EA028355B1

EA028355B1 - Трансгенные растения сахарной свеклы

Info

Publication number: EA028355B1
Application number: EA201001767A
Authority: EA
Inventors: Йоханнес Якобус Лудгерус Гилен; Томас Крафт; Пьерр Пен
Original assignee: Зингента Партисипейшнс Аг
Priority date: 2008-05-23
Filing date: 2009-05-25
Publication date: 2017-11-30
Also published as: EP2291525A1; EP2291525B1; EA201001767A1; PL2291525T3

Abstract

В изобретении представлены трансгенные растения сахарной свеклы, имеющие фенотип замедленного стрелкования. В заявке описаны также полинуклеотиды, тесно сцепленные с обусловливающим стрелкование геном или геном B в геноме сахарной свеклы, и которые можно применять для дискриминации генотипа, ассоциированного с однолетним типом развития, и генотипа, ассоциированного с двулетним типом развития, или различных гаплотипов в группах растений сахарной свеклы, характеризующихся ассоциированным с двулетним типом развития генотипом.

Description

Настоящее изобретение относится в целом к области молекулярной биологии растений, трансформации растений и селекции растений. Более конкретно изобретение относится к трансгенным растениям сахарной свеклы, для которых характерен фенотип замедленного стрелкования. Изобретение относится также к полинуклеотидным маркерам, которые тесно сцеплены или находятся в гене ЬоШпд (ген, обусловливающий стрелкование, ген, определяющий одно-двулетний тип развития) или гене В в геноме сахарной свеклы и которые можно применять для того, что различать характерный для однолетнего и характерный для двулетнего типа развития генотип или различные гаплоидные генотипы (гаплотипы) в группах растений сахарной свеклы, которые имеют характерный для двулетнего типа развития генотип.

Окультуренная сахарная свекла (Ве1а уи1дап5 55р. уц1дап5 Ь) представляет собой двулетнее растение, которое в первый год образует запасающий корень и листовую розетку. Удлинение побега (стрелкование) и образование цветка начинается после периода низкой температуры. В противоположность этому для многих диких представителей свекольных В. уи1дап5 55р. тапйта характерен однолетний тип развития в результате присутствия обусловливающего стрелкование гена В в локусе В, который картирован в центральной области хромосомы II. Ген ВОБ-ΤΙΝΟ (В-ген) ответствен за детерминацию признака однолетности у сахарной свеклы. Однолетность у видов р. Ве1а рассматривается как моногенный и доминантный признак. Растения, несущие доминантный В-аллель, обладают способностью переходить от ювенильной к репродуктивной стадии независимым от яровизации образом, что отличает их от двулетних растений, которые несут Ь-аллель, при наличии которого яровизация является совершенно необходимой для того, чтобы могло происходить стрелкование и последующее цветение. Доминантный аллель локуса В часто встречается у различных диких видов свекольных, и он обусловливает стрелкование в течение периодов с длинным световым днем, и у таких растений отсутствует необходимость в низких температурах, которые, как правило, требуются для двулетних культиваров (АЬе и др., 1997), несущих рецессивный аллель.

Стрелкование (удлинение побега) является первой хорошо заметной стадией перехода от вегетативного к репродуктивному росту.

Традиционно двулетнюю окультуренную сахарную свеклу высаживают весной и собирают осенью. Однако ожидается, что удлинение вегетационного периода в результате посева осенью и культивации в течение зимы должно существенно повышать урожайность и позволять расширять операции по переработке сахарной свеклы, что соответствует требованиям сахарной промышленности. Однако культивирование зимой существующей в настоящее время сахарной свеклы в центральной Европе (т.е. в виде озимой культуры) в современных условиях невозможно, поскольку яровизация (которая индуцируется воздействием низких температур в течение зимы) может приводить к стрелкованию и снижению урожайности. Таким образом, существует очень большая потребность в создании нестрелкующейся озимой сахарной свеклы, яровизационный ответ которой модифицируют с целью придания устойчивости к стрелкованию или значительного замедления стрелкования после индукции охлаждением. Поскольку ген В играет ключевую роль в яровизационном ответе у сахарной свеклы, он является многообещающим кандидатом для конструирования устойчивости к стрелкованию путем модуляции яровизационного ответа.

Кроме того, у окультуренной сахарной свеклы стрелкование является нежелательным явлением, поскольку оно приводит к резкому снижению урожая и к проблемам в процессе сбора урожая и при экстракции сахара. Производство семян сахарной свеклы для продажи часто осуществляют в регионах, в которых произрастают однолетние сорные виды свекольных, что может вызывать загрязнение образующихся семян пыльцой этих растений, приводя к присутствию генотипа, характерного для однолетнего типа развития, в предназначенных для продажи семенах. Это является неприемлемым для покупателей. Для выявления загрязнения характерным для однолетнего типа развития генотипом партии предназначенных для продажи семян выращивают в регионах, в которых однолетние виды свекольных не вырастают непосредственно после сбора семян. Растения являются неяровизированными и загрязняющие растения выявляют по наличию стрелок. Является очень желательной замена такого метода оценки основанным на применении маркеров скрининговым анализом, с помощью которого можно получать результаты за более короткий период времени, что должно приводить к снижению стоимости переработки семян.

Подход, основанный на применении маркеров, может оказаться также целесообразным для селекции сахарной свеклы, например для ускорения процесса селекции, или для интродукции нового признака изменчивости, выбранного из множества диких видов свекольных. Из-за неполной пенетрантности Валлеля и его зависимости от окружающей среды при селекции линий растений существует потребность в тесно сцепленных с ним молекулярных маркерах для осуществления скрининга по признаку его присутствия. Во всех этих случаях важно иметь маркер, тесно сцепленный с геном В, для того чтобы иметь возможность точно идентифицировать однолетний или двулетний типы развития.

Исходя из вышеизложенных потребностей существует необходимость в разработке трансгенных подходов (основанных на применении трансгенов), предназначенных для модуляции яровизационного ответа сахарной свеклы, а также в связанных с использованием маркеров подходов для того, что различать аллели гена В, с которыми ассоциирован однолетний или двулетний типы развития, что является важным для производства семян и селекции сахарной свеклы.

- 1 028355

При создании настоящего изобретения были разработаны такие трансгенные подходы, а также ассоциированные с использованием маркеров подходы, предназначенные для решения указанных выше задач.

Краткое изложение сущности изобретения

Настоящее изобретение относится к нуклеотидным последовательностям, которые имеют последовательность, идентичную по меньшей мере на 70% нуклеотидной последовательности, выбранной из группы нуклеотидных последовательностей, представленных в любой из ЗЕф ГО N0: 1, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 53 или 54, к нуклеотидным последовательностям, которые содержат по меньшей мере 15 последовательно расположенных нуклеотидов нуклеотидной последовательности, выбранной из группы нуклеотидных последовательностей, представленных в любой из ЗЕф ГО N0: 1, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 53 или 54, или к нуклеотидным последовательностям, которые гибридизуются в строгих условиях с одной из них, или к нуклеотидной последовательности, выбранной из группы нуклеотидных последовательностей, представленных в любой из ЗЕф ГО N0: 1, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 53 или 54.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения нуклеотидная последовательность, предлагаемая в настоящем изобретении, представляет собой выделенную нуклеиновую кислоту. Касательно гомологии последовательностей, все индивидуальные численные значения, которые подпадают под диапазон, указанный выше в настоящем описании, который начинается по меньшей мере с 70, т. е. 71, 72, 73, 74, 75,...80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99%, должны также рассматриваться как подпадающие под объем настоящего изобретения. Предпочтительно нуклеотидная последовательность, предлагаемая в настоящем изобретении, состоит по меньшей мере из 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или по меньшей мере из 50 последовательно расположенных нуклеотидов нуклеотидной последовательности, выбранной из группы нуклеотидных последовательностей, представленных в любой из ЗЕф ГО N0: 1, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 53 или 54. Следует понимать, что понятие по меньшей мере х нуклеотидов относится к молекулам нуклеиновых кислот, имеющих любое численное значение, начинающееся с X и выше. Например, подразумевается, что понятие по меньшей мере 15 нуклеотидов относится к молекулам нуклеиновых кислот, которые включают 15, 16, 17, 18, 19, 20 или большее количество нуклеотидов. В более предпочтительном варианте осуществления изобретения указанная выше нуклеотидная последовательность, предлагаемая в настоящем изобретении, гибридизуется в строгих условиях, более предпочтительно в очень строгих условиях с нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы нуклеотидных последовательностей, представленных в любой из ЗЕф ГО N0: 1, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 53 или 54.

В одном из вариантов указанного объекта изобретения молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, включающей ЗЕф ГО N0: 1, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 53 или 54, и ее комплемент. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения указанная выше нуклеотидная последовательность, предлагаемая в настоящем изобретении, содержит нуклеотидную последовательность, представленную в ЗЕф ГО N0: 8, где эта последовательность имеет одну или несколько замен, делеций или добавлений нуклеиновых кислот, которые представлены в табл. 7-1 и 7-2, где полиморфизмы, указанные в табл. 7-1 и 7-2, соответствуют 18 аллелям, ассоциированным с однолетним типом развития, и 2 аллелям, ассоциированным с двулетним типом развития, в последовательности, представленной в ЗЕф ГО N0: 8. Табл. 7-1 и 7-2 представлены также на фиг. 11 и 12.

Следующим объектом настоящего изобретения являются также полипептиды, которые кодируются указанными выше нуклеотидными последовательностями, предлагаемыми в настоящем изобретении. В предпочтительном варианте осуществления изобретения указанный выше полипептид, предлагаемый в настоящем изобретении, имеет аминокислотную последовательность, выбранную из группы аминокислотных последовательностей, которые представлены в ЗЕф ГО N0: 11 или 12.

Изобретение относится также к применению гена В, прежде всего гена ΒνΡΚΚ7, в основанном на использовании трансгенов подходе для получения растений, имеющих характеризующийся отсутствием стрелкования фенотип. В частности, изобретение относится к химерным конструкциям, содержащим кассету экспрессии, которая несет указанную выше нуклеотидную последовательность, предлагаемую в настоящем изобретении, под контролем регуляторных элементов, в частности под контролем регуляторных элементов, обладающих функциональной активностью в растениях.

В одном из вариантов осуществления изобретения химерная конструкция, описанная выше, может содержать также ген маркера для селекции, который позволяет различать трансформированный и нетрансформированный растительный материал при осуществлении процесса отбора.

В одном из вариантов осуществления изобретения химерная конструкция, предлагаемая в изобретении, содержит маркер отрицательной селекции, прежде всего маркер для селекции, который кодирует фактор, определяющий устойчивость к токсичным для растения соединениям, таким как антибиотики или гербициды. В другом варианте осуществления изобретения химерная конструкция, предлагаемая в изобретении, содержит маркер положительной селекции, прежде всего маркер для селекции, который кодирует фермент, придающий трансформированному растению селективное преимущество по сравнению с нетрансформированными растениями, прежде всего преимущество с позиций питания, такой, например, как ген фосфоманнозоизомеры или ген ксилозоизомеразы.

- 2 028355

Предпочтительным вариантом осуществления изобретения является химерная конструкция, предлагаемая в настоящем изобретении, предназначенная для трансгенной понижающей регуляции экспрессии гена ΒνΡΚΚ7, в частности посредством антисмыслового или ΡΗΚί-подхода. В этом контексте подразумевается, что понятие понижающая регуляция или супрессирующее действие относится к любому снижению уровня экспрессии гена ΒνΡΡΚ7 по сравнению с экспрессией гена в нентрансформированных растениях в таких же условиях. Под это понятие подпадает также молчание гена, при котором не удается выявлять экспрессию гена. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения химерная конструкция, предлагаемая в настоящем изобретении, которая предназначена для трансгенной понижающей регуляции экспрессии гена ΒνΡΚΚ7, содержит молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую άδΡΗΚ, которая обладает способностью к целенаправленному расщеплению мРНК, полученных в результате транскрипции последовательности ДНК, которая кодирует белок, являющийся продуктом гена Β, предпочтительно белок, являющийся продуктом гена ΒνΡΚΚ7. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения указанная выше химерная конструкция, предлагаемая в настоящем изобретении, содержит молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую άδΡΗΚ, где молекула нуклеиновой кислоты состоит по меньшей мере из 21 нуклеотида и практически идентична по меньшей мере части кодирующей последовательности гена ΒνΡΡΚ7. Указанные кодирующие последовательности гена ΒνΡΚΚ7 представляют собой предпочтительно указанные выше нуклеотидные последовательности, предлагаемые в настоящем изобретении. Более предпочтительно кодирующие последовательности гена ΒνΡΚΚ7 представляют собой молекулы нуклеиновых кислот, которые имеют последовательность, представленную в БЕО ГО N0: 1, 4, 5, 6, 9, 10, 53 или 54, предлагаемую в настоящем изобретении. Понятие практически идентичны относится к двум молекулам нуклеиновых кислот, которые могут гибридизоваться друг с другом в строгих условиях. Как правило, идентичность или гомология между άδΡΗΚ и кодирующей последовательностью гена ΒνΡΡΚ7 или его частями не подразумевает наличие идентичности или гомологии по всей длине άδΡΗΚ. Является достаточным, если идентичными являются участки, состоящие меньшей мере из 21 нуклеотида, однако предпочтительно выбирают нуклеотидные последовательности, кодирующие άδΡΗΚ, которые гомологичны молекуле РНК-мишени на участке длиной более 21 нуклеотида. Предпочтительно указанная выше химерная конструкция, предлагаемая в настоящем изобретении, содержит молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует άδΡΗΚ и состоит более чем из 21 нуклеотида, более предпочтительно более чем из 50, 100, 250, 500, 600, 750, 1000 или большего количества нуклеотидов.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения молекула нуклеиновой кислоты, кодирующей άδΡΗΚ, которая входит в химерную конструкцию, предлагаемую в настоящем изобретении, имеет нуклеотидную последовательность, представленную в БЕО ГО N0: 1, которая находится под контролем конститутивного промотора, предпочтительно промотора ИЫ3 из Λπ-ιΕίάορδίδ. В другом варианте осуществления изобретения химерная конструкция, предлагаемая в настоящем изобретении, содержит также последовательность второго интрона из гена 8ГО81 картофеля (ΕοΚοδ и др., 1986; Уаиеаииеу! и др., 1990). В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения химерная конструкция, предлагаемая в настоящем изобретении, содержит инвертированный повтор, мишенью которого является ΒνΡΚΚ7, состоящий из нуклеотидной последовательности, представленной в БЕЦ ГО N0: 1, клонированной между промотром ЦЫ3 (Νοττίδ и др., 1993) и терминатором Νοδ, как в антисмысловой, так и в смысловой ориентации, разделенными с помощью второго интрона гена 81Ь81 из картофеля.

Одним из вариантов осуществления изобретения является трансформирующий вектор и/или экспрессионный вектор, прежде всего растительный трансформирующий вектор и/или экспрессионный вектор, который содержит химерную конструкцию, предлагаемую в изобретении и описанную выше. Согласно следующему варианту осуществления изобретения растительный экспрессионный вектор представляет собой экспрессионный вектор, применяемый для ΡΗΚί, который содержит указанную выше химерную конструкцию, предлагаемую в изобретении. Согласно более предпочтительному варианту осуществления изобретения экспрессионный вектор, применяемый для ΡΗΚί, содержит химерную конструкцию, предлагаемую в настоящем изобретении, которая представлена на фиг. 10.

Другим объектом настоящего изобретения является растительная клетка, содержащая химерную конструкцию или векторную молекулу (например, трансформирующий вектор или экспрессионный вектор), предлагаемую в изобретении и описанную выше. В предпочтительном варианте осуществления изобретения растительная клетка, содержащая химерную конструкцию или векторную молекулу, предлагаемую в настоящем изобретении, представляет собой растительную клетку растения сахарной свеклы.

Кроме того, в изобретении предложены трансгенные растения, прежде всего растения сахарной свеклы, для которых характерен фенотип замедленного стрелкования, или их клетки, ткани или семена, которые все содержат растительную клетку, предлагаемую в настоящем изобретении, и/или химерную конструкцию, предлагаемую в настоящем изобретении, и/или нуклеотидную последовательность, предлагаемую в изобретении, как они описаны выше, где трансгенное растение экспрессирует άδΡΗΚ, которая замедляет стрелкование, в частности подавляет стрелкование, и растение характеризуется фенотипом замедленного стрелкования, предпочтительно фенотипом отсутствия стрелкования. Под понятием замедление стрелкования подразумевают модуляцию встречающейся в естественных условиях реакции

- 3 028355 стрелкования растений сахарной свеклы. В процессе стрелкования стебель удлиняется на первой стадии стрелкования и во время перехода от вегетативного роста к репродуктивному росту после яровизации растений (т.е. воздействия низких температур), и в конце концов приводит к развитию цветка. Подразумевается, что замедление реакции стрелкования относится к удлинению стебля, которое начинается позднее, чем у растений в норме; такие растения характеризуются фенотипом замедленного стрелкования. Реакцию стрелкования можно замедлить на несколько дней (т.е. на 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 или 14 дней) и на период вплоть до нескольких недель (т.е. на 2, 3. 4 недели) или нескольких месяцев (т.е. на 1, 2, 3, 5 или 6 месяцев). В предпочтительном варианте осуществления изобретения реакцию стрелкования полностью подавляют; такие растения не начинают давать стрелку после яровизации и характеризуются фенотипом отсутствия стрелкования. Другим предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения являются трансгенные растения, прежде всего растения сахарной свеклы, которые получают из клеток, тканей или семян, предлагаемых в настоящем изобретении и описанных выше.

Другим объектом настоящего изобретения является способ получения гибридных семян, из которых можно выращивать растения, прежде всего растения сахарной свеклы, которые имеют фенотип модулированного стрелкования. Указанные способы предпочтительно заключаются в том, что а) получают линию растений, прежде всего линию сахарной свеклы, которые имеют фенотип модулированного стрелкования, прежде всего трансгенного растения сахарной свеклы, предлагаемого в изобретении и описанного выше, в качестве первой родительской линии, б) получают вторую линию растений, прежде всего линию сахарной свеклы с другим генотипом в качестве второй родительской линии; где одна из родительских линий, полученных на стадии а) или стадии б), представляет собой мужскую стерильную линию, обладающую ЦМС (цитоплазматическая мужская стерильность), и где вторая родительская линия обладает мужской фертильностью, и в) дают растениям родительской линии, обладающей мужской фертильностью, опылять цветки второй родительской линии, обладающей мужской стерильностью, дают развиться семенам, и собирают гибридный семенной материал; где собранные гибридные семена представляют собой семена гибридного растения, прежде всего гибридного растения сахарной свеклы, которое имеет фенотип замедленного стрелкования. В предпочтительном варианте осуществления изобретения обе родительские линии представляют собой линии растений сахарной свеклы, при этом по меньшей мере одна из родительских линий сахарной свеклы представляет собой трансгенную линию сахарной свеклы, предлагаемую в настоящем изобретении. По меньшей мере одна родительская линия сахарной свеклы, имеющая фенотип модулированного стрелкования, может предпочтительно представлять собой также растение, не несущее какого-либо трансгена, который затем создают другими методами генетической манипуляции, которые описаны ниже. Согласно одному из вариантов этого объекта линия растения сахарной свеклы, полученная на стадии а), представляет собой инбредную линию сахарной свеклы с мужской стерильностью, обладающую ЦМС, которая содержит одну или несколько нуклеотидных последовательностей, предлагаемых в настоящем изобретении, или их фрагментов, а вторая родительская линия сахарной свеклы, полученная на стадии б), представляет собой инбредную линию сахарной свеклы, обладающую мужской фертильностью. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения родительская линия сахарной свеклы, полученная на стадии а), представляет собой растение сахарной свеклы, обладающее мужской фертильностью, которое содержит одну или несколько нуклеотидных последовательностей, предлагаемых в настоящем изобретении, или их фрагментов, а вторая родительская линия сахарной свеклы, полученная на стадии б), представляет собой инбредную линию сахарной свеклы с мужской стерильностью, обладающую ЦМС.

Следующим объектом настоящего изобретения является гибридное семя растения, прежде всего растения сахарной свеклы, характеризующееся фенотипом замедленного стрелкования. Согласно другому объекту настоящего изобретения гибридное семя получают с помощью способа, предлагаемого в настоящем изобретении и описанного выше. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения гибридное растение, прежде всего гибридное растение сахарной свеклы, которое имеет фенотип замедленного стрелкования, получают путем выращивания описанного выше гибридного семени, предлагаемого в настоящем изобретении. Следующий предпочтительный вариант осуществления настоящего изобретения относится к частям растения, выбранным из группы, включающей семена, зародыши, микроспоры, зиготы, протопласты, клетки, семяпочки, пыльцу, главные корни, семядоли, экстракты или биологические образцы, которые получают из трансгенного растения сахарной свеклы или его семян, предлагаемых в настоящем изобретении, или получают из описанных выше гибридных растений или семян, предлагаемых в настоящем изобретении.

Следующим объектом настоящего изобретения является применение нуклеотидных последовательностей, предлагаемых в настоящем изобретении, или их фрагментов для трансформации растительных клеток, прежде всего клеток растений сахарной свеклы. Целью трансформации растительных клеток, прежде всего клеток растения сахарной свеклы, нуклеотидной последовательностью, предлагаемой в настоящем изобретении, или ее фрагментами является модуляция особенностей стрелкования растений, описанная выше. Другим вариантом этого объекта изобретения является способ трансформации растительных клеток, прежде всего клеток растения сахарной свеклы, где способ заключается в том, что применяют нуклеотидную последовательность, предлагаемую в настоящем изобретении, или химерную кон- 4 028355 струкцию, предлагаемую в настоящем изобретении, или вектор, предлагаемый в настоящем изобретении, которые описаны выше. Следующим объектом настоящего изобретения является применение трансгенного растения, предлагаемого в настоящем изобретении, гибридного растения, предлагаемого в настоящем изобретении, или частей растений, предлагаемых в настоящем изобретении и указанных выше, в способе, выбранном из группы, включающей способы получения сахара, способы аэробной ферментации и способы анаэробной ферментации. Предпочтительно трансгенное растение, предлагаемое в настоящем изобретении, гибридное растение, предлагаемое в настоящем изобретении, или части растения, предлагаемые в настоящем изобретении и указанные выше, применяют в способе получения сахара. Другим объектом изобретения является способ получения сахара, в котором растение сахарной свеклы или его клетки или ткани, предлагаемые в настоящем изобретении и указанные выше, перерабатывают для получения сахара. Настоящее изобретение относится также к сахару, полученному из переработанного растения сахарной свеклы, или его клеток, или тканей, предлагаемых в настоящем изобретении и указанных выше.

Следующим объектом настоящего изобретения является полинуклеотидный маркер, созданный на основе нуклеотидной последовательности, которую можно получать из области геномной ДНК, для которой характерна истинная косегрегация с фенотипом, ассоциированным с геном, обусловливающим стрелкование (геном В), у сахарной свеклы, где маркер позволяет различать генотип, характерный для однолетнего и характерный для двулетнего типа развития, или различные гаплотипы в группах растений сахарной свеклы, которые имеют генотип, характерный для двулетнего типа развития или характерный для однолетнего типа развития. В предпочтительном варианте осуществления изобретения полинуклеотидные маркеры, предлагаемые в настоящем изобретении, имеют нуклеотидную последовательность, которую можно получать из одной или нескольких нуклеотидных последовательностей, предлагаемых в настоящем изобретении и указанных выше. В одном из вариантов осуществления изобретения полинуклеотидные маркеры, предлагаемые в настоящем изобретении, несут также один или несколько полиморфизмов, прежде всего полиморфизм, основанный на 8ΝΡ (однонуклеотидный полиморфизм, полиморфизм единичных нуклеотидов), §§К (простые повторяющиеся последовательности), делеции или инсерции по меньшей мере одного нуклеотида, но прежде всего полиморфизм, основанный на 8ΝΡ, этот полиморфизм является диагностическим для аллеля В в локусе В. Указанные полинуклеотидные маркеры предпочтительно обладают способностью выявлять по меньшей мере один из различных 8ΝΡ, присутствующих в различных аллелях геномной последовательности, которая представлена в контексте настоящего описания в виде 5>Еф ГО N0: 8, и которые приведены в табл. 7-1 (представлены также на фиг. 11) и 7-2 (представлены также на фиг. 12), где указанный полипептидный маркер позволяет осуществлять дифференциацию различных аллелей, прежде всего различать однолетние и двулетние линии сахарной свеклы. В предпочтительном варианте осуществления изобретения полинуклеотидный маркер, предлагаемый в настоящем изобретении, обладает способностью выявлять по меньшей мере один 8ΝΡ, выбранный из группы 8ΝΡ в положениях №№ 224, 351, 615, 897, 1082, 1841, 1915, 2334, 11592, 12316, 12490 или 12544 последовательности, представленной в 5>Еф ГО N0: 8, и которые приведены в табл. 7-1 (представлены также на фиг. 11) и 7-2 (представлены также на фиг. 12). Следующим объектом настоящего изобретения является набор полинуклеотидных маркеров, который содержит множество индивидуальных маркеров, предлагаемых в настоящем изобретении, которые описаны выше. В этом контексте понятие множество относится к набору, включающему больше одного полинуклеотидного маркера, который предпочтительно состоит из двух, трех или большего количества маркеров.

Другим объектом настоящего изобретения является пара праймеров, которая состоит из прямого праймера и обратного праймера, где праймеры обладают способностью к ренатурации с нуклеотидной последовательностью в геномной области геномной ДНК сахарной свеклы, характеризующейся истинной косегрегацией с обусловливающим стрелкование геном (геном В). В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения пара праймеров, предлагаемых в настоящем изобретении, обладает способностью к ренатурации с нуклеотидной последовательностью, предлагаемой в изобретении и указанной выше, и обеспечивает амплификацию полинуклеотида, предпочтительно полинуклеотидного маркера, предлагаемого в настоящем изобретении, или его информативного фрагмента, где указанный полинуклеотид содержит один или несколько полиморфизмов, прежде всего один или несколько полиморфизмов, который(ые) является(ются) диагностическим(и) для аллеля В в локусе В, и позволяет различать генотип, характерный для однолетнего типа развития, и генотип, характерный для двулетнего типа развития. В предпочтительном варианте осуществления изобретения пару праймеров, предлагаемую в настоящем изобретении, выбирают из группы, включающей а) пару праймеров, которая обладает способностью к ренатурации с нуклеотидной последовательностью в 3-м интроне ВуРРК.7, представленной в 5>Еф ГО N0: 6, и к амплификации информативного фрагмента из указанной области, который содержит полиморфизм, прежде всего полиморфизм, представляющий собой 8ΝΡ С/Т в положении № 87, и/или 8ΝΡ С/Т в положении № 160, и/или 8ΝΡ Л/С в положении № 406; или б) пару праймеров, которая обладает способностью к ренатурации с нуклеотидной последовательностью, представленной в 5>Еф ГО N0: 8, и к амплификации информативного фрагмента из указанной последовательности области, которая содержит полиморфизм, выбранный из полиморфизмов на основе §№, которые присутствуют в различ- 5 028355 ных аллелях указанной последовательности, что показано в табл. 7-1 (представлены также на фиг. 11) и 7-2 (представлены также на фиг. 12). В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения пара праймеров, предлагаемая в настоящем изобретении, содержит а) прямой праймер ΡΚΚ7(Τ6)-Ρ, представленный в 8ЕЦ ГО N0: 49, и обратный праймер ΡΚΚ7(Τ6)-Κ, представленный в 8ЕЦ ГО N0: 50, для амплификации фрагмента, который содержит 8ΝΡ № 2334; или б) прямой праймер ΡΚΚ7(Τ1)-Ρ, представленный в 8ЕЦ ГО N0: 13, и обратный праймер ΡΚΚ7(Τ1)-Κ, представленный в 8ЕЦ ГО N0: 14, для амплификации фрагмента, который содержит 8№ № 160; или в) прямой праймер 1γ22(Τ1)-Ρ, представленный в 8ЕЦ ГО N0: 55, и обратный праймер 1γ22(Τ1)-Κ, представленный в 8ЕЦ ГО N0: 56, для амплификации фрагмента и молекулы-зонда 1τ22(Τ1)-νΐΟ, представленной в 8ЕЦ ГО N0: 57, в качестве первой молекулы-зонда, меченной νΐί'.' в качестве первого флуоресцентного красителя, и молекулызонда 1γ22(Τ1)-ΡΑΜ, представленной в 8ЕЦ ГО N0: 58, в качестве второй молекулы-зонда, меченной РАМ в качестве второго флуоресцентного красителя.

Одним из вариантов осуществления изобретения является один или множество молекул-зондов и/или один или множество праймеров, прежде всего один или несколько праймеров, но особенно предпочтительно одна или множество пар праймеров, содержащих прямой праймер и обратный праймер, где праймеры обладают способностью к ренатурации с нуклеотидной последовательностью, которую можно получать из области геномной ДНК, характеризующейся истинной косегрегацией с фенотипом, ассоциированным с геном, обусловливающим стрелкование (геном В), у сахарной свеклы, где маркер позволяет различать характерный для однолетнего и характерный для двулетнего типа развития генотип или различные гаплотипы в группах растений сахарной свеклы, которые имеют генотип, характерный для двулетнего типа развития или характерный для однолетнего типа развития.

Одним из вариантов осуществления изобретения является набор полинуклеотидных зондов, содержащий по меньшей мере две различные молекулы-зонды, которые комплементарны подобласти в информативном полинуклеотидном фрагменте, предлагаемом в изобретении и описанном выше, который содержит полиморфный сайт, с помощью которого амплифицируют частично перекрывающиеся фрагменты, различающиеся только одним или двумя ошибочными спариваниями оснований в области перекрытия, при этом первый зонд, прежде всего зонд, меченный первым флуоресцентным красителем, более предпочтительно первым флуоресцентным красителем и гасителем, представляет собой один аллель, а второй зонд, прежде всего зонд, меченный вторым флуоресцентным красителем, который не идентичен первому красителю, более предпочтительно вторым флуоресцентным красителем и гасителем, представляет собой другой аллель.

Указанные выше полинуклеотидные маркеры, предлагаемые в настоящем изобретении, набор полинуклеотидных маркеров, предлагаемый в изобретении, или пару праймеров, предлагаемую в настоящем изобретении, можно применять для анализа аллельной дискриминации с целью выявления отсутствия или присутствия аллеля, ассоциированного с однолетним типом развития, у растения сахарной свеклы.

