EA022877B1

EA022877B1 - Полинуклеотид гена стрелкования b сахарной свеклы и его применение

Info

Publication number: EA022877B1
Application number: EA200901525A
Authority: EA
Inventors: Йоханнес Якобус Лудгерус Гилен; Томас Крафт; Пьерр Пин
Original assignee: Зингента Партисипейшнс Аг
Priority date: 2007-05-23
Filing date: 2008-05-23
Publication date: 2016-03-31
Also published as: EP1995320A2; EP2152885B1; CA2724419A1; CN101772575A; CN102057045B; JP2010527598A; CN102057045A; UA105489C2; US20100209919A1; BRPI0812387A2; MA31495B1; EP2390335A2; EA200901525A1; DK2152885T3; CA2724419C; EP1995320A3; WO2008142167A3; EP2390335A3; JP2011520461A; CA2687760C

Abstract

В заявке описаны полинуклеотиды, которые близко сцеплены с обусловливающим стрелкование геном или геном В в геноме сахарной свеклы и которые можно применять для создания молекулярных маркеров. В заявке описаны также молекулярные маркеры и наборы, содержащие указанные маркеры, которые можно применять для картирования, идентификации и выделения обусловливающего стрелкование гена или гена В в геноме сахарной свеклы, и для того, что различать характерный для однолетнего и характерный для двулетнего типа развития генотип или различные гаплотипы в группах растений сахарной свеклы, имеющих характерный для двулетнего типа развития генотип. В заявке описаны также анализы и способы селекции растений сахарной свеклы с использованием указанных маркеров.

Description

Настоящее изобретение относится к селекции с помощью маркеров и контролю качества семян сахарной свеклы. В частности, изобретение относится к полинуклеотидам, которые близко сцеплены или находятся в гене ЬоШпд (ген, обусловливающий стрелкование, ген, определяющий одно-двулетний тип развития) или гене В в геноме сахарной свеклы и которые можно применять для создания молекулярных маркеров. Изобретение относится также к молекулярным маркерам и наборам, содержащим указанные маркеры, которые можно применять для картирования, идентификации и выделения обусловливающего стрелкование гена или гена В в геноме сахарной свеклы и для того, что различать характерный для однолетнего и характерный для двулетнего типа развития генотип и различные гаплоидные генотипы (гаплотипы) в группах растений сахарной свеклы, которые имеют характерный для двулетнего типа развития генотип. Изобретение относится также к трансгенным подходам, с помощью которых получают трансгенные растения, у которых ген В либо сверхэкспрессируется, либо регулируется по типу отрицательной связи.

Окультуренная сахарная свекла (Вс1а уи1даг15 55р. уи1дап5 Ь.) представляет собой двулетнее растение, которое в первый год образует запасающий корень и листовую розетку. Удлинение побега (стрелкование) и образование цветка начинается после периода низкой температуры. В противоположность этому, для многих диких свекольных рода В. уи1дап5 55р. тагШта характерен однолетний тип развития в результате присутствия обусловливающего стрелкование гена В в В-локусе, который картирован в центральной области хромосомы II. Доминантный аллель В-локуса часто встречается у различных диких видов свекольных, и он вызывает стрелкование в течение периодов с длинным световым днем и у таких растений отсутствует необходимость в низких температурах, которые, как правило, требуются для двулетних культиваров (ЛЬе и др., 1997), несущих рецессивный аллель.

Стрелкование (удлинение побега) является первой хорошо заметной стадией перехода от вегетативного к репродуктивному росту.

У окультуренной сахарной свеклы стрелкование является нежелательным явлением, поскольку оно приводит к снижению урожая и к проблемам в процессе сбора урожая и при экстракции сахара. Из-за неполной пенетрантности В-аллеля и его зависимости от окружающей среды при селекции линий растений существует потребность в близко сцепленных с ним молекулярных маркерах для осуществления скрининга по признаку его присутствия. Производство семян сахарной свеклы для продажи часто осуществляют в регионах, в которых произрастают однолетние сорные виды свекольных, что может вызывать загрязнение образующихся семян пыльцой этих растений, приводя к присутствию генотипа, характерного для однолетнего типа развития, в предназначенных для продажи семенах. Это является неприемлемым для покупателей. Для выявления загрязнения характерным для однолетнего типа развития генотипом партии предназначенных для продажи семян выращивают в регионах, в которых однолетние виды свекольных не вырастают непосредственно после сбора семян. Растения являются неяровизированными и загрязняющие растения выявляют по наличию стрелок. Является очень желательной замена такого метода оценки основанным на применении маркеров скрининговым анализом, с помощью которого можно получать результаты за более короткий период времени, что должно приводить к снижению стоимости переработки семян.

Подход, основанный на применении маркеров, может оказаться также целесообразным для селекции сахарной свеклы, например, для ускорения процесса селекции, или для интродукции нового признака изменчивости, выбранного из множества диких видов свекольных. В этих случаях важно иметь маркер, близко сцепленный с геном В, для того, чтобы точно различать однолетний и двулетний типы развития.

В настоящем изобретении предложены пути создания указанных маркеров.

В частности, настоящее изобретение относится к полинуклеотиду, прежде всего выделенному полинуклеотиду, идентифицированному в геноме сахарной свеклы, включая его варианты и производные, где полинуклеотид генетически близко сцеплен или предпочтительно локализован в обусловливающем стрелкование гене или гене В. Изобретение относится также к применению указанного полинуклеотида для создания маркеров, которые можно применять для картирования, идентификации и выделения обусловливающего стрелкование гена или гена В в геноме сахарной свеклы.

Один из объектов изобретения относится к полинуклеотиду, предлагаемому в изобретении, для которого характерна истинная косегрегация с фенотипом, ассоциированным с геном, обусловливающим стрелкование (геном В), у сахарной свеклы.

Одним из вариантов осуществления изобретения является полинуклеотид, включая его информативные фрагменты, предлагаемый в изобретении и описанный выше, где полинуклеотид можно получать из области геномной ДНК, которая картирована на расстоянии 1 сМ против хода транскрипции относительно маркеров МР0176 и СЮ1 и для которой характерна косегрегация с маркером ОП31, характеризующийся истинной косегрегацией с фенотипом, который ассоциирован с геном, обусловливающим стрелкование (геном В), у сахарной свеклы.

Другим вариантом осуществления изобретения является полинуклеотид, включая его информативные фрагменты, прежде всего выделенный полинуклеотид, предлагаемый в изобретении и описанный выше, который можно получать из геномной ДНК, локализованной в области, которая ограничена мар- 1 022877 керами ОЛ31 и СЮ1.

Одним из вариантов осуществления изобретения является полинуклеотид, включая его информативный фрагмент, прежде всего выделенный полинуклеотид, который можно получать из геномной ДНК сахарной свеклы, связанный с обусловливающим стрелкование геном или геном В в геноме сахарной свеклы, и который содержит один или несколько из следующих элементов:

а) интронную область, которая позволяет получать продукт амплификации размером примерно 0,5 т.п.н. с помощью ПЦР-реакции с использованием прямого праймера РКК7-Р и обратного праймера РКК7-К, последовательности которых представлены в 8ЕО ГО N0: 7 и 8Е0 ГО N0: 8 соответственно, или пары праймеров, последовательности которых по меньшей мере на 90%, предпочтительно по меньшей мере на 95%, более предпочтительно по меньшей мере на 98% и вплоть до 99% идентичны последовательностям, представленным в 8Е0 ГО N0: 7 и 8Е0 ГО N0: 8 соответственно, при применении геномной ДНК сахарной свеклы в качестве матрицы, прежде всего получать полинуклеотидный фрагмент, который имеет нуклеотидную последовательность, представленную в 8Е0 ГО N0: 2, 3 или 4, или последовательность, которая по меньшей мере на 70%, предпочтительно по меньшей мере на 75%, более предпочтительно по меньшей мере на 80%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 85%, но наиболее предпочтительно по меньшей мере на 90% и по меньшей мере вплоть до 95-99% идентична указанной последовательности;

б) полинуклеотидный фрагмент, содержащий нуклеотидную последовательность, которая на 70%, предпочтительно на 75%, более предпочтительно на 80%, еще более предпочтительно на 85%, но наиболее предпочтительно на 90% и вплоть до 95-99% идентична нуклеотидной последовательности, представленной в 8Е0 ГО N0: 1 или 8Е0 ГО N0: 52;

в) полинуклеотидный фрагмент, содержащий нуклеотидную последовательность, представленную в 8Е0 ГО N0: 5, или последовательность, которая на 70%, предпочтительна на 75%, более предпочтительно на 80%, еще более предпочтительно на 85%, но наиболее предпочтительно на 90% и вплоть до 95-99% идентична нуклеотидной последовательности, представленной в 8Е0 ГО N0: 5 или 8Е0 ГО N0: 51;

г) полинуклеотидный фрагмент, который после сплайсинга кодирует полипептид, последовательность которого по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 85%, более предпочтительно по меньшей мере на 90%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 95%, но наиболее предпочтительно по меньшей мере на 98% и вплоть до 100% идентична аминокислотной последовательности, представленной в 8Е0 ГО N0: 6, и необязательно также

д) высококонсервативный участок, кодирующий мотив домена-приемника регулятора псевдоответа (Ркеийо Кекропзе Кеди1а!ог КесеНег Όοιηαίη) (РКК), который расположен вблизи ЛН₂-конца, и мотив ССТ на СоОн-конце.

Одним из вариантов осуществления изобретения является полинуклеотид, включая его информативный фрагмент, прежде всего выделенный полинуклеотид, содержащий интронную область, которая позволяет получать продукт амплификации размером примерно 0,5 т.п.н. с помощью ПЦР-реакции с использованием прямого праймера РКК7-Р и обратного праймера РКК7-К, последовательности которых представлены в 8Е0 ГО N0: 7 и 8Е0 ГО N0: 8 соответственно, или пары праймеров, последовательности которых по меньшей мере на 90%, предпочтительно по меньшей мере на 95%, более предпочтительно по меньшей мере на 98% и вплоть до 99% идентичны последовательностям, представленным в 8Е0 ГО N0: 7 и 8Е0 ГО N0: 8 соответственно, при применении геномной ДНК сахарной свеклы в качестве матрицы.

Одним из вариантов осуществления изобретения является полинуклеотид, включая его информативный фрагмент, прежде всего выделенный полинуклеотид, содержащий полинуклеотидный фрагмент, который имеет нуклеотидную последовательность, представленную в 8Е0 ГО N0: 1, или последовательность, которая по меньшей мере на 70%, предпочтительно по меньшей мере на 75%, более предпочтительно по меньшей мере на 80%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 85%, но наиболее предпочтительно по меньшей мере на 90% и по меньшей мере вплоть до 95-99% идентична указанной последовательности.

Одним из вариантов осуществления изобретения является полинуклеотид, включая его информативный фрагмент, прежде всего выделенный полинуклеотид, содержащий полинуклеотидный фрагмент, который имеет нуклеотидную последовательность, представленную в 8Е0 ГО N0: 2, 3 или 4, или последовательность, которая по меньшей мере на 70%, предпочтительно по меньшей мере на 75%, более предпочтительно по меньшей мере на 80%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 85%, но наиболее предпочтительно по меньшей мере на 90% и по меньшей мере вплоть до 95-99% идентична указанным последовательностям.

Одним из вариантов осуществления изобретения является полинуклеотид, включая его информативный фрагмент, прежде всего выделенный полинуклеотид, содержащий полинуклеотидный фрагмент, который после сплайсинга кодирует полипептид, последовательность которого по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 85%, более предпочтительно по меньшей мере на 90%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 95%, но наиболее предпочтительно по меньшей мере на 98% и вплоть до 100% идентична аминокислотной последовательности, представленной в 8Е0 ГО N0: 6.

- 2 022877

Одним из вариантов осуществления изобретения является полинуклеотид, включая его информативный фрагмент, прежде всего выделенный полинуклеотид, содержащий полинуклеотидный фрагмент, который имеет нуклеотидную последовательность, представленную в 5>ЕО ГО N0: 5, или последовательность, которая по меньшей мере на 70%, предпочтительно по меньшей мере на 75%, более предпочтительно по меньшей мере на 80%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 85%, но наиболее предпочтительно по меньшей мере на 90% и по меньшей мере вплоть до 95-99% идентична нуклеотидной последовательности, представленной в 5>Е0 ГО N0: 5.

Одним из вариантов осуществления изобретения является полинуклеотид, включая его информативный фрагмент, прежде всего выделенный полинуклеотид, содержащий полинуклеотидный фрагмент, который имеет нуклеотидную последовательность, представленную в 5>Е0 ГО N0: 51, или последовательность, которая по меньшей мере на 70%, предпочтительно по меньшей мере на 75%, более предпочтительно по меньшей мере на 80%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 85%, но наиболее предпочтительно по меньшей мере на 90% и по меньшей мере вплоть до 95-99% идентична нуклеотидной последовательности, представленной в 5>Е0 ГО N0: 51.

Одним из вариантов осуществления изобретения является полинуклеотид, включая его информативный фрагмент, прежде всего выделенный полинуклеотид, содержащий полинуклеотидный фрагмент, который имеет нуклеотидную последовательность, представленную в 5>Е0 ГО N0: 52, или последовательность, которая по меньшей мере на 70%, предпочтительно по меньшей мере на 75%, более предпочтительно по меньшей мере на 80%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 85%, но наиболее предпочтительно по меньшей мере на 90% и по меньшей мере вплоть до 95-99% идентична нуклеотидной последовательности, представленной в 5>Е0 ГО N0: 52.

Все индивидуальные численные значения, которые подпадают под диапазон от 70-99%, указанный выше в настоящем описании, т.е. 71, 72, 73, 74, 75, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99%, должны также рассматриваться как подпадающие под объем настоящего изобретения.

Одним из вариантов осуществления изобретения является полинуклеотид, включая его информативный фрагмент, прежде всего выделенный полинуклеотид, содержащий полинуклеотидный фрагмент, причем комплементарная цепь указанного полинуклеотидного фрагмента обладает способностью гибридизоваться с нуклеотидной последовательностью, представленной в 5>Е0 ГО N0: 1, прежде всего в умеренных условиях гибридизации, более предпочтительно в строгих условиях гибридизации. Одним из вариантов осуществления изобретения является полинуклеотид, включая его информативный фрагмент, прежде всего выделенный полинуклеотид, содержащий полинуклеотидный фрагмент, причем комплементарная цепь указанного полинуклеотидного фрагмента обладает способностью гибридизоваться с нуклеотидной последовательностью, представленной в 5>Е0 ГО N0: 2, 3 или 4, прежде всего в умеренных условиях гибридизации, более предпочтительно в строгих условиях гибридизации.

Одним из вариантов осуществления изобретения является полинуклеотид, включая его информативный фрагмент, прежде всего выделенный полинуклеотид, содержащий полинуклеотидный фрагмент, причем комплементарная цепь указанного полинуклеотидного фрагмента обладает способностью гибридизоваться с нуклеотидной последовательностью, представленной в 5>Е0 ГО N0: 5, прежде всего в умеренных условиях гибридизации, более предпочтительно в строгих условиях гибридизации.

Одним из вариантов осуществления изобретения является полинуклеотид, включая его информативный фрагмент, прежде всего выделенный полинуклеотид, содержащий полинуклеотидный фрагмент, причем комплементарная цепь указанного полинуклеотидного фрагмента обладает способностью гибридизоваться с нуклеотидной последовательностью, представленной в 5>Е0 ГО N0: 51, прежде всего в умеренных условиях гибридизации, более предпочтительно в строгих условиях гибридизации.

Одним из вариантов осуществления изобретения является полинуклеотид, включая его информативный фрагмент, прежде всего выделенный полинуклеотид, содержащий полинуклеотидный фрагмент, причем комплементарная цепь указанного полинуклеотидного фрагмента обладает способностью гибридизоваться с нуклеотидной последовательностью, которая кодирует полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в 5>Е0 ГО N0: 6, прежде всего в умеренных условиях гибридизации, более предпочтительно в строгих условиях гибридизации.

Одним из вариантов осуществления изобретения является полинуклеотид, включая его информативный фрагмент, прежде всего выделенный полинуклеотид, содержащий полинуклеотидный фрагмент, причем комплементарная цепь указанного полинуклеотидного фрагмента обладает способностью гибридизоваться с нуклеотидной последовательностью, представленной в 5>Е0 ГО N0: 52, прежде всего в умеренных условиях гибридизации, более предпочтительно в строгих условиях гибридизации.

Одном из вариантов осуществления изобретения является полинуклеотид, включая его информативный фрагмент, прежде всего выделенный полинуклеотид, где полинуклеотид можно получать из геномной ДНК сахарной свеклы, сцепленной с обусловливающим стрелкование геном или геном В в геноме сахарной свеклы, для чего

а) осуществляют скрининг ВАС-библиотеки (бактериальная искусственная хромосома), созданной из двулетнего коммерческого культивара Н20, с помощью прямого праймера РКК7-Р и обратного праймера РКК7-К, последовательности которых представлены в 5>Е0 ГО N0: 7 и 5>Е0 ГО N0: 8 соответ- 3 022877 ственно, или пары праймеров, последовательности которых по меньшей мере на 90%, предпочтительно по меньшей мере на 95%, более предпочтительно по меньшей мере на 98% и вплоть до 99% идентичны последовательностям, представленным в §ЕЦ ГО N0: 7 и §ЕЦ ГО N0: 8 соответственно, с помощью ПЦР-реакции в следующих условиях:

начальная денатурация при 95°С в течение 5 мин; затем циклов амплификации по 30 с при 95°С, с при 60°С;

с при 72°С; и затем мин при 72°С;

б) отбирают клон ВАС §ВА079-Ь24, содержащий два неперекрывающихся набора последовательных фрагментов, которые оба имеют последовательность, гомологичную Е8Т (экспрессируемый ярлык) СУ301305, представленную в §ЕЦ ГО N0: 1, и объединяют их в одну последовательность;

в) получают генную структуру гена ΒνΡΚΚ7 свеклы, содержащую интроны и экзоны, на основе сравнительного анализа набора последовательных фрагментов последовательности ВАС и Е8Т СУ301305, представленной в §ЕЦ ГО N0: 1, и гомологии последовательности с геном ΡΚΚ7 из АгаЫйор818.

В конкретном варианте осуществления изобретения полинуклеотид, предлагаемый в изобретении, содержит нуклеотидную последовательность, которая включает нуклеотидную последовательность, представленную в §ЕЦ ГО N0: 1.

В конкретном варианте осуществления изобретения полинуклеотид, предлагаемый в изобретении, содержит нуклеотидную последовательность, которая включает нуклеотидную последовательность, представленную в §ЕЦ ГО N0: 2.

В конкретном варианте осуществления изобретения полинуклеотид, предлагаемый в изобретении, содержит нуклеотидную последовательность, которая включает нуклеотидную последовательность, представленную в §ЕЦ ГО N0: 3.

В конкретном варианте осуществления изобретения полинуклеотид, предлагаемый в изобретении, содержит нуклеотидную последовательность, которая включает нуклеотидную последовательность, представленную в §ЕЦ ГО N0: 4.

В конкретном варианте осуществления изобретения полинуклеотид, предлагаемый в изобретении, содержит нуклеотидную последовательность, которая включает нуклеотидную последовательность, представленную в §ЕЦ ГО N0: 5.

В конкретном варианте осуществления изобретения полинуклеотид, предлагаемый в изобретении, содержит нуклеотидную последовательность, которая включает нуклеотидную последовательность, представленную в §ЕЦ ГО N0: 51.

В конкретном варианте осуществления изобретения полинуклеотид, предлагаемый в изобретении, содержит нуклеотидную последовательность, которая включает нуклеотидную последовательность, представленную в §ЕЦ ГО N0: 52.

В конкретном варианте осуществления изобретения полинуклеотид, предлагаемый в изобретении, содержит нуклеотидную последовательность, которая включает нуклеотидную последовательность, представленную в §ЕЦ ГО N0: 5, причем эта последовательность несет С в положении 3695, С в положении 3827, Т в положении 3954, Т в положении 5284, С в положении 5714, С в положении 10954, Т в положении 11043, С в положении 11143, С в положении 11150, А в положении 11220, С в положении 11238, А в положении 11299, А в положении 11391, С в положении 12053, С в положении 12086, Т в положении 12127, А в положении 12193, С в положении 12337 и С в положении 12837 и представляет собой аллель 1, ассоциированный с однолетним типом развития.

В конкретном варианте осуществления изобретения полинуклеотид, предлагаемый в изобретении, содержит нуклеотидную последовательность, которая включает нуклеотидную последовательность, представленную в §ЕЦ ГО N0: 5, причем эта последовательность несет Т в положении 3695, С в положении 3827, Т в положении 3954, Т в положении 5284, С в положении 5714, С в положении 10954, Т в положении 11043, С в положении 11143, С в положении 11150, А в положении 11220, А в положении 11238, Т в положении 11299, А в положении 11391, С в положении 12053, С в положении 12086, Т в положении 12127, С в положении 12193, С в положении 12337 и С в положении 12837 и представляет собой аллель 2, ассоциированный с однолетним типом развития.

В конкретном варианте осуществления изобретения полинуклеотид, предлагаемый в изобретении, содержит нуклеотидную последовательность, которая включает нуклеотидную последовательность, представленную в §ЕЦ ГО N0: 5, причем эта последовательность несет С в положении 3695, С в положении 3827, Т в положении 3954, Т в положении 5284, С в положении 5714, С в положении 10954, С в положении 11043, Т в положении 11143, С в положении 11150, А в положении 11220, С в положении 11238, Т в положении 11299, А в положении 11391, С в положении 12053, С в положении 12086, Т в положении 12127, С в положении 12193, С в положении 12337 и С в положении 12837 и представляет собой аллель 3, ассоциированный с однолетним типом развития.

В конкретном варианте осуществления изобретения полинуклеотид, предлагаемый в изобретении,

- 4 022877 содержит нуклеотидную последовательность, которая включает нуклеотидную последовательность, представленную в 8ЕО ГО N0: 5, причем эта последовательность несет С в положении 3695, С в положении 3827, Т в положении 3954, Т в положении 5284, С в положении 5714, С в положении 10954, Т в положении 11043, С в положении 11143, Т в положении 11150, А в положении 11220, С в положении 11238, Т в положении 11299, А в положении 11391, С в положении 12053, С в положении 12086, Т в положении 12127, А в положении 12193, С в положении 12337 и С в положении 12837 и представляет собой аллель 4, ассоциированный с однолетним типом развития.

В конкретном варианте осуществления изобретения полинуклеотид, предлагаемый в изобретении, содержит нуклеотидную последовательность, которая включает нуклеотидную последовательность, представленную в 8ЕО ГО N0: 5, причем эта последовательность несет С в положении 3695, С в положении 3827, Т в положении 3954, Т в положении 5284, С в положении 5714, С в положении 10954, Т в положении 11043, С в положении 11143, С в положении 11150, А в положении 11220, С в положении 11238, Т в положении 11299, А в положении 11391, С в положении 12053, А в положении 12086, Т в положении 12127, А в положении 12193, А в положении 12337 и С в положении 12837 и представляет собой аллель 5, ассоциированный с однолетним типом развития.

В конкретном варианте осуществления изобретения полинуклеотид, предлагаемый в изобретении, содержит нуклеотидную последовательность, которая включает нуклеотидную последовательность, представленную в 8ЕЦ ГО N0: 5, причем эта последовательность несет С в положении 3695, С в положении 3827, Т в положении 3954, Т в положении 5284, С в положении 5714, С в положении 10954, Т в положении 11043, С в положении 11143, С в положении 11150, А в положении 11220, С в положении 11238, Т в положении 11299, А в положении 11391, С в положении 12053, С в положении 12086, Т в положении 12127, А в положении 12193, А в положении 12337 и С в положении 12837 и представляет собой аллель 6, ассоциированный с однолетним типом развития.

В конкретном варианте осуществления изобретения полинуклеотид, предлагаемый в изобретении, содержит нуклеотидную последовательность, которая включает нуклеотидную последовательность, представленную в 8ЕЦ ГО N0: 5, причем эта последовательность несет С в положении 3695, А в положении 3827, А в положении 3954, С в положении 5284, Т в положении 5714, А в положении 10954, С в положении 11043, С в положении 11143, С в положении 11150, С в положении 11220, С в положении 11238, Т в положении 11299, С в положении 11391, А в положении 12053, С в положении 12086, С в положении 12127, С в положении 12193, С в положении 12337 и А в положении 12837 и представляет собой аллель 7, ассоциированный с двулетним типом развития.

В конкретном варианте осуществления изобретения полинуклеотид, предлагаемый в изобретении, содержит нуклеотидную последовательность, которая включает нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, аминокислотная последовательность которого представлена в 8ЕЦ ГО N0: 6.

Одним из вариантов осуществления изобретения является продукт амплификации размером примерно 0,5 т.п.н., включая его информативный фрагмент, который можно получать с использованием прямого праймера РРК7-Р и обратного праймера РРК7-К, последовательности которых представлены в 8ЕО ГО N0: 7 и 8ЕЦ ГО N0: 8 соответственно, при применении геномной ДНК сахарной свеклы в качестве матрицы.

Конкретным вариантом осуществления изобретения является набор полинуклеотидных маркеров, который содержит множество индивидуальных маркеров, где эти маркеры создают на основе полинуклеотида, представленного в 8ЕЦ ГО N0: 5, включая любой из его аллельных вариантов 1-7, которые описаны выше, и с его помощью можно выявлять различные 8МР (однонуклеотидный полиморфизм, полиморфизм единичных нуклеотидов) в нуклеотидных положениях, представленных в табл. 5, где с помощью указанного набора маркеров можно идентифицировать различные аллели и таким образом осуществлять дифференциацию однолетних и двулетних линий сахарной свеклы.

Одним из вариантов осуществления изобретения является одна или несколько молекул-зондов и/или один или несколько праймеров, прежде всего одна или несколько пар праймеров, но прежде всего одна или несколько пар праймеров, которая(ые) состоит из прямого праймера и обратного праймера, где праймеры обладают способностью к ренатурации с нуклеотидной последовательностью в области генома сахарной свеклы, которая генетически близко сцеплена с геном В, но прежде всего с областью в гене В, и которая содержит полинуклеотид, предлагаемый в изобретении и описанный выше, включая его информативный фрагмент, где указанный фрагмент содержит полиморфизм, прежде всего полиморфизм, основанный на 8МР, 88Р (простые повторяющиеся последовательности), делеции или инсерции по меньшей мере одного нуклеотида, но прежде всего полиморфизм, основанный на 8МР, этот полиморфизм является диагностическим для В-аллеля в В-локусе и позволяет различать характерный для однолетнего и характерный для двулетнего типа развития генотип или различные гаплотипы в группах растений сахарной свеклы, имеющих характерный для двулетнего или однолетнего типа развития генотип.

Одним из вариантов осуществления изобретения является полинуклеотидный маркер, который можно создавать из полинуклеотидной молекулы или ее информативного фрагмента, выбранного из группы полинуклеотидов, которые имеют последовательность, представленную в 8Е0 ГО N0: 1, 8Е0 ГО N0: 2, 8ЕО ГО N0: 3, 8ЕО ГО N0: 4, 8ЕО ГО N0: 5 , 8ЕО ГО N0: 51, 8ЕО ГО N0: 52, и полинуклеотида,

- 5 022877 который кодирует полипептид, аминокислотная последовательность которого представлена в 8ЕО ГО N0: 6, где указанный полинуклеотид содержит один или несколько полиморфизмов, прежде всего полиморфизм, основанный на 8ΝΡ, 88К, делеции или инсерции по меньшей мере одного нуклеотида, но прежде всего полиморфизм, основанный на 8ΝΡ, этот полиморфизм является диагностическим для В-аллеля в В-локусе и позволяет различать характерный для однолетнего и характерный для двулетнего типа развития генотип или различные гаплотипы в группах растений сахарной свеклы, имеющих характерный для двулетнего или однолетнего типа развития генотип.

Одним из конкретных вариантов осуществления изобретения является полинуклеотидный маркер, который создан на основе полинуклеотида, представленного в 8Е0 ГО N0: 2, указанный маркер можно применять для выявления по меньшей мере одного из следующих 8ΝΡ в 3-м интроне гена ΒνΡΚΚ.7:

а) цитозин или тимин в положении 87,

б) цитозин или тимин в положении 160,

в) аденин или гуанин в положении 406, и таким образом осуществлять дифференциацию характерных для однолетнего и двулетнего типа развития гаплотипов.

Одним из вариантов осуществления изобретения является полинуклеотидный маркер, представленный одной или несколькими молекулами-зондами и/или одним или несколькими праймерами, прежде всего одной или несколькими парами праймеров, но прежде всего парой праймеров, которая состоит из прямого праймера и обратного праймера, где праймеры обладают способностью к ренатурации с нуклеотидной последовательностью в области генома сахарной свеклы, которая генетически близко сцеплена с геном В и имеет нуклеотидные последовательности, представленные в 8Е0 ГО N0: 2, и способностью к амплификации информативного фрагмента, где указанный фрагмент содержит один или несколько полиморфизмов, прежде всего полиморфизм, основанный на 8ΝΡ, 88К, делеции или инсерции по меньшей мере одного нуклеотида, но прежде всего полиморфизм, основанный на 8ΝΡ, представленный, например, в табл. 1, где полиморфизм является диагностическим для В-аллеля в В-локусе и позволяет различать растения, которые имеют характерный для однолетнего или характерный для двулетнего типа развития генотип или различные гаплотипы в группах растений сахарной свеклы, имеющих характерный для двулетнего или однолетнего типа развития генотип.

Конкретным вариантом осуществления изобретения является пара праймеров, предлагаемая в изобретении и описанная выше, которая обладает способностью к ренатурации с нуклеотидной последовательностью в 3-м интроне, представленной в 8Е0 ГО N0: 2, и к амплификации информативного фрагмента из указанной области, который содержит полиморфизм, прежде всего полиморфизм, представляющий собой 8Ж С/Т в положении № 87, и/или 8Ж С/Т в положении № 160, и/или 8№ Л/С в положении № 406.

В частности, пара праймеров включает прямой праймер ΡΚΚ7-Ρ, представленный в 8Е0 ГО N0: 7, и обратный праймер ΡΚΚ7-Κ, представленный в 8Е0 ГО N0: 8, предназначенные для амплификации фрагмента, который содержит 8Ж № 160, 87 и 406.

Одним из вариантов осуществления изобретения является полинуклеотидный маркер, представленный одной или несколькими молекулами-зондами и/или одним или несколькими праймерами, прежде всего одной или несколькими парами праймеров, но прежде всего парой праймеров, которая состоит из прямого праймера и обратного праймера, где праймеры обладают способностью к ренатурации с нуклеотидной последовательностью в области генома сахарной свеклы, которая генетически близко сцеплена с геном В, прежде всего с нуклеотидной последовательностью в гене В, в частности с нуклеотидной последовательностью, которая представлена в 8Е0 ГО N0: 5, и способностью к амплификации информативного фрагмента, где указанный фрагмент содержит один или несколько полиморфизмов, прежде всего полиморфизм, основанный на 8ΜΡ, 88К, делеции или инсерции по меньшей мере одного нуклеотида, но прежде всего полиморфизм, основанный на 8ΜΡ, представленный, например, в табл. 5, где полиморфизм является диагностическим для В-аллеля в В-локусе и позволяет различать растения, имеющие характерный для однолетнего и характерный для двулетнего типа развития генотип или различные гаплотипы в группах растений сахарной свеклы, имеющих характерный для двулетнего или однолетнего типа развития генотип.

Конкретным вариантом осуществления изобретения является пара праймеров, предлагаемая в изобретении и описанная выше, которая обладает способностью к ренатурации с нуклеотидной последовательностью в кодирующей области гена ΒνΡΚΚ7, которая представлена в 8Е0 ГО N0: 5, к амплификации информативного фрагмента из указанной кодирующей последовательности, содержащего полиморфизм, прежде всего полиморфизм, представляющий собой 8NΡ А/С в положении № 3827 и/или 8ΗΡ А/Т в положении 3954, и/или 8Ж Т/С в положении 5714, и/или 8Ж С/А в положении 11220, и/или 8№ С/А в положении 11391, и/или 8NΡ А/С в положении 12053, и/или 8ΗΡ С/Т в положении 12127.

В частности, первая пара праймеров содержит прямой праймер Р3806, представленный в 8Е0 ГО N0: 27, и обратный праймер К3807, представленный в 8Е0 ГО N0: 28, для амплификации фрагмента, который содержит 8№ № 3827 и 8Ж № 3954.

Вторая пара праймеров содержит прямой праймер Р3768, представленный в 8Е0 ГО N0: 21, и

- 6 022877 обратный праймер К3769, представленный в §ЕЦ ГО N0: 22, для амплификации фрагмента, который содержит 8ΝΡ № 5714.

Третья пара праймеров содержит прямой праймер Р3857, представленный в §ЕЦ ГО N0: 37, и обратный праймер К3858, представленный в §ЕЦ ГО N0: 38, для амплификации фрагмента, который содержит 8ΝΡ № 11220.

Четвертая пара праймеров содержит прямой праймер Р3859, представленный в §ЕЦ ГО N0: 39, и обратный праймер К3860, представленный в §ЕЦ ГО N0: 40, для амплификации фрагмента, который содержит §№ № 11391.

Пятая пара праймеров содержит прямой праймер Р3861, представленный в §ЕЦ ГО N0: 41, и обратный праймер К3862, представленный в §ЕЦ ГО N0: 42, для амплификации фрагмента, который содержит §ИР № 12053 и 12127.

Одним из вариантов осуществления изобретения является предлагаемый в изобретении полинуклеотидный маркер, представленный одной или несколькими молекулами-зондами и/или одним или несколькими праймерами, прежде всего одной или несколькими парами праймеров, но прежде всего парой праймеров, которая состоит из прямого праймера и обратного праймера, где праймеры обладают способностью к ренатурации с нуклеотидной последовательностью в области генома сахарной свеклы, которая генетически близко сцеплена с геном В, прежде всего с нуклеотидной последовательностью в промоторной области гена ΡΚΚ7, прежде всего с нуклеотидной последовательностью в промоторной области гена ΡΚΚ7, которая представлена в §ЕЦ ГО N0: 5 и §ЕЦ ГО N0: 51 соответственно, и к амплификации информативного фрагмента, который является диагностическим для В-аллеля в В-локусе и позволяет различать растения, которые имеют характерный для однолетнего и характерный для двулетнего типа развития генотип или различные гаплотипы в группах растений сахарной свеклы, имеющих характерный для двулетнего или однолетнего типа развития генотип.

Конкретным вариантом осуществления изобретения является полинуклеотидный маркер, который представлен парой праймеров, выбранной из группы, включающей пару праймеров Р3808 (8ЕЦ ГО N0: 29) и К3809 (8Е0 ГО N0: 30), которая обеспечивает получение продукта амплификации размером 0,6 т.п.н.; пару праймеров Р3855 (8ЕЦ ГО N0: 35) и К3809 (8ЕЦ ГО N0: 30), которая обеспечивает получение продукта амплификации размером 1,0 т.п.н.; и пару праймеров Р3855 (8ЕЦ ГО N0: 35) и К3856 (8ЕЦ ГО N0: 36) (табл. 4), которая обеспечивает получение продукта амплификации размером 0,8 т.п.н.; когда в качестве матрицы применяют геномную ДНК из двулетних линий, но не обеспечивает амплификацию в случае однолетних линий.

Указанный информативный фрагмент может содержать также один или несколько полиморфизмов, прежде всего полиморфизм, основанный на δΜΡ, δδΚ, делеции или инсерции по меньшей мере одного нуклеотида, но прежде всего полиморфизм, основанный на δΜΡ, представленный, например, в табл. 5, который является диагностическим для В-аллеля в В-локусе и позволяет различать характерный для однолетнего и характерный для двулетнего типа развития генотип или различные гаплотипы в группах растений сахарной свеклы, имеющих характерный для двулетнего или однолетнего типа развития генотип.

Изобретение относится также к одной или нескольким молекулам-зондам и/или одному или нескольким праймерам, прежде всего одной или нескольким парам праймеров, но прежде всего паре праймеров, которая состоит из прямого праймера и обратного праймера, где праймеры обладают способностью к ренатурации с нуклеотидной последовательностью в области генома сахарной свеклы, которая генетически близко сцеплена с геном В, прежде всего с нуклеотидной последовательностью в промоторной области гена ΡΚΚ7, в частности с нуклеотидной последовательностью в промоторной области гена ΡΚΚ.7, которая представлена в §ЕЦ ГО N0: 5 и §ЕЦ ГО N0: 51 соответственно, и к амплификации информативного фрагмента, который является диагностическим для В-аллеля в В-локусе и позволяет различать растения, которые имеют характерный однолетнего и характерный для двулетнего типа развития генотип или различные гаплотипы в группах растений сахарной свеклы, имеющих характерный для двулетнего или однолетнего типа развития генотип.

Другим конкретным вариантом осуществления изобретения является пара праймеров, выбранная из группы, включающей пару праймеров Р3808 (8ЕЦ ГО N0: 29) и К3809 (8ЕЦ ГО N0: 30), которая обеспечивает получение продукта амплификации размером 0,6 т.п.н.; пару праймеров Р3855 (8ЕЦ ГО N0: 35) и К3809 (8ЕЦ ГО N0: 30), которая обеспечивает получение продукта амплификации размером 1,0 т.п.н.; и пару праймеров Р3855 (8ЕЦ ГО N0: 35) и К3856 (8ЕЦ ГО N0: 36) (табл. 4), которая обеспечивает получение продукта амплификации размером 0,8 т.п.н., когда в качестве матрицы применяют геномную ДНК из двулетних линий, но не обеспечивает амплификацию в случае однолетних линий.

Описанные выше молекулы-зонды и/или праймеры можно применять в способе идентификации загрязнений характерным для однолетнего типа развития геномом поступающих в продажу семян сахарной свеклы.

Одним из вариантов осуществления изобретения является набор полинуклеотидных зондов, содержащий по меньшей мере две различные молекулы-зонды, которые комплементарны подобласти в информативном полинуклеотидном фрагменте, предлагаемом в изобретении и описанном выше, который содержит полиморфный сайт, с помощью которого амплифицируют частично перекрывающиеся фраг- 7 022877 менты, различающиеся только одним или двумя ошибочными спариваниями оснований в области перекрытия, при этом первый зонд, прежде всего зонд, меченный первым флуоресцентным красителем, более предпочтительно первым флуоресцентным красителем и гасителем, представляет собой один аллель, а второй зонд, прежде всего зонд, меченный вторым флуоресцентным красителем, который не идентичен первому красителю, более предпочтительно вторым флуоресцентным красителем и гасителем, представляет собой другой аллель.

В конкретном варианте осуществления изобретения указанный информативный полинуклеотидный фрагмент содержит полиморфизм, где указанный полиморфизм основан на 8ΝΡ № 3827 в доменеприемнике псевдоответа гена ΡΚΚ7, последовательность которого представлена в 8ЕО ГО N0: 5, а первая молекула-зонд, меченная первым флуоресцентным красителем, имеет нуклеотидную последовательность, представленную в 8Е0 ГО N0: 47, а вторая молекула-зонд, меченная вторым флуоресцентным красителем, имеет нуклеотидную последовательность, представленную в 8Е0 ГО N0: 48.

Одним из вариантов осуществления изобретения является применение полинуклеотида, предлагаемого в изобретении и представленного выше, или любого его информативного фрагмента для создания маркера, который можно применять для анализа аллельной дискриминации с целью выявления полиморфизма в геноме сахарной свеклы, где полиморфизм является диагностическим для В-аллеля в Влокусе и позволяет различать характерный для однолетнего и характерный для двулетнего типа развития генотип или различные гаплотипы в группах растений сахарной свеклы, имеющих характерный для двулетнего типа развития генотип, или применять для картирования гена В в геноме сахарной свеклы.

Конкретным вариантом осуществления изобретения является применение одного или нескольких праймеров, прежде всего одной или нескольких пар праймеров, предлагаемых в изобретении и описанных выше, в анализе аллельной дискриминации с целью выявления полиморфизма в геноме сахарной свеклы, прежде всего полиморфизма, основанного на δΝΡ, §§К, делеции или инсерции по меньшей мере одного нуклеотида, но прежде всего полиморфизма, основанного на 8ΝΡ, где полиморфизм является диагностическим для В-аллеля в В-локусе и позволяет различать характерный для однолетнего и характерный для двулетнего типа развития генотип или различные гаплотипы в группах растений сахарной свеклы, имеющих характерный для двулетнего типа развития генотип.

В другом конкретном варианте осуществления изобретения набор молекул-зондов, предлагаемых в изобретении и описанных выше, можно применять также в указанном анализе аллельной дискриминации.

Одним из вариантов осуществления изобретения является способ выявления отсутствия или присутствия аллеля, ассоциированного с признаком однолетности у растения сахарной свеклы, заключающийся в том, что

а) отбирают образец генома растения сахарной свеклы, подлежащий анализу,

б) анализируют нуклеотидную последовательность геномной области сахарной свеклы, генетически близко сцепленную с геном В и комплементарную или содержащую последовательность полинуклеотида, предлагаемого в изобретении и описанного выше, и

в) сравнивают указанную последовательность с аллельной последовательностью, для которой известно, что она ассоциирована с двулетним фенотипом и однолетним фенотипом соответственно.

б) амплифицируют фрагмент из указанного образца ДНК с помощью праймера, прежде всего пары праймеров, комплементарной и связывающейся с последовательностью, которая присутствует в промоторной области гена ΒνΡΚΚ7, в частности ΒνΡΚΚ7, последовательность которого представлена в 8Е0 ГО N0: 51, и

в) сравнивают указанную последовательность с аллельной последовательностью, для которой известно, что она ассоциирована с двулетним фенотипом, но не ассоциирована с однолетним фенотипом.

б) зондируют указанный образец ДНК молекулой-зондом, содержащей специфическую для аллеля последовательность, прежде всего специфическую для аллеля последовательность из промоторной области гена ΒνΡΚΚ7, в частности ΒνΡΚΚ7, последовательность которого представлена в 8Е0 ГО N0: 51, для которой известно, что она присутствует в аллеле, ассоциированном с двулетним типом развития, но не присутствует в аллеле, ассоциированном с однолетним типом развития.

В конкретном варианте осуществления изобретения в указанном способе применяют пару праймеров, выбранную из группы, включающей пару праймеров Р3808 (8Е0 ГО N0: 29) и К.3809 (8Е0 ГО N0: 30), которая обеспечивает получение продукта амплификации размером 0,6 т.п.н.; пару праймеров Р3855 (8Е0 ГО N0: 35) и К3809 (8Е0 ГО N0: 30), которая обеспечивает получение продукта амплификации

- 8 022877 размером 1,0 т.п.н.; и пару праймеров Р3855 (8ЕЦ ГО N0: 35) и К3856 (8ЕЦ ГО N0: 36) (табл. 4), которая обеспечивает получение продукта амплификации размером 0,8 т.п.н., когда в качестве матрицы применяют геномную ДНК из двулетних линий, но не обеспечивает амплификацию в случае однолетних линий.

Одним из вариантов осуществления изобретения является способ выявления специфического гаплотипа в группе растений сахарной свеклы, которые имеют характерный для двулетнего типа развития генотип, заключающийся в том, что

в) сравнивают указанную последовательность с аллельной последовательностью, для которой известно, что она ассоциирована с конкретным гаплотипом.

В конкретном варианте осуществления изобретения осуществляют анализ последовательности с использованием молекулярного маркера, основой которого является полинуклеотид или его информационный фрагмент или один или несколько праймеров, прежде всего одна или несколько пар праймеров, но предпочтительно одна или несколько пар праймеров, включающая(ие) прямой праймер и обратный праймер, предлагаемые в изобретении и описанные выше.

