CN101772575A - 多核苷酸标志物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及糖用甜菜基因组内与抽苔基因或B基因紧密连锁的且能用于开发分子标志物的多核苷酸。本发明进一步涉及分子标志物和包含所述标志物的试剂盒，其能用于糖用甜菜基因组中抽苔基因或B基因的定位、鉴定和分离及用于一年生与二年生基因型之间或显示二年生基因型的糖用甜菜植株的植物分组内不同单元型之间的区分。本发明还涉及牵涉所述标志物的糖用甜菜植物育种的测定法和方法。

Description

多核苷酸标志物

发明领域

本发明属于糖用甜菜种子的标志物辅助育种和质量控制的领域。具体而言，本发明涉及糖用甜菜基因组内与抽苔基因或B基因紧密连锁的或位于抽苔基因或B基因内的且能用于开发分子标志物的多核苷酸。本发明进一步涉及分子标志物和包含所述标志物的试剂盒，其能用于糖用甜菜基因组中抽苔基因或B基因的定位、鉴定和分离及用于一年生与二年生基因型之间或显示二年生基因型的糖用甜菜植株的植物分组内不同单元型之间的区分。本发明进一步涉及转基因方法，其中提供B基因或是过表达或是下调的转基因植物。

发明背景

栽培的糖用甜菜(Beta vulgaris ssp.vulgaris L.)是二年生植物，其在第一年形成贮藏根和莲座叶。在一段时间的低温后开始枝条延长(抽苔)和花形成。与此相反，B.vulgaris ssp.maritima属的许多野生甜菜显示一年生生长习性，这是由于B基因座处存在抽苔基因B，其位于染色体II的中央区。基因座B的显性等位基因在野生甜菜中是丰富的，而且在长日照下引起抽苔(bolting)，无需对于携带隐性等位基因的二年生栽培种(cultivars)而言通常至关重要的冷(低温，cold)要求(Abe等，1997)。

抽苔(茎延长)是营养性向生殖性生长转换中明显可见的第一步。

在栽培的糖用甜菜中，抽苔是不想要的现象，因为它导致产量降低而且引起收获和提取糖期间的问题。由于B等位基因的不完全外显率及其环境依赖性，需要紧密连锁的分子标志物来筛选它在育种系中的存在。

糖用甜菜的商业性种子生产常常在生长有一年生杂生(weed)甜菜的地区进行，它们能在种子生产中引起花粉污染，导致商业性种子中有一年生植物。这是客户不能接受的。为了鉴定一年生植物的污染，在收获种子后立即在没有野生型一年生甜菜生长的地区种植各批次的商业性种子。不对植物春化，而且通过抽苔者的存在来鉴定污染。非常希望用基于标志物的筛选测定法来替代此测试，因为能更早地得到结果，这会导致种子加工中成本节约。

基于标志物的方法还能有利地用于糖用甜菜育种，例如用于加快育种过程，或用于引入来自野生海甜菜的新变异。在这些情况中，重要的是要有与B基因紧密连锁的能够精确选择一年生植物或二年生植物的标志物。

本发明现在提供了用于开发此类标志物的手段。

发明概述

具体而言，本发明涉及在糖用甜菜基因组中鉴定的多核苷酸，特别是分离的多核苷酸，包括其变体和衍生物，该多核苷酸与抽苔基因或B基因在遗传上紧密连锁，或者优选的是，该多核苷酸位于抽苔基因或B基因内。本发明进一步涉及所述多核苷酸用于开发标志物的用途，该标志物能用于糖用甜菜基因组中抽苔基因或B基因的定位、鉴定和分离。

在本发明的一个方面中，依照本发明的所述多核苷酸在糖用甜菜中显示与抽苔基因(B基因)相关表型的完美共分离。

在一个实施方案中，本发明涉及依照本发明的且如本文中所描述的多核苷酸，包括其信息片段，该多核苷酸可自位于标志物MP0176和GJ01上游1cM且与标志物GJ131共分离的，在糖用甜菜中显示与抽苔基因(B基因)相关表型完美共分离的基因组DNA区获得。

在另一个实施方案中，本发明涉及依照本发明的且如本文中所描述的多核苷酸，包括其信息片段，特别是分离的多核苷酸，其是自位于以标志物GJ131和GJ01定界的间隔的基因组DNA可获得的。

在本发明的一个实施方案中，提供了多核苷酸，包括其信息片段，特别是分离的多核苷酸，该多核苷酸是自糖用甜菜基因组中与抽苔基因或B基因遗传连锁的且包含一种或多种下述元件的基因组糖用甜菜DNA可获得的：

a)内含子区，其在使用基因组糖用甜菜DNA作为模板时在使用SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8分别所示正向引物PRR7-F和反向引物PRR7-R或与SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8分别所示序列具有至少90％、特别是至少95％、更特别的是至少98％和多至99％序列同一性的引物对的PCR反应中生成大约0.5kb的扩增产物，特别是多核苷酸片段，显示SEQ ID NO：2、3或4所示核苷酸序列或其中具有至少70％、特别是至少75％、更特别的是至少80％、甚至更特别的是至少85％、但尤其是至少90％和多至至少95％-99％序列同一性的序列；

b)包含与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：52所示核苷酸序列具有70％、特别是75％、更特别的是80％、甚至更特别的是85％、但尤其是90％和多至95％-99％序列同一性的核苷酸序列的多核苷酸片段；

c)多核苷酸片段包含SEQ ID NO：5所示核苷酸序列或与SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：51所示核苷酸序列具有70％、特别是75％、更特别的是80％、甚至更特别的是85％、但尤其是90％和多至95％-99％序列同一性的序列；

d)在剪接后编码与SEQ ID NO：6所示核苷酸序列具有至少80％、特别是至少85％、更特别的是至少90％、甚至更特别的是至少95％、但尤其是至少98％和多至100％序列同一性的多肽的多核苷酸片段；和，任选地，此外

e)编码氨基末端附近的假应答调控物接受者域基序(Pseudo ResponseRegulator Receiver Domain motif(PRR))和羧基末端附近的CCT基序的高度保守部分。

在一个实施方案中，本发明涉及多核苷酸，包括其信息片段，特别是分离的多核苷酸，其包含在使用基因组糖用甜菜DNA作为模板时在使用SEQID NO：7和SEQ ID NO：8分别所示正向引物PRR7-F和反向引物PRR7-R或与SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8分别所示序列对具有至少90％、特别是至少95％、更特别的是至少98％和多至99％序列同一性的引物的PCR反应中产生大约0.5kb扩增产物的内含子区。

在一个实施方案中，本发明涉及多核苷酸，包括其信息片段，特别是分离的多核苷酸，其包含如下多核苷酸片段，该多核苷酸片段显示SEQ ID NO：1所示核苷酸序列或其中具有至少70％、特别是至少75％、更特别的是至少80％、甚至更特别的是至少85％、但尤其是至少90％和多至至少95％-99％序列同一性的序列。

在一个实施方案中，本发明涉及多核苷酸，包括其信息片段，特别是分离的多核苷酸，其包含如下多核苷酸片段，该多核苷酸显示SEQ ID NO：2、3或4所示核苷酸序列或其中具有至少70％、特别是至少75％、更特别的是至少80％、甚至更特别的是至少85％、但尤其是至少90％和多至至少95％-99％序列同一性的序列。

在一个实施方案中，本发明涉及多核苷酸，包括其信息片段，特别是分离的多核苷酸，其在剪接后编码与SEQ ID NO：6所示核苷酸序列具有至少80％、特别是至少85％、更特别的是至少90％、甚至更特别的是至少95％、但尤其是至少98％和多至100％序列同一性的多肽。

在一个实施方案中，本发明涉及多核苷酸，包括其信息片段，特别是分离的多核苷酸，其包含如下的多核苷酸片段，该多核苷酸片段包含SEQ IDNO：5所示核苷酸序列或与SEQ ID NO：5所示核苷酸序列具有至少70％、特别是至少75％、更特别的是至少80％、甚至更特别的是至少85％、但尤其是至少90％和多至至少95％-99％序列同一性的序列。

在一个实施方案中，本发明涉及多核苷酸，包括其信息片段，特别是分离的多核苷酸，其包含如下的多核苷酸片段，该多核苷酸片段包含SEQ IDNO：51所示核苷酸序列或与SEQ ID NO：51所示核苷酸序列具有至少70％、特别是至少75％、更特别的是至少80％、甚至更特别的是至少85％、但尤其是至少90％和多至至少95％-99％序列同一性的序列。

在一个实施方案中，本发明涉及多核苷酸，包括其信息片段，特别是分离的多核苷酸，其包含如下的多核苷酸片段，该多核苷酸片段包含SEQ IDNO：52所示核苷酸序列或与SEQ ID NO：52所示核苷酸序列具有至少70％、特别是至少75％、更特别的是至少80％、甚至更特别的是至少85％、但尤其是至少90％和多至至少95％-99％序列同一性的序列。

本发明应当同样地覆盖落在本文所述70％-99％范围中的所有个别数值(individual numerical values)，即71％、72％、73％、74％、75％、......90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％。

在一个实施方案中，本发明涉及多核苷酸，包括其信息片段，特别是分离的多核苷酸，其包含如下的多核苷酸片段，其中所述多核苷酸片段的互补链能够与SEQ ID NO：1所示核苷酸序列杂交，特别是在中等杂交条件下，更特别的是在严格杂交条件下。

在一个实施方案中，本发明涉及多核苷酸，包括其信息片段，特别是分离的多核苷酸，其包含如下的多核苷酸片段，其中所述多核苷酸片段的互补链能够与SEQ ID NO：2、3或4所示核苷酸序列杂交，特别是在中等杂交条件下，更特别的是在严格杂交条件下。

在一个实施方案中，本发明涉及多核苷酸，包括其信息片段，特别是分离的多核苷酸，其包含如下的多核苷酸片段，其中所述多核苷酸片段的互补链能够与SEQ ID NO：5所示核苷酸序列杂交，特别是在中等杂交条件下，更特别的是在严格杂交条件下。

在一个实施方案中，本发明涉及多核苷酸，包括其信息片段，特别是分离的多核苷酸，其包含如下的多核苷酸片段，其中所述多核苷酸片段的互补链能够与SEQ ID NO：51所示核苷酸序列杂交，特别是在中等杂交条件下，更特别的是在严格杂交条件下。

在一个实施方案中，本发明涉及多核苷酸，包括其信息片段，特别是分离的多核苷酸，其包含如下的多核苷酸片段，其中所述多核苷酸片段的互补链能够与编码具有SEQ ID NO：6所示氨基酸序列的多肽的核苷酸序列杂交，特别是在中等杂交条件下，更特别的是在严格杂交条件下。

在一个实施方案中，本发明涉及多核苷酸，包括其信息片段，特别是分离的多核苷酸，其包含如下的多核苷酸片段，其中所述多核苷酸片段的互补链能够与SEQ ID NO：52所示核苷酸序列杂交，特别是在中等杂交条件下，更特别的是在严格杂交条件下。

在本发明的一个实施方案中，多核苷酸，包括其信息片段，特别是分离的多核苷酸，所述多核苷酸在糖用甜菜基因组中与抽苔基因或B基因遗传连锁的基因组糖用甜菜DNA中可得到，

a)在PCR反应中使用SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8分别所示正向引物PRR7-F和反向引物PRR7-R或与SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8分别所示序列具有至少90％、特别是至少95％、更特别的是至少98％和至多99％序列同一性的引物对筛选自二年生商业性栽培种H20开发的BAC文库，特别是在如下条件下：初始变性95℃5分钟，接着35个扩增循环30秒钟95℃、30秒钟60℃、30秒钟72℃，再接着5分钟72℃；

b)选择包含均与SEQ ID NO：1所示EST CV301305共享序列同源性的两个非交叠毗连序列群的BAC SBA079-L24并将它们组合成一条单一序列；

c)基于BAC序列毗连序列群与SEQ ID NO：1所示EST CV301305的比对及基于与来自拟南芥的PRR7基因的序列同源性，获得包含内含子和外显子的甜菜BvPRR7基因的基因结构。

在一个具体的实施方案中，依照本发明的多核苷酸包含具有SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的核苷酸序列。

在一个具体的实施方案中，依照本发明的多核苷酸包含具有SEQ ID NO：2所示核苷酸序列的核苷酸序列。

在一个具体的实施方案中，依照本发明的多核苷酸包含具有SEQ ID NO：3所示核苷酸序列的核苷酸序列。

在一个具体的实施方案中，依照本发明的多核苷酸包含具有SEQ ID NO：4所示核苷酸序列的核苷酸序列。

在一个具体的实施方案中，依照本发明的多核苷酸包含具有SEQ ID NO：5所示核苷酸序列的核苷酸序列。

在一个具体的实施方案中，依照本发明的多核苷酸包含具有SEQ ID NO：51所示核苷酸序列的核苷酸序列。

在一个具体的实施方案中，依照本发明的多核苷酸包含具有SEQ ID NO：52所示核苷酸序列的核苷酸序列。

在一个具体的实施方案中，依照本发明的多核苷酸包含具有SEQ ID NO：5所示核苷酸序列的核苷酸序列，其中所述序列具有位于3695的G、位于3827的C、位于3954的T、位于5284的T、位于5714的G、位于10954的G、位于11043的T、位于11143的C、位于11150的C、位于11220的A、位于11238的C、位于11299的A、位于11391的A、位于12053的G、位于12086的G、位于12127的T、位于12193的A、位于12337的G、和位于12837的G，代表一年生等位基因1。

在一个具体的实施方案中，依照本发明的多核苷酸包含具有SEQ ID NO：5所示核苷酸序列的核苷酸序列，其中所述序列具有位于3695的T、位于3827的C、位于3954的T、位于5284的T、位于5714的G、位于10954的G、位于11043的T、位于11143的C、位于11150的C、位于11220的A、位于11238的A、位于11299的T、位于11391的A、位于12053的G、位于12086的G、位于12127的T、位于12193的G、位于12337的G、和位于12837的G，代表一年生等位基因2。

在一个具体的实施方案中，依照本发明的多核苷酸包含具有SEQ ID NO：5所示核苷酸序列的核苷酸序列，其中所述序列具有位于3695的G、位于3827的C、位于3954的T、位于5284的T、位于5714的G、位于10954的G、位于11043的G、位于11143的T、位于11150的C、位于11220的A、位于11238的C、位于11299的T、位于11391的A、位于12053的G、位于12086的G、位于12127的T、位于12193的G、位于12337的G、和位于12837的G，代表一年生等位基因3。

在一个具体的实施方案中，依照本发明的多核苷酸包含具有SEQ ID NO：5所示核苷酸序列的核苷酸序列，其中所述序列具有位于3695的G、位于3827的C、位于3954的T、位于5284的T、位于5714的G、位于10954的G、位于11043的T、位于11143的C、位于11150的T、位于11220的A、位于11238的C、位于11299的T、位于11391的A、位于12053的G、位于12086的G、位于12127的T、位于12193的A、位于12337的G、和位于12837的G，代表一年生等位基因4。

在一个具体的实施方案中，依照本发明的多核苷酸包含具有SEQ ID NO：5所示核苷酸序列的核苷酸序列，其中所述序列具有位于3695的G、位于3827的C、位于3954的T、位于5284的T、位于5714的G、位于10954的G、位于11043的T、位于11143的C、位于11150的C、位于11220的A、位于11238的C、位于11299的T、位于11391的A、位于12053的G、位于12086的A、位于12127的T、位于12193的A、位于12337A、和位于12837的G，代表一年生等位基因5。

在一个具体的实施方案中，依照本发明的多核苷酸包含具有SEQ ID NO：5所示核苷酸序列的核苷酸序列，其中所述序列具有位于3695的G、位于3827的C、位于3954的T、位于5284的T、位于5714的G、位于10954的G、位于11043的T、位于11143的C、位于11150的C、位于11220的A、位于11238的C、位于11299的T、位于11391的A、位于12053的G、位于12086的G、位于12127的T、位于12193的A、位于12337A、和位于12837的G，代表一年生等位基因6。

在一个具体的实施方案中，依照本发明的多核苷酸包含具有SEQ ID NO：5所示核苷酸序列的核苷酸序列，其中所述序列具有位于3695的G、位于3827的A、位于3954的A、位于5284的C、位于5714的T、位于10954的A、位于11043的G、位于11143的C、位于11150的C、位于11220的C、位于11238的C、位于11299的T、位于11391的G、位于12053的A、位于12086的G、位于12127的C、位于12193的G、位于12337G、和位于12837的A，代表二年生等位基因7。

在一个具体的实施方案中，依照本发明的多核苷酸包含具有编码如下多肽的核苷酸序列的核苷酸序列，该多肽具有SEQ ID NO：6所示氨基酸序列。

在一个实施方案中，本发明涉及大约0.5kb的扩增产物，包括信息片段，其在使用基因组糖用甜菜DNA作为模板时在用SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8分别所示正向引物PRR7-F和反向引物PRR7-R进行的PCR反应中可得到。

在本发明的一个具体实施方案中，提供了一组多核苷酸标志物，其包含众多标志物个体，所述标志物是基于SEQ ID NO：5所示多核苷酸，包括上文所述任何其等位基因变体1-7开发的，且能够检测位于表5所示核苷酸位置处的各种SNP，其中所述标志物组能够鉴定不同等位基因并如此区分一年生和二年生糖用甜菜系。

在一个实施方案中，本发明涉及一种或众多探针分子和/或一种或众多引物，特别是一种或众多引物对，但尤其是由正向引物和反向引物组成的一种或众多引物对，该引物能够与糖用甜菜基因组中与B基因遗传紧密连锁基因组区域(特别是B基因内的区域)内的核苷酸序列退火，且包含依照本发明和如本文所述的多核苷酸，包括其信息片段，其中所述片段包含多态性，特别是基于SNP、SSR、至少一个核苷酸的缺失或插入的多态性，但尤其是基于SNP的多态性，该多态性鉴定B基因座处的B等位基因且容许区分一年生与二年生基因型或显示二年生或一年生基因型的糖用甜菜植物的植物分组内的不同单元型。

在本发明的一个实施方案中，提供了多核苷酸标志物，其能自选自下组的多核苷酸分子或其信息片段开发：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：51和SEQ ID NO：52所示多核苷酸及编码包含SEQ ID NO：6所示氨基酸序列的多肽的多核苷酸，其中所述多核苷酸标志物包含一处或多处多态性，特别是基于SNP、SSR、至少一个核苷酸的缺失或插入的多态性，但尤其是基于SNP的多态性，该多态性鉴定B基因座处的B等位基因且容许区分一年生与二年生基因型或显示二年生或一年生基因型的糖用甜菜植物的植物分组内的不同单元型。

在本发明的一个具体实施方案中，提供了基于SEQ ID NO：2所示多核苷酸开发的多核苷酸标志物，该标志物能够检测BvPRR7基因第3内含子中的至少一种下述SNP：

a)位于87的胞嘧啶或胸腺嘧啶，

b)位于160的胞嘧啶或胸腺嘧啶，

c)位于406的腺嘌呤或鸟嘌呤，

并如此区分一年生与二年生单元型。

在一个实施方案中，所述多核苷酸标志物表现为一种或众多探针分子和/或一种或众多引物，特别是一种或众多引物对，但尤其是由正向引物和反向引物组成的一对引物，所述引物能够与糖用甜菜基因组中与B基因遗传紧密连锁的显示SEQ ID NO：2所示核苷酸序列的基因组区域内的核苷酸序列退火显示且能够扩增其信息片段，其中所示片段包含一处或多处多态性，特别是基于SNP、SSR、或至少一个核苷酸的缺失或插入的多态性，但尤其是表1所示基于SNP的多态性，该多态性鉴定B基因座处的B等位基因且容许区分具有一年生与二年生基因型的植物或显示二年生或一年生基因型的糖用甜菜植物的植物分组内的不同单元型。

在一个具体的实施方案中，提供了依照本发明的和如本文所述的一对引物，其与SEQ ID NO：2所示第3内含子内的核苷酸序列退火，且自所示区域扩增包含多态性的信息片段，特别是包含位于#87的C/T SNP和/或位于#160的C/T SNP和/或位于#406的A/G SNP的多态性。

具体而言，一对引物包含用于扩增包含SNP#160、SNP#87和SNP#406的片段的SEQ ID NO：7所示正向引物PRR7-F和SEQ ID NO：8所示反向引物PRR7-R。

在一个实施方案中，依照本发明的多核苷酸标志物表现为一种或众多探针分子和/或一种或众多引物、特别是一种或众多引物对、但尤其是由正向引物和反向引物组成的一对引物，所述引物能够与糖用甜菜基因组中与B基因遗传紧密连锁的基因组区域内的核苷酸序列(特别是B基因内的核苷酸序列，特别是SEQ ID NO：5所示核苷酸序列)退火，且扩增其信息片段，其中所述片段包含一处或多处多态性，特别是基于SNP、SSR、至少一个核苷酸的缺失或插入的多态性，但尤其是例如表5所示基于SNP的多态性，该多态性鉴定B基因座处的B等位基因且容许区分具有一年生与二年生基因型的植物或显示二年生或一年生基因型的糖用甜菜植物的植物分组内的不同单元型。

在一个具体的实施方案中，提供了依照本发明的和如本文所述的一对引物，其与SEQ ID NO：5所示BvPRR7基因的编码区内的核苷酸序列退火且自所述编码序列扩增包含多态性的信息片段，特别是包含位于#3827的A/C SNP和/或位于#3954的A/T SNP和/或位于#5714的T/G SNP和/或位于#11220的C/ASNP和/或位于#11391的G/A SNP和/或位于#12053的A/G SNP和/或位于#12127的C/T SNP的多态性。

具体而言，第一对引物包含用于扩增包含SNP#3827和SNP#3954的片段的SEQ ID NO 27所示正向引物F3806和SEQ ID NO 28所示反向引物R3807。

第二对引物包含用于扩增包含SNP#5714的片段的SEQ ID NO 21所示正向引物F3768和R3769SEQ ID NO 22所示反向引物。

第三对引物包含用于扩增包含SNP#11220的片段的SEQ ID NO 37所示正向引物F3857和SEQ ID NO 38所示反向引物R3858。

第四对引物包含用于扩增包含SNP#11391的片段的SEQ ID NO 39所示正向引物F3859和SEQ ID NO 40所示反向引物R3860。

第五对引物包含用于扩增包含SNP#12053和SNP#12127的片段的SEQID NO 41所示正向引物F3861和SEQ ID NO 42所示反向引物R3862。

在一个实施方案中，依照本发明的多核苷酸标志物表现为一种或众多探针分子和/或一种或众多引物、特别是一种或众多引物对、但尤其是由正向引物和反向引物组成的一对引物，所述引物能够与糖用甜菜基因组中与B基因遗传紧密连锁的基因组区域内的核苷酸序列(特别是B基因内的核苷酸序列、特别是PRR7基因启动子区内的核苷酸序列、特别是SEQ ID NO：5和SEQ IDNO：51分别所示PRR7基因启动子区内的核苷酸序列)退火，且扩增其信息片段，该信息片段鉴定B基因座处的B等位基因且容许区分具有一年生与二年生基因型的植物或显示二年生或一年生基因型的糖用甜菜植物的植物分组内的不同单元型。

在本发明的一个具体实施方案中，提供了多核苷酸标志物，其表现为选自下组的一对引物：产生0.6kb扩增产物的引物对F3808(SEQ ID NO 29)和R3809(SEQ ID NO 30)；产生1.0kb扩增产物的引物对F3855(SEQ ID NO 35)和R3809(SEQ ID NO 30)；和产生0.8kb扩增产物的引物对F3855(SEQ ID NO35)和R3856(SEQ ID NO 36)(表4)，前提是使用来自二年生系的基因组DNA作为模板，但是不为一年生系提供扩增。

所述信息片段可进一步包含一处或多处多态性，特别是基于SNP、SSR、至少一个核苷酸的缺失或插入的多态性，但尤其是基于SNP的多态性，该多态性鉴定B基因座处的B等位基因且容许区分具有一年生与二年生基因型的植物或显示二年生或一年生基因型的糖用甜菜植物的植物分组内的不同单元型。

本发明进一步涉及一种或众多探针分子和/或一种或众多引物、特别是一种或众多引物对、但尤其是由正向引物和反向引物组成的一对引物，所述引物能够与糖用甜菜基因组中与B基因遗传紧密连锁的基因组区域内的核苷酸序列(特别是B基因内的核苷酸序列、特别是PRR7基因启动子区内的核苷酸序列、特别是SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：51分别所示PRR7基因启动子区内的核苷酸序列)退火，且扩增其信息片段，该信息片段鉴定B基因座处的B等位基因且容许区分具有一年生与二年生基因型的植物或显示二年生或一年生基因型的糖用甜菜植物的植物分组内的不同单元型。

在本发明的另一个实施方案中，提供了选自下组的引物对：产生0.6kb扩增产物的引物对F3808(SEQ ID NO 29)和R3809(SEQ ID NO 30)；产生1.0kb扩增产物的引物对F3855(SEQ ID NO 35)和R3809(SEQ ID NO 30)；和产生0.8kb扩增产物的引物对F3855(SEQ ID NO 35)和R3856(SEQ ID NO 36)(表4)，前提是使用来自二年生系的基因组DNA作为模板，但是不为一年生系提供扩增。

上述探针分子和/或引物可用于在商业性糖用甜菜种子中鉴定一年生污染物的方法。

在一个实施方案中，本发明涉及一组探针多核苷酸，其包含与依照本发明的和其如本文所述的信息多核苷酸片段内包含多态性位点的亚区互补且扩增在交叠区域中只因一个或两个碱基错配而不同的部分交叠片段的至少两种不同探针分子，其中第一探针(特别是用第一荧光染料标记的探针，更特别的是用第一荧光染料和淬灭剂)呈现一种等位基因，而第二探针(特别是用不同于第一染料的第二荧光染料标记的探针，特别是用第二荧光染料和淬灭剂)呈现另一种(other)等位基因。

在本发明的一个具体实施方案中，所述信息多核苷酸片段包含多态性，其中所述多态性基于SEQ ID NO：5所示PRR7基因假接受者域内的SNP#3827，且用第一荧光染料标记的第一探针分子具有SEQ ID NO：47所示核苷酸序列，而用第二荧光染料标记的第二探针分子具有SEQ ID NO：48所示核苷酸序列。

在一个实施方案中，本发明涉及依照本发明的和如本文所述的多核苷酸或其任何信息片段用于开发可以在用于在糖用甜菜基因组中检测多态性的等位基因区分测定法中使用的标志物的用途，该多态性鉴定B基因座处的B等位基因且容许区分一年生与二年生基因型或显示二年生基因型的糖用甜菜植物的植物分组内的不同单元型或将B基因定位至糖用甜菜基因组。

在一个具体的实施方案中，本发明涉及一种或众多引物、特别是依照本发明的和如本文所述的一种或众多引物对在用于在糖用甜菜基因组中检测多态性(特别是基于SNP、SSR、至少一个核苷酸的缺失或插入的多态性，但尤其是基于SNP的多态性)的等位基因区分测定法中的用途，所述多态性鉴定(diagnostic)B基因座处的B等位基因且容许区分一年生与二年生基因型或显示二年生基因型的糖用甜菜植物的植物分组内的不同单元型。

