CN102057045A - 转基因糖用甜菜植物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及具有延迟抽苔的表型的转基因糖用甜菜植物。本发明进一步涉及多核苷酸，其在糖用甜菜基因组内与抽苔基因或B基因紧密连锁，而且可以用于区分一年生与二年生基因型或展现出二年生基因型的糖用甜菜植株的植物分组内的不同单元型。

Description

转基因糖用甜菜植物
一般而言，本发明涉及植物分子生物学、植物转化、和植物育种领域。更具体而言，本发明涉及具有延迟抽苔的表型的转基因糖用甜菜植物。本发明进一步涉及多核苷酸标志物，其在糖用甜菜基因组内与抽苔基因或B基因紧密连锁或驻留(residing)于抽苔基因或B基因内，而且可以用于区分一年生与二年生基因型或展现出二年生基因型的糖用甜菜植株的植物分组内的不同单元型(haplotypes)。
栽培的糖用甜菜(Beta vulgaris ssp.vulgaris L.)是一种二年生植物，其在第一年形成贮藏根和莲座叶。在一段时间的低温后开始枝条延长(抽苔)和花形成。比较而言，一年生甜菜(B.vulgaris ssp.maritime)属的许多野生甜菜显示一年生生长习性，这是由于B基因座处存在抽苔基因B，其位于染色体II的中央区。抽苔基因(B基因)负责决定糖用甜菜中的一年生习性。认为甜菜物种中的一年生是单基因的且显性的性状。与携带b等位基因的二年生植物相反，携带显性B等位基因的植物能够以不依赖于春化的方式自幼年期转变成生殖期，所述二年生植物强制性需要春化进行抽苔，随后发生开花。基因座B的显性等位基因在野生甜菜中是丰富的，而且在长日照下引起抽苔，无需对于携带隐性等位基因的二年生栽培种而言通常至关重要的冷(低温，cold)要求(Abe等，1997)。
抽苔(茎延长)(stem elongation)是营养性向生殖性生长转换中明显可见的第一步。
传统上，二年生栽培的糖用甜菜在春季种植并在秋季收获。然而，预期通过在秋季播种并在冬季里栽培来延长生长期本质上提高产率，而且会容许延长糖用甜菜加工活动，解决糖工业的一项需求。然而，在中部欧洲在冬季里栽培目前的糖用甜菜(即作为冬季作物)目前是不可能，这是因为春化(通过暴露于冬季期间的寒冷温度诱导的)会导致抽苔和产率损失。如此，高度想要开发非抽苔冬季甜菜，其中修饰春化响应以赋予冷诱导后对抽苔的抗性或抽苔的显著延迟。由于B基因在糖用甜菜的春化响应中发挥关键作用，它代表用于通过调控春化响应来工程化改造抽苔抗性的有希望的候选。
此外，在栽培的糖用甜菜中，抽苔是不想要的现象，因为它导致产率显著降低而且引起收获和提取糖期间的问题。糖用甜菜的商业性种子生产常常在生长有一年生杂生(weed)甜菜的地区进行，它们能在种子生产中引起花粉污染，导致商业性种子中有一年生植物。这是客户不能接受的。为了鉴定一年生植物的污染，在收获种子后立即在没有野生型一年生甜菜生长的地区种植各批次的商业性种子。不对植物春化，而且通过抽苔者的存在来鉴定污染。非常希望用基于标志物的筛选测定法来替代此测试，因为能更早地得到结果，这会导致种子加工中成本节约。
基于标志物的方法还能有利地用于糖用甜菜育种，例如用于加快育种过程，或用于引入来自野生海甜菜的新变异。由于B等位基因的不完全渗透(incomplete penetration)及其环境依赖性，还需要紧密连锁的分子标志物来筛选它在育种系中的存在。对于所有这些情况，重要的是要有与B基因紧密连锁的能够精确鉴定一年生植物或二年生植物的标志物。
出于上述原因，需要转基因手段来调控糖用甜菜的春化响应，而且还需要标志物辅助手段来在种子生产中和糖用甜菜育种中区分B基因的一年生和二年生等位基因。
本发明现在提供了解决上述需要的此类转基因手段以及标志物辅助手段。
发明概述
本发明涉及核酸序列，其与如下的核酸序列具有至少70％的序列同一性，所述核酸序列选自如SEQ ID NO：1、4、5、6、7、8、9、10、53或54之任一项中所列的核酸序列的组，涉及核酸序列，其包含如下核酸序列的至少15个连续核苷酸，所述核酸序列选自如SEQ ID NO：1、4、5、6、7、8、9、10、53或54之任一项中所列的核酸序列的组，涉及所述核酸序列；涉及所述一个(to said one)，或者涉及核酸序列，其在严格条件下与如下的核酸序列杂交，所述核酸序列选自如SEQ ID NO：1、4、5、6、7、8、9、10、53或54之任一项中所列的核酸序列的组。
在一个优选的实施方案中，上文所描述的本发明的核酸序列是分离的核酸。关于同源性，本发明应当同样地涵盖所有个别数值(它们落入以至少70％开始的范围中，如上文所提及的，即71％、72％、73％、74％、75％、...、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)。优选地，本发明的核酸序列的长度包含选自下组的核酸序列的至少15、20、25、30、35、40、45、或至少50个连续的核苷酸：如SEQ ID NO：1、4、5、6、7、8、9、10、53、或54之任一项中所列的核酸序列。要理解的是，术语“至少x个核苷酸”涵盖具有以x开始的任何数值及以上的核酸分子。例如，术语“至少15个核苷酸”意图涵盖具有15、16、17、18、19、20、和更多个核苷酸的核酸分子。在一个进一步优选的实施方案中，上文所描述的本发明的核酸序列在严格条件下，更优选地在高度严格条件下与选自下组的核酸序列杂交：如SEQ ID NO：1、4、5、6、7、8、9、10、53、或54之任一项中所列的核酸序列。
在此方面的一个别的实施方案中，核酸分子包含选自下组的核苷酸序列及其互补物：SEQ ID NO：1、4、5、6、7、8、9、10、53、或54。在另一个优选的实施方案中，上文所描述的本发明的核酸序列包含如SEQ ID NO：8中所描述的核酸序列，其中所述序列包含一处或多处核酸替代、缺失、或添加，如表7-1和表7-2中所显示的，其中表7-1和表7-2中显示的多态性分别代表SEQID NO：8中所描述的序列的18种一年生和2种二年生等位基因。表7-1和表7-2也显示为图10和图11。
依照另一方面，本发明进一步提供了由上文所描述的本发明的核酸序列编码的多肽。在一个优选的实施方案中，上文所描述的本发明的多肽具有选自下组的氨基酸序列：如SEQ ID NO：11或12中所描述的氨基酸序列。
本发明进一步涉及B基因特别地BvPRR7基因在用于生成显现出非抽苔表型的植物的转基因方法中的用途。具体地，本发明涉及包含表达盒的嵌合构建体，所述表达盒包含在调节元件控制下，优选地在植物中有功能的调节元件控制下的如上文所描述的本发明的核酸序列。
在本发明的一个实施方案中，如上文所描述的嵌合构建体可以进一步含有选择标志基因，其容许在选择方法(selection procedure)中区分经转化的和未转化的植物材料。
在一个实施方案中，本发明的嵌合构建体包含负选择标志，特别地编码对植物毒性化合物诸如抗生素或除草剂的抗性的选择标志。在另一个实施方案中，本发明的嵌合构建体包含正向选择标志，特别地编码给经转化的植物提供超过非转化植物的选择优势，特别地营养优势的酶的选择标志诸如例如磷酸甘露糖异构酶基因或木糖异构酶基因。
在一个优选的实施方案中，提供了本发明的嵌合构建体以转基因下调BvPRR7基因表达，特别地经由反义或RNAi办法来进行。在此上下文中，术语“下调”或“抑制”想要指与相同条件下非转化的植物中的基因表达相比BvPPR7基因的表达水平的任何降低。这包括基因“沉默”，使得可以检测不到基因表达。在另一个优选的实施方案中，用于转基因下调BvPRR7基因表达的本发明的嵌合构建体包含编码dsRNA的核酸分子，所述dsRNA能够靶向通过转录编码B基因蛋白，优选地BvPRR7蛋白的DNA序列生成的mRNA以进行降解。在另一个优选的实施方案中，上文所描述的本发明的嵌合构建体包含编码所述dsRNA的核酸分子，其中所述核酸分子具有至少21个核苷酸的长度，而且与所述BvPRR7基因的编码序列的至少一部分基本上相同。BvPRR7基因的所述编码序列优选是上文所描述的本发明的核酸序列。更优选地，BvPRR7基因的所述编码序列是具有本发明中如列为SEQ ID NO：1、4、5、6、9、10、53、或54的序列的核酸分子。“基本上相同的”指能够在严格条件下彼此杂交的两种核酸分子。一般地，在dsRNA的整个长度里不要求dsRNA与BvPRR7基因的编码序列或其部分之间的同一性或同源性。足够的是如果至少21个核苷酸的区段具有同一性，但是优选地，选择编码在超过21个核苷酸的区段里与靶RNA分子具有同源性的dsRNA的核酸序列。优选地，上文所描述的本发明的嵌合构建体包含编码dsRNA且具有超过21个核苷酸，更优选超过50、100、250、500、600、750、1000或更多个核苷酸的长度的核酸分子。
在一个优选的实施方案中，编码本发明嵌合构建体中包含的dsRNA的核酸分子具有在组成型启动子，优选地来自拟南芥的Ubi3启动子的控制下的如SEQ ID NO：1中所描述的核苷酸序列。在另一个实施方案中，本发明的嵌合构建体进一步包含来自马铃薯StLS1基因的第二内含子的序列(Eckes等，1986；Vancanneyt等，1990)。在一个优选的实施方案中，本发明的嵌合构建体包含靶向BvPRR7的反向重复，其由如SEQ ID NO：1中所描述的核苷酸序列组成，以由来自马铃薯的StLS1基因第二内含子分开的反义和有义两种取向克隆在Ubi3启动子(Norris等，1993)与Nos终止子之间。
在本发明的一个实施方案中，提供了转化载体和/或表达载体，特别地植物转化载体和/或表达载体，其包含如上文所描述的本发明的嵌合构建体。在一个别的实施方案中，植物表达载体是RNAi表达载体，其包含上文所描述的本发明的嵌合构建体。在一个更优选的实施方案中，RNAi表达载体包含图11中所显示的本发明的嵌合构建体。
在本发明的一个别的方面，提供了一种植物细胞，其包含依照本发明的和如上文所描述的嵌合构建体或载体分子(例如转化载体或表达载体)。在一个优选的实施方案中，所述包含本发明的嵌合构建体或载体分子的植物细胞是糖用甜菜植物的植物细胞。
进一步提供了具有延迟抽苔的表型的转基因植物特别地糖用甜菜植物或其细胞、组织或种子，各包含本发明的植物细胞和/或依照本发明的嵌合构建体和/或如上文所描述的本发明的的核酸序列，其中所述转基因植物表达所述dsRNA，从而延迟特别地抑制抽苔，并且所述植物展现出延迟抽苔的表型优选地非抽苔表型。“抽苔的延迟”应当理解为调控糖用甜菜植物的天然抽苔反应。在抽苔期间，植物春化(即暴露于冷温度)后作为第一步并且在从营养性转变成生殖性生长过程中茎伸长，最终导致花形成。抽苔反应的延迟想要指与正常的植物相比较晚开始的茎伸长；那些植物展现出延迟抽苔的表型。抽苔反应可以延迟几天(即5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天)和多至数周(即2、3、4周)或数月(即1、2、3、5、或6个月)。在一个优选的实施方案中，完全抑制抽苔响应；此类植物在春化后未开始抽苔，而且展现出非抽苔表型。在一个进一步优选的实施方案中，本发明提供了转基因植物特别地糖用甜菜植物，其是自本发明的和上文所描述的细胞、组织或种子生成的。
在另一方面，本发明提供了一种用于生成杂种种子的方法，可以自所述杂种种子种植具有受调控的抽苔的表型的植物特别地糖用甜菜植物。优选地，所述方法：(a)提供具有受调控的抽苔的表型的植物系特别地糖用甜菜系特别地本发明的和如上文所描述的转基因糖用甜菜植物作为第一亲本系，(b)提供具有不同基因型的第二植物系，特别是糖用甜菜系作为第二亲本系；其中步骤a)或步骤b)的所述亲本系之一是雄性不育CMS系，且其中另一亲本系是雄性能育，并(c)容许所述雄性能育亲本系的植物传粉给第二雄性不育亲本系的花，让所述种子形成，并收获所述杂种种子；其中收获的杂种种子是具有延迟抽苔的表型的杂种植物特别地糖用甜菜杂种植物的种子。在一个优选的实施方案中，两种亲本系都是糖用甜菜植物系，其中至少一种糖用甜菜亲本系是本发明的转基因糖用甜菜系。至少一种具有受调控的抽苔的表型的糖用甜菜亲本系也可以优选是没有任何转基因的植物，然后其通过遗传操作的其它方法获得，如下文所描述的。在此方面的一个实施方案中，步骤(a)中提供的糖用甜菜亲本系是雄性不育CMS近交糖用甜菜系，其包含一种或多种本发明的核酸序列或其片段，而步骤(b)中提供的第二糖亲本系是雄性能育近交糖用甜菜系。在另一个优选的实施方案中，步骤(a)中提供的糖用甜菜亲本系是雄性能育糖用甜菜植物，其包含一种或多种本发明的核酸序列或其片段，而步骤(b)中提供的第二糖亲本系是雄性不育CMS近交糖用甜菜系。
本发明的别的方面涉及展现出延迟抽苔的表型的植物特别地糖用甜菜植物的杂种种子。在本发明的又一方面，所述杂种种子是通过本发明的和如上文所描述的方法生成的。在一个进一步优选的实施方案中，具有延迟抽苔的表型的杂种植物特别地杂种糖用甜菜植物是通过种植上文所描述的本发明的杂种种子生成的。本发明的进一步优选的实施方案涉及选自下组的植物部分：种子、胚、小孢子、合子、原生质体、细胞、胚珠、花粉、直根、子叶、提取物或生物学样品，它们衍生自本发明的转基因糖用甜菜植物(taproots)或其种子或者衍生自本发明的杂种植物或其种子，如上文所描述的。
本发明的另一方面涉及本发明的核酸序列或其片段用于转化植物细胞特别地糖用甜菜植物细胞的用途。用本发明的核酸序列或其片段转化植物细胞特别地糖用甜菜植物细胞的目的是调控植物的抽苔习性，如上文所描述的。此方面的另一个实施方案涉及转化植物细胞特别地糖用甜菜植物细胞的方法，其中该方法包括使用本发明的核酸序列或本发明的嵌合构建体或本发明的和如上文所描述的载体。
在另一方面，本发明提供了本发明的转基因植物、本发明的杂种植物、或本发明的和如上文所描述的植物部分在选自下组的方法中的用途：糖生产的方法、需氧发酵的方法和厌氧发酵的方法。优选地，在生产糖的方法中使用本发明的转基因植物、本发明的杂种植物、或本发明的和如上文所描述的植物部分。另一方面涉及一种用于生产糖的方法，其中加工本发明的和如上文所描述的糖用甜菜植物、或其细胞或组织以生产糖。本发明进一步提供了自本发明的和如上文所描述的糖用甜菜植物、或其细胞或组织生产的糖。
在别的方面，本发明涉及基于核酸序列开发的多核苷酸标志物，所述核酸序列可获自糖用甜菜中显示与抽苔基因(B基因)相关表型完美共分离的基因组DNA区，且其中所述标志物容许区分一年生与二年生基因型或展现出二年生或一年生表型的糖用甜菜植物的植物分组内的不同单元型。在一个优选的实施方案中，本发明的多核苷酸标志物具有可获自本发明的和如上文所描述的一种或多种核酸序列的核酸序列。在一个实施方案中，本发明的多核苷酸标志物进一步包含一个或多个多态性，特别是基于SNP、SSR、或至少一个核苷酸的缺失或插入的多态性，但是特别是基于SNP的多态性，该多态性诊断B基因座处的B等位基因。优选地，所述多核苷酸标志物能够检测本文中列为SEQ ID NO：8的所述基因组序列的不同等位基因中存在的和表7-1(图10中进一步描绘的)和表7-2(图10中进一步描绘的)中所显示的多种SNP的至少一种，其中所述多核苷酸标志物能够区分不同等位基因，特别地区分一年生和二年生糖用甜菜系。在一个优选的实施方案中，本发明的多核苷酸标志物能够检测至少一种选自下组的SNP，该组包括列为SEQ ID NO：8的序列的位置#224、#351、#615、#897、#1082、#1841、#1915、#2334、#11592、#12316、#12490、或#12544处的和如表7-1(图10中进一步描绘的)和表7-2(图11中进一步描绘的)中所显示的SNP。本发明的别的方面涉及一组多核苷酸标志物，其包含本发明的和上文所描述的众多多核苷酸标志物。在此上下文中，术语“众多”指一组超过一个的多核苷酸标志物，其优选地由两种、三种或更多种标志物组成。
本发明的另一方面涉及引物对，其由正向引物和反向引物组成，所述引物能够与糖用甜菜基因组DNA中显示与抽苔基因(B基因)完美共分离的基因组区域内的核苷酸序列退火。在一个优选的实施方案中，本发明的引物对与本发明的和如上文所描述的核酸序列退火，并扩增本发明的多核苷酸，优选多核苷酸标志物，或其信息部分，其中所述多核苷酸包含一个或多个多态性，特别地一处或多处诊断B基因座处的B等位基因且容许区分一年生和二年生基因型的多态性。在一个优选的实施方案中，本发明的引物对选自下组：(a)与BvPPR7的第三内含子内如SEQ ID NO：6中所描述的核苷酸序列退火的引物对，其自包含多态性特别地包含位置#87处的C/T SNP和/或位置#160处的C/T SNP和/或位置#406处的A/G SNP的多态性的所述区域扩增信息片段；或(b)引物对，其与列为SEQ ID NO：8的核酸序列退火，并自包含多态性的所述序列扩增信息片段，所述多态性选自基于所述序列的不同等位基因中存在的SNP的多态性，如表7-1(图10中进一步描绘的)和表7-2(图11中进一步描绘的)中所显示的。在一个进一步优选的实施方案中，本发明的引物对包含：(a)如SEQ ID NO：49中所描述的正向引物PRR7(T6)-F和如SEQ ID NO：50中所描述的反向引物PRR7(T6)-R，用于扩增包含SNP#2334的片段；或(b)如SEQID NO：13中所描述的正向引物PRR7(T1)-F和如SEQ ID NO：14中所描述的反向引物PRR7(T1)-R，用于扩增包含SNP#160的片段；或(c)用于扩增片段的如SEQ ID NO：55中所描述的正向引物1r22(T1)-F和如SEQ ID NO：56中所描述的反向引物1r22(T1)-R和如SEQ ID NO：57中所描述的探针分子1r22(T1)-VIC，作为用作为第一荧光染料的VIC标记的第一探针分子，和如SEQ ID NO：58中所描述的探针分子1r22(T1)-FAM，作为用作为第二荧光染料的FAM标记的第二探针分子。
在一个实施方案中，本发明涉及一种或多种探针分子和/或涉及一种或多种引物，特别地一种或多种引物对，但是特别地一种或多种由正向引物和反向引物组成的引物对，所述引物能够与可获自糖用甜菜中显示与抽苔基因(B基因)有关的表型完美共分离的基因组DNA区域的核酸序列退火，且其中所述标志物容许区分一年生与二年生基因型或展现出二年生或一年生基因型的糖用甜菜植物的植物分组内的不同单元型。
在一个实施方案中，本发明涉及一组探针多核苷酸，其包含与包含多态性位点的依照本发明的和如上文中所描述的信息多核苷酸片段内的亚区互补的至少两种不同探针分子，并扩增在交叠的区域中仅相差一个或两个碱基错配的部分交叠片段，其中第一探针，特别地用第一荧光染料，更特别用第一荧光染料和猝灭剂标记的探针代表一种等位基因，而第二探针，特别地用第二荧光染料(其与第一染料不相同)，更特别地用第二荧光染料和猝灭剂标记的探针代表另一等位基因。
可以在用于鉴定糖用甜菜植物中与一年生(annuality)有关的等位基因的缺失或存在的等位区分测定法中使用本发明的上述多核苷酸标志物、本发明的一组多核苷酸标志物或本发明的引物对。
在本发明的另一方面，提供了用于鉴定糖用甜菜植物中与一年生有关的等位基因的缺失或存在的等位区分测定法，其容许区分一年生和二年生植物。在一个优选的实施方案中，在此测定法中使用本发明的多核苷酸标志物、本发明的一组多核苷酸标志物、或本发明的引物对。
在一个进一步优选的实施方案中，本发明的等位区分测定法包括下列步骤：(a)自要分析的糖用甜菜植物获得基因组DNA的样品，(b)使用本发明的引物对自所述样品或基因组DNA扩增片段，并(c)比较所扩增的片段与已知与二年生表型有关但与一年生表型无关的等位序列。在此测定法中，比较步骤(c)的扩增片段的序列与已知与二年生表型有关的等位基因的序列。若序列与二年生等位基因的序列不同，则这指明一年生等位基因(即一年生植物)的存在。在另一个优选的实施方案中，用包含对一年生等位基因特异性的序列的经第一荧光标记的探针分子探查本发明等位区分测定法的步骤c)中获得的扩增片段。若第一探针的染料荧光在反应过程中升高，则这指明一年生等位基因的存在。
在一个优选的实施方案中，本发明的测定法采用(a)用于扩增包含SNP#2334的片段的如SEQ ID NO：49中所描述的正向引物PRR7(T6)-F和如SEQID NO：50中所描述的反向引物PRR7(T6)-R和如SEQ ID NO：51中所描述的探针分子PRR7(T6)-VIC作为用作为第一荧光染料的VIC标记的第一探针分子和如SEQ ID NO：52中所描述的探针分子PRR7(T6)-FAM作为用作为第二荧光染料的FAM标记的第二探针分子；或(b)用于扩增包含SNP#160的片段的如SEQ ID NO：13中所描述的正向引物PRR7(T1)-F和如SEQ ID NO：14中所描述的反向引物PRR7(T1)-R和如SEQ ID NO：15中所描述的探针分子PRR7(T1)-VIC作为用作为第一荧光染料的VIC标记的第一探针分子和如SEQ ID NO：16中所描述的探针分子PRR7(T1)-FAM作为用作为第二荧光染料的FAM标记的第二探针分子；或(c)用于扩增片段的如SEQ ID NO：55中所描述的正向引物1r22(T1)-F和如SEQ ID NO：56中所描述的反向引物1r22(T1)-R和如SEQ ID NO：57中所描述的探针分子1r22(T1)-VIC作为用作为第一荧光染料的VIC标记的第一探针分子和如SEQ ID NO：58中所描述的探针分子1r22(T1)-FAM作为用作为第二荧光染料的FAM标记的第二探针分子。
在一个实施方案中，本发明涉及一种在商业种子中鉴定一年生污染物的方法，其使用依照本发明的和如上文所描述的基于标志物的等位区分测定法来进行。
附图简述
附图
图1：不同物种间的REC域和糖用甜菜EST CV301305的推定REC域的氨基酸序列比较。相同的氨基酸以黑色标示；保守的氨基酸以灰色标示；弱相似的氨基酸以浅灰色标示；而不相似的氨基酸以白色标示。Bb，支气管炎博德特氏菌(Bordetella bronchiseptica)；Bs，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)；Bv，甜菜(Beta vulgaris)；Ec，大肠埃希氏菌/大肠杆菌(Escherichia coli)；Kp，肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)；Pa，铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)；Rc，荚膜红细菌(Rhodobacter capsulatus)；Sc，天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)；Sf，弗氏志贺氏菌(Shigella flexneri)；St，鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)。
图2：拟南芥PRR7蛋白质与来自糖用甜菜EST CV301305的预测部分蛋白质的氨基酸序列比较。相同的氨基酸以黑色标示；相似的氨基酸以灰色标示；而不相似的氨基酸以白色标示。
图3：拟南芥PRR7基因与糖用甜菜EST CV301305之间的基因组和mRNA序列的序列比对。拟南芥与甜菜之间保守的核苷酸以灰色标示。内含子以长划串代表。
图4：糖用甜菜染色体II的遗传学图。染色体右边给出了标志物名称，左边标示了累积遗传距离。
图5：BvPRR7基因的基因结构的示意图，显示了推定的外显子和内含子。由EST CV301305覆盖的区域以黑色箭头显示了。
图6：拟南芥PRR基因家族成员和BvPRR7蛋白质的氨基酸序列比较。相同的氨基酸以黑色标示；保守的氨基酸以灰色标示；弱相似的氨基酸以浅灰色标示；而不相似的氨基酸以白色标示。
图7：BvPRR7与来自其它开花植物的相关蛋白质之间的系统发生关系，其通过使用Neighbor-Joining方法(Saitou和Nei，1987)基于对来自数种植物物种的PRR基因家族中的多种成员(包括来自糖用甜菜、拟南芥(Arabidopsisthaliana)(TOC1，NP_200946；PRR3，NP_568919；PRR5，NP_568446；PRR7，NP_568107；和PRR9，NP_566085)、稻(Oryza sativa)(PRR37，Q0D3B6)、大麦(Hordeum vulgare)(PPD-H1，AAY17586)和普通小麦(Triticum aestivum)(PPD-D1，ABL09477)的PRR7同系物)的系统发生分析得到。采用自1000个复制品推导出的自展共有树来代表所分析的分类单位的进化史(Felsenstein，1985)。折叠与在少于50％的自展复制品中再现的分区对应的分支。在分支的后面显示了复制树(replicate tree)的百分比，其中相关的分类单位在自展(bootstrap)测试(1000个复制品)中簇集到一起。该树是按比例绘制的，分支长度的单位与用于推导系统发生树的进化距离的相同。进化距离是使用Poisson矫正法(Zuckerkandl和Pauling，1965)计算的，单位为每个位点的氨基酸替代数目。自数据集消除所有含有缺口和缺失数据的位置(完全缺失选项)。最终的数据集中有总共352个位置。