В другом варианте осуществления изобретения предложен анализ аллельной дискриминации для выявления отсутствия или присутствия аллеля, ассоциированного с однолетним типом развития, у растения сахарной свеклы, который позволяет различать однолетние и двулетние растения. В предпочтительном варианте осуществления изобретения для осуществления этого анализа применяют полинуклеотидный маркер, предлагаемый в изобретении, набор полинуклеотидных маркеров, предлагаемый в изобретении, или пару праймеров, предлагаемую в настоящем изобретении.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения анализ аллельной дискриминации, предлагаемый в настоящем изобретении, заключается в том, что осуществляют стадии, на которых: а) отбирают образец геномной ДНК из растения сахарной свеклы, подлежащий анализу, б) амплифицируют фрагмент из указанного образа или геномной ДНК с использованием пары праймеров, предлагаемой в настоящем изобретении, и в) сравнивают амплифицированный фрагмент с аллельной последовательностью, для которой известно, что она ассоциирована с фенотипом двулетнего типа развития, но не с фенотипом однолетнего типа развития. В этом анализе последовательность амплифицированного фрагмента на стадии в) сравнивают с последовательностями аллелей, в отношении которых известно, что они ассоциированы с фенотипом двулетнего типа развития. Если последовательность отличается от последовательностей аллелей, ассоциированных с фенотипом двулетнего типа развития, то это свидетельствует о присутствии аллеля, ассоциированного с фенотипом однолетнего типа развития (т. е. однолетнего растения). В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения амплифицированный фрагмент, полученный на стадии в), при анализе аллельной дискриминации зондируют первой флуоресцентномеченной молекулой-зондом, которая содержит последовательность, специфическую для аллеля, ассоциированного с фенотипом однолетнего типа развития. Если уровень флуоресценции красителя первого зонда увеличивается в процессе реакции, то это свидетельствует о присутствии аллеля, ассоциированного с фенотипом однолетнего типа развития.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения в анализе, предлагаемом в настоящем изобретении, применяют либо а) прямой праймер ΡΚΚ7(Τ6)-Ρ, представленный в 8ЕЦ ГО N0: 49, и обратный праймер ΡΚΚ7(Τ6)-Κ, представленный в 8ЕЦ ГО N0: 50, для амплификации фрагмента, кото- 6 028355 рый содержит δΝΡ № 2334, и молекулу-зонд РКК7(Т6)-У1С, представленную в δΕρ ГО N0: 51, в качестве первой молекулы-зонда, меченной с помощью У1С в качестве первого флуоресцентного красителя, и молекулу-зонд РКК7(Т6)-РАМ, представленную в δΕρ ГО N0: 52, в качестве второй молекулы-зонда, меченной с помощью РАМ в качестве второго флуоресцентного красителя; или б) прямой праймер РКК7(Т1)-Р, представленный в δΕρ ГО N0: 13, и обратный праймер РКК7(Т1)-К, представленный в δΕρ ГО N0: 14, для амплификации фрагмента, который содержит δΝΡ № 160, и молекулу-зонд РКК7(Т1)-У1С, представленную в δΕρ ГО N0: 15, в качестве первой молекулы-зонда, меченной с помощью У1С в качестве первого флуоресцентного красителя, и молекулу-зонд РКК7(Т1)-РАМ, представленную в δΕρ ГО N0: 16, в качестве второй молекулы-зонда, меченной с помощью РАМ в качестве второго флуоресцентного красителя; или (в) прямой праймер 1г22(Т1)-Р, представленный в δΕρ ΙΌ N0: 55, и обратный праймер 1г22(Т1)-К, представленный в δΕρ ΙΌ N0: 56, для амплификации фрагмента, и молекулу-зонд 1т22(Т1)-У!С, представленную в δΕρ ГО N0: 57, в качестве первой молекулы-зонда, меченной с помощью У1С в качестве первого флуоресцентного красителя, и молекулу-зонд 1г22(Т1)-РАМ, представленную в δΕρ ГО N0: 58, в качестве второй молекулы-зонда, меченной с помощью РАМ в качестве второго флуоресцентного красителя.

Одним из вариантов осуществления изобретения является способ идентификации загрязнений характерным для однолетнего типа развития генотипом предназначенных для продажи семян, заключающийся в том, что применяют основанный на использовании маркера анализ аллельной дискриминации, предлагаемый в изобретении и описанный выше.

Краткое описание чертежей и последовательностей

На чертежах показано:

на фиг. 1 - сравнение аминокислотных последовательностей КΕС-доменов различных видов и предполагаемого КБС-домена ΕδТ СУ301305 сахарной свеклы. Идентичные аминокислоты обозначены черным цветом; консервативные - серым цветом; аминокислоты с низким уровнем подобия - светлосерым цветом и неподобные - белым цветом. ВЬ, Вогбе1е11а ЬтоисШкерИса; Вк, ВасШик киЫШк; Βν, Ве1а уи1дат18; Ε£, ΕδсЬе^^сЫа сой; Кр, К1еЬ81е11а риеишошае; Ра, Ркеиботопак аетидшока; Ке, КйойоЬас1ет сар8и1а1и8; δμ δΐгерΐотусе8 соейсо1от; δί, δ1ιί^1Ει Пехпеп; δΐ, δа1тоηе11а 1урЫтитшт;

на фиг. 2 - сравнение аминокислотных последовательностей белка РКК7 ЛгаЫйор515 и предсказанного фрагмента белка ΕδТ У301305 сахарной свеклы. Идентичные аминокислоты обозначены черным цветом; подобные - серым цветом; и неподобные - белым цветом;

на фиг. 3 - сравнительный анализ первичной структуры последовательностей геномной и мРНК гена РКК7 АгаЬ1бор818 и ΕδТ СУ301305 сахарной свеклы. Консервативные нуклеотиды АгаЬ1бор818 и Βеΐа \п1дап5 Ь. обозначены серым цветом. Интроны обозначены заштрихованными полосами;

на фиг. 4 - генетическая карта хромосомы ΙΙ сахарной свеклы. Название маркеров приведены справа от хромосомы, а слева показаны генетические дистанции в порядке их возрастания;

на фиг. 5 - схематическое изображение генной структуры гена ΒνΡКК7, включая предполагаемые экзоны и интроны. Область, консервативная ΕδТ СУ301305, обозначена широкой стрелкой;

на фиг. 6 - сравнение аминокислотных последовательностей представителей семейства продуктов гена РКК АтаЬШоркхк и белка ΒνΡКК7. Идентичные аминокислоты обозначены черным цветом; консервативные - серым цветом; аминокислоты с низким уровнем подобия - светло-серым цветом и неподобные - белым цветом;

на фиг. 7 - филогенетическая взаимосвязь между ΒνΡКК7 и родственными белками из других видов цветковых растений, установленная с помощью филогенетического анализа множества представителей семейства гена РКК из нескольких видов растений, включая гомолог РКК7 из сахарной свеклы, АтаЫйор515 Шайаиа (Т0С1, N1’ 200946; РКК3, №__568919; РКК5, N1’ 568446; РКК7, №_568107; и РКК9, №_566085), 0гу/а каЩа (РКК37, Р0И3В6), Ногбеит мйдаге (РРИ-Н1, ААУ17586) и Тпйсит аекЩит (РРИ-И1, АВЬ09477), с использованием метода объединения соседей (№1дйЬот-.1ошт§ МеШоб) (ЬаНои и №ί, 1987). Для выведения эволюционной истории анализируемых таксонов применяли консенсусное дерево, построенное методом бутстрэпа (Ьоо181гар) на основе 1000 реплик (РеЕетЮит 1985). Ветви, соответствующие разделению, воспроизводимому менее чем в 50% Ьооΐ8ΐ^ар-реплик, удаляли (осуществляли их коллапс). Рядом с ветвями указан процент реплик деревьев, для которых ассоциированные таксоны кластеризовали, при осуществлении Ьоо151гар-анализа (1000 реплик). Дерево изображено в таком масштабе, когда длины ветвей представлены в тех же единицах, представляющих собой эволюционные расстояния, которые применяли для выведения филогенетического дерева. Эволюционные расстояния рассчитывали с помощью метода коррекции Пуассона (УискегкапШ и Раийпд, 1965) и выражали в единицах, представляющих собой количество аминокислотных замен на один сайт. Все позиции, содержащие бреши, и недостающие данные исключали из базы данных (опция полной делеции). В конечной базе данных содержалось в целом 352 позиции;

на фиг. 8 - суточные профили экспрессии ΒνΡКК7 в однолетних и двулетних растениях сахарной свеклы. Листовые ткани собирали каждые 2 ч в течение периода времени, составляющего 24 ч. Белым и темно-серым фоном обозначены соответственно данные, полученные в течение периода света и периода темноты. Данные представлены в виде средних значений, полученных для трех независимых биологиче- 7 028355 ских образцов. Значения выражали в виде относительных уровней экспрессии, стандартизованных относительно референс-гена ΒνΙΟΌΗ, с помощью анализа на основе геометрического усреднения (Уапбе8отре1е и др., 2002). Усами обозначено ±С.К.0. ΖΤ, таймер;

на фиг. 9 - конечный результат анализа аллельной дискриминации для набора однолетних и двулетних отдельных растений. Значения, отложенные на осях Υ и X, представляют собой уровни флуоресценции красителя РАМ и красителя У1С соответственно. Значительное увеличение уровня флуоресценции только красителя У1С (ось X) свидетельствует о гомозиготности аллеля, ассоциированного с двулетним типом развития (обозначен на этом чертеже как аллель X). Значительное увеличение уровня флуоресценции только красителя РАМ свидетельствует о гомозиготности аллеля, ассоциированного с однолетним типом развития (обозначен на этом чертеже как аллель Υ). Значительное увеличение уровня обоих флуоресцентных сигналов свидетельствует о гетерозиготности, т.е. об однолетнем растении, гетерозиготном по локусе В;

на фиг. 10 - плазмидная карта бинарного вектора, применяемого для трансгенной супрессии ΒνΡΚΚ7 с помощью ΡΗΚί. Инвертированный повтор для ΒνΡΚΚ7 состоит из кДНК-фрагмента размером 0,6 т.п.н., который клонировали между промотором ИЫ3 Щот8 и др., 1993) и терминатором N08 как в смысловой, так и в антисмысловой ориентации, разделенных вторым интроном гена З1ЬЗ1 картофеля (Еске8 и др., 1986; Уапсаппеу! и др., 1990). Селектируемый маркер представляет собой ген ΡΜΙ под контролем промотора НЗГ80 (Вгипке и АЙ80П, 1993);

на фиг. 11 - таблица, в которой представлены полиморфизмы, идентифицированные в промоторной области ΒνΡΚΚ7, полученные при сравнении 18 аллелей ΒνΡΚΚ7, которые ассоциированы с однолетним типом развития, и 2 аллелей ΒνΡΚΚ7, которые ассоциированы с двулетним типом развития, положения ЗЖ представленные в таблице, пронумерованы согласно ЗЕф ГО N0: 8;

на фиг. 12 - таблица, в которой представлены полиморфизмы, идентифицированные в кодирующей области ΒνΡΚΚ7, полученные при сравнении 18 аллелей ΒνΡΚΚ7, которые ассоциированы с однолетним типом развития, и 2 аллелей ΒνΡΚΚ7, которые ассоциированы с двулетним типом развития, положения ЗИБ, представленные в таблице, пронумерованы согласно ЗЕф ГО N0: 8.

Последовательности.

ЗЕф ГО N0: 1 - нуклеотидная последовательность ЕЗТ СУ301305 сахарной свеклы,

ЗЕф ГО N0: 2 - нуклеотидная последовательность прямого праймера ΡΚΚ7-Ε,

ЗЕф ГО N0: 3 - нуклеотидная последовательность обратного праймера ΡΚΚ7-Ε

ЗЕф ГО N0: 4 - нуклеотидная последовательность интрона 3 аллельного варианта 2 ΒνΡΚΚ7 (гаплотип №2),

ЗЕф ГО N0: 5 - нуклеотидная последовательность интрона 3 аллельного варианта 1 ΒνΡΚΚ7 (гаплотип №1),

ЗЕф ГО N0: 6 - нуклеотидная последовательность интрона 3 ΒνΡΚΚ7 и ее аллельная изменчивость, предназначенная для картирования,

ЗЕф ГО N0: 7 - геномная нуклеотидная последовательность аллеля ΒνΡΚΚ7, ассоциированного с двулетним типом развития,

ЗЕф ГО N0: 8 - нуклеотидная последовательность геномной нуклеотидной последовательности ΒνΡΚΚ7, включающая промоторную и терминирующую области,

ЗЕф ГО N0: 9 - нуклеотидная последовательность кодирующей области аллеля ΒνΡΚΚ7, ассоциированного с двулетним типом развития,

ЗЕф ГО N0: 10 - нуклеотидная последовательность кодирующей области аллеля ΒνΡΚΚ7, ассоциированного с однолетним типом развития,

ЗЕф ГО N0: 11 - предполагаемая аминокислотная последовательность аллеля ΒνΡΚΚ7, ассоциированного с двулетним типом развития,

ЗЕф ГО N0: 12 - предполагаемая аминокислотная последовательность аллеля ΒνΡΚΚ7, ассоциированного с однолетним типом развития,

ЗЕф ГО N0: 13 - нуклеотидная последовательность праймера ΡΚΚ7(Τ1)-Ε,

ЗЕф ГО N0: 14 - нуклеотидная последовательность праймера ΡΚΚ7(Τ1)-Κ,

ЗЕф ГО N0: 15- нуклеотидная последовательность зонда ΡΚΚ7(Τ1)-ν^,

ЗЕф ГО N0: 16 - нуклеотидная последовательность зонда ΡΚΚ7(Τ1)-ΕΑΜ,

ЗЕф ГО N0: 17 - нуклеотидная последовательность праймера 01131(Τ1)-Ε,

ЗЕф ГО N0: 18 - нуклеотидная последовательность праймера 01131(Τ1)-Κ,

ЗЕф ГО N0: 19 - нуклеотидная последовательность зонда Ο.Π31(Τ1)-νΚζ

ЗЕф ГО N0: 20 - нуклеотидная последовательность зонда 01131(Τ1)-ΕΑΜ,

ЗЕф ГО N0: 21 - нуклеотидная последовательность праймера Е^031700(Τ1)-Р,

ЗЕф ГО N0: 22 - нуклеотидная последовательность праймера ЕЭ031700(Τ1)-Κ,

ЗЕф ГО N0: 23 - нуклеотидная последовательность зонда Е^031700(Τ1)-УIС,

ЗЕф ГО N0: 24 - нуклеотидная последовательность зонда ЕЭ031700(Τ1)-ΡΑΜ,

ЗЕф ГО N0: 25 - нуклеотидная последовательность праймера 27(Τ2)-Ρ,

ЗЕф ГО N0: 26 - нуклеотидная последовательность праймера 27(Τ2)-Κ,

- 8 028355 δΕΟ ΙΌ N0: 27 - нуклеотидная последовательность зонда 9_27(Т2)-У1С, δΕΟ ΙΌ N0: 28 - нуклеотидная последовательность зонда 9_27(Т2)-РЛМ, δΕΟ ΙΌ N0: 29 - нуклеотидная последовательность праймера 0ГО1(Т1)-Р. δΕΟ ГО N0: 30 - нуклеотидная последовательность праймера 0ГО1(Т1)-К. δΕΟ ΙΌ N0: 31 - нуклеотидная последовательность зонда С101(Т1)-У1С, δΕΟ ΙΌ N0: 32 - нуклеотидная последовательность зонда 0ГО1(Т1)-РЛМ. δΕΟ ΙΌ N0: 33 - нуклеотидная последовательность праймера δΕΡΆ3977, δΕΟ ΙΌ N0: 34 - нуклеотидная последовательность праймера δΕΌΆ3988, δΕΟ ΙΌ N0: 35 - нуклеотидная последовательность праймера δΕΌΆ4442, δΕΟ ΙΌ N0: 36 - нуклеотидная последовательность праймера δΕΌΆ3809, δΕΟ ΙΌ N0: 37 - нуклеотидная последовательность праймера δΕΌΆ3810, δΕΟ ΙΌ N0: 38 - нуклеотидная последовательность праймера δΕΌΆ3807, δΕΟ ΙΌ N0: 39 - нуклеотидная последовательность праймера δΕΌΆ3766, δΕΟ ΙΌ N0: 40 - нуклеотидная последовательность праймера δΕΌΆ3769, δΕΟ ΙΌ N0: 41 - нуклеотидная последовательность праймера δΕΌΆ3857, δΕΟ ΙΌ N0: 42 - нуклеотидная последовательность праймера δΕΌΆ3860, δΕΟ ΙΌ N0: 43 - нуклеотидная последовательность праймера δΕΌΆ3861, δΕΟ ΙΌ N0: 44 - нуклеотидная последовательность праймера δΕΌΆ3864, δΕΟ ΙΌ N0: 45 - нуклеотидная последовательность прямого праймера ΒνΡΚΕ7, применяемого для анализа экспрессии генов, δΕΟ ΙΌ N0: 46 - нуклеотидная последовательность обратного праймера ΒνΡΚΚ7, применяемого для анализа экспрессии генов, δΕΟ ΙΌ N0: 47 - нуклеотидная последовательность прямого праймера ΒνΙί','ΌΗ. применяемого для анализа экспрессии генов, δΕΟ ΙΌ N0: 48 - нуклеотидная последовательность обратного праймера ΒνΙί',’ΌΗ. применяемого для анализа экспрессии генов.

δΕΟ ΙΌ N0: 49 - нуклеотидная последовательность праймера РКК7(Т6)-Р. δΕΟ ΙΌ N0: 50 - нуклеотидная последовательность праймера РКК7(Т6)-К. δΕΟ ΙΌ N0: 51 - нуклеотидная последовательность зонда ΡΚΚ7(Т6)-VIС. δΕΟ ΙΌ N0: 52 - нуклеотидная последовательность зонда РКК7(Т6)-РЛМ.

δΕΟ ΙΌ N0: 53 - нуклеотидная последовательность кодирующей области аллеля РКЕ7. ассоциированного с однолетним типом развития. расположенная по ходу транскрипции относительно ее промоторной области длиной примерно 1.3 т.п.н..

δΕΟ ΙΌ N0: 54 - нуклеотидная последовательность кодирующей области аллеля РКК7. ассоциированного с однолетним типом развития. включающая ее промоторную область длиной примерно 1.3 т.п.н. и ее терминаторную область длиной примерно на 0.7 т.п.н..

δΕΟ ΙΌ N0: 55 - нуклеотидная последовательность праймера 1г22(Т1)-Р. δΕΟ ΙΌ N0: 56 - нуклеотидная последовательность праймера 1г22(Т1)-К. δΕΟ ΙΌ N0: 57 - нуклеотидная последовательность зонда 1г22(Т1)-УТС. δΕΟ ΙΌ N0: 58 - нуклеотидная последовательность зонда 1г22(Т1)-РЛМ.

Определения.

Технические понятия и выражения. применяемые в настоящем описании. как правило. если специально не указано иное. имеют значения. которые обычно используют в области молекулярной биологии растений.

В настоящем описании и прилагаемой формуле изобретения подразумевается. если из контекста ясно не следует иное. что употребляемое в единственном числе существительное включает также множественное число. Так. например. ссылка на растение включает одно или несколько растений. а ссылка на клетку включает смеси клеток. тканей и т. п.

Понятие сахарная свекла относится ко всем видам и подвидам рода Вс1а. а также ко всем сортам культурной свеклы Вс1а мйдапх Культурные сорта свеклы подразделяют на четыре группы: листовая свекла. огородная свекла. кормовая свекла и сахарная свекла. Понятие сахарная свекла относится также ко всем культурным сортам свеклы. включая сорта. выращиваемые для целей. отличных от получения сахара. например. для получения этанола. пластиков или индустриальных продуктов. В частности. понятие сахарная свекла относится к кормовой свекле и сахарной свекле. но наиболее предпочтительно к сахарной свекле. Под это понятие подпадают также растения сахарной свеклы. адаптированные для выращивания в тропических или субтропических регионах.

Понятие однолетняя линия сахарной свеклы относится к растению сахарной свеклы. содержащему доминантный аллель В в локусе Β в гетерозиготном или гомозиготном состоянии.

Понятие двулетняя линия сахарной свеклы относится к растению сахарной свеклы. содержащему рецессивный аллель Ь в локусе Β в гетерозиготном состоянии.

Понятие стрелкование относится к переходу от вегетативной розеточной стадии к стадии цветения или репродуктивного роста.

- 9 028355

Под понятием замедленное стрелкование или замедление стрелкования в контексте настоящего описания подразумевается модуляция встречающейся в естественных условиях реакции стрелкования растений сахарной свеклы. У растений с замедленным стрелкованием удлинение стебля, представляющее собой первую видимую стадию стрелкования, начинается позднее, чем у нормальных растений. Реакцию стрелкования можно замедлять всего лишь на несколько дней (т.е., например, на 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 или 14 дней) и на период, составляющий вплоть до нескольких недель (т.е. на 2, 3, 4 недели) или нескольких месяцев (т.е. на 1, 2, 3, 5 или 6 месяцев). Замедление стрелкования может приводить также к полному подавлению реакции стрелкования; у таких растений не образуется стрелка после яровизации, и они характеризуются нестрелкующим фенотипом.

Понятие ген В в контексте настоящего описания относится к гену, который ответствен за детерминацию признака однолетности (раннее стрелкование) у сахарной свеклы. У растений, несущих доминантный аллель В, может происходить переключение с ювенильной на репродуктивную стадию не зависящим от яровизации образом, т.е. происходить удлинение побега и последующее цветение без предварительного нахождения при низких температурах.

Понятие яровизация относится к процессу, при котором у некоторых растений ускоряется индукция цветения при охлаждении растений в течение определенного периода времени.

Понятие аллель в контексте настоящего изобретения относится к альтернативным формам различных генетических единиц, ассоциированных с различными формами гена или любыми видами идентифицируемого генетического элемента, которые альтернативно наследуются, поскольку расположены в одном и том же локусе в гомологичных хромосомах. В диплоидной клетке или организме два аллеля данного гена (или маркера), как правило, расположены в соответствующих локусах на паре гомологичных хромосом.

В контексте настоящего описания понятие гаплотип относится к набору аллелей, наследуемых индивидуумом от одного родителя. Таким образом, диплоидный индивидуум имеет два гаплотипа. Понятие гаплотип можно использовать в более ограниченном смысле для обозначения физически связанных и/или несвязанных генетических маркеров (например, полиморфизмы последовательностей), ассоциированных с фенотипическим признаком (в контексте настоящего описания с таким признаком, как признак стрелкования при однолетнем или двулетнем типе развития растений сахарной свеклы). Касательно гена В гаплотип этого гена также определяет непосредственно фенотип. Признак однолетнего типа развития сахарной свеклы, например, определяется присутствием доминантного аллеля локуса В на хромосоме II.

Понятие локус в контексте настоящего изобретения относится к области на хромосоме, которая содержит ген или любой другой генетический элемент или фактор, определяющий признак.

В контексте настоящего описания понятие генетический маркер относится к особенности индивидуального генома (например, к нуклеотидной или полинуклеотидной последовательности, которая присутствует в индивидуальном геноме), ассоциированной с одним или несколькими представляющими интерес локусами. В некоторых вариантах осуществления изобретения в зависимости от контекста генетический маркер является полиморфным в представляющей интерес популяции или представляет собой локус, в котором присутствует полиморфизм. Генетические маркеры представляют собой, например, такие маркеры, как (но не ограничиваясь только ими) однонуклеотидные полиморфизмы (§№), инделы (т.е. инсерции/делеции), простые повторяющиеся последовательности (88К), полиморфизмы длин рестрикционных фрагментов (ΚΤΈΡ), произвольно амплифицированные полиморфные ДНК (ΚΑΡΌ), маркеры, представляющие собой расщепленную амплифицированную полиморфную последовательность (САР§), маркеры, полученные с помощью технологии разнообразия массивов (ΌίνβΓδίίγ Лггаук ТесЬпо1оду (ΌΛγΤ), полиморфизмы длин амплифицированных фрагментов (АРЬР). Генетические маркеры можно применять, например, для локализации на хромосоме генетических локусов, содержащих аллели, с которыми связана вариабельность экспрессии фенотипических признаков. Под понятием генетический маркер можно подразумевать также полинуклеотидную последовательность, комплементарную геномной последовательности, такую как последовательность нуклеиновой кислоты, применяемую в качестве зондов.

Генетический маркер физически может быть локализован в положении на хромосоме внутри или вне генетического локуса, с которым он ассоциирован (т.е. он может являться интрагенным или экстрагенным соответственно). Другими словами, хотя генетические маркеры, как правило, применяют, когда локализация на хромосоме гена, соответствующего представляющему интерес локусу, не идентифицирована и имеет место не нулевая степень рекомбинации между генетическим маркером и представляющим интерес локусом, согласно одному из объектов настоящего изобретения можно применять также генетические маркеры, которые физически являются пограничными генетическому локусу (например, находятся внутри геномной последовательности, которая соответствует гену, такому как (но не ограничиваясь только им) полиморфизм в интроне или экзоне гена). В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения один или несколько генетических маркеров включают от 1 до 10 маркеров, а в некоторых вариантах осуществления изобретения один или несколько генетических маркеров включает более 10 генетических маркеров.

- 10 028355

В контексте настоящего описания понятие фенотипический признак относится к появляющейся или иным образом проявляющейся характеристике индивидуума, являющейся результатом взаимодействия генома с его окружением.

Понятие фенотип в контексте изобретения относится к различимой(ым) характеристике(ам) генетически контролируемого признака.

В настоящем описании понятия тесно сцеплена или генетически тесно сцеплена касательно геномной области генома сахарной свеклы, сцепленной с геном В, подразумевается тесная ассоциация геномной области и гена В при наследовании благодаря близкой локализации обоих на одной и той же хромосоме, что оценивают на основе процента частоты рекомбинации между локусами (в сантиморганах, сМ). В контексте настоящего описания понятие сцепление и его грамматические варианты относятся к тенденции аллелей, находящихся в различных локусах на одной и той же хромосоме, к сегрегации друг с другом (к косегрегации) чаще, чем это можно было бы ожидать, если бы их перенос был независимым.

В контексте настоящего описания понятие информативный фрагмент относится к полинуклеотидному фрагменту с информационным содержанием, которое является восстановимым и может способствовать определению и/или характеризации представляющего интерес генетического локуса. Это информационное содержание может представлять собой полиморфизм, ассоциированный с указанным представляющим интерес локусом, такой, например, как (но не ограничиваясь только ими) однонуклеотидные полиморфизмы (8NΡ), инделы (т.е. инсерции/делеции), простые повторяющиеся последовательности (88Κ), полиморфизмы длин рестрикционных фрагментов (ΚΡΈΡ), маркеры, представляющие собой произвольно амплифицированные полиморфные ДНК (ΚΑΡΌ), расщепленную амплифицированную полиморфную последовательность (ΟΑΡ8), маркеры, полученные с помощью технологии разнообразия массивов (ΌΑγΤ), полиморфизмы длин амплифицированных фрагментов (ΑΡΌΡ), и их можно применять для создания генетического маркера. Информационное содержание информативного фрагмента может представлять собой также специфическую последовательность, которую можно выявлять с помощью соответствующей молекулы-зонда. Указанные информативные фрагменты могут представлять собой праймер, или маркер, или их часть. Указанные фрагменты могут состоять по меньшей мере из 10 нуклеотидов, предпочтительно по меньшей мере из 15, 20, 25, 30, 50 или 100 нуклеотидов.

Понятие основанная на применении маркера селекция в контексте настоящего изобретения относится к применению генетических маркеров для выявления одной или нескольких нуклеиновых кислот растения, где нуклеиновая кислота ассоциирована с требуемым признаком, для идентификации растений, которые несут гены требуемых (или нежелательных) признаков, в результате чего эти растения можно использовать (или избегать их использования) в программе селективного размножения.

Понятие ПЦР (полимеразная цепная реакция) в контексте изобретения относится к методу получения в относительно больших количествах специфических областей ДНК, что позволяет осуществлять различные анализы, основанные на использовании этих областей.

ПЦР-праймер или праймер в контексте изобретения относится к коротким фрагментам выделенной одноцепочечной ДНК, применяемым для ПЦР-амплификации специфических областей ДНК. Они обладают способностью к ренатурации с комплементарной цепью ДНК-мишени в результате гибридизации нуклеиновых кислот с образованием гибрида между праймером и цепью ДНК-мишени, а затем к удлинению цепи ДНК-мишени с помощью полимеразы, такой как ДНК-полимераза. Пары или наборы праймеров можно применять для амплификации молекулы нуклеиновой кислоты, например, с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) или других общепринятых методов амплификации нуклеиновых кислот. Праймеры, как правило, состоят из 10-15 или большего количества нуклеотидов. Праймеры могут состоять по меньшей мере из 20 или большего количества нуклеотидов, или по меньшей мере из 25 или большего количества нуклеотидов, или по меньшей мере из 30 или большего количества нуклеотидов. Указанные праймеры специфически гибридизуются с последовательностью-мишенью в строгих условиях гибридизации. Праймеры, предлагаемые в настоящем изобретении, могут иметь полную последовательность, комплементарную последовательности-мишени. Должно быть очевидно, что длина праймеров, предлагаемых в настоящем изобретении, может иметь любое численное значение, находящееся в пределах указанного численного диапазона. Так, к праймерам, состоящим из 10-15 или большего количества нуклеотидов, относятся праймеры, состоящие из 10, 11, 12, 13, 14 или 15 нуклеотидов, в то время как под понятие по меньшей мере 20 нуклеотидов подпадают также праймеры, включающие 16, 17, 18, 19 или 20 нуклеотидов. Это относится также и к понятию включает по меньшей мере 25 или большее количество нуклеотидов и включает по меньшей мере 30 или большее количество нуклеотидов.

В контексте настоящего описания понятие амплифицированный, амплификация относится к созданию множества копий молекулы нуклеиновой кислоты или множества копий комплементарной молекулы нуклеиновой кислоты с использованием по меньшей мере одной молекулы нуклеиновой кислоты в качестве матрицы. Системы амплификации включают систему на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР), систему на основе лигазной цепной реакции (ЛЦР), транскрипционный метод амплификации нуклеиновых кислот (амплификация на основе нуклеотидных последовательностей) >А8ВА, фирма Сапдепе, Миссиссауга, провинция Онтарио), системы на основе Ц-бета репликазы, транскрипционную

- 11 028355 систему амплификации (ΊΆδ) и амплификации с удалением (вытеснением) цепи (8ΌΆ) (см., например, Όίαβηοδίία Мо1еси1аг М1сгоЫо1оду: ΡπικίρΕδ αηά Αρρίίοαίίοηδ, под ред. Ό. Η. Бегетд и др., изд-во Атепсап §ос1е!у ίοτ МюгоЪю1оду, VаδЬ^п§ΐοп Э.С.. 1993). Продукт амплификации называют ампликоном.

Зонд представляет собой выделенную нуклеиновую кислоту, к которой присоединяют общепринятую выявляемую метку или репортерную молекулу, такую как радиоактивный изотоп, лиганд, хемилюминисцентный агент, флуросцентную метка или фермент. Указанный зонд является комплементарным цепи нуклеиновой кислоты-мишени. Зонды, предлагаемые в настоящем изобретении, включают не только дезоксирибонуклеиновые или рибонуклеиновые кислоты, но также и полиамиды и другие материалы, из которых состоят зонды, которые связываются специфически с последовательностью ДНКмишени и которые можно применять для выявления присутствия этой последовательности ДНКмишени.

Праймеры и зонды, как правило, состоят из 10-15 или большего количества нуклеотидов. Праймеры и зонды могут состоять также по меньшей мере из 20 или большего количества нуклеотидов, или по меньшей мере из 25 или большего количества нуклеотидов, или по меньшей мере из 30 или большего количества нуклеотидов. Указанные праймеры и зонды специфически гибридизуются с последовательностью-мишенью в строгих условиях гибридизации. Праймеры и зонды, предлагаемые в настоящем изобретении, могут иметь полную последовательность, комплементарную последовательности-мишени, хотя с помощью общепринятых методов можно создавать зонды, отличающиеся от последовательностимишени и сохраняющие способность гибридизоваться с последовательностями-мишенями. Должно быть очевидно, что длина праймеров и зондов, предлагаемых в настоящем изобретении, может иметь любое численное значение, находящееся в пределах указанного численного диапазона. Так, к праймерам и зондам, которые, как правило, состоят из 10-15 или большего количества нуклеотидов, относятся праймеры и зонды, состоящие из 10, 11, 12, 13, 14 или 15 нуклеотидов, в то время как под понятие по меньшей мере 20 нуклеотидов подпадают также праймеры и зонды, включающие 16, 17, 18, 19 или 20 нуклеотидов. Это относится также и к понятию включает по меньшей мере 25 или большее количество нуклеотидов и включает по меньшей мере 30 или большее количество нуклеотидов.

Понятие полиморфизм в контексте изобретения относится к присутствию в популяции двух или большего количества различных форм гена, генетического маркера или наследуемого признака.

Подразумевается, что понятие однонуклеотидный полиморфизм или 8ΝΡ в контексте изобретения относится к вариации последовательности ДНК, которая имеет место, когда один нуклеотид в геноме (или другой рассматриваемой последовательности) является различным у представителей видов или в спаренных хромосомах у индивидуума. Два секвенированных ДНК-фрагмента из различных индивидуумов, имеющие различие в одном нуклеотиде, называют также двумя аллелями. Предпочтительно 8ΝΡ имеет только два аллеля.

