objetivo (por ejemplo, para permitir el tiempo para terminación de la cirugía y/o cicatrización después de la cirugía; para permitir el tiempo para que el constructo de polinucleótido que comprende el ácido nucleico objetivo, alcance el sitio, células, sistema o tejido a ser tratado; para permitir el tiempo para que las células que contienen injerto transformadas en el constructo, lleguen a incorporarse en el tejido u órgano sobre o dentro del cual han sido empalmados o unidos, etc. ) .

VIIJ. USOS DE MULTÍMEROS ADICIONALES Las aplicaciones potenciales de multímeros de la presente invención, son diversas e incluyen cualquier uso en donde se desea un agente de afinidad. En algunos casos, se selecciona un par de monómeros o multímeros para enlazarse al mismo objetivo (es decir, para uso en ensayos a base de intercalaciones) . Para seleccionar un monómero igualado o par de multímero, dos diferentes monómeros o multímeros típicamente son capaces de enlazarse a la proteína objetivo simultáneamente. Un procedimiento para identificar tales pares involucra lo siguiente: (1) inmovilizar la mezcla de fago o proteína que fue previamente seleccionada para enlazarse a la proteína objetivo. (2) contactar la proteína objetivo al fago o proteína inmovilizada y lavar; (3) contactar la mezcla de fago o proteína al objetivo unido y lavar; y (4) eluir el fago o proteína unida sin eluir el fago o proteína inmovilizada. Un uso de los dominios de multímeros o monómeros de la invención, es usar anticuerpos de reemplazo u otros agentes de afinidad en la detección u otros ensayos a base de afinidad. De este modo, en algunas modalidades, los dominios de monómeros o multímeros se seleccionan contra la capacidad para enlazar componentes distintos de un objetivo en una mezcla. El procedimiento general puede incluir realizar la selección de afinidad bajo condiciones que estrechamente parecen las condiciones del ensayo, que incluyen mimetizar la composición de una muestra durante el ensayo. De este modo, una etapa de selección podría incluir contactar un dominio de monómero o multímero en una mezcla que no incluye el ligando objetivo, y seleccionar contra cualquiera de los dominios o multímeros que se enlazan a la mezcla. De este modo, las mezclas (ausentes del ligando objetivo, las cuales podrían ser vaciadas usando un anticuerpo, dominio de monómero o multímero), pueden ser usadas como un agente de bloqueo. Tal sustracción es empleada por ejemplo, para crear proteínas farmacéuticas que se enlazan a su objetivo, pero no a otras proteínas o tejidos sin proteínas. Por ejemplo, la invención puede ser usada en la aplicación para crear antagonistas, en donde los dominios de monómeros seleccionados o multímeros, bloquean la interacción entre dos proteínas, por ejemplo, las cadenas OÍ y ß de Met y/o entre Met y HGF. Opcionalmente, la invención puede generar agonistas. Por ejemplo, los multímeros que se enlazan a dos diferentes proteínas, por ejemplo, enzima y sustrato, pueden mejorar la función de la proteína, que incluye por ejemplo, actividad enzimática y/o conversión subsecuente. En algunas modalidades, los dominios de monómeros son usados para la inhibición de ligando, separación de ligando o estimulación de ligando. Los ligandos posibles en estos métodos incluyen, por ejemplo, HGF. Si la inhibición del enlace de ligando a un receptor se desea, se selecciona un domino de monómero que se enlaza al ligando (por ejemplo, HGF), a una porción del ligando que contacta el receptor del ligando, o que se enlaza al receptor en una porción del receptor que se enlaza para contactar el ligando, con ello, previniendo la interacción de ligando-receptor. Los dominios de monómeros pueden ser ligados opcionalmente a un extendedor de vida media si se desea. La separación de ligando se refiere a modular la vida media de un ligando soluble en el fluido corporal. Por ejemplo, la mayoría de los dominios de monómeros, ausentes de un extendedor de vida media, tienen una vida media corta. De este modo, el enlace de un dominio de monómero al ligando, reducirá la vida media del ligando, con ello, reduciendo la concentración del ligando por separación del ligando a través del riñon, tan pronto como el complejo no sea más grande que el tamaño máximo capaz de pasar a través del riñon (menos de aproximadamente 50 a 40 kD) . La porción del ligando (por ejemplo, HGF), unida por el dominio del monómero, en general no es materia, aunque puede ser benéfica para enlazar el ligando a la porción del ligando que se enlaza a su receptor (por ejemplo, Met), con ello, inhibiendo además, el efecto del ligando. Este método es empleado para reducir la concentración de cualquier molécula en la corriente sanguínea. Alternativamente, un multímero que comprende un primer dominio que se enlaza a un extendedor de vida media y un segundo dominio de monómero que se enlaza a una porción del ligando que no se enlaza al receptor del ligando, puede ser usada para incrementar la vida media del ligando. En otra modalidad, un multímero que comprende un primer dominio de monómero que se enlaza al ligando y un segundo dominio de monómero que se enlaza al receptor, puede ser usado para incrementar la afinidad efectiva del ligando al receptor. En otra modalidad, los multímeros que comprenden al menos dos monómeros que se enlazan a receptores, son usados para llevar dos receptores en proximidad por ambos enlaces de multímeros, con ello, activando los receptores. Ejemplos adicionales de usos potenciales de la invención incluyen dominios de monómeros, y multímeros de los mismos, que son capaces de enlazar fármacos (por ejemplo, enlazando ribonucleótidos para enlace farmacéutico, objetivo para extensión de vida media de fármacos, enlace de sustancia controlada para el tratamiento de sobredosis y terapia de adición) , modulación de la función inmune (por ejemplo, bloqueando la inmunogenicidad enlazando tales receptores como CTLA-4, mejorando la inmunogenicidad enlazando tales receptores a CD80, o activación complemento por enlace tipo Fc) , y suministro especializado (por ejemplo, liberación lenta por el desdoblamiento enlazador, dominios de electrotransporte, dominios de dimerización, o enlace específico a: dominios de entrada de células, reporteros de separación tales como FcR, receptores de suministro oral tales como plgR para transporte trans-mucosa, y receptores de transferencia hematoencefálica tales como transferrinaR) . En modalidades adicionales, los monómeros o multímeros pueden ser enlazados a una etiqueta detectable (por ejemplo, Cy3, Cy5, etc.), o enlazados a un producto de gen reportero (por ejemplo, CAT, luciferasa, peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, GFP, etc.). Los monómeros o multímeros de la invención que se enlazan a Met, pueden también ser usados en aplicaciones de diagnóstico en las cuales son empleados para detectar Met. Por ejemplo, la detección de Met puede ser usada para predecir el pronóstico de cáncer de mama, en donde la sustancia superior de Met que en el tejido normal, indica una escasa prognosis. Véase por ejemplo, Patente Estadounidense No. 6,673,559.

IX. DOMINIOS DE MONÓMEROS DE MANIPULACIÓN ADICIONALES Y/O ÁCIDOS NUCLEICOS Y POLIPÉPTIDOS DE MULTÍMEROS Como se mencionó anteriormente, el polipéptido de la presente invención puede ser alterado. Las descripciones de una variedad de procedimientos que generan diversidad para generar secuencias de ácido nucleico alterado o modificado, que codifican estos polipéptidos, se describen en este documento y en las referencias citadas en este documento. Otro aspecto de la presente invención incluye la clonación y expresión de dominios de monómeros, dominios de monómeros seleccionados, multímeros y/o multímeros seleccionados que codifican ácidos nucleicos. De este modo, los dominios de multímeros pueden ser sintetizados como una proteína única usando sistemas de expresión bien conocidos en la técnica. Los textos generales los cuales describen técnicas biológicas moleculares empleadas en este documento, que incluyen el uso de vectores, promotores y muchos otros tópicos relevantes para expresar ácidos nucleicos tales como dominios de monómeros, dominios de monómeros seleccionados, multímeros y/o multímeros seleccionados, incluyen Berger and Kimme1, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology volumen 152 Academic Press, Inc., San Diego, CA (Berger); Sambrook et al., Molecular Cloning - A Laboratory Manual (2nd Ed. ) , Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989 ("Sambrook") and Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., (supplemented through 1999) ("Ausubel")). Ejemplos de técnicas suficientes para personas expertas en la técnica a través de los métodos de amplificación in vi tro, empleadas en la identificación, aislamiento y clonación de dominios de monómeros y multímeros que codifican ácidos nucleicos, que incluyen la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) , la reacción en cadena de la ligasa (LCR) , amplificación de Q-replicasa y otras técnicas mediadas por la polimerasa de ARN (por ejemplo, NASBA), se encuentran en Berger, Sambrook, and Ausubel, así como también Mullís et al , (1987) Patente Estadounidense No. 4,683,202; PCR Protocols A Guide to Methods and Applications (Innis et al . eds) Academic Press Inc. San Diego, CA (1990) (Innis); Arnheim & Levinson (Octubre 1, 1990) C&EN 36-47; The Journal Of NIH Research (1991) 3, 81-94; (Kwoh et al . (1989) Proc. Nati . Acad. Sci . USA 86, 1173; Guatelli et al . (1990) Proc . Na ti . Acad. Sci . USA 87, 1874; Lomell et al . (1989) J. Clin. Chem 35, 1826; Landegren et al , (1988) Science 241, 1077-1080; Van Brunt (1990) Biotechnology 8, 291-294; Wu and Wallace, (1989) Gene 4, 560; Barringer et al . (1990) Gene 89, 117, y Sooknanan and Malek (1995) Biotechnology 13: 563-564. Los métodos mejorados de clonación de ácidos nucleicos amplificados in vi tro, se describen en Wallace et al . , Patente Estadounidense No. 5,426,039. Los métodos mejorados para amplificar ácidos nucleicos grandes por PCR, se resumen en Cheng et al . , (1994), Nature 369:684-685 y las referencias en estos, en las cuales se generan los amplicones por PCR de hasta 40 kb. Uno de habilidad apreciará que esencialmente cualquiera de los ARN puede ser convertido en un ADN de doble hebra, adecuados para digestión por restricción, expansión de PCR y secuenciamiento usando transcriptasa inversa y una polimerasa. Véase, Ausubel, Sambrook and Berger, todos, anteriormente . La presente invención también se refiere a la introducción de vectores de la invención en células hospederas, y la producción de dominios de monómeros, dominios de monómeros seleccionados, multímeros y/o multímeros seleccionados de la invención, por técnicas recombinantes. Las células hospederas son diseñadas por ingeniería genética (es decir, transducidas, transformadas o transfectadas) , con los vectores de esta invención, los cuales pueden ser, por ejemplo, un vector de clonación o un vector de expresión. El vector puede ser, por ejemplo, en la forma de un plásmido, una partícula viral un fago, etc. Las células hospederas diseñadas por ingeniería, pueden ser cultivadas en medio nutriente convencional modificado, como sea apropiado, para activar promotores, seleccionar transformantes, o amplificación del dominio de monómero, dominio de monómero seleccionado, multímero y/o gen (es) de multímeros seleccionados de interés. Las condiciones de cultivo, tales como temperatura, pH y similares, son aquellas previamente usadas con la célula hospedera seleccionada para expresión y serán aparentes para aquellos expertos en la técnica en las referencias citadas en este documento, que incluyen, por ejemplo, Freshney (1994) Cul ture of Animal Cells, a Manual of Basi c Technique, tercera edición, Wiley-Liss, New York y referencias citadas en este documento. Como se mencionó anteriormente, los polipéptidos de la invención pueden también ser producidos en células no animales tales como plantas, levaduras, hongos, bacterias y similares. Sin embargo, como se nota a través de esta, la exhibición del fago es una técnica especialmente relevante para producir tales polipéptidos. Además, de Sambrook, Berger y Ausubel, detalles con respecto a los cultivos celulares, se pueden encontrar en Payne et al . (1992) Plant Cell and Tissue Cul ture in Liquid Systems John Wiley & Sons, Inc. New York, NY; Gamborg and Phillips (eds) (1995) Plant Cell , Tissue and Organ Cul ture; Fundamental Methods Springer Lab Manual, Springer-Verlag (Berlin Heidelberg New York) and Atlas and Parks (eds) The Handbook of Microbiological Media (1993) CRC Press, Boca Ratón, FL. La presente invención también incluye alteraciones de dominios de monómeros, inmuno dominios y/o multímeros, para mejorar propiedades farmacológicas, reducir la inmunogenicidad, o facilitar el transporte del dominio de multímero y/o monómero en una célula o tejido (por ejemplo, a través de la barrera hematoencefálica, o a través de la piel) . Estos tipos de alteraciones incluyen una variedad de modificaciones (por ejemplo, la adición de grupos azúcar o glicosilación) , la adición de PEG, la adición de dominios de proteína que se enlazan a una cierta proteína (por ejemplo, HSA u otra proteína del suero) , la adición de fragmentos de proteínas o secuencias que señalan el movimiento o transporte dentro, fuera y a través de la célula. Los componentes adicionales pueden también ser agregados a un dominio de multímero y/o monómero, para manipular las propiedades del dominio de multímero y/o monómero. También se puede agregar una variedad de componentes que incluyen, por ejemplo, un dominio que se enlaza a un receptor conocido (por ejemplo, un dominio de proteína de la región Fc que se enlaza al receptor Fc) , toxina (s) o parte de una toxina, un prodominio que puede ser opcionalmente desdoblado para activar el dominio de multímero o monómero, una molécula reportera (por ejemplo, proteína fluorescente verde) , un componente que se enlaza a una molécula reportero (tal como un radionúclido para radioterapia, biotina o avidina) , o una combinación de modificaciones .

X. MODELOS ANIMALES Otro aspecto de la invención es el desarrollo de modelos animales no humanos, en los cuales, se prueba la inmunogenicidad de dominios de monómeros o multímeros. El método para producir tales modelos animales no humanos comprende: introducir en al menos algunas células de un recipiente animal no humano, vectores que comprenden genes que codifican una pluralidad de proteínas humanas a partir de la misma familia de proteínas, en donde los genes son cada uno operablemente ligados a un promotor que es funcional en al menos, algunas de las células en las cuales los vectores son introducidos, de manera tal que un animal no humano genéticamente modificado se obtiene, de manera que puede expresar la pluralidad de proteínas humanas a partir de la misma familia de proteínas. Los animales no humanos adecuados empleados en la práctica de la presente invención, incluyen, todos los animales vertebrados, excepto humanos (por ejemplo, ratón, rata, conejo, oveja y similares) . Típicamente, la pluralidad de elementos de una familia de proteínas incluye al menos, dos elementos de tal familia, y usualmente, al menos diez elementos de la familia. En algunas modalidades, la pluralidad incluye todos los elementos conocidos de la familia de proteínas. Genes ejemplares que pueden ser usados incluyen aquellos que codifican dominios de monómeros, tales como, por ejemplo, elementos de la familia del receptor clase A de LDL, la familia del dominio similar a EGF, así como también las otras familias de dominios descritas en este documento . Los modelos animales no humanos de la presente invención, pueden ser usados para seleccionar inmunogenicidad de un dominio de monómero o multímero que se deriva de la misma familia de proteínas expresadas por el modelo animal no humano. La presente invención incluye el modelo animal no humano, elaborado de conformidad con el método descrito anteriormente, así como también los animales no humanos transgénicos cuyas células de gérmenes y somáticas contienen y expresan moléculas de ADN que codifican una pluralidad de proteínas humanas, a partir de la misma familia de proteínas (tales como los dominios de monómeros descritos en este documento) , en donde las moléculas de ADN han sido introducidas en el animal no humano transgénico en una etapa embriónica, y en donde las moléculas de ADN son cada una operablemente ligadas a un promotor, en al menos, algunas de las células en las cuales las moléculas de ADN han sido introducidas . Un ejemplo de un modelo de ratón empleado para la selección de proteínas de enlace derivadas del dominio del receptor clase A de LDL, se describe como sigue. Agrupamientos de gen que codifican los monómeros de dominio del receptor de clase A de LDL de tipo humano nativo, son amplificados a partir de células humanas que usan PCR. Caso todos los 200 diferentes dominios A, pueden ser amplificados con solamente tres reacciones de amplificación de PCR separadas de aproximadamente 7kb cada una. Estos fragmentos son entonces usados para generar ratones transgénicos de conformidad con el método descrito anteriormente. Estos fragmentos son entonces usados para generar ratones transgénicos, de conformidad con el método descrito anteriormente. El ratón transgénico reconocerá los dominios humanos A como "auto", de este modo, mimetizando la "individualidad" de un humano con respecto a los dominios A. Los dominios A individuales derivados de monómeros o multímeros, son probados en estos ratones inyectando los monómeros o multímeros derivados del dominio A en el ratón, entonces analizando la respuesta inmune (o carencia de respuesta) generada. Los ratones son probados para determinar si han desarrollado una respuesta anti-humana de ratón (MAHR) . Los monómeros y multímeros que no resultan en la generación de un MAHR, son probablemente no inmunogénicos cuando se administran a humanos. Históricamente, la prueba de MAHR en ratones transgénicos, se usa para probar proteínas individuales en ratones que son transgénicos para tales proteínas únicas. Por el contrario, el método descrito anteriormente, proporciona un modelo animal no humano que reconoce una familia completa de proteínas humanas como "auto", y que pueden ser usadas para evaluar un número basto de proteínas variantes que cada una son capaces de bastamente variar actividades de enlace y usos.

XI. KITS Los kits que comprenden los componentes necesarios en los métodos (típicamente en una forma no mezclada) y componentes de kits (materiales envasados, instrucciones para usar los componentes y/o métodos, uno o más recipientes (tubos de reacción, columnas, etc.)), para mantener los componentes que son una característica de la presente invención. Los kits de la presente invención pueden contener una biblioteca de multímero, o un tipo único de monómeros o multímeros. Los kits también pueden incluir reactivos adecuados para promover el enlace de la molécula objetivo, tales como amortiguadores o reactivos que facilitan la detección, incluyendo moléculas detectablemente etiquetadas. Estándares para calibrar un enlace de ligando a un dominio de monómero o similares, pueden también ser incluidos en los kits de la invención.

La presente invención también proporciona ensayos de enlace comercialmente valiosos y kits para practicar los ensayos. En algunos de los ensayos de la invención, uno o más ligandos se emplean para detectar el enlace de un dominio de monómero, inmunodominios y/o multímeros. Tales ensayos se basan en cualquier método conocido en la técnica, por ejemplo, citometría de flujo, microscopio fluorescente, resonancia de plasmón y similares, para detectar enlace de un ligando a dominio de monómero y/o multímero. También se proporcionan kits basados en los ensayos. Los kits típicamente incluyen un recipiente, y uno o más ligandos. Los kits opcionalmente comprenden direcciones para realizar los ensayos, reactivos de detección adicionales, amortiguadores o instrucciones para el uso de cualquiera de estos componentes, o similares.

Alternativamente, los kits pueden incluir células, vectores (por ejemplo, vectores de expresión, vectores de secreción que comprenden un polipéptido de la invención) , para la expresión de un dominio de monómero y/o un multímero de la invención. En un aspecto adicional, la presente invención proporciona el uso de cualquier composición, dominio de monómero, inmuno-dominio, multímero, célula, cultivo celular, aparato, componentes de aparatos o kits en este documento, para la práctica de cualquier método o ensayo de este documento, y/o para el uso de cualquiera de los aparatos o kits para practicar cualquier ensayo o método en este documento y/o para el uso de células, cultivos celulares, composiciones u otras características de este documento, como una formulación terapéutica. También se proporciona la manufactura de todos los componentes en este documento como formulaciones terapéuticas para los tratamientos descritos aquí.

