CN118109480A - “早15”基因及其在调控植物生长发育中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了“早15”基因、其编码蛋白、及其在调控植物生长发育，尤其是调控玉米早熟及矮秆中的应用。本发明证实了通过在植物尤其是玉米中过表达“早15”基因，可获得早熟及矮秆的植物，尤其是玉米植株。
Description
技术领域
本发明涉及“早15”基因、其编码蛋白、及其在调控植物生长发育，尤其是调控玉米早熟及矮秆中的应用。
背景技术
玉米在我国乃至全世界的粮食生产中都占有举足轻重的地位。早熟、矮秆、耐密是玉米育种的方向。早熟一方面可以扩大玉米种植区域，这样可以在北方冷凉区、冷寒区一季作春播区；另一方面，早熟可以使玉米在适播区进行复播种植。黄淮海小麦玉米轮作区为了保证一年种两季，玉米的生育期不能过长，生育期缩短的基因可以使一些生育期过长而不适合黄淮海种植的品种变得适合在黄淮海夏播种植。此外，早熟更适宜机械化作业，这是因为玉米成熟后收获前，玉米籽粒含水量降低不到25％以下，籽粒直收会导致玉米籽粒破籽率增高，不利于机械化收割。玉米矮秆可以增加种植密度、增强抗倒性、提升产量。
MADS-box家族基因编码的转录因子在植物花发育的ABCDE模型中起着非常重要的作用，同时还参与调控植物发育过程中的其他环节，如营养器官的生长等。拟南芥中AGL12(Tapia-Lopez et al.,2008)、AGL28(Yoo et al.,2006)与植物的开花时间有关。水稻中OsMADS14是一种主要负责水稻早期开花的调节因子，在水稻中过表达OsMADS14基因会使水稻抽穗期严重缩短，并形成极早开花表型(Pelucchi et al.,2002)。下游调控水稻开花的基因OsMADS15，它的过表达会导致转基因水稻节间伸长，植株变矮，开花提前(Lu et al.,2012)。玉米中过表达ZmMADS1导致早期开花表型，RNA干扰介导的ZmMADS1下调导致玉米开花延迟(Alter et al.,2016)。与Alter报道的来自于玉米自交系B73的ZmMADS1序列不同，同样编码MADS-box转录因子MADS1的“早15”基因来自于玉米自交系郑58，与文献报道中的ZmMADS1基因在CDS序列上存在8处点差，氨基酸序列存在5处点差。氨基酸序列的1处点差存在于K结构域，该结构域参与介导蛋白分子间的相互作用；另外4处点差都位于C末端的C结构域，该结构域介导不同MADS-box蛋白发挥不同的作用。
目前，有关与玉米“早15”相似基因的用途尚未见报道。在已有的国内专利中报道了水稻MADS盒基因(CN00813062.0)具有一种调节植物分枝的功能。玉米中MADS转录因子家族SILKY1(CN200880019049.4)和ZMM28(CN201980026679.2)可以提高籽粒产量。此外，ZmMADS15在短日照条件下，蛋白质ZmMADS15可以调控玉米吐丝时间和散粉时间。但在长日照条件下，ZmMADS15不影响玉米吐丝时间和散粉时间(CN115011628A)。
因此，仍然需要寻找调控植物生长发育，尤其是对于玉米早熟兼具矮秆方向育种具有重要的应用价值的基因。
发明概述
本发明对于植物尤其是玉米的早熟兼具矮秆方向育种具有重要的应用价值。
发明人发现，通过在植物尤其是玉米中过表达“早15”基因，可以使植物尤其是玉米植株在短日照和长日照条件下开花期、成熟期均提前，而且株高、穗位降低；而通过基因编辑技术突变“早15”基因，则可获得开花期、成熟期均延迟的植物，尤其是玉米植株。
因此，本发明的目的是提供玉米“早15”基因、其编码蛋白、及其在调控植物生长发育中的应用，尤其涉及该基因在调控玉米早熟兼具矮秆中的应用。
因此，根据第一方面，本发明涉及玉米“早15”基因。
本发明玉米“早15”基因来源为郑58，其Zea mays(B73RefGen_v3)版本编码为：GRMZM2G171365，Zea mays(Zm-B73-REFERENCE-GRAMENE-4.0)版本编码为Zm00001d048474，Zea mays(Zm-B73-REFERENCE-NAM-5.0)版本编码为Zm00001eb403750(参见图1)。
基因序列信息
本发明“早15”基因相关序列
>GRMZM2G171365cDNA(郑58)(SEQ ID NO:1)
CGGCCATCACGGTGCGCCCTTTCCCTTCCTCCCCAGATCCCCGTCCCCGTTTTCCACTTTTGCCTCCGCCCCAATTCGGATAACAAACCCCTCCGCCTCGTCGCGTCTCCTCCCAGCCGAGCCGATCCGGTAGAGAGAGGGAGAGGGAGAGGGAGGGACTGAGGGAGGAGGAGCTGGGTTCCGGTCCCGGCCGCCCGGCCGGCTGCGCGATTCGATTGTAGCTCTCGTCCCCGGGCGGCGTCCAGGATGGTGCGGGGCAAGACGCAGATGAAGCGAATAGAGAACCCGACCAGCCGCCAGGTCACCTTCTCCAAGCGCCGCAACGGCCTGCTCAAGAAGGCGTTCGAGCTCTCCGTCCTCTGCGACGCCGAGGTCGCCCTCGTCGTCTTCTCCCCGCGCGGCAAGCTCTACGAATTCGCCAGCGGAAGTGCGCAGAAAACGATTGAACGTTATAGAACATACACAAAGGATAATGTCAGCAACAAGACAGTGCAGCAGGATATTGAGCGAGTAAAAGCTGATGCGGATGGCCTGTCAAAGAGACTTGAAGCACTTGAAGCTTACAAAAGGAAACTTTTGGGTGAGAGGTTGGAAGACTGCCCCATTGAAGAGCTGCACAGTTTGGAAGTCAAGCTTGAGAAGAGCCTGCATTGCATCAGGGGAAGAAAGACTGAGCTGCTGGAGGAGCAAGTCCGTAAGCTGAAGCAGAAGGAGATGAGTCTGCGCAAGAGCAACGAAGATTTGCGTGAAAAGTGCAAGAAGCAGCCGCCTGTGCCGATGGCTCCGCCGCCGCCTCGTGCGCCGGCAGTCGACACCGTGGAGGACGATCACCGGGAGCCGAAGGACGACGGAATGGACGTGGAGACGGAGCTGTACATAGGATTGCCCGGCAGAGACTACCGCTCAAGCAAAGACAAGGCTGCAGTGGCGGTCAGGTCAGGCTAGCAGCTAGCTCAGCCACGCACAGGCCCAATCAACGCAAGCTAGCTAGCTGAGAATAATCTTTTAGATCTCTGGTAGTGTGGAGATCGAGATGCAAGCCAAGCAATGTGATATCGCGTCGTGTGTTACCAAAAAAAAAAAAAAAAGTCAGTCAGGCCA
>GRMZM2G171365CDS(郑58)(SEQ ID NO:3)
ATGGTGCGGGGCAAGACGCAGATGAAGCGAATAGAGAACCCGACCAGCCGCCAGGTCACCTTCTCCAAGCGCCGCAACGGCCTGCTCAAGAAGGCGTTCGAGCTCTCCGTCCTCTGCGACGCCGAGGTCGCCCTCGTCGTCTTCTCCCCGCGCGGCAAGCTCTACGAATTCGCCAGCGGAAGTGCGCAGAAAACGATTGAACGTTATAGAACATACACAAAGGATAATGTCAGCAACAAGACAGTGCAGCAGGATATTGAGCGAGTAAAAGCTGATGCGGATGGCCTGTCAAAGAGACTTGAAGCACTTGAAGCTTACAAAAGGAAACTTTTGGGTGAGAGGTTGGAAGACTGCCCCATTGAAGAGCTGCACAGTTTGGAAGTCAAGCTTGAGAAGAGCCTGCATTGCATCAGGGGAAGAAAGACTGAGCTGCTGGAGGAGCAAGTCCGTAAGCTGAAGCAGAAGGAGATGAGTCTGCGCAAGAGCAACGAAGATTTGCGTGAAAAGTGCAAGAAGCAGCCGCCTGTGCCGATGGCTCCGCCGCCGCCTCGTGCGCCGGCAGTCGACACCGTGGAGGACGATCACCGGGAGCCGAAGGACGACGGAATGGACGTGGAGACGGAGCTGTACATAGGATTGCCCGGCAGAGACTACCGCTCAAGCAAAGACAAGGCTGCAGTGGCGGTCAGGTCAGGCTAG