Другим конкретным вариантом осуществления изобретения является способ выявления отсутствия или присутствия аллеля, ассоциированного с признаком однолетности у растения сахарной свеклы, заключающийся в том, что

б) анализируют нуклеотидную последовательность интронной области, которую можно получать из генома сахарной свеклы с помощью ПЦР-амплификации, с использованием прямого праймера РРК7-Р, последовательность которого представлена в 8ЕЦ ГО N0: 7, и обратного праймера, РКК.7-К, последовательность которого представлена в 8ЕЦ ГО N0: 8, и

в) сравнивают указанную последовательность с аллельной последовательностью, для которой известно, что она ассоциирована с двулетним фенотипом или однолетним фенотипом соответственно.

В одном из вариантов осуществления изобретения последовательность интронной области по меньшей мере на 70%, предпочтительно по меньшей мере на 75%, более предпочтительно по меньшей мере на 80%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 85%, но наиболее предпочтительно по меньшей мере на 90% и вплоть до 95-99% идентична нуклеотидной последовательности, представленной в ЗЕЦ ГО N0: 2.

Еще в одном конкретном варианте осуществления изобретения интронная область имеет нуклеотидную последовательность, представленную в ЗЕЦ ГО N0: 2.

Другим конкретным вариантом осуществления изобретения является способ выявления отсутствия или присутствия аллеля, ассоциированного с признаком однолетности растения сахарной свеклы, заключающийся в том, что

б) анализируют нуклеотидную последовательность геномной области, содержащей нуклеотидную последовательность, представленную в ЗЕЦ ГО N0: 5, и

в) сравнивают указанную последовательность с аллельной последовательностью, для которой известно, что она ассоциирована с двулетним фенотипом или однолетним фенотипом соответственно, и

г) определяют, получен ли указанный геномный образец из генома, определяющего однолетний или двулетний фенотип.

Еще одним вариантом осуществления изобретения является способ, заключающийся в том, что в геномном образце из растения сахарной свеклы анализируют интронную область полинуклеотида, предлагаемого в изобретении и описанного выше, с помощью прямого и обратного праймеров, фланкируя подобласть в интронной области, для которой известно, что она содержит полиморфный сайт, амплифицируя указанную подобласть и сравнивая амплифицированный фрагмент с аллельной последовательностью, для которой известно, что она ассоциирована с двулетним фенотипам или однолетним фенотипом соответственно.

Еще одним конкретным вариантом осуществления изобретения является описанный выше способ, заключающийся в том, что создают набор полинуклеотидных зондов на основе ЗЫР, содержащий две отдельных молекулы-зонда, которые отличаются по меньшей мере одним ошибочным спариванием, предпочтительно двумя или большим количеством ошибочных спариваний, которые локализованы в соседних сайтах, но прежде всего одним ошибочным спариванием, в котором первая молекула-зонд, прежде всего меченая молекула-зонд, более предпочтительно молекула-зонд, меченная первым флуоресцентным красителем и гасителем, представляет собой один аллель, а вторая молекула-зонд, прежде всего меченая молекула-зонд, более предпочтительно молекула-зонд, меченная вторым флуоресцентным красителем, который не идентичен первому красителю, и гасителем, представляет собой другой аллель, и в котором указанный набор полинуклеотидных зондов применяют для дискриминации двух аллельных

- 9 022877 вариантов.

В частности, маркеры, предлагаемые в настоящем изобретении, можно применять в анализе аллельной дискриминации, прежде всего в анализе дискриминации различных гаплотипов в группах растений, которые имеют характерный для двулетнего типа развития генотип. Для указанного анализа используют набор полинуклеотидных зондов, содержащий две отдельные молекулы-зонды, которые комплементарны, например, подобласти гена ΒνΡΚΚ.7, которую можно получать ПЦР-амплификацией с использованием прямого праймера РРК.7-Р и обратного праймера ΡΚΚ.7-Κ, последовательности которых представлены в 8ЕО ГО N0: 7 и 8Е0 ГО N0: 8 соответственно, при этом молекулы-зонды различаются только одним ошибочным спариваний оснований, прежде всего в положении № 631.

Первая молекула-зонд, прежде всего молекула-зонд, которая имеет последовательность, представленную в 8Е0 ГО N0: 9, и помечена первым флуоресцентным красителем, таким, например, как РАМ, более предпочтительно первым флуоресцентным красителем и гасителем, представляет собой один аллель, а вторая молекула-зонд, прежде всего молекула-зонд, которая имеет последовательность, представленную в 8Е0 ГО N0: 10, и помечена вторым флуоресцентным красителем, который не идентичен первому красителю, таким как У1С, более предпочтительно вторым флуоресцентным красителем и гасителем, представляет собой второй аллель.

Следующим вариантом осуществления изобретения является анализ аллельной дискриминации, предназначенный для выявления полиморфизма в геномной области генома сахарной свеклы, который обладает способностью к косегрегации с фенотипом однолетности, прежде всего полиморфизма, основанного на 8МР, 88Р. делеции или инсерции по меньшей мере одного нуклеотида, но прежде всего полиморфизма, основанного на 8МР, где этот полиморфизм является диагностическим для Β-аллеля в Βлокусе и позволяет различать характерный для однолетнего и характерный для двулетнего типа развития генотип или различные гаплотипы в группах растений сахарной свеклы, имеющих характерный для однолетнего и характерный для двулетнего типа развития генотип, для которого применяют молекулярный маркер, созданный на основе полинуклеотида, предлагаемого в изобретении и описанного выше, или любой его информативный фрагмент.

В конкретном варианте осуществления изобретения молекулярный маркер содержит пару праймеров, предлагаемых в изобретении и описанных выше.

Другим конкретным вариантом осуществления изобретения является анализ аллельной дискриминации, предназначенный для выявления однонуклеотидного полиморфизма в интронной области, которую можно получать из генома сахарной свеклы с помощью ПЦР-амплификации с использованием прямого праймера РРК.7-Р, последовательность которого представлена в 8Е0 ГО N0: 7, и обратного праймера РКК.7-К, последовательность которого представлена в 8Е0 ГО N0: 8, для которого применяют набор праймеров и/или полинуклеотидных зондов, предлагаемых в изобретении и описанных выше.

В одном из вариантов осуществления изобретения последовательность интронной области по меньшей мере на 70%, предпочтительно по меньшей мере на 75%, более предпочтительно по меньшей мере на 80%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 85%, но наиболее предпочтительно по меньшей мере на 90% и вплоть до 95-99% идентична нуклеотидной последовательности, представленной в 8ЕЕ) ГО N0: 2.

Еще в одном конкретном варианте осуществления изобретения интронная область имеет нуклеотидную последовательность, представленную в 8Е0 ГО N0: 2.

Одним из вариантов осуществления изобретения является применение полинуклеотида, предлагаемого в изобретении и описанного выше, для создания молекулярного маркера, который можно использовать для выявления отсутствия или присутствия аллеля, ассоциированного с признаком однолетности в геноме сахарной свеклы, которое предусматривает

а) идентификацию указанных полиморфных сайтов,

б) оценку связи указанных полиморфизмов с отсутствием или присутствием аллеля, ассоциированного с признаком однолетности у сахарной свеклы, путем

в) создания молекулы-зонда или нескольких молекул-зондов, прежде всего праймера или нескольких праймеров, предпочтительно пары праймеров или нескольких пар праймеров, но наиболее предпочтительно прямого и обратного праймера, которые распознают нуклеотидную последовательность, фланкирующих указанный полиморфный сайт, для амплификации полинуклеотида, содержащего указанный полиморфный сайт, который можно применять для анализа аллельной дискриминации.

Одним из вариантов осуществления изобретения является способ идентификации загрязнений характерным для однолетнего типа развития генотипом предназначенных для продажи семян, заключающийся в том, что применяют полинуклеотид, предлагаемый в изобретении и описанный выше, или его информативный фрагмент в качестве маркера для выявления присутствия или отсутствия определяющего однолетность аллеля в полученном из растения образце.

В частности, изобретение относится к способу идентификации загрязнений характерным для однолетнего типа развития генотипом предназначенных для продажи семян, заключающемуся в том, что применяют полинуклеотид, предлагаемый в изобретении и описанный выше, или его информативный фрагмент в качестве маркера для идентификации загрязнений характерным для однолетнего типа разви- 10 022877 тия генотипом предназначенных для продажи семян.

Одним из вариантов осуществления изобретения является способ идентификации загрязнений характерным для однолетнего типа развития генотипом предназначенных для продажи семян, заключающийся в том, что применяют основанный на использовании маркера анализ аллельной дискриминации, предлагаемый в изобретении и описанный выше.

Изобретение относится также к применению гена В, прежде всего гена ΒνΡΚΚ7, в основанном на применении трансгенов подходе к получению растений, имеющих однолетний или характеризующийся отсутствием стрелкования фенотип.

В частности, изобретение относится к химерным конструкциям, содержащим кассету экспрессии, которая несет кодирующую последовательность гена В, предпочтительно кодирующую последовательность ΒνΡΚΚ7, представленную в ЗЕО ГО N0: 1, но наиболее предпочтительно в ЗЕО ГО N0: 52, или последовательность, которая идентична ей по меньшей мере на 70%, предпочтительно по меньшей мере на 75%, более предпочтительно по меньшей мере на 80%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 85%, но наиболее предпочтительно по меньшей мере на 90% и вплоть до 95-99%, под контролем регуляторных элементов, в частности под контролем регуляторных элементов, обладающих функциональной активностью в растениях.

Одним из вариантов осуществления изобретения являются химерные конструкции, содержащие кассету экспрессии, которая несет кодирующую последовательность гена В, предпочтительно кодирующую последовательность ΒνΡΡΚ7, представленную в ЗЕО ГО N0: 1, но наиболее предпочтительно в ЗЕО ГО N0: 52, или последовательность, которая идентична ей по меньшей мере на 70%, предпочтительно по меньшей мере на 75%, более предпочтительно по меньшей мере на 80%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 85%, но наиболее предпочтительно по меньшей мере на 90% и вплоть до 95-99%, под контролем регуляторных элементов, в частности под контролем связанных с признаком однолетности промотором и терминирующих последовательностей, таких как характерные для гена ΡΚΚ7, прежде всего гена ΡΡΚ7 Ве!а уифагй.

В одном из вариантов осуществления изобретения химерная конструкция, описанная выше, может содержать также ген маркера для селекции, который позволяет различать трансформированный и нетрансформированный растительный материал при осуществлении процесса отбора.

В одном из вариантов осуществления изобретения химерная конструкция, предлагаемая в изобретении, содержит маркер отрицательной селекции, прежде всего маркер для селекции, который кодирует фактор, определяющий устойчивость к токсичным для растения соединениям, таким как антибиотики или гербициды.

В одном из вариантов осуществления изобретения химерная конструкция, предлагаемая в изобретении, содержит маркер положительной селекции, прежде всего маркер для селекции, который кодирует фермент, придающий трансформированному растению селективное преимущество по сравнению с нетрансформированными растениями, прежде всего преимущество с позиций питания, такой, например, как ген фосфоманнозоизомеры, ген ксилозоизомеразы.

Одним из вариантов осуществления изобретения является трансформирующий вектор и/или экспрессионный вектор, прежде всего растительный трансформирующий вектор и/или экспрессионный вектор, который содержит химерную конструкцию, предлагаемую в изобретении и описанную выше.

Одним из вариантов осуществления изобретения является растительная клетка, прежде всего растительная клетка растения сахарной свеклы, которая содержит химерную полинуклеотидную конструкцию или векторную молекулу, предлагаемую в изобретении и описанную выше.

Одним из вариантов осуществления изобретения является растение, прежде всего растение сахарной свеклы, которое содержит растительную клетку, предлагаемую в изобретении, и экспрессирует белок, кодируемый геном В, прежде всего белок, кодируемый геном ΒνΡΡΚ7, например растение, имеющее однолетний фенотип.

Одним из вариантов осуществления изобретения является полинуклеотидная конструкция, предназначенная для трансгенной супрессии экспрессии гена ΒνΡΡΚ7 прежде всего с помощью антисмыслового или ΡΗΚί-подхода (подхода, основанного на РНК-интерференции).

Одним из вариантов осуществления изобретения является полинуклеотидная конструкция, которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую бзРНК, которая обладает способностью направленно воздействовать на мРНК, продуцируемые в результате транскрипции последовательности ДНК, которая кодирует белок гена В, прежде всего белок гена ΒνΡΚΚ7, приводя к их расщеплению.

Одним из вариантов осуществления изобретения является полинуклеотидная конструкция, которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую бзРНК, которая практически идентична по меньшей области кодирующей последовательности гена В, в частности кодирующей области гена ΒνΡΡΚ7, представленной в ЗЕО ГО N0: 1, но прежде всего в ЗЕО ГО N0: 52, или последовательности, которая идентична ей по меньшей мере на 70%, предпочтительно по меньшей мере на 75%, более предпочтительно по меньшей мере на 80%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 85%, но наиболее предпочтительно по меньшей мере на 90% и вплоть до 95-99%.

Одним из вариантов осуществления изобретения является полинуклеотидная конструкция, которая

- 11 022877 содержит фрагмент кодирующей области гена В, в частности фрагмент кодирующей области гена ΒνΡΚΚ7, представленной в 8ЕР ГО N0: 1, но прежде всего в 8ЕР ГО N0: 52, или последовательности, которая идентична ей по меньшей мере на 70%, предпочтительно по меньшей мере на 75%, более предпочтительно по меньшей мере на 80%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 85%, но наиболее предпочтительно по меньшей мере на 90% и вплоть до 95-99%, которая находится в кассете для ΡΗΚί под контролем конститутивного промотора, такого, например, как промотор ИЫ3 из ЛгаЫбор515.

Одним из вариантов осуществления изобретения является трансформирующий вектор и/или применяемый для ΡΗΚί экспрессионный вектор, прежде всего растительный трансформирующий вектор и/или экспрессионный вектор, который содержит полинуклеотидную конструкцию, предлагаемую в изобретении и описанную выше.

Одним из вариантов осуществления изобретения является растительная клетка, которая содержит полинуклеотидную конструкцию или векторную молекулу, предлагаемую в изобретении и описанную выше.

Одним из вариантов осуществления изобретения является растение, прежде всего растение сахарной свеклы, которое содержит растительную клетку, предлагаемую в изобретении, и экспрессирует бвРНК, в результате чего подавляется стрелкование, и растение приобретает фенотип, характеризующийся отсутствием стрелкования.

Краткое описание чертежей и последовательностей

На чертежах показано:

фиг. 1 - сравнение аминокислотных последовательностей КЕС-доменов различных видов и предполагаемого КЕС-домена Е8Т СУ301305 сахарной свеклы. Идентичные аминокислоты обозначены черным цветом; консервативные - серым цветом; аминокислоты с низким уровнем подобия - светло-серым цветом и неподобные - белым цветом. ВЬ, Вогбс1с11а ЬтопсШверйса; Ββ, ВасШив виЫШв; Βν, Вс1а мбдапв; Ес, ЕвсНепсЫа сой; Кр, К1еЬв1е11а рпеитотае; Ра, Рвеиботопав аегидшова; Кс, КНобоЬас1ег сарви1аШв; 8с, ЫгсрЮтуссв соейсо1ог; δί, δΗί^1Π Пехпеп; δΐ, δа1тоηе11а 1ур1йтипит;

фиг. 2 - сравнение аминокислотных последовательностей белка РКК7 ЛтаЫборв1в и предсказанного фрагмента белка ΕδΤ У301305 сахарной свеклы. Идентичные аминокислоты обозначены черным цветом; подобные - серым цветом; и неподобные - белым цветом;

фиг. 3 - сравнительный анализ первичной структуры последовательностей геномной и мРНК гена РКК7 ЛтаЫборв1в и ΕδΤ СУ301305 сахарной свеклы. Консервативные нуклеотиды ЛтаЫборв1в и Ве1а νυ1дапв Ь. обозначены серым цветом. Интроны обозначены заштрихованными полосами;

фиг. 4 - генетическая карта хромосомы II сахарной свеклы. Название маркеров приведены справа от хромосомы, а слева показаны генетические дистанции в порядке их возрастания;

фиг. 5 - схематическое изображение генной структуры гена ΒνΡΚΚ7, включая предполагаемые экзоны и интроны. Область, консервативная ΕδΤ СУ301305, обозначена широкой стрелкой;

фиг. 6 - сравнение аминокислотных последовательностей представителей семейства продуктов гена РКК ЛтаЫборв1в и белка ΒνΡΚΚ7. Идентичные аминокислоты обозначены черным цветом; консервативные - серым цветом; аминокислоты с низким уровнем подобия - светло-серым цветом и неподобные белым цветом. Мотивы КЕС и ССТ обозначены прямоугольниками;

на фиг. 7 - филогенетическая взаимосвязь между ΒνΡКК7 и родственными белками из других видов цветковых растений. Предсказанную аминокислотную последовательность ΒνΡКК7 выравнивали с указанными ниже белками с помощью программы С1ив1а1А и конструировали неукорененное филогенетическое дерево. Для выведения эволюционной истории использовали метод объединения соседей (№1дйЬот-.Го1тп§ МеШоб) (Бабой и №ί, 1987). Для выведения эволюционной истории анализируемых таксонов применяли консенсусное дерево, построенное методом бутстрэпа (Ьоо1в1гар) на основе 1000 реплик (Ре1вепв1:е1п, 1985). Ветви, соответствующие разделению, воспроизводимому менее чем в 50% Ьоо1в1гар-реплик. удаляли (осуществляли их коллапс). Рядом с ветвями указан процент реплик деревьев, для которых ассоциированные таксоны кластеризовали, при осуществлении Ьоо1в1гар-анализа (1000 реплик). Дерево изображено в таком масштабе, когда длины ветвей представлены в тех же единицах, представляющих собой эволюционные расстояния, которые применяли для выведения филогенетического дерева. Эволюционные расстояния рассчитывали с помощью метода коррекции Пуассона (2искегкаиб1 и Раийпд, 1965) и выражали в единицах, представляющих собой количество аминокислотных замен на один сайт. Все позиции, содержащие бреши и недостающие данные, исключали из базы данных (опция полной делеции). В конечной базе данных содержалось в целом 352 позиции. Филогенетический анализ осуществляли с помощью программного обеспечения МЕСЛ4 (Татига и др., 2007). Использовали следующие сокращения: Αΐ РКК3, АтаЫборв1в Шайапа РКК3 (N0568919); Αΐ РКК5, АтаЫборв1в Шайапа РКК5 (№_568446); Αΐ РКК7, АтаЫборв1в ШаПапа РКК7 (№_568107); Αΐ РКК9, АтаЫборв1в ШаПапа РКК9 (№_566085); Αΐ Т0С1, Лга1ж1орв1в Шайапа Т0С1/РКК1 (ΝΠ 200946); Ην РРИ-Н1, Ногбеит \и1даге РРИΗ1 (ΑΑΥ17586); 0в РКК37, 0гу/а вайта РКК37 (Ο0Ό3Β6); Та РРИ-П1, ТгШсит аевШ'ит РРИГО1 (ΑΒΕ09477);

фиг. 8 - профиль генной экспрессии ΒνΡКК7 в двулетнем растении сахарной свеклы, выращенной в условиях длинного светового для (16 ч света, 8 ч темноты) и при постоянной температуре 18°С. Значения

- 12 022877 выражали в виде относительных уровней экспрессии, стандартизованных относительно референс-генов ΒνΒΤυ и ΒνΖΟΌΗ с помощью анализа на основе геометрического усреднения (Уапбекотре1е и др., 2002);

фиг. 9 - плазмидная карта бинарного вектора, предназначенного для трансформации кДНК ΒνΡΚΚ7 под контролем фрагмента промотора ΒνΡΡΚ7, ассоциированного с однолетним типом развития растений. Селектируемый маркер представляет собой ген ΡΜΙ под контролем промотора Η8Ρ80 (Ратке и \УПкоп, 1993);

фиг. 10 - плазмидная карта бинарного вектора, предназначенного для трансгенной супрессии ΒνΡΚΚ7 с помощью РНКЕ Инвертированный повтор для ΒνΡΡΚ7 состоит из кДНК-фрагмента размером 0,6 т.п.н., который клонировали между промотором иЫ3 (Νογγικ и др., 1993) и терминатором Νοκ как в смысловой, так и в антисмысловой ориентации, разделенный вторым интроном гена 81Ь81 картофеля (Ескек и др., 1986; Уапсаппеу! и др., 1990). Селектируемый маркер представляет собой ген ΡΜΙ под контролем промотора Η8Ρ80 (Бгипке и ХУПкоп, 1993);

Последовательности

8ЕО ГО N0: 1 - нуклеотидная последовательность Е8Т СУ301305,

8ЕО ГО N0: 2 - нуклеотидная последовательность интрона 3 ΒνΡΚΚ7 и ее аллельная изменчивость, предназначенная 5ЕС) ГО N0:

тип № 1),

5ЕС) ГО N0:

тип № 2),

5ЕС) ГО N0 5ЕС) ГО N0 5ЕС) ГО N0 5ЕС) ГО N0 5ЕС) ГО N0 5ЕС) ГО N0 5ЕС) ГО N0 5ЕС) ГО N0 5ЕС) ГО N0 5ЕС) ГО N0 5ЕС) ГО N0 5ЕС) ГО N0 5ЕС) ГО N0 5ЕС) ГО N0 5ЕС) ГО N0 5ЕС) ГО N0 5ЕС) ГО N0 5ЕС) ГО N0 5ЕС) ГО N0 5ЕС) ГО N0 5ЕС) ГО N0 5ЕС) ГО N0 5ЕС) ГО N0 5ЕС) ГО N0 5ЕС) ГО N0 5ЕС) ГО N0 5ЕС) ГО N0 5ЕС) ГО N0 5ЕС) ГО N0 5ЕС) ГО N0 5ЕС) ГО N0 5ЕС) ГО N0 5ЕС) ГО N0 5ЕС) ГО N0 5ЕС) ГО N0 5ЕС) ГО N0 5ЕС) ГО N0 5ЕС) ГО N0 5ЕС) ГО N0 5ЕС) ГО N0 5ЕС) ГО N0 5ЕС) ГО N0 для картирования,

- нуклеотидная последовательность интрона 3 аллельного варианта 1 ΒνΡΚΚ7 (гапло4 - нуклеотидная последовательность интрона 3 аллельного варианта 2 ΒνΡΚΚ7 (гапло5 - геномная нуклеотидная последовательность ΒνΡΚΚ7,

- предполагаемая аминокислотная последовательность ΒνΡΡΚ7,

- нуклеотидная последовательность праймера ΡΡΚ7-Ρ,

- нуклеотидная прследовательность праймера ΡΡΚ7-Κ,

- нуклеотидная последовательность зонда ΡΡΚ7(Τ1)-ΡΆΜ,

- нуклеотидная последовательность зонда ΡΚΚ7(Τ1)-νΐΠ,

- нуклеотидная последовательность прямого праймера ΒνΡΡΚ7,

- нуклеотидная последовательность обратного праймера ΒνΡΚΚ7,

- нуклеотидная последовательность прямого праймера ΒνΒΤυ,

- нуклеотидная последовательность обратного праймера ΒνΒΤυ,

- нуклеотидная последовательность прямого праймера ΒυΚ.ΌΗ,

- нуклеотидная последовательность обратного праймера ΒυΚΌΗ,

- нуклеотидная последовательность праймера Р3766,

- нуклеотидная последовательность праймера К3767,

- нуклеотидная последовательность праймера Р3354,

- нуклеотидная последовательность праймера К3355,

- нуклеотидная последовательность праймера Р3768,

- нуклеотидная последовательность праймера К3769,

- нуклеотидная последовательность праймера Р3782,

- нуклеотидная последовательность праймера К3783,

- нуклеотидная последовательность праймера Р3784,

- нуклеотидная последовательность праймера К3785,

- нуклеотидная последовательность праймера Р3806,

- нуклеотидная последовательность праймера К3807,

- нуклеотидная последовательность праймера Р3808,

- нуклеотидная последовательность праймера К3809,

- нуклеотидная последовательность праймера Р3810,

- нуклеотидная последовательность праймера К3811,

- нуклеотидная последовательность праймера Р3853,

- нуклеотидная последовательность праймера Р3854,

- нуклеотидная последовательность праймера Р3855,

- нуклеотидная последовательность праймера К3856,

- нуклеотидная последовательность праймера Р3857,

- нуклеотидная последовательность праймера К3858,

- нуклеотидная последовательность праймера Р3859,

- нуклеотидная последовательность праймера К3860,

- нуклеотидная последовательность праймера Р3861,

- нуклеотидная последовательность праймера К3862,

- нуклеотидная последовательность праймера Р3863,

- нуклеотидная последовательность праймера К3864,

- нуклеотидная последовательность праймера Р3865,

- нуклеотидная последовательность праймера К3866,

- 13 022877 δΕΟ ΙΌ N0: 47 - нуклеотидная последовательность зонда РКК7(№ 3827)-РЛМ, δΕΟ ΙΌ N0: 48 - нуклеотидная последовательность зонда РКК7(№ 3827)-У1С, δΕΟ ΙΌ N0: 49 - нуклеотидная последовательность прямого праймера ВуРКК7, применяемого для анализа экспрессии генов, δΕΟ ΙΌ N0: 50 - нуклеотидная последовательность обратного праймера ВуРКК7, применяемого для анализа экспрессии генов, δΕΟ ΙΌ N0: 51 - нуклеотидная последовательность геномной нуклеотидной последовательности ВуРКК7, включающая промоторную область размером примерно 13 т.п.н., δΕΟ ΙΌ N0: 52 - нуклеотидная последовательность кодирующей области ВуРКК7.

Определения

Технические понятия и выражения, применяемые в настоящем описании, как правило, если специально не указано иное, имеют значения, которые обычно используют в области молекулярной биологии растений.

В настоящем описании и прилагаемой формуле изобретения подразумевается, если из контекста ясно не следует иное, что употребляемое в единственном числе существительное включает также множественное число. Так, например, ссылка на растение включает одно или несколько растений, а ссылка на клетку включает смеси клеток, тканей и т.п.

Понятие сахарная свекла относится ко всем видам и подвидам рода Вс1а. а также ко всем сортам культурной свеклы Вс1а уи1дат15. Культурные сорта свеклы подразделяют на четыре группы: листовая свекла, огородная свекла, кормовая свекла и сахарная свекла. Понятие сахарная свекла относится также ко всем культурным сортам свеклы, включая сорта, выращиваемые для целей, отличных от получения сахара, например, для получения этанола, пластиков или индустриальных продуктов. В частности, понятие сахарная свекла относится к кормовой свекле и сахарной свекле, но наиболее предпочтительно к сахарной свекле.

Понятие однолетняя линия сахарной свеклы относится к растению сахарной свеклы, содержащему доминантный аллель Ь в локусе В в гетерозиготном или гомозиготном состоянии.

Понятие двулетняя линия сахарной свеклы относится к растению сахарной свеклы, содержащему рецессивный аллель Ь в локусе В в гетерозиготном состоянии.

Понятие стрелкование относится к переходу от вегетативной розеточной стадии к стадии цветения или репродуктивного роста.

Понятие ген В в контексте настоящего описания относится к гену, который ответствен за раннее стрелкование сахарной свеклы. У растений, несущих доминантный аллель, происходит удлинение побега и последующее цветение без предварительного нахождения при низких температурах.

Понятие яровизация относится к процессу, при котором у некоторых растений ускоряется индукция цветения при охлаждении растений в течение определенного периода времени.

Понятие аллель в контексте настоящего изобретения относится к альтернативным формами различных генетических единиц, ассоциированных с различными формами гена или любыми видами идентифицируемого генетического элемента, которые альтернативно наследуются, поскольку расположены в одном и том же локусе в гомологичных хромосомах. В диплоидной клетке или организме два аллеля данного гена (или маркера), как правило, расположены в соответствующих локусах на паре гомологичных хромосом.

В контексте настоящего описания понятие размножение (селекция) и его грамматические варианты относится к любому процессу, который позволяет получать индивидуальное потомство. Размножение может быть половым или неполовым или представлять собой любую их комбинацию. Примерами размножения являются, но не ограничиваясь только ими, скрещивание, самоопыление, получение производного с удвоенным гаплоидным набором и их комбинации.

Понятие локус в контексте настоящего изобретения относится к области на хромосоме, которая содержит ген или любой другой генетический элемент или фактор, определяющий признак.

В контексте настоящего описания понятие генетический маркер относится к особенности индивидуального генома (например, нуклеотидной или полинуклеотидной последовательности, которая присутствует в индивидуальном геноме), ассоциированной с одним или несколькими представляющими интерес локусами. В некоторых вариантах осуществления изобретения, в зависимости от контекста, генетический маркер является полиморфным в представляющей интерес популяции или представляет собой локус, в котором присутствует полиморфизм. Генетические маркеры представляют собой, например, такие маркеры, но не ограничиваясь только ими, как однонуклеотидные полиморфизмы (δNР), инделы (т.е. инсерции/делеции), простые повторяющиеся последовательности (δδΚ), полиморфизмы длины рестрикционных фрагментов (КЕРР), произвольно амплифицированные полиморфные ДНК (КАРО), маркеры, представляющие собой расщепленную амплифицированную полиморфную последовательность (САРδ), маркеры, полученные с помощью технологии разнообразия массивов (Όίνβτδίίγ Аггаук Тесйио1оду (ΌΑτΤ), полиморфизмы длины амплифицированных фрагментов (АРЬР). Генетические маркеры можно применять, например, для локализации на хромосоме генетических локусов, содержащих аллели, с которыми связана вариабельность экспрессии фенотипических признаков. Под поднятием генетиче- 14 022877 ский маркер может подразумеваться также полинуклеотидная последовательность, комплементарная геномной последовательности, такая как последовательность нуклеиновой кислоты, применяемая в качестве зондов.

Генетический маркер физически может быть локализован в положении на хромосоме внутри или вне генетического локуса, с которым он ассоциирован (т.е. он может являться интрагенным или экстрагенным соответственно). Другими словами, хотя генетические маркеры, как правило, применяют, когда локализация на хромосоме гена, соответствующего представляющему интерес локусу, не идентифицирована и имеет место не нулевая степень рекомбинации между генетическим маркером и представляющим интерес локусом, согласно одному из объектов настоящего изобретения можно применять также генетические маркеры, которые физически являются пограничными генетическому локусу (например, находятся внутри геномной последовательности, которая соответствует гену, такому как, но не ограничиваясь только им, полиморфизм в интроне или экзоне). В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения один или несколько генетических маркеров включают от 1 до 10 маркеров, а в некоторых вариантах осуществления изобретения один или несколько генетических маркеров включает более 10 генетических маркеров.

В контексте настоящего описания понятие информативный фрагмент относится к полинуклеотидному фрагменту с информационным содержанием, которое является восстановимым и может способствовать определению и/или характеризации представляющего интерес генетического локуса. Это информационное содержание может представлять собой полиморфизм, ассоциированный с указанным представляющим интерес локусом, такой, например, как, но не ограничиваясь только ими, однонуклеотидные полиморфизмы (8ИР), инделы (т.е. инсерции/делеции), простые повторяющиеся последовательности (δδΚ), полиморфизмы длины рестрикционных фрагментов (ΚΡΈΡ), маркеры, представляющие собой произвольно амплифицированные полиморфные ДНК (ΚΑΡΌ), расщепленную амплифицированную полиморфную последовательность (САР8), маркеры, полученные с помощью технологии разнообразия массивов (ΌΑτΤ), полиморфизмы длины амплифицированных фрагментов (АРЬР), и их можно применять для создания генетического маркера. Информационное содержание информативного фрагмента может представлять собой также специфическую последовательность, которую можно выявлять с помощью соответствующей молекулы-зонда.

В контексте настоящего описания понятие фенотипический признак относится к появляющейся или иным образом проявляющейся характеристике индивидуума, являющейся результатом взаимодействия генома с его окружением.

Понятие основанная на применении маркера селекция в контексте настоящего изобретения относится к применению генетических маркеров для выявления одной или нескольких нуклеиновых кислот растения, где нуклеиновая кислота ассоциирована с требуемым признаком, для идентификации растений, которые несут гены требуемых (или нежелательных) признаков, в результате чего эти растения можно использовать (или избегать их использования) в программе селективного размножения.

Понятие микросателлитный или δδΚ (простые повторяющиеся последовательности) (маркер) в контексте настоящего изобретения относится к типу генетического маркера, который состоит из многочисленных повторов коротких последовательностей оснований ДНК, которые находятся в локусах, повсеместных в растительной ДНК, и могут быть высокополиморфными.

Понятие ПЦР (полимеразная цепная реакция) в контексте изобретения относится к методу получения относительно больших количеств специфических областей ДНК, что позволяет осуществлять различные анализы, основанные на использовании этих областей.

Понятие ПЦР-праймер в контексте изобретения относится к относительно коротким фрагментам одноцепочечной ДНК, которые применяют в ПЦР-амплификации специфических областей ДНК.

Понятие фенотип в контексте изобретения относится к различимой(ым) характеристике(ам) генетически контролируемого признака.

Понятие полиморфизм в контексте изобретения относится к присутствию в популяции двух или большего количества различных форм гена, генетического маркера или наследуемого признака.

Понятие селективное размножение в контексте изобретения относится к программе размножения, в которой используют растения, которые несут или проявляют требуемые признаки, характерные для родителей.

Понятие полинуклеотид в контексте настоящего описания относится к полимерной высокомолекулярной молекуле, которая может быть одноцепочечной или двухцепочечной, состоящей из мономеров (нуклеотидов), которые содержат сахар, фосфат и основание, относящееся либо к пуринам, либо к пиримидинам. Фрагмент полинуклеотида (полинуклеотидный фрагмент) представляет собой часть данной полинуклеотидной молекулы. В высших растениях дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) представляет собой генетический материал, а рибонуклеиновая кислота (РНК) участвует в переносе информации, входящей в ДНК, на белки. Геном представляет собой полную совокупность генетического материала, входящего в каждую клетку организма. Таким образом, понятие полинуклеотид относится к полимеру ДНК или РНК, который может быть одно- или двухцепочечным, необязательно содержащему синтетические, не встречающиеся в естественных условиях или измененные нуклеотидные основания, которые

- 15 022877 могут включаться в полимеры ДНК или РНК. Если не указано иное, то подразумевается, что конкретная нуклеотидная последовательность, предлагаемая в настоящем изобретении, включает также ее полученные в результате консервативной модификации варианты (например, замены кодонов из-за вырожденности генетического кода) и комплементарные последовательности, а также определенные указанные последовательности. В частности, для замены кодонов из-за вырожденности генетического кода можно создавать последовательности, в которых в третьем положении в одном или в нескольких выбранных (или во всех) кодонах произведена замена смешанными основаниями и/или остатками дезоксиинозина (Ва1/ег и др., 1991; ОЫзика и др., 1985; КоззоНт и др., 1994). Понятия полинуклеотид используют взаимозаменяемо с понятиями нуклеиновая кислота, нуклеотидная последовательность, кДНК и мРНК, кодируемая геном, и т.д.

Подразумевается, что полинуклеотид, предлагаемый в изобретении, должен находиться в выделенной форме. Понятие выделенный означает, что описанный и предлагаемый в изобретении полинуклеотид не является полинуклеотидом, который встречается в естественных условиях, если реально существует его встречающийся в естественных условиях дубликат. Таким образом, предполагается, что и другие соединения, описанные ниже, должны быть выделенными. В контексте растительного генома полинуклеотид, предлагаемый в изобретении, отличается от его встречающихся в естественных условиях дубликатов инсерционным участком и последовательностями, фланкирующими указанный инсерционный участок.

В контексте настоящего описания понятие нуклеиновая кислота относится к любой физической цепи мономерных единиц, которая может соответствовать цепи нуклеотидов, включая полимер нуклеотидов (например, типичный полимер ДНК или РНК), модифицированных олигонуклеотидов (например, олигонуклеотиды, содержащие основания, не являющиеся типичными для биологической РНК или ДНК, например 2'-О-метилированные олигонуклеотиды), и т.п. В некоторых вариантах осуществления изобретения нуклеиновая кислота может быть одноцепочечной, двухцепочечной, многоцепочечной или представлять собой их комбинации. Если не указано иное, то конкретная нуклеотидная последовательность, предлагаемая в настоящем изобретении, необязательно содержит или кодирует комплементарные последовательности помимо любых конкретно указанных последовательностей.

Понятие ген в широком смысле относится к любому сегменту нуклеиновой кислоты, связанному с биологической функцией. Так, гены включают кодирующие последовательности и/или регуляторные последовательности, необходимые для их экспрессии. Например, понятие ген относится к фрагменту нуклеиновой кислоты, который экспрессирует мРНК или функциональную РНК или кодирует конкретный белок и который включает регуляторные последовательности. Гены включают также неэкспрессируемые сегменты ДНК, которые, например, образуют последовательности, распознаваемые другими белками. Гены можно получать из различных источников, включая клонирование из представляющего интерес источника или синтез из известного или предсказанного на основе информации о последовательности источника, или они могут включать последовательности, сконструированные так, что они имеют требуемые параметры.

Маркерный ген кодирует селектируемый или выявляемый путем скрининга признак.

Понятие химерный ген относится к любому гену, который сдержит 1) последовательности ДНК, включая регуляторные и кодирующие последовательности, которые не встречаются вместе в естественных условиях, или 2) последовательности, кодирующие участки белков, которые не объединены в естественных условиях, или 3) участки промоторов, которые не объединены в естественных условиях. Таким образом, химерный ген может содержать регуляторные последовательности и кодирующие последовательности, выведенные из различных источников, или содержать регуляторные последовательности и кодирующие последовательности, выведенные из одного и того же источника, но собранные иным образом по сравнению с их укладкой в естественных условиях.

Понятие трансген относится к интродуцированному путем трансформации в геном и стабильно поддерживаемому гену. К трансгенам относятся, например, гены, которые гетерологичны или гомологичны генам конкретного подлежащего трансформации растения. Кроме того, трансгены могут представлять собой нативные гены, встроенные в ненативный организм, или химерные гены.

Понятие белок, пептид и полипептид в контексте настоящего описания используют взаимозаменяемо.

Понятие кодирующая последовательность относится к последовательности ДНК или РНК, которая кодирует конкретную аминокислотную последовательность, и не включает некодирующие последовательности. Она может представлять собой непрерывную кодирующую последовательность, т.е. последовательность, в которой отсутствуют интрон, такую как кДНК, или может включать один или несколько интронов, ограниченных соответствующими сплайсинговыми стыками. Интрон представляет собой последовательность РНК, которая входит в первичный транскрипт, но которая удаляется в результате расщепления и повторного лигирования РНК в клетке с образованием зрелой мРНК, которая может транслироваться в белок.

Понятие промотор относится к нуклеотидной последовательности, как правило, расположенной против хода транскрипции (5') относительно кодирующей последовательности, которая контролирует

- 16 022877 экспрессию кодирующей последовательности, обеспечивая распознавание РНК-полимеразой и другими факторами, необходимыми для правильной транскрипции. Промотор включает минимальный промотор, который представляет собой короткую последовательность ДНК, содержащую ТАТА-бокс и другие последовательности, которые обеспечивают специфичность сайта инициации транскрипции, к которому добавляют регуляторные элементы для контроля экспрессии. Понятие промотор относится также к нуклеотидной последовательности, которая содержит минимальный промотор плюс регуляторные элементы, которые обладают способностью контролировать экспрессию кодирующей последовательности или функциональной РНК. Этот тип промотора состоит из проксимальных и более дистально расположенных против хода транскрипции элементов, последние элементы часто относят к энхансерам. Таким образом, энхансер обозначает последовательность ДНК, которая может стимулировать активность промотора и может представлять собой присущий промотору элемент или гетерологичный элемент, встроенный для повышения уровня активности или тканеспецифичности помотора. Он может проявлять активность в обоих направлениях (прямом или обратном) и может функционировать даже при его смещении либо в против хода, либо по ходу транскрипции относительно промотора. И энхансеры, и другие находящиеся против хода транскрипции промоторные элементы связывают специфические для последовательности ДНК-связывающие белки, которые опосредуют их действия. Промоторы могут быть полностью выведены из нативного гена или состоять из различных элементов, выведенных из различных промоторов, присутствующих в природе, или даже состоять из различных синтетических ДНК-сегментов. Промотор может включать также последовательности ДНК, которые участвуют в связывании белковых факторов, контролирующих эффективность инициации транскрипции в ответ на физиологические или связанные с фазой развития условия.

Сайт инициации представляет собой положение, окружающее первый нуклеотид, который является частью транскрибируемой последовательности, который обозначают также как положение +1. Относительно этого сайта нумеруют все другие последовательности гена и его контролирующие области. Расположенные по ходу транскрипции последовательности (т.е. дополнительные кодирующие белок последовательности, расположенные в З'-направлении) нумеруют положительными числами, а расположенные против хода транскрипции последовательности (главным образом контролирующиеся области, расположенные в 5'-направлении) нумеруют отрицательными числами.

Промоторные элементы, в частности ТАТА-элемент, которые являются неактивными или обладают значительно пониженной промоторной активностью в отсутствие активации против хода транскрипции, обозначают как минимальные или внутренние промоторы. В присутствии приемлемого фактора транскрипции минимальный промотор функционирует, обеспечивая транскрипцию. Таким образом, минимальный или внутренний промотор состоит только из всех основных элементов, необходимых для инициации транскрипции, например ТАТА-бокса и/или инициатора.

Понятие конститутивная экспрессия относится к экспрессии с использованием конститутивного или регулируемого промотора. Понятие обусловленная или регулируемая экспрессия относится к экспрессии, контролируемой регулируемым промотором.

Понятие конститутивный промотор относится к промотору, который может обеспечивать экспрессию открытой рамки считывания (ОРС), который обеспечивает контроль во всех или практически во всех растительных тканях в течение всех или практически всех стадий развития растения. Любой из активирующих транскрипцию элементов не характеризуется абсолютной тканеспецифичностью, но опосредует активацию транскрипции в большинстве частей растения на уровне >1% от уровня, достигаемого в растении, в котором транскрипция является наиболее активной.

Понятие регулируемый промотор относится к промоторам, которые контролируют генную экспрессию не конститутивно, а регулируемым временем и/или пространственным положением образом, к ним относятся как тканеспецифические, так и индуцибельные промоторы. Они включают встречающиеся в естественных условиях и синтетические последовательности, а также последовательности, которые могут представлять собой комбинацию синтетических и встречающихся в естественных условиях последовательностей. Различные промоторы могут контролировать экспрессию гена в различных типах тканей или клеток или на различных стадиях развития или в ответ на различные факторы окружающей среды. В настоящее время открыты новые промоторы различных типов, которые можно применять в растительных клетках, их многочисленные примеры описаны у 0катиго и др., 1989. Типичные регулируемые промоторы, которые можно применять в растениях, включают, но не ограничиваясь только ими, индуцируемые антидотами промоторы, промоторы, выведенные из индуцируемой тетрациклином системы, промоторы, выведенные из индуцируемых салицилатами систем, промоторы, выведенные из индуцируемых спиртами систем, промоторы, выведенные из индуцируемых глюкокортикоидами систем, промоторы, выведенные из индуцируемых патогенами систем, и промоторы, выведенные из индуцируемых экдизонами систем.

Понятие тканеспецифический промотор относится к регулируемым промоторам, которые экспрессируются не во всех растительных клетках, а только в одном или нескольких типах клеток в конкретных органах (таких как листья или семена), конкретных тканях (таких как зародыш или семядоля), или в конкретных типах клеток (таких как паренхима листа или запасающие клетки семян). К ним отно- 17 022877 сятся также промоторы, регуляция которых обусловлена периодом времени, таким как ранняя или поздняя стадия эмбриогенеза, стадия созревания в развитии семян и плодов, стадия полностью дифференцированной ткани листа или начало старения.