XII. SISTEMAS INTEGRADOS La presente invención proporciona computadoras, medios legibles por computadoras y sistemas integrados que comprenden cadenas, que corresponden a dominios de monómeros, dominios de monómeros seleccionados, multímeros y/o multímeros seleccionados y ácidos nucleicos que codifican tales polipéptidos. Estas secuencias pueden ser manipuladas en métodos de recombinación in silico, o por alineación de secuencia estándar o software de procesamiento de palabras. Por ejemplo, diferentes tipos de similitudes y consideraciones de varias rigurosidad es y longitudes de cadena, se pueden detectar y reconocer en los sistemas integrados en este documento. Por ejemplo, muchos métodos de determinación de homología han sido diseñados por análisis comparativo de secuencias de biopolímeros, para verificación de deletreo en procesador de palabras, y para recuperación de datos a partir de varias bases de datos. Con un entendimiento de interacciones de complemento de par de doble hélice entre 4 nucleobases en polinucleótidos naturales, también se pueden usar modelos que estimulan el templado de las cadenas de polinucleótidos homólogos complementarios, como una fundación de alineación de secuencia y otras operaciones típicamente realizadas en las cadenas correspondientes en las secuencias de este documento (por ejemplo, manipulaciones de procesamiento de palabras, construcción de figuras que comprenden subsecuencias o cadenas de subsecuencia, tablas de salida, etc.). Un ejemplo de paquete de software con GOs para calcular la similitud de secuencia es BLAST, el cual puede ser adaptado a la presente invención, ingresando cadenas que corresponden a la secuencia en este. El BLAST es descrito en Altschul et al . , (1990) J^ Mol. Biol. 215:403-410. El software para realizar los análisis BLAST es públicamente disponible a través del Centro Nacional para la Información de Biotecnología (disponible en la Amplia Red Mundial en ncbi.nlm.nih.gov). Este algoritmo involucra identificar primero pares de secuencia de alto registro (HSP) , identificando palabras cortas de longitud W en la secuencia de interrogación, la cual ya sea, iguala o satisface algún registro T de umbral de valor positivo, cuando se alinea con una palabra de la misma longitud en una base de datos de secuencia. T es referido como el umbral de registro de palabra cercana (Altschul et al . , supra). Este lanzamiento de palabra cercana inicial, actúa sembrando búsquedas de inicio para encontrar HSP más largos que los contienen. Los lanzamientos de palabras son entonces extendidos en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia, tan lejos como se pueda incrementar el registro de alineación cumulativo. Los registros cumulativos son calculados usando, para secuencias de nucleótidos, los parámetros M (registro inverso para un par de residuos apareados; siempre >0) y N (registro de falta para residuos desapareados; siempre <0) . Para secuencias de aminoácidos, se usa una matriz de registro para calcular el registro cumulativo. La extensión de los lanzamientos de palabra en cada dirección es obstaculizada cuando: el registro de alineación cumulativa calla cuantificando X de su valor máximo logrado; el registro cumulativo va de cero o por debajo, debido a la acumulación de una o más alineaciones de residuos de registros negativos; o se alcanza el final de cualquier secuencia. Los parámetros de algoritmo BLAST W, T, y X, determinan la sensibilidad y velocidad de la alineación. El programa BLASTN (para secuencias de nucleótidos) , usa como omisiones, una longitud de palabra (W) de 11, una expectación (E) de 10, un valor límite de 100, M= 5, N=-4, y una comparación de ambas hebras. Para secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP usa como omisiones, una longitud de palabra (W) de 3, una expectación (E) de 10, y la matriz de registro BLOSUM62 (véase, Henikoff & Henikoff (1989) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89:10915). Un ejemplo adicional de un algoritmo de alineación de secuencia útil es PILEUP. El PILEUP crea una alineación de secuencia múltiple de un grupo de secuencias relacionadas usando alineaciones en forma de pares, progresivas. También puede trazarse un árbol que muestra las relaciones de agrupamiento usadas para crear la alineación. El PILEUP, usa una simplificación del método de alineación progresivo de Feng & Doolittle, (1987) J. Mol. Evol. 35:351-360. El método usado es similar al método descrito por Higgins & Sharp, (1989) CABIOS 5:151-153. El programa puede alinear, por ejemplo, hasta 300 secuencias de una longitud máxima de 5,000 letras. El procedimiento de alineación múltiple comienza con la alineación en forma de pares de las dos secuencias más similares, produciendo un agrupamiento de dos secuencias alineadas. Este agrupamiento puede entonces ser alineado para la siguiente secuencia más relacionada o agrupamiento de secuencias alineadas. Dos agrupamientos de secuencias pueden ser alineados por una extensión simple del alineamiento en forma de pares de dos secuencias individuales. La alineación final se logra por una serie de alineaciones en forma de pares, progresivas. El programa también se puede usar para trazar un dendograma o representación de árbol de las relaciones de agrupamientos. El programa se corre designando secuencias específicas y sus aminoácidos o nucleótidos se coordinas para regiones de comparación de secuencia. Por ejemplo, para determinar los aminoácidos observados en una familia de dominio de monómero o para comparar las secuencias de los dominios de monómeros en una familia, la secuencia de la invención, o ácidos nucleicos codificantes, son alineadas para proporcionar información de función-estructura. En un aspecto, el sistema ordenador es usado para realizar recombinación o intercambio de secuencia "in silico", de cadenas que corresponden a los dominios de monómeros. Se expone una variedad de tales métodos en "Methods For Making Character Strings, Polynucleotides & Polypeptides Having Desired Characteristics" by Selifonov and Stemmer, filed February 5, 1999 (USSN 60/118854) and "Methods For Making Character Strings, Polynucleotides & Polypeptides Having Desired Characteristics" by Selifonov and Stemmer, presentado en Octubre 12, de 1999 (USSN 09/416,375). En breve, los operadores genéticos son usados en algoritmos genéticos para cambiar secuencias dadas, por ejemplo, mimetizando eventos genéticos tales como mutación, recombinación, muerte y similares. Los análisis multi-dimensionales para optimizar secuencias, pueden ser realizados en el sistema de computadora, por ejemplo, como se describe en la solicitud 375. También se puede instruir un sistema digital en un sintetizador de oligonucleótido para sintetizar oligonucleótidos, por ejemplo, usados para la reconstrucción o recombinación de gen, o para oligonucleótidos de fuentes comerciales (por ejemplo, imprimiendo formas de orden apropiado o enlazándose a una forma ordenada en la Internet) . El sistema digital puede también incluir elementos de salida para controlar síntesis de ácido nucleico (por ejemplo, basadas en una secuencia o una alineación de un recombinante, por ejemplo, recombinado, dominio de monómero, como en este documento) , es decir, un sistema integrado de la invención opcionalmente incluye un sintetizador de oligonucleótido o un controlador de síntesis de oligonucleótido. El sistema puede incluir otras operaciones que corren en la dirección 3' de una alineación u otra operación realizada usando una cadena correspondiente a una secuencia en esta, por ejemplo, como se notó con referencia al análisis.

EJEMPLOS Se ofrecen los siguientes ejemplos para ilustrar, pero no limitar la invención reivindicada.

Ejemplo 1 Este ejemplo describe la selección de dominios de monómeros y la creación de multímeros.

Los materiales de partida para identificar dominios de monómeros y crear multímeros de los dominios de monómeros seleccionados y procedimientos, se pueden derivar de cualquiera de una variedad de secuencias humanas y/o no humanas. Por ejemplo, para producir un dominio de monómero seleccionado con enlace específico para un ligando deseado o mezcla de ligandos, se seleccionan uno o más gen (es) de dominios de monómeros, a partir de una familia de dominios de monómeros que se enlazan a un cierto ligando. Las secuencias de ácido nucleico que codifican uno o más genes de dominio de monómero, se pueden obtener por amplificación por PCR de ADN genómico o ADNc, u opcionalmente, pueden ser producidas sintéticamente usando oligonucleótidos traslapantes. Más comúnmente, estas secuencias son entonces clonadas en un formato de exhibición de superficie celular (es decir, exhibición de la superficie de células bacterianas, de levadura o mamífero (COS) ; exhibición de fago), para expresión y selección. Las secuencias recombinantes son transfectadas (transducidas o transformadas) en la célula hospedera apropiada, en donde son expresadas y exhibidas en la superficie celular. Por ejemplo, las células pueden ser teñidas con un ligando deseado etiquetado (por ejemplo, etiquetado fluorescentemente) . Las células teñidas son distribuidas por citometría de flujo, y los dominios de monómeros seleccionados que codifican genes son recuperados (por ejemplo, por aislamiento de plásmido, PCR o expansión y clonación), de las células positivas. El proceso de teñido y distribución, puede ser repetido múltiples veces (por ejemplo, usando concentraciones reducidas progresivamente del ligando deseado hasta que se obtiene un nivel deseado de enriquecimiento) . Alternativamente, se puede usar cualquier selección o método de detección conocido en la técnica, que se puede usar para identificar células que se enlazan al ligando deseado o mezcla de ligandos. El dominio de monómero seleccionado que codifica genes recuperados del ligando deseado o mezcla de ligandos que se enlazan a células, puede ser opcionalmente recombinado de conformidad con cualquiera de los métodos descritos en este documento o en las referencias citadas. Las secuencias recombinantes producidas en esta ronda de diversificación, son entonces seleccionadas por el mismo o diferente método para identificar genes recombinantes con afinidad mejorada para el ligando objetivo o deseado. Los procesos de diversificación y selección son opcionalmente repetidos hasta que se obtiene una afinidad deseada. Los ácidos nucleicos de dominio de monómero seleccionados por los métodos, se pueden unir en conjunto vía una secuencia enlazadora para crear multímeros, por ejemplo, por el montaje combinatorial de secuencias de ácido nucleico que codifican dominios de monómeros seleccionados por ligación de ADN, u opcionalmente, reacciones a base de PCR, traslapadas de auto-cebación. Las secuencias de ácido nucleico que codifican los multímeros, son entonces clonadas en un formato de exhibición de superficie celular (es decir, exhibición de superficie de células bacterianas, de levadura, o mamífero (COS) ; exhibición de fago) , para expresión y selección. Las secuencias recombinantes son transfectadas (transducidas o transformadas) en la célula hospedera apropiada, en donde son expresadas y exhibidas en la superficie celular. Por ejemplo, las células pueden ser teñidas con una etiqueta, por ejemplo, fluorescentemente etiquetadas, ligando deseado o mezcla de ligandos. Las células teñidas son distribuidas por citometría de flujo, y los genes que codifican multímeros seleccionados, son recuperados (por ejemplo, por PCR o expansión y clonación), a partir de las células positivas. Las células positivas incluyen multímeros con una avidez o afinidad mejorada o especificidad alterada al ligando deseado o mezcla de ligandos, comparada con el (los) dominio (s) de monómero (s) seleccionados. El proceso de teñido y distribución puede ser repetido múltiples veces (por ejemplo, usando concentraciones progresivamente reducidas del ligando deseado o mezcla de ligandos, hasta que se obtiene un nivel deseado de enriquecimiento) . Alternativamente, se puede usar cualquier método de selección o detección conocido en la técnica, que puede ser usado para identificar células que se enlazan al ligando deseado o mezcla de ligandos. Los genes que codifican multímeros seleccionados recuperados del ligando deseado o mezcla de ligandos que se enlazan a las células, pueden ser opcionalmente recombinados de conformidad con cualquiera de los métodos descritos en este documento o en las referencias citadas. Las secuencias recombinantes producidas en esta ronda de diversificación, son entonces seleccionadas por el mismo o diferente método para identificar genes recombinantes con avidez o afinidad mejorada o especificidad alterada para el ligando deseado u objetivo. La diversificación y proceso de selección es opcionalmente repetido hasta que se obtiene una avidez o afinidad deseada o especificidad alterada.

Ejemplo 2 Este ejemplo describe recombinación intra-proteína in vivo, para generar bibliotecas de mayor diversidad. Un vector de plásmido que codifica el monómero (vector derivado de pCK; véase abajo) , flanqueados por sitios JoxP ortólogos, fueron recombinados en una manera dependiente de Cre, con un vector fago vía sus sitios JoxP compatibles. Los vectores de fago recombinantes fueron detectados por PCR usando cebadores específicos para el constructo recombinante. El secuenciamiento de ADN indica que se generó el producto recombinante correcto.

Reactivos y procedimientos experimentales p-CK-cre-lox-Monómero-loxP. Este vector tiene dos características particularmente relevantes. Primero, porta el gen cre, que codifica la recombinasa de ADN específica del sitio Cre, bajo el control de Plac. El cre se amplificó por PCR a partir de p705-cre (de GeneBridges) con cebadores específicos de cre que incorporan Xbal (5' ) y Sfil (3') en los extremos del producto de PCR. Este producto se digirió con Xbal y Sfil y clonó en los sitios idénticos de pCK, un bla-, CmR derivado de pcK110919-HC-Bla (pACYC orí) , proporcionando pCK- cre. La segunda característica es una biblioteca de dominio naive A, flanqueada por dos sitios JoxP ortólogos, JoxP (tipo nativo) y JoxP (FAS), los cuales se requieren para la recombinación de ADN específica del sitio catalizada por Cre. Véase por ejemplo, Siegel, R. W. et aJ., FEBS Letters 505:467-473 (2001). Estos sitios se combinan rara vez con otros. Los sitios JoxP fueron construidos en pCK-cre secuencialmente. Los oligonucleótidos 5' -fosforilados loxP(K) y loxP(K_rc), que llevan loxP(WT) y EcoRI y HindlII-sobresalientes compatibles, para permitir la alineación a pCK digerido con EcoRI y iíínDIII, fueron hibridizados en conjunto y ligados a pCK-cre en una reacción de ligación estándar (ligasa T4; durante la noche a 16°C) .

El plásmido resultante se digirió con EcoRI y Sphl y se ligó a oligos 5' -fosforilados, hibridizados loxP(L) y loxP(L_rc), los cuales llevan JoxP(FAS) y £co.I y Sphl sobresalientes compatibles. Para preparar la construcción de biblioteca, se realizó una purificación a gran escala (Qiagen MAXI prep) de pCK-cre-lox-P (wt) -loxP (FAS) , de conformidad con el protocolo de Qiagen. El plásmido purificado de Qiagen se sometió a centrifugación de gradiente CsCl para purificación adicional. Este constructo fue entonces digerido con Sphl y BgJII y se ligó al inserto de biblioteca de dominio A naive digerido, el cual se obtuvo vía amplificación de PCR de una combinación de biblioteca de dominio A preexistente. Por diseño, los sitios JoxP y monómeros están en estructura, la cual genera monómeros con enlazadores codificados por JoxP. Esta biblioteca se utilizó en el procedimiento de recombinación in vi vo como se detalla abajo.

Vector fUSE5HA-Monómero-lox-lox. El vector es un derivado de fUSE5 de George Smith' s Laboratory (Universidad de Missouri) . Fue subsecuentemente modificado para portar un extremo HA para ensayos de inmunodetección. Los sitios JoxP fueron acumulados en fUSE5HA secuencialmente. Los oligonucleótidos 5' -fosforilados loxP(l) y loxP(I)_rc, que llevan loxP(WT), una cadena de codones de detención y Xmal y S-fil-sobresalientes compatibles, fueron hibridizados en conjunto y ligados a fUSE5HA digeridos con Xmal y Sfil en una reacción de ligación estándar (New England Biolabs T4 ligasa; durante la noche a 16°C) . El vector de fago resultante fue después digerido con Zmal y Sphl y ligado a los oligos hibridizados loxP(J) y loxP(J)_rc, los cuales llevan JoxP (FAS) y sobresalientes compatibles con Xmal y Sphl . Este constructo se digirió con Xmal/ Sfil , y después se ligó para pre-cortar el inserto de biblioteca de dominio naive A (Xmal/ Sfil ) (Producto de PCR) . Los codones de detención son localizados entre los sitios JoxP, previniendo la expresión de gilí y consecuentemente, la producción de fago infeccioso. La biblioteca/vector ligado, fue subsecuentemente transformada en un hospedero E. coli que porta un plásmido que expresa gilí, que permite el rescate del fago ÍUSE5HA-Monómero-lox-lox, como se detalla abajo. pCK-grIII. Este plásmido lleva gilí bajo el control de su promotor nativo. Se construyó por amplificación de gilí por PCR y su promotor a partir del fago auxiliador VCSM13 (Strategene) con cebadores gIIIPromotor_EcoRI y gIIIPromotor_HinDIII . Este producto se digirió con EcoRI y HinDIII y se clonó en los mismos sitios de pCK110919-HC-Bla.

Como el gilí está bajo el control de su propio promotor, la expresión de gilí es presumiblemente consecutiva. El pCK-gUT fue transformado en EC100 de E. coli (Epicentro) .

Procedimiento de recombinación ±n vivo. En resumen, el procedimiento involucra las siguientes etapas claves: a) Producción infectiva (es decir, rescate) de biblioteca fUSE5HA-Monómero-lox-lox con hospedero de E. coli que expresa gilí a partir de un plásmido; b) Clonación de la 2da. biblioteca (pCK) y transformación en F+ TGl de E. coli ; c) infección del cultivo que lleva la 2da. biblioteca con la biblioteca del gado fUSE5HA-Monómero-lox-lox rescatado. a. Rescate de vector fago. Las células electrocompetentes que llevan pCK-glTT fueron preparadas por protocolos estándares. Estas células tienen una frecuencia de transformación de 4 x 108/µg de ADN y fueron sometidas a electroporación con ligaciones a gran escala (~ 5 µg de vector de ADN) de vector fUSE5HA-lox-lox y el inserto de biblioteca de dominio A naive. Después de las electroporaciones individuales (100 ng de ADN/electroporación) , con ~70 µl de células/vaso de precipitado, se agregaron 930 µl de medio SOC caliente, y las células se dejaron recuperar con agitación a 37°C por 1 hora. Después, se agregó tetraciclina a una concentración final de 0.2 µg/ml, y las células se sacudieron por ~45 minutos a 37°C. Se removió una alícuota de este cultivo, diluida serialmente 10 veces y se colocó para determinar el tamaño de biblioteca resultante (1.8 x 107) . El cultivo restante se diluyó en 2 x 500 ml de 2xYT (con 20 µg/ml de cloranfenicol y 20 µg/ml de tetraciclona, para seleccionar pCK-gJJJ y el vector a base de fUSE5HA, respectivamente) y se hicieron crecer durante la noche a 30°C. Los fagos rescatados fueron cosechados usando protocolo de precipitación estándar PEG/NaCl. El titulador fue aproximadamente 1 x 102 unidades de transducción/ml . b. Clonación de la 2da . biblioteca y transformación en un hospedero de E. coli . La biblioteca de dominio naive A/pCK ligado, es sometida a electroporación en un hospedero bacteriano F+, con un tamaño de biblioteca esperado de aproximadamente 108. Después de un periodo de recuperación largo de una hora a 37°C con sacudimiento, las células electroporadas son diluidas a OD6oo~0.05 en 2xYT (más 20 µg/ml de cloranfenicol) y se hicieron crecer a fase log media a 37°C antes de la infección por fUSEHA-Monómero-lox-lox. c. Infección del cul tivo que lleva la 2da . biblioteca con la biblioteca de fago rescatado fUSE5HA-Monómero-lox-lox. Para maximizar la generación de recombinantes, es deseable una relación a alta infección (>50%) de E. coli dentro de un cultivo. La inefectividad de E. coli depende de un número de factores, que incluyen la expresión de F pilus y condiciones de crecimiento. Los antecedentes de E. coli TGl (que llevan un F' ) y K91 (una cadena Hfr) fueron hospederos para el sistema de recombinación.