图8：一年生和二年生糖用甜菜植物中BvPRR7的昼夜表达样式。贯穿24小时的期间每2小时收获叶组织。白色和深灰色背景分别表示光照期和黑暗期。所显示的数据是来自三份独立生物学样品的均值数值。数值表示为通过几何学平均分析(Vandesompele等，2002)相对于BvICDH参照基因标准化的相对表达水平。误差棒±SD。ZT，授时因子(zeitgeber)时间。
图9：一组一年生和二年生植物个体之间的等位区分分析的端点读取。Y和X轴上的数值分别表示FAM染料和VIC染料的荧光水平。VIC染料荧光(X轴)的本质升高仅指明二年生等位基因(在此图中称为等位基因X)的纯合性。FAM染料荧光的本质(substantial)升高仅指明一年生等位基因((在此图中称为等位基因Y)的纯合性。两种荧光信号的本质升高指明杂合性，即具有B基因座杂合性的一年生植物。
图10：用于借助RNAi来转基因抑制BvPRR7的二元载体的质粒图。BvPRR7的反向重复由0.6kb cDNA片段组成，以由来自马铃薯的StLS1基因第二内含子(Eckes等，1986；Vancanneyt等，1990)分开的反义和有义两种取向克隆在Ubi3启动子(Norris等，1993)与Nos终止子之间。选择标志由在HSP80启动子(Brunke和Wilson，1993)控制下的PMI基因组成。
图11：显示在比较BvPRR7的18种一年生和2种二年生等位基因时BvPRR7的启动子区域中鉴定的多态性的表；依照SEQ ID NO：8编号表中所标示的SNP位置。
图12：显示在比较BvPRR7的18种一年生和2种二年生等位基因时BvPRR7的编码区中鉴定的多态性的表；依照SEQ ID NO：8编号表中所标示的SNP位置。
序列
SEQ ID NO：1描述了糖用甜菜EST CV301305的核苷酸序列
SEQ ID NO：2描述了正向引物PRR7-F的核苷酸序列
SEQ ID NO：3描述了反向引物PRR7-R的核苷酸序列
SEQ ID NO：4描述了BvPRR7等位变体2(单元型#2)的内含子3的核苷酸序列
SEQ ID NO：5描述了BvPRR7等位变体1(单元型#1)的内含子3的核苷酸序列
SEQ ID NO：6描述了BvPRR7内含子3的核苷酸序列及其用于定位的等位变异性
SEQ ID NO：7描述了BvPRR7的二年生等位基因的基因组核苷酸序列
SEQ ID NO：8描述了包括启动子和终止子区域的BvPRR7的基因组核苷酸序列的核苷酸序列。
SEQ ID NO：9描述了BvPRR7的二年生等位基因的编码区的核苷酸序列
SEQ ID NO：10描述了BvPRR7的一年生等位基因的编码区的核苷酸序列
SEQ ID NO：11描述了BvPRR7的二年生等位基因的推定的氨基酸序列
SEQ ID NO：12描述了BvPRR7的一年生等位基因的推定的氨基酸序列
SEQ ID NO：13描述了引物PRR7(T1)-F的核苷酸序列
SEQ ID NO：14描述了引物PRR7(T1)-R的核苷酸序列
SEQ ID NO：15描述了探针PRR7(T1)-VIC的核苷酸序列
SEQ ID NO：16描述了探针PRR7(T1)-FAM的核苷酸序列
SEQ ID NO：17描述了引物GJ131(T1)-F的核苷酸序列
SEQ ID NO：18描述了引物GJ131(T1)-R的核苷酸序列
SEQ ID NO：19描述了探针GJ131(T1)-VIC的核苷酸序列
SEQ ID NO：20描述了探针GJ131(T1)-FAM的核苷酸序列
SEQ ID NO：21描述了引物ED031700(T1)-F的核苷酸序列
SEQ ID NO：22描述了引物ED031700(T1)-R的核苷酸序列
SEQ ID NO：23描述了探针ED031700(T1)-VIC的核苷酸序列
SEQ ID NO：24描述了探针ED031700(T1)-FAM的核苷酸序列
SEQ ID NO：25描述了引物9_27(T2)-F的核苷酸序列
SEQ ID NO：26描述了引物9_27(T2)-R的核苷酸序列
SEQ ID NO：27描述了探针9_27(T2)-VIC的核苷酸序列
SEQ ID NO：28描述了探针9_27(T2)-FAM的核苷酸序列
SEQ ID NO：29描述了引物GJ01(T1)-F的核苷酸序列
SEQ ID NO：30描述了引物GJ01(T1)-R的核苷酸序列
SEQ ID NO：31描述了探针GJ01(T1)-VIC的核苷酸序列
SEQ ID NO：32描述了探针GJ01(T1)-FAM的核苷酸序列
SEQ ID NO：33描述了引物SELA3977的核苷酸序列
SEQ ID NO：34描述了引物SELA3988的核苷酸序列
SEQ ID NO：35描述了引物SELA4442的核苷酸序列
SEQ ID NO：36描述了引物SELA3809的核苷酸序列
SEQ ID NO：37描述了引物SELA3810的核苷酸序列
SEQ ID NO：38描述了引物SELA3807的核苷酸序列
SEQ ID NO：39描述了引物SELA3766的核苷酸序列
SEQ ID NO：40描述了引物SELA3769的核苷酸序列
SEQ ID NO：41描述了引物SELA3857的核苷酸序列
SEQ ID NO：42描述了引物SELA3860的核苷酸序列
SEQ ID NO：43描述了引物SELA3861的核苷酸序列
SEQ ID NO：44描述了引物SELA3864的核苷酸序列
SEQ ID NO：45描述了用于基因表达分析的正向引物BvPRR7的核苷酸序列
SEQ ID NO：46描述了用于基因表达分析的反向引物BvPRR7的核苷酸序列
SEQ ID NO：47描述了用于基因表达分析的正向引物BvICDH的核苷酸序列
SEQ ID NO：48描述了用于基因表达分析的反向引物BvICDH的核苷酸序列
SEQ ID NO：49描述了引物PRR7(T6)-F的核苷酸序列
SEQ ID NO：50描述了引物PRR7(T6)-R的核苷酸序列
SEQ ID NO：51描述了探针PRR7(T6)-VIC的核苷酸序列
SEQ ID NO：52描述了探针PRR7(T6)-FAM的核苷酸序列
SEQ ID NO：53描述了一年生PRR7等位基因中在其启动子区下游约1，3kb的编码区的核苷酸序列
SEQ ID NO：54描述了BvPRR7的一年生等位基因的编码区的核苷酸序列，所述BvPRR7包含约1，3kb的其启动子区和约0.7kb的其终止子区域
SEQ ID NO：55描述了引物1r22(T1)-F的核苷酸序列
SEQ ID NO：56描述了引物1r22(T1)-R的核苷酸序列
SEQ ID NO：57描述了探针1r22(T1)-VIC的核苷酸序列
SEQ ID NO：58描述了探针1r22(T1)-FAM的核苷酸序列
定义
如果本文中下文没有另外指明，一般给予本申请范围内使用的技术术语和表述以植物分子生物学有关领域中通常应用于它们的含义。
如本说明书和所附权利要求书中所使用的，单数形式“一个”、“一种”、和“所述”、“该”包括复数称谓，除非上下文另外明确指明。如此，例如，提到“一株/种植物”包括一或多株/种植物，而提到“一个/种细胞”包括细胞、组织、等等的混合物。
“糖用甜菜”指甜菜(Beta)属内的所有种和亚种，以及甜菜的所有种类栽培甜菜。已经将栽培的甜菜分成四组：叶甜菜(leaf beet)、菜用甜菜(gardenbeet)、饲料甜菜(fodder beet)和糖用甜菜(sugar beet)。“糖用甜菜”也指所有栽培甜菜，包括那些为制糖以外的目的(诸如乙醇、塑料或工业产品)而种植的。具体而言，“糖用甜菜”指饲料甜菜和糖用甜菜，但是尤其指糖用甜菜。此术语还包括适合于在热带或亚热带地区生长的糖用甜菜植物。
“一年生糖用甜菜系”指以杂合或纯合状态在B基因座处含有显性等位基因B的糖用甜菜植物。
“二年生糖用甜菜系”指以纯合状态在B基因座处含有隐性等位基因b的糖用甜菜植物。
“抽苔”指自营养性莲座阶段向花序或生殖性生长阶段的转换。
如本文中所使用的，“延迟的抽苔”或“抽苔的延迟”必须理解为调控糖用甜菜植物的天然抽苔反应。在具有延迟的抽苔的植物中，作为抽苔的第一可见步骤的茎伸长比在正常植物中开始得晚。抽苔反应可以延迟仅几天(即，例如5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天)和多至数周(即2、3、4周)或数月(即1、2、3、5、或6个月)。抽苔的延迟还可以导致对抽苔响应的完全抑制；此类植物在春化后不抽苔，而且展现出非抽苔表型。
如本文中所使用的，“B基因”指负责决定糖用甜菜中的一年生习性(早期抽苔)的基因。携带显性等位基因B的植物能够以不依赖于春化的方式自幼年期转变成生殖期，即在没有先前暴露于冷温度的情况中进行枝条伸长，接着开花。
“春化”指有些植物中将植物暴露于冷一段时间促进成花诱导的过程。
“等位基因”在本发明范围内理解为指与不同形式的基因或任何种类的可鉴定遗传元件有关的各种遗传单元的交替形式，因为它们位于同源染色体中的相同基因座，所以它们在遗传方面是交替的。在二倍体细胞和生物体中，给定基因(或标志物)的两个等位基因通常占据一对同源染色体的对应基因座。
如本文中所使用的，术语“单元型”指个体自一个亲本遗传的一组等位基因。如此，二倍体个体具有两份单元型。术语“单元型”可以以更有限的意义使用，指与表型性状(诸如本发明的上下文中的糖用甜菜植物的一年生或二年生抽苔习性)有关的物理上连锁的和/或不连锁的遗传标志物(例如序列多态性)。关于B基因，此基因的单元型还直接赋予表型。例如，糖用甜菜的一年生生长习性是由染色体II上基因座B的显性等位基因的存在引起的。
“基因座”在本发明范围内理解为指染色体上包含基因或任何其它促成性状的遗传元件或因子的区域。
如本文中所使用的，短语“遗传标志物”指与一个或多个感兴趣基因座有关的个体基因组特征(例如存在于个体基因组中的核苷酸或多核苷酸序列)。在一些实施方案中，遗传标志物在感兴趣群体和由多态性占据的基因座中是多态性的，这取决于上下文。遗传标志物包括例如单核苷酸多态性(SNP)、插入/缺失、简单序列重复(SSR)、限制性片段长度多态性(RFLP)、随机扩增多态性DNA(RAPD)、切割扩增多态性序列(CAPS)标志物、多样性阵列技术(DArT)标志物、和扩增片段长度多态性(AFLP)、等许多其它例子。遗传标志物可以用于例如在染色体上定位含有促成表型性状表达变应性的等位基因的遗传基因座。短语“遗传标志物”还可以指与基因组序列互补的多核苷酸序列，诸如用作探针的核酸序列。
遗传标志物可以在物理上位于染色体上与它相关的遗传基因座之内或之外的位置中(即分别是基因内的或基因外的)。换言之，虽然当与感兴趣基因座对应的基因在染色体上的位置尚未鉴定且遗传标志物和感兴趣基因座之间的重组率非零时通常采用遗传标志物，但是当前公开的主题也可以采用在物理上在遗传基因座边界内的遗传标志物(例如在与基因对应的基因组序列之内，诸如但不限于基因内含子或外显子内的多态性)。在当前公开的主题的一些实施方案中，一种或多种遗传标志物包含1-10种标志物，而在一些实施方案中，一种或多种遗传标志物包含超过10种遗传标志物。
如本文中所使用的，短语“表型性状”指个体源自其基因组与环境相互作用的外观或其它可检测特征。
“表型”在本发明范围内理解为指遗传控制性状的可区分特征。
如本文中所使用的，术语“紧密连锁的”或“遗传上紧密连锁的”在糖用甜菜基因组中与B基因连锁的基因组区域的上下文中理解为指所述基因组区域和B基因在遗传力上紧密联合，这是由于同一染色体上接近的两者的位置，其通过基因座之间的百分比重组(厘摩，cM)来测量。如本文中所使用的，术语“连锁”及其语法变型指同一染色体上不同基因座处的等位基因一起分离(共分离)的趋势比在它们的传递是独立的情况中偶然会预期的趋势更频繁。
如本文中所使用的，短语“信息片段”指具有可回收的且能帮助测定和/或表征感兴趣遗传基因座的信息内容的多核苷酸片段。此信息内容可以由与所述感兴趣基因座有关的多态性来代表，诸如例如单核苷酸多态性(SNP)、插入/缺失、简单序列重复(SSR)、限制性片段长度多态性(RFLP)、随机扩增多态性DNA(RAPD)、切割扩增多态性序列(CAPS)标志物、多样性阵列技术(DArT)标志物、和扩增片段长度多态性(AFLP)、等许多其它例子，而且可用于开发遗传标志物。此类“信息片段”的信息内容也可以由能通过相应探针分子来检测的特定序列来代表。此类信息片段可以是引物或标志物或其部分。此类片段具有至少10个核苷酸，优选至少15、20、25、30、50、或100个核苷酸的长度。
“基于标志物的选择”在本发明范围内理解为指使用遗传标志物来检测一种或多种来自植物的核酸，其中所述核酸与期望性状有关以鉴定携带关于期望(或不期望)性状的基因的植物，使得那些植物可用于(或避免用于)选择性育种程序。
“PCR(聚合酶链式反应)”在本发明范围内理解为指生成相对较大量的DNA特定区域的方法，由此使得各种基于那些区域的分析成为可能。
“PCR引物”或“引物”在本发明范围内理解为指特定DNA区域的PCR扩增中使用的分离的单链DNA的短片段。通过核酸杂交将它们与互补的靶DNA链退火以形成引物与靶DNA链之间的杂合物，然后通过聚合酶诸如DNA聚合酶沿着靶DNA链延伸。可以使用引物对或组来扩增核酸分子，例如通过聚合酶链式反应(PCR)或其它常规的核酸扩增方法来进行。引物一般长10-15个核苷酸或更多。引物还可以长至少20个核苷酸或更多，或至少25个核苷酸或更多，或长至少30个核苷酸或更多。此类引物在高严格杂交条件下与靶序列特异性杂交。依照本发明的引物可以具有与靶序列的完全序列互补性。要理解的是，本发明引物的长度可以是本文中规定的数值之间的任何数值。如此，一般长10-15个核苷酸或更多的引物涵盖具有10、11、12、13、14、或15个核苷酸的长度的引物，而表述“至少20个核苷酸”进一步包括具有16、17、18、19或更多个核苷酸的长度的引物。其适用于表述“至少25个核苷酸或更多”和“长至少30个核苷酸或更多”。
如本文中所使用的，术语“扩增的”意指使用至少一种核酸分子作为模板构建多拷贝的核酸分子或与核酸分子互补的多拷贝。扩增系统包括聚合酶链式反应(PCR)系统、连接酶链式反应(LCR)系统、基于核酸序列的扩增(NASBA，Cangene，Mississauga，Ontario)、Q-β复制酶系统、基于转录的扩增系统(TAS)、和链置换扩增(SDA)。参见例如Diagnostic Molecular Microbiology：Principles and Applications，D.H.Persing等编，American Society forMicrobiology，Washington，D.C.(1993)。扩增产物称作扩增子。
“探针”是附着有常规的可检测标记物或报告分子诸如放射性同位素、配体、化学发光剂、荧光标记物或酶的分离的核酸。此类探针与靶核酸的链互补。依照本发明的探针不仅包括脱氧核糖核酸或核糖核酸，而且还包括聚酰胺和其它探针材料，它们特异性结合靶DNA序列，而且可以用于检测所述靶DNA序列的存在。
引物和探针一般长10-15个核苷酸或更多。引物和探针也可以长至少20个核苷酸或更多，或至少25个核苷酸或更多，或长至少30个核苷酸或更多。此类引物和探针在高严格杂交条件下与靶序列特异性杂交。依照本发明的引物和探针可以具有与靶序列的完全序列互补性，虽然可以通过常规的方法来设计与靶序列不同且保留与靶序列杂交的能力的探针。要理解的是，本发明引物和探针的长度可以是本文中规定的数值之间的任何数值。如此，一般长10-15个核苷酸或更多的引物和探针涵盖具有10、11、12、13、14、或15个核苷酸的长度的引物和探针，而表述“至少20个核苷酸”进一步包括具有16、17、18、19或更多个核苷酸的长度的引物和探针。其适用于表述“至少25个核苷酸或更多”和“长至少30个核苷酸或更多”。
“多态性”在本发明范围内理解为指群体中存在两种或更多种形式的基因、遗传标志物、或遗传性状。
“单核苷酸多态性”或“SNP”在本发明的范围内理解为指在基因组中的单个核苷酸(或其它共享的序列)在物种的成员间或个体中配对的染色体间有所不同时发生的DNA序列变异。来自在单个核苷酸上含有差异的不同个体的两种测序的DNA片段称作两种等位基因。优选地，SNP仅具有两种等位基因。
术语“多核苷酸”在本文中理解为指由含有糖、磷酸根和碱基(或是嘌呤或是嘧啶)的单体(核苷酸)构成的高分子量的聚合物分子，其可以是单链的或双链的。“多核苷酸片段”是给定多核苷酸分子的一部分。在高等植物中，脱氧核糖核酸(DNA)是遗传物质，而核糖核酸(RNA)涉及将DNA内所含信息转移至蛋白质。“基因组”是生物体的每个细胞中所含遗传物质的整体。如此，术语“多核苷酸”指DNA或RNA聚合物，其可以是单链的或双链的，任选含有能够掺入DNA或RNA聚合物的合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基。除非另外指明，本发明的特定核酸序列还隐含地涵盖其保守修饰变体(例如简并密码子替代)和互补序列，就像明确指明的序列。具体而言，简并密码子替代可通过生成其中一个或多个选定(或所有)密码子的第三位用混和碱基和/或脱氧肌苷残基替代的序列来实现(Batzer等，1991；Ohtsuka等，1985；Rossolini等，1994)。术语多核苷酸与核酸、核苷酸序列可互换使用，而且可包括基因、由基因编码的mRNA、cDNA等。
在本发明的核酸分子的上下文中使用时，术语“分离的”指在各自的来源生物体内在其染色体核酸序列背景内鉴定的和自其染色体核酸序列背景分离/分开的核酸序列。分离的核酸不是像它在其天然背景中出现的那样的核酸，如果它确实有天然存在对应物的话。比较而言，未分离的核酸是以它们在自然界中存在的状态找到的核酸诸如DNA和RNA。例如，在宿主细胞染色体上在接近邻近基因处找到给定的DNA序列(例如基因)。分离的核酸序列可以以单链或双链形式存在。或者，它可以含有有义和反义链两者(即核酸序列可以是双链的)。如果在植物基因组的背景中要求保护，本发明的核酸分子与天然存在对应物的区别在于基因组中的插入位点和插入位点处的侧翼序列。在一个优选的实施方案中，本发明的核酸分子理解为分离的。
如本文中所使用的，短语“核酸”指能与核苷酸串(或链)对应的，单体单元的任何物理串，包括核苷酸聚合物(例如典型的DNA或RNA聚合物)、修饰的寡核苷酸(例如包含对于生物学RNA或DNA而言不是典型的碱基的寡核苷酸，诸如2’-O-甲基化寡核苷酸)、诸如此类。在一些实施方案中，核酸可以是单链的、双链的、多链的、或其组合。除非另外指明，当前公开主题的特定核酸序列任选在任何明确指明的序列之外还包含或编码互补序列。
术语“基因”广泛用于指与生物学功能有关的任何核酸区段。如此，基因包括其表达需要的编码序列和/或调控序列。例如，基因指表达mRNA或功能性RNA或编码特定蛋白质且包括调控序列的核酸片段。基因还包括不表达的DNA区段，其例如形成其它蛋白质的识别序列。基因可以自多种来源分离，包括自感兴趣来源分离或自已知或预测序列信息合成，而且可以包括设计成具有期望参数的序列。
如本文中所使用的，“表达盒”意指能够在合适的宿主细胞中指导特定核苷酸序列表达的核酸分子，其包含与感兴趣的核苷酸序列可操作连接的启动子，所述感兴趣的核苷酸序列与终止信号可操作连接。典型地，它还包含核苷酸序列的正确翻译所需要的序列。表达盒还可以包含直接表达感兴趣的核苷酸序列不必要的但由于便于自表达载体除去该盒的限制性位点而存在的序列。包含感兴趣核苷酸序列的表达盒可以是嵌合的，意味着至少一种其构件就至少一种其其它构件而言是异源的。表达盒还可以是天然存在的但已经以可用于异源表达的重组形式获得的表达盒。典型地，然而，表达盒对于宿主而言是异源的，即表达盒的特定核酸序列在宿主细胞中不天然存在，而且必须已经通过本领域中已知的转化方法导入宿主细胞或宿主细胞的祖先中。表达盒中核苷酸序列的表达可以在组成型启动子或诱导型启动子的控制下，所述诱导型启动子仅在将宿主暴露于某些特定的外部刺激物时启动转录。在多细胞生物体诸如植物的情况中，启动子也可以是对特定组织、或器官、或发育阶段特异性的。表达盒或其片段在转化入植物中时也可以称为“插入的序列”或“插入序列”。
术语“表达”在用于提及核酸序列诸如基因时指将基因中编码的遗传信息经由基因的“转录”(即经由RNA聚合酶的酶促作用)转化成RNA(例如mRNA、rRNA、tRNA、或snRNA)和在可适用的情况(此时基因表达蛋白质)中经由mRNA的“翻译”转化成蛋白质的过程。可以在该过程中的许多阶段调节基因表达。
术语“嵌合基因”指含有以下各项的任何基因：1)没有在自然界中一起找到的DNA序列，包括调控和编码序列，或2)编码天然不相连的、蛋白质各部分的序列，或3)天然不相连的、启动子各部分。因而，嵌合基因可包含自不同来源衍生的调控序列和编码序列，或包含自相同来源衍生的但以与在自然界中找到的方式不同的方式排列的调控序列和编码序列。
“转基因”指已经通过转化导入基因组中并稳定维持的基因。转基因可包括例如对于要转化的特定植物的基因而言异源或同源的基因。另外，转基因可包含插入非天然生物体的天然基因，或嵌合基因。
“转化”是用于将异源核酸导入宿主细胞或生物体的方法。具体地，“转化”意指DNA分子稳定整合入感兴趣的生物体的基因组中。
“转化的/转基因的/重组的”指其中已经导入异源核酸分子的宿主生物体诸如细菌或植物。可以将核酸分子稳定地整合入宿主的基因组中或者核酸分子也可以以染色体外分子存在。此类染色体外分子可以是自主复制的。经转化的细胞、组织、或植物理解为不仅涵盖转化方法的终产物，而且还涵盖其转基因后代。“未转化的”、“非转基因的”、“非重组的”宿主指野生型生物体，例如细菌或植物，其不含异源核酸分子。如本文中所使用的，“转基因的”指如下的植物、植物细胞、或众多结构化的(structured)或非结构化的(unstructured)植物细胞，其具有经由遗传操作和基因插入的公知技术在与通常存在于天然植物或植物细胞中的基因座不同的基因座处或以比通常存在于天然植物或植物细胞中的拷贝数目大的拷贝数目整合入植物基因组中，并且通常整合入细胞核、线粒体或其它含有染色体的细胞器的染色体中的代表感兴趣基因的核酸序列。与天然存在的突变形成对比，转基因植物源自操作和插入此类核酸序列以生成非天然存在的植物或具有非天然存在的基因型的植物。用于转化植物和植物细胞的技术是本领域中公知的，并且可以包括例如电穿孔、显微注射、土壤杆菌属(Agrobacterium)介导的转化、和弹道转化(ballistic transformation)。
术语“蛋白质”、“肽”和“多肽”在本文中可互换使用。
“编码序列”指编码特定氨基酸序列且排除非编码序列的DNA或RNA序列。它可构成“不中断的编码序列”，即缺少内含子，诸如cDNA，或者它可包括一个或多个以适宜剪接点为界的内含子。“内含子”是包含在初级转录物中但经由细胞内为创建能翻译成蛋白质的成熟mRNA对RNA的切割和再连接被切除的RNA序列。
“启动子”指通常位于其编码序列上游(5’)的核苷酸序列，其通过提供正确转录需要的RNA聚合酶识别和其它因子来控制编码序列的表达。“启动子”包括最小启动子，它是由TATA框和承担规定转录起始位点的其它序列构成的短DNA序列，向其添加用于控制表达的调控元件。“启动子”还指包括最小启动子加能够控制编码序列或功能性RNA表达的调控元件的核苷酸序列。此类启动子序列由近端和更多远端上游元件组成，后一类元件常常称作增强子。因而，“增强子”是能刺激启动子活性的DNA序列，而且可以是启动子的内在元件或为了增强启动子的水平或组织特异性而插入的异源元件。它能够以两个方向(正常的或倒转的)运转，而且甚至在移动到启动子上游或下游时仍能够运行。增强子和其它上游启动子元件都结合介导其效应的序列特异性DNA结合蛋白。启动子可以整体衍生自天然基因，或者由自在自然界中找到的不同启动子衍生的不同元件构成，或者甚至由合成DNA区段构成。启动子还可以含有涉及响应生理或发育条件控制转录起始效率的蛋白质因子的结合的DNA序列。
“起始位点”是围绕作为所转录序列一部分的第一个核苷酸(也定义为+1位置)的位置。就此位点而言，对基因及其控制区的所有其它序列编号。下游序列(即3’方向的其它蛋白质编码序列)命名为正数，而上游序列(主要是5’方向的控制序列)命名为负值。
在上游激活缺失的情况中没有活性或具有大大降低的启动子活性的启动子元件，特别是TATA元件称作“最小或核心启动子”。在存在合适转录因子的情况中，最小启动子发挥允许转录的功能。如此，“最小或核心启动子”仅仅由转录起始需要的所有基础元件(例如TATA框和/或起始子)组成。