Понятие индуцибельный промотор относится к таким регулируемым промоторам, которые могут превращаться в специфические для одного или нескольких типов клеток под воздействием внешнего стимула, такого как химические агенты, свет, гормон, стресс или патоген.

Понятие функционально связаны относится к ассоциации нуклеотидных последовательностей на одном фрагменте нуклеиновой кислоты так, что функция одной оказывает воздействие на функцию другой. Например, регуляторная последовательность ДНК функционально связана с или ассоциирована с последовательностью ДНК, которая кодирует РНК или полипептид, если две последовательности расположены так, что регуляторная последовательность ДНК обладает способностью воздействовать на экспрессию кодирующей последовательности ДНК (т.е. транскрипция кодирующей последовательности или функциональной РНК находится под транскрипционным контролем промотора). Кодирующие последовательности могут быть функционально связаны с регуляторными последовательностями в смысловой или антисмысловой ориентации.

Понятие экспрессия относится к транскрипции и/или трансляции эндогенного гена, ОРС или ее части или трансгена в растениях. Например, в случае антисмысловых конструкций понятие экспрессия может относиться к транскрипции только антисмысловой ДНК. Кроме того, экспрессия относится к транскрипции и стабильной аккумуляции смысловой (мРНК) или функциональной РНК. Экспрессия может относиться также к производству белка.

Понятие сверхэкспрессия относится к уровню экспрессии в трансгенных клетках или организмах, превышающим уровни экспрессии в нормальных или нетрансформированных (нетрансгенных) клетках или организмах.

Понятие антисмысловое ингибирование относится к производству антисмысловых РНКтранскриптов, которые обладают способностью подавлять экспрессию белка с эндогенного гена или трансгена.

Понятие молчание гена относится к зависящему от гомологии подавлению вирусных генов, трансгенов или эндогенных ядерных генов. Молчание гена может быть транскрипционным, когда подавление обусловлено пониженной транскрипцией пораженных генов, или пост-транскрипционным, когда подавление обусловлено повышенным круговоротом (расщепление) видов РНК, гомологичных пораженным генам (ЕидНзЬ и др., 1996). Молчание гена включает индуцированное вирусом молчание гена (Ριιίζ и др., 1998).

Понятие гибридизуется в контексте настоящего описания относится к общепринятым условиям гибридизации, предпочтительно к таким условиям гибридизации, в которых используют 5х88РЕ, 1% ДСН, 1х раствор Денхардта в качестве раствора и/или температуры гибридизации от 35 до 70°С, предпочтительно 65°С. После гибридизации отмывку предпочтительно осуществляют сначала с использованием 2х88С, 1% ДСН, а затем 0,2х88С при температуре от 35 до 75°С, в частности от 45 до 65°С, но наиболее предпочтительно при 59°С (описание обозначений 88РЕ, 88С и раствор Денхардта см. у 8атЬгоок и др. 1ос. οίί (в указанном месте)). Строгие условия гибридизации, например, описанные у 8атЬгоок и др., выше, являются наиболее предпочтительными. Наиболее предпочтительные строгие условия гибридизации представляют собой вышеописанные условия, при которых гибридизацию и отмывку осуществляют при 65°С. Нестрогие условия гибридизации, при которых, например, гибридизацию и отмывку осуществляют при 45°С, являются менее предпочтительными, а при 35°С еще менее предпочтительными.

Понятия гомология последовательностей или идентичность последовательностей в контексте настоящего описания используют взаимозаменяемо. Понятия идентичный или процент идентичности в отношении двух или большего количества нуклеотидных или белковых последовательностей обозначает, что две или большее количество последовательностей или подпоследовательностей являются одинаковыми или имеют определенный процент одинаковых аминокислотных остатков или нуклеотидов при сопоставлении и сравнительном анализе максимального соответствия, что оценивают с помощью одного из приведенных ниже алгоритмов сравнения последовательностей или путем визуальной оценки. Если две подлежащие сравнению друг с другом последовательности имеют различную длину, то понятие идентичность последовательностей предпочтительно относится к проценту нуклеотидных остатков более короткой последовательности, которые идентичны нуклеотидным остаткам более длинной последовательности. Идентичность последовательностей традиционно можно определять с помощью компьютерных программ, таких как программа Везйй (Азсоизш 8сциспсс Лиа1у515 Раскаде, версия 8 для Итх, Сеиейсз Сотри!ег Сгоир, ИтуегзНу КезсагсЬ Рагк, 575 8с1епсс Ииуе МаФзои, XVI 53711). Программа Всз1П1 основана на алгоритме локальной гомологии Смита и Ватермана (8ιηί11ι и Vаΐе^таη, Лбуапсез ίη ЛррПсб МаШетайсз 2, 1981, с. 482-489) для поиска сегмента, имеющего самую высокую степень идентичности между двумя последовательностями. При применении Везйй или другой программы сравнительного анализа первичной структуры последовательностей для решения вопроса о том, идентична ли конкрет- 18 022877 ная последовательность на 95% референс-последовательности, предлагаемой в настоящем изобретении, параметры предпочтительно регулируют так, чтобы процент идентичности рассчитывать по всей длине референс-последовательности и чтобы допускать гомологию брешей вплоть до 5% от общего количества нуклеотидов в референс-последовательности. При использовании ВеЧГп так называемые необязательные параметры предпочтительно имеют свои предварительно установленные (принимаемые по умолчанию) значения. Отклонения, обнаруженные при сравнении данной последовательности и описанных выше последовательностей, предлагаемых в изобретении, могут быть обусловлены, например, добавлением, делецией, заменой, инсерцией или рекомбинацией. Такое сравнение последовательностей предпочтительно можно осуществлять также с помощью программы Гак1а20и66 (версия 2.0и66, сентябрь 1998 г., ГСППат К. Реагкоп и (Не ИтуеткНу οΓ νίΓβίηία; см. также у Реагкоп, 1990 прилагаемые примеры, а также Нбр://№огкЬепсЬ.кбкс.еби/). Для этой цели можно использовать установку принимаемых по умолчанию параметров.

Другим доказательством того, что две нуклеотидные последовательности практически идентичны, является то, что две молекулы гибридизуются друг с другом в строгих условиях. Фраза специфично гибридизуется с относится к связыванию, образованию дуплекса или гибридизации молекулы только с определенной нуклеотидной последовательностью в строгих условиях, когда последовательность присутствует в комплексной смеси (например, общей клеточной) ДНК или РНК. Понятие практически связан(ы) относится к комплементарной гибридизации между нуклеиновой кислотой-зондом и нуклеиновой кислотой-мишенью и подразумевает наличие небольшого количества ошибочных спариваний, которые можно допускать при снижении строгости сред для гибридизации для достижения требуемого обнаружения последовательности нуклеиновой кислоты-мишени.

Понятия строгие условия гибридизации и условия отмывки, соответствующие строгой гибридизации в контексте экспериментов по гибридизации нуклеиновых кислот, таких как Саузерн- и Нозернгибридизации, зависят от последовательности и являются разными при применении различных параметров окружающей среды. Для специфичной гибридизации более длинных последовательностей используют более высокие температуры. Подробным руководством по гибридизации нуклеиновых кислот является работа Туккеп ЬаЬогаФгу ТесНпищек ίη ВюсЬетюНу апб Мо1еси1аг Вю1оду-НуЬпб1/а0оп \\ίΐ1ι Ыис1е1с Лаб РгоЬек, часть I, глава 2 0уег\ае\у оГ ртшс1р1ек оГ 11уЬпб1/айоп апб 1Не ЧгаЮду оГ пис1ею ааб ргоЬе аккаук, изд-во Е1кеу1ет, №\у Уогк, 1993. Как правило, выбирают очень строгие условия гибридизации и отмывки, при которых температура примерно на 5°С ниже, чем температура плавления (Т_т) для конкретной последовательности при определенной ионной силе и значении рН. Как правило, при использовании строгих условий зонд должен гибридизоваться с подпоследовательностью-мишенью, но не гибридизоваться с другими последовательностями.

Т_т обозначает температуру (при определенной ионной силе и значении рН), при которой 50% последовательностей-мишеней гибридизуется с точно подобранным зондом. При выборе очень строгих условий гибридизации температура равна Т_т конкретного зонда. Примером строгих условий гибридизации на фильтре методом Саузерн- или Нозерн-блоттинга для гибридизации комплементарных нуклеиновых кислот, которые имеют более 100 комплементарных остатков, является применение 50%-ного формамида с 1 мг гепарина при 42°С при осуществлении гибридизации в течение ночи. Примером очень строгих условий отмывки является применение 0,15М №С1 при 72°С в течение примерно 15 мин. Примером строгих условий отмывки является отмывка 0,2х88С при 65°С в течение 15 мин (описание 88Сбуфера см. у 8атЬгоок, ниже). Часто отмывке в очень строгих условиях предшествует отмывка в расслабленных условиях для удаления фонового сигнала зонда. Примером отмывки в условиях умеренной строгости для дуплексов, состоящих, например, более чем из 100 нуклеотидов, является применение 1х88С при 45°С в течение 15 мин. Примером расслабленных условий отмывки для дуплексов, состоящих, например, более чем из 100 нуклеотидов, является применение 4-6х88С при 40°С в течение 15 мин. Для коротких зондов (например, состоящих примерно из 10-50 нуклеотидов) строгие условия, как правило, включают концентрации солей, соответствующие менее чем 1,0М концентрации ионов N3, как правило, примерно от 0,01 до 1,0М концентрации ионов № (или других солей) при рН от 7,0 до 8,3, при этом температура, как правило, составляет по меньшей мере примерно 30°С. Строгие условия также можно получать при добавлении дестабилизирующих агентов, таких как формамид. Как правило, величина отношения сигнала к шуму, равная 2 (или выше) по сравнению с обнаруженной при применении неродственного зонда в конкретном опыте по гибридизации, свидетельствует о наличии специфической гибридизации. Нуклеиновые кислоты, которые не гибридизуются друг с другом в строгих условиях, все еще являются практически идентичными, если белки, которые они кодируют, являются практически идентичными. Это имеет место, например, в случае, когда копию нуклеиновой кислоты создают с использованием максимальной вырожденности кодонов, допускаемой генетическим кодом.

Растение обозначает любое растение на любой стадии развития, в частности семенное растение.

Понятие растительная клетка относится к структурной и физиологической единице растения, включающей протопласт и клеточную оболочку. Растительная клетка может находиться в форме выделенной отдельной клетки или культивируемой клетки или представлять собой часть высокоорганизован- 19 022877 ной единицы, такой, например, как ткань растения, орган растения или целое растение.

Культура растительных клеток обозначает культуры структурных единиц растения, таких, например, как протопласты, клетки в культуре клеток, клетки в тканях растения, пыльца, пыльцевые трубки, семяпочки, зародышевые мешки, зиготы и зародыши на различных стадиях развития.

Понятие растительный материал относится к листьям, стеблям, корням, цветкам или частям цветков, плодам, пыльце, яйцеклеткам, зиготам, семенам, отводкам, культурам клеток или тканей или любой другой части или продукту растения.

Орган растения обозначает отдельную и четко структурно оформленную дифференцированную часть растения, такую как корень, стебель, лист, листовая почка или зародыш.

В контексте настоящего описания понятие растительная ткань относится к группе растительных клеток, организованных в виде структурной и функциональной единицы. Под это понятие подпадает любая ткань растения, присутствующая в самом растении или находящаяся в культуре. Это понятие включает, но не ограничиваясь только ими, целые растения, органы растения, семена растения, культуру ткани и любые группы растительных клеток, организованных в виде структурных и/или функциональных единиц. Использование этого понятия в сочетании с указанием какого-либо конкретного типа растительной ткани (или безотносительно к нему), как это имеет место выше или в ином месте в настоящем описании, не следует истолковывать в том смысле, что оно не может относиться к любому другому типу растительной ткани.

Настоящее изобретение относится к полинуклеотидам, идентифицированным в геноме сахарной свеклы, включая их варианты и производные, где для полинуклеотидов продемонстрирована истинная косегрегация с фенотипом сахарной свеклы, ассоциированным с геном, который обусловливает стрелкование (т.е. с геном В), и применение указанных полинуклеотидов для создания маркеров, которые можно использовать для картирования и идентификации гена, обусловливающего стрелкование, или гена В. Полинуклеотидные маркеры, предлагаемые в изобретении, можно применять также для контроля качества партий поступающих в продажу семян путем скрининга поступающих в продажу семян двулетней сахарной свеклы в отношении загрязнителей, имеющих характерный для однолетнего типа развития генотип, и для идентификации однолетних/двулетних растений в программах размножения, в которых используют признак однолетнего типа развития для ускорения процесса селекции, или когда признак однолетнего типа развития интродуцируют вместе с новыми источниками генетической вариации.

Полинуклеотиды, предлагаемые в изобретении и описанные выше, можно применять также в основанном на использовании трансгенов подходе для получения трансгенных растений сахарной свеклы, которые содержат указанные полинуклеотиды, стабильно интегрированные в геном сахарной свеклы. В частности, после экспрессии из генома продукт экспрессии можно использовать для модуляции характерного для процесса яровизации ответа (яровизационного ответа) растения сахарной свеклы.

В одном из объектов изобретения яровизационный ответ можно замедлять путем подавления или регуляции по типу отрицательной связи экспрессии гена В.

В другом объекте изобретения раннее стрелкование без воздействия холода можно индуцировать путем сверхэкспрессии гена В.

Настоящее изобретение относится к полинуклеотиду, который картирован в локусе В или находится в непосредственной близости к нему, в частности, на расстоянии 1 сМ против хода транскрипции относительно маркеров МР0176 и СЮ1 и который обладает способностью к косегрегации с маркером ОЛ31 (МбЬг1п§ З. и др., 2004; СааГаг К.М. и др., 2005) (фиг. 5).

Одним из вариантов осуществления изобретения является полинуклеотид, включая его информативный фрагмент, предлагаемый в изобретении, который можно получать из области геномной ДНК, картированной на расстоянии менее 1 сМ, предпочтительно менее 0,75 сМ, более предпочтительно менее 0,5 сМ, еще более предпочтительно менее 0,3 сМ, но наиболее предпочтительно менее 0,25 сМ относительно гена В.

Полинуклеотид, предлагаемый в изобретении, можно применять также для полной характеризации области, окружающей Β-локус, включающий ген В, с целью идентификации других предполагаемых контролирующих время цветения перспективных генов (генов-кандидатов).

ВАС-библиотеку создавали, используя ДНК из двулетнего поступающего в продажу культивара сахарной свеклы Н20. Осуществляли двукратный отбор частично расщепленных (ΗίηάΙΙΙ) высокомолекулярных (НМ\У) ДНК-фрагментов размером 100-400 т.п.п. ДНК-фрагменты встраивали путем лигирования в вектор ρΒе1οΒΑС-Κаη. Библиотека содержала 57600 клонов со средним размером вставки примерно 120 т.п.н., что соответствует примерно 8-кратному перекрытию генома. Избыточность оценивали путем скрининга с использованием однокопийных зондов, было установлено, что частота клонов из митохондриальной или плазмидной ДНК составляла менее 1%.

Эту библиотеку ВАС применяли для выделения полноразмерной геномной последовательности гена ΡΚΚ7 сахарной свеклы.

В частности, для скрининга ВАС-библиотеки сахарной свеклы применяли праймеры ΡΚΚ7-Ρ и

ΡΚΚ7-Κ с помощью стандартных методов ПЦР, хорошо известных специалистам в данной области. Для скрининга пулов ДНК использовали следующие условия ПЦР: денатурацию праймеров осуществляли

- 20 022877 при температуре от 90 до 98°С, предпочтительно примерно при 95°С, в течение 2-10 мин, предпочтительно примерно в течение 5 мин, после чего осуществляли 30-40 циклов амплификации в течение 25-35 с, предпочтительно примерно 35 циклов амплификации в течение 30 с при температуре от 90 до 98°С, предпочтительно примерно при 95°С в течение 25-35 с, предпочтительно в течение 30 с при температуре от 55 до 65°С, предпочтительно примерно при 60°С, и в течение 25-35 с, предпочтительно 30 с при температуре от 68 до 75°С, предпочтительно примерно 72°С, а затем в течение 2-8 мин, предпочтительно примерно 5 мин, при температуре от 68 до 75°С, предпочтительно примерно 72°С. ПЦР-эксперименты осуществляли с помощью соответствующей реакционной смеси, включающей приемлемую полимеразу, предпочтительно полимеразу Тас|. Последующий скрининг пулов ДНК в отношении ΒνΡΚΚ7-фрагментов позволил идентифицировать положительный ВАС-клон, несущий соответствующий фрагмент.

Для получения полноразмерной последовательности гена ΒνΡΚΚ7 ранее идентифицированный ВАС-клон секвенировали с использованием стандартного метода секвенирования, такого, например, как метод пиросеквенирования, разработанный фирмой 454 ЫСе 8с1епсе5. Два неперекрывающихся набора последовательных фрагментов, последовательность которых обладала гомологией с последовательностью Е8Т СУ301305, затем можно объединять в одной последовательности (8ЕЦ ГО N0: 5). На основе сравнительного анализа первичной структуры последовательностей набора последовательных фрагментов ВАС и Е8Т СУ301305 и на основе гомологии с последовательностью гена ΡΚΚ7 из АтаЫйор818 удалось предсказать предполагаемую структуру гена ΒνΡΚΚ7 сахарной свеклы, включающую интроны и экзоны, которая представлена на фиг. 5. На основе указанной предсказанной геномной последовательности удалось продемонстрировать, что участок полного гена ΒνΡΚΚ7 размером 3,6 т.п.н. простирается на последовательности против хода транскрипции от стоп-кодона АТС и участок размером 2,2 т.п.н. простирается по ходу транскрипции относительно кодирующей области. Соответствующая аминокислотная последовательность ΒνΡΚΚ7 представлена в 8ЕЦ ГО N0: 6. Сравнительный анализ первичной структуры аминокислотной последовательности ΒνΡΚΚ7 и всех представителей семейства ΡΚΚ-гена из АтаЪМор818, включая ТОС1 (ΡΚΚ1), ΡΚΚ3, ΡΚΚ5, ΡΚΚ7 и ΡΚΚ9, позволил проиллюстрировать выраженную консервативность мотива домена-приемника регулятора псевдоответа (ΡΚΚ) (р£ат00072) вблизи ИН₂-конца и ССТ-мотива (р£ат06203) на СООН-конце (фиг. 6). Помимо семейства ΡΚΚ-гена из АтаЫйор818 ΒνΡΚΚ7 характеризуется также выраженной гомологией с ΡΚΚ7 зерновых культур, что проиллюстрировано с помощью филогенетического дерева, представленного на фиг. 7. Установлено, что гомолог ΡΚΚ7 в зерновых культурах, более известный как Ρрά, представляет собой основной определяющий фактор фотопериодической реакции (Тигпег и др., 2005; Βеа1е8 и др., 2007). Его роль в яровизационном ответе, как это обнаружено для сахарной свеклы, пока не установлена.

С учетом их гомологии с известными контролирующими время цветения генами или их возможной регуляторной функции, которую можно предположить, исходя из присутствия консервативных доменов, характерных для регуляторных белков, удалось идентифицировать несколько генов в качестве потенциальных кандидатов на роль гена В. Эти гены нуждаются в дополнительной валидации с помощью опытов, оценивающих аллельную вариабельность и/или генную экспрессию, генотипов, характерных для однолетнего и двулетнего типа развития, или на основе экспериментов по оценке комплементарности или выключения с использованием трансгенных подходов.

Ген В можно применять в трансгенном подходе для получения трансгенных растений сахарной свеклы, которые содержат указанные полинуклеотиды, стабильно интегрированные в геном сахарной свеклы. В частности, после экспрессии из генома продукт экспрессии можно применять для модуляция яровизационного ответа растения сахарной свеклы.

Согласно одному из объектов изобретения яровизационный ответ можно замедлять путем подавления или регуляции по типу отрицательной связи экспрессии гена В.

Ранее были разработаны методы применения молекулярных маркеров, которые можно использовать для генетического картирования, клонирования генов, размножения растений с участием маркеров и фингерпринтинга генома и исследования генетических взаимосвязей. Основой генетических маркеров являются полиморфизмы ДНК в нуклеотидных последовательностях геномных областей и их можно выявлять либо с помощью рестриктаз, или с помощью двух примированных сайтов.

Известно несколько типов молекулярных маркеров, которые можно применять для основанного на использовании маркеров отбора, в том числе полиморфизмы длины рестрикционных фрагментов (ΚΡΈΡ), произвольно амплифицированные полиморфные ДНК (ΚΆΡΟ), полиморфизмы длины амплифицированных фрагментов (АΡ^Ρ), простые повторяющиеся последовательности (88Κ) и однонуклеотидные полиморфизмы (8№).

Информационное содержание различных типов маркеров может различаться в зависимости от метода, применяемого для получения данных о маркерах и популяции, в которой оценивали маркеры. Например, не всегда возможно различать геномные фрагменты, которые находятся в гомозиготном состоянии, и гетерозиготные фрагменты. В гетерологичной популяции типа Р2, кодоминантные маркеры, такие как полиморфизмы длины рестрикционных фрагментов (ΚΡΡΡ, ΒοΙδ^ίη и др., 1980) и характеризующие- 21 022877 ся кодоминантностью полиморфизмы длины амплифицированных фрагментов (ΑΡΕΡ, Уо8 и др., 1995), являются более информативными, чем доминантные маркеры, такие как произвольно амплифицированные полиморфные ДНК (ΚΑΡΌ, АекН и МсС1е1апб, 1990) и характеризующиеся доминантностью ΑΡΌΡ. ΚΡΕΡ являются кодоминантными и их можно применять для идентификации уникального локуса. ΚΡΕΡ предусматривает применение рестриктаз для расщепления хромосомной ДНК в специфических коротких сайтах рестрикции, полиморфизмы являются результатом дупликаций сайтов или их делеций, или мутаций в сайтах рестрикции.

При использовании ΛΡΕΡ требуется расщепление клеточной ДНК с помощью рестриктазы перед осуществлением ПЦР и селективных нуклеотидов в праймерах для амплификации специфических фрагментов. При использовании этого метода можно оценивать вплоть до 100 полиморфных локусов, и для каждого анализа требуется лишь относительно небольшой образец ДНК.

Наиболее предпочтительным методом для амплификации нуклеотидных фрагментов, покрывающих полиморфную область растительного генома, является полимеразная цепная реакция (ПЦР) (МцШк и др., 1986), для осуществления которой используют пару праймеров, включающую обратный праймер и прямой праймер, которые обладают способностью гибридизоваться с проксимальными последовательностями, определяющими полиморфизм, в их двухцепочечном формате.

В отличие от ΚΡΕΡ для осуществления методов, основанных на ПЦР, требуется лишь небольшой процент (примерно 10%) ДНК, применяемой в качестве матрицы, для получения больших количеств последовательности-мишени с помощью ПЦР-амплификации.

Одним из таких основанных на ПЦР методов является ΚΑΡΌ, в котором применяют осуществляемую в расслабленных условиях амплификацию с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием только праймеров произвольной последовательности для создания специфических для штамма массивов неизвестных ДНК-фрагментов. Для этого метода требуются лишь очень небольшие образцы ДНК, и он позволяет анализировать большое число полиморфных локусов. Однако непредсказуемое поведение коротких праймеров, на которые влияют различные условиях реакции, их доминантный путь наследования и популяционная специфичность являются основными недостатками ΚΆΡΌ.

Микросателлиты или простые повторяющиеся последовательности (δδΚ), полиморфизмы длины простых последовательностей (δδΕΡ), короткие тандемные повторы (δΤΚ), мотивы простых последовательностей (§§М) и микросателлиты последовательностей-мишеней (§ТМ) представляют собой класс повторяющихся последовательностей, которые широко распространены в геноме эукариот. Вариация количества и длины повторов является источником полиморфизма даже среди близкородственных особей. δδΚ-анализ основан на этих (несущих короткий повтор) последовательностях, которые селективно амплифицируют для выявления вариаций в простых повторяющихся последовательностях. Такие микросателлитные последовательности легко можно амплифицировать с помощью ПЦР с использованием пары фланкирующих локус-специфических олигонуклеотидов в качестве праймеров для выявления полиморфизмов длин ДНК (ΠϊΐΕ и БиЦ, 1989; АеЬег и Мау, 1989).

Мутации, затрагивающие одно положение в нуклеотидной последовательности, приводящие к заменам, делециям или инсерциям, приводят к однонуклеотидным полиморфизмам или δ№, которые встречаются примерно через каждые 1,3 т.п.н. в геноме человека (Соорег и др., 1985; К\уок и др., 1996). Большинство полиморфизмов этого типа имеет только два аллеля и их называют также биаллельными локусами. Позиционное клонирование на основе ΑΡ может облегчать идентификацию признаков болезней и ряда биологически информативных мутаций (Аапд и др., 1998).

Анализы, основанные на ПЦР-удлинении, которые позволяют эффективно выявлять точечные мутации, можно применять для обнаружения δ№. Для процедуры требуются небольшое количество ДНК на образец. Тремя широко распространенными типами анализов выявления δ№ с использованием метода ПЦР, являются методы, основанные на применении расщепленных амплифицированных полиморфных последовательностей (ί',ΆΡδ) (Кошес/пу и ЛщнЬек 1993; ТЫе1 и др., 2004), производных СΑΡδ (^ΑΡδ) (МюЬаеН и Литию, 1998; №££ и др., 1998) и конформационного полиморфизма одной цепи (δδСΡ) (0п1а и др., 1989).

СΑΡδ-полиморфизмы представляют собой различия в длинах рестрикционных фрагментов, вызываемые δNΡ или инделами, которые создают или упраздняют распознаваемые обладающими эндонуклеазной активностью рестриктазами сайты рестрикции в ПЦР-ампликонах, продуцируемых специфическими для локуса олигонуклеотидными праймерами. Анализы СΑΡδ осуществляют путем расщепления специфических для локуса ПЦР-ампликонов одной или несколькими рестриктазами и последующего разделения расщепленной ДНК на агарозных или полиакриламидных гелях.

άί',ΆΡδ является модификацией метода СΑΡδ, который позволяет выявлять большинство однонуклеотидных изменений путем использования ошибочно спаренных ПЦР-праймеров. С помощью этого метода распознаваемый рестриктазой сайт, который включает δ№, интродуцируют в ПЦР-продукт с помощью праймера, который содержит одно или несколько ошибочных спариваний с ДНК-матрицей. Затем ПЦР-продукт, модифицированный таким образом, подвергают расщеплению рестриктазой и определяют присутствие или отсутствие δ№ на основе полученной рестрикционной схемы.

Метод δδСΡ позволяет разделять денатурированную двухцепочечную ДНК на неденатурирующем

- 22 022877 геле и в результате позволяет определять на основе подвижности в геле вторичную структуру, а также молекулярную массу одноцепочечной ДНК.

Процедура ΆΚΜδ (амплификация рефракторной мутационной системы)-ПЦР (Уе и др., 2001) предусматривает применение одной ПЦР для генотипирования §№ (Рап и др., 2003; СПарраппо и др., 2004). Состоящий из двух пар праймеров тетрапраймер используют для амплификации двух различных аллелей δΜΡ в одной реакции ПЦР.

Для амплификации таких фрагментов можно применять альтернативные методы, такие как лигазная цепная реакция (ЛЦР) (Вагапу Р., 1991)), для осуществления которой применяют две пары олигонуклеотидных зондов для экспоненциальной амплификации специфической мишени. Последовательности каждой пары олигонуклеотидов выбирают для того, чтобы позволять паре гибридизоваться с примыкающими последовательностями этой же цепи мишени. С помощью указанной гибридизации формируют субстрат для зависящей от матрицы лигазы. Также как в случае ПЦР, образовавшиеся продукты служат в качестве матрицы в последующих циклах и таким образом осуществляют экспоненциальную амплификацию требуемой последовательности.

ЛЦР можно осуществлять с олигонуклеотидами, имеющими проксимальные и дистальные последовательности одной и той же цепи полиморфного сайта. В одном из вариантов осуществления изобретения следует создавать олигонуклеотиды, включающие фактический полиморфный сайт полиморфизма. В таком варианте осуществления изобретения условия реакции выбирают так, чтобы олигонуклеотиды могли лигироваться вместе только в том случае, когда молекула-мишень либо содержит, либо лишена специфического олигонуклеотида, который является комплементарным полиморфному сайту, присутствующему в олигонуклеотиде. В другом варианте олигонуклеотиды можно выбирать так, что они не включают полиморфный сайт (см. 8едеу, заявка ГСТ \У0 90/01069).

Еще один альтернативный метод, который можно применять, представляет собой метод лигирования олигонуклеотидов (0ЬА) (Ьапбедгеп и др., 1988). В 0ЬА-протоколе используют два олигонуклеотида, которые создают так, чтобы они могли гибридизоваться с примыкающими последовательностями одной цепи мишени. 0ЬА, подобно ЛЦР, наиболее пригоден для выявления точечные мутаций. В отличие от ЛЦР в результате 0ЬА получают линейную, а не экспоненциальную амплификацию последовательности мишени.

№скег8оп с соавторами в 1990 г. описали анализ выявления нуклеиновой кислоты, который объединяет особенности и ПЦР, и 0ЬА (№скег§оп и др., 1990). В этом методе ПЦР используют для достижения экспоненциальной амплификации ДНК-мишени, которую затем выявляют с помощью 0ЬА. Помимо необходимости в осуществлении нескольких и разнообразных стадий процессинга, одна из проблем, возникающих при применении таких комбинированных методов, состоит в том, что они включают все проблемы, связанные как с ПЦР, так и с 0ЬА.

Известны также схемы, основанные на лигировании двух (или большего числа) олигонуклеотидов в присутствии нуклеиновой кислоты, имеющей последовательность образовавшегося диолигонуклеотида, что приводит к амплификации диолигонуклеотида (\Уи и \Уа11асе, 1989), и их можно легко адаптировать для целей настоящего изобретения.

Таким образом, различные анализы, основанные на применении генной последовательности, предлагаемой в изобретении и описанной выше, можно создавать и применять для скрининга растительного материала в отношении присутствия или отсутствия аллеля, ассоциированного с признаком однолетности.

На основе δΜΡ можно разрабатывать молекулярные маркеры, предпочтительно такие, как Епб роиН ТадМап®, отличающиеся от секвенированных ПЦР-продуктов тем, что их амплифицируют из однолетних и двулетних растений. При этом требуется осуществлять несколько циклов ПЦР-амплификации для того, чтобы охватить всю последовательность гена.

Затем новые молекулярные маркеры следует тестировать с использованием различных генетических фонов однолетних и двулетних растений для оценки робастности молекулярного теста.

В одном из вариантов осуществления изобретения молекулярный маркер представляет собой ДНКфрагмент, амплифицированный с помощью ПЦР, например δδΚ-маркер или ΚΛΡΌ-маркер. В одном из вариантов осуществления изобретения присутствие или отсутствие амплифицированного ДНКфрагмента является показателем присутствия или отсутствия самого признака или конкретного ассоциированного с признаком аллеля. В одном из вариантов осуществления изобретения различие в длине амплифицированного ДНК-фрагмента является показателем присутствия или отсутствия конкретного ассоциированного с признаком аллеля и в результате позволяет дифференцировать различные ассоциированные с признаком аллели.

В конкретном варианте осуществления изобретения микросателлитные (простые повторяющиеся последовательности) (§§К) маркеры используют для идентификации подпадающих под объем изобретения аллелей в родительских растениях и/или их предках, а также в потомстве растений, полученном в результате скрещивания указанных родительских растений.

В другом варианте осуществления изобретения маркер, основанный на однонуклеотидном полиморфизме, используют для идентификации подпадающих под объем изобретения аллелей в родитель- 23 022877 ских растениях и/или их предках, а также в потомстве растений, полученном в результате скрещивания указанных родительских растений.

Еще в одном варианте осуществления изобретения маркер, основанный на делеции или инсерции (инделе) по меньшей мере одного нуклеотида, используют для идентификации подпадающих под объем изобретения аллелей в родительских растениях и/или их предках, а также в потомстве растений, полученном в результате скрещивания указанных родительских растений.

Эти маркеры можно создавать на основе последовательности полинуклеотидов, предлагаемых в изобретении и описанных выше.

Согласно одному из объектов изобретения можно разрабатывать и применять маркеры, которые не полностью соответствуют представленным в настоящем описании, или еще не идентифицированные маркеры. На основе информации, представленной в настоящем описании, специалист в данной области может идентифицировать или создавать маркеры, которые не полностью соответствуют представленным в настоящем описании, но генетически близко сцеплены или предпочтительно локализованы в гене, обусловливающим стрелкование, или гене В, или сцеплены с маркерами, представленными в настоящем описании. Специалисту в данной области должно быть очевидно, что другие маркеры могут найти по меньшей мере такое же применение в скрининговых анализах и связанной с маркерами селекции.

Специалистам в данной области известны и доступны несколько методов или подходов, которые можно применять для идентификации и/или создания маркеров неравновесного сцепления и/или сцепленных с и/или локализованных в области гена В, а также маркеров, которые представляют собой фактически причинные мутации, ответственные характерный для двулетнего типа развития генотип. Известные специалистам в данной области подходы включают, но не ограничиваясь только ими.

Применение описанных последовательностей/маркеров в основанных на использовании гибридизации подходах для идентификации другой последовательности в представляющей интерес области: праймерные последовательности, представленные в настоящем описании, и/или последовательности маркеров/генов (или их фрагмент), которые можно определять с помощью праймерных последовательностей, представленных в настоящем описании, можно применять в качестве зондов (гибридизующихся) для выделения нуклеотидных последовательностей/генов, фланкирующих маркеры, и/или сцепленных с областью гена В и/или локализованных в ней, и/или специфических для нее, из образца геномной нуклеиновой кислоты и/или образца РНК или кДНК, или пула образцов (например, осуществляя скрининг геномных ресурсов типа ВАС-библиотек или скрининг библиотек гДНК или кДНК).

Применение описанных последовательностей/маркеров в основанных на использовании ПЦР подходах для идентификации другой последовательности в представляющей интерес области праймерные последовательности, представленные в настоящем описании, и/или последовательности маркеров/генов(кандидатов) (или их фрагмент), которые можно определять с помощью праймерных последовательностей, представленных в настоящем описании, можно применять в качестве праймеров для (ПЦР-)амплификации нуклеотидной последовательности/гена, фланкирующего ОТЬ-область и/или сцепленного с ней, и/или ассоциированного с ней, и/или специфического в отношении нее из образца геномной нуклеиновой кислоты и/или образца РНК или кДНК, или пула образцов, либо выделенных из конкретной растительной ткани, либо не выделенных из нее, и/или после специфической обработки растения, и из растения сахарной свеклы и в принципе из любого другого организма, имеющего достаточную степень гомологии с сахарной свеклой.

Применение описанных последовательностей/маркеров в основанных на использовании ПЦР подходах для идентификации другой последовательности в представляющей интерес области: нуклеотидные последовательности/гены одного или нескольких маркеров можно определять после создания внутренних праймеров для указанных маркерных последовательностей и применять для определения дополнительных фланкирующих последовательностей/генов в области гена В и/или генетически сцепленных и/или ассоциированных с признаком.

Применение описанных последовательностей/маркеров в основанных на использовании картирования и/или сравнительного картирования для идентификации маркеров в одном(их) и том(тех) же области(ях) (определение местоположения (позиционирование) гена В на других картах): на основе информации о местоположении и/или информации о маркерах, представленной выше, маркеры любого типа можно идентифицировать на основе подходов с использованием генетического картирования, в конечном счете (если в этом есть необходимость) путем определения местоположения описанных маркеров (методом генетического картирования или экстраполяции на основе общих маркеров на картах) на генетической(их) карте(ах) (высокой плотности) и/или интегрированной(ых) генетической(их) или консенсусной(ых) карты(карт). Маркеры, которые уже являются известными и/или новые маркеры, генетически сцепленные и/или расположенные вблизи описанных маркеров и/или области гена В, можно идентифицировать и/или получать и в конечном счете применять для картирования (точного) гена В и/или клонирования гена В, и/или применения для МА8-селекции.

Применение описанных последовательностей/маркеров в ш-зПосо-подходах (методы молекулярного моделирования на основе набора вычислительных методов) для идентификации дополнительных последовательностей/маркеров/генов-кандидатов в области(ях) гена В: праймерные последовательности,

- 24 022877 представленные в настоящем описании, и/или последовательности маркеров/генов-кандидатов (или их фрагмент), которые можно определять с помощью праймерных последовательностей, представленных в настоящем описании, или на основе сцепленных маркеров, можно использовать в ш-кШсо-методах для поиска в базах данных последовательностей или белков (например, с использованием программы ВБА8Т) (дополнительных) фланкирующих и/или гомологичных последовательностей/генов, и/или аллельного разнообразия (как геномных последовательностей, так и/или последовательностей кДНК или даже белков, полученных как из представителей рода Саркюнт (перец), так и/или из любого другого организма), которые генетически сцеплены и/или ассоциированы с признаками, указанными в настоящем описании, и/или локализованы в области гена В.

Применение описанных последовательностей/маркеров в основанных на физическом картировании подходах (определение местоположения гена В на физической карте или в геномной последовательности): праймерные последовательности, представленные в настоящем описании, и/или последовательности маркеров/генов (или их фрагменты), которые можно определять с помощью праймерных последовательностей, представленных в настоящем описании, или с помощью других маркеров, генетически сцепленных с маркерами, представленными в настоящем описании, и/или локализованных в области гена В, можно позиционировать на физической карте и/или в (полной) геномной последовательности в принципе любого организма, имеющей достаточную степень гомологии для идентификации (перспективных) последовательностей/маркеров/генов, которые можно применять для картирования (точного) гена В и/или клонирования гена В, и/или применения для ΜΆδ-селекции.

Применение описанных последовательностей/маркеров для определения местоположения гена В на других (физических) картах или геномах (других видов...., при этом для перца, естественно, первостепенный интерес имеют другие представители пасленовых (8о1аиасеае), такие как томаты и картофель, но можно применять также модельные виды типа АгаЫборкю): праймерные последовательности, представленные в настоящем описании, и/или последовательности маркеров/генов (или их фрагменты), которые можно определять с помощью праймерных последовательностей, представленных в настоящем описании, можно применять для подходов, основанных на сравнительном картировании генома или синтении, для идентификации гомологичной области и последовательностей гомологов и/или ортологов/генов (кандидатов), генетически сцепленных с областью гена В и/или расположенных в ней, и которые можно применять для картирования (точного) гена В и/или клонирования гена В, и/или применения для МА§селекции.

Применение описанных последовательностей/маркеров для отбора соответствующих особей, с помощью которых можно идентифицировать маркеры в представляющей интерес области с помощью генетических подходов: праймерные последовательности и/или маркеры, представленные в настоящем описании, можно использовать для отбора особей с различными/контрастирующими аллелями гена В. Генетические подходы и/или анализ объединенных сегрегантов (В8А, М1сйе1тоте и др., 1991) можно применять для идентификации маркеров/генов в конкретной представляющей интерес области (области гена В) и/или области, ассоциированной или генетически сцепленной с описанными признаками.

Применение представленной информации для поиска (позиционных) генов-кандидатов: представленную информацию можно применять для идентификации позиционных и/или функциональных геновкандидатов, которые могут быть ассоциированы и/или генетически сцеплены с описанными признаками.

В частности, маркеры, предлагаемые в настоящем изобретении, можно применять в анализе аллельной дискриминации, прежде всего в анализе, который позволяет различать (дискриминировать) различные гаплотипы в группах растений сахарной свеклы, имеющих генотип, характерный для двулетнего типа развития. Указанный анализ базируется на применении набора полинуклеотидных зондов, содержащего две различные молекулы-зонды, которые комплементарны, например, подобласти гена ΒνΡΚΚ7, которую можно получать путем ПЦР-амплификации с использованием прямого праймера ΡΚΚ7-Ρ и обратного праймера ΡΡΚ7-Κ, последовательности которых представлены в 8ЕО ГО N0: 7 и 8Е0 ГО N0: 8 соответственно, где молекулы-зонды различаются только одним ошибочным спариванием оснований, прежде всего ошибочным спариванием оснований в положении № 631.

Другим объектом изобретения является анализ, включающий применение маркеров, с помощью которых можно осуществлять специфическую идентификацию однолетних растений и двулетних растений, и поэтому их можно применять, например, для контроля качества партий семян.

В частности, в изобретении предложен анализ, базирующийся на применении набора олигонуклеотидных зондов, содержащих две различные молекулы-зонды, которые комплементарны, например, подобласти гена ΒνΡΚΚ7, которую можно получать путем ПЦР-амплификации с использованием прямого праймера ΡΡΚ7-Ρ и обратного праймера ΡΡΚ7-Κ, последовательности которых представлены в 8Е0 ГО N0: 7 и 8Е0 ГО N0: 8 соответственно, где молекулы-зонды различаются только одним ошибочным спариванием оснований, прежде всего ошибочным спариванием оснований в положении № 631.

Большая часть производств предназначенных для продажи семян сахарной свеклы находится на юге Франции и севере Италии. В обоих регионах присутствуют однолетние сорные виды свекольных, это может приводить к загрязнению их пыльцой получаемых продуктов и как следствие, к появлению характерного для однолетнего типа развития генотипа у предназначенных для продажи семян. Это является

- 25 022877 неприемлемым для покупателей, и поэтому все предназначенные для продажи партии семян выращивают в регионах, таких как Аргентина, в которых сорные виды свекольных не вырастают непосредственно после сбора семян. Растения являются неяровизированными и наличие стрелок используют для идентификации партий, загрязненных характерным для однолетнего типа развития генотипом.

Признак однолетнего типа развития растений проявляется в зависимости от состояния гена В как моногенный доминантный признак; таким образом, потребность в яровизации у двулетних растений является рецессивной. Таким образом, можно предположить, что трансформация определяющего однолетний тип развития аллеля ВуРКК7 в характерный для двулетнего типа развития генотип приводит к включению признака ежегодного цветения, в характерный для двулетнего типа развития акцепторный генотип. Для подтверждения этой гипотезы кодирующей последовательностью определяющего однолетний тип развития аллеля гена ВуРКК7, находящейся под контролем характерных для однолетнего типа развития промотора и фрагмента терминатора, трансформируют характерный для двулетнего типа развития генотип, такой, например, как 0018. Трансформацию можно осуществлять методами, известными в данной области, такими как методы, описанные у Сйаид и др., 2002, используя меристему сахарной свеклы в качестве эксплантата и ген фосфоманнозоизомеразы (РМ1) в качестве селектируемого маркера. Трансгенные побеги отбирают по признаку экспрессии маркера селекции, такого, например, как РМ1активность (1оег§Ьо и др., 1998), и затем укореняют, высаживают в почву и переносят в теплицу. В качестве отрицательного контроля используют нетрансгенные побеги, которые подвергают такой же процедуре регенерации ίη уйго, но без заражения ЛдгоЬаОегшт и селекции. Растения выращивают в вегетационных камерах при постоянной температуре 18°С и фотопериоде 17 ч света и 7 ч темноты. В этих условиях ни у одного из нетрасгенных контролей не должно быть обнаружено каких-либо признаков стрелкования в течение периода наблюдения, в то время как однолетние контрольные растения в норме должны выбрасывать стрелку в пределах 8-недельного периода времени. В отличие от нетрансгенных двулетних контрольных растений у большинства трансгенов стрелкование должно начинаться через 4-10 недель, и они должны обладать основным признаком, характерным для однолетних растений, несмотря на их генетический фон, соответствующий двулетним растениям. Трансгенные растения, у которых обнаружено стрелкование и цветение, подвергают перекрестному опылению двулетней поддерживающей линией с получением потомства. У растений-потомков оценивают активность маркера селекции и затем оценивают в отношении стрелкования и цветения без яровизации. Большая часть потомков должна характеризоваться коэффициентом сегрегации 1:1 и прямой корреляцией между РМ1-активностью и признаком однолетности. Эти данные должны недвусмысленно подтверждать причинную связь между ВуРКК7 и независящим от яровизации цветением у сахарной свеклы.