在本发明的另一个实施方案中，可以在所述等位基因区分测定法中另外采用依照本发明的和如本文所述的一组探针分子。

在一个实施方案中，本发明涉及一种鉴定糖用甜菜植物中与一年生有关的等位基因的缺失或存在的方法，包括：

a)自要分析的糖用甜菜植物获得基因组样品；

b)分析糖用甜菜基因组中与B基因遗传紧密连锁的且与依照本发明的和如本文所述的多核苷酸的序列互补或包含依照本发明的和如本文所述的多核苷酸的序列的基因组区域的核苷酸序列；并

c)比较所述序列与已知分别与二年生表型和一年生表型有关的等位基因序列。

在一个实施方案中，本发明涉及一种鉴定糖用甜菜植物中与一年生有关的等位基因的缺失或存在的方法，包括：

a)自要分析的糖用甜菜植物获得基因组样品；

b)使用与BvPRR7基因(特别是SEQ ID NO：51公开的BvPRR7)的启动子区中存在的核苷酸序列互补并结合的引物、特别是一对引物，自所述样品DNA扩增片段；并

c)比较所述序列与已知与二年生表型有关但与一年生表型无关的等位基因序列。

在一个实施方案中，本发明涉及一种鉴定糖用甜菜植物中与一年生有关的等位基因的缺失或存在的方法，包括：

a)自要分析的糖用甜菜植物获得基因组样品；

b)用包含已知在二年生等位基因中存在但在一年生等位基因中不存在的等位基因特异性序列(特别是来自BvPRR7基因(特别是SEQ ID NO：51公开的BvPRR7)启动子区的等位基因特异性序列)的探针分子探查所述样品DNA。

在本发明的一个具体实施方案中，在所述方法中使用选自下组的引物对：产生0.6kb扩增产物的引物对F3808(SEQ ID NO 29)和R3809(SEQ ID NO30)；产生1.0kb扩增产物的引物对F3855(SEQ ID NO 35)和R3809(SEQ IDNO 30)；和产生0.8kb扩增产物的引物对F3855(SEQ ID NO 35)和R3856(SEQID NO 36)(表4)，前提是使用来自二年生系的基因组DNA作为模板，但是不为一年生系(annual line)提供扩增。

在一个实施方案中，本发明涉及在显示二年生基因型的糖用甜菜植物的植物分组内鉴定特定单元型的方法，包括：

a)自要分析的糖用甜菜植物获得基因组样品；

b)分析糖用甜菜基因组中与B基因遗传紧密连锁且与依照本发明的和如本文所述的多核苷酸互补或包含依照本发明的和如本文所述的多核苷酸的基因组区域的核苷酸序列；并

c)比较所述序列与已知与特定单元型有关的等位基因序列。

在一个具体的实施方案中，使用基于多核苷酸或其信息片段或基于一种或众多引物、特别是一种或众多引物对、但尤其是由依照本发明的和如本文所述的正向引物和反向引物组成的一种或众多引物对的分子标志物进行序列分析。

在另一个具体的实施方案中，提供了鉴定糖用甜菜植物中与一年生有关的等位基因的缺失或存在的方法，包括

a)自要分析的糖用甜菜植物获得基因组样品；

b)分析通过基于SEQ ID NO：7所示正向引物PRR7-F和SEQ ID NO：8所示反向引物PRR7-R的PCR扩增自糖用甜菜基因组可得到的内含子区的核苷酸序列；并

c)比较所述序列与已知分别与二年生表型和一年生表型有关的等位基因序列。

在一个实施方案中，所述内含子区与SEQ ID NO：2所示核苷酸序列具有至少70％、特别是至少75％、更特别的是至少80％、甚至更特别的是至少85％、但尤其是至少90％和多至至少95％-99％序列同一性。

在还有一个具体的实施方案中，所述内含子区具有SEQ ID NO：2所示核苷酸序列。

在另一个具体的实施方案中，提供了鉴定糖用甜菜植物中与一年生有关的等位基因的缺失或存在的方法，包括

a)自要分析的糖用甜菜植物获得基因组样品；

b)分析包含SEQ ID NO：5所示核苷酸序列的基因组区域的核苷酸序列；

c)比较所述序列与已知分别与二年生表型和一年生表型有关的等位基因序列；并

d)确定所述基因组样品是来自代表呈现一年生表型或是呈现二年生表型的基因组。

在还有一个具体的实施方案中，提供了一种方法，其中在来自糖用甜菜植物的基因组样品内，使用所述内含子区内已知包含多态性位点的亚区侧翼的正向和反向引物分析依照本发明的和如本文所述的多核苷酸的内含子区，扩增所述亚区，并比较扩增得到的片段与已知分别与二年生表型和一年生表型有关的等位基因序列。

在另一个具体的实施方案中，提供了如本文所述的方法，其中基于所述SNP设计一组探针多核苷酸，其包含相差至少一处错配(特别是位于邻近位点的两处或更多处错配，但尤其是一处单一错配)的两种不同探针分子，其中第一探针分子(特别是经标记的探针分子，更特别的是用第一荧光染料和淬灭剂标记的探针分子)呈现一种等位基因，而第二探针分子(特别是经标记的探针分子，更特别的是用不同于第一染料的第二荧光染料和淬灭剂标记的探针分子)呈现另一等位基因，且其中所述探针多核苷酸组用于区分两种等位基因变体。

具体而言，依照本发明的标志物可用于等位基因区分测定法、特别是用于区分显示二年生基因型的糖用甜菜植物的植物分组内的不同单元型的测定法。所述测定法基于一组探针多核苷酸，其包含两种不同探针分子，与例如通过基于SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8分别所示正向引物PRR7-F和反向引物PRR7-R的PCR扩增可得到的BvPRR7基因亚区互补的，该探针分子只因一个碱基错配、特别是位于#631的碱基错配而不同。

第一探针分子(特别是具有SEQ ID NO：9所示序列且用第一荧光染料诸如例如FAM标记的探针分子，更特别的是用第一荧光染料和淬灭剂)呈现第一等位基因，而第二探针分子(特别是具有SEQ ID NO：10所示序列且用不同于第一染料的第二荧光染料诸如例如VIC标记的探针分子，更特别的是用第二荧光染料和淬灭剂)呈现另一等位基因。

在一个实施方案中，提供了用于在糖用甜菜基因组中与一年生表型共分离的基因组区域中检测多态性(特别是基于SNP、SSR、至少一个核苷酸的缺失或插入的多态性、但尤其是基于SNP的多态性)的等位基因区分测定法，该多态性鉴定B基因座处的B等位基因且容许区分一年生和二年生基因型，包括基于依照本发明的和如本文所述的多核苷酸或其任何信息片段开发的分子标志。

在一个具体的实施方案中，所述分子标志物包含依照本发明的和如本文所述的一对引物。

在另一个具体的实施方案中，提供了用于检测通过基于SEQ ID NO：7所示正向引物PRR7-F和SEQ ID NO：8所示反向引物PRR7-R的PCR扩增自糖用甜菜基因组可得到的内含子区中单碱基多态性的等位基因区分测定法，包括依照本发明的和如本文所述的一组引物和/或探针多核苷酸。

在一个实施方案中，所述内含子区与SEQ ID NO：2所示核苷酸序列具有至少70％、特别是至少75％、更特别的是至少80％、甚至更特别的是至少85％、但尤其是至少90％和多至至少95％-99％序列同一性。

在还有一个具体的实施方案中，所述内含子区具有SEQ ID NO：2所示核苷酸序列。

在一个实施方案中，本发明涉及依照本发明的和如本文所述的多核苷酸用于开发如下分子标志物的用途，所述分子标志物用于鉴定糖用甜菜基因组中与一年生有关的等位基因的缺失或存在，包括：

a)在所述多核苷酸中鉴定多态性位点；

b)将所述多态性同糖用甜菜中与一年生有关的等位基因的缺失或存在关联起来；并

c)设计识别此多态性位点侧翼核苷酸序列的一种探针分子或众多探针分子、特别是一种引物或众多引物、特别是一对引物或众多引物对、但尤其是正向和反向引物来扩增可用于等位基因区分测定法的、包含所述多态性位点的多核苷酸。

在一个实施方案中，本发明涉及在商业性种子中鉴定一年生污染物的方法，其中使用依照本发明的和如本文所述的多核苷酸或其信息片段作为标志，用于确定植物样品中一年生等位基因的存在或缺失。

具体而言，本发明涉及在商业性种子中鉴定一年生污染物的方法，其中使用依照本发明的和如本文所述的多核苷酸或其信息片段作为标志物，用于在商业性种子中鉴定一年生污染物。

在一个实施方案中，本发明涉及使用依照本发明的和如本文所述的基于标志物的等位基因区分测定法在商业性种子中鉴定一年生污染物(contamination)的方法。

本发明进一步涉及B基因、特别是BvPRR7基因在用于生成显示一年生或不抽苔表型的植物的转基因方法中的用途。

具体而言，本发明涉及包含表达盒的嵌合构建体，所述表达盒包含B基因编码序列、特别是SEQ ID NO：1所示BvPRR7编码序列、但特别是在SEQ IDNO：52或其中具有至少70％、特别是至少75％、更特别的是至少80％、甚至更特别的是至少85％、但尤其是至少90％和多至至少95％-99％序列同一性的序列中，在调控元件控制下，特别是在在植物中有功能的调控元件控制下。

在一个实施方案中，本发明提供了包含表达盒的嵌合构建体，所述表达盒包含B基因编码序列、特别是SEQ ID NO：1所示BvPRR7编码序列、但特别是在SEQ ID NO：52或其中具有至少70％、特别是至少75％、更特别的是至少80％、甚至更特别的是至少85％、但尤其是至少90％和多至至少95％-99％序列同一性的序列中，其在一年生启动子和终止子序列(诸如PRR7基因、特别是甜菜PRR7基因中提供的那些)控制下。

在本发明的一个实施方案中，本文所述嵌合构建体可进一步含有选择标志基因，其容许在选择规程中区分已转化的与未转化的植物材料。

在一个实施方案中，本发明的嵌合构建体包含负选择标志，特别是编码植物毒性化合物(诸如抗生素或除草剂)抗性的选择标志。

在一个实施方案中，本发明的嵌合构建体包含正选择标志，特别是编码如下酶的选择标志，所述酶为转化植物提供胜过非转化植物的选择优势，特别是营养优势，诸如例如磷酸甘露糖异构酶基因、木糖异构酶基因。

在本发明的一个实施方案中，提供了转化载体和/或表达载体，特别是植物转化载体和/或表达载体，其包含如本文所述的本发明嵌合构建体。

在本发明的一个实施方案中，提供了植物细胞，特别是糖用甜菜植物的植物细胞，其包含依照本发明的和如本文所述的嵌合多核苷酸构建体或载体分子。

在本发明的一个实施方案中，提供了植物，特别是糖用甜菜植物，其包含本发明的植物细胞且表达B基因蛋白质(特别是BvPRR7蛋白质)，使得植物显示一年生表型。

在本发明的一个实施方案中，提供了多核苷酸构建体，其用于对BvPRR7基因表达的转基因遏制，特别是经由反义或RNAi方法。

在本发明的一个实施方案中，提供了多核苷酸构建体，其包含编码如下dsRNA的核苷酸序列，所述dsRNA能够靶向由编码B基基因蛋白质(特别是BvPRR7蛋白质)的DNA序列转录生成的mRNA来降解。

在一个实施方案中，提供了多核苷酸构建体，其包含编码与B基因编码序列(特别是SEQ ID NO：1所示BvPRR7基因的编码区，但特别是在SEQ IDNO：52或其中具有至少70％、特别是至少75％、更特别的是至少80％、甚至更特别的是至少85％、但尤其是至少90％和多至至少95％-99％序列同一性的序列中)的至少一个区域基本上相同的dsRNA的核苷酸序列。

在本发明的一个实施方案中，提供了多核苷酸构建体，其包含B基因编码区的片段，特别是SEQ ID NO：1所示BvPRR7基因编码区的片段，但特别是在SEQ ID NO：52或其中具有至少70％、特别是至少75％、更特别的是至少80％、甚至更特别的是至少85％、但尤其是至少90％和多至至少95％-99％序列同一性的序列中，其装配入RNAi盒中，在组成性启动子(诸如例如来自拟南芥的Ubi3启动子)控制下。

在本发明的一个实施方案中，提供了转化载体和/或RNAi表达载体，特别是植物转化载体和/或表达载体，其包含如本文所述的本发明多核苷酸构建体。

在本发明的一个实施方案中，提供了一种植物细胞，其包含依照本发明的和如本文所述的多核苷酸构建体或载体分子。

在本发明的一个实施方案中，提供了一种植物，特别是糖用甜菜植物，其包含本发明的植物细胞且表达dsRNA，使得抽苔受到遏制且植物显示不抽苔表型。

附图和序列简述

附图

图1：不同物种间的REC域和糖用甜菜EST CV301305的推定REC域的氨基酸序列比较。相同的氨基酸以黑色标示；保守的氨基酸以灰色标示；弱相似的氨基酸以浅灰色标示；而不相似的氨基酸以白色标示。Bb，支气管炎博德特氏菌(Bordetella bronchiseptica)；Bs，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)；Bv，甜菜(Beta vulgaris)；Ec，大肠埃希氏菌/大肠杆菌(Escherichia coli)；Kp，肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)；Pa，铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)；Rc，荚膜红细菌(Rhodobacter capsulatus)；Sc，天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)；Sf，弗氏志贺氏菌(Shigella flexneri)；St，鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)。

图2：拟南芥PRR7蛋白质与来自糖用甜菜EST CV301305的预测部分蛋白质的氨基酸序列比较。相同的氨基酸以黑色标示；相似的氨基酸以灰色标示；而不相似的氨基酸以白色标示。

图3：拟南芥PRR7基因与糖用甜菜EST CV301305之间的基因组和mRNA序列的序列比对。拟南芥与甜菜之间保守的核苷酸以灰色标示。内含子以长划串代表。

图4：糖用甜菜染色体II的遗传学图。染色体右边给出了标志物名称，左边标示了累积遗传距离。

图5：BvPRR7基因的基因结构的示意图，显示了推定的外显子和内含子。由EST CV301305覆盖的区域以黑色箭头显示了。

图6：拟南芥PRR基因家族成员和BvPRR7蛋白质的氨基酸序列比较。相同的氨基酸以黑色标示；保守的氨基酸以灰色标示；弱相似的氨基酸以浅灰色标示；而不相似的氨基酸以白色标示。框示了REC和CCT基序。

图7：BvPRR7与来自其它开花植物的相关基因之间的系统发生关系。使用ClustalW比对BvPRR7的预测氨基酸序列与上文所列蛋白质，并构建无根形态发生树。进化史是使用Neighbor-Joining法(Saitou和Nei，1987)推导的。采用自1000个复制品推导出的自展共有树来代表所分析的分类单位的进化史(Felsenstein，1985)。折叠与在少于50％的自展复制品中再现的分区对应的分支。在分支的后面显示了复制树(replicate tree)的百分比，其中相关的分类单位在自展(bootstrap)测试(1000个复制品)中簇集到一起。该树是按比例绘制的，分支长度的单位与用于推导系统发生树的进化距离的相同。进化距离是使用Poisson矫正法(Zuckerkandl和Pauling，1965)计算的，单位为每个位点的氨基酸替代数目。自数据集消除所有含有缺口和缺失数据的位置(完全缺失选项)。最终的数据集中有总共352个位置。形态发生分析是在MEGA4软件(Tamura等，2007)中进行的。At PRR3，拟南芥(Arabidopsis thaliana)PRR3(NP_568919)；At PRR5，拟南芥(Arabidopsis thaliana)PRR5(NP_568446)；At PRR7，拟南芥(Arabidopsis thaliana)PRR7(NP_568107)；At PRR9，拟南芥(Arabidopsis thaliana)PRR9(NP_566085)；At TOC1，拟南芥(Arabidopsis thaliana)TOC1/PRR1(HP_200946)；Hv PPD-H1，大麦(Hordeum vulgare)PPD-H1(AAY17586)；Os PRR37，稻(Oryza sativa)PRR37(Q0D3B6)；Ta PPD-D1，普通小麦(Triticum aestivum)PPD-D1(ABL09477)。

图8：在长日照(16小时亮，8小时暗)和恒温18℃下种植的二年生糖用甜菜植株中的BvPRR7基因表达谱。数值表述成通过几何平均分析(Vandesompele等，2002)针对BvBTU和BvICDH参照基因标准化的相对表达水平。

图9：用于转化在一年生BvPRR7启动子片段控制下的BvPRR7 cDNA的二元载体的质粒图。选择标志由在HSP80启动子(Brunke和Wilson，1993)控制下的PMI基因组成。

图10：用于借助RNAi来转基因遏制BvPRR7的二元载体的质粒图。BvPRR7的倒置重复由0.6kb cDNA片段组成，以由来自马铃薯的StLS1基因第二内含子(Eckes等，1986；Vancanneyt等，1990)分开的反义和有义两种取向克隆在Ubi3启动子(Norris等，1993)与Nos终止子之间。选择标志由在HSP80启动子(Brunke和Wilson，1993)控制下的PMI基因组成。

序列

SEQ ID NO：1描绘了EST CV301305的核苷酸序列

SEQ ID NO：2描绘了BvPRR7内含子3的核苷酸序列及其用于作图的等位基因变应性

SEQ ID NO：3描绘了BvPRR7等位基因变体1(单元型#1)内含子3的核苷酸序列

SEQ ID NO：4描绘了BvPRR7等位基因变体2(单元型#2)内含子3的核苷酸序列

SEQ ID NO：5描绘了BvPRR7的基因组核苷酸序列

SEQ ID NO：6描绘了BvPRR7的推定氨基酸序列

SEQ ID NO：7描绘了引物PRR7-F的核苷酸序列

SEQ ID NO：8描绘了引物PRR7-R的核苷酸序列

SEQ ID NO：9描绘了探针PRR7(T1)-FAM的核苷酸序列

SEQ ID NO：10描绘了探针PRR7(T1)-VIC的核苷酸序列

SEQ ID NO：11描绘了正向引物BvPRR7的核苷酸序列

SEQ ID NO：12描绘了反向引物BvPRR7的核苷酸序列

SEQ ID NO：13描绘了正向引物BvBTU的核苷酸序列

SEQ ID NO：14描绘了反向引物BvBTU的核苷酸序列

SEQ ID NO：15描绘了正向引物BvICDH的核苷酸序列

SEQ ID NO：16描绘了反向引物BvICDH的核苷酸序列

SEQ ID NO：17描绘了引物F3766的核苷酸序列

SEQ ID NO：18描绘了引物R3767的核苷酸序列

SEQ ID NO：19描绘了引物F3354的核苷酸序列

SEQ ID NO：20描绘了引物R3355的核苷酸序列

SEQ ID NO：21描绘了引物F3768的核苷酸序列

SEQ ID NO：22描绘了引物R3769的核苷酸序列

SEQ ID NO：23描绘了引物F3782的核苷酸序列

SEQ ID NO：24描绘了引物R3783的核苷酸序列

SEQ ID NO：25描绘了引物F3784的核苷酸序列

SEQ ID NO：26描绘了引物R3785的核苷酸序列

SEQ ID NO：27描绘了引物F3806的核苷酸序列

SEQ ID NO：28描绘了引物R3807的核苷酸序列

SEQ ID NO：29描绘了引物F3808的核苷酸序列

SEQ ID NO：30描绘了引物R3809的核苷酸序列

SEQ ID NO：31描绘了引物F3810的核苷酸序列

SEQ ID NO：32描绘了引物R3811的核苷酸序列

SEQ ID NO：33描绘了引物F3853的核苷酸序列

SEQ ID NO：34描绘了引物F3854的核苷酸序列

SEQ ID NO：35描绘了引物F3855的核苷酸序列

SEQ ID NO：36描绘了引物R3856的核苷酸序列

SEQ ID NO：37描绘了引物F3857的核苷酸序列

SEQ ID NO：38描绘了引物R3858的核苷酸序列

SEQ ID NO：39描绘了引物F3859的核苷酸序列

SEQ ID NO：40描绘了引物R3860的核苷酸序列

SEQ ID NO：41描绘了引物F3861的核苷酸序列

SEQ ID NO：42描绘了引物R3862的核苷酸序列

SEQ ID NO：43描绘了引物F3863的核苷酸序列

SEQ ID NO：44描绘了引物R3864的核苷酸序列

SEQ ID NO：45描绘了引物F3865的核苷酸序列

SEQ ID NO：46描绘了引物R3866的核苷酸序列

SEQ ID NO：47：描绘了探针PRR7(#3827)-FAM的核苷酸序列

SEQ ID NO：48：描绘了探针PRR7(#3827)-VIC的核苷酸序列

SEQ ID NO：49：描绘了用于基因表达分析的正向引物BvPRR7的核苷酸序列

SEQ ID NO：50：描绘了用于基因表达分析的反向引物BvPRR7的核苷酸序列

SEQ ID NO：51：描绘了包括大约13kb启动子区的BvPRR7基因组核苷酸序列的核苷酸序列。

SEQ ID NO：52：描绘了BvPRR7编码区的核苷酸序列。

发明详述

定义

如果本文中下文没有另外指明，一般给予本申请范围内使用的技术术语和表述以植物分子生物学有关领域中通常应用于它们的含义。

如本说明书和所附权利要求书中所使用的，单数形式“一个”、“一种”、和“所述”、“该”包括复数称谓，除非上下文另外明确指明。如此，例如，提到“一株/种植物”包括一或多株/种植物，而提到“一个/种细胞”包括细胞、组织、等等的混合物。

“糖用甜菜”指甜菜(Beta)属内的所有种和亚种，以及甜菜(Betavulgaris)的所有种类栽培甜菜。已经将栽培的甜菜分成四组：leaf beet、gardenbeet、饲料甜菜(fodder beet)和糖用甜菜(sugar beet)。“糖用甜菜”也指所有栽培甜菜，包括那些为制糖以外的目的(诸如乙醇、塑料或工业产品)而种植的。具体而言，“糖用甜菜”指饲料甜菜和糖用甜菜，但是尤其指糖用甜菜。

“一年生糖用甜菜系”指以杂合或纯合状态在B基因座处含有显性等位基因b的糖用甜菜植物。

“二年生糖用甜菜系”指以纯合状态在B基因座处含有隐性等位基因b的糖用甜菜植物。

“抽苔”指自营养性莲座阶段向花序或生殖性生长阶段的转换。

如本文中所使用的，“B基因”指在糖用甜菜中负责早期抽苔的基因。携带显性等位基因的植物在先前没有暴露于低温的情况中发生枝条延长，接着开花。

“春化”指有些植物中将植物暴露于冷一段时间促进成花诱导的过程。

“等位基因”在本发明范围内理解为指与不同形式的基因或任何种类的可鉴定遗传元件有关的各种遗传单元的交替形式，因为它们位于同源染色体中的相同基因座，所以它们在遗传方面是交替的。在二倍体细胞和生物体中，给定基因(或标志物)的两个等位基因通常占据一对同源染色体的对应基因座。

如本文中所使用的，术语“育种”及其语法变形指生成后代个体的任何过程。育种可以是有性的或无性的，或其任意组合。例示性的非限制性类型的育种包括杂交、自交、重双单倍体衍生物生成、及其组合。

“基因座”在本发明范围内理解为指染色体上包含基因或任何其它促成性状的遗传元件或因子的区域。

如本文中所使用的，短语“遗传标志物”指与一个或多个感兴趣基因座有关的个体基因组特征(例如存在于个体基因组中的核苷酸或多核苷酸序列)。在一些实施方案中，遗传标志物在感兴趣群体和由多态性占据的基因座中是多态性的，这取决于上下文。遗传标志物包括例如单核苷酸多态性(SNP)、插入/缺失、简单序列重复(SSR)、限制性片段长度多态性(RFLP)、随机扩增多态性DNA(RAPD)、切割扩增多态性序列(CAPS)标志物、多样性阵列技术(DArT)标志物、和扩增片段长度多态性(AFLP)、等许多其它例子。遗传标志物可以用于例如在染色体上定位含有促成表型性状表达变应性的等位基因的遗传基因座。短语“遗传标志物”还可以指与基因组序列互补的多核苷酸序列，诸如用作探针的核酸序列。

遗传标志物可以在物理上位于染色体上与它相关的遗传基因座之内或之外的位置中(即分别是基因内的或基因外的)。换言之，虽然当与感兴趣基因座对应的基因在染色体上的位置尚未鉴定且遗传标志物和感兴趣基因座之间的重组率非零时通常采用遗传标志物，但是当前公开的主题也可以采用在物理上在遗传基因座边界内的遗传标志物(例如在与基因对应的基因组序列之内，诸如但不限于基因内含子或外显子内的多态性)。在当前公开的主题的一些实施方案中，一种或多种遗传标志物包含1-10种标志物，而在一些实施方案中，一种或多种遗传标志物包含超过10种遗传标志物。

如本文中所使用的，短语“信息片段”指具有可回收的且能帮助测定和/或表征感兴趣遗传基因座的信息内容的多核苷酸片段。此信息内容可以由与所述感兴趣基因座有关的多态性来代表，诸如例如单核苷酸多态性(SNP)、插入/缺失、简单序列重复(SSR)、限制性片段长度多态性(RFLP)、随机扩增多态性DNA(RAPD)、切割扩增多态性序列(CAPS)标志物、多样性阵列技术(DArT)标志物、和扩增片段长度多态性(AFLP)、等许多其它例子，而且可用于开发遗传标志物。此类“信息片段”的信息内容也可以由能通过相应探针分子来检测的特定序列来代表。

如本文中所使用的，短语“表型性状”指个体源自其基因组与环境相互作用的外观或其它可检测特征。

“基于标志物的选择”在本发明范围内理解为指使用遗传标志物来检测一种或多种来自植物的核酸，其中所述核酸与期望性状有关以鉴定携带关于期望(或不期望)性状的基因的植物，使得那些植物可用于(或避免用于)选择性育种程序。

“微卫星或SSR(简单序列重复)(标志物)”在本发明范围/内理解为指一类由DNA碱基短序列的众多重复组成的遗传标志物，其见于遍及植物DNA的基因座，而且有高度多态性的可能性。