“组成性表达”指使用组成性或可调型启动子的表达。“条件性”和“可调型表达”指由可调型启动子控制的表达。
“组成型启动子”指能够在所有或几乎所有植物组织中在植物的所有或几乎所有发育阶段期间表达它控制的可读框(ORF)的启动子。每一个转录激活元件不显示绝对组织特异性，但是在大多数植物部分中以转录最有活性的植物部分中达到的水平1％以上的水平介导转录激活。
“可调型启动子”指以不是组成性的，而是时间和/或空间受调控的方式指导基因表达的启动子，而且包括组织特异性的和诱导型的启动子。它包括天然的和合成的序列，以及可以是合成序列与天然序列的组合的序列。不同启动子可以在不同组织或细胞类型中、在发育的不同阶段、或响应不同环境条件指导基因表达。不断地发现在植物细胞中有用的各种类型新启动子，众多例子可见于汇编Okamuro等(1989)。在植物中有用的典型的可调型启动子包括但不限于安全剂可诱导的启动子、自四环素可诱导系统衍生的启动子、自水杨酸可诱导系统衍生的启动子、自醇可诱导系统衍生的启动子、自糖皮质激素可诱导系统衍生的启动子、自病原体可诱导系统衍生的启动子、和自蜕皮激素可诱导系统衍生的启动子。
“组织特异性启动子”指不是在所有植物细胞中表达，而是只在特定器官(诸如叶或种子)、特定组织(诸如胚或子叶)、或特定细胞类型(诸如叶薄壁组织或种子贮藏细胞)的一种或多种细胞类型中表达的可调型启动子。这些还包括时间受调控的启动子，诸如在胚胎发生的早期或晚期、在种子或果实发育中果实成熟期间、或在完全分化的叶中、或在衰老开始时。
“诱导型启动子”指那些能在一种或多种细胞类型中被外部刺激(诸如化学制品、光、激素、压力、或病原体)开启的可调型启动子。
“可操作连接”指单一核酸片段上各核酸序列的联系，使得一核酸序列的功能受到另一核酸序列的影响。例如，若调控DNA序列和编码RNA或多肽的DNA序列的定位使得调控DNA序列影响编码DNA序列的表达(即编码序列或功能性RNA处于启动子的转录控制下)，则说这两序列“可操作连接”或“相关”。编码序列可以以有义或反义取向与调控序列可操作连接。
“表达”指内源基因、ORF或其部分的、或转基因在植物中的转录和/或翻译。例如，就反义构建体而言，表达可以仅仅指反义DNA的转录。另外，表达指有义(mRNA)或功能性RNA的转录和稳定积累。表达还可以指蛋白质的生成。
“过表达”指转基因细胞或生物体中的表达水平超过正常或未转化(非转基因)细胞或生物体中的表达水平。
“反义抑制”指能够抑制自内源基因或转基因表达蛋白质的反义RNA转录物的生成。
“基因沉默”指对病毒基因、转基因、或内源细胞核基因的，同源性依赖性抑制。基因沉默可以是转录的，这时抑制是由于受影响基因的转录降低，或者是转录后的，这时是由于与受影响基因同源的RNA种类的周转(降解)升高。基因沉默包括病毒诱导的基因沉默。
“RNA干扰”(RNAi)指植物和动物中由短干扰RNA(siRNA)介导的序列特异性转录后基因沉默的过程。各种术语诸如siRNA、靶RNA分子、切酶或核糖核酸酶III酶是本领域技术人员已知的概念，并且与RNAi有关的这些术语和其它概念的全面描述可以参见文献。理解的是，描述RNAi机制的任何特定假设对于实施本发明不是必需的。
术语“siRNA”指短干扰RNA。在一些实施方案中，siRNA包含长约21-23个核苷酸的双链体或双链区；siRNA在每条链的3’端处常含有约2-4个未配对的核苷酸。siRNA的双链体或双链区的至少一条链与靶RNA分子基本上同源或基本上互补。与靶RNA分子互补的链是“反义链”；与靶RNA分子同源的链是“有义链”，而且还与siRNA反义链互补。siRNA还可以含有别的序列；此类序列的非限制性例子包括连接序列、或环，以及茎和其它折叠结构。siRNA表现为在无脊椎动物和脊椎动物中触发RNA干扰中和在植物中在转录后基因沉默过程中触发序列特异性RNA降解中起关键媒介物的作用。
“dsRNA”或“双链RNA”是具有两条互补链的RNA，其经由称为RNA干扰(RNAi)的过程指导mRNA的序列特异性降解。将dsRNA切成干扰特定基因表达的siRNA。
术语“靶RNA分子”指与siRNA(或dsRNA)的短双链区的至少一条链同源或互补的RNA分子。典型地，在此类同源性或互补性在至少21个核苷酸的区段里是约100％时，siRNA能够沉默或抑制靶RNA分子的表达。虽然认为经加工的mRNA是siRNA的靶物，本发明不限于任何具体的假设，而且此类假设对于实施本发明不是必需的。如此，涵盖的是，其它RNA分子也可以是siRNA的靶物。此类RNA靶分子包括未加工的mRNA、核糖体RNA、和病毒RNA基因组。靶RNA分子与dsRNA之间在dsRNA的整个长度里有100％的同源性不是必要的，但是dsRNA的发夹应当包含至少21个核苷酸，优选至少23个核苷酸，更优选至少50个核苷酸，甚至更优选至少500个核苷酸，最优选至少700个核苷酸，和多至1000个核苷酸的区段，其与靶RNA分子间具有至少95％，优选100％的同源性。
如本文中所使用的，术语“杂交”指常规杂交条件，优选如下的杂交条件，其中使用5x SSPE，1％SDS，1x Denhardts溶液作为溶液和/或杂交温度介于35℃和70℃之间，优选65℃。杂交后，优选首先用2x SSC，1％SDS进行清洗，随后用0.2x SSC进行清洗，温度介于35℃和75℃之间，特别是介于45℃和65℃之间，但是尤其是59℃(关于SSPE、SSC和Denhardts溶液的定义参见Sambrook等见上文)。举例而言，Sambrook等，见上文中记载的高严格性杂交条件是特别优选的。例如，若如上所述于65℃进行杂交和清洗，则存在特别优选的严格杂交条件。例如，于45℃进行杂交和清洗的非严格杂交条件优选程度较低，而35℃甚至更低。
“序列同源性或序列同一性”在本文中可互换使用。处于“相同”或百分比“同一性”在两种或更多种核酸或蛋白质序列的语境中指在为了最大对应而比对或比较时，如使用下述序列比较算法之一或通过肉眼检查所测量的，两种或更多种序列或亚序列是相同的或具有特定百分比的、相同的氨基酸残基或核苷酸。若要彼此比较的两种序列长度不同，则序列同一性优选涉及较短序列中与较长序列的核苷酸残基相同的核苷酸残基的百分比。序列同一性可使用计算机程序诸如Bestfit程序(Wisconsin Sequence Analysis Package，Version 8for Unix，Genetics Computer Group，University Research Park，575Science Drive Madison，WI 53711)常规测定。Bestfit利用Smith和Waterman，Advances in Applied Mathematics 2(1981)，482-489的局部同源性算法来寻找两种序列间具有最高序列同一性的区段。在使用Bestfit或另一种序列比对程序来测定特定序列是否与本发明参比序列具有例如95％同一性时，优选调整参数使得在参比序列全长上计算同一性百分比且容许参比序列中有占核苷酸总数多至5％的同一性缺口。在使用Bestfit时，所谓的任选参数优选保留它们的预设(“默认/缺省”)值。在给定序列与上文所述本发明序列之间的比较中出现的偏差可能是由添加、缺失、替代、插入或重组引起的。优选的是，此类序列比较也可以用程序“fasta20u66”(2.0u66版，1998年9月，William R.Pearson和弗吉尼亚大学；还可参见Pearson，1990，所附例子和http://workbench.sdsc.edu/)进行。为此目的，可使用“缺省”参数。
两种核酸序列基本上相同的另一项指标是这两种分子在严格条件下彼此杂交。短语“特异性杂交”指当特定核苷酸序列存在于复杂混合物(例如总细胞DNA或RNA)中时，在严格条件下一种分子只与该序列结合、形成双链、或杂交。“基本上结合”指探针核酸与靶核酸之间的互补性杂交，而且涵盖微小错配，其可以通过降低杂交介质的严格性来容许，用以实现对靶核酸序列的期望检测。
“严格条件”、“严格杂交条件”或“严格杂交清洗条件”在核酸杂交实验诸如Southern和Northern杂交的语境中包括提及探针会以比对其它序列可检出地更大程度与其靶序列杂交的条件。严格条件是靶序列依赖性的，而且在不同环境参数下是不同的，并且会随多核苷酸的结构而有所不同。较长的序列在较高的温度特异性杂交。关于核酸杂交的广泛指导可参见Tijssen P.，1993Laboratory Techniques in Biochemistry and MolecularBiology-Hybridization with Nucleic Acid Probes，第I部分，第2章“Overviewof principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays”Elsevier，New York；和Current Protocols in Molecular Biology，第2章，Ausubel等编，Greene Publishing and Wiley-Interscience：New York(1995)，及还有Sambrook等(2001)Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第5版ColdSpring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY)。
特异性通常是杂交后清洗的功能，关键的因素是最终清洗溶液的离子强度和温度。一般而言，高度严格杂交和清洗条件选择成比特定序列在限定离子强度和pH的热解链点(Tm)低大约5°。典型的是，在“严格条件”下，探针会与其靶亚序列杂交，但不与其它序列杂交。
Tm是50％的靶序列与完全匹配的探针杂交的温度(在限定的离子强度和pH下)。很严格的条件选择成等于特定探针的Tm。具有超过100个互补残基的互补核酸在滤器上在Southern或Northern印迹中的杂交的严格杂交条件的一个例子是50％甲酰胺及1mg肝素，杂交于42℃进行过夜。
通常，高严格清洗之前有低严格清洗以消除背景探针信号。高度严格的清洗条件的一个例子是0.2x SSC于65℃清洗15分钟(关于SSC缓冲液的说明参见Sambrook，见下文)，而非常高度严格的清洗条件的例子是0.15M NaCl于72℃达约15分钟。用于例如超过100个核苷酸的双链体的中等(中间)严格性清洗的一个例子是1x SSC于45℃达15分钟。用于例如超过100个核苷酸的双链体的低严格清洗的一个例子是4-6x SSC于40℃15分钟。对于短探针(例如大约10-50个核苷酸)，严格条件通常涉及低于大约1.0M Na离子、通常大约0.01-1.0M Na离子浓度(或其它盐)的盐浓度，于pH 7.0-8.3，而且温度通常是至少大约30℃。严格条件还可以通过添加去稳定剂诸如甲酰胺来实现。一般而言，特定杂交测定法中用无关探针观察到的信噪比2倍(或更高)的信噪比指示检测到特异性杂交。若由核酸编码的蛋白质基本上相同，则在严格条件下彼此不杂交的核酸仍然是基本上相同的。这发生于例如使用遗传密码容许的最大密码子简并性来创建核酸拷贝的时候。
以下是杂交/清洗条件的例示性组，其可以用于杂交与本发明的参照核苷酸序列基本上相同的核苷酸序列：优选地，参照核苷酸序列在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中于50℃与参照核苷酸序列杂交，其中在2X SSC、0.1％SDS中于50℃清洗，更期望地在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中于50℃杂交，其中在1X SSC、0.1％SDS中于50℃清洗，更期望地仍在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4、1mMEDTA中于50℃杂交，其中在0.5X SSC、0.1％SDS中于50℃清洗，优选地在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中于50℃杂交，其中在0.1X SSC、0.1％SDS中于50℃清洗，更优选地在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中于50℃杂交，其中在0.1X SSC、0.1％SDS中于65℃清洗。可以使用所有上述条件来检测本发明的序列。出于限定本发明的目的，使用高度严格性条件。
“植物”是处于任何发育阶段的任何植物，特别是种子植物。
“植物细胞”是植物的结构和生理单元，包含原生质体和细胞壁。植物细胞可以是分离的单细胞或培养的细胞的形式，或者是更高级的、有组织的单元诸如例如植物组织、植物器官、和完整植株的一部分。
“植物细胞培养物”指植物单元，诸如例如原生质体、细胞培养细胞、植物组织中的细胞、花粉、花粉管、胚珠、胚囊、合子和各种发育阶段的胚的培养物。
“植物材料”指植物的叶、茎、根、花或花的各部分、果实、花粉、卵细胞、合子、种子、插条、细胞或组织培养物、或任何其它部分或产物。这还包括愈伤组织(callus)或愈伤组织组织以及提取物(诸如来自直根的提取物)或样品。
“植物器官”是植物的独特的且明显有结构的且分化的部分，诸如根、茎、叶、花芽、或胚。如本文中所使用的，“植物组织”指组织成结构和功能单元的一组植物细胞。包括种植或培养的植物的任何组织。此术语包括但不限于完整植株、植物器官、植物种子、组织培养物和组织成结构和/或功能单元的任何植物细胞组。此术语在连同上文所列或此定义以其它方式涵盖的任何特定类型植物组织或在没有任何特定类型植物组织的情况中的使用并非意图排除任何其它类型的植物组织。
如本文中所使用的，术语“育种”及其语法变形指生成后代个体的任何过程。育种可以是有性的或无性的，或其任意组合。例示性的非限制性类型的育种包括杂交、自交、重双单倍体衍生物生成、及其组合。
“选择性育种”在本发明范围内理解为指使用拥有或显示期望性状的植株作为亲本的育种程序。
如本文中所使用的，“发酵”指使用微生物将有机分子转化成另一种分子的过程。例如，“发酵”可以指需氧转化来自植物材料诸如本发明的植物材料的糖或其它分子以生成醇(例如乙醇、甲醇、丁醇)；有机酸(例如柠檬酸、乙酸、衣康酸、乳酸、葡糖酸)；酮(例如丙酮)、氨基酸(例如谷氨酸)；气体(例如H2和CO2)、抗生素(例如青霉素和四环素)；酶；维生素(例如核黄素、B12、β-胡萝卜素)；和/或激素。发酵包括可消费醇工业(例如啤酒和酒)中使用的发酵。发酵还包括厌氧发酵，例如，用于生产生物燃料。可以通过适合于用于想要的发酵步骤的任何生物体(包括但不限于细菌、真菌、古细菌、和原生生物)来实现发酵。合适的发酵生物体包括那些能将单糖、二糖、和三糖，特别地葡萄糖和麦芽糖，或任何其它生物量衍生的分子直接或间接转化成想要的发酵产物(例如乙醇、丁醇等)的生物体。合适的发酵生物体还包括那些能将非糖分子转化成想要的发酵产物的生物体。此类生物体和发酵方法对于本领域技术人员是已知的。
如本文中所使用的，术语“生物燃料”指由植物材料的需氧或厌氧发酵生成的任何生物燃料。通过需氧发酵获得的生物燃料的非限制性例子是生物乙醇。可以通过厌氧发酵获得的生物燃料包括但不限于沼气和/或生物柴油(biodiesel)。需氧和/或厌氧发酵的方法对于本领域技术人员是已知的。
发明详述
本发明公开了具有延迟抽苔的表型的转基因糖用甜菜植物。
栽培的糖用甜菜是一种二年生植物，其在第一年形成贮藏根和莲座叶。在一段时间的低温后开始枝条延长(抽苔)和花形成，而一年生甜菜属的许多野生甜菜显示一年生生长习性，这是由于B基因座处存在抽苔基因B。抽苔基因(B基因)负责决定糖用甜菜中的一年生习性。认为甜菜物种中的一年生是单基因的且显性的性状。与携带b等位基因的二年生植物相反，携带显性B等位基因的植物能够以不依赖于春化的方式自幼年期转变成生殖期，所述二年生植物强制性需要春化进行抽苔，随后发生开花。基因座B的显性等位基因在野生甜菜中是丰富的，而且在长日照下引起抽苔，无需对于携带隐性等位基因的二年生栽培种而言通常至关重要的冷要求(Abe等，1997)。
本发明人现在使用候选基因办法来鉴定和表征糖用甜菜中推定的抽苔控制基因。在此办法中，依靠使用BLAST具的同源性搜索将具有登录号CV301305的EST序列鉴定为PRR7的推定甜菜同源物(参见实施例1.1)。相应的氨基酸序列显示了假响应调节物接受者(PRR，pfam00072)或信号接受者(REC，cd00156)域的部分存在(图1)，即均在昼夜节律钟中起至关重要作用的PRR基因家族的一种标志(Nakamichi等，2005)。图2显示了CV301305与PRR7，即其最接近的拟南芥同源物的氨基酸序列比对。如最初在拟南芥中所描述的假响应调节物7(PRR7)基因是假响应调节物基因家族(PRR1或TOC1、PRR3、PRR5、PRR7和PRR9)的成员，所述假响应调节物基因家族都含有两项特征性标记：响应调节物接受者(REC)和CCT域。PRR家族成员的转录水平以昼夜节律方式振荡，这提示其蛋白质与昼夜节律钟紧密相关。事实上，PRR7在拟南芥中被描述为温度敏感性昼夜节律系统的一种成分(Nakamichi等，2007；Salomé和McClung 2005)。在植物中，昼夜节律钟牵涉调节许多基础生物学过程，包括叶运动、光合作用活性的昼间变化和开发时间的光周期控制(Imaizumi和Kay，2006；Zhou等，2007)。最近，在大麦、小麦和稻(HvPPD、TaPPD和OsPRR37)中鉴定和表征PRR7同源物，而且显示为谷物中光周期响应的主要决定子。
在本发明的一方面，如此，提供了BvPRR7的数种一年生和二年生等位基因的序列，优选地如SEQ ID NO：1、4、5、6、7、8、9、10、53、或54中给定的序列，其编码功能上与B基因等同的蛋白质。
基于EST序列，将约0.5Kb的部分甜菜PRR7片段扩增并测序(参见实施例1.1)。使用自一年生系与对第160位的一种SNP而言多态性的二年生系之间的杂交衍生的198个个体的F2群体的定位实验显示了染色体II上在GJ131标志物下游1cM的近似距离处的BvPRR7图(图4)，即已知含有关于不依赖春化的开花的B基因的区域(
Figure BPA00001272851400281
等，2004；Gaafar等，2005)。标志物测定法的结果显示了B基因预测基因型与BvPRR7基因基因型之间的完全匹配(参见实施例1，1)。进一步定位分析的结果，即其定位位置与其与温度敏感性昼夜节律有关的生物学功能的组合(Salomé和McClung，2005)显示了BvPRR7是B基因的一种强候选物(实施例1.1)。
在下一步中，使用本领域技术人员公知的标准PCR技术来筛选BAC文库以回收糖用甜菜PRR7基因的全长基因组序列(参见实施例1.2)。所使用的BAC文库是已经用来自二年生商业性糖用甜菜栽培种H20的DNA建立的BAC文库。对大小为100-400kb的部分(HindIII)消化的HMW DNA片段进行了两次大小选择。将DNA片段连接入载体pBeloBAC-Kan中。所述文库含有57,600个克隆，平均插入物大小大约120kb，对应于甜菜基因组的8倍覆盖。通过用单拷贝探针进行的筛选测试了冗余度，而且来自线粒体或质体DNA的克隆的频率估算为低于1％。对DNA集合后续筛选片段BvPRR7导致携带相应片段的BAC克隆的正鉴定。
为了得到BvPRR7基因的全长序列，使用标准测序技术对先前鉴定的BAC克隆(BAC SBA079-L24)测序。然后可以将两个都与EST CV301305共享序列同源性的非交叠的毗连序列群组合成一条单序列(SEQ ID NO 8)。基于BAC序列毗连序列群与EST CV301305的比对及与来自拟南芥的PRR7基因的序列同源性，可预测包含内含子和外显子的甜菜BvPRR7基因的推定基因结构，如图5所示。基于此预测，基因组序列可显示出跨越整个BvPRR7基因及ATG终止密码子上游的3.6kb序列和编码区下游的2.2kb序列。BvPRR7的相应氨基酸序列显示于SEQ ID NO 11。BvPRR7氨基酸序列与来自拟南芥的PRR基因家族所有成员(包括TOC1(PRR1)、PRR3、PRR5、PRR7和PRR9)的比对说明了氨基末端附近假应答调控物接受者域(PRR)基序(pfam00072)和羧基末端处CCT基序(pfam06203)的强保守性(图6)。在来自拟南芥的PRR基因家族之外，BvPRR7还与谷类植物中的PRR7同系物共享强同源性，如图7所示系统发生树所图示的。谷类植物中的PRR7同系物(更多地称作Ppd)显示出呈现光周期应答的重大决定子(Turner等，2005；Beales等，2007)。尚未证明在糖用甜菜中春化应答中的作用。
基于它们与已知开花时间控制基因的同源性或根据调控蛋白代表性的保守结构域的存在推导出的调控功能，可以将少数基因鉴定为B基因的潜在候选者。这些基因需要通过一年生与二年生基因型之间的等位基因变异性和/或基因表达研究或借助使用转基因办法进行的互补或敲除实验来进一步验证。由B基因赋予的一年生植物习性表现为单一显性性状；因而二年生植物中对春化的要求是隐性的。如此，将BvPRR7的一年生等位基因转化入二年生基因型预测将一年生开花行为赋予二年生受体基因型。为了验证此假说，将在一年生启动子和终止子片段控制下的BvPRR7的一年生等位基因的编码序列转化入二年生基因型，诸如例如G018(参见实施例2)。转化可通过本领域已知方法来实现，诸如Chang等，2002所记载的，使用糖用甜菜分生组织作为外植体材料并使用磷酸甘露糖异构酶(PMI)基因作为选择标志。对转基因枝条检查选择标志的表达，诸如例如PMI活性(Joersbo等，1998)，随后生根，在土壤中盆载并转移至温室。阴性对照由接受相同体外再生规程但不进行土壤杆菌感染和选择的非转基因枝条组成。在生长室中种植植物，恒温18℃，光周期17小时光照和7小时暗。在这些条件(没有通过应用冷温度来诱导抽苔)下，非转基因二年生对照在多至12周的观察期内不显示任何抽苔迹象，而一年生对照植株通常在6至8周内开始抽苔。与非转基因二年生对照植株相反，实质性数目的转基因植株在4-10周内开始抽苔，而且基本上表现为一年生植物，尽管它们具有二年生遗传背景。将抽苔并开花的转基因植株与二年生保持系交叉授粉以生成后代。对后代植株测试PMI活性，随后在没有春化的情况中监测抽苔和开花。这些后代植物显示1对1的分离比及PMI活性与一年生习性之间的完全相关。这些数据证实糖用甜菜中BvPRR7与不依赖春化的开花之间的因果关系。
本发明人进一步发现了BvPRR7在糖用甜菜的春化响应中起关键的作用，并且如此可以用于通过抑制春化响应来将抽苔抗性工程化改造入糖用甜菜植物中。在本发明的一方面，如此，可以在用于生成转基因糖用甜菜植物的转基因方法中使用BvPRR7基因，所述转基因糖用甜菜植物包含稳定地整合入糖用甜菜基因组中的所述多核苷酸。具体地，自基因组表达后，可以使用表达产物来调控糖用甜菜植物的春化响应，其通过抑制或下调B基因的表达来实现。
将感兴趣的DNA序列装配入嵌合构建体中，所述嵌合构建体含有要在植物中运行的调节元件控制下的转基因植物中表达的核酸序列。用于装配此类嵌合构建体的方法是本领域技术人员公知的。
在合适的植物组织中获得足够水平的转基因表达是遗传工程作物生产的一个重要方面。异源DNA序列在植物宿主中的表达依赖于在所述植物宿主中有功能的可操作连接的启动子的存在。启动子序列的选择会决定何时和何处在生物体内表达所述异源DNA序列。
例如，可以采用会指导所述基因在再生植物的所有组织中表达的植物启动子片段。此类启动子在本文中称作“组成性”启动子，而且在大多数环境条件和发育或细胞分化状态下是有活性的。组成型启动子的例子包括花椰菜花叶病毒(CaMV)35S转录起始区、自根癌土壤杆菌T-DNA衍生的1’-或2’-启动子、和来自技术人员知道的各种植物基因的其它转录起始区。此类基因包括例如AP2基因、来自拟南芥的ACT11(Huang等Plant Mol.Biol.33：125-139(1996))、来自拟南芥的Cat3(GenBank No.U43147；Zhong等，Mol.Gen.Genet.251：196-203(1996))、来自欧洲油菜(Brassica napus)的编码硬脂酰-酰基载体蛋白去饱和酶的基因(Genbank No.X74782；Solocombe等Plant Physiol.104：1167-1176(1994))、来自玉米的GPc1(GenBank No.X15596；Martinez等J.Mol.Biol 208：551-565(1989))、和来自玉米的Gpc2(GenBank No.U45855；Manjunath等，Plant Mol.Biol.33：97-112(1997))。
或者，植物启动子可以在特定组织中，或者可以以其它方式在更精确的环境或发育控制下指导本发明核酸分子的表达。可通过诱导型启动子影响转录的环境条件的例子包括厌氧条件、升高的温度、或光照的存在。此类启动子在本文中称作“诱导型”或“组织特异性”启动子。技术人员会认识到，组织特异性启动子可以在靶组织以外的组织中驱动可操作连接的序列的表达。如此，如本文中所使用的，组织特异性启动子指优先在靶组织中驱动表达，但也可以在其它组织中导致一些表达的启动子。
