JP6309461B2 - ヒストンアセチル化の標的化 - Google Patents
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Description
本開示の1つの態様は、DNA結合ドメイン及び少なくとも1つのヒストンアセチルトランスフェラーゼ(HAT)ドメインを、含む融合タンパク質を提供する。DNA結合ドメインは、特定のDNA配列を認識して、その配列に結合するので、融合タンパク質を細胞染色体における特定の配列に導く。その特定の配列に結合したら、融合タンパク質のHATドメインが、細胞染色体におけるその特定の配列と関連する少なくとも1つのタンパク質をアセチル化する。
本明細書に開示されている融合タンパク質は、DNA結合ドメインを含み、このドメインは、DNAの特定の配列を認識して、その配列に結合する少なくとも1つのモチーフを含む。DNA結合ドメインは、2本鎖DNA及び/又は1本鎖DNAに結合できる。概して、DNA結合ドメインは、細胞染色体の2本鎖DNAにおける特定の配列を認識して、その配列に結合する。
例示的実施形態では、DNA結合ドメインはジンクフィンガーDNA結合ドメインである。ジンクフィンガーDNA結合ドメインは、2つ、3つ、又はそれ以上のジンクフィンガーモチーフ(すなわち「ジンクフィンガー」)のタンデムリピートを含む。各ジンクフィンガーでは、亜鉛(又は別のイオン)が配位結合しており、約3個の連続するヌクレオチド残基と相互作用する。様々なジンクフィンガーが知られており、亜鉛と配位結合している残基の種類と順序によって分類することができる(例えばCys2His2、Cys4、及びCys6)。
別の実施形態では、融合タンパク質のDNA結合ドメインはTALエフェクターDNA結合ドメインである。TALエフェクターは、病原菌が各種の植物種に感染すると、その病原菌によって分泌される転写因子である。これらのタンパク質は、リピート数が様々である約34個のアミノ酸リピートからなる中央のリピートドメインを介して、植物のDNA配列を認識することによって、細菌感染を補助する植物遺伝子の発現を活性化する。従って、TALエフェクターの中央のリピートドメインはDNA結合ドメインである。各リピート内の2つの重要なアミノ酸による標的DNA配列内の特定のヌクレオチドの認識は、単純に1対1で対応していると見られる。従って、人造TALエフェクターDNA結合ドメインは、いずれかの目的のDNA配列を認識して、その配列に結合するように組み換えることができる。概して、本明細書に開示されている融合タンパク質に含めるように設計されたTALエフェクターDNA結合ドメインは、約2〜約40個のリピートを含む。具体的な実施形態では、TALエフェクターDNA結合ドメインは、約12〜約25個のリピートを含む。
概して、本発明の融合タンパク質のDNA結合ドメインは、目的の染色体配列における特定の配列を認識して、その配列に結合するように組み換えられている。好適な標的配列の非限定例としては、リプログラミング因子(例えばOct4、Sox2、Klf4、c−Myc、Nanog、Lin−28、miRNA302−367クラスター、Zfp296など)、増殖因子(例えばAng、BMP、BDNF、EGF、FGF、GDNF、G−CSF、GDF9、HGF、HDGF、IGF、I−lGF1、I−lGF2、GDF8、NSF、NGF、PDGF、TGF、TNF−α、VEGF、PEDF、PIGFなど)、サイトカイン(例えばインターロイキン、インターフェロン、EPO、TPO、など)、増殖因子又はサイトカイン受容体(例えばFGFR、NGFR、HGFR、VEGFR、EPOR、ErfBGFR、SCFR、TGFR、BMPRなど)、癌抑制因子(例えばp53、p21、p16、VHL、CDH1、BRCA2、PTEN、VHL、APC、CD95、ST5、YPEL3、ST7、ST14など)、及び細胞周期制御因子(例えばANAPC2、ATR、AURKA、BCCIP、BCL2、BRCA2、CCNB1、CCNB2、CCNC、CCND1、CCND2、CCND3、CCNE1、CCNF、CCNH、CCNT1、CDC16、CDC20、CDC25C、CDC6、CDK1(CDC2)、CDK2、CDK4、CDK5R1、CDK6、CDK7、CDK8、CDKN1A(p21CIP1/WAF1)、CDKN1B(p27KIP1)、CKS1B、E2F1、E2F4、GADD45A、KNTC1、MKI67、RAD9A、RB1、SKP2、TFDP1、TFDP2、WEE1など)、活性因子/阻害剤、遺伝子標的などをコードする配列が挙げられる。