“PCR(聚合酶链式反应)”在本发明范围内理解为指生成相对较大量的DNA特定区域的方法，由此使得各种基于那些区域的分析成为可能。

“PCR引物”在本发明范围内理解为指特定DNA区域的PCR扩增中使用的相对较短的单链DNA片段。

“表型”在本发明范围内理解为指遗传控制性状的可区分特征。

“多态性”在本发明范围内理解为指群体中存在两种或更多种形式的基因、遗传标志物、或遗传性状。

“选择性育种”在本发明范围内理解为指使用拥有或显示期望性状的植株作为亲本的育种程序。

术语“多核苷酸”在本文中理解为指由含有糖、磷酸根和碱基(或是嘌呤或是嘧啶)的单体(核苷酸)构成的高分子量的聚合物分子，其可以是单链的或双链的。“多核苷酸片段”是给定多核苷酸分子的一部分。在高等植物中，脱氧核糖核酸(DNA)是遗传物质，而核糖核酸(RNA)涉及将DNA内所含信息转移至蛋白质。“基因组”是生物体的每个细胞中所含遗传物质的整体。如此，术语“多核苷酸”指DNA或RNA聚合物，其可以是单链的或双链的，任选含有能够掺入DNA或RNA聚合物的合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基。除非另外指明，本发明的特定核酸序列还隐含地涵盖其保守修饰变体(例如简并密码子替代)和互补序列，就像明确指明的序列。具体而言，简并密码子替代可通过生成其中一个或多个选定(或所有)密码子的第三位用混和碱基和/或脱氧肌苷残基替代的序列来实现(Batzer等，1991；Ohtsuka等，1985；Rossolini等，1994)。术语多核苷酸与核酸、核苷酸序列可互换使用，而且可包括基因、由基因编码的mRNA、cDNA、等。

本发明的多核苷酸理解为以分离的形式提供。术语“分离的”意味着本文中所公开的和要求保护的多核苷酸不是像它在其天然背景中出现的那样的多核苷酸，如果它确实有天然存在对应物的话。因而，下文进一步描述的本发明其它化合物理解为是分离的。如果在植物基因组的背景中要求保护，本发明的多核苷酸与天然存在对应物的区别在于基因组中的插入位点和插入位点处的侧翼序列。

如本文中所使用的，短语“核酸”指能与核苷酸串对应的，单体单元的任何物理串，包括核苷酸聚合物(例如典型的DNA或RNA聚合物)、修饰的寡核苷酸(例如包含对于生物学RNA或DNA而言不是典型的碱基的寡核苷酸，诸如2′-O-甲基化寡核苷酸)、诸如此类。在一些实施方案中，核酸可以是单链的、双链的、多链的、或其组合。除非另外指明，当前公开主题的特定核酸序列任选在任何明确指明的序列之外还包含或编码互补序列。

术语“基因”广泛用于指与生物学功能有关的任何核酸区段。如此，基因包括其表达需要的编码序列和/或调控序列。例如，基因指表达mRNA或功能性RNA或编码特定蛋白质且包括调控序列的核酸片段。基因还包括不表达的DNA区段，其例如形成其它蛋白质的识别序列。基因可以自多种来源分离，包括自感兴趣来源分离或自已知或预测序列信息合成，而且可以包括设计成具有期望参数的序列。

“标志物基因”编码可选择或可筛选的性状。

术语“嵌合基因”指含有以下各项的任何基因：1)没有在自然界中一起找到的DNA序列，包括调控和编码序列，或2)编码天然不相连的、蛋白质各部分的序列，或3)天然不相连的、启动子各部分。因而，嵌合基因可包含自不同来源衍生的调控序列和编码序列，或包含自相同来源衍生的但以与在自然界中找到的方式不同的方式排列的调控序列和编码序列。

“转基因”指已经通过转化导入基因组中并稳定维持的基因。转基因可包括例如对于要转化的特定植物的基因而言异源或同源的基因。另外，转基因可包含插入非天然生物体的天然基因，或嵌合基因。

术语“蛋白质”、“肽”和“多肽”在本文中可互换使用。

“编码序列”指编码特定氨基酸序列且排除非编码序列的DNA或RNA序列。它可构成“不中断的编码序列”，即缺少内含子，诸如cDNA，或者它可包括一个或多个以适宜剪接点为界的内含子。“内含子”是包含在初级转录物中但经由细胞内为创建能翻译成蛋白质的成熟mRNA对RNA的切割和再连接被切除的RNA序列。

“启动子”指通常位于其编码序列上游(5′)的核苷酸序列，其通过提供正确转录需要的RNA聚合酶识别和其它因子来控制编码序列的表达。“启动子”包括最小启动子，它是由TATA框和承担规定转录起始位点的其它序列构成的短DNA序列，向其添加用于控制表达的调控元件。“启动子”还指包括最小启动子加能够控制编码序列或功能性RNA表达的调控元件的核苷酸序列。此类启动子序列由近端和更多远端上游元件组成，后一类元件常常称作增强子。因而，“增强子”是能刺激启动子活性的DNA序列，而且可以是启动子的内在元件或为了增强启动子的水平或组织特异性而插入的异源元件。它能够以两个方向(正常的或倒转的)运转，而且甚至在移动到启动子上游或下游时仍能够运行。增强子和其它上游启动子元件都结合介导其效应的序列特异性DNA结合蛋白。启动子可以整体衍生自天然基因，或者由自在自然界中找到的不同启动子衍生的不同元件构成，或者甚至由合成DNA区段构成。启动子还可以含有涉及响应生理或发育条件控制转录起始效率的蛋白质因子的结合的DNA序列。

“起始位点”是围绕作为所转录序列一部分的第一个核苷酸(也定义为+1位置)的位置。就此位点而言，对基因及其控制区的所有其它序列编号。下游序列(即3′方向的其它蛋白质编码序列)命名为正数，而上游序列(主要是5′方向的控制序列)命名为负值。

在上游激活缺失的情况中没有活性或具有大大降低的启动子活性的启动子元件，特别是TATA元件称作“最小或核心启动子”。在存在合适转录因子的情况中，最小启动子发挥允许转录的功能。如此，“最小或核心启动子”仅仅由转录起始需要的所有基础元件(例如TATA框和/或起始子)组成。

“组成性表达”指使用组成性或可调型启动子的表达。“条件性”和“可调型表达”指由可调型启动子控制的表达。

“组成性启动子”指能够在所有或几乎所有植物组织中在植物的所有或几乎所有发育阶段期间表达它控制的可读框(ORF)的启动子。每一个转录激活元件不显示绝对组织特异性，但是在大多数植物部分中以转录最有活性的植物部分中达到的水平1％以上的水平介导转录激活。

“可调型启动子”指以不是组成性的，而是时间和/或空间受调控的方式指导基因表达的启动子，而且包括组织特异性的和诱导型的启动子。它包括天然的和合成的序列，以及可以是合成序列与天然序列的组合的序列。不同启动子可以在不同组织或细胞类型中、在发育的不同阶段、或响应不同环境条件指导基因表达。不断地发现在植物细胞中有用的各种类型新启动子，众多例子可见于汇编Okamuro等(1989)。在植物中有用的典型的可调型启动子包括但不限于安全剂可诱导的启动子、自四环素可诱导系统衍生的启动子、自水杨酸可诱导系统衍生的启动子、自醇可诱导系统衍生的启动子、自糖皮质激素可诱导系统衍生的启动子、自病原体可诱导系统衍生的启动子、和自蜕皮激素可诱导系统衍生的启动子。

“组织特异性启动子”指不是在所有植物细胞中表达，而是只在特定器官(诸如叶或种子)、特定组织(诸如胚或子叶)、或特定细胞类型(诸如叶薄壁组织或种子贮藏细胞)的一种或多种细胞类型中表达的可调型启动子。这些还包括时间受调控的启动子，诸如在胚胎发生的早期或晚期、在种子或果实发育中果实成熟期间、或在完全分化的叶中、或在衰老开始时。

“诱导型启动子”指那些能在一种或多种细胞类型中被外部刺激(诸如化学制品、光、激素、压力、或病原体)开启的可调型启动子。

“可操作连接”指单一核酸片段上各核酸序列的联系，使得一核酸序列的功能受到另一核酸序列的影响。例如，若调控DNA序列和编码RNA或多肽的DNA序列的定位使得调控DNA序列影响编码DNA序列的表达(即编码序列或功能性RNA处于启动子的转录控制下)，则说这两序列“可操作连接”或“相关”。编码序列可以以有义或反义取向与调控序列可操作连接。

“表达”指内源基因、ORF或其部分的、或转基因在植物中的转录和/或翻译。例如，就反义构建体而言，表达可以仅仅指反义DNA的转录。另外，表达指有义(mRNA)或功能性RNA的转录和稳定积累。表达还可以指蛋白质的生成。

“过表达”指转基因细胞或生物体中的表达水平超过正常或未转化(非转基因)细胞或生物体中的表达水平。

“反义抑制”指能够遏制自内源基因或转基因表达蛋白质的反义RNA转录物的生成。

“基因沉默”指对病毒基因、转基因、或内源细胞核基因的，同源性依赖性遏制。基因沉默可以是转录的，这时遏制是由于受影响基因的转录降低，或者是转录后的，这时是由于与受影响基因同源的RNA种类的周转(降解)升高(English等，1996)。基因沉默包括病毒诱导的基因沉默(Ruiz等，1998)。

如本文中所使用的，术语“杂交”指常规杂交条件，优选如下的杂交条件，其中使用5x SSPE，1％SDS，1x Denhardts溶液作为溶液和/或杂交温度介于35℃和70℃之间，优选65℃。杂交后，优选首先用2x SSC，1％SDS进行清洗，随后用0.2x SSC进行清洗，温度介于35℃和75℃之间，特别是介于45℃和65℃之间，但是尤其是59℃(关于SSPE、SSC和Denhardts溶液的定义参见Sambrook等见上文)。举例而言，Sambrook等，见上文中记载的高严格性杂交条件是特别优选的。例如，若如上所述于65℃进行杂交和清洗，则存在特别优选的严格杂交条件。例如，于45℃进行杂交和清洗的非严格杂交条件优选程度较低，而35℃甚至更低。

“序列同源性或序列同一性”在本文中可互换使用。处于“相同”或百分比“同一性”在两种或更多种核酸或蛋白质序列的语境中指在为了最大对应而比对或比较时，如使用下述序列比较算法之一或通过肉眼检查所测量的，两种或更多种序列或亚序列是相同的或具有特定百分比的、相同的氨基酸残基或核苷酸。若要彼此比较的两种序列长度不同，则序列同一性优选涉及较短序列中与较长序列的核苷酸残基相同的核苷酸残基的百分比。序列同一性可使用计算机程序诸如Bestfit程序(Wisconsin Sequence Analysis Package，Version 8 for Unix，Genetics Computer Group，University Research Park，575Science Drive Madison，WI 53711)常规测定。Bestfit利用Smith和Waterman，Advances in Applied Mathematics 2(1981)，482-489的局部同源性算法来寻找两种序列间具有最高序列同一性的区段。在使用Bestfit或另一种序列比对程序来测定特定序列是否与本发明参比序列具有例如95％同一性时，优选调整参数使得在参比序列全长上计算同一性百分比且容许参比序列中有占核苷酸总数多至5％的同一性缺口。在使用Bestfit时，所谓的任选参数优选保留它们的预设(“默认/缺省”)值。在给定序列与上文所述本发明序列之间的比较中出现的偏差可能是由添加、缺失、替代、插入或重组引起的。优选的是，此类序列比较也可以用程序“fasta20u66”(2.0u66版，1998年9月，William R.Pearson和弗吉尼亚大学；还可参见Pearson，1990，appended examples和http://workbench.sdsc.edu/)进行。为此目的，可使用“默认”参数。

两种核酸序列基本上相同的另一项指标是这两种分子在严格条件下彼此杂交。短语“特异性杂交”指当特定核苷酸序列存在于复杂混合物(例如总细胞DNA或RNA)中时，在严格条件下一种分子只与该序列结合、形成双链、或杂交。“基本上结合”指探针核酸与靶核酸之间的互补性杂交，而且涵盖微小错配，其可以通过降低杂交介质的严格性来容许，用以实现对靶核酸序列的期望检测。

“严格杂交条件”和“严格杂交清洗条件”在核酸杂交实验诸如Southern和Northern杂交的语境中是序列依赖性的，而且在不同环境参数下是不同的。较长的序列在较高的温度特异性杂交。关于核酸杂交的广泛指导可参见Tijssen P.，1993 Laboratory Techniques in Biochemistry and MolecularBiology-Hybridization with Nucleic Acid Probes part I chapter 2″Overview ofprinciples of hybridisation and the strategy of nucleic acid probe assays″Elsevier，New York。一般而言，高度严格杂交和清洗条件选择成比特定序列在限定离子强度和pH的热解链点(T_m)低大约5℃。典型的是，在“严格条件”下，探针会与其靶亚序列杂交，但不与其它序列杂交。

T_m是50％的靶序列与完全匹配的探针杂交的温度(在限定的离子强度和pH下)。很严格的条件选择成等于特定探针的T_m。具有超过100个互补残基的互补核酸在滤器上在Southern或Northern印迹中的杂交的严格杂交条件的一个例子是50％甲酰胺及1mg肝素，杂交于42℃进行过夜。高度严格的清洗条件的一个例子是0.15M NaCl于72℃大约15分钟。严格清洗条件的一个例子是用0.2x SSC于65℃清洗15分钟(关于SSC缓冲液的说明参见Sambrook，见下文)。通常，高严格清洗之前有低严格清洗以消除背景探针信号。用于例如超过100个核苷酸的双链体的中等严格性清洗的一个例子是1x SSC于45℃15分钟。用于例如超过100个核苷酸的双链体的低严格清洗的一个例子是4-6x SSC于40℃15分钟。对于短探针(例如大约10-50个核苷酸)，严格条件通常涉及低于大约1.0M Na离子、通常大约0.01-1.0M Na离子浓度(或其它盐)的盐浓度，于pH 7.0-8.3，而且温度通常是至少大约30℃。严格条件还可以通过添加去稳定剂诸如甲酰胺来实现。一般而言，特定杂交测定法中用无关探针观察到的信噪比2倍(或更高)的信噪比指示检测到特异性杂交。若由核酸编码的蛋白质基本上相同，则在严格条件下彼此不杂交的核酸仍然是基本上相同的。这发生于例如使用遗传密码容许的最大密码子简并性来创建核酸拷贝的时候。

“植物”是处于任何发育阶段的任何植物，特别是种子植物。

“植物细胞”是植物的结构和生理单元，包含原生质体和细胞壁。植物细胞可以是分离的单细胞或培养的细胞的形式，或者是更高级的、有组织的单元诸如例如植物组织、植物器官、和完整植株的一部分。

“植物细胞培养物”指植物单元，诸如例如原生质体、细胞培养细胞、植物组织中的细胞、花粉、花粉管、胚珠、胚囊、合子和各种发育阶段的胚的培养物。

“植物材料”指植物的叶、茎、根、花或花的各部分、果实、花粉、卵细胞、合子、种子、插条、细胞或组织培养物、或任何其它部分或产物。

“植物器官”是植物的独特的且明显有结构的且分化的部分，诸如根、茎、叶、花芽、或胚。

如本文中所使用的，“植物组织”指组织成结构和功能单元的一组植物细胞。包括种植或培养的植物的任何组织。此术语包括但不限于完整植株、植物器官、植物种子、组织培养物和组织成结构和/或功能单元的任何植物细胞组。此术语在连同上文所列或此定义以其它方式涵盖的任何特定类型植物组织或在没有任何特定类型植物组织的情况中的使用并非意图排除任何其它类型的植物组织。

本发明公开了在糖用甜菜基因组中鉴定的被证明显示在糖用甜菜中与抽苔基因(B基因)相关表型完美共分离的多核苷酸，包括其变体和衍生物，而且本发明还公开了所述多核苷酸用于开发能用于抽苔基因或B基因定位和鉴定的标志物的用途。依照本发明的多核苷酸还可用于各批商业性种子的质量控制(这通过对商业性二年生糖用甜菜种子筛选一年生污染物来进行)及在育种程序中鉴定一年生植物/二年生植物(这使用一年生性状来加速育种过程，或在一起引入一年生性状与遗传变异新来源时)。

依照本发明的和如本文所述的多核苷酸可在用于生成转基因糖用甜菜植物的转基因方法中使用，所述转基因糖用甜菜植物包含稳定整合入糖用甜菜基因组中的所述多核苷酸。具体而言，在自基因组表达后，表达产物能用于调控糖用甜菜植物的春化应答。

在本发明的一个方面，通过延迟(delay)或下调B基因表达会延迟春化应答。

在本发明的另一个方面，在B基因过表达后会诱导没有冷处理的情况中的早期抽苔。

本发明提供了位于B基因座或非常接近B基因座(特别是标志物MP0176和GJ01上游1cM的距离)且与标志物GJ131共分离的多核苷酸(

S.等，2004；Gaafar R.M.等，2005)(图5)。

在一个实施方案中，本发明涉及依照本发明的和如本文所述的多核苷酸，包括其信息片段，其是自距离B基因不到1cM、特别是不到0.75cM、更特别的是不到0.5cM、甚至更特别的是不到0.3cM、但尤其是不到0.25cM的基因组DNA区域可得到的。

依照本发明的多核苷酸可进一步用于包括B基因的B基因座附近区域的完全表征及鉴定其它推定开花时间控制候选基因。

已经用来自二年生商业性糖用甜菜栽培种H20的DNA建立了BAC文库。对大小为100-400kb的部分(HindIII)消化的HMW DNA片段进行了两次大小选择。将DNA片段连接入载体pBeloBAC-Kan中。所述文库含有57,600个克隆，平均插入物大小大约120kb，对应于甜菜基因组的8倍覆盖。通过用单拷贝探针进行的筛选测试了冗余度，而且来自线粒体或质体DNA的克隆的频率估算为低于1％。

使用此BAC文库来回收糖用甜菜PRR7基因的全长基因组序列。

具体而言，使用引物PRR7-F和PRR7-R来筛选糖用甜菜BAC文库，这使用本领域技术人员公知的标准PCR技术来进行。用于筛选DNA集合的PCR条件如下：初始变性在90-98℃(特别是约95℃)的温度进行2-10分钟(特别是约5分钟)，接着30-40个扩增循环(特别是约35个扩增循环)的90-98℃(特别是约95℃)25-35秒(特别是30秒)、55-65℃(特别是约60℃)25-35秒(特别是30秒)和68-75℃(特别是约72℃)25-35秒(特别是30秒)，再接着68-75℃(特别是约72℃)2-8分钟(特别是约5分钟)。PCR实验使用适宜的反应混合物来进行，其包含合适的聚合酶(特别是Taq聚合酶)。对DNA集合后续筛选片段BvPRR7导致携带相应片段的BAC克隆的正鉴定。

为了得到BvPRR7基因的全长序列，使用标准测序技术对先前鉴定的BAC克隆测序，诸如例如由454 Life Sciences开发的焦磷酸测序技术。然后可以将两个都与EST CV301305共享序列同源性的非交叠的毗连序列群组合成一条单序列(SEQ ID NO 5)。基于BAC序列毗连序列群与EST CV301305的比对及与来自拟南芥的PRR7基因的序列同源性，可预测包含内含子和外显子的甜菜BvPRR7基因的推定基因结构，如图5所示。基于此预测，基因组序列可显示出跨越整个BvPRR7基因及ATG终止密码子上游的3.6kb序列和编码区下游的2.2kb序列。BvPRR7的相应氨基酸序列显示于SEQ ID NO 6。BvPRR7氨基酸序列与来自拟南芥的PRR基因家族所有成员(包括TOC1(PRR1)、PRR3、PRR5、PRR7和PRR9)的比对说明了氨基末端附近假应答调控物接受者域(PRR)基序(pfam00072)和羧基末端处CCT基序(pfam06203)的强保守性(图6)。在来自拟南芥的PRR基因家族之外，BvPRR7还与谷类植物中的PRR7同系物共享强同源性，如图7所示系统发生树所图示的。谷类植物中的PRR7同系物(更多地称作Ppd)显示出呈现光周期应答的重大决定子(Turner等，2005；Beales等，2007)。尚未证明在糖用甜菜中春化应答中的作用。

基于它们与已知开花时间控制基因的同源性或根据调控蛋白代表性的保守结构域的存在推导出的调控功能，可以将少数基因鉴定为B基因的潜在候选者。这些基因需要通过一年生与二年生基因型之间的等位基因变异性和/或基因表达研究或借助使用转基因办法进行的互补或敲除实验来进一步验证。

B基因可在用于生成转基因糖用甜菜植物的转基因办法中使用，所述转基因糖用甜菜植物包含稳定整合入糖用甜菜基因组中的所述多核苷酸。具体而言，在自基因组表达后，表达产物能用于调控糖用甜菜植物的春化应答。

在本发明的一个方面，可以通过遏制或下调B基因表达来延迟春化应答。

在本发明的另一个方面，可以在B基因过表达后诱导没有冷处理的情况中的早期抽苔。

过去，已经开发了能用于遗传作图、基因克隆、标志物辅助植物育种及用于基因组指纹术和调查遗传关系的分子标志物技术。遗传标志物基于基因组区域的核苷酸序列中的DNA多态性，而且能通过限制酶或借助两个引发位点来检测。

有数种类型的分子标志物可用于基于标志物的选择，包括限制性片段长度多态性(RFLP)、多态性DNA的随机扩增(RAPD)、扩增限制性片段长度多态性(AFLP)、简单序列重复(SSR)和多核苷酸多态性(SNP)。

不同类型标志物的信息内容可以是不同的，这取决于用于获得标志物数据的方法和关于标志物评分的群体。例如，并非总是可能区分在纯化条件中存在的基因组片段与杂合片段。在杂合群体中，像F2，共显性标志物(像限制性片段长度多态性)(RFLP，Botstein等，1980)和共显性评分的扩增片段长度多态性(AFLP，Vos等，1995)产生比显性标志物(像随机扩增多态性DNA)(RAPD，Welsh和McCleland，1990)和显性评分的AFLP要多的信息。RFLP是共显性的，而且能够鉴定独特基因座。RFLP涉及使用限制酶在特定短限制性位点(源自重复或位点间缺失或限制性位点处突变的多态性)处切割染色体DNA。

AFLP要求用限制酶消化细胞DNA，之后使用PCR和引物中的选择性核苷酸来扩增特定片段。凭借此方法，可测量多至100个多态性基因座，而且每项测试只要求相对较少的DNA样品。

用于实现跨越植物基因组多态性区域的核苷酸片段的此类扩增的最优选方法采用聚合酶链式反应(“PCR”)(Mullis等，1986)，其使用包括能够与以双链形式限定多态性的近端序列杂交的反向引物和正向引物的引物对。

与RFLP不同，基于PCR的技术只要求少量(大约10％)的DNA作为模板通过PCR扩增生成大量的靶序列。

一种此类基于PCR的技术是RAPD，其利用低严格性聚合酶链式反应(PCR)扩增，使用具有任意序列的单一引物来生成无名DNA片段的株特异性种类。该方法只要求很少的DNA样品，且分析大量的多态性基因座。然而，受到众多反应条件、显性方式的继承、和群体特异性影响的短引物的不可预测的表现是RAPD的主要缺点。

微卫星、或简单序列重复(SSR)、简单序列长度多态性(SSLP)、短串联重复(STR)、简单序列基序(SSM)、和序列靶微卫星(STM)代表一类广泛分布于整个真核生物基因组中的重复序列。重复数目和长度的变异是多态性的一个来源，甚至在密切相关的个体间。SSR分析基于选择性扩增的这些(短重复)序列来检测简单序列重复中的变异。此类微卫星序列可容易地使用侧翼基因座特异性寡核苷酸作为引物通过PCR来扩增，并检测DNA长度多态性(Litt和Luty，1989；Weber和May，1989)。

单一核苷酸位置处导致替代、缺失或插入的突变产生多核苷酸多态性或SNP，其在人类中每1.3kb发生一次(Cooper等，1985；Kwok等，1996)。大多数此类型多态性只具有两种等位基因，也称作双等位基因基因座。基于SNP的定位克隆可加速疾病性状和有效量生物学信息突变的鉴定(Wang等，1998)。

可使用有效选出点突变的PCR延伸测定法来检测SNP。该规程只要求每份样品少量DNA。使用PCR进行的SNP检测测定法的三种广泛使用的类型是切割扩增多态性序列(cleaved amplified polymorphic sequences，CAPS)(Konieczny和Ausubel，1993；Thiel等，2004)、衍生CAPS(dCAPS)(Michaels和Amasino，1998；Neff等，1998)、和单链构象多态性(single strand conformationpolymorphism，SSCP)(Orita等，1989)。

CAPS多态性指由SNP或INDEL引起的限制性片段长度差异，其是通过由基因座特异性寡核苷酸引物生成的PCR扩增子中的限制性内切核酸酶识别位点创建或消除的。如下实施CAPS测定法，即用一种或多种限制酶消化基因座特异性PCR扩增子，然后在琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶上将经过消化的DNA分开。

dCAPS是CAPS技术的改良，通过利用错配的PCR引物，其容许检测大多数单核苷酸变化。使用该方法时，通过含有一处或多处相对于模板DNA的错配的引物，将包含SNP的限制酶识别位点引入PCR产物。然后对以此方式修饰的PCR产物进行限制酶消化，并通过所得限制性样式确定SNP的存在或缺失。

SSCP技术在非变性凝胶上将变性双链DNA分开，并如此容许单链DNA的二级结构及分子量决定凝胶泳动率。

ARMS(扩增不应性突变系统)-PCR规程(Ye等，2001)涉及使用单一PCR来进行SNP基因分型(Fan等，2003；Chiapparino等，2004)。使用四引物(采用两对引物)在单一PCR反应中扩增SNP的两种不同等位基因。

可采用备选方法来扩增此类片段，诸如“连接酶链式反应”(“LCR”)(Barany，F.，1991)，其使用两对寡核苷酸探针来指数扩增特定靶物。每对寡核苷酸的序列选择成容许该对与靶物同一条链的相邻序列杂交。所述杂交为模板依赖性连接酶形成底物。与PCR一样，所得产物如此在后续循环中充当模板，并且获得期望序列的指数扩增。

可以用具有多态性位点同一条链的近端和远端序列的寡核苷酸实施LCR。在一个实施方案中，任一寡核苷酸设计成包含多态性的实际多态性位点。在这样的一个实施方案中，反应条件选择成使得所述寡核苷酸只能在靶分子含有或缺少与所述寡核苷酸上存在的多态性位点互补的特定核苷酸的情况中连接到一起。或者，寡核苷酸可以选择成使得它们不包含多态性位点(参见Segev，PCT申请WO 90/01069)。

可采用的另一种方法是“寡核苷酸连接测定法”(“OLA”)(Landegren等，1988)。OLA方案使用设计成能够与靶物单链上的相邻序列杂交的两种寡核苷酸。像LCR一样，OLA特别适合于点突变的检测。然而，与LCR不同，OLA导致靶序列的“线性”而非指数扩增。

Nickerson等，1990记载了组合PCR和OLA属性的核酸检测测定法(Nickerson等，1990)。在此方法中，使用PCR来实现靶DNA的指数扩增，然后使用OLA进行检测。在需要多个分开的加工步骤之外，与此类组合有关的一个问题是它们继承了与PCR和OLA有关的所有问题。

基于在存在具有所得“二寡核苷酸”序列的核酸的情况中两个(或更多个)寡核苷酸的连接由此扩增二寡核苷酸的方案也是已知的(Wu和Wallace，1989)，而且可容易地适应本发明的目的。