在发育控制下的启动子的例子包括只(或主要只)在某些组织(诸如果实、种子、或花)中启动转录的启动子。在胚珠、花或种子中驱动核酸表达的启动子是本发明中特别有用的。如本文中所使用的，种子特异性或优先性启动子指特异性地或优先在种子组织中指导表达的启动子，此类启动子可以是例如胚珠特异性的、胚特异性的、胚乳特异性的、珠被特异性的、种皮特异性的、或其组合。例子包括来自胚珠特异性BEL1基因的启动子，记载于Reiser等Cell 83：735-742(1995)(GenBank No.U39944)。其它合适的种子特异性启动子衍生自下列基因：来自玉米的MACl(Sheridan等Genetics 142：1009-1020(1996))、来自玉米的Cat3(GenBank No.L05934；Abler等Plant Mol.Biol.22：10131-1038(1993))、来自玉米的编码油质蛋白18kD的基因(GenBank No.J05212；Lee等Plant Mol.Biol.26：1981-1987(1994))、来自拟南芥的vivparous-1(Genbank No.U93215)、来自拟南芥的编码油质蛋白的基因(Genbank No.Z17657)、来自拟南芥的Atmycl(Urao等Plant Mol.Biol.32：571-576(1996))、来自拟南芥的2s种子贮藏蛋白基因家族(Conceicao等Plant 5：493-505(1994))、来自欧洲油菜的编码油质蛋白20kD的基因(GenBankNo.M63985)、来自欧洲油菜的napA(GenBank No.J02798；Josefsson等JBL26：12196-1301(1987))、来自欧洲油菜的油菜籽蛋白基因(Sjodahl等Planta197：264-271(1995))、来自欧洲油菜的编码2S贮藏蛋白的基因(Dasgupta等Gene 133：301-302(1993))、来自大豆的编码油质蛋白A(Genbank No.U09118)和油质蛋白B(Genbank No.U09119)的基因、及来自大豆的编码低分子量硫富含蛋白的基因(Choi等Mol Gen.Genet.246：266-268(1995))。
或者，可以鉴定提供具有期望表达特征的启动子或具有表达增强活性的启动子的具体序列，而且可以经由突变将这些序列或相似序列引入序列中。进一步考虑可以诱变这些序列以增强它们转基因在特定物种中的表达。
此外，组合来自超过一种启动子的元件的启动子也是有用的。例如，美国专利No.5,491,288披露了组合花椰菜花叶病毒(CaMV)启动子与组蛋白启动子。如此，可以将来自本文中所公开的启动子的元件与来自其它启动子的元件组合。
多种5’和3’转录调控序列可用于本发明。转录终止子负责转录终止和正确的mRNA聚腺苷酸化。3’非翻译调控DNA序列优选包括约50个至约1,000个、更优选约100个至约1,000个核苷酸碱基对，而且含有植物转录和翻译终止序列。适宜的转录终止子和已知在植物中有功能的转录终止子包括CaMV35S终止子、tml终止子、胭脂碱合酶终止子、豌豆rbcS E9终止子、来自根癌土壤杆菌章鱼碱合酶基因的T7转录物的终止子、和来自马铃薯或番茄的蛋白酶抑制剂I或II基因的3’末端，但是也可以采用技术人员知道的其它3’元件。或者，也可以使用伽马coixin、油质蛋白3或来自薏苡属(Coix)的其它终止子。
优选的3’元件包括来自根癌土壤杆菌胭脂碱合酶基因的3’元件(Bevan等，1983)、来自根癌土壤杆菌章鱼碱合酶基因的T7转录物的终止子、和来自马铃薯或番茄的蛋白酶抑制剂I或II基因的3’末端。
由于转录起始位点与编码序列起点之间的DNA序列(即不翻译的前导序列)能影响基因表达，所以也可能希望采用特定的前导序列。优选的前导序列包括包含预测指导所附着基因最佳表达的前导序列，即包括可提高或维持mRNA稳定性和防止不当翻译起始的优选共有前导序列。本领域技术人员根据本公开内容会知道此类序列的选择。自在植物中高表达的基因衍生的序列会是最优选的。
已经发现在转基因植物中增强基因表达的其它序列包括内含子序列(例如来自Adh1、bronze1、肌动蛋白1、肌动蛋白2(WO 00/760067)、或蔗糖合酶内含子的)和病毒前导序列(例如来自TMV、MCMV和AMV的)。例如，已知自病毒衍生的许多非翻译前导序列增强表达。具体而言，来自烟草花叶病毒(TMV)、玉米褪绿斑点病毒(MCMV)、和苜蓿花叶病毒(AMV)的前导序列已经显示了在增强表达方面是有效的(例如Gallie等，1987；Skuzeski等，1990)。本领域已知的其它前导包括但不限于：小RNA病毒前导，例如EMCV前导(脑心肌炎5非编码区)(Elroy-Stein等，1989)；马铃薯Y病毒前导，例如TEV前导(烟草蚀纹病毒)；MDMV前导(玉米矮缩花叶病毒)；人免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP)前导(Macejak等，1991)；来自苜蓿花叶病毒外壳蛋白mRNA(AMV RNA4)的非翻译前导(Jobling等，1987)、烟草花叶前导(TMV)(Gallie等，1989)；和玉米褪绿斑点(chlorotic mottle)病毒前导(MCMV)(Lommel等，1991)。还可参见Della-Cioppa等，1987。
在期望时，可进一步包括诸如Adh内含子1(Callis等，1987)、蔗糖合酶内含子(Vasil等，1989)或TMVΩ元件(Gallie等，1989)等调控元件。
增强子的例子包括来自CaMV 35S启动子、章鱼碱合酶基因(Ellis等，1987)、稻肌动蛋白I基因、玉米醇脱氢酶基因(Callis等，1987)、玉米皱缩I基因(Vasil等，1989)、TMVΩ元件(Gallie等，1989)和来自非植物真核生物的启动子(例如酵母；Ma等，1988)的元件。
一种用于控制表达的主要方法是表达不足。为了表达不足，有两种主要方法，它们在本领域中常常称作“反义下调”和“有义下调”(有义下调也称作“共抑制”)。一般而言，这些过程称作“基因沉默”。这两种方法都导致对靶基因表达的抑制。
本发明包含用于降低本发明核酸分子的表达、量、活性和/或功能的多种策略。熟练技术人员领会如下实情，即许多不同方法是可用的，以便以想要的方式影响本发明核酸分子的表达、量、活性和/或功能。可以提及但不是限制性的例子是：
“有义”抑制
本发明核苷酸序列表达的改变(优选是其表达的降低)是通过“有义”抑制得到的(参见例如Jorgensen等(1996)Plant Mol.Biol.31，957-973)。在这种情况中，在DNA分子中包含整个或部分的本发明核苷酸序列。所述DNA分子优选是可操作连接至在包含靶基因的细胞(优选植物细胞)中有功能的启动子的，并被导入该核苷酸序列在其中可表达的所述细胞中。将所述核苷酸序列以“有义取向”插入所述DNA分子中，这意味着所述核苷酸序列的编码链能转录。在一个优选的实施方案中，所述核苷酸序列是完全可转录的，而且所述核苷酸序列中包含的所有遗传信息或其一部分翻译成多肽。在另一个优选的实施方案中，所述核苷酸序列是部分可翻译的，而且一种短肽得到翻译。在一个优选的实施方案中，这是通过在所述核苷酸序列中插入至少一个提前终止密码子而实现的，这使得翻译停止。在另一个更加优选的实施方案中，所述核苷酸序列得到转录，但是没有生成翻译产物。这通常是通过消除由核苷酸序列编码的多肽的起始密码子(例如“ATG”)而实现的。在另一个优选的实施方案中，包含所述核苷酸序列的DNA分子或其一部分在植物细胞的基因组中稳定整合。在另一个优选的实施方案中，包含所述核苷酸序列的DNA分子或其一部分包含在染色体外复制分子中。
在包含上文刚刚所述DNA分子之一的转基因植物中，与所述DNA分子中包含的核苷酸序列对应的核苷酸序列的表达优选是降低的。优选的是，所述DNA分子中的核苷酸序列与表达得到降低的核苷酸序列至少80％相同，更优选的是，它是至少90％相同的、仍更优选至少95％相同的、且最优选至少99％相同的。
“反义”抑制
在另一个优选的实施方案中，本发明核苷酸序列表达的改变(优选是其表达的降低)是通过“反义”抑制得到的。在DNA分子中包含整个或部分的本发明核苷酸序列。所述DNA分子优选是可操作连接至在植物细胞中有功能的启动子的，并被导入该核苷酸序列在其中可表达的植物细胞中。将所述核苷酸序列以“反义取向”插入所述DNA分子中，这意味着所述核苷酸序列的反向互补序列(有时也称作非编码链)能转录。在一个优选的实施方案中，包含所述核苷酸序列的DNA分子或其一部分在植物细胞的基因组中稳定整合。在另一个优选的实施方案中，包含所述核苷酸序列的DNA分子或其一部分包含在染色体复制分子中。为了进一步说明，引用数份描述这种办法的出版物(Green，P.J.等，Ann.Rev.Biochem.55：569-597(1986)；van der Krol，A.R.等，Antisense Nuc.Acids&Proteins，第125页-第141页(1991)；Abel，P.P.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：6949-6952(1989)；Ecker，J.R.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：5372-5376(Aug.1986))。
在包含上文刚刚所述DNA分子之一的转基因植物中，与所述DNA分子中包含的核苷酸序列对应的核苷酸序列的表达优选是降低的。优选的是，所述DNA分子中的核苷酸序列与表达得到降低的核苷酸序列至少80％相同，更优选的是，它是至少90％相同的、仍更优选至少95％相同的、且最优选至少99％相同的。
同源重组
在另一个优选的实施方案中，至少一个与本发明核苷酸序列对应的基因组拷贝通过同源重组在植物的基因组中得到修饰，如Paszkowski等，EMBOJournal 7：4021-26(1988)进一步说明的。这种技术利用同源序列通过本领域称作同源重组的过程来彼此识别和相互之间交换核苷酸序列的特性。同源重组可以在细胞中核苷酸序列的染色体拷贝与通过转化导入细胞中的核苷酸序列的引入拷贝之间发生。如此，在核苷酸序列的染色体拷贝中精确地引入特定修饰。在一个实施方案中，本发明核苷酸序列的调控元件是经过修饰的。此类调控元件易于通过使用本发明的核苷酸序列或其一部分作为探针筛选基因组文库来获得。将现有的调控元件用不同的调控元件替换，如此改变核苷酸序列的表达，或者将它们突变或缺失，如此消除核苷酸序列的表达。在另一个实施方案中，通过缺失核苷酸序列的一部分或整个核苷酸序列或者通过突变来修饰核苷酸序列。本发明也涵盖突变型多肽在植物细胞中的表达。这种技术用于破坏内源植物基因的最新精化已有记载(Kempin等，Nature389：802-803(1997)及Miao和Lam，Plant J.，7：359-365(1995))。
熟练技术人员知道如何以靶定的方式修饰基因组序列的许多可能的方法。这些包括特别是如下的方法，诸如依靠靶向同源重组产生敲除突变体，例如通过产生终止密码子来实现、读码框的移位等(Hohn B和Puchta H(1999)Proc Natl Acad Sci USA 96：8321-8323)或依靠例如序列特异性重组酶或核酸酶来实现序列的靶向删除或倒位。在另一个优选的实施方案中，通过用由RNA连续区段与在末端具有双重发夹帽的、双链体构象的DNA残基构成的嵌合寡核苷酸转化细胞，在核苷酸序列的染色体拷贝中引入突变。所述寡核苷酸的另一项特征是例如在RNA残基处存在2’-O-甲基化。所述RNA/DNA序列设计成与本发明核苷酸序列的染色体拷贝排列且含有期望的核苷酸变化。例如，此技术进一步记载于美国专利5,501,967及Zhu等(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96：8768-8773。
核酶
在另一个实施方案中，编码本发明多肽的RNA受到对此类RNA特异性的催化性RNA或核酶的切割。在转基因植物中表达所述核酶，导致所述植物细胞中编码本发明多肽的RNA的量降低，如此导致所述细胞中积累的多肽的量降低。此方法进一步记载于美国专利4,987,071。
显性负突变体
在另一个优选的实施方案中，改变了由本发明核苷酸序列编码的多肽的活性。这是通过在转基因植物中表达所述蛋白质的显性负突变体而实现的，导致内源蛋白质的活性损失。
适体
在另一个实施方案中，通过在转基因植物中表达特异性结合蛋白质的称作适体的核酸配体，抑制了本发明多肽的活性。适体优选通过SELEX(通过指数富集进行的配体系统进化)方法来获得。在SELEX法中，使具有随机化序列区域的单链核酸的候选混合物与蛋白质接触，并将那些具有升高的对靶物的亲和力的核酸与候选混合物的剩余物分开。扩增分隔出来的核酸以生成配体富集混合物。数次重复后，得到了具有最佳的对多肽的亲和力的核酸，并用于在转基因植物中表达。此方法进一步记载于美国专利5,270,163。
锌指蛋白
还使用结合本发明核苷酸序列或其调控区的锌指蛋白来改变所述核苷酸序列的表达。优选的是，所述核苷酸序列的表达得到降低或提高。锌指蛋白记载于例如Beerli等(1998)PNAS 95：14628-14633；WO 95/19431；WO98/54311；或WO 96/06166，通过述及将它们都完整收入本文。
dsRNA
通过dsRNA干扰(RNAi)也获得本发明核苷酸序列的表达变化。已经多次对动物和植物生物体描述了依靠双链RNA(“双链RNA干扰”；dsRNAi)的基因调节方法(例如Matzke M A等(2000)Plant Mol Biol 43：401-415；Fire A.等(1998)Nature 391：806-811；WO 99/32619；WO 99/53050；WO 00/68374；WO00/44914；WO 00/44895；WO 00/49035；WO 00/63364，通过提及而将它们都完整收入本文)。在此明确提及指明的参考文献中所描述的过程和方法。dsRNAi方法基于如下现象，即同时导入基因转录物的互补链和轮廓链(contour strand)以高度有效的方式抑制相应基因的表达。优选地，所引起的表型与相应的敲除突变体的表型非常相似(Waterhouse P M等(1998)ProcNatl Acad Sci USA 95：13959-64)。dsRNAi方法在降低标志物蛋白质表达上已经证明为特别有效且有利的。
双链RNA(dsRNA)分子在本发明范围内优选地意指一种或多种核糖核酸序列，其由于互补序列而在理论上(例如依照Watson和Crick的碱基对规则)和/或实际上(例如由于体外和/或体内杂交实验)能够形成双链RNA结构。双链技术人员知道如下的实情，即双链RNA结构的形成代表平衡状态。优选地，双链分子与相应的解离形式的比率是至少1比10，优选1∶1，特别优选5∶1，最优选10∶1。
本发明进一步涉及双链RNA分子，其在导入植物生物体中(或导入自其衍生的细胞、组织、器官或增殖材料中)时引起至少一种靶基因的表达降低。优选地，本文的用于降低靶基因的表达的双链RNA分子包含a)“有义”RNA链，其包含与靶基因的“有义”RNA转录物的至少一部分基本上相同的至少一种核糖核苷酸序列，和b)“反义”RNA链，其在a)下与RNA有义链基本上，优选完全互补。
“基本上相同的”意指dsRNA序列与靶基因序列相比还可以具有插入、缺失而且还有个别的点突变，然而引起表达的有效降低。抑制性dsRNA的“有义”链与靶基因核酸序列的“有义”RNA转录物的至少一个部分之间(或靶基因的核酸序列的互补链的“反义”链之间)的同源性(如下文中所定义的)优选是至少75％、优选至少80％、非常特别优选至少90％、最优选100％。
dsRNA与标志物蛋白质基因转录物之间的100％序列同一性为了引起靶基因表达的有效降低不是绝对必要的。因此，该方法对于可由于遗传突变、多态性或进化趋异而存在的序列偏差是有利地耐受的。如此，有可能例如使用已经生成的自第一生物体的靶基因的序列开始的dsRNA来抑制第二生物体中的靶基因表达。出于此目的，dsRNA优选地包括靶基因转录物中与保守区对应的序列区域。所述保守区可以容易地源自序列比较。
或者，“基本上相同的”dsRNA还可以定义为能够与靶基因转录物的一部分杂交的核酸序列。
“基本上互补的”意指“反义”RNA链与此“有义”RNA链的互补物相比还可以具有插入、缺失而且还有个别的点突变。“反义”RNA链与“有义”RNA链的互补物之间的同源性优选是至少80％，优选至少90％，非常特别优选至少95％，最优选100％。
靶基因核酸序列的““有义”RNA转录物的一部分”意指自靶基因核酸序列转录或可转录的RNA或mRNA的片段。在此上下文中，片段具有优选地至少20个碱基、优选地至少50个碱基、特别优选地至少100个碱基、非常特别优选地至少200个碱基、最优选地至少500个碱基的序列长度。还包括完全可转录的RNA或mRNA。还包括如下的序列，诸如可以在人工条件下自靶基因区域转录的那些序列，所述靶基因区域在其它情况中在天然条件下不转录，诸如例如启动子区域。
dsRNA可以由一条或多条多核糖核苷酸链组成。天然地，为了实现相同的目的，还有可能将多种在每种情况中包含上文定义的核糖核苷酸序列部分之一的个别dsRNA分子导入细胞或生物体中。可以自两个互补的、分开的RNA链开始或者优选地自单一、自身互补的RNA链开始来形成双链dsRNA结构。在此情况中，“有义”RNA链和“反义”RNA链优选以反向“重复”形式彼此共价连接。
如WO 99/53050中所描述的，例如，dsRNA还可以包含发夹结构，其通过由连接序列(“接头”；例如内含子)连接“有义”和“反义”链来得到。将优选给予自身互补的dsRNA结构，因为它们仅需要RNA序列的表达，而且总是包含等摩尔比率的互补RNA链。优选地，连接序列可以是内含子(例如马铃薯ST-LS1基因的内含子；Vancanneyt G F等(1990)Mol Gen Genet220(2)：245-250)。
编码dsRNA的核酸序列可以包括别的元件，诸如例如转录终止信号或多聚腺苷酸化信号。
举例而言，可以以下列方式实现在细胞或植物中聚集(若想要的话)dsRNA的两条链：a)用包含两种表达盒的载体转化细胞或植物，b)用两种载体共转化细胞或植物，所述载体之一包含含有“有义”链的表达盒，而所述载体的另一种包含含有“反义”链的表达盒。可以在细胞外部或内部启动RNA双链体的形成。
可以在体内或在体外合成dsRNA。出于此目的，可以将编码dsRNA的DNA序列插入至少一种遗传控制元件(诸如例如启动子)控制下的表达盒中。多聚腺苷酸化不是必需的，并且也不需要存在的任何用于启动翻译的元件。将优选给予靶向靶基因的dsRNA的表达盒，其存在于转化构建体或转化载体上。出于此目的，优选地，将编码靶向靶基因的dsRNA的“反义”链和/或“有义”链或dsRNA的自身互补链的表达盒插入转化载体中，并通过使用下文所描述的方法来导入植物细胞中。稳定插入基因组中对本发明的方法可以是有利的，但是不是绝对必要的。因为dsRNA引起长期效果，所以瞬时表达在许多情况中也是足够的。dsRNA也可以是要通过核酸序列表达的RNA的一部分，所述核酸序列要通过将其融合例如至所述RNA的3’-非翻译部分来插入。
可以以使每个细胞至少一个拷贝成为可能的量导入dsRNA。若合适的话，较高的量(例如每个细胞至少5、10、100、500或1000个拷贝)可以引起更有效的降低。
对于RNAi抑制BvPRR7，本发明人已经将cDNA片段诸如例如SEQ ID NO：1中所描述的0.6Kb片段装配成组成型启动子控制下的RNAi盒(参见实施例3)。合适的组成型启动子是例如，来自拟南芥的Ubi3启动子(Norris等，1993)、CaMV 35S启动子、或任何其它已知在糖用甜菜中促进组成性表达的启动子。表达盒进一步含有合适启动子控制下的选择标志基因。具体地，标志物基因编码正向选择标志物诸如磷酸甘露糖异构酶或木糖异构酶。BvPRR7片段的反向重复由来自马铃薯StLS1基因的第二内含子分开(Eckes等，1986；Vancanneyt等，1990)以稳定化RNAi盒，而且还改善RNAi现象的效率(Wang和Waterhouse，2001；Smith等，2000)。
DNA分子的插入(插入诱变)
在另一个优选的实施方案中，将DNA分子插入本发明核苷酸序列的染色体拷贝或其调节区中。优选地，此类DNA分子包含能够在植物细胞中转座的可转座元件，诸如例如Ac/Ds、Em/Spm、突变基因(mutator)。或者，所述DNA分子包含土壤杆菌T-DNA的T-DNA边界。所述DNA分子也可包含重组酶或整合酶识别位点，其可用于自植物细胞的染色体消除所述DNA分子的一部分。还涵盖使用T-DNA、转座子、寡核苷酸或本领域技术人员知道的其它方法进行的插入诱变方法。使用T-DNA和转座子进行插入诱变的方法记载于Winkler等(1989)Methods Mol.Biol.82：129-136及Martienssen(1998)PNAS95：2021-2026，通过述及将它们完整收入本文。别的合适的方法是将无义突变导入内源靶基因中，例如依靠将RNA/DNA寡核苷酸导入植物中来进行(zhu等(2000)Nat Biotechnol 18(5)：555-558)。也可以依靠DNA-RNA杂合物来产生点突变，所述DNA-RNA杂合物也称为“嵌合修复术(chimeraplasty)”(Cole-Strauss等(1999)Nucl Acids Res 27(5)：1323-1330；Kmiec(1999)Genetherapy American Scientist 87(3)：240-247)。
缺失诱变
在又一个实施方案中，本发明核酸分子的突变是在细胞或植物中的所述序列的基因组拷贝中创建的，其通过缺失所述核苷酸序列或调节序列来实现。缺失诱变的方法是本领域技术人员知道的。参见例如Miao等，(1995)PlantJ.7：359。也可以通过靶基因中的靶向缺失来降低靶基因表达的活性或量，例如通过在识别序列处序列特异性诱导DNA双链断裂以在靶基因核酸序列中或接近靶基因核酸序列处特异性诱导DNA双链断裂来实现。
在又一个实施方案中，此缺失是在一大群植物中随机创建的，其通过化学诱变或辐射来实现，并且通过正向或反向遗传学分离在本发明基因中具有缺失的植物。已知用快中子或伽马射线进行的辐射引起植物中的缺失突变(Silverstone等，(1998)Plant Cell，10：155-169；Bruggemann等，(1996)Plant J.，10：755-760；Redei和Koncz，于Methods in Arabidopsis Research，WorldScientific Press(1992)，第16页-第82页)。可以使用PCR及基因组DNA合并集合在反向遗传学策略中回收本发明基因中的缺失突变，正如在秀丽线虫(C.elegans)中所显示的(Liu等，(1999)，Genome Research，9：859-867)。正向遗传学策略会涉及诱变显示PTGS的系，接着对M2后代筛选PTGS的缺失。在这些突变体中会预期有些突变体破坏了本发明的基因。这可通过使用来自这些突变体的基因组DNA进行的本发明基因的Southern印迹或PCR来评估。
在又一个实施方案中，在植物的每个细胞中改变本发明核苷酸序列的表达。这是例如经由同源重组或通过染色体中的插入而得到的。这也是例如通过在能够在植物的每一个细胞中表达有义或反义RNA、锌指蛋白或核酶的启动子控制下表达有义或反义RNA、锌指蛋白或核酶而得到的。依照本发明的教导，例如如下所述，制备用于表达有义或反义RNA、锌指蛋白或核酶或用于过表达本发明核苷酸序列的构建体，并转化入植物细胞中。
组合应用也是想得到的。别的方法对于熟练技术人员是已知的，并且可以包括阻止或停止靶基因的加工、由靶基因编码的蛋白质或其mRNA的转运、对核糖体附着的抑制、对RNA剪接的抑制、降解靶基因RNA的酶的诱导和/或对翻译延长或终止的抑制。
因此，本发明还提供了与序列表的SEQ ID NO：1、4、5、6、7、8、9、10、53、或54中所列序列对应的有义和反义核酸分子及其直向同系物。
可以将与编码SEQ ID NO：6所示多肽的核苷酸基本上相似的依照本发明的基因和可读框(包括任何相应的反义构建体)可操作连接至在植物宿主内有功能的任何启动子(包括依照本发明的启动子序列或其突变体)。
一旦完成，可以将包含表达盒或RNAi盒的本发明多核苷酸构建体动员入对于植物转化而言合适的载体(诸如例如二元载体)中，然后可以使用公知的转化技术之一(诸如例如土壤杆菌介导的转化)将其动员至糖用甜菜。