ВуРКК7 играет основную роль в яровизационном ответе сахарной свеклы и поэтому его можно применять для создания устойчивости к стрелкованию у растений сахарной свеклы путем подавления яровизационного ответа. Для этой цели кДНК-фрагмент ВуРКК7, такой, например, как фрагмент размером 0,6 т.п.п., представленный в 8Е0 ГО N0: 1, помещают в кассету для РНЮ под контроль конститутивного промотора. Приемлемыми конститутивными промоторами являются, например, промотор ИЫЗ ЛгаЫйор818 (№гп5 и др., 1993), промотор 358 СаМУ или другие промоторы, для которых известно, что они обеспечивают конститутивную экспрессию сахарной свеклы. Кассета экспрессии содержит также селектируемый маркерный ген под контролем приемлемого промотора. В частности, маркерный ген кодирует маркер положительной селекции, такой как фосфоманнозоизомераза или ксилозоизомераза. Инвертированный повтор ВуРКК7-фрагмента может быть отделен вторым интроном от гена 8ГО81 картофеля (Ескек и др., 1986; Уапсапиеу!: и др., 1990) для стабилизации РНЮ-кассеты, но также для повышения эффективности процесса РНК1 (Ааид и Аа1егЬои8е, 2001; διηίΐΐι и др., 2000).

Затем РНЮ-кассетой можно трансформировать определяющий признак двулетнего развития генотип сахарной свеклы, такой, например, как 0018, согласно описанному выше методу. Трансгенные побеги отбирают по признаку экспрессии маркера селекции, такого, например, как РМ1-активность (1оег§Ьо и др., 1998). Дающие положительную реакцию побеги и нетрансгенные контрольные побеги укореняют и переносят в теплицу для акклиматизации в течение минимум двух недель при 18°С до их обработки для яровизации. Согласно принятым методам трансгенные растения подвергают обработке для яровизации, которая предусматривает выдерживание в течение 14 дней при постоянной температуре 6°С и 12часовой низкой искусственной освещенности.

Перед воздействием индуцирующих стрелкование условий яровизированные растения медленно акклиматизируют в течение двух недель в климатических камерах путем ступенчатого повышения температуры с 10 до 18°С. Затем растения пересаживают в более крупные горшки (2 л) и осуществляют мониторинг стрелкования, выдерживая их при постоянной температуре 18°С и фотопериоде с длительным световым днем 17 ч света/7 ч темноты. У нетрансгенных контрольных растений, как правило, стрелкование начинается в период между 4-6 неделями после яровизации. У трансгенных растений с подавленным геном ВуРКК7 часто наблюдается замедление стрелкования на период времени, составляющий от лишь двух недель и вплоть до более чем 2 месяцев. В некоторых случаях стрелкование вообще не происходило в условиях, существующих в теплице. Помимо замедления стрелкования и цветения трансгенные растения развиваются нормально и не имеют фенотипических аномалий. В целом, для растений с замедлен- 26 022877 ным стрелкованием характерно большее количество листьев в момент стрелкования в результате пролонгированной вегетативной стадии.

Получение достаточных уровней трансгенной экспрессии в соответствующих растительных тканях является важным аспектом выращивания созданных с помощью генной инженерии культурных растений. Экспрессия гетерологичных последовательностей ДНК в растении-хозяине зависит от присутствия функционально связанного промотора, который функционирует в растении-хозяине. Выбор промоторной последовательности должен определять время, когда экспрессируется гетерологичная последовательность ДНК, и место в организме, где это происходит.

Например, если существует потребность в сверхэкспрессии, то можно применять растительный промоторный фрагмент, который обеспечивает экспрессию гена во всех тканях регенерированного растения. Указанные промоторы в контексте настоящего описания обозначены как «конститутивные» промоторы, и они обладают активностью при большинстве условий окружающей среды и стадиях развития или клеточной дифференцировки. Примерами конститутивных промоторов являются область инициации транскрипции вируса мозаики цветной капусты (СаМУ) 358. 1'- или 2'-промотор, выведенный из Т-ДНК АдгоЬас1ейит 1ите£ас1епз, и другие области инициации транскрипции из различных растительных генов, которые известны специалистам в данной области. Такие гены включают, например, ген АР2, АСТ11 из АгаЫбор515 (Ниапд и др., Р1ап1 Мо1. ΒίοΙ. 33, 1996, с. 125-139), Са13 из АгаЫборз1з (ОепВапк N0: И43147, Ζ1ιοη§ и др., Мо1. Оеп. Оепе1. 251, 1996, с. 196-203), ген, кодирующий стеароил-АПБ (ацилпереносящий белок)-десатуразу из Вгаззюа париз (ОепЬапк N0: Х74782, 8о1осотЬе и др., Р1ап1 РЬузю1. 104, 1994, с. 1167-1176), ОРс1 из кукурузы (ОепВапк N0: Х15596, Майте/ и др., I. Мо1. Вю1 208, 1989, с. 551-565) и Орс2 из кукурузы (ОепВапк N0: И45855, МапщпаШ и др., Р1агй Мо1. Вю1. 33, 1997, с. 97-112).

В другом варианте промотор может обеспечивать экспрессию молекул нуклеиновых кислот в конкретной ткани или может более точно контролироваться условиями окружающей среды или стадией развития. Примерами условий окружающей среды, которые могут влиять на транскрипцию с помощью индуцибельных промоторов, являются анаэробные условия, повышенная температура или присутствие света. Такие промоторы в контексте настоящего описания обозначены как индуцибельные или тканеспецифические промоторы. Специалисту в данной области должно быть очевидно, что тканеспецифический промотор может обеспечивать экспрессию функционально связанных последовательностей в тканях, отличных от ткани-мишени. Таким образом, в контексте настоящего описания тканеспецифический промотор представляет собой промотор, который обеспечивает экспрессию прежде всего в тканимишени, но может контролировать также определенный уровень экспрессия в других тканях.

Примерами промоторов, действие которых зависит от стадии развития, являются промоторы, которые инициируют транскрипцию только (или практически только) в определенных тканях, таких как плод, семена или цветки. Промоторы, которые обеспечивают экспрессию нуклеиновых кислот в семяпочках, цветках или семенах, являются наиболее предпочтительными согласно настоящему изобретению. В контексте настоящего описания под специфическим или предпочтительным для семени промотором подразумевается промотор, который обеспечивает экспрессию специфически или предпочтительно в тканях семян, например, указанные промоторы могут быть специфическими для семяпочки, специфическими для зародыша, специфическими для эндосперма, специфическими для интегумента, специфическими для семенной оболочки или специфическими для определенных комбинаций этих органов. Их примерами являются промотор из специфического для семяпочки гена ВЕЬ1, который описан у Казег и др., Се11 83, 1995, с. 735-742 (ОепВапк N0: И39944). Другие пригодные специфические для семян промоторы выводят из следующих генов: МАС1 из кукурузы (8Ьейбап и др., Оепейсз 142, 1996, с. 1009-1020, Са13 из кукурузы (ОепВапк N0: Ь05934, АЬ1ег и др., Р1ап1 Мо1. Вю1. 22, 1993, с. 10131-1038), кодирующий олеозин ген размером 18 т.п.н. из кукурузы (ОепВапк N0: 105212, Ьее и др., Р1агй Мо1. Вю1. 26, 1994, с. 1981-1987), у1урагоиз-1 из АгаЫборз1з (ОепЬапк N0: И93215), кодирующий олеозин ген из АгаЫборз1з (ОепЬапк N0: Ζ17657), А1тус1 из АгаЫборз1з (Игао и др., Р1ап1 Мо1. Вю1. 32, 1996, с. 571-576), семейство генов 2з запасающего белка семян АгаЫборз1з (Сопсеюао и др., Р1ап1 5, 1994, с. 493-505), кодирующий олеозин ген размером 20 т.п.н. из Вгаззюа париз (ОепВапк N0: М63985), парА из Вгаззюа париз (ОепВапк N0: 102798, 1озеГззоп и др., ХВЬ 26, 1987, с. 12196-1301, семейство генов напина из Вгаззюа париз (8|обак1 и др., Р1агйа 197, 1995, с. 264-271), ген, кодирующий запасающий белок 28, из Вгаззюа париз (Наздир1а и др., Оепе 133, 1993, с. 301-302), гены, кодирующие олеозин А (ОепВапк N0: И09118) и олеозин В (ОепВапк N0: И09119) из сои, и ген, кодирующий низкомолекулярный богатый серой белок из сои (СЬо1 и др., Мо1 Оеп, Оепе!. 246, 1995, с. 266-268).

В другом варианте можно идентифицировать конкретные последовательности, представляющие собой промотор с требуемыми характеристиками экспрессии или промотор с повышенной экспрессионной активностью, или эти или подобные последовательности интродуцировать в последовательности посредством мутации. Кроме того, можно осуществлять мутагенез этих последовательностей для повышения экспрессии трансгенов в конкретных видах.

Кроме того, можно применять промоторы, в которых объединены элементы более одного промотора. Например, в И8 5491288 описана комбинация промотора вируса мозаики цветной капусты и промотора гистона. Таким образом, элементы промоторов, представленных в настоящем описании, можно объ- 27 022877 единять с элементами других промоторов.

Для применения в настоящем изобретения доступны различные регулирующие транскрипцию 5'- и 3'-последовательности. Терминаторы транскрипции ответственны за терминацию транскрипции и правильное полиаденилирование мРНК. 3'-нетраслируемая регуляторная последовательность ДНК предпочтительно включает от примерно 50 до примерно 1000, более предпочтительно от примерно 100 до примерно 1000 пар оснований (нуклеотидов) и содержит растительные терминирующие транскрипцию и трансляцию последовательности. Приемлемые терминаторы транскрипции и терминаторы, для которых известно, что они функционируют в растениях, представляют собой терминатор 35δ СаМУ, терминатор 1т1, терминатор нопалинсинтазы, терминатор Е9 τ^δ гороха, терминатор для транскрипта Т7 из гена октопинсинтазы АдгоЬасЮгнип 1итеГас1еп5 и 3'-конец генов протеазных ингибиторов Ι или ΙΙ из картофеля или томатов, хотя можно применять также другие 3'-концевые элементы, известные специалистам в данной области. В другом варианте можно применять также терминатор коиксина гамма, олеозина 3 или другие терминаторы из рода Со1х.

Предпочтительными 3'-элементами являются элементы из гена нопалинсинтазы АдгоЬасЮгнип 1итеГас1еи5 (Βеνаη и др., 1983), терминатор для транскрипта Т7 из гена октопинсинтазы АдгоЬасЮгннп 1итеГааеик и 3'-концевые элементы генов протеазных ингибиторов Ι или ΙΙ из картофеля или томатов.

Поскольку последовательность ДНК, расположенная между сайтом инициации транскрипции и стартовым кодоном кодирующей последовательности, т.е. нетранслируемая лидерная последовательность, может влиять на экспрессию гена, может оказаться желательным применять конкретную лидерную последовательность. Считается, что предпочтительными лидерными последовательностями являются последовательности, которые включают последовательности, для которых предсказана способность обеспечивать оптимальную экспрессию присоединенного гена, т.е. предпочтительные консенсусные лидерные последовательности, которые могут повышать или поддерживать стабильность мРНК и предупреждать несоответствующую инициацию трансляции. Выбор указанных последовательностей должен быть очевиден специалистам в данной области в свете настоящего описания. Наиболее предпочтительными являются последовательности, выведенные из генов, характеризующихся высоким уровнем экспрессии в растениях.

Другие последовательности, для которых обнаружена способность повышать генную экспрессию в трансгенных растениях, представляют собой интронные последовательности (например, из генов Абб1, Ьгоп/е1, асби 1, асби 2 (\У0 00/760067), или интрон синтазы сазарозы) и вирусные лидерные последовательности (например, из вирусов ТМУ, МСМУ и АМУ). Например, известно несколько нетранслируемых лидерных последовательностей, полученных из вирусов, которые обладают способностью повышать экспрессию. В частности, установлено, что лидерные последовательности из вируса табачной мозаики (ТМУ), вируса хлорозной пятнистости кукурузы (МСМУ) и вирус мозаики люцерны (АМУ) обладают эффективностью в отношении повышения экспрессии (например, Оа1бе и др., 1987; δΚι^ίΧί и др., 1990). Другие известные в данной области лидерные последовательности представляют собой, но не ограничиваясь только ими: лидеры пикорнавирусов, например, лидер БМСУ (5'-некодирующая область вируса энцефаломиокардита) (Б1гоу-8)ет и др., 1989); лидеры потивирусов, например, лидер ТБУ (вирус табачной гравировки); лидер МИМУ (вирус мозаичной карликовости кукурузы); лидер человеческого белка, связывающего тяжелую цепь иммуноглобулинов (В1Р) (Масе)ак и др., 1991); нетранслируемый лидер из мРНК оболочечного белка вируса мозаики люцерны (АМУ КNΑ 4), ОоЬПпд и др., 1987), лидер вируса табачной мозаики (ТМУ) (Оа1бе и др., 1989; и лидер хлорозной пятнистости кукурузы (МСМУ) (Ботте1 и др., 1991) (см. также Иеба-Сюрра и др., 1987).

При необходимости можно включать также регуляторные элементы, такие как интрон 1 Абб (Са1бк и др., 1987), интрон синтазы сахарозы (Уакб и др., 1989) или элемент ТМУ-омега (Оа1бе и др., 1989).

Примерами энхансеров являются элементы промотора 35δ СаМУ, генов октопинсинтазы (БШк и др., 1987), гена актина Ι риса, гена алкогольдегидрогеназы кукурузы (СаШк и др., 1987), гена Ι морщинистости кукурузы (Уакб и др., 1989), элемент ТМУ-омега (Оа1бе и др., 1989) и промоторы из эукриотических организмов кроме растений (например, дрожжей; Ма и др., 1988).

Известно два основных метода контроля экспрессии, такие как обеспечение сверхэкспрессии и пониженной экспрессии. Для достижения сверхэкспрессии можно использовать инсерцию одной или нескольких дополнительных копий выбранного гена. Однако к настоящему времени отсутствует информация о растениях или их потомстве, исходно трансформированных одной или несколькими дополнительными копиями нуклеотидной последовательности, для которых характерна пониженная экспрессия, а также сверхэкспрессия. Известны два основных метода для достижения пониженной экспрессии, которые обычно обозначают как антисмысловая регуляция по типу отрицательной связи и смысловая регуляция по типу отрицательной связи (смысловую регуляцию по типу отрицательной связи обозначают также как косупрессия). В целом, эти процессы обозначают как молчание генов. Оба эти метода позволяют осуществлять ингибирование экспрессии гена-мишени.

Согласно настоящему изобретению для изменения экспрессии молекулы нуклеиновой кислоты, предлагаемой в настоящем изобретении, можно применять один из следующих путей.

Смысловая супрессия

- 28 022877

Изменение экспрессии нуклеотидной последовательности, предлагаемой в настоящем изобретении, предпочтительно снижение ее экспрессии, получают с помощью смысловой супрессии (описание см., например, у 1огдеп8еп и др., Р1ап1 Мо1. ΒίοΙ. 31, 1996, с. 957-973). В этом случае полную нуклеотидную последовательность, предлагаемую в настоящем изобретении, или ее часть включают в молекулу ДНК. Молекулу ДНК предпочтительно функционально связывают с промотором, который обладает способностью функционировать в клетке, содержащей ген-мишень, предпочтительно растительной клетке, и интродуцируют в клетку, в которой может происходить экспрессия нуклеотидной последовательности. Нуклеотидную последовательность встраивают в молекулу ДНК в смысловой ориентации, т.е. таким образом, что кодирующая цепь нуклеотидной последовательности может транскрибироваться. В предпочтительном варианте осуществления изобретения нуклеотидная последовательность является полностью транслируемой, и вся генетическая информация, содержащаяся в нуклеотидной последовательности или ее части, транслируется в полипептид. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения нуклеотидная последовательность является частично транслируемой и продуктом трансляции является короткий пептид. В предпочтительном варианте осуществления изобретения для этой цели используют инсерцию по меньшей мере одного преждевременного стоп-кодона в нуклеотидную последовательность, что снижает трансляцию наполовину. В другом более предпочтительном варианте осуществления изобретения нуклеотидная последовательность транскрибируется, но при этом не образуется продукт трансляции. Для этой цели, как правило, используют удаление стартового кодона, например АТС, полипептида, кодируемого нуклеотидной последовательностью. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения молекулу ДНК, которая содержит нуклеотидную последовательность или ее часть, стабильно интегрируют в геном растительной клетки. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения молекулу ДНК, которая содержит нуклеотидную последовательность или ее часть, включают во внехромосомно реплицирующуюся молекулу.

В трансгенных растениях, которые содержат одну из описанных непосредственно выше молекул ДНК, экспрессию нуклеотидной последовательности, соответствующей нуклеотидной последовательности, которая содержится в молекуле ДНК, предпочтительно понижают. Предпочтительно нуклеотидная последовательность, входящая в ДНК, идентична по меньшей мере на 70% нуклеотидной последовательности, экспрессию которой понижают, более предпочтительно идентична по меньшей мере на 80%, еще более предпочтительно идентична по меньшей мере на 90%, еще более предпочтительно идентична по меньшей мере на 95%, еще более предпочтительно идентична по меньшей мере на 99%.

Антисмысловая супрессия

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения изменение экспрессии нуклеотидной последовательности, предлагаемой в настоящем изобретении, предпочтительно снижение ее экспрессии, осуществляют с помощью антисмысловой супрессии. Полную нуклеотидную последовательность, предлагаемую в настоящем изобретении, или ее часть включают в молекулу ДНК. Молекулу ДНК предпочтительно функционально связывают с промотором, который обладает способностью функционировать в клетке, содержащий ген-мишень, и интродуцируют в растительную клетку, в которой может происходить экспрессия нуклеотидной последовательности. Нуклеотидную последовательность встраивают в молекулу ДНК в антисмысловой ориентации, т.е. таким образом, что может транскрибироваться обратный комплемент (называемый также иногда некодирующей цепью) нуклеотидной последовательности. В предпочтительном варианте осуществления изобретения молекулу ДНК, которая содержит нуклеотидную последовательность или ее часть, стабильно интегрируют в геном растительной клетки. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения молекулу ДНК, которая содержит нуклеотидную последовательность или ее часть, включают во внехромосомно реплицирующуюся молекулу. С целью дополнительной иллюстрации ниже процитирован ряд публикаций, в которых описан указанный подход (Сгееп Р.1. и др., Αηη. Реу. ВюсЬет. 55, 1986, с. 569-597; ναη йег Кго1 Α.Κ. и др., АпШепке Шс. Ас1Й8 & Рго1е1П8, 1991, с. 125-141; АЬе1 Р.Р. и др., Ргос. №11. Асай. δα. И8А 86, 199, с. 6949-6952; Ескег Ι.Κ. и др., Ргос. №11. Асай. δα. И8А 83, август 1986 г., с. 5372-5376).

Гомологичная рекомбинация

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения по меньшей мере одну геномную копию, соответствующую нуклеотидной последовательности, предлагаемой в настоящем изобретении, модифицируют в геноме растения путем гомологичной рекомбинации, что дополнительно проиллюстрировано у Ра5/ко\У51й и др., ЕМВ0 1оигпа1 7, 1988, с. 4021-4026.

Этот метод основан на способности гомологичных последовательностей распознавать друг друга и обмениваться друг с другом нуклеотидными последовательностями с помощью процесса, известного как

- 29 022877 гомологичная рекомбинация. Гомологичная рекомбинация может происходить между хромосомной копий нуклеотидной последовательности в клетке и внесенной копией нуклеотидной последовательности, интродуцированной в клетку путем трансформации. Таким образом точно интродуцируют специфические модификации в хромосомную копию нуклеотидной последовательности. Согласно одному из вариантов осуществления изобретения можно модифицировать регуляторные элементы нуклеотидной последовательности, предлагаемой в настоящем изобретении. Указанные регуляторные элементы легко получать путем скрининга геномной библиотеки с использованием нуклеотидной последовательности, предлагаемой в настоящем изобретении, или ее части в качестве зонда. Существующие регуляторные элементы заменяют различными регуляторными элементами, изменяя тем самым экспрессию нуклеотидной последовательности, или их подвергают мутации или изымают путем делеции, упраздняя тем самым экспрессию нуклеотидной последовательности. Согласно другому варианту осуществления изобретения нуклеотидную последовательность модифицируют путем делеции части нуклеотидной последовательности или полной нуклеотидной последовательности или с помощью мутации. Экспрессия мутантного полипептида в растительной клетке подпадает также под объем настоящего изобретения. Опубликовано более современное усовершенствование этого метода с целью нарушения эндогенных растительных генов (Кетрш и др., №Циге 389, 1997, с. 802-803 и М1ао и Ьат, Р1ап1 ί., 7, 1995, с. 359-365).

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения мутацию в хромосомной копии нуклеотидной последовательности интродуцируют путем трансформации клетки химерным олигонуклеотидом, состоящим из смежного участка остатков РНК и ДНК, имеющего конформационные особенности дуплексной структуры с двумя кэпами в виде шпилек на концах Дополнительной особенностью олигонуклеотида является, например, 2'-О-метилирование остатков РНК. Последовательность РНК/ДНК создают так, чтобы она была выровнена с последовательностью хромосомной копии нуклеотидной последовательности, предлагаемой в настоящем изобретении, и содержала требуемую нуклеотидную замену (например, этот метод дополнительно описан в υδ 5501967 и у 2йи и др., Ргос. №И. Асаб. δα. υδΑ 96, 1999, с. 8768-8773).

Рибозимы

В другом варианте осуществления изобретения РНК, кодирующую полипептид, предлагаемый в настоящем изобретении, расщепляют с помощью каталитической РНК или рибозима, специфического для указанной РНК. Рибозим экспрессируется в трансгенных растениях, что приводит к снижению уровня РНК, кодирующей полипептид, в растительных клетках и в результате к снижению уровня полипептида, накапливаемого в клетках. Этот метод описан также в υδ 4987071.

Доминантно-негативные мутации

В другом варианте осуществления изобретения изменяют активность полипептида, кодируемого нуклеотидными последовательностями, предлагаемыми в настоящем изобретении. Для этой цели используют экспрессию доминантно-негативных мутантов белков в трансгенных растениях, что приводит к потере активности эндогенного белка.

Аптамеры

В другом варианте осуществления изобретения активность полипептида, предлагаемого в настоящем изобретении, ингибируют путем экспрессии в трансгенных растениях лигандов нуклеиновых кислот, так называемых аптамеров, которые специфически связываются с белком. Аптамеры предпочтительно получают с помощью метода δΕΓΕΧ (системная эволюция лигандов экспоненциальным обогащением). При применении метода δΕΓΕΧ перспективную смесь (смесь-кандидат) одноцепочечных нуклеиновых кислот, содержащих области рандомизированной последовательности, приводят в контакт с белком и нуклеиновые кислоты, обладающие повышенной аффинностью к мишени, отделяют от остальной части перспективной смеси. Отделенные нуклеиновые кислоты амплифицируют с получением обогащенной лигандами смеси. После нескольких итераций получают нуклеиновую кислоту, обладающую оптимальной аффинностью к полипептиду, и применяют для экспрессии в трансгенных растениях. Этот метод описан также в υδ 5270163.

Белки, содержащие домен цинковых пальцев

Белок, содержащий домен цинковых пальцев, который связывается с нуклеотидной последовательностью, предлагаемой в настоящем изобретении, или с ее регуляторной областью, можно применять также для изменения экспрессии нуклеотидной последовательности. Предпочтительно транскрипцию нуклеотидной последовательности понижают или повышают. Белки, содержащие домен цинковых пальцев, описаны (см., например, у ВеегБ и др., ΡΝΑδ 95, 1988, с. 14628-14633 или в АО 95/19431, АО 98/54311 или АО 96/06166, все публикации полностью включены в настоящее описание в качестве ссылки).

бкРНК

Для изменения экспрессии нуклеотидной последовательности, предлагаемой в настоящем изобретении, можно использовать также интерференцию бкРНК, описанную, например, в АО 99/32619, АО

99/53050 или АО 99/61631, которые полностью включены в настоящее описание в качестве ссылки.

Инсерция молекулы ДНК (инсерционный мутагенез)

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения молекулу ДНК встраивают в

- 30 022877 хромосомную копию нуклеотидной последовательности, предлагаемой в настоящем изобретении, или ее регуляторную область. Предпочтительно такая молекула ДНК содержит транслоцируемый элемент, обладающий способностью к транспозиции в растительной клетке, такой, например, как, Лс/Эв, Ет^рт, мутатор. В другом варианте молекула ДНК содержит пограничную последовательность Т-ДНК из ТДНК Α§^оЬасΐе^^ит. Молекула ДНК может содержать также сайт, распознаваемый рекомбиназой или интегразой, которую можно применять для удаления части молекулы ДНК из хромосомы растительной клетки. Вариант этого метода описан в примере 2. Под объем изобретения подпадают также методы инсерционного мутагеназа, в которых используют Т-ДНК, транспозоны, олигонуклеотиды, или другие методы, известные специалистам в данной области. Методы, основанные на применении Т-ДНК и транспозона для инсерционного мутагенеза, описаны у Ашк1ег и др., МеШобв Мо1. Βϊθ1. 82, 1989, с. 129-136 и МагНепввеп, ΡNΑδ 95, 1998, с. 2021-2026, публикации полностью включены в настоящее описание в качестве ссылки.

Делеционный мутагенез

Согласно еще одному варианту осуществления изобретения мутацию молекулы нуклеиновой кислоты, предлагаемой в настоящем изобретении, создают в геномной копии последовательности в клетке или растении путем делеции части нуклеотидной последовательности или регуляторной последовательности. Методы делеционного мутагенеза известным специалистам в данной области (см., например, М1ао и др., Р1ап1 I. 7, 1995, с.359).

Согласно еще одному варианту осуществления изобретения указанную делецию создают произвольно в большой популяции растений с помощью химического мутагенеза или облучения и растение, имеющее делецию в гене, предлагаемом в настоящем изобретении, выделяют путем стратегий прямой генетики и обратной генетики. Известно, что облучение быстрыми нейтронами или гамма-лучами вызывает делеционные мутации у растений (БПуегв1опе и др., Р1ап1 Се11, 10, 1998, с. 155-169; Β^иддетапп и др., Р1ап1 I., 10, 1996, с. 755-760; Кебе1 и Копс/ в МеШобв ш Α^аЬ^борβ^β КевеагсН, изд-во Аог1б δс^епι^Γ^с Ргевв, 1992, с. 16-82). Делеционные мутации в гене, предлагаемом в настоящем изобретении, можно восстанавливать на основе стратегии обратной генетики с помощью ПЦР с использованием объединенных групп геномных ДНК, как описано для С. е1едапв (Ыи и др., Сепоте КевеагсН, 9, 1999, с. 859-867). Стратегия прямой генетики включает мутагенез линии, для которой характерно пост-транскрипционное молчание генов (ΡΤСδ), с последующим скринингом М2-потомства по признаку отсутствия ΡΤСδ. Следует ожидать, что среди этих мутантов у некоторых должен быть нарушен ген, предлагаемый в настоящем изобретении. Это можно оценивать с помощью Саузерн-блоттинга или ПЦР гена, предлагаемого в настоящем изобретении, с геномной ДНК этих мутантов.

Сверхэкспрессия в растительной клетке

Согласно еще одному предпочтительному варианту осуществления изобретения осуществляют сверэкспрессию в растительной клетке нуклеотидной последовательности, предлагаемой в настоящем изобретении, которая кодирует ген В, прежде всего ген ΒνΡКК7. Примеры молекул нуклеиновых кислот и экспрессионных кассет для сверхэкспрессии молекулы нуклеиновой кислоты, предлагаемой в настоящем изобретении, представлены выше. Под объем настоящего изобретения подпадают также методы сверхкспрессии молекул нуклеиновых кислот, известные в данной области.

Согласно еще одному предпочтительному варианту осуществления изобретения экспрессию нуклеотидной последовательности, предлагаемой в настоящем изобретении, изменяют в каждой клетке растения. Для этой цели можно применять, например, гомологичную рекомбинацию или инсерцию в хромосому. Для этой цели можно применять также, например, экспрессию смысловой или антисмысловой РНК, белка, содержащего домен цинковых пальцев, или рибозима под контролем промотора, обладающего способностью экспрессировать смысловую или антисмысловую РНК, белок, содержащий домен цинковых пальцев, или рибозим, в каждой клетке растения. Под объем настоящего изобретения подпадают также конститутивная экспрессия, индуцибельная, тканеспецифическая или регулируемая стадией развития экспрессия, и они приводят к конститутивному, индуцибельному, тканеспецифическому или регулируемому стадией развития изменению экспрессии нуклеотидной последовательности, предлагаемой в настоящем изобретении, в растительной клетке. Создают конструкции, предназначенные для экспрессии смысловой или антисмысловой РНК, белка, содержащего домен цинковых пальцев, или рибозима или для сверхэкспрессии нуклеотидной последовательности, предлагаемой в настоящем изобретении, и трансформируют ими растительную клетку согласно способам, предлагаемым в настоящем изобретении, например, описанным выше.

Таким образом, изобретение относится также к смысловым и антисмысловым молекулам нуклеиновых кислот, соответствующих открытым рамкам считывания, которые представлены в δΡΟ ΙΌ N0: 1 в перечне последовательностей, а также их ортологам.

Г ены и открытые рамки считывания, предлагаемые в настоящем изобретении, которые практически подобны нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, представленный в δΕ^ ГО N0: 6, включая любые соответствующие антисмысловые конструкции, можно функционально связывать с любым промотором, который обладает функциональной активностью в растении-хозяине, включая промоторные последовательности, предлагаемые в изобретении, или их мутанты.

- 31 022877

После создания полинуклеотидную конструкцию, предлагаемую в изобретении, которая содержит экспрессионную кассету или кассету для РНЮ, можно мобилизовать в приемлемый вектор для трансформации растений, такой, например, как бинарный вектор, который затем можно мобилизовать в растение сахарной свеклы с помощью одного из широко известных методов трансформации, такого, например, как опосредуемая ЛдгоЬас1егшт трансформация.

Трансгенные растения (или клетки растений или эксплантаты растений или ткани растений), которые несут и экспрессируют полинуклеотид или бзРНК, предлагаемые в изобретении, можно получать различными хорошо известными методами. После создания полинуклеотидной конструкции, предлагаемой в изобретении, которая содержит экспрессионную кассету или кассету для РНЮ, включенную в полинуклеотидную последовательность, предлагаемую в изобретении и описанную выше, можно использовать стандартные методики для интродукции полинуклеотида в представляющие интерес растение, клетку растения, эксплантат растения или ткань растения. Необязательно клетку растения, эксплантат растения или ткань растения можно регенерировать с получением трансгенного растения. Растение может представлять собой любое высшее растение, включая голосемянные, однодольные и двудольные растения. Приемлемые протоколы известны для представителей сем. Ьедиттозае (люцерна, соя, клевер и т.д.), сем. итЬеШГегае (морковь, сельдерей, пастернак), сем. Сгисйсгае (капуста, редис, рапс, брокколи и т.д.), сем. СигсигЬйасеае (дыни и огурцы), сем. Статшеае (пшеница, кукуруза, рис, ячмень, просо и т.д.), сем. 8о1аиасеае (картофель, томаты, табак, перцы и т.д.) и различных других культур (см. протоколы, описанные в НаибЬоок оГ Р1ап1 Се11 СиНите-Сгор 8рес1е под ред. ЛтпигаЮ и др., изд-во МастШаи РиЬ1. Со., №\ν Уогк, КУ., 1984; 81итато1о и др., №Циге 338, 1989, с. 274-276; Рготт и др., Вю/ТесЬио! 8, 1990, с. 383-839; и УазП и др., Вю/ТесЬио1. 8, 1990, с. 429-434). Трансформация и регенерация и однодольных, и двудольных растений в настоящее время является общепринятой, и специалист в данной области может осуществлять выбор наиболее пригодного метода трансформации. Выбор метода трансформации должен варьироваться в зависимости от типа растения, подлежащего трансформации; специалисты в данной области могут определять пригодность конкретных методов для данных типов растений. Приемлемыми методами являются, но не ограничиваясь только ими: электропорация протопластов растений; опосредуемая липосомами трансформация; опосредуемая полиэтиленгликолем (ПЭГ) трансформация; трансформация с помощью вирусов; микроинъекция растительных клеток; бомбардировка микроснарядами растительных клеток; вакуумная инфильтрация; и опосредуемая АдтоЬас1егшт 1птеГас1Спз трансформация.

Трансформацию растений можно осуществлять индивидуальной молекулой ДНК или несколькими молекулами ДНК (т.е. котрансформация), и оба эти метода пригодны для применения в сочетании с полинуклеотидным конструкциями, предлагаемыми в настоящем изобретении. Многочисленные трансформационные векторы пригодны для трансформации растений и экспрессионные кассеты, предлагаемые в настоящем изобретении, можно применять в сочетании с любым из таких векторов. Выбор вектора должен зависеть от предпочтительного метода трансформации и видов-мишеней для трансформации.

Специалистам в данной области доступны и известны различные методы интродукции конструкций в растительную клетку-хозяина. Эти методы, как правило, включают трансформацию с помощью ДНК с использованием А. ШтеГааспз или А. НЮодепез в качестве трансформирующих агентов, липосом, осаждения с помощью ПЭГ, электропорации, инъекции ДНК, непосредственного поглощения ДНК, бомбардировки микроснарядами, ускорения частиц и т.п. (см., например, ЕР 295959 и ЕР 138341) (см. ниже). Однако полинуклеотидной конструкцией, предлагаемой в изобретении, можно трансформировать не только растительные клетки. Общие сведения о растительных экспрессионных векторах и репортерных генах, и АдтоЬайетшт и опосредуемом АдгоЬас1епит переносе генов можно почерпнуть у СгиЬег и др., 1993.

Экспрессионные векторы, содержащие полинуклеотидную последовательность, предлагаемую в изобретении, можно интродуцировать в протопласты или в интактные ткани или выделенные клетки. Предпочтительно экспрессионные векторы интродуцируют в интактные ткани. Общие методы культивирования растительных тканей описаны(см., например, у Май и др., 1993; и РЫШрз и др., 1988). Предпочтительно экспрессионные векторы интродуцируют в ткани кукурузы или других растений с помощью метода прямого переноса гена, такого как опосредуемый микроснарядами перенос, инъекция ДНК, электропорация и т.п. Более предпочтительно экспрессионные векторы интродуцируют в растительные ткани, используя введение содержащих микроснаряды сред с помощью биобаллистической пушки (см., например, Тотез и др., 1995). Векторы, предлагаемые в изобретении, можно не только применять для экспрессии структурных генов, но их можно использовать также при клонировании с использованием экзона-ловушки или промотора-ловушки для выявления экспрессии различных генов в различных тканях (Юибзеу и др., 1993; АисЬ и КеШ и др.).

Наиболее предпочтительным является применение векторов бинарного типа на основе Τί- и Κίплазмид АдгоЬас1епит зрр. Выведенными из Τί-плазмид векторами трансформируют широкое разнообразие высших растений, включая однодольные и двудольные растения, такие как соя, хлопчатник, рапс, табак и рис (РассюШ и др., 1985: Вугие и др., 1987; 8икЬаршйа и др., 1987; Бога и др., 1985; Ройукиз,

1985; Рагк и др., 1985; Н1е1 и др., 1994). Применение Т-ДНК для трансформации растительных клеток

- 32 022877 широко изучено и подробно описано (ЕР 120516; Ноекета, 1985; КпаиГ и др., 1983; и Ап и др., 1985). Для интродукции в растения химерные гены, предлагаемые в изобретении, можно встраивать в бинарные векторы, как описано в примерах.

Специалистам в данной области должно быть очевидно, что выбор метода может зависеть от типа растения, например, является ли оно однодольным или двудольным, предназначенного для трансформации. Приемлемыми методами трансформации растительных клеток являются, но не ограничиваясь только ими, микроинъекция (Сгозз^ау и др., 1986), электропорация (Κί§§5 и др., 1986), опосредуемая АдгоЪайегшт трансформация (НтсНее и др., 1988), прямой перенос генов (Ρ;·ΐ5/1<ο\ν5ΐ<ί и др., 1984) и баллистическое ускорение частиц с помощью устройств, поставляемых фирмой АдгасеШз, 1пс., Мэдисон, шт. Висконсин, и фирмой ΒίοΡίΐύ. Геркулес, шт. Калифорния (см., например, ЗапГогй и др., ИЗ 4945050; и МсСаЪе и др., 1988) (см. также Юе1551пдег и др., 1988; ЗапГогй и др., 1987 (лук); СНп51ои и др., 1988 (соя); МсСаЪе и др., 1988 (соя); ЭаПа и др., 1990 (рис); К1еш и др., 1988 (кукуруза); К1еш и др., 1988 (кукуруза); К1еш и др.,1988 (кукуруза); Рготт и др., 1990 (кукуруза); и Оогйоп-Катт и др., 1990 (кукуруза); ЗνаЪ и др., 1990 (хлоропласты табака); Ко/1е1 и др., 1993 (кукуруза); З1йтатоЮ и др., 1989 (рис); СНг15Юи и др., 1991 (рис); ЕР 0332581 (ежа сборная и другие представители сем. Ροο^άеае); Уа5Й и др., 1993 (пшеница); \Уее1<5 и др., 1993 (пшеница)). В одном из вариантов осуществления изобретения применяют метод трансформации протопласта кукурузы (ЕР 0292435, ИЗ 5350689).

Основной целью настоящего изобретения является трансформация сахарной свеклы. Экспериментальные процедуры для трансформации сахарной свеклы хорошо известны специалистам в данной области и описаны, например, у Сйапд и др., 2002, в этом исследовании применяли меристему сахарной свеклы в качестве материала эксплантата.

После того как трансформированные растения отобраны и выращены до созревания, идентифицируют растения, имеющие представляющий интерес признак. Признак может представлять собой любой признак, описанный выше. Кроме того, для подтверждения того, что представляющий интерес признак является результатом экспрессии интродуцированного представляющего интерес полинуклеотида под контролем регуляторного нуклеотида, предлагаемого в изобретении, уровни экспрессии или активности представляющего интерес полипептида или полинуклеотида можно определять с помощью анализа экспрессии мРНК с использованием Нозерн-блоттинга, ОТ-ПЦР или микромассивов, или экспрессии белка с использованием иммуноблотинга или Вестерн-блоттинга или анализов сдвига в гелях.

Таким образом, изобретение относится к растительным клеткам и тканям, к растениям, полученным из таких клеток и тканей соответственно, к растительному материалу, к потомству и семенам таких растений и к сельскохозяйственным продуктам, включая продукты переработки растений с улучшенными свойствами, которые можно получать, например, с помощью одного из методов трансформации, описанных ниже.

После того как экспрессионной кассетой, предлагаемой в настоящем изобретении и описанной выше, которая содержит полинуклеотидную последовательность, предлагаемую в изобретении, в сочетании с представляющим интерес полинуклеотидом, трансформированы виды растений, ее можно размножать в этих видах или переносить в другие сорта этих же видов, прежде всего включая предназначенные для продажи сорта, с помощью традиционных методов селекции. Предпочтительными растениями согласно изобретению являются голосемянные, однодольные и двудольные растения, прежде всего агрономически важные культурные растения, такие как рис, пшеница, ячмень, рожь, рапс, кукуруза, картофель, морковь, сладкий картофель, сахарная свекла, фасоль, горох, цикорий, латук-салат, капуста, цветная капуста, брокколи, турнепс, редис, шпинат, спаржа, лук, чесок, баклажан, перец, сельдерей, тыква крупноплодная, тыква обыкновенная, цуккини, огурец, яблоня, груша, айва, дыня, слива, вишня, персик, нектарин, абрикос, земляника, виноград, малина, ежевика, ананас, авокадо, папайя, манго, банан, соя, табак, томаты, сорго и сахарный тростник.

Описанные выше генетически свойства, сконструированные в трансгенных растениях, передаются при половом размножении или вегетативном росте и в результате их можно поддерживать и размножать в потомстве растений. Как правило, для поддержания и размножения используют известные сельскохозяйственные методы, разработанные для высокоспецифических целей, такие как обработка почвы, посев или сбор урожая. Можно применять также специализированные процессы, такие как гидропоника или технология возделывания в теплицах. Дающие преимущество генетические свойства трансгенных растений, предлагаемых в изобретении, можно применять также при селекции растений с целью создания растений с улучшенными характеристиками, такими как устойчивость к вредителям, гербицидам или стрессу, повышенная питательная ценность, повышенная урожайность или улучшенная структура, обусловливающая защиту от полегания или осыпания. Для осуществления различных стадий селекции требуется хорошо известное вмешательство человека, включая, например, отбор линий, подлежащих скрещиванию, прямое опыление родительских линий или отбор соответствующих потомков растений. В зависимости от требуемых характеристик выбирают различные пути селекции. Соответствующие методы хорошо известны в данной области и включают, но не ограничиваясь только ими, гибридизацию, инбридинг, обратное скрещивание, многолинейное скрещивание, смешение различных линий, неспецифическую гибридизацию, анеопладию. Методы гибридизации включают также стерилизацию растений с по- 33 022877 лучением растений с мужской или женской стерильностью с помощью механических, химических или биохимических средств. Перекрестное опыление растения с мужской стерильностью пыльцой другой линии гарантирует, что геном обладающего мужской стерильность, но женской фертильностью растения, будет в равной степени включать свойства обеих родительских линий. Таким образом, трансгенные растения, предлагаемые в изобретении, можно применять для отбора улучшенных линий растений, что позволяет, например, повышать эффективность общепринятых методов, таких как обработка гербицидами или пестицидами, или обходиться без указанных методов в результате модифицированных генетических особенностей растений. В другом варианте можно получать новые культуры с повышенной устойчивостью к стрессу, благодаря их оптимизированному генетическому «аппарату», что позволяет получать продукт более высокого качества, чем продукты, которые не обладают способностью противостоять аналогичным вредным условиям, воздействующим их развитие.

Одним из вариантов осуществления изобретения является полинуклеотидная последовательность, представленная в 8Е0 ГО N0: 5, 8Е0 ГО N0: 51 и 8Е0 ГО N0: 52, которая кодирует белок, функционально эквивалентный гену В.

Примеры

В приведенных ниже примерах проиллюстрированы варианты осуществления изобретения. В свете представленного описания и известного уровня техники специалистам в данной области должно быть очевидно, что приведенные ниже примеры даны только с целью иллюстрации и что многочленные изменения, модификации и вариации можно применять без отклонения от сущности и объема изобретения, представленного в формуле изобретения.