本明細書に開示されている融合タンパク質は、少なくとも1つのHATドメインも含む。HATドメインは、タンパク質アセチラーゼ活性を呈する。例えば、HATドメインは、ヒストンアセチラーゼ活性を呈することができ、すなわち、アセチルCoAからアセチル基を移転して、ε−N−アセチルリジンを形成させることによって、ヒストンタンパク質におけるリジン残基をアセチル化できる。好適なヒストンタンパク質としては、コアヒストンH2A、H2B、H3、及びH4、並びにリンカーヒストンH1が挙げられる。HATドメインは、染色体的に関連するその他のタンパク質に対するアセチラーゼ活性も呈することができる。染色体的に関連するタンパク質としては、クロマチン構造に関わるヒストン以外のタンパク質、並びに、転写、複製、及びその他の本質的なプロセスに関与する酵素及びタンパク質因子が挙げられる。
いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、少なくとも1つの核局在化シグナル又は配列(NLS)をさらに含む。NLSは、融合タンパク質を核の中に導くように促すアミノ酸配列であり、この核の中で、融合タンパク質が標的ヒストンのアセチル化を媒介する。核局在化シグナルは、当該技術分野において既知である(例えばMakkerh et al.(1996)Current Biology 6:1025−1027を参照されたい)。例えば、NLSは、SV40T−抗原、ヌクレオプラスミン、c−myc、hnRNPA1、Matα2などのような天然のタンパク質に由来することができる。あるいは、NLSは、多くのNLS配列に由来するコンセンサス配列であることができる。NLSは、融合タンパク質のN末端、C末端、又は内部の位置に位置することができる。
本開示の別の態様は、上記の項(I)に記載されている融合タンパク質をコードする単離された核酸を包含する。融合タンパク質をコードするこの核酸は、DNA、RNA、2本鎖、1本鎖、直鎖状、又は環状であることができる。核酸がRNAである実施形態では、そのRNAはメッセンジャーRNA(mRNA)であることができる。このmRNAは、5’末端にキャップを有し、及び/又は3’末端がポリアデニル化されていることができる。キャッピング(又はポリアデニル化)は、インビトロ合成反応中に行うことができ、あるいは、キャッピング(又はポリアデニル化)は、転写後に特定の反応を介して行うことができる。
本開示のさらなる態様は、細胞における標的染色体位置の少なくとも1つのヒストンタンパク質をアセチル化する方法を提供する。この方法は、細胞を融合タンパク質又は融合タンパク質をコードする核酸と接触させることを含み、この融合タンパク質は、DNA結合ドメイン及び少なくとも1つのHATドメインを含む。融合タンパク質のDNA結合ドメインが標的染色体位置の特定の配列に結合したら、融合タンパク質のHATドメインが、標的染色体位置の少なくとも1つのヒストンタンパク質をアセチル化する。
上記の方法は、単離された融合タンパク質又は融合タンパク質をコードする核酸との接触を含む。融合タンパク質は、上記の項(I)に詳述されており、融合タンパク質をコードする核酸は、上記の項(II)に説明されている。
様々な細胞が、本発明の方法で用いるのに適している。様々な実施形態において、細胞は、ヒト細胞、ヒト以外の哺乳類細胞、哺乳類以外の脊椎動物細胞、無脊椎動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母細胞、又は単細胞真核生物であることができる。様々な胚が、本発明の方法で用いるのに適している。例えば、胚は、ヒト以外の哺乳類1細胞胚であることができる。1細胞胚を含む例示的哺乳類胚としては、これらに限らないが、マウス胚、ラット胚、ハムスター胚、げっ歯類胚、ウサギ胚、ネコ胚、イヌ胚、ヒツジ胚、ブタ胚、ウシ胚、ウマ胚、及び霊長類胚が挙げられる。さらに別の実施形態では、細胞は幹細胞であることができる。好適な幹細胞としては、これらに限らないが、胚性幹細胞、ES様幹細胞、胎児幹細胞、成体幹細胞、万能性幹細胞、誘導万能性幹細胞、多能性幹細胞、少能性幹細胞、単能性幹細胞、及びその他の幹細胞が挙げられる。例示的実施形態では、細胞は哺乳類細胞である。
別段の定めのない限り、本明細書で用いられているいずれの専門用語及び科学用語も、本発明の属する技術分野の者によって広く理解されている意味を有する。Singleton et al.,Dictionary of Microbiology and Molecular Biology(2nd ed.1994)、The Cambridge Dictionary of Science and Technology(Walker ed.,1988)、The Glossary of Genetics,5th Ed.,R.Rieger et al.(eds.),Springer Verlag(1991)、及びHale&Marham,The Harper Collins Dictionary of Biology(1991)という参考文献は、当業者に、本発明で用いられている多くの用語の一般的な定義を示している。本明細書で使用する場合、下記の用語は、別段の指定のない限り、その用語のものとされている意味を有する。