可以通过多种完全确立的技术来生成掺有且表达本发明核酸序列或dsRNA的转基因植物(或植物细胞或植物外植体或植物组织)。构建包含掺有依照本发明的和如本文所述的核酸序列的表达盒或RNAi盒的本发明嵌合构建体后，可使用标准技术将该嵌合构建体导入感兴趣植物、植物细胞、植物外植体或植物组织。任选的是，可以再生植物细胞、网状物或组织以再生转基因植物。所述植物可以是任何高等植物，包括裸子植物、单子叶植物和双子叶植物。合适的方案是可得的。对于豆科(Leguminosae)(苜蓿、大豆、三叶草、等)、伞形科(Umbelliferae)(胡萝卜、芹菜、欧洲防风)、十字花科(Cruciferae)(卷心菜、萝卜、油菜籽、嫩茎花椰菜、等)、葫芦科(Curcurbitaceae)(甜瓜和黄瓜)、禾本科(Gramineae)(小麦、玉米、稻、大麦、粟、等)、茄科(Solanaceae)(马铃薯、番茄、烟草、胡椒、等)、及各种其它农作物。参见Ammirato等，编，(1984)Handbook of Plant Cell Culture--Crop Species，Macmillan Publ.Co.，New York，N.Y.；Shimamoto等(1989)Nature 338：274276；Fromm等(1990)Bio/Technol.8：833839；及Vasil等(1990)Bio/Technol.8：429434中记载的方案。单子叶植物和双子叶植物二者细胞的转化和再生现在是常规的，而且从业人员会确定最适宜的转化技术的选择。方法的选择会随要转化的植物的类型而变化；本领域技术人员会认识到特定方法对于指定植物类型的合适性。合适的方法可包括但不限于：植物原生质体的电穿孔；脂质体介导的转化；聚乙二醇(PEG)介导的转化；使用病毒进行的转化；植物细胞的显微注射；植物细胞的微弹轰击；真空渗透；和根癌土壤杆菌介导的转化。
植物转化可以用单一DNA分子或多种DNA分子(即共转化)进行，而且这两种技术都适合于与本发明的嵌合构建体一起使用。用于植物转化的许多转化载体是可得的，而且本发明的表达盒可以与任何此类载体一起使用。载体的选择会取决于优选的转化技术和要转化的靶物种。
用于将构建体导入植物细胞宿主中的多种技术是可得的且本领域技术人员已知的。这些技术一般包括采用根癌土壤杆菌或发根土壤杆菌作为转化剂、脂质体、PEG沉淀、电穿孔、DNA注射、直接DNA摄取、微弹轰击、微粒加速、诸如此类进行的DNA转化(参见例如EP 295959和EP 138341)(见下文)。然而，可以用本发明的多核苷酸构建体转化植物细胞以外的细胞。关于植物表达载体和报告基因及土壤杆菌属和土壤杆菌介导的基因转移的一般描述可见于Gruber等(1993)。
可以将含有依照本发明的核酸序列的表达载体导入原生质体或完整的组织或分离的细胞中。优选的是，将表达载体导入完整的组织中。培养植物组织的通用方法见于例如Maki等，(1993)；及Phillips等(1988)。优选的是，使用直接基因转移方法将表达载体导入玉米或其它植物组织中，诸如微弹介导的投递、DNA注射、电穿孔等等。更优选的是，用弹道装置使用微弹介导的投递将表达载体导入植物组织中。参见例如Tomes等(1995)。本发明的载体不仅可用于结构基因的表达，而且可用于外显子-捕获克隆或启动子捕获规程以检测各种组织中的差异基因表达(Lindsey等，1993；Auch和Reth等)。
特别优选使用土壤杆菌的二元型载体Ti和Ri质粒。Ti衍生载体转化广泛的高等植物，包括单子叶植物和双子叶植物，诸如大豆、棉、油菜、烟草、和稻(Pacciotti等，1985；Byrne等，1987；Sukhapinda等，1987；Lorz等，1985；Potrykus，1985；Park等，1985；Hiei等，1994)。T-DNA用于转化植物细胞的用途得到了广泛研究和详细描述(EP 120516；Hoekema，1985；Knauf等-，1983；及An等，1985)。为了导入植物中，可以将本发明的嵌合构建体插入二元载体中，如实施例中所描述的。
本领域技术人员会领会，方法的选择可取决于要进行转化的植物的类型，即单子叶植物或双子叶植物。合适的植物细胞转化方法包括但不限于显微注射(Crossway等，1986)、电穿孔(Riggs等，1986)、土壤杆菌介导的转化(Hinchee等，1988)、直接基因转移(Paszkowski等，1984)、和弹道微粒加速，其使用可自Agracetus，Inc.(Madison，Wis.)和BioRad(Hercules，Calif.)获得的装置进行(参见例如Sanford等，美国专利No.4,945,050；及McCabe等，1988)。还可参见Weissinger等，1988；Sanford等，1987(洋葱)；Christou等，1988(大豆)；McCabe等，1988(大豆)；Datta等，1990(稻)；Klein等，1988(玉米)；Klein等，1988(玉米)；Klein等，1988(玉米)；Fromm等，1990(玉米)；及Gordon-Kamm等，1990(玉米)；Svab等，1990(烟草叶绿体)；Koziel等，1993(玉米)；Shimamoto等，1989(稻)；Christou等，1991(稻)；欧洲专利申请EP 0332581(鸭茅和其它Pooideae)；Vasil等，1993(小麦)；Weeks等，1993(小麦)。在一个实施方案中，采用用于玉米的原生质体转化方法(欧洲专利申请EP 0292435；美国专利No.5,350,689)。
本发明的主要焦点是糖用甜菜的转化。用于转化糖用甜菜的实验规程是本领域技术人员公知的，诸如使用糖用甜菜分生组织作为外植体材料的Chang等，2002所披露的或如Joersbo等，1998所描述的。
在一个优选的实施方案(如实施例3中所显示的)中，可以将RNAi盒转化入二年生糖用甜菜基因型诸如例如G018中。对转基因枝条检查选择标志的表达诸如例如PMI活性(Joersbo等，1998)。使阳性枝条和非转基因对照生根，并转移至于18℃的温室达两周最小值的驯化期，之后春化处理。一旦完善建立，将转基因植物暴露于春化处理，其由于6℃恒定温度的14周期间和低人工光的12小时组成。在应用抽苔诱导性条件前，通过逐渐将温度从10提高至18℃来在气候室中将春化的植物缓慢驯化2周。随后，将植物移植入更大的盆(2升)中，并监测抽苔，期间暴露于18℃的恒定温度和17小时光/7小时黑暗的长日照光周期。
选出经转化植物细胞或植物并种植至成熟后，鉴定那些显示出感兴趣性状的植物。所述性状可以是任何上文所述那些性状。另外，为了确认感兴趣性状是由于所导入的感兴趣核酸序列在依照本发明的调控性核苷酸控制下的表达，可使用Northern印迹、RT-PCR或微阵列分析mRNA表达或使用免疫印迹或Western印迹或凝胶位移测定法分析蛋白质表达，由此测定感兴趣多肽或核酸序列的表达水平或活性。
如此，本发明涉及植物细胞和组织、自此类细胞和组织衍生的植物、植物材料、自此类植物衍生的后代和种子、及农业产品，包括可通过例如下文所述任一转化方法得到的、经过加工的植物产品。
一旦将包含依照本发明核酸序列的依照本发明的和如本文所述的表达盒转化入特定植物物种中，可以使用传统育种技术在该物种中繁殖或移入相同物种的其它品种中，特别是包括商业性品种。本发明的优选植物包括裸子植物、单子叶植物、和双子叶植物，尤其是在农业上重要的农作物植物，诸如稻(rice)、小麦(wheat)、大麦(barley)、黑麦(rye)、油菜(rape)、玉米(corn)、马铃薯(potato)、胡萝卜(carrot)、甘薯(sweet potato)、糖用甜菜(sugar beet)、菜豆(bean)、豌豆(pea)、菊苣(chicory)、莴苣(lettuce)、甘蓝(cabbage)、花椰菜(cauliflower)、嫩茎花椰菜(broccoli)、芜菁(turnip)、萝卜(radish)、菠菜(spinach)、芦笋(asparagus)、洋葱(onion)、蒜(garlic)、茄子(eggplant)、胡椒(pepper)、芹菜(celery)、胡萝卜(carrot)、西葫芦(squash)、南瓜(pumpkin)、夏南瓜(zucchini)、黄瓜(cucumber)、苹果(apple)、梨(pear)、温柏(quince)、甜瓜(melon)、李(plum)、樱桃(cherry)、桃(peach)、油桃(nectarine)、杏(apricot)、草莓(strawberry)、葡萄(grape)、覆盆子(raspberry)、黑莓(blackberry)、凤梨(pineapple)、鳄梨(avocado)、番木瓜(papaya)、芒果(mango)、香蕉(banana)、大豆(soybean)、烟草(tobacco)、番茄(tomato)、高粱(sorghum)和甘蔗(sugarcane)。
工程化改造入上文所述转基因植物中的遗传特性通过有性生殖或营养生长而传递，而且如此能在后代植物中维持和繁殖。一般而言，所述维持和繁殖利用开发用来适应特定目的的已知农业方法，诸如耕耘、播种或收获。也可以应用专用过程，诸如水培或温室技术。可进一步地在致力于开发具有改良特性(诸如对害虫、除草剂、或压力的耐受，改良的营养价值，升高的产量，或引起倒伏或落粒损失减少的改良结构)的植物的植物育种中进行依照本发明的转基因植物的有利遗传特性的使用。各种育种步骤的特征在于清楚限定的人为干预，诸如选择要杂交的系、指导亲本系的授粉、或选择适宜的后代植物。根据期望的特性，采用不同的育种度量。相关技术是本领域公知的，包括但不限于杂交/近交/回交育种、多系育种、品种混和(variety blend)、种间杂交、非整倍体技术、等。杂交技术还包括通过机械、化学或生化手段进行的植物不育化，以生成雄性或雌性不育植物。不同系的花粉对雄性不育植物的交叉授粉确保雄性不育而非雌性不育植物的基因组会一致地获得这两个亲本系的特性。如此，依照本发明的转基因植物能用于改良植物系的育种，例如由于它们的修饰遗传特性而提高常规方法(诸如除草剂或杀虫剂处理)的效率或容许免除所述方法。或者，能得到具有改良压力耐受的新农作物，即由于它们经过优化的遗传“配备”，生成质量比不能耐受相当的不利发育条件的产物要好的收获产物。
本领域技术人员会认可可以通过育种入包含不同转基因或非转基因基因型的其它亲本系(优选糖用甜菜植物系)中来基因渗入本发明的转基因基因型。此不同转基因或非转基因基因型可以是任何基因型，但是优选包含至少一种感兴趣的性状的基因型。例如，可以将包含本发明转基因基因型的糖用甜菜近交物与包含对已知感染糖用甜菜植物的不同病毒有抗性的事件的转基因基因型的糖用甜菜近交系杂交。所得的种子和后代植物会以叠加形式具有延迟的抽苔的性状和抗性性状。例如，可以将具有本发明转基因基因型的糖用甜菜近交物与包含草甘膦抗性H7-1事件的转基因基因型的糖用甜菜近交物(欧洲专利申请EP-Al-1597373，通过提及而将其收入本文)杂交。所得的种子和后代植物具有抗性性状和延迟的抽苔的性状两者。也可以使用别的性状，如除草剂抗性、疾病抗性或对病毒(即如例如转基因形式或来自常规来源(如冬青属(Holly)或C48)的BNYVV的病毒或与BNYVV不同的病毒)的抗性来与本发明的转基因基因型叠加。会进一步认可的是，可以与本发明的转基因基因型进行其它组合或叠加，并且如此这些例子不应视为限制性的。
本领域技术人员还会认可可以用各种种子处理化学品(包括各种杀虫剂和杀昆虫剂)处理包含本发明转基因基因型的转基因糖用甜菜种子以进一步提升本发明的抗性。
可以使用本领域公认的育种技术在任何糖用甜菜近交物或杂种中基因渗入本发明的转基因基因型。植物育种的目的是在单一品种或杂种中组合多种想要的性状。对于大田作物，这些性状可以包括对昆虫和疾病(例如衍生自常规的来源，包括但不限于冬青属和C48)的抗性、对除草剂的耐受性、对热和干旱的耐受性、较大的产率、和较好的农艺学质量。通过许多作物的机械收获，植物特征诸如萌发和直根建立、生长率、成熟、和根大小的一致性是重要的。
在另一方面，本发明提供了一种用于生成杂种种子的方法，具有延迟抽苔的表型的糖用甜菜植物来自所述杂种种子。所述方法包括：(a)提供具有延迟抽苔的表型的糖用甜菜系，特别地依照本发明的转基因糖用甜菜植物作为第一亲本系，(b)提供具有不同基因型的第二糖用甜菜系作为第二亲本系；(c)容许步骤(a)的第一亲本系的植物和步骤(b)的第二亲本系的植物彼此传粉，让所述种子形成，并收获所述杂种种子；其中收获的杂种种子是具有延迟抽苔的表型的糖用甜菜杂种植物的种子。在此方面的一个实施方案中，步骤(a)中所提供的第一亲本系是包含本发明的一种或多种或所有多核苷酸的近交糖用甜菜系。在此方面的一个别的实施方案中，所述第二亲本系选自下组：(a)对至少一种影响糖用甜菜的病毒诸如例如甜菜坏死黄脉病毒有抗性的近交糖用甜菜植物系；(b)对至少一种除草剂有抗性的近交糖用甜菜植物系；和(c)具有对至少一种疾病的抗性的近交糖用甜菜植物系。影响糖用甜菜的常见病毒和疾病和针对这些病毒或疾病的抗性的来源的例子是本领域技术人员已知的。此外，对糖用甜菜使用的除草剂和针对这些除草剂的抗性的来源也是本领域技术人员已知的。
已经自花传粉并为许多世代选择类型的植物在几乎所有基因基因座处变为纯合的，而且产生真实育种后代的一致群体。两种不同纯合品系之间的杂交产生在许多基因基因座上可以为杂合的杂种植物的一致群体。在许多基因基因座处各为杂合的两种植物的杂交会产生在遗传上不同且不会是一致的杂种植物的群体。
本领域中已知的且在糖用甜菜植物育种程序中使用的植物育种技术包括但不限于轮回选择、回交、谱系育种、限制性长度多态性增强的选择、遗传标志增强的选择和转化。糖用甜菜植物育种程序中糖用甜菜杂种的开发一般需要纯合近交系的开发、这些品系的杂交、和评估所述杂交。使用谱系育种和轮回选择育种方法来从育种群体开发近交系。糖用甜菜植物育种程序将来自两种或更多种近交系或多种其它种质来源的遗传背景组合成育种集合，通过自交和选择想要的表型自所述育种集合开发新的近交系。将新的近交物与其它近交系杂交，并评估来自这些杂交的杂种以测定那些中哪些具有商业潜力。如糖用甜菜植物育种程序中实施的植物育种和杂种开发是昂贵且费时的方法。
谱系育种以两种基因型的杂交开始，所述基因型的每一种可以具有另一种中缺乏的或互补另一种的一种或多种想要的特征。若两种初始亲本不提供所有想要的特征，则可以将其它来源包括入育种种群中。在谱系方法中，在连续世代中对卓越植株进行自交并选择。在随后的世代中，杂合条件由于自花传粉和选择而为同质系(homogeneous line)所代替。通常，在育种的谱系方法中，实施5个或更多个世代的自交和选择：F1→F2；F2→F3；F3→F4；F4→F5；等等。
可以使用轮回选择育种(例如回交)来改善近交系和使用那些近交物生成的杂种。可以使用回交来将特定的想要性状从一种近交物或来源转移至缺乏所述性状的近交物。这可以如下实现，即例如首先将卓越的近交物(轮回亲本)与供体近交物(非轮回亲本)杂交，所述供体近交物携带适合于所讨论性状的基因。然后将此杂交的后代返回与卓越的轮回亲本配对，接着对所得的后代选择要自非轮回亲本转移的想要性状。通过选择想要性状的5个或更多个回交世代后，后代会在控制所转移的特征的基因座方面为纯合的，但是对于基本上所有其它基因会像卓越的亲本。然后自交最后的回交世代以给出所转移的基因方面的纯育种后代。自含有所转移的基因的近交物开发的杂种与自没有转移基因的相同近交物开发的杂交基本上相同。
也可以使用良种近交系，即纯育种、纯合近交系作为用于育种的起始材料或来源群体，自此开发其它近交系。可以使用较早所描述的谱系育种和轮回选择育种方法来开发自良种近交系衍生的这些近交系。作为一个例子，在使用回交育种来创建这些在糖用甜菜植物育种程序中衍生的品系时，可以使用良种近交物作为亲本系或起始材料或来源群体，而且可以充当供体或轮回亲本。
单杂交杂种源自于两种近交系的杂交，所述近交系之每一种具有互补另一种的基因型的基因型。第一代的杂种后代称作F1。在糖用甜菜植物育种程序中的商业杂种开发中，仅寻求F1杂种植物。优选的F1杂种比其近交亲本更茁壮(vigorous)。可以在许多多基因性状中显示此杂种活力或杂合优势，包括增加的营养生长和增加的产率。
糖用甜菜植物育种程序中糖用甜菜杂种的开发牵涉三个步骤：(1)从多种种质集合选择植物来进行初始育种杂交；(2)自交自育种杂交选定的植物达数个世代以产生一系列近交系，它们虽然彼此不同，但是准确育种而且是高度一致的；并(3)将选定的近交系与不同近交系杂交以产生杂种后代(F1)。糖用甜菜中的近交方法过程中，品系的活力降低。活力在杂交两种不同近交系以产生杂种后代(F1)时恢复。近交系的纯合性和同质性的重要结果是限定近交物对之间的杂种总会是相同的。一旦已经鉴定出给出卓越杂种的近交物，可以无限地繁殖杂种种子，只要近交亲本的同质性得到维持。
在杂交两种近交系以产生F1后代时产生单杂交杂种。自成对杂交的四种近交系(AXB和CXD)产生双杂交杂种，然后再次杂交两种F1杂种(AXB)X(CXD)。自三种近交系产生三系杂交杂种，其中杂交所述近交系的两种(AXB)，然后将所得的F1杂种与第三近交系杂交(AXB)XC。由F1杂种展现出的大量杂种活力在下一世代(F2)中丧失。因此，来自杂种的种子不用于定植苗(planting stock)。
在杂种种子生成中，消除或灭活雌性亲本的花粉生成是优选的。不完全除去或灭活花粉提供自花传粉的潜力。可能无意收获这种疏忽地自花传粉的种子并与杂种种子包装在一起。一旦种植种子，有可能鉴定并选择这些自花传粉的植物。这些自花传粉的植物会在遗传上相当于用于生成杂种的雌性近交系。典型地，这些自花传粉的植物可以由于其降低的活力而鉴定和选择。雌性自交通过其在生长和/或生殖特征方面活力较小的外观来鉴定。也可以经由分子标志分析来实现这些自花传粉的品系的鉴定。
然而，存在简单且有效的传粉控制系统，其通过在商业杂种种子生产中排除自花传粉来确保利用杂种优势。若亲本之一是自交不亲和的(SI)、细胞质雄性不育(CMS)或细胞核雄性不育(NMS)植物，其不能自花传粉或不能产生花粉，则只会发生杂交传粉。通过消除杂交中一个亲本品种的花粉，植物育种人员确信获得一致质量的杂种种子，只要亲本是一致质量的，并且育种人员进行单杂交。细胞质雄性不育(CMS)是母体遗传现象，其遗传决定子位于细胞质细胞器，即线粒体的基因组中。此类植物在其产生功能性花粉粒的能力上受到严重损害。CMS系统的恢复系基因是显性核基因，其抑制细胞质的雄性不育效果。CMS植物中雄性不育的表达是隐性核基因与雄性不育特异性胞质基因组之间的不相容性的结果。
在一个优选的实施方案中，应用CMS系统以产生本发明的杂种糖用甜菜植物。在此类系统中，使用雄性不育CMS系作为雌性亲本，其由作为雄性亲本使用的雄性能育系传粉。依照本发明的延迟抽苔的性状可以存在于CMS雄性不育(雌性)亲本系或雄性能育(雄性)亲本系或者甚至两者中。优选地，在雄性不育侧保持延迟抽苔的性状以避免经由由雄性亲本脱落的含有该性状的花粉引起的GM污染。
如本领域技术人员容易显而易见的，上文仅是那些期望将本发明的转基因基因型基因渗入其它糖用甜菜系中的人可获得本发明近交物的多种方式中的一些。其它手段是本领域技术人员可获得的和已知的，并且上述例子仅是例示性的。
一般地，用于杂种生成的第二亲本系也可以是具有延迟抽苔的表型的糖用甜菜植物系，如例如本发明的糖用甜菜植物。优选地，用于生成杂种种子的第一亲本系和第二亲本系基于遗传上多种多样的背景。遗传距离可以通过使用分子标志测量，如例如记载于Knaak(1996)的。然而，第二亲本系也可以是糖用甜菜近交物，其包含感兴趣的另一性状，如例如但不限于草甘膦抗性的(例如含有H7-1事件，如欧洲专利申请EP-A1-1597373中所描述的，通过提及而将其收入本文)。所得的杂种种子会含有延迟的抽苔和除草剂草甘膦的叠加性状。第二亲本系中还可以包含别的性状，如除草剂抗性、疾病抗性或针对来自常规来源(如冬青属或C48)的BNYVV或与BNYVV不同的病毒的抗性以在杂种种子中与本发明的转基因基因型叠加。会进一步认可可以与本发明的转基因基因型进行其它组合或叠加，并且如此这些例子不应视为限制性的。
本发明的另一个优选的实施方案涉及具有延迟抽苔的表型的糖用甜菜植物的杂种种子。在本发明的一方面，所述杂种种子是通过本发明的用于生成具有延迟抽苔的表型的糖用甜菜植物的糖用甜菜杂种种子的方法生成的。此类方法是本领域技术人员已知的。在本发明的又一方面，提供了具有延迟抽苔的表型的杂种糖用甜菜植物，其是通过种植本发明的杂种种子生成的。优选地，此杂种植物完全不抽苔，即显示对春化响应的完全抑制。本发明的进一步优选的实施方案涉及本发明所述杂种糖用甜菜植物的一部分。优选地，所述部分选自下组：种子、胚、小孢子、合子、原生质体、细胞、胚珠、花粉、直根、子叶、提取物或样品。
依照本发明的另一方面，提供了检测生物学样品中本发明的核酸序列或嵌合构建体的存在的方法。所述方法包括：(a)将包含DNA的样品与引物对接触，所述引物对在用于与来自携带本发明核酸序列或嵌合构建体的糖用甜菜的基因组DNA的核酸扩增反应时产生诊断本发明糖用甜菜的扩增子；(b)实施核酸扩增反应，由此生成扩增子；并(c)检测所述扩增子。可以通过本领域中公知的任何手段(包括但不限于荧光的、化学发光的、放射线学的、免疫学的等)来进行扩增的检测。在意图使用杂交作为用于扩增特定序列以生成扩增子的手段的情况中，意图通过本领域中公知的任何手段的扩增子生成和检测指示与一种靶序列(其中利用一种探针或引物)，或者多种序列(利用两种或更多种探针或引物)的预期杂交。
进一步涵盖用于生产糖的方法，其中加工本发明的糖用甜菜植物、或其细胞或组织、生物学样品或提取物以生产糖。此外，本发明提供了糖，其是通过本发明的生产糖的方法生产的。用于生产糖的方法可以是本领域技术人员已知的用于生产糖的任何常规方法。
另一个优选的方面涉及一种用于生产一种或多种选自下组的生物燃料的方法：乙醇、沼气和/或生物柴油，其通过加工本发明的转基因糖用甜菜植物、或其细胞或组织、或生物学样品或提取物以生成一种或多种生物燃料来进行。生物燃料可以是通过植物材料的需氧或厌氧发酵生成的任何生物燃料。通过需氧发酵获得的生物燃料的非限制性例子是生物乙醇。可以通过厌氧发酵获得的生物燃料包括但不限于沼气和/或生物柴油。需氧和/或厌氧发酵的方法是本领域技术人员已知的。本发明进一步涵盖选自下组的生物燃料：乙醇、沼气和/或生物柴油，如通过本发明的用于生产一种或多种生物燃料的方法所生成的。
在另一个优选的方面，本发明提供了多核苷酸标志物，其在B基因座处或极其接近B基因座处，特别地在标志物MP0176和GJ01上游1cM距离处定位，而且与标志物GJ131共分离(
Figure BPA00001272851400501
S.等，2004；Gaafar R.M.等，2005)(图5)。
本发明进一步涉及糖用甜菜基因组中鉴定的多核苷酸标志物，包括其变体和衍生物，所述多核苷酸标志物是基于核酸序列开发的，所述核酸序列可获自糖用甜菜中显示与抽苔基因(B基因)相关表型完美共分离的基因组DNA区，且其中所述标志物容许区分一年生与二年生基因型或展现出二年生或一年生表型的糖用甜菜植物的植物分组内的不同单元型。在一个优选的实施方案中，本发明的多核苷酸标志物具有自本发明的和如上文所描述的一种或多种核酸序列可获得的核酸序列。优选地，本发明的多核苷酸标志物进一步包含一个或多个多态性，特别是基于SNP、SSR、或至少一个核苷酸的缺失或插入的多态性，但是特别是基于SNP的多态性，该多态性诊断B基因座处的B等位基因。优选地，此类多核苷酸标志物能够检测本文中列为SEQ ID NO：8的所述基因组序列的不同等位基因中存在的和表7-1(图10中进一步描绘的)和表7-2(图10中进一步描绘的)中所显示的多种SNP的至少一种，其中所述多核苷酸标志物能够区分不同等位基因，特别地区分一年生和二年生糖用甜菜系。在一个优选的实施方案中，本发明的多核苷酸标志物能够检测至少一种选自下组的SNP，该组包括列为SEQ ID NO：8的序列的位置#224、#351、#615、#897、#1082、#1841、#1915、#2334、#11592、#12316、#12490、或#12544处的和如表7-1(图10中进一步描绘的)和表7-2(图11中进一步描绘的)中所显示的SNP。本发明的别的方面涉及一组多核苷酸标志物，其包含本发明的和上文所描述的众多多核苷酸标志物。在此上下文中，术语“众多”指一组超过一个的多核苷酸标志物，其优选地由两种、三种或更多种标志物组成。
在本发明的一方面，可以开发并使用本文中没有明确公开的标志物或甚至还要鉴定的标志物。基于本申请中所提供的信息，对于技术人员会有可能鉴定或开发本文中没有明确公开的但是在遗传学上与抽苔基因或B基因紧密连锁的，或优选地位于抽苔基因或B基因内的或与本文中所公开的标志物连锁的标志物。技术人员知道其它标志物可以在筛选测定法和标志物辅助选择中提供至少相等的效用。
例如，可开发基于自测序PCR产物(其是自一年生和二年生植物扩增的)表征的SNP的分子标志物，优选终点
Figure BPA00001272851400511