Oligonucleótidos loxP(K) [P-5 ' agcttataacttcgtatagaaaggtatatacgaagttatagatctcgtgctgcatgcggtgcg] loxP(K_rc) [P-5 ' aattcgcaccgcatgcagcacgagatctataacttcgtatatacctttctatacgaagttataagct] loxP(L) [P-5 ' ataacttcgtatagcatacattatacgaagttatcgag] loxP (L_rc) [P-5 ' ctcgataacttcgtataatgtatgctatacgaagttatg] loxP(I) [P5'ccgggagcagggcatgc aagtgagtaataagtgagtaaataacttcgtatatacctttctatacgaagttatcgtctg] loxP(I)_rc [P-5 ' acgataacttcgtatagaaaggt atatacgaagttatttactcacttattactcacttagcatgccctgctc] loxP(J) [5 ' ccgggaccagtggcctctggggccataacttcgtatagcatacattatacgaagttatg] loxP( _rc [5' cataacttcgtetaatgtatgctatacgaagttatggccccagaggccactggtc] gIIIPro oter_EcoRI [5' atggcgaattctcattgtcggcgcaactat gmPromoterJffinDIII [5' gataagctttcattaagactccttattacgcag] Ejemplo 6 Este ejemplo describe la construcción de una biblioteca de monómero basada en EGF. La biblioteca de dominio CaEGF, E3, codifica un dominio de proteína de 36-43 aminoácidos que tiene el siguiente patrón: X (5) Cl-X (4/6) -C2-X (4,5) -C3-X (8) -C4-X (1) -C5-X (8/12) -C6 La tabla siguiente se describe para cada posición en la cual los aminoácidos están formados en la biblioteca, basados en la diversidad natural de dominios de EGF de enlace de calcio humano: Se creó una biblioteca de secuencias de ADN, E3, que codifican dominios de EGF que se enlazan a calcio monomérico, por montaje de PCR como se describe en Stemmer et al., Gene 164:49-53 (1995). Los oligonucleótidos usados en esta reacción de PCR están en dos grupos 1 y 2. Estos son: Grupo 1 1 5'-AAAAGGCCTCGAGOGCCTGGGTGGCAATGGT-3' 2 5'-CCTGAACCACCACA HKACCGYKSNBGCACGGAYYCGRCRMACATTC ATYAAYATCTDYACCATTGCCACCC-3' 3 5'-CCTGAACCACCACAKNTGSCGYYGYKMHSGCACGGAYYCGRCRMACATTC ATYAAYATCTDYACCATTGCCACCC-3' 4. 5'-CCTGAACCACCACAKHKACCGYKSNBGCAARBAYBCGVAHYCWSKBYAC ATTCATYAAYATCTDYACCATTGCCACCC-3 ' 5. 5'-CCrGAACCACCACAKNTGSCGYYGYKMHSGCAARBAYBCGVAHYCWSKBY ACATTCATYAAYATCTDYACCATTGCCACCC-3' 6.5'-TGAATTTTCTGTATGAGGTTTTGCTAAACAACTTTCAACAGTTTCGGCCC CAGAGGCCCTGGAGCCACCTGAACCACCACA-3' Grupo 2 ; 1. 5'-ACGGTGCCTACCCGTATGATGTTCCGGATTATGCCCCG GGTGGCAATGGT-3 ' 2. S'-CCTGAACCACCACAGHKTDBACCGGHAWAGCCTKSCRSGCASHBACAK YKAWAGCYACCCDSTRWATYTWBACCATTGCCACCC-3' 3. 5'-CCTGAACCACCACAKBYKBTKCYGKYCBSABYCNGCDBAWAGCCTK BGBKGCASHBACAKYKAWAGCYACCCDSTRWATYTWBACCATTGCCACCC-3' 4. 5'-AAAAGGCCCCAGAGGCCCCTGAACCACCACA-3' donde V=A/C/G, Y N=A/C/G/T.

Siguiendo los PCR separados de oligonucleótidos del Grupo 1 y 2, los fragmentos de PCR del grupo 1 se digirieron con Bpml y los fragmentos de PCR del Grupo 2, fueron digeridos con BsrDI. Los productos de digestión fueron purificados usando columnas Qiagen Qiaquick y después se ligaron juntos. El ADN ligado fue entonces amplificado en PCR usando dos cebadores. Estos son: 5'-AAAAGGCCTCGAGGGCCTGGGTGGCAATGGT-3' 5'-AAAAGGCCCCAGAGGCCCCTGAACCACCACA-3' Los productos de PCR fueron purificados con columnas Qiagen Qiaquick y digeridos con Sfil. El producto diferido se purificó con columnas Qiagen Qiaquick. Los fragmentos de ADN fueron ligados en los sitios de restricción Sfil del vector de exhibición de fago fuse5-HA(G4S) 4, un derivado de fuse5 que lleva un epítope HA en estructura y un enlazador de glicina, serina flexible. La mezcla de ligación se sometió a electroporación en células E. coli electrocompetentes TranforMax™ EC100™. Las células E. coli transformadas, se hicieron crecer durante la noche a 37°C en medio 2xYT que contiene 20 µg/ml de tetraciclina. La biblioteca resultante contiene 2xl09 clones independientes. Las partículas de fago fueron purificadas del medio de cultivo por precipitación de PEG. El titulador del fago fue 1.3xl012/ml. Las secuencias de 24 clones individuales fueron determinadas y estas fueron consistentes con el diseño de biblioteca.

Ejemplo 3 Este ejemplo describe la construcción de una biblioteca de monómero a base de EGF. Se puede usar recombinación para optimización intradominio . Por ejemplo, se puede usar una reacción traslapada de PCR que recombina dos o más segmentos de un dominio único relativo a cada uno de los otros. Se pueden usar dos, tres, cuatro, cinco o más reacciones de fragmentos traslapados en la misma forma como se ilustra. Este proceso de recombinación tiene muchas aplicaciones. Una aplicación es recombinar una gran combinación de cientos de clones previamente seleccionados sin información de secuencia. Todo lo que se necesita para que cada traslape funcione, es una región conocida de secuencias (relativamente) constantes, que existen en la misma ubicación en cada uno de los clones (procedimientos de sitios ajustados) . Para dominios A, típicamente estos clones podrían haber sido derivados de una biblioteca en la cual, 20-25 aminoácidos distribuidos sobre los cinco segmentos de inter-cisteína, fueron aleatorizados. El método de recombinación intra-dominio, puede también ser realizado en una combinación de dominios de monómeros relacionados con la secuencia por recombinación de ADN estándar (por ejemplo, Stemmer, Nature 370:389-391 (1994)), basada en la fragmentación aleatoria y remontaje, basado en la homología de secuencia de ADN, la cual no requiere un sitio de traslape fijo en todos los clones que son recombinados . Otra aplicación de este proceso es crear bibliotecas naive (que significa seleccionadas por inmovilización) , separadas, múltiples en cada una de las cuales solamente uno de los bucles de intercisteína es aleatorizado, para aleatorizar un bucle diferente en cada biblioteca. Después de seleccionar por inmovilización estas bibliotecas separadamente contra el objetivo, los clones seleccionados son entonces recombinados. De cada biblioteca seleccionada por inmovilización, solamente el segmento aleatorizado es amplificado por PCR y los segmentos aleatorizados múltiples son entonces combinados en un dominio único, creando una biblioteca intercambiada la cual se seleccionada por inmovilización y/o seleccionada para determinar la potencia incrementada. Este proceso puede también ser usado para intercambiar un número menor de clones de secuencia conocida. Se puede usar cualquier secuencia común como puntos cruzados. Para un dominio u otros monómeros que contienen cisteína, los residuos de cisteína son lugares lógicos para la cruza. Sin embargo, existen otras formas para determinar sitios cruzados óptimos, tales como modelación por computadora. Alternativamente, residuos con entropía alta, o al menos número de contactos intramoleculares, también pueden ser buenos sitios para cruzas. Un método ejemplar para generar bibliotecas comprendidas de proteínas con bucles inter-cisteínas aleatorizadas, se presenta abajo. En este ejemplo, contrario al procedimiento de procedimiento de biblioteca separada, de bucle separado descrito anteriormente, bucles de intercisteína múltiples son aleatorizados simultáneamente en la misma biblioteca. Se construyó una biblioteca NNK de dominio A, que codifica un dominio de proteína de 39-45 aminoácidos, que tienen el siguiente patrón: C1-X(4,6)-E1-F-R1-C2-A-X(2,4)-G1-R2-C3-I-P-S1-S2-W-V-C4-D1-G2-E2-D2-D3-C5- G3-D4-G4-S3-D5-E3-X(4,6)-C6; en donde, C1-C6: cisteínas; X(n): secuencia de n aminoácidos con cualquier residuo en cada posición; E1-E3: glutamina; F: fenilalanina; R1-R2 arginina; A: alanina; G1-G4: glicina; I: isoleucina; P: prolina; S1-S3: serina; W: triptofano; V: valina; D1-D5: ácido aspártico; y C1-C3, C2-C5 y C4-C6 de disulfuros.

La biblioteca se construyó creando una biblioteca de secuencias de ADN, que contienen codones de tirosina (TAT) o codones no conservados variables (NNK) , por montaje de PCR como se describe en Stemmer et al . , Gene 164:49-53 (1995).

Comparado con el andamiaje de dominio A y el diseño que se usó para construir la biblioteca Al (descrita previamente) , este procedimiento: 1) mantiene más de los residuos existentes en su lugar, en lugar de aleatorizar estos residuos potencialmente críticos, y 2) insertar una cadena de aminoácidos de longitud variable de 20 aminoácidos (codón NNK) , de manera tal que el número promedio de residuos de inter-cisteína se extiende más allá del dominio natural A en la biblioteca Al. La relación de residuos de tirosina se incrementó, incluyendo codones de tirosina en los oligonucleótidos, debido a que las tirosinas se encontraron por ser sobre representadas en los sitios de enlace al anticuerpo, presumiblemente debido al gran número de diferentes contactos que la tirosina puede hacer. Los oligonucleótidos usados en esta reacción de PCR son: 1. 5' -ATATCCCGGGTCTGGAGGCGTCTGGTGGTTCGTGTNNKNNKNNKNNKGAATTCCGA- 3' 2. 5' -ATATCCCGGGTCTGGAGGCGTCTGGTGGTTCGTGTNNBCNNKNNKNNKN KGAATTCCGA- 3' 3. 5' -ATATCCCGGGTCTGGAGGCGTCTGGTGGTTCGTGTNNKNNKNNK NKNNKNNKGAATTCCGA- 3' 4. 5' -ATATCCCGGGTCTGGAGGCGTCTGGTGGTTCGTGTTATNNKNN NNKGAATTCCGA- 3' 5. 5' -ATATCCCGGGTCTGGAGGCGTCTGGTGGTTCGTGTNNKTATNNKNNKNNKGAATTCCGA- 3' 6. 5' -ATATCCCGGGTCTGGAGGCGTCTGGTGGTTCGTGTNNKTATNNKNNKGñATTCCGA- 3' 7. 5' -ATATCCCGGGTCTGGAGGCGTCTGGTGGTTCGTGTNNKNNKATNNKGAATTCCGA- 3' 8. 5' -ATATCCCGGGTCTGGAGGCGTCTGGTGGTTCGTGTNNKNNKNNKTATGAATTCCGA- 3' 9. 5' -ATATCCCGGGTCTGGAGGCGTCTGGTGGTTCGTGTNNKN KNNKTATNNKGAATTCCGA- 3' 10. 5' -ATACCCAAGAAGACGGTATACATCGTCCMNNMNNTGCACATCGGAATTC- 3' 11. 5' -ATACCCAAGAAGACGGTATACATCGTCCM NMNNMN TGCACATCGGAATTC- 3' 12. 5' -ATACCCAAGAAGACGGTATACATCGTCCMNNMNNMNNMNNTGCACATCGGAATTC- 3' 13. 5' -ATACCCAAGAAGACGGTATACATCGTCCATAMNNMNNTGCACATCGGAATTC- 3' 14 . 5' -ATACCCAAGAAGACGGTATACATCGTCCMNNATAM NMNNTGCACATCGGAATTC- 3 ' 15. 5' -ATACCCAAGAAGACGGTATACATCGTCCM ATA NNTGCACATCGGAATTC- 3 ' 16. 5' -ATACCCAAGAAGACGGTATACATCGTCC NNMNNATATGCACATCGGAATTC- 3 ' 17. 5' -ATACCO?GAAGACGGTATACATCGTCC NNMNNATñMNNTGCACATCGGAATTC- 3 ' 18 . 5 ' -ACCGTCTTCTTGGGTATGTGACGGGGAGGACGATTGTGGTGACGGATCTGACGAG- 3 ' 19. 5' -ATATGGCCCCAGAGGCCTGCAATGATCCACCGCCCCCACAMNN NNMNN NNCTCGTCAG ATCCGT- 3' 20. 5' -ATATGGCCCt^GAGGCCTGC^TGATCC&CCGCCCCCACAMNNM NM]^^ GATCCGT- 3' 21. 5' -ATATGGCCCCAGAGGCCTGOUVTGATCC&CCGCCCCCAa^MNN N^^ TCGTCAGATCCGT- 3' 22. 5' -ATATGGCCCCAGAGGCCTGCAATGATCCACCGCCCCCACAATAMNN NNMNNCTCGTC AGATCCGT- 3' 23. 5' -ATATGGCCCC^GAGGCCTGí^^TGATCCACCGCCCCCACAMNNATA NNMNN NNCT CGTCAGATCCGT- 3' 24. 5' -ATATGGCCCC?GAGGCCTGCT TGATCCACCGCCCCCAayíNlIATAMNNMNNCTCGT CAGATCCGT- 3' 25. 5' -ATATGGCCCCAGAGGCCTGCAATGATCCACCGCCCCCACAMNNMNNATAMNNCTCG TCAGATCCGT- 3' 26. 5' -ATATGGCCCCAGAGGCCTGCAATGATCCACCGCCCCCACAMNNMNN NNATACTCG TCAGATCCGT- 3' 27. 5' - La biblioteca se construyó a través de una ronda inicial de 10 ciclos de amplificaciones PCR usando una mezcla de 4 combinaciones de oligonucléotidos, cada combinación contiene 400 pmoles de ADN. La combinación 1 contiene oligonucleótidos 1-9, la combinación 2 contiene 10-17, la combinación 3 contiene únicamente 18 y la combinación 4 contiene 19-27. La biblioteca completamente ensamblada se obtuvo a través de 8 ciclos adicionales de PCR usando 1 a 4 combinaciones. Los fragmentos de biblioteca se digirieron con Xmal y Sfil. Los fragmentos de ADN se ligaron en sitios de restricción correspondientes del vector fusionado 5-HA que exhibe el fago, un derivado del fusionado 5 portado en una estructura epítope HA. La mezcla de ligación se sometió a electoporación en células E. coli del electrocomponente TransforMAX™ EC100™ que resulta en una biblioteca de clones individuales 2xl09. Las células E. coli transformadas se hicieron crecer durante la noche a 37 °C en un medio 2xYT que contiene 20 µg/ml de tetraciclina. Las partículas del fago se purificaron del medio de cultivo por precipitación PEG y se determinó un titulador de 1.1 x 1013/ml. Se determinaron secuencias de 24 clones y se hizo estable con las expectaciones del diseño de la biblioteca.

Ejemplo 4 Este ejemplo describe la optimización de multímeros optimizando monómeros y/o enlazadores para el enlace a un objetivo. Un procedimiento para optimizar multiméros enlazados a los objetivos, involucra la optimización de monómeros, multiméros y enlazadores. Primero una biblioteca de monómeros se selecciona por inmovilización para enlazarse al objetivo (por ejemplo, Met) . Sin embargo, algunos de los monómeros pueden unirse a ubicaciones en el objetivo que están lejos entre sí, de forma tal que los dominios que se unen a estos sitios no se pueden conectar por un péptido enlazador. Es por lo tanto útil para crear y seleccionar una biblioteca amplia de homo- o heterotrímeros de estos monómeros después de la optimización de los monómeros. Estas bibliotecas de trímero se pueden seleccionar, por ejemplo, en fago (típico para crear heterotrímeros de una combinación grande de monómeros) o se hace y se ensaya separadamente (por ejemplo, para homotrímeros) . Por este método, se identifica el mejor trímero. Los ensayos pueden incluir ensayos de enlace para una determinación de potencia de un objetivo o agonista o antagonista del multímero en ensayos basados de proteína o célula funcionales. El (los) dominio (s) monomérico (s) del mejor trímero sencillo después se optimizan con una segunda etapa. Los homomultímeros son más fáciles para optimizar, puesto que únicamente existe una secuencia de dominio, aunque los heteromultímeros también se pueden sintetizar. Para homomultímeros, un incremento en el enlace por el multímero comparado al monómero es un efecto de avidez. Después de la optimización de la secuencia del dominio (por ejemplo, recombinando o aleatorización NNK) y selección por inmovilización del fago, los monómeros mejorados se usan para construir un dímero con una biblioteca enlazadora. Las bibliotecas enlazadoras se pueden formar, por ejemplo, de enlazadores con una composición NNK y/o longitud de secuencia variable. Después de la selección por inmovilización de esta biblioteca enlazadora, los mejore clones (por ejemplo, determinados por potencia en la inhibición u otro ensayo funcional) se convierten en multímeros compuestos de dominios de secuencias optimizadas múltiples (por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, etc.) y enlazadores de longitud y secuencia optimizada.

Ejemplo 5 Este ejemplo describe un análisis estructural de dominios A. Como con virtualmente todas la proteínas, únicamente una fracción de la superficie total de un dominio A participa en el enlace de un objetivo sencillo. Basado en la estructura de solución del dominio, se pueden identificar posiciones del residuo adyacente los cuales son probablemente capaces de cooperar en el enlace a un objetivo dado. Incluso, tales grupos de residuos adyacentes son referidos como categorías estructurales. Un ejemplo, cuatro de tales categorías se ha identificado a través del examen de la estructura del dominio A, designadas Superior, Inferior, Bucle 1 y Bucle 2. Por bibliotecas diseñadas las cuales únicamente permiten diversidad dentro de una categoría dada, el espacio de secuencia teórica permitido por una biblioteca puede ser significantemente reducido, permitiendo para mejor cobertura del espacio teórico por la biblioteca física. Además, en el caso de categorías no traslapadas tales como categorías Superior e Inferior, secuencias de dominio medio seleccionadas contra objetivos diferentes se pueden combinar en una secuencia única la cual será capaz de unirse simultáneamente o alternativamente a los objetivos seleccionados. En cuyo caso, creando sitios de enlace que ocupan únicamente la mitad que un dominio permite para la creación de moléculas que son medidas como grandes y podrán tener el número de epítope inmunogénico, que reduce el riesgo de inmunogenicidad.