>GRMZM2G171365氨基酸(郑58)(SEQ ID NO:2)
MVRGKTQMKRIENPTSRQVTFSKRRNGLLKKAFELSVLCDAEVALVVFSPRGKLYEFASGSAQKTIERYRTYTKDNVSNKTVQQDIERVKADADGLSKRLEALEAYKRKLLGERLEDCPIEELHSLEVKLEKSLHCIRGRKTELLEEQVRKLKQKEMSLRKSNEDLREKCKKQPPVPMAPPPPRAPAVDTVEDDHREPKDDGMDVETELYIGLPGRDYRSSKDKAAVAVRSG
1.3郑58和B73序列比较
GRMZM2G171365基因在B73数据库中含有1个长内含子，3个短内含子；该基因共存在4种转录本(T01与T04完同)，其中T01最长，翻译232个氨基酸。由郑58克隆得到的CDS长度与B73数据库中的T01 CDS最为相似，GRMZM2G171365CDS(郑58)序列与GRMZM2G171365_T01CDS(B73)序列存在8处点差(参见图2)。
GRMZM2G171365CDS(郑58)和GRMZM2G171365_T01 CDS(B73)翻译的氨基酸个数一致，但氨基酸序列存在5处点差：P119S、P180S、P181A、T190N、D194G(图3)。氨基酸序列的1处点差存在于K结构域，该结构域参与介导蛋白分子间的相互作用；另外4处点差都位于C末端的C结构域，该结构域介导不同MADS-box蛋白发挥不同的作用(参见图3)。
本发明提供一种分离的核酸分子，其特征在于，其包含选自以下的序列：
1)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；
2)与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％同一性的核苷酸序列，其编码的多肽具有调控植物生长发育的功能；
3)在严格条件下与SEQ ID NO:1所示序列杂交的核苷酸序列；
4)在SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列中通过取代和/或缺失和/或增加一个或多个核苷酸，表达相同或功能缺失、突变的蛋白质的核苷酸序列；
5)由SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列产生的不同转录本。
在另一方面，本发明还提供一种分离的核酸分子，其特征在于，其包含选自以下的序列：
1)编码SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的核苷酸序列；
2)编码与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％同一性的氨基酸序列的核苷酸序列，其编码的多肽具有调控植物生长发育的功能；
3)编码在SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列中通过取代和/或缺失和/或增加一个或多个氨基酸残基所得的氨基酸序列的核苷酸序列，其编码的多肽具有调控植物生长发育的功能。
在另一方面，本发明提供一种分离的核酸分子，其特征在于，其包含选自以下的序列：
1)SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；
2)与SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％同一性的核苷酸序列，其编码的多肽具有调控植物生长发育的功能；
3)在严格条件下与SEQ ID NO:3所示序列杂交的核苷酸序列；
4)在SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列中通过取代和/或缺失和/或增加一个或多个核苷酸，表达相同或功能缺失、突变的蛋白质的核苷酸序列；
5)由SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列产生的不同转录本。
在另一方面，本发明提供一种分离的多肽，其特征在于，其由以上方面所述的核酸分子转录和/或表达得到。
在另一方面，本发明提供一种分离的多肽，其特征在于，包含选自如下所述的氨基酸序列：
1)SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；
2)与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％同一性的氨基酸序列，所述多肽具有调控植物生长发育的功能；
3)在SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列中通过取代和/或缺失和/或增加一个或多个氨基酸残基所得的氨基酸序列，所述多肽具有调控植物生长发育的功能。
在另一方面，本发明提供一种重组载体，其特征在于，包含以上方面所述的核酸分子。
在另一方面，本发明提供一种宿主细胞，其特征在于，包含以上方面所述的核酸分子，或包含以上方面所述的多肽或包含以上方面所述的重组载体。
在另一方面，本发明提供一种转基因植物，其特征在于，包含以上方面所述的核酸分子，或包含以上方面所述的重组载体。
在一些实施方案中，所述转基因植物是单子叶植物或双子叶植物，优选作物植物。
在一些具体的实施方案中，所述转基因植物选自玉米(Zea mays)、高粱(Sorghumbicolor,Sorghum vulgare)、大豆(Glycine max)、小麦(Triticum aestivum)、水稻(Oryzasativa)、棉花(如海岛棉(Gossypium barbadense)、芸苔(Brassica campestris)、甘蓝(Brassica oleracea)、油菜(Brassica napus)、芥菜(Brassica juncea)、大麦(Hordeumvulgare)、黑麦(Secale cereale)、燕麦(Avena sativa)、小米、粟(如珍珠粟(Pennisetumglaucum))、番茄(Lycopersicon esculentum)、向日葵(Helianthus annuus)、马铃薯(Solanum tuberosum)、花生(Arachis hypogaea)、甘薯(Ipomoea batatus)、木薯(Manihotesculenta)、甜菜(Beta vulgaris)、甘蔗(Saccharum spp.)、烟草(Nicotiana tabacum)或拟南芥中(Arabidopsis thaliana)的一种或多种；优选拟南芥和玉米；更优选玉米。
在另一个方面，本发明提供以上方面所述的分离的核酸分子或以上方面所述的分离的多肽或以上方面所述的重组载体在调控植物生长发育中的应用。
在另一个方面，本发明提供以上方面所述的分离的核酸分子或以上方面所述的分离的多肽或以上方面所述的重组载体在调控植物早熟和矮杆中的应用。
在一些实施方案中，所述应用包括如下步骤：
1)将以上方面所述的核酸分子，或以上方面所述的重组载体引入目的植物，获得过表达转基因植物；和
2)培养所述植物，使得所述过表达转基因植物与对照植物相比，具有早熟和矮秆的性能。
在另一个方面，本发明提供以上方面所述的分离的核酸分子或以上方面所述的分离的多肽或以上方面所述的重组载体在调控植物晚熟中的应用。