。在这里，会实施数次PCR扩增，以覆盖所述基因的完整序列。然后在不同一年生和二年生遗传背景内测试新的分子标志，以评估分子测试的稳健性。
在一个实施方案中，分子标志是通过PCR扩增的DNA片段，例如SSR标志物或RAPD标志物。在一个实施方案中，扩增DNA片段的存在或缺失指示性状自身的或该性状的特定等位基因的存在或缺失。在一个实施方案中，扩增DNA片段的长度差异指示性状的特定等位基因的存在，并如此能够区分性状的不同等位基因。
在本发明的一个具体实施方案中，使用简单序列重复(SSR)标志物来鉴定亲本植物和/或其祖先，以及自所述亲本植株杂交产生的后代植株中的本发明相关等位基因。
本领域技术人员知道可利用的数种别的方法或办法，它们能用于鉴定和/或开发与B基因区连锁不平衡的和/或与B基因区连锁的和/或位于B基因区中的标志物，以及呈现负责二年生基因型的实际原因突变的标志物。本领域技术人员知道的办法包括但不限于：
-在杂交办法中使用已公开的序列/标志物来鉴定感兴趣区域中的其它序列：本文中公开的引物序列和/或能使用本文中公开的引物序列测定的标志物/基因序列(或其部分)可用作(杂交)探针，用于自基因组核酸样品和/或RNA或cDNA样品或样品合并物分离标志物侧翼的和/或与B基因区连锁的和/或与B基因区有关的和/或对B基因区特异性的核酸序列/基因(例如筛选基因组资源，像BAC文库或gDNA或cDNA文库筛选)；
-在PCR办法中使用已公开的序列/标志物来鉴定感兴趣区域中的其它序列：可使用本文中公开的引物序列和/或标志物/可使用本文中公开的引物序列测定的(候选)基因序列(或其部分)作为(PCR)扩增引物自基因组核酸样品和/或RNA或cDNA样品或样品合并物扩增QTL区侧翼的和/或与QTL区连锁的和/或与QTL区有关的和/或对QTL区特异性的核酸序列/基因，所述样品是或不是自特定植物组织和/或在植物特定处理后且自糖用甜菜或原则上具有足够同源性的任何其它生物体分离的；
-在PCR办法中使用已公开的序列/标志物来鉴定感兴趣区域中的其它序列：在为标志物序列设计内部引物并用于进一步测定B基因区内的和/或与所述性状遗传连锁的和/或有关的别的侧翼序列/基因后，能测定一种或多种标志物的核苷酸序列/基因；
-在作图和/或比较作图办法中使用已公开的序列/标志物来鉴定同一区域中的标志物(在其它图上定位B基因)：基于本文中公开的位置信息和/或标志物信息，可通过遗传作图办法，最终(如果早就需要的话)通过在(高密度)遗传图和/或集成遗传或共有图上定位已公开标志物(通过遗传作图或基于各图间共有标志物的外推)，鉴定任何类型的标志物。可鉴定和/或获得与已公开标志物和/或B基因区遗传连锁的和/或位于已公开标志物和/或B基因区附近的早就知道的标志物和/或新的标志物，并最终用于B基因(精细)作图和/或B基因克隆和/或MAS育种应用；
-在“计算机”办法中使用已公开的序列/标志物来鉴定B基因区中的别的序列/标志物/(候选)基因：可以在“计算机”方法中使用本文中公开的引物序列和/或可使用本文中公开的引物序列或基于连锁标志物测定的标志物/(候选)基因序列(或其部分)来对序列或蛋白质数据库(例如BLAST)搜索与本文所述性状遗传连锁的和/或与本文所述性状有关的和/或位于B基因区中的(别的)侧翼和/或同源序列/基因和/或等位基因多样性(基因组和/或cDNA序列二者或甚至蛋白质，二者都源自辣椒和/或任何其它生物体)；
-在物理作图办法(在物理图或基因组序列上定位B基因)中使用已公开的序列/标志物：可以在原则上具有足够同源性的任何生物体的物理图和/或(完整)基因组序列上定位本文中公开的引物序列和/或可使用本文中公开的引物序列或使用与本文中公开的标志物遗传连锁的和/或位于B基因区中的其它标志物测定的标志物/基因序列(或其部分)来鉴定在B基因(精细作图)和/或B基因克隆和/或MAS育种应用中可应用的(候选)序列/标志物/基因；
-使用已公开的序列/标志物在其它(物理)图或基因组上定位B基因(物种间)：可以在比较基因组或syntheny作图办法中使用本文中公开的引物序列和/或可使用本文中公开的引物序列测定的标志物/基因序列(或其部分)来鉴定同系物区和同系物和/或直向同系物序列/与B基因区遗传连锁的和/或位于B基因区中的且在B基因(精细作图)和/或B基因克隆和/或MAS育种应用中可应用的(候选)基因；
-使用已公开的序列/标志物来选择适宜的个体，容许通过遗传办法鉴定感兴趣区域中的标志物：可使用本文中公开的引物序列和/或标志物来选择具有不同/对比B基因等位基因的个体。可使用遗传关联办法(geneticassociation approach)和/或大批分离子分析(bulk segregant analysis，BSA；Michelmore等，1991)来鉴定特定感兴趣区域(B基因区)中的和/或与所述性状关联的或遗传连锁的标志物/基因；或
-使用已公开的信息来搜索(位置)候选基因：可使用已公开的信息来鉴定位置和/或功能候选基因，其可以与所描述的性状相关和/或遗传连锁。
在本发明的另一个具体实施方案中，使用基于单核苷酸多态性的标志物来鉴定亲本植物和/或其祖先，以及自所述亲本植株杂交产生的后代植株中的本发明相关等位基因。
糖用甜菜的商业性种子生产大多在法国南部和意大利北部进行。在这两个地区，一年生杂生甜菜的存在能在种子生产中引起花粉污染，导致商业性种子中有一年生植物。这是客户不能接受的，而且因此在收获种子后立即在没有野生甜菜的地区(诸如阿根廷)种植所有批次的商业性种子。不对植物春化，而且通过利用抽苔者的存在来鉴定污染有一年生植物的种子批次。
因此，依照本发明的多核苷酸标志物可用于各批商业性种子的质量控制(这通过对商业性二年生糖用甜菜种子筛选一年生污染物来进行)及在育种程序中鉴定一年生植物/二年生植物(这使用一年生性状来加速育种过程，或在一起引入一年生性状与遗传变异新来源时)。
如此可开发基于依照本发明的且如本文中所描述的基因序列的不同测定法，并用于对植物材料筛选一年生等位基因的存在或缺失。
过去，已经开发了能用于遗传作图、基因克隆、标志物辅助植物育种及用于基因组指纹术和调查遗传关系的分子标志技术。遗传标志物基于基因组区域的核苷酸序列中的DNA多态性开发，而且能通过限制酶或依靠两个引发位点来检测。
有数种类型的分子标志物可用于基于标志物的选择，包括限制性片段长度多态性(RFLP)、多态性DNA的随机扩增(RAPD)、扩增限制性片段长度多态性(AFLP)、简单序列重复(SSR)和多核苷酸多态性(SNP)。
不同类型标志物的信息内容可以是不同的，这取决于用于获得标志物数据的方法和关于标志物评分的群体。例如，并非总是可能区分在纯合条件中存在的基因组片段与杂合片段。在杂合群体中，像F2，共显性标志物(像限制性片段长度多态性)(RFLP，Botstein等，1980)和共显性评分的扩增片段长度多态性(AFLP，Vos等，1995)产生比显性标志物(像随机扩增多态性DNA)(RAPD，Welsh和McCleland，1990)和显性评分的AFLP要多的信息。RFLP是共显性的，而且能够鉴定独特基因座。RFLP涉及使用限制酶在特定短限制性位点(源自重复或位点间缺失或限制性位点处突变的多态性)处切割染色体DNA。
AFLP要求用限制酶消化细胞DNA，之后使用PCR和引物中的选择性核苷酸来扩增特定片段。凭借此方法，可测量多至100个多态性基因座，而且每项测试只要求相对较少的DNA样品。
用于实现跨越植物基因组多态性区域的核苷酸片段的此类扩增的最优选方法采用聚合酶链式反应(“PCR”)(Mullis等，1986)，其使用包括能够与以双链形式限定多态性的近端序列杂交的反向引物和正向引物的引物对。
与RFLP不同，基于PCR的技术只要求少量(大约10％)的DNA作为模板通过PCR扩增生成大量的靶序列。
一种此类基于PCR的技术是RAPD，其利用低严格性聚合酶链式反应(PCR)扩增，使用具有任意序列的单一引物来生成无名DNA片段的株特异性种类。该方法只要求很少的DNA样品，且分析大量的多态性基因座。然而，受到众多反应条件、显性方式的继承、和群体特异性影响的短引物的不可预测的表现是RAPD的主要缺点。
微卫星、或简单序列重复(SSR)、简单序列长度多态性(SSLP)、短串联重复(STR)、简单序列基序(SSM)、和序列靶微卫星(STM)代表一类广泛分布于整个真核生物基因组中的重复序列。重复数目和长度的变异是多态性的一个来源，甚至在密切相关的个体间。SSR分析基于选择性扩增的这些(短重复)序列来检测简单序列重复中的变异。此类微卫星序列可容易地使用侧翼基因座特异性寡核苷酸作为引物通过PCR来扩增，并检测DNA长度多态性(Litt和Luty，1989；Weber和May，1989)。
单一核苷酸位置处导致替代、缺失或插入的突变产生多核苷酸多态性或SNP，其在人类中每1.3kb发生一次(Cooper等，1985；Kwok等，1996)。大多数此类型多态性只具有两种等位基因，也称作双等位基因基因座。基于SNP的定位克隆可加速疾病性状和有效量生物学信息突变的鉴定(Wang等，1998)。
可使用有效选出点突变的PCR延伸测定法来检测SNP。该规程只要求每份样品少量DNA。使用PCR进行的SNP检测测定法的三种广泛使用的类型是切割扩增多态性序列(cleaved amplified polymorphic sequences，CAPS)(Konieczny和Ausubel，1993；Thiel等，2004)、衍生CAPS(dCAPS)(Michaels和Amasino，1998；Neff等，1998)、和单链构象多态性(single strand conformaionpolymorphism，SSCP)(Orita等，1989)。
CAPS多态性指由SNP或INDEL引起的限制性片段长度差异，其是通过由基因座特异性寡核苷酸引物生成的PCR扩增子中的限制性内切核酸酶识别位点创建或消除的。如下实施CAPS测定法，即用一种或多种限制酶消化基因座特异性PCR扩增子，然后在琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶上将经过消化的DNA分开。
dCAPS是CAPS技术的改良，通过利用错配的PCR引物，其容许检测大多数单核苷酸变化。使用该方法时，通过含有一处或多处相对于模板DNA的错配的引物，将包含SNP的限制酶识别位点引入PCR产物。然后对以此方式修饰的PCR产物进行限制酶消化，并通过所得限制性样式确定SNP的存在或缺失。
SSCP技术在非变性凝胶上将变性双链DNA分开，并如此容许单链DNA的二级结构及分子量决定凝胶泳动率。
ARMS(扩增不应性突变系统)-PCR观程(Ye等，2001)涉及使用单一PCR来进行SNP基因分型(Fan等，2003；Chiapparino等，2004)。使用四引物(采用两对引物)在单一PCR反应中扩增SNP的两种不同等位基因。
可采用备选方法来扩增此类片段，诸如“连接酶链式反应”(“LCR”)(Barany，F.，1991)，其使用两对寡核苷酸探针来指数扩增特定靶物。每对寡核苷酸的序列选择成容许该对与靶物同一条链的相邻序列杂交。所述杂交为模板依赖性连接酶形成底物。与PCR一样，所得产物如此在后续循环中充当模板，并且获得期望序列的指数扩增。
可以用具有多态性位点同一条链的近端和远端序列的寡核苷酸实施LCR。在一个实施方案中，任一寡核苷酸设计成包含多态性的实际多态性位点。在这样的一个实施方案中，反应条件选择成使得所述寡核苷酸只能在靶分子含有或缺少与所述寡核苷酸上存在的多态性位点互补的特定核苷酸的情况中连接到一起。或者，寡核苷酸可以选择成使得它们不包含多态性位点(参见Segev，PCT申请WO 90/01069)。
可采用的另一种方法是“寡核苷酸连接测定法”(“OLA”)(Landegren等，1988)。OLA方案使用设计成能够与靶物单链上的相邻序列杂交的两种寡核苷酸。像LCR一样，OLA特别适合于点突变的检测。然而，与LCR不同，OLA导致靶序列的“线性”而非指数扩增。
Nickerson等，1990记载了组合PCR和OLA属性的核酸检测测定法(Nickerson等，1990)。在此方法中，使用PCR来实现靶DNA的指数扩增，然后使用OLA进行检测。在需要多个分开的加工步骤之外，与此类组合有关的一个问题是它们继承了与PCR和OLA有关的所有问题。
基于在存在具有所得“二寡核苷酸”序列的核酸的情况中两个(或更多个)寡核苷酸的连接由此扩增二寡核苷酸的方案也是已知的(Wu和Wallace，1989)，而且可容易地适应本发明的目的。
在本发明的又一个实施方案中，使用基于至少一个核苷酸的缺失或插入(“INDEL”)的标志物来鉴定亲本植物和/或其祖先，以及自所述亲本植株杂交产生的后代植株中的本发明相关等位基因。可以基于依照本发明的和如上文所述的多核苷酸的序列来开发这些标志物。
具体地，依照本发明的标志物可用于等位区分测定法，特别地用于区分展现出二年生基因型的糖用甜菜植株的植物分组内的不同单元型的测定法。所述测定法基于一组探针多核苷酸，其包含与例如通过PCR扩增可获得的BvPRR7基因的亚区域互补的两种不同探针分子，所述PCR扩增基于如分别在SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14中给定的正向引物PRR7(T1)-F和反向引物PRR7(T1)-R，所述探针分子仅相差一个碱基错配，并且是探针PRR7(T1)-VIC(SEQ ID NO：15)和PRR7(T1)-FAM(SEQ ID NO：16)。进一步优选的组是与探针PRR7(T6)-VIC(SEQ ID NO：51)和PRR7(T6)-FAM(SEQ ID NO：52)一起的如SEQ ID NO：49中所描述的正向引物PRR7(T6)-F和如SEQ ID NO：50中所描述的反向引物PRR7(T6)-R，以及与探针rr22(T1)-VIC(SEQ ID NO：57)和1r22(T1)-FAM(SEQ ID NO：58)一起的如SEQ ID NO：55中所描述的正向引物1r22(T1)-F和如SEQ ID NO：56中所描述的反向引物1r22(T1)-R。
优选地，此类测定法(其中采用一组探针多核苷酸)包含至少两种不同探针分子，其相差至少一种错配(one mismatch)，特别地相差位于相邻位点处的两个或更多个错配，但是特别地相差一个单错配，其中第一探针分子，特别地经标记的探针分子，更特别地用第一荧光染料和猝灭剂标记的探针分子代表一种等位基因，而第二探针分子，特别地经标记的探针分子，更特别地用第二荧光染料和猝灭剂标记的探针分子(其与第一染料不相同)代表另一等位基因，且其中使用所述探针多核苷酸组来区分两种等位变体。可以采用另外两种不同的荧光标记物，其荧光可以容易区别。例如，用第一荧光染料(如例如FAM)标记第一探针，而用第二荧光染料(如例如VIC)标记第二探针。在本发明的此类测定法的一个优选的实施方案中，另外用包含对二年生等位基因特异性的序列的经第二荧光标记的探针分子探查上文所描述的本发明等位区分测定法的步骤b)中所获得的扩增片段。在此测定法中，第一探针的染料荧光升高仅指示一年生等位基因的存在。此测定法中所使用的两种染料优选是VIC和FAM。一般地，本发明的测定法优选地采用两种引物(即一对依照本发明的引物)和至少一种针对一年生等位基因的探针。可以进一步采用第二探针，其是针对二年生等位基因的探针。
在本发明的另一方面，提供了如下的方法，其牵涉可以特异性区分一年生植物和二年生植物，并且如此可以用于例如种子批次的质量控制的标志物。
具体地，本发明涉及一种测定法，该测定法基于一组探针多核苷酸，其包含与例如通过PCR扩增可获得的BvPRR7基因的亚区域互补的两种不同探针分子，所述PCR扩增基于如分别在SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14中给定的正向引物PRR7(T1)-F和反向引物PRR7(T1)-R，所述探针分子仅相差一个碱基错配，并且是探针PRR7(T1)-VIC(SEQ ID NO：15)和PRR7(T1)-FAM(SEQID NO：16)。进一步优选的组是与探针PRR7(T6)-VIC(SEQ ID NO：51)和PRR7(T6)-FAM(SEQ ID NO：52)一起的如SEQ ID NO：49中所描述的正向引物PRR7(T6)-F和如SEQ ID NO：50中所描述的反向引物PRR7(T6)-R，以及与探针rr22(T1)-VIC(SEQ ID NO：57)和1r22(T1)-FAM(SEQ ID NO：58)一起的如SEQ ID NO：55中所描述的正向引物1r22(T1)-F和如SEQ ID NO：56中所描述的反向引物1r22(T1)-R。
在另一方面，本发明提供了一种用于在商业种子中鉴定一年生污染物的方法。优选地，此方法包括使用本发明的和本文中所描述的基于标志物的等位区分测定法。
以下实施例仅意图例示本发明的一个或多个优选的实施方案，并且不应解释为限制本发明的范围。
实施例
以下实施例提供了例示性实施方案。根据本公开内容和本领域一般技术水平，技术人员会领会以下实施例意图仅作为例示性的，而且可采用众多变化、改良、和改变而不背离当前要求保护的主题的范围。
实施例1：糖用甜菜PRR7基因的表征
实施例1.1：来自糖用甜菜的推定PRR7同系物的定位
基于用于鉴定和表征糖用甜菜中推定抽苔控制基因的候选基因方法，凭借使用BLAST进行的同源性搜索将编号CV301305的EST序列鉴定为PRR7的推定甜菜同系物。SEQ ID NO：1显示了EST CV301305的核苷酸序列。相应的氨基酸序列显示了假应答调控物接受者(PRR，pfam00072)或信号接受者(REC，cd00156)域的部分存在(图1)，其是在昼夜节律钟中都起关键作用的PRR基因家族的一种标志(Nakamichi等，2005)。图2显示了CV301305与其最密切的拟南芥同系物PRR7的氨基酸序列比对，后者已经被描述成温度敏感性昼夜节律系统的一个成分(Nakamichi等，2007；Salomé和McClung 2005)。已知昼夜节律钟在植物中控制数个发育过程，包括开花时间控制(Imaizumi和Kay，2006；Zhou等，2007)。
基于上述观察结果，使用拟南芥PRR7基因(分别为AT5G02810和NM 120359)与BvPRR7糖用甜菜EST(CV301305)基因组序列和mRNA之间的比对，推导部分甜菜PRR7片段的推定基因结构，这揭示了数个推定内含子区的存在(图3)。在使用基因组甜菜DNA作为模板时，涵盖第三推定内含子区的引物PRR7-F和PRR7-R(SEQ ID NO 2和3)产生大约0.5kb的扩增产物。用于扩增反应的PCR条件如下：初始变性95℃5分钟，接着35个扩增循环30秒95℃、30秒60℃和30秒72℃，再接着5分钟72℃。在来自AppliedBiosystems Inc.的GeneAMP PCR系统9600仪器上使用来自InvitrogenCorporation的铂Taq DNA聚合酶和相应反应混合物如供应商所推荐的那样运行PCR实验。对PCR产物的序列分析得以重建BvPRR7基因片段内含子3周围的基因组序列，并证实了长度为296碱基对的内含子的存在(SEQ ID NO 4)。
在一组(包括15种二年生和1种一年生系)糖用甜菜亲本系间对BvPRR7基因的基因组片段扩增和测序。所有二年生系展现BvPRR7单态性，因为只观察到两种不同单元型：一种二年生等位基因和一种一年生等位基因(表1)。为了在对一年生习性分离的群体中定位BvPRR7，开发了一种使用端点
Figure BPA00001272851400591
技术靶向第160位SNP(SEQ ID NO 4)的测定法。表2总结了为靶向第160位SNP的PRR7(T1)
Figure BPA00001272851400592
测定法设计的引物和探针的核苷酸序列；依照制造商的推荐，该反应体系进一步包括来自Applied Biosystems Inc.的
Figure BPA00001272851400593
通用PCR大师级混合物，No
Figure BPA00001272851400594
UNG(2X)。使用ABIPRISM 7700序列检测仪仪器，如下实施PCR扩增：95℃10分钟，接着40个循环95℃15秒和60℃1分钟。使用序列检测系统(Sequence Detection System)2.0软件实施端点测量。
表1：在1种一年生和15种二年生糖用甜菜系之间对跨越内含子3的BvPRR7基因片段观察的多态性。
 SEQ ID NO 4：位置   87   160   406
 单元型#1   T   T   G   一年生
 单元型#2   C   C   A   二年生
标题行(header row)标示BvPRR7基因片段的基因组序列(如SEQ ID NO：4中所描述的)处的核苷酸位置。标题为“单元型#1”和“单元型#2”的行表示一组16种品系间观察的2种单元型。
表2：与用于SNP#160基因分型的TaqMan测定法PRR7(T1)对应的引物和探针的核苷酸序列
  前体名称   核苷酸序列(5’至3’)   SEQ ID NO：
  PRR7(T1)-   GAGGTGTCACAGTGTAAGTGTCT   13
  PRR7(T1)-R   AAAGACTGCTACACGAACCACTAAG   14
  PRR7(T1)-FAM   FAM-CTGATGAAAAGCTG-MGB-NFQ   16
  PRR7(T1)-VIC   VIC-CTGATGGAAAGCTG-MGB-NFQ   15
使用上述PRR7(T1)测定法，在自一年生系与对第160位SNP而言多态性的二年生系之间的杂交衍生的198个个体的F2群体中定位了BvPRR7基因。BvPRR7位于染色体II，在GJ131标志物下游大约1cM处(图4)，即已知含有关于不依赖春化的开花的B基因的一个区域(
Figure BPA00001272851400601
等，2004；Gaafar等，2005)。PRR7(T1)测定法的结果显示了B基因预测基因型与BvPRR7基因基因型之间的完全匹配。B基因的基因型是基于自个别F2植株衍生的F3群体关于不依赖春化的开花的表型评估预测的。表3总结了包含最靠近的重组事件的9个后代植株个体的B基因区细微图的图形显示。其定位位置与其与温度敏感性昼夜节律有关的生物学功能的组合(Salomé和McClung，2005)显然使得BvPRR7成为B基因的强候选物。
表3：多种标志物的基因型，包括在B基因的任一侧显示重组事件的9个F2植物间的B基因周围的PRR7(T1)定位。PRR7(T1)以及927(T2)标志物显示了与B基因的预测基因型完美匹配。B基因的基因型基于自F2植物个体衍生的F3群体的表型评估。(B-二年生等位基因；A-一年生等位基因；H-对于一年生等位基因杂合的)
Figure BPA00001272851400611
实施例1.2：BvPRR7全长基因组序列的回收
使用引物PRR7-F和PRR7-R，依靠PCR来筛选糖用甜菜BAC文库。该文库是自二年生商业性栽培种H20开发的，而且计算呈现6个基因组当量，平均插入物大小120kb(McGrath等，2004)。此文库的DNA集合由AmpliconExpress，Pullman WA销售。用于筛选DNA集合的PCR条件如下：初始变性95℃5分钟，接着35个扩增循环30秒95℃、30秒60℃和30秒72℃，再接着5分钟72℃。在来自Applied Biosystems Inc.的GeneAMP PCR系统9700仪器上使用来自Invitrogen Corporation的铂Taq DNA聚合酶和相应的反应混合物如供应商推荐的那样运行PCR实验。依照供应商的指令对DNA集合进行的关于BvPRR7片段存在情况的后续筛选导致BAC SBA079-L24的阳性鉴定。
为了获得BvPRR7基因的全长序列，将BAC SBA079-L24送往德国MWGBiotech AG，借助454测序技术进行序列分析。在必要时，通过规则Sanger测序来填充得到的毗连序列群之间的缺口，为BvPRR7基因产生一条单一基因组序列(SEQ ID NO 8)。基于该基因组序列与EST CV301305的比对及与来自拟南芥的PRR7基因的序列同源性，预测了包含内含子和外显子的甜菜BvPRR7基因的推定基因结构，如图5所示。BvPRR7的相应氨基酸序列显示于SEQ ID NO11。BvPRR7与来自拟南芥的PRR基因家族所有成员(包括TOC1(PRR1)、PRR3、PRR5、PRR7和PRR9)的氨基酸序列比对说明了氨基末端附近假应答调控物接受者(PRR)基序(pfam00072)和羧基末端处CCT基序(pfam06203)的强保守性(图6)。在来自拟南芥的PRR基因家族之外，BvPRR7还与谷类植物中的PRR7同系物共享强同源性，如图7所示系统发生树所图示的。通过对来自数种植物物种的PRR基因家族的多种成员(包括甜菜BvPRR7、拟南芥(TOC1，NP_200946；PRR3，NP_568919；PRR5，NP_568446；PRR7，NP_568107；和PRR9，NP_566085)、稻(PRR37，Q0D3B6)、大麦(PPD-H1，AAY17586)和普通小麦(PPD-D1，ABL09477))应用Neighbor-Joining方法(Saitou和Nei，1987)来进行图7中所显示的树。使用ClustalW自氨基酸序列的比对产生无根树状图，并通过MEGA4显示系统树(Tamura等，2007)。在每个分支上显示了1000次再取样的引导值(bootstraps value)。令人惊讶的是，已知谷类植物中的PRR7同系物(更多地称作Ppd)呈现光周期应答(Turner等，2005；Beales等，2007)而非春化应答的一种重大决定子，如本文关于糖用甜菜提示的。