Понятие полинуклеотид в контексте настоящего описания относится к полимерной высокомолекулярной молекуле, которая может быть одноцепочечной или двухцепочечной, состоящей из мономеров (нуклеотидов), которые содержат сахар, фосфат и основание, относящееся либо к пуринам, либо к пиримидинам. Фрагмент полинуклеотида (полинуклеотидный фрагмент) представляет собой часть данной полинуклеотидной молекулы. В высших растениях дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) представляет собой генетический материал, а рибонуклеиновая кислота (РНК) участвует в переносе информации, входящей в ДНК, на белки. Геном представляет собой полную совокупность генетического материала, входящего в каждую клетку организма. Таким образом, понятие полинуклеотид относится к полимеру ДНК или РНК, который может быть одно- или двухцепочечным, необязательно содержащему синтетические не встречающиеся в естественных условиях или измененные нуклеотидные основания, которые могут включаться в полимеры ДНК или РНК. Если не указано иное, то подразумевается, что конкретная нуклеотидная последовательность, предлагаемая в настоящем изобретении, включает также ее полученные в результате консервативной модификации варианты (например, замены кодонов из-за вырожденности генетического кода) и комплементарные последовательности, а также определенные указанные последовательности. В частности, для замены кодонов из-за вырожденности генетического кода можно создавать последовательности, в которых в третьем положении в одном или в нескольких выбранных (или во всех) кодонах произведена замена смешанными основаниями и/или остатками дезоксиинозина (БгЦ/ег и др., 1991; ОйЦика и др., 1985; Κοδδοίίηί и др., 1994). Понятие полинуклеотид используют взаимозаменяемо с понятием нуклеиновая кислота, нуклеотидная последовательность, кДНК и мРНК, кодируемая геном и т. д.

Понятие выделенный в контексте молекул нуклеиновых кислот, предлагаемых в настоящем изобретении, относится к нуклеотидной последовательности, идентифицированной в хромосоме и выделенной/отделенной от хромосомной нуклеотидной последовательности, присутствующей в соответствующем организме-источнике. Выделенная нуклеиновая кислота не является нуклеиновой кислотой, которая встречается в естественных условиях, если реально существует ее встречающийся в естественных условиях дубликат. В противоположность этому невыделенные нуклеиновые кислоты представляют собой нуклеиновые кислоты, такие как ДНК и РНК, которые находятся в таком же состоянии, в котором они встречаются в естественных условиях. Например, данная последовательность ДНК (например, ген) при- 12 028355 сутствует в хромосоме клетки-хозяина вблизи от соседних генов. Выделенная нуклеотидная последовательность может находиться в одноцепочечной или двухцепочечной форме. В альтернативном варианте она может содержать смысловую и антисмысловую цепи (т.е. нуклеотидная последовательность может быть двухцепочечной). В контексте растительного генома молекула нуклеиновой кислоты, предлагаемая в изобретении, отличается от ее встречающихся в естественных условиях дубликатов инсерционным участком, встроенным в геном, и последовательностями, фланкирующими указанный инсерционный сайт. В предпочтительном варианте осуществления изобретения подразумевается, что молекулы нуклеиновых кислот, предлагаемые в изобретении, должны быть выделенными.

В контексте настоящего описания понятие нуклеиновая кислота относится к любой физической цепи мономерных единиц, которая может соответствовать цепи нуклеотидов, включая полимер нуклеотидов (например, типичный полимер ДНК или РНК), модифицированных олигонуклеотидов (например, олигонуклеотиды, содержащие основания, не являющиеся типичными для биологической РНК или ДНК, например 2'-О-метилированные олигонуклеотиды), и т.п. В некоторых вариантах осуществления изобретения нуклеиновая кислота может быть одноцепочечной, двухцепочечной, многоцепочечной или представлять собой их комбинации. Если не указано иное, то конкретная нуклеотидная последовательность, предлагаемая в настоящем изобретении, необязательно содержит или кодирует комплементарные последовательности помимо любых конкретно указанных последовательностей.

Понятие ген в широком смысле относится к любому сегменту нуклеиновой кислоты, связанному с биологической функцией. Так, гены включают кодирующие последовательности и/или регуляторные последовательности, необходимые для их экспрессии. Например, понятие ген относится к фрагменту нуклеиновой кислоты, который экспрессирует мРНК или функциональную РНК или кодирует конкретный белок и который включает регуляторные последовательности. Гены включают также неэкспрессируемые сегменты ДНК, которые, например, образуют последовательности, распознаваемые другими белками. Гены можно получать из различных источников, включая клонирование из представляющего интерес источника или синтез из известного или предсказанного на основе информации о последовательности источника, или они могут включать последовательности, сконструированные так, что они имеют требуемые параметры.

В контексте настоящего описания кассета экспрессии означает молекулу нуклеиновой кислоты, которая обладает способностью обеспечивать экспрессию конкретной нуклеотидной последовательности в соответствующей клетке-хозяине, она содержит промотор, функционально связанный с представляющей интерес нуклеотидной последовательностью, которая функционально связана с сигналами терминации. Она, как правило, содержит также последовательности, необходимые для правильной трансляции нуклеотидной последовательности. Кассета экспрессии может содержать также последовательности, которые не являются необходимыми для обеспечения экспрессии представляющей интерес нуклеотидной последовательности, но присутствие которых связано с созданием соответствующих сайтов рестрикции, предназначенных для удаления кассеты из экспрессионного вектора. Кассета экспрессии, которая содержит представляющую интерес нуклеотидную последовательность, может быть химерной, т. е. по меньшей мере один из ее компонентов является гетерологичным относительно по меньшей мере одного из других ее компонентов. Кассета экспрессии может представлять собой также кассету, которая встречается в естественных условиях, но которая была получена в рекомбинантной форме, пригодной для гетерологичной экспрессии. Однако, как правило, кассета экспрессии является гетерологичной для хозяина, т.е. конкретная нуклеотидная последовательность экспрессионной кассеты не встречается в естественных условиях в клетке-хозяине и ее необходимо интродуцировать в клетку-хозяина или предшественника клетки-хозяина с помощью известного в данной области метода трансформации. Экспрессия нуклеотидной последовательности в кассете экспрессии может находиться под контролем конститутивного промотора или индуцибельного промотора, который инициирует транскрипцию только при воздействии на клетку-хозяина некоторых определенных внешних стимулов. В случае многоклеточного организма, такого как растение, промотор может также быть специфическим для конкретной ткани или органа или стадии развития. Кассету экспрессии или ее фрагмент при трансформации растения можно обозначать также как встроенная последовательность или последовательность-вставка.

Понятие экспрессия при применении касательно нуклеотидной последовательности, такой как ген, относится к процессу преобразования генетической информации, кодируемой в гене, в РНК (например, мРНК, рРНК, тРНК или малая ядерная РНК (мяРНК)) посредством транскрипции гена (т.е. посредством ферментативной активности РНК-полимеразы) и, если это возможно, в белок (когда ген кодирует белок) посредством трансляции мРНК. Экспрессию генов можно регулировать на многих стадиях этого процесса.

Понятие химерный ген относится к любому гену, который содержит

1) последовательности ДНК, включая регуляторные и кодирующие последовательности, которые не встречаются вместе в естественных условиях, или

2) последовательности, кодирующие участки белков, которые не объединены в естественных условиях, или

3) участки промоторов, которые не объединены в естественных условиях.

- 13 028355

Таким образом, химерный ген может содержать регуляторные последовательности и кодирующие последовательности, выведенные из различных источников, или содержать регуляторные последовательности и кодирующие последовательности, выведенные из одного и того же источника, но собранные иным образом по сравнению с их укладкой в естественных условиях.

Понятие трансген относится к интродуцированному путем трансформации в геном и стабильно поддерживаемому гену. К трансгенам относятся, например, гены, которые гетерологичны или гомологичны генам конкретного подлежащего трансформации растения. Кроме того, трансгены могут представлять собой нативные гены, встроенные в ненативный организм, или химерные гены.

Трансформация представляет собой процесс интродукции гетерологичной нуклеиновой кислоты в клетку- или организм-хозяин. В частности, трансформация означает стабильную интеграцию молекулы ДНК в геном представляющего интерес организма.

Трансформированный/трансгенный/рекомбинантный относится к организму-хозяину, такому как бактерия или растения, в которого интродуцирована молекула гетерологичной нуклеиновой кислоты. Молекула нуклеиновой кислоты может быть стабильно интегрирована в геном хозяина или молекула нуклеиновой кислоты может присутствовать также в виде внехромосомной молекулы. Указанная внехромосомная молекула может обладать способностью к саморепликации. Под трансформированными клетками, тканями или растениями подразумеваются не только конечный продукт процесса трансформации, но также их трансгенное потомство. Понятие нетрансформированный, нетрансгенный или нерекомбинантный хозяин относится к организму дикого типа, например бактерии или растению, который не содержит молекулу гетерологичной нуклеиновой кислоты. В контексте настоящего описания понятие трансгенный относится к растению, растительной клетке или к множеству структурированных или неструктурированных растительных клеток, в которые интегрирована с помощью хорошо известных методов генетической манипуляции и встраивания генов последовательность нуклеиновой кислоты, характерная для представляющего интерес гена, в том числе интегрирована в геном растения и, как правило, в хромосому клеточного ядра, митохондрий или в другую содержащую хромосомы органеллу клетки, в другой локус или в большем количестве копий по сравнению с встречающимся в норме в нативном растении или растительной клетке. Трансгенные растения получают в результате манипуляции и встраивания указанных нуклеотидных последовательностей, в отличие от встречающихся в естественных условиях мутаций, с получением не встречающегося в естественных условиях растения, которое имеет не встречающийся в естественных условиях генотип. Методики трансформации растений и растительных клеток хорошо известны в данной области и могут представлять собой, например, электропорацию, микроинъекцию, опосредуемую Л§тоЪас1егшт трансформацию и баллистическую трансформацию.

Понятие белок, пептид и полипептид в контексте настоящего описания используют взаимозаменяемо.

Понятие кодирующая последовательность относится к последовательности ДНК или РНК, которая кодирует конкретную аминокислотную последовательность, и не включает некодирующие последовательности. Она может представлять собой непрерывную кодирующую последовательность, т.е. последовательность, в которой отсутствуют интрон, такую как кДНК, или может включать один или несколько интронов, ограниченных соответствующими сплайсинговыми стыками. Интрон представляет собой последовательность РНК, которая входит в первичный транскрипт, но которая удаляется в результате расщепления и повторного лигирования РНК в клетке с образованием зрелой мРНК, которая может транслироваться в белок.

Понятие промотор относится к нуклеотидной последовательности, как правило, расположенной против хода транскрипции (5') относительно кодирующей последовательности, которая контролирует экспрессию кодирующей последовательности, обеспечивая распознавание РНК-полимеразой и другими факторами, необходимыми для правильной транскрипции. Промотор включает минимальный промотор, который представляет собой короткую последовательность ДНК, содержащую ТАТА-бокс и другие последовательности, которые обеспечивают специфичность сайта инициации транскрипции, к которому добавляют регуляторные элементы для контроля экспрессии. Понятие промотор относится также к нуклеотидной последовательности, которая содержит минимальный промотор плюс регуляторные элементы, которые обладают способностью контролировать экспрессию кодирующей последовательности или функциональной РНК. Этот тип промотора состоит из проксимальных и более дистально расположенных против хода транскрипции элементов, последние элементы часто относят к энхансерам. Таким образом, энхансер обозначает последовательность ДНК, которая может стимулировать активность промотора и может представлять собой присущий промотору элемент или гетерологичный элемент, встроенный для повышения уровня активности или тканеспецифичности помотора. Он может проявлять активность в обоих направлениях (прямом или обратном) и может функционировать даже при его смещении либо против хода, либо по ходу транскрипции относительно промотора. И энхансеры, и другие находящиеся против хода транскрипции промоторные элементы связывают специфические для последовательности ДНК-связывающие белки, которые опосредуют их действия. Промоторы могут быть полностью выведены из нативного гена или состоять из различных элементов, выведенных из различных промоторов, присутствующих в природе, или даже состоять из различных синтетических ДНК-сегментов.

- 14 028355

Промотор может включать также последовательности ДНК, которые участвуют в связывании белковых факторов, контролирующих эффективность инициации транскрипции в ответ на физиологические или связанные с фазой развития условия.

Сайт инициации представляет собой положение, окружающее первый нуклеотид, который является частью транскрибируемой последовательности, который обозначают также как положение +1. Относительно этого сайта нумеруют все другие последовательности гена и его контролирующие области. Расположенные по ходу транскрипции последовательности (т.е. дополнительные кодирующие белок последовательности, расположенные в З'-направлении) нумеруют положительными числами, а расположенные против хода транскрипции последовательности (главным образом контролирующие области, расположенные в 5'-направлении) нумеруют отрицательными числами.

Промоторные элементы, в частности ТАТА-элемент, которые являются неактивными или обладают значительно пониженной промоторной активностью в отсутствии активации против хода транскрипции, обозначают как минимальные или внутренние промоторы. В присутствии приемлемого фактора транскрипции минимальный промотор функционирует, обеспечивая транскрипцию. Таким образом, минимальный или внутренний промотор состоит только из всех основных элементов, необходимых для инициации транскрипции, например ТАТА-бокса и/или инициатора.

Понятие конститутивная экспрессия относится к экспрессии с использованием конститутивного или регулируемого промотора. Понятие обусловленная или регулируемая экспрессия относится к экспрессии, контролируемой регулируемым промотором.

Понятие конститутивный промотор относится к промотору, который может обеспечивать экспрессию открытой рамки считывания (ОРС), который обеспечивает контроль во всех или практически во всех растительных тканях в течение всех или практически всех стадий развития растения. Любой из активирующих транскрипцию элементов не характеризуется абсолютной тканеспецифичностью, но опосредует активацию транскрипции в большинстве частей растения на уровне >1% от уровня, достигаемого в растении, в котором транскрипция является наиболее активной.

Понятие регулируемый промотор относится к промоторам, которые контролируют генную экспрессию не конститутивно, а регулируемым временем и/или пространственным положением образом, к ним относятся как тканеспецифические, так и индуцибельные промоторы. Они включают встречающиеся в естественных условиях и синтетические последовательности, а также последовательности, которые могут представлять собой комбинацию синтетических и встречающихся в естественных условиях последовательностей. Различные промоторы могут контролировать экспрессию гена в различных типах тканей или клеток или на различных стадиях развития или в ответ на различные факторы окружающей среды. В настоящее время открыты новые промоторы различных типов, которые можно применять в растительных клетках, их многочисленные примеры описаны у Окатиго и др., 1989. Типичные регулируемые промоторы, которые можно применять в растениях, включают (но не ограничиваясь только ими) индуцируемые антидотами промоторы, промоторы, выведенные из индуцируемой тетрациклином системы, промоторы, выведенные из индуцируемых салицилатами систем, промоторы, выведенные из индуцируемых спиртами систем, промоторы, выведенные из индуцируемых глюкокортикоидами систем, промоторы, выведенные из индуцируемых патогенами систем, и промоторы, выведенные из индуцируемых экдизонами систем.

Понятие тканеспецифический промотор относится к регулируемым промоторам, которые экспрессируются не во всех растительных клетках, а только в одном или нескольких типах клеток в конкретных органах (таких как листья или семена), конкретных тканях (таких как зародыш или семядоля) или в конкретных типах клеток (таких как паренхима листа или запасающие клетки семян). К ним относятся также промоторы, регуляция которых обусловлена периодом времени, таким как ранняя или поздняя стадия эмбриогенеза, стадия созревания в развитии семян и плодов, стадия полностью дифференцированной ткани листа или начало старения.

Понятие индуцибельный промотор относится к таким регулируемым промоторам, которые могут превращаться в специфические для одного или нескольких типов клеток под воздействием внешнего стимула, такого как химические агенты, свет, гормон, стресс или патоген.

Понятие функционально связаны относится к ассоциации нуклеотидных последовательностей на одном фрагменте нуклеиновой кислоты так, что функция одной оказывает воздействие на функцию другой. Например, регуляторная последовательность ДНК функционально связана с или ассоциирована с последовательностью ДНК, которая кодирует РНК или полипептид, если две последовательности расположены так, что регуляторная последовательность ДНК обладает способностью воздействовать на экспрессию кодирующей последовательности ДНК (т. е. транскрипция кодирующей последовательности или функциональной РНК находится под транскрипционным контролем промотора). Кодирующие последовательности могут быть функционально связаны с регуляторными последовательностями в смысловой или антисмысловой ориентации.

Понятие экспрессия относится к транскрипции и/или трансляции эндогенного гена, ОРС или ее части или трансгена в растениях. Например, в случае антисмысловых конструкций понятие экспрессия может относиться к транскрипции только антисмысловой ДНК. Кроме того, экспрессия относится к

- 15 028355 транскрипции и стабильной аккумуляции смысловой (мРНК) или функциональной РНК. Экспрессия может относиться также к производству белка.

Понятие сверхэкспрессия относится к уровню экспрессии в трансгенных клетках или организмах, превышающим уровни экспрессии в нормальных или ^трансформированных (нетрансгенных) клетках или организмах.

Понятие антисмысловое ингибирование относится к производству антисмысловых РНКтранскриптов, которые обладают способностью подавлять экспрессию белка с эндогенного гена или трансгена.

Понятие молчание гена относится к зависящему от гомологии подавлению вирусных генов, трансгенов или эндогенных ядерных генов. Молчание гена может быть транскрипционным, когда подавление обусловлено пониженной транскрипцией пораженных генов, или посттранскрипционным, когда подавление обусловлено повышенным круговоротом (расщепление) видов РНК, гомологичных пораженным генам. Молчание гена включает индуцированное вирусом молчание гена.

Понятие РНК-интерференция (ΡΗΚί) относится к процессу специфического для последовательности посттранскрипционного молчания гена у растений и животных, опосредуемому малыми интерферирующими РНК (κίΡΗΚ). Различные понятия, такие как κίΡΗΚ, молекула РНК-мишень, фермент Э|ссг или рибонуклеаза III, представляют собой концепции, известные специалистам в данной области, и полное описание указанных понятий и других концепций, относящихся к ΡΗΚί, присутствует в литературе. Очевидно, что любая из конкретных гипотез, касающихся механизмов ΡΗΚί, не является необходимой для воплощения на практике настоящего изобретения.

Понятие κίΡΗΚ относится к малым интерферирующим РНК. В некоторых вариантах осуществления изобретения κίΡΗΚ содержат дуплекс или двухцепочечную область, состоящую примерно из 21-23 нуклеотидов; часто κίΡΗΚ содержат примерно от 2 до 4 неспаренных нуклеотидов на З'-конце каждой цепи. По меньшей мере одна цепь дуплекса или двухцепочечной области κίΡΗΚ является практическим гомологом или практически комплементарна молекуле РНК-мишени. Цепь, комплементарная молекуле РНК-мишени, представляет собой антисмысловую цепь: цепь, гомологичная молекуле РНК-мишени, представляет собой смысловую цепь, и она комплементарна также антисмысловой цепи κίΡΗΚ. κίΡΗΚ могут содержать также дополнительные последовательности; примерами таких последовательностей являются (но не ограничиваясь только ими) связывающие последовательности (последовательностилинкеры) или петли, а также ствол и другие складчатые структуры. Вероятно, κίΡΗΚ функционируют в качестве имеющих решающее значение посредников, участвующих в запуске РНК-интерференции, у беспозвоночных и позвоночных животных и в запуске специфического для последовательности расщепления РНК в процессе посттранскрипционного молчания генов у растений.

άκΡΗΚ или двухцепочечная РНК представляет собой РНК с двумя комплементарными цепями, которая контролирует специфическое для последовательности расщепление мРНК с помощью процесса, известного как РНК-интерференция (ΡΗΚί). άκΡΗΚ превращаются в результате расщепления в κίΡΗΚ, которые оказывают интерферирующее воздействие на экспрессию специфического гена.

Понятие молекула РНК-мишень относится к молекуле РНК, по отношению к которой по меньшей мере одна цепь короткой двухцепочечной области или κίΡΗΚ (или άκΡΗΚ) является гомологичной или комплементарной. Как правило, когда указанная гомология или комплементарность составляет примерно 100% для участка, состоящего по меньшей мере из 21 нуклеотида, κίΡΗΚ может вызывать молчание или ингибировать экспрессию молекулы РНК-мишени. Хотя, вероятно, процессированная мРНК является мишенью для κίΡΗΚ, настоящее изобретение не ограничено какой-либо конкретной гипотезой, и такие гипотезы не являются необходимыми для воплощения на практике настоящего изобретения. Так, подразумевается, что другие молекулы РНК также могут являться мишенями для κίΡΗΚ. Указанные молекулы РНК-мишени представляют собой непроцессированную мРНК, рибосомную РНК и вирусную геномную РНК. Не является необходимым, чтобы 100%-ная гомология между молекулой РНК-мишенью и άκΡΗΚ имела место по всей длине άκΡΗΚ, но шпильки άκΡΗΚ должны содержать участки, состоящие по меньшей мере из 21 нуклеотида, предпочтительно по меньшей мере из 23 нуклеотидов, более предпочтительно по меньшей мере из 50 нуклеотидов, еще более предпочтительно по меньшей мере из 500 нуклеотидов, наиболее предпочтительно по меньшей мере из 700 нуклеотидов и вплоть до 1000 нуклеотидов, для которых характерна гомология на уровне, составляющем по меньшей мере 95%, предпочтительно 100%, с молекулой РНК-мишенью.

Понятие гибридизуется в контексте настоящего описания относится к общепринятым условиям гибридизации, предпочтительно к таким условиям гибридизации, в которых используют 5χδδΡΕ, 1% ДСН, 1х раствор Денхардта в качестве раствора и/или температуры гибридизации от 35 до 70°С, предпочтительно 65°С. После гибридизации отмывку предпочтительно осуществляют сначала с использованием 2х§§С, 1% ДСН, а затем 0,2х§§С при температуре от 35 до 75°С, в частности от 45 до 65°С, но наиболее предпочтительно при 59°С (описание обозначений δδΡΕ, §§С и раствор Денхардта см. у 8атЪгоок и др., 1ос. С11 (в указанном месте). Строгие условия гибридизации, например, описанные у 8атЪгоок и др. выше, являются наиболее предпочтительными. Наиболее предпочтительные строгие условия гибридиза- 16 028355 ции представляют собой вышеописанные условия, при которых гибридизацию и отмывку осуществляют при 65°С. Нестрогие условия гибридизации, при которых, например, гибридизацию и отмывку осуществляют при 45°С, являются менее предпочтительными, а при 35°С еще менее предпочтительными.

Понятия гомология последовательностей или идентичность последовательностей в контексте настоящего описания используют взаимозаменяемо. Понятия идентичный или процент идентичности в отношении двух или большего количества нуклеотидных или белковых последовательностей обозначает, что две или большее количество последовательностей или подпоследовательностей являются одинаковыми или имеют определенный процент одинаковых аминокислотных остатков или нуклеотидов при сопоставлении и сравнительном анализе максимального соответствия, что оценивают с помощью одного из приведенных ниже алгоритмов сравнения последовательностей или путем визуальной оценки. Если две подлежащие сравнению друг с другом последовательности имеют различную длину, то понятие идентичность последовательностей предпочтительно относится к проценту нуклеотидных остатков более короткой последовательности, которые идентичны нуклеотидным остаткам более длинной последовательности. Идентичность последовательностей традиционно можно определять с помощью компьютерных программ, таких как программа ВеШЛ (У18соп8ш Зециепсе Лпа1у818 Раскаде, версия 8 для Итх, Сепе0с5 СотрШег Сгоир, ИпЕегеку Ке8еагск Рагк, 575 §аепсе ИгЕе Мак18оп, VI 53711). Программа Ве81.П1 основана на алгоритме локальной гомологии Смита и Уотермана (διηίΐΐι и Уа1егтап, ЛЖапсе8 ίη ЛррПек МаШетакс8 2, 1981, с. 482-489) для поиска сегмента, имеющего самую высокую степень идентичности между двумя последовательностями. При применении Ве81(к или другой программы сравнительного анализа первичной структуры последовательностей для решения вопроса о том, идентична ли конкретная последовательность на 95% референс-последовательности, предлагаемой в настоящем изобретении, параметры предпочтительно регулируют так, чтобы процент идентичности рассчитывать по всей длине референс-последовательности и чтобы допускать гомологию брешей вплоть до 5% от общего количества нуклеотидов в референс-последовательности. При использовании Ве81(к так называемые необязательные параметры предпочтительно имеют свои предварительно установленные (принимаемые по умолчанию) значения. Отклонения, обнаруженные при сравнении данной последовательности и описанных выше последовательностей, предлагаемых в изобретении, могут быть обусловлены, например, добавлением, делецией, заменой, инсерцией или рекомбинацией. Такое сравнение последовательностей предпочтительно можно осуществлять также с помощью программы Га81а20и66 (версия 2.0и66, сентябрь 1998 г., ХУППаш К. Реаг8оп и (Не ИпЕегеку оГ Укдша; см. также у Реаг8оп, 1990 прилагаемые примеры, а также на сайте 1Шр://\уогкЬепсН.8к8с.еки/). Для этой цели можно использовать установку принимаемых по умолчанию параметров.

Другим доказательством того, что две нуклеотидные последовательности практически идентичны, является то, что две молекулы гибридизуются друг с другом в строгих условиях. Фраза специфично гибридизуется с относится к связыванию, образованию дуплекса или гибридизации молекулы только с определенной нуклеотидной последовательностью в строгих условиях, когда последовательность присутствует в комплексной смеси (например, общей клеточной) ДНК или РНК. Понятие практически связан(ы) относится к комплементарной гибридизации между нуклеиновой кислотой-зондом и нуклеиновой кислотой-мишенью и подразумевает наличие небольшого количества ошибочных спариваний, которые можно допускать при снижении строгости сред для гибридизации для достижения требуемого обнаружения последовательности нуклеиновой кислоты-мишени.

Понятия строгие условия, строгие условия гибридизации или условия отмывки, соответствующие строгой гибридизации в контексте экспериментов по гибридизации нуклеиновых кислот, таких как Саузерн- и Нозерн-гибридизация, зависят от условий, в которых зонд будет гибридизоваться с его последовательностью-мишенью в заметно большей степени, чем с другими последовательностями. Строгие условия зависят от последовательности-мишени и являются разными при применении различных параметров окружающей среды и должны отличаться в зависимости от структуры полинуклеотида. Для специфичной гибридизации более длинных последовательностей используют более высокие температуры. Подробным руководством по гибридизации нуклеиновых кислот является работа Ту88еп ЬаЬогаФгу ТесЬтдие8 ш В1оскет181гу апк Мо1еси1аг Вю1оду-НуЬпк1/акоп \\кН ШсЮс Лак РгоЬе8, часть I, глава 2: 0\'ег\ае\у оГ ргтс1р1е8 оГ НуЬпФ/айоп апк Ше 81га1еду оГ пис1ек аак ргоЬе а88ау8, изд-во Ε18еν^е^, №\у Уогк, 1993; и СиггеШ РгоЮсок т Мо1еси1аг Вю1оду, глава 2, под ред. Ли8иЬе1 и др., изд-во Сгеепе РиЬШктд апк \УПеу-1п1ег8аепсе: №\у Уогк, 1995;а также 8атЬгоок и др., Мо1еси1аг С1отпд: Л ЬаЬогаФгу Мапиа1, 5-е изд., изд-во Со1к 8ргшд НагЬог ЬаЬогаФгу, Со1к 8ргтд НагЬог, ΚΥ, 2001.

Специфичность, как правило, является функцией условий отмывок после гибридизации, при этом имеющими решающее значение факторами является ионная сила и температура раствора для конечной отмывки. Как правило, выбирают очень строгие условия гибридизации и отмывки, при которых температура примерно на 5°С ниже, чем температура плавления (Т_ш) для конкретной последовательности при определенной ионной силе и значении рН. Как правило, при использовании строгих условий зонд должен гибридизоваться с подпоследовательностью-мишенью, но не гибридизоваться с другими последовательностями.

Тт обозначает температуру (при определенной ионной силе и значении рН), при которой 50% по- 17 028355 следовательностей-мишеней гибридизуется с точно подобранным зондом. При выборе очень строгих условий гибридизации температура равна > конкретного зонда. Примером строгих условий гибридизации на фильтре методом Саузерн- или Нозерн-блоттинга для гибридизации комплементарных нуклеиновых кислот, которые имеют более 100 комплементарных остатков, является применение 50%-ного формамида с 1 мг гепарина при 42°С при осуществлении гибридизации в течение ночи.

Часто отмывке в очень строгих условиях предшествует отмывка в расслабленных условиях для удаления фонового сигнала зонда. Примером отмывки в очень строгих условиях является отмывка в 0,2х88С при 65°С в течение 15 мин (см. у 8атЬгоок, выше описание 88С-буфера), а примером очень строгих условий отмывки является применение 0,15М №С1 при 72°С в течение примерно 15 мин. Примером отмывки в условиях умеренной строгости для дуплексов, состоящих, например, более чем из 100 нуклеотидов, является применение 1х88С при 45°С в течение 15 мин. Примером расслабленных условий отмывки для дуплексов, состоящих, например, более чем из 100 нуклеотидов, является применение 46х88С при 40°С в течение 15 мин. Для коротких зондов (например, состоящих примерно из 10-50 нуклеотидов) строгие условия, как правило, включают концентрации солей, соответствующие менее чем 1,0М концентрации ионов N3, как правило, примерно от 0,01 до 1,0М концентрации ионов N3 (или других солей) при рН от 7,0 до 8,3, при этом температура, как правило, составляет по меньшей мере примерно 30°С. Строгие условия также можно получать при добавлении дестабилизирующих агентов, таких как формамид. Как правило, величина отношения сигнала к шуму, равная 2 (или выше) по сравнению с обнаруженной при применении неродственного зонда в конкретном опыте по гибридизации, свидетельствует о наличии специфической гибридизации. Нуклеиновые кислоты, которые не гибридизуются друг с другом в строгих условиях, все еще являются практически идентичными, если белки, которые они кодируют, являются практически идентичными. Это имеет место, например, в случае, когда копию нуклеиновой кислоты создают с использованием максимальной вырожденности кодонов, допускаемой генетическим кодом.

Ниже приведен ряд примеров условий гибридизации/отмывки, которые можно использовать для гибридизации нуклеотидных последовательностей, которые практически идентичны нуклеотидной референс-последовательности, предлагаемой в настоящем изобретении: нуклеотидная референспоследовательность предпочтительно гибридизуется с нуклеотидной референс-последовательностью в 7%-ном додецилсульфате натрия (ДСН), 0,5М NаΡО₄, 1мМ ЭДТК при 50°С с отмывкой в 2х88С, 0,1% ДСН при 50°С, более предпочтительно в 7%-ном додецилсульфате натрия (ДСН), 0,5М NаΡО₄, 1мМ ЭДТК при 50°С с отмывкой в 1х88С, 0,1 % ДСН при 50°С, более предпочтительно в 7%-ном додецилсульфате натрия (ДСН), 0,5М NаΡО₄, 1мМ ЭДТК при 50°С с отмывкой в 0,5х88С, 0,1% ДСН при 50°С, еще более предпочтительно в 7%-ном додецилсульфате натрия (ДСН), 0,5М NаΡО₄, 1мМ ЭДТК при 50°С с отмывкой в 0,1х88С, 0,1% ДСН при 50°С, еще более предпочтительно в 7%-ном додецилсульфате натрия (ДСН), 0,5М NаΡО₄, 1мМ ЭДТК при 50°С с отмывкой в 0,1х88С, 0,1% ДСН при 65°С. Последовательности, предлагаемые в настоящем изобретении, можно выявлять с использованием всех вышеуказанных условий. При создании изобретения использовали очень строгие условия.

Растение обозначает любое растение на любой стадии развития, в частности семенное растение.

Понятие растительная клетка относится к структурной и физиологической единице растения, включающей протопласт и клеточную оболочку. Растительная клетка может находиться в форме выделенной отдельной клетки или культивируемой клетки или представлять собой часть высокоорганизованной единицы, такой, например, как ткань растения, орган растения или целое растение.

Культура растительных клеток обозначает культуры структурных единиц растения, таких, например, как протопласты, клетки в культуре клеток, клетки в тканях растения, пыльца, пыльцевые трубки, семяпочки, зародышевые мешки, зиготы и зародыши на различных стадиях развития.

Понятие растительный материал относится к листьям, стеблям, корням, цветкам или частям цветков, плодам, пыльце, яйцеклеткам, зиготам, семенам, отводкам, культурам клеток или тканей или любой другой части или продукту растения. Оно включает также каллус или ткань каллуса, а также экстракты (например, экстракты главных корней) или образцы.