在一些实施方案中，所述应用包括如下步骤：
1)破坏植物中的“早15”基因或与其他植物中的“早15”基因同源的基因，获得转基因植物；和
2)培养所述植物，使得所述转基因植物与对照植物相比，具有晚熟的性能。
在一些实施方案中，所述破坏是通过敲除或敲低“早15”基因实现的。
在一些实施方案中，所述破坏通过CRISPR/Cas、TALEN、ZFN的基因组编辑系统或其他基因编辑系统来实现。
在另一个方面，本发明提供以上方面所述的核酸分子或以上方面所述的多肽或以上方面所述的重组载体在选育性状改变的植物中的应用。
在一些实施方案中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物，优选作物植物。
在一些具体的实施方案中，所述转基因植物选自玉米、高粱、大豆、小麦、水稻、棉花、芸苔、甘蓝、油菜、芥菜、大麦、黑麦、燕麦、小米、粟、番茄、向日葵、马铃薯、花生、甘薯、木薯、甜菜、甘蔗、烟草或拟南芥中的一种或多种；优选拟南芥和玉米；更优选玉米。
在另一个方面，本发明提供一种调控植物生长发育的方法，其包括：
1)将以上方面所述的分离的核酸分子，或以上方面所述的重组载体引入目的植物，获得转基因植物；和
2)培养所述植物，其中与对照植物相比，所述转基因植物具有早熟和矮秆的性能。
在另一个方面，本发明提供一种调控植物生长发育的方法，其包括：
1)破坏植物中的“早15”基因或与其他植物中的“早15”基因同源的基因，获得转基因植物；和
2)培养所述植物，其中与对照植物相比，所述转基因植物具有晚熟的性能。
在另一个方面，本发明提供一种生产转基因植物的方法，所述转基因植物包含引入的以上方面所述的分离的核酸分子、或根据以上方面所述的重组载体，或者其重组表达根据以上方面所述的分离的多肽，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
1)获得所述转基因植物的种子；
2)种植所述种子，获得性状可稳定遗传的所述转基因植物。
在另一个方面，本发明提供一种生产转基因植物的方法，所述转基因植物包含破坏植物中的“早15”基因或与其他植物中的“早15”基因同源的基因，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
1)获得所述转基因植物的种子；
2)种植所述种子，获得性状可稳定遗传的所述转基因植物。
在一些具体的实施方案中，所述转基因植物选自玉米、高粱、大豆、小麦、水稻、棉花、芸苔、甘蓝、油菜、芥菜、大麦、黑麦、燕麦、小米、粟、番茄、向日葵、马铃薯、花生、甘薯、木薯、甜菜、甘蔗、烟草或拟南芥中的一种或多种；优选拟南芥和玉米；更优选玉米。
附图说明
图1示出“早15”基因不同版本汇总。
图2示出“早15”基因在郑58和B73中的CDS序列差异。
图3示出“早15”基因在郑58和B73中的氨基酸序列差异。MADS-box功能域(3-75)，K-box功能域(83-169)，C结构域(170-231)。
图4示出pBCXUN载体图谱。
图5示出重组表达载体pBXCUN-“早15”。
图6示出“早15”基因在对照植株和本发明转基因植物的叶片中的相对表达。
图7示出基因编辑载体pXUE411C结构。
图8示出各年份对照植株和本发明过表达转基因自交系植株的散粉天数的比较。通过Dunnett法检验分析，*p≤0.05；**p≤0.01。
图9示出各年份对照植株和本发明过表达转基因自交系植株的抽丝天数的比较。通过Dunnett法检验分析，*p≤0.05；**p≤0.01。
图10示出对照植株和本发明过表达转基因自交系植株的成熟期天数的比较。通过Dunnett法检验分析，*p≤0.05；**p≤0.01。
图11示出各年份对照植株和本发明过表达转基因杂交种植株的散粉天数的比较。通过Dunnett法检验分析，*p≤0.05；**p≤0.01。
图12示出各年份对照植株和本发明过表达转基因杂交种植株的吐丝天数的比较。通过Dunnett法检验分析，*p≤0.05；**p≤0.01。
图13示出对照植株和本发明过表达转基因杂交种植株的成熟期天数的比较。通过Dunnett法检验分析，*p≤0.05；**p≤0.01。
图14示出对照植株和本发明过表达转基因杂交种穗子的乳线比较照片(小图A为对照植株，小图B为本发明转基因杂交种植株)。
图15示出对照植株和本发明过表达转基因自交系植株的花期与株高比较照片(小图A和B中，左为对照植株，右为本发明转基因自交系植株)。
图16示出对照植株和本发明过表达转基因杂交种植株的花期与株高比较照片(小图A和B中，左为对照植株，右为本发明转基因杂交种植株)。
图17示出对照植株和本发明基因编辑植株的散粉天数的比较。通过Dunnett法检验分析，*p≤0.05；**p≤0.01。
图18示出对照植株和本发明基因编辑植株的吐丝天数的比较。通过Dunnett法检验分析，*p≤0.05；**p≤0.01。
图19示出各年份对照植株和本发明过表达转基因自交系植株的株高的比较。通过Dunnett法检验分析，*p≤0.05；**p≤0.01。
图20示出各年份对照植株和本发明过表达转基因自交系植株的穗位的比较。通过Dunnett法检验分析，*p≤0.05；**p≤0.01。
图21示出各年份对照植株和本发明过表达转基因杂交种植株的株高的比较。通过Dunnett法检验分析，*p≤0.05；**p≤0.01。
图22示出各年份对照植株和本发明过表达转基因杂交种植株的穗位的比较。通过Dunnett法检验分析，*p≤0.05；**p≤0.01。
发明详述
以下定义和说明以更好地定义本发明，并指导所属技术领域技术人员实施本发明。除非另有规定，本文中使用的所有技术和术语与本发明所属技术领域的技术人员通常理解的含义相同。除非特别说明，本文应用和涵盖的技术是本发明所属技术领域的技术人员熟知的标准方法。所述材料、方法和实施例仅用作说明目的，而不以任何方式限制本发明的保护范围。
本文所述的，“植物”包括完整的植物、转基因植物、分生组织、植物的部分、植物细胞及其后代。植物的部分包括但不限于叶、茎、块茎、根、花(包括例如苞、萼片、花瓣、雄蕊、心皮、花药、胚珠等)、果实、胚、胚乳、种子、花粉、分生组织、愈伤组织、原生质体、小孢子等。
本文所述的，可用的植物种类通常涵盖适用于转基因技术的高等植物种类，包括被子植物(单子叶和双子叶植物)、裸子植物、蕨类植物、木贼类植物、裸蕨植物、石松类植物、苔藓植物和多细胞藻类。
在一些实施方案中，本发明的植物的部分或植物细胞是可再生的。在另一些实施方案中，本发明的植物的部分或植物细胞是不可再生的。
在具体的实施方案中，适于本发明的植物选自以下：玉米、高粱、大豆、小麦、水稻、棉花、芸苔、甘蓝、油菜、芥菜、大麦、黑麦、燕麦、小米、粟、番茄、向日葵、马铃薯、花生、甘薯、木薯、甜菜、甘蔗、烟草、拟南芥等。优选地，适用于本发明的植物是玉米或水稻。
本文所述的，术语“转基因”是指人工引入宿主细胞的基因组中的多核苷酸分子。这种转基因可以是与宿主细胞异源的。术语“转基因植物”是指包含上述异源多核苷酸的植物，转基因植物包括从最初转化的植物细胞再生的植物和来自转基因植物的后续生成或杂交的后代转基因植物。
本领域技术人员所知的本领域的任何常用方法可用于获得转基因植物，例如通过植物细胞原生质体的电穿孔或显微注射引入异源核酸序列；或通过DNA微粒轰击(DNAparticle bombardment)将异源核酸序列直接引入植物组织细胞中；或使用根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)宿主细胞将异源核酸序列引入植物细胞中。
本文所述的，“对照植物”是指不含赋予增强性状的重组DNA的植物。对照植物用于鉴定和选择具有增强性状的转基因植物。合适的对照植物可以是用于生成转基因植物的亲本系的非转基因植物，例如，野生型植物(WT)。合适的对照植物也可以是含有赋予其它性状的重组DNA的转基因植物，例如，具有增强的除草剂耐受性的转基因植物。