实施例1.3：B基因座的精细定位
基于上述实施例1.1中所描述的初始定位的结果，启动较大的精细分辨率定位以使用于定位的分子标志物GJ131和GJ01周围的区域饱和，并确认B基因的预测基因型与BvPRR7基因的基因型之间的相互关系。用两种侧翼标志物GJ01(T1)和GJ131(T1)(Gaafar等，2005)分析自在一年生习性上分离的数个群体获得的总共5157个F2个体。总共鉴定出已经在两种侧翼标志物之间重组的71个F2植物。因而，在0.69cM处计算B基因的定位间隔。随后，使用上文所描述的PRR7(T1)测定法和如欧洲专利申请EP 1995320A1中所披露的可用于间隔的9_27(T2)和ED031700(T1)测定法来对重组植物基因型分型。表4汇总了设计用于GJ131(T1)、9_27(T2)、ED031700(T1)、PRR7(T1)和GJ01(T1)测定法的引物和探针的核苷酸序列；依照制造商的推荐，该反应进一步采用来自Applied Biosystems Inc.的
Figure BPA00001272851400622
通用PCR大师级混合物，No
Figure BPA00001272851400623
UNG(2X)。如下实施PCR扩增：95℃达10分钟，接着为95℃达15秒和60℃达1分钟的40个循环，其使用Applied Biosystems 7500实时PCR系统仪器进行。
表4：分别在GJ131(T1)、9_27(T2)、ED031700(T1)、PRR7(T1)和GJ01(T1)
Figure BPA00001272851400624
测定法中所使用的引物和探针的核苷酸序列。
Figure BPA00001272851400625
Figure BPA00001272851400631
自对F2植物个体(即18小时白天和6小时黑夜的长日照条件下的抽苔或非抽苔)以及通过F2植物自交获得的相应后代群体进行的表型观察推导出B基因的状态。表5提供了B基因区域的精细分辨率图的图示，其汇总了自多种重组植物获得的基因型和表型数据。所有重组体间PRR7基因的基因型与表型之间的完美相互关系容许推断甜菜PRR7同源物确实是B基因。在假设在B基因的每一侧的单一重组事件时，B基因的定位间隔现在缩短至0，02cM，其中PRR7基因在一年生习性的B基因上面共定位。
表5：B基因区域的精细分辨率图的图示。每种标志物的“A”和“B”基因型分别对应于一年生和二年生等位基因。B基因定位的间隔以两个侧翼黑色栏标示，并且基于对每个F2重组植物观察的表型。(B-二年生等位基因；A-一年生等位基因；H-在一年生等位基因上杂合的)
Figure BPA00001272851400632
Figure BPA00001272851400641
Figure BPA00001272851400651
实施例1.4：对BvPRR7的基因表达分析
为了基因表达分析，在受控环境室中于恒温18℃和分别为光周期16小时白昼/8小时黑夜(LD)或8小时光照/16小时黑暗(SD)的光周期种植来自一年生、二年生和经春化的二年生植株的幼苗。在24小时期间里每2小时收集叶片样品，并使用购自Ambion的
Figure BPA00001272851400652
-4PCR试剂盒遵照供应商的指令分离总RNA。自作为模板的1μg总RNA开始，使用
Figure BPA00001272851400653
试剂盒(Ambion)将RNA样品转变成cDNA。在实时PCR 7500系统仪器上使用Power
Figure BPA00001272851400661
Green PCR大师级混合物(Applied Biosystems Inc.)通过定量PCR(qPCR)测量BvPRR7基因的表达。PCR条件如下：初始变性95℃10分钟，接着40个扩增循环的15秒95℃和1分钟60℃。用于BvPRR7的正向和反向引物的核苷酸序列分别如下：5’-TTGGAGGAGGTGTCACAGTTCTAG-3’(SEQ IDNO：45)和5’-TGTCATTGTCCGACTCTTCAGC-3’(SEQ ID NO：46)。使用异柠檬酸脱氢酶(BvICDH)基因(AF173666)作为参照基因，将BvPRR7的表达标准化。设计用于此参照基因的引物序列组成如下：5’-CACACCAGA
Figure BPA00001272851400662
TGAAGGCCGT-3’(SEQ ID NO：47)和5’-CCCTGAAGACCGTGCCAT-3’(SEQ ID NO：48)。表达水平计算为三次生物学重复的平均值，并将每次qPCR反应重复三次。
如图8中所显示的，BvPRR7显示了所有三类植物(即一年生、二年生和经春化的二年生植物)的表达的昼夜振荡，其中峰在LD(16小时光照/8小时黑暗)和SD(8小时光照/16小时黑暗)条件下都在日出后7小时。此实验证实了BvPRR7的节律性和昼夜节律性表达，如关于大多数至今鉴定的时钟相关基因所记载的(McClung，2006)。
实施例1.5：等位基因变异性及与春化要求的关联
使用表6中提供的引物对，在一组二年生和一年生登录物(accession)间对BvPRR7基因完整编码区以及其启动子区的±1.0Kb扩增和测序。此组包含来自Svngenta种质集合的3种二年生良种系以及遍及欧洲收集的一年生和二年生野生甜菜。用于扩增的PCR条件如下：初始变性95℃5分钟，接着35个扩增循环30秒95℃、30秒60℃和30秒72℃，再接着5分钟72℃。在来自AppliedBiosystems Inc.的GeneAMP PCR系统9700仪器上使用来自InvitrogenCorporation的铂Taq DNA聚合酶和相应的反应混合物如供应商推荐的那样运行PCR实验。观察到的基因型的图形表示显示了数种一年生等位基因和2种二年生等位基因(分别参见表7-1和表7-2(还可以参见图10和图11))。数种多态性显示了对BvPRR7观察到的等位基因变异与一年生或二年生植物习性之间的强相关性。此观察结果进一步加强了糖用甜菜中BvPRR7与关于不依赖春化的开花的B基因座之间的因果关系。表7-1(图10)显示了在比较一年生和二年生等位基因时在启动子区中鉴定的多态性。从分析除去具有等位基因的杂合形式的植物系。依照SEQ ID NO：8编号表中标示的SNP位置。可以使用以星号(*)标示的核苷酸位置来区分一年生和二年生等位基因。如自表7-1(图10)可看出的，可以使用分别在启动子区的位置#11592、#12316、#12490和#12544处的SNP来区分所有一年生等位基因与二年生等位基因。表7-2(图11)中显示了比较一年生与二年生等位基因时在编码区中鉴定的多态性。再次从分析除去具有杂合形式的植物系。在表7-2(图11)中，分别依照SEQ ID NO：9和11编号SNP和氨基酸位置。可以使用以星号(*)标示的核苷酸和氨基酸位置来区分一年生和二年生等位基因。在编码区中检出的SNP中，可以使用分别在位置#224、#351、#615、#897、#1082、#1841、#1915、和#2334处的SNP来区分所有一年生等位基因与二年生等位基因。出于质量保证的目的，可以使用编码区以及启动子区中检测出的SNP之任一种或超过一种的组合来依靠靶向此一种或多种SNP的分子标志检测二年生栽培种的商业种子批次(lots)中的一年生等位基因的存在。
表6：用于对BvPRR7基因的编码区以及5’UTR区的±1Kb的扩增和测序的引物的核苷酸序列。
Figure BPA00001272851400671
表7-1：不同一年生和二年生登录物内的BvPRR7的单元型(还可参见图10)。
Figure BPA00001272851400681
表7-2：不同一年生和二年生登录物内的BvPRR7的单元型(还可参见图11)。
Figure BPA00001272851400691
实施例1.6：一年生和二年生糖用甜菜植物之间的等位区分
商业种子批次中由于杂种种子生成过程中一年生花粉流入的“抽苔者(bolter)”的存在，即携带一年生B等位基因的糖用甜菜植物代表糖用甜菜的生产和销售中的重要质量参数。对于种子生产中的质量控制，如此具有容许区分一年生和二年生植物的手段是重要的。
对于等位区分，通过采用常规的DNA分离方法自要测试的植物或种子分离DNA。然后在靶向编码区中位置#2334处的SNP的测定法中测试DNA。此测定法中所使用的核苷酸序列如下：PRR7(T6)-F：5’-GCTATC
Figure BPA00001272851400702
GGTATTCCTTCCTTTGTTT-3’(SEQ ID NO：49)、PRR7(T6)-R：5’-CTCGTGTTCGT
Figure BPA00001272851400703
GGGCAATT-3’(SEQ ID NO：50)、PRR7(T6)-VIC：5’-VIC-CTCGTACCTGGCGCAC-MGB-NTQ-3’(SEQ ID NO：51)和PRR7(T6)-FAM：5’-FAM-CTCGCACCTGGCGCAC-MGB-NFQ-3’(SEQ IDNO：52)。PCR反应进一步包括依照制造商推荐的来自Applied Biosystems Inc.的
Figure BPA00001272851400705
通用PCR大师级混合物和No
Figure BPA00001272851400706
UNG(2X)。如下实施PCR扩增：95℃达10分钟，接着为95℃达15秒和60℃达1分钟的的40个循环，其使用实时PCR 7500系统仪器进行。使用序列检测系统2.0软件来实施端点测量。若分析仅显示VIC染料荧光的实质升高，则这指明等位基因X的纯合性(即二年生等位基因的纯合性)。FAM染料荧光的本质升高仅指明等位基因Y的纯合性(即一年生等位基因的纯合性。若两种荧光信号都本质升高，则植物是杂合的(即对于B基因座具有杂合性的一年生植物)。
图9显示了一组一年生和二年生植物个体等位区分测定法的结果。
可以在此测定法中类似地使用且提供相似结果的核苷酸序列(即其容许区分一年生和二年生植物个体)如下：1r22(T1)-F：5’-GATAAATTCTGACCCGCATCACA-3’(SEQ ID NO：55)、1r22(T1)-R：5’-GGACTGAGTTGATAATAATCAACTTTCC-3’(SEQ ID NO：56)、1r22(T1)-VIC：5’-VIC-CTAGCGCAATTTC-MGB-NFQ-3’(SEQ ID NO：57)和1r22(T1)-FAM：5’-FAM-AGCTAGCGCCCAATT-MGB-NFQ-3’(SEQ ID NO：58)。
实施例2：依靠互补研究进行的BvPRR7的转基因确认
由B基因赋予的一年生植物习性表现为单一显性性状；因而二年生植物中对春化的要求是隐性的。如此，将BvPRR7的一年生等位基因转化入二年生基因型中预测将一年生开花行为赋予二年生受体基因型。如此，应当不需要春化转基因植物来诱导抽苔，因为假设BvPRR7的经转化的一年生等位基因否决需要赋予一年生习性的春化。为了验证此假说，将在一年生启动子以及终止子片段控制下的BvPRR7的一年生等位基因的编码序列转化入二年生基因型G018中。携带PMI选择标志基因和一年生BvPRR7等位基因二者的基因盒的二元载体的质粒图显示于图10。糖用甜菜转化的实验规程本质上如Chang等，2002所披露的，使用糖用甜菜分生组织作为外植体材料并使用磷酸甘露糖异构酶(PMI)基因作为选择标志。SEQ ID NO：53描述了一年生PRR7等位基因编码区的核苷酸序列(SEQ ID NO：49的核苷酸1306至3672)，在其启动子区(SEQ ID NO：49的核苷酸1至1305)下游1，3kb。对转基因枝条检查PMI活性(Joersbo等，1998)，随后生根、在土壤中盆栽并转移至温室。阴性对照由接受相同体外再生规程但不进行土壤杆菌感染和甘露糖选择的非转基因一年生和二年生糖用甜菜植物两者的枝条(shoots)组成。在生长室中种植植物，恒温18℃，光周期17小时光照和7小时暗。
在这些条件(不通过应用冷温度诱导抽苔)下，非转基因二年生对照在多至12周的观察期期间没有显示任何抽苔迹象，而一年生对照植株在6至8周内开始抽苔。与非转基因二年生对照植株相反，实质性数目的转基因植株在4-10周内开始抽苔，而且基本上表现为一年生植物，尽管它们具有二年生遗传背景。将抽苔并开花的转基因植株与二年生保持系异花授粉(cross-pollinated)以生成后代。对后代植株测试PMI活性，随后在没有春化的情况中监测抽苔和开花。这些后代植物显示1对1的分离比及PMI活性与一年生习性之间的完全相关。这些数据证实糖用甜菜中BvPRR7与不依赖春化的开花之间的因果关系。
实施例3：对BvPRR7的转基因遏制赋予抽苔抗性
既然BvPRR7在糖用甜菜中的春化应答中发挥关键作用，那么BvPRR7为通过遏制春化应答来改造抽苔抗性呈现了显而易见的候选物。为此目的，将0.6kb的BvPRR7cDNA片段(SEQ ID NO.1)装配入在来自拟南芥的组成性Ubi3启动子(Norris等，1993)控制下的RNAi盒中。通过马铃薯StLS1基因第二内含子(Eckes等，1986；Vancanneyt等，1990)将BvPRR7片段的倒置重复分开以稳定RNAi盒，而且还改进RNAi现象的效率(Wang和Waterhouse，2001；Smith等，2000)。携带BvPRR7的RNAi基因盒和PMI选择标志基因的二元载体的质粒图显示于图11。将RNAi盒转化入二年生基因型G018，并实施PMI阳性枝条的选择，如先前的实施例所述。使PMI阳性枝条和非转基因对照生根，并转移至18℃温室，最少两周的驯化期，之后进行春化处理。一旦完全确立，使转基因植物暴露于春化处理，其由14周6℃恒温和12小时低人工光照组成。在应用抽苔诱导条件前，通过将温度自10℃逐步升高至18℃，在气候室中缓慢驯化春化植株两周。随后将植株换入更大的盆(2升)，并在暴露于恒温18℃和长日照光周期17小时亮/7小时暗的同时监测抽苔。非转基因对照植株在春化后4-6周开始抽苔。遏制了BvPRR7的转基因植株频繁显示抽苔延迟，范围为只有两周至超过四个月。在温室中应用的条件下少数植株根本不显示任何抽苔习性。除抽苔和开花延迟外，转基因植株正常发育并没有显示表型畸变。一般而言，抽苔延迟的植株在抽苔时显示更高的叶片数目，原因在于延长的营养性阶段。
参考文献：
Abe J.，Guan G.-P和Shimamoto Y.，1997.A gene complex for annual habit insugar beet(Beta vulgaris L.).Euphytica 94：129-135.
Barany F.，1991.Genetic Disease Detection and DNA Amplification UsingCloned Thermostable Ligase.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88：189-93.
Batzer M.A.，Carlton J.E.和Deininger P.L.，1991.Enhanced evolutionary PCRusing oligonucleotides with inosine at the 3’-terminus.Nucleic Acids Res.19：5081.
Beales J.，Turner A.，Griffiths S.，Snape J.W.和Laurie D.A.，2007.APseudo-Response Regulator is misexpressed in the photoperiod insensitivePpd-Dla mutant of wheat(Triticum aestivum L.).Theor.Appl.Genet.115：721-733.
Botstein D.，White R.L.，Skolnick M.和Davis R.W.，1980.Construction ofgenetic linkage map in man using restriction length polymorphisms.Am.J.Hum.Genet..32：314-331.
Brunke K.J.和Wilson S.L.，1993.Brassica hsp 80 promoter.EP0559603Chang Y.-F.，Zhou H.，Dunder E.M.，Rouse S.N.，Gu W.和Boutreau E.，2002.Methods for stable transformation of plants.WO 02/14523Chiapparino E.，Lee D.和Donini P.，2004.Genotyping single nucleotidepolymorphisms in barley by tetra-primer ARMS-PCR.Genome 47：414-420.Cooper D.N.，Smith B.A.，Cooke H.J.等，1985.An estimate of unique DNAsequence heterozygosity in the human genome.Hum.Genet.69：201-205.
Eckes P.，Rosahl S.，Schell J.和Willmitzer L.，1986.Isolation and characterizationof a light-inducible，organ-specific gene from potato and analysis of itsexpression after tagging and transfer into tobacco and potato shoots.Mol GenGenet 205，14-22.
English J.J.，Mueller E.和Baulcombe  D.C.，1996.Suppression  of virusaccumulation in transgenic plants exhibiting silencing of nuclear genes.PlantCell 8：179-188.
Fan J.B.，Oliphant A.，Shen R.，Kermani B.G.，Garcia F.，Gunderson K.L.，HansenM.等，2003.Highly parallel SNP genotyping.Cold Spring Harb Symp QuantBiol 68：69-78.
Felsenstein J.，1985.Confidence limits on phylogenies：An approach using thebootstrap.Evolution 39：783-791.
Gaafar R.M.，Hohmann U.和Jung C.，2005.Bacterial artificialchromosome-derived molecular markers for early bolting in sugar beet.Theor.Appl.Genet.110，Number 6：1027-1037.
Imaizumi T.和Kay S.A.，2006.Photoperiodic control of flowering：not only bycoincidence.Trends Plant Science 11：550-557.
Joersbo M.，Donaldson I.，Kreiberg K.，Petersen S.G.，Brunstedt J.和Okkels F.T.，1998.Analysis of mannose selection used for transformation of sugar beet.MolBreeding 4：111-117.
Konieczny A.和Ausubel F.M.，1993.A procedure for mapping Arabidopsismutations using co-dominant ecotype-specific PCR-based markers，Plant J.4，pp.403-410.
Kwok P.Y.，Deng Q.，Zakeri H.，Taylor S.L.和Nickerson D.A.，1996.Increasingthe information content of STS-based genome maps：Identifying polymorphismsin mapped STSs.Genomics 31：123-126.
Landegren U.，Kaiser R.，Sanders J.和Hood L.，1988.A ligase-mediated genedetection technique.Science 2414869，第1077页-第1080页.
Litt M.和Luty J.A.，1989.Hypervariable microsatellite revealed by in-vitroamplification of a dinucleotide repeat in the cardiac muscle actin gene.Am JHum Genet 44：397-401.
McClung C.R.，2006.Plant circadian rhythms.Plant Cell 18：792-803.
McGrath J.M.，Shaw R.S.，de los Reyes B.G.和Weiland J.J.，2004.Constructionof a Sugar Beet BAC Library from a Hybrid with diverse Traits.Plant Mol BiolRep 22：23-28.
Michaels S.D.和Amasino R.M.，1998.A robust method for detectingsingle-nueleotide changes as polymorphic markers by PCR.The Plant Journal14(3)：381-385.
S.，Salamini F.和Schneider K.，2005.Multiplexed，linkagegroup-specific SNP marker sets for rapid genetic mapping and fingerprinting ofsugar beet(Beta vulgaris L.).Molecular Breeding，第14卷，第4期：475-488.
Mullis K.B.，Faloona F.A.，Scharf S.，Saiki R.，Horn G.和Erlich H.，1986.
Specific enzymatic amplification of DNA in vitro：the polymerase chain reaction.Cold Spring Harbor Symp Quant Biol 5l：263-273.
Nakamichi N.，Kita M.，Ito S.，Sato E.，Yamashino T.和Mizuno T.，2005.
PSEUDO-RESPONSE REGULATORS，PRR9，PRR7and PRR5，together playessential roles close to the circadian clock of Arabidopsis thaliana.Plant CellPhysiol.，46：686-698.
Neff M.M.，Neff J.D.，Chory J.和Pepper A.E.，1998.dCAPS，a simple techniquefor the genetic analysis of single nucleotide polymorphisms：experimentalapplications in Arabidopsis thaliana genetics.Plant J 14：387-392.