Пример 1. Характеризация гена РКК7 сахарной свеклы

Пример 1.1. Характеризация предполагаемого гомолога РКК7 из сахарной свеклы

На основе подхода, включающего применение генов-кандидатов, для идентификации и характеризации предполагаемых генов, контролирующих стрелкование у сахарной свеклы, была идентифицирована Е8Т-последовательность, имеющая регистрационный номер СУ301305, в качестве предполагаемого гомолога гена РКК7 свеклы с помощью оценки гомологии ВЬА8Т-методом. В 8Е0 ГО N0: 1 представлена нуклеотидная последовательность Е8Т СУ301305. Частью соответствующей аминокислотной последовательности является мотив домена-приемника регулятора псевдоответа (РКК, р£ат00072) или домена-приемника сигнала (КЕС, сй00156) (фиг. 1), отличительного признака семейства генов РКК, который, вероятно, имеет решающее значение при некоторых связанных с циркадными ритмами событиях (№катюЫ и др., 2005). На фиг. 2 представлен сравнительный анализ аминокислотной последовательности СУ301305 и РКК7, ее ближайшего гомолога из АгаЫйор818, который описан как компонент чувствительной к температуре циркадной системе (внутренних часов организма) (ХакатюЫ и др., 2007; 8а1оте и МсС1ии§, 2005). Известно, что внутренние часы организма контролируют ряд связанных с развитием процессов у растений, включая контроль времени цветения (т.е. стрелкование) (Ιιηαίζιιιηί и Кау, 2006; Ζΐκιιι и др., 2007).

На основе вышеуказанных данных была выведена предполагаемая генная структура части РКК7фрагмента с помощью сравнительного анализа геномной последовательности и мРНК гена ЛгаЫйор818 РКК7 (АТ5002810 и ХМ120359 соответственно) и Е8Т (СУ301305) ΒνΡКК7 сахарной свеклы, который подтвердил присутствие нескольких предполагаемых интронных областей (фиг. 3). Праймеры РКК7-Р и -К (8Е0 ГО N0: 2 и 3), фланкирующие предполагаемую 3-ю интронную область, обеспечивали получение продукта амплификации размером примерно 0,5 т.п.н. при применении геномной ДНК свеклы в качестве матрицы. Для амплификации с помощью ПЦР применяли следующие условия: начальная денатурация при 95°С в течение 5 мин, затем 35 циклов амплификации по 30 с при 95°С, 30 с при 60°С и 30 с при 72°С и затем 5 мин при 72°С. ПЦР-эксперименты осуществляли в устройстве ОеиеАМР РСК 8у81ет 9600 фирмы Аррйей Вю8У81ет8 1пс., используя меченную платиной ДНК-полимеразу Тад и соответствующую реакционную смесь фирмы 1пи£го§еп Согрогайоп, согласно рекомендациям поставщика. Анализ последовательности ПЦР-продукта позволил реконструировать геномную последовательность вокруг интрона 3 гена ΒνΡКК7 и подтвердил присутствие фрагмента длиной 296 пар оснований (8Е0 ГО N0: 4).

Пример 1.2. Картирование гена ΒνΡКК7

С помощью описанных выше праймеров РКК7-Р и РКК7-К геномный фрагмент гена ΒνΡКК7 амплифицировали и секвенировали с использованием панели родительских линий сахарной свеклы, включающей 15 двулетних и 1 однолетнюю линию. Все двулетние линии оказались мономорфными по ΒνΡКК7, поскольку обнаружено только два различных гаплотипа: один аллель, ассоциированный с двулетним типом развития, и один аллель, ассоциированный с однолетним типом развития (табл. 1). Для картирования ΒνΡКК7 в популяции, расщепленной по признаку однолетности, создавали анализ, обеспечивающий выявление §№ в положении № 160 (8Е0 ГО N0: 4), используя технологию ЕпйРоиН ТадМаи®. В табл. 2 представлены нуклеотидные последовательности праймеров и зондов, созданных для анализа РКК7(Т1) с использованием ТадМаи®, направленного на выявление 8ХР в положении № 160; в реакции использовали также универсальную мастер-смесь для ПЦР (ТадМаи® ИиКег8а1 РСК Ма81ег М1х, № АтрЕга8е® υNΟ) (2х) фирмы Аррйей Вю8У81ет8 1пс. согласно рекомендациям производителя. ПЦР- 34 022877 амплификацию осуществляли с использованием следующих условий: 95°С в течение 10 мин, затем 40 циклов при 95°С в течение 15 с и 60°С в течение 1 мин, используя детекторное устройство для секвенирования последовательности типа ΑΒΙ РК18М 7700. Оценку с использованием технологии ЕпбРош! осуществляли с помощью программы 8едиепсе ОеЮсЦоп 8ук1ет 2.0.

С помощью описанного выше анализа РКК7(Т1) ген ВуРКК7 был картирован в Р2-популяции, включающей 198 растений, которые получали скрещиванием однолетней линии и двулетней линии, полиморфной по 8®Р в положении № 160. ВуРКК7 картирован на хромосоме II на расстоянии примерно 1 сМ по ходу транскрипции относительно маркера СН31 (фиг. 4), в области, которая, как известно, содержит ген В, обусловливающий независимое от яровизации цветение (МоЪгшд и др., 2004; ОааГаг и др., 2005). Результаты РКК7(Т1)-анализа продемонстрировали точное соответствие между предсказанным генотипом гена В и генотипом гена ВуРКК7. Генотип гена В был предсказан на основе фенотипической оценки Р3-популяций, полученных из Р2-растений, характеризующихся независимым от яровизации цветением. В табл. 3 дано графическое представление точной карты области гена В для 9 индивидуальных растений-потомков, включающих случаи ближайшей рекомбинации. Сочетание его положения на карте и биологической функции, связанной с чувствительным к температуре циркадным ритмом (8а1оте и МсС1ипд, 2005), с большой долей вероятности делает ВуРКК7 наиболее перспективным кандидатом на роль В-гена.

Пример 1.3. Выявление полноразмерной геномной последовательности ВуРКК7

Используя праймеры РКК7-Р и РКК7-К, подвергали скринингу ВАС-библиотеку сахарной свеклы с помощью ПЦР. Библиотеку создавали на основе двулетнего коммерческого культивара Н20 с тем расчетом, чтобы включала 6 геномных эквивалентов со средним размером вставки 120 т.п.н. (МсОгаШ и др., 2004). Пулы ДНК для этой библиотеки получали от фирмы АтрПсоп Ехргекк, Пулман, шт. Вашингтон. Для скрининга пулов ДНК применяли следующие условия ПЦР: начальная денатурация при 95°С в течение 5 мин, затем 35 циклов амплификации по 30 с при 95°С, 30 с при 60°С и 30 с при 72°С и затем в течение 5 мин при 72°С. ПЦР-эксперименты осуществляли в устройстве СепеАМР РСК 8ук1ет 9600 фирмы АррБеб ВюкукЮтк 1пс., используя меченную платиной ДНК-полимеразу Тад и соответствующую реакционную смесь фирмы ЫуЦгодеп Согрогайоп согласно рекомендациям поставщика. Последующий скрининг пулов ДНК в отношении присутствия ВуРКК7-фрагмента, проведенный согласно инструкциям поставщика, позволил осуществить положительную идентификацию клона ВАС 8ВА079-Б24.

Для получения полноразмерной последовательности гена клон ВАС 8ВА079-Б24 передавали на фирму МГСС Вю1есП АС, Германия, для анализа последовательности с помощью технологии секвенирования, разработанной фирмой 454 ЫГе 8Ыепсек. При необходимости бреши между полученными наборами последовательных фрагментов заполняли путем общепринятого секвенирования по Сангеру с получением моногенной последовательности гена ВуРКК7 (8ЕЦ ГО N0: 5). На основе сравнительного анализа геномной последовательности с Е8Т С'У30Е305 на основе гомологии последовательностей с геном РКК7 из АтаЫборык была предсказана предполагаемая структура гена ВуРКК7 свеклы, включающая интроны и экзоны, которая представлена на фиг. 5. Согласно предсказанной структуре геномная последовательность включает полный ген ВуРКК7, при этом последовательность размером 3,6 т.п.н. простирается против хода транскрипции от стартового кодона АТС, и последовательность размером 2,2 т.п.н. по ходу транскрипции относительно кодирующей области. Соответствующая аминокислотная последовательность ВуРКК7 представлена в 8ЕЦ ГО N0: 6. Сравнительный анализ аминокислотной последовательности ВуРКК7 и всех представителей семейства РКК-гена из АтаЫборык, включая ТОС1 (РКК1), РКК3, РКК5, РКК7 и РКК9, позволил проиллюстрировать выраженную консервативность мотива доменаприемника регулятора псевдоответа (РКК) (рГат00072) вблизи ИН₂-конца и ССТ-мотива (рГат06203) на СООН-конце (фиг. 6). Помимо семейства РКК-гена из АтаЫборык ВуРКК7 характеризуется также выраженной гомологией с РКК7 зерновых культур, что проиллюстрировано с помощью филогенетического дерева, представленного на фиг. 7. Неожиданным является то, что гомолог РКК7 в зерновых культурах, более известный как Ррб, рассматривается в качестве основного определяющего фактора фотопериодической реакции (Тигпег и др., 2005; Веа1ек и др., 2007), а не определяющего яровизационный ответ фактора, как это предполагается в настоящем описании для сахарной свеклы.

Пример 1.4. Анализ генной экспрессии ВуРКК7

Для анализа генной экспрессии проростки двулетних яровизированных растений выращивали в камерах с контролируемыми условиями окружающей среды при постоянной температуре 18°С и фотопериоде день/ночь 16/8 ч. Каждые 2 ч в течение 24 ч отбирали образцы листьев и выделяли общую РНК с помощью набора КПАдиеои^ЧРСК, поступающего в продажу от фирмы АтЫоп, следуя в целом инструкциям поставщика. При осуществлении стадий выделения РНК добавляли вспомогательное средство для выделения растительной РНК (Р1ап1 КЛА 1ко1айоп А1б) (фирма АтЫоп) с целью удаления загрязнителей, таких как полисахариды и полифенолы, и образцы РНК обрабатывали ДКАзой I (фирма АтЫоп) для удаления остатков ДНК. Образцы РНК превращали в кДНК с помощью набора РЕТР0кспр1® (фирма АтЫоп), начиная процесс с 1 мкг общей РНК в качестве матрицы. Уровень экспрессии гена ВуРКК7 оценивали с использованием количественной ПЦР (кПЦР) с помощью мастер-смеси для ПЦР Ро\\ег

- 35 022877 δΥΒΕ® Огееп Ρί’Κ МаЧег Μίχ (фирма Аррйей В1о8у81ет8 1пс.) на устройстве для секвенирования последовательностей типа АВ1 ΡΕΙδΜ 7700. При осуществлении ПЦР использовали следующие параметры: начальная денатурация при 95°С в течение 10 мин, затем 40 циклов амплификации по 15 с при 95°С и 1 мин при 60°С. Применяли прямой и обратный праймеры для ΒνΡΕΕ7, имеющие следующие нуклеотидные последовательности: 5'-ТТООАООАООт0тСАСАОТТСТАО-3' (8ЕЦ ГО N0: 49) и 5'ТОТСАТТОТССОАСТСТТСАОС-3' (δΗΟ ГО N0: 50) соответственно. Гены бета-тубулина (ВуВТИ) и изоцитратдегидрогеназы (Ву1СИН) использовали в качестве генов, с которыми проводят сравнение (референс-генов) для стандартизации экспрессии ΒνΡΕΕ7. Праймерные последовательности, созданные для этих двух референс-генов, представляли собой 5'-ТТОТТОААААТОСАОАСОАОТОТ-3' (8ЕЦ ГО N0: 13) и 5'-ААОАТСОССАААОСТТООТО-3' для ВуВТИ (А№063029) (δΗΟ ГО N0: 14) и 5'САСАССАОАТОААООССОТ-3' (δΗΟ ГО N0: 15) и 5'-СССТОААОАССОТОССАТ-3' (δΗΟ ГО N0: 16) для Ву1СИН (АР173666). В каждый момент времени для оценки использовали по три биологических образца и каждый кПЦР-эксперимент проводили с дублированием. Данные анализировали с помощью пакета программ §едиепсе Ие!есйоп §у81ет 2.0 (фирма Аррйей Вю^уЧепъ 1пс.) и пакета программ ОепЕх (программы для многомерных анализов (МиИГО Апа1у8е§)).

Как проиллюстрировано на фиг. 8, профиль экспрессии гена ΒνΡΕΕ7 характеризуется циркадным колебанием с пиком экспрессии через 7 ч после рассвета. Этот эксперимент подтвердил ритмичную и циркадную экспрессию ΒνΡΕΚ7, что описано для большинства ассоциированных с внутренними часами генами, идентифицированными к настоящему времени (МсС1ип§, 2006).

Пример 1.5. Аллельная вариабельность и связь с требованием к яровизации

С помощью нескольких пар праймеров (табл. 4) амплифицировали полную кодирующую область гена ΒνΡΕΕ7 и секвенировали с использованием панели, включающей 16 двулетних и 14 однолетних растений. Для ПЦР-амплификации использовали следующие условия: начальная денатурация при 95°С в течение 5 мин, затем 35 циклов амплификации по 30 с при 95°С, 30 с при 60°С и 30 с при 72°С и затем 5 мин при 72°С. ПЦР-эксперименты осуществляли с помощью устройства ОеηеΛΜΡ ГСР 8у8!ет 9600 фирмы Аррйей Вю^уЧепъ 1пс., используя меченную платиной ДНК-полимеразу Тад и соответствующую реакционную смесь фирмы 1пуйгодеп Согрогайоп согласно рекомендациям поставщика. Графическое представление обнаруженных генотипов включало 7 различных аллелей; 6 аллелей, ассоциированных с однолетним типом развития, и 1 - с двулетним типом развития (табл. 5). Ассоциированный с двулетним типом развития аллель оказался уникальным для двулетних линий и никогда не встречался в однолетних линиях, что позволило сделать предположение о наличии выраженной корреляции между аллельными вариациями, обнаруженными для ΒνΡΕΕ7, и однолетним или двулетним фенотипом растения. Эти данные подтверждают причинную взаимосвязь между ΒνΡΕΕ7 и В-локусом для независимого от яровизации цветения у сахарной свеклы. Из 19 δΜΡ, характерных для кодирующей области, 7 приводили к аминокислотным заменам в предсказанной белковой последовательности, позволяющим различать ассоциированные с однолетним и ассоциированные с двулетним типом развития аллели. Согласно гаплотипам, проиллюстрированным в табл. 5, любой из 8ИБ в положениях № 3827, 3954, 5284, 5714, 10954, 11220, 11391, 12053, 12127 и 12837 можно применять для того, что различать все ассоциированные с однолетним типом развития аллели от ассоциированных с двулетним типом развития аллеля, с помощью молекулярных маркеров, мишенью которых является один или несколько из указанных δΜΡ.

Помимо кодирующей области гена ΡΕΕ7, в промоторной области также имеет место полиморфизм между однолетними и двулетними линиями. С использованием праймеров Р3808 (ЪЕО ГО N0: 29) и Е3809 (ЪЕО ГО N0: 30) получали продукт амплификации размером 0,6 т.п.н. при применении геномной ДНК из двулетних линий в качестве матрицы, но при этом не происходила амплификация однолетних линий. Для ПЦР-амплификации использовали следующие условия: начальная денатурация при 95°С в течение 5 мин, затем 35 циклов амплификации по 30 с при 95°С, 30 с при 60°С и 30 с при 72°С и затем 5 мин при 72°С. ПЦР-эксперименты осуществляли с помощью устройства ОепеАМГ ГСР δу8ΐет 9600 фирмы Аррйей Вю^уЧепъ 1пс., используя меченную платиной ДНК-полимеразу Тад и соответствующую реакционную смесь фирмы Игуйгодеп Согрогайоп согласно рекомендациям поставщика. Таким образом, указанная пара праймеров обеспечивает специфическую амплификацию ассоциированных с двулетним типом развития аллелей, но не ассоциированных с однолетним типом развития аллелей. Аналогичные результаты получали при использовании пары Р3855 (ЪЕО ГО N0: 35) и Е3809 (ЪЕО ГО N0: 30) или Р3855 (ЪЕО ГО N0: 35) и Е3856 (ЪЕО ГО N0: 36) (табл. 4), при применении которой получали продукты амплификации размером 1,0 и 0,8 т.п.н. при использовании двулетних линий, но при этом не происходила амплификация однолетних линий. Специалисту в данной области должно быть известно, что выбор обеспечивающих дискриминацию полиморфизмов не ограничен перечисленными выше полиморфизмами, но их можно идентифицировать также в других частях некодирующих или фланкирующих областей, таких как терминатор и интроны.

Таблица 1. Полиморфизмы, обнаруженные среди 1 однолетней и 15 двулетних линий сахарной свеклы во фрагменте гена ΒνΡΡΡ7, охватывающем интрон 3

Положение в δΡΟ ΙΌ N0: 4

- 36 022877

ΙΙ>ΝΟ: 4. Я7 160

Н.16

С однолетни

А двулетни

В верхнем ряду показано положение нуклеотидов в геномной последовательности фрагмента гена ΒνΡΚΚ7 (8ЕЦ ΙΌ N0: 5). В остальных рядах представлены 2 гаплотипа, обнаруженные в панели, включающей 16 линий.

Таблица 2. Нуклеотидные последовательности праймеров и зондов, соответствующие анализу ТацМап ΡΚΚ7(Γ1) для генотипирования 8Ж № 160

Обозначения предшественников	Последовательность {5’ —► 3’)
РКК7(Т1)-Р	САОСТОТСАСАОТОТААОТСТСТ
РКК7(Т1)-К	АААОАСТОСТАСАССААССАСТААО
РЕК7(Т1)-РАМ	РАМ-СТОАТСААААОСТО-МОВ-ΝΡΟ
РКК7(Т1)-У1С	νΐΟ-ΟΤΟΑΤΟΟΑΑΑΟΟΤΟ-ΜΟΒ-ΝΡΟ

Таблица 3. Генотипы для некоторых маркеров, включающие ΡΚΚ7(Т1)-картирование вокруг гена В в 9 Р2-растениях, характерные для случаев рекомбинации на любой стороне гена В. ΡΚΚ7(ΊΊ), а также маркер 9_27(Т2) характеризуются точным соответствием с предсказанным генотипом гена В. Генотип гена В оценивают по фенотипу Р3-популяции, полученной из индивидуальных Р2-растений.

Е8М4:193

Е05МНВ24 ΕΙ5Μ4Ί62 Е15М4:159 СЛ31 9_27 РЕК7 ген В

С301

МР0176

Е13М4-196

Ε09Μ08-Π3

Ё09М08-124

Е09М08:03

Е13М04:36

М80278

Е09М08-588

Е8М4:174

Е13М04:50

Е16М1б:19

Е16М16:17

Е16М16:20

-5 В •3 В

-2 В •2 В

-2 В

О В

О В н

н н

Н

К

Н

А Н

Н В н в н в н в н в н в н в н в н в н в н в н в н в н в н в н в н в

Н А

Н А Н А

Н А

А Н

А Н н н

В А

А Н А Н Н Н н н н н н н и н н н н н н н н н н н н н н н н н н н н н н н н н н в н в н в

Таблица 4. Нуклеотидные последовательности ПЦР-праймеров, применяемых для амплификации, и последовательность всех экзонов ΒνΡΚΚ7 и части интронных и промоторных или терминирующих областей

- 37 022877

Наименование предшественника	Последовательность (5’—* 3’)	Локализиция	ЗЕО Ιϋ ΝΟ
Р3766	ТТТОАТОСТТТТТТСАООССА	интрон 1	3Ε0ΙΟΝΟ:17
К3767	ТТТТСТТАТАООСТТСАССАОАААОТС	экзон 3	8Е(} Ю N0:18
Р3354	АТОТСАТСТСАТСАТТССАТОСС	экзон 3	ЗЕО 10 N0:19
К3355	ТСАССССТСТТССТТССТАТС	экзон 4	8Е<5 10 N0:20
Р3768	ТТТССТСАТТСТТТТТТТАОТСТАОТООТ	интрон 3/экзон 4	8Е0 ГО N0:21
К3769	ААТАТОТОТОАОААААТОСТСОСА	интрон 4	5Е(? ГО N0:22
Р3782	ТСУСААТОООАААООАТТТО	экзон 6	ЗЕО Ю N0:23
К3783	ААТТТСОСОТООТОСАТСАО	экзон 6	5Е<} ГО N0:24
Р3784	ОСССССААССАСАОТСТАСА	экзон 5	ЗЕ<5 ГО N0:25
К3785	ООТССАТТТАОССОТОААТСТС	экзон 6	8ΕΟΙϋΝΟ:26
Р3806	ТТТТТССАТАССОААООСОТ	промотор	8Е0 ГО N0:27
КЗ 807	САТТТОТТОААОТАОСТОАТААООАСАА	интрон 1	ЗЕО ГО N0:28
Р3808	ТТАСАТССТСТСССТТАСАСТСТТСТОТ	промотор	ЗЕ<5 ГО N0:29
К3809	ТСАССААТТСТТТАТАТСАТАТСАТСАСА	промотор	ЗЕ<3 ГО N0:30
Р3810	ОАОААААОООТТТТАОАТООТААОТТТТ	промотор	ЗЕО ГО N0:31
К3811	ААСТТТААСССАТСАТОТСТТТТСААС	промотор	8Е0 ГО N0:32
Р3853	ААСТООАСАСТТООАТТТСААСТСА	промотор	8Е<5 ГО N0:33
К3854	ТТАТООСААААААСТСТСОСТАТТСТ	промотор	ЗЕ<5 ГО N0:34
Р3855	ОААССССАТТТТАОТАТТОАСАТТТСТ	промотор	ЗЕО ГО N0:35
К3856	ААТТАОАТОААТАААААОАСАААТСАООАА	промотор	5Е(? ГО N0:36
Р3857	ТССАТТТОАОСАСТАООТАТОАТОАС	интрон 4	ЗЕО 10 N0:37
К3858	СТТСОАССАТСАТТТТССТОСТ	экзон 6	ЗЕО ГО N0:38
Р3859	ООААААССААТАТТСАСАСТТАОАССТ	экзон 6	ЗЕО 10 N0:39
К3860	ТСТТОАОСТОСТОАТССАСОТ	экзон 7	ЗЕО ГО N0:40
Р3861	СТОСАТСТООТААОССТОСТС	экзон 7	ЗЕО ГО N0:41
К3862	ССТАССТСОСССАССААТ	экзон 8	ЗЕО ГО N0:42
Р3863	ААТТТССССАТТТСТТОСТТСТАТ	интрон 7	ЗЕО ГО N0:43
К3864	ААТСТОАССССТАААСОССТ	терминатор	ЗЕО ГО N0:44
Р3865	ООТОТОАТОСАТАТААТСТТОТТТСС	терминатор	ЗЕО ГО N0:45
К3866	АОСААОССТОСОСТОО '	терминатор	ЗЕО ГО N0:46

Таблица 5. Гаплотипы и полиморфизмы, обнаруженные в кодирующей области ΒνΡΗΚ7

В табл. 5 представлены 19 полиморфизмов, идентифицированных в кодирующих областях при осуществлении сравнения ассоциированных с однолетним и двулетним типом развития аллелей. Полиморфизмы в домене-приемнике псевдоответа и ССТ-домене обозначены жирными линиями. Аминокислотные замещения обозначены маленькими звездочками. Аминокислотные замены, специфические для ассоциированного с двулетним типом развития аллеля, обозначены крупными звездочками. Положение 8ΝΡ показаны в верхнем ряду и пронумерованы в соответствии с 8Ер Ιϋ N0: 5.

Пример 2. Валидация трансгенов ΒνΡΗΗ7 с помощью изучения комплементарности

Однолетний фенотип растения, обусловленный геном В, проявляется в виде одиночного доминантного признака; таким образом, требование к яровизации у двулетних растений является рецессивным. Таким образом, можно предсказать, что трансформация ассоциированного с однолетним типом развития аллеля ΒνΡΗΗ7 в характерный для двулетнего типа развития генотип должна придавать характерный для однолетнего типа развития признак цветения характерному для двулетнего типа развития генотипуакцептору. Для подтверждения этой гипотезы кодирующей последовательностью ассоциированного с однолетним типом развития аллеля ΒνΡΚΚ7 под контролем ассоциированного с однолетним типом развития промотора и фрагмента терминатора трансформируют характерный для двулетнего типа развития генотип 0018. Экспериментальная процедура трансформации сахарной свеклы в целом соответствовала описанной у Сйапд и др., 2002, в которой использовали меристему сахарной свеклы в качестве эксплантата и ген фосфоманнозоизомеразы (ΡΜΙ) в качестве селектируемого маркера. Плазмидная карта бинарного вектора, несущего генные кассеты как для гена селектируемого маркера ΡΜΙ, так и для ассоциированного с однолетним типом развития аллеля ΒνΡΚΚ.7, показана на фиг. 9. Трансгенные побеги отбирали по признаку наличия активности ΡΜΙ (1оегзЬо и др., 1998), затем укореняли, высаживали в почву и переносили в теплицу. В качестве отрицательного контроля использовали нетрансгенные побеги, которые подвергали такой же процедуре регенерации т νΐίτο, но без заражения АдгоЬас1епит и селекции с использованием маннозы. Растения выращивали в вегетационных камерах при постоянной температуре 18°С и фотопериоде 17 ч света и 7 ч темноты. Предполагалось, что в этих условиях ни у одного из нетрасгенных контролей не должно проявляться каких-либо признаков стрелкования в течение периода наблюдения, в то время как однолетние контрольные растения в норме должны выбрасывать стрелку через 8 недель. В отличие от нетрансгенных двулетних контрольных растений у большинства трансгенов стрелкование должно начинаться через 4-10 недель, и они должны обладать основным признаком, харак- 38 022877 терным для однолетних растений, несмотря на соответствующий двулетним растениям генетический фон. Трансгенные растения, у которых обнаружено стрелкование и цветение, подвергали перекрестному опылению двулетней поддерживающей линией с получением потомства. У растений-потомков оценивали активность ΡΜΙ и затем их оценивали в отношении стрелкования и цветения без яровизации. Большая часть потомков должна характеризоваться коэффициентом сергрегации 1:1 и прямой корреляцией между ΡΜΙ-активностью и признаком однолетности. Эти данные должны недвусмысленно подтверждать причинную связь между ΒνΡΚΚ7 и независимым от яровизации цветением у сахарной свеклы.

Пример 3. Супрессия трансгенов ΒνΡΚΚ7 обусловливает устойчивость к стрелкованию

Поскольку ΒνΡΚΚ7 играет решающую роль в яровизационном ответе у сахарной свеклы, то ΒνΡΚΚ7 является очевидным кандидатом для создания устойчивости к стрелкованию путем подавления яровизационного ответа. Для этой цели кДНК-фрагмент ΒνΡΚΚ.7 размером 0,6 т.п.н. (ЗЕО ГО N0: 1) помещали в кассету для ΡΗΚί под контроль конститутивного промотора ИЫ3 АгаЫборк1к (№гпк и др., 1993). Инвертированный повтор ΒνΡΚΚ7-фрагмента отделяли вторым интроном от гена ЗЮЗ1 картофеля (Ескек и др., 1986; Уапсаппеу! и др., 1990) для стабилизации ΡΗΚί-кассеты, но также для повышения эффективности процесса ΡΗΚί (\Уапд и ^а1егйоике, 2001; ЗтЪЬ и др., 2000). Плазмидная карта бинарного вектора, несущего генную кассету для ΡΗΚί, предназначенную для ΒνΡΚΚ7, и селектируемый маркерный ген ΡΜΙ, представлена на фиг. 10. ΡΗΚί-кассетой трансформировали двулетний генотип 0018 согласно методу, описанному в предыдущем примере. ΡΜΙ-позитивные побеги и нетрансгенные контрольные побеги укореняли и переносили в теплицу для акклиматизации в течение минимум двух недель при 18°С до их обработки для яровизации. Согласно принятым методам трансгенные растения подвергали обработке для яровизации, которая предусматривает выдерживание в течение 14 дней при постоянной температуре 6°С и 12-часовой низкой искусственной освещенности. Перед воздействием индуцирующих стрелкование условий яровизированные растения медленно акклиматизировали в течение двух недель в климатических камерах путем ступенчатого повышения температуры с 10 до 18°С. Затем растения пересаживали в более крупные горшки (2 л) и осуществляли мониторинг стрелкования, выдерживая их при постоянной температуре 18°С и фотопериоде с длинным световым днем (17 ч света/7 ч темноты). У нетрансгенных контрольных растений, как правило, стрелкование начиналось в период между 4-6 неделями после яровизация. У трансгенных растений с подавленным геном ΒνΡΚΚ7 часто наблюдалось замедление стрелкования на период от всего лишь двух недель и вплоть до более чем 2 месяцев. В некоторых случаях стрелкование вообще не происходило в условиях, существующих в теплице. Помимо замедления стрелкования и цветения трансгенные растения развивались нормально и не имели фенотипических аномалий. В целом, для растений с замедленным стрелкованием характерно большее количество листьев в момент стрелкования в результате пролонгированной вегетативной стадии.

Ссылки

1. АЬе ί., Оиап 0.-Ρ. и ЗЫтато!о Υ., А депе сотр1ех Гог аппиа1 ЬаЬЬ ίη кидаг Ьее! (Ье!а уи1дапк Ь.). ЕирЬуйса 94, 1997, с. 129-135.

2. Βа^аηу Р., Оепейс И1кеаке Ое!ес!юп апб ЭНА АтрЬйсабоп Икшд С1опеб ТЬегток!аЬ1е Пдаке. Бгос. №Ш Асаб. 8ά. ИЗА, 88, 1991, с. 189-193.

3. Β3^γ ΜΑ, СагЬоп ТЕ. и ОешШдег Г.Ь., ЕпЬапсеб еуоЬЛопагу ΡΟΚ. икшд ойдопис1еойбек \\ЬЬ шокше а! Ше 3'-!егтишк. N^1010 АШбк Кек. 19, 1991, с. 5081.

4. Βеа1ек ί., Тигпег А., ОпйгШк З., Зпаре IV. и Тайпе И.А., А Ρкеибо-Кекроηке Кеди1аШг 1к иикехргеккеб ш !Ье рЬо!орепоб ФкепкШуе Брб-Э1а ти!ап! оГ \\Ьеа! (Тййсит аекйуит Ь.). ТЬеог. Арр1. Оепе!. 115, 2007, с. 721-733.

5. Βо!к!е^η Ό., \У1и!е К.Ь., Зко1тск Μ. и Эаую Κ.ν., Сопк!гис!юп оГ депейс Ьпкаде тар ш тап икшд гекйгсйоп 1епд!Ь ро1утогрЫктк. Ат. ί. Нит. Оепе!., 32, 1980, с. 314-331.

6. Βγικι1<0 К.1 и ХУПкоп З.Ь., Βη-ι^Πι Ькр80 ргото!ег. ЕΡ 0559603, 1993.

7. СЬапд Υ.-Р., 2Ьои Н., Эипбег ЕМ., Койке 8.Ν, Ои V. апб Βои!^еаи Е., ΜеШобк Гог к!аЬ1е !гапкГогтайоп оГ р1ап!к. ν0 02/14523, 2002.

8. СЫаррайпо Е., Ьее Ό. и Оотт Ρ., Оепо1уртд кшд1е пис1еойбе ро1утогрЫктк ш Ьаг1еу Ьу !е!гарйтег АΚΜЗ-ΡСΚ. Оепоте 47, 2004, с. 414-420.

9. Соорег Ό.Ν, ЗтйЬ Β.Λ., Сооке Н.Т и др., Ап ек!ипа!е оГ итдие ΩΥΛ кециепсе Ье!его/удок1!у ш Ше Ьитап депоте. Нит. Оепе!. 69, 1985, с. 201-205.

10. Ескек Ρ., КокаЬ1 З., ЗсЬе11 ί. и \УП1тП/ег Ь., 1ко1айоп апб сЬагас!еп/а!юп оГ а ЬдЫ-шбисЫе, огдапкресйгс депе Ггот ро!а!о апб апаймк оГ Ьк ехргеккюп айег !аддтд апб йапкГег шШ !оЬассо апб ро!а!о кЬоо!к. Μθ1 Оеп Оепе! 205, 1986, с. 14-22.

11. ЕпдйкЬ II, Μικ1Κγ Е. и Βаи1сотЬе Э.С., Зирргеккюп оГ \лгик ассити1айоп ш йапкдетс р1ап!к ехЫЬйшд кйепстд оГ пис1еаг депек. ΡΕπι! Се11 8, 1996, с. 179-188.

12. Рап ΙΒ., 0ЬрЬап! А., ЗЬеп К., Кегтат ΒΌ., Оагаа Р., Оипбегкоп К.Ь., Напкеп Μ. и др., Н1дЬ1у рага11е1 ЗЖ депо1уршд. Со1б Зрппд НагЬ Зутр Оиап! ΒΠ1 68, 2003, с. 69-78.

13. Ре1кепк!еФ ί., Сопйбепсе Ьтйк оп рЬу1одетек: Ап арргоасЬ икшд Ше Ьоо!к!гар. ЕуоЬФоп 39, 1985, с. 783-791.

14. ОааГаг КМ, НоЬтапп и. и Лтд С., Βас!е^^а1 агОПаа1 сЬготокоте-бепуеб то1еси1аг тагкегк Гог

- 39 022877 еаг1у ЬоШпд ίη 8идаг Ьее!. Ткеог. Лрр1. Оепе!. 110, NитЬе^ 6, 2005, с. 1027-1037.

15. Ιιηηίζιιιηί Т. и Кау δ.Α., Ρко!оре^^об^с соп1го1 оГ Г1о\уеппд: по! оп1у Ьу сошшбепсе. Тгепб8 Ρ1ηηΙ δ^ητν 11, 2006, с. 550-557.

16. 1оег§Ьо М., ЭопаАоп I., КгеШегд К., Ρе!е^8еη δ.Ο., Вгип8!еб! 1. и 0кке18 Ρ.Τ., Лпа1у818 оГ шаппозе 8е1есйоп и8еб Гог 1гап8Гогшайоп оГ зидаг Ьее!. Мо1 Вгеебшд 4, 1998, с. 111-117.

17. Коη^есζηу А. и Ли8иЬе1 ΡΜ., Л ргосебиге Гог тарршд ЛгаЫбор818 ти!айоп8 изшд со-ботшап! есо1уре-8ресШс ΡСΚ-Ьа8еб тагкег8, Ρ1ηηΙ 1. 4, 1993, с. 403-410.

18. К\уок Ρ.Υ., Оепд р., 2акей Н., Тау1ог δ®. и №скег8оп Ό.Α., 1псгеа8тд Ше шГогтайоп соп!еп! оГ δΤδ-Ьа8еб депоте тар8: ИепШутд ро1утогрШ8т8 ш тарреб δΤδ8. Оепотк8 31, 1996, с. 123-126.

19. йапбедгеп и., Ка18ег Κ., δηιΑίΈ ί. и Нооб Ь., Л бда8е-тебкйеб депе бе!есйоп (ескпщие. δΑι^ 241 4869, 1988, с. 1077-1080.

20. ЙШ М. и Йи1у ЕЛ., НурегуапаЫе Ш1сго8а!е11йе геуеа1еб Ьу 6ι-νίΐΐΌ атрббсабоп оГ а бшис1еойбе гереа! ш бю сагб1ас ти8с1е асбп депе. Лт ί Нит Оепе! 44, 1989, с. 397-401.

21. МсС1ипд С.К, Ρ1ηηΙ сйсаб1ап гку!кт8. Ρ1ηηΙ Се11 18, 2006, с. 792-803.

22. МсОгаШ ЕМ., δΐιηχν Κ.δ., бе 1о8 ^уе8 В.О. и Аебапб ЕЕ, Соп8!гисбоп оГ а δι^-π Вее! ВАС 6ίЬгагу Ггот а НуЬпб уйк б^νе^8е ТгаЙ8. Ρ1ηηΙ Мо1 ВИ1 ^р 22, 2004, с. 23-28.

23. Мккаек δ.Ό. и Лта8то КМ., Л гоЬи8! тебюб Гог бе!есйпд 8шд1е-пис1еойбе скапде8 а8 ро1утогрШс тагкег8 Ьу ΡΕ’Κ Тке Ρ1ηηΙ Иита1 14(3), 1998, с. 381-385.

24. Мокппд δ., δηΟη-ηπί Ρ. и δскπе^бе^ К., Ми1йр1ехеб, Нпкаде дгоир-8ресШс δ№ тагкег 8е!8 Гог гар1б депейс тарршд апб йпдегрйпйпд оГ 8идаг Ьее! (Ве!а νи1да^^8 й.). Мо1еси1аг Вгеебшд, т. 14, номер 4, 2005, с. 475-488.

25. Ми1Й8 К.В., Ρа1ооηа ΡΑ, δска^Г δ., διιίΚί Κ., Нот О. и Егбск Н., δрес^Πс еηζутайс атрббсабоп оГ ^NΑ ш уйго: !ке ро1утега8е скат геасбоп. Со1б δр^^ηд НагЬог δутр Риап! Вю1 51, 1986, с. 263-273.

26. ШкатюЫ К, Кйа М., 1!о δ., δа!о Е., Уата8к|по Т. и [Πίζω-Μ Т., ΡδЕυ^Ο-ΚЕδΡΟNδЕ ΚЕОυ^ΑТ0^, ΡΚΚ9, ΡΚΚ7 апб ΡΚΚ5, !оде!кег р1ау е88епйа1 го1е8 с1о8е !о !ке сйсаб1ап с1оск оГ ЛгаЬИор818 Шакапа. Ρ1ηηΙ Се11 Ρ^8Ϊθ1., 46, 2005, с. 686-698.

27. №ГГ М.М., №ГГ ΕΌ., Скогу 1. и Ρерре^ Л.Е., бСЛΡδ, а 81тр1е (ескпкще Гог бю депейс апа1у818 оГ 8шд1е пис1еойбе ро1утогрк18Ш8: ехрейшейа1 аррксайош ш ЛгаЫбор818 Шакапа депейс8. Ρ1ηηΙ ί 14, 1998, с. 387-392.

28. №скег8оп Э.Л., Ка18ег Κ., йаррш δ., δΕ\\ΉΠ ί., Нооб й. и йапбедгеп и., Ли!ота!еб ^NΑ б1адпо8Цс8 И8шд ап ЕШЛ-Ьа8еб ойдопис1еойбе кдайоп а88ау. Ργόο. №й1. Лсаб. δά. ^Л.; 87(22), ноябрь 1990, с. 8923-8927.

29. №гп8 δ.Κ., Меуег δ.Ε. и СаШ8 ί., Тке шйоп оГ ЛгаШбор818 Шайапа ройиЬкцббп депе8 18 сошетеб ш 1осабоп апб 18 а с.1иапб1аб\'е бе!егтшап! оГ сШтепс депе ехрге88юп. Ρ1ηηΙ Мо1 Вю1 21, 1993, с. 895-906.

30. 0к!8ика Е., Ма!8иИ δ., 1кекага М., Такака8к1 Υ. и Ма!8иЬага К., Лп акетайсе арргоаск !о беохуоИдопис1еойбе8 а8 куЬ^^б^ζаί^оη ргоЬе8 Ьу Ш8егйоп оГ беохушо8ше а! атЫдиош собоп ро8Шоп8, ί. Вю1. Скет. 260(5), 1985, с. 2605-2608.

31. 0катиго ЕК. и Оо1бЬегд КВ., Κеди1айоη оГ Ρ1ηηΙ Оепе Ехрге88юп: Оепега1 Ρύπ^^. Вюскет18йу оГ Ρ1οώ8, т. 15, 1989, с. 1-82.

32. 0п!а М., δι.ιζι,ιΚί Υ., δек^уа Т. и Науа8к1 К., К)р1б апб 8еη8^йνе бе!есйоп оГ рот! ти1айоп8 апб ^NΑ ро1утогрк18т И8шд ке ро1утега8е скат геасйоп. Оепотк8 5, 1989, с. 874-879.

33. Ρеа^8оη Α.Κ., К)р1б апб δеη8Й^νе δе^иеηсе Сотрап8оп уйк ΡΑδΤΡ апб ΡΑδΤΑ. Ме!коб8 ίη Епζуто1оду 183, 1990, с. 63-98.

34. Κо88о1^η^ О.М., Сге8Й δ., 1пд1апт Л., Сайат Ρ., Кссю М.й. и δайа О., И8е оГ беохушо8шесойашшд рйтег8 ν8 бедепега!е рйтег8 Гог ро1утега8е скат геасбоп Ьа8еб оп атЫдиош 8ециепсе ОГогтабоп, Мо1. Се11 Ριό^8 8, 1994, с. 91-98.

35. ΚΦζ М.Т., Уо1ппе! О. и Ваи1сотЬе Ό.Ε., 1пШайоп апб таш!епапсе оГ ν^т8-^ηбисеб депе 8Йепсшд. Ρ1ηηΙ Се11 10, 1998, с. 937-946.

36. δа1оте ΡΑ и МсС1ипд С.К, ΡδЕυ^Ο-ΚЕδΡΟNδЕ ΚЕОυ^ΑΤΟΚ 7 апб 9 аге рагйайу гебипбап! депе8 е88епйа1 Гог !ке !етрега!иге ^е8роη8^νеηе88 оГ !ке ЛгаЬИор818 сйсаб1ап с1оск. Ρ1ηηΐ Се11 17, 2005, с. 791-803.

37. δа^!ои N. и №ί М., Тке пе1дкЬог-_)оттд тебюб: Л пе\у те!коб Гог гесоп8йисбпд рку1одепебс 1гее8. Мо1еси1аг Вю1оду апб ЕуоШйоп 4, 1987, с. 406-425.

38. δедеν Ό., ΡΟΓ Ρϋό. №. А0 90/01069, 1990.

39. δтйк КЛ., δί-дк δ.Ρ., Аапд М.В., δ!ои!^е8б^^к ΡΑ Огееп Л.О. и Аа!егкои8е Ρ^., То!а1 8Йепсшд Ьу шйоп-8рксеб какрш ΚNΑ8. №йиге 407, 2000, с. 319-320.

40. δт^!к Т/Ρ. и Аа!егтап М.8., Αбνаηсе8 ш Лррйеб МаШетайс8. 2, 1981, с. 482-489.

41. Татига К., Эиб1еу ί., №ί М. и Китаг δ., МЕОЛ4: Мо1еси1аг ЕуоШйопигу Сепебс8 Лпа1у818 (МЕОЛ) 8ойуаге νе^8^оη 4.0. Мо1еси1аг Вю1оду апб ЕуоШйоп 24, 2007, с. 1596-1599.

42. Тк1е1 Т., Ко!а Κ., Ого88е I., δΕηι N. и Огапег Л., δNΡ2СΑΡδ: а δ№ апб ШОЕЙ апа1у818 !оо1 Гог СΑΡδ тагкег беνе1ортеη!. №с1ею Лаб8 К8 32(1), 2004, с. е5.

43. Тд88еп Ρ., йаЬога!огу Тескп1дие8 ίη Вюскет18йу апб Мо1еси1аг Β^о1оду-НуЬ^^б^ζаί^оη уйк №.1с1ею Лаб

- 40 022877

РгоЬез, часть I, глава 2 (Кегуюху оГ ргтс1р1ез оГ РуЬгкР/аРоп апй 1Ре з!га!еду оГ пискис ас1Й ргоЬе аззауз, издво Е1зеукг, №\у Уогк, 1993.

44. Тигпег А., Веа1ез I., Раите δ., Оип&гй К.Р. и Раиле О.А., ТЬе Рзеийо-Кезропзе Кеди1а!ог Ррй-Н1 ргоУ1Йез айар!а!юп !о рРо!орелой ίη Ьаг1еу. 8с1епсе 310, 2005, с. 1031-1034.

45. Уапсаппеу! С., 8сЬт1й1 К., 0'Соппог-8апсЬе2 А., УШтР/ег Ь. и КосЬа-8оза М., Сопз!гис!юп оГ ап т1гоп-соп1аттд тагкег депе: 5рПстд оГ !Ре т!гоп т (гапздешс р1ап!з апй 1!з изе т топРоппд еаг1у еνеπΐз т АдгоЬас!епит-тей1а!ей р1ап!1гапзГогта1юп. Мо1. Сеп. Сепе!. 220, 1990, с. 245-250.

