CN114466867A - 用于抑制α-突触核蛋白表达的锌指蛋白转录因子 - Google Patents

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Abstract

本公开提供了抑制神经系统中α‑突触核蛋白表达的锌指融合蛋白，及使用该蛋白质来治疗帕金森病(Parkinson’s disease)、路易体痴呆(Lewy bodydementia)、多系统萎缩、阿尔兹海默症(Alzheimer’s disease)及其他神经退行性疾病的方法。

Description

用于抑制α-突触核蛋白表达的锌指蛋白转录因子
相关申请的交叉引用
本申请要求2019年10月2日提交的美国临时申请62/909,496及2020年1月9日提交的美国临时申请62/959,153的优先权。前述临时申请的内容通过引用整体并入本文。
序列表
本申请包含已以ASCII格式电子提交的序列表并通过引用整体并入本文。所述ASCII副本创建于2020年10月1日，命名为025297_WO011_SL.txt且大小为121,468字节。
背景技术
帕金森病(PD)是特征为运动缺陷的神经退行性病症。约50％的PD患者最终发展为痴呆。PD是仅次于阿尔兹海默症的第二普遍的神经退行性疾病。在美国，存在约一百万的PD患者且每年有50,000至60,000的新增病例。PD的偶发形式具有60至70岁的典型发病年龄。自最初诊断至PD并发症死亡的时间跨度一般为15至20年。
PD患者展现一系列运动症状，例如运动迟缓、僵硬、驼背姿势、隐藏面部表情、躯干前倾、手臂摆动减少；肘部、手腕、臀部和膝盖弯曲、姿势不稳、静止时四肢震颤及拖步、短步的步态。患者通常也具有非运动症状，包括嗅觉丧失、睡眠障碍、肠动力降低、神经性疼痛及痴呆。参见，例如，Jeanjean和Aubert，Lancet(2011)378(9805):1773-4；Kalia和Lang，Lancet(2015)386(9996):896-912。
PD患者脑的特征在于被称为黑质(substantia nigra)的区域中产多巴胺(多巴胺能)神经元的损失。PD患者脑的特征也在于路易体(Lewy bodies)和路易神经突(Lewyneurites)的存在，路易体为神经元内部形成的蛋白质聚集体或团块，路易神经突为含有类似于路易体的蛋白质聚集体的神经突(神经元的突起)。路易体首先在1912年由FriedrichLewy在PD患者的脑中发现并且随后被发现含有聚集的和不可溶形式的α-突触核蛋白的原纤维(Goedert和Spillantini，Mol Psychiatry.(1998)3(6):462-5；Spillantini等人，Neurosci Lett.(1998)251(3):205-8；Spillantini等人，Nature(1997)388(6645):839-40)。α-突触核蛋白基因(SNCA)中的突变于1997年在患有PD家族中得以鉴别(参见，例如，Polymeropoulos等人，Science(1997)276(5321):2045-7)。随后，SNCA基因的复制和三倍复制以及α-突触核蛋白的额外点突变被证明与PD的遗传或家族形式相关。此外，在大型无偏见人群研究(全基因组关联研究，GWAS)中，控制α-突触核蛋白表达水平的基因组部分的变化已被证明与PD风险增加有关。
α-突触核蛋白是参与神经元突触前末端的囊泡释放的膜结合蛋白。其也可能在DNA修复中发挥作用。成熟的α-突触核蛋白是14-kD的小蛋白质，其具有称为NAC(阿尔茨海默症淀粉样蛋白的非A-β组分)区的含有疏水氨基酸的中心核心区域(残基61-95)。NAC有助于蛋白质聚集。错误折叠的α-突触核蛋白多肽聚集成寡聚体和原纤维，然后聚集以形成路易体中存在的大的不溶性聚集体。越来越多的证据表明，α-突触核蛋白错误折叠和聚集在PD中发生的细胞损伤中起核心作用，并最终导致黑质中的神经元死亡。此外，已显示较小的α-突触核蛋白聚集体从细胞间移动并扩散到整个脑，其与在朊病毒疾病中看到的情况类似。抑制α-突触核蛋白聚集可以减少对神经元的损伤，减缓甚至阻止PD的进展。
目前降低α-突触核蛋白水平的方法包括使用在RNA水平上靶向α-突触核蛋白的反义寡核苷酸(ASO)以及靶向细胞外的α-突触核蛋白的特定3D形状或构象的单克隆抗体(mAb)。然而，仍然迫切需要通过靶向α-突触核蛋白来治疗PD的临床有效方法。
发明概述
本发明提供靶向人SNCA基因中或附近的位点的锌指蛋白(ZFP)结构域。本发明的ZFP结构域可融合至转录因子以在DNA水平上特异性抑制人SNCA基因的表达。这些融合蛋白含有(i)特异性结合SNCA基因中的靶区域的ZFP结构域及(ii)减少基因转录的转录抑制结构域。