Clasificación Estructural de Posiciones del Dominio A Una secuencia del dominio A canónica se muestra abajo con posiciones de alta diversidad representada como una X. Las posiciones que corresponden a ya sea las categorías Superior, Inferior, Bucle 1 o Bucle 2 se designan con una estrella.

Ejemplo 6 Este ejemplo describe la selección para monómeros o multímeros que se enlazan a c-MET (también conocido como HGFR) . Las bibliotecas del fago se seleccionan por inmovilización a través de varias rondas en ya sea un soporte sólido (por ejemplo, placas Nunc Maxisorp) o en solución (por ejemplo, Streptavidina Dynal o perlillas de proteína A) . El fago de salida se combinó con (a) la frecuencia mayor de clones del fago individual que se enlaza a c-MET y (b) diversidad de secuencia mayor entre los clones del fago de enlace positivo se seleccionan por selección de proteína.

I. Ronda 1 (placas Maxisorp o Perlillas Dynal) 1. Objetivo de Revestimiento A. Placas de revestimiento: Se revistieron directamente seis cavidades/bibliotecas con dominio extracelular c-MET (ECD) /quimera Fc (0.5 µg/cavidad) usando 100 µl/cavidad de 5 µg/ml de c-MET-EDC diluido en TBS [pH 7.5] /2 mM CaCl2. Cuando se usa c-MET-ECD/fusión Fc (R & D Systems; portador libre) como el objetivo, las placas se pre-revistieron con Proteína A por 1 hora a temperatura ambiente con agitación. Cuando se usa una forma biotinilada de c-MET EDC/Fc, las placas se pre-revistieron con estreptavidina por 1 hora a temperatura ambiente con agitación. Además, una cavidad/biblioteca de control negativo se revistió con TBS [pH 7.5] /2 M de CaCl2 únicamente. Después que el pre-revestimiento se completó, se agregó c-MET-Fc (+/- biotina) y las placas se incubaron por 1.5 horas a temperatura ambiente con agitación. B. Perlillas revestidas : Se incubaron 20 µl de estreptavidina Dynal (M-280; Dynal ASA) o perlillas de Proteína A Dynal (Dynal ASA) con 5 µg de c-MET/Fc biotinilado o c-MET/Fc no biotinilado, respectivamente, en 500 µl de TBS [pH 7.5] /2 mM de CaCl2 y se giró a temperatura ambiente por 1 hora en tubos Eppendorf. Como un control negativo, 20 µl de estreptavidina Dynal o perlillas de Proteína A sin objetivo se incubaron a 500 µl de TBS]pH 7.5]/2 mM de CaCl2 y se giró a temperatura ambiente por 1 hora. Nótese que las perlillas Dynal se lavaron al menos dos veces con TBS [pH 7.5] /2 mM de CaCl2 antes de agregar el objetivo, y las perlillas se revistieron en volumen. 2. Bloqueo A. Placas de bloqueo: Se removió la solución de revestimiento y las cavidades se lavaron una vez con 200 µl/cavidad de TBS [pH 7.5] /2 mM de CaCl2. Se agregó 250 µl/cavidad de BSA al 1% (libre de proteasa) en TBS [pH 7.5] /2 mM de CaCl2 y se incubó por 1 hora a temperatura ambiente con agitación. Se pueden usar reactivos alternativos (por ejemplo, caseína o leche) para bloqueo. B. Perlillas de bloqueo: Se removió la solución de revestimiento y las perlillas se lavaron dos veces con TBS [pH 7.5] /2 mM de CaCl2. Se agregó 500 µl de BSA al 1% (libre de proteasa) en TBS [pH 7.5] /2 mM de CaCl2 y se giró por 1 hora a temperatura ambiente. Como se notó anteriormente, se pueden usar reactivos de bloqueo alternativo. 3. Lavados A. Placas Lavadas: Las cavidades se lavaron tres veces con 200 µl/cavidad de TBS[pH 7.5] /2 mM de CaCl2 para remover exceso de objetivo. B. Perlillas Lavadas: Las perlillas se lavaron tres veces con 1000 µl de TBS [pH 7.5] /2 mM de CaCl2 para remover exceso de objetivo. Las perlillas se dejaron colectar en un magneto por unos pocos minutos después de cada lavado para evitar pérdida de perlillas. 4. Adición del Fago A. Adición del Fago a Placas: Se agregaron aproximadamente 1000 equivalentes de biblioteca (biblioteca del fago naive dominio Al) en amortiguador de adición del fago (1% de leche deshidratada sin grasa/BSA al 0.2% (libre de proteasa) , u otro agente de bloqueo apropiado, en TBS [pH 7.5]/2 mM de CaCl2) y se incubaron a temperatura ambiente por 2 horas con agitación. En las rondas 2-3, se agregaron 100 µl de total de fago cosechado a 7 cavidades (control 6 objetivo + 1 negativo) diluido en amortiguador de adición del fago. B. Adición del Fago a Perlillas: Se agregaron aproximadamente 1000 equivalentes de biblioteca (biblioteca del fago naive de dominio Al) en 500 µl de 1% de leche deshidratada sin grasa + 100 µl de BSA al 1% (libre de proteasa) en TBS [pH 7.5] /2 mM CaCl2 y se incubaron con rotación a temperatura ambiente por 2 horas. En las rondas 2-3, se agregaron 100 µl del fago cosechado a las perlillas. 5. Lavados A. Placas Lavadas: Las placas se lavaron ocho veces a doce veces con 200 µl/cavidad de TBS [pH 7.5] /2 mM de CaCl2/T een-20 al 1% durante un periodo de 10 minutos. B. Perlillas Lavadas: Las perlillas se lavaron de 8-12 veces con 800 µl de TBS [pH 7.5] /2 mM de CaCl2/T een-20 al 1% durante un periodo de 30-45 minutos. La suspensión de perlilla se facilitó dispersando amortiguador lavado directamente en perlillas colectadas o pipeteando arriba y abajo (no por vórtice) . Alternativamente, se puede usar un aparato KingFisher (Thermo LabSystems) o equivalente para lavado de perlilla.

Condiciones para lavado Riguroso (opciones) a. 800 µl de TBS [pH 7.5]/2 mM de CaCl2/T een-20 al 1% a 37°C. b. 800 µl de TBS [450 mM de NaCl, pH 7.5] /2 mM de CaCl2/Tween-20 al 1% a temperatura ambiente; c. Las perlillas se lavaron normalmente 6-8 veces, después, se agregó 1 µl de c-MET-ECD sin etiquetar por 1 hora a temperatura ambiente o 37 °C. La fago que permanece al término después de este lavado se retuvo por elución/infección; d. 1% de leche/0.2% de BSA/con o sin 1M de urea/37°C (altamente riguroso) . 6. Competencia (opcional) : A. Competencia en Placas : Se incubó el fago con 100 µl/cavidad de 50 ug/ml (5 µg/cavidad) de HGF (el ligando c-MET) ) en TBS [pH 7.5] /2 mM de CaCl2 por una hora a temperatura ambiente con agitación. Se retuvieron los eluatos HGF por infección de E. coli BlueKan K91. B. Competencia de Perlillas: Se incubó el fago con 10 µg de HGF en 500 µl de TBS [pH 7.5]/2 mM de CaCl2 por 1 hora a temperatura ambiente con agitación. Se retuvieron los eluatos HGF por infección de E. coli BlueKan K91. 7. Elución del Fago A. Elución de Placas: Se agregó 100 µl/cavidad de 100 mg/ml de tripsina en TBS [pH 7.5] /2 mM de CaCl2, y las placas se incubaron a 37°C por 30 minutos con agitación. B. Elución de Perlillas: Se agregó 100 µl/ml de tripsina en TBS [pH 7.5] /2 M de CaCl2 a las perlillas, las cuales se incubaron a 37°C (en un bastidor Eppendorf) por 30 minutos con agitación. C. Elución/infección alternativo: Se agregaron 200 µl de células E. coli BlueKan K91 de fase larga a OD60o ~ 0.5 a cada cavidad (para placas) o para perlillas aspiradas. Esta infección se dejó proceder por 30 minutos a 37°C sin agitación. Después, se combinaron 200 µl de volúmenes y se agregaron a ~ 3 ml de 2xYT/0.2 µg/ml de tetraciclina y se agitó por 15 minutos a 37°C. 8. Infección: (el mismo para el Protocolo de Placa y Perlilla) Se hizo crecer un volumen apropiado de E. coli BlueKan K91 de fase larga (en 2xYT/40 µg/ml de canamicina) a OD6oo ~0.5 ~0.06. Cuando el cultivo alcanza OD60o, se colocó en hielo antes del usó, a pesar que el tiempo en hielo se generalmente minimizado. A. En un tubo estéril cónico de 50 ml, se mezcló el fago eluido con 5 ml del cultivo E. coli BlueKan K91 de fase larga y se incubó a 37°C por 25 minutos sin agitación. Los tubos cónicos estériles se cubrieron con tapón AirPore (Qiagen) para facilitar la aeración. B. Se agregó tetraciclina a una concentración final de 0.2 µg/ml y se agitó por 15 minutos a 37°C. C. Se sometió a muestra una alícuota de 10 µl titulando y diluyendo serialmente 10 veces (10_1 hasta 10"6) en 2xYT, colocado en manchas de 8 µl/dilución en 2xYT/20 µg/ml de placas de tetraciclina y se incubaron durante la noche a 30°C o 37°C. El volumen restante de las diluciones 10"2 - 10~4 se colocaron para obtener colonias únicas para los ELISA del fago subsecuente. D. Se diluyeron 5 ml de cultivos infectados ~10 veces en 50 ml 2xYT/20 µg/ml de tetraciclina y se incubaron con agitación a 30°C durante la noche a saturación. 9. Se usó el fago de entrada de titulación en la ronda actual de selección por inmovilización (lo miso para el Protocolo de Placa y Perlilla) A. Se hicieron diluciones seriales 100 veces (10~4 hasta 10"10) del fago cosechado en 2xYT. B. Se agregaron 100 µl/cavidad de un cultivo E. coli BlueKan K91 de fase larga a OD6oo ~0.5-0.6 a 6 cavidades de una placa de polipropileno de 96 cavidades. C. Se agregó 10 µl del fago diluido a las cavidades que contienen 100 µl de E. coli BlueKan K91. D. Se incubaron las mezclas fago/célula a 37°C por 25 minutos son agitación, y las placas se cubrieron con tapón AirPore (Qiagen) para permitir la aeración. E. Se agregó tetraciclina a una concentración final de 0.2 µg/ml y la placa se agitó por 15 minutos a 37°C. F. Se colocó 8 µl de cada dilución (10-4 hasta 10-10) en 2xYT agar/20 µg/ml de placa de tetraciclina. G. Las placas se incubaron a 30°C o 37°C durante la noche. 10. Fago cosechado (lo mismo para los Protocolos de Placa y Perlilla) A. Los cultivos de la noche se centrifugaron a 7000 rpm en tubos de 50 ml disponibles por 25 minutos a células de pelotillas . B. Se realizó un procedimiento de precipitación PEG/NaCl del fago estándar agregando 1/5 volúmenes de una solución base PEG al 20%/NaCl al 15% al sobrenadante del cultivo. Se mezcló bien repetidamente invirtiendo e incubándolo en hielo por 45 minutos por 1 hora. C. El cultivo se centrifugó a 7000 rpm por 40 minutos a un fago en pelotilla y lo sobrenadante se desechó. D. La pelotilla del fago se suspendió nuevamente en 1 ml de TBS [pH 7.5] /2 mM de CaCl2, se transfirió a un tubo Eppendorf y se centrifugó a 13K rpm por al menos 2 minutos para un material insoluble en pelotilla. E. Lo sobrenadante se transfirió a un tubo fresco y 1/5 volúmenes de PEG/NaCl se agregó, se mezcló y se incubó en hielo por ~ 5 minutos. F. La mezcla después se centrifugó a 13000 rpm por al menos 2 minutos, y se removió lo sobrenadante. Se suspendieron nuevamente la pelotilla, el fago purificado en 1 ml de TBS [pH 7.5] /2 mM de CaCl2 y se almacenó a 4°C.

II. Ronda 2 y ronda 3 de selección por inmovilización Las condiciones de selección por inmovilización de las rondas 2da y 3era son generalmente las mismas como en la Ronda 1 descrita anteriormente, excepto que la cantidad del objetivo revestido (es decir, c-MET-ECD) disminuyó 2 a 4 veces para cada una de las rondas subsecuentes, y las placas (o perlillas) se lavaron 2-4 veces adicionales en cada ronda subsecuente de selección por inmovilización.

III. Recombinación intra-dominio opcional Se recombinaron secuencias del monómero en combinaciones del fago seleccionado que muestra el fago en el siguiente procedimiento. Este proceso generó monómeros híbridos derivados de mitades mezcladas de la colección del monómero de partida en protocolos dados. Para bibliotecas del fago basados en el dominio Al, los cebadores pares SHF1 (ATTATGCCCCGGGTCTGGAGGCGTC) /traslape SHB (CGCCGTCGCAA) y traslape SHF (TTGCGACGGCG) /B3 (TCGGCCCCAGAGGCCTGCAATG) se usaron para amplificación por PCR de las dos mitades de los monómeros. Las 2 mitades se fusionaron junto con polimerasa Taq LA (Takara) . Después, las secuencias que codifican al híbrido fusionado se amplificaron por cebadores SHF2 (CCGGATTATGCCCCGGGTCTGGA) y SHB4 (AACAGTTTCGGCCCCAGAGGCCTGC) .

Los producto PCT purificados se digirieron por Sfil (NEB) y se ligaron con el vector del fago ÍUSE5HA Sfil digerido para generar bibliotecas del monómero recombinado. Las bibliotecas recombinadas se seleccionaron por inmovilización al menos dos o más rondas contra c-MET ECD/Fc y se seleccionan como se describe abajo. Los datos de caracterización de monómeros recombinados es en la Tabla 1 y 2.

IV. Análisis de selección por inmovilización de salida (lo mismo para protocolos de placa y perlilla) ELISA para Fago: Para cada "combinación de fago" de salida a ser analizados (típicamente Rondas 2, 3 y 4, si son aplicables) , se inocularon clones independientes en 1 ml de cultivos (2xYT/20 µg/ml de tetraciclina) crecidos en placas de cavidad profunda de polietileno de 96 cavidades. Se dejaron las puntas inoculando, y las placas se sacudieron durante la noche a 37°C. Las células se hicieron pelotillas por centrifugación a 3600 rpm por 15 minutos. Se retuvieron los sobrenadantes del cultivo y se realizaron los ELISA como se describe abajo. Se revistió directamente c-MET ECD/Fc no biotinilados (0.1 µg/cavidad) en placas Nunc Maxisorp. Sin embargo, c-MET ECD/Fc biotinilado, placas Maxisorp Nunc de 96 cavidades deben ser primero revestidos con 50 µl/cavidad de 50 µg/ml (2.5 µg/cavidad) de estreptavidina, diluida en TBS [pH 7.5] /2 mM de CaCl2. La placa se incubó a 37°C por 1 hora con agitación. Las placas se lavaron tres veces con 200 µl/cavidad de TBS [pH 7.5] /2 mM de CaCl2. Las cavidades se bloquearon con 200 µl/cavidad de BSA al 1% (fracción V) y las placas cubiertas se incubaron a temperatura ambiente por 1 hora con agitación. La placa se lavó tres veces con TBS [pH 7.5] /2 mM de CaCl2. Después, la placa Maxisorp de 96 cavidades se revistieron con 100 µl/cavidad de 1 µg/ml de c- MET-ECD botinilado (0.1 µg/cavidad diluido en TBS [pH 7.5] /2 mM de CaCl2 o 100 µl/cavidad de amortiguador únicamente (control negativo) . La placa se incubó a temperatura ambiente por 1 hora con agitación. Las placas se lavaron tres veces con TBS [pH 7.5] /2 mM de CaCl2. Después, se agregó 30 µl de cada sobrenadante del fago a las cavidades en la presencia de 70 µl de 1% de leche/BSA al 0.2%/ [pH 7.5] /2 mM de CaCl2/Tween-20 al 0.02%. Las placas cubiertas se incubaron a temperatura ambiente por 1.5 horas con agitación.

Las placas se lavaron cuatro veces con TBS [pH 7.5] /2 mM CaCl2/Tween-20 al 0.02%. Después, se agregó 100 µl/cavidad del anticuerpo monoclonal «-M13-HPR (Amersham Pharmacia), diluido 1:5000 en TBS [pH 7.5] /2 mM de CaCl2 + T een-20 al 0.02%. Las placas se incubaron a 4°C por 1 hora con agitación. Las placas se lavaron tres veces con TBS frío [pH 7.5] /2 mM de CaCl2/Tween-20 al 0.02%. Se agregó 100 µl/cavidad de la mezcla TMB/H202 (Pierce), diluida 1:1, para desarrollar el ELISA. Las reacciones se dejaron tornar azul hasta que el OD65o de las señales más fuertes alcanzaron ~ 1.0. La reacción se detuvo con 100 µl/cavidad de H2S04 2 N, y las cavidades positivas cambiaron en color de azul hasta amarillo. Una vez que la reacción se detuvo, se leyó a OD450 en un lector de placa ELISA usando el software SoftMaxPro. Se seleccionaron las combinaciones del fago positivo del ELISA del fago para subclonarlos en un vector de expresión si tienen (a) una frecuencia alta de clones del fago individuales que se une a c-Met ECD/Fc y (b) alta diversidad de secuencia entre los clones del fago de enlace positivo. Las combinaciones que cubren estos criterios se escogieron para seleccionar proteína en los procesos resumidos abajo. Para subclonar el monómero o secuencias del multímero de una combinación del fago dado en el vector de expresión, pEve, aproximadamente 108-1010 fagos se amplificaron por 25 ciclos de PCR como sigue: Receta PCR 0.5 - 1 µl de fago purificado 5 µl 10X de Amortiguador 8 µl 2.5 M de dNTPs 5 µl 10 uM de cebador VS-para (5'-ATCATCTGGCCGGTCCGGCCTACCCGTATGATGTTCCGGA-3' ) 5 µl 10 uM del cebador EveNut (5'-AAAAGGCCCCAGAGGCCTTCTGCAATGAC-3' ) 26 µl de H20 0.5 µl de polimerasa La Taq (1 unidad) (Takara) Ciclos: 25X [94°C/10 seg. -45°C/30 seg.-72°C/30 seg.] Se corrieron los productos PCR en un gel de agarosa al 3% para análisis. El monómero o producto multímero (aproximadamente 200 pb) se purificó con una columna de giro QIAquick (Qiagen) , se digirió con SFi I (NEB) , purificado nuevamente con una columna QIAquick y después se ligó usando Ligasa ADN TA (NEB) para el vector digerido Sfi I, p Eve. La ligación se transformó en electrocomponente BL21 (DE3) de E. coli y se colocó en placas 2xYT que contienen canamicina a 400 µl/ml. Después del crecimiento durante la noche, aproximadamente 6000 clones individuales se incubaron en 2xYT/canamicina y se hicieron crecer durante la noche. Los controles positivo y negativo también se incluyen en las placas.