46. Уапйезотре1е I., Ое Рге!ег К., Ра!!уп Р., Рорре В, Уап Коу Ы., Ое Раере А. и 8ре1етап Р., Ассига!е погтаРгаРоп оГ геа1-Рте циапРкШуе КТ-РСК йа!а Ьу деоте!лс ауегадтд оГ ти1Рр1е т!ета1 соп!го1 депез. Сепоте Вю1оду 3, 2002, с. 1-11.

47. Уоз Р., Нодегз К., В1еекег М. и др., АРРР: а пе\у 1есРп1цие Гог ОКА йпдегргтРпд. Мискк Ас1йз КезеагсР 23(21), 1995, с. 4407-4414.

48. Уапд Э.С., Рап 1В., 81ао С.1. и др., Рагде-зса1е Иепййсайоп, тарртд, апй депо!уртд оГ зтд1епискоййе ро1утогрЫзтз т !Ре Ритап депоте. 8с1епсе 15, 1998, с. 1077-1082.

49. Уапд М.В. и Уа1егРоизе Р.М., АррРсаРоп оГ депе зРепстд т р1ап!з. Сигг. 0рт. Р1ап! Вю1 5, 2001, с. 124-150.

50. УеЬег 1Ь. и Мау Р.Е., АЬипйап! с1азз оГ Ритап ОНА ро1утогЫзтз хуРюР сап Ье !урей изтд !Ре ро1утегаге сРат геасйоп. Ат. I. Нит. Сепе!. 44, 1989, с. 388-396.

51. Уе1зР I. и МсС1е1апй М., РтдегргтРпд депотез изтд РСК \уРР агЬРтагу рлтегз. Мискк Ас1йз КезеагсР 18 (24), 1990, с. 7213-7218.

52. Уи Ό.Υ. и Уа11асе К.В., Сепотюз 4, 1989, с. 560-569.

53. Уе δ., ЭРШоп δ., Ке X., Со1Рпз А.К. и Рау ΙΝ., Ап ейюкп! ргосейиге Гог депо!уртд зтд1е пискоРйе ро1утогрЫзтз. Упскас Асйз Кез., 29, 2001, с. Е88-Е88.

54. /Рои Υ., δип Χ.-Ώ. и N1 М., Тттд оГ рРо!орелойк По\уегтд: РдР! регсерРоп апй сРсаФап с1оск. I. 1п!едгаруе Р1ап! Вю1. 49, 2007, с. 28-34.

55. /искегкапй1 Е. и РаиРпд Б., ]Уо1икопагу йУегдепсе апй сопуегдепсе т рго!етз, в 1Уо1утд Сепез апй Рго!етз, под ред. У. Вгузоп и Н.1 Уоде1., изд-во Асайетк Ргезз, №\ν Уогк, 1965, с. 97-166.

Перечень последовательностей <110> Зингента Партисипейшнс АГ <120> Полинуклеотидные маркеры <130> N1453 РСТ В5 <150> 07108777.9 <151> 2007-05-23 <160> 52 <170> РаСепЫп версия 3.4 <210> 1 <211> 840 <212> ДНК <213> Веса уи1даг!8 <400> 1 дсСсссдсса ссаСдасдСс аСсСсаСдаС СсдасдддСС СадСсСЬааа дЬдсССаСсс 60 аадддсдссд ССдасСССсС ддСдаадссС асаадааааа асдаасЬСаа ааассСССдд 120 садсаСдсСС 99аддаддСд СсасадсСсС адСддСадСд даадсдааад сСдСдСаадд 180 ааСддааааС ссаСаддаад саададддсС даададСсдд асааСдасас СдасаСсааС 240 даддаадаСд аСаасадаад сасСддСССа саадсСсддд аСддаадСда сааСддаадС 300 дддасссада дССсаСддас ааааадддсС дсадаадССд ададссссса ассасадСсС 360 асаСдддадс аадсаасСда СссассСдаС адсасССдСд сСсаддСсаС ССаСссааСд 420

СсСдаддсаС ссдссадсад сСддаСдссС ддаСссасдс аддаасССда сддасаддас 480 саСсааСасд асаасдСссс аасдддааад дасссддада ссддадсасс садаасссса 540 дасссасддс ЬаааСддасс ааасаааасд дссаадссад саасСасСдс Ьдаддаааас 600 саасасесас адССадассС саассаддаа аасдасддсс даадСЬССда сдаададаас 660 сСддадасда аСааСдасаа ассСаааадС дадсддасса аасаддсСаС даасЬсасса 720 ддаааадССд аадаасаСсд СададдаааС ааадСаСсСд аСдсассасс сдаааСССса 780 аааСааадда саааддсаСд саасаСдСсд аддаСаСдсс ССсСсССдСд сСсадСсСда 840 <210> 2 <211> 493 <212> ДНК

- 41 022877 <213> Веса уи1даг!8 <400> 2

аСдСсассСс аСдаССсдаС	дддсссадсс	ссааадсдсс	Сасссааддд	сдссдссдас	60
сссссддсда	адссСасаад	ааааааудаа	сССааааасс	СССддсадса	сдсссддадд	120
аддСдСсаса	дсдСаадСдС	ссссасассс	СссадссССу	саСсадсССа	дСддССсдСд	180
СадсадСсСС	СсагаССССс	даасСССсСа	дсасаСаСда	саааССааас	ссдсасдсса	240
аССсссдаСС	адаСааСдда	аСаадсСсСС	СсадсСддСс	ССССасССеС	сссссссссс	300
сСсССаСдаа	ааасСддСаС	дссасСаСдс	аСсССдССсс	аддСдСССдС	ссадсдсссс	360
ссссссссас	ссдссссссс	дСССССасСС	ссаассссаа	ССССагСССС	сссСсаС СсС	420
ССССЪСадСс	СадСддСадС	ддаадСдааа	дсСдСдСаад	дааСддаааа	сссасаддаа	480
дсаададддс	Сда					493
<210> 3 <211> 493 <212> ДНК <213> Веса	уи1даг!з
<400> 3 асдСсаСсСс	асдасссдас	дддсссадсс	ссааадсдсс	сасссааддд	сдссдссдас	60
сссссддсда	адссСаСаад	ааааааСдаа	сССааааасс	СССддсадса	СдСССддадд	120
аддсдссаса	дсдСаадСдС	сСССасаССС	СссадсСССС	саСсадсССа	дСддССсдСд	180
СадсадсссС	СсаааССССс	даасСССсСа	дсасаСаСда	саааССааас	ссдсасдсса	240
аССсссдаСС	адасаасдда	аСаадсСсСС	СсадсСддСс	ССССасССеС	ССсСсССсСс	ЗОО
ссссеасдаа	аааесддсас	дссасСаСдс	аСсССдССсс	аддСдСССдС	ссадсдсссс	360
ссссссссас	СсдССССССС	дСССССаССС	ссаассссаа	ссссадсссс	ссессасссс	420
ссссссадсс	СадСддСадС	ддаадСдааа	дсСдСдСаад	даасддаааа	сссасаддаа	480
дсаададддс	Сда					493
<210> 4 <211> 493 <212> ДНК <213> Веса уи1даг18
<400> 4 аСдссаСссс	аСдаССсдаС	дддСССадСс	ССааадСдсС	Сасссааддд	сдсСдССдас	60
СССсСддСда	адссСасаад	ааааааСдаа	сССааааасс	СССддсадса	сдсссддадд	120
аддсдссаса	дсдсаадсдс	ссссасассс	СссадсСССС	саСсадсССа	дСддССсдСд	180
садсадсссс	СсадаССССс	даасСССсСа	дсасаСаСда	саааССааас	сСдсаСдсСа	240
ассессдасс	адасаасдда	аСаадсСсСС	СсадсСддСс	ССССасССеС	ССсСсССсСс	300
сСсССаСдаа	ааасСддСаС	дссасСаСдс	аСсССдССсс	аддСдСССдС	ссадсдсссс	360
СССссСССас	СсдССССССС	дСССССаССС	ссаассссаа	ссссаасссс	СссСсаССсС	420
ССССССадСс	СадСддСадС	ддаадСдааа	дсСдСдСаад	даасддаааа	СссаСаддаа	480
дсаададддс	Сда					493
<210> 5 <211> 15037 <212> ДНК <213> Веса уи1даг19
<400> 5 аССаССдСас	аСауамдасу	аСССасдСаа	сСаааССааа	аааадССССа	ааааСдсааа	60
асадааааСа	ааассаааСа	СсдасаСССд	даааСССаСа	аСадаааСда	аСаааааСаа	120
дддадаааса	аасдаадаас	ааааСаааСд	адааададаа	ССааааСддс	СсССдааааа	180
СаааСдадад	адааааддад	ддаасдадсд	адсдасдада	дадааададс	СддсссасСС	240
СсаааааССс	сдссаааадс	ссдссааасс	ссддсссссс	саааадсасс	аааассасдС	300
адССССддсс	ааддсдсадд	асдсссассс	Сасасссссд	сдсаддассс	ааассдсдсс	360
СадаааСадд	дСсСссСааС	аСССсСсСас	садсаССССС	сдсасдсдас	дсдСдсССда	420
асссссссеа	адасадааас	ссдаСССССС	СсдасдСаСд	СаааадСсаа	аасссаааса	480
ССадасаСас	ааадСаСааС	СдСССССадС	сасаааассс	аассддссса	дСсСсСдсаа	540
ессдадсссс	ссассадссс	сссссссссс	Сссссссссс	СССасСССса	аадссааасс	600
ссасдаасаа	аасадааасс	ССаССдааСС	СаСсСаСдаС	ССсСааСаСС	асСссссссд	660
асссааааСа	СадССсссаС	ССсссССССС	ссасддсаас	ссасдсааас	адааСаСаад	720
адддасадса	аадаСССССС	дСССаСССаа	асааасдссд	сасдддаааа	даСдаССССа	780

- 42 022877

ддададааад	СададааСаа	ССддСдааад	адСаССааСС	дсааеасссс	ддССдааСаа	840
асаааддааа	ааасаааас с	саадаадсаа	аСаааСдада	аССдСССссС	сдаасааСдс	900
аааадСдддС	сссаассссс	аааасасдсс	еааааасааа	ааааеСсссЬ	дСдСассдСс	960
сасдсаадас	ддсасдсдад	асссс С ίί ί-ί	ссСасССсаа	СасаассдсС	асссааадСа	1020
дсддСССасС	дассссссес	СССаСсСасС	саддсаааас	ессддсдссд	адСдаСаСаа	1060
ессдссассс	саадьадсда	сссассдааа	сссссаасес	саСадСССда	СаСдСдсССд	1140
саасаССССд	сссаддСааа	ссдсСасСса	дддСадсддС	ССаСдСдСаС	ааассдсСас	1200
ссааадсадс	ддСССаСССС	аасасааасс	ассассдсда	дСадсддССС	асдСдддсаа	1260
ааасаааааа	ааааасадсс	СсСсдсдСдС	сдСссСасдС	ддасддСасд	садддаассс	1320
ссьаассссс	дддсаСаССС	СдддаасСаа	аасссасССС	СдсаССаССс	ааддаааааа	1380
ССсааасааа	сдасдддаса	сддСССССсС	адасаааССа	сдааааааСд	СддаасСааа	1440
СаСдааааСд	дааасСаСаС	СССдддасас	ссааааСдда	аасдддаасс	аСаССЪСддд	1500
асддадддад	СаСааССССС	садссдассс	ССдааССаад	СасассасСС	саСаСаССдС	1560
СаадааасСд	дасасССдда	ссссаадсса	аасссссдсд	адсасдсасс	дасдССдСад	1620
СдСаССддСС	дСадСССдСа	адссаасссс	едСССССдСа	аадсссасСс	асссдадсда	1680
СССдСаСааС	дсаааССаСд	саасСсСаСд	ассссадссд	асссдсдадс	даССдССаСа	1740
ассссасссс	сассассссс	асссдаассс	ссссссддес	сдсасдсдаа	сссдсаассс	1800
адаааддсаа	аддддСаааа	СадСсСсССс	асъсдддаас	ассаСадсес	сссСсссссс	18б0
ессасасаас	ааадасдасд	асдасссссд	аСааСааСда	СССдСаадСд	ааСЬаСдсда	1920
асдсссссдс	асдсассдас	дсссСадсаС	ассадсссса	дСССдСаадС	СааССССЪСС	1980
дСССССдСаа	адссссссда	СсаСССдадС	даССССсдСд	аССССССдСд	аССССсСсаа	2040
ссссасдадс	даСССдСааа	дСССсССдаС	асаадсдасс	сссдадсддс	дссдаассаа	2100
СССссддСдд	ссссдссада	ассссасссс	адСаССдаса	СССсССССдС	ааСССадааа	2160
дддааадддд	ддсаааасад	дсаСССсааа	аааддасасс	аССдсСсссс	ссССсссССа	2220
СдСааССдад	аСаСсССааа	адааСассда	дадССССССс	ссасааадда	дСаССССССС	2280
СааааССССС	СссаСааадд	адСаСССаСС	адСассаадС	Сдасссссса	ааСсаССаСс	2340

сССдсдсааа	ССдсасааСд	дадасасссд	дсдССдасдС	дсдаасасдд	ддссаСааСа	2400
асаддаддсс	ааааасаааа	ссасаадддс	СааааСсдСС	асаасассаа	асаадсаСсС	2460
сасаССсСса	ссддСсассс	ССССССаасс	сасСаааада	асааассссс	аасСсСссСс	2520
асаасссдас	асдСдСсдаа	сассдасъса	сСдадаСсаа	сссадасссс	сСсссьсада	2580
сссссссдсс	сссссадсас	адесссадас	сСсаассСсс	асдссадсаа	адссасссса	2640
сдСдСсаСсс	СасдсддссС	ссссссссас	сссСсасСсс	СссасдСсаа	сасссссесс	2700
сааааССааа	аааСсаСССС	СССаССаСаС	ссасссдаас	дСаСаСааСа	аСдСсСасСд	2760
аСсЬСссссс	ССадаасСаС	сСссССсСсс	саССддаасс	СсааааСсаС	сессасссса	2820
СССсдадааа	аддааааааа	адсасаСсСС	ссссдаадас	саасссдсдд	ассассассд	2880
адсССсаСсд	СаССаааааа	саСадСаааа	дССсСССссс	саСССдСсСС	СССаССсаСс	2940
саассссссс	СадСдаадаа	сссСааСССС	дСССдСдааС	СсСсаадССс	аадссссдас	3000
ссдддсассс	СССССдаСда	аасссдсдса	дсСдСаддаС	дССаСсдСдс	сдадаааадд	3060
дССССадаСд	дСаадССССС	ССССсСССда	сссссссссе	сСасСССССС	ССССдССССд	3120
сСССадаСаа	СасСдСсаСд	аСаСдаСаСа	аадааССддС	даСССдддСа	дсссасссаа	3180
ссСаСдасСа	СдСдССаССС	дссссдассс	ССсааСССаС	сСддЬдсСдс	дсдсасасас	3240
дССССдЬССС	сссссаадса	СССддССаСС	ассдаадСдд	дсаассадда	аСССдсСасС	3300
ааСсСаСдда	СССдддССсС	дССдСдаССа	аСССасСаСа	даСССдаддС	СЪаасссаСд	3360
ссссасаддс	Садаааадда	ааСсааСдаС	ссдсссдсдд	аСССдадСад	аССдСССдСС	3420
адСдСдсдСа	сдасдасасс	аасССссаСС	ассссссесс	аааССадддд	СааССдаСдд	3480
ссссссдеас	ассдааддсд	СаСЬсСсССС	даСдаСддад	сдассдссда	ааадасаСда	3540
СдддССааад	ССдсаддаСС	ассссасссс	ааСааасаса	ассдассаас	ссддаСсСдс	3600
СдааСдаддС	СдаССсасаа	аааСдаадае	дддсссддСд	ссдссаадсс	ддсддсадад	3660
сССаассаас	асасадссде	СдСдаааааа	дааддСаддд	дСадддсСдс	аддсдааддд	3720
саддддсССС	ссдаддадда	сдаасСдада	аССаССдадд	аСддсдаада	сдсааасадс	3780
аддсдсссСС	СдадССсСдС	ссадсССсса	дССсаЪасСс	асаддсаСса	дссасаадСа	3840
саассссадд	ддададСсСд	ссдддададд	СССсСсссСд	ССддаСсСсс	ъааддССССд	3900

сЕсдЕадааа	дсдасдассс	аасЕсдЕсаЕ	аЕЕдЕЕадЕд	сЕЕЕдсЕасд	даааедЕадс	3960
ЕаЕдааддЕд	аЕЕЕдаЕсЕд	ЕЕЕЕааЕссс	аЕаЕаЕдсаа	ЕдЕсЕЕдЕсс	ССаСсассСа	4020
сЕЕсаасааа	ЕдаЕЕаадад	ааЕЕдЕасЕс	ссЕсдЕЕсса	аааЕааЕадс	аасасЕЕадс	4080
сЕЕсссдЕад	асЕЕЕаддда	дсдЕЕЕддЕЕ	саЕаЕЕаЕдд	ЕаЕдддЕЕЕд	дааЕЕаддаа	4140
Едааассаад	дсддсасддд	дЕЕддаасЕЕ	даЕасЕЕааЕ	ассЕЕдЕаЕЕ	ЕддЕЕЕсаЕЕ	4200
ЕаддааЕдаа	ааааЕЕЕсЕЕ	СЕаЕСЕдаЕа	ссЕададдЕа	аддсаЕдадс	саЕасссасс	4260
ЕссссссаЕд	ддЕЕЕсЕааа	ссссаЕассЕ	ЕаЕдддЕЕЕд	аддЕаЕдддЕ	ЕЕааааЕЕЕа	4320
ааааЕаадЕЕ	ааасааасас	ЕаддЕаЕдЕд	ЕЕЕЕдЕЕсаЕ	Ессааассса	ЕассЕсаЕас	4380
сЕаааасЕад	Едаассааас	асссссЕЕаа	ддаЕсЕЕддд	асааадддаа	ЕссаЕЕасЕа	4440
даЕсЕддЕда	саЕЕаасасс	ЕаадЕЕСаса	ЕсадЕЕЕсас	ЕЕаааЕссЕЕ	сдЕЕЕЕаааа	4500
ааадаааааа	аассЕдЕЕад	ЕсЕдадЕаад	ЕЕЕасЕааЕЕ	ЕЕЕдЕЕсЕаа	ааЕЕсаасас	4560
аЕЕаЕсЕаса	ЕдсаадсасЕ	ЕасЕадЕаса	аЕасаасЕса	аасааЕаЕаЕ	дсаЕссЕаЕс	4620
ЕдЕЕсасааЕ	даассдаааа	сЕааЕсЕЕЕЕ	саЕасссЕЕд	ЕЕЕдаЕдсЕЕ	ЕЕЕЕсаддсс	4680
аЕасаааЕЕС	сЕЕЕаассЕа	ааЕЕдссЕсс	ЕсадЕсасЕд	ЕЕсааааЕЕд	садЕЕЕЕаас	4740
аЕссЕсаада	ссаЕдЕдаЕд	ЕасЕдЕЕада	ЕЕаЕаЕЕаад	ассссаЕЕдЕ	аааЕааадса	4800
ЕдЕаЕадЕдд	аасаааасдс	аЕдЕсЕЕссЕ	ЭСЕЕЕЕЕЕЕЕ	дддддссаЕд	аасссассдс	4860
ЕЕдаЕаЕЕЕЕ	дсадЕЕдЕад	дддЕдссааа	ЕддсаЕадаа	дсаЕддаааа	ЕсЕЕадаада	4920
ЕЕЕдадсааЕ	садаСЕдасс	ЕадЕЕЕЕаас	ЕдаддЕадЕс	асаЕсаддас	ЕсЕсЕддЕаЕ	4980
аддЕсЕЕсЕд	ЕссаадаЕаа	ЕдадЕсасаа	аадсЕдссад	ааЕасЕссЕд	ЕсаЕЕадсда	5040
дсЕЕЕсдЕЕс	сЕЕдЕЕдЕаЕ	ЕадЕдЕаЕдЕ	ЕсЕдЕаЕЕЕд	аЕЕЕЕсЕЕЕс	ЕЕЕдЕдсаЕа	5100
ЕсЕЕдссЕЕд	ЕЕЕЕЕЕасаа	ЕЕаЕЕЕадаЕ	ЕЕЕадаЕдаа	ааЕдеаЕасЕ	саЕЕЕЕаЕдд	5160
ЕсЕЕЕадсЕд	саасаЕЕЕда	ЕЕаЕЕЕЕдЕд	ЕдсадЕдаЕд	ссассссасд	аЕЕсдаеддд	5220
ЕЕЕадЕсЕЕа	аадЕдсЕЕаЕ	ссаадддсдс	ЕдСЕдасЕЕЕ	сЕддЕдаадс	СЕаЕаадааа	5280
ааасдаасЕЕ	ааааассЕЕЕ	ддсадсаЕдЕ	ЕЕддаддадд	ЕдЕ сасадЕд	ЕаадЕдЕсЕЕ	5340
ЕасаЕЕЕЕсс	адсЕЕЕссаЕ	садсЕЕадЕд	дЕЕсдЕдЕад	садЕсЕЕЕса	ааЕЕЕЕсдаа	5400
сЕЕЕсЕадса	саЕаЕдасаа	аЕЕааассЕд	саЕдсЕааСЕ	сссдаЕЕада	ЕааЕддааЕа	5460

адсЕсЕЕЕса	дсЕддЕсСЕЕ	ЕасЕЕсЕЕЕс	ЕсЕЕсЕссЕс	ЕЕаЕдааааа	сЕддЕаЕдсс	5520
асЕаЕдсаес	ЕЕдЕЕссадд	ЕдЕЕЕдЕСЕа	дЕдЕЕЬсЕЕЕ	ссЕСЕаЕЕсд	ЕЕЕЕЕЕСдЕЕ	5580
СЕСаСЕСЕЕа	аСЕЕСааЬСС	СааЕЕЕЕЕСС	ЕсаСЕССССС.	сссадсссад	ЕддЕадСдда	5640
адЕдааадсЕ	дсдЕааддаа	ЕддааааЕсс	аЕаддаадса	ададддсЕда	ададЕсддас	5700
ааЕдасасЕд	асаЕсааЕда	ддаадаЕдаЕ	аасадаадса	ЕЕддЕЕЕаса	адсЕсдддаЕ	5760
ддаадЕдаса	аЕддаадЕдд	дасссаддЕа	дЕдсЕаассс	сЕдЕааЕаЕЕ	ааасЕЕссЕа	5820
ЕадЕаддЕдЕ	ддЕЕааЕдЕд	асдсЕдЕЕаа	ддссЕЕЕЕдд	дЕддЕЕдсЕЕ	сЕадЕЕсасЕ	5880
ааддасааса	адаааЕадсЕ	сдсЕассдас	адСЕадддса	ссЕсааЕаЕс	ассСссЕсЕЕ	5940

дЕаедЕЕЕдЕ	ЕдаасЕасаЕ	ЕЕЕЕадссад	асЕЕдадЕаЕ	ЕЕЕаЕссЕда	аддаЕадаас	6000
аддЕдсаЕЕЕ	ЕсддЕЕдсдд	ЕЕдЕЕадЕЕд	ЕЕасЕдЕЕаЕ	дсааадасЕа	ЕСдссассаЕ	6060
ЕЕЕСЕсасас	аЕаЕСЕааса	ЕддаадЕдсс	ссаассассс	сссаасссаа	аааасдддад	6120
ддадаааЕЕа	сЕддадаЕдд	дааадаадЕЕ	асаЕааааад	ЕЕадЕсдЕЕЕ	дддСсаСдаЕ	6180
СдСЕСдССдЬ	аессдсааад	ЕЕадедсдЕЕ	сЕсЕЕсссдд	аЕдсЕЕсааа	асаадссдас	6240
дсассаЕааа	деассасЕсЕ	ЕддсЕЕсасс	ЕдЕЕддЕдЕд	дасссаасса	аСдЕасссЕС	6300
дЕЕдаЕсЕсд	адасадасаа	ададдаадЕЕ	ЕааЕЕЕсЕсЕ	ЕЕаЕаЕдЕЕа	ЕсЕсЕсЕЕса	6360
асссдссадс	адссасдЕсс	СЕЕЬсдЕдда	саСССадаас	ссаЕдЕСадд	ЕЕсаЕаЕЕЕа	6420
ЕадЕЕаддЕд	аЕЕдЕаЕсаа	ааЕЕдссаЕс	асааЕаааса	даасаЕЕааС	ЕСсЕаЕЕддд	6480

ааддаЕЕсаа ддаЕсаааЕа Еасаддааад адсадЕдСад дадаЕаЕсаЕ сЕЕдЕСдаас 6540

аасаааадаа	асаЕЕаасаЕ	саасЕддЕда	ЕааЕсЕЕЕдс	аадаЕЕддаЕ	дасааааСда	6600
ддадЕсдаСс	ЕааЕаЕаааа	саааЕЕддда	асСдссадсС	аСаЕссСдса	ЕаЕсаадааЕ	6660
ддадассЕЕЕ	аадаааадЕа	адассаЕЕЕЕ	ЕЕдЕСдддаа	дЕсаадссаЕ	ЕдЕсссадЕЕ	6720
ЕссСЕдЕдаа	асссадЕЕса	ЕсЕЕадсЕЕС	ссссСассаа	саЕдааЕЕсЕ	СЕЕЕССЕЕЕС	6780

адсссЕЕдса аасЕЕддЕЕЕ ЕаЕдсЕааЕЕ аЕсадЕдЕЕЕ ссЕЕсаЕЕЕа дъасдссдад 6840

адддЕЕЕаЕЕ	ЕддЕЕдаЕса	аадааЕасЕЕ	даЕдассЕЕд	аддЕадаЕдс	ЕссасаЕдда	6900
даадЕЕссЕс	ЕаадЕдЕаса	аадааЕсЕад	ЕЕсдассаас	Ессдасссад	даададасаа	6960
сасдаЕсасс	ЕсдЕддЕсЕа	дасЕсЕддад	аддЕсааадЕ	дЕдсаааадд	дЕаЕЕЕЕЕда	7020

- 44 022877

аадасааСдд	ессдссдасс	сасдаседаа	ассддасддс	сдсдасСдад	сасасассаЬ	7080
садсддссес	сССсСааддс	даСаСаадса	СдСдаСаасс	сааСсссдеа	саессссссд	7140
аддасассаа	ССдСдсСасС	ассссадддс	дсСддадасс	саСасаСаСа	дадссаССда	7200
саассаасас	ааасССсаас	сасССаСССС	СаСССсаССС	аадсСассаа	Ссссеаадаа	7260
ададсссасс	саадсссссд	сессаддсдс	аессссессс	ССССсадсСа	дсдсасаааа	7320
ааСдаасССС	сдадасадас	сдссааассс	дссссдссаа	даадасаааа	ССССдасаса	7380
саассдсаас	сдсассссас	дасассСасд	ссдаеаеаСс	сдсаадсдаа	дССдаСаСдс	7440
ааааасСаСд	садссссссс	сдссеасдде	аасадассес	сдСсааСдСд	асдсссдсдь	7500
дссаЬсаЬаа	ааСдаСаССд	ддСсСССада	сСсСдЬСасС	сСасадсСда	аддаСсССад	7560
ссссддсасс	сасасесссс	ссасссаааа	дССааааааа	дсддассдСС	ьдасссаедС	7620
ааддааааад	даааддааСс	дадааадаса	ааддадддда	аадаадссаа	аСсСссСааа	76В0
аадсссдссс	СдСдсддСда	дададддадс	дасеСдаааС	СдссаССдас	даСдаССддС	7740
СсасааССдС	ааСсдаааСс	ааасСсасСс	СсСсСсСсес	сссссссссс	аСсасссссс	7800
СсааасСаСа	асаСсасадС	ссСССааасд	сдаесдсссс	дддддаСадС	даседдсадд	7860
даСдддсаад	ддСсдддСсС	ддссддассс	Садасссдда	сссеааСССЪ	СССССдСада	7920
сссааасссд	дассссаадд	дСсСдааааа	аССддассСС	дасссадасс	сССадддСсС	7980
даадддСсСа	дадддСсадд	адддСссадд	сССаааСССС	ссассссдсе	аааСССССад	8040
еассассаас	ассаасааСс	аСССдаааСС	сдсасдааас	ааасасаааа	аааааСсдса	8100
СдааСсааас	асаааааССс	дсаСдаааса	аасасСааса	сасааассда	аааааасдаа	8160
асааасасаа	ассСаСааас	даааааааСС	дааасаааса	саассссааа	саСаСааасС	8220
дааааааааа	асдааасааа	сасаааСаСа	сааасЬдааа	аааадаадаа	асааасасаа	8280
сССасаСаад	адсссадаас	дддСдССаСа	дсссасдссс	СадСсаСССа	даааассаас	8340
ссдсьссссс	сссааадсса	аааСдСаСаС	аееаааеаад	СССадддСсС	ааддсдссдд	8400
аасасссаса	дддсааеддд	СССдааасСс	асасдддсас	дсассадаад	аддаддаддс	8460
сСадСаСдса	аааддССада	дСдсаСсаад	Сддсаасаас	дсдсассдсс	асассааедс	8520
сдсдадСсдс	дасаддсдСс	дсдддссдсд	ассадсдссС	сдсдадсССс	ьСсдсаСдСс	8580
дсдасдсдСс	ССсСдссССд	дааСдсдааа	аааСдссесд	дсддссссас	аСссдССдСд	8640
асдссссдсс	дассасссса	асдассссса	аддСсССССа	ассадсадас	СаааддссСС	8700
СдаСдадСда	ссаадасддд	ддсеаедСда	есаассссСс	СадссааСда	аасдссдасс	8760
аСдсССаСаС	аассСССдда	сессСасдад	сдаддадсса	даадааааСС	адаасСССсС	8820
асасСсСссс	аааадссссс	ЬСдсеСадсС	саададааас	съсдсаассс	СсСсССдадС	8880
дССсССсаса	аасасаааас	асаадссссс	дССдаССсас	ссадаадасс	ассСаадсдд	8940
ассдсссссс	СссаССдСаС	сссасеадсс	аССЬсдСдсс	аасссддсда	СссСададдд	9000
дсдааассаа	асеаассдда	аадсдсадсс	сссдСдссСС	ддадСдддаС	аСссддСЪсС	9060
сСсаССдаСс	асаадсссаа	саСаадддСс	дддСсСдддС	ссаааесеса	адасссддас	9120
ссддасссСа	аааааССсас	ССддасссад	асссддассс	ддасссесад	ддСсСдаааа	9180
адссддассс	ааассссеаа	асеадддСсд	ддСссаасад	ддсссдддСа	дддСсССдда	9240
сссаСдссса	СсссСадСда	ссдддсадсс	сассдсадаа	СаССдадаас	дсааСаСааа	9300
ддддсдссда	дааададддс	сссдадсдса	ССдСССаада	аадССдддаа	аддааСдада	9360
даСдаадСас	адаадаааас	дСсСадааад	Сдаадсаедд	дадсссдссс	сССССсСССС	9420
СссСааадСС	ссссассааа	СдСсссССаа	дсддССсадс	сасдссссед	дасаадсССа	9480
ссассаадсС	ссссасссса	даСсаСаССС	дааСсаааса	сссессееес	СССадааСаС	9540
сссссссссд	едсасдааад	ссааССссаС	дадаСаСдСа	ссссасассс	сСсСааааСа	9600
СаСаааСааС	сдасдаадса	аССССсадаС	саССадаеаа	дсдССсСаса	ааадаассаС	9660
сСССССССдс	ССссССдСде	асССддаааа	СдСадССссс	аСаСаеааСС	ССассаСддс	9720
адСасССсСа	садассасса	адсессесдс	ССдСдсаасс	СаСадСдсаС	ссаададддс	9780
ССаддСаСад	асадссееса	сСССсааССд	дССададСсС	ассСссадСа	СсасСдасад	9840
аасссссаас	аддаассесС	десаСаасСС	ааССсдсада	аадсасСаас	Сааасаассс	9900
сССадССсСС	садееаадсд	сссдассддс	сасасссадс	ссссадсссс	СадСаСддад	9960
аСССаСааад	садсасдасс	СдадеСдааС	адсдааедса	адассадаса	сасссасаса	10020
дСсдСдССаа	ССССддааас	СдасаддадС	дасСадааас	сасССССССС	дСдСссаааа	10080
сссссасаса	ССдСееесСа	аааааасСдс	сааассасда	Сдасаасааа	сааассССас	10140

асаддСассд	дааСдаСасс	дааасааасс	даддссадсд	асаадссаСа	аСсссССасс	10200
ьсдааассса	даддсСдСсе	дсСдсадСсС	сСаСсаСсСС	сССаСССсае	сааассаасс	10260
аССассСдсС	СсаассСсаа	сддСссдадд	сссадасасс	дсдсссссда	СадсаСсаСс	10320
асадссдааа	ассаасдсдс	асСССсССсС	асССаааСас	саСССдадад	сдсссссддс	10380
адссассасд	аасдСсдсда	дассасаасс	сдСдаааСаС	адССССсаСс	асаССсССас	10440
сСдсаСдсдС	ааддаааадс	асадсдссад	СдССсааСсС	СССдсСасСС	сСддСдасСд	10500
дСсаасддСс	ааадСасдса	деасдасссс	дсдСССдсса	дСССсССсСС	СаааСаадСд	10560
СдаасСдссс	садсссаадс	СдсСсдаасе	сссааааадс	дссддасссд	ССадССдССа	10620
саСдСаСаса	аСдССдаССд	ддСдддсССС	сесасасасс	ассасасссд	ССдааСсаса	10680
асдаадСасс	сасссссасс	сдаддадсад	дСаСдаСдад	дССадсаддд	адсссдадсд	10740
ссаааддсса	СдСдаадаСд	СаааааССса	сСдасааСда	дассССадСа	СссдасддСС	10800
ддаассссас	еаассссасс	дссссдссас	ссссссассс	ссасссадса	сссссссссс	10860
аСаааССССС	дсдаСсСада	дССсаСддас	ааааадддсС	дсадаадссд	ададссссса	10920
ассасадСсС	асаСдддадс	аадсаасСда	Сссасссдас	адсасССдсд	сСсаддСсас	10980
ссасссаасд	Сссдаддсас	ссдссадсад	ссддасдссс	ддаСссаСдс	аддаасссда	11040
СддасаддаС	саСсааСаСд	дСаСдСддСа	сСдсаСССда	СадаадССас	аасаасдсдс	11100
ааасСдааас	сасССааСда	ссСадсаСсс	асссдсасса	дасаасдссс	саасдддааа	11160
ддаСССддад	аССддадСас	сСадааСССс	адасссасдд	ссааасддас	сааасаааас	11220
ддССаадсСа	дсаасСасСд	сСдаддаааа	ссаасассса	садссадасс	Ссаассадда	11280
ааасдасддс	сдаадссссд	аСдаададаа	ссСддадаСд	ааСааСдаСа	аассСаааад	11340
сдадсддасс	ааасаддсСа	СдаасСсасс	аддаааадСС	даадаасасс	дсададдааа	11400
СааадСаСсС	дасдсассас	ссдааасссс	сааааСааад	дасаааддса	СдсаасаСдС	11460
сдаддасаСд	сесссссссд	СдсСсадСсС	даададдССд	ддСдаСаССд	садасасдад	11520
сасСааСдСс	Ссадассада	асассдссдд	дсдсссадад	сСССсадссС	СсассаддСа	11580
сдесададаа	ддсдааассс	дааСССаСаС	ааСддасаад	сддасааСас	ссеассссса	11640
аассдссдса	ддСасааССс	аддсасаасС	ддсаассадд	дссааасадд	саасдссддс	11700

адседсссСс	сассаааСаа	садсссадаа	дсадсааадс	адссссаССС	СдаСдсСсса	11760
саСсаааССС	сдааСадсад	СадСаасааС	аасааСаСдд	дсСсСассас	СааСаадССс	11820
сссааааадс	сСдсСаСдда	саССдаСаад	асассСдсаа	ааСсаасадС	саасСдССсС	11880
сассасссас	аСдСдСССда	дссадсдсаа	адССсссаСа	СдСсСааСаа	саассссасс	11940
дсаСсСддСа	адссСддСдС	СддсСссдСа	ааСддСаСдс	Сдсаадаааа	сдСассадСа	12000
аасдссдссс	Сдссдсаада	аааСаасдСд	даСсадсадс	СсаадаССса	дсассассас	12060
сассассаСс	аССасдасдс	ссаСадСдСа	садсадсСас	саааддСССс	СдССсаасаС	12120
ааСаСдссса	ааадсаадда	СдСдасадса	сссссасадс	дСдддСсССс	ааасасССдС	12180
адаСсдссаа	ССдаадсааа	СдССдссааС	СдсадСССда	аСддаадСдд	СадСддаадс	12240
ааСсаСддда	дсааСССссС	СааСддаадС	адЬдсСдсСд	ЬдааСдССда	аддаасааас	12300
аСддСсаасд	аСадсдддаС	адсСдсаааа	даСддСдссд	ааааСддаад	СддСадСдда	12360
адсддаадСд	дСадСддСад	сддсдссддс	дСддаСсааа	дссдассадс	Ссаасдадаа	12420
дссдссссда	асааассссд	ссссаадсдс	ааадааадас	дсСССдасаа	аааддСааса	12480
сСссаааССс	СсСссадааС	дсссасасес	ддасаСссад	сасдсасаСс	сССдааСсСа	12540
аасСдсаааа	дсСдааСССс	адааСааааа	асасаааССа	СаСсаадСаС	дааддсадад	12600
сассдсадСа	ассасадссс	ССсСддСасд	дааССадСас	ССасаСССас	садаадсссд	12660
ссдесасаад	ссасаасссд	аСсаСсаадс	аасааСааСС	СддссаСССс	ССдсССдСаС	12720
Сдааадсдад	аСдасССсаа	асССаСССдС	дСаСсаСсас	аСсаддСдсд	асассааадс	12780
адааадаадс	СадсадаСса	аадассСсдС	дССсдСдддс	аасссдъдсд	ссаддсасда	12840
даааасааад	дааддаасас	сдасадссаа	сассаасссС	ССссасаадС	СдсСдссаад	12900
ассаСССаСд	ссасСсСдаС	дСсадсСдСс	ССсаСаСдСа	саааСССсда	ассссасдсд	12960
СдсаСдаддС	дсСаааСасС	дСсааассСс	адСдаССсСд	СССддСССад	дсСдСадааа	13020
дасаСсСССС	ссСССдСдСС	сссасддссс	ССаССССдад	сСдСдССсас	сасСССССаС	13080
аасаеддъад	ссссСддссд	ссСССддааа	СаадсССССс	сссаааддСд	СдаСдсаСаС	13140
ааСсССдССС	ддСдССадаС	сасасдасса	сссссссадд	сдСССасддд	СсасаССССс	13200
сддаассссс	Ссааасдсда	ССссддааас	аасддсссас	аССССсСССС	ддссссаадд	13260

- 46 022877

адааддссас	ССаааасада	ааадаСССад	дССасадааа	СсадСдаСда	адсааСдадС	13320
сссассасад	ааСаддСада	адсадддддс	дССЬСССссд	ЬасСсссдад	асадааадСд	13380
дддаСадаСС	ссссддассс	дссадааадд	аасаасасад	ССдСсСассь	сссссасссс	13440
СадССсЬСдС	аддадСЬЬСа	ССссасССсс	аСССЬСдЬаа	аасссаддад	ССдСааддас	13500
дсдСааадад	ааСсСдссаЬ	ссадаЬСССа	ассдасддса	аасссдссес	СЬСсаЬдЬСС	13560
ЬсссаадЬаа	ссасаасдсс	сссассдааС	ссасадддас	сссссаасдс	дСассСдаСа	13620
даддсасаса	дсаасаасаа	сасаадсаса	СаСаСЬсССС	аадааСааСд	асасадсааС	13680
сасассссса	аСасаааСаа	аадаЬдСссС	СаСдсаасда	аасаааСаас	ССССссССда	13740
аддсасдсса	саассаасса	ссссассесд	аадасасссс	аьасссадсс	сдддсадсдд	13800
аасСасСааа	СаааааСаЬд	дЬСаСадСаа	саСдСасСса	СдСдсдаасс	дааааааасс	13860
сьасдссссс	СсСаааадСС	сссааасссС	сдадссьаьа	дссссдасдд	сссадсдсад	13920
дсССдседда	дсдссдсдСс	дсСсасссСд	ссдссдасда	дссьдсаСдс	сдСассдсСс	13980
ддСсьСсСда	аддсссадсс	ссссссдьсс	сСсЬССдСдС	СаССсаЬсдЬ	СсссаСсссс	14040
саСдссСссс	сССссссСдС	садСддсСдС	сддссьсссс	ЬСссссьаСС	аасддьсдсс	14100
ддссСссссС	СсссССсссс	сСааСадСдд	ссдссддссс	ссссССсссс	ссссасдссд	14160
ссаадссдсс	ссСССссссд	ССсссссЬСС	сссСадсссе	ессссддсдс	СсССдССдСС	14220
дССадСССад	ЬддсССЬддС	сддссадссс	ддсСдадСдс	ССсдСсдСед	СаСдсссССс	14280
сССдсСсссс	СаСССддССС	сддссасдьь	ддддссседд	ССаассссдс	СсссапдссС	14340
ааасдСддда	дддссссадд	асссадаЬас	аааддСсаСс	асссссдсдс	ссадасдсда	14400
дадддаССаа	дСдССсаддд	аСаадддсСс	сдССссЪдсд	сЬСааасдСд	ддадаасССа	14460
ааддссссад	дссссасадд	адССССддда	ССддааадСа	сасдаасссс	дсссддсада	14520
адасдасадс	дсаасдСддд	дассаассас	ССсдССССсС	СссСССЬСаа	саадссадсс	14580
СсССаССаСд	ададсссссс	аССадССсСа	ассссссьаа	ссссссдсад	дддССдСаад	14640
СсСадСССдС	сдссдсссад	СаСаСсСадС	ссдадаадсС	сдааадСССд	аддССдСдда	14700
аааасдсасс	сассддссдс	адаСсаадаа	сассаадасд	аасдсссдас	сссаасссас	14760
сассдсасса	ддсаддааас	асддсдадсс	аСсдааСаСс	сассасддсс	ддааСадСас	14820

еасассасдд аадсддСССе даадсдСдСа сассадсааа аСадаСдаад аьасссааас 14880 сдасдсссса дассассссс ЪасдсасдСа адддСсаССа ЬЬдССдСада сдСЬдЬаСдд 14940 ссссссаасс саасдасаас ссссссссас СсссасССаа аадсааасаа сдсасссасд 15000

СдсасаСаСС адсасаСаСа СССдЬаСаСа саСсесд 15037 <210> 6 <211> 788 <212> РЕТ <213> веса уи1даг1в <400> 6