ヒトOCT4遺伝子の転写開始部位に近い特定の配列を標的とするように、融合タンパク質を設計した。この融合タンパク質は、ジンクフィンガー(ZF)DNA結合ドメイン及びヒトp300HATドメインを含んでいた。ZF結合ドメインは、OCT4の転写開始部位から+181下流のヌクレオチドから始まる5’−GGAGGGcCAGGAATCGGGC−3’(配列番号1)という特定の配列に結合するように設計した。このZF DNA結合ドメイン、ZF(Oct4+181)という、は、以下のアミノ酸配列を有していた:AAMAERPFQCRICMRNFSDRSHLTRHIRTHTGEKPFACDICGRKFARNDDRKKHTKIHTGSQKPFQCRICMRNFSQSGNLARHIRTHTGEKPFACDICGRKFAAKWNLDAHTKIHTHPRAPIPKPFQCRICMRNFSRSAHLSRHIRTHTGEKPFACDICGRKFAQSGHLSRHTKIHLRQKDAAR(配列番号2)。HATドメインは、ヒトp300(登録番号:NM_001429)のアミノ酸1284〜1673に相当した。
OCT4の転写開始部位から−720又は−615上流のヌクレオチドに位置する配列を標的とするさらなるZF−p300融合タンパク質を設計した:ZF(Oct4−720)−p300及びZF(Oct4−615)−p300。ポジティブコントロールとして用いるために、NF−κBサブユニットp65を含む第2の組のコントロール融合タンパク質も構築した:ZF(Oct4+181)−p65及びZF(Oct4−720)−p65。
p300HATドメインを含むZF融合タンパク質が、他の遺伝子を活性化できるか調べるために、ヒトPEDF(色素上皮由来因子)遺伝子を標的とするように、ZF DNA結合ドメイン融合体を設計した。PEDFをコードする配列の転写開始部位から−92上流のヌクレオチドから始まる特定の配列5’−GGATGGtGGTGCAGCAGTG−3’(配列番号7)に結合するように、ZF結合ドメインを設計した。このZF(PEDF)DNA結合ドメインはZF6961といい、以下のアミノ酸配列を有していた:AAMAERPFQCRICMRNFSRSDALSRHIRTHTGEKPFACDICGRKFAQSGDLTRHTKIHTGGQRPFQCRICMRNFSQSGDLTRHIRTHTGEKPFACDICGRKFATSGHLSRHTKIHTGGGGSQKPFQCRICMRNFSRSDHLSNHIRTHTGEKPFACDICGKKFAQSATRITHTKIHLRQKDAAR(配列番号8)。ZF(PEDF)DNA結合ドメインをp300HATドメイン又はNF−κBサブユニットp65のいずれかに結合させた。
別のヒストンアセチルトランスフェラーゼのHATドメインがp300の代わりになり得るかを決定するために、GCN5のHATドメインを含む融合タンパク質の組を構築した。このHATドメインは、ヒトGCN5(登録番号:NM_021078)のアミノ酸491〜662に相当した。CGN5のHATドメインをZF(PEDF)に結合して、ZF−GCN5を作製するか、又はZF(PEDF)−p65に結合してGCN5−ZF−p65を作製するかのいずれかを行った。細胞に、ZF−p65(すなわちZF(PEDF)−p65)、ZF−GCN5)、又はGCN5−ZF−p65を発現するベクターをトランスフェクションした。コントロール細胞には、p65(ZFは含まない)をコードするベクターをトランスフェクションした。72時間後に全RNAを単離し、PEDFのmRNA及び内在性コントロールシクロフィリンAのmRNAのレベルをRT−PCRによって測定した。PEDFの発現を正規化するのにPEDF/cyc比を用いた。図4に示されているように、ZF−GCN5は、PEDFの発現を活性化しなかった。実際、ZF−p65による活性化は、GCN5との融合により弱まった。
OCT4の転写開始部位周辺の配列を体系的に標的とするように、一連のZF−p300融合タンパク質を設計した。ヒトOCT4遺伝子の転写開始部位から約−2.5kb上流〜約+1.5kb下流に位置する配列を標的とするように、標準的な手順を用いてZFドメインを設計及び構築した。各ZF(Oct4)−p300融合体をコードする発現ベクターをHEK293細胞にトランスフェクションした。ネガティブコントロール細胞には、GFP又はp300HATドメイン(ZFドメインは含まない)をコードするベクターをトランスフェクションした。トランスフェクションした細胞の各集団において、OCT4のmRNAのレベルをRT−PCRによって測定し、本質的に上記の実施例2に説明されているように、OCT4の発現をシクロフィリンAの発現に対して正規化した。