在一方面，本发明提供了包含锌指蛋白(ZFP)结构域和转录抑制结构域的融合蛋白，其中ZFP结构域结合至人α-突触核蛋白基因(SNCA基因)中的靶区域。在一些实施方案中，靶区域(即靶位点)在SNCA基因中的转录起始位点(TSS，例如TSS 1、2a或2b)的约1kb之内。在进一步的实施方案中，靶区域在SNCA基因的TSS 2a上游的约500bp之内、TSS 2b下游的约500bp之内、和/或TSS 1上游或下游的约500bp之内，如图2B和/或图4中所示。靶区域的非限制性实例示于表1中。
在一些实施方案中，融合蛋白包含一个或多个(例如两个、三个、四个、五个或六个)锌指。其可以将SNCA基因的表达抑制至少约40％、75％、90％、95％或99％，优选地没有或具有最低的可检测脱靶结合或活性(例如结合不是SNCA基因的基因)。锌指结构域的非限制性实例示于表1中。在一些实施方案中，融合蛋白包含表1所示的一种或多种识别螺旋序列。在进一步的实施方案中，融合蛋白包含来自该表格的单行、具有或不具有所指示的骨架突变的部分或全部识别螺旋序列。在某些实施方案中，融合蛋白包含表2所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，融合蛋白的转录抑制结构域来自KOX1蛋白的KRAB结构域。锌指结构域可以通过肽连头连接至转录抑制结构域。在另一方面，本发明提供了包含本发明融合蛋白的编码序列的核酸构建体，其中该编码序列可操作地连接至转录调节元件，转录调节元件例如为在脑细胞中组成型活性或诱导型的哺乳动物启动子，且其中该启动子任选地为人突触蛋白I启动子。本发明还提供了包含核酸构建体的宿主细胞。宿主细胞可以是例如脑细胞或多能干细胞的人细胞，其中该干细胞任选地为胚胎干细胞或诱导性多能干细胞(iPSC)。
在另一方面，本发明提供了抑制人脑细胞中α-突触核蛋白的表达的方法，包括将本发明的融合蛋白引入细胞中(例如通过引入核酸构建体或重组病毒，例如AAV(例如AAV2、AAV6、AAV9或其杂交体))，从而抑制细胞中α-突触核蛋白的表达。脑细胞可以是神经元、神经胶质细胞、室管膜细胞或神经上皮细胞。该细胞可以存在于患有帕金森病、路易体痴呆、阿尔茨海默症、多系统萎缩或其他突触核蛋白病(synucleinopathy)或有发展出这些疾病的风险的患者的脑中。
本发明也提供了治疗患者的突触核蛋白病变(例如减慢其进展)的方法，包括向患者施用编码本发明的融合蛋白的重组AAV。在一些实施方案中，AAV通过静脉内、鞘内、脑室内、小脑延髓池内(intra-cisternal magna)、纹状体内或黑质内注射或注射入任何脑区中而引入患者。患者可以患有帕金森病、路易体痴呆、阿尔兹海默症或多系统萎缩。
本发明也提供了用于以上方法的融合蛋白及本发明的融合蛋白在制备用于以上方法中的药物中的用途。
本发明的其他特征、目标及优点在随后的详细描述中显而易见。然而，应当理解，详细描述仅以说明而非限制的方式给出以指示本发明的实施方案及方面。本发明范围内的各种改变和修改将从详细描述中对本领域技术人员显而易见。
附图说明
图1说明了识别SNCA基因中的18个碱基对的工程改造的6指锌指蛋白转录因子(ZFP-TF)对SNCA基因的特异性靶向。ZFP-TF与该基因的结合导致减少的SNCA转录，进而导致减少的SNCA mRNA和α-突触核蛋白水平。该图公开了SEQ ID NO:20。
图2A是说明了人SNCA基因的基因组结构的图。该基因具有7个外显子(2个非蛋白编码和5个蛋白编码)，且每个转录本含有5个内含子。存在三个称为TSS 1、TSS 2a和TSS 2b的转录起始位点(TSS)，其分别产生以非编码外显子1、2a和2b开始的转录本。所有转录本中的第一蛋白编码外显子为外显子3。
图2B是说明了人SNCA基因的上游基因组区域的图。SNCA mRNA序列显示为红色条。该基因下方簇中的小三角形描绘了SNCA基因中被本文所例示的416个代表性ZFP-TF所靶向的区域。该图也显示了每种ZFP-TF对减少用ZFP-TF mRNA转染后24小时收获的SK-N-MC人神经母细胞瘤细胞中人SNCA mRNA表达的影响。通过RT-qPCR测量信使RNA含量。归一化的SNCA表达水平由梯度条“SNCA mRNA”指示。最深(红色)颜色表示减少100％。最浅颜色(白色)表示减少0％。将RT-qPCR数据相对于两个管家基因(ATP5B和EIF4A2)mRNA水平的平均值进行归一化。指向右侧的三角形指示ZFP-TF结合该基因的正义链。指向左侧的三角形指示ZFP-TF结合该基因的反义链。