МеС Агд Ьеи Не Шз Ьуз Азп С1и Азр С1у Рго С1у Уа1 А1а Ьуз Зег 15 10 15

Уа1 А1а <31и ьеи Азп 61η Ηίβ Не Уа1 А1а Уа1 Ьуз Ьуз <31и <31у Агд 20 25 зо

С1у Агд Уа1 А1а О1у О1и <31у С1п С1у Ьеи Зег О1и С1и Азр О1и Ьеи 35 40 45

Агд Не Не О1и Азр <31у <31и Азр А1а Азп Зег Агд Агд Зег Ьеи Зег 50 55 €0

Зег Уа1 О1п Ьеи Рго Уа1 Шз ТЬг Ηίβ Агд Ηίβ О1п Рго Οίη Уа1 αΐη

70 75 80

Рго С1п С1у Агд Уа1 Суз Тгр С1и Агд РЬе Ьеи Рго Уа1 С1у Зег Рго

90 95

Ьуз Уа1 Ьеи Ьеи Уа! С1и Зег Азр Азр Зег ТЬг Агд Ηίβ 11е Уа1 Зег 100 105 110

А1а Ьеи Ьеи Агд Ьуз Сув Зег Туг С1и Уа1 Уа1 <31у Уа1 Рго Азп <31у 115 120 125

Не О1и А1а Тгр Ьуз Не Ьеи С1и Азр Ьеи Зег Азп С1п Не Азр Ьеи 130 135 140

УаЬ Ьеи ТЬг СЬи УаЬ УаЬ ТЬг Зег СЬу Ьеи Зег С1у Не СЬу Ьеи Ьеи 145 150 155 160

Зег Ьуз 11е Мес Зег Ηίδ ьуз Зег Сув СЬп Авп ТЬг Рго УаЬ Не Мес 165 170 175

МеС Зег Зег Ηίβ Азр Зег МеС СЬу Ьеи УаЬ Ьеи Ьуз Суз Ьеи Зег Ьуз 180 185 190

01у А1а УаЬ А8р РЬе Ьеи УаЬ Ьуз Рго Не Агд Ьуз Азп СЬи Ьеи Ьуз 195 200 205

Азп Ьеи Тгр <31п Ηίδ УаЬ Тгр Агд Агд Суз Н1з Зег Зег Зег СЬу Зег 210 215 220

С1у Зег СЬи Зег Суз УаЬ Агд Азп сЬу Ьуз Зег Не С1у Зег Ьуз Агд 225 230 235 240

А1а СЬи СЬи Зег Азр Азп Азр ТЬг Азр Пе Азп СЬи СЬи Азр Азр Азп 245 250 255

Агд Зег 1Ье СЬу Ьеи СЬп АЬа Агд Азр СЬу Зег Азр Азп ОЬу Зег ОЬу 260 265 270

ТЬг СЬп Зег Зег Тгр ТЬг Ьув Агд АЬа АЬа СЬи УаЬ СЬи Зег Рго СЬп 275 280 285

Рго СЬп Зег ТЬг Тгр СЬи СЬп АЬа ТЬг Азр Рго Рго Азр Зег ТЬг Суз 290 295 300

АЬа СЬп УаЬ 1Ье Туг Рго МеС Зег СЬи АЬа РЬе АЬа Зег Зег Тгр МеС 305 310 315 320

Рго ОЬу Зег Мес СЬп СЬи Ьеи Азр СЬу СЬп Азр НЬз СЬп Туг Азр Азп 325 330 335

УаЬ Рго Мес СЬу Ьуз Аэр Ьеи СЬи Не ОЬу УаЬ Рго Агд Не Зег Азр

Зег Агд Ьеи Азп СЬу Рго Азп Ьуз ТЬг УаЬ Ьуз Ьеи АЬа ТЬг ТЬг АЬа

СЬи СЬи Азп СЬп Туг £ег С1п Ьеи Азр Ьеи Аэп СЬп СЬи Азп Азр С1у

Агд Зег РЬе Азр СЬи СЬи Азп Ьеи СЬи Мес Азп Азп Авр Ьуз Рго Ьуз 385 390 395 400

Зег СЬи Тгр 1Ье Ьуз СЬп АЬа МеС Азп Зег Рго ОЬу Ьуз УаЬ СЬи СЬи 405 410 415

НЬз Агд Агд С1у Азп Ьуз УаЬ Зег Азр АЬа Рго Рго СЬи Пе Зег Ьуз 420 425 430

Ые Ьуз Азр Ьуз С1у Мес СЬп НЬз УаЬ (31и Азр Мес Рго Зег Ьеи УаЬ 435 440 445

Ьеи Зег Ьеи Ьуз Агд Ьеи С1у Азр Пе АЬа Азр ТЬг Зег ТЬг Азп УаЬ 450 455 460

Зег Азр СЬп Азп Пе УаЬ ОЬу Агд Зег СЬи Ьеи Зег АЬа РЬе ТЬг Агд 465 470 475 480

Туг Азп Зег ОЬу ТЬг ТЬг СЬу Азп СЬп СЬу СЬп ТЬг СЬу Аап УаЬ ОЬу 485 490 495

Зег Суз Зег Рго Рго Азп Азп Зег Зег СЬи АЬа АЬа Ьуз СЬп Зег Ηίβ 500 505 510

РЬе Азр АЬа Рго Ηίβ СЬп 11е Зег Азп 5ег Зег Зег Азп Азп Азп Азп 515 520 525

МеС СЬу Зег ТЬг ТЬг Азп Ьуз РЬе РЬе Ьуз Ьуз Рго АЬа Мес Азр Пе 530 535 540

Азр Ьуз ТЬг Рго АЬа Ьуз Зег ТЬг УаЬ Азп Суз Зег Н13 Ηίβ Зег Ηίβ 545 550 555 560

- 48 022877

Уа1 РЬе О1и Рго Уа1 ΟΙη Зег Зег Нхз МеГ Зег Азп Азп Азп Ьеи ТЬг 565 570 575

А1а Зег О1у Ьуз Рго О1у Уа1 О1у Зег Уа1 Азп О1у МеЬ Ьеи С1п О1и

Азп Уа1 Рго Уа1 Азп А1а Уа1 Ьеи Рго О1п О1и Азп Азп Уа1 Азр 01п

О1п Ьеи Ьуз Не ΟΙη Ηίβ Ηίβ Ηιβ Ηίβ Туг Ηίβ Ηΐ3 Туг Аэр Уа1 Ηί8

Зег Уа1 О1п О1п Ьеи Рго Ьуз Уа1 Зег Уа1 ΟΙη Ηίβ Азп Мес Рго Ьуз

Зег Ьуз Азр Уа1 ТЬг А1а Рго Рго 01п Суз 01у Зег Зег Азп ТЬг Суз 645 650 655

Агд Зег Рго Не О1и А1а Азп Уа1 А1а Азп Суз Зег Ьеи Азп О1у Зег 660 665 670

О1у Зег О1у Зег Азп Ηίβ О1у Зег Авп РЬе Ьеи Азп О1у Зег Зег А1а 675 680 685

А1а Уа1 Азп Уа1 О1и О1у ТЬг Азп мес Уа1 Авп Авр Зег С1у Не А1а 690 695 700

А1а Ьуз Азр О1у А1а С1и Азп 01у Зег <31у Зег О1у Зег О1у Зег О1у 705 710 715 720

Зег 01у Зег О1у Уа1 С1у Уа1 Азр О1п Зег Агд Зег А1а О1п Агд О1и 725 730 735

А1а А1а Ьеи Азп Ьуз РЬе Агд Ьеи Ьув Агд Ьуз 01и Агд Суз РЬе Азр 740 745 750

Ьуз Ьуз Уа1 Агд Туг О1п Зег Агд Ьуз Ьуз Ьеи А1а Азр О1п Агд Рго 755 760 765

- 49 022877

- 50 022877

<210>	28
с211>	28
<212>	ДНК
<213>	Искусственная

<220>
<223>	праймер νΚ3807

<400> 28 саССЬдЬСда адСаддрдаС ааддасаа 28

<210>	29
<211>	28
<212>	ДНК
<213>	Искусственная

<220>
<223>	праймер Р3808

<400> 29

РСадаЬссЬс ЪсссССадас РсССсСдР 28

<210>	30
<211>	29
<212>	ДНК
<213>	Искусственная

<220>
<223>	праймер Е3809

<400> 30 ссассаассс ссьаЪассаЪ ассаСдаса 29

<210>	31
<211>	28
<212>	ДНК
<213>	Искусственная

<220>
<223>	праймер Г3810
<400>	31

дадааааддд СРССадаСдд ЬаадЪССС 28

<210>	32
<211>	27
<212>	ДНК
<21 3 >	Искусственная
<220>
<223>	праймер Е3811

<400> 32 аасЬСЬаасс сассаьдс.с1; ЪЬСсаас 27

<210>	33
<211>	25
<212>	ДНК
<213>	Искусственная

<220>
<223>	праймер Р3853

<400> 33 аасЬддасас ьсддасьсса адсса 25

<210>	34
с211>	26
<212>	ДНК
<213>	Искусственная

<220>
<223>	праймер К3854

<400> 34 ссасдддааа ааасссСсдд саьссс 26

<210>	35
<211>	27
<212>	ДНК
<213>	Искусственная

<220>
<223>	праймер Р3855
<400>	35

даассссаьс ььадьасьда сассъсС 27

<210>	36
<211>	30
<212>	ДНК
<213>	Искусственная

<220>
<223>	праймер Е3856

- 52 022877 <400> 36 аассадаСда аСааааадас аааСдаддаа 30 <210> 37 <211> 26 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> праймер РЗВ57 <400> 37

СссаСССдад дадЪаддсас даСдад 26 <210> 38 <211> 22 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> праймер К3858 <400> 38 сССсдассаС саССССссСд дс 22 <210> ЗЭ <211> 27 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> праймер Р3859 <400> 39 ддаааассаа сасссасадь СадассС 27 <210> 40 <211> 21 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> праймер К3860 <400> 40

СсССдадсСд ссдаСссасд С 21 <210> 41 <211> 21 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> праймер Р3861 <400> 41 ссдсасссдд саадсссддь д 21 <210> 42 <211> 18 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> праймер К3862 <400> 42 сдСасссддс дсасдааС 18 <210> 43 <211> 24 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> праймер Р3863 <400> 43 ааСССддсса ССЬсССдсЬС дсас 24 <210> 44 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> праймер К3864 <400> 44 ааСдСдассс дСааасдссС 20 <210> 45 <211> 26 <212> ДНК <213> Искусственная

02.27 <220>

<223> праймер Г3865 <400> 45 ддСдСдаСдс аСаСааСсСС дСССдд <210> 46 <211> 16 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> праймер К3866 <400> 46 адсаадссСд сдседд <210> 47 <211> 13 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> ЗОНД РКК7(№3827)-ГАМ <4ОО> 47 асаддсаСса дсс <210> 48 <211> 15 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> зонд РЕВ7(№3827)-УХС <400> 48

СсасаддссС садсс <210> 49 <211> 24 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> «прямой» праймер ΒνΡΗΚ7, <400> 49

ССддаддадд сдссасадсс сСад применяемый для анализа генной экспрессии <210> 50 <211> 22 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> «обратный» праймер ΒνΡΕΚ7, <400> 50

СдСсаССдСс сдасссссса дс <210> 51 <211> 24128 <212> ДНК <213> Веса уиЬдагхв <400> 51 тааасдссдс дассассеаа сассассдаа асссадссса ссасасссда ссдаддасаа аадСдСдСаа ссССсааасС ссССаадСсд ссасасдссс ассасаасаа ъасссаадсс аасааасдас саасссссса ассеасссда

Ссаададдсс аадасассаа СссСаасСсС аадсссссас ссааССсаса дсадссссаа сддсдССССд садсдСсаад аасасасСаа

СсаааддааС ссасСаааСа СаССааСаад саддсссдсс садсдсдсас саассасаса

СсссСаСадс ссаСдааасС дсдсСаСсаа ссаСССасдС СсаассСаас даССсдаасС ассддасада дССссасСсд СсаааСсасд сасСССдаас дССССаСССа асассааасс

СааасаСааа саСаасаСаС сааадсдадС

СадСасасаа ССааасссас СсСссСаСаС применяемый для анализа генной экспрессии

сасассасос	ссаСаасССа	СссСааСаСС	60
аасссСссаа	СсСсссасСС	дсссаадаас	120
сССаасдСсС	аасссдасда	сасдаСааса	180
дсссссъдаа	асосдадссс	даассдссда	240
дсасддссас	дсассссоад	сссссасссС	300
Саддаддасс	сасссаассс	ъдсаСдасса	360
ссдесдсссс	СаЬаассссс	ссссасддса	420
СссССаадеа	адаасадссс	сасасесаСд	480
адСсСсаСаа	ассССССада	даасСсссас	540
адсссасдса	ааСдассада	сасссссасд	600
СсаасССдса	аСсСадСсса	СдаааССдаа	660
адддасСаад	дСаСаССаСа	асСссСдССс	720
саСССдасаа	ссссаСсааа	сдССаСаааа	780
аадассааас	аадаасаааа	сССССаССда	840
ааССаСаасС	дСдаасСааС	саааадсааа	900
дсССаадссс	СаСадсссса	дсасдасссс	960

- 54 022877

саСдсссддд	сСдСддсааа	ддСССадСса	ааддаСсадс	дасаССасСа	СссдСаСдаа	1020
ссССдсааас	сассаеассс	ГССсСсСсаа	сдаСССсСсд	аасдадаСда	аасСССсСаа	1080
дсасасдссс	асасссссда	сдсдассссд	дссесссада	ссдадссасд	дсассаССдС	1140
СаСсасааСд	СаааасааСа	ссаСсСссаа	сассаддсас	СасСссСадс	СссадааСда	1200
аессссссас	ссааасддсс	СссСССдсСд	саСсСдсСдс	адсааСаСас	ссадсссссд	1260
СсдСадааСс	адсдасадЪд	сСССдсСССд	аасССССсса	дсСсасСдсс	ссссеассса	1320
дасаааадаС	дааассадаС	сдддаСсдда	ааСсаСсССС	дСсадСССдд	ааасССдсаС	1380
сСдСдсаасс	сссаасааСС	аасССасССС	СассСссаСа	сассаадааа	ссасссссад	1440
ссссссссаа	дСасСССадд	аСаССсССад	ссдсасссса	дсдсдсдсса	сссддасссд	1500
ассддаассс	дссасасасд	сссааддсас	аСдааасаСс	СдддсдадСа	сааассасдд	1560
адСасаСааС	ддадссСаСа	дсСдасдсаС	ааддаасасс	асссасссдс	ссаассссас	1620
саддсссада	аддасассда	дссССдсСаа	дсдасасСсс	аСдССдсаСд	ддСаддаадс	1680
сСсСсССада	дССССссаСд	ССдаасССад	сдасдасссс	аСсСаСаеаа	дсссдссддс	1740
саадсссдас	сассссссса	дассСаСссс	СаСадаСсСС	даСссссааа	аСаСасссдд	1800
едсссссдад	дСсСССсаСа	дааааасаас	СССССаасса	ССссССдасС	дасСсаадса	1860
сдддаасдсс	дссссссасд	адаадсасдс	саСсСасаСа	саадассаад	аадассаСдС	1920
сассессасс	ссссссессд	Сааасасаад	асСссссссс	аСССССаада	ааассааасС	1980
ссссдассдс	сссассаааа	сдаадасссс	аасСссдСда	сдсссдсссс	аасссасааа	2040
сддасссссд	аадсССасаС	асссСсссад	дассссссдд	асссасаааа	сссСссддсс	2100
дСдСсаСаСа	сасаСссСсС	сссаадаасс	саССсаадаа	адсддССССд	асаСссаССС	2160

дссааасссс дСааСсаСад ааддсддсда ГсдсЬаддад ГаСссдаасд даГССаадса 2220 сддесассдд сдааааддсс ссдссасадс сСасассаСд аассСдсССд аасссССССд 2280 саассаассС СдсСССдСаа ассСдааСаС СассаСссСС дСсСдССССс асСССдаааа 2340 сссасссдса ассааСаддС дсдаСсссас сдддсааасс сассаадссс сасасссдас 2400

СССсадасаС ддаСдссаСС СсддассСса сддссссдад ссаСССССсд дадСсССсас 2460

СсаСсааадс	ссдсссдсаа	дсадсаддсс	ссСсаааССс	саааассасс	аСсСсадаас	2520
СССсадссаа	саадаааСса	асааассСсС	СддССддСаС	ссссдссеса	сСадасССас	2560
даддддсСдс	аасаддадаа	аССССсССсС	саасааСаСд	адаасссссд	сасдааССад	2640
аССсдадСдд	дасаасадда	ддССсдСдСа	сдддаСдсас	дСссСссаас	асССддСсад	2700
ссасдддада	адассссссс	аааддаддаа	сСасССсаад	сссаасаСсС	ддсСсГГдСд	2760
СсдССдСсСс	саасасадда	СдаасСасдс	ссаСССдССд	аСсССсссда	асССсССсда	2820
даааСасасс	асссссассс	дсссссссдд	аааСааааСс	ссссссеааа	аадасассас	2880
дасдадсаас	ааасаосссд	оссссадсдс	даССдСадаа	дсаасадссс	ссддссссос	2940
ССддаСаасс	сасааадааа	сасССассСд	аСССаддддс	дадсссассс	дааадсааас	3000
дссссасаса	аассСсасас	ссссаааСас	дсадаааада	саадсссдда	аессссссас	3060
СссаСаСсСс	асасддсдсс	ссасссассд	ссСССдаСдд	адсссСаССа	адСдСдааад	3120
СадсадссСс	дададсасас	ссссадаадд	асассддаад	ассадсаааа	сСсаСсаСад	3180
ассдаассаС	аСсаадСада	дсссдасссс	СссСССссда	аасассаССс	аассдаддсд	3240
ссссаддсдд	адСдадССдС	дааадаассс	сасаасСссС	саадсдасса	ссааассесс	3300
ддсСсаааСа	ССсассасса	сдассддасс	дсадСдсССС	дассдссссд	ссаадссддс	3360
сссддасссс	ассссддаас	СсСССдааСС	ссссааасда	ссссдассса	сдесссасса	3420
ааСадасаСа	СссаСаСсСа	сССаааСсдС	ссдСаааадС	ааСдаадСаС	ссааасссСс	3480
сссСадсССС	СдСдсСсаСС	ддСссасаса	саСсадСаСд	сассаддссс	ааСадаЬсас	3540
сдассесссс	асссСССсса	дСааааддСд	асСССдСсаС	СССасссаСС	ааасаСдаСС	3600
сасасасасс	аааСддсСса	аадСсаааад	аСдССадаад	ессаСсСССа	сдсаассссс	3660
даасдедссс	сдсдСССаСд	сдссссааас	дасааЬдсса	СаадСаадСа	ддаССадСаС	3720
сдсССдССсС	аСдССССССд	ссдсссасдс	СааддасаСс	СССдСсСаад	СсЬаддГааС	3780
аСадассаСС	адассСсССа	дсадсддсаС	аааасассда	аССсаааСаа	асададааас	3840
аассссссСс	ааЬСдЬаааС	даааасссСС	саССаСссаа	аасаддааСа	даааГааГдС	3900
ссссддсаас	адсаддаасд	саасаасаас	сассаадссс	СааСаССааС	ссадааддса	3960
ааддСадасС	аСаадСссса	асСдсаасдд	сддсаасссс	СдсассаССС	ссаасСсдса	4020
дССссассСс	ссесссадсс	ааддссссас	СссССсССад	сссссдсаса	ГГсдаадсаа	4080

Сдкдадааас	асаассддка	ссааасассс	аадаадСада	СдССдсСааа	ССааСдСсаа	4140
кдасакадаС	асскдаадаа	даадссосад	ассссССакс	сССсаадСас	СССдддсадС	4200
касдскксса	аСдассСаСС	СдаСсасаак	адаадсаскС	ддсаСССдсд	дссасссссд	4260
дскСкдсссс	СдссСдСддс	ккаасадсад	ссссадсддс	аасССдсССд	сссссасесс	4320
дскккккскк	дссадсссаС	ксскксккаа	аасссккСкс	сесСкдаасс	аСаадаасСС	4380
сскксккадд	Сдсаасадкд	акдккккдск	сддсадъсае	дадсасссса	СдсаасСсад	4440
саадддсссс	сдасасссса	кксакаССда	ааССсааСсд	ааасдСаССд	аасссссСас	4500
даадСдадСд	садаасдасд	ссадСадсса	асСсССддсС	аСааддааад	сссаассссс	4560
ссасддскСс	аааасаасса	ассассссда	адасаСдадС	ддсдассддс	ссдсссссаа	4620
скаасдааса	сСсаадааСа	дссккдкдад	СССсаСассС	сСссаСссда	дсССдССдСС	4680
дааасакддС	ссссаассдс	сддакааСдс	СаСаддсакс	саадсСкдса	аассСсСССС	4740
дааддсккдд	ССссаСадсс	дссадсасаа	ддсаадсаас	аассассдас	сСССссдсаа	4800
сддссССаСд	ддсссссссе	СсадсаСсад	Сададдсадс	а^ссаааасс	дддассддсд	4860
СССсаадаас	аСссСсСсда	сссссддасс	саадаасаас	СсССадаССс	сссссссаас	4920
сааддаадСС	дССсссдССс	ааСССаСссЪ	ссссааддас	сдааедсаад	ССааааддсд	4980
ааккаккдкС	дССассадас	асдасасеса	саСадаадаС	дсааааадСа	СаадСаСдСС	5040
СаСсаСааСа	дсССССааса	аассссааас	асЪЪСааааС	аааадссасд	сасССдасса	5100
аккккаасдс	дссссссссд	ааСсаадСдд	ссссаадакс	ссассаааса	сдасссасаа	5160
дкддасСССд	дссСсаасСС	аааассаадС	есааааддса	адСааасСсс	сссассаасс	5220
асаасаассд	СаасссССад	ССааСдддСд	аскдесаадд	СдаССасдсс	сссаддсаад	5280
даадкСассс	асаасдссдд	ддададссСС	сссаасссеа	дасададсаС	дссасссааа	5340
сасааааасс	сасааасссс	дсСасааааС	ссаааассдС	СССдаСдаЪС	ссдссдддсс	5400
ааассааасС	аааскСдсаа	аСССсддааа	сссассссас	ССадсссаад	ассдааадса	5460
аСасСсСдсС	ССддсадаас	сСассасСаа	сдассаадсс	ссадсаддсд	сссасссдда	5520
асадсааааа	сссааСаССС	СаСССааддд	ассСаадеаа	аССаССаСдс	сдасссаасс	5580
дсСадСдаас	аСССаааСаа	ССаааСсаса	адсасаасаа	асССадааад	сасссаааад	5640

саакакккаа	аСдсаСаааа	ккааакасда	ксскадкакд	дсссскааас	скааадаска	5700
скскккаада	сСсссСкдкС	даассассак	ддакскссак	ссккдкдскк	сакаддакаа	5760
даккдаакса	ссакксккск	каккаакаск	кдаакааака	ккккккдааа	ккакаааска	5820
аааааккаса	ааааасасса	асдакдсдка	даксдкаккк	адаккасааа	аакасаккаа	5880
сдакасдсак	аксдкакСкк	скакссаадк	кккдддссак	аскадксасс	дсакдсаккс	5940
акаакаксак	асасасаааа	асакдсаккк	кааксааска	ккаааакааа	ккаксакдкк	6000
ккаасааскк	СаааасаСаа	каасассакд	аадакккаак	сасасаккаа	аСсскакддС	6060
СддСассСЬа	адасаааакС	кааксакакк	адаакЬЬсдк	сксасааадд	сСЬЬааааСа	6120
ССааСсСаас	аааСССааЬс	акаССаааск	Сааадааааа	СкааадсааС	Сдкаддсасс	6180
асаСаСааЬС	СааСсаЬаСС	ааааасаааа	асккаасакд	акдаскаасс	асаСааааад	6240
ддсаСдааад	аассааксаа	скаккаакас	каасаасска	асакдкаакк	аасаксакаа	6300
аааааСаака	аСадССаска	аскссккадк	аасссссккк	ааааССаасС	адксааССак	6360
сасасаСааС	Сааскаакаа	ааккааадск	саккакккаа	СксааСкакд	асСкааакак	6420
ааааССааСс	ассакСаакк	аакккакккд	саааккддаа	какасксааа	аасаадаааа	6480
адааадаааа	аааааааааа	адсаддсСдс	сааддсадса	дкдСасаскд	ссассСсадк	6540
дссддссасс	Сдсдсдасса	ссадааасда	ссадаасскд	ссассдсдкс	дскддссасд	6600
дсдассадса	ссддсадсас	кдсадсдсад	дсадсаддсс	дсдссаасад	садсдсссад	6660
сдсаддаадс	ссдсдссдсд	сдадссасса	сдасдссддс	сасадкссдд	сддсасдсса	6720
дссассаСдС	сддссдаасс	ссддкддасс	кксссссСкС	сссСССсааС	СаСсаСсаас	6780
ссССдСдсаС	ааССдааСда	аадккасаас	аааС Сдаккк	ддддаааааа	ССадддСЬса	6840
СаСсааСССС	дкСССааааа	ааатсаСдаа	сСаасасааа	ааакскдака	ССССдСдакд	6900
кдадакккса	аккккдадка	каакакакак	ккакакакак	асаС«ааааС	ссааССкСЬа	6960
СдСкСссаас	саакСааСаС	сакаакакса	аккакдсааа	кааакксака	какааадссс	7020
СсссССааСС	дааккааааа	акдааакааа	асакдсакса	асакдаксак	аккаакскак	7080
дсааСаддсС	ааскдакасс	аскдкаддаа	сккадакдса	каакдсддаа	ааксаадкак	7140
слааСасесд	касаксеаСс	ссаадаксак	кдсакааакк	адкакдаакс	ааасааСадк	7200

- 56 022877

асадаассас	ассСССдаСд	сдсасдССсс	СсССдСсасс	ааасССсСад	сддадаСсас	7260
сССадаасдС	саадсдссдс	ссссесаасд	ССддСссасд	аасаасасСС	ддаСсассас	7320
дСаСдсСадС	асддаадада	дааааасасС	сСсССасССС	Сдсддсдадд	дссдаааасд	7380
адСдсдаааа	дасСааддда	ааааСсадас	ССССсасСсС	адаадССдСа	ааадсдсаса	7440
СссассСССд	СаассссаСа	СсааСаСаСа	аддсддссас	аааададдсд	ссссасдадд	7500
ссссассссв	ссссасаасд	ссасасасса	сдадсссаас	ааасссасда	дССасаасСс	7560
ССсссаСсса	СсаСсааасс	дсдсаассса	СССсасааас	ддасссддас	аааСаСссаа	7620
дСдСсаССас	ССдСдСдасс	СсаСаддасС	саасдасасс	адсадССддс	ссСааСсаСа	7680
ССадСссаас	ааассасааС	СадсССсСад	саааасдССд	СдаСсаСсСа	аСаССасСда	7740
аСасаССасс	сссасаасес	ассссаасас	сасссадссс	ассасасссд	ассдаддаса	7800
аааСссССса	сааасдсаса	сддсссдасд	сасаасааса	ъасдадсдса	сасссдддса	7860
сссссаасда	СсааадСааС	дассаСсадС	дСасаССдСд	аСССаСссСС	аСССасдССд	7920
дССдсддСас	сСССССаССа	ссассассад	ссссасссас	адССдсаСдС	асаСдсасдС	7980
ассСадсаСд	СасасСССдС	Сдасасесас	дСасаССаас	сдддссаасд	ССасааССаС	8040
дССдсСаСдС	дССдассССС	сдссссааса	сСсдСаССда	дССССССССд	ссссдсссдс	8100
дСссаСаСса	сааддаССдС	асСССддаСд	сссассассд	сссассдсдс	дССаССдасд	8160
аССССаСддд	дддаСдСсаС	сдсдеасссс	дассссдсса	аедаасаасс	асдаадссаа	8220
дааСдСасаа	адааасасаа	СадааСаааа	дСаасссааС	СссСааадсС	даСдСсаадС	8280
дадСааСССд	сааСсСССдС	асассддедС	дссдасдссс	дЬСсдсССаС	даааССсааС	8340
асдсасаасс	аСадСсаСаС	ассСсаСадС	дссссаддСд	ссасаааааа	аасссаасас	8400
дддсассааа	асааааддСс	аасасасаас	аасасдассд	саасссадсс	аасдсасасд	8460
ааСдссааса	аадСдСасаС	дсааддСасд	сдсаСдсаса	сдсаассдса	сдСддадсСа	8520
аСааСааааа	ааддСассдс	аассаасдса	ааСааддаСа	ааСсасааСд	СасасСдаСд	8580
дссассассс	СдаСсасСда	аааСааддас	асаССассдс	седассдаас	дсссассдда	8640
СаСдасссаа	СдСасаааСа	ССсСадсаад	ассдсссаас	сассаадссс	даасдсасаа	8700
сдссдссасд	асСдааСдСС	саадССаССС	СаСададсСд	ассссдсссс	дсдсасасса	8760

аадСЬдсдСС	ааСдаСсаСС	дСдсаСдасС	ааасасасас	садссссасс	аасасдсдСд	8820
саСаасасаС	СсСаСадаса	сааас аааас	ааааааааас	СсааСаСддд	СасСадаССа	8880
аааддссаас	асаСаасаас	сСдаССдСаа	сссадССааС	дСасасдаас	дСсаасааад	8940
СдСасаСдса	аддСасдСдс	аСдСасаСдс	дасСдСадаС	ддадссааСа	аСаааааааа	9000
ддссссасаа	ссаасдСааа	СааддаСааа	СсасааСдСа	сасСдаСддС	саССассССд	9060
аСсасСдааа	аСасссаааС	дСасасСсдС	аСаССаССдС	асаСсааасс	аСаСдсаССС	9120
дссасассаа	ааааадсссс	аааааСдсаа	аасадааааС	ааааСсаааС	ассдасассс	9180
ддааасссас	ааСадаааСд	ааСаааааСа	адддадаааС	аааСдаадаа	сааааСаааС	9240
дадааадада	аССааааСдд	ССсССдаааа	аСаааСдада	дадаааадда	дддааСдадС	9300
дадСдаСдад	ададааадад	ссддсссасС	сссааааасс	сСдссаааад	сссдссаааС	9360
СССддсссСс	сСаааадсаС	саааасСасд	садссссддс	сааддСдСад	дасдсссаСс	9420
ссасассСсс	дСдсаддаСс	СаааССдсдс	ССадаааСад	ддСсСссСаа	СаСССсСеСа	9480
ссадеасссс	ССдсасдсда	сдсдсдсссд	аасссссссс	аадаСадааа	сСсдассссс	9540
сссдаедсас	дсаааадсса	ааасссааас	^.ссадасаса	сааадсаСаа	ссдсссссад	9600
ССасааааСС	сааееддссе	адсссссдса	асссдадссс	сСсассадСс	сссссссссс	9660
СССССССССС	ССССассесс	ааадсеаааС	Сссаедааса	аааСадаааС	СССаССдааС	9720
ссасссасда	с ССссааСаС	СасСсссссс	дасссааааС	асадссссса	СССсссСССС	9780
ССсасддсаа	сссасдсааа	еадаасасаа	дадддасадс	ааадассссс	сдсссассса	9840
ааСаааСдСС	дСаСдддааа	адаСдаСССС	аддададааа	дСададааСа	аССддСдааа	9900
дадсассаас	СдсаасаССС	СддССдааса	аасаааддаа	аааасааааС	ссаадаадса	9960
ааСаааСдад	ааССдСССсс	ССдааСааСд	саааадСддд	ссссаасссс	сааааСаСдс	10020
ссаааааСаа	аааааССссс	сдсдСассдс	ссасдсаада	сддсасдсда	даСССССССС	10080
СссСасССса	аСасаассдс	СасССааадС	адсддсссас	сдассссссс	ССССаСсСас	10140
ССаддсаааа	ссССддсдсС	дадСдаСаСа	рсссдссасс	ссаадсадсд	аСССасСдаа	10200
асссссаасС	ссаСадСССд	аСаСдСдсСС	дсаасаСССС	дсссаддСаа	ассдсСасСс	10260
адддСадсдд	сссасдсдса	сааассдсса	сссааадсад	сддСССаССС	СаасаСааас	10320

сасСаССдСд	адьадсддсс	СасдСдддса	аааасааааа	ааааааСадС	сссссдсдсд	10380
ссдСссСасд	ьддасддСас	дсадддааЬС	ссссаасссс	СдддсаСаСС	ссдддаасСа	10440
ааасссассь	ЬСдсаСЬаЬС	сааддааааа	асссааасаа	асдасдддас	асддСССССс	10500
СадасаааСС	асдааааааС	дСддаасЬаа	асасдаааас	ддааасСаСа	СССЬдддаса	10560
сссааааСдд	аааЬдддаас	саьассссдд	дасддаддда	дСаСааСССС	ссадссдасс	10620
ъссдаассаа	дСаСасЪасС	ссасасассд	ССаадааасС	ддасасссдд	ассссаадсс	10680
аааСССССдС	дадСаСдсаС	СдасдССдЬа	дсдсассддс	сдсадсссдс	аадссаассс	10740
ССдССЪССдС	ааадсссасс	саССЬдадСд	асссдсасаа	СдСаааССаС	дсаасссеаС	10800
даССССадСС	дасССдСдад	ЬдаССдССаС	аасъссассс	ссассаеъсе	сасссдаасс	10860
ьсссъссддс	ссдсасдьда	асссдсаасс	Садаааддса	ааддддСааа	аСадСсСсСС	10920
саССсдддаа	сассасадсс	ссссСссССс	ссССаЬаСаа	СааадаСдаС	даСдаССССС	10980
даСааСааСд	асссдсаадь	дааССаСдСд	ааСдССЬССд	СаСдСаССда	сдСсссадСа	11040
СаССадСЬСС	адсссдсаад	ссаасссссс	СдСССССдСа	аадСССсссд	ассасссдад	11100
сдасссссдс	даССЬССЬдЬ	даССССсСса	ассссасдад	сдасссдсаа	адСССсССда	11160
сасаадсдас	ССсСдадСдд	СдССдааССа	аСССссддСд	дсСССдССад	аассссаССС	11220
садЪаЬЬдас	аССЬсССССд	СааСССадаа	адддаааддд	дддСааааСа	ддсаСССсаа	11280
ааааддасас	саССдсСссс	сссССсссСС	асдсаассда	дасассссаа	аадааСассд	11340
ададсссссс	сссасааадд	адсасссссс	ссаааасссс	ссссасааад	дадСаСССаС	11400
садсассаад	ССдаСССссс	ааассассас	ссССдсдсаа	аССдсаСааС	ддадасаССС	11460
ддсдссдасд	СдСдааСаСд	дддссаСааС	аасаддаддс	сааааасааа	асСасааддд	11520
ссаааассдс	сасааСаССа	аасаадсаСс	СсасаССсСс	асСддСсасС	ссссссьаае	11580
сСаССаааад	аасааасссс	саассссссс	сасаассьда	сасдСдСсда	асассдаъсс	11640
асСдадаСса	ассеадаесс	ссссссссад	аессьсссдс	ссссссадса	садсССЬада	11700
ссссаассьс	саСдСсадса	аадССассСС	асдСдСсаСс	сСасдСддсс	ссссссссса	11760
ссссссассс	сСссасдСса	асаССССссС	ссаааассаа	ааааСсаССС	ссссассаса	11820
ЬССасССдаа	сдсасасаас	аасдсссасс	дассССсССс	сССадаасСа	ι СсЪОСССССС	11880
СсаСЬддаас	сСсааааСса	сссссасссс	аСССсдадаа	ааддаааааа	аадсасаСсс	11940
ссьссдаада	ССааСССдСд	даССаССаСС	дадсССсаСс	дсаССааааа	асаСадСааа	12000
адССсСССсс	СсаСССдСсС	ссссассеас	осаасссссс	ссадсдаада	асссСааССС	12060
СдСССдСдаа	сссссаадсс	саадссссда	СССдддСаЬС	ССССССдаСд	аааСССдСдс	12120
адсСдЬадда	СдЬЬаСсдСд	сСдадаааад	ддссссадас	ддСаадСССС	ЬССССсСССд	12180
аСССсСсСсС	ссЬасССССС	СССССдСССС	дссссадаса	асассдссас	дасасдасас	12240
ааадааССдд	сдасссдддс	адсссассса	асссаСдаСС	аСдСдССаСС	СдССССдаСс	12300
СССсааСССа	СседдСдсСд	сдСдСаьаЬа	сдсьссдсьь	ССсССсаадЬ	асСЬддССаС	12360
сассдаадсд	ддсаассадд	аасссдссас	саасссасдд	аСССдддССс	сдссдсдась	12420
аасссассас	адасъсдадд	сссаасссас	дссссасадд	ССадаааадд	ааассаасда	12480
ЬССдСССдСд	даСССдадСа	даССдСССдС	СадСдСдСдС	аСдаСдаСаС	СаасССссас	12540
СаСЬсССссс	саааССаддд	дСааССдаСд	дССССССдса	Сассдааддс	дсаССсСсСС	12600
сдаСдаСдда	дСдаССдССд	аааадасаСд	аСдддССааа	дССдсаддаС	СаСССсаССС	12660
саасааасас	ааССдаСсаа	сссддасссд	ссдаасдадд	ССдасСсаса	аааасдаада	12720
СдддсссддС	дСЬдссаадЬ	сддСддсада	дсССааСсаа	саСаСадССд	сСдСдааааа	12780
адааддСадд	ддсадддссд	саддсдаадд	дсаддддссс	ьссдаддадд	асдаасСдад	12840
аассассдад	дасддСдаад	аСдсааасад	саддсдсьсс	ссдадссссд	сссадссссс	12900
адССсасасс	сасаддсаЬс	адссасаадС	асаассссад	дддададСсС	дссдддадад	12960
дССЬсСсссС	дСЬддаЬсСс	сСааддСССС	дсСсдСадаа	адСдаСдасС	саасСсдСса	13020
сассдссадс	дсСССдсСас	ддааасдсад	ссаСдааддс	дасссдассс	дССССааСсс	13080
сасасасдса	асдссьсдсс	сССаСсассС	асССсаасаа	аСдаССаада	дааССдСасС	13140
сссссдЬСсс	ааааСааСад	саасасССад	ссССсссдСа	дасСССаддд	адедсссддс	13200
СсаСаССаЬд	дсаСдддССС	ддаассадда	асдааассаа	ддСддСаСдд	ддССддаасС	13260
СдаЬасССаа	сассссдсас	ссддссъсае	ССаддааСда	аааааСССсС	есласесдас	13320
ассСададдС	ааддсасдад	ссасасссас	сСссссссаС	дддСССсСаа	ассссаСасс	13380
ссасдддесс	даддСаСддд	СССааааССС	аааааСаадС	сааасаааса	сСаддСаСдЬ	13440

десссдссса	еессааассс	асассесаеа	ссеаааасеа	дсдаассааа	сасссссееа	13500
аддаСсССдд	дасаааддда	аессаееасе	адаеседдсд	асаееааСас	сеаадеееас	13560
аесадСССса	сссаааессе	есдееесааа	аааадеаааа	ааассСдееа	дсседадеаа	13620
дЪССасСаас	есссдеесса	аааессааса	саССаСсеас	аСдсаадсас	ееасеадСас	13680
ааСасаасСс	ааасааеаСа	едсаСссСае	сСдеесасаа	сдаассдааа	асСааСсеье	13740
ьсаСасссее	дСССдаСдсС	СССССсаддс	саСасаааее	есСССаассе	аааССдссСс	13800
сСсадЬсасЬ	дсссаааасс	дсадееъьаа	саессесаад	ассаедедаС	деасСдССад	13860
аССаСаССаа	дасссеасед	еаааеааадс	аСдСаСадСд	дааеааааСд	саедесССсс	13920
сасссссесе	СдддддСсаС	даасСсаССд	сеедасаеъе	едсадСЬдСа	ддддедссаа	13980
аеддсаъада	адсаСддааа	аСсСЪадаад	аСССдадсаа	есадаеедас	ссадсььеаа	14040
седаддеаде	сасаесадда	сесеседдса	еаддесеьсе	дессаадаеа	аСдадСсаса	14100
ааадсЪдсса	даасассссе	десаесадед	адсесссдсе	ссесдесдса	ееадедеаед	14160
СЬсСдСаССе	дасъсссссе	сееедСдсаС	аСсесдссее	десъеесаса	аееаеееада	14220
ссссадаеда	аааедСаеас	есаееесасд	дСсееСадсС	дсаасаСССд	аееасессде	14280
дСдсадСдаС	десаесСсаС	даеесдаедд	дсесадьсье	ааадСдсССа	Сссаадддсд	14340
сЪдССдасСС	СсСддСдаад	ссСаеаадаа	аааасдаасе	сааааассее	еддсадсаед	14400
ессддаддад	дедСсасаде	деаадСдСсС	ееасассесс	садсьеъсса	ссадсееаде	14460
ддсссдсдса	дсадСсССЪс	аааеьеесда	ассессеадс	асаЬаедаса	ааеъааассе	14520
дсаСдсеаае	СсссдаССад	аеааеддааъ	аадсесееес	адссддссее	ееассесесе	14580
сСсССсСссС	сССаСдаааа	аседдеаСдс	сасСаСдсае	сеедСессад	дедееедесе	14640
адСдССесСС	СссСССаССс	дсеъссееде	еьееаеессс	аасеееааес	ееаасссссс	14700
сСсаСССССС	есесадссса	дсддСадСдд	аадсдааадс	СдСдеаадда	аСддааааСс	14760
саСаддаадс	аададддс ед	аададСсдда	сааСдасасе	дасаесааСд	аддаадаеда	14820
Саасадаадс	аседдеесас	аадсесддда	еддаадСдас	ааеддаадед	ддасссаддС	14880
адСдсСаасс	сседеааЪае	Сааасеессе	аеадЬаддСд	еддееааСде	дасдсСдееа	14940
аддссССССд	ддСддССдсС	есСадеесас	СааддаСааС	аадаааСадс	СсдсеаССда	15000

еадСЬадддс	ассссааеае	сасссссЪсе.	СдСаСдСССд	ССдаасСаса	ееессадсса	15060
дасесдадеа	ССССаессСд	ааддасадаа	саддСдсаСС	СССддседсд	дССдССадСС	15120
десаседееа	СдсааадасС	аЬСдссасса	ССССсесаса	саЪасъеаас	аСддаадедС	15180
ссеаассасс	ссссаассса	аааааеддда	дддадааасс	аседдадасд	ддааадаадС	15240
еасаеааааа	дССадСсдСС	СдддСсаеда	ссдеьсдссд	сасссдсааа	дсеадсдсдС	15300
сссссссссд	дасдссесаа	аасаадсСда	Сдсассаеаа	адсассасес	ссддссссас	15360
седееддеде	ддасссаасс	аасдСасссе	СдССдаСсСс	дадаСадаса	аададдаадС	15420
ееаасссссс	сссасасдсс	ассСсесССс	аасссдесад	садссаедес	ессессдсдд	15480
асае ССадаа	сссаедССад	дССсаСаССЬ	аСадССаддС	даССдеаСса	аааССдссае	15540
сасааеааас	адаасаесаа	ееесеассдд	дааддаССса	аддаСсаааС	аеасаддааа	15600
дадсадСдСа	ддадаСаСса	есседеедаа	саасаааада	аасаССааса	СсааседдСд	15660
аъаасссесд	саадаседда	Сдасаааасд	аддадСсдас	сеаасаеааа	асааассддд	15720
аасСдесадс	саеасссЪдс	аъаесаадаа	СддадассСС	саадаааадс	аадассаеее	15780
СССдССддда	адСсаадсса	ссдссссаде	ССссесдСда	аасесадсес	ассссадсее	15840
СссесСасса	асаСдааССс	ссесссссее	садсссседс	ааасесддсе	сеаСдсСаае	15900
СаСсадСдСС	СссССсаССС	адСасдсСда	дадддсссас	есддеедаес	ааадааСасС	15960
СдаСдассее	даддеадасд	сссеасаедд	адаадССссС	сеаадедЬас	ааадааСсеа	16020
дсссдассаа	сеседаесса	ддаададаСа	асасдаСсас	сесдСддСсС	адасСседда	16080
даддесааад	Сдедсаааад	ддСассееед	ааадасааед	дсССдССдаС	есаСдасСда	16140
ааССддаСдд	СсдСдасСда	дсасаеасеа	ССадСддсес	есесссаадд	сдасасаадс	16200
асдсдаеаас	ссааСссСде	асаьссссес	даддасаСса	аесдсдссас	СаССсСаддд	16260
сдседдадас	ссаСасаСае	ададссассд	асаасеааса	сааасессаа	ССасСЬаССС	16320
ссаесссасе	СаадсСаСса	аСсссеаада	аададсссаС	ссаадсессС	дсессаддед	16380
саСссссесс	сесессадсс	адсдсасааа	аааСдаасЬС	СсдадаСада	ссдссаааес	16440
СдсСССдСса	адаадасааа	аССССдаСас	асааседеаа	ссдсаееееа	СдасасССас	16500
дседаСаСаС	седсаадСда	адССдаеаед	сааааасСае	дсадссессе	СсдСсСасдд	16560