Nickerson D.A.，Kaiser R.，Lappin S.，Stewart J.，Hood L.和Landegren U.，1990.
Automated DNA diagnostics using an ELISA-based oligonucleotide ligationassay.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.1990Nov；87(22)：8923-7.
Norris S.R.，Meyer S.E.和Callis J.，1993.The intron of Arabidopsis thalianapolyubiquitin genes is conserved in location and is a quantitative determinant ofchimeric gene expression.Plant Mol Biol 21：895-906.
Ohtsuka E.，Matsuki S.，Ikehara M.，Takahashi Y.和Matsubara K.，1985.Analternative approach to deoxyoligonucleotides as hybridization probes byinsertion of deoxyinosine at ambiguous codon positions，J.Biol.Chem.260(5)：2605-2608.
Okamuro J.K.和Goldberg R.B.，1989.Regulation of Plant Gene Expression：General Principles.Biochemistry of Plants，vol.15：1-82.
Orita M.，Suzuki Y.，Sekiya T.和Hayashi K.，1989.Rapid and sensitive detectionof point mutations and DNA polymorphism using he polymerase chain reaction.Genomics 5：874-879.
Pearson W.R.，1990.Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP andFASTA.Methods in Enzymology 183，63-98.
Rossolini G.M.，Cresti S.，Ingianni A.，Cattani P.，Riccio M.L.和Satta G.，1994.
Use of deoxyinosine-containing primers vs degenerate primers for polymerasechain reaction based on ambiguous sequence information，Mol.Cell Probes 8(1994)，第91页-第98页.
Ruiz M.T.，Voinnet O.和Baulcombe D.C.，1998.Initiation and maintenance ofvirus-induced gene silencing.Plant Cell 10，937-946.
SaloméP.A.和McClung C.R.，2005.PSEUDO-RESPONSE REGULATOR 7and9are partially redundant genes essential for the temperature responsiveness of theArabidopsis circadian clock.Plant Cell 17：791-803.
Saitou N.和Nei M.，1987.The neighbor-joining method：A new method forreconstructing phylogenetic trees.Molecular Biology and Evolution 4：406-425.Segev D.，1990.PCT公开文本No.WO 90/01069.
Smith N.A.，Singh S.P.，Wang M.B.，Stoutjesdijk P.A.Green A.G.和WaterhouseP.M.，2000.Total silencing by intron-spliced hairpin RNAs.Nature 407：319-320.
Smith T.F.和Waterman M.S.，1981.Advances in Applied Mathematics.2，482-489.
Tamura K.，Dudley J.，Nei M.和Kumar S.，2007.MEGA4：MolecularEvolutionary Genetics Analysis(MEGA)software version 4.0.MolecularBiology and Evolution 24：1596-1599.
Thiel T.，Kota R.，Grosse I.，Stein N.和Graner A.，2004.SNP2CAPS：a SNP andINDEL analysis tool for CAPS marker development.Nucleic Acids Res 32(1)：e5.
Tijssen P.，1993.Laboratory Techniques in Biochemistry and MolecularBiology-Hybridization with Nucleic Acid Probes part I chapter 2“Overview ofprinciples of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays”Elsevier，New York.
Turner A.，Beales J.，Faure S.，Dunford R.P.和Laurie D.A.，2005.ThePseudo-Response Regulator Ppd-H1provides adaptation to photoperiod in barley.Science 310：1031-1034.
Vancanneyt G.，Schmidt R.，O’Connor-Sanchez A.，Willmitzer L.和Rocha-SosaM.，1990.Construction of an intron-containing marker gene：Splicing of theintron in transgenic plants and its use in monitoring early events inAgrobacterium-mediated plant transformation.Mol.Gen.Genet.220：245-250.
Vandesompele J.，De Preter K.，Pattyn F.，Poppe B，Van Roy N.，De Paepe A.和Speleman F.，2002.Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR databy geometric averaging of multiple internal control genes.Genome Biology 3：1-11.
Vos P.，Hogers R.，Bleeker M.等1995.AFLP：a new technique for DNAfingerprinting.Nucleic Acids Research 23(21)：4407-4414.
Wang D.G.，Fan J.B.，Siao C.J.等，1998.Large-scale identification，mapping，andgenotyping of single-nucleotide polymorphisms in the human genome.Science15，1077-82.
Wang M.B.和Waterhouse P.M.，2001.Application of gene silencing in plants.Curr.Opin.Plant Biol 5：124-150.
Weber J.L.和May P.E.，1989.Abundant class of human DNA polymorhismswhich can be typed using the polymerare chain reaction.Am.J.Hum.Genet.44，388-396.
Welsh J.和McCleland M.，1990.Fingerprinting genomes using PCR witharbitrary primers.Nucleic Acids Research 18(24)：7213-7218.
Wu D.Y.和Wallace R.B.，1989.Genomics 4：560-569.
Ye S.，Dhillon S.，Ke X.，Collins A.R.和Day I.N.，2001.An efricient procedurefor genotyping single nucleotide polymorphisms.Nucleic Acids Res.，29，E88-E88.
Zhou Y.，Sun X.-D.和Ni M.，2007.Timing of photoperiodic flowering：lightperception and circadian clock.J.Integrative Plant Biol.49：28-34.
Zuckerkandl E.和Pauling L.，1965.Evolutionary divergence and convergence inproteins，第97页-第166页于Evolving Genes and Proteins，V.Bryson和H.J.Vogel.编Academic Press，New York.
Figure IPA00001272850800011
Figure IPA00001272850800021
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Claims (46)

1.一种核酸序列，其：
a)与如下的核酸序列具有至少70％的序列同一性；或
b)包含如下核酸序列的至少15个连续核苷酸；或
c)在严格条件下与如下的核酸序列杂交
所述核酸序列选自如SEQ ID NO：1、4、5、6、7、8、9、10、53或54之任一项中所列的核酸序列的组。
2.依照权利要求1的核酸序列，其中所述核酸序列包含如SEQ ID NO：1、4、5、6、7、8、9、10、53、或54之任一项中所列的核酸序列。
3.依照权利要求2的核酸序列，其中所述核酸序列包含如SEQ ID NO：8中所描述的核酸序列，其中所述序列包含一个或多个核酸取代、缺失、或添加，如表7-1((图10中描绘的)和表7-2(图11中描绘的)中所显示的，其中表7-1(图10中描绘的)和表7-2(图11中描绘的)中显示的多态性分别代表SEQ ID NO：8中所描述的序列的18种一年生和2种二年生等位基因。
4.多肽，其是由依照权利要求1至3中任一项的核酸序列编码的。
5.依照权利要求4的多肽，其具有选自下组的氨基酸序列：如SEQ ID NO：11或12中所描述的氨基酸序列。
6.嵌合构建体，其包含表达盒，所述表达盒包含在调节元件控制下，优选地在植物中有功能的调节元件控制下的依照权利要求1至3中任一项的核酸序列。
7.依照权利要求6的嵌合构建体，其进一步包含选择标志基因，其容许在选择方法中区分经转化的和未转化的植物材料。
8.依照权利要求6或7的嵌合构建体，其中为BvPRR7基因表达的转基因下调提供所述嵌合构建体。
9.依照权利要求8的嵌合构建体，其用于BvPRR7基因表达的转基因下调，其中所述嵌合构建体包含编码dsRNA的核酸分子序列，所述dsRNA能够靶向通过转录编码B基因蛋白，优选地BvPRR7蛋白的DNA序列而生成的mRNA以进行降解。
10.依照权利要求9的嵌合构建体，其中编码所述dsRNA的核酸分子具有至少21个核苷酸的长度，而且与所述BvPRR7基因的编码序列的至少一部分，优选地与依照权利要求1至3中任一项的核酸序列基本上相同。
11.依照权利要求9或10的嵌合构建体，其中编码所述dsRNA的核酸分子具有在组成型启动子，优选地来自拟南芥的Ubi3启动子的控制下的如SEQID NO：1中所描述的核苷酸序列。
12.依照权利要求9至11中任一项的嵌合构建体，其进一步包含来自马铃薯StLS1基因的第二内含子的序列。
13.植物转化载体和/或植物表达载体，其包含依照权利要求6至12中任一项的嵌合构建体。
14.依照权利要求13的植物表达载体，其是包含依照权利要求6至12中任一项的嵌合构建体的RNAi表达载体。
15.依照权利要求14的RNAi表达载体，其中所述RNAi表达载体包含图11中所显示的嵌合构建体。
16.植物细胞，其包含依照权利要求6至12中任一项的嵌合构建体或依照权利要求13至15中任一项的载体。
17.依照权利要求16的植物细胞，其是糖用甜菜植物的植物细胞。
18.具有延迟抽苔的表型的转基因植物，优选糖用甜菜植物或其细胞、组织或种子，各包含依照权利要求16或17的植物细胞或依照权利要求6至12中任一项的嵌合构建体或依照权利要求1至3中任一项的核酸序列，其中所述转基因植物特别是糖用甜菜植物表达所述dsRNA，从而延迟特别是抑制抽苔，并且所述植物展现出延迟抽苔的表型，优选为非抽苔表型。
19.转基因植物，特别是糖用甜菜植物，其是自依照权利要求18的细胞、组织或种子生成的。
20.一种生成杂种种子的方法，可以自所述杂种种子种植具有受调控的抽苔的表型的植物特别是糖用甜菜植物，所述方法包括下列步骤：
a.提供具有受调控的抽苔的表型的植物系特别是糖用甜菜系，特别是依照权利要求18或19的转基因糖用甜菜植物作为第一亲本系；
b.提供具有不同基因型的第二植物系，特别是糖用甜菜系作为第二亲本系；
其中步骤a)或步骤b)的所述亲本系之一是雄性不育cms系，且其中另一亲本系是雄性能育，并
c.容许所述雄性能育亲本系的植物传粉给第二雄性不育亲本系的花，让所述种子形成，并收获所述杂种种子；
其中收获的杂种种子是具有延迟抽苔的表型的杂种植物，特别是糖用甜菜杂种植物的种子。
21.依照权利要求20的生成杂种种子特别是糖用甜菜杂种种子的方法，其中所述雄性不育CMS糖用甜菜亲本系是近交糖用甜菜系，其包含依照权利要求1至3中任一项的核酸或其片段。
22.具有延迟抽苔的表型的植物特别是糖用甜菜植物的杂种种子。
23.依照权利要求22的杂种种子，其中所述种子是通过权利要求20或21的方法生成的。
24.具有延迟抽苔的表型的杂种植物特别是杂种糖用甜菜植物，其是通过种植权利要求22或23的杂种种子生成的。
25.植物部分，其选自下组：种子、胚、小孢子、合子、原生质体、细胞、胚珠、花粉、直根、子叶、提取物或生物学样品，它们衍生自依照权利要求18或19的转基因糖用甜菜植物或其种子或依照权利要求22或23的杂种植物或其种子。
26.依照权利要求1至3中任一项的核酸序列或其片段用于转化植物细胞特别是糖用甜菜植物细胞的用途。
27.转化植物细胞特别是糖用甜菜植物细胞的方法，包括使用依照权利要求1至3中任一项的核酸序列或依照权利要求6至12中任一项的嵌合构建体或依照权利要求13至15中任一项的载体。
28.依照权利要求18或19的转基因植物、依照权利要求24的杂种植物、或依照权利要求25的植物部分在选自下组的方法中的用途：糖生产的方法、需氧发酵的方法和厌氧发酵的方法，特别是在糖生产的方法中的用途。
29.用于生产糖的方法，其中加工依照权利要求18、19、24或25中任一项的糖用甜菜植物、或其细胞或组织以生产糖。
30.自依照权利要求18、19、24或25中任一项的糖用甜菜植物、或其细胞或组织生成的糖。
31.多核苷酸标志物，其中所述标志物是基于核酸序列开发的，所述核酸序列可获自糖用甜菜中显示与抽苔基因(B基因)相关表型完美共分离的基因组DNA区，且其中所述标志物容许区分一年生与二年生基因型或区分展现出二年生或一年生表型的糖用甜菜植物的植物分组内的不同单元型(haplotypes)。
32.依照权利要求31的多核苷酸标志物，其中所述核酸序列可获自依照权利要求1至3中任一项的核酸序列。
33.依照权利要求31或32的多核苷酸标志物，其进一步包含一个或多个多态性，特别是基于SNP、SSR、或至少一个核苷酸的缺失或插入的多态性，但是特别是基于SNP的多态性，该多态性诊断B基因座处的B等位基因。
34.依照权利要求33的多核苷酸标志物，其能够检测如SEQ ID NO：8所列的所述基因组序列的不同等位基因中存在的和如表7-1(图10中描绘的)和表7-2(图11中描绘的)中所显示的多种SNP的至少一种，其中所述多核苷酸标志物能够区分不同等位基因，特别是区分一年生和二年生糖用甜菜系。
35.依照权利要求34的多核苷酸标志物，其能够检测至少一种选自下组的SNP，该组包括如SEQ ID NO：8所列的序列的位置#224、#351、#615、#897、#1082、#1841、#1915、#2334、#11592、#12316、#12490、或#12544处的和如表7-1(图10中描绘的)和表7-2(图11中描绘的)中所显示的SNP。
36.多核苷酸标志物组，其包含权利要求31至35中任一项的多个多核苷酸标志物。
37.引物对，其由正向引物和反向引物组成，所述引物能够与糖用甜菜基因组DNA中显示与抽苔基因(B基因)完美共分离的基因组区域内的核苷酸序列退火。
38.依照权利要求37的引物对，其与依照权利要求1至3中任一项的核酸序列退火，并扩增依照权利要求31至35中任一项的多核苷酸或其信息部分，其中所述多核苷酸包含一个或多个多态性，特别是一个或多个诊断B基因座处的B等位基因且容许区分一年生和二年生基因型的多态性。
39.依照权利要求38的引物对，其选自下组：
a.引物对，其与BvPPR7的第三内含子中如SEQ ID NO：6中所描述的核苷酸序列退火，并自包含多态性特别是包含位置#87处的C/T SNP和/或位置#160处的C/T SNP和/或位置#406处的A/G SNP的多态性的所述区域扩增信息片段；
b.引物对，其与如SEQ ID NO：8所列的核苷酸序列退火，并自包含多态性的所述序列扩增信息片段，所述多态性选自基于所述序列的不同等位基因中存在的SNP的多态性，如表7-1(图10中描绘的)和表7-2(图11中描绘的)中所显示的。
40.依照权利要求39的引物对，其包含
a.如SEQ ID NO：49中所描述的正向引物PRR7(T6)-F和如SEQ ID NO：50中所描述的反向引物PRR7(T6)-R，用于扩增包含SNP#2334的片段；或
b.如SEQ ID NO：13中所描述的正向引物PRR7(T1)-F和如SEQ ID NO：14中所描述的反向引物PRR7(T1)-R，用于扩增包含SNP#160的片段；或
c.如SEQ ID NO：55中所描述的正向引物1r22(T1)-F和如SEQ ID NO：56中所描述的反向引物1r22(T1)-R。
41.依照权利要求31至36中任一项的多核苷酸标志物、依照权利要求36的多核苷酸标志物组、或依照权利要求37至40中任一项的引物对在等位区分测定法中的用途，所述等位区分测定法用于鉴定糖用甜菜植物中与一年生有关的等位基因的缺失或存在。
42.用于鉴定糖用甜菜植物中与一年生有关的等位基因的缺失或存在的等位区分测定法，其容许区分一年生和二年生植物，其中使用依照权利要求31至36中任一项的多核苷酸标志物、依照权利要求36的多核苷酸标志物组、或依照权利要求37至40中任一项的引物对。
43.依照权利要求42的等位区分测定法，其包含下列步骤：
a.自要分析的糖用甜菜植物获得基因组DNA的样品，
b.使用依照权利要求37至40中任一项的引物对自所述样品或基因组DNA扩增片段，并
c.分别比较所扩增的片段与已知与二年生表型有关但与一年生表型无关的等位序列。
44.依照权利要求42或43的等位区分测定法，其中在步骤c)中用包含对一年生等位基因特异性的序列的经第一荧光标记的探针分子探查步骤b)中获得的扩增片段，且其中所述第一探针的染料荧光的升高指示一年生等位基因的存在。
45.依照权利要求44的等位区分测定法，其中另外用包含对二年生等位基因特异性的序列的经第二荧光标记的探针分子探查步骤b)中获得的扩增片段，且其中所述第一探针的染料荧光的升高仅指示一年生等位基因的存在。
46.一种在商业种子中鉴定一年生污染物的方法，其使用依照权利要求42至45中任一项的基于标志物的等位区分测定法来进行。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104093843A (zh) * 2012-01-06 2014-10-08 先锋国际良种公司 胚珠体细胞特异性启动子及使用方法
CN112501333A (zh) * 2012-09-13 2021-03-16 塞米尼斯蔬菜种子公司 Myb28的遗传标志物

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2687760C (en) * 2007-05-23 2017-10-31 Syngenta Participations Ag Sugar beet polynucleotide markers
WO2009141446A1 (en) * 2008-05-23 2009-11-26 Syngenta Participations Ag Transgenic sugar beet plants
EP2291525B1 (en) * 2008-05-23 2015-04-15 Syngenta Participations AG Transgenic sugar beet plants
AU2012242525B2 (en) * 2011-04-14 2015-09-17 Complete Genomics, Inc. Processing and analysis of complex nucleic acid sequence data
KR101962636B1 (ko) * 2016-06-08 2019-03-27 동아대학교 산학협력단 실린드로카폰 데스트럭탄스균을 선별하기 위한 프라이머 선별방법 및 프라이머 세트
KR101962669B1 (ko) * 2016-06-08 2019-03-27 동아대학교 산학협력단 푸자리움 푸지쿠로이 종복합체 구분을 위한 프라이머 선별방법 및 프라이머 세트
CN107267660B (zh) * 2017-08-21 2020-10-09 黑龙江大学 检测甜菜雄蕊育性的ssr分子标记及其应用
US11180796B2 (en) 2018-06-13 2021-11-23 International Business Machines Corporation Detection of mutations regarding one or more deoxyribonucleic acid sequences using deterministic lateral displacement arrays
US11149298B2 (en) 2018-06-13 2021-10-19 International Business Machines Corporation Detection of nucleic acid sequences using deterministic lateral displacement arrays
CN109825604B (zh) * 2019-04-03 2022-12-13 中国农业科学院郑州果树研究所 与桃抗蚜性状紧密连锁的分子标记，用于检测桃抗蚜性状的引物、试剂盒、方法及其应用
CN110305981A (zh) * 2019-08-05 2019-10-08 辽宁省果树科学研究所 一种杏果实硬度关键基因的分子标记pg1524及其检测方法和应用
CN110527740B (zh) * 2019-09-11 2022-03-22 东北农业大学 一种与印度南瓜强雌基因紧密连锁的分子标记、引物及应用
CN111518916B (zh) * 2020-02-28 2022-07-15 南京农业大学 猪13号染色体与二花脸猪产活仔数显著相关的snp标记及其检测方法与应用
CN116121437B (zh) * 2022-11-07 2023-10-13 中国热带农业科学院南亚热带作物研究所 一种杧果品种的snp标记组合及杧果育种中的应用

Family Cites Families (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NL8300698A (nl) 1983-02-24 1984-09-17 Univ Leiden Werkwijze voor het inbouwen van vreemd dna in het genoom van tweezaadlobbige planten; agrobacterium tumefaciens bacterien en werkwijze voor het produceren daarvan; planten en plantecellen met gewijzigde genetische eigenschappen; werkwijze voor het bereiden van chemische en/of farmaceutische produkten.
EP0138341B1 (en) 1983-09-03 1988-10-26 Bass Public Limited Company Beer and other beverages and their manufacture
US4945050A (en) 1984-11-13 1990-07-31 Cornell Research Foundation, Inc. Method for transporting substances into living cells and tissues and apparatus therefor
US4987071A (en) 1986-12-03 1991-01-22 University Patents, Inc. RNA ribozyme polymerases, dephosphorylases, restriction endoribonucleases and methods
US5350689A (en) 1987-05-20 1994-09-27 Ciba-Geigy Corporation Zea mays plants and transgenic Zea mays plants regenerated from protoplasts or protoplast-derived cells
ES2074999T3 (es) 1987-05-20 1995-10-01 Ciba Geigy Ag Plantas de zea mays y plantas de zea mays transgenicas regeneradas de protoplastos o celulas derivadas de protoplastos.
NZ225044A (en) 1987-06-19 1990-01-29 Plant Cell Res Inst Bertholletia excelsa dna molecule; sulphur rich storage protein
DE58909753D1 (de) 1988-03-08 1997-01-23 Ciba Geigy Ag Regeneration von fertilen Gramineen-Pflanzen aus der Unterfamilie Pooideae ausgehend von Protoplasten
EP0425563B1 (en) 1988-07-20 1996-05-15 David Segev Process for amplifying and detecting nucleic acid sequences
US5501967A (en) 1989-07-26 1996-03-26 Mogen International, N.V./Rijksuniversiteit Te Leiden Process for the site-directed integration of DNA into the genome of plants
US5270163A (en) 1990-06-11 1993-12-14 University Research Corporation Methods for identifying nucleic acid ligands
FR2673642B1 (fr) 1991-03-05 1994-08-12 Rhone Poulenc Agrochimie Gene chimere comprenant un promoteur capable de conferer a une plante une tolerance accrue au glyphosate.
HU218034B (hu) 1992-01-09 2000-05-28 Novartis Ag. Új növényi promoter
US6140466A (en) 1994-01-18 2000-10-31 The Scripps Research Institute Zinc finger protein derivatives and methods therefor
CA2681922C (en) 1994-01-18 2012-05-15 The Scripps Research Institute Zinc finger protein derivatives and methods therefor
JP4118327B2 (ja) 1994-08-20 2008-07-16 ゲンダック・リミテッド Ｄｎａ認識のための結合タンパク質におけるまたはそれに関連する改良
US6506559B1 (en) 1997-12-23 2003-01-14 Carnegie Institute Of Washington Genetic inhibition by double-stranded RNA
CN1202246C (zh) 1998-04-08 2005-05-18 联邦科学和工业研究组织 获得修饰表型的方法和措施
AR020078A1 (es) 1998-05-26 2002-04-10 Syngenta Participations Ag Metodo para alterar la expresion de un gen objetivo en una celula de planta
US20100293669A2 (en) * 1999-05-06 2010-11-18 Jingdong Liu Nucleic Acid Molecules and Other Molecules Associated with Plants and Uses Thereof for Plant Improvement
US20040031072A1 (en) * 1999-05-06 2004-02-12 La Rosa Thomas J. Soy nucleic acid molecules and other molecules associated with transcription plants and uses thereof for plant improvement
US20070234438A1 (en) * 2000-05-08 2007-10-04 Abad Mark S Nucleic acid molecules and other molecules associated with plants
US20040181830A1 (en) * 2001-05-07 2004-09-16 Kovalic David K. Nucleic acid molecules and other molecules associated with plants and uses thereof for plant improvement
BR0113156A (pt) 2000-08-11 2003-07-08 Syngenta Participations Ag Método para produzir um planta dicotiledÈnea transformada, célula de planta transformada, cultura de múltiplos brotos, planta transformada, semente produzida pela planta transformada, método para produzir uma planta compreendendo um genoma de plastìdeo transformado, genoma de plastìdeo transformado, e, plastìdeo
JP4909072B2 (ja) * 2003-06-06 2012-04-04 アーバージェン インコーポレイテッド 転写因子
US20060150283A1 (en) * 2004-02-13 2006-07-06 Nickolai Alexandrov Sequence-determined DNA fragments and corresponding polypeptides encoded thereby
US20070048768A1 (en) * 2005-06-30 2007-03-01 Syngenta Participations Ag Methods for screening for gene specific hybridization polymorphisms (GSHPs) and their use in genetic mapping and marker development
CA2648499A1 (en) * 2006-04-21 2007-11-01 Syngenta Participations Ag Transgenic plants and methods for controlling bolting in sugar beet
CA2687760C (en) * 2007-05-23 2017-10-31 Syngenta Participations Ag Sugar beet polynucleotide markers

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
NORIHITO NAKAMICHI等: "PSEUDO-RESPONSE REGULATORS, PRR9, PRR7 and PRR5, Together Play Essential Roles Close to the Circadian Clock of Arabidopsis thaliana", 《PLANT CELL PHYSIOL》 *
TREBBI D，等: "登录号：", 《EBI》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104093843A (zh) * 2012-01-06 2014-10-08 先锋国际良种公司 胚珠体细胞特异性启动子及使用方法
CN104093843B (zh) * 2012-01-06 2016-02-17 先锋国际良种公司 胚珠体细胞特异性启动子及使用方法
CN112501333A (zh) * 2012-09-13 2021-03-16 塞米尼斯蔬菜种子公司 Myb28的遗传标志物

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Publication number Publication date
CN102057045B (zh) 2018-06-05
CN101772575B (zh) 2015-03-11
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US8796506B2 (en) 2014-08-05
EP1995320A2 (en) 2008-11-26
EP1995320A3 (en) 2009-01-07
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