V. Se seleccionaron miles de proteínas del monómero en 1 ml de lisados celulares Producción de Proteína de 1 ml de Lisado calentado (Día 1) : Se inocularon clones individuales en cavidades de una placa de cavidad profunda Costar de 96 cavidades que contiene 400 µl/cavidad de 2xYT/40 µg/ml de canamicina. Los cultivos se hicieron crecer durante la noche (los cuales dejaron puntas en las cavidades) mientras se agitaron a 300 rpm a 37°C. Este proceso permitió seleccionar moles de individuos, monómeros parcialmente purificados en el nivel de lisado celular. (Día 2) Se inoculó 100 µl de cultivo durante la noche en una placa nueva de cavidad profunda Costar de 96 cavidades que contienen 1 ml/cavidad de 2xYT/40 µg/ml de canamicina + 1 mM de CaCl2. (Lo cultivado durante la noche restante se logro por la adición de 25% de concentración de glicerol final y después se almacenó a -80°C para uso último) . Las placas se cubrieron con una Tapa AirPore (Qiagen) y los cultivos se hicieron crecer con agitación a 375 rpm a 37°C hasta que se alcanzó un OD6oo de ~8.0 hasta 1.0. Una vez que se alcanzó el OD60o deseado, los cultivos se inducen con 1 mM de IPTG por 3 horas mientras se agitan a 375 rpm a 37°C. Las placas que contienen cultivos inducidos después se centrifugaron por 15 minutos a 3600 rpm a 4°C para células de pelotillas. Lo sobrenadante se removió y se desechó, y la pelotilla celular restante se suspendió nuevamente en 100 µl de TBS [pH 7.5] /l mM de CaCl2. Las células nuevamente suspendidas se transfirieron de la placa de cavidad profunda de 96 cavidades a una placa PCR de polipropileno de 96 cavidades y se calentó por 5 minutos a 65°C en una máquina PCR. Las células calentadas/lisadas después se centrifugaron por 15 minutos a 3600 rpm a 4°C. Después de la centrifugación, se completó la producción de proteína, y los lisados calentados están listos para caracterización en una selección primaria vía ELISA enlazado y/o ensayo AlphaScreen de competición. ELISA c-Met ECD/proteína Fc: Se colocaron placas Maxisorp de 96 cavidades con 100 µl/cavidad de 1 µg/ml (0.1 µg/cavidad) c-MET ECD/Fc (R&D systems) diluido en TBS [pH 7.5] /l mM de CaCl2, y la fase se inoculó a 4°C durante la noche a temperatura ambiente (TA) por 1.5 horas con agitación. Las cavidades se vaciaron y después se bloquearon con 200 µl/cavidad de BSA 1% (fracción V) /TBS [pH 7.5] /l mM de CaCl2. La placa cubierta se incubó a TA por 1 hora con agitación. La placa se lavó tres veces con TBS [pH 7.5] /l mM de CaCl2. Se agregó 100 µl/cavidad de proteína de monómero a la placa en TBS[pH 7.5] /l mM de CaCl2/BSA al 0. l%/Tween-20 al 0.02%. Se agregó 1 ml de proteína de las preparaciones usadas calentadas a las cavidades como una concentración de punto sencillo 1:10. Las placas cubiertas se inocularon a TA por 1.5 horas con agitación. La placa se lavó tres veces con TBS[pH 7.5] /l mM de CaCl2/Tween-20 al 0.02%. Se agregó 100 µl/cavidad del anticuerpo de detección anti-HA-HRP (Roche) diluido 1:2000 en TBS [pH 7.5] /l mM de CaCl2/BSA al 0.1%/Twee-20 0.02%. Las placas cubiertas se inocularon a TA por 1 hora con agitación. La placa se lavó tres veces con TBS[pH 7.5] /l mM de CaCl2/Tween-20 al 0.02%. Se agregó 100 µl/cavidad de mezcla TMB/H2S04 diluida 1:1. El color se dejó tornarse azul hasta el OD6so de las señales más fuertes alcanzaron ~1.0. La reacción se detuvo con 100 µl/cavidad de H2S04 2N. Una vez detenida, la placa se reyó en lector de placa ELISA a OD5o- Ensayo de competición HGF de homogénea de c-Met/Fc biotinilado (bn) AlphaScreen Ensayo de competición: Todos los componentes del ensayo se diluyeron en Amortiguador AlphaScreen: 40 mM de HEPES [pH 7.4]p/NaOH, 1 mM de CaCl2, BSA al 0.1% (p/v), Tween-20 al 0.05%, 100 mM de NaCl. Se hicieron tres adiciones a una placa de ensayo de microtitulador Greiner, de volumen reducido, de 384 cavidades, blanca sin tiempo de incubación entre adiciones. Primero, se agregaron monómeros o HGF humano recombinante sin etiquetar (rhHGF) (como control positivo) a la placa de 2 µl/cavidad. Se agregaron monómeros de 1 ml de preparaciones usadas calentadas a las cavidades • a una concentración única (ya sea sin diluir [es decir, dilución de ensayo final 1:4] o hasta una dilución 1: 100 [dilución de ensayo final 1:400]). Como un control positivo, en lugar de proteina de monómero, se agregó 2 µl/cavidad de rhHGF sin etiquetar (Prepo Tech) a la placa como una curva de concentración de doce puntos partiendo con 400 nM (es decir, 100 mM de concentración de ensayo final) y después de diluciones seriales 1:4 después de esto con el último punto como únicamente amortiguador. En segundo lugar, se agregó 4 µl/cavidad de c-MET ECD/Fc a 0.6 nM (es decir, 0.3 mM de concentración de ensayo final) a la placa. Nótese que el resto del ensayo se realizó en tenue o luz verde filtrada como perlillas de AlphaScreen que son sensibles a la luz. En tercer lugar, se agregó 2 µl/cavidad de una mezcla de bn-HGF a 1 nM (es decir, 0.25 mM de la concentración del ensayo final) y "perlillas donadoras" de estreptavidina AlphaScreen y "perlillas aceptoras de la Proteína A (PerkinElmer) ambas diluidas a 40 µl/ml (es decir, 10 µl/ml de concentración del ensayo final) a la placa. La placa de ensayo después se cubrió con topseal y se giró hacia abajo por ~ 30 segundos a 800 rpm. La placa después se incubó durante la noche en la oscuridad a temperatura ambiente y se leyó al siguiente día en un lector de Placa de Fusión (PerkinElmer) .

VI. Muítimerización y recombinación de monómeros seleccionados que exhiben al fago Los monómeros que se ha subclonado en pEve (pEve/monómero) se multimerizaron en la siguiente manera. Los plásmidos pEve/monómero (individualmente o en combinaciones) se digirieron con ya sea BsrDI o Bp l (NEB) . Los fragmentos ~1.1 kb BsrDI y ~2.9 Bpml se aislaron de geles de agarosa al 1% y se purificaron con columnas de giro QIAquick Qiagen. Las combinaciones de cada uno de los dos fragmentos se ligaron usando ligasa ADN T4 (NEB) ; subsecuentemente, la ligación se purificó con una columna de giro QIAquick Qiagen. Usando los cebadores VS-For y EveNut descritos en la anterior sección de subclonación del fago, las secuencias que codifican el multímero se amplificaron por PCR de la ligación. Los productos PCR se purificaron y se digirieron con Sfil (NEB) , seguido por ligación con pEve y transformación de E. coli BL21 (DE3) . Este método creó dímeros comprendidos de diferentes combinaciones de los monómeros de partida. Este método se puede también usar para generar otros multímeros, tales como trímeros. Cuando se elaboran los trímeros, las combinaciones de pEve/dímeros (por ejemplo, en el ejemplo anterior) y pEve/monómeros (la colección de partida) son los materiales de partida. Se procesan como anteriormente. Un procedimiento de biología molecular similar a aquel descrito abajo para elaborar "bibliotecas andadoras" también se usa para generar multímeros. En todos los casos, las proteínas se expresaron, purificaron y seleccionaron como anteriormente. Bibliotecas adicionales, referidas como "bibliotecas andadoras", se generaron por monómeros seleccionados que exhiben el fago de ligación (es decir, monómeros seleccionados) con la representación completa de una biblioteca de monómero naive. Estas bibliotecas se construyeron en la siguiente manera. Se usó PCR para amplificar en dos reacciones separadas: a) las secuencias codificantes de los monómeros seleccionados con pETF (ACCCGTATGATGTTCCGGATTA) /pETB2r (GATGTATTCGGCCCCAGA GGCCTGCAATGAC) ; y b) las secuencias codificantes de los monómeros naive en una biblioteca del monómero con 21newl (GAAATTCACCTCGAAAGCAA) /23 (ATGGGTTCCTATTGGGCT) . Los productos -200 pb se aislaron de un gel de agarosa al 3% y se purificaron con columnas de giro QIAquick Qiagen. Cada producto de (a) y (b) anteriores se digirió con ya sea BsrDI o Bpml (NEB) en reacciones separadas. Los monómeros Bpml digeridos tiene un sobresaliente el cual puede ser ligado a monómeros BsrDI digeridos. Los productos de digestión purificados se ligaron a otro usando ADN T4 ligado (NEB) . La ligación del monómero naive BsrDI-cut con monómeros Bpml-cut seleccionados genera una biblioteca de dímero andadora comprendida de monómeros naive N-terminal fusionados a monómeros seleccionados C-terminal. La ligación de monómeros naive Bpml-cut con monómeros BsrDI-cut seleccionados genera una biblioteca de dímero andadora comprendida de monómeros naive C-terminal fusionados a monómeros seleccionados N-terminal. Se usaron cebadores pETF/pETB2r para amplificación por PCR las secuencias que codifican el dímero ligado de la ligación, y los productos purificados se digirieron con Sfil seguido por Xmal. Los productos digeridos se ligaron al vector ÍUSE5HA del fago para la generación de una "biblioteca andadora" del dímero que exhibe el fago, típicamente con 108-109 únicos elementos. Se puede generar una "biblioteca andadora" del trímero (o multímero largo) en una forma similar, excepto que los materiales de partida son dímeros (o largos) y monómeros naive. Las bibliotecas andadoras se seleccionaron por inmovilización contra c-MET ECD/Fc y se seleccionaron como se describe anteriormente.

VII. Caracterización de monómeros purificados en ensayos de enlace y competición Una vez que las proteínas se caracterizaron en el nivel lisado de proteína calentada, los mejores monómeros se escogieron para caracterización adicional. Los cultivos a gran escala de clones individuales se prepararon y los monómeros, los cuales portan un extremo 6His, se purificaron vía resina Ni-NTA. Estos monómeros purificados por níquel se ensayaron en ELISA de enlace y el ensayo de competición AlphaScreen. Los datos de la secuencia de proteína y datos bioquímicos de caracterización de monómeros purificados son en las Tablas 1 y 2. Purificación de Proteina en 500 ml de Cultivos para NiNTA: (Día 1) En un tubo de cultivo de 15 ml que contiene 3 ml de 2xYT + 40 µg/ml de canamicina, se inoculó la solución base de glicerol archivada en "cavidad primaria de golpe" apropiada. Los cultivos se sacudieron a 300 rpm a 37°C. (Día 2) Se inoculó 2 ml del cultivo durante la noche en matraz sacudido Erlenmeyer ÍL que contiene 500 ml de 2xYT + 40 µg/ml de canamicina. Los cultivos se hicieron crecer con agitación a 375 rpm a 37°C hasta se alcanzó un OD6oo de aproximadamente 0.8-1.0. Una vez que se alcanzó el OD6oo deseado, los cultivos se inducen con 1 mM de concentración final de IPTG por 3 horas mientras se agitó a 375 rpm. Después de 3 horas de inducción, 500 ml del cultivo se transfirieron a un tubo de autoclave Sorvall/limpio y se centrifugó por 8 minutos a 8000 rpm a 4°C a células de pelotilla. Una vez que las células se convirtieron en pelotilla, se removió lo sobrenadante y se desecho, y se agregó 20 ml de amortiguador de sonicación (sacarosa al 10%/20 mM de Tris [pH 7.5] /150 mM de NaCl/0.2 mM de CaCl2) a cada tubo. La pelotilla se resuspendió en amortiguador de sonicación con pipeta serológica de 10 ml hasta que los paquetes no son visibles, y después las células suspendidas nuevamente (~ 30 ml) se trasfirieron en Tubos Oakridge de 35 ml y se sonicaron por 8 minutos a ~16 de energía de salida. Después de la sonicación, los Tubos Oakridge calientes que contienen células sonicadas se colocaron en baño hielo/agua por ~10 minutos para enfriarlos. Una vez enfriados, los tubos se centrifugaron por 30 minutos a 18,000 rpm a 4°C para células usadas de pelotillas. Mientras las células que contienen células usadas se centrifugaron, se lavó la resina NiNTA (Qiagen) con agua Milli-Q para remover etanol. Se usó 3 ml de resina NiNTA/proteína diluida a 1:1 (es decir, actualmente se usó 1.5 ml de resina/proteína). Se agregó 3 ml de mezcla resina/agua a un tubo con tapa de rosca de 50 ml limpio apropiadamente etiquetado (con proteína ID) . Después las células sonicadas se hicieron pelotilla, lo sobrenadante de la proteína se removió y se agregó a un tubo de 50 ml que contiene 1.5 ml de la resina NiNTA lavada. Se permitió enlazar la proteína a la resina NiNTA balanceándolo suavemente por 0.5 horas @ TA. Después de la inoculación con resina NiNTA, los tubos de 50 ml se centrifugaron con NiNTA se enlazaron a la proteína por 10 minutos a ~1500 rpm. Lo sobrenadante se vertió suavemente y se desecho.

Se transfirieron la resina NiNTA + proteína de enlace a columnas Clontech de 15 ml apropiadamente etiquetadas agregando 1 ml del Amortiguador Lavado NiNTA (20 mM de Tris [pH 7.5], 200 mM de NaCl, 0.1 mM de CaCl2, 20 mM de imidazol) a un tubo de 50 ml que contiene resina, girados para resuspenderlo, después se pipeteó la mezcla en una columna la cual se ha montado en un colector a vacío. La resina NiNTA + proteína de enlace se lavó con al menos 10 volúmenes de columna (15 ml) del amortiguador lavado NiNTA. 15 columnas que contienen resina NiNTA + proteína de enlace y proteína lavada se transfirieron a tubos de colección de tapa de rosca de 15 ml limpios. Se agregó 4 ml de amortiguador de elución Ni (20 mM de Tris [pH 7.5], 200 mM de NaCl, 0.1 mM de CaCl2, 200 mM de imidazol) a cada columna para eluir la proteína en el tubo de colección de 15 ml . Después se dejó eluir por gravedad. La proteína eluida se trasfirió al cásete lyzer-A dividido (corte MW apropiado para monómeros que usan 3.5 kDa de corte y para dímeros y trímeros que usan 10 kDa de corte) usando aguja calibre 18.5 y jeringa 5 ml para cargar el cásete. Lyzers-A dividido que contiene proteínas eluidas se colocaron en amortiguador de diálisis durante la noche que contiene reactivos redox (20 mM de Tris [pH 7.5], 100 mM de NaCl, 1 M de CaCl2, 1 mM de 2-mercaptoetanol, 0.25 mM de 2-hidroxietildisulfuro) .

(Día 3) Casetes Lyzer-A dividido que contiene proteínas dializadas durante la noche se transfirieron en amortiguador de diálisis son redox (20 mM de Tris [pH 7.5], 100 mM de NaCl, 1 mM de CaCl2) . Después de 3 horas de diálisis, los casetes lyzer-A divididos se transfirieron en TBS/CaCl2 fresco sin redox por otras 3 horas. Después la 2aa diálisis cambia, las proteínas se removieron de los casetes lyzer-A divididos usando una aguja de calibre 18.5 y una jeringa de 5 ml, y la proteína se transfirió por filtrado usando un filtro de jeringa de 0.2 micrones en un tubo de polipropileno de 15 ml apropiadamente etiquetado. Las proteínas purificadas NiNTA anti-c-MET, las cuales se seleccionan como los "inhibidores mejores" en ensayos de competición AlphaScreen, se purificaron adicionalmente por intercambio aniónico Q-Sefarosa para remover contaminantes. Purificación Q-Sefarosa: Se agregó 1 ml de Resina de Flujo Rápido Q-Sefarosa (Amersham Biosciences) a una columna Clontech de 15 ml . Se equilibró la resina con 15 volúmenes de columna (o 15 ml) de 20 mM de Tris [pH 7.5], 50 mM de NaCl, 1 mM de CaCl2. Se agregó 2 ml (~ 5 mg) de proteína NiNTA purificada filtrada a la resina y la proteína se dejo enlazar a la resina por gravedad. Se colectó a través de flujo en una primera columna de la placa de 96 cavidades. La columna cargada con proteína se transfirió en un tubo de colección de 15 ml y se lavó la resina/proteína de enlace con 10 volúmenes de columna (o 10 ml) de 20 mM de Tris [pH 7.5], 50 mM de CaCl, 1 mM de CaCl2. Una vez lavada, se saturó la elución del gradiente NaCl de la proteina. La concentración de NaCl es variada n gradiente como sigue: 100 mM, 150 mM, 200 mM, 250 mM, 300 mM, 350 mM, 400 mM, 500 mM y finalmente 1 M de NaCl, a una base de 20 mM de Tris [pH 7.5], 1 mM de CaCl2. Las fracciones se colectaron en un placa de polipropileno de cavidad profunda de 96 cavidades de 2 ml/fracción, en incrementos de 1 ml . Las fracciones que contiene proteína se probaron por Bradford y analizado por SDS PAGE. Las fracciones se probaron en ELISA de enlace y ensayos de competición como se describe anteriormente con el siguiente cambio. La proteína de preparaciones NiNTA purificadas de 500 ml o preparaciones NiNTS + Q-sefarosa purificada se agregaron a la placa como una curva de concentración de doce puntos partiendo con una primera dilución 1:5 a 1:100 y después diluciones seriales 1:4 después de esto con el último punto como amortiguado único. LOs datos de secuencia de proteína y datos bioquímicos de la caracterización de monómeros purificados son en las Tablas 1 y 2.

Tabla 1. Secuencias de Monómero Recombinado (Rec) y Avimer anti-c-MET. Nótese que algunas proteínas de la biblioteca del monómero recombinante son dímeros . Tabla 2. Monómero anti-c-MET u Monómero Recombinante Enlazado a Kd y Datos IC50 Bioquímicos. Nótese que algunas proteínas aisladas de la biblioteca del monómero recombinado son dímeros (indicada en la Tabla 1) . Las entradas en blanco indican datos no disponibles.