Орган растения обозначает отдельную и четко структурно оформленную дифференцированную часть растения, такую как корень, стебель, лист, листовая почка или зародыш.

В контексте настоящего описания понятие растительная ткань относится к группе растительных клеток, организованных в виде структурной и функциональной единицы. Под это понятие подпадает любая ткань растения, присутствующая в самом растении или находящаяся в культуре. Это понятие включает (но не ограничиваясь только ими) целые растения, органы растения, семена растения, культуру ткани и любые группы растительных клеток, организованных в виде структурных и/или функциональных единиц. Использование этого понятия в сочетании с указанием какого-либо конкретного типа растительной ткани (или безотносительно к нему), как это имеет место выше или в ином месте в настоящем описании, не следует истолковывать в том смысле, что оно не может относиться к любому другому типу растительной ткани.

В контексте настоящего описания понятие размножение и его грамматические варианты относит- 18 028355 ся к любому процессу, позволяющему получать потомство индивидуального растения. Размножение может быть половым или вегетативным или представлять собой любую их комбинацию. Примерами типов размножения являются (но не ограничиваясь только ими) скрещивание, самоопыление, создание производных с двумя гаплоидными наборами и их комбинации.

Под селективным размножением в контексте настоящего изобретения подразумевается программа размножения, в которой используют растения, которые несут или характеризуются требуемыми родительскими признаками.

В контексте настоящего описания понятие ферментация относится к процессу превращения органической молекулы в другую молекулу с помощью микроорганизма. Например, ферментация может относиться к аэробному превращению сахаров или других молекул из растительного материала, такого как растительный материал, предлагаемый в настоящем изобретении, с получением спиртов (например, этанола, метанола, бутанола); органических кислот (например, лимонной кислоты, уксусной кислоты, итаконовой кислоты, молочной кислоты, глюконовой кислоты); кетонов (например, ацетона); аминокислот (например, глутаминовой кислоты); газов (например, Н₂ и СО₂); антибиотиков (например, пенициллина и тетрациклина); ферментов; витаминов (например, рибофлавина, В12, бета-каротина) и/или гормонов. Ферментация включает ферментации, применяемые для промышленного приготовления пригодных для потребления человеком алкогольных продуктов (например, пива и вина). Ферментация включает также анаэробные ферментации, например, для производства различных видов биотоплива. Для осуществления ферментации можно использовать любой организм, пригодный для применения на требуемой стадии ферментации, включая (но не ограничиваясь только ими) бактерии, грибы, архебактерии и одноклеточные организмы. К пригодным ферментирующим организмам относятся организмы, которые могут прямо или косвенно превращать моно-, ди- и трисахариды, прежде всего глюкозу и мальтозу, или любую другую полученную из биомассы молекулу в требуемый продукт ферментации (например, этанол, бутанол и т.д.). К пригодным ферментирующим организмам относятся также организмы, которые могут превращать не относящиеся к сахарам молекулы в требуемый продукт ферментации. Указанные организмы и методы ферментации известны специалистам в данной области.

Понятие биотопливо в контексте настоящего описания относится к любому биотопливу, полученному с помощью аэробной или анаэробной ферментации растительного материала. Примером биотоплива, полученного путем аэробной ферментации, является (но не ограничиваясь только им) биоэтанол. Примерами биотоплива, которое можно получать путем анаэробной ферментации, являются (но не ограничиваясь только ими) биогазы и/или дизельное биотопливо. Методы аэробной и/или анаэробной ферментации известны специалисту в данной области.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение относится к трансгенным растениям сахарной свеклы, для которых характерен фенотип замедленного стрелкования. Окультуренная сахарная свекла (Ве1а уи1дат18 88р. уи1дат18 Ь) представляет собой двулетнее растение, которое в первый год образует запасающий корень и листовую розетку. Удлинение побега (стрелкование) и образование цветка начинается после периода низкой температуры, однако для многих диких представителей свекольных В. уи1даг18 88р. тагШта характерен однолетний тип развития в результате присутствия обусловливающего стрелкование гена В в локусе В. Ген ВОЬТ1ЫО (В-ген) ответствен за детерминацию признака однолетности у сахарной свеклы. Однолетность у видов р. Ве1а рассматривается как моногенный и доминантный признак. Растения, несущие доминантный аллель В, обладают способностью переходить от ювенильной к репродуктивной стадии независимым от яровизации образом, что отличает их от двулетних растений, которые несут Ь-аллель, при наличии которого яровизация является совершенно необходимой для того, чтобы могло происходить стрелкование и последующее цветение. Доминантный аллель локуса В часто встречается у различных диких видов свекольных, и он вызывает стрелкование в течение периодов с длинным световым днем и у таких растений отсутствует необходимость в низких температурах, которые, как правило, требуются для двулетних культиваров (АЬе и др., 1997), несущих рецессивный аллель. Хотя известно, что ген В играет решающую роль в яровизационном ответе у сахарной свеклы, сам ген к настоящему времени не идентифицирован.

При создании настоящего изобретения был использован подход, основанный на применении генакандидата, для идентификации и характеризации предполагаемых контролирующих стрелкование генов у сахарной свеклы. При использовании этого подхода была идентифицирована Е§Т-последовательность, имеющая регистрационный номер СУ301305, в качестве предполагаемого гомолога гена РКК7 свеклы с помощью оценки гомологии ВЬА§Т-методом (см. пример 1.1). Частью соответствующей аминокислотной последовательности является мотив домена-приемника регулятора псевдоответа (РНК, р£ат00072) или домена-приемника сигнала (КЕС, СЙ00156) (фиг. 1), отличительного признака семейства генов РКК, которые все, вероятно, имеют решающее значение при некоторых связанных с циркадными ритмами (внутренними часами организма) событиях (ШкаписЫ и др., 2005). На фиг. 2 представлено сравнение аминокислотной последовательности СУ301305 и РКК7, ее ближайшего гомолога из АгаЬМор818. Ген регулятора псевдоответа 7 (РЗЕИОО КЕ§РОЫ§Е КЕОиЬАТОК 7) (РКК7), впервые описанный у АгаЫйор818, является представителем семейства генов регуляторов псевдоответа (РКК1 или ТОС1, РКК3,

- 19 028355

ΡΚΚ5, ΡΚΚ7 и ΡΚΚ9), которые все содержат два характерных мотива: домен-приемник регулятора ответа (КЕС) и ССТ-домен. Уровни транскрипции представителей ΡΚΚ-семейства колеблются в циркадном ритме, что позволяет предположить, что их белки тесно связаны с внутренними часами организма. Так, ΡΚΚ7 описан в качестве компонента чувствительной к температуре циркадной системы у АгаЫбро818 (ШкашЫй и др., 2007; За1оте и МсС1ип§, 2005). У растений внутренние часы организма участвуют в регуляции ряда фундаментальных биологических процессов, включая движение листьев, ежедневные изменения активности фотосинтеза и фотопериодический контроль времени цветения (Ιιηαίζιιιηί и Кау, 2006; Ζ^ΐ-ΐ и др., 2007). В настоящее время гомологи ΡΚΚ7 идентифицированы и охарактеризованы у ячменя, пшеницы и риса (ΗνΡΡΌ, ΤηΡΡΩ и 08ΡΚΚ37) и установлено, что они являются основными определяющими факторами фотопериодического ответа у зерновых культур.

Одним из объектов изобретения являются последовательности нескольких аллелей ΒνΡΚΚ7, ассоциированных с однолетним или двулетним типом развития, предпочтительно последовательности, представленные в ЗЕф ГО N0: 1, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 53 или 54, которые кодируют белок, который является функциональным эквивалентом белка гена Β.

На основе ЕЗГОпоследовательности амплифицировали и секвенировали частичный ΡΚΚ7-фрагмент длиной примерно 0,5 т.п.н. (см. пример 1.1). Эксперименты по картированию, проведенные с использованием Р2-популяции, включающей 198 растений, которые получали скрещиванием однолетней линии и двулетней линии, полиморфной по одному З№ в положении № 160, продемонстрировали, что ген ΒνΡΚΚ7 картирован на хромосоме II на расстоянии примерно 1 сМ по ходу транскрипции относительно маркера СЛ31 (фиг. 4), в области, которая, как известно, содержит ген В, обусловливающий независимое от яровизации цветение (МоЬгтд и др., 2004; СааТаг и др., 2005). Результаты анализа с использованием маркеров продемонстрировали точное соответствие между предсказанным генотипом гена Β и генотипом гена ΒνΡΚΚ7(см. пример 1.1). Результаты дополнительного картирования, т.е. определение положения на карте, в сочетании с биологической функцией, связанной с чувствительным к температуре циркадным ритмом (За1оте и МсС1ип§, 2005), подтвердили, что ΒνΡΚΚ7 является наиболее перспективным кандидатом на роль гена Β (пример 1.1).

На следующей стадии библиотеку ΒΑС подвергали скринингу с использованием стандартных методов ПЦР, которые хорошо известны специалистам в данной области, для выделения полноразмерной геномной последовательности гена ΡΚΚ7 сахарной свеклы (см. пример 1.2). Применяемая библиотека ΒΑС представляла собой библиотеку ΒΑί'.\ созданную с использованием ДНК из поступающего в продажу двулетнего культивара сахарной свеклы Н20. Осуществляли двукратный отбор частично расщепленных (ΗίηάΙΙΙ) высокомолекулярных (НМА) ДНК-фрагментов размером 100-400 т.п.н. ДНКфрагменты встраивали путем лигирования в вектор рΒе1оΒΑС-Κаη. Библиотека содержала 57600 клонов со средним размером вставки примерно 120 т.п.н., что соответствует примерно 8-кратному перекрытию генома. Избыточность оценивали путем скрининга с использованием однокопийных зондов, было установлено, что частота клонов из митохондриальной или плазмидной ДНК составляла менее 1%. Последующий скрининг пулов ДНК в отношении ΒνΡΚΚ7-фрагментов привел к положительной идентификации ΒΑС-клона, несущего соответствующий фрагмент.

Для получения полноразмерной последовательности гена ΒνΡΚΚ7 ранее идентифицированный ΒΑС-клон ЩАС ЗΒΑ079-^24) секвенировали с использованием стандартного метода секвенирования. Два неперекрывающихся набора последовательных фрагментов, последовательность которых обладала гомологией с последовательностью ЕЗΤ СУ301305, затем можно объединять в одной последовательности (ЗЕф ГО N0: 8). На основе сравнительного анализа первичной структуры последовательностей набора последовательных фрагментов ΒΑС и ЕЗΤ СУ301305 и на основе гомологии с последовательностью гена ΡΚΚ7 из АгаЫбор818 удалось предсказать предполагаемую структуру гена ΒνΡΚΚ7 сахарной свеклы, включающую интроны и экзоны, которая представлена на фиг. 5. На основе указанной предсказанной геномной последовательности удалось продемонстрировать, что участок полного гена ΒνΡΚΚ7 размером 3,6 т.п.н. простирается на последовательности против хода транскрипции от стоп-кодона ΑΤС и участок размером 2,2 т.п.н. простирается по ходу транскрипции относительно кодирующей области. Соответствующая аминокислотная последовательность ΒνΡΚΚ7 представлена в ЗЕф ГО N0: 11. Сравнительный анализ первичной структуры аминокислотной последовательности ΒνΡΚΚ7 и всех представителей семейства ΡΚΚ-гена из АгаЫбор818, включая ТОС1(ЕКК1), ΡΚΚ3, ΡΚΚ5, ΡΚΚ7 и ΡΚΚ9, позволил проиллюстрировать выраженную консервативность мотива домена-приемника регулятора псевдоответа (ΡΚΚ) (р£ат00072) вблизи ЛН₂-конца и ССТ-мотива (р£ат06203) на С00Н-конце (фиг. 6). Помимо гомологии с семейством ΡΚΚ-гена из АгаЫбор818 ΒνΡΚΚ7 характеризуется также выраженной гомологией с ΡΚΚ7 зерновых культур, что проиллюстрировано с помощью филогенетического дерева, представленного на фиг. 7. Установлено, что гомолог ΡΚΚ7 в зерновых культурах, более известный как Ρрά, представляет собой основной определяющий фактор фотопериодической реакции (Τιιγικγ и др., 2005; Βеа1е8 и др., 2007). Его роль в яровизационном ответе, как это обнаружено для сахарной свеклы, пока не установлена.

С учетом их гомологии с известными контролирующими время цветения генами или их возможной регуляторной функции, которую можно предположить исходя из присутствия консервативных доменов, характерных для регуляторных белков, удалось идентифицировать несколько генов в качестве потенци- 20 028355 альных кандидатов на роль гена В. Эти гены нуждаются в дополнительной валидации с помощью опытов, оценивающих аллельную вариабельность и/или генную экспрессию, генотипов, характерных для однолетнего и двулетнего типа развития, или на основе экспериментов по оценке комплементарности или выключения с использованием трансгенных подходов.

Признак однолетнего типа развития растений проявляется в зависимости от состояния гена В как моногенный доминантный признак; таким образом, потребность в яровизации у двулетних растений является рецессивной. Таким образом, можно предположить, что трансформация определяющего однолетний тип развития аллеля ΒνΡΚΚ7 в характерный для двулетнего типа развития генотип приводит к включению признака ежегодного цветения, в характерный для двулетнего типа развития акцепторный генотип. Для подтверждения этой гипотезы кодирующей последовательностью определяющего однолетний тип развития аллеля гена ΒνΡΚΚ7, находящейся под контролем характерных для однолетнего типа развития промотора и фрагмента терминатора, трансформируют характерный для двулетнего типа развития генотип, такой, например, как С018 (см. пример 2). Трансформацию можно осуществлять методами, известными в данной области, такими как методы, описанные у Сйапд и др., 2002, используя меристему сахарной свеклы в качестве эксплантата и ген фосфоманнозоизомеразы (ΡΜΙ) в качестве селектируемого маркера. Трансгенные проростки отбирают по признаку экспрессии маркера селекции, такого, например, как ΡΜΙ-активность ЦоегеЪо и др., 1998), и затем укореняют, высаживают в почву и переносят в теплицу. В качестве отрицательного контроля используют нетрансгенные проростки, которые подвергают такой же процедуре регенерации ίη νίΐτο, но без заражения АдгоЪас1егшт и селекции. Растения выращивают в вегетационных камерах при постоянной температуре 18°С и фотопериоде 17 ч света и 7 ч темноты. В этих условиях (без индукции стрелкования с помощью низких температур) нетрансгенные двулетние контрольные растения не обладают какими-либо признаками стрелкования в течение периода наблюдения, составляющего вплоть до 12 недель, в то время как однолетние контрольные растения в норме начинают выбрасывать стрелку в пределах 6-8-недельного периода времени. В отличие от нетрансгенных двулетних контрольных растений у большинства трансгенов стрелкование начинается через 4-10 недель, и они обладают основным признаком, характерным для однолетних растений, несмотря на их генетический фон, соответствующий двулетним растениям. Трансгенные растения, у которых обнаружено стрелкавание и цветение, подвергают перекрестному опылению двулетней поддерживающей линией с получением потомства. У растений-потомков оценивают активность ΡΜΙ и затем оценивают в отношении стрелкования и цветения без яровизации. Эти растения-потомки характеризуются коэффициентом сегрегации 1:1 и прямой корреляцией между активностью ΡΜΙ и признаком однолетности. Эти данные подтверждают причинную связь между ΒνΡΡΚ7 и независящим от яровизации цветением у сахарной свеклы.

При создании настоящего изобретения установлено также, что ΒνΡΚΚ7 играет основную роль в яровизационном ответе сахарной свеклы и поэтому его можно применять для создания устойчивости к стрелкованию у растений сахарной свеклы путем подавления яровизационного ответа. Согласно одному из объектов изобретения в результате ген ΒνΡΡΚ7 можно использовать для трансгенного подхода к получению трансгенных растений сахарной свеклы, содержащих полинуклеотиды, стабильно интегрированные в геном сахарной свеклы. В частности, после экспрессии из генома продукт экспрессии можно применять для модуляции яровизационного ответа растения сахарной свеклы путем подавления или понижающей регуляции экспрессии гена Β.

Представляющие интерес последовательности ДНК собирают в виде химерных конструкций, которые содержат нуклеотидную последовательность, подлежащую экспрессии в трансгенном растении, под контролем регуляторных элементов, которые функционируют в растениях. Методы сборки указанных химерных конструкций хорошо известны специалисту в данной области.

Получение достаточных уровней трансгенной экспрессии в соответствующих растительных тканях является важным аспектом выращивания созданных с помощью генной инженерии культурных растений. Экспрессия гетерологичных последовательностей ДНК в растении-хозяине зависит от присутствия функционально связанного промотора, который функционирует в растении-хозяине. Выбор промоторной последовательности должен определять время, когда экспрессируется гетерологичная последовательность ДНК, и место в организме, где это происходит.

Например, можно применять растительный промоторный фрагмент, который обеспечивает экспрессию гена во всех тканях регенерированного растения. Указанные промоторы в контексте настоящего описания обозначены как конститутивные промоторы, и они обладают активностью при большинстве условий окружающей среды и стадиях развития или клеточной дифференцировки. Примерами конститутивных промоторов являются область инициации транскрипции вируса мозаики цветной капусты (ί'τιΜν) 358, 1'- или 2'-промотор, выведенный из Т-ДНК АдгоЪасЮгшт ЩтеГааещ. и другие области инициации транскрипции из различных растительных генов, которые известны специалистам в данной области. Такие гены включают, например, ген АР2, АСТ11 из АгаЪМор818 (Ниапд и др., ΡΙαηΙ Μοί. Βίοι. 33, 1996, с. 125-139), Са13 из АгаЫбор818 (СеηΒаηк N0: И43147, 2йопд и др., Μοί. Оеп. Оепеб 251, 1996, с. 196-203), ген, кодирующий стеароил-АПБ (ацилпереносящий белок)-десатуразу из Β^а88^са пари8 (ОепЪапк N0: Х74782, 8о1осотЪе и др., ΡΠώ ΡΗу8^ο1. 104, 1994, с. 1167-1176), ΟΡΜ из кукурузы (Оеп- 21 028355

Βаηк N0: Х15596, Марте/ и др., ί. Мо1. ΒίοΙ 208, 1989, с. 551-565) и Орс2 из кукурузы (ОепБапк N0: И45855, МащипаШ и др., ΡΗηί Мо1. ΒίοΙ. 33, 1997, с. 97-112).

В другом варианте промотор может обеспечивать экспрессию молекул нуклеиновых кислот в конкретной ткани или может более точно контролироваться условиями окружающей среды или стадией развития. Примерами условий окружающей среды, которые могут влиять на транскрипцию с помощью индуцибельных промоторов, являются анаэробные условия, повышенная температура или присутствие света. Такие промоторы в контексте настоящего описания обозначены как индуцибельные или тканеспецифические промоторы. Специалисту в данной области должно быть очевидно, что тканеспецифический промотор может обеспечивать экспрессию функционально связанных последовательностей в тканях, отличных от ткани-мишени. Таким образом, в контексте настоящего описания тканеспецифический промотор представляет собой промотор, который обеспечивает экспрессию прежде всего в тканимишени, но может контролировать также определенный уровень экспрессии в других тканях.

Примерами промоторов, действие которых зависит от стадии развития, являются промоторы, которые инициируют транскрипцию только (или практически только) в определенных тканях, таких как плод, семена или цветки. Промоторы, которые обеспечивают экспрессию нуклеиновых кислот в семяпочках, цветках или семенах, являются наиболее предпочтительными согласно настоящему изобретению. В контексте настоящего описания под специфическим или предпочтительным для семени промотором подразумевается промотор, который обеспечивает экспрессию специфически или предпочтительно в тканях семян, например, указанные промоторы могут быть специфическими для семяпочки, специфическими для зародыша, специфическими для эндосперма, специфическими для интегумента, специфическими для семенной оболочки или специфическими для определенных комбинаций этих органов. Их примером является промотор из специфического для семяпочки гена ΒΕΕ1, который описан у К^ег и др., Се11 83, 1995, с. 735-742 (ОепБапк N0: И39944). Другие пригодные специфические для семян промоторы выводят из следующих генов: МАС1 из кукурузы (δίκπάαπ и др., Оепе1Ю 142, 1996, с. 1009-1020, Са13 из кукурузы (ОеηБаηк N0: Ь05934, АЪ1ег и др., ΡΠώ Мо1. Βίο1. 22, 1993, с. 10131-1038), кодирующий олеозин ген размером 18 т.п.н. из кукурузы (ОеηБаηк №, 105212, Ьее и др., ΡΠώ Мо1. Βίο1. 26, 1994, с.1981-1987), ущрагои8-1 из Απώίάορδίδ (ОепЪапк N0: И93215), кодирующий олеозин ген из Απώίάορδίδ (ОепЪапк N0: Ζ17657), А1тус1 из ΑιπΜάορδίδ (Игао и др., Ρίαπί Мо1. Βίο1. 32, 1996, с. 571-576), семейство генов 2δ запасающего белка семян ΑιπΜάορδίδ (Сопсеюао и др., Ρίαπί 5, 1994, с. 493-505), кодирующий олеозин ген размером 20 т.п.н. из ΒιοίδΐοΗ ικιριίδ (ОеηБаηк N0: М63985), парА из Βπ·ΐδδχ;·ι ικιριίδ (ОеηБаηк N0: 102798, ^е1Аоп и др., ΙΒΕ 26, 1987, с. 12196-1301, семейство генов напина из ΒιοίδΐοΗ ικιριίδ (δ_)οάаЫ и др., ΡΙηπΙη 197, 1995, с. 264-271), ген, кодирующий запасающий белок 28, из Βπ·ΐδδΚ;·ι парш (Ό;-ΐδ§ир!а и др., Оепе 133, 1993, с. 301-302), гены, кодирующие олеозин А (ОепЪапк N0: И09118) и олеозин В (ОепЪапк N0: И09119) из сои, и ген, кодирующий низкомолекулярный богатый серой белок из сои (СНо1 и др., Мо1. Оеп., Оепе!. 246, 1995, с. 266-268).

В другом варианте можно идентифицировать конкретные последовательности, представляющие собой промотор с требуемыми характеристиками экспрессии или промотор с повышенной экспрессионной активностью, или эти или подобные последовательности интродуцировать в последовательности посредством мутации. Кроме того, можно осуществлять мутагенез этих последовательностей для повышения экспрессии трансгенов в конкретных видах.

Кроме того, можно применять промоторы, в которых объединены элементы более одного промотора. Например, в И8 5491288 описана комбинация промотора вируса мозаики цветной капусты (СаМУ) и промотора гистона. Таким образом, элементы промоторов, представленных в настоящем описании, можно объединять с элементами других промоторов.

Для применения согласно настоящему изобретению доступны различные регулирующие транскрипцию 5'- и 3'-последовательности. Терминаторы транскрипции ответственны за терминацию транскрипции и правильное полиаденилирование мРНК. 3'-нетраслируемая регуляторная последовательность ДНК предпочтительно включает от примерно 50 до примерно 1000, более предпочтительно от примерно 100 до примерно 1000 пар оснований (нуклеотидов) и содержит растительные терминирующие транскрипцию и трансляцию последовательности. Приемлемые терминаторы транскрипции и терминаторы, для которых известно, что они функционируют в растениях, представляют собой терминатор 358 СаМУ, терминатор 1т1, терминатор нопалинсинтазы, терминатор Е9 гЪс8 гороха, терминатор для транскрипта Т7 из гена октопинсинтазы АдгоЪас1егшт ЮтеГашещ и 3'-конец генов протеазных ингибиторов I или II из картофеля или томатов, хотя можно применять также другие 3'-концевые элементы, известные специалистам в данной области. В другом варианте можно применять также терминатор коиксина гамма, олеозина 3 или другие терминаторы из рода Со1х.

Предпочтительными 3'-элементами являются элементы из гена нопалинсинтазы АдгоЪас1егшт 1итеГасаепз (Беνаη и др., 1983), терминатор для транскрипта Т7 из гена октопинсинтазы АдгоЪас1егшт ΙιιтеГасаепз и 3'-концевые элементы генов протеазных ингибиторов I или II из картофеля или томатов.

Поскольку последовательность ДНК, расположенная между сайтом инициации транскрипции и стартовым кодоном кодирующей последовательности, т. е. нетранслируемая лидерная последовательность, может влиять на экспрессию гена, может оказаться желательным применять конкретную лидер- 22 028355 ную последовательность. Считается, что предпочтительными лидерными последовательностями являются последовательности, которые включают последовательности, для которых предсказана способность обеспечивать оптимальную экспрессию присоединенного гена, т.е. предпочтительные консенсусные лидерные последовательности, которые могут повышать или поддерживать стабильность мРНК и предупреждать несоответствующую инициацию трансляции. Выбор указанных последовательностей должен быть очевиден специалистам в данной области в свете настоящего описания. Наиболее предпочтительными являются последовательности, выведенные из генов, характеризующихся высоким уровнем экспрессии в растениях.

Другими последовательностями, для которых обнаружена способность повышать генную экспрессию в трансгенных растениях, могут служить интронные последовательности (например, из генов АДЫ, Ьгоп/с1. ас4ш1, асДи 2 (ЛУО 00/760067), или интрон синтазы сахарозы) и вирусные лидерные последовательности (например, из вирусов ТМУ, МСМУ и АМУ). Например, известно несколько нетранслируемых лидерных последовательностей, полученных из вирусов, которые обладают способностью повышать экспрессию. В частности, установлено, что лидерные последовательности из вируса табачной мозаики (ТМУ), вируса хлорозной пятнистости кукурузы (МСМУ) и вирус мозаики люцерны (АМУ) обладают эффективностью в отношении повышения экспрессии (например, ОаШе и др., 1987; бки/екЮ и др., 1990). Другие известные в данной области лидерные последовательности представляют собой (но не ограничиваясь только ими): лидеры пикорнавирусов, например лидер ЕМСУ (5'-некодирующая область вируса энцефаломиокардита) (Е1гоу-81еш и др., 1989); лидеры потивирусов, например лидер ТЕУ (вирус табачной гравировки); лидер МОМУ (вирус мозаичной карликовости кукурузы); лидер человеческого белка, связывающего тяжелую цепь иммуноглобулинов (ΒίΡ) (Масе_)ак и др., 1991); нетранслируемый лидер из мРНК оболочечного белка вируса мозаики люцерны (АМУ Κ.ΝΛ 4), (ЛоЬПпд и др., 1987), лидер вируса табачной мозаики (ТМУ), (ОаШе и др., 1989) и лидер хлорозной пятнистости кукурузы (МСМУ) (Ьотте1 и др., 1991) (см. также БеПа-Сюрра и др., 1987).

При необходимости можно включать также регуляторные элементы, такие как интрон 1 АДЬ (СаШк и др., 1987), интрон синтазы сахарозы (УакП и др., 1989) или элемент ТМУ-омега (ОаШе и др., 1989).

Примерами энхансеров являются элементы промотора 358 СаМУ, генов октопинсинтазы (ЕШк и др., 1987), гена актина I риса, гена алкогольдегидрогеназы кукурузы (СаШк и др., 1987), гена I морщинистости кукурузы (УакП и др., 1989), элемент ТМУ-омега (ОаШе и др., 1989) и промоторы из эукриотических организмов, кроме растений (например, дрожжей; Ма и др., 1988).

Одним из основных методов контроля экспрессии является обеспечение пониженной экспрессии. Известны два основных метода для достижения пониженной экспрессии, которые обычно обозначают как антисмысловая регуляция по типу отрицательной связи (понижающая регуляция) и смысловая регуляция по типу отрицательной связи (понижающая регуляция) (смысловую регуляцию по типу отрицательной связи обозначают также как косупрессия). В целом, эти процессы обозначают как молчание генов. Оба эти метода позволяют осуществлять ингибирование экспрессии гена-мишени.

Изобретение относится к различным стратегиям снижения экспрессии, уровня, активности и/или функции молекулы нуклеиновой кислоты, предлагаемой в изобретении. Специалисту в данной области очевидно, что существуют различные методы воздействия требуемым образом на экспрессию, уровень, активность и/или функцию молекулы нуклеиновой кислоты, предлагаемой в изобретении. Их примерами являются (но не ограничиваясь только ими).

Смысловая супрессия.

Изменение экспрессии нуклеотидной последовательности, предлагаемой в настоящем изобретении, предпочтительно снижение ее экспрессии, получают с помощью смысловой супрессии (описание см., например, у Шгдепкеп и др., Р1ап1 Мо1. ΒίοΙ. 31, 1996, с. 957-973). В этом случае полную нуклеотидную последовательность, предлагаемую в настоящем изобретении, или ее часть включают в молекулу ДНК. Молекулу ДНК предпочтительно функционально связывают с промотором, который обладает способностью функционировать в клетке, содержащей ген-мишень, предпочтительно растительной клетке, и интродуцируют в клетку, в которой может происходить экспрессия нуклеотидной последовательности. Нуклеотидную последовательность встраивают в молекулу ДНК в смысловой ориентации, т.е. таким образом, что кодирующая цепь нуклеотидной последовательности может транскрибироваться. В предпочтительном варианте осуществления изобретения нуклеотидная последовательность является полностью транслируемой, и вся генетическая информация, содержащаяся в нуклеотидной последовательности или ее части, транслируется в полипептид. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения нуклеотидная последовательность является частично транслируемой, и продуктом трансляции является короткий пептид. В предпочтительном варианте осуществления изобретения для этой цели используют инсерцию по меньшей мере одного преждевременного стоп-кодона в нуклеотидную последовательность, что снижает трансляцию наполовину. В другом более предпочтительном варианте осуществления изобретения нуклеотидная последовательность транскрибируется, но при этом не образуется продукт трансляции. Для этой цели, как правило, используют удаление стартового кодона, например АТО, полипептида, кодируемого нуклеотидной последовательностью. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения молекулу ДНК, которая содержит нуклеотидную последователь- 23 028355 ность или ее часть, стабильно интегрируют в геном растительной клетки. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения молекулу ДНК, которая содержит нуклеотидную последовательность или ее часть, включают во внехромосомно реплицирующуюся молекулу.

В трансгенных растениях, которые содержат одну из описанных непосредственно выше молекул ДНК, экспрессию нуклеотидной последовательности, соответствующей нуклеотидной последовательности, которая содержится в молекуле ДНК, предпочтительно понижают. Предпочтительно нуклеотидная последовательность, входящая в ДНК, идентична нуклеотидной последовательности, экспрессию которой понижают по меньшей мере на 80%, более предпочтительно идентична по меньшей мере на 90%, еще более предпочтительно идентична по меньшей мере на 95% и наиболее предпочтительно идентична по меньшей мере на 99%.

Антисмысловая супрессия.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения изменение экспрессии нуклеотидной последовательности, предлагаемой в настоящем изобретении, предпочтительно снижение ее экспрессии, осуществляют с помощью антисмысловой супрессии. Полную нуклеотидную последовательность, предлагаемую в настоящем изобретении, или ее часть включают в молекулу ДНК. Молекулу ДНК предпочтительно функционально связывают с промотором, который обладает способностью функционировать в клетке, содержащий ген-мишень, и интродуцируют в растительную клетку, в которой может происходить экспрессия нуклеотидной последовательности. Нуклеотидную последовательность встраивают в молекулу ДНК в антисмысловой ориентации, т.е. таким образом, что может транскрибироваться обратный комплемент (называемый также иногда некодирующей цепью) нуклеотидной последовательности. В предпочтительном варианте осуществления изобретения молекулу ДНК, которая содержит нуклеотидную последовательность или ее часть, стабильно интегрируют в геном растительной клетки. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения молекулу ДНК, которая содержит нуклеотидную последовательность или ее часть, включают во внехромосомно реплицирующуюся молекулу. С целью дополнительной иллюстрации ниже процитирован ряд публикаций, в которых описан указанный подход (Огееп Р.1. и др., Апп. Кеу. ВюсНет. 55, 1986, с. 569-597; уап бег Кго1 А. К. и др., Апйкепке Ыис. АсШз & Рго1еш8, 1991, с. 125-141; АЪе1 Р. Р. и др., Ргос. Νίώ. Асай. 8ά. США 86, 199, с. 6949-6952; Ескег кК. и др., Ргос. Ν;·ιΐ1. Асай. 8ск США 83, август 1986 г., с. 5372-5376).