如此可开发基于依照本发明的且如本文中所描述的基因序列的不同测定法，并用于对植物材料筛选一年生等位基因的存在或缺失。

可开发基于自测序PCR产物(其是自一年生和二年生植物扩增的)表征的SNP的分子标志物，优选终点因此，会实施数次PCR扩增，以覆盖所述基因的完整序列。

然后在不同一年生和二年生遗传背景内测试新的分子标志物，以评估分子测试的稳健性。

在一个实施方案中，分子标志物是通过PCR扩增的DNA片段，例如SSR标志物或RAPD标志物。在一个实施方案中，扩增DNA片段的存在或缺失指示性状自身的或该性状的特定等位基因的存在或缺失。在一个实施方案中，扩增DNA片段的长度差异指示性状的特定等位基因的存在，并如此能够区分性状的不同等位基因。

在本发明的一个具体实施方案中，使用简单序列重复(SSR)标志物来鉴定亲本植物和/或其祖先，以及自所述亲本植株杂交产生的后代植株中的本发明相关等位基因。

在本发明的另一个具体实施方案中，使用基于单核苷酸多态性的标志物来鉴定亲本植物和/或其祖先，以及自所述亲本植株杂交产生的后代植株中的本发明相关等位基因。

在本发明的又一个具体实施方案中，使用基于至少一个核苷酸的缺失或插入(“INDEL”)的标志物来鉴定亲本植物和/或其祖先，以及自所述亲本植株杂交产生的后代植株中的本发明相关等位基因。

可以基于依照本发明的和如本文所述的多核苷酸的序列来开发这些标志物。

在本发明的一个方面中，可以开发和使用本文中没有明确公开的标志物或甚至有待鉴定的标志物。基于本申请中提供的信息，本领域技术人员有可能鉴定或开发本文中没有明确公开的但与抽苔基因或B基因遗传紧密连锁或优选位于抽苔基因或B基因内的或与本文中公开的标志物连锁的标志物。技术人员知道其它标志物在筛选测定法和标志物辅助选择中可以提供至少相等的功效。

本领域技术人员知道可利用的数种方法或办法，它们能用于鉴定和/或开发与B基因区连锁不平衡的和/或与B基因区连锁的和/或位于B基因区中的标志物，以及呈现负责二年生基因型的实际原因突变的标志物。本领域技术人员知道的办法包括但不限于：

-在杂交办法中使用已公开的序列/标志物来鉴定感兴趣区域中的其它序列：本文中公开的引物序列和/或能使用本文中公开的引物序列测定的标志物/基因序列(或其部分)可用作(杂交)探针，用于自基因组核酸样品和/或RNA或cDNA样品或样品合并物分离标志物侧翼的和/或与B基因区连锁的和/或与B基因区有关的和/或对B基因区特异性的核酸序列/基因(例如筛选基因组资源，像BAC文库或gDNA或cDNA文库筛选)。

-在PCR办法中使用已公开的序列/标志物来鉴定感兴趣区域中的其它序列：可使用本文中公开的引物序列和/或标志物/可使用本文中公开的引物序列测定的(候选)基因序列(或其部分)作为(PCR)扩增引物自基因组核酸样品和/或RNA或cDNA样品或样品合并物扩增QTL区侧翼的和/或与QTL区连锁的和/或与QTL区有关的和/或对QTL区特异性的核酸序列/基因，所述样品是或不是自特定植物组织和/或在植物特定处理后且自糖用甜菜或原则上具有足够同源性的任何其它生物体分离的。

-在PCR办法中使用已公开的序列/标志物来鉴定感兴趣区域中的其它序列：在为标志物序列设计内部引物并用于进一步测定B基因区内的和/或与所述性状遗传连锁的和/或有关的别的侧翼序列/基因后，能测定一种或多种标志物的核苷酸序列/基因。

-在作图和/或比较作图办法中使用已公开的序列/标志物来鉴定同一区域中的标志物(在其它图上定位B基因)：基于本文中公开的位置信息和/或标志物信息，可通过遗传作图办法，最终(如果早就需要的话)通过在(高密度)遗传图和/或集成遗传或共有图上定位已公开标志物(通过遗传作图或基于各图间共有标志物的外推)，鉴定任何类型的标志物。可鉴定和/或获得与已公开标志物和/或B基因区遗传连锁的和/或位于已公开标志物和/或B基因区附近的早就知道的标志物和/或新的标志物，并最终用于B基因(精细)作图和/或B基因克隆和/或MAS育种应用。

-在“计算机”办法中使用已公开的序列/标志物来鉴定B基因区中的别的序列/标志物/(候选)基因：可以在“计算机”方法中使用本文中公开的引物序列和/或可使用本文中公开的引物序列或基于连锁标志物测定的标志物/(候选)基因序列(或其部分)来对序列或蛋白质数据库(例如BLAST)搜索与本文所述性状遗传连锁的和/或与本文所述性状有关的和/或位于B基因区中的(别的)侧翼和/或同源序列/基因和/或等位基因多样性(基因组和/或cDNA序列二者或甚至蛋白质，二者二者都源自辣椒和/或任何其它生物体)

-在物理作图办法(在物理图或基因组序列上定位B基因)中使用已公开的序列/标志物：可以在原则上具有足够同源性的任何生物体的物理图和/或(完整)基因组序列上定位本文中公开的引物序列和/或可使用本文中公开的引物序列或使用与本文中公开的标志物遗传连锁的和/或位于B基因区中的其它标志物测定的标志物/基因序列(或其部分)来鉴定在B基因(精细作图)和/或B基因克隆和/或MAS育种应用中可应用的(候选)序列/标志物/基因。

-使用已公开的序列/标志物在其它(物理)图或基因组上定位B基因(物种间的...胡椒，其它茄科，像番茄和马铃薯当然是第一感兴趣的，但是也可使用模式物种，像拟南芥)：可以在比较基因组或syntheny作图办法中使用本文中公开的引物序列和/或可使用本文中公开的引物序列测定的标志物/基因序列(或其部分)来鉴定同系物区和同系物和/或直向同系物序列/与B基因区遗传连锁的和/或位于B基因区中的且在B基因(精细作图)和/或B基因克隆和/或MAS育种应用中可应用的(候选)基因。

-使用已公开的序列/标志物来选择适宜的个体，容许通过遗传办法鉴定感兴趣区域中的标志物：可使用本文中公开的引物序列和/或标志物来选择具有不同/对比B基因等位基因的个体。可使用遗传关联办法(geneticassociation approach)和/或大批分离子分析(bulk segregant analysis，BSA；Michelmore等，1991)来鉴定特定感兴趣区域(B基因区)中的和/或与所述性状关联的或遗传连锁的标志物/基因。

-使用已公开的信息来搜索(位置)候选基因：可使用已公开的信息来鉴定位置和/或功能候选基因，其可以与所描述的性状相关和/或遗传连锁。具体而言，依照本发明的标志物可用于等位基因区分测定法，特别是测定法用于区分显示二年生基因型的糖用甜菜植物的植物分组内的不同单元型。所述测定法基于包含两种不同探针分子的一组探针多核苷酸，，所述探针分子与例如通过基于SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8分别所示正向引物PRR7-F和反向引物PRR7-R的PCR扩增可获得的BvPRR7基因亚区互补，所述探针分子只相差一处碱基错配(特别是位于#631的碱基错配)。

在本发明的另一个方面，提供了一种测定法，其涉及能特异性区分一年生植物与二年生植物，且如此能用于例如各批种子质量控制的标志物。

具体而言，本发明涉及一种测定法，其基于包含两种不同探针分子的一组探针多核苷酸，所述探针分子与例如通过基于SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8分别所示正向引物PRR7-F和反向引物PRR7-R的PCR扩增可获得的BvPRR7基因亚区互补，所述探针分子只相差一处碱基错配(特别是位于#631的碱基错配)。

糖用甜菜的商业性种子生产大多在法国南部和意大利北部进行。在这两个地区，一年生杂生甜菜的存在能在种子生产中引起花粉污染，导致商业性种子中有一年生植物。这是客户不能接受的，而且因此在收获种子后立即在没有野生甜菜的地区(诸如阿根廷)种植所有批次的商业性种子。不对植物春化，而且通过利用抽苔者的存在来鉴定污染有一年生植物的种子批次。

由B基因赋予的一年生植物习性表现为单一显性性状；因而二年生植物中对春化的要求是隐性的。如此，将BvPRR7的一年生等位基因转化入二年生基因型预测将一年生开花行为赋予二年生受体基因型。为了验证此假说，将在一年生启动子和终止子片段控制下的BvPRR7的一年生等位基因的编码序列转化入二年生基因型(诸如例如G018)。转化可通过本领域已知方法来实现，诸如Chang等，2002所记载的，使用糖用甜菜分生组织作为外植体材料并使用磷酸甘露糖异构酶(PMI)基因作为选择标志。对转基因枝条检查选择标志的表达，诸如例如PMI活性(Joersbo等，1998)，随后生根，在土壤中盆载并转移至温室。阴性对照由接受相同体外再生规程但不进行土壤杆菌感染和选择的非转基因枝条组成。在生长室中种植植物，恒温18℃，光周期17小时光照和7小时暗。在这些条件下，非转基因对照在观察期期间无一显示任何抽苔迹象，而一年生对照植株通常在8周内抽苔。与非转基因二年生对照植株相反，实质性数目的转基因植株在4-10周内开始抽苔，而且基本上表现为一年生植物，尽管它们具有二年生遗传背景。将抽苔并开花的转基因植株与二年生保持系交叉授粉以生成后代。对后代植株测试选择标志活性，随后在没有春化的情况中监测抽苔和开花。大多数后代显示1对1的分离比及PMI活性与一年生习性之间的完全相关。这些数据证实糖用甜菜中BvPRR7与不依赖春化的开花之间的因果关系。

BvPRR7在糖用甜菜中的春化应答中发挥关键作用，而且如此可用于通过遏制春化应答将抽苔抗性工程化改造入糖用甜菜植物中。为此目的，将BvPRR7cDNA片段(诸如例如SEQ ID NO.1所示0.6kb片段)装配入在组成性启动子控制下的RNAi盒中。合适的组成性启动子是例如来自拟南芥的Ubi3启动子(Norris等，1993)、CaMV 35S启动子、或已知在糖用甜菜中促进组成性表达的任何其它启动子。所述表达盒进一步包含在合适启动子控制下的选择标志基因。具体而言，所述标志基因编码正选择标志，诸如磷酸甘露糖异构酶或木糖异构酶。可以用来自马铃薯StLS1基因的第二内含子(Eckes等，1986；Vancanneyt等，1990)将BvPRR7片段的倒置重复分开以稳定RNAi盒，还有改进RNAi现象的效率(Wang和Waterhouse，2001；Smith等，2000)。

然后可以将所述RNAi盒转化入二年生糖用甜菜基因型中，诸如例如G018，如本文中先前所述。对转基因枝条检查选择标志的表达，诸如例如PMI活性(Joersbo等，1998)。使阳性枝条和非转基因对照生根，并转移至18℃温室，最少两周的驯化期，之后进行春化处理。一旦完全确立，使转基因植物暴露于春化处理，其由14周6℃恒温和12小时低人工光照组成。在应用抽苔诱导条件之前，通过将温度自10℃逐步升高至18℃，在气候室中缓慢驯化春化植株两周。随后将植株换入更大的盆(2升)，并在暴露于恒温18℃和长日照光周期17小时亮/7小时暗的同时监测抽苔。非转基因对照植株在春化后4-6周常规开始抽苔。遏制了BvPRR7的转基因植株频繁显示抽苔延迟，范围为只有两周至超过四个月。在温室中应用的条件下少数植株永不抽苔。除抽苔和开花延迟外，转基因植株正常发育并没有显示表型畸变。一般而言，抽苔延迟的植株在抽苔时显示更高的叶片数目，原因在于延长的营养性阶段。

在植物组织中获得足够水平的转基因表达是遗传工程农作物的一个重要方面。异源DNA序列在植物宿主中的表达依赖于在所述植物宿主中有功能的可操作连接的启动子的存在。启动子序列的选择会决定何时和何处在生物体内表达所述异源DNA序列。

例如，如果希望过表达，那么可采用会指导所述基因在再生植物的所有组织中表达的植物启动子片段。此类启动子在本文中称作“组成性”启动子，而且在大多数环境条件和发育或细胞分化状态下是有活性的。组成性启动子的例子包括花椰菜花叶病毒(CaMV)35S转录起始区、自根癌土壤杆菌T-DNA衍生的1′-或2′-启动子、和来自技术人员知道的各种植物基因的其它转录起始区。此类基因包括例如AP2基因、来自拟南芥的ACT11(Huang等Plant Mol.Biol.33：125-139(1996))、来自拟南芥的Cat3(GenBank No.U43147；Zhong等，Mol.Gen.Genet.251：196-203(1996))、来自欧洲油菜(Brassica napus)的编码硬脂酰-酰基载体蛋白去饱和酶的基因(Genbank No.X74782；Solocombe等Plant Physiol.104：1167-1176(1994))、来自玉米的GPc1(GenBank No.X15596；Martinez等J.Mol.Biol 208：551-565(1989))、和来自玉米的Gpc2(GenBankNo.U45855；Manjunath等，Plant Mol.Biol.33：97-112(1997))。

或者，植物启动子可以在特定组织中，或者可以以其它方式在更精确的环境或发育控制下指导本发明核酸分子的表达。可通过诱导型启动子影响转录的环境条件的例子包括厌氧条件、升高的温度、或光照的存在。此类启动子在本文中称作“诱导型”或“组织特异性”启动子。技术人员会认识到，组织特异性启动子可以在靶组织以外的组织中驱动可操作连接的序列的表达。如此，如本文中所使用的，组织特异性启动子指优先在靶组织中驱动表达，但也可以在其它组织中导致一些表达的启动子。

在发育控制下的启动子的例子包括只(或主要只)在某些组织(诸如果实、种子、或花)中启动转录的启动子。在胚珠、花或种子中驱动核酸表达的启动子是本发明中特别有用的。如本文中所使用的，种子特异性或优先性启动子指特异性地或优先在种子组织中指导表达的启动子，此类启动子可以是例如胚珠特异性的、胚特异性的、胚乳特异性的、珠被特异性的、种皮特异性的、或其组合。例子包括来自胚珠特异性BEL1基因的启动子，记载于Reiser等Cell 83：735-742(1995)(GenBank No.U39944)。其它合适的种子特异性启动子衍生自下列基因：来自玉米的MAC1(Sheridan等Genetics142：1009-1020(1996))、来自玉米的Cat3(GenBank No.L05934；Abler等PlantMol.Biol.22：10131-1038(1993))、来自玉米的编码油质蛋白18kD的基因(GenBank No.J05212；Lee等Plant Mol.Biol.26：1981-1987(1994))、来自拟南芥的vivparous-1(Genbank No.U93215)、来自拟南芥的编码油质蛋白的基因(Genbank No.Z17657)、来自拟南芥的Atmycl(Urao等Plant Mol.Biol.32：571-576(1996))、来自拟南芥的2s种子贮藏蛋白基因家族(Conceicao等Plant 5：493-505(1994))、来自欧洲油菜的编码油质蛋白20kD的基因(GenBankNo.M63985)、来自欧洲油菜的napA(GenBank No.J02798；Josefsson等JBL26：12196-1301(1987))、来自欧洲油菜的油菜籽蛋白基因(Sjodahl等Planta197：264-271(1995))、来自欧洲油菜的编码2S贮藏蛋白的基因(Dasgupta等Gene 133：301-302(1993))、来自大豆的编码油质蛋白A(Genbank No.U09118)和油质蛋白B(Genbank No.U09119)的基因、及来自大豆的编码低分子量硫富含蛋白的基因(Choi等Mol Gen.Genet.246：266-268(1995))。

或者，可以鉴定提供具有期望表达特征的启动子或具有表达增强活性的启动子的具体序列，而且可以经由突变将这些序列或相似序列引入序列中。进一步考虑可以诱变这些序列以增强它们转基因在特定物种中的表达。

另外，组合来自超过一种启动子的元件的启动子也是有用的。例如，美国专利No.5,491,288披露了组合花椰菜花叶病毒启动子与组蛋白启动子。如此，可以将来自本文中所公开的启动子的元件与来自其它启动子的元件组合。

多种5’和3’转录调控序列可用于本发明。转录终止子负责转录终止和正确的mRNA聚腺苷酸化。3’非翻译调控DNA序列优选包括约50个至约1,000个、更优选约100个至约1,000个核苷酸碱基对，而且含有植物转录和翻译终止序列。适宜的转录终止子和已知在植物中有功能的转录终止子包括CaMV35S终止子、tml终止子、胭脂碱合酶终止子、豌豆rbcS E9终止子、来自根癌土壤杆菌章鱼碱合酶基因的T7转录物的终止子、和来自马铃薯或番茄的蛋白酶抑制剂I或II基因的3’末端，但是也可以采用技术人员知道的其它3’元件。或者，也可以使用伽马coixin、油质蛋白3或来自薏苡属(Coix)的其它终止子。

优选的3’元件包括来自根癌土壤杆菌胭脂碱合酶基因的3’元件(Bevan等，1983)、来自根癌土壤杆菌章鱼碱合酶基因的T7转录物的终止子、和来自马铃薯或番茄的蛋白酶抑制剂I或II基因的3’末端。

由于转录起始位点与编码序列起点之间的DNA序列(即不翻译的前导序列)能影响基因表达，所以也可能希望采用特定的前导序列。优选的前导序列包括包含预测指导所附着基因最佳表达的前导序列，即包括可提高或维持mRNA稳定性和防止不当翻译起始的优选共有前导序列。本领域技术人员根据本公开内容会知道此类序列的选择。自在植物中高表达的基因衍生的序列会是最优选的。

已经发现在转基因植物中增强基因表达的其它序列包括内含子序列(例如来自Adh1、bronze1、肌动蛋白1、肌动蛋白2(WO 00/760067)、或蔗糖合酶内含子的)和病毒前导序列(例如来自TMV、MCMV和AMV的)。例如，已知自病毒衍生的许多非翻译前导序列增强表达。具体而言，来自烟草花叶病毒(TMV)、玉米褪绿斑点病毒(MCMV)、和苜蓿花叶病毒(AMV)的前导序列已经显示了在增强表达方面是有效的(例如Gallie等，1987；Skuzeski等，1990)。本领域已知的其它前导包括但不限于：小RNA病毒前导，例如EMCV前导(脑心肌炎5非编码区)(Elroy-Stein等，1989)；马铃薯Y病毒前导，例如TEV前导(烟草蚀纹病毒)；MDMV前导(玉米矮缩花叶病毒)；人免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP)前导(Macejak等，1991)；来自苜蓿花叶病毒外壳蛋白mRNA(AMV RNA 4)的非翻译前导(Jobling等，1987)、烟草花叶前导(TMV)(Gallie等，1989)；和玉米褪绿斑点(chlorotic mottle)病毒前导(MCMV)(Lommel等，1991)。还可参见Della-Cioppa等，1987。

在期望时，可进一步包括诸如Adh内含子1(Callis等，1987)、蔗糖合酶内含子(Vasil等，1989)或TMV Ω元件(Gallie等，1989)等调控元件。

增强子的例子包括来自CaMV 35S启动子、章鱼碱合酶基因(Ellis等，1987)、稻肌动蛋白I基因、玉米醇脱氢酶基因(Callis等，1987)、玉米皱缩I基因(Vasil等，1989)、TMV Ω元件(Gallie等，1989)和来自非植物真核生物的启动子(例如酵母；Ma等，1988)的元件。

知道两种用于控制表达的主要方法，即过表达和表达不足。过表达可通过插入选定基因的一个或超过一个的额外拷贝来实现。然而，不知道最初用核苷酸序列的一个或超过一个的额外拷贝转化的植物或其后代是否会显示表达不足及过表达的效应。为了表达不足，有两种主要方法，它们在本领域中常常称作“反义下调”和“有义下调”(有义下调也称作“共遏制”)。一般而言，这些过程称作“基因沉默”。这两种方法都导致对靶基因表达的抑制。

在本发明的范围内，本发明核酸分子表达的改变可以下列方式之一来实现。

“有义”遏制

本发明核苷酸序列表达的改变(优选是其表达的降低)是通过“有义”遏制得到的(参见例如Jorgensen等(1996)Plant Mol.Biol.31，957-973)。在这种情况中，在DNA分子中包含整个或部分的本发明核苷酸序列。所述DNA分子优选是可操作连接至在包含靶基因的细胞(优选植物细胞)中有功能的启动子的，并被导入该核苷酸序列在其中可表达的所述细胞中。将所述核苷酸序列以“有义取向”插入所述DNA分子中，这意味着所述核苷酸序列的编码链能转录。在一个优选的实施方案中，所述核苷酸序列是完全可转录的，而且所述核苷酸序列中包含的所有遗传信息或其一部分翻译成多肽。在另一个优选的实施方案中，所述核苷酸序列是部分可翻译的，而且一种短肽得到翻译。在一个优选的实施方案中，这是通过在所述核苷酸序列中插入至少一个提前终止密码子而实现的，这使得翻译停止。在另一个更加优选的实施方案中，所述核苷酸序列得到转录，但是没有生成翻译产物。这通常是通过消除由核苷酸序列编码的多肽的起始密码子(例如“ATG”)而实现的。在另一个优选的实施方案中，包含所述核苷酸序列的DNA分子或其一部分在植物细胞的基因组中稳定整合。在另一个优选的实施方案中，包含所述核苷酸序列的DNA分子或其一部分包含在染色体外复制分子中。

在包含上文刚刚所述DNA分子之一的转基因植物中，与所述DNA分子中包含的核苷酸序列对应的核苷酸序列的表达优选是降低的。优选的是，所述DNA分子中的核苷酸序列与表达得到降低的核苷酸序列至少70％相同，更优选的是，它是至少80％相同的、仍更优选至少90％相同的、仍更优选至少95％相同的、仍更优选至少99％相同的。

“反义”遏制

在另一个优选的实施方案中，本发明核苷酸序列表达的改变(优选是其表达的降低)是通过“反义”遏制得到的。在DNA分子中包含整个或部分的本发明核苷酸序列。所述DNA分子优选是可操作连接至在植物细胞中有功能的启动子的，并被导入该核苷酸序列在其中可表达的植物细胞中。将所述核苷酸序列以“反义取向”插入所述DNA分子中，这意味着所述核苷酸序列的反向互补序列(有时也称作非编码链)能转录。在一个优选的实施方案中，包含所述核苷酸序列的DNA分子或其一部分在植物细胞的基因组中稳定整合。在另一个优选的实施方案中，包含所述核苷酸序列的DNA分子或其一部分包含在染色体复制分子中。为了进一步说明，引用数份描述这种办法的出版物(Green，P.J.等，Ann.Rev.Biochem.55：569-597(1986)；van der Krol，A.R.等，Antisense Nuc.Acids & Proteins，pp.125-141(1991)；Abel，P.P.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：6949-6952(1989)；Ecker，J.R.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：5372-5376(Aug.1986))。

在包含上文刚刚所述DNA分子之一的转基因植物中，与所述DNA分子中包含的核苷酸序列对应的核苷酸序列的表达优选是降低的。优选的是，所述DNA分子中的核苷酸序列与表达得到降低的核苷酸序列至少70％相同，更优选的是，它是至少80％相同的、仍更优选至少90％相同的、仍更优选至少95％相同的、仍更优选至少99％相同的。

同源重组

在另一个优选的实施方案中，至少一个与本发明核苷酸序列对应的基因组拷贝通过同源重组在植物的基因组中得到修饰，如Paszkowski等，EMBOJournal 7：4021-26(1988)进一步说明的。这种技术利用同源序列通过本领域称作同源重组的过程来彼此识别和相互之间交换核苷酸序列的特性。同源重组可以在细胞中核苷酸序列的染色体拷贝与通过转化导入细胞中的核苷酸序列的引入拷贝之间发生。如此，在核苷酸序列的染色体拷贝中精确地引入特定修饰。在一个实施方案中，本发明核苷酸序列的调控元件是经过修饰的。此类调控元件易于通过使用本发明的核苷酸序列或其一部分作为探针筛选基因组文库来获得。将现有的调控元件用不同的调控元件替换，如此改变核苷酸序列的表达，或者将它们突变或缺失，如此消除核苷酸序列的表达。在另一个实施方案中，通过缺失核苷酸序列的一部分或整个核苷酸序列或者通过突变来修饰核苷酸序列。本发明也涵盖突变型多肽在植物细胞中的表达。这种技术用于破坏内源植物基因的最新精化已有记载(Kempin等，Nature389：802-803(1997)及Miao和Lam，Plant J.，7：359-365(1995))。

在另一个优选的实施方案中，通过用由RNA连续区段与在末端具有双重发夹帽的、双链体构象的DNA残基构成的嵌合寡核苷酸转化细胞，在核苷酸序列的染色体拷贝中引入突变。所述寡核苷酸的另一项特征是例如在RNA残基处存在2’-O-甲基化。所述RNA/DNA序列设计成与本发明核苷酸序列的染色体拷贝排列且含有期望的核苷酸变化。例如，此技术进一步记载于美国专利5,501,967及Zhu等(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96：8768-8773。

核酶

在另一个实施方案中，编码本发明多肽的RNA受到对此类RNA特异性的催化性RNA或核酶的切割。在转基因植物中表达所述核酶，导致所述植物细胞中编码本发明多肽的RNA的量降低，如此导致所述细胞中积累的多肽的量降低。此方法进一步记载于美国专利4,987,071。

显性负突变体

在另一个优选的实施方案中，改变了由本发明核苷酸序列编码的多肽的活性。这是通过在转基因植物中表达所述蛋白质的显性负突变体而实现的，导致内源蛋白质的活性损失。

适配体

在另一个实施方案中，通过在转基因植物中表达特异性结合蛋白质的称作适配体的核酸配体，抑制了本发明多肽的活性。适配体优选通过SELEX(通过指数富集进行的配体系统进化)方法来获得。在SELEX法中，使具有随机化序列区域的单链核酸的候选混合物与蛋白质接触，并将那些具有升高的对靶物的亲和力的核酸与候选混合物的剩余物分开。扩增分隔出来的核酸以生成配体富集混合物。数次重复后，得到了具有最佳的对多肽的亲和力的核酸，并用于在转基因植物中表达。此方法进一步记载于美国专利5,270,163。

锌指蛋白

还使用结合本发明核苷酸序列或其调控区的锌指蛋白来改变所述核苷酸序列的表达。优选的是，所述核苷酸序列的表达得到降低或提高。锌指蛋白记载于例如Beerli等(1998)PNAS 95：14628-14633；WO 95/19431；WO98/54311；或WO 96/06166，通过述及将它们都完整收入本文。

dsRNA

通过dsRNA干扰，也获得了本发明核苷酸序列表达的改变，如例如WO99/32619；WO 99/53050或WO 99/61631中记载的，通过述及将它们都完整收入本文。

DNA分子的插入(插入诱变)