Ejemplo 7 Este ejemplo describe experimentos que demuestran la inhibición de proliferación celular de HGF inducida por monómeros c-MET enlazantes. El HGF es un estimulador potente de proliferación celular epitelial. El uso de células de adenocarcinoma de pulmón humano A549 en ensayos de proliferación de HGF inducido para demostrar la eficacia de HGF y/o inhibidores c-MET es bien establecido en la técnica. Para los propósitos de estos experimentos, un clon de célula única de la línea celular A549, llamada A549-SC, se dividió por dilución limitante. El clon A549-SC se seleccionó en base a su respuesta de difundir la célula fuerte en la presencia de HGF. Las células A549-SC se colocaron en placas de 96 cavidades revestidas de colágeno (lxlO4 células/cavidad) en 100 µl de medio F-12 libre de suero por cavidad, Después se incubaron por 48 horas a 37°C en C02 al 5%. Después de 48 horas, el medio se removió de la cavidad y se reemplazó con diluciones del monómero, en un volumen de 50 µl de medio F-12 libre de suero por cavidad. Después de 1 hora de incubación a 37°C en C02 al 5%. Se agregó 50 µl de medio F-12 libre de suero complementado con 40 ng/ml de HGF humano recombinante, para dar una concentración final de 20 ng/ml de HGF, el EC50 para HGF. Las placas se incubaron por unas 48 horas adicionales a 37°C en C02 al 5%, después se pulsó con 2 µCi de metiltimidina titulada por cavidad por unas 15 horas adicionales. Después de pulsar, el medio se removió y se colocó con 200 µl de tripsina al 0.05% por cavidad, y las placas se incubaron a 37°C por 5 minutos. Las células etiquetadas después se cosecharon por un filtro de fibra de vidrio usando un Cosechador 96 Tomtec. La etiqueta incorporada después se midió por conteo de escintilación. Una fusión recombinante del dominio extracelular de c-MET humano con dominio Fc de inmunoglobulina (c-METFc) se usó como un control positivo en estos experimentos (R&D Systems) . Una titulación de c-METFc se mezcló con HGF humano recombinante a una concentración final de 20 ng/ml de HGF y se incubó a 37°C por 1 hora. Esta mezcla de c-METFc de HGF después se agregó a células A549-SC deficientes de suero en una placa de 96 cavidades. Estas células después se procesaron en la misma forma como aquellas tratadas con los monómeros o multímeros. La figura 9 muestra una comparación entre c-METFc, un monómero c-MET específico (M26) y un dímero c-MET específico (RM12; RecM12) con respecto a sus capacidades relativas para bloquear la proliferación inducida por HGF de células de adenocarcinoma de pulmón humano A549-SC deficiente de suero. El IC50 para el dímero RM12 es 0.32 nM. El IC50 para c-METFc es 1.73 nM. (n=3 para todos los puntos de datos) . El monómero M26 mostró actividad inhibitoria poco detectable en este ensayo basado en células. Este ensayo proporciona un medio para seleccionar monómeros o multímeros para actividad anti-c-MET en un bioensayo en vito usando células humanas. Para determinación de valores IC50 para multímero o monómeros probados, se pueden identificar moléculas opcionales y clasificar en las bases de su actividad biológica.

Ejemplo 8 Este ejemplo describe experimentos que demuestran el monómero enlazado a una línea celular humana que expresa C-MET . Los monómeros se construyeron para incluir un extremo de epítope de hemaglutinina de influenza (HA) . Esto habilita al monómero a ser usado como un agente de detección de citometría de flujo primario, con anticuerpo secundario anti-HA de extremo fluorescente siendo usado como el agente de detección secundario. Se probaron 15 monómeros seleccionados por selección por inmovilización contra c-MET para la capacidad a enlazar células de adenocarcinoma de pulmón humano A549, una línea celular que expresa c-MET. Las células T Jurkat se usaron como una línea celular de control c-MET negativo.

Las células A549 adherentes se cosecharon de placas de cultivo de tejido usando 10 mM de EDTA en salina amortiguada fosfatada (pH 7.4). Las células T Jurkat se removieron del medio de cultivo por centrifugación. Para determinaren enlace del monómero, se tiñeron 2.5xl05 células con 10 µM del monómero c-MET en 100 µl de amortiguador de teñido de citometría de flujo ("amortiguador FACS" PBS pH 7.4, suero de bovino fetal al 5%, azida de sodio al 0.01%) en hielo por 30 minutos. Las células se lavaron una vez con 4 ml de amortiguador FACS enfriado en hielo, después se resuspendió en 100 µl de amortiguador FACS más 0.2 µg del anticuerpo monoclonal anti-HA de FITC conjugado (Santa Cruz Biotechnology) y se incubó en hielo por 30 minutos. Las células se lavaron una vez con 4 ml de amortiguador FACS enfriado en hielo, después se resuspendió en 200 µl de amortiguador FACS y se analizó usando Citometría de Flujo FACSCalibur (BD Biosciences) . Los datos se colectaron y se analizaron usando CellQuest Pro (BD Biosciences) . La fluorescencia media geométrica se determinó por células tanto A549 como T Jurkat, y se normalizó contra la fluorescencia media geométrica para la línea celular teñida con anticuerpo monoclonal anti-HA FITC conjugado solo. Lo siguiente ilustra el enlace preferencia de monómeros c-MET específicos a las células A549 c-MET positivo en lugar de las células T Jurkat c-MET negativo.

Estos datos muestran que los monómeros anti-c-MET se enlazan a adenocarcinoma de pulmón humano A549, una línea celular positivo c-MET, pero no a células T Jurkat, una línea celular c-MET negativa. Esta citometría de flujo basada en métodos que tiene utilidad en monómero específico confirmado enlazado al objetivo en el contexto de otras proteínas de superficie celular. Además de demostrar que los monómeros se enlazan a c-MET negativo, este método también muestra que los monómeros exhiben poco o nada de enlace especifico a células.

Ejemplo 9 Este ejemplo describe experimentos diseñados para mostrar inhibición de monómero de la proliferación de la célula inducido por HGF. El HGF se identificó como "factor de proliferación", que induce un fenotipo de motilidad en células epiteliales. En adición de HGF, las agrupaciones de célula epitelial se rompe a parte, y las células migran lejos de algún otro, o proliferan. Un clon de célula única de adenocarcinoma de pulmón humano A549 (llamado A549-C) se aisló por dilución limitada en las bases de agrupaciones firmes formadas las cuales proliferan sobre el curso de 24 horas, después de la adición de HGF de humano recombinante. Este clon se usó en todos los experimentos subsecuentes. Se colocaron A549-SC a 25 células/cavidad en una placa de 96 cavidades en medio F12 complementado con FBS al 10%. Las células se cultivaron hasta que agrupaciones de 20 a 30 células fueron visibles, aproximadamente 4 días. Después de 4 días, el medio se removió de las células, y se reemplazaron con diluciones de monómero en un volumen de 50 µi/cavidad de medio F-12 libre de suero. Además, se usó una proteína de fusión recombinante del dominio extracelular de c-MET humano con dominio Fc de inmunoglobulina (c-METFc) como un control positivo en estos experimentos (R&D Systems) . Después de 1 hora de incubación a 37°C en C02 al 5%, se agregó 50 µl por cavidad de 40 ng/ml de HGF recombinante en medio F12 libre de suero, para dar una concentración final de 20 ng/ml de HGF. También se incluye HGF que carece de cavidades de control. Las placas después se inocularon por 24 horas a 37°C en C02 al 5%. Después de 24 horas, el medio se removió de las placas, y las células se fijaron con metanol al 100% por 15 minutos a temperatura ambiente, y después se tiñó por 1 hora a temperatura ambiente con violeta cristal al 0.2% en etanol al 30%. Las células teñidas se lavaron con salina amortiguada de fosfato, y después se fotografío. Veinte ng/ml (aproximadamente EC50) del ligando c-MET induce una respuesta de proliferación celular en células A549-SC; un monómero de especificidad irrelevante (control negativo) como se espera no inhibe esta respuesta de proliferación. En contraste, tanto 0.5 µM de c-MET-Fc (control positivo) como 1 µM de un monómero Avimer anti-c-MET parcialmente inversa a la respuesta de proliferación inducida por HGF. Estos datos ilustran que un monómero anti-c-MET puede inhibir la respuesta de proliferación por al menos una magnitud similar como una concentración comparable de un inhibidor c-MET-Fc de control positivo. c-MET enlazado a monómeros y dimeros Lo siguiente proporciona un resumen de los monómeros c-MET identificados, agrupados por homología de secuencia. Hay 10 familias, en donde los elementos de la misma familia tienen secuencias relacionadas. La información puede ser resumida como sigue. Las secuencias en corchetes ("[]") indican aminoácidos alternos en una posición única.

Porción para las 10 familias: Secuencias consenso de familia (periodos (".") indican cualquier aminoácido; el espaciado es solamente para propósitos de alineación. Una fila incluye un polipéptido contiguo) : Fam 1 c... [eq]f .c. st.r c[iv] ... .cdgdndced. sde. Fam 2 c.... [eq]fec. st.r c[iv] ... . cdg. ndced. sde . Fam 3 c.... [eq]f.c. st.r c[ilv]p.. w.cdg..dced.sde.. Fam 4 c... [eq]fqc. st.r c[iv] p.. .cdg.ndcedssde..c Fam 5 c.... [eq] f .c. .... c[ilv] ... de. d. sde. Fam 6 c... [eq] f . c. stgr c. p.. w.c.g.ndced. sde. Fam 7 c . [eq]f .c. st.r c[ilv] ... . c.... dc.d. sd c. Fam 8 c... [eq]f .c. .... c[ilv] ... w. cdg.nde. d. s . e.... c Fam 9 c.... [eq]f .c. st.r c[ilv]p.. w.c.g..dc.d. sde. Fam 10 c.... [eq]f .c. .... c[ilv] ... w.cdg..dc.d. sde. Dominios naturales A: c( . ) ... . f.c. ...(.) c[ilv]. . cd...de. d. sde. ( .. )c Biblioteca Al: C. (.) f.c. . • * . ..cdg..dc.d. sde. • (. • )c a I P 11 dp P q 1 s wr en s k V v vd Basado en la alineación de la familia 10, la invención proporciona polipéptidos que comprenden dominios de monómero que se originan de forma no natural que se enlazan a c-MET y que tiene la secuencia GR o KR inmediatamente precedente a la tercera cisteína en un andamiaje del dominio A. Detalles de cada una de la familia c-MET de enlace es como sigue. Los guiones ("-") son insertados para propósitos de alineación y no representan posiciones en las proteínas.

Faml CAPSEE CNSTGRCIPQEWVCDGDNDCEDSSDEAPD CASAAPT CAPSEFTCNSTGRCIPQEWVCDGDNDCEDSSDEAPDLCASAAPT CAPSEFTCNSTGRC1PQEWVCDGDNDCEDSSDEAPDLCASAAPT CAPSEFTCNSTGRCIPQEWVCDGDNDCEDSSDEAPD CASAAPT CAPSEFTCNSTGRCIPQEWVCDGDNDCEDSSDEAPDLCASAAPT CAPSEFTCNSTGRCIPQEWVCDGDNDCEDSSDEAPDLCASAAPT CAPSQFTCNSTGRCIPQEWVCDGDNDCEDSSDEAPDLCAIAAPT CLANEFTCRSTGRCIPQT VCDGDNDCEDSSDEAPDLCASAAPT CESNEFQCRSTNRCIP QWVCDGDNDCEDSSDEAPDLCASAAPT CESNEFQCSSTGRCIPQAVCDGDNDCEDSSDEAPDLCASAAPT CRANEFQCHSTGRCIPASW CDGDNDCEDSSDEAPDLCASAAPT CEPNEFQCRSTGRCISLAWVCDGDNDCEDSSDEAPALCKASVPT CPASEFTCRSTGRCISQGWVCDGDNDCEDSSDESPAICATTGPT CPAGQFTCRSTNRCIPLQ VCDGDNDCEDSSDESPAICATTGPT CPASQFTCRSTDRCIPLAWVCDGDNDCEDSSDESPEICSAPASEPPG CQASQFTCRSTGRCIPLDWVCDGDDDCEDGSDESPEICAAPAPT CESNEFQCRSTGRCVPLSWVCDGDNDCEDGSDESPAICKTPGHT CESNEFQCHSTGRCIPQAW CDGDNDCEDSSDEAPAICKTPGHT CRSNEFTCRSTERCIPLGWVCDGDNDCEDSSEEAPXIRKTPGHT CPANEFKCHSTGRCISLAWVCDGDNDCEDSSDEKS—CRGPGHT Fam2 CQSFTEFECHSTGRCIPLQWVCDGDNDCEDSSDESP ATCATPGHT CQSFTEFECHSTGRCIPASWLCDGDNDCEDSSDESP ANCATPAHT CQSFTEFECHSTGRCIPVEWLCDGDNDCEDSSDEA AICKTPGHT CQSFTEFECHSTGRCIPASWLCDGDNDC?DSSDE EGCEAAAPT CQSFTEFECH?TGRCIPVDWLCDGDNDCEDSSDE KDCKQ--HT CQSFTEFECHSTGRCIPVDWLCDGDNDCEDSSDE KDCKQ—HT CQSFTEFECHSTGRCIPRTWLCDGDNDCEDSSDE KDCKQ—HT CQSFTEFECHSTGRCIPVDWLCDGDNDCEDGSDE KSCPA—HT CQSFTEFECHSTGRCIPVDWLCDGDNDCEDSSDE KNCQP—PT CRPTAEFECHSTGRCIPVDWLCDGDNDCEDSSDE KNCKA--HT CRPIAEFECHSTSRCIPRTWLCDGDNDCEDSSDE ANCQP—PT CHPTAEFECNSTGRCVSADWLCDGDNDCEDGSDESP A CK—APT CHPTAEFECNSTGRCVSADWLCDGDNDCEDGSDESP ALCK—APT CHPTAEFECNSTGRCVSADWLCDGDNDCEDGSDESS APCETTGPT CHPTSEFECRSTARCIPLTWVCDGDNDCEDSSDEK HCQPP— CHPTSEFECRSTARCIPLTWVCDGDNDCEDSSDEAP AICKTPGHT CHAPTQFECRSTNRCIPLQWVCDGDNDCEDSSDE TGCAK—PT CHTPTQFECRSTGRCIPLEWLCDGDNDCEDSSDE TGCAK—PT CHAPTQFECRSTGRCIPLQWVCDGDNDCEDSSDES LATCQQ—HT CNAPNQFECRSTSRCIPLGWVCDGVNDCEDSSDE TDCQE--PT CHAPTQFECRSTGRCIPRDWVCDGDNDCEDSSDE SCGAPG—PT CQASDQFECKSTGRCIPLAWRCDGDNDCEDGSDESPAICGRPGLEASG—GS CQASDQFECKSTGRCIPLAWRCDGVNDCEDGSDE AGCAASG--PT CQASDQFECKSTGRCIPLDWLCDGVNDCEDSSDE ALENCA-QHT Fam3 CG-SSEFQCHSTGRCIPENWVCDGDDDCEDSSDEK--SCTSAAPT CG-SSEFQCHSTGRCIPENWVCDGDDDCEDSSDEK—SCTSAAPT CG-SSEFQCHSTGRCIPENWVCDGDDDCDDSSDEK—SCTSAAPT CE-SNEFQCQSTGRCIPRTWVCDGDNDCEDSSDEK—SCTTPAPT CE-SNEFQCRSTGRCVPVAWVCDGDNDCEDSSDET—GCKAPT CE-SNEFQCRSTGRCVPVAWVCDGDNDCEDSSDET—GCAKPT CE-SNEFQCRSTGRCVPVA VCDGDNDCEDSSDEK—NCKAHT CE-SNEFQCRSTGRCVPVAWVCDGDNDCEDSSDEK—NCKAPT CE-SNEFQCRSTGRCVPVAVCDGDNDCEDSSDEK—DCSAPASEPPGSL CE-SNEFQCRSTGRCVPVAWVCDGDNDCEDSSDEA—NCGDSHILPFSTPGPST- CE-SNEFQCRSTGRCVPVAWVCDGDNDCEDSSDEK--DCGDSHILPFSTPGPST- CE-SNEFQCRSTGRCIPVSWVCDGDNDCEDSSDEA—SCGDSHILPFGTPGPST- CE-SNEFQCRSTGRCVPVAWVCDGDNDCEDSSDEA--SCG APGPT-- CE-ASEFTCRSTNRCIPVDWVCDGDNDCEDSSDEK—GCGDSHILPFSTPGPST- CE-ASEFTCRSTNRCIPVDWVCDGDNDCEDSSDEK--GCGDSHILPFSTPGPST- CE-ASEFTCRSTNRCIPQDWVCDGDNDCEDSSDEK--GCGDSHILPFSTPGPST- CE-ASEFTCRSTNRCIPLQWVCDGDNDCEDSSDEA--NCGDSHILPFSTPGPST- CP-AGQFTCRSTNRCIPLQWVCDGDNDCEDSSDEA—NCGDSHILPFSTPGPST- CE-ASEFTCRSTNRCIPAN VCDGDNDCEDSSDEA—NCGDSHILPFSTPGPSX- 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CRA-NEFQCHSTGRCIPASWLCDGDNDCEDSSDE—KGCGDSHILPFXTPGPST CRA-NEFQCHSTGRCIPAS LCDGDNDCEDSSDE--TGC AKPT- CRA-NEFQCHSTGRCIPASWLCDGDNDCEDSSDE—TGC AKPT- CRA-NEFQCHSTGRCIPASWLCDGDNDCEDSSDE—TGC AKPX- CRA-NEFQCHSTGRCIPQT LCDGDNDCEDGSDE—AGC AASGPT- CEA-NEFQCQSTGRCIPLN LCDGDNDCEDGSDE— NCG TPGPT- CEA-SEFTCRSTDRCIPLE LCDGDNDCEDGSDEAN—CG AAART- CQS-SEFTCKSTNRCIPLAWLCDGVNDCEDGSDEAN—CT SPERT- CRS-SEFTCRSTSRCIPENWLCDGVNDCEDGSDETG—CG TSAPT- CRS-SEFTCRSTSRCIPEN LCDGVNDCEDGSDET —CG TSAPT- FamlO -CQA-GQFECRSTNRCIPQDWVCDGVNDCEDSSDEE SCTSPART -CQA-GQFECRSTNRCIPQD VCDGVNDCEDSSDEE SCTSPART -CQA-GQFECRSTNRCIPQD VCDGVNDCEDSSDEE SCTSPART -CQA-GQFECRSTNRCIPQDWVCDGVNDCEDSSDEE SCTSPART -CQA-GQFQCRSTNRCIPQDWVCDGVXDCEDSSDEE RCTSPART -CPA-GQFQCRSTNRCIPQD VCDGVNDCEDSSDEE SCTSPART -CEA-NQFRCKSTSRCIPQNWLCDGVNDCEDSSDEE NCTRTAPT -CEA-DEFRCRSTGRCISVD RCDGVSDCEDSSDEE SCESTAPT -CEA-GEFRCKSTDRCIPLAWRCDGVNDCEDSSDEA SCKSSAHT -CLA-NEFTCRSTGRCIPRTWRCDGVNDCEDGSDEA NCKKPT— -CLA-NEFTCRSTGRCIPRTWRCDGVNDCEDGSDEA NCKKPT— 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-CAS-NQFRC-RNGRCIPLPWVCDGEDDCQDNSDE ASCAAPAPT -CAS-NQFRC-RNGRCIPLP VCDGEDDCQDNSDE ASCAAPAPT -CVA-DEFPCGN-GNCIPLPWRCDGDDDCGDNSDE TDCESSXPT -CPP-DEFPCSNSGICIPRS RCDGEDDCGDNSDE EDCTSAGHT -CAP-NEFPCGN-GRCIPATWLCDGDNDCGDNSDE EGCGGSART -CPP-SEFPCGN-GSCVPQAWVCDGDPDCPDNSDE EGCTGTGPT -CPP-DEFRCNN-GKCIPLS RCDGDDDCQDSSDE AGCT—ERT -CXP-GEFQC-NNGRCIPATWLCDGDDDCGDNSDE TGCTEHT— -CXP-GEFQC-NNGRCIPATWLCDGDDDCGDNSDE TGCTEHT— -CQS-NEFQC-NNGRCISVTWLCDGDDDCGDSSDE TDCTSAVPT -CPS-SEFQCRNNKTCIPRN LCDGEDDCGDSSDE TDCTTHT-- -CVP-GEFRCHDSGTCVPLAXLCXGDNDCGDNSDE ASCESSEPT -CAP-GQFRCKN-GRCVPLSWVCDGDDDCEDDSDE ANCESPEPT -CAA-DQFRCSS-GRCVPLTWLCDGDDDCADDSDE KDCESTAHT -CAA-DEFQCNSTGRCIPVS VCDGEDDCRDDSDE ENCRSSEPT -CLA-GEFRCNS-GRCIPEHWRCDGEDDCLDSSDE KDCTTSEPT -CX-AXQFTC-DNGQCLFQNWVCDGENDCPDXSDE KNCAPHT— -CX-SSXFRC-XNGXCLPLX VCDGENDCGDXSDE XXC -CV-ADQFRC-DNGRCLSREWVCDGVNDCQDGSDE TNCQERT— -CA-AGEFRCRDSGRCLPQH LCDGENDCADGSDE TNCTQHT— -CX-PSEFTC-SSGQCIPED VCXGXNDCGDDSDE TNCETRT— -CV-ANEFKC-GSGKCIPETWVCDGDNDCGDGSDE ASCAQPT— -CG-ANEFKC-SSGSCIPQEWRCDGENDCGDNSDES— APCKEPT— -CR-ADEFKC-GNGHCIPGQ LCDGENDCQDGSDE KSCEQPT— -CL-PNQFQCQSSGRCIPLN LCDGDDDCGDDSDE TSCKAPT— -CP-ASEFQCGN-GRCISEHWLCDGDNDCGDNSDE TSCKAPVPT -CQ-ADEFQCRNTEKCLPLN LCDGDNDCGDDSDE TSCATPT— -CVA-SEFTCKDTDRCIPLHWVCDGVDDCGDNSDEAD CETSVHT -CEA-NEFRCQSTDRCIPASWVCDGVDDCEDGSDEKS CTTSGHT -CEA-SEFTCNSTGRCLPLTWVCDGVNDCEDGSDEKS CTTSVRT -CAP-NEFTCSSTGRCLPRAWVCDGVDDCEDGSDETS CGATVHT -CGA-NEFTCQSTNRCIPQS VCDGVNDCEDGSDESPV—LCATTVHT -CQP-DEFRCRSTGRCLPQEWLCDGVNDCEDSSDEAD CGTSAHT -CAP-GEFPCRSTGRCIPQT VCDGVNDCEDSSDEKS CATAEHT Los dominios de monómeros de la Fam 10, pueden ser además, divididos en subfamilias (designadas "10A", "10B", etc.). Lo siguiente, lista las porciones consenso para las varias subfamilias: 10A CxxxEFQCNnGRCIPxxWLCDGDdDCGDxSDETxC 10B CPPxEFPCxNGxCIPxx xCDGDxDCxDNSDEEGCT 10C CxAgEFrCxxGRCiPLxWxCDGdDDCgDxSDExdCESS 10D CpsGEFRCSNGxCIpqx ICDGeDDCGDxSDExxCA 1OE CxADEFKCGNGrCIpxxWvCDGexDCGDdSDExsC Se generaron varias secuencias consenso de las subfamilias Fam 10: 10A-E CpaxEFxCxNGrCIPxxWxCDGddDCGDxSDExxC 1OA-E CxxxEFxCxNGxCIPxxWxCDGxdDCGDxSDExxC De este modo, los dominios de monómeros de enlace c-MET tienen un andamiaje de dominio A y comprenden la secuencia: EFXCX GXCIPXXWXCDGXDDCGDXSDE están abarcados por la presente invención. Lo siguiente, proporciona dímeros que se enlazan a c-MET, es decir, polipéptidos que comprenden dos o más dominios de monómeros, cada uno de los cuales se enlaza a c-MET. Las siguientes tablas cada una de familia de dímeros, representan porciones consenso basadas en la alineación de los elementos de la familia. Nótese que la designación "Fam", se refiere a familia de dímeros, las cuales son diferentes de las familias de monómeros listadas anteriormente.