Гомологичная рекомбинация.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения по меньшей мере одну геномную копию, соответствующую нуклеотидной последовательности, предлагаемой в настоящем изобретении, модифицируют в геноме растения путем гомологичной рекомбинации, что дополнительно проиллюстрировано у Ра5/ко\\ък1 и др., ЕМВО 1оигпа1 7, 1988, с. 4021-4026. Этот метод основан на способности гомологичных последовательностей распознавать друг друга и обмениваться друг с другом нуклеотидными последовательностями с помощью процесса, известного как гомологичная рекомбинация. Гомологичная рекомбинация может происходить между хромосомной копий нуклеотидной последовательности в клетке и внесенной копией нуклеотидной последовательности, интродуцированной в клетку путем трансформации. Таким образом, интродуцируют специфические модификации точно в хромосомную копию нуклеотидной последовательности. Согласно одному из вариантов осуществления изобретения можно модифицировать регуляторные элементы нуклеотидной последовательности, предлагаемой в настоящем изобретении. Указанные регуляторные элементы легко получать путем скрининга геномной библиотеки с использованием нуклеотидной последовательности, предлагаемой в настоящем изобретении, или ее части в качестве зонда. Существующие регуляторные элементы заменяют различными регуляторными элементами, изменяя тем самым экспрессию нуклеотидной последовательности, или их подвергают мутации или изымают путем делеции, упраздняя тем самым экспрессию нуклеотидной последовательности. Согласно другому варианту осуществления изобретения нуклеотидную последовательность модифицируют путем делеции части нуклеотидной последовательности или полной нуклеотидной последовательности или с помощью мутации. Экспрессия мутантного полипептида в растительной клетке подпадает также под объем настоящего изобретения. Опубликовано более современный усовершенствованный вариант этого метода, предназначенный для нарушения эндогенных растительных генов (Кетрш и др., №Шге 389, 1997, с. 802-803 и М1ао и Ьат, Р1жИ 1., 7, 1995, с. 359-365).

Специалисту в данной области известны многочисленные приемлемые методы целенаправленной модификации геномных последовательностей. Они включают, в частности, такие методы, как получение молчащих (выключенных) мутантов с помощью процессов целенаправленной гомологичной рекомбинации, например, путем создания стоп-кодонов, сдвигов рамки считывания и т.д. (НоЬп В. и РисЫа Н.,

- 24 028355

Ргос №л1 Асаб δοί США 96. 1999. с. 8321-8323) или целенаправленной делеции или инверсии последовательностей с помощью. например. специфических для последовательности рекомбиназ или нуклеаз. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения мутацию в хромосомной копии нуклеотидной последовательности интродуцируют путем трансформации клетки химерным олигонуклеотидом. состоящим из смежного участка остатков РНК и ДНК. имеющего конформационные особенности дуплексной структуры с двумя кэпами в виде шпилек на концах. Дополнительной особенностью олигонуклеотида является. например. 2'-О-метилирование остатков РНК. Последовательность РНК/ДНК создают так. чтобы она была выровнена с последовательностью хромосомной копии нуклеотидной последовательности. предлагаемой в настоящем изобретении. и содержала требуемую нуклеотидную замену. Например. этот метод дополнительно описан в υδ 5501967 и у Ζΐιιι и др.. Ргос. №л1. Асаб. δα. США 96. 1999. с. 8768-8773.

Рибозимы.

В другом варианте осуществления изобретения РНК. кодирующую полипептид. предлагаемый в настоящем изобретении. расщепляют с помощью каталитической РНК или рибозима. специфического для указанной РНК. Рибозим экспрессируется в трансгенных растениях. что приводит к снижению уровня РНК. кодирующей полипептид. в растительных клетках и в результате к снижению уровня полипептида. накапливаемого в клетках. Этот метод описан также в υδ 4987071.

Доминантно-негативные мутации.

В другом варианте осуществления изобретения изменяют активность полипептида. кодируемого нуклеотидными последовательностями. предлагаемыми в настоящем изобретении. Для этой цели используют экспрессию доминантно-негативных мутантов белков в трансгенных растениях. что приводит к потере активности эндогенного белка.

Аптамеры.

В другом варианте осуществления изобретения активность полипептида. предлагаемого в настоящем изобретении. ингибируют путем экспрессии в трансгенных растениях лигандов нуклеиновых кислот. так называемых аптамеров. которые специфически связываются с белком. Аптамеры предпочтительно получают с помощью метода δΕΕΕΧ (системная эволюция лигандов экспоненциальным обогащением). При применении метода δΕΕΕΧ перспективную смесь (смесь-кандидат) одноцепочечных нуклеиновых кислот. содержащих области рандомизированной последовательности. приводят в контакт с белком. и нуклеиновые кислоты. обладающие повышенной аффинностью к мишени. отделяют от остальной части перспективной смеси. Отделенные нуклеиновые кислоты амплифицируют с получением обогащенной лигандами смеси. После нескольких итераций получают нуклеиновую кислоту. обладающую оптимальной аффинностью к полипептиду. и применяют для экспрессии в трансгенных растениях. Этот метод описан также в υδ 5270163.

Белки. содержащие домен цинковых пальцев.

Для изменения экспрессии нуклеотидной последовательности можно применять также белок. содержащий домен цинковых пальцев. который связывается с нуклеотидной последовательностью. предлагаемой в настоящем изобретении. или с ее регуляторной областью. Предпочтительно транскрипцию нуклеотидной последовательности понижают или повышают. Белки. содержащие домен цинковых пальцев. описаны. например. у ВеегН и др.. ΡNАδ 95. 1988. с. 14628-14633 или в XV0 95/19431. XV0 98/54311 или XV0 96/06166. все публикации полностью включены в настоящее описание в качестве ссылки.

бкРНК.

Для изменения экспрессии нуклеотидной последовательности. предлагаемой в настоящем изобретении. можно использовать также интерференцию бкРНК (РНК1). Процесс регуляции генов с помощью двухцепочечной РНК (интерференция с помощью двухцепочечной РНК; бкРНКД многократно описан для животных и растительных организмов (например. М;Ц/ке М.А. и др.. Р1аШ Мо1. ΒίοΙ. 43. 2000. с. 401415; Р1ге А. и др.. ХаПие 391. 1998. с. 806-811; ΧΧΌ 99/32619; ΧΧΌ 99/53050; ΧΧΌ 00/68374; ΧΧΌ 00/44914; ΧΧ0 00/44895; Χ0 00/49035; Χ0 00/63364. все публикации полностью включены в настоящее описание в качестве ссылки). Процессы и методы. описанные в представленных в настоящем описании ссылках. прежде всего касательно бкРНКц основаны на том явлении. что одновременная интродукция комплементарной цепи и контурной цепи транскрипта гена подавляет экспрессию соответствующего гена с высокой эффективностью. Предпочтительно обусловленный этим явлением фенотип очень напоминает фенотип. соответствующий молчащему мутанту (ХХа1ег1юи5е Р.М. и др.. Ргос №16 Асаб δα США 95. 1998. с. 13959-13964). Установлено. что использование процесса бкРНКл является наиболее эффективным и предпочтительным путем снижения экспрессии маркерного белка.

Двухцепочечная молекула РНК (бкРНК) согласно изобретению предпочтительно означает одну или несколько последовательностей рибонуклеиновых кислот. которые с помощью комплементарных последовательностей. теоретически (например. на основе правила спаривания оснований Уотосона и Крика) и/или фактически (например. благодаря экспериментам по гибридизации ίη νίΙΐΌ и/или ίη νί\Ό) обладают способностью образовывать двухцепочечные структуры ДНК. Специалисту в данной области известен тот факт. что образование двухцепочечных структур РНК представляет собой равновесное состояние.

- 25 028355

Предпочтительно соотношение двухцепочечных молекул и соответствующих диссоциированных форм составляет по меньшей мере 1:10, предпочтительно 1:1, более предпочтительно 5:1, наиболее предпочтительно 10:1.

Настоящее изобретение относится также к двухцепочечным молекулам РНК, которые при их интродукции в организм растения (или в полученную из него клетку, ткань, орган или материал для размножения) вызывают снижение уровня экспрессии по меньшей мере одного гена-мишени. Двухцепочечная молекула РНК, предназначенная для снижения уровня экспрессии гена-мишени, согласно настоящему описанию предпочтительно содержит:

а) смысловую цепь РНК, которая включает по меньшей мере одну рибонуклеотидную последовательность, практически идентичную по меньшей мере части смыслового РНК-транскрипта генамишени, и

б) антисмысловую цепь РНК, которая практически предпочтительно полностью комплементарна смысловой цепи РНК, указанной в подпункте а).

Практически идентичная означает, что последовательность бкРНК может включать также инсерции, делеции, а также отдельные точечные мутации при сравнении с последовательностью гена-мишени и несмотря на это обладает способностью эффективно снижать уровень экспрессии. Гомология (что будет описано ниже) между смысловой цепью ингибирующей бкРНК и по меньшей мере одной частью смыслового РНК-транскрипта нуклеотидной последовательности гена-мишени (или между антисмысловой цепью комплементарной цепи нуклеотидной последовательности гена-мишени) предпочтительно составляет по меньшей мере 75%, предпочтительно по меньшей мере 80%, более предпочтительно по меньшей мере 90%, наиболее предпочтительно 100%.

100%-ная идентичность последовательностей бкРНК и транскрипта гена маркерного белка не является абсолютно необходимой для эффективного снижения экспрессии гена-мишени. Таким образом, процесс предпочтительно допускает наличие отклонений в последовательности, причиной которых являются генетические манипуляции, полиморфизмы или эволюционная дивергенция. Так, можно, например, использовать бкРНК, которая создана исходя из последовательности гена-мишени первого организма для подавления экспрессии гена-мишени во втором организме. Для этой цели бкРНК предпочтительно включает области последовательности транскриптов генов-мишеней, которые соответствуют консервативным областям. Указанные консервативные области легко можно получать путем сравнений последовательностей.

В альтернативном варианте практически идентичную бкРНК можно определять также как нуклеотидную последовательность, которая обладает способностью к гибридизации с частью транскрипта гена-мишени.

Практически комплементарная означает, что антисмысловая цепь РНК может содержать также инсерции, делеции, а также отдельные точечные мутации по сравнению с комплементом указанной смысловой цепи РНК. Гомология между антисмысловой цепью РНК и комплементом смысловой цепи РНК предпочтительно составляет по меньшей мере 80%, предпочтительно по меньшей мере 90%, более предпочтительно по меньшей мере 95%, наиболее предпочтительно 100%.

Часть смыслового РНК-транскрипта нуклеотидной последовательности гена-мишени означает фрагмент РНК или мРНК, транскрибируемый или обладающий способностью к трансляции с нуклеотидной последовательности гена-мишени. В этом контексте фрагмент имеет последовательность, состоящую предпочтительно по меньшей мере из 20 оснований, предпочтительно по меньшей мере из 50 оснований, более предпочтительно по меньшей мере из 100 оснований, еще более предпочтительно по меньшей мере из 200 оснований, наиболее предпочтительно по меньшей мере из 500 оснований. Под это понятие подпадает также полная транскрибируемая РНК или мРНК. Под это понятие подпадают также последовательности, которые могут транскрибироваться в искусственных условиях с областей геновмишеней, которые в ином случае в естественных условиях не транскрибируются, например промоторные области.

ИкРНК может состоять из одной или нескольких цепей полирибонуклеотидов. В естественных условиях для достижения такой цели можно также интродуцировать множество индивидуальных молекул бкРНК, которые содержат в каждом случае один из указанных выше участков рибонуклеотидных последовательностей, в клетку или организм. Структура двухцепочечной бкРНК может формироваться на основе двух комплементарных разных цепей РНК или предпочтительно, на основе одной самокомплементарной цепи РНК. В этом случае смысловая цепь РНК и антисмысловая цепь РНК предпочтительно соединены друг с другом ковалентно с образованием инвертированного повтора.

Например, как описано в \У0 99/53050, бкРНК может содержать также структуру в виде шпильки в результате соединения смысловой и антисмысловой цепей с помощью соединяющей последовательности (линкер, например, интрон). Предпочтительными являются самокомплементарные структуры бкРНК, поскольку для них требуется только экспрессия последовательности РНК, и они всегда содержат комплементарные цепи РНК в эквимолярном соотношении. Соединяющая последовательность может предпочтительно представлять собой интрон (например, интрон гена δ^Εδ1 картофеля; Уапсапηеуΐ С.Р. и др., Мо1. Сеп. Сепеΐ 220(2), 1990, с. 245-250).

- 26 028355

Нуклеотидная последовательность, кодирующая άκΡΗΚ, может включать дополнительные элементы, такие, например, как сигналы терминации транскрипции или сигналы полиаденилирования.

При необходимости вступление в контакт двух цепей άκΡΗΚ в клетке или растении можно обеспечивать, например, следующим образом:

а) путем трансформации клетки или растения вектором, который содержит обе кассеты экспрессии,

б) путем совместной трансформации (котрансформация) клетки или растения двумя векторами, один из которых содержит кассеты экспрессии, несущие смысловую цепь, а другой содержит кассеты экспрессии, несущие антисмысловую цепь. Образование дуплекса РНК можно инициировать либо извне, либо внутри клетки.

ΌκΡΗΚ можно синтезировать либо ίη νί\Ό. либо ίη νίΐΐΌ. Для этой цели последовательность ДНК, кодирующую άκΡΗΚ, можно встраивать в кассету экспрессии под контролем по меньшей мере одного генетического контролирующего элемента (такого, например, как промотор). Полиаденилирование не является необходимым и в этом случае никогда не требуется присутствие каких-либо элементов для инициации трансляции. Предпочтительной является кассета экспрессии άκΡΗΚ, оказывающая целенаправленное действие на ген-мишень, присутствующий в трансформирующей конструкции или трансформирующем векторе. Для этой цели кассеты экспрессии, кодирующие антисмысловую цепь и/или смысловую цепь άκΡΗΚ, оказывающие целенаправленное действие на ген-мишень, или кодирующие самокомплементарую цепь άκΡΗΚ, предпочтительно встраивают в трансформирующий вектор и интродуцируют в растительную клетку с помощью описанного ниже процесса. Стабильная инсерция в геном может являться предпочтительной для способа, предлагаемого в изобретении, но не является абсолютно необходимой. Поскольку άκΡΗΚ обусловливает продолжительное действие, во многих случаях может оказаться также достаточной кратковременная экспрессия. ΌκΡΗΚ может представлять собой также часть РНК, подлежащей экспрессии с использованием нуклеотидной последовательности, которая должна быть встроена путем ее слияния, например, с З'-нетранслируемой областью указанной РНК.

ΌκΡΗΚ можно интродуцировать в количестве, которое делает возможным присутствие по меньшей мере одной копии в клетке. Более значительные количества копий (например, по меньшей мере 5, 10, 100, 500 или 1000 копий на клетку) может при необходимости приводить к более эффективному снижению. Для супрессии посредством ΡΗΚί ΒνΡΚΚ7 при создании изобретения осуществляли сборку кДНКфрагмента, такого, например, как имеющий длину 0,6 т.п.н. фрагмент, представленный в §ЕЦ ΙΌ N0: 1, в кассете для ΡΗΚί под контролем конститутивного промотора (см. пример 3). Приемлемыми конститутивными промоторами являются, например, промотор ИЫ3 из Α^аЪ^άорκ^κ (Штю и др., 1993), промотор 358 СаМУ или любой другой промотор, для которого известна его способность повышать конститутивную экспрессию в сахарной свекле. Кассета экспрессии содержит также селектируемый маркерный ген под контролем приемлемого промотора. В частности, маркерный ген кодирует маркер положительной селекции, такой как фосфоманнозоизомераза или ксилозоизомераза. Инвертированный повтор ΒνΡΚΚ7фрагмента отделяют вторым интроном из гена 81Ό81 картофеля (Ε^βκ и др., 1986; Уапсаппеу! и др., 1990) для стабилизации ΡΗΚί-кассеты, но также с целью улучшения эффективности процесса ΡΗΚί (\Уапд и \Vаιс^1юиκс. 2001; 8ιηίί1ι и др., 2000).

Инсерция молекулы ДНК (инсерционный мутагенез).

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения молекулу ДНК встраивают в хромосомную копию нуклеотидной последовательности, предлагаемой в настоящем изобретении, или в ее регуляторную область. Предпочтительно такая молекула ДНК содержит транслоцируемый элемент, обладающий способностью к внутрихромосомной транслокации (траспозиции) в растительной клетке, такой, например, как, Ас/Οκ, Ет/8рт, мутатор. В другом варианте молекула ДНК содержит пограничную последовательность Т-ДНК из Т-ДНК АдгоЪасЮпит. Молекула ДНК может содержать также сайт, распознаваемый рекомбиназой или интегразой, который можно применять для удаления части молекулы ДНК из хромосомы растительной клетки. Под объем изобретения подпадают также методы инсерционного мутагеназа, в которых используют Т-ДНК, транспозоны, олигонуклеотиды, или другие методы, известные специалистам в данной области. Методы, основанные на применении Т-ДНК и транспозона для инсерционного мутагенеза, описаны у \Утк1ег и др., МеΛоάκ Мо1. Вю1. 82, 1989, с. 129-136 и Ма^ι^сηκκсη. ΡΝΑ8 95, 1998, с. 2021-2026, публикации полностью включены в настоящее описание в качестве ссылки. Другими приемлемыми методами является интродукция нонсенс-мутаций в эндогенные гены-мишени, например, путем интродукции олигонуклеотидов РНК/ДНК в растение (Ζ1η.ι и др., №б Вю1сс1ию1 18(5), 2000, с. 555-558). Можно создавать также точечные мутации с помощью гибридов ДНК-РНК, которые известны также как химеропласт (Сок-Бкаи^ и др., №с1 Ααάκ Κβκ 27(5), 1999, с. 323-1330; Κт^ес, Оепе Легару Атепсап ЗскпИй 87(3), 1999, с. 240-247).

Делеционный мутагенез.

Согласно еще одному варианту осуществления изобретения мутацию молекулы нуклеиновой кислоты, предлагаемой в настоящем изобретении, создают в геномной копии последовательности в клетке или растении путем делеции части нуклеотидной последовательности или регуляторной последовательности. Методы делеционного мутагенеза известны специалистам в данной области (см., например, М1ао и др., В1ап1 ί. 7, 1995, с. 359). Активность или уровень экспрессии гена-мишени можно снижать также

- 27 028355 путем целенаправленной делеции в гене-мишени, например, с помощью индукции специфических для последовательности двухцепочечных разрывов в ДНК в распознающей последовательности, предназначенной для специфической индукции двухцепочечных разрывов в ДНК, или вблизи нуклеотидной последовательности гена-мишени.

Согласно еще одному варианту осуществления изобретения такую делецию создают произвольно в большой популяции растений путем химического мутагенеза или облучения, и растение, имеющее делецию в гене, предлагаемом в настоящем изобретении, выделяют путем стратегий прямой генетики и обратной генетики. Известно, что облучение быстрыми нейтронами или гамма-лучами вызывает делеционные мутации у растений (8Пуег8Юпе и др., Р1ап1 Се11, 10, 1998, с. 155-169; Вгиддетапп и др., Р1аи1 1., 10, 1996, с. 755-760; Рейд и Копс/ в: Ме1йоЙ8 ίη ЛгаЫйор818 Кекеагсй, изд-во \Уог1й 8с1епИйс Рге88, 1992, с. 16-82). Делеционные мутации в гене, предлагаемом в настоящем изобретении, можно восстанавливать на основе стратегии обратной генетики с помощью ПЦР с использованием объединенных групп геномных ДНК, как описано для С. е1едап8 (Ьш и др., Сепоте Кекеагсй, 9, 1999, с. 859-867.). Стратегия прямой генетики включает мутагенез линии, для которой характерно посттранскрипционное молчание генов (РТС8), с последующим скринингом М2-потомства по признаку отсутствия РТС8. Следует ожидать, что среди этих мутантов у некоторых должен быть нарушен ген, предлагаемый в настоящем изобретении. Это можно оценивать с помощью Саузерн-блоттинга или ПЦР гена, предлагаемого в настоящем изобретении, с геномной ДНК этих мутантов.

Согласно еще одному варианту осуществления изобретения экспрессию нуклеотидной последовательности, предлагаемой в настоящем изобретении, изменяют в каждой клетке растения. Для этой цели, например, используют гомологичную рекомбинацию или инсерцию в хромосому. Для этой цели можно применять также, например, экспрессию смысловой или антисмысловой РНК, белка, содержащего домен цинковых пальцев, или рибозима под контролем промотора, обладающего способностью экспрессировать смысловую или антисмысловую РНК, белок, содержащий домен цинковых пальцев, или рибозим, в каждой клетке растения. Создают конструкции, предназначенные для экспрессии смысловой или антисмысловой РНК, белка, содержащего домен цинковых пальцев, или рибозима или для сверхэкспрессии нуклеотидной последовательности, предлагаемой в настоящем изобретении, и трансформируют ими растительную клетку согласно способам, предлагаемым в настоящем изобретении, например описанным выше.

Допустимо также применение комбинаций этих методов. Другие методы известны специалистам в данной области и могут включать вмешательство в процессинг гена-мишени, транспорт белка, кодируемого геном-мишенью, или его мРНК, ингибирование присоединения рибозима, ингибирование сплайсинга РНК, индукцию ферментативного расщепления РНК гена-мишени и/или ингибирование элонгации или терминации при трансляции или остановку этих процессов.

Таким образом, изобретение относится также к смысловым и антисмысловым молекулам нуклеиновых кислот, которые соответствуют последовательностям, представленным в 8ЕЦ ГО N0: 1, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 53 или 54 в перечне последовательностей, а также их ортологам.

Гены и открытые рамки считывания, предлагаемые в настоящем изобретении, которые практически подобны нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, представленный в 8ЕЦ ГО N0: 6, включая любые соответствующие антисмысловые конструкции, можно функционально связывать с любым промотором, который обладает функциональной активностью в растении-хозяине, включая промоторные последовательности, предлагаемые в изобретении, или их мутанты.

После создания полинуклеотидной конструкции, предлагаемой в изобретении, которая содержит экспрессионную кассету или кассету для ΡΗΚί, ее можно мобилизовать в приемлемый вектор для трансформации растений, такой, например, как бинарный вектор, который затем можно мобилизовать в растение сахарной свеклы с помощью одного из широко известных методов трансформации, такого, например, как опосредуемая АдгоЪас1егшт трансформация.

Трансгенные растения (или клетки растений, или эксплантаты растений, или ткани растений), которые несут и экспрессируют нуклеотидные последовательности или Й8РНК, предлагаемые в изобретении, можно получать различными хорошо известными методами. После создания химерной конструкции, предлагаемой в изобретении, которая содержит экспрессионную кассету или кассету для ΡΗΚί, включающую нуклеотидную последовательность, предлагаемую в изобретении и описанную выше, можно использовать стандартные методики для интродукции химерной конструкции полинуклеотида в представляющие интерес растение, клетку растения, эксплантат растения или ткань растения. Необязательно клетку растения, эксплантат растения или ткань растения можно регенерировать с получением трансгенного растения. Растение может представлять собой любое высшее растение, включая голосемянные, однодольные и двудольные растения. Приемлемые протоколы известны для представителей сем. Ьедитшо8ае (люцерна, соя, клевер и т.д.), сем. ИтЪеШИегае (морковь, сельдерей, пастернак), сем. СгисИегае (капуста, редис, рапс, брокколи и т.д.), сем. СигсигЪИасеае (дыни и огурцы), сем. Сгатшеае (пшеница, кукуруза, рис, ячмень, просо и т.д.), сем. 8о1апасеае (картофель, томаты, табак, перцы и т.д.) и различных других культур (см. протоколы, описанные в НапйЪоок оИ Р1ап1 Се11 СиИиге-Сгор 8рес1е под ред. АтпигаЮ и др., изд-во МастШап РиЪ1. Со., Νονν Уогк, Ν.Υ., 1984; 8Ытато1о и др., №-11иге 338, 1989, с. 274- 28 028355

276; Ргошш и др., Вю/ТесЬпо1. 8, 1990, с. 833-839; и УакП и др., Вю/ТесЬпо1. 8, 1990, с. 429-434). Трансформация и регенерация и однодольных, и двудольных растений в настоящее время является общепринятой, и специалист в данной области может осуществлять выбор наиболее пригодного метода трансформации. Выбор метода трансформации должен варьироваться в зависимости от типа растения, подлежащего трансформации; специалисты в данной области могут определять пригодность конкретных методов для данных типов растений. Приемлемыми методами являются (но не ограничиваясь только ими): электропорация протопластов растений; опосредуемая липосомами трансформация; опосредуемая полиэтиленгликолем (ПЭГ) трансформация; трансформация с помощью вирусов; микроинъекция растительных клеток; бомбардировка микроснарядами растительных клеток; вакуумная инфильтрация и опосредуемая ЛдгоЬасЮгшт ШтеГааепк трансформация.

Трансформацию растений можно осуществлять индивидуальной молекулой ДНК или несколькими молекулами ДНК (т.е. котрансформация), и оба эти метода пригодны для применения в сочетании с химерными конструкциями, предлагаемыми в настоящем изобретении. Для трансформации растений пригодны многочисленные трансформационные векторы и экспрессионные кассеты, предлагаемые в настоящем изобретении, можно применять в сочетании с любым из таких векторов. Выбор вектора должен зависеть от предпочтительного метода трансформации и видов-мишеней для трансформации.

Специалистам в данной области доступны и известны различные методы интродукции конструкций в растительную клетку-хозяина. Эти методы, как правило, включают трансформацию с помощью ДНК с использованием А. ЫтеГашепк или А. гЫ/одепек в качестве трансформирующих агентов, липосом, осаждения с помощью ПЭГ, электропорации, инъекции ДНК, непосредственного поглощения ДНК, бомбардировки микроснарядами, ускорения частиц и т.п. (см., например, ЕР 295959 и ЕР 138341) (см. ниже). Однако полинуклеотидной конструкцией, предлагаемой в изобретении, можно трансформировать не только растительные клетки. Общие сведения о растительных экспрессионных векторах и репортерных генах, и АдтоЪайегшт и опосредуемом АдгоЬас1епит переносе генов можно почерпнуть у ОтиЪет и др., 1993.

Экспрессионные векторы, содержащие нуклеотидную последовательность, предлагаемую в изобретении, можно интродуцировать в протопласты, или в интактные ткани, или выделенные клетки. Предпочтительно экспрессионные векторы интродуцируют в интактные ткани. Общие методы культивирования растительных тканей описаны, например, у Мак! и др., 1993; и РЫШрк и др., 1988. Предпочтительно экспрессионные векторы интродуцируют в ткани кукурузы или других растений с помощью метода прямого переноса гена, такого как опосредуемый микроснарядами перенос, инъекция ДНК, электропорация и т.п. Более предпочтительно экспрессионные векторы интродуцируют в растительные ткани, используя введение содержащих микроснаряды сред с помощью биобаллистической пушки (см., например, Тошек и др., 1995). Векторы, предлагаемые в изобретении, можно не только применять для экспрессии структурных генов, но их можно использовать также при клонировании с использованием экзона-ловушки или промотора-ловушки для выявления экспрессии различных генов в различных тканях (Ьшбкеу и др., 1993; Аисй и РеШ и др.).

Наиболее предпочтительным является применение векторов бинарного типа на основе Τι- и К1плазмид АдгоЬас1епшп крр. Выведенными из Τί-плазмид векторами трансформируют широкое разнообразие высших растений, включая однодольные и двудольные растения, такие как соя, хлопчатник, рапс, табак и рис (РассюШ и др., 1985: Вугпе и др., 1987; 8ик1артба и др., 1987; Бог/ и др., 1985; Ройукик, 1985; Рагк и др., 1985: Ше1 и др., 1994). Применение Т-ДНК для трансформации растительных клеток широко изучено и подробно описано (ЕР 120516; Ноекета, 1985; КпаиГ и др., 1983 и Ап и др., 1985). Для интродукции в растения химерные конструкции, предлагаемые в изобретении, можно встраивать в бинарные векторы, как описано в примерах.

Специалистам в данной области должно быть очевидно, что выбор метода может зависеть от типа растения, предназначенного для трансформации, например, от того, является ли оно однодольным или двудольным. Приемлемыми методами трансформации растительных клеток являются (но не ограничиваясь только ими) микроинъекция (Стокк^ау и др., 1986), электропорация (Шддк и др., 1986), опосредуемая АдгоЬас1епшп трансформация (Ншскее и др., 1988), прямой перенос генов (Рак/ко\укЫ и др., 1984), и баллистическое ускорение частиц с помощью устройств, поставляемых фирмой АдтасеЫк, 1пс., Мэдисон, шт. Висконсин, и фирмой ВюКаб, Геркулес, шт. Калифорния (см., например, 8апГогб и др., И8 4945050; и МсСаЪе и др., 1988) (см. также \Уе1ккшдег и др., 1988; 8апГогб и др., 1987 (лук); СЫтДои и др., 1988 (соя); МсСаЪе и др., 1988 (соя); ЭаНа и др.,1990 (рис); К1еш и др., 1988 (кукуруза); К1еш и др., 1988 (кукуруза); К1ет и др.,1988 (кукуруза); Ргошш и др., 1990 (кукуруза) и Оогбоп-Катт и др., 1990 (кукуруза); 8уаЬ и др., 1990 (хлоропласты табака); Ко/1е1 и др., 1993 (кукуруза); 8Ыта1поЮ и др., 1989 (рис); СПпкЮн и др., 1991 (рис); ЕР 0332581 (ежа сборная и другие представители сем. РооШеае); УакП и др., 1993 (пшеница); \Уеекк и др., 1993 (пшеница)). В одном из вариантов осуществления изобретения применяют метод трансформации протопласта кукурузы (ЕР 0292435, И8 5350689).

Основной целью настоящего изобретения является трансформация сахарной свеклы. Экспериментальные процедуры для трансформации сахарной свеклы хорошо известны специалистам в данной области и описаны, например, у СПапд и др., 2002, в этом исследовании применяли меристему сахарной

- 29 028355 свеклы в качестве материала эксплантата, указанные методы описаны также у 1оег5Ьо и др., 1998.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения (см. пример 3) кассетой для ΡΗΚί можно трансформировать генотип, характерный для двулетнего типа развития сахарной свеклы генотип, такой, например, как 0018. Трансгенные проростки отбирают по признаку экспрессии маркера селекции, такого, например, как ΡΜΙ-активность ЦоегеЬо и др., 1998). Дающие положительную реакцию проростки и нетрансгенные контрольные проростки укореняют и переносят в теплицу для акклиматизации в течение минимум двух недель при 18°С до их обработки с целью яровизации (яровизационная обработка). Согласно принятым методам трансгенные растения подвергают обработке с целью яровизации, которая предусматривает выдерживание в течение 14 недель при постоянной температуре 6°С и 12-часовой низкой искусственной освещенности. Перед воздействием индуцирующих стрелкование условий прошедшие яровизизацию растения медленно акклиматизируют в течение двух недель в климатических камерах путем ступенчатого повышения температуры с 10 до 18°С. Затем растения пересаживают в более крупные горшки (2 л), и осуществляют мониторинг стрелкования, выдерживая их при постоянной температуре 18°С и фотопериоде с длительным световым днем 17 ч света/7 ч темноты.

После того как трансформированные растения отобраны и выращены до созревания, идентифицируют растения, имеющие представляющий интерес признак. Признак может представлять собой любой признак, описанный выше. Кроме того, для подтверждения того, что представляющий интерес признак является результатом экспрессии интродуцированной представляющей интерес нуклеотидной последовательности под контролем регуляторного нуклеотида, предлагаемого в изобретении, уровни экспрессии или активности представляющего/представляющей интерес полипептида или нуклеотидной последовательности можно определять с помощью анализа экспрессии мРНК с использованием Нозерн-блоттинга, ОТ-ПЦР или микромассивов или экспрессии белка с использованием иммуноблотинга или Вестернблоттинга или анализов сдвига в гелях.

Таким образом, изобретение относится к растительным клеткам и тканям, к растениям, полученным из таких клеток и тканей соответственно, к растительному материалу, к потомству и семенам таких растений и к сельскохозяйственным продуктам, включая продукты переработки растений, которые можно получать, например, с помощью одного из методов трансформации, описанных ниже.