本文所述的，“性状”是指植物或特定植物材料或细胞的生理、形态、生化或物理特征。在一些情况下，该特征是人眼可见的，如种子或植物尺寸，或者可以通过生化技术(如检测蛋白、淀粉、某些代谢物或种子或叶的油含量)或通过观察代谢或生理过程(如通过测量对水剥夺或特定盐或糖浓度的耐受性)或通过测量一种或多种基因的表达水平(如利用Northern分析、RT-PCR、微阵列基因表达测定法或报道基因表达系统)或通过农业观察(如高渗胁迫耐受性和产量)来测量。任何技术都可用于测量转基因植物中的任何选择的化学化合物或大分子的量、比较水平或差异。
本文所述的，“基因”或“基因序列”是指基因的部分或完全编码序列，其互补序列，和其5’和/或3’非翻译区。基因也是遗传的功能单元，并且在物理方面是参与产生多肽链的沿着DNA(或RNA，在RNA病毒的情况下)的分子的核苷酸的特定区段或序列。后者可以经历后续处理，如化学修饰或折叠以获得功能性蛋白或多肽。通过实例的方式，转录调节基因编码转录调节多肽，其可以是功能性的或需要加工以充当转录的引发剂。
本文所述的，术语“核酸”涉及任何包含脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸的聚合物，包括但不限于经过修饰的或者未经修饰的DNA、RNA，其长度不受任何特别的限制。对于用于构建重组构建体的核酸，优选为DNA，相比RNA而言，其更稳定，且易于操作。
术语“DNA”是指基因组或合成来源的双链DNA分子，即脱氧核糖核苷酸碱基的聚合物或核苷酸分子，从5’端(上游)至3’端(下游)阅读。术语“核苷酸序列”是指通常从5’(上游)末端至3’(下游)末端显示的DNA或RNA分子的核苷酸的序列。
本领域技术人员知晓的方法都可用于分离和本文所述的DNA分子或其片段。例如，PCR(聚合酶链式反应)技术可用于扩增特定起始DNA分子和/或产生原始分子的变体。DNA分子或其片段也可以通过其它技术来获得，如通过化学方法直接合成片段(如自动化寡核苷酸合成仪)。
术语“转录本”，是指对DNA核苷酸序列进行的、由RNA聚合酶催化的转录得到的产物。当RNA转录本是DNA序列的完美互补拷贝时，其被称为一级转录本，或者其可是对一级转录本进行转录后加工获得的RNA，被称为成熟RNA。
术语“分离的”是指，至少部分地将所述分子与通常在其自体或天然状态中与其连接的其它分子分离。
在一些实施方案中，术语“分离的核酸分子”是指这样的核酸分子，其至少部分地与在自体或天然状态中通常侧翼连接所述核酸分子的核酸分离。因此，在本文中，如作为重组技术的结果，融合于它们通常不相连接的调控或编码序列的核酸分子，被认为是分离的。此类分子即使当整合入宿主细胞的染色体或与其它核酸分子一起存在于核酸溶液中时，亦被认为是分离的。
本文所述的，“多肽”包含多个连续的聚合氨基酸残基，例如至少约15个连续聚合的氨基酸残基。通常，多肽包含一系列的聚合的氨基酸残基，为转录调节剂或其结构域或部分或片段。此外，所述多肽可包含：(i)定位结构域；(ii)活化结构域；(iii)抑制结构域；(iv)寡聚化结构域；(v)蛋白-蛋白相互作用结构域；(vi)DNA结合结构域；或其他部分。所述多肽任选地包含经修饰的氨基酸残基、不由密码子编码的天然存在的氨基酸残基、非天然存在的氨基酸残基。
本文所述的，“蛋白”是指一系列氨基酸、寡肽、肽、多肽或其部分，无论是天然存在的还是合成的。
术语“分离的多肽”，是指，无论是天然存在还是重组的多肽，在细胞中(或细胞外)，比在野生型细胞中的其天然状态的多肽含量更高，例如，含量超过约5％或超过约10％或超过约20％或超过约50％或更多，即可替代地表示为：相对于以100％均一化的野生型多肽，含量为105％，110％，120％，150％或更多。这不是野生型植物的自然反应的结果。此外，将分离的多肽与其它通常缔合的细胞组分分离，例如，利用各种蛋白纯化方法。
本文所述的，“同一性百分比”、“％同一性”或“同一性％”是氨基酸序列或核苷酸序列之间的比较，由在比较窗口上的最佳比对的两个序列比较确定(如为与另一核苷酸序列或氨基酸序列进行最佳比对，可将空位引入到第一条核苷酸序列或氨基酸序列中)。本领域技术人员知道如何计算两个序列之间的同一性百分比，例如通过Clustal、Bestfit、Blast、Fasta等多种软件进行。同一性百分比通过以下测定：计算两个序列中相同核苷酸或氨基酸的位置数目，除以参照序列的全长(不包括由比对过程引入参考序列的空位)，再乘以100％。参照序列可以是如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5，或者SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6。相对于参照序列，另一个序列之一可以具有一个或多个氨基酸/核苷酸的插入，取代和缺失。
在一些实施方案中，本发明的核苷酸序列与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、98％、99％或100％的同一性。
在一些实施方案中，本发明的多肽序列与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、98％、99％或100％的同一性。
如本文所述，术语“严格条件”或“严格杂交条件”包括探针以比其他序列更高的可检测度(例如，至少比背景高两倍)与目标序列杂交的条件。严格条件根据序列和环境的不同而不同。通过调节杂交和/或洗涤调节的严格程度，可以检测与探针最高100％互补的目标序列。或者，也可以调节严格程度使得序列中可以存在一些错配，从而检测同一性较低的目标序列。杂交特异性取决于杂交后的洗涤步骤，关键因素是洗涤溶液中的盐浓度和温度。根据需要，温度和盐浓度两者均可以变化，或者温度或盐浓度保持不变，而另一变量改变。促进DNA杂交的适当严格条件是本领域技术人员知晓的。低度严格条件的示例有：在37℃下，在含30-35％甲酰胺、1M NaCl、1％ SDS的缓冲液中杂交，并在50℃-55℃下用1-2×SSC(氯化钠/柠檬酸钠)洗涤。中度严格条件的示例有：在37℃下，在含40-45％甲酰胺、1MNaCl、1％SDS的缓冲液中杂交，并在55℃-60℃下用0.5-1×SSC洗涤。高度严格条件的示例有：在37℃下，在含50％甲酰胺、1M NaCl、1％ SDS的缓冲液中杂交，并在60℃-65℃下用0.1×SSC洗涤。关于核酸杂交的详细描述可以参见Haymes等，Nucleic Acid Hybridization,APractical Approach,IRL Press,Washington,DC(1985)；及Sambrook等，CurrentProtocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,N.Y.(1989),6.3.1-6.3.6。
如本文所述，“插入”、“缺失”或“取代”一个或多个核苷酸或氨基酸，这里的插入、缺失和/或取代并不会损害原始序列的功能(例如，在本文中是指仍然保留抗旱和/或在干旱条件下提高作物产量的功能)。本领域技术人员知晓在原始序列中完成一个或多个核苷酸/氨基酸的插入、缺失和/或取代，并同时保留原始序列生物功能的方法。例如选择在非保守区进行这样的插入、缺失和/或取代；或基于遗传密码子的简并性，通过“沉默变异”来修饰核苷酸而不改变该核苷酸编码的多肽；又或，通过“保守性取代”将蛋白质中的一个氨基酸替换为性质相似的另一个氨基酸而不影响该蛋白质的生物功能。保守性取代可以发生在以下组内：1)酸性(带负电荷)氨基酸，如天冬氨酸和谷氨酸；2)碱性(带正电荷)氨基酸，如精氨酸、组氨酸和赖氨酸；3)中性极性氨基酸，如甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；和4)中性非极性(疏水)氨基酸，如丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。对于天然蛋白或多肽内的氨基酸的保守性取代可以选自天然存在的氨基酸所属组群的其它成员。如，具有脂族侧链的氨基酸组群是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；具有脂族-羟基侧链的氨基酸组群是丝氨酸和苏氨酸；具有含酰胺侧链的氨基酸组群是天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳族侧链的氨基酸组群是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有碱性侧链的氨基酸组群是赖氨酸、精氨酸和组氨酸；和具有含硫侧链的氨基酸组群是半胱氨酸和甲硫氨酸。天然保守氨基酸取代组群是：缬氨酸-亮氨酸、缬氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸缬氨酸、天冬氨酸-谷氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。