在另一个优选的实施方案中，将DNA分子插入本发明核苷酸序列的染色体拷贝或其调控区中。优选的是，此类DNA分子包含能够在植物细胞中转座的可转座元件，诸如例如Ac/Ds、Em/Spm、突变基因(mutator)。或者，所述DNA分子包含土壤杆菌T-DNA的T-DNA边界。所述DNA分子也可包含重组酶或整合酶识别位点，其可用于自植物细胞的染色体消除所述DNA分子的一部分。实施例2中列出了此方法的一个例子。还涵盖使用T-DNA、转座子、寡核苷酸或本领域技术人员知道的其它方法进行的插入诱变方法。使用T-DNA和转座子进行插入诱变的方法记载于Winkler等(1989)Methods Mol.Biol.82：129-136及Martienssen(1998)PNAS 95：2021-2026，通过述及将它们完整收入本文。

缺失诱变

在又一个实施方案中，本发明核酸分子的突变是在细胞或植物中的所述序列的基因组拷贝中创建的，其通过缺失所述核苷酸序列或调控序列来实现。缺失诱变的方法是本领域技术人员知道的。参见例如Miao等，(1995)PlantJ.7：359。

在又一个实施方案中，此缺失是在一大群植物中随机创建的，其通过化学诱变或辐射来实现，并且通过正向或反向遗传学分离在本发明基因中具有缺失的植物。已知用中子或伽马射线进行的辐射引起植物中的缺失突变(Silverstone等，(1998)Plant Cell，10：155-169；Bruggemann等，(1996)Plant J.，10：755-760；Redei和Koncz，于Methods in Arabidopsis Research，WorldScientific Press(1992)，pp.16-82)。可以使用PCR及基因组DNA合并集合在反向遗传学策略中回收本发明基因中的缺失突变，正如在秀丽线虫中所显示的(Liu等，(1999)，Genome Research，9：859-867)。正向遗传学策略会涉及诱变显示PTGS的系，接着对M2后代筛选PTGS的缺失。在这些突变体中会预期有些突变体破坏了本发明的基因。这可通过使用来自这些突变体的基因组DNA进行的本发明基因的Southern印迹或PCR来评估。

在植物细胞中的过表达

在又一个优选的实施方案中，过表达植物细胞中的编码B基因(特别是BvPRR7基因)的本发明核苷酸序列。上文描述了用于过表达本发明核酸分子的核酸分子和表达盒的例子。本发明还涵盖本领域技术人员知道的、用于过表达核酸分子的方法。

在又一个实施方案中，在植物的每一个细胞中改变本发明核苷酸序列的表达。这是例如经由同源重组或通过染色体中的插入而得到的。这也是例如通过在能够在植物的每一个细胞中表达有义或反义RNA、锌指蛋白或核酶的启动子控制下表达有义或反义RNA、锌指蛋白或核酶而得到的。组成性的、诱导型的、组织特异性的或发育调节性的表达也在本发明的范围内，而且导致植物细胞中本发明核苷酸序列表达的组成性的、诱导型的、组织特异性的或发育调节性的改变。依照本发明的教导，例如如下所述，制备用于表达有义或反义RNA、锌指蛋白或核酶或用于过表达本发明核苷酸序列的构建体，并转化入植物细胞中。

因此，本发明还提供了与序列表的SEQ ID NO：1中鉴定的可读框对应的有义和反义核酸分子及其直向同系物。

可以将与编码SEQ ID NO：6所示多肽的核苷酸基本上相似的依照本发明的基因和可读框(包括任何相应的反义构建体)可操作连接至在植物宿主内有功能的任何启动子(包括依照本发明的启动子序列或其突变体)。

一旦完成，可以将包含表达盒或RNAi盒的本发明多核苷酸构建体动员入对于植物转化而言合适的载体(诸如例如二元载体)中，然后可以使用公知的转化技术之一(诸如例如土壤杆菌介导的转化)将其动员至糖用甜菜。

可以通过多种完全确立的技术来生成掺有且表达本发明多核苷酸或dsRNA的转基因植物(或植物细胞或植物外植体或植物组织)。构建包含掺有依照本发明的和如本文所述的多核苷酸序列的表达盒或RNAi盒的本发明多核苷酸构建体后，可使用标准技术将该多核苷酸导入感兴趣植物、植物细胞、植物外植体或植物组织。任选的是，可以再生植物细胞、网状物或组织以再生转基因植物。所述植物可以是任何高等植物，包括裸子植物、单子叶植物和双子叶植物。合适的方案是可得的。对于豆科(Leguminosae)(苜蓿、大豆、三叶草、等)、伞形科(Umbelliferae)(胡萝卜、芹菜、欧洲防风)、十字花科(Cruciferae)(卷心菜、萝卜、油菜籽、嫩茎花椰菜、等)、葫芦科(Curcurbitaceae)(甜瓜和黄瓜)、禾本科(Gramineae)(小麦、玉米、稻、大麦、粟、等)、茄科(Solanaceae)(马铃薯、番茄、烟草、胡椒、等)、及各种其它农作物。参见Ammirato等，编，(1984)Handbook of Plant Cell Culture--CropSpecies，Macmillan Publ.Co.，New York，N.Y.；Shimamoto等(1989)Nature 338：274276；Fromm等(1990)Bio/Technol.8：833839；及Vasil等(1990)Bio/Technol.8：429434中记载的方案。单子叶植物和双子叶植物二者细胞的转化和再生现在是常规的，而且从业人员会确定最适宜的转化技术的选择。方法的选择会随要转化的植物的类型而变化；本领域技术人员会认识到特定方法对于指定植物类型的合适性。合适的方法可包括但不限于：植物原生质体的电穿孔；脂质体介导的转化；聚乙二醇(PEG)介导的转化；使用病毒进行的转化；植物细胞的显微注射；植物细胞的微弹轰击；真空渗透；和根癌土壤杆菌介导的转化。

植物转化可以用单一DNA分子或多种DNA分子(即共转化)进行，而且这两种技术都适合于与本发明的多核苷酸构建体一起使用。用于植物转化的许多转化载体是可得的，而且本发明的表达盒可以与任何此类载体一起使用。载体的选择会取决于优选的转化技术和要转化的靶物种。

用于将构建体导入植物细胞宿主中的多种技术是可得的且本领域技术人员已知的。这些技术一般包括采用根癌土壤杆菌或发根土壤杆菌作为转化剂、脂质体、PEG沉淀、电穿孔、DNA注射、直接DNA摄取、微弹轰击、微粒加速、诸如此类进行的DNA转化(参见例如EP 295959和EP 138341)(见下文)。然而，可以用本发明的多核苷酸构建体转化植物细胞以外的细胞。关于植物表达载体和报告基因及土壤杆菌属和土壤杆菌介导的基因转移的一般描述可见于Gruber等(1993)。

可以将含有依照本发明的多核苷酸序列的表达载体导入原生质体或完整的组织或分离的细胞中。优选的是，将表达载体导入完整的组织中。培养植物组织的通用方法见于例如Maki等，(1993)；及Phillips等(1988)。优选的是，使用直接基因转移方法将表达载体导入玉米或其它植物组织中，诸如微弹介导的投递、DNA注射、电穿孔等等。更优选的是，用弹道装置使用微弹介导的投递将表达载体导入植物组织中。参见例如Tomes等(1995)。本发明的载体不仅可用于结构基因的表达，而且可用于外显子-捕获克隆或启动子捕获规程以检测各种组织中的差异基因表达(Lindsey等，1993；Auch & Reth等)。

特别优选使用土壤杆菌的二元型载体Ti和Ri质粒。Ti衍生载体转化广泛的高等植物，包括单子叶植物和双子叶植物，诸如大豆、棉、油菜、烟草、和稻(Pacciotti等，1985；Byrne等，1987；Sukhapinda等，1987；Lorz等，1985；Potrykus，1985；Park等，1985；Hiei等，1994)。T-DNA用于转化植物细胞的用途得到了广泛研究和详细描述(EP 120516；Hoekema，1985；Knauf等，1983；及An等，1985)。为了导入植物中，可以将本发明的嵌合基因插入二元载体中，如实施例中所描述的。

本领域技术人员会领会，方法的选择可取决于要进行转化的植物的类型，即单子叶植物或双子叶植物。合适的植物细胞转化方法包括但不限于显微注射(Crossway等，1986)、电穿孔(Riggs等，1986)、土壤杆菌介导的转化(Hinchee等，1988)、直接基因转移(Paszkowski等，1984)、和弹道微粒加速，其使用可自Agracetus，Inc.(Madison，Wis.)和BioRad(Hercules，Calif.)获得的装置进行(参见例如Sanford等，美国专利No.4,945,050；及McCabe等，1988)。还可参见Weissinger等，1988；Sanford等，1987(洋葱)；Christou等，1988(大豆)；McCabe等，1988(大豆)；Datta等，1990(稻)；Klein等，1988(玉米)；Klein等，1988(玉米)；Klein等，1988(玉米)；Fromm等，1990(玉米)；及Gordon-Kamm等，1990(玉米)；Svab等，1990(烟草叶绿体)；Koziel等，1993(玉米)；Shimamoto等，1989(稻)；Christou等，1991(稻)；欧洲专利申请EP 0 332 581(鸭茅和其它Pooideae)；Vasil等，1993(小麦)；Weeks等，1993(小麦)。在一个实施方案中，采用用于玉米的原生质体转化方法(欧洲专利申请EP 0 292 435；美国专利No.5,350,689)。

本发明的主要焦点是糖用甜菜的转化。用于转化糖用甜菜的实验规程是本领域技术人员公知的，诸如Chang等，2002所披露的，其中使用糖用甜菜分生组织作为外植体材料。

选出经转化植物细胞或植物并种植至成熟后，鉴定那些显示出感兴趣性状的植物。所述性状可以是任何上文所述那些性状。另外，为了确认感兴趣性状是由于所导入的感兴趣多核苷酸在依照本发明的调控性核苷酸控制下的表达，可使用Northern印迹、RT-PCR或微阵列分析mRNA表达或使用免疫印迹或Western印迹或凝胶位移测定法分析蛋白质表达，由此测定感兴趣多肽或多核苷酸的表达水平或活性。

如此，本发明涉及植物细胞和组织、自此类细胞和组织衍生的植物、植物材料、自此类植物衍生的后代和种子、及农业产品，包括可通过例如下文所述任一转化方法得到的、具有改良特性的、经过加工的植物产品。

一旦将包含依照本发明的多核苷酸序列连同感兴趣多核苷酸的依照本发明的和如本文所述的表达盒转化入特定植物物种中，可以使用传统育种技术在该物种中繁殖或移入相同物种的其它品种中，特别是包括商业性品种。本发明的优选植物包括裸子植物、单子叶植物、和双子叶植物，尤其是在农业上重要的农作物植物，诸如稻(rice)、小麦(wheat)、大麦(barley)、黑麦(rye)、油菜(rape)、玉米(corn)、马铃薯(potato)、胡萝卜(carrot)、甘薯(sweet potato)、糖用甜菜(sugar beet)、菜豆(bean)、豌豆(pea)、菊苣(chicory)、莴苣(lettuce)、甘蓝(cabbage)、花椰菜(cauliflower)、嫩茎花椰菜(broccoli)、芜菁(turnip)、萝卜(radish)、菠菜(spinach)、芦笋(asparagus)、洋葱(onion)、蒜(garlic)、茄子(eggplant)、胡椒(pepper)、芹菜(celery)、胡萝卜(carrot)、西葫芦(squash)、南瓜(pumpkin)、夏南瓜(zucchini)、黄瓜(cucumber)、苹果(apple)、梨(pear)、温柏(quince)、甜瓜(melon)、李(plum)、樱桃(cherry)、桃(peach)、油桃(nectarine)、杏(apricot)、草莓(strawberry)、葡萄(grape)、覆盆子(raspberry)、黑莓(blackberry)、凤梨(pineapple)、鳄梨(avocado)、番木瓜(papaya)、芒果(mango)、香蕉(banana)、大豆(soybean)、烟草(tobacco)、番茄(tomato)、高粱(sorghum)和甘蔗(sugarcane)。

工程化改造入上文所述转基因植物中的遗传特性通过有性生殖或营养生长而传递，而且如此能在后代植物中维持和繁殖。一般而言，所述维持和繁殖利用开发用来适应特定目的的已知农业方法，诸如耕耘、播种或收获。也可以应用专用过程，诸如水培或温室技术。可进一步地在致力于开发具有改良特性(诸如对害虫、除草剂、或压力的耐受，改良的营养价值，升高的产量，或引起倒伏或落粒损失减少的改良结构)的植物的植物育种中进行依照本发明的转基因植物的有利遗传特性的使用。各种育种步骤的特征在于清楚限定的人为干预，诸如选择要杂交的系、指导亲本系的授粉、或选择适宜的后代植物。根据期望的特性，采用不同的育种度量。相关技术是本领域公知的，包括但不限于杂交/近交/回交育种、多系育种、品种混和(variety blend)、种间杂交、非整倍体技术、等。杂交技术还包括通过机械、化学或生化手段进行的植物不育化，以生成雄性或雌性不育植物。不同系的花粉对雄性不育植物的交叉授粉确保雄性不育而非雌性不育植物的基因组会一致地获得这两个亲本系的特性。如此，依照本发明的转基因植物能用于改良植物系的育种，例如由于它们的修饰遗传特性而提高常规方法(诸如除草剂或杀虫剂处理)的效率或容许免除所述方法。或者，能得到具有改良压力耐受的新农作物，即由于它们经过优化的遗传“配备”，生成质量比不能耐受相当的不利发育条件的产物要好的收获产物。

在一个实施方案中，提供了如SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：51和SEQ IDNO：52所示的多核苷酸序列，它们编码在功能上等同于B基因的蛋白质。

实施例

以下实施例提供了例示性实施方案。根据本公开内容和本领域一般技术水平，技术人员会领会以下实施例意图仅作为例示性的，而且可采用众多变化、改良、和改变而不背离当前要求保护的主题的范围。

实施例1：糖用甜菜PRR7基因的表征

实施例1.1：来自糖用甜菜的推定PRR7同系物的表征

基于用于鉴定和表征糖用甜菜中推定抽苔控制基因的候选基因方法，凭借使用BLAST进行的同源性搜索将编号CV301305的EST序列鉴定为PRR7的推定甜菜同系物。SEQ ID 1显示了EST CV301305的核苷酸序列。相应的氨基酸序列显示了假应答调控物接受者(PRR，pfam00072)或信号接受者(REC，cd00156)域的部分存在(图1)，其是表现出对某些昼夜节律相关事件而言至关紧要的PRR基因家族的一种标志(Nakamichi等，2005)。图2显示了CV301305与其最密切的拟南芥同系物PRR7的氨基酸序列比对，后者已经被描述成温度敏感性昼夜节律系统的一个成分(Nakamichi等，2007；Salomé和McClung 2005)。已知昼夜节律钟在植物中控制数个发育过程，包括开花时间(即抽苔)控制(Imaizumi和Kay，2006；Zhou等，2007)。

基于上述观察结果，使用拟南芥PRR7基因(分别为AT5G02810和NM_120359)与BvPRR7糖用甜菜EST(CV301305)基因组序列和mRNA之间的比对，推导部分甜菜PRR7片段的推定基因结构，这揭示了数个推定内含子区的存在(图3)。在使用基因组甜菜DNA作为模板时，涵盖第三推定内含子区的引物PRR7-F和-R(SEQ ID NO 2和3)产生大约0.5kb的扩增产物。用于扩增反应的PCR条件如下：初始变性95℃ 5min，接着35个扩增循环30sec95℃、30sec 60℃和30sec 72℃，再接着5min 72℃。在来自Applied BiosystemsInc.的GeneAMP PCR系统9600仪器上使用来自Invitrogen Corporation的白金级Taq DNA聚合酶和相应反应混合物如供应商所推荐的那样运行PCR实验。对PCR产物的序列分析得以重建BvPRR7基因片段内含子3周围的基因组序列，并证实了长度为296碱基对的内含子的存在(SEQ ID NO 4)。

实施例1.2：BvPRR7基因的定位

使用上文所述PRR7-F和PRR7-R引物，在一组(包括15种二年生和1种一年生系)糖用甜菜亲本系间对BvPRR7基因的基因组片段扩增和测序。所有二年生系展现BvPRR7单态性，因为只观察到两种不同单元型：一种二年生等位基因和一种一年生等位基因(表1)。为了在对一年生习性分离的群体中定位BvPRR7，开发了一种使用EndPoint

技术靶向第160位SNP(SEQ ID NO 4)的测定法。表2总结了为靶向第160位SNP的PRR7(T1)

测定法设计的引物和探针的核苷酸序列；依照制造商的推荐，该反应体系进一步包括来自Applied Biosystems Inc.的

通用PCR大师级混合物，No

UNG(2X)。使用ABI PRISM 7700序列检测仪仪器，如下实施PCR扩增：95℃ 10min，接着40个循环95℃ 15sec和60℃ 1min。使用Sequence Detection System 2.0软件实施EndPoint测量。

使用上述PRR7(T1)测定法，在自一年生系与对第160位SNP而言多态性的二年生系之间的杂交衍生的198个个体的F2群体中定位了BvPRR7基因。BvPRR7位于染色体II，在GJ131标志物下游大约1cM处(图4)，即已知含有关于不依赖春化的开花的B基因的一个区域(

等，2004；Gaafar等，2005)。PRR7(T1)测定法的结果显示了B基因预测基因型与BvPRR7基因基因型之间的完全匹配。B基因的基因型是基于自个别F2植株衍生的F3群体关于不依赖春化的开花的表型评估预测的。表3总结了包含最靠近的重组事件的9个后代植株个体的B基因区细微图的图形显示。其定位位置与其与温度敏感性昼夜节律有关的生物学功能的组合(Salomé和McClung，2005)显然使得BvPRR7成为B基因的强候选物。

实施例1.3：BvPRR7全长基因组序列的回收

使用引物PRR7-F和PRR7-R，借助PCR来筛选糖用甜菜BAC文库。该文库是自二年生商业性栽培种H20开发的，而且计算呈现6个基因组当量，平均插入物大小120kb(McGrath等，2004)。此文库的DNA集合由AmpliconExpress，Pullman WA销售。用于筛选DNA集合的PCR条件如下：初始变性95℃ 5min，接着35个扩增循环30sec 95℃、30sec 60℃和30sec 72℃，再接着5min 72℃。在来自Applied Biosystems Inc.的GeneAMP PCR系统9700仪器上使用来自Invitrogen Corporation的白金级Taq DNA聚合酶和相应的反应混合物如供应商推荐的那样运行PCR实验。依照供应商的指令对DNA集合进行的关于BvPRR7片段存在情况的后续筛选导致BAC SBA079-L24的阳性鉴定。

为了获得BvPRR7基因的全长序列，将BAC SBA079-L24送往德国MWGBiotech AG，借助454测序技术进行序列分析。在必要时，通过规则Sanger测序来填充得到的毗连序列群之间的缺口，为BvPRR7基因产生一条单一基因组序列(SEQ ID NO 5)。基于该基因组序列与EST CV301305的比对及与来自拟南芥的PRR7基因的序列同源性，预测了包含内含子和外显子的甜菜BvPRR7基因的推定基因结构，如图5所示。基于此预测，该基因组序列跨越整个BvPRR7基因及ATG起始密码子上游的3.6kb序列和编码区下游的2.2kb序列。BvPRR7的相应氨基酸序列显示于SEQ ID NO 6。BvPRR7与来自拟南芥的PRR因家族所有成员(包括TOC1(PRR1)、PRR3、PRR5、PRR7和PRR9)的氨基酸序列比对说明了氨基末端附近假应答调控物接受者(PRR)基序(pfam00072)和羧基末端处CCT基序(pfam06203)的强保守性(图6)。在来自拟南芥的PRR基因家族之外，BvPRR7还与谷类植物中的PRR7同系物共享强同源性，如图7所示系统发生树所图示的。令人惊讶的是，已知谷类植物中的PRR7同系物(更多地称作Ppd)呈现光周期应答(Turner等，2005；Beales等，2007)而非春化应答的一种重大决定子，如本文关于糖用甜菜提示的。

实施例1.4：BvPRR7基因表达分析

为了基因表达分析，在受控环境室中种植来自二年生春化植株的幼苗，恒温18℃，光周期16小时白昼和8小时黑夜。在24小时期间里每2小时收集叶片样品，并使用购自Ambion的

试剂盒遵照供应商的指令分离总RNA。将植物RNA分离助剂(Ambion)添加至RNA分离步骤以除去污染物，诸如多糖和多酚，并用DNA酶I(Ambion)处理RNA样品以除去DNA残余物。自作为模板的1μg总RNA作为，使用

试剂盒(Ambion)将RNA样品转变成cDNA。在ABI PRISM 7700序列检测仪仪器上使用Power

Green PCR大师级混合物(Applied Biosystems Inc.)通过定量PCR(qPCR)测量BvPRR7基因的表达。PCR条件如下：初始变性95℃ 10min，接着40个扩增循环的15sec 95C和1min 60℃。用于BvPRR7的正向和反向引物的核苷酸序列分别如下：5’-TTGGAGGAGGTGTCACAGTTCTAG-3’(SEQ IDNO：49)和5’-TGTCATTGTCCGACTCTTCAGC-3’(SEQ ID NO：50)。使用β-微管蛋白(BvBTU)和异柠檬酸脱氢酶(BvICDH)基因作为参照基因，将BvPRR7的表达标准化。设计用于这两种参照基因的引物序列组成如下：用于BvBTU(AW063029)的5’-TTGTTGAAAATGCAGACGAGTGT-3’(SEQ IDNO：13)和5’-AAGATCGCCAAAGCTTGGTG-3’(SEQ ID NO：14)及用于BvICDH(AF173666)的5’-CACACCAGATGAAGGCCGT-3’(SEQ ID NO：15)和5’-CCCTGAAGACCGTGCCAT-3’(SEQ ID NO：16)。以三份生物学复制品运行所有时间点，而且每个qPCR实验重复两次。使用Sequence DetectionSystem 2.0软件(Applied Biosystems Inc.)和GenEx软件(MultiD Analyses)分析数据。

如图8所示，BvPRR7基因的表达谱显示了昼夜节律性振荡，表达峰位于日出后7小时。此实验证实了BvPRR7的节律性和昼夜节律性表达，如关于大多数至今鉴定的时钟相关基因所记载的(McClung，2006)。

实施例1.5：等位基因变异性及与春化要求的关联

使用数对引物(表4)，在一组16株二年生和14株一年生植株间对BvPRR7基因完整编码区扩增和测序。用于扩增的PCR条件如下：初始变性95℃ 5min，接着35个扩增循环30sec 95℃、30sec 60℃和30sec 72℃，再接着5min 72℃。在来自Applied Biosystems Inc.的GeneAMP PCR系统9600仪器上使用来自Invitrogen Corporation的白金级Taq DNA聚合酶和相应的反应混合物如供应商推荐的那样运行PCR实验。观察到的基因型的图形表示显示了7种不同等位基因；6种一年生和1种二年生等位基因(表5)。二年生等位基因是二年生系独有的，从未在一年生参加者中找到，这提示对BvPRR7观察到的等位基因变异与一年生或二年生植物习性之间的强相关性。此观察结果进一步加强了糖用甜菜中BvPRR7与关于不依赖春化的开花的B基因座之间的因果关系。在编码区中表征的19种SNP中，其中7种导致一年生与二年生植物之间预测蛋白质序列中的氨基酸变化。依照表5所示单元型，位置#3827、#3954、#5284、#5714、#10954、#11220、#11391、#12053、#12127、和#12837的任何SNP都能用于借助靶向这些SNP中一种或多种的分子标志物来区分所有一年生等位基因与二年生等位基因。

在PRR7基因编码区之外，启动子区也揭示一年生与二年生系之间的多态性。使用引物F3808(SEQ ID NO 29)和R3809(SEQ ID NO 30)，在使用来自二年生系的基因组DNA作为模板时得到0.6kb的扩增产物，但是一年生系没有发生扩增。用于扩增反应的PCR条件如下：初始变性95℃ 5min，接着35个扩增循环30sec 95℃、30sec 60℃和30sec 72℃，再接着5min 72℃。在来自Applied Biosystems Inc.的GeneAMP PCR系统9600仪器上使用来自InvitrogenCorporation的白金级Taq DNA聚合酶和相应的反应混合物如供应商推荐的那样运行PCR实验。如此，此对引物特异性扩增二年生等位基因，但不扩增一年生等位基因。引物对F3855(SEQ ID NO 35)加R3809(SEQ ID NO 30)或F3855(SEQ ID NO 35)加R3856(SEQ ID NO 36)得到了相似的结果(表4)，在二年生系中分别产生了1.0kb和0.8kb的扩增产物，但是在一年生中没有扩增。本领域技术人员会知道，区别性多态性的选择不限于上文列举的那些，而是还能在其它部分，非编码区或侧翼区，诸如终止子和内含子中鉴定。

表

表1：在1种一年生和15种二年生糖用甜菜系之间关于跨越内含子3的BvPRR7基因片段观察到的多态性

标题行指示在BvPRR7基因片段的基因组序列(SEQ ID NO 5)中的核苷酸位置。其余行代表在一组16种系间观察到的2种单元型。

表2：与用于SNP#160基因分型的TaqMan测定法PRR7(T1)对应的引物和探针的核苷酸序列

前体名称	序列(5′至3′)
		PRR7(T1)-F	GAGGTGTCACAGTGTAAGTGTCT
PRR7(T1)-R	AAAGACTGCTACACGAACCACTAAG
		PRR7(T1)-FAM	FAM-CTGATGAAAAGCTG-MGB-NFQ
PRR7(T1)-VIC	VIC-CTGATGGAAAGCTG-MGB-NFQ

表3：许多标志物，包括在显示B基因任一侧重组事件的9株F2植株间位于B基因周围的PRR7(T1)的基因型。PRR7(T1)以及9_27(T2)标志物显示与B基因预测基因型的完全匹配。B基因的基因型基于对自个别F2植株衍生的F3群体的表型评估。

表4：用于BvPRR7所有外显子和部分内含子及启动子或终止子区的扩增和测序的PCR引物的核苷酸序列

前体名称	序列(5’至3’)	位置	SEQ ID NO
				F3766	TTTGATGCTTTTTTCAGGCCA	内含子1	SEQ ID NO：17
R3767	TTTTCTTATAGGCTTCACCAGAAAGTC	外显子3	SEQ ID NO：18
				F3354	ATGTCATCTCATGATTCGATGGG	外显子3	SEQ ID NO：19
R3355	TCAGCCCTCTTGCTTCCTATG	外显子4	SEQ ID NO：20