После того как предлагаемой в настоящем изобретении и описанной выше экспрессионной кассетой, которая содержит нуклеотидную последовательность, предлагаемую в изобретении, трансформированы виды растений, ее можно размножать в этих видах или переносить в другие сорта этих же видов, включая, прежде всего, предназначенные для продажи сорта, с помощью традиционных методов селекции. Предпочтительными растениями согласно изобретению являются голосемянные, однодольные и двудольные растения, прежде всего агрономически важные культурные растения, такие как рис, пшеница, ячмень, рожь, рапс, кукуруза, картофель, морковь, сладкий картофель, сахарная свекла, фасоль, горох, цикорий, латук-салат, капуста, цветная капуста, брокколи, турнепс, редис, шпинат, спаржа, лук, чесок, баклажан, перец, сельдерей, тыква крупноплодная, тыква обыкновенная, цуккини, огурец, яблоня, груша, айва, дыня, слива, вишня, персик, нектарин, абрикос, земляника, виноград, малина, ежевика, ананас, авокадо, папайя, манго, банан, соя, табак, томаты, сорго и сахарный тростник.

Описанные выше генетически свойства, сконструированные в трансгенных растениях, передаются при половом размножении или вегетативном росте и в результате их можно поддерживать и размножать в потомстве растений. Как правило, для поддержания и размножения используют известные сельскохозяйственные методы, разработанные для высокоспецифических целей, такие как обработка почвы, посев или сбор урожая. Можно применять также специализированные процессы, такие как гидропоника или технология возделывания в теплицах. Дающие преимущество генетические свойства трансгенных растений, предлагаемых в изобретении, можно применять также при селекции растений с целью создания растений с улучшенными характеристиками, такими как устойчивость к вредителям, гербицидам или стрессу, повышенная питательная ценность, повышенная урожайность или улучшенная структура, обусловливающая защиту от полегания или осыпания. Для осуществления различных стадий селекции требуется хорошо известное вмешательство человека, включая, например, отбор линий, подлежащих скрещиванию, прямое опыление родительских линий или отбор соответствующих потомков растений. В зависимости от требуемых характеристик выбирают различные пути селекции. Соответствующие методы хорошо известны в данной области и включают (но не ограничиваясь только ими) гибридизацию, инбридинг, обратное скрещивание, многолинейное скрещивание, смешение различных линий, неспецифическую гибридизацию, анеопладию. Методы гибридизации включают также стерилизацию растений с получением растений с мужской или женской стерильностью с помощью механических, химических или биохимических средств. Перекрестное опыление растения с мужской стерильностью пыльцой другой линии гарантирует, что геном обладающего мужской стерильность, но женской фертильностью растения, будет в равной степени включать свойства обеих родительских линий. Таким образом, трансгенные растения, предлагаемые в изобретении, можно применять для отбора улучшенных линий растений, что позволяет, например, повышать эффективность общепринятых методов, таких как обработка гербицидами или пестицидами, или обходиться без указанных методов в результате модифицированных генетических особенностей растений. В другом варианте можно получать новые культуры с повышенной устой- 30 028355 чивостью к стрессу, благодаря их оптимизированному генетическому аппарату, что позволяет получать продукт более высокого качества, чем продукты, которые не обладают способностью противостоять аналогичным вредным условиям, воздействующим их развитие.

Специалисту в данной области известно, что трансгенный генотип, предлагаемый в настоящем изобретении, можно интрогрессировать путем скрещивания с другими линиями растений (предпочтительно линиями сахарной свеклы), содержащими другие трансгенные или нетрансгенные генотипы. Указанный другой трансгенный или нетрансгенный генотип может представлять собой любой генотип, но предпочтигельным является генотип, обусловливающий по меньшей мере один представляющий интерес признак. Например, инбредную линию сахарной свеклы, содержащую трансгенный генотип, предлагаемый в настоящем изобретении, можно скрещивать с инбредной линией сахарной свеклы, содержащей трансгенный генотип, обусловливающий устойчивость к различным вирусам, которые, как известно, заражают растения сахарной свеклы. Образовавшиеся семена и растения-потомки должны нести признак замедленного стрелкования и признаки устойчивости в объединенной форме. Например, инбредную линию сахарной свеклы с трансгенным генотипом, предлагаемым в настоящем изобретении, можно скрещивать с инбредной линией сахарной свеклы, содержащей трансгенный генотип, обусловливающий устойчивость к глифосату, такой как Н7-1 (заявка на европейский патент ЕР-А1-1597373, которая включена в настоящее описание в качестве ссылки). Образовавшиеся семена и растения-потомки имеют как признак устойчивости, так и признак замедленного стрелкования. Другие признаки типа устойчивости к гербицидам, устойчивости к болезням или устойчивости к вирусам (т.е. вирусам типа, например, ΒΝΥνν (вирус некротического пожелтения жилок свеклы), полученным либо из трансгенного, либо из общепринятых источников (типа Но11у или С48), или вирусам, отличным от ΒΝΥνν) можно применять для объединения с трансгенным генотипом, предлагаемым в настоящем изобретении. Кроме того, должно быть очевидно, что другие комбинации или группы можно создавать с использованием трансгенного генотипа, предлагаемого в изобретении, и поэтому указанные примеры не следует рассматривать, как ограничивающие объем изобретения.

Специалисту в данной области также должно быть очевидно, что трансгенный семенной материал сахарной свеклы, содержащий трансгенный генотип, предлагаемый в настоящем изобретении, можно обрабатывать различными химическими соединениями, предназначенными для обработки семян, включая различные пестициды и инсектициды, для дополнительного повышения устойчивости, предлагаемой в настоящем изобретении.

Трансгенный генотип, предлагаемый в настоящем изобретении, можно интрогрессировать в любую инбредную или гибридную линию сахарной свеклы с использованием известных в данной области методов скрещивания. Целью скрещивания растений является объединение в одном сорте или гибриде различных требуемых признаков. Для полевых культур эти признаки включают устойчивость к насекомым и болезням (например, полученные из общепринятых источников, включая (но не ограничиваясь только ими) Но11у и С48), толерантность к гербицидам, толерантность к высоким температурам и засухе, повышенную урожайность и более высокое агрономическое качество. При механическом сборе урожая многих культур является важной однородность характеристик растений, таких как прорастание и образование главного корня, скорость роста, созревание и размер корней.

Другим объектом настоящего изобретения является способ получения гибридных семян, из которых образуются растения сахарной свеклы, имеющие фенотип замедленного стрелкования. Указанные способы заключаются в том, что: а) получают линию сахарной свеклы с фенотипом замедленного стрелкования, прежде всего трансгенное растение сахарной свеклы, предлагаемое в настоящем изобретении, в качестве первой родительской линии; б) получают вторую линию сахарной свеклы с другим генотипом в качестве второй родительской линии; в) дают растениям первой родительской линии, полученной на стадии а), и растениям второй родительской лини, полученной на стадии б), опылять друг друга, дают развитья семенам и собирают гибридный семенной материал, где собранные гибридные семена представляют собой семена гибридного растения сахарной свеклы, имеющего фенотип замедленного стрелкования. В одном из вариантов этого объекта первая родительская линия, полученная на стадии а), представляет собой инбредную линию сахарной свеклы, содержащую один или несколько или все полинуклеотиды, предлагаемые в настоящем изобретении. В другом варианте этого объекта вторую родительскую линию выбирают из группы, включающей а) инбредную линию сахарной свеклы, устойчивую по меньшей мере к одному вирусу, поражающему сахарную свеклу, такому, например, как вирус некротического пожелтения жилок свеклы; б) инбредную линию растений сахарной свеклы, устойчивую по меньшей мере к одному гербициду; и в) инбредную линию растений сахарной свеклы, устойчивую по меньшей мере к одной болезни. Примеры обычных вирусов и болезнетворных агентов, поражающих сахарную свеклы, и источников устойчивости к этим вирусам или болезням известны специалисту в данной области. Кроме того, гербициды, которые используют на сахарной свекле, и источники устойчивости к этим гербицидам, также известны специалисту в данной области.

Растения, которым давали самоопыляться и отобрали в отношении типа в течение многих поколений, становились гомозиготными практически по всем генным локусам и давали однородную популяцию чистосортового потомства. Скрещивание между двумя гомозиготными линиям дают однородную попу- 31 028355 ляцию гибридных растений, которые могут быть гетерогенными по многим генным локусам. Скрещивание двух растений, каждое из которых является гетерозиготным по нескольким генным локусам, должно приводить к получению популяции гибридных растений, которые отличаются генетически и не могут быть однородными.

Методы скрещивания растений, которые известны в данной области и которые можно применять в программах селекции сахарной свеклы, включают (но не ограничиваясь только ими) рекуррентную (периодическую) селекцию, возвратное скрещивание, селекцию на базе родословной, селекцию повышенной эффективности на основе полиморфизма длин рестрикционных фрагментов, селекцию повышенной эффективности на основе генетических маркеров и трансформацию. Для создания гибридов сахарной свеклы в рамках программы селекции сахарной свеклы требуется, в целом, создание гомозиготных инбредных линий, скрещивание этих линий и оценка кроссов. Методы селекции на базе родословной и рекуррентной селекции используют для создания инбредных линий из предназначенных для разведения популяций. В программах селекции сахарной свеклы объединяют генетические фоны из двух или большего количества инбредных линий или различных других источников зародышевой плазмы в пулы для разведения, из которых создают новые инбредные линии путем самоопыления и отбора требуемых фенотипов. Новые инбредные линии скрещивают с другими инбредными линиями, и гибриды, полученные в результате этих скрещиваний, оценивают для выявления тех из них, которые потенциально можно использовать для продажи. Разведение растений и создание гибридов при воплощении на практике программы селекции растений сахарной свеклы является дорогостоящим и требующим значительных временных затрат процессом.

Селекция на базе родословной начинается со скрещивания двух генотипов, каждый из которых может иметь одну или несколько требуемых характеристик, которые отсутствуют в другом или которые дополняют другой. Если два исходных родителя не обеспечивают присутствие всех требуемых характеристик, то в популяцию для разведения можно включать другие источники. При использовании метода селекции на базе родословной растения высшего качества опыляют и отбирают последовательные поколения. В последовательных поколениях гетерозиготное состояние позволяет получать гомозиготные линии в результате самоопыления и селекции. Как правило, при использовании метода селекции на базе родословной на практике для самоопыления и селекции применяют пять или большее количество поколений

Р1- -Р2; 1'2 >1^;3; Р3--Р4; Р4>-Р5 и т.д.

Разведение на основе рекуррентной селекции, например возвратное скрещивание, можно использовать для улучшения инбредной линии и гибрида, созданного с использованием этих инбредных линий. Возвратное скрещивание можно применять для переноса конкретного требуемого признака из одной инбредной линии или из одного источника в инбредную линию, в которой отсутствует этот признак. Это можно осуществлять, например, путем первого скрещивания инбредной линии высшего качества (рекуррентный родитель) с инбредной линией-донором (нерекуррентный родитель), которая несет соответствующий^) ген(ы), обусловливающий(е) представляющий интерес признак. Затем потомство этого скрещивания подвергают возвратному скрещиванию с рекуррентным родителем высшего качества с последующей селекцией образовавшего потомства в отношении требуемого признака, который должен быть перенесен из нерекуррентного родителя. После получения 5 или большего количества поколений бэккроссов с их селекцией по требуемому признаку потомство должно быть гомозиготным по локусу, контролирующему характеристику, подлежащую переносу, но должно быть похоже на родителя высшего качества касательно всех других генов. Затем последнее поколение бэккроссов опыляют с получением чистосортового потомства в отношении гена(ов), подлежащего(их) переносу. Гибрид, созданный из инбредных линий, содержащих перенесенный(ые) ген(ы), является практически таким же, что и гибрид, полученный из этих инбредных линий без перенесенного(ых) гена(ов).

Элитные инбредные линии, которые представляют собой чистосортовые гомозиготные инбредные линии, можно применять также в качестве исходного материала для селекции или популяцийисточников, из которых создают другие инбредные линии. Эти инбредные линии выводят из элитных инбредных линий с помощью описанных ранее методов разведения, таких как селекция на базе родословной и рекуррентная селекция. Например, когда возвратное скрещивание используют для создания этих выведенных линий при осуществлении программы селекции растений сахарной свеклы, элитные инбредные линии можно применять в качестве родительской линии или исходного материала или популяции-источника, и они могут служить либо в качестве донора, либо в качестве рекуррентного родителя.

Простой гибрид получают в результате скрещивания двух инбредных линий, каждая из которых имеет генотип, комплементарный генотипу другого. Гибридное потомство первого поколения обозначают как Р1. При создании предназначенных для продажи гибридов при осуществлении программы селекции растений сахарной свеклы высаживают только гибридные Р1-растения. Предпочтительные Р1гибриды являются более сильными, чем их инбредные родители. Эта гибридная сила или гетерозис может проявляться во многих полигенных признаках, включая повышенный вегетативный рост и повышенную урожайность.

Создание гибрида сахарной свеклы при осуществлении программы селекции растений сахарной

- 32 028355 свеклы включает три стадии:1) отбор растений, полученных из различных пулов зародышевой плазмы для начальных кроссбридингов; (2) самоопыление отобранных растений, полученных в результате кроссбридинга нескольких поколений, с получением серий инбредных линий, которые хотя отличаются друг от друга, являются чистосортовыми и обладают высокой степенью однородности; и 3) скрещивание отобранных инбредных линий с различными инбредными линиями с получением гибридного потомства (Р1). В процессе инбридинга сахарной свеклы сила линий снижается. Сила восстанавливается, когда две различные инбредные линии скрещивают с получением гибридного потомства (Р1). Важным результатом гомозиготности и гомогенности инбредных линий является то, что гибрид двух различных пар инбредных линий всегда является тем же самым. После идентификации инбредных линий, которые дают гибрид высшего качества, гибридный семенной материал можно неограниченно размножать, если сохраняется гомогенность инбредных родителей.

Простой гибрид получают в том случае, когда скрещивают две инбредные линии с получением Р1потомства. Двойной гибрид получают в результате попарного скрещивания четырех инбредных линий (АхВ и СхЭ). а затем два Р1-гибрида скрещивают вновь (АхВ)х(СхЭ). Трехлинейный гибрид получают из трех инбредных линий, при этом скрещивают две из этих инбредных линий (АхВ), а затем образовавшийся Р1-гибрид скрещивают с третьей инбредной линией (АхВ)хС. Большая часть гибридной силы, характерной для Р1-гибридов, теряется в следующем поколении (Р2). Следовательно, семенной материал гибридов нельзя применять в качестве посадочного материала.

При производстве гибридных семян предпочтительно элиминируют или инактивируют производство пыльцы материнской особью. Неполное удаление или инактивация пыльцы оставляет потенциальную возможность самоопыления. Эти полученные в результате нежелательного самоопыления семена могут быть непреднамеренно собраны и упакованы вместе с гибридными семенами. После посева семян можно идентифицировать и отбирать эти полученные в результате самоопыления растения. Эти полученные в результате самоопыления растения будут генетически эквивалентны женской инбредной линии, применяемой для получения гибрида. Как правило, эти полученные в результате самоопыления растения можно идентифицировать по их пониженной силе. Женские растения, полученные в результате самоопыления, идентифицируют по снижению силы вегетативных и/или репродуктивных характеристик. Идентификацию этих полученных в результате самоопыления линий можно осуществлять также с помощью анализа с использованием молекулярных маркеров.

Однако существует простая и эффективная система контроля опыления, гарантирующая наличие гетерозиса, путем исключения самоопыления при производстве предназначенных для продажи гибридов. Если один из родителей обладает самостерильностью (81), цитоплазматической мужской стерильностью (ЦМС) или ядерной мужской стерильностью (ЯМС), то растение не может самоопыляться или неспособно производить пыльцу, при этом должно иметь место только перекрестное опыление. Путем элиминации пыльцы одного из применяемых для скрещивания родительских сортов растениевод-селекционер гарантирует получение гибридного семенного материала однородного качества при условии, что родители имеют однородное качество и селекционер осуществляет одно скрещивание. Цитоплазматическая мужская стерильность (ЦМС) представляет собой наследуемый по материнской линии признак, генетические детерминанты которого локализованы в геноме цитоплазматических органелл, митохондрий. У таких растений в значительной степени нарушена способность образовывать функциональные пыльцевые зерна. Гены-восстановители системы ЦМС представляют собой доминантные ядерные гены, которые подавляют эффекты мужской стерильности, свойственные цитоплазме. Проявление мужской стерильности в растениях, обладающих ЦМС, является результатом несовместимости между рецессивным ядерным геном и специфическим для мужской стерильности цитоплазматическим геномом.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения систему ЦМС применяют для получения гибридных растений сахарной свеклы, предлагаемых в настоящем изобретении. В этой системе мужскую стерильную линию, обладающую ЦМС, применяют в качестве материнской особи, которую опыляют мужской фертильной линией, применяемой в качестве отцовской особи. Признак замедленного стрелкования, рассматриваемый в настоящем изобретении, может присутствовать как в мужской стерильной линии, обладающей ЦМС, которая представляет собой (материнскую) родительскую линию, так и в мужской фертильной (отцовской) родительской линии, или даже в обеих линиях. Предпочтительно признак замедленного стрелкования поддерживают в варианте, обладающем мужской стерильностью, для того чтобы избежать ГМ (генномодифицированных) загрязнений через пыльцу, содержащую признак, переносимый отцовской особью.

Как должно быть очевидно специалисту в данной области, выше изложены лишь некоторые из возможных путей, с помощью которых можно получать инбредные линии, предлагаемые в настоящем изобретении, относящиеся к интрогрессии трансгенного генотипа, предлагаемого в изобретении, в другие линии сахарной свеклы. Специалисту в данной области известны и доступны другие средства, а приведенные выше примеры даны только с целью иллюстрации.

В целом, вторая родительская линия, применяемая для получения гибридов, может представлять собой также линию растений сахарной свеклы, имеющую фенотип замедленного стрелкования, напри- 33 028355 мер растение сахарной свеклы, предлагаемое в настоящем изобретении. Предпочтительно первая родительская линия и вторая родительская линия, применяемые для получения гибридного семенного материла, отличаются различным генетическим фоном. Генетическое расстояние можно измерять с помощью молекулярных маркеров согласно методу, описанному, например, у Киаак (1996). Однако вторая родительская линия может представлять собой также инбредную линию сахарной свеклы, которая содержит другой представляющий интерес признак, такой, например, как (но не ограничиваясь только им) устойчивость к глифосату (например, содержит фактор Н7-1, описанный в заявке на европейский патент ЕРА1-1597373, которая включена в настоящее описание в качестве ссылки). Образовавшееся гибридное семя должно содержать сгруппированные признаки замедленного стрелкования и устойчивости к гербициду глифосату. Другие признаки типа устойчивости к гербицидам, устойчивости к болезням или устойчивости к ΒΝ^'Ψ^Ϋ, полученные из общепринятых источников (типа Но11у или С48), или устойчивости к вирусам, отличным от ΕΝΥΥΥ, может нести также вторая родительская линия для объединения с трансгенным генотипом, предлагаемым в настоящем изобретении, в гибридном семени. Очевидно также, что можно создавать другие комбинации или группы с трансгенным генотипом, предлагаемым в изобретении, и таким образом, эти примеры не следует рассматривать в качестве ограничивающих объем изобретения.

Другим предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения является гибридное семя растения сахарной свеклы, имеющее фенотип замедленного стрелкования. Согласно одному из объектов настоящего изобретения гибридное семя получают с помощью предлагаемого в настоящем изобретении способа получения гибридного семени сахарной свеклы или растений сахарной свеклы, которые имеют фенотип замедленного стрелкования. Указанные методы известны специалистам в данной области. Согласно другому объекту настоящего изобретения получают гибридное растение сахарной свеклы, имеющее фенотип замедленного стрелкования, путем выращивания гибридного семени, предлагаемого в настоящем изобретении. Предпочтительно у этого гибридного растения стрелкование отсутствует полностью, т.е. для него характерно полное подавление яровизационного ответа. Другим предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения является часть гибридного растения сахарной свеклы, предлагаемого в настоящем изобретении. Предпочтительно указанную часть растения выбирают из группы, включающей семена, зародыши, микроспоры, зиготы, протопласты, клетки, семяпочки, пыльцу, главные корни, семядоли или другие репродуктивные или вегетативные части или экстракты, или образцы.

Следующим объектом изобретения являются способы выявления присутствия нуклеотидной последовательности или химерной конструкции, предлагаемой в настоящем изобретении, в биологическом образце. Указанные способы заключаются в том, что а) приводят в контакт образец, содержащий ДНК с парой праймеров, которые при применении в реакции амплификации нуклеиновой кислоты, в которой используют геномную ДНК из сахарной свеклы, несущей нуклеотидную последовательность или химерную конструкцию, предлагаемую в настоящем изобретении, продуцируют ампликон, являющийся диагностическим для сахарной свеклы, предлагаемой в настоящем изобретении; б) осуществляют реакцию амплификации нуклеиновой кислоты, получая тем самым ампликон; и в) выявляют ампликон. Выявление ампликона можно осуществлять с помощью любых средств, хорошо известных в данной области, включая (но не ограничиваясь только ими) флуоресцентные, хемилюминисцентные, радиологические, иммунологические или иные средства обнаружения. В том случае, когда для амплификации конкретной последовательности с целью получения ампликона предполагается применять гибридизацию, то подразумевается, что получение и выявление ампликона с помощью любых средств, хорошо известных в данной области, может свидетельствовать о требуемой гибридизации с последовательностью-мишенью, когда применяют один зонд или праймер, или с последовательностями-мишениями, когда используют два или большее количество зондов или праймеров.

Изобретение относится также к способам получения сахара, при которых для получения сахара осуществляют переработку растения сахарной свеклы, предлагаемого в настоящем изобретении, или его клеток или тканей, биологического образца или экстракта. Кроме того, настоящее изобретение относится к сахару, полученному с помощью способа получения сахара, предлагаемого в настоящем изобретении. Способ получения сахара может включать любой общепринятый метод получения сахара, известный специалисту в данной области.

Другим предпочтительным объектом изобретения является способ получения одного или несколько видов биотоплива, выбранных из группы, включающей этанол, биогазы и/или дизельное биотопливо, путем переработки трансгенного растения сахарной свеклы, предлагаемого в настоящем изобретении, или его клеток или тканей, биологического образца или экстракта с получением одного или нескольких видов биотоплива. Биотопливо может представлять собой любое биотопливо, получаемое путем аэробной или анаэробной ферментации растительного материала. Примером биотоплива является (но не ограничиваясь только им) полученный с помощью аэробной ферментации биоэтанол. Биотоплива, которые можно получать с помощью анаэробной ферментации, представляют собой (но не ограничиваясь только ими) биогазы и/или дизельное биотопливо. Методы аэробной и/или анаэробной ферментации известны специалистам в данной области. Под объем настоящего изобретения подпадают также виды биотоплива,

- 34 028355 выбранные из группы, включающей этанол, биогазы и/или дизельное биотопливо, которые получают с помощью способа получения одного или нескольких видов биотоплива, предлагаемого в настоящем изобретении.

Другим предпочтительным объектом настоящего изобретения являются полинуклеотидные маркеры, которые картированы в локусе Β или находятся в непосредственной близости к нему, в частности на расстоянии 1 сМ против хода транскрипции относительно маркеров МР0176 и ОГО1, и которые обладают способностью к косегрегации с маркером ОЛ31 (Μοίιπι^ 8. и др., 2004; ОааГаг КМ. и др., 2005) (фиг. 5).

Изобретение относится также к полинуклеотидным маркерам, идентифицированным в геноме сахарной свеклы, включая их варианты и производные, где полинуклеотидные маркеры создают на основе нуклеотидной последовательности, которую можно получать из области геномной ДНК, для которой характерна истинная косегрегация с фенотипом, ассоциированным с геном, обусловливающим стрелкование (ген В), у сахарной свеклы, где маркер позволяет различать генотип, характерный для однолетнего и характерный для двулетнего типа развития, или различные гаплотипы в группах растений сахарной свеклы, которые имеют характерный для двулетнего типа развития или характерный для однолетнего типа развития фенотип. В предпочтительном варианте осуществления изобретения полинуклеотидные маркеры, предлагаемые в настоящем изобретении, имеют нуклеотидную последовательность, которую можно получать из одной или нескольких нуклеотидных последовательностей, предлагаемых в настоящем изобретении и описанных выше. Предпочтительные полинуклеотидные маркеры, предлагаемые в настоящем изобретении, несут один или несколько полиморфизмов, прежде всего полиморфизм, основанный на 8ΝΡ, 88К, делеции или инсерции по меньшей мере одного нуклеотида, но прежде всего полиморфизм, основанный на 8ΝΡ, этот полиморфизм является диагностическим для аллеля Β в локусе Β.

Указанные полинуклеотидные маркеры предпочтительно обладают способностью выявлять по меньшей мере один из различных 8ΝΡ, присутствующих в различных аллелях геномной последовательности, которая представлена в настоящем описании в 8ЕЦ ГО N0: 8, и которые приведены в табл. 7-1 (представлены также на фиг. 11) и 7-2 (представлены также на фиг. 12), где указанный полипептидный маркер позволяет осуществлять дифференциацию различных аллелей, прежде всего различать однолетние и двулетние линии сахарной свеклы. В предпочтительном варианте осуществления изобретения полинуклеотидный маркер, предлагаемый в настоящем изобретении, обладает способностью выявлять по меньшей мере один 8ΝΡ, выбранный из группы 8ΝΡ в положениях №№ 224, 351, 615, 897, 1082, 1841, 1915, 2334, 11592, 12316, 12490 или 12544 последовательности, представленной в 8ЕЦ ГО N0: 8, и которые приведены в табл. 7-1 (представлены также на фиг. 11) и 7-2 (представлены также на фиг. 12).

Следующим объектом настоящего изобретения является набор полинуклеотидных маркеров, который содержит множество индивидуальных маркеров, предлагаемых в настоящем изобретении и описанных выше. В этом контексте понятие множество относится к набору, включающему больше одного полинуклеотидного маркера, который предпочтительно состоит из двух, трех или большего количества маркеров.

Согласно одному из объектов изобретения можно разрабатывать и применять маркеры, которые не полностью соответствуют представленным в настоящем описании, или еще не идентифицированные маркеры. На основе информации, представленной в настоящем описании, специалист в данной области может идентифицировать или создавать маркеры, которые не полностью соответствуют представленным в настоящем описании, но генетически близко сцеплены или предпочтительно локализованы в гене, обусловливающем стрелкование, или гене Β, или сцеплены с маркерами, представленными в настоящем описании. Специалисту в данной области должно быть очевидно, что другие маркеры могут найти по меньшей мере такое же применение в скрининговых анализах и связанной с использованием маркеров селекции.

Молекулярные маркеры, предпочтительно применяемые в технологии Епб роиН Τа^Μаη®, можно разрабатывать, например, на основе 8№, которые характеризуют на основе секвенированных ПЦРпродуктов, амплифицированных из однолетних и двулетних растений. При этом требуется осуществлять несколько циклов ПЦР-амплификации для того, чтобы охватить полную последовательность гена. Затем новые молекулярные маркеры следует тестировать с использованием различных генетических фонов однолетних и двулетних растений для оценки робастности молекулярного теста.

В одном из вариантов осуществления изобретения молекулярный маркер представляет собой ДНКфрагмент, амплифицированный с помощью ПЦР, например 88К-маркер или ΚΑΡΌ-маркер. В одном из вариантов осуществления изобретения присутствие или отсутствие амплифицированного ДНКфрагмента является показателем присутствия или отсутствия самого признака или конкретного ассоциированного с признаком аллеля. В одном из вариантов осуществления изобретения различие в длине амплифицированного ДНК-фрагмента является показателем присутствия или отсутствия конкретного ассоциированного с признаком аллеля и в результате позволяет дифференцировать различные ассоциированные с признаком аллели.

В одном из вариантов осуществления изобретения (микросателлитные), основанные на простых повторяющихся последовательностях (88К), маркеры используют для идентификации подпадающих под объем изобретения аллелей в родительских растениях и/или их предках, а также в потомстве растений,

- 35 028355 полученном в результате скрещивания указанных родительских растений.

Специалистам в данной области известно или доступно несколько дополнительных методов или подходов. которые можно применять для идентификации и/или создания маркеров неравновесного сцепления и/или сцепленных с и/или локализованных в области гена Β. а также маркеров. которые представляют собой фактически причинные мутации. ответственные за характерный для двулетнего типа развития генотип. Известные специалистам в данной области подходы включают (но не ограничиваясь только ими) применение описанных последовательностей/маркеров в основанных на использовании гибридизации подходах для идентификации другой последовательности в представляющей интерес области; праймерные последовательности. представленные в настоящем описании. и/или последовательности маркеров/генов (или их фрагмент). которые можно определять с помощью праймерных последовательностей. представленных в настоящем описании. можно применять в качестве зондов (гибридизующихся) для выделения нуклеотидных последовательностей/генов. фланкирующих маркеры. и/или сцепленных и/или ассоциированных с областью гена Β. и/или специфических для нее. из образца геномной нуклеиновой кислоты и/или образца РНК. или кДНК. или пула образцов (например. осуществляя скрининг геномных ресурсов типа ΒАС-библиотек или скрининг библиотек гДНК или кДНК);

применение описанных последовательностей/маркеров в основанных на использовании ПЦР подходах для идентификации другой последовательности в представляющей интерес области: праймерные последовательности. представленные в настоящем описании. и/или последовательности маркеров/генов(кандидатов) (или их фрагмент). которые можно определять с помощью праймерных последовательностей. представленных в настоящем описании. можно применять в качестве праймеров для (ПЦР)-амплификации нуклеотидной последовательности/гена. фланкирующего ОТЬ (локусы количественных признаков)-область и/или сцепленного с ней. и/или ассоциированного с ней. и/или специфического в отношении нее из образца геномной нуклеиновой кислоты и/или образца РНК или кДНК. или пула образцов. либо выделенных из конкретной растительной ткани. либо не выделенных из нее. и/или после специфической обработки растения. и из растения сахарной свеклы или в принципе из любого другого организма. имеющего достаточную степень гомологии с сахарной свеклой;

применение описанных последовательностей/маркеров в основанных на использовании ПЦР подходах для идентификации другой последовательности в представляющей интерес области: нуклеотидные последовательности/гены одного или нескольких маркеров можно определять после создания внутренних праймеров для указанных маркерных последовательностей и применять для определения дополнительных фланкирующих последовательностей/генов в области гена Β и/или генетически сцепленных и/или ассоциированных с признаком;

применение описанных последовательностей/маркеров в основанных на использовании картирования и/или сравнительного картирования для идентификации маркеров в одном(их) и том(тех) же области(ях) (определение местоположения (позиционирование) гена Β на других картах): на основе информации о местоположении и/или информации о маркерах. представленной выше. маркеры любого типа можно идентифицировать на основе подходов с использованием генетического картирования. в конечном счете (если в этом есть необходимость) путем определения местоположения описанных маркеров (методом генетического картирования или экстраполяции на основе общих маркеров на картах) на генетической(их) карте(ах) (высокой плотности) и/или интегрированной(ых) генетической(их) или консенсусной(ых) карты(карт). Маркеры. которые уже являются известными и/или новые маркеры. генетически сцепленные и/или расположенные вблизи описанных маркеров и/или области гена Β. можно идентифицировать и/или получать и в конечном счете применять для картирования (точного) гена Β и/или клонирования гена Β. и/или применения для МАδ-(связанная с маркерами селекция)-селекции;

применение описанных последовательностей/маркеров в т-811осо-подходах (методы молекулярного моделирования на основе набора вычислительных методов) для идентификации дополнительных последовательностей/маркеров/генов-кандидатов в области(ях) гена Β: праймерные последовательности. представленные в настоящем описании. и/или последовательности маркеров/генов-кандидатов (или их фрагмент). которые можно определять с помощью праймерных последовательностей. представленных в настоящем описании. или на основе сцепленных маркеров. можно использовать в ш-8Шсо-методах для поиска в базах данных последовательностей или белков (например. с использованием программы Βί-Λδ^ (дополнительных) фланкирующих и/или гомологичных последовательностей/генов. и/или аллельного разнообразия (как геномных последовательностей. так и/или последовательностей кДНК или даже белков. полученных как из представителей рода Саркюит (перец). так и/или из любого другого организма). которые генетически сцеплены и/или ассоциированы с признаками. указанными в настоящем описании. и/или локализованы в области гена Β;

применение описанных последовательностей/маркеров в основанных на физическом картировании подходах (определение местоположения гена Β на физической карте или в геномной последовательности): праймерные последовательности. представленные в настоящем описании. и/или последовательности маркеров/генов (или их фрагменты). которые можно определять с помощью праймерных последовательностей. представленных в настоящем описании. или с помощью других маркеров. генетически сцеп- 36 028355 ленных с маркерами, представленными в настоящем описании, и/или локализованных в области гена В, можно позиционировать на физической карте и/или в (полной) геномной последовательности в принципе любого организма, имеющей достаточную степень гомологии для идентификации (перспективных) последовательностей/маркеров/генов, которые можно применять для картирования (точного) гена В и/или клонирования гена В, и/или применения для МА8-селекции;

применение описанных последовательностей/маркеров для определения местоположения гена В на других (физических) картах или геномах (других видов): праймерые последовательности, представленные в настоящем описании, и/или последовательности маркеров/генов (или их фрагменты), которые можно определять с помощью праймерных последовательностей, представленных в настоящем описании, можно применять для подходов, основанных на сравнительном картировании генома или синтении, для идентификации гомологичной области и последовательностей гомологов и/или ортологов/генов (кандидатов), генетически сцепленных с областью гена В и/или расположенных в ней, и которые можно применять для картирования (точного) гена В и/или клонирования гена В, и/или применения для МА8селекции;

применение описанных последовательностей/маркеров для отбора соответствующих особей, с помощью которых можно идентифицировать маркеры в представляющей интерес области с помощью генетических подходов: праймерные последовательности и/или маркеры, представленные в настоящем описании, можно использовать для отбора особей с другими/контрастирующими аллелями гена В. Подходы, основанные на генетической ассоциации, и/или анализ объединенных сегрегантов (В8А, М1сйе1тоге и др., 1991) можно применять для идентификации маркеров/генов в конкретной представляющей интерес области (области гена В) и/или области, ассоциированной или генетически сцепленной с описанными признаками; или применение представленной информации для поиска (позиционных) генов-кандидатов: представленную информацию можно применять для идентификации позиционных и/или функциональных геновкандидатов, которые могут быть ассоциированы и/или генетически сцеплены с описанными признаками.