実施例5で、OCT4の発現を活性化することが確認された2つの融合タンパク質を他の細胞種で調べた。このタンパク質は:ZF(Oct4+286)−p300及びZF(Oct4+420)−p300であった。ZF(Oct4+286)−p300のDNA結合ドメインは、以下のアミノ酸配列を有していた:AAMAERPFQCRICMRNFSRSAHLSRHIRTHTGEKPFACDICGRKFARSDALARHTKIHTGSQKPFQCRICMRNFSDRSHLTRHIRTHTGEKPFACDICGRKFATSGSLTRHTKIHTGSQKPFQCRICMRNFSRSDNLSTHIRTHTGEKPFACDICGRKFADNRDRIKHTKIHLRQKDAAR(配列番号9)。ZF(Oct4+420)−p300のDNA結合ドメインは、以下のアミノ酸配列を有していた:AAMAERPFQCRICMRNFSQSSNLARHIRTHTGEKPFACDICGRKFAQSGHLSRHTKIHTGSQKPFQCRICMRNFSQSSNLARHIRTHTGEKPFACDICGRKFAQSGHLSRHTKIHTGSQKPFQCRICMRNFSQSSDLSRHIRTHTGEKPFACDICGRKFAQSGNLARHTKIHLRQKDAAR(配列番号10)。
SOX2の転写開始部位周辺の配列を体系的に標的とするように、一連のZF−p300融合タンパク質を設計した。ヒトSOX2遺伝子の転写開始部位から約−500bp上流〜約+1500bp下流に位置する配列を標的とするように、標準的な手順を用いて、ZFドメインを設計及び構築した。各ZF(Sox2)−p300融合体をコードする発現ベクターをHEK293細胞にトランスフェクションした。ネガティブコントロール細胞には、GFP又はp300HATドメイン(ZFドメインは含まない)をコードするベクターをトランスフェクションした。SOX2のmRNAのレベルをRT−PCRによって測定し、トランスフェクションした細胞の各組において、SOX2の発現をシクロフィリンAの発現に対して正規化した。
Claims (14)
- ジンクフィンガーDNA結合ドメイン、および哺乳類E1A結合タンパク質p300のアミノ酸1284〜1673からなる少なくとも1つのヒストンアセチルトランスフェラーゼ活性を有するドメインを含む融合タンパク質であって、前記DNA結合ドメインが染色体配列に結合する、融合タンパク質。
- 前記ジンクフィンガーDNA結合ドメインが、5〜7個のジンクフィンガーを含む、請求項1に記載の融合タンパク質。
- 前記ジンクフィンガーDNA結合ドメインが、転写開始部位の上流又は下流に位置する特定の配列に結合する、請求項1または2に記載の融合タンパク質。
- 前記転写開始部位が、Oct4、PEDF、又はSox2をコードする染色体配列と関連する、請求項3に記載の融合タンパク質。
- 請求項1〜4のいずれか1項に記載の融合タンパク質をコードする単離された核酸。
- 少なくとも1つの発現制御配列をさらに含む、請求項5に記載の単離された核酸。
- 細胞における標的染色体位置の少なくとも1つのヒストンタンパク質をアセチル化するためのインビトロの方法であって、前記方法が、前記細胞を融合タンパク質又は前記融合タンパク質をコードする核酸と接触させることを含み、前記融合タンパク質が、ジンクフィンガーDNA結合ドメイン、および哺乳類E1A結合タンパク質p300のアミノ酸1284〜1673からなる少なくとも1つのヒストンアセチルトランスフェラーゼ活性を有するドメインを含み、前記DNA結合ドメインが前記標的染色体位置の配列に結合したら、前記ヒストンアセチルトランスフェラーゼ活性を有するドメインが、前記標的染色体位置の少なくとも1つのヒストンタンパク質をアセチル化するようになっている、方法。
- 前記ジンクフィンガーDNA結合ドメインが、5〜7個のジンクフィンガーを含む、請求項7に記載のインビトロの方法。
- 前記ヒストンタンパク質が、ヒストンH2A、ヒストンH2B、ヒストンH3、又はヒストンH4である、請求項7または8に記載のインビトロの方法。
- 前記ヒストンアセチルトランスフェラーゼ活性を有するドメインが、ヒストンH3のリジン18、ヒストンH3のリジン27、又はこの両方をアセチル化する、請求項7〜9のいずれか1項に記載のインビトロの方法。
- 前記標的染色体位置の染色体配列の転写が増大する、請求項7〜10のいずれか1項に記載のインビトロの方法。
- 前記細胞が、ヒト細胞、哺乳類細胞、哺乳類以外の脊椎動物細胞、無脊椎動物細胞、又は単細胞真核生物である、請求項7〜11のいずれか1項に記載のインビトロの方法。
- 前記ジンクフィンガーDNA結合ドメインが、転写開始部位の上流又は下流に位置する特定の配列に結合する、請求項7に記載のインビトロの方法。
- 前記転写開始部位が、Oct4、PEDF、又はSox2をコードする染色体配列と関連する、請求項13に記載のインビトロの方法。
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