前体名称	序列(5’至3’)	位置	SEQ ID NO
				F3768	TTTCCTCATTCTTTTTTTAGTCTAGTGGT	内含子3/外显子4	SEQ ID NO：21
R3769	AATATGTGTGAGAAAATGGTGGCA	内含子4	SEQ ID NO：22
				F3782	TCYCAATGGGAAAGGATTTG	外显子6	SEQ ID NO：23
R3783	AATTTCGGGTGGTGCATCAG	外显子6	SEQ ID NO：24
				F3784	GCCCCCAACCACAGTCTACA	外显子5	SEQ ID NO：25
R3785	GGTCCATTTAGCCGTGAATCTG	外显子6	SEQ ID NO：26
				F3806	TTTTTGCATACCGAAGGCGT	启动子	SEQ ID NO：27
R3807	CATTTGTTGAAGTAGGTGATAAGGACAA	内含子1	SEQ ID NO：28
				F3808	TTAGATCCTCTCCCTTAGACTCTTCTGT	启动子	SEQ ID NO：29
R3809	TCACCAATTCTTTATATCATATCATGACA	启动子	SEQ ID NO：30
				F3810	GAGAAAAGGGTTTTAGATGGTAAGTTTT	启动子	SEQ ID NO：31
R3811	AACTTTAACCCATCATGTCTTTTCAAC	启动子	SEQ ID NO：32
				F3853	AACTGGACACTTGGATTTCAAGTCA	启动子	SEQ ID NO：33
R3854	TTATGGGAAAAAACTCTCGGTATTCT	启动子	SEQ ID NO：34
				F3855	GAACCCCATTTTAGTATTGACATTTCT	启动子	SEQ ID NO：35
R3856	AATTAGATGAATAAAAAGACAAATGAGGAA	启动子	SEQ ID NO：36
				F3857	TCCATTTGAGGAGTAGGTATGATGAG	内含子4	SEQ ID NO：37
R3858	CTTCGACCATCATTTTCCTGGT	外显子6	SEQ ID NO：38
				F3859	GGAAAACCAATATTCACAGTTAGACCT	外显子6	SEQ ID NO：39
R3860	TCTTGAGCTGCTGATCCACGT	外显子7	SEQ ID NO：40
				F3861	CTGCATCTGGTAAGCCTGGTG	外显子7	SEQ ID NO：41

前体名称	序列(5’至3’)	位置	SEQ ID NO
				R3862	CGTACCTGGCGCACGAAT	外显子8	SEQ ID NO：42
F3863	AATTTGGCCATTTCTTGCTTGTAT	内含子7	SEQ ID NO：43
				R3864	AATGTGACCCGTAAACGCCT	终止子	SEQ ID NO：44
F3865	GGTGTGATGCATATAATCTTGTTTGG	终止子	SEQ ID NO：45
				R3866	AGCAAGCCTGCGCTGG	终止子	SEQ ID NO：46

表5：在16种二年生和14种一年生系中在BvPRR7的编码区中观察到的单元型和多态性

该表显示了在比较一年生与二年生等位基因时在编码区中鉴定的19种多态性。假隐性和CCT域中的多态性以粗线标示。氨基酸替代以小星号标示。二年生等位基因特异的氨基酸变化以大星号标示。标题行中标示的SNP位置是依照SEQ ID NO 5编号的。

实施例2：借助互补研究进行的BvPRR7的转基因确认

由B基因赋予的一年生植物习性表现为单一显性性状；因而二年生植物中对春化的要求是隐性的。如此，将BvPRR7的一年生等位基因转化入二年生基因型中预测将一年生开花行为赋予二年生受体基因型。为了验证此假说，将在一年生启动子和终止子片段控制下的BvPRR7的一年生等位基因的编码序列转化入二年生基因型G018。糖用甜菜转化的实验规程本质上如Chang等，2002所披露的，使用糖用甜菜分生组织作为外植体材料并使用磷酸甘露糖异构酶(PMI)基因作为选择标志。携带PMI选择标志基因和一年生BvPRR7等位基因二者的基因盒的二元载体的质粒图显示于图9。对转基因枝条检查PMI活性(Joersbo等，1998)，随后生根、在土壤中盆栽并转移至温室。阴性对照由接受相同体外再生规程但不进行土壤杆菌感染和甘露糖选择的非转基因枝条组成。在生长室中种植植物，恒温18℃，光周期17小时光照和7小时暗。在这些条件下，非转基因对照在观察期期间无一显示任何抽苔迹象，而一年生对照植株通常在8周内抽苔。与非转基因二年生对照植株相反，实质性数目的转基因植株在4-10周内开始抽苔，而且基本上表现为一年生植物，尽管它们具有二年生遗传背景。将抽苔并开花的转基因植株与二年生保持系交叉授粉以生成后代。对后代植株测试PMI活性，随后在没有春化的情况中监测抽苔和开花。大多数后代显示1对1的分离比及PMI活性与一年生习性之间的完全相关。这些数据证实糖用甜菜中BvPRR7与不依赖春化的开花之间的因果关系。

实施例3：对BvPRR7的转基因遏制赋予抽苔抗性

既然BvPRR7在糖用甜菜中的春化应答中发挥关键作用，那么BvPRR7为通过遏制春化应答来改造抽苔抗性呈现了显而易见的候选物。为此目的，将0.6kb的BvPRR7 cDNA片段(SEQ ID NO.1)装配入在来自拟南芥的组成性Ubi3启动子(Norris等，1993)控制下的RNAi盒中。通过马铃薯StLS1基因第二内含子(Eckes等，1986；Vancanneyt等，1990)将BvPRR7片段的倒置重复分开以稳定RNAi盒，而且还改进RNAi现象的效率(Wang和Waterhouse，2001；Smith等，2000)。携带BvPRR7的RNAi基因盒和PMI选择标志基因的二元载体的质粒图显示于图10。将RNAi盒转化入二年生基因型G018，如前一实施例所述。使PMI阳性枝条和非转基因对照生根，并转移至18℃温室，最少两周的驯化期，之后进行春化处理。一旦完全确立，使转基因植物暴露于春化处理，其由14周6℃恒温和12小时低人工光照组成。在应用抽苔诱导条件前，通过将温度自10℃逐步升高至18℃，在气候室中缓慢驯化春化植株两周。随后将植株换入更大的盆(2升)，并在暴露于恒温18℃和长日照光周期17小时亮/7小时暗的同时监测抽苔。非转基因对照植株在春化后4-6周常规开始抽苔。遏制了BvPRR7的转基因植株频繁显示抽苔延迟，范围为只有两周至超过四个月。在温室中应用的条件下少数植株可永不抽苔。除抽苔和开花延迟外，转基因植株正常发育并没有显示表型畸变。一般而言，抽苔延迟的植株在抽苔时显示更高的叶片数目，原因在于延长的营养性阶段。

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序列表

<120>多核苷酸标志物

 

<130>N1453 PCT BS

 

<150>07108777.9

<151>2007-05-23

 

<160>52

 

<170>PatentIn version 3.4

 

<210>1

<211>840

<212>DNA

<213>甜菜(Beta vulgaris)

 

<400>1

gctcctgtca ttatgatgtc atctcatgat tcgatgggtt tagtcttaaa gtgcttatcc   60

aagggcgctg ttgactttct ggtgaagcct ataagaaaaa acgaacttaa aaacctttgg  120

cagcatgttt ggaggaggtg tcacagttct agtggtagtg gaagtgaaag ctgtgtaagg  180

aatggaaaat ccataggaag caagagggct gaagagtcgg acaatgacac tgacatcaat  240

gaggaagatg ataacagaag cattggttta caagctcggg atggaagtga caatggaagt  300

gggacccaga gttcatggac aaaaagggct gcagaagttg agagccccca accacagtct  360

acatgggagc aagcaactga tccacctgat agcacttgtg ctcaggtcat ttatccaatg  420

tctgaggcat ttgccagcag ctggatgcct ggatccatgc aggaacttga tggacaggat  480

catcaatatg acaatgtccc aatgggaaag gatttggaga ttggagtacc tagaatttca  540

gattcacggc taaatggacc aaacaaaacg gttaagttag caactactgc tgaggaaaac  600

caatattcac agttagacct caaccaggaa aatgatggtc gaagttttga tgaagagaac  660

ctggagatga ataatgataa acctaaaagt gagtggatta aacaggctat gaactcacca  720

ggaaaagttg aagaacatcg tagaggaaat aaagtatctg atgcaccacc cgaaatttca  780

aaataaagga caaaggcatg caacatgtcg aggatatgcc ttctcttgtg ctcagtctga  840

 

<210>2

<211>493

<212>DNA

<213>甜菜(Beta vulgaris)

 

<400>2

atgtcatctc atgattcgat gggtttagtc ttaaagtgct tatccaaggg cgctgttgac   60

tttctggtga agcctataag aaaaaaygaa cttaaaaacc tttggcagca tgtttggagg  120

aggtgtcaca gtgtaagtgt ctttacattt tccagcttty catcagctta gtggttcgtg  180

tagcagtctt tcarattttc gaactttcta gcacatatga caaattaaac ctgcatgcta  240

attcccgatt agataatgga ataagctctt tcagctggtc ttttacttct ttctcttctc  300

ctcttatgaa aaactggtat gccactatgc atcttgttcc aggtgtttgt ttagtgtttc  360

tttcctttat tcgttttttt gtttttattt ttaattttaa ttttartttt tcctcattct  420

ttttttagtc tagtggtagt ggaagtgaaa gctgtgtaag gaatggaaaa tccataggaa  480

gcaagagggc tga                                                       493

 

<210>3

<211>493

<212>DNA

<213>甜菜(Beta vulgaris)

 

<400>3

atgtcatctc atgattcgat gggtttagtc ttaaagtgct tatccaaggg cgctgttgac     60

tttctggtga agcctataag aaaaaatgaa cttaaaaacc tttggcagca tgtttggagg    120

aggtgtcaca gtgtaagtgt ctttacattt tccagctttt catcagctta gtggttcgtg    180

tagcagtctt tcaaattttc gaactttcta gcacatatga caaattaaac ctgcatgcta    240

attcccgatt agataatgga ataagctctt tcagctggtc ttttacttct ttctcttctc    300

ctcttatgaa aaactggtat gccactatgc atcttgttcc aggtgtttgt ttagtgtttc    360

tttcctttat tcgttttttt gtttttattt ttaattttaa ttttagtttt tcctcattct    420

ttttttagtc tagtggtagt ggaagtgaaa gctgtgtaag gaatggaaaa tccataggaa    480

gcaagagggc tga                                                       493

 

<210>4

<211>493

<212>DNA

<213>甜菜(Beta vulgaris)

 

<400>4

atgtcatctc atgattcgat gggtttagtc ttaaagtgct tatccaaggg cgctgttgac     60

tttctggtga agcctataag aaaaaatgaa cttaaaaacc tttggcagca tgtttggagg    120

aggtgtcaca gtgtaagtgt ctttacattt tccagctttt catcagctta gtggttcgtg    180

tagcagtctt tcagattttc gaactttcta gcacatatga caaattaaac ctgcatgcta    240

attcccgatt agataatgga ataagctctt tcagctggtc ttttacttct ttctcttctc    300

ctcttatgaa aaactggtat gccactatgc atcttgttcc aggtgtttgt ttagtgtttc    360

tttcctttat tcgttttttt gtttttattt ttaattttaa ttttaatttt tcctcattct    420

ttttttagtc tagtggtagt ggaagtgaaa gctgtgtaag gaatggaaaa tccataggaa    480

gcaagagggc tga                                                       493

 

<210>5

<211>15037

<212>DNA

<213>甜菜(Beta vulgaris)

 

<400>5

attattgtac atayawgacy atttacgtaa ctaaattaaa aaaagtttta aaaatgcaaa     60

acagaaaata aaatcaaata tcgacatttg gaaatttata atagaaatga ataaaaataa    120

gggagaaata aatgaagaac aaaataaatg agaaagagaa ttaaaatggt tcttgaaaaa    180

taaatgagag agaaaaggag ggaatgagtg agtgatgaga gagaaagagc tggcccactt    240

tcaaaaattc tgccaaaagc ctgccaaatt ttggccctcc taaaagcatc aaaactacgt    300

agttttggcc aaggtgtagg atgctcatcc tacacctccg tgcaggatct aaattgcgct    360

tagaaatagg gtctcctaat atttctctac tagcattttt tgcacgcgat gcgtgcttga    420

atttttttca agatagaaac tcgatttttt tcgacgtatg taaaagtcaa aatttaaaca     480

ttagacatac aaagtataat tgtttttagt tacaaaattt aattggttta gtctctgtaa     540

cttgagtttc tcaccagtct tttttttttt tttttttttt tttactttca aagttaaatt     600

ctatgaacaa aatagaaatt ttattgaatt tatctatgat ttctaatatt actccctccg     660

acccaaaata tagttcccat ttcccttttt tcacggtaat ttatgcaaat agaatataag     720

agggatagta aagatttttt gtttatttaa ataaatgttg tatgggaaaa gatgatttta     780

ggagagaaag tagagaataa ttggtgaaag agtattaatt gtaacatttt ggttgaataa     840

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caaaattaaa aaatcatttt tttattatat ttacttgaat gtatataata atgtctactg    2760

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cctatgatta tgtgttattt gttttgatct ttcaatttat ctggtgctgt gtgtatatat    3240

gttttgtttt tcttcaagta tttggttatt attgaagtgg gtaattagga atttgctact    3300

aatctatgga tttgggttct gttgtgatta atttactata gatttgaggt ttaatttatg    3360

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tgaatgaggt tgattcacaa aaatgaagat gggcccggtg ttgccaagtc ggtggcagag    3660

cttaatcaac atatagttgc tgtgaaaaaa gaaggtaggg gtagggttgc aggtgaaggg    3720

caggggcttt ccgaggagga cgaactgaga attattgagg atggtgaaga tgcaaacagc    3780

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tgaaaccaag gtggtatggg gttggaactt gatacttaat accttgtatt tggtttcatt    4200

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tccccccatg ggtttctaaa ccccatacct tatgggtttg aggtatgggt ttaaaattta    4320

aaaataagtt aaacaaacac taggtatgtg ttttgttcat tccaaaccca tacctcatac    4380

ctaaaactag tgaaccaaac acccccttaa ggatcttggg acaaagggaa tccattacta    4440

gatctggtga cattaatacc taagtttaca tcagtttcac ttaaatcctt cgttttaaaa    4500

aaagtaaaaa aacctgttag tctgagtaag tttactaatt tttgttctaa aattcaacac    4560

attatctaca tgcaagcact tactagtaca atacaactca aacaatatat gcatcctatc    4620

tgttcacaat gaaccgaaaa ctaatctttt catacccttg tttgatgctt ttttcaggcc    4680

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atcctcaaga ccatgtgatg tactgttaga ttatattaag accctattgt aaataaagca    4800

tgtatagtgg aataaaatgc atgtcttcct actttttttt gggggtcatg aactcattgt    4860

ttgatatttt gcagttgtag gggtgccaaa tggcatagaa gcatggaaaa tcttagaaga    4920

tttgagcaat cagattgacc tagttttaac tgaggtagtc acatcaggac tctctggtat    4980

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gctttcgttc cttgttgtat tagtgtatgt tctgtatttg attttctttc tttgtgcata    5100

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tacattttcc agctttccat cagcttagtg gttcgtgtag cagtctttca aattttcgaa    5400

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ggaagtgaca atggaagtgg gacccaggta gtgctaaccc ctgtaatatt aaacttccta    5820

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gtatgtttgt tgaactacat ttttagccag acttgagtat tttatcctga aggatagaac    6000

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tgtttgttgt atttgcaaag ttagcgcgtt ctcttcctgg atgcttcaaa ataagctgat    6240

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gttgatctcg agatagacaa agaggaagtt taatttctct ttatatgtta tctctcttca    6360

atttgttagc agctatgtct ctttcgtgga catttagaac ccatgttagg ttcatattta    6420

tagttaggtg attgtatcaa aattgccatc acaataaaca gaacattaat ttctattggg    6480

aaggattcaa ggatcaaata tacaggaaag agcagtgtag gagatatcat cttgttgaac    6540

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ggagaccttt aagaaaagta agaccatttt ttgttgggaa gtcaagccat tgtcccagtt    6720

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tagtggttct cttctaaggt gatataagta tgtgataacc caatcctgta tatttcttcg    7140

aggacatcaa ttgtgctact attctagggt gctggagacc catacatata gagccattga    7200

caattaacac aaacttcaac cacttatttt tatttcattt aagctatcaa tccctaagaa    7260

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caactgtaat tgcattttat gacacttacg ctgatatatc tgcaagtgaa gttgatatgc    7440

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ccttggcatt tatatccttt ttatccaaaa gttaaaaaaa gcggaccgtt tgacccatgt    7620

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tcaaactata acatcacagt cctttaaacg tgactgtttc gggggatagt gactggtagg    7860

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cattattaat atcaataatc atttgaaatt cgcatgaaac aaacacaaaa aaaaatcgca    8100

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cttacataag agttcagaat gggtgttata gtttatgttt tagtcattta gaaaatcaat    8340

ttgttttttt tttaaagtta aaatgtatat attaaataag tttagggtct aaggtgttgg    8400

aacatttata gggtaatggg tttgaaactc atatgggtat gtactagaag aggaggaggt    8460

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atgctttgtt gatcatttta atgactttta aggtctttta atcagtagat taaaggcctt    8700

tgatgagtga ttaagatggg ggttatgtga ttaacctctc tagtcaatga aatgttgatt    8760

atgcttatat aacctttgga ttcctatgag tgaggagtta gaagaaaatc agaattttct    8820

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gttcttcaca aacacaaaac acaagttctt gttgattcac ttagaagatc atctaagtgg    8940

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ctcattgatc acaagcctaa cataagggtc gggtctgggt ccaaatttta agacccggac     9120

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tattgtagta attatagttt ttctggtatg gaattagtac ttacatttac cagaagcctg    12660

ctgtcacaag ccataatttg atcatcaagc aacaataatt tggccatttc ttgcttgtat    12720

tgaaagtgag atgacttcaa acttatttgt gtatcatcac atcaggtgcg atatcaaagc    12780

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gaaaacaaag gaaggaatac cgatagctaa caccaattct ttccacaagt tgctgccaag    12900

atcatttatg ccactctgat gtcagctgtc ttcatatgta caaatttcga attttatgtg    12960

tgcatgaggt gctaaatact gtcaaacctc agtgattctg tttggtttag gctgtagaaa    13020

gacatctttt cctttgtgtt ttcatggttc ttattttgag ctgtgttcac tactttttat    13080

aacatggtag cccctggttg cctttggaaa taagcttttc cttaaaggtg tgatgcatat    13140

aatcttgttt ggtgttagat tatatgatca tttcttcagg cgtttacggg tcacattttc    13200

cggaatcctt tcaaacgcga ttccggaaac aatggctcat attttctttt ggtttcaagg    13260

agaaggctat ttaaaacaga aaagatttag gttacagaaa tcagtgatga agcaatgagt    13320

ttcattatag aataggtaga agtagggggt gttttttccg tactcttgag atagaaagtg    13380

gggatagatt ctttggactc gtcagaaagg aataatatag ttgtctacct ttttcatttt    13440

tagttcttgt aggagtttta ttccacttcc atttttgtaa aatttaggag ttgtaaggac    13500

gtgtaaagag aatctgccat ccagatttta accgacggta aatttgttct tttcatgttt    13560

tctcaagtaa ctataatgtt ttcatcgaat ctatagggat tttctaatgt gtacctgata    13620

gaggcacaca gtaacaataa tataagtaca tatattcttt aagaataatg acatagtaat    13680

tatattttta atacaaataa aagatgtcct tatgtaatga aacaaataac ttttccttga    13740

aggtatgcca taattaatta ctttattttg aagatatttt atatttagtt tgggtagtgg    13800

aactactaaa taaaaatatg gttatagtaa catgtactca tgtgcgaacc gaaaaaaacc    13860

ctatgctttc tctaaaagtt cccaaaccct tgagcttata gccccgacgg cccagcgcag    13920

gcttgctgga gcgccgcgtc gctcaccctg tcgccgacga gcctgcatgt cgtatcgttc    13980

ggtcttctga aggtttagtt ttccctgttc ctctttgtgt tattcatcgt tcccatcccc    14040

catgtctccc cttcccctgt cagtggttgt cggcctcccc ttcccctatt aatggttgtc    14100

ggcctcccct tccctttccc ctaatagtgg ttgttggtct ccccttcccc tttcatgttg    14160

tcaagttgtt cctttccccg ttctcccttt tcctagtcct cttttggtgt tcttgttgtt    14220

gttagtttag tggctttggt tggttagttc ggctgagtgc ttcgtcgtcg tatgcccttc    14280

cttgttcccc tatttggttt tggttatgtt ggggtttcgg ttaaccccgt tcccatgctt    14340

aaacgtggga gggcctcagg atttagatat aaaggtcatc attctcgcgc ttagacgtga    14400

gagggattaa gtgttcaggg ataagggctc cgttcctgcg cttaaacgtg ggagaactta    14460

aaggttctag gttttacagg agttttggga ttggaaagta tatgaactct gtttggcaga    14520

agatgacagt gcaatgtggg gattaatcat ttcgttttct tcctttttaa taagttagtc    14580

tcttattatg agagttttct attagttcta atccccttaa tttcttgtag gggttgtaag    14640

tctagtttgt cgttgtttag tatatctagt tcgagaagct cgaaagtttg aggttgtgga    14700

aaaatgtact tactggttgc agatcaagaa tattaagacg aatgtttgac ttcaatttac    14760

tattgcatca ggtaggaaat atggtgagtc atcgaatatc cattatggtt ggaatagtac    14820

catatcatgg aagcggtttc gaagcgtgta tattagtaaa atagatgaag atattcaaat    14880

cgatgtttta gattatcttt tatgtacgta agggtcatta ttgttgtaga tgttgtatgg    14940

ttttttaatt taatgataat ttttccttat tcccacttaa aagtaaacaa tgcattcatg    15000

tgcacatatt agtacatata tttgtatata catctcg                             15037

 

<210>6

<211>788

<212>PRT

<213>甜菜(Beta vulgaris)

 

<400>6

Met Arg Leu Ile His Lys Asn Glu Asp Gly Pro Gly Val Ala Lys Ser

1               5                   10                  15

Val Ala Glu Leu Asn Gln His Ile Val Ala Val Lys Lys Glu Gly Arg

            20                  25                  30

Gly Arg Val Ala Gly Glu Gly Gln Gly Leu Ser Glu Glu Asp Glu Leu

        35                  40                  45

Arg Ile Ile Glu Asp Gly Glu Asp Ala Asn Ser Arg Arg Ser Leu Ser

    50                  55                  60

Ser Val Gln Leu Pro Val His Thr His Arg His Gln Pro Gln Val Gln

65                  70                  75                  80

Pro Gln Gly Arg Val Cys Trp Glu Arg Phe Leu Pro Val Gly Ser Pro

                85                  90                  95

Lys Val Leu Leu Val Glu Ser Asp Asp Ser Thr Arg His Ile Val Ser

            100                 105                 110

Ala Leu Leu Arg Lys Cys Ser Tyr Glu Val Val Gly Val Pro Asn Gly

        115                 120                 125

Ile Glu Ala Trp Lys Ile Leu Glu Asp Leu Ser Asn Gln Ile Asp Leu

    130                 135                 140

Val Leu Thr Glu Val Val Thr Ser Gly Leu Ser Gly Ile Gly Leu Leu

145                 150                 155                 160

Ser Lys Ile Met Ser His Lys Ser Cys Gln Asn Thr Pro Val Ile Met

                165                 170                 175

Met Ser Ser His Asp Ser Met Gly Leu Val Leu Lys Cys Leu Ser Lys

            180                 185                 190

Gly Ala Val Asp Phe Leu Val Lys Pro Ile Arg Lys Asn Glu Leu Lys

        195                 200                 205

Asn Leu Trp Gln His Val Trp Arg Arg Cys His Ser Ser Ser Gly Ser

    210                 215                 220

Gly Ser Glu Ser Cys Val Arg Asn Gly Lys Ser Ile Gly Ser Lys Arg

225                 230                 235                 240

Ala Glu Glu Ser Asp Asn Asp Thr Asp Ile Asn Glu Glu Asp Asp Asn

                245                 250                 255

Arg Ser Ile Gly Leu Gln Ala Arg Asp Gly Ser Asp Asn Gly Ser Gly

            260                 265                 270

Thr Gln Ser Ser Trp Thr Lys Arg Ala Ala Glu Val Glu Ser Pro Gln

        275                 280                 285

Pro Gln Ser Thr Trp Glu Gln Ala Thr Asp Pro Pro Asp Ser Thr Cys

    290                 295                 300

Ala Gln Val Ile Tyr Pro Met Ser Glu Ala Phe Ala Ser Ser Trp Met

305                 310                 315                 320

Pro Gly Ser Met Gln Glu Leu Asp Gly Gln Asp His Gln Tyr Asp Asn

                325                 330                 335

Val Pro Met Gly Lys Asp Leu Glu Ile Gly Val Pro Arg Ile Ser Asp

            340                 345                 350

Ser Arg Leu Asn Gly Pro Asn Lys Thr Val Lys Leu Ala Thr Thr Ala

        355                 360                 365

Glu Glu Asn Gln Tyr Ser Gln Leu Asp Leu Asn Gln Glu Asn Asp Gly

    370                 375                 380

Arg Ser Phe Asp Glu Glu Asn Leu Glu Met Asn Asn Asp Lys Pro Lys

385                 390                 395                 400

Ser Glu Trp Ile Lys Gln Ala Met Asn Ser Pro Gly Lys Val Glu Glu

                405                 410                 415

His Arg Arg Gly Asn Lys Val Ser Asp Ala Pro Pro Glu Ile Ser Lys

            420                 425                 430

Ile Lys Asp Lys Gly Met Gln His Val Glu Asp Met Pro Ser Leu Val

        435                 440                 445

Leu Ser Leu Lys Arg Leu Gly Asp Ile Ala Asp Thr Ser Thr Asn Val

    450                 455                 460

Ser Asp Gln Asn Ile Val Gly Arg Ser Glu Leu Ser Ala Phe Thr Arg

465                 470                 475                 480

Tyr Asn Ser Gly Thr Thr Gly Asn Gln Gly Gln Thr Gly Asn Val Gly

                485                 490                 495

Ser Cys Ser Pro Pro Asn Asn Ser Ser Glu Ala Ala Lys Gln Ser His

            500                 505                 510

Phe Asp Ala Pro His Gln Ile Ser Asn Ser Ser Ser Asn Asn Asn Asn

        515                 520                 525

Met Gly Ser Thr Thr Asn Lys Phe Phe Lys Lys Pro Ala Met Asp Ile

    530                 535                 540

Asp Lys Thr Pro Ala Lys Ser Thr Val Asn Cys Ser His His Ser His

545                 550                 555                 560

Val Phe Glu Pro Val Gln Ser Ser His Met Ser Asn Asn Asn Leu Thr

                565                 570                 575

Ala Ser Gly Lys Pro Gly Val Gly Ser Val Asn Gly Met Leu Gln Glu

            580                 585                 590

Asn Val Pro Val Asn Ala Val Leu Pro Gln Glu Asn Asn Val Asp Gln

        595                 600                 605

Gln Leu Lys Ile Gln His His His His Tyr His His Tyr Asp Val His

    610                 615                 620

Ser Val Gln Gln Leu Pro Lys Val Ser Val Gln His Asn Met Pro Lys

625                 630                 635                 640

Ser Lys Asp Val Thr Ala Pro Pro Gln Cys Gly Ser Ser Asn Thr Cys

                645                 650                 655

Arg Ser Pro Ile Glu Ala Asn Val Ala Asn Cys Ser Leu Asn Gly Ser

            660                 665                 670

Gly Ser Gly Ser Asn His Gly Ser Asn Phe Leu Asn Gly Ser Ser Ala

        675                 680                 685

Ala Val Asn Val Glu Gly Thr Asn Met Val Asn Asp Ser Gly Ile Ala

    690                 695                 700

Ala Lys Asp Gly Ala Glu Asn Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly

705                 710                 715                 720

Ser Gly Ser Gly Val Gly Val Asp Gln Ser Arg Ser Ala Gln Arg Glu

                725                 730                 735

Ala Ala Leu Asn Lys Phe Arg Leu Lys Arg Lys Glu Arg Cys Phe Asp

            740                 745                 750

Lys Lys Val Arg Tyr Gln Ser Arg Lys Lys Leu Ala Asp Gln Arg Pro

        755                 760                 765

Arg Val Arg Gly Gln Phe Val Arg Gln Val Arg Glu Asn Lys Gly Arg

    770                 775                 780

Asn Thr Asp Ser

785

 

<210>7

<211>23

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>引物PRR7(T1)-F

 

<400>7

gaggtgtcac agtgtaagtg tct                                      23

 

<210>8

<211>25

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>引物PRR7(T1)-R

 

<400>8

aaagactgct acacgaacca ctaag                                    25

<210>9

<211>14

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>探针PRR7(T1)-FAM

 

<400>9

ctgatgaaaa gctg                                      14

 

<210>10

<211>14

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>探针PRR7(T1)-VIC

 

<400>10

ctgatggaaa gctg                                      14

 

<210>11

<211>23

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>引物BvPRR7

 

<400>11

atgtcatctc atgattcgat ggg                            23

 

<210>12

<211>21

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>引物BvPRR7

 

<400>12

tcagccctct tgcttcctat g                              21

 

<210>13

<211>23

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>引物BvBTU

 

<400>13

ttgttgaaaa tgcagacgag tgt                            23

 

<210>14

<211>20

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>引物BvBTU

 

<400>14

aagatcgcca aagcttggtg                                20

<210>15

<211>19

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>引物BvlCDH

 

<400>15

cacaccagat gaaggccg t                     19

 

<210>16

<211>18

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>引物BvICDH

 

<400>16

ccctgaagac cgtgccat                       18

 

<210>17

<211>21

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>引物F3766

 

<400>17

tttgatgctt ttttcaggcc a                   21

 

<210>18

<211>27

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>引物R3767

 

<400>18

ttttcttata ggcttcacca gaaagtc             27

 

<210>19

<211>23

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>引物F3354

 

<400>19

atgtcatctc atgattcgat ggg                 23

 

<210>20

<211>21

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>引物R3355

 

<400>20

tcagccctct tgcttcctat g                   21

<210>21

<211>29

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>引物F3768

 

<400>21

tttcctcatt ctttttttag tctagtggt                     29

 

<210>22

<211>24

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>引物R3769

 

<400>22

aatatgtgtg agaaaatggt ggca                          24

 

<210>23

<211>20

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>引物F3782

 

<400>23

tcycaatggg aaaggatttg                               20

 

<210>24

<211>20

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>引物R3783

 

<400>24

aatttcgggt ggtgcatcag                               20

 

<210>25

<211>20

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>引物F3784

 

<400>25

gcccccaacc acagtctaca                               20

 

<210>26

<211>22

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>引物R3785

 

<400>26

ggtccattta gccgtgaatc tg                           22

<210>27

<211>20

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>引物F3806

 

<400>27

tttttgcata ccgaaggcgt                     20

 

<210>28

<211>28

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>引物vR3807

 

<400>28

catttgttga agtaggtgat aaggacaa            28

 

<210>29

<211>28

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>引物F3808

 

<400>29

ttagatcctc tcccttagac tcttctgt           28

 

<210>30

<211>29

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>引物R3809

 

<400>30

tcaccaattc tttatatcat atcatgaca          29

 

<210>31

<211>28

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>引物F3810

 

<400>31

gagaaaaggg ttttagatgg taagtttt           28

 

<210>32

<211>27

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>引物R3811

 

<400>32

aactttaacc catcatgtct tttcaac            27

<210>33

<211>25

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>引物F3853

 

<400>33

aactggacac ttggatttca agtca                     25

 

<210>34

<211>26

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>引物R3854

 

<400>34

ttatgggaaa aaactctcgg tattct                    26

 

<210>35

<211>27

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>引物F3855

 

<400>35

gaaccccatt ttagtattga catttct                   27

 

<210>36

<211>30

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>引物R3856

 

<400>36

aattagatga ataaaaagac aaatgaggaa                30

 

<210>37

<211>26

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>引物F3857

 

<400>37

tccatttgag gagtaggtat gatgag                    26

 

<210>38

<211>22

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>引物R3858

 

<400>38

cttcgaccat cattttcctg gt                        22

<210>39

<211>27

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>引物F3859

 

<400>39

ggaaaaccaa tattcacagt tagacct                     27

 

<210>40

<211>21

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>引物R3860

 

<400>40

tcttgagctg ctgatccacg t                           21

 

<210>41

<211>21

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>引物F3861

 

<400>41

ctgcatctgg taagcctggt g                           21

 

<210>42

<211>18

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>引物R3862

 

<400>42

cgtacctggc gcacgaat                               18

 

<210>43

<211>24

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>引物F3863

 

<400>43

aatttggcca tttcttgctt gtat                        24

 

<210>44

<211>20

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>引物R3864

 

<400>44

aatgtgaccc gtaaacgcct                            20

<210>45

<211>26

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>引物F3865

 

<400>45

ggtgtgatgc atataatctt gtttgg                     26

 

<210>46

<211>16

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>引物R3866

 

<400>46

agcaagcctg cgctgg                                16

 

<210>47

<211>13

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>探针PRR7(#3827)-FAM

 

<400>47

acaggcatca gcc                                   13

 

<210>48

<211>15

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>探针PRR7(#3827)-VIC

 

<400>48

tcacaggcct cagcc                                 15

 

<210>49

<211>24

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>用于基因表达分析的正向引物BvPRR7

 

<400>49

ttggaggagg tgtcacagtt ctag                       24

 

<210>50

<211>22

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>用于基因表达分析的反向引物BvPRR7

 

<400>50

tgtcattgtc cgactcttca gc                         22

<210>51

<211>24128

<212>DNA

<213>甜菜(Beta vulgaris)

 

<400>51

maaacgttgt gatcatctaa tattattgaa tatattatct ccataactta tcctaatatt      60

atttagttta ttacacttga tcgaggacaa aatccttcaa tctcccactt gtctaagaac     120

aagtgtgtaa ccttcaaact ccttaagtcg cttaatgtct aacttgatga catgataaca     180

tcatatgttc atcataacaa tattcaagtc gttccttgaa atctgagttt gaactgtcga     240

aacaaatgat taacttctta atccatttga gcacggccat gcattttcag ttctcactct     300

tcaagaggcc aagacaccaa tcctaactct taggaggact tatccaatct tgtatgacca     360

aagctcccac tcaattcata gcagttccaa tcgctgcttt tataacctcc ttttacggca     420

cggcgttttg cagcgtcaag aacatactaa tccttaagta agaacagttt catactcatg     480

tcaaaggaat ccactaaata tattaataag agtctcataa accttttaga gaactcccac     540

taggtctgcc cagcgtgtat caactataca agcctatgca aatgactaga catctccatg     600

tccctatagc ccatgaaact gcgctatcaa tcaacttgca atctagtcca tgaaattgaa     660

tcatttacgt tcaacttaat gattcgaact agggactaag gtatattata actcctgttc     720

actggataga gttccattcg tcaaatcacg tatttgacaa ttctatcaaa cgttataaaa     780

tactttgaac gttttattta atactaaacc aagattaaat aagaacaaaa cttttattga     840

taaacataaa cataacatat caaagcgagt aattataact gtgaactaat taaaagtaaa     900

tagtacacaa ttaaacccac tctcctatat gcttaagccc tatagcccta gtatgactct     960

catgcttggg ctgtggcaaa ggtttagtca aaggatcagc gacattacta tccgtatgaa    1020

ccttgcaaac tattacatcc tttctctcaa cgatttctcg aatgagatga aactttctaa    1080

gtacatgttt acatctttga tgtgatcttg gttccttaga ctgagctatg gcaccattgt    1140

tatcacaatg taaaacaata ccatctccaa cactaggcac tactcctagc tccagaatga    1200

acttcttcat ccaaacggct tcctttgctg catctgctgc agcaatatac tcagcttctg    1260

tcgtagaatc agcgacagtg ctttgctttg aacttttcca gctcactgcc cctccattta    1320

gacaaaagat gaaaccagat tgggatcgga aatcatcttt gtcagtttgg aaacttgcat    1380

ctgtgtaacc ctcaacaatt aacttacttt tacctccata cactaagaaa ttatccttag    1440

tccttctcaa gtactttagg atattcttag ctgcactcca gtgtgcgtca cctggatttg    1500

attggaatct gctacacatg ctcaaggcat atgaaacatc tgggcgagta caaatcatgg    1560

agtacataat ggagcctata gctgacgcat aaggaacatt actcattcgc ttaatctcat    1620

caggcccaga aggacactga gtcttgctaa gcgacactcc atgttgcatg ggtaggaagc    1680

ctctcttaga gttttccatg ttgaacttag tgacgatctt atctatataa gttcgttggc    1740

taagtccgat catcctctta gacctatccc tatagatctt gatccccaaa atatactcgg    1800

cgttttcgag gtctttcata gaaaaacaac tttttaacca ttccttgact gactcaagca    1860

tgggaatgtt gtttcctatg agaagtatgt catctacata caagaccaag aagactatgt    1920

tactcccact ttccttcttg taaacacaag actcttctcc atttttaaga aaaccaaact    1980

ctttgattgc ctcatcaaaa cgaagattcc aactccgtga tgcttgcttc aatccataaa    2040

tggatttttg aagcttacat accctcctag gattttctgg atccacaaaa ccctccggct    2100

gtgtcatata cacatcctct ttcaagaacc cattcaagaa agcggttttg acatccattt    2160

gccaaatctc gtaatcatag aaggcggcga tcgctaggag tatccgaacg gatttaagca    2220

tggctaccgg tgaaaaggtt tcgtcatagt ctataccatg aacttgcttg aacccttttg    2280

caaccaacct tgctttgtaa acctgaatat taccatcctt gtctgttttc actttgaaaa    2340

cccatttgca accaataggt gtgatcccat cgggcaaatc taccaagtcc catacttgat    2400

tttcagacat ggatgccatt tcggacctca tggcttcgag ccatttttcg gagtcttcac    2460

tcatcaaagc ttgcttgtaa gtagtaggtt cctcaaattc taaaatcatt atctcagaat    2520

tttcagttaa caagaaatca acaaacctct tggttggtat tcttgttcta ctagacttac    2580

gaggggctgc aacaggagaa attttcttct caacaatatg agaattttcg cacgaattag    2640

attcgagtgg gacaatagga ggttcgtgta cgggatgcac gtcctccaac acttggtcag    2700

ttatgggaga agattcctcc aaaggaggaa ctacttcaag cccaacatct ggctcttgtg    2760

tcgttgtctc taacatagga tgaactatgt ccatttgttg atcttctcga acttcttcga    2820

gaaatacatt actcccactt gcctttttgg aaataaaatc tttttccaaa aagacaccac    2880

gacgagcaac aaacactttg ccctcagtgc gattgtagaa gtaatagccc ttggtttcct    2940

ttggataacc cacaaagaaa cacttatctg atttaggggc gagtttatct gaaagtaaac    3000

gctttacata aacctcacat ccccaaatac gtagaaaaga caagtttgga acttttccac    3060

tccatatctc atatggtgtc ttatctactg cctttgatgg agttctatta agtgtgaaag    3120

tagcagtttc gagagcatat ccccagaagg atattggaag atcagcaaaa ctcatcatag    3180

accgaaccat atcaagtaga gttcgattcc tcctttccga aacaccattc aactgaggtg    3240

ttccaggcgg agtgagttgt gaaagaattc cacaactctt caagtgatca ttaaactctt    3300

ggctcaaata ttcaccacca cgatcggatc gcagtgcttt gattgttttg ccaagctggt    3360

tttggacttc attttggaat tctttgaatt tttcaaatga ttccgactta tgcttcatta    3420

aatagacata tccatatcta cttaaatcgt ccgtaaaagt aatgaagtat ccaaaccctc    3480

ccctagcttt tgtgctcatt ggtccacata catcagtatg tattaggccc aatagatcac    3540

tgaccttttc accctttcca gtaaaaggtg actttgtcat tttacccatt aaacatgatt    3600

cacacacatc aaatggctca aagtcaaaag atgttagaag tccatcttta tgcaacttct    3660

gaatgcgttt cgcgtttatg tgtcctaaac gacaatgcca taagtaagta ggattagtat    3720

cgcttgttct atgttttttg ttgtctatgt taaggacatc tttgtctaag tctaggtaat    3780

atagaccatt agacctctta gcagtggcat aaaacattga attcaaataa acagagaaac    3840

aacctttctc aattgtaaat gaaaaccctt cattatccaa aacaggaata gaaataatgt    3900

ttttggtaat agcaggaacg taataacaat tattaagctc taatattaat ccagaaggca    3960

aaggtagact ataagtccca actgcaacgg cggcaactct tgcaccattt ccaactcgca    4020

gttccacctc tcctttagcc aaggttctac tccttcttag tccctgcaca ttcgaagtaa    4080

tgtgagaaac acaaccggta tcaaataccc aagaagtaga tgttgctaaa ttaatgtcaa    4140

tgacatagat acctgaagaa gaagccccag acttcttatc cttcaagtac tttgggcagt    4200

tacgcttcca atgacctatt tgatcacaat agaagcactt ggcatttgcg gccacctttg    4260

gctttgcctt tgcctgtggc ttaatagcag tcttagtggc aacttgcttg cccttatctt    4320

gctttttctt gccagcccat tccttcttaa aacccttttc cttttgaacc ataagaactt    4380

ccttcttagg tgcaatagtg atgttttgct cggcagtcat gagcatccca tgcaactcag    4440

caagggtttt cgacacccca ttcatattga aattcaatcg aaacgtattg aaccccttat    4500

gaagtgagtg cagaatgatg tcagtagcca actcttggct ataaggaaag cccaacctct    4560

ccatggcttc aaaataacca atcatttcga agacatgagt ggcgaccggc ttgccttcaa    4620

ctaacgaaca ctcaagaata gccttgtgag tttcatacct ctctatccga gcttgttgtt    4680

gaaacatggt tttcaactgt cggataatgc tataggcatc caagcttgca aacctctttt    4740

gaaggcttgg ttccatagcc gctagcataa ggcaagtaac aattactgac ctttctgcaa    4800

cggccttatg ggcctctttc tcagcatcag tagaggtagt agttaaaact gggatcggtg    4860

tttcaagaac atcctctcga ccttcggacc taagaacaat tcttagattc ctttcccaat    4920

caaggaagtt gttcccgttc aatttatcct tctcaaggat tgaacgtaag ttaaaaggtg    4980

aattattgtt gttaccagac atgatatcta catagaagat gcaaaaagta taagtatgtt    5040

tatcataata gcttttaaca aattttaaac actttaaaat aaaagctatg cacttgacca    5100

attttaatgt gtcccttttg aatcaagtgg ttctaagatc ctatcaaaca tgatttataa    5160

gtggactttg gcctcaactt aaaaccaagt ttaaaaggta agtaaactcc tttactaatt    5220

acaacaattg taactcttag ttaatgggtg attgctaagg tgattacgct cccaggtaag    5280

gaagttaccc acaacgttgg ggagagcctt cctaatccta gacagagcat gtcacccaaa    5340

cacaaaaacc cataaacttt gctacaaaat ccaaaaccgt tttgatgatt ttgttgggcc    5400

aaaccaaact aaacttgcaa atttcggaaa tttactctac ttagcccaag attgaaagta    5460

atactctgct ttggcagaac ctattactaa cgatcaagtt ttagtaggtg tttatttgga    5520

atagcaaaaa cccaatattt tatttaaggg acctaagtaa attattatgt tgatttaatt    5580

gctagtgaac atttaaataa ttaaatcaca agcataataa acttagaaag catttaaaag    5640

caatatttaa atgcataaaa ttaaatatga tcctagtatg gcccctaaac ctaaagacta    5700

ctctttaaga ctcccttgtt gaatcaccat ggatctccat ccttgtgctt cataggataa    5760

gattgaatca ccattcttct tattaatact tgaataaata ttttttgaaa ttataaacta    5820

aaaaattaca aaaaatacca acgatgcgta gatcgtattt agattacaaa aatacattaa    5880

cgatacgcat atcgtatttt ctatccaagt tttgggccat actagtcacc gcatgcattc    5940

ataatatcat atatacaaaa acatgcattt taatcaacta ttaaaataaa ttatcatgtt    6000

ttaacaactt taaaacataa taacaccatg aagatttaat cacacattaa atcctatggt    6060

tggtacctta agacaaaatt taatcatatt agaatttcgt ctcacaaagg ctttaaaata    6120

ttaatctaac aaatttaatc atattaaact taaagaaaaa ttaaagcaat tgtaggcacc    6180

acatataatt taatcatatt aaaaacaaaa acttaacatg atgactaacc acataaaaag    6240

ggcatgaaag aattaatcaa ctattaatac taacaaccta acatgtaatt aacatcataa    6300

aaaaataata atagttacta actccttagt aacccccttt aaaattaact agtcaattat    6360

cacatataat taactaataa aattaaagct cattatttaa ttcaattatg acttaaatat    6420

aaaattaatc accattaatt aatttatttg caaattggaa tatactcaaa aacaagaaaa    6480

agaaagaaaa aaaaaaaaaa agcaggctgc caaggcagca gtgtacactg ccacctcagt    6540

gccggccacc tgcgcgacca ccagaaacga ccagaacctg ccaccgcgtc gctggccacg    6600

gcgaccagca ccggcagcac tgcagcgcag gcagcaggcc gcgccaacag cagcgcccag    6660

cgcaggaagc tcgcgccgcg cgagccacca cgacgccggc cacagtccgg cggcacgcca    6720

gccaccatgt cggtcgaatt ccggtggacc ttcccccttt ccctttcaat tatcatcaac    6780

ccttgtgcat aattgaatga aagttacaac aaattgattt ggggaaaaaa ttagggttca    6840

tatcaatttt gttttaaaaa aaamcatgaa ctaacacaaa aaatctgata ttttgtgatg    6900

tgagatttca attttgagta taatatatat ttatatatat acatwaaaat ccaattttta    6960

tgtttccaat caattaatat cataatatca attatgcaaa taaattcata tataaagccc    7020

tcccttaatt gaattaaaaa atgaaataaa acatgcatca acatgatcat attaatctat    7080

gcaataggct aactgatacc actgtaggaa cttagatgca taatgcggaa aatcaagtat    7140

caaatacttg tacatctatc ccaagatcat tgcataaatt agtatgaatc aaacaatagt    7200

atagaattat acctttgatg cgtatgttcc tcttgtcacc aaacttctag tggagatcac    7260

cttagaacgt caagcgccgt tcctctaatg ttggtccacg aacaacactt ggatcaccac    7320

gtatgctagt acggaagaga gaaaaacact ctcttacttt tgtggtgagg gccgaaaatg    7380

agtgtgaaaa gactaaggga aaaatcagat ttttcactct agaagttgta aaagtgtata    7440

tccacctttg taaccccata tcaatatata aggtggttac aaaagaggtg tttcatgagg    7500

ctttatttts cctcataatg tcatacatta tgagtctaat aaactcatga gttacaactc    7560

ttcccatcca tcatcaaacc gcgcaaccca tttcacaaat ggatttggat aaatatccaa    7620

gtgtcattac ttgtgtgacc tcataggact caatgatatt agtagttggc cctaatcata    7680

ttagtccaac aaaccacaat tagcttctag caaaacgttg tgatcatcta atattattga    7740

atatattatc tccataactt atcctaatat tatttagttt attacacttg atcgaggaca    7800

aaatccttca caaatgcata tggtttgatg tacaataata tacgagtgta catttgggta    7860

ttttcaatga tcaaagtaat gaccatcagt gtacattgtg atttatcctt atttacgttg    7920

gttgcggtac ctttttatta ttattattag ctccacctac agttgcatgt acatgcacgt    7980

acctagcatg tacactttgt tgacattcat gtacattaac cgggttaacg ttacaattat    8040

gttgttatgt gttgaccttt tgttttaata ctcgtattga gttttttttg ttttgtttgt    8100

gtctatatca caaggattgt actttggatg tctattattg ttcattgtgt gttattgacg    8160

attttatggg gggatgtcat tgtgcatttt gattttgtta atgaacaacc acgaagccaa    8220

gaatgtacaa agaaacataa tagaataaaa gtaacccaat tcctaaagct gatgtcaagt    8280

gagtaatttg caatctttgt acactggtgt gttgatgttt gttcgcttat gaaattcaat    8340

atgtacaatt atagtcatat acctcatagt gctccaggtg ccacaaaaaa aactcaatat    8400

gggtattaaa acaaaaggtc aatacataac aacatgattg caacccagtt aatgtacatg    8460

aatgtcaaca aagtgtacat gcaaggtacg tgcatgtaca tgcaactgta tgtggagcta    8520

ataataaaaa aaggtaccgc aaccaacgta aataaggata aatcacaatg tacactgatg    8580

gtcattactt tgatcactga aaataaggat acattattgt ttgattgaat gttcactgga    8640

tatgactcaa tgtacaaata ttctagcaag attgttcaat tattaagcct gaatgtacaa    8700

tgttgttatg actgaatgtt caagttattt tatagagctg actttgttct gtgtacatta    8760

aagttgcgtt aatgatcatt gtgtatgact aaatatacat tagcttcact aacatgcgtg    8820

cataacatat tctatagaca caaacaaaac aaaaaaaaac tcaatatggg tactagatta    8880

aaaggtcaac acataacaac ctgattgtaa cccagttaat gtacatgaat gtcaacaaag    8940

tgtacatgca aggtacgtgc atgtacatgc aactgtagat ggagctaata ataaaaaaaa    9000

ggttccacaa ccaacgtaaa taaggataaa tcacaatgta cactgatggt cattactttg    9060

atcactgaaa atacccaaat gtacactcgt atattattgt acatcaaacc atatgcattt    9120

gttacattaa aaaaagtttt aaaaatgcaa aacagaaaat aaaatcaaat atcgacattt    9180

ggaaatttat aatagaaatg aataaaaata agggagaaat aaatgaagaa caaaataaat    9240

gagaaagaga attaaaatgg ttcttgaaaa ataaatgaga gagaaaagga gggaatgagt    9300

gagtgatgag agagaaagag ctggcccact ttcaaaaatt ctgccaaaag cctgccaaat    9360

tttggccctc ctaaaagcat caaaactacg tagttttggc caaggtgtag gatgctcatc    9420

ctacacctcc gtgcaggatc taaattgcgc ttagaaatag ggtctcctaa tatttctcta    9480

ctagcatttt ttgcacgcga tgcgtgcttg aatttttttc aagatagaaa ctcgattttt    9540

ttcgacgtat gtaaaagtca aaatttaaac attagacata caaagtataa ttgtttttag    9600

ttacaaaatt taattggttt agtctctgta acttgagttt ctcaccagtc tttttttttt    9660

tttttttttt ttttactttc aaagttaaat tctatgaaca aaatagaaat tttattgaat    9720

ttatctatga tttctaatat tactccctcc gacccaaaat atagttccca tttccctttt    9780

ttcacggtaa tttatgcaaa tagaatataa gagggatagt aaagattttt tgtttattta    9840

aataaatgtt gtatgggaaa agatgatttt aggagagaaa gtagagaata attggtgaaa    9900

gagtattaat tgtaacattt tggttgaata aacaaaggaa aaaacaaaat tcaagaagca    9960

aataaatgag aattgtttcc ttgaataatg caaaagtggg ttttaattcc caaaatatgc   10020

ccaaaaataa aaaaattccc tgtgtaccgt ccacgtaaga cggcacgcga gatttttttt   10080

tcctacttca atacaaccgc tacttaaagt agcggtttac tgattttttt ttttatctac   10140

ttaggtaaaa ccttggcgct gagtgatata actcgctact tcaagtagcg atttactgaa   10200

atccccaact ccatagtttg atatgtgctt gcaacatttt gcccaggtaa accgctactc   10260

agggtagcgg tttatgtgta taaaccgcta cttaaagtag cggtttattt taatataaac   10320

cactattgtg agtagcggtt tacgtgggca aaaacaaaaa aaaaaatagt ttctcgcgtg   10380

tcgtcctacg tggacggtac gcagggaatt ttttaatttt tgggcatatt ttgggaacta   10440

aaacccactt ttgcattatt caaggaaaaa attcaaataa atgatgggac acggtttttc   10500

tagacaaatt acgaaaaaat gtggaactaa atatgaaaat ggaaactata ttttgggaca   10560

cccaaaatgg aaatgggaat tatattttgg gacggaggga gtataatttt ttagttgatt   10620

tttgaattaa gtatactact tcatatattg ttaagaaact ggacacttgg atttcaagtc    10680

aaatttttgt gagtatgtat tgacgttgta gtgtattggt tgtagtttgt aagttaattt    10740

ttgtttttgt aaagtttact catttgagtg atttgtataa tgtaaattat gcaattctat    10800

gattttagtt gacttgtgag tgattgttat aattttattt ccattatttt tatttgaatc    10860

tccctttggt ttgtatgtga atttgtaatt tagaaaggca aaggggtaaa atagtctctt    10920

cattcgggaa caccatagtt cccctccttc ccttatataa taaagatgat gatgattttt    10980

gataataatg atttgtaagt gaattatgtg aatgtttttg tatgtattga cgtcctagta    11040

tattagtttt agtttgtaag ttaatttttt tgtttttgta aagtttcccg atcatttgag    11100

tgattttcgt gattttttgt gattttctca attctatgag tgatttgtaa agtttcttga    11160

tataagtgat ttctgagtgg tgttgaatta atttccggtg gctttgttag aaccccattt    11220

tagtattgac atttcttttg taatttagaa agggaaaggg gggtaaaata ggcatttcaa    11280

aaaaggacac cattgctccc cccttccctt atgtaattga gatatcttaa aagaataccg    11340

agagtttttt cccataaagg agtatttttt ttaaaatttt ttccataaag gagtatttat    11400

tagtaccaag ttgatttccc aaatcattat ccttgcgcaa attgcataat ggagatattt    11460

ggtgttgacg tgtgaatatg gggccataat aataggaggt caaaaacaaa actacaaggg    11520

ttaaaatcgt cacaatatta aacaagcatc tcacattctc actggtcact tttttttaac    11580

ctattaaaag aacaaacctt taactctcct cacaatctga cacgtgtcga atattgattt    11640

actgagatca atttagatcc tctcccttag actcttctgt cttctcagta cagctttaga    11700

tctcaacctc catgtcagca aagttacctt acgtgtcatc ctacgtggcc tctccttcta    11760

cccctcactc ctccacgtca acattttcct ccaaaattaa aaaatcattt ttttattata    11820

tttacttgaa tgtatataat aatgtctact gatcttcttc tttagaacta tctccttctc    11880

tcattggaac ctcaaaatca ttcttatttt atttcgagaa aaggaaaaaa aagcacatct    11940

tttttgaaga ttaatttgtg gattattatt gagcttcatc gtattaaaaa acatagtaaa    12000

agttctttcc tcatttgtct ttttattcat ctaatttttt ttagtgaaga accctaattt    12060

tgtttgtgaa ttctcaagtt caagttttga tttgggtatt ttttttgatg aaatttgtgc    12120

agctgtagga tgttatcgtg ctgagaaaag ggttttagat ggtaagtttt tttttctttg    12180

atttctctct cctacttttt tttttgtttt gctttagata atactgtcat gatatgatat    12240

aaagaattgg tgatttgggt agtttattta acctatgatt atgtgttatt tgttttgatc    12300

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<210>52

<211>2367

<212>DNA

<213>甜菜(Beta vulgaris)