В другом конкретном варианте осуществления изобретения маркер, основанный на однонуклеотидном полиморфизме, используют для идентификации подпадающих под объем изобретения аллелей в родительских растениях и/или их предках, а также в потомстве растений, полученном в результате скрещивания указанных родительских растений.

Большая часть производств предназначенных для продажи семян сахарной свеклы находится на юге Франции и севере Италии. В обоих регионах присутствуют однолетние сорные виды свекольных, это может приводить к загрязнению их пыльцой получаемых продуктов и, как следствие, к появлению характерного для однолетнего типа развития генотипа у предназначенных для продажи семян. Это является неприемлемым для покупателей, и поэтому все предназначенные для продажи партии семян выращивают в регионах, таких как Аргентина, в которых сорные виды свекольных не вырастают непосредственно после сбора семян. Растения являются неяровизированными и наличие стрелок используют для идентификации партий, загрязненных характерным для однолетнего типа развития генотипом.

Таким образом, полинуклеотидные маркеры, предлагаемые в изобретении, можно применять для контроля качества партий поступающих в продажу семян путем скрининга поступающих в продажу семян двулетней сахарной свеклы в отношении загрязнителей, имеющих характерный для однолетнего типа развития генотип, и для идентификации однолетних/двулетних растений в программах селекции, в которых используют признак однолетнего типа развития для ускорения процесса селекции, или когда признак однолетнего типа развития интродуцируют вместе с новыми источниками генетической вариации. Различные анализы, основанные на применении генной последовательности, предлагаемой в изобретении и описанной выше, можно создавать и применять для скрининга растительного материала в отношении присутствия или отсутствия аллеля, ассоциированного с признаком однолетности.

Ранее были разработаны методы применения молекулярных маркеров, которые можно использовать для генетического картирования, клонирования генов, размножения растений с использованием маркеров и фингерпринтинга генома и исследования генетических взаимосвязей. Генетические маркеры создают на основе полиморфизмов ДНК в нуклеотидных последовательностях геномных областей и их можно выявлять либо с помощью рестриктаз, либо с помощью двух примированных сайтов.

Известно несколько типов молекулярных маркеров, которые можно применять для основанного на использовании маркеров отбора, в том числе полиморфизмы длин рестрикционных фрагментов (ΚΡΈΡ), произвольно амплифицированные полиморфные ДНК (ΚΑΡΌ), полиморфизмы длин амплифицированных фрагментов (ΑΡΈΡ), простые повторяющиеся последовательности (88Κ) и однонуклеотидные полиморфизмы (8№).

Информационное содержание различных типов маркеров может различаться в зависимости от метода, применяемого для получения данных о маркерах, и популяции, в которой оценивали маркеры. Например, не всегда возможно отличать геномные фрагменты, которые находятся в гомозиготном состоянии, от гетерозиготных фрагментов. В гетерологичной популяции типа Р2, кодоминантные маркеры, такие как полиморфизмы длин рестрикционных фрагментов (ΚΡΈΡ, Во151ет и др., 1980) и характеризующиеся кодоминантностью полиморфизмы длин амплифицированных фрагментов (ΑΡΈΡ, ^5 и др.,

- 37 028355

1995), являются более информативными, чем доминантные маркеры, такие как произвольно амплифицированные полиморфные ДНК (КАРИ, \УеЫ1 и МсС1е1апб, 1990) и характеризующиеся доминантностью АРЬР. КРЬР являются кодоминантными и их можно применять для идентификации уникального локуса. КРЬР предусматривает применение рестриктаз для расщепления хромосомной ДНК в специфических коротких сайтах рестрикции, полиморфизмы являются результатом дупликаций сайтов или их делеций, или мутаций в сайтах рестрикции.

При использовании АРЬР требуется расщепление клеточной ДНК с помощью рестриктазы перед осуществлением ПЦР и селективных нуклеотидов в праймерах для амплификации специфических фрагментов. При использовании этого метода можно оценивать вплоть до 100 полиморфных локусов, и для каждого анализа требуется лишь относительно небольшой образец ДНК.

Наиболее предпочтительным методом для амплификации нуклеотидных фрагментов, покрывающих полиморфную область растительного генома, является полимеразная цепная реакция (ПЦР) (Ми11ΐδ и др., 1986), для осуществления которой используют пару праймеров, включающую обратный праймер и прямой праймер, которые обладают способностью гибридизоваться с проксимальными последовательностями, определяющими полиморфизм, в их двухцепочечной форме.

В отличие от КРЬР для осуществления методов, основанных на ПЦР, требуется лишь небольшой процент (примерно 10%) ДНК, применяемой в качестве матрицы, для получения больших количеств последовательности-мишени с помощью ПЦР-амплификации.

Одним из таких основанных на ПЦР-методов является КАРИ, в котором применяют осуществляемую в расслабленных условиях амплификацию с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием только праймеров произвольной последовательности для создания специфических для штамма массивов неизвестных ДНК-фрагментов. Для этого метода требуются лишь очень небольшие образцы ДНК, и он позволяет анализировать большое число полиморфных локусов. Однако непредсказуемое поведение коротких праймеров, на которые влияют различные условия реакции, их доминантный путь наследования и популяционная специфичность являются основными недостатками КАРИ.

Микросателлиты или простые повторяющиеся последовательности (δδΗ)„ полиморфизмы длин простых последовательностей (δδΗ’), короткие тандемные повторы (δΈΤ), мотивы простых последовательностей (δδМ) и микросателлиты последовательностей-мишеней 0ТМ) представляют собой класс повторяющихся последовательностей, которые широко распространены в геноме эукариот. Вариация количества и длины повторов является источником полиморфизма даже среди близкородственных особей. Анализ δδК основан на этих (несущих короткий повтор) последовательностях, которые селективно амплифицируют для выявления вариаций в простых повторяющихся последовательностях. Такие микросателлитные последовательности легко можно амплифицировать с помощью ПЦР с использованием пары специфических для локуса фланкирующих олигонуклеотидов в качестве праймеров для выявления полиморфизмов длин ДНК (ЬШ и Ευΐν, 1989; ^еЬег и Мау, 1989).

Мутации, затрагивающие одно положение в нуклеотидной последовательности, приводящие к заменам, делециям или инсерциям, приводят к однонуклеотидным полиморфизмам или δNΡ, которые встречаются примерно через каждые 1,3 т.п.н. в геноме человека (Соорег и др., 1985; Кеток и др., 1996). Большинство полиморфизмов этого типа имеют только два аллеля и их называют также биаллельными локусами. Позиционное клонирование на основе δ№ может облегчать идентификацию признаков болезней и ряда биологически информативных мутаций (\Уапд и др., 1998).

Анализы, основанные на ПЦР-удлинении, которые позволяют эффективно выявлять точковые мутации, можно применять для обнаружения δ№. Для процедуры требуется небольшое количество ДНК на образец. Тремя широко распространенными типами анализов выявления δ№ с использованием метода ПЦР, являются методы, основанные на применении расщепленных амплифицированных полиморфных последовательностей (САΡδ), (Кошес/пу и Аи8иЬе1, 1993; ТЫе1 и др., 2004), производных САΡδ (άСАΡδ) (МюйаеН и Атакшо, 1998; №£Т и др., 1998) и конформационного полиморфизма одной цепи (55СР) (0гйа и др., 1989).

САΡδ-полиморфизмы представляют собой различия в длинах рестрикционных фрагментов, вызываемые δ№ или инделами, которые создают или упраздняют распознаваемые обладающими эндонуклеазной активностью рестриктазами сайты рестрикции в ПЦР-ампликонах, продуцируемых специфическими для локуса олигонуклеотидными праймерами. Анализы САΡδ осуществляют путем расщепления специфических для локуса ПЦР-ампликонов одной или несколькими рестриктазами и последующего разделения расщепленной ДНК на агарозных или полиакриламидных гелях.

άСАΡδ является модификацией метода САΡδ, который позволяет выявлять большинство однонуклеотидных изменений путем использования ошибочно спаренных ПЦР-праймеров. С помощью этого метода распознаваемый рестриктазой сайт, который включает δ^, интродуцируют в ПЦР-продукт с помощью праймера, который содержит одно или несколько ошибочных спариваний с ДНК-матрицей. Затем модифицированный таким образом ПЦР-продукт подвергают расщеплению рестриктазой и определяют присутствие или отсутствие δ№ на основе полученной рестрикционной схемы.

Метод δδСΡ позволяет разделять денатурированную двухцепочечную ДНК на неденатурирующем геле и в результате позволяет определять на основе подвижности в геле вторичную структуру, а также

- 38 028355 молекулярную массу одноцепочечной ДНК.

Процедура АКМЗ (амплификация рефракторной мутационной системы)-ПЦР Ае и др., 2001) предусматривает применение одной ПЦР для генотипирования З№ (Рап и др., 2003; СЫарраппо и др., 2004). Состоящий из двух пар праймеров тетрапраймер используют для амплификации двух различных аллелей З№ в одной реакции ПЦР.

Для амплификации таких фрагментов можно применять альтернативные методы, такие как лигазная цепная реакция (ЛЦР) (Έπιέικ Р., 1991)), для осуществления которой применяют две пары олигонуклеотидных зондов для экспоненциальной амплификации специфической мишени. Последовательности каждой пары олигонуклеотидов выбирают так, чтобы позволять паре гибридизоваться с примыкающими последовательностями этой же цепи мишени. С помощью указанной гибридизации формируют субстрат для зависящей от матрицы лигазы. Также как в случае ПЦР, образовавшиеся продукты служат в качестве матрицы в последующих циклах и таким образом осуществляют экспоненциальную амплификацию требуемой последовательности. ЛЦР можно осуществлять с олигонуклеотидами, имеющими проксимальные и дистальные последовательности одной и той же цепи полиморфного сайта. В одном из вариантов осуществления изобретения следует создавать олигонуклеотиды, включающие фактический полиморфный сайт полиморфизма. В таком варианте осуществления изобретения условия реакции выбирают так, чтобы олигонуклеотиды могли лигироваться вместе только в том случае, когда молекуламишень либо содержит, либо лишена специфического олигонуклеотида, который является комплементарным полиморфному сайту, присутствующему в олигонуклеотиде. В другом варианте олигонуклеотиды можно выбирать так, что они не включают полиморфный сайт (см. Зедеу, заявка Ρί'.'ΤΑ0 90/01069).

Еще один альтернативный метод, который можно применять, представляет собой метод лигирования олигонуклеотидов (0ЬА) (Ьапйедгеп и др., 1988). В 0ЬА-протоколе используют два олигонуклеотида, которые создают так, чтобы они могли гибридизоваться с примыкающими последовательностями одной цепи мишени. 0ЬА подобно ЛЦР наиболее пригоден для выявления точечных мутаций. В отличие от ЛЦР в результате 0ЬА получают линейную, а не экспоненциальную амплификацию последовательности мишени.

№скег8оп с соавторами в 1990 г. описали анализ выявления нуклеиновой кислоты, который объединяет особенности и ПЦР, и 0ЬА (№скег8оп и др., 1990). В этом методе ПЦР используют для достижения экспоненциальной амплификации ДНК-мишени, которую затем выявляют с помощью 0ЬА. Помимо необходимости в осуществлении нескольких и разнообразных стадий процессинга одна из проблем, возникающих при применении таких комбинированных методов, состоит в том, что они включают все проблемы, связанные как с ПЦР, так и с 0ЬА.

Известны также схемы, основанные на лигировании двух (или большего числа) олигонуклеотидов в присутствии нуклеиновой кислоты, имеющей последовательность образовавшегося диолигонуклеотида, что приводит к амплификации диолигонуклеотида (Аи и Аа11асе, 1989), и их можно легко адаптировать для целей настоящего изобретения.

Еще в одном варианте осуществления изобретения маркер, полученный на основе делеции или инсерции (индел) по меньшей мере одного нуклеотида, используют для идентификации подпадающих под объем изобретения аллелей в родительских растениях и/или их предках, а также в потомстве растений, полученном в результате скрещивания указанных родительских растений. Эти маркеры можно создавать на основе последовательности полинуклеотидов, предлагаемых в изобретении и описанных выше.

В частности, маркеры, предлагаемые в настоящем изобретении, можно применять в анализе аллельной дискриминации, прежде всего в анализе, который позволяет различать (дискриминировать) различные гаплотипы в группах растений сахарной свеклы, имеющих генотип, характерный для двулетнего типа развития. Указанный анализ базируется на применении набора полинуклеотидных зондов, содержащего две различные молекулы-зонды, которые комплементарны, например, подобласти гена ΒνΡΚΚ7, которую можно получать путем ПЦР-амплификации с использованием прямого праймера ΡΚΚ7(Τ1)-Ρ и обратного праймера ΡΚΚ7(Τ1)-Ρ-Κ, последовательности которых представлены в ЗЕф ГО N0: 13 и ЗЕф ГО N0: 14 соответственно, где молекулы-зонды различаются только одним ошибочным спариванием оснований и представляют собой зонды ΡΚΚ7(Τ1)-νΚ.’ (ЗЕф ГО N0: 15) и ΡΚΚ7(Τ1)-РΑΜ (ЗЕф ГО N0: 16). Другие предпочтительные наборы включают прямой праймер ΡΚΚ7(Τ6)-Ρ, представленный в ЗЕф ГО N0: 49, и обратный праймер ΡΚΚ7(Τ6)-Κ, представленный в ЗЕф ГО N0: 50, в сочетании с зондами ΡΚΚ7(Τ6)-νΚ (ЗЕф ГО N0: 51) и ΡΚΚ7(Τ6)-РΑΜ (ЗЕф ГО N0: 52), а также прямой праймер 1γ22(Τ1)-Ρ, представленный в ЗЕф ГО N0: 55, и обратный праймер 1τ22(Τ1)-Κ, представленный в ЗЕф ГО N0: 56, в сочетании с зондами п22(Т1)-УГС (ЗЕф ГО N0: 57) и 1г22СП)-РАМ (ЗЕф ГО N0: 58).

Указанные анализы, в которых применяют набор полинуклеотидных зондов, предпочтительно содержащий по меньшей мере две отдельные молекулы-зонды, которые отличаются по меньшей мере одним ошибочным спариванием, предпочтительно двумя или большим количеством ошибочных спариваний, которые локализованы в соседних сайтах, но прежде всего одним ошибочным спариванием, в котором первая молекула-зонд, прежде всего меченая молекула-зонд, более предпочтительно молекула-зонд, меченная первым флуоресцентным красителем и гасителем, представляет собой один аллель, а вторая молекула-зонд, прежде всего меченая молекула-зонд, более предпочтительно молекула-зонд, меченная

- 39 028355 вторым флуоресцентным красителем, который не идентичен первому красителю, и гасителем, представляет собой другой аллель, и где указанный набор полинуклеотидных зондов применяют для дискриминации двух аллельных вариантов. Кроме того, можно применять две различные флуоресцентные метки, флуоресценцию которых легко можно различать. Например, первый зонд метят первым флуоресцентным красителем (типа, например РЛМ), а второй зонд метят вторым флуоресцентным красителем (типа, например У1С). В предпочтительном варианте указанного анализа, предлагаемого в настоящем изобретении, амплифицированный фрагмент, полученный на стадии б) описанного выше анализа аллельной дискриминации, предлагаемого в настоящем изобретении, дополнительно зондируют второй флуоресцентномеченной молекулой-зондом, которая содержит последовательность, специфическую для аллеля, ассоциированного с двулетним типом развития. В этом анализе повышение уровня флуоресценции только одного красителя, которым метят первый зонд, свидетельствует о присутствии аллеля, ассоциированного с однолетним типом развития. Два красителя, которые применяют в этом анализе, предпочтительно представляют собой У1С и РЛМ. Как правило, в анализах, предлагаемых в настоящем изобретении, предпочтительно применяют 2 праймера (т. е. пару праймеров, предлагаемых в изобретении) и по меньшей мере один зонд для аллеля, ассоциированного с однолетним типом развития. Можно применять также второй зонд, представляющий собой зонд для аллеля, ассоциированного с двулетним типом развития.

Другим объектом изобретения является анализ, для которого используют маркеры, обеспечивающие специфическую дискриминацию однолетних растений и двулетних растений, который в результате можно применять, например, для контроля качества партий семян.

В частности, изобретение относится к анализу, основанному на использовании набора полинуклеотидных зондов, содержащего две различные молекулы-зонды, которые комплементарны, например, подобласти гена В\'РКК7. которую можно получать путем ПЦР-амплификации с использованием прямого праймера РКК7(Т1)-Р и обратного праймера РКК7(Т1)-Р-К, последовательности которых представлены в 8ЕЦ ГО N0: 13 и 8ЕЦ ГО N0: 14 соответственно, где молекулы-зонды различаются только одним ошибочным спариванием оснований и представляют собой зонды РКК7(Т1)-У1С (8ЕЦ ГО N0: 15) и РКК7(Т1)-РЛМ (8ЕЦ ГО N0: 16). Другие предпочтительные наборы включают прямой праймер РКК7(Т6)-Р, представленный в 8ЕЦ ГО N0: 49, и обратный праймер РКК7(Т6)-К, представленный в 8ЕЦ ГО N0: 50, в сочетании с зондами РКК7(Т6)-У1С (8ЕЦ ГО N0: 51) и РКК7(Т6)-РЛМ (8ЕЦ ГО N0: 52), а также прямой праймер 1г22(Т1)-Р, представленный в 8ЕЦ ГО N0: 55, и обратный праймер 1г22(Т1)-К, представленный в 8ЕЦ ГО N0: 56, в сочетании с зондами гг22(Т1)-У1С (8ЕЦ ГО N0: 57) и 1г22(Т1)-РЛМ (8ЕЦ ГО N0: 58).

Следующим объектом настоящего изобретения является способ идентификации загрязнения однолетним генотипом предназначенных для продажи семян. Предпочтительно этот способ заключается в том, что применяют основанный на использовании маркеров анализ аллельной дискриминации, предлагаемый в настоящем изобретении и представленный в настоящем описании.

Представленные ниже примеры даны только для иллюстрации одного или нескольких предпочтительных вариантов осуществления изобретения и не направлены на ограничение объема изобретения.

Примеры

В приведенных ниже примерах проиллюстрированы варианты осуществления изобретения. В свете представленного описания и известного уровня техники специалисту в данной области должно быть очевидно, что приведенные ниже примеры даны только с целью иллюстрации и что многочленные изменения, модификации и вариации можно применять без отклонения от сущности и объема изобретения, представленного в формуле изобретения.

Пример 1. Характеризация гена РКК7 сахарной свеклы.

Пример 1.1. Картирование предполагаемого гомолога РКК7 из сахарной свеклы.

На основе подхода, включающего применение генов-кандидатов, для идентификации и характеризации предполагаемых генов, контролирующих стрелкование у сахарной свеклы, была идентифицирована Е8Т-последовательность, имеющая регистрационный номер СУ301305, в качестве предполагаемого гомолога гена РКК7 свеклы с помощью оценки гомологии ВЬЛ8Т-методом. В 8ЕЦ ГО N0: 1 представлена нуклеотидная последовательность Е8Т СУ301305. Частью соответствующей аминокислотной последовательности является мотив домена-приемника регулятора псевдоответа (РКК, рГат00072) или домена-приемника сигнала (КЕС, ск00156) (фиг. 1), отличительного признака семейства генов РКК, которые все имеют решающее значение для работы внутренних часов организма ЩакатюЫ и др., 2005). На фиг. 2 представлено сравнение аминокислотной последовательности СУ301305 и аминокислотной последовательности РКК7, ее ближайшего гомолога из ЛгаЫкор818, который описан как компонент чувствительной к температуре циркадной системы (внутренних часов организма) (ЦакатюЫ и др., 2007; 8а1оте и МсС1ипд, 2005). Известно, что внутренние часы организма контролируют ряд связанных с развитием процессов у растений, включая контроль времени цветения (Птн/ипи и Кау, 2006; 2йои и др., 2007).

На основе вышеуказанных данных была выведена предполагаемая генная структура части РКК7фрагмента с помощью сравнительного анализа геномной последовательности и мРНК гена РКК7 ЛгаЫкор818 (ЛТ5С02810 и ИМ_120359 соответственно) и Е8Т (СУ301305) гена ВνΡКК7 сахарной свеклы, ко- 40 028355 торый подтвердил присутствие нескольких предполагаемых интронных областей (фиг. 3). Праймеры РКК7-Е и РКК7-К (ЗЕР ΙΌ ΝΟ: 2 и 3), фланкирующие предполагаемую третью интронную область, обеспечивали получение продукта амплификации размером примерно 0,5 т.п.н. при применении геномной ДНК свеклы в качестве матрицы. Для амплификации с помощью ПЦР применяли следующие условия: начальная денатурация при 95°С в течение 5 мин, затем 35 циклов амплификации по 30 с при 95°С, 30 с при 60°С и 30 с при 72°С и затем 5 мин при 72°С. ПЦР-эксперименты осуществляли в устройстве ОепеАМР РСК Зу§1еш 9600 фирмы АррНеб Вю8у§1еш8 1пс., используя меченную платиной ДНКполимеразу Тац и соответствующую реакционную смесь фирмы 1пуйго§еп СогрогаЕоп, согласно рекомендациям поставщика. Анализ последовательности ПЦР-продукта позволил реконструировать геномную последовательность вокруг интрона 3 гена ВуРКК7 и подтвердил присутствие фрагмента длиной 296 пар оснований (ЗЕР ГО ΝΟ: 4). Геномный фрагмент гена ВуРКК7 амплифицировали и секвенировали с использованием панели родительских линий сахарной свеклы, включающей 15 двулетних и 1 однолетнюю линию. Все двулетние линии оказались мономорфными по ВуРКК7, поскольку обнаружено только два различных гаплотипа: один аллель, ассоциированный с двулетним типом развития, и один аллель, ассоциированный с однолетним типом развития (табл. 1). Для картирования ВуРКК7 в популяции, расщепленной по признаку однолетности, создавали анализ, обеспечивающий выявление 3ΝΓ в положении №160 (ЗЕР ГО ΝΟ: 4), используя технологию ЕпбРот! ТацМап®. В табл. 2 представлены нуклеотидные последовательности праймеров и зондов, созданных для РКК7(Т1)-ТацМап®-анализа, направленного на выявление 3ΝΓ в положении №160; в реакции использовали также универсальную мастер-смесь для ПЦР (ТацМап® Цшуег§а1 РСК Ма§1ег Μΐχ, № ЛшрЕгазе® ϋΝΘ) (2х) фирмы ЛррНеб Вю8у§1еш8 1пс. согласно рекомендациям производителя. ПЦР-амплификацию осуществляли с использованием следующих условий: 95°С в течение 10 мин, затем 40 циклов при 95°С в течение 15 с и 60°С в течение 1 мин, используя детекторное устройство для секвенирования последовательности типа АВ1 РК1ЗМ 7700. Оценку с использованием технологии ЕпбРот! осуществляли с помощью программы Зециепсе Эе1ес1юп Зу§1еш 2.0.

Таблица 1

Полиморфизмы, обнаруженные среди 1 однолетней и 15 двулетних линий сахарной свеклы во фрагменте гена ВуРКК7, охватывающем интрон 3

8ЕЦ Ιϋ ΝΟ 4: положение	87	160	406
гаплотип №1	Т	т	О	однолетний
гаплотип №2	С	с	А	двулетний

В верхнем ряду таблицы показаны положения нуклеотидов в геномной последовательности фрагмента гена ВуРКК7 (представлена в ЗЕО ГО ΝΟ: 4). В ряду, озаглавленном гаплотип № 1 и гаплотип № 2 представлены два гаплотипа, которые были обнаружены в панели, состоящей из 16 линий.

Таблица 2

Нуклеотидные последовательности праймеров и зондов, применяемых в ТадМап-анализе с использованием РКК7(Т1) с целью генотипирования З№Р №160

Обозначения применяемых праймеров и зондов	Нуклеотидная последовательность (5’-3’)	ЗЕЦ ГО ΝΟ:
РКК7(Т1)-Р	ОАООТОТСАСАОТОТААОТОТСТ	13
РКК7(Т1)-К	АААОАСТОСТАСАСОААССАСТААО	14
РКК7(Т1)-РАМ	РАМ-СТОАТОААААОСТО-МОВ-ЧРЦ	16
РКК7(Т1)-У1С	УГО-СТОАТООЛААОСТО-МОВ-ИРЦ	15

С помощью описанного выше анализа с использованием РКК7(Т1) ген ВуРКК7 был картирован в Г2-популяции, включающей 198 растений, которые получали скрещиванием однолетней линии и двулетней линии, полиморфной по З№Р в положении №160. ВуРКК7 картирован на хромосоме II на расстоянии примерно 1 сМ по ходу транскрипции относительно маркера 01131 (фиг. 4), в области, которая, как известно, содержит ген В, обусловливающий независимое от яровизации цветение (Мокппд и др., 2004; ОааГаг и др., 2005). Результаты анализа с использованием РКК7(Т1) продемонстрировали точное соответствие между предсказанным генотипом гена В и генотипом гена ВуРКК7. Генотип гена В был предсказан на основе фенотипической оценки Г3-популяций, которые были получены из индивидуальных Г2растений, характеризующихся независимым от яровизации цветением. В табл. 3 дано графическое представление точной карты области гена В для 9 индивидуальных растений-потомков, включающих случаи ближайшей рекомбинации. Сочетание его положения на карте и биологической функции, связанной с чувствительным к температуре циркадным ритмом (За1оше и МсС1ипд, 2005), с большой долей вероятности делает ВуРКК7 наиболее перспективным кандидатом на роль гена В.

- 41 028355

Таблица 3

Генотипы некоторых маркеров, включенных в РКК7(Т1)-картирование вокруг гена Β в 9 Р2-растениях, характерные для случаев рекомбинации на любой стороне гена Β. РКК7(Т1), а также маркер 9_27(Т2) характеризуются точным соответствием с предсказанным генотипом гена Β. Генотип гена Β оценивают по фенотипу Р3-популяции, полученной из индивидуальных Р2-растений (В - аллель, ассоциированный с признаком двулетности;

А - аллель, ассоциированный с признаком однолетности; Н -гетерозиготы по аллелям,

Используя праймеры РКК7-Р и РКК7-К, подвергали скринингу ΒΛС-библиотеку сахарной свеклы с помощью ПЦР. Библиотеку создавали на основе двулетнего коммерческого культивара Н20 с тем расчетом, чтобы она включала 6 геномных эквивалентов со средним размером вставки 120 т.п.н. (МсОгаШ и др., 2004). Пулы ДНК для этой библиотеки получали от фирмы АтрНсои Ехргезз, Пулман, шт. Вашингтон. Для скрининга пулов ДНК применяли следующие условия ПЦР: начальная денатурация при 95°С в течение 5 мин, затем 35 циклов амплификации по 30 с при 95°С, 30 с при 60°С и 30 с при 72°С и затем в течение 5 мин при 72°С. ПЦР-эксперименты осуществляли в устройстве ОеиеАМР РСК 8уз1ет 9600 фирмы АррНеД Β^οδуδΐетδ 1ис., используя меченную платиной ДНК-полимеразу Тац и соответствующую реакционную смесь фирмы 1иу11годеи СогрогаНои согласно рекомендациям поставщика. Последующий скрининг пулов ДНК в отношении присутствия ΒνΡКК7-фрагмента, проведенный согласно инструкциям поставщика, позволил осуществить положительную идентификацию клона ΒΛС δΒΛ079-^24.

Для получения полноразмерной последовательности гена клон ΒΛС δΒΛ079-^24 передавали на фирму ЖО Βω^Η АО, Германия, для анализа последовательности с помощью технологии секвенирования, разработанной фирмой 454 ЕДе 8с1еисез. При необходимости бреши между полученными наборами последовательных фрагментов заполняли путем общепринятого секвенирования по Сангеру с получением моногенной последовательности гена ΒνΡКК7 (ВЕР ГО NО: 8). На основе сравнительного анализа геномной последовательности с последовательностью ЕВТ СУ301305 и на основе гомологии последовательностей с геном РКК7 из АгаЫДорзхз, была предсказана предполагаемая структура гена ΒνΡКК7 свеклы, включающая интроны и экзоны, которая представлена на фиг. 5. Соответствующая аминокислотная последовательность ΒνΡКК7 представлена в ВЕС) ГО NО: 11. Сравнительный анализ аминокис- 42 028355 лотной последовательности ВуРКК7 и всех представителей семейства РКК-гена из АгаЫбор818, включая ТОС1 (РКК1), РКК3, РКК5, РКК7 и РКК9, позволил проиллюстрировать выраженную консервативность мотива домена-приемника регулятора псевдоответа (РКК) (р!ат00072) вблизи ЯН₂-конца и ССТ-мотива (р!ат06203) на СООН-конце (фиг. 6). Помимо семейства РКК-гена из АгаЫбор818, ВуРКК7 характеризуется также выраженной гомологией с РКК7 зерновых культур, что проиллюстрировано с помощью филогенетического дерева, представленного на фиг. 7. Дерево, представленное на фиг. 7, создавали, используя метод объединения соседей (Забои и №ΐ, 1987), с применением нескольких представителей семейства гена РКК из нескольких видов растений, включая Ве1а уи1§ап8 ВуРКК7, АгаЫбор818 ШаНапа (ТОС1, ΝΓ_200946; РКК3, ΝΓ_568919; РКК5, ЫР_568446; РКК7, ΝΓ_568107; и РКК9, ЫР_566085), Огу/а 8аИуа (РКК37, ^0^3В6), Ногбеит уи1§аге (РРЭ-Н1, ААУ17586) и ТгЩсит ае8йуит (РРЭ-ОЦ АВБ09477). Дендрограммы неукорененного дерева создавали, осуществляя сравнительных анализ аминокислотных последовательностей с использованием программы С1и81а1Ш, а филогенетическое дерево строили с использованием программы МЕОА4 (Татига и др., 2007). На каждой ветви представлены значения, полученные при использовании Ьоо181гар-анализа для 1000 реплик. Неожиданным является то, что гомолог РКК7 в зерновых культурах, более известный как Ррб, рассматривается в качестве основного определяющего фактора фотопериодической реакции (Тигпег и др., 2005; Веа1е8 и др., 2007), а не определяющего яровизационный ответ фактора, как это предполагается в настоящем описании для сахарной свеклы.