本文所述的，术语“重组”是指通常未在自然界中发现的并且因而通过人干预产生的DNA和/或蛋白质和/或生物体形式。这样的人干预可产生重组DNA分子和/或重组植物。
在一些实施方案中，重组载体还包含可操作地连接至所述核苷酸序列的启动子、终止子、调节序列、选择标记和/或其在宿主细胞中表达所必需的任何其他序列。在一些具体的实施方案中，所述重组载体是质粒。
这里所述的，术语“启动子”通常是指参与RNA聚合酶II和其它蛋白(反式作用转录因子)的识别和结合以起始转录的DNA分子。
在一些实施方案中，启动子可以最初分离自基因的基因组拷贝的5’非翻译区(5’UTR)；或者，启动子可以是合成产生或操纵的DNA分子。在一些实施方案中，启动子也可以是嵌合的，即通过两个或多个异源DNA分子的融合产生的启动子。植物启动子包括获得自植物、植物病毒、真菌和细菌(如农杆菌)的启动子DNA。在一些实施方案中，所述启动子是发育调节型、细胞器特异性、组织特异性、诱导型、组成型或细胞特异性启动子。
本文所述的，“可操作地连接”可与“以可操作的方式连接”互换使用，是指第一个序列(例如启动子)与第二个序列(例如目的基因)之间的功能性连接，其中启动子序列启动并介导第二个序列的转录。通常，可操作地连接的两个序列是邻近的。本领域技术人员知道如何选择在宿主细胞中表达基因所需的启动子，终止子和其他序列。
在一些具体的实施方案中，基因的表达由所谓的“强”启动子(即，具有高转录潜能的启动子，使得该基因被强表达)控制。
本文所述的，“宿主细胞”是指含有重组载体并支持该表达载体进行复制和/或表达的细胞。宿主细胞可以是原核细胞(例如大肠杆菌细胞、根瘤农杆菌细胞)或真核细胞(例如酵母、昆虫、植物或动物细胞)。
在一些实施方案中，宿主细胞优选为单子叶或双子叶植物细胞，包括但不限于来自玉米、高粱、大豆、小麦、水稻、棉花、芸苔、甘蓝、油菜、芥菜、大麦、黑麦、燕麦、小米、粟、番茄、向日葵、马铃薯、花生、甘薯、木薯、甜菜、甘蔗、烟草、拟南芥的细胞。优选地，宿主细胞是玉米细胞或水稻细胞；更优选地，宿主细胞是玉米细胞。
本文所述的，将核酸分子或表达载体“引入”植物或植物细胞是指将所述核酸分子或重组表达载体转染、转化、转导或掺入宿主细胞，使得核酸分子能够在宿主细胞中进行自主复制或表达。
在一些实施方案中，引入的核酸分子被整合到宿主细胞基因组DNA中(例如染色体、质粒、质体或线粒体DNA)中，所述核苷酸序列的表达受调节性启动子区的控制。在另一些实施方案中，引入的核酸分子没有被整合到细胞基因组中。
本文所述的CRISPR/Cas基因编辑系统，包括例如Cas9或修饰的Cas9酶、指导RNA和/或同源定向修复模板等所需的所有组分；包括(a)CRISPR/Cas系统核苷酸序列或编码CRISPR/Cas系统核苷酸序列的核苷酸序列和/或(b)编码CRISPR/Cas酶的核苷酸序列，上述序列可被包括在一种或多种重组病毒载体中。其中(a)核苷酸序列可以位于与(b)的核苷酸序列相同或不同重组病毒载体上。
在一些实施方案中，病毒载体可以是逆转录病毒载体，可选慢病毒载体、杆状病毒载体、单纯疱疹病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒(AAV)载体(如AAV8载体)、或痘病毒(如牛痘病毒)。
在一些实施方案中，(a)CRISPR/Cas系统核苷酸序列或编码CRISPR/Cas系统核苷酸序列的核苷酸序列和/或(b)编码CRISPR/Cas酶的核苷酸序列可以通过脂质体、纳米粒子、外泌体、微囊泡或基因枪递送至生物的细胞。
在一些具体的实施方案中，优选的CRISPR/Cas酶是II型CRISPR/Cas酶，优选地II型Cas9酶或其生物活性片段或衍生物。
本发明所涉及的玉米“早15”基因序列来源为郑58，其Zea mays(B73 RefGen_v3)版本编码为：GRMZM2G171365，Zea mays(Zm-B73-REFERENCE-GRAMENE-4.0)版本编码为Zm00001d048474，Zea mays(Zm-B73-REFERENCE-NAM-5.0)版本编码为Zm00001eb403750。由于玉米同一段DNA序列可产生不同转录本，翻译出不同蛋白质，该段序列产生的不同转录本以及翻译出的不同蛋白质均在本申请保护范围内。
本发明利用基因编辑的方法对玉米“早15”基因进行敲除，可获得晚熟的玉米植株；而在玉米中过表达玉米“早15”基因，可获得早熟和矮杆的玉米植株。因此本发明对培育开花期、成熟期均提前，而且株高、穗位降低的玉米有重要的理论指导意义和生产应用价值。
本发明的技术效果如下：
本发明实施例中通过在玉米中过表达玉米“早15”基因，可获得早熟和矮杆的玉米植株。与传统育种方式相比，本发明“早15”基因过表达转基因玉米的花期、成熟期均显著且稳定地提前了，并且株高与穗位均显著且稳定地降低了。因此，本发明为培育和改良玉米提供了基因资源，并且为阐明“早15”基因在植物生长发育，尤其是早熟和矮杆的重要角色提供了理论依据。综上所述，本发明拓宽了植物育种中可用的优良等位基因的来源，为获得优良等位基因提供了新的思路；大大缩短了优良等位基因的选择进程，为优良等位基因的应用提供了可能。
具体实施方式
以下实施例所使用的玉米受体材料自交系为ND101；农杆菌菌株为EHA105。
实施例1.过表达载体设计构建及转基因材料创制
1.1载体骨架
pBCXUN：在载体pCXUN(NCBI GenBank：FJ905215)基础上进行改造，将HYG基因通过XhoⅠ位点替换为Bar；Bar基因来自pCAMBIA3301，pCXUN载体中启动目的基因表达的启动子为玉米Ubiquitin-1，终止子为T-nos。
载体图谱如图4所示。
1.2“早15”基因过表达载体的构建
首先，按照制造商的说明，采用磁珠法植物总RNA提取试剂盒(北京百泰克生物技术有限公司，货号AU3402)从玉米品种郑58的V4期叶片提取RNA，然后采用High-CapacitycDNA Reverse Transcription Kit(Thermo Scientific公司，货号4368814)将RNA反转录为cDNA，并构建全基因组cDNA文库。然后，对cDNA文库进行测序，通过生物信息学方法，参照已公布的B73序列及基因注释，筛选获得含有“早15”基因完整CDS序列的质粒，并通过限制性内切酶Quick cut SfiI(TaKaRa公司，货号1637)酶切获得“早15”基因的CDS序列(GRMZM2G171365cDNA(郑58))。将纯化后的“早15”CDS序列与pBCXUN载体(NCBI GenBank：FJ905215，参见例如Plant Physiol.150(3),1111-1121(2009))进行连接，得到重组表达载体pBCXUN-“早15”(参见图5)。用该重组表达载体转化大肠杆菌，筛选阳性克隆，并经测序确认其中含有完整的“早15”基因。
1.3制备“早15”基因过表达的转基因玉米