 

<400>52

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gtagaaagtg atgactcaac tcgtcatatt gttagtgctt tgctacggaa atgtagctat  360

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cagattgacc tagttttaac tgaggtagtc acatcaggac tctctggtat aggtcttctg  480

tccaagataa tgagtcacaa aagctgccag aatactcctg tcattatgat gtcatctcat  540

gattcgatgg gtttagtctt aaagtgctta tccaagggcg ctgttgactt tctggtgaag  600

cctataagaa aaaacgaact taaaaacctt tggcagcatg tttggaggag gtgtcacagt  660

tctagtggta gtggaagtga aagctgtgta aggaatggaa aatccatagg aagcaagagg  720

gctgaagagt cggacaatga cactgacatc aatgaggaag atgataacag aagcattggt  780

ttacaagctc gggatggaag tgacaatgga agtgggaccc agagttcatg gacaaaaagg  840

gctgcagaag ttgagagccc ccaaccacag tctacatggg agcaagcaac tgatccacct  900

gatagcactt gtgctcaggt catttatcca atgtctgagg catttgccag cagctggatg  960

cctggatcca tgcaggaact tgatggacag gatcatcaat atgacaatgt cccaatggga 1020

aaggatttgg agattggagt acctagaatt tcagattcac ggctaaatgg accaaacaaa 1080

acggttaagt tagcaactac tgctgaggaa aaccaatatt cacagttaga cctcaaccag 1140

gaaaatgatg gtcgaagttt tgatgaagag aacctggaga tgaataatga taaacctaaa 1200

agtgagtgga ttaaacaggc tatgaactca ccaggaaaag ttgaagaaca tcgtagagga 1260

aataaagtat ctgatgcacc acccgaaatt tccaaaataa aggacaaagg catgcaacat 1320

gtcgaggata tgccttctct tgtgctcagt ctgaagaggt tgggtgatat tgcagacacg    1380

agcactaatg tctcagacca gaatattgtt gggcgttcag agctttcagc cttcaccagg    1440

tacaattcag gcacaactgg taaccagggt caaacaggta atgttggcag ttgctctcca    1500

ccaaataata gttcagaagc agcaaagcag tcccattttg atgctccaca tcaaatttcg    1560

aatagcagta gtaacaataa caatatgggc tctactacta ataagttctt caaaaagcct    1620

gctatggaca ttgataagac acctgcaaaa tcaacagtca actgttctca tcattcacat    1680

gtgtttgagc cagtgcaaag ttcccatatg tctaataata accttactgc atctggtaag    1740

cctggtgttg gctccgtaaa tggtatgctg caagaaaacg taccagtaaa tgctgttctg    1800

ccgcaagaaa ataacgtgga tcagcagctc aagattcagc accaccatca ctaccatcat    1860

tacgatgtcc atagtgtaca gcagctacca aaggtttctg ttcaacataa tatgcccaaa    1920

agcaaggatg tgacagcacc cccacagtgt gggtcttcaa acacttgtag atcgccaatt    1980

gaagcaaatg ttgccaattg cagtttgaat ggaagtggta gtggaagcaa tcatgggagc    2040

aatttcctta atggaagtag tgctgctgtg aatgttgaag gaacaaacat ggtcaatgat    2100

agtgggatag ctgcaaaaga tggtgctgaa aatggaagtg gtagtggaag tggaagtggt    2160

agtggtagtg gtgttggtgt ggatcaaagt cgatcagctc aacgagaagc tgccttgaat    2220

aaattccgtc tcaagcgtaa agaaagatgc tttgacaaaa aggtgcgata tcaaagcaga    2280

aagaagttag cagatcaaag acctcgtgtt cgtgggcaat tcgtgcgcca ggtacgagaa    2340

aacaaaggaa ggaataccga tagctaa                                        2367

Claims (63)

1.依照本发明的且如本文中所描述的多核苷酸，包括其信息片段，该多核苷酸可自定位于距标志物MP0176和GJ01上游1cM距离且与标志物GJ131共分离的，在糖用甜菜中显示与抽苔基因(B基因)相关表型完美共分离的基因组DNA区获得。

2.依照权利要求1的依照本发明的且如本文中所描述的多核苷酸，包括其信息片段，特别是分离的多核苷酸，其是自定位于相对于B基因不到1cM、特别是不到0.75cM、更特别的是不到0.5cM、甚至更特别的是不到0.3cM、但尤其是不到0.25cM距离的基因组DNA区可获得的。

3.依照权利要求1的多核苷酸，包括其信息片段，该多核苷酸是自糖用甜菜基因组中与抽苔基因或B基因遗传连锁的基因组糖用甜菜DNA可获得的且包含一种或多种下述元件：

a)内含子区，其在使用基因组糖用甜菜DNA作为模板时在使用SEQID NO：7和SEQ ID NO：8分别所示正向引物PRR7-F和反向引物PRR7-R或与SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8分别所示序列具有至少90％、特别是至少95％、更特别的是至少98％和多至99％序列同一性的引物对的PCR反应中生成大约0.5kb的扩增产物，特别是多核苷酸片段，其显示SEQ ID NO：2、3或4所示核苷酸序列或其中具有至少70％、特别是至少75％、更特别的是至少80％、甚至更特别的是至少85％、但尤其是至少90％和多至至少95％-99％序列同一性的序列；

b)包含与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：52所示核苷酸序列具有70％、特别是75％、更特别的是80％、甚至更特别的是85％、但尤其是90％和多至95％-99％序列同一性的核苷酸序列的多核苷酸片段；

c)多核苷酸片段包含SEQ ID NO：5所示核苷酸序列或与SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：51所示核苷酸序列具有70％、特别是75％、更特别的是80％、甚至更特别的是85％、但尤其是90％和多至95％-99％序列同一性的序列和；任选地，此外

d)在剪接后编码与SEQ ID NO：6所示氨基酸(核苷酸)序列具有至少80％、特别是至少85％、更特别的是至少90％、甚至更特别的是至少95％、但尤其是至少98％和多至100％序列同一性的多肽的多核苷酸片段；

e)编码NH2-末端附近的假应答调控物接受者域基序(PRR)和COOH-末端处的CCT基序的高度保守部分。

4.依照权利要求1-3(34)的多核苷酸，包括其信息片段，其包含在使用基因组糖用甜菜DNA作为模板时在使用SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8分别所示正向引物PRR7-F和反向引物PRR7-R或与SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8分别所示序列具有至少90％、特别是至少95％、更特别的是至少98％和多至99％序列同一性的引物对的PCR反应中产生大约0.5kb扩增产物的内含子区。

5.依照前述权利要求的多核苷酸，包括其信息片段，特别是分离的多核苷酸，其包含如下多核苷酸片段，该多核苷酸片段显示SEQ ID NO：1所示核苷酸序列或其中具有至少70％、特别是至少75％、更特别的是至少80％、甚至更特别的是至少85％、但尤其是至少90％和多至至少95％-99％序列同一性的序列。

6.依照前述权利要求的多核苷酸，包括其信息片段，其包含如下多核苷酸片段，该多核苷酸显示SEQ ID NO：2、3或4所示核苷酸序列或其中具有至少70％、特别是至少75％、更特别的是至少80％、甚至更特别的是至少85％、但尤其是至少90％和多至至少95％-99％序列同一性的序列。

7.依照前述权利要求的多核苷酸，包括其信息片段，其在剪接后编码与SEQ ID NO：6所示氨基酸(核苷酸)序列具有至少80％、特别是至少85％、更特别的是至少90％、甚至更特别的是至少95％、但尤其是至少98％和多至100％序列同一性的多肽。

8.依照前述权利要求的多核苷酸，包括其信息片段，其包含如下的多核苷酸片段，该多核苷酸片段包含SEQ ID NO：5所示核苷酸序列或与SEQ ID NO：5所示核苷酸序列具有至少70％、特别是至少75％、更特别的是至少80％、甚至更特别的是至少85％、但尤其是至少90％和多至至少95％-99％序列同一性的序列。

9.依照前述权利要求的多核苷酸，包括其信息片段，其包含如下的多核苷酸片段，该多核苷酸片段包含SEQ ID NO：51所示核苷酸序列或与SEQ IDNO：51所示核苷酸序列具有至少70％、特别是至少75％、更特别的是至少80％、甚至更特别的是至少85％、但尤其是至少90％和多至至少95％-99％序列同一性的序列。

10.依照前述权利要求的多核苷酸，包括其信息片段，其包含如下的多核苷酸片段，该多核苷酸片段包含SEQ ID NO：52所示核苷酸序列或与SEQ IDNO：52所示核苷酸序列具有至少70％、特别是至少75％、更特别的是至少80％、甚至更特别的是至少85％、但尤其是至少90％和多至至少95％-99％序列同一性的序列。

11.依照前述权利要求的多核苷酸，包括其信息片段，其包含如下的多核苷酸片段，其中所述多核苷酸片段的互补链能够与SEQ ID NO：1所示核苷酸序列杂交，特别是在中等杂交条件下，更特别的是在严格杂交条件下。

12.依照前述权利要求的多核苷酸，包括其信息片段，其包含如下的多核苷酸片段，其中所述多核苷酸片段的互补链能够与SEQ ID NO：2、3或4所示核苷酸序列杂交，特别是在中等杂交条件下，更特别的是在严格杂交条件下。

13.依照前述权利要求的多核苷酸，包括其信息片段，其包含如下的多核苷酸片段，其中所述多核苷酸片段的互补链能够与SEQ ID NO：5所示核苷酸序列杂交，特别是在中等杂交条件下，更特别的是在严格杂交条件下。

14.依照前述权利要求的多核苷酸，包括其信息片段，其包含如下的多核苷酸片段，其中所述多核苷酸片段的互补链能够与编码具有SEQ ID NO：6所示氨基酸序列的多肽的核苷酸序列杂交，特别是在中等杂交条件下，更特别的是在严格杂交条件下。

15.依照前述权利要求的多核苷酸，包括其信息片段，其包含如下的多核苷酸片段，其中所述多核苷酸片段的互补链能够与SEQ ID NO：51所示核苷酸序列杂交，特别是在中等杂交条件下，更特别的是在严格杂交条件下。

16.依照前述权利要求的多核苷酸，包括其信息片段，其包含如下的多核苷酸片段，其中所述多核苷酸片段的互补链能够与SEQ ID NO：52所示核苷酸序列杂交，特别是在中等杂交条件下，更特别的是在严格杂交条件下。

17.依照前述权利要求的多核苷酸，包括其信息片段，所述多核苷酸是自糖用甜菜基因组中与抽苔基因或B基因遗传连锁的基因组糖用甜菜DNA中可获得的，

a)在PCR反应中使用SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8分别所示正向引物PRR7-F和反向引物PRR7-R或与SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8分别所示序列具有至少90％、特别是至少95％、更特别的是至少98％和至多99％序列同一性的引物对筛选自二年生商业性栽培种H20开发的BAC文库，特别是在如下条件下：初始变性95℃5分钟，接着35个扩增循环30秒钟95℃、30秒钟60℃、30秒钟72℃，再接着5分钟72℃；

b)选择包含均与SEQ ID NO：1所示EST CV301305共享序列同源性的两个非交叠毗连序列群的BAC SBA079-L24并将它们组合成一条单一序列；

c)基于BAC序列毗连序列群与SEQ ID NO：1所示EST CV301305的比对及基于与来自拟南芥属的PRR7基因的序列同源性，获得包含内含子和外显子的甜菜BvPRR7基因的基因结构。

18.依照前述权利要求的多核苷酸，包括其信息片段，其包含具有SEQ IDNO：1所示核苷酸序列的核苷酸序列。

19.依照前述权利要求的多核苷酸，包括其信息片段，其包含具有SEQ IDNO：2所示核苷酸序列的核苷酸序列。

20.依照前述权利要求的多核苷酸，包括其信息片段，其包含具有SEQ IDNO：3所示核苷酸序列的核苷酸序列。

21.依照前述权利要求的多核苷酸，包括其信息片段，其包含具有SEQ IDNO：4所示核苷酸序列的核苷酸序列。

22.依照前述权利要求的多核苷酸，包括其信息片段，其包含具有SEQ IDNO：5所示核苷酸序列的核苷酸序列。

23.依照前述权利要求的多核苷酸，包括其信息片段，其包含具有SEQ IDNO：51所示核苷酸序列的核苷酸序列。

24.依照前述权利要求的多核苷酸，包括其信息片段，其包含具有SEQ IDNO：52所示核苷酸序列的核苷酸序列。

25.依照前述权利要求的多核苷酸，包括其信息片段，其包含具有SEQ IDNO：5所示核苷酸序列的核苷酸序列，其中所述序列具有位于3695的G、位于3827的C、位于3954的T、位于5284的T、位于5714的G、位于10954的G、位于11043的T、位于11143的C、位于11150的C、位于11220的A、位于11238的C、位于11299的A、位于11391的A、位于12053的G、位于12086的G、位于12127的T、位于12193的A、位于12337的G、和位于12837的G，代表一年生等位基因1。

26.依照前述权利要求的多核苷酸，包括其信息片段，其包含具有SEQ IDNO：5所示核苷酸序列的核苷酸序列，其中所述序列具有位于3695的T、位于3827的C、位于3954的T、位于5284的T、位于5714的G、位于10954的G、位于11043的T、位于11143的C、位于11150的C、位于11220的A、位于11238的A、位于11299的T、位于11391的A、位于12053的G、位于12086的G、位于12127的T、位于12193的G、位于12337的G、和位于12837的G，代表一年生等位基因2。

27.依照前述权利要求的多核苷酸，包括其信息片段，其包含具有SEQ IDNO：5所示核苷酸序列的核苷酸序列，其中所述序列具有位于3695的G、位于3827的C、位于3954的T、位于5284的T、位于5714的G、位于10954的G、位于11043的G、位于11143的T、位于11150的C、位于11220的A、位于11238的C、位于11299的T、位于11391的A、位于12053的G、位于12086的G、位于12127的T、位于12193的G、位于12337的G、和位于12837的G，代表一年生等位基因3。

28.依照前述权利要求的多核苷酸，包括其信息片段，其包含具有SEQ IDNO：5所示核苷酸序列的核苷酸序列，其中所述序列具有位于3695的G、位于3827的C、位于3954的T、位于5284的T、位于5714的G、位于10954的G、位于11043的T、位于11143的C、位于11150的T、位于11220的A、位于11238的C、位于11299的T、位于11391的A、位于12053的G、位于12086的G、位于12127的T、位于12193的A、位于12337的G、和位于12837的G，代表一年生等位基因4。

29.依照前述权利要求的多核苷酸，包括其信息片段，其包含具有SEQ IDNO：5所示核苷酸序列的核苷酸序列，其中所述序列具有位于3695的G、位于3827的C、位于3954的T、位于5284的T、位于5714的G、位于10954的G、位于11043的T、位于11143的C、位于11150的C、位于11220的A、位于11238的C、位于11299的T、位于11391的A、位于12053的G、位于12086的A、位于12127的T、位于12193的A、位于12337A、和位于12837的G，代表一年生等位基因5。

30.依照前述权利要求的多核苷酸，包括其信息片段，其包含具有SEQ IDNO：5所示核苷酸序列的核苷酸序列，其中所述序列具有位于3695的G、位于3827的C、位于3954的T、位于5284的T、位于5714的G、位于10954的G、位于11043的T、位于11143的C、位于11150的C、位于11220的A、位于11238的C、位于11299的T、位于11391的A、位于12053的G、位于12086的G、位于12127的T、位于12193的A、位于12337A、和位于12837的G，代表一年生等位基因6。

31.依照前述权利要求的多核苷酸，包括其信息片段，其包含，其中所述序列具有位于3695的G、位于3827的A、位于3954的A、位于5284的C、位于5714的T、位于10954的A、位于11043的G、位于11143的C、位于11150的C、位于11220的C、位于11238的C、位于11299的T、位于11391的G、位于12053的A、位于12086的G、位于12127的C、位于12193的G、位于12337G、和位于12837的A，代表二年生等位基因7。

32.依照前述权利要求的多核苷酸，包括其信息片段，其包含具有编码如下多肽的核苷酸序列的核苷酸序列，该多肽具有SEQ ID NO：6所示氨基酸序列。

33.大约0.5kb的扩增产物，包括信息片段，其是在使用基因组糖用甜菜DNA作为模板时在用SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8分别所示正向引物PRR7-F和反向引物PRR7-R进行的PCR反应中可获得的。

34.一组多核苷酸标志物，其包含众多个体标志物，所述标志物是基于SEQID NO：5所示多核苷酸，包括本文所述任何其等位基因变体1-7开发的，且能够检测位于表5所示核苷酸位置处的多种SNP，其中所述标志物组能够鉴定所述不同等位基因并由此区分一年生和二年生糖用甜菜系。

35.一种多核苷酸标志物，其能自选自下组的多核苷酸分子或其信息片段开发：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ IDNO：5、SEQ ID NO：51和SEQ ID NO：52所示多核苷酸及编码包含SEQ ID NO：6所示氨基酸序列的多肽的多核苷酸，其中所述多核苷酸标志物包含一处或多处多态性，特别是基于SNP、SSR、至少一个核苷酸的缺失或插入的多态性，但尤其是基于SNP的多态性，该多态性鉴定B基因座处的B等位基因且容许区分一年生与二年生基因型或显示二年生或一年生基因型的糖用甜菜植物的植物分组内的不同单元型。

36.依照权利要求35的多核苷酸标志物，其是基于SEQ ID NO：2所示多核苷酸开发的且能够检测BvPRR7基因第3内含子中的至少一种下述SNP：

a)位于87的胞嘧啶或胸腺嘧啶，

b)位于160的胞嘧啶或胸腺嘧啶，

c)位于406的腺嘌呤或鸟嘌呤，

并由此区分一年生与二年生单元型。

37.依照前述权利要求的多核苷酸标志物，其表现为由正向引物和反向引物组成的引物对，所述引物能够与糖用甜菜基因组中与B基因遗传紧密连锁的显示SEQ ID NO：2所示核苷酸序列的基因组区域内的核苷酸序列退火显示且能够扩增其信息片段，其中所述片段包含一处或多处多态性，特别是基于SNP、SSR、或至少一个核苷酸的缺失或插入的多态性，但尤其是例如表5所示基于SNP的多态性，该多态性鉴定B基因座处的B等位基因且容许区分具有一年生与二年生基因型的植物或显示二年生或一年生基因型的糖用甜菜植物的植物分组内的不同单元型。

38.引物对，其与SEQ ID NO：2所示第3内含子内的核苷酸序列退火，且自所示区域扩增包含多态性的信息片段，特别是包含位于#87的C/T SNP和/或位于#160的C/T SNP和/或位于#406的A/G SNP的多态性。

39.引物对，其由正向引物和反向引物组成，所述引物能够与糖用甜菜基因组中与B基因遗传紧密连锁的基因组区域，特别是与B基因内的区域内的核苷酸序列退火，且包含依照本发明和如本文所述的多核苷酸，包括其信息片段，其中所述片段包含多态性，该多态性鉴定B基因座处的B等位基因且容许区分一年生与二年生基因型或显示二年生或一年生基因型的糖用甜菜植物的植物分组内的不同单元型。

40.依照权利要求39的引物对，其由正向引物和反向引物组成，所述引物能够与糖用甜菜基因组中与B基因遗传紧密连锁的基因组区域内的核苷酸序列，特别是与B基因内的核苷酸序列，特别是与B基因启动子区内的核苷酸序列，特别是与SEQ ID NO：51所示B基因启动子区内的核苷酸序列退火，且能够扩增其信息片段，该信息片段鉴定B基因座处的B等位基因且容许区分具有一年生与二年生基因型的植物或显示二年生或一年生基因型的糖用甜菜植物的植物分组内的不同单元型。

41.依照权利要求39的引物对，所述引物能够扩增依照任何前述权利要求的多核苷酸或其信息部分的片段，其中所述片段包含多态性，该多态性鉴定B基因座处的B等位基因且容许区分一年生和二年生基因型。

42.依照权利要求39的引物对，其中所示多态性位点特征在于基于SNP、SSR、至少一个核苷酸的缺失或插入的多态性。

43.引物对，其与SEQ ID NO：5所示BvPRR7基因的编码区内的核苷酸序列退火且自所述编码序列扩增包含多态性的信息片段，特别是包含位于#3827的A/C SNP和/或位于#3954的A/T SNP和/或位于#5714的T/G SNP和/或位于#11220的C/A SNP和/或位于#11391的G/A SNP和/或位于#12053的A/G SNP和/或位于#12127的C/T SNP的多态性。

44.依照权利要求43的引物对，其包含用于扩增包含SNP #3827的片段的SEQ ID NO 27所示正向引物F3806和SEQ ID NO 28所示反向引物R3807。

45.依照前述权利要求的引物对，其包含用于扩增包含SNP #160的片段的SEQ ID NO：7所示正向引物PRR7-F和SEQ ID NO：8所示反向引物PRR7-R。

46.一组探针多核苷酸，其包含与包含多态性的信息多核苷酸片段内的亚区互补的至少两种不同探针分子，其中所述多态性基于SEQ ID NO：5所示PRR7基因的假接受者域内的SNP #3827，且用第一荧光染料标记的第一探针分子具有SEQ ID NO：47所示核苷酸序列，而用第二荧光染料标记的第二探针分子具有SEQ ID NO：48所示核苷酸序列。

47.依照任何前述权利要求的多核苷酸或其任何信息片段在用于在糖用甜菜基因组中检测多态性的等位基因区分测定法中作为标志物的用途。

48.依照任何前述权利要求的引物对在用于在糖用甜菜基因组中检测多态性的等位基因区分测定法中的用途。

49.一种鉴定糖用甜菜植物中与一年生有关的等位基因的缺失或存在的方法，包括：

a.自要分析的糖用甜菜植物获得基因组样品；

b.分析来自所述样品的、与依照任何前述权利要求的多核苷酸的序列互补的基因组区域的核苷酸序列；并

c.比较所述序列与已知分别与二年生表型和一年生表型有关的等位基因序列。

50.依照权利要求49的方法，其中所述基因组区域具有SEQ ID NO：5所示序列。

51.依照权利要求49的方法，其中使用依照任何前述权利要求的基于多核苷酸或其信息片段的分子标志物或引物对进行序列分析。

52.依照权利要求49的方法，包括：

i.分析自第一组BAC选择的BAC的核苷酸序列，所述第一组BAC是自从二年生商业性栽培种H20开发的BAC文库分离的；并

ii.比较所述序列与已知分别与二年生表型和一年生表型有关的等位基因序列。

53.依照权利要求49的方法，其中在使用依照任何前述权利要求的多核苷酸的包含多态性位点的亚区侧翼正向和反向引物的PCR反应中分析内含子区，扩增所述亚区，并比较扩增得到的片段与已知分别与二年生表型和一年生表型有关的等位基因序列。

54.依照权利要求53的方法，其中所述多态性基于SNP。

55.一种用于鉴定糖用甜菜植物中与一年生有关的等位基因的缺失或存在的方法，包括：

a)自要分析的糖用甜菜植物获得基因组样品；

b)通过基于SEQ ID NO：7所示正向引物PRR7-F和SEQ ID NO：8所示反向引物PRR7-R的PCR扩增，分析自糖用甜菜基因组可获得的内含子区的核苷酸序列；并

c)比较所述序列与已知分别与二年生表型和一年生表型有关的等位基因序列。

56.依照权利要求55的方法，其中所述内含子区与SEQ ID NO：2所示核苷酸序列具有至少70％、特别是至少75％更特别的是至少80％、甚至更特别的是至少85％、但尤其是至少90％和多至至少95％-99％序列同一性。

57.依照权利要求55的方法，其中所述内含子区具有SEQ ID NO：2所示核苷酸序列。

58.一种用于鉴定糖用甜菜基因组中与一年生表型共分离的基因组区域中的多态性的等位基因区分测定法，该多态性鉴定B基因座处的B等位基因且容许区分一年生与二年生表型，其包含基于依照任何前述权利要求的多核苷酸或其任何信息片段开发的分子标志物。

59.依照权利要求58的等位基因区分测定法，其中所述分子标志物包含依照任何前述权利要求的引物对。

60.使用依照权利要求58或59的基于标志物的等位基因区分测定法在商业性种子中鉴定一年生污染物的方法。

61.依照任何前述权利要求的多核苷酸用于开发用来鉴定糖用甜菜基因组中与一年生有关的等位基因的缺失或存在的分子标志物的用途，包括：

a)在所述多核苷酸中鉴定多态性位点；

b)将所述多态性同糖用甜菜中与一年生有关的等位基因的缺失或存在关联起来；

c)设计识别此多态性位点侧翼的核苷酸序列的正向和反向引物来扩增可用于等位基因区分测定法的、包含所述多态性位点的多核苷酸。

62.一种鉴定糖用甜菜植物中与一年生有关的等位基因的缺失或存在的方法，包括：

a)自要分析的糖用甜菜植物获得基因组样品；

b)使用与BvPRR7基因(特别是SEQ ID NO：51公开的BvPRR7)的启动子区中存在的核苷酸序列互补并与之结合的引物，特别是引物对自所述样品DNA扩增片段；并

c)比较所述序列与已知与二年生表型有关但与一年生表型无关的等位基因序列。

63.依照权利要求62的方法，包括：

a)自要分析的糖用甜菜植物获得基因组样品；

b)用包含已知在二年生等位基因中存在但在一年生等位基因中不存在的等位基因特异性序列(特别是来自BvPRR7基因(特别是SEQ IDNO：51公开的BvPRR7)的启动子区的等位基因特异性序列)的探针分子探查所述样品DNA。

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