Пример 1.3. Точное картирование В-локуса.

На основе предварительных результатов картирования, описанных выше в примере 1.1, начинали крупномасштабное картирование с высокой степенью разрешения для заполнения области вокруг молекулярных маркеров 01131 и 0101, применяемых для картирования и подтверждения корреляции между предсказанным генотипом гена В и генотипом гена ВуРКК. Было проанализировано в целом 5157 особей Р2-поколения, полученных из нескольких популяций, для которых характерна сегрегация по признаку однолетности, с использованием двух фланкирующих маркеров ОЮ1(Т1) и ОН31(Т1) (ОааГаг и др., 2005). В целом идентифицировано 71 растение Р2-поколения, для которых характерна рекомбинация между двумя фланкирующими маркерами. Соответственно рассчитан интервал картирования для гена В, составляющий 0,69 сМ. Затем рекомбинантные растения генотипировали с помощью анализа с использованием РКК7(Т1), описанного выше, и с помощью пригодных для данного интервала анализов 9_27(Т2) и Е0031700(Т1), которые описаны в заявке на европейский патент ЕР 1995320 А1. В табл. 4 обобщены нуклеотидные последовательности праймеров и зондов, созданных для ОН31(Т1)-, 9_27(Т2)-, Е0031700(Т1)-, РКК7(Т1)- и ОЮ1(Т1)-ТацМап®-анализов; в реакциях использовали также универсальную мастер-смесь для ПЦР (ТацМап® ишуег8а1 РСК Ма81ег Μΐχ, ΝΘ АтрЕга8е® ϋΝΘ) (2х) фирмы АррНеб Вю8у81ет8 1пс. согласно рекомендациям производителя. ПЦР-амплификацию осуществляли с использованием следующих условий: 95°С в течение 10 мин, затем 40 циклов при 95°С в течение 15 с и 60°С в течение 1 мин, используя устройство для осуществления ПЦР в реальном времени типа АррНеб Вю8у81ет8 7500.

Таблица 4

Нуклеотидные последовательности праймеров и зондов, применяемые в ОН31(Т1)-,

9_27(Т2)-, Е0031700(Т1)-, РКК7(Т1)- и 0101(Т1)-ТадМап®-анализах соответственно

СЛ31(Т1)-анализ
	5ЕЦ ГО ΝΟ	Последовательность
«прямой» праймер	17	СССССТАСАААСАААОАСТТСТС
«обратный» праймер	18	АСССАСААТОТТСАТСАТСАТАСА
зонд ТацМап У1С	19	ТССАТСТСТССАСАССТТ
зонд ТацМап УАМ	20	ТССАТСТССССАСАССТ
9 27(Т2)-анализ
«прямой» праймер	25	ТСССААААСАСАСАТТСТАССТАТАСА
«обратный» праймер	26	ТСССТСТСССТССТТСААО
зонд ТаяМап У1С	27	САТСТСТАСААСАСТАСС
зонд ТадМап УАМ	28	АТСТСТАСААСАСТАСС
Е0031700(Т1)-анализ
«прямой» праймер	21	ТАААССТССТААТТТТАСАСААТТТТАССА
«обратный» праймер	22	ССТССТТТТСААААААТТТССС
зонд ТацМап У1С	23	ТТТААТТСССАТССТТСТ
зонд ТадМап УАМ	24	ТТААТТСОСАААСТТСТ
РКК7(Т1)-анализ
«прямой» праймер	13	САССТСТСАСАСТСТААСТСТСТ
«обратный» праймер	14	АААСАСТССТАСАССААССАСТААС
зонд ТацМап У1С	15	СТСАТОСАААССТС
зонд ТацМап УАМ	16	СТСАТСААААССТС
Ш01(Т1)-анализ
«прямой» праймер	29	СААСССАССАТТАСТССТСАСС
«обратный» праймер	30	ААААСТАСААТААААТСТААССТССТССАТСТС
зонд ТацМап У1С	31	АСССААСАТААСАТСАС
зонд ТацМап УАМ	32	АСССААСАТААССТСАС

- 43 028355

Аллельный статус гена Β выводили на основе исследований фенотипов индивидуальных растений из Р2-поколения (т.е. наличие или отсутствие стрелкования в условиях фотопериода с длинным световым днем (18 ч света/6 ч темноты), а также соответствующих популяций потомков, которые получали самоопылением растений Р2-поколения. В табл. 5 представлено графическое изображение полученной с высоким разрешением карты области гена Β, на котором обобщены генотипические и фенотипические данные, полученные для различных рекомбинантных растений. Полная корреляция между генотипом гена ΡΚΚ7 и фенотипом всех рекомбинантов позволяет сделать заключение о том, что гомолог ΡΚΚ7 свеклы действительно представляет собой ген В. Принимая во внимание наличие одного случая рекомбинации на каждой стороне гена Β, при создании настоящего изобретения интервал картирования гена Β был снижен до 0,02 сМ, при этом ген ΡΚΚ7 в случае признака однолетности совместно локализован наверху гена Β.

Таблица 5

Графическое изображение полученной с высоким разрешением карты области гена Β.

Генотипы А и Β каждого маркера соответствуют аллелям, ассоциированным с признаком однолетности и двулетности соответственно. Интервалы локализации гена Β обозначены двумя примыкающими выделенными черным цветом колонками и основаны на фенотипах, обнаруженных для каждого рекомбинантного растения Р2-поколения (Β - аллель, ассоциированный с признаком двулетности; А - аллель, ассоциированный с признаком однолетности; Η - гетерозиготы по аллелям, ассоциированным с признаком однолетности)

- 44 028355

- 45 028355

Пример 1.4. Анализ генной экспрессии ΒνΡΚΚ7.

Для анализа генной экспрессии проростки однолетних, двулетних и двулетних яровизированных растений выращивали в камерах с контролируемыми условиями окружающей среды при постоянной температуре 18°С и фотопериоде 16 ч света/8 ч темноты (длинный световой день, ДД) или 8 ч света/16 ч темноты (короткий световой день, КД) соответственно. Каждые 2 ч в течение 24 ч отбирали образцы листьев и выделяли общую РНК с помощью набора КNА^иеои8®-4ΡСК, поступающего в продажу от фирмы АтЪюп, следуя в целом инструкциям поставщика. Образцы РНК превращали в кДНК с помощью набора КЕТК08спр1® (фирма АтЪюп), начиная процесс с 1 мкг общей РНК в качестве матрицы. Уровень экспрессии гена ΒνΡΚΚ7 оценивали с использованием количественной ПЦР (кПЦР) с помощью мастер-смеси для ПЦР Ро\уег 8ΥΒΚ® Сгееп РСК Ма81ег Μίχ (фирма Аррйей Вю8У81ет8 1пс.) на устройстве для осуществления ПЦР в реальном времени типа 7500 8у81ет. При осуществлении ПЦР использовали следующие параметры: начальная денатурация при 95°С в течение 10 мин, затем 40 циклов амплификации по 15 с при 95°С и 1 мин при 60°С. Применяли прямой и обратный праймеры для ΒνΡКК7, имеющие следующие нуклеотидные последовательности: 5'-ТТССАССАССТСТСАСАСТТСТАС-3' (8ЕС) ГО N0: 45) и 5'-ТСТСАТТСТСССАСТСТТСАСС-3' (8ЕО ГО N0: 46) соответственно. Ген изоцитратдегидрогеназы (ΒνΚ,ΌΗ) использовали в качестве гена, с которым проводят сравнение (референсгена), для стандартизации уровня экспрессии ΒνΡКК7. Праймерные последовательности, созданные для этого референс-гена, представляли собой 5'-САСАССАСАТСААСССССТ-3' (8ЕЦ ГО N0: 47) и 5'СССТСААСАСССТСССАТ-3' (8ЕЦ ГО N0: 48), Уровни экспрессии рассчитывали в виде средних для трех биологических повторностей и каждую кПЦР повторяли трижды.

Как проиллюстрировано на фиг. 8, экспрессия гена ΒνΡКК7 во всех трех классах растений (т.е. однолетних, двулетних и двулетних яровизированных растений) характеризуется циркадным колебанием с пиком уровня экспрессии через 7 ч после рассвета как при ДД (16 ч света/8 ч темноты), так и при КД (8 ч света/16 ч темноты). Этот эксперимент подтвердил ритмичную и циркадную экспрессию ΒνΡКК7, что описано для большинства ассоциированных с внутренними часами генов, идентифицированных к настоящему времени (МсС1ипд, 2006).

Пример 1.5. Аллельная вариабельность и связь с требованием к яровизации.

С помощью пар праймеров, представленных в табл. 6, полную кодирующую область гена ΒνΡКК7, а также участок ±1,0 т.п.н. ее промоторной области, амплифицировали и секвенировали с использованием панели двулетних и однолетних исследуемых вариантов. Эта панель включала 3 двулетние элитные линии из пула зародышевой плазмы фирмы 8упдеп1а, а также однолетние и двулетние дикие и сорные виды свеклы, собранные в Европе. Для ПЦР-амплификации использовали следующие условия: начальная денатурация при 95°С в течение 5 мин, затем 35 циклов амплификации по 30 с при 95°С, 30 с при 60°С и 30 с при 72°С и затем 5 мин при 72°С. ПЦР-эксперименты осуществляли с помощью устройства СепеАМР РСК 8у81ет 9700 фирмы Аррйей Вю8У81ет8 1пс., используя меченную платиной ДНКполимеразу Тац и соответствующую реакционную смесь фирмы йцЦгодеп Согрогайоп согласно рекомендациям поставщика. Графическое представление обнаруженных генотипов включало несколько различных аллелей, ассоциированных с однолетним типом развития, и 2 - с двулетним типом развития (ср. табл. 7-1 и 7-2, также представленные на фиг. 11 и 12 соответственно). Для нескольких полиморфизмов обнаружено наличие выраженной корреляции между аллельными вариациями, обнаруженными для ΒνΡКК7, и однолетним или двулетним фенотипом растения. Эти данные подтверждают причинную взаимосвязь между ΒνΡКК7 и локусом В для независимого от яровизации цветения у сахарной свеклы. В табл. 7-1 (фиг. 11) представлены полиморфизмы, идентифицированные в промоторной области при сравнении аллелей, ассоциированных с однолетним типом развития и двулетним типом развития. Линии растений с гетерозиготными формами аллелей не использовали для анализа. Положения 8№, указанные в табл., пронумерованы согласно 8ЕЦ ГО N0: 8. Нуклеотидые положения, обозначенные звездочкой (*), можно применять для дискриминации аллелей, ассоциированных с однолетним типом развития и двулетним типом развития. Как видно из табл. 7-1 (фиг. 11), 8№ в положениях №№ 11592, 12316, 12490 и 12544 соответственно промоторной области можно применять для того, чтобы различать аллели, ассоциированные с однолетним и с двулетним типом развития. Полиморфизмы, идентифицированные в кодирующей области, при сравнении аллелей, ассоциированных с однолетним типом развития и двулетним типом развития, представлены в табл. 7-2 (фиг. 12). Линии растений с гетерозиготными формами аллелей и в этом случае не использовали для анализа. В табл. 7-2 (фиг. 12) 8№ и аминокислотные положения пронумерованы согласно 8ЕЦ ГО N0: 9 и 11 соответственно. Нуклеотидные и аминокислотные положения, обозначенные звездочкой (*), можно применять для дискриминации аллелей, ассоциированных с однолетним типом развития и двулетним типом развития. Среди 8№, обнаруженных в кодирующей области, 8№ в положениях №№ 224, 351, 615, 897, 1082, 1841, 1915 и 2334 соответственно, можно применять для того, чтобы различать все ассоциированные с однолетним и ассоциированные с двулетним типом развития аллели. Для гарантии качества любой один или комбинации нескольких 8№, обнаруженных в кодирующей области, а также в промоторной области, можно применять для выявления присутствия ассоциированного с однолетним типом развития аллеля в предназначенных для продажи партиях

- 46 028355 семян двулетних культиваров с помощью молекулярных маркеров, мишенью которых является один или несколько из указанных 8ΝΚ

Таблица 6

Нуклеотидные последовательности праймеров, применяемых для амплификации и секвенирования кодирующей области, а также участка! 1 т.п.н. из 5' иТК-области гена ВуРКК 7

Праймер Ю	ЗЕ() ГО N0	Последовательность 5'	Ориентация	Применение в сочетании с	Локализация на ΒνΡΚΚ7
8ЕЬА3977	33	ССТСТССААТАТТОАТТТАСТОАОАТС	Прямая	8ЕЬА3988	5' итк
5ЕБА3988	34	ТААСССАТСАТСТСТТТТСААСААТС	Обратная	8ЕЬА3977	5' итк
ЗЕЬА4442	35	ААСААТАСССАСАСТТТТТТССС	Прямая	8ЕЬА3809	5' итк
8ЕЕА3809	36	ТСАССААТТСТТТАТАТСАТАТСАТСАСА	Обратная	ЗЕЬА4442	5¹ итк
8ЕЬА3810	37	САСААААСССТТТТАСАТССТААСТТТТ	Прямая	8ЕЬА3807	5' итк
8ЕЬА3807	38	САТТТСТТСААСТАССТСАТААССАСАА	Обратная	8ЕЬА3810	Интрон 2
8ЕЕА3766	39	ТТТСАТССТТТТТТСАССССА	Прямая	8ЕЬА3769	Интрон 2
8ЕЬА3769	40	ААТАтатстаАСААААтестаасА	Обратная	8ЕЬА3766	Интрон 5
8ЕЬА3857	41	ТССАТТТСАССАСТАССТАТСАТСАС	Прямая	8ЕЬА3860	Интрон 5
ЗЕЬА3860	42	ТСТТСАССТССТСАТССАССТ	Обратная	8ЕЬА3857	Экзон 8
8ЕЬА3861	43	стссатстсстаассстсстс	Прямая	8ЕЬА3864	Экзон 8
8ЕЬА3864	44	ААТСТСАССССТАААССССТ	Обратная	8ЕЬА3861	з¹ итк

Таблица 7-1

Гаплотипы ВуРКК7 в различных однолетних и двулетних исследуемых вариантах (см. также фиг. 11)

- 47 028355

ί?	11948	Ο ο	11828	СС
_	*	>	-	>
; ”1	2	I	σ	.>
Η,	-		σ	>
'«ϊ			σ	>
А	г		σ	>
ΐ.	г		σ	>
	с		σ	>
Α	-		σ	>
-			σ	>
	ο		σ	>
Η			σ	ϊ»
	-		σ	>
			σ
	-		σ	>
		>	σ	>
	-	>	σ	>
	-		σ	>
	-	>	σ	>
	-		σ	, Η'
	-		σ	>
	-		σ	>
			Ό	>

Фенотип	Линии	Источники
	ΒΑΤΚ.ΑΝ	Испания
	ΟΚΕ1ΑΝ	Греция
	КШ1	8уп8еп4аоднодетний
	ггаьам	Италия
	ΡΟΗΊΑΝ	Португалия
	υδΟΑ-62	США
	13В ЮА '	Италия
	ΒΡσζΒ	Италия
	Р1А01КО	Франция
	Р1А02КО ^_	Франция
	ΗΐΰΟϋτΑ	Франция
	ЕШ12ТА	Франция
	ΡΙΕΟΓΓΑ	Франция
	И2С068О	Франция
	ЫН01ВА	Франция
	Ρ2Β1ϋνΑ	Франция
	Н2СТ28О “	Франция
	13Ο10Α	Италия
даулегн	изА1осв	Великобритания
двулетн.	ОТТ8	Луп§еп1а О-тип
двулетн.	Η346	Яуп£еп1а Р-1
двулетн	ИГО2	5уп§еп1а Р-2
мишень

Таблица 7-2

Гаплотипы ΒνΡΚΚ7 в различных однолетних и двулетних исследуемых вариантах (см. также фиг. 12)

Пример 1.6. Аллельная дискриминация однолетних и двулетних растений сахарной свеклы.

Присутствие стрелкующихся растений, т.е. растений сахарной свеклы, содержащих ассоциированный с однолетним типом развития аллель В, в лотах, предназначенных для продажи семян из-за попадания пыльцы однолетнего растения в процессе получения гибридных семян, представляет собой основной параметр качества при производстве и продаже сахарной свеклы. Поэтому для контроля качества производства семян важно иметь средство, позволяющее осуществлять дискриминацию однолетних и двулетних растений.

Для аллельной дискриминации выделяли ДНК из растений или семян, подлежащих оценке, с помощью общепринятых методов выделения ДНК. Затем ДНК тестировали с использованием Та^Μаη®анализа, направленного на выявление 8№ в положении № 2334 в кодирующей области. В этом анализе использовали следующие нуклеотидные последовательности:

РКК7(Т6)-Р: 5’ОСТАТСООТАТТССТТССТТТОТТТ-3’ (ЗЕО ГО N0: 49), РКК7(Т6)-К: 5’СТСОТОТТСОТОООСААТТ-3’ (8Е<2 ГО N0: 50), РКК7(Т6)-У1С: 5’-У1ССТССТАССТОССОСАС-МОВ-КРО-З’ (ЗЕО ГО N0: 51) и РКК7(Т6)-РАМ: 5’РАМ-СТСОСАССТООСОСАС-МОВ-КРО-З’ (ЗЕ<2 ГО N0: 52).

Для осуществления ПЦР-реакции использовали также универсальную мастер-смесь для ПЦР (ТацΜаη® Ипгуег8а1 Ю Μа8ΐе^ Μΐχ, № АтрЕга8е® υNΟ) (2х) фирмы Аррйей Β^ο8у8ΐет8 1пс. согласно рекомендациям производителя. ПЦР-амплификацию осуществляли в следующих условиях: 95°С в течение 10 мин, затем 40 циклов при 95°С в течение 15 с и 60°С в течение 1 мин, с использованием устройства для осуществления ПЦР в реальном времени типа, Аррйей Β^ο8у8ΐет8 7500 Зу81ет. Оценку с использованием технологии ЕηйΡο^ηΐ осуществляли с помощью программы Зециепсе Ое1есВоп Зу81ет 2.0. Если анализ демонстрировал существенное повышение только флуоресценции, связанной с красителем то это свидетельствует о гомозиготности аллеля X (т.е. гомозиготности аллеля, ассоциированного с двулетним типом развития). Существенное повышение только флуоресценции, связанной с красителем ΕΑΜ, свидетельствует о гомозиготности аллеля Υ (т.е. гомозиготности аллеля, ассоциированного с однолетним типом развития). Если существенно повышается уровень обоих флуоресцентных сигналов, то растение является гетерозиготным (т.е. представляет собой однолетнее растение, гетерозиготное по локусу В).

На фиг. 9 представлены результаты анализа аллельной дискриминации набора однолетних и двулетних индивидуальных растений.

В этом анализе можно применять также следующие нуклеотидные последовательности с получением аналогичных результатов (т.е. позволяющие осуществлять дискриминацию однолетних и двулетних индивидуальных растений):

1г22(Т1)-Р: 5’-ОАТАААТТСТОАСССССАТСАСА-3’ (8Е0 ГО ΝΟ:

55) , 1г22(Т1)-К: 5’-ООАСТОАОТТОАТААТААТСААСТТТСС-3’ (ЗЕО ГО N0:

56) , 1г22(Т1)-У1С: 5’-У1С-СТАОСОСААТТТС-МОВ-МРО-3’ (ЗЕО ΙϋΝΟ: 57) и 1г22(Т1)-РАМ: 5’-РАМ-АОСТАОСОСССААТТ-МОВ-ЕРО-3’ (ЗЕО ГО N0: 58).

- 49 028355

Пример 2. Валидация трансгенов ВνΡΚΚ7 с помощью изучения комплементарности.

Однолетний фенотип растения, обусловленный геном В, проявляется в виде одиночного доминантного признака; таким образом, требование к яровизации у двулетних растений является рецессивным. Таким образом, можно предсказать, что трансформация ассоциированного с однолетним типом развития аллеля ВνΡΚΚ7 в характерный для двулетнего типа развития генотип должна придавать характерный для однолетнего типа развития признак цветения характерному для двулетнего типа развития генотипуакцептору. Таким образом, нет необходимости проводить яровизацию трансгенных растений для индукции стрелкования, поскольку трансформированный ассоциированный с признаком однолетности аллель ВνΡΚΚ7, по-видимому, аннулирует необходимость в яровизации, ассоциированной с признаком однолетности. Для подтверждения этой гипотезы кодирующей последовательностью ассоциированного с однолетним типом развития аллеля ВνΡΚΚ7 под контролем ассоциированного с однолетним типом развития промотора и фрагмента терминатора трансформировали характерный для двулетнего типа развития генотип 0018. Плазмидная карта бинарного вектора, несущего генные кассеты как для гена селектируемого маркера ΡΜΙ, так и для ассоциированного с однолетним типом развития аллеля ВνΡΚΚ7, показана на фиг. 10. Экспериментальная процедура, применяемая для трансформации сахарной свеклы, соответствует в целом описанной у С1апд и др., 2002, для которой используют меристему сахарной свеклы в качестве материала эксплантата и ген фосфоманнозоизомеразы (ΡΜΙ) в качестве селектируемого маркера. В 8ЕЦ ГО N0: 53 представлена нуклеотидная последовательность кодирующей области аллеля ΡΚΚ7, ассоциированного с однолетним типом развития (нуклеотиды 1306-3672 8ЕЦ ГО N0: 49), расположенная по ходу транскрипции относительно ее промоторной области длиной примерно 1,3 т.п.н. (нуклеотиды 11305 8ЕЦ ГО N0: 49). Трансгенные проростки отбирали по признаку ΡΜΙ-активности ЦоегеЬо и др.) и затем укореняли, высаживали в горшки и переносили в теплицу. В качестве отрицательных контролей применяли проростки нетрансгенных как однолетних, так и двулетних растений сахарной свеклы, которые подвергали такой же процедуре регенерации ίη ν 11го. но без заражения АдгоЬас1епит и селекции с использованием маннозы. Растения выращивали в вегетационных камерах при постоянной температуре 18°С и фотопериоде 17 ч света и 7 ч темноты.

В этих условиях (без индукции стрелкования с помощью низких температур) ни у одного из нетрансгенных двухлетних контрольных растений не проявлялись какие-либо признаки стрелкования в течение периода наблюдения, составляющего вплоть до 12 недель, в то время как однолетние контрольные растения в норме начинали выбрасывать стрелку через 6-8 недель. В отличие от нетрансгенных двулетних контрольных растений у основного большинства трансгенов стрелкование начиналось через 4-10 недель, и они обладали основным признаком, характерным для однолетних растений, несмотря на соответствующий двулетним растениям генетический фон. Трансгенные растения, у которых происходило стрелкование и цветение, подвергали перекрестному опылению двулетней поддерживающей линией с получением потомства. У растений-потомков оценивали активность ΡΜΙ и затем их оценивали в отношении стрелкования и цветения без яровизации. Для растений-потомков характерны коэффициент сергрегации 1:1 и прямая корреляция между ΡΜΙ-активностью и признаком однолетности. Эти данные подтвердили причинную связь между ВνΡΚΚ7 и независимым от яровизации цветением у сахарной свеклы.

Пример 3. Трансгенная супрессия ВνΡΚΚ7 обусловливает устойчивость к стрелкованию.

Поскольку ВνΡΚΚ7 играет решающую роль в яровизационном ответе у сахарной свеклы, то ВνΡΚΚ7 является очевидным кандидатом для создания устойчивости к стрелкованию путем подавления яровизационного ответа. Для этой цели кДНК-фрагмент ВνΡΚΚ7 размером 0,6 т.п.н. (8ЕЦ ГО N0: 1) помещали в кассету для ΡΗΚί под контроль конститутивного промотора ИЫ3 АгаЫбор515 (№гп5 и др., 1993). Инвертированный повтор ВνΡΚΚ7-фрагмента отделяли вторым интроном от гена 8ГО81 картофеля (Еске5 и др., 1986; να^αη^γΐ и др., 1990) для стабилизации ΡΗΚί-кассеты, но также для повышения эффективности процесса ΡΗΚί (\Уапд и \Уа1ег1юи5е. 2001; 8ιηί11ι и др., 2000). Плазмидная карта бинарного вектора, несущего генную кассету для ΡΗΚί, предназначенную для ВνΡΚΚ7, и селектируемый маркерный ген ΡΜΙ, представлена на фиг. 10. ΡΗΚί-кассетой трансформировали двулетний генотип 0018 и осуществляли отбор позитивных по ΡΜΙ проростков согласно методу, описанному в предыдущем примере. ΡΜΙ-позитивные проростки и нетрансгенные контрольные проростки укореняли и переносили в теплицу для акклиматизации в течение минимум двух недель при 18°С до их обработки с целью яровизации. Согласно принятым методам трансгенные растения подвергали обработке с целью яровизации, которая предусматривает выдерживание в течение 14 дней при постоянной температуре 6°С и 12-часовой низкой искусственной освещенности. Перед воздействием индуцирующих стрелкование условий яровизированные растения медленно акклиматизировали в течение двух недель в климатических камерах путем ступенчатого повышения температуры с 10 до 18°С. Затем растения пересаживали в более крупные горшки (2 л) и осуществляли мониторинг стрелкования, выдерживая их при постоянной температуре 18°С и фотопериоде с длинным световым днем (17 ч света/7 ч темноты). У нетрансгенных контрольных растений, как правило, стрелкование начиналось в период между 4-6 неделями после яровизации. У трансгенных растений с подавленным геном ВνΡΚΚ7 часто наблюдалось замедление стрелкования на период, составляющий от всего лишь двух недель и вплоть до более чем 2 месяцев. В некоторых случаях в условиях, существующих в теплице, стрелкование вообще не происходило. За исключением замедления стрелкова- 50 028355 ния и цветения трансгенные растения развивались нормально и не имели фенотипических аномалий. В целом, для растений с замедленным стрелкованием характерно большее количество листьев в момент стрелкования в результате пролонгированной вегетативной стадии.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая ген сахарной свеклы ΒνΡКК7, которая включает нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8Е^ ГО N0: 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 53 или 54.
2. Растительный экспрессионный вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по п.1.

- 116 028355
3. Растительный экспрессионный вектор по п.2, который представляет собой экспрессионный вектор для РНК ΐ.
4. Клетка растения сахарной свеклы, содержащая молекулу нуклеиновой кислоты по п.1 или вектор по любому из пп.2 и 3.
5. Трансгенное растение сахарной свеклы, которое имеет фенотип замедленного стрелкования и содержит растительную клетку по п.3 или молекулу нуклеиновой кислоты по п.1.
6. Часть растения сахарной свеклы, выбранная из группы, включающей семена, зародыши, микроспоры, зиготы, протопласты, семяпочки, пыльцу, главные корни, семядоли, которые получают из трансгенного растения сахарной свеклы по п.5, где указанная часть растения сахарной свеклы включает клетки растения сахарной свеклы по п.4 или молекулу нуклеиновой кислоты по п.1.
7. Способ трансформации растений свеклы, отличающийся тем, что в клетки сахарной свеклы вводят молекулу нуклеиновой кислоты по п.1 или вектор по любому из пп.2 и 3.
8. Полинуклеотидный маркер, представляющий собой молекулу ДНК, созданный на основе нуклеотидных последовательностей, раскрытых в п.1, который позволяет различать генотипы, обеспечивающие проявление характерных для однолетнего и для двулетнего типа развития фенотипов растения сахарной свеклы, или различные гаплотипы в группах растений сахарной свеклы, обеспечивающие проявление характерных для двулетнего или однолетнего типа развития фенотипов, причем указанный маркер дополнительно содержит один однонуклеотидный полиморфизм (ЗNΡ) и способен обнаруживать один или несколько ЗNΡ8 в положениях, которые выбраны из группы, включающей положения № 224, 351, 615, 897, 1082, 1841, 1915, 2334, 11592, 12316, 12490 или 12544 в нуклеотидной последовательности ЗЕО ΙΌ N0: 8, причем указанные ЗОТ8 приведены в табл. 7-1 и 7-2.
9. Пара праймеров, состоящая из прямого праймера и обратного праймера, обладающих способностью к ренатурации с нуклеотидной последовательностью в области геномной ДНК свеклы, для которой характерно полностью совместное наследование с геном, обусловливающим стрелкование (ΒνΡΚΚ7), причем указанная последовательность является нуклеотидной последовательностью по п.1, и к амплификации полинуклеотидного маркера по п.8, где указанный полинуклеотидный маркер содержит один или несколько 8NΡ8, которые являются диагностическими для аллеля ΒνΡΚΚ7Β в локусе ΒνΡΚΚ7, и позволяет различать растения сахарной свеклы, которые имеют характерный для однолетнего и для двулетнего типа развития генотип.
10. Пара праймеров по п.9, выбранная из группы, включающей:

а) пару праймеров, которые обладают способностью к ренатурации с нуклеотидной последовательностью в 3-м интроне гена ΒνΡΡΚ7, представленной в ЗЕО ΙΌ N0: 6, и к амплификации фрагмента из указанной области, который содержит З№,

б) пару праймеров, которые обладают способностью к ренатурации с нуклеотидной последовательностью ЗЕО ΙΌ N0: 8, и к амплификации фрагмента из указанной последовательности, содержащего ЗNΡ, выбранный из ЗNΡ8, которые присутствуют в различных аллелях указанной последовательности и представлены в табл. 7-1 и 7-2.

11. Пара праймеров по п.9 или 10, содержащая:

а) прямой праймер ΡΚΚ7(Τ6)-Ε, представленный в ЗЕО ΙΌ N0: 49, и обратный праймер ΡΚΚ7(Τ6)-Κ, представленный в ЗЕО ΙΌ N0: 50, для амплификации фрагмента, содержащего З№ № 2334; или

б) прямой праймер ΡΚΚ7(Τ1)-Ε, представленный в ЗЕО ΙΌ N0: 13, и обратный праймер ΡΚΚ7(Τ1)-Κ, представленный в ЗЕО ΙΌ N0: 14, для амплификации фрагмента, содержащего З№ № 160.

Ес (1ΖΗ4_Α) 2 .[75].УЬЗ АКЗ.[3].ОК1ААЕОАСАВОУЬЗКРЕС1СЕЬ0А.[3]. 113 Βν (СУ301305: ) 1 ММ3 3Ηϋ.[3].ЬУЬКСЬЗКСАУОЕЕУКРТККМЕЕКМ.[3]. 37 Кр (Р21649) 58 . [78] .ΕΙΤ АНК.[1].ΗΑνΕΑΕΕΕΕΑΕϋΥΙΕΚΡΥΟΕΒΚΙΙΝ.[3]. 170 Вз (Р13800) 4 . [78] .1ЬЗ ΙΗϋ.[3].ΥνΤΗΑΕΚΤΟΑΡΟΥΕΕΚΕΜΟΑΟΤΕΙΕ.[3]. 118 Зс (004942) 2 . [75] .ЬЬТ ΑΡΝ. [3] . ϋνννθΕΕ5<3ΑΟΟΥννΚΡνθ<3ΚνΕΟΑ. [3] . 113 ЗР (Р25852) 6 .[76].ΙΜΤ ΑΕ3. [3] . ТАУЕАЕКАСАЕОУЫКРЬОЕОКЬОЕ. [3] . 118 Ра (000934) 4 .[76].ΜΙΤ ΑΥΟ. [3] .ΤΑΙΟΑΕΚΑΟΑΕϋΕΕΤΚΡνΟΕΟΚΕΚΕ. [3] . 116 ЗР (Р0АЕС4) 526 .[79].АЕТ ΑΝν.[2].ΟΚΟΕΥΕΝΑΟΜΟΟνΕΒΚΡΕΒνΡΑΕΤΑ.[3]. 64 0 ВЬ (Р26762) 973 .[81].ЬЕС.[1] . ТАЗ . [4 ] . ЕА0КСКААСМООСЬЕКР1СУОАЕК0. [3] . 1092 Кс (Р37740) 3 .[78].ЕЬТ СНА. [3] . ΙΑνΟΒΕΚΑΟΑΕΟΕνΕΚΡΕΝΟΝΗΐνΟ. [3] . 117