将重组表达载体pBXCUN-“早15”导入农杆菌EHA105菌株，得到重组菌。然后通过农杆菌介导法，将重组菌导入玉米自交系ND101中，获得T0代转基因植株。
取T0代转基因植株的幼苗叶片，提取基因组DNA。以基因组DNA为模板，采用引物Ubip-F(针对重组表达载体pBXCUN-“早15”的Ubi1P启动子5’端)和引物Nos-R(针对重组表达载体pBXCUN-“早15”的Nos终止子3’端)进行PCR扩增。玉米自交系ND101幼苗叶片的基因组DNA作为阴性对照，重组表达载体pBXCUN-“早15”的质粒作为阳性对照。
Ubip-F：5’-TTTTAGCCCTGCCTTCATACGC-3’(SEQ ID NO:4)；
Nos-R：5’-AGACCGGCAACAGGATTCAATC-3’(SEQ ID NO:5)。
将PCR扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳检测。结果表明，转基因植株与质粒均能扩增出1291bp大小的单一条带，而亲本ND101没有扩增出相应条带，说明“早15”基因被成功转入该转基因植株。
将经鉴定的T0代转基因植株进行自交获得T1代转基因植株子代；T1代转基因植株子代再进行自交，得到T2代转基因植株子代；T2代转基因植株子代再进行自交，得到T3代转基因植株子代；在每一代均采用上述PCR扩增的方法鉴定阳性转基因植株，然后再进行自交。选择3个代表性的T3代纯合转基因株系(即，早15-1、早15-2、早15-3)用于后续的功能分析实验。
1.4“早15”基因的表达量检测
本实施例用3个代表性的T3代纯合转基因株系(即，早15-1、早15-2、早15-3)和玉米自交系ND101(WT)作为待测植株。
首先，按照制造商的说明，采用磁珠法植物总RNA提取试剂盒(北京百泰克生物技术有限公司，货号AU3402)提取待测植株的V4期叶片的RNA，然后采用High-Capacity cDNAReverse Transcription Kit(Thermo Scientific公司，货号4368814)将RNA反转录为cDNA。
然后，采用SYBR Premix Ex TaqTM II(Tli RNaseH Plus)试剂盒(Takara公司，货号RR820A)，以cDNA为模板，用特异性引物“早15”-Q-F(5’-CTCCGCCGCCGCCTCGTG-3’)(SEQID NO:6)和“早15”-Q-R(5’-CGTCCATTCCGTCGTCCTTC-3’)(SEQ ID NO:7)进行实时荧光定量PCR扩增，以检测“早15”基因的表达量。玉米自交系ND101(WT)的cDNA用作对照。玉米Actin基因用作内参基因，其检测引物为：ZmActin-rF：5’-GAGCTCCGTGTTTCGCCTGA-3’(SEQ IDNO:8)和ZmActin-rR：5’-CAGTTGTTCGCCCACTAGCG-3’(SEQ ID NO:9)。荧光定量PCR扩增的反应程序如下表1所示。
表1.荧光定量PCR扩增的反应程序
荧光定量PCR的结果如图6所示。从图6可以看出，转基因株系早15-1、早15-2、早15-3中的“早15”表达量均显著高于对照植株玉米自交系ND101(WT)。这些结果表明，“早15”基因在T3代纯合转基因株系早15-1、早15-2、早15-3中成功地过表达。
实施例2.基因编辑载体与基因编辑材料创制
2.1基因编辑载体骨架
本实施例中使用的载体pBUE411C是在pBUE411基础上进行改造，通过BsaⅠ位点，用大肠杆菌F质粒阴性菌株致死基因ccdB替换抗性基因SpR，构建成现用终载体pBUE411C。该载体转入DH5α后，阴性菌将无法生长，可明显提高阳性率至90％以上。pBUE411由中国农业大学作物功能基因组与分子育种研究中心合作教授、生物学院陈其军教授实验室设计构建并馈赠，相关研究成果已发表(Xing et al BMC Plant Biol.2014Nov 29；14(1):327.)。
基因编辑载体pXUE411C结构如图7所示。
2.2“早15”基因靶点设计及基因编辑载体构建
设计构建单靶点基因敲除载体早15M，将特异单靶点序列GGTGACCTGGCGGCTGGTC，构建至载体pBUE411C。将重组表达载体导入农杆菌EHA105菌株，得到重组菌。然后通过农杆菌介导法，将重组菌导入玉米自交系ND101中，获得T0代转基因植株。
2.2.1靶点设计利用基因编辑载体设计网站http://crispor.tefor.net/查找候选靶点，然后对候选靶点进行筛选。由于靶点设计网站依据的是已完成测序的自交系，与转基因受体材料有异，为保证基因编辑效率，需要对转基因受体材料进行靶点验证。以受体材料玉米自交系野生型DNA为模板，参照目标基因DNA序列设计特异引物，对受体材料涵盖靶序列区段完成测序验证，且靶序列与受体材料完全一致。
2.2.2靶点验证
以受体材料玉米自交系ND101野生型DNA为模板，采用KOD酶进行30μl体系的PCR扩增，引物为早15M-(-172)F&早15M-229R，PCR体系和Touch Down PCR程序如下。取5μl PCR产物做琼脂糖凝胶电泳检测，PCR产物片段大小正确且特异，其余的产物直接送测，测序引物为早15M-(-172)F，根据测序结果验证靶点序列是否与受体材料完全匹配。如完全匹配则进行下一步载体设计构建。
靶点验证引物：
早15M-(-172)F：5’-CCCCAATTCGGATAACAAACC-3’(SEQ ID NO:10)
早15M-229R：5’-CTCGAACTCGAAGGGAAGACG-3’(SEQ IDNO:11)
PCR扩增体系：
PCR扩增程序：
PCR扩增序列(SEQ ID NO:12)：
2.2.3载体构建
确认靶点序列后合成引物进行单靶点载体构建：将含有靶点序列的寡核苷酸链利用PCR仪直接退火后连接至酶切好的基因编辑载体pBUE411C；原理及构建方法参照中国农业大学陈其军老师发表的文章。(Xing et al BMC Plant Biol.2014Nov 29；14(1):327.)。
单靶点载体构建引物如下：
CAU0574-BsF：5’-GGCGGGTGACCTGGCGGCTGGTC-3’(SEQ ID NO:13)
CAU0574-BsR：5’-AAACGACCAGCCGCCAGGTCACC-3’(SEQ ID NO:14)
用该重组表达载体转化大肠杆菌，筛选阳性克隆，提取质粒后送测序公司测序，将测序结果与目标靶点进行比对分析，确保载体中含有完整且PAM位于3’端的靶点序列，表明pBUE411C中已导入正确的靶点序列，克隆构建即完成。
2.3在ND101中创制“早15”基因编辑材料
将重组基因编辑载体早15M导入农杆菌EHA105菌株，得到重组菌。然后通过农杆菌介导法，将重组菌导入玉米自交系ND101中，针对Bar抗性筛选得到T0代转基因苗，获得T0代转基因植株。
待遗传转化出苗后，取T0代转基因植株的幼苗叶片，提取基因组DNA。以基因组DNA为模板，进行筛选抗性基因Bar拷贝数的检测，筛选得到转基因阳性植株；然后选用靶点验证引物早15M-(-172)F&早15M-229R对目的基因序列进行基因编辑检测，进行PCR扩增。PCR产物直接送公司测序，测序引物为早15M-(-172)F，进一步分析基因编辑后的突变类型，筛选突变体株系。
针对它们的子代T1代植株进行Bar基因拷贝数和基因编辑类型的检测，在T1进行单株表型筛选，选取具有表型的株系(早15M-1、早15M-2和早15M-3)在T2进行田间测试。
实施例3.本发明过表达转基因玉米与基因编辑材料的花期分析
3.1过表达转基因玉米的生育期分析