- 59 022877

саасадаСсе ссдссаасдс дасдсссдсд сдссассаса ааасдасась дддЬсЬСЪад	16620
асссСдссас сссасадссд ааддасссса дссЪСддсаС ЬСаСаЬсссс сссаЬссааа	16680
адСЬаааааа адсддассдЬ СЪдасссаЬд Ьааддааааа ддаааддаас сдадааадас	16740
аааддадддд ааадаадССа ааСсСссСаа ааадсССдСС ссдСдсддСд адададддад	16800
сдасССдааа ССдссаССда СдаСдаССдд ССсасааССд СааСсдаааС сааасСсасС	16860
сссСсссСсе сссесссссе сассассссс сссааассаь аасассасад ссссссааас	16920
дСдасСдССС сдддддаСад СдасСддСад ддаСдддсаа дддСсдддСс сддсСддасс	16980
ссадасссдд ассссааССС ССССССдСад асссааассс ддассссаад ддсссдаааа	17040
аассддассс Сдасссадас ссССадддСс СдаадддссС ададддссад дадддессад	17100
дсССаааССС сссассссдс сааассссса дсассассаа еаесаасааъ сассъдааас	17160
СсдсаСдааа сааасасааа ааааааСсдс аСдаассааа сасааааасс сдсасдааас	17220
ааасасСаас аСаСаааССд ааааааасда аасааасаса аасССаСааа сдаааааааС	17280
Сдааасааас асаассссаа асаСаСааас Сдаааааааа аасдааасаа асасаааСаС	17340
асааасСдаа ааааадаада аасааасаса асССасаСаа дадССсадаа СдддСдССаС	17400
адсссасдсс ссадссассс адаааассаа СССдСССССС ССССааадСС ааааСдСаСа	17460
СаССаааСаа дСССадддСс сааддСдССд даасаСССаС адддсаасдд дсссдааасс	17520
саСаСдддСа сдСассадаа даддаддадд сосадсасдс ааааддССад адсдсассаа	17580
дсддсаасаа сдсдсасСдС саСассааСд ссдсдадСсд сдасаддсдС сдсдддСсдс	17640
дассадсдсс СсдсдадсСС ссСсдсаСдС сдсдасдсдс сССсСдссСС ддааСдсдаа	17700
ааааСдссСс ддсддССССа СаСссдССдС даСдсСССдС СдаСсаСССС ааСдасСССС	17760
ааддСсСССС ааСсадСада ССаааддссС ССдаСдадСд аССаадаСдд дддССаСдСд	17820
аССаассСсС сСадСсаасд аааСдССдас СаСдсССаСа Саасссссдд аССссСаСда	17880
Э^даддадЪС адаадаааас садааССССс сасаессссс саааадссСС сССдсССадс	17940
ссаададааа ссССдсааСс ЪСсСсССдад СдССсССсас ааасасаааа сасаадССсе	18000
СдССдаССса сССадаадас сассСаадСд даССдСССсС сСссаССдСа СсСсасСадс	18060
сассссдсдс СаасссддСд аСссСададд ддсдааасса аассаассдд ааадсдСадС	18120
ссссдсдсес сддадСддда сасссддссс ссссассдас сасаадссСа асасаадддС	18180
сдддСседдд СссаааСССС аадасссдда сссддасссс аааааассса сССддассса	18240
дасссддасс сддасСсССа дддСсСдааа аадССддасс сааасссССа ааССадддСс	18300
дддСссааса дддсссдддс адддСсССдд асссаСдссс аСсссеадсд аССдддСадс	18360
ссассдсада асассдадаа сдсааСаСаа аддддсдссд адааададдд ссссдадсдс	18420
аССдСССаад ааадССддда ааддааСдад адаСдаадСа садаадаааа сдСсСадааа	18480
дСдаадсаСд ддадСсСдСС ссССССсССС ссссСааадС сСсссассаа аСдСсссССа	18540
адСддССсад ссасдссССС ддасаадссс ассассаадс СссссаСссс адаСсаСаСС	18600
Сдаассааас аСсСССсССС ССССадааса СССССССССС дсдсасдааа дссааССсса	18660
сдадасасдс ассССаСаСС СсСсСаааае аСаСаааСаа ссдасдаадс ааССССсада	18720
ссассадаса адсдссссас аааадаасса ессССССССд сссссССдСд сасссддааа	18780
аСдСадССсс саСаСаСааС сссассаСдд садСассСсС асадассасЬ аадССсССсд	18840
сССдСдсаас сЬасадСдса СССаададдд СССаддСаСа дасадссССс ассссеаасс	18900
ддссададСс СассСссадС аСсасСдаса даасссссаа саддаасССс сдСсаСаасС	18960
Саасссдсад ааадсасСаа сСааасаасс ссесадсссс ссадссаадс дсССдаССдд	19020
СсасаСссад сССССадССС ССадСаСдда даСССаСааа дСадсаСдас ССдадССдаа	19080
СадсдаасдС аадаССадас аСаСССаСаС адСсдСдССа ассссддааа сСдасаддад	19140
сдассадааа ссасСССССС сдСдСссааа асссссасас ассдсссссс ааааааасСд	19200
сеаааесасд асдаСаасаа асааасссса сасаддСасс ддаасдасас сдааасааас	19260
сдаддССадС даСаадссаС ааСсссСЪас сССдаааССс ададдсСдСс ЪдсСдсадСс	19320
СсСаСсаСсС сессасссса сСаааСсааС СаССассСдс ССсаассСса асддСссдад	19380
дсссадасас СдСдСсСССд аСадСаСсаС сасадссдаа ааССааСдСд СасСССсССс	19440
СаСССаааса ссасссдада дсдсссссдд СадСсаССаС дааСдСсдСд адаСсасааС	19500
ссдСдаааСа СадССЪСсаС сасаССсССа ссСдсаСдСд сааддаааад саСадсдССа	19560
дСдССсааСс ССССдсСасС СсСддСдасС ддСсааСддС сааадСаСдс адсаСдаСЬС	19620
СдЬдСЬсдСс адСССсССсС ССаааСаадС дСдаасСдсС ссадСсСаад сСдсСсдаас	19680

- 60 022877

СсССааааад	СдССддасСС	дЬСадССдСС	асаСдСаСас	аасдссдаьс	зддсдддссс	19740
ссссасасас	СаССаСаССС	дссдаассас	аасдаадсас	ссаСССссаС	ССдаддадСа	19800
ддсасдасда	ддССадсадд	дадСССдадС	дССаааддСС	аСдСдаадаС	дСаааааССс	19860
асСдасааСд	адасссСадС	асссдасддь	сддаассъса	ссааССССаС	СдссССдССа	19920
ссСЬСссаСЬ	сссасссадс	асссессссъ	еасааасссс	СдСдаСсСад	адССсаСдда	19980
сааааадддс	сдсадаадсс	дададссссс	аассасадсс	СасаСдддад	саадсаасСд	20040
аСссассЕда	СадсасССдС	дсСсаддСса	СССаСссааС	дСсСдаддса	сссдссадса	20100
дсСддаСдсс	сддасссасд	саддаасССд	аСддасадда	СсаСсааСаС	ддСаСдСддС	20160
ассдсасссд	асадаадсса	сааСаасдСд	саааесдааа	ссасССааСд	ассСадСаСс	20220
саСссдсаСс	адасааСдСс	ссааСдддаа	аддаСССдда	дассддадса	ссСадааССС	20280
садасссасд	дссааасдда	ссааасаааа	сддССаадСС	адсаассасс	дсСдаддааа	20340
ассаасассс	асадССадас	сСсаассадд	аааасдасдд	СсдаадСССС	даСдаадада	20400
ассЪддадаС	дааСааСдаС	ааассСаааа	дСдадСддаС	СааасаддсС	аСдаасСсас	20460
саддаааадс	сдаадаасаС	сдСададдаа	асааадсасс	сдасдсасса	сссдааассс	20520
ссааааСааа	ддасаааддс	асдсаасаСд	СсдаддаСаС	дссЬСсСссс	дСдсСсадСс	20580
СдаададдСС	дддСдаСаСС	дсадасасда	дсассаасдС	сСсадассад	аасассдссд	2064 0
ддсдсссада	дсСССсадсс	ССсассаддС	асдссадада	аддсдааасс	сдаасссаса	20700
СааСддасаа	дСддасааСа	ссссассссс	аааССдССдс	аддСасааСС	саддсасаас	20760
Сддсаассад	ддСсааасад	дСааСдССдд	садССдсСсС	ссассаааСа	аСадССсада	20820
адсадсааад	садесссасс	ССдаСдсСсс	асаСсаааСС	СсдааСадса	дСадСаасаа	20880
СаасаасаСд	ддсСссасСа	сСааСаадСС	ссссааааад	ссъдссасдд	асассдасаа	20940
дасассСдса	аааСсаасад	СсаасСдССс	сеассассса	саСдСдСССд	адссадсдса	21000
аадсссссаС	асдсссааса	аСаасссСас	СдсаСсСддС	аадссСддСд	ССддс СссдЬ	21060
аааСддСаСд	сСдсаадааа	асдСассадс	ааасдссдсс	ссдссдсаад	ааааСаасдС	21120
ддаЬсадсад	сСсаадаССс	адсассасса	ссасСассас	саССасдаСд	СссаСадсдС	21180
асадсадсса	ссаааддссс	сСдССсааса	саасасдссс	аааадсаадд	аСдСдасадс	21240

асссссасад	СдСдддСсСС	сааасасССд	СадаСсдсса	ассдаадсаа	аСдССдссаа	21300
ъсдсадсссд	аасддаадСд	дсадсддаад	сааСсаСддд	адсааСССсс	ссаасддаад	21360
садсдссдсс	дсдаасдссд	ааддаасааа	еасддссаас	даСадсддда	СадсСдсааа	21420
адасддсдсс	даааасддаа	дсддсадсдд	аадсддаадС	ддСадСддСа	дСддСдССдд	21480
СдСддаСсаа	адСсдаСсад	сссаасдада	адсСдссссд	аасааасссс	дСсСсаадсд	21540
Сааадааада	СдсСССдаса	ааааддСааС	ассссааасс	ссссссадаа	СдСССаСасС	21600
СддасаСсСа	дСаСдСасаС	ссССдааСсС	ааассдсааа	адссдаассс	садаасаааа	21660
аасасаааСС	аСаСсаадСа	Сдааддсада	дСаССдСадС	аассасадсс	СССсЬддЬаС	21720
ддаассадса	сССасаСССа	ссадаадссС	дсСдСсасаа	дссаСааССС	даСсассаад	21780
саасааСааС	ССддссаССС	сССдсССдСа	ссдааадсда	дасдасссса	аасССаСССд	21840
СдСаСсаСса	саСсаддСдс	дасассааад	садааадаад	ССадсадаСс	ааадассесд	21900
СдССсдСддд	сааССсдСдс	дссаддСасд	адаааасааа	ддааддааСа	ссдаСадсЬа	21960
асассааССс	СССссасаад	ССдсСдссаа	даСсаСССаС	дссасСсСда	СдСсадсСдС	22020
есссасасдс	асааассссд	аассссасдс	дСдсаСдадд	СдсСаааСас	сдссааассс	22080
садСдаССсС	дСССддСССа	ддсСдСадаа	адасаСсссс	ссесссдсдс	ььсеасддсс	22140
ессассссда	дсСдсдссса	сСасСССССа	саасасддса	дссссСддСС	дссСССддаа	22200
аЕаадсЕЕЕЕ	ссССаааддС	дСдаСдсаСа	СааСсССдСС	СддСдССада	сьасасдасс	22260
асъссЬСсад	дсдсъсасдд	дссасасссс	ссддааСссС	ССсааасдсд	ассссддааа	22320
сааСддсСса	СаССЬСсССС	СддСССсаад	дадааддсСа	СССаааасад	аааадаСССа	22380
ддССасадаа	аСсадСдаСд	аадсааСдад	ссссассаса	дааСаддСад	аадСаддддд	22440
сдсссссссс	дсасссссда	даСадааадС	ддддасадас	СсСССддасС	сдСсадааад	22500
дааСааСаСа	дсСдСсСасс	ьсссссассс	ССадССсССд	саддадСССС	аССссасССс	22560
сасссссдса	ааасссадда	дссдсаадда	сдсдсааада	дааСссдсса	ссеадасъсс	22620
аассдасддс	аааессдъсс	ссссеасдсс	сссСсаадСа	асСаСааСдС	ъсьсассдаа	22680
СсСаСаддда	ССССсСааСд	СдСассСдаС	ададдсасас	адСаасааСа	аСаСаадСас	22740
аСаСаССсСС	саадаасаас	сасасадсаа	ссасассссс	ааСасаааСа	ааадасдссс	22800

ССаСдСааСд	ааасаааСаа	сССССссССд	ааддсасдсс	асаассаасс	асСССаСССС	22860
даадасассс	СаСаСССадС	ссдддсадсд	даасСасСаа	аСаааааСаС	ддССаСадСа	22920
асаСдсассс	аСдСдсдаас	сдааааааас	ссСаСдсССС	сСсСаааадС	Ссссааассс	22980
ссдадсССаС	адссссдасд	дсссадсдса	ддсССдсСдд	адсдссдсдС	сдсСсасссС	23040
дСсдссдасд	адссСдсаСд	ссдсассдсс	сддСсССсСд	ааддсссадс	СССсссСдСС	23100
ссСссссдсд	ССаССсаСсд	ССсссаСссс	ссаСдСсСсс	ссССссссСд	ссадсддссд	23160
Ссддсссссс	сссссссСаС	СааЬддССдС	сддссСсссс	ССсссЕССсс	ссСаасадсд	23220
дССдССддСс	Сссссссссс	сСССсаСдСС	дссаадссдс	СССССССССС	дССсСсссСС	23280
ССссСадссс	ссссссддсд	ССсССдССдс	ЪдЬСадСССа	дсддсСССдд	ССддССадСС	23340
сддсСдадСд	сССсдссдСс	дсасдссссс	ссССдССссс	ссаСССддСС	ссддссасдс	23400
СддддСССсд	дССаассссд	ССсссаСдсс	сааасдсддд	адддссСсад	даСССадаСа	23460
СаааддСсаС	сасссссдсд	сссадасдсд	ададддаССа	адСдССсадд	даСаадддсС	23520
ссдССссСдс	дсССааасдС	дддадаасСС	аааддССсСа	ддССССасад	дадССССддд	23580
ассддааадс	асасдаассс	сдсссддсад	аадаСдасад	СдсааСдСдд	ддаССааСса	23640
СССсдССССс	сссессссса	аСаадССадС	ессссассас	дададссссс	сассадсссс	23700
ааСссссССа	аСССсССдСа	ддддССдСаа	дсссадсссд	седссдссса	дсаСасссад	23760
сссдадаадс	ссдааадссс	даддссдъдд	аааааСдСас	ССасСддССд	садаСсаада	23820
аСаССаадас	дааСдСССда	ссссаассса	ссассдсасс	аддсаддааа	сасддсдадс	23880
саСсдааСаС	ссаССаСддС	СддааСадСа	ссаСаСсаСд	даадсддССС	сдаадсдСдС	23940
асассадсаа	ааСадаСдаа	даСасссааа	ссдасдсссс	адассасссс	ССаСдСасдс	24000
аадддСсаСС	ассдссдсад	асдссдсасд	дССССССааС	ССааСдаСаа	СССССссССа	24060
ССсссасССа	ааадСаааса	аСдсаССсаС	дСдсасаСаС	СадСасаСаС	аСССдСаСаС	24120

асассссд 24128 <210> 52 <211> 2367 <212> ДНК <213> Веса уиТдапв

<400> 52 аСдаддССда	ССсасааааа	СдаадаСддд	сссддсдссд	ссаадссддС	ддсададссс	60
ааСсаасаСа	СадССдссдС	даааааадаа	ддСаддддСа	дддССдсадд	сдаадддсад	120
дддссссссд	аддаддасда	ассдадаасс	ассдаддасд	дСдаадаСдс	ааасадсадд	180
сдССсСССда	дССсСдССса	дсссссадСС	саСасСсаса	ддсаСсадсс	асаадсасаа	240
ссссадддда	дадСсСдССд	ддададдССС	сссссСдссд	дассссссаа	ддССССдсСс	300
дСадааадСд	аСдасСсаас	СсдСсаСаСС	дссадсдссс	Сдссасддаа	аСдСадссас	360
даадссдсад	дддсдссааа	СддсаСадаа	дсасддаааа	ссссадаада	СССдадсааС	420
садас Сдасс	СадССССаас	СдаддСадСс	асаСсаддас	ссссСддСаС	аддСсССсСд	480
Сссаадасаа	Сдадссасаа	аадссдссад	ааСасСсссд	сеассасдас	дссаСсссаС	540
даССсдаСдд	дСССадСсСС	ааадСдсССа	Сссаадддсд	ссдссдассс	СсСддСдаад	600
ссСаСаадаа	аааасдаасС	СааааассСС	сддсадсасд	СССддаддад	дСдСсасадС	660
сссадсддса	дсддаадсда	аадсСдсдса	аддааСддаа	ааСссаСадд	аадсаададд	720
дсСдаададС	сддасааСда	сасСдасаСС	аасдаддаад	асдасаасад	аадсаССддС	780
ССасаадссс	дддасддаад	сдасаасдда	адСдддассс	ададССсаСд	дасааааадд	840
дссдсадаад	ССдададссс	ссаассасад	СсСасаСддд	адсаадсаас	сдасссассс	900
даСадсасСС	дСдсЬсаддС	сасссассса	аСдСсСдадд	саСССдссад	садсСддаСд	960
ссСддассса	Сдсаддаасс	сдаСддасад	даСсаСсааС	аСдасааСдС	сссаасддда	1020
ааддасссдд	адассддадс	ассСадааСС	ссадасссас	ддссааасдд	ассааасааа	1080
асддССаадС	СадсаасСас	СдсСдаддаа	аассааСаСС	сасадССада	ссСсаассад	1140
дааааСдаСд	дСсдаадССЬ	СдаСдаадад	аассСддада	СдааЬааЬда	СааассСааа	1200
адСдадСдда	ССааасаддс	сасдаассса	ссаддаааад	ССдаадааса	ссдСададда	1260
ааСааадСаС	сСдаСдсасс	асссдаааСС	СссааааСаа	аддасааадд	саСдсаасаС	1320
дСсдаддаСа	СдссССсСсС	сдСдсСсадс	сСдаададдС	СдддСдаСаС	сдсадасасд	1380
адсасСааСд	СсСсадасса	даасассдсс	дддсдССсад	адсСССсадс	сССсассадд	1440
сасаасссад	дсасаассдд	СаассадддС	сааасаддСа	аСдССддсад	ссдсссссса	1500

- 62 022877 ссаааСааСа дсссадаадс адсааадсад ссссаСССЬд аСдсСссаса СсаааСССсд 1560 ааСадсадСа дСаасааСаа сааСаСдддс СсСасСасСа аСаадССсСС сааааадссС 1620 дсСаСддаса ССдаСаадас ассСдсаааа СсаасадСса асСдССсЬса ссаССсасаС 1680 дсдСССдадс садедсааад сссссасаСд СсСааСааСа ассссасСдс асссддсаад 1740 ссСддСдССд дсСссдсааа СддСаСдсСд саадаааасд ЬассадСааа сдсСдСЪсСд 1800 ссдсаадааа аСаасдЬдда ъсадсадсСс аадаЬСсадс ассассаСса сьассассас 1860

СасдаСдСсс аСадСдСаса дсадсСасса ааддЬССсСд ССсаасаСаа СаСдсссааа 1920 адсааддаьд Сдасадсасс сссасадСдс дддСсССсаа асассСдСад аСсдссааСС 1980 даадсаааСд ССдссаассд садССЪдаас ддаадСддСа дСддаадсаа СсаСдддадс 2040 ааСССссССа аСддаадСад сдсСдсСдСд ааСдЪСдаад даасааасаС ддСсаасдаС 2100 адСдддаСад сСдсаааада сддСдсСдаа аасддаадсд дСадСддаад ЪддаадСддС 2160 адСддСадСд дсдССддСдС ддассааадс сдаСсадсСс аасдадаадс СдссССдааС 2220 ааассссдсс ссаадсдсаа адааадасдс СССдасаааа аддСдсдаЪа Ссааадсада 2280 аадаадССад садаСсааад ассСсдСдСС сдСдддсааС СсдСдсдсса ддсасдадаа 2340 аасаааддаа ддааСассда СадсСаа 2367

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Полинуклеотид, включая его информативные фрагменты, который (1) генетически сцеплен с или принадлежит гену стрелкования (В гену) в геноме сахарной свеклы, (2) может быть использован в качестве маркеров для картирования, идентификации и/или обнаружения В гена сахарной свеклы и (3) получен из области геномной ДНК, имеющей нуклеотидную последовательность δΞΟ ΙΌ N0: 51, где указанный полинуклеотид, включая его информативный фрагмент, содержит:

а) нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, включающей последовательности δΞΟ ΙΌ N0: 1, 5 или 52 и аллельные варианты этих последовательностей, которые ассоциированы с однолетним типом развития сахарной свеклы; или

б) нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, включающей последовательности δΞΟ ΙΌ N0: 1, 5 или 52 и аллельные варианты этих последовательностей, которые ассоциированы с однолетним типом развития сахарной свеклы.
2. Полинуклеотид, включая его информативный фрагмент, по п.1, содержащий нуклеотидную последовательность δΞΟ ΙΌ N0: 5, которая имеет С в положении 3695, С в положении 3827, Т в положении 3954, Т в положении 5284, С в положении 5714, С в положении 10954, Т в положении 11043, С в положении 11143, С в положении 11150, А в положении 11220, С в положении 11238, А в положении 11299, А в положении 11391, С в положении 12053, С в положении 12086, Т в положении 12127, А в положении 12193, С в положении 12337 и С в положении 12837 и представляет собой аллель 1, ассоциированный с однолетним типом развития сахарной свеклы.
3. Полинуклеотид, включая его информативный фрагмент, по п.1, содержащий нуклеотидную последовательность δΞΟ ΙΌ N0: 5, которая имеет Т в положении 3695, С в положении 3827, Т в положении 3954, Т в положении 5284, С в положении 5714, С в положении 10954, Т в положении 11043, С в положении 11143, С в положении 11150, А в положении 11220, А в положении 11238, Т в положении 11299, А в положении 11391, С в положении 12053, С в положении 12086, Т в положении 12127, С в положении 12193, С в положении 12337 и С в положении 12837 и представляет собой аллель 2, ассоциированный с однолетним типом развития сахарной свеклы.
4. Полинуклеотид, включая его информативный фрагмент, по п.1, содержащий нуклеотидную последовательность δΞΟ ΙΌ N0: 5, которая имеет С в положении 3695, С в положении 3827, Т в положении 3954, Т в положении 5284, С в положении 5714, С в положении 10954, С в положении 11043, Т в положении 11143, С в положении 11150, А в положении 11220, С в положении 11238, Т в положении 11299, А в положении 11391, С в положении 12053, С в положении 12086, Т в положении 12127, С в положении 12193, С в положении 12337 и С в положении 12837 и представляет собой аллель 3, ассоциированный с однолетним типом развития.
5. Полинуклеотид, включая его информативный фрагмент, по п.1, содержащий нуклеотидную последовательность δΞΟ ΙΌ N0: 5, которая имеет С в положении 3695, С в положении 3827, Т в положении 3954, Т в положении 5284, С в положении 5714, С в положении 10954, Т в положении 11043, С в положении 11143, Т в положении 11150, А в положении 11220, С в положении 11238, Т в положении 11299, А в положении 11391, С в положении 12053, С в положении 12086, Т в положении 12127, А в положении 12193, С в положении 12337 и С в положении 12837 и представляет собой аллель 4, ассоциированный с однолетним типом развития сахарной свеклы.
6. Полинуклеотид, включая его информативный фрагмент, по п.1, содержащий нуклеотидную последовательность δΞΟ ΙΌ N0: 5, которая имеет С в положении 3695, С в положении 3827, Т в положении 3954, Т в положении 5284, С в положении 5714, С в положении 10954, Т в положении 11043, С в поло- 63 022877 жении 11143, С в положении 11150, А в положении 11220, С в положении 11238, Т в положении 11299, А в положении 11391, С в положении 12053, А в положении 12086, Т в положении 12127, А в положении 12193, А в положении 12337 и С в положении 12837 и представляет собой аллель 5, ассоциированный с однолетним типом развития сахарной свеклы.
7. Полинуклеотид, включая его информативный фрагмент, по п.1, содержащий нуклеотидную последовательность ЗЕЦ ГО N0: 5, которая имеет С в положении 3695, С в положении 3827, Т в положении 3954, Т в положении 5284, С в положении 5714, С в положении 10954, Т в положении 11043, С в положении 11143, С в положении 11150, А в положении 11220, С в положении 11238, Т в положении 11299, А в положении 11391, С в положении 12053, С в положении 12086, Т в положении 12127, А в положении 12193, А в положении 12337 и С в положении 12837 и представляет собой аллель 6, ассоциированный с однолетним типом развития сахарной свеклы.
8. Полинуклеотид, включая его информативный фрагмент, по п.1, содержащий нуклеотидную последовательность ЗЕО ГО N0: 5, которая имеет С в положении 3695, А в положении 3827, А в положении 3954, С в положении 5284, Т в положении 5714, А в положении 10954, С в положении 11043, С в положении 11143, С в положении 11150, С в положении 11220, С в положении 11238, Т в положении 11299, С в положении 11391, А в положении 12053, С в положении 12086, С в положении 12127, С в положении 12193, С в положении 12337 и А в положении 12837 и представляет собой аллель 7, ассоциированный с двулетним типом развития сахарной свеклы.
9. Полинуклеотидный З№ маркер, полученный на основе полинуклеотидной последовательности ЗЕО ГО N0: 51 или ее информативного фрагмента, содержащий один или несколько полиморфизмов, выбранных из группы полиморфизмов в нуклеотидных положениях № 87, 160, 406, 3827, 3954, 5284, 5714, 10954, 11220, 11391, 12053, 12127 и 12837 ЗЕО ГО N0: 5, где эти полиморфизмы раскрыты в табл. 1 и 5 описания и являются диагностическими для В-аллеля в Β-локусе сахарной свеклы и позволяют различать характерный для однолетнего или двулетнего типа развития генотип или различные гаплотипы в группах растений сахарной свеклы, имеющих характерный для двулетнего или однолетнего типа развития генотип.
10. Пара праймеров, состоящая из прямого праймера и обратного праймера, где праймеры (1) ренатуруются с нуклеотидной последовательностью в В гене сахарной свеклы с последовательностью ЗЕО ГО N0: 51 и (2) амплифицируют его информативный фрагмент в ПЦР-реакции, где продукт амплификации является диагностическим для Β-аллеля в Β-локусе и позволяет различать растения, имеющие характерный для однолетнего или двулетнего типа развития генотип или различные гаплотипы в группах растений сахарной свеклы, имеющих характерный для двулетнего или однолетнего типа развития генотип, где указанная пара праймеров выбрана из группы пары праймеров, состоящей из:

a) прямого праймера ΡΚΚ7-Ρ, последовательность которого представлена в ЗЕО ГО N0: 7, и обратного праймера ΡΚΚ7-Κ, последовательность которого представлена в ЗЕО ГО N0: 8, для амплификации фрагмента, содержащего С/Т З№, соответствующего положению № 87 в ЗЖ ЗЕО ГО N0: 5; где наличие Т в нуклеотидной последовательности продукта амплификации в положении, которое соответствует положению № 87 в ЗЕО ГО N0: 5, указывает на то, что в качестве матрицы была использована геномная ДНК однолетней линии сахарной свеклы, в то время как наличие С в нуклеотидной последовательности продукта амплификации в положении, которое соответствует положению № 87 в ЗЕО ГО N0: 5, указывает на то, что в качестве матрицы была использована геномная ДНК двулетней линии сахарной свеклы;

b) прямого праймера ΡΚΚ7-Ρ, последовательность которого представлена в ЗЕО ГО N0: 7, и обратного праймера ΡΚΚ7-Κ, последовательность которого представлена в ЗЕО ГО N0: 8, для амплификации фрагмента, содержащего С/Т ЗЖ, соответствующего положению № 160 в ЗЖ ЗЕО ГО N0: 5; где наличие Т в нуклеотидной последовательности продукта амплификации в положении, которое соответствует положению № 160 в ЗЕО ГО N0: 5, указывает на то, что в качестве матрицы была использована геномная ДНК однолетней линии сахарной свеклы, в то время как наличие С в нуклеотидной последовательности продукта амплификации в положении, которое соответствует положению № 160 в ЗЕО ГО N0: 5, указывает на то, что в качестве матрицы была использована геномная ДНК двулетней линии сахарной свеклы;

c) прямого праймера ΡΚΚ7-Ρ, последовательность которого представлена в ЗЕО ГО N0: 7, и обратного праймера ΡΚΚ7-Κ, последовательность которого представлена в ЗЕО ГО N0: 8, для амплификации фрагмента, содержащего А/С З№, соответствующего положению № 406 в ЗЖ ЗЕО ГО N0: 5; где наличие С в нуклеотидной последовательности продукта амплификации в положении, которое соответствует положению № 406 в ЗЕО ГО N0: 5, указывает на то, что в качестве матрицы была использована геномная ДНК однолетней линии сахарной свеклы, в то время как наличие А в нуклеотидной последовательности продукта амплификации в положении, которое соответствует положению № 406 в ЗЕО ГО N0: 5, указывает на то, что в качестве матрицы была использована геномная ДНК двулетней линии сахарной свеклы;

ά) прямого праймера Р3806, последовательность которого представлена в ЗЕО ГО N0: 27, и обратного праймера К3807, последовательность которого представлена в ЗЕО ГО N0: 28, для амплифика- 64 022877 ции фрагмента, содержащего А/С δΝΡ, соответствующего положению № 3827 в δΕΟ ГО NО: 5; где наличие С в нуклеотидной последовательности продукта амплификации в положении, которое соответствует положению № 3827 в δΕΟ ГО NО: 5, указывает на то, что в качестве матрицы была использована геномная ДНК однолетней линии сахарной свеклы, в то время как наличие А в нуклеотидной последовательности продукта амплификации в положении, которое соответствует положению № 3827 в δΕΟ ГО NО: 5, указывает на то, что в качестве матрицы была использована геномная ДНК двулетней линии сахарной свеклы;

е) прямого праймера Р3806, последовательность которого представлена в δΕΟ ΙΌ NО: 27, и обратного праймера К3807, последовательность которого представлена в δΕΟ ΙΌ NО: 28, для амплификации фрагмента, содержащего А/Т δΝΡ, соответствующего положению № 3954 в δΝΡ δΕΟ ΙΌ NО: 5; где наличие Т в нуклеотидной последовательности продукта амплификации в положении, которое соответствует положению № 3954 в δΝΡ δΕΟ ГО NО: 5, указывает на то, что в качестве матрицы была использована геномная ДНК однолетней линии сахарной свеклы, в то время как наличие А в нуклеотидной последовательности продукта амплификации в положении, которое соответствует положению № 3954 в δΕΟ ГО NО: 5, указывает на то, что в качестве матрицы была использована геномная ДНК двулетней линии сахарной свеклы;

ί) прямого праймера Р3768, последовательность которого представлена в δΕΟ ΙΌ NО: 21, и обратного праймера К3769, последовательность которого представлена в δΕΟ ГО NО: 22, для амплификации фрагмента, содержащего Т/С δΝΡ, соответствующего положению № 5714 в δΝΡ δΕΟ ΙΌ NО: 5; где наличие С в нуклеотидной последовательности продукта амплификации в положении, которое соответствует положению № 5714 в δΕΟ ГО NО: 5, указывает на то, что в качестве матрицы была использована геномная ДНК однолетней линии сахарной свеклы, в то время как наличие Т в нуклеотидной последовательности продукта амплификации в положении, которое соответствует положению № 5714 в δΕΟ ГО NО: 5, указывает на то, что в качестве матрицы была использована геномная ДНК двулетней линии сахарной свеклы;

д) прямого праймера Р3857, последовательность которого представлена в δΕΟ ΙΌ NО: 37, и обратного праймера К3858, последовательность которого представлена в δΕΟ ΙΌ NО: 38, для амплификации фрагмента, содержащего С/А δΝΡ, соответствующего положению № 11220 в δΝΡ δΕΟ ΙΌ NО: 5; где наличие А в нуклеотидной последовательности продукта амплификации в положении, которое соответствует положению № 11220 в δΕΟ ГО ΝΌ: 5, указывает на то, что в качестве матрицы была использована геномная ДНК однолетней линии сахарной свеклы, в то время как наличие С в нуклеотидной последовательности продукта амплификации в положении, которое соответствует положению № 11220 в δΕΟ ГО ЫО: 5, указывает на то, что в качестве матрицы была использована геномная ДНК двулетней линии сахарной свеклы;

й) прямого праймера Р3859, последовательность которого представлена в δΕΟ ΙΌ НО: 39, и обратного праймера К3860, последовательность которого представлена в δΕΟ ΙΌ МО: 40, для амплификации фрагмента, содержащего С/А δΝΡ, соответствующего положению № 11391 в δΝΡ δΕΟ ΙΌ КО: 5; где наличие А в нуклеотидной последовательности продукта амплификации в положении, которое соответствует положению № 11391 в δΕΟ ГО ПО: 5, указывает на то, что в качестве матрицы была использована геномная ДНК однолетней линии сахарной свеклы, в то время как наличие С в нуклеотидной последовательности продукта амплификации в положении, которое соответствует положению № 11391 в δΕΟ ГО иО: 5, указывает на то, что в качестве матрицы была использована геномная ДНК двулетней линии сахарной свеклы;

ί) прямого праймера Р3861, последовательность которого представлена в δΕΟ ΙΌ иО: 41, и обратного праймера К3862, последовательность которого представлена в δΕΟ ГО иО: 42, для амплификации фрагмента, содержащего С/А δΝΡ, соответствующего положению № 12053 в δΝΡ δΕΟ ΙΌ иО: 5; где наличие С в нуклеотидной последовательности продукта амплификации в положении, которое соответствует положению № 12053 в δΕΟ ГО иО: 5, указывает на то, что в качестве матрицы была использована геномная ДНК однолетней линии сахарной свеклы, в то время как наличие А в нуклеотидной последовательности продукта амплификации в положении, которое соответствует положению № 12053 в δΕΟ ГО иО: 5, указывает на то, что в качестве матрицы была использована геномная ДНК двулетней линии сахарной свеклы;

_)) прямого праймера Р3861, последовательность которого представлена в δΕΟ ΙΌ иО: 41, и обратного праймера К3862, последовательность которого представлена в δΕΟ ГО иО: 42, для амплификации фрагмента, содержащего С/Т δΝΡ, соответствующего положению № 12127 в δΝΡ δΕΟ ΙΌ иО: 5; где наличие Т в нуклеотидной последовательности продукта амплификации в положении, которое соответствует положению № 12127 в δΕΟ ГО иО: 5, указывает на то, что в качестве матрицы была использована геномная ДНК однолетней линии сахарной свеклы, в то время как наличие С в нуклеотидной последовательности продукта амплификации в положении, которое соответствует положению № 12127 в δΕΟ ГО иО: 5, указывает на то, что в качестве матрицы была использована геномная ДНК двулетней линии сахарной свеклы;

к) прямого праймера Р3808, последовательность которого представлена в δΕΟ ΙΌ иО: 29, и об- 65 022877 ратного праймера Р3809, последовательность которого представлена в δΕΡ ΙΌ N0: 30, которые обеспечивают получение продукта амплификации размером 0,6 т.п.н., когда в качестве матрицы применяют геномную ДНК из двулетних линий, но не обеспечивают получение продукта амплификации в случае, когда в качестве матрицы применяют геномную ДНК из однолетних линий;

1) прямого праймера Р3855, последовательность которого представлена в δΕρ ΙΌ N0: 35, и обратного праймера Р3809, последовательность которого представлена в δΕρ ΙΌ N0: 30, которые обеспечивают получение продукта амплификации размером 1,0 т.п.н., когда в качестве матрицы применяют геномную ДНК из двулетних линий, но не обеспечивают получение продукта амплификации в случае, когда в качестве матрицы применяют геномную ДНК из однолетних линий; и

т) прямого праймера Р3855, последовательность которого представлена в δΕρ ΙΌ N0: 35, и обратного праймера Р3856, последовательность которого представлена в δΕρ ΙΌ N0: 36, которые обеспечивают получение продукта амплификации размером 0,8 т.п.н.; когда в качестве матрицы применяют геномную ДНК из двулетних линий, но не обеспечивают получение продукта амплификации в случае, когда в качестве матрицы применяют геномную ДНК из однолетних линий.
11. Набор полинуклеотидных зондов для использования в анализе аллельной дискриминации для выявления полиморфизмов в В гене генома сахарной свеклы с целью различения однолетних и двухлетних растений сахарной свеклы, содержащий два различных молекулярных зонда, которые комплементарны подобласти нуклеотидной последовательности В гена сахарной свеклы δΕρ ΙΌ N0: 51, где последовательности указанных двух полинуклеотидных зондов частично перекрываются и отличаются одним мисматчем в перекрывающейся области, который представлен полиморфным сайтом в нуклеотидной последовательности δΕρ ΙΌ N0: 515 гена, где первый полинуклеотидный зонд мечен первым флуоресцентным красителем и представляет один аллель и где второй полинуклеотидный зонд мечен вторым флуоресцентным красителем, который не идентичен первому красителю, и представляет второй аллель, где указанный набор полинуклеотидных зондов выбран из:

а) набора полинуклеотидных зондов, состоящего из первого полинуклеотидного зонда, имеющего нуклеотидную последовательность δΕρ ΙΌ N0: 9, и второго полинуклеотидного зонда, имеющего нуклеотидную последовательность δΕρ ΙΌ N0: 10; и

б) набора полинуклеотидных зондов, состоящего из первого нуклеотидного зонда, имеющего нуклеотидную последовательность δΕρ ΙΌ N0: 47, и второго полинуклеотидного зонда, имеющего нуклеотидную последовательность δΕρ ΙΌ N0: 48.
12. Применение пары праймеров по п.10 в анализе аллельной дискриминации для выявления полиморфизмов в В гене генома сахарной свеклы с целью различения однолетних и двулетних растений сахарной свеклы.
13. Способ выявления отсутствия или присутствия аллеля сахарной свеклы, ассоциированного с однолетним типом развития сахарной свеклы, включающий:

а) отбор образца генома растения сахарной свеклы, подлежащего анализу,

б) анализ в указанном образце интронной последовательности гена В, которая является комплементарной соответствующей области последовательности δΕρ ΙΌ N0: 51, причем указанный анализ осуществляют с помощью ПЦР-реакции с использованием прямого и обратного праймера, при осуществлении которого фланкируют подобласть последовательности δΕρ ΙΌ N0: 51, которая содержит полиморфизм, выбранный из группы полиморфизмов в нуклеотидных положениях № 87, 160, 406, 3827, 3954, 5284, 5714, 10954, 11220, 11391, 12053, 12127 и 12837 δΕρ ΙΌ N0: 5, раскрытых в табл. 1 и 5 описания, и

в) сравнение проанализированной последовательности, полученной на стадии (б), с последовательностью δΕρ ΙΌ N0: 4 или с δΕρ ΙΌ N0: 5, которые являются последовательностями аллеля, ассоциированного с двулетним типом развития сахарной свеклы, или с последовательностью δΕρ ΙΌ N0: 3, которая является последовательностью аллеля, который ассоциирован с однолетним типом развития сахарной свеклы.
14. Способ выявления отсутствия или присутствия аллеля, ассоциированного с однолетним типом развития сахарной свеклы, включающий:

а) отбор образца генома растения сахарной свеклы, подлежащего анализу,

б) секвенирование нуклеотидной последовательности интронной области гена В сахарной свеклы, полученной из генома сахарной свеклы путем ПЦР-амплификации с использованием прямого праймера РКК7-Р, последовательность которого представлена в δΕρ ΙΌ N0: 7, и обратного праймера РКК7-К, последовательность которого представлена в δΕρ ΙΌ N0: 8, и

в) сравнение секвенированной последовательности с последовательностью δΕρ ΙΌ N0: 4, которая является последовательностью аллеля, ассоциированного с двулетним типом развития сахарной свеклы, или с последовательностью δΕρ ΙΌ N0: 3, которая является последовательностью аллеля, ассоциированного с однолетним типом развития сахарной свеклы соответственно, где присутствие тимина в положении, соответствующем положению 87 δΕρ ΙΌ N0: 5, и/или присутствие тимина в положении, соответствующем положению 160 δΕρ ΙΌ N0: 5, и/или присутствие гуанина в положении, соответствующем положению 406 δΕρ ΙΌ N0: 5, указывает на присутствие аллеля, ассоциированного с однолетним типом развития сахарной свеклы, и где присутствие цитозина в положении, соответствующем положению 87

- 66 022877 δΕρ ΙΌ N0: 5, и/или присутствие цитозина в положении, соответствующем положению 160 δΕρ ΙΌ N0: 5, и/или присутствие аденина в положении, соответствующем положению 406 δΕρ ΙΌ N0: 5, указывает на присутствие аллеля, связанного с двулетним типом развития сахарной свеклы.
15. Способ по п.14, в котором интронная область имеет нуклеотидную последовательность δΕρ ΙΌ N0: 2.
16. Способ выявления загрязнения характерным для однолетнего типа развития генотипом предназначенных для продажи семян сахарной свеклы, где этот способ включает применение полинуклеотида по любому из пп.1-8 или его информативных фрагментов в качестве маркера в способе выявления отсутствия или присутствия аллеля, ассоциированного с признаком однолетности у растения сахарной свеклы по любому из пп.13-15.
17. Применение полинуклеотида по одному из пп.1-8 в качестве молекулярного маркера для выявления отсутствия или присутствия аллеля, ассоциированного с признаком однолетности в геноме сахарной свеклы.
18. Способ выявления отсутствия или присутствия аллеля, ассоциированного с однолетним типом сахарной свеклы, включающий:

а) отбор образца генома растения сахарной свеклы, подлежащий анализу,

б) амплификацию фрагмента ДНК из этого образца с помощью пары праймеров, которые комплементарны и связываются с промоторной областью гена В с последовательностью δΕρ ΙΌ N0: 51, и

в) сравнение амплифицированной последовательности с последовательностью δΕρ ΙΌ N0: 4, которая является последовательностью аллеля, ассоциированного с двулетним типом развития сахарной свеклы, и где присутствие цитозина в положении, соответствующем положению 87 δΕρ ΙΌ N0: 5, и/или присутствие цитозина в положении, соответствующем положению 160 δΕρ ΙΌ N0: 5, и/или присутствие аденина в положении, соответствующем положению 406 δΕρ ΙΌ N0: 5, указывает на присутствие аллеля, ассоциированного с двулетним типом развития сахарной свеклы.