Fam 1 CQASDQFECKSTGRCIPLAWRCDGDNDCEDGSDESPAICG RPGLEASGGSCRAN- EFQCHSTGRCIPASWLCDGDNDCEDGSDE-AS-CGRPGPGGTS APAA CRAN- EFQCHSTGRCIPAS LCDGDNDCEDSSDEAPDLCASAAPTSLQASGLEASGGSCHAPTQFECRSTGRCIPAA VC DGDNDCEDGSDESPAICGRPGLGXTSA—PAA -. CESG-EFQCHSTGRCIPAS LCDGDNDCEDGSDES-QLCT AHTCAPG- ^ EFQCHSTGRCIPAS LRDGDNDCEDGSDES-XLCTA-HX CRSN-EFTCRSTGRCIPRTWVCDGDNDCEDGSDESPAICGDSHILPFSTPGLEASGGSCP- AGQFTCRSTNRCIPLQ VCDGDNDCEDSSDEAN—CGDSHILPFSTPGPST CLAN-EFTCRSTGRCIPLQWVCDGDNDCEDSSDEK—GCGDSHILP GLEASXGSCX- XSQFXCRSTGRCIPAE VCDGDNDCEDSSDEAS—CGDSHILPFSTPGPST CASS-EFRCRSTGRCIPQR VCDGDNDCEDGSDET— CGDSHILPFSTPGLEASGGSCQ- TGEFRCRSTDRCIPAE VCDGDSDCEDGSDET —CGDSHILPFSTPGPST CASS-EFRCRSTGRCIPQR VCDGDNDCEDSSDEK—GCGDSHILPFSTPGLEASGGSCA- ADQFQCRSTGRCIPRTWLCDGVNDCEDGSDEPLALCSAPASEP PGSL CEAS-EFTCRSTNRCIPLQWVCDGDNDCEDSSDEK—GCGDSHILPFSTPGLEASGGSCG- SNQFTCRSTKRCITATWVCDGDNDCEDSSDE-TD-CSAPASEP PGSL CGSD-EFQCKSTSRCIPLT RCDGDSDCEDSSDEA— CGR PGLEASGGSCQ- SGQFQCXSTGRCIPRT VCDGDNDCEDSSDEK-N-CQ-P PT CESN-EFQCQSTSRCIPLT RCDGDNDCEDSSDEK—SCSAPASEP PGLEASGGSCP- ASEFTCRSTGRCISQGWVCDGDNDCEDSSDESPAICATTG PT Las secuencias consenso abajo, incluyen marcas de interrogación ("?"). Estas posiciones indican que pueden estar presentes o ausentes. s m ex c at pe o motivo ch cte r es d ? 1 C* 2 f. 10 c. [as] ..?[eq]f .c.st.rcip..w.cdgd.dced.sde..?.?.c..?.?.?. ?.?.?.?.?.? 6 5d .?.?.?.?.?.?.. [st]c..?..?[eq]f .c.st.rci...w[ilv] .dgdndced.sd?..?.?. i 1 10" c. [as] .. ?[eq]f .c.st.rcip..w.cdgd.dced.sde..?.?.c..?.?.?. ?.?.?.?.?.? 25 60 .?.?.?.?.?. ?ggsc..?..?[eq]f. c.st.rci...w[ilv] cdgdndced. sde..?.?.... 9 9. 10 c. [as] .. ?[eq]f .c[kr]st.rcip..w.cdgd.dced.sde..?.?.cg. ?.?.?. ?.?.?.?. 54 ?.?.?.?.?.?.? .?ggsc..?..?[eq] f .c.st.rci...w[ilv] cdgdndced. sde..?.?c ...?.?.?.?.?.?.?.?.?.?.?.?.?.? 7 10" c[ekqr] [as] .. ? [eq]f [eq]c.stgrcip. [as] w. cdgdndced. sde [as] . ?. ?[ilv]c. 7 3 70 .?.?.?."?.?.?.?.?.?.?.?.?.?.?.?.. [st] c ..?..? [eq] £ [eq] c . stgrcipa [as] w 1 [ilv] .dgdndcedgsde[as] .?.? ?.?.?.?.?.?.?.?.?.?.?.?.?.? 71 10 cgs . ?efqckstsrcipltwrcdgdsdcedssdea. ? . ?ncg.?.?.?.?.?.?.?.?.?.?.?.? 196 . ? . ? . ?ggscq. ?s . ?qfqc. stgrciprtwvcdgdndcedssdek. ? . ?cqp. ? .?.?.?.?.?.? 6 9 9 9 9 9 9 9 Fam 2 CXAXQFTCD-NGQCLPQNWVCDGENDCPDXSDEKN—C— APHTCPSGEFQCRSTNRCIPETWLCDGDNDCEDGSDEESCTPPT CQPGEFTCN-NGNCLPLEWVCDGENDCGDSSDEEN— CGGSEHTCPSGEFQCRSTNRCIPET LCDGDNDCEDGSDEESCTPPT CLAGEFRCN-SGRCIPEHWRCDGEDDCLDSSDEKD— CTTSEPTCPSGEFQCRSTNRCIPETWLCDGDNDCEDGSDEESCTPPT CPSGEFRC-SNGSCIPQEWGCDGXNDCGDDSDEKN— CAAAGPTCPSGEFQCRSTNRCIPKT LCDGDNDCEDGSDEESCTPPT CPSGEFRCQSSNTCIPLNWLCDGEDDCGDDSDEKN— CEASVPTCPSGEFQCRSTNRCIPET LCDGDNDCEDGSDEESCTPPT CASNQFRCR-NGRCIPLPWVCDGEDDCQDNSDEAS— CAAPAPTCPSGEFQCRSTNRCIPET LCDGDNDCEDGSDEESCTPPT CASNQFRCR-NGRCIPLP VCDGEDDCQDNSDEAS— CAAPAPTCPSGEFQCRSTNRCIPET LCDGDNDCEDGSDEESCTPPT CASNQFTCN-NGHCLPQHWRCDGEDDCGDNSDEAS—CQP— PTCPSGEFQCRSTNRCIPET LCDGDNDCEDGSDEESCTXXT CQADEFRCG-NGRCISPTWVCDGEXDCGDDSDEAN— CATTERTCPSGEFQCRSTNRCIPET LCDGDNDCEDGSDEESCTPPT CPPDEFKCG-NGHCISQT LCDGEXDCGDNSDEES—CAAP— TCPSGEFQCRXTNRCIPETWLCDGDNDCEDGSDEESCTPPT CPPDEFRCS-NGRCLPQPWVCDGEDDCGDGSDETS— CATTAPTCPSGEFQCRSTNRCIPET LCDGDNDCEDGSDEESCTPPT CVANEFKCG-SGKCIPETWVCDGDNDCGDGSDEAS—CAQPT— CPSGEFQCRSTNRCIPET LCDGDNDCEDGSDEESCTPPT 10 CGANEFKCS-SGSCIPQE RCDGENDCGDNSDESLAPCKEPT— CPSGEFQCRSTNRCIPETWLCDGDNDCEDGSDEESCTPPT CRADEFKCG-NGHCIPGQWLCDGENDCQDGSDEKS—CEQPT— CPSGEFQCRSTNRCIPET LCDGDNDCEDGSDEESCTPPT CVPGEFRCHDSGTCVPLAXLCXGDNDCGDNSDEAS— CESSEPTCPSGEFQCRSTNRCIPETWLCDGDNDCEDGSDEESCTPPT SC mat expe -11- or , , , motivo 15 ches cte 12 ^ 15 10"17 c... [eq]£.c.?.?...c[ilv] c.g..dc.d. sde...?.?..?.?.?.?.?.?. 15 [dn] [dn] ..[de] ... [de]e. 32 14 10*63 c... [eq]f .c.?.?...c[ilv] c.g..dc.d. sde...?. ?c. ?.?.?.?.?. ?cp 82 sgefqcr. tnrci [ekq] twlcdgdndcedgsdeesct ..t 3 3 oC11 ^ 13 10'66 c... [eq]f.c.?.?...c[ilv] ...w.cdg..dc.d. sde...?. ?c. ?.?.?.?.?. ?cp 85 sgefqcr. tnrci [ekq] twlcdgdndcedgsdeesc .. t 3 30 ^0 ^ 20 ^ 12 10"69 c... [eq]f .c.?.?...c[ilv] ...w.cdg..dc.d. sde...?. ?c. ?.?.?. ?.?.?cp 45 sgefqcr . tnrcip [ekq] twlcdgdndcedgsdeesctppt 2 288 O 11 10"70 c... [eq]f.c.?.?...c[ilv] ...w.cdge. c.d. sde...?. ?c. ?.?.?.?.?. ?cp 49 sgefqcr. tnrcipetwlcdgdndcedgsdeesctppt 26 ^ 10 10"72 c... [eq]f.c.?.?...c[ilv]p..w.cdg. [dn] dc.d. sde...?.?c. ?.?.?.?.?. 53 ?cpsgefqcrstnrcip [ekq] twlcdgdndcedgsdeesctppt 24 ^ Zl 9 10"74 c... [eq]f .c.?.?...c[ilv]p..w.cdge [dn] dc.d. sde...?.?c. ?.?.?.?.?. -^ ?cpsgefqcrstnrcipetwlcdgdndcedgsdeesctppt 5 21 8 10"75 c... [eq]f. c. ?.?. g. c[ilv]p.. w. cdge[dn] dc.d. sde...?.?c. ?.?.?.?.?. 95 ?cpsgefqcrstnrcipetwlcdgdndcedgsdeesctppt 6 10"77 c... [eq]£.c.?.?ng.c[ilv]p.. w[ilv] cdge [dn]dc.d. sde...?.?c. ?.?.?. 87 ? . ? . ?cpsgef qcrstnrcipetwlcdgdndcedgsdeesctppt 14 10"78 c... [eq]f .c.?.?ng.c[ilv]p.. vcdgefdn] dc.d. sde...?.?c.?.?. ?.?.?. 14 ?cpsge£qcrstnrcipetwlcdgdndcedgsdeesctppt 1 111 10 -80 cc.... [ [ddnn]] [[eeqq]]££[[kkrr]]cc..??..??nngg..cc[[iillvv]]pp....w[[iillvv]]ccddcge [dn] dc.d. sde. s. ?. ?c. 66 ?.?.?.?.?. ?cpsgef qcrstnrcipetwlcdgdndcedgsdeesctppt Fam 3 CPSG-EFQCRSTNRCIPET LCDGE-DDCGDSSDESLALCGRPGPATSAPAACP- SGEFQCRSTNRCIPETWLCDGDNDCEDGSDEESCTPPT l o CPSG-EFQCRSTNRCIPETWLCDGD—NDCEDGSDE ESCTPPTCP- PGFQCRSTNRCIPETWLCDGDNDCEDGSDEESCTPPTE CQSFTEFECHSTGRCIPAS LCDGD— DCEDSSDEE GCEAAAPTCP- SGFRCRXTXRCIPXTWLCDGDNDCEDGSXEESCTPPTE CRAN-EFQCHSTGRCIPAS LCDGD—NDCEDGSDE SQLCTAHTCP- SGFQCRSTNRCIPET LCDGDNDCEDGSDEES-CTPPE CXPG-EFQCNNGR-CIPAT LCDGD—DDCGDNSÜET GC —EHTCP- SGFQCRSTNRCIPETWLCDGDNDCEDGSDEESCTPPTE CXPG-EFQCNNGR-CIPATWLCDGD—DDCGDNSDET GCT—EHTCP- 5 SGFQCRSTNRCIPET LCDGDNDCEDGSDEESCTPPTE CQSN-EFQCNNGR-CISVTWLCDGD—DDCGDSSDET DCTSAVPTCP- SGFQCRSTNRCIPET LCDGDNDCEDGSDEESCTPPTE CPSS-EFQCRNNKTCIPRNWLCDGE—DDCGDSSDET DCT—THTCP- SGFQCRSTNRCIPETWLCDGDNDCEDGSDEESCTPPTE CLPS-EFPC-SNGRCVPRPWVCDGD—DDCEDNSDEA GCP—KPTCP- SGFQCRSTNRCIPXTWLCDGDNDCEDGSDEESCTPPTE CPPS-EFPC-GNGSCVPQAVCDGD—PDCPDNSDEE GCTGTGPTCP- O SGFQCRSTNRCIPET LCDGDNDCEDGSDEESCTPPTE CLPN-QFQCQSSGRCIPLNWLCDGD—DDCGDDSDET SCK—APTCP- SGFQCRSTNRCIPETWLCDGDNDCEDGSDEESCTPPTE CQAD-EFQCRNTEKCLPLN LCDGD— DCGDDSDET SCA—TPTCP- SGFQCRSTNRCIPETWLCDGDNDCEDGSDEESCTPPTE CQPD-EFRCRNTDICIPQRWVCDGD—NDCEDSSDEADCQQPTCR- ANEFQCHSTGRCIPET LCDGDNDCEDGSDEES CTPPT- 5 se ma exp or tch ecte motivo e es d 77 10' c ?[eq]f.c? ?c[ilv] ...w[ilv]cdg[de] .?.? [de] ..?.?.? 6 10 .?.?.?.?.?..?.?.?......?.? [de]...?.?.?.?.?. ?. ? . ? 9 20 ln 10" c ?[eq]f .c? ?c[ilv] ...w[ilv] cdg [de] .?.? .dc.d. sde. ?.?.?.? . 65 55 ?.?.?.?..?.?.?.. tcp.?.?gf [kqr]cr.t.rcip.twlcdgdndce. ?.?.?. ?.?.?. ? . ?tppt . ? - n 19Q 10" c ?[eq]f.c? ?c[ilv] ...w[ilv]cdg[de] .?.?.dc.d. sde. ?.?.?.?. lu 51 ?.?.?.?..?.?.?..tcp.?. ?gfqcrstnrcip.twlcdgdndce. ?.?.?.?.?.?. ?.?t ppt.? 17 R 10" c ?[eq]£.c? ?c[ilv] ...w[ilv] cdg [de] .?.? .de. d.sde. ?.?.?.? . 82 60 ?.?.?.?c. ?.?.?..tcp.?.?gfqcrstnrcip.twlcdgdndce.?.?.?.?.?.?.?.?t ppt.? 16 _ 10" c ?[eq]fqc? ?c[ilv] ...wlcdg[de] .?.? [dn] dc.d. sde. ?.?.?.?. ? 10 62 .?.?.?..?.?.?..tcp. ? . ?gfqcrstnrcipetwlcdgdndce.?.?.?.?.?.?.?. ?tp pt.? 14, 10" c ?[eq]fqc? ?c[ilv] ...wlcdgfde] . ? . ? [dn] degd. sde.?. ?.?.?.? 39 ° 65 .?.?. ?c. ?.?.?..tcp.?. ?g£qcrstnrcipetwlcdgdndce.?. ?.?.?.?.?.?. ?tp pt.? 12 10" c ?e£qc.?n. [ekqr] .?c[ilv] ...wlcdg[de] .?.? [dn]dcgd. sde. ?.?.?. ? 36 67 .?.?.?. ?c. ?.?.?.. tcp. ? . ?gfqcrstnrcipetwlcdgdndce . ?.?.?. ?.?.?.?.? tppt.? 10. 10 c....?efqc.?n. [ekqr] ,?c[ilv]p..wlcdg[de] .?.? [dn] degd.sde. ?.?.?. ? 0 68 .?.?.?. ?c .?.?.?.. tcp. ? . ?gfqcrstnrcipetwlcdgdndce .?.?.?.?.?.?.?.? tppt.? 78 10" ^ 3 ? c....?efqc.?ngr.?ci.. twlcdgd. ?. ?ddcgd. sde. ?.?.?.?.?.?.?. ?c. ?.?. ? 0 ..tcp. ? . ?gfqcrstnrcipetwlcdgdndce.?.?.?.?.?.?.?. ?tppt. ? Fam 4 CQPNEFQCHSTGRCIPAS LCDGDNDCEDSSDESPANCATPTHTCPASEFQCHSTGRCIPASWLCDGDNDCEDSS DEAG—CTTPEPT CAPGQFRCK-NGRCVPLSWVCDGDDDCEDDSDE— ANCESPEPTCESGEFQCHSTGRCIPASWLCDGDNDCEDSSDEAG—CTTPEPT 5 CQSDQFRCSN-GRCIPVEWVCDGEDDCLDGSDEP- QVCGTTAPTCAADEFQCNSTGRCIPVSWVCDGVNDCEDSSDEAG—CATSGPT CQADEFKCGN-GRCLPEAVCDGEDDCGDNSDE ADCQAPTCAADEFQCNSTGRCIPVSWVCDGXNDCEDSSDEAG—CATSGPT CPPDEFPCSNSGICIPRSWRCDGEDDCGDNSDEE-D- CTSAGHTCAPSEFTCNSTGRCIPQE VCDGDNDCEDSSDEAPDLCASAAPT CQPGEFRCRN-GKCIPQT LXXGXDDCGDNSDE— ADCATTAPTCPPDEFTCRSTERCIPLAWVCDGDNDCEDSSDEAG—CTTPEPT CLSGEFRCSN-GNCLPADWLCDGEDDCGDNSDE— TSCAASEPTCPPDEFTCRSTERCIPLAWVCDGDNDCEDSSDEAG—CTTPEPT CGSSEFQCHSTGRCIPENWVCDGDDDCEDSSDE— KSCTSAAPTCPPDEFTCRSTERCIPLA VCDGDNDCEDSSDEAG—CTTPEPT CAADQFKCDN-GRCVPQNWRCDGEXDCGDNSDE—ENCTT— PTCPPDEFTCRSTERCIPLAWVCDGDNDCEDSSDEAG—CTTPEPT sc mat exp or che ecte motivo e s d 18 ^ 9 10"55c... [eq]f .c..?.?g.c[ilv]p..w...g..de. d.sde. ?.?.?. ? ?.?.tc. 79 f .c. st .rcip..w[ilv] cdg.ndcedssdea.. ? . ?c[ast] [st] ..pt 17 10"59c... 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[eq]f [kqr]c.. ? . ?grc[iv]p[eq]nw. cdg[de] .de. d.sde.? t] . ?.?ptcppdeftcrsterciplawvcdgdndcedssdeag. ?. ?cttpept Ejemplo 11 Los monómeros o multímeros que se enlazan al IgG humano y/o IgGs de otras especies, que incluyen IgG de mono cinomolgo (referido colectivamente como igG) , fueron identificados esencialmente por los métodos descritos en el Ejemplo 7. Se identificaron los siguientes monómeros de enlace a igG. Las tablas después de cada familia de dímeros, representan porciones consenso basadas en la alineación de los elementos de la familia: Faml CASGQFQCRSTSICVPMWWRCDGVPDCPDNSDEK—SCEPP T CASGQFQCRSTSICVP W RCDGVPDCVDNSDET—SCTST VHT CASGQFQCRSTSICVPMWRCDGVPDCADGSDEK—DCQQH T CASGQFQCRSTSICVP WWRCDGVNDCGDGSDEA—DCGRPGPGATSAPAA— CASGQFQCRSTSICVPMWWRCDGVPDCLDSSDEK—SCNAP ASEPPGSL CASGQFQCRSTSICVPM RCDGVPDCRDGSDEAPAHCSAP ASEPPGSL CASGQFQCRSTSICVPQWWVCDGVPDCRDGSDEP-EQCTPP T CLSSQFRCRDTGICVPQ WVCDGVPDCGDGSDEKG—CGRT GHT CLSSQFRCRDTGICVPQ WVCDGVPDCRDGSDEAAV-CGRP GHT CLSSQFRCRDTGICVPQ WVCDGVPDCRDGSDEAPAHCSAP ASEPPGSL scor match expecte motivo e es d *17 10 10"28 c.s. qf[kqr]cr.t.icvp.ww.cdgv. de. d.sde..?.?.?c....?.?.?.?..?. ?.?.?.?.?.? 109 9 1Q-29 c.s.qf [kqr]cr.t.icvp. ww.cdgvpdc. d.sde..?.?.?c....?.?.?.?..?. ?.?.?.?.?.? 942 7 10"" casgqf qcrstsicvp.ww.cdgv. dc.d. sde.. ?.?.?c....?.?.?.?..?.?.?. ?.?.?.? ai 866 6 10"3S casgqf qcrstsicvp wwrcdgv. dc.d. sde..?.?.?c ?.?.?.?..?.?.?. 9 9 9 9 Fam2 CGAS-EFTCRSSSRCIPQAWVCDGENDCRDNSDE—ADCSAPASEPPGSL CRSN-EFTCRSSERCIPLA VCDGDNDCRDDSDE—ANCSAPASEPPGSL CVSN-EFQCRGTRRCIPRTWLCDGLPDCGDNSDEAPANCSAPASEPPGSL CHPTGQFRCRSSGRCVSPTWVCDGDNDCGDNSDE—ENCSAPASEPPGSL CQAG-EFQC-GNGRCISPA VCDGENDCRDGSDE—ANCSAPASEPPGSL scor match expecte mot¿vo e es d 683 5 10"3 c ?[eq]f .c?...rc[iv] .. [ast]w[ilv] cdg..de. d.sde. ?.?. [dn]c sapaseppgsl O. 584 4 10"3d c ?[eq]f .c?...rc[iv] .. [ast] wvcdg[de]ndc. d.sde. ?.?. [dn]cs apaseppgsl 480 3 10"1 c. [as] .. ?ef .c. ? ...rci..awvcdg [de]ndcrd. sde . ? . ?a[dn] csapasepp gsl Una porción que resume los monómeros del dominio de enlace A de IgG de la Familia 2 continúa: [eq] f xcrx [st] xrc [iv] xxxw [ilv] cdgxxdcxd [dn] sde Fam3 CPPSQFTCKSNDKCIPVH LCDGDNDCGDSSDE—ANCGRPGPGATSAPAA CPSGEFPCRSSGRCIPLAWLCDGDNDCRDNSDEPPALCGRPGPGATSAPAA CAPSEFQCRSSGRCIPLPWVCDGEDDCRDGSDES-AVCGAPAP—T CQASEFTCKSSGRCIPQEWLCDGEDDCRDSSDE—KNCQQPT CLSSEFQCQSSGRCIPLAWVCDGDNDCRDDSDE—KSCKPRT registro apareamiento* esperados porción 526 5 10-" c...[eq]f.c[kqr]s..[kr]cip..w[ilv]cdg[de] [dn]dc. d.sde. ?.?..c ?. 46 4 10-28 c...ef.c[kqr]ssgrcip..w[ilv]cdg[de] [dn]dcrd.sde.?.?..c ?.?.?.?. ?.?.?.?.? 375 3 10J0 C c. ,.isef .c[kqr]ssgrcip..wtilv]cdg[de] [dn]dcrd.sde.?.?..c...[ast] .?.?. ?.?.?. ?.?.