过表达转基因玉米自交系试验使用的材料为pBCXUN-“早15”株系早15-1、早15-2和早15-3，同时以ND101作为对照植株。过表达转基因玉米杂交种试验使用的试验材料是将pBCXUN-“早15”株系3个T3代纯合转基因株系作为父本，与T13进行杂交，得到3个转基因纯合株系F1(即，F1-早15-1、F1-早15-2和F1-早15-3)，同时以ND101与T13进行杂交获得的F1-ND101作为对照植株。自交系与杂交种都进行了多年多点试验。分别于2015年1个试点(长日照条件：公主岭，每点2个重复)、2020年在2个试点(长日照条件：公主岭；短日照条件：开封夏播，每点3个重复)、2021年在2个试点(长日照条件：公主岭；短日照条件：开封夏播，每点3个重复)及2022年在1个试点(长日照条件：公主岭，每点3个重复)种植早15-1、早15-2、早15-3和WT(ND101)。分别于2015年在8个点(长日照条件：公主岭、上庄、包头、涿州、安阳春播、银川；短日照条件：安阳夏播、开封夏播，每点2个重复)、2021年在2个点(长日照条件：公主岭；短日照条件：开封夏播，每点1个重复)及2022年在1个试点(长日照条件：公主岭，每点2个重复)种植F1-早15-1、F1-早15-2、F1-早15-3和WT(F1-ND101)。在苗期至成熟期调查每个株系的田间性状，包括吐丝期、散粉期、成熟期、株高和穗位高。
图8示出了“早15”过表达转基因玉米自交系试验不同株系散粉天数与对照植株的比较结果。如图8所示，与对照植株ND101相比，在2015年3个自交系株系的散粉天数平均提前了6.68天，在2020年3个株系平均提前了5.61天，在2021年3个株系平均提前了6.42天，均达到了极显著水平。总体而言，3个“早15”过表达转基因玉米自交系早15-1、早15-2和早15-3在2015年、2020年和2021年的散粉天数均比对照组提前了，且自交系三年试验散粉天数平均提前6.24天，达到了极显著水平。
图9示出了“早15”过表达转基因玉米自交系试验不同株系吐丝天数与对照植株的比较结果。如图9所示，与对照植株ND101相比，在2015年3个自交系株系的抽丝天数平均提前了6.78天，在2020年3个株系平均提前了5.35天，在2021年3个株系平均提前了6.93天，均达到了极显著水平。总体而言，3个“早15”过表达转基因玉米自交系早15-1、早15-2和早15-3在2015年、2020年和2021年的抽丝天数均比对照组提前了，且自交系三年试验抽丝天数平均提前6.36天，达到了极显著水平。
图10示出了“早15”过表达转基因玉米自交系试验不同株系成熟期天数与对照植株的比较结果。如图10所示，3个“早15”过表达转基因玉米自交系早15-1、早15-2和早15-3在2022年的成熟期天数分别比对照组提前了9.23天、8.90天、8.90天，3个自交系成熟期天数平均提前9.0天，达到了极显著水平。
图11示出了“早15”过表达转基因玉米杂交种试验不同株系散粉天数与对照植株的比较结果。如图11所示，与对照植株F1-ND101相比，在2015年3个转基因玉米杂交种的散粉天数平均提前了7.98天，在2021年3个株系平均提前了6.5天，均达到了极显著水平。总体而言，3个“早15”过表达转基因玉米杂交种F1-早15-1、F1-早15-2和F1-早15-3在2015年和2021年的散粉天数均比对照组提前了，且杂交种两年试验散粉天数平均提前7.24天，达到了极显著水平。
图12示出了“早15”过表达转基因玉米杂交种试验不同株系吐丝天数与对照植株的比较结果。如图12所示，与对照植株F1-ND101相比，在2015年3个转基因玉米杂交种的抽丝天数平均提前了7.30天，在2021年3个株系平均提前了7.00天，均达到了极显著水平。总体而言，3个“早15”过表达转基因玉米杂交种F1-早15-1、F1-早15-2和F1-早15-3在2015年和2021年的抽丝天数均比对照组提前了，且杂交种两年试验抽丝天数平均提前7.15天，达到了极显著水平。
图13示出了“早15”过表达转基因玉米杂交种试验不同株系成熟期天数与对照植株的比较结果。如图13所示，3个“早15”过表达转基因玉米杂交种F1-早15-1、F1-早15-2和F1-早15-3在2022年的成熟期天数分别比对照组提前了8.23天、7.90天、7.90天，3个自交系成熟期天数平均提前8.0天，达到了极显著水平。
如图14所示，与对照植株F1-ND101相比，“早15”过表达转基因玉米杂交种籽粒的乳线已消失，杂交种对照植株籽粒的乳线才刚刚开始。
上述结果表明，在长日照和短日照条件下，“早15”过表达转基因玉米自交系与杂交种的花期、成熟期均显著且稳定地提前了(参见图14、图15、图16)。
3.2基因编辑材料的花期分析
基因编辑材料试验使用的材料为早15M株系早15M-1、早15M-2和早15M-3，同时以ND101作为对照植株。于2021年在2个试点(长日照条件：公主岭；短日照条件：开封夏播，，每点1个重复)种植早15M-1、早15M-2、早15M-3和WT(ND101)。在苗期至乳熟期调查每个株系的田间性状。
图17示出了“早15”基因编辑玉米自交系试验不同株系散粉天数与对照植株的比较结果。如图17所示，3个基因编辑株系早15M-1、早15M-2和早15M-3在2021年的散粉天数均比对照组延迟了。具体而言，与对照植株ND101相比，早15M-1延迟了0.75天，与对照植株ND101相比有差异。与对照植株ND101相比，早15M-2和早15M-3分别延迟了2.75天和4.75天，均达到了极显著水平。
图18示出了“早15”基因编辑玉米自交系试验不同株系吐丝天数与对照植株的比较结果。如图18所示，3个基因编辑株系早15M-1、早15M-2和早15M-3在2021年的抽丝天数均比对照组延迟了。具体而言，与对照植株ND101相比，早15M-1延迟了1.05天，与对照植株ND101相比有差异。与对照植株ND101相比，早15M-2和早15M-3分别延迟了3.55天和5.55天，均达到了极显著水平。
上述结果表明，在长日照和短日照条件下，“早15”基因编辑玉米自交系的花期均显著且稳定地延迟了(参见图17、图18)。
实施例4.本发明过表达转基因玉米的株高与穗位分析
图19示出了“早15”过表达转基因玉米自交系试验不同株系株高与对照植株的比较结果。如图19所示，与对照植株ND101相比，在2015年3个自交系株系的株高平均降低了41.26％，在2020年3个株系平均降低了39.17％，在2021年3个株系平均降低了34.81％，均达到了极显著水平。总体而言，3个“早15”过表达转基因玉米自交系早15-1、早15-2和早15-3在2015年、2020年和2021年的株高均比对照组降低了，且自交系三年试验株高平均降低了38.41％，达到了极显著水平。
图20示出了“早15”过表达转基因玉米自交系试验不同株系穗位与对照植株的比较结果。如图20所示，与对照植株ND101相比，在2015年3个自交系株系的穗位平均降低了69.74％，在2020年3个株系平均降低了55.55％，在2021年3个株系平均降低了49.43％，均达到了极显著水平。总体而言，3个“早15”过表达转基因玉米自交系早15-1、早15-2和早15-3在2015年、2020年和2021年的穗位均比对照组降低了，且自交系三年试验穗位平均降低了58.24％，达到了极显著水平。
图21示出了“早15”过表达转基因玉米杂交种试验不同株系株高与对照植株的比较结果。如图21所示，与对照植株F1-ND101相比，在2015年3个转基因玉米杂交种的株高平均降低了23.98％，在2021年3个株系平均降低了29.32％，均达到了极显著水平。总体而言，3个“早15”过表达转基因玉米杂交种F1-早15-1、F1-早15-2和F1-早15-3在2015年和2021年的株高均比对照组降低了，且杂交种两年试验株高平均降低了26.65％，达到了极显著水平。
图22示出了“早15”过表达转基因玉米杂交种试验不同株系穗位与对照植株的比较结果。如图22所示，与对照植株F1-ND101相比，在2015年3个转基因玉米杂交种的穗位平均降低了41.71％，在2021年3个株系平均降低了46.79％，均达到了极显著水平。总体而言，3个“早15”过表达转基因玉米杂交种F1-早15-1、F1-早15-2和F1-早15-3在2015年和2021年的穗位均比对照组降低了，且杂交种两年试验穗位平均降低了44.25％，达到了极显著水平。
上述结果表明，在长日照和短日照条件下，本发明“早15”过表达转基因玉米自交系、杂交种的株高与穗位均显著且稳定地降低了(参见图15、图16)。
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Claims (25)
1.一种分离的核酸分子，其特征在于，其包含选自以下的序列：
1)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；
2)与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％同一性的核苷酸序列，其编码的多肽具有调控植物生长发育的功能；
3)在严格条件下与SEQ ID NO:1所示序列杂交的核苷酸序列；
4)在SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列中通过取代和/或缺失和/或增加一个或多个核苷酸，表达相同或功能缺失、突变的蛋白质的核苷酸序列；
5)由SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列产生的不同转录本。
2.一种分离的核酸分子，其特征在于，其包含选自以下的序列：
1)编码SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的核苷酸序列；
2)编码与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％同一性的氨基酸序列的核苷酸序列，其编码的多肽具有调控植物生长发育的功能；
3)编码在SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列中通过取代和/或缺失和/或增加一个或多个氨基酸残基所得的氨基酸序列的核苷酸序列，其编码的多肽具有调控植物生长发育的功能。
3.一种分离的核酸分子，其特征在于，其包含选自以下的序列：
1)SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；
2)与SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％同一性的核苷酸序列，其编码的多肽具有调控植物生长发育的功能；
3)在严格条件下与SEQ ID NO:3所示序列杂交的核苷酸序列；
4)在SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列中通过取代和/或缺失和/或增加一个或多个核苷酸，表达相同或功能缺失、突变的蛋白质的核苷酸序列；
5)由SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列产生的不同转录本。
4.一种分离的多肽，其特征在于，其由权利要求1-3任一项所述的核酸分子转录和/或表达得到。
5.一种分离的多肽，其特征在于，包含选自如下所述的氨基酸序列：
1)SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；
2)与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％同一性的氨基酸序列，所述多肽具有调控植物生长发育的功能；
3)在SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列中通过取代和/或缺失和/或增加一个或多个氨基酸残基所得的氨基酸序列，所述多肽具有调控植物生长发育的功能。
6.一种重组载体，其特征在于，包含权利要求1-3任一项所述的核酸分子。
7.一种宿主细胞，其特征在于，包含权利要求1-3任一项所述的核酸分子，或包含权利要求4或5所述的多肽或包含权利要求6所述的重组载体。
8.一种转基因植物，其特征在于，包含权利要求1-3任一项所述的核酸分子，或包含权利要求6所述的重组载体。
9.根据权利要求8所述的转基因植物，其中，所述转基因植物是单子叶植物或双子叶植物，优选作物植物。
10.根据权利要求8或9所述的转基因植物，其中，所述转基因植物选自玉米、高粱、大豆、小麦、水稻、棉花、芸苔、甘蓝、油菜、芥菜、大麦、黑麦、燕麦、小米、粟、番茄、向日葵、马铃薯、花生、甘薯、木薯、甜菜、甘蔗、烟草或拟南芥中的一种或多种；优选拟南芥和玉米。
11.权利要求1-3任一项所述的分离的核酸分子或权利要求4或5所述的分离的多肽或权利要求6所述的重组载体在调控植物生长发育中的应用。
12.权利要求1-3任一项所述的分离的核酸分子或权利要求4或5所述的分离的多肽或权利要求6所述的重组载体在调控植物早熟和矮杆中的应用。
13.根据权利要求12所述的应用，其包括如下步骤：
1)将权利要求1-3任一项所述的核酸分子，或权利要求6所述的重组载体引入目的植物，获得过表达转基因植物；和
2)培养所述植物，使得所述过表达转基因植物与对照植物相比，具有早熟和矮秆的性能。
14.权利要求1-3任一项所述的分离的核酸分子或权利要求4或5所述的分离的多肽或权利要求6所述的重组载体在调控植物晚熟中的应用。
15.根据权利要求14所述的应用，其包括如下步骤：
1)破坏植物中的“早15”基因或与其他植物中的“早15”基因同源的基因，获得转基因植物；和
2)培养所述植物，使得所述转基因植物与对照植物相比，具有晚熟的性能。
16.根据权利要求15所述的应用，其中所述破坏是通过敲除或敲低“早15”基因实现的。
17.根据权利要求15所述的应用，其中所述破坏通过CRISPR/Cas、TALEN、ZFN的基因组编辑系统或其他基因编辑系统来实现。
18.权利要求1-3任一项所述的分离的核酸分子或权利要求4或5所述的分离的多肽或权利要求6所述的重组载体在选育性状改变的植物中的应用。
19.根据权利要求11-18任一项所述的应用，其中所述植物为单子叶植物或双子叶植物，优选作物植物。
20.根据权利要求19所述的应用，其中，所述植物选自玉米、高粱、大豆、小麦、水稻、棉花、芸苔、甘蓝、油菜、芥菜、大麦、黑麦、燕麦、小米、粟、番茄、向日葵、马铃薯、花生、甘薯、木薯、甜菜、甘蔗、烟草或拟南芥中的一种或多种；优选拟南芥和玉米。
21.一种调控植物生长发育的方法，其包括：
1)将权利要求1-3任一项所述的分离的核酸分子，或权利要求6所述的重组载体引入目的植物，获得转基因植物；和
2)培养所述植物，其中与对照植物相比，所述转基因植物具有早熟和矮秆的性能。
22.一种调控植物生长发育的方法，其包括：
1)破坏植物中的“早15”基因或与其他植物中的“早15”基因同源的基因，获得转基因植物；和
2)培养所述植物，其中与对照植物相比，所述转基因植物具有晚熟的性能。
23.一种生产转基因植物的方法，所述转基因植物包含引入的权利要求1-3任一项所述的分离的核酸分子、或根据权利要求6所述的重组载体，或者其重组表达根据权利要求4或5所述的分离的多肽，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
1)获得所述转基因植物的种子；
2)种植所述种子，获得性状可稳定遗传的所述转基因植物。
24.一种生产转基因植物的方法，所述转基因植物包含破坏植物中的“早15”基因或与其他植物中的“早15”基因同源的基因，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
1)获得所述转基因植物的种子；
2)种植所述种子，获得性状可稳定遗传的所述转基因植物。
25.根据权利要求21-24任一项所述的方法，其中，所述植物选自玉米、高粱、大豆、小麦、水稻、棉花、芸苔、甘蓝、油菜、芥菜、大麦、黑麦、燕麦、小米、粟、番茄、向日葵、马铃薯、花生、甘薯、木薯、甜菜、甘蔗、烟草或拟南芥中的一种或多种；优选拟南芥和玉米。
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