Dos porciones resumen los monómeros de dominio de enlace A de IgG de la Familia 3 siguientes: CXSSGRCIPXX VCDGXXDCRDXSDE CXSSGRCIPXXWLCDGXXDCRDXSDE Basados en las alineaciones de la familia 3, la invención proporciona polipéptidos que comprenden dominios de monómeros que no se originan naturalmente, que se enlazan a IgG y que tienen la secuencia SSGR inmediatamente precediendo la tercera cisteína en un andamiaje de dominio A. Fa 4 CPANEFQCSNGRCISPALCDGENDCVDGSDE—KGCTPRT CPPSEFQCGNGRCISPAWLCDGDNDCVDGSDE—TNCTTSGPT CPPGEFQCGNGRCISAG VCDGENDCVDDSDE—KDCPART CGSGEFQCSNGRCISLGWVCDGEDDCPDGSDE—TNCGDSHILPFSTPGPST CPADEFTCGNGRCISPAVCDGEPDCRDGSDE-AAVCETHT CPSNEFTCGNGRCISLAWLCDGEPDCRDSSDESLAICSQDPEFHKV registro apareamientos esperados porción 630 10 ,-24 c...ef .c.ngrcis.. w [ilv] cdg [de] .de. d.sde.?.?..c. 546 10 •25 cp..ef .c.ngrcis.. [ilv] cdg [de] .de. d.sde. ?.?..c. 452 10 ,-27 cp.. ef . cgngrcis ..w [ilv] cdg [de] .de. d.sde.?.?..c. 367 10 •29 cp..efqc.ngrcis..w[ilv] cdg[de]ndcvd.sde. ? . ?..c.

Ejemplo 10 Este ejemplo ilustra las afinidades de enlace de monómeros de enlace IgG para IgG de varias especies animales.

Tabla: Afinidad de dominios de enlace a IgG por especies Una fracción completa de IgG de 0.2 ug de las especies indicadas, se inmovilizó en cavidades duplicadas de una placa Maxisorp de 96 cavidades (Nunc) y se bloqueó con BSA al 1%. Las diluciones seriales de los dominios purificados se agregaron entonces, y la cantidad de proteína unida se cuantificó vía un anticuerpo secundario anti-HA de alta afinidad, conjugado a HRP, usando métodos ELISA estándares. Los datos se ajustaron a un modelo de enlace 1:1 usando un algoritmo de mejor ajuste no lineal, 'para determinar el KD (afinidad) .

Ejemplo 11 Este ejemplo describe un experimento diseñado para ilustrar la vida media de farmacocinética conferida en un multímero, por la presencia de un dominio Avier de enlace a IgG, Ig-M02. El constructo Avimer C242, es un trímero de dominios de Avimer (~15 kDa) . El domino Avimer N-terminal es Ig-M02. Se inyectaron tres monos cinomolgos con una dosis única de 1 mg/kg de Avimer C242, el cual ha sido etiquetado con rastros con 125I . Los monos 1 y 2 recibieron dosis intravenosas; los monos 3 recibieron una dosis intramuscular. Las muestras de suero se obtuvieron y valoraron por 125I cpm a los tiempos indicados en la Figura 10, después de 288 horas. La vida media del suero terminal observada en este experimento es ~53 horas, la cual, alométricamente escala a una vida media de ~106 horas predichas en humanos. En un experimento similar en ratones, se observó una vida media terminal de 7-9 horas, consistente con el tamaño más pequeño del roedor. Además, como los trazos para los animales inyectados i.v. e inyectados i.m. convergen y llegan a ser claramente idénticos de aproximadamente 12 inyecciones posteriores, se infiere que el monómero exhibe alta biodisponibilidad in vivo. 53 horas son significantemente más largas que las esperadas para una proteína de este tamaño. Por ejemplo, la vida media del suero de la interleucina-ß de citocina de 20 kDa en titís es 4-6 horas (Ryffel, B. et al. Blood 83, 2093-102 (1994)). De este modo, el dominio Ig-M02 de enlace a IgG, confiere una vida media suficientemente larga para permitir al menos una vez semanalmente, dosificaciones en sujetos humanos. Mientras la invención mencionada anteriormente ha sido descrita en algún detalle para propósitos de claridad y entendimiento, será claro para un experto en la técnica, a partir de leer esta descripción, que se pueden hacer varios cambios en forma y detalle sin apartarse del alcance verdadero de la invención. Por ejemplo, todas las técnicas, métodos, composiciones, aparatos y sistemas descritos anteriormente, pueden ser usados en varias combinaciones. Todas las publicaciones, patentes, solicitudes de patente u otros documentos citados en esta solicitud, están incorporados por referencia en su totalidad para todos los propósitos, en la misma magnitud como si cada publicación individual, patente, solicitud de patente, u otro documento, fueran individualmente indicados para estar incorporados por referencia para todos los propósitos.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (33)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones .

1. Polipéptido, caracterizado porque comprende un dominio de monómero que se enlaza a c-MET, en donde el dominio de monómero: es un dominio de monómero que no se origina naturalmente, que comprende 30 a 50 aminoácidos; y comprende al menos, un enlace disulfuro.

2. Polipéptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el dominio de monómero es un dominio de monómero de receptor clase A de LDL.

3. Polipéptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el dominio de monómero es un dominio de monómero de receptor clase A de LDL, que comprende la siguiente secuencia: EFXCXNGXCIPXX XCDGXDDCGDXSDE, en donde X es cualquier aminoácido.

4. Polipéptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polipéptido comprende al menos, uno o más de seis dominios de monómeros que se enlazan a c-MET.

5. Polipéptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polipéptido comprende al menos, dos dominios de monómeros que se enlazan a c-MET.

6. Polipéptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polipéptido además comprende un segundo dominio de monómero, en donde el segundo dominio de monómero tiene una especificidad de enlace para un factor sanguíneo, con ello, incrementando la vida media del suero del polipéptido, cuando el polipéptido es inyectado en un animal, comparado con la vida media del suero de un polipéptido que carece del dominio de monómero que se enlaza al factor sanguíneo.

7. Polipéptido de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el factor sanguíneo es albúmina de suero, una inmunoglobulina o un eritrocito.

8. Polipéptido de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el segundo dominio de monómero, se enlaza a una inmunoglobulina (IgG) y el segundo dominio de monómero es un dominio de monómero del receptor clase A de LDL, que comprende una secuencia seleccionada de la siguiente: CXSSGRCIPXXWVCDGXXDCRDXSDE, y CXSSGRCIPXX LCDGXXDCRDXSDE, en donde X es cualquier aminoácido.

9. Polipéptido de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el segundo dominio de monómero se enlaza a una inmunoglobulina (IgG), y el segundo dominio de monómero es un dominio de monómero del receptor clase A de LDL que comprende la siguiente secuencia: [EQ] FXCRX [ST] XRC [ IV] XXX [ ILV] CDGXXDCXD [DN] SDE, en donde X es cualquier aminoácido y aminoácidos en los corchetes, son aminoácidos alternativos en una posición única.

10. Polipéptido de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el segundo dominio de monómero comprende CHPTGQFRCRSSGRCVSPTWVCDGDNDCGDNSDEENC.

11. Polipéptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque los dominios de monómeros son cada uno de entre 35 a 45 aminoácidos.

12. Polipéptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque cada dominio de monómero comprende tres enlaces disulfuro.

13. Polipéptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el dominio de monómero es un dominio de receptor clase A de LDL que no se origina naturalmente.

14. Polipéptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el monómero comprende una secuencia de aminoácido en la cual: al menos 10% de los aminoácidos en la secuencia son cisteína; y/o al menos 25% de los aminoácidos son aminoácidos que no se originan naturalmente.

15. Método para identificar un polipéptido que se enlaza a c-MET, caracterizado porque comprende: seleccionar una biblioteca de polipéptidos para afinidad a c-MET; y seleccionar un polipéptido que comprende al menos, un dominio de monómero que se enlaza a c-MET, en donde el dominio de monómero: tiene entre 30-100 aminoácidos; es un dominio de monómero que no se origina naturalmente; comprende al menos, un enlace disulfuro.

16. Método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque la etapa de selección comprende, seleccionar un polipéptido que reduce la proliferación y/o migración de células mediadas por HGF.

17. Método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque además comprende, seleccionar un polipéptido que inhibe el crecimiento del tumor en un animal.

18. Método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el monómero comprende una secuencia de aminoácido en la cual: al menos 10% de los aminoácidos en la secuencia son cisteína; y/o al menos 25% de los aminoácidos son aminoácidos que no se originan naturalmente.

19. Método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado además porque comprende enlazar el dominio de monómero en el polipéptido seleccionado a un segundo dominio de monómero, para formar una biblioteca de multímeros, cada multímero comprende al menos, dos dominios de monómeros; seleccionar la biblioteca de multímeros por la habilidad para enlazarse a c-MET; y seleccionar un multímero que se enlaza a c-MET.

20. Método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque además comprende enlazar el dominio de monómero en el polipéptido seleccionado, a un segundo dominio de monómero para formar una biblioteca de multímeros, cada multímero comprende al menos, dos dominios de monómeros; seleccionar la biblioteca de multímeros por la habilidad para enlazarse a una molécula objetivo distinta de c-MET; y seleccionar un multímero que se enlaza a la molécula objetivo.

21. Método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado además porque comprende una etapa de mutar al menos, un dominio de monómero, con ello, proporcionando una biblioteca que comprende los dominios de monómeros mutados.

22. Método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque la biblioteca de dominios de monómeros se expresa como una exhibición de superficie de fago, exhibición de ribosoma o exhibición de superficie celular.

23. Método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el polipéptido comprende al menos, dos dominios de monómeros y los dominios de monómeros son ligados por un enlazador.

24. Método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque los dominios de monómeros son cada uno de entre 35 a 45 aminoácidos.

25. Método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque cada dominio de monómero comprende tres enlaces disulfuro.

26. Método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque al menos, uno de los dominios de monómeros es un dominio de receptor clase A de LDL.

27. Método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el dominio de monómero comprende una secuencia de aminoácido en la cual: al menos 10% de los aminoácidos en la secuencia son cisteína; y/o al menos 25% de los aminoácidos son aminoácidos que no se originan naturalmente.

28. Polinucleótido, caracterizado porque codifica el polipéptido de conformidad con la reivindicación 1.

29. Polipéptido, caracterizado porque comprende un dominio de monómero que se enlaza a la inmunoglobulina G (IgG), en donde el dominio de monómero es un dominio de monómero del receptor clase A de LDL, que comprende la secuencia seleccionada de la siguiente: CXSSGRCIPXXWVCDGXXDCRDXSDE, CXSSGRCIPXXWLCDGXXDCRDXSDE, y [EQ]FXCRX[ST]XRC[IV]XXXW[ILV]CDGXXDCXD[DN]SDE, en donde X es cualquier aminoácido y. aminoácidos en corchetes, son aminoácidos alternativos en una posición única; y en donde el polipéptido tiene una vida media del suero incrementada, cuando el polipéptido es inyectado en un animal, comparado con la vida media del suero de un polipéptido que carece del dominio de monómero que se enlaza a IgG.

30. Polipéptido de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque el dominio de monómero comprende CHPTGQFRCRSSGRCVSPT VCDGDNDCGDNSDEENC .

31. Polipéptido de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado además porque comprende un segundo dominio de monómero con especificidad de enlace para una molécula distinta de IgG, en donde el segundo dominio de monómero : tiene entre 30-100 aminoácidos; es un dominio de aminoácido que no se origina naturalmente; comprende al menos, un enlace disulfuro.

32. Polipéptido de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque el segundo dominio de monómero es un dominio del receptor clase A de LDL que no se origina naturalmente.

33. Polipéptido, caracterizado porque codifica el polipéptido de conformidad con la reivindicación 29.