图3A至3E是显示了来自如本文所述的416个ZFP-TF文库的筛选结果的图。筛选在SK-N-MC人神经上皮细胞系中进行。各图中的y轴是相对于两个管家基因(EIF4A2和ATP5B)的几何平均值归一化且在用编码不同ZF P-TF的RNA转染后24小时评估的α-突触核蛋白mRNA表达。RNA剂量自左至右增加(3、10、30、100、300和1,000ng)。条线代表四次技术重复的平均值且误差棒代表标准偏差。图下方的数字为ZFP-TF的内部参考编号。
图4是说明了人SNCA基因的上游基因组区域的图。SNCA mRNA序列显示为红色条。该基因下方簇中的小三角形描绘了SNCA基因中被50个具有1、2或3个磷酸盐接触突变的代表性ZFP-TF靶向的区域。该图也显示了每种ZFP-TF对减少用ZFP-TF mRNA转染后24小时收获的SK-N-MC人神经母细胞瘤细胞中人SNCA mRNA表达的影响。通过RT-qPCR测量信使RNA含量。归一化SNCA表达水平由梯度条“SNCA mRNA”指示。最深(红色)颜色表示减少100％。最浅颜色(白色)表示减少0％。将RT-qPCR数据相对于两个管家基因(ATP5B和EIF4A2)的mRNA水平的平均值进行归一化。指向右侧的三角形指示ZFP-TF结合该基因的正义链。指向左侧的三角形指示ZFP-TF结合该基因的反义链。
图5显示了来自50个具有1、2或3个磷酸盐接触突变的代表性ZFP-TF的文库的说明性筛选结果。筛选在SK-N-MC人神经上皮细胞系中进行。各图中的y轴是相对于两个管家基因(EIF4A2和ATP5B)的几何平均值归一化且在用编码不同ZFP-TF的RNA转染后24小时评估的α-突触核蛋白mR NA表达。RNA剂量自左至右增加(3、10、30、100、300和1,000ng)。条线代表四次技术重复的平均值且误差棒代表标准偏差。图下方的数字为ZFP-TF的内部参考编号。
图6A和6B是显示了在SK-N-MC人神经母细胞瘤细胞和人iPSC衍生的神经元中展现出一系列α-突触核蛋白抑制活性的40种α-突触核蛋白ZFP-TF的一系列图。描述于表1和2中的二十个说明性ZFP-TF显示于图6A中。在图3A至3E中表征但未在表1和2中描述的说明性ZFP-TF显示于图6B中。y轴是相对于两个管家基因(ATP5B和EIF4A2)的几何平均值归一化且在用编码不同ZFP-TF的RNA转染SK-N-MC细胞后24小时或在用编码不同ZFP-TF的AAV6转导iPSC衍生的神经元后28天评估的α-突触核蛋白mRNA表达。在x轴指示所使用的RNA或AAV6的量，其中RNA(3、10、30、100、300及1,000ng)或AAV6(1E3、3E3、1E4、3E4、1E5及3E5)剂量自左至右增加。蓝色和橙色条线代表四次技术重复的平均值且误差棒代表标准偏差。滴定标度的放大版本显示于图底部。
图7A至7D是描绘了40种α-突触核蛋白ZFP-TF在小鼠原代神经元(A和B)和人iPSC衍生的神经元(C和D)中的脱靶活性的一系列火山图。为便于参考，将说明了ZFP-TF在人iPSC衍生的神经元中的抑制活性的图6A-6B的条形图显示于相应ZFP-TF的火山图附近。火山图概述了显示转导后7天小鼠原代神经元(A和B)或转导后19天人iPSC衍生的神经元(C和D)的转录组变化的微阵列数据。在火山图中，以红色和绿色显示的数字分别指示下调和上调的脱靶基因计数。黄色圆圈指示人α-突触核蛋白。绿色圆圈(各火山图的右侧)代表显著上调>2倍的基因。红色圆圈代表显著下调>2倍的基因。
图8A和8B是显示了雌性PAC突触核蛋白小鼠的不同脑区中的(A)ZFP-TF和α-突触核蛋白mRNA表达水平或(B)神经胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)、离子化钙结合衔接分子1(IBA1)和NeuN的mRNA表达水平(Kuo等人，Hum Mol Genet.(2010)19(9):1633-50)的一系列图。在纹状体的两个位点对动物双侧施用编码所指示测试制品的AAV9或载剂。将所有基因表达数据相对于3个管家基因(ATP5B、EIF4A2和GAPDH)的几何平均值进行归一化。y轴为所指示基因的mRNA表达水平且x轴为脑区。红色正方形指示施用ZFP-TF82195的n＝3只动物的平均表达数据，且绿色三角形指示施用ZFP-TF 82264的n＝3只动物的平均表达数据。在图8A中，将α-突触核蛋白mRNA表达相对于3只经载剂处理的动物的平均值进行归一化，且ZFP-TF的表达以对数(log)标度作为每ng输入RNA的拷贝数提供。在图8B中，将所有表达水平相对于3只经载剂处理的动物的平均值进行归一化。使用单向方差分析(ANOVA)后接邓尼特多重比较检验(Dunnett’s multiple comparisons test)进行统计分析。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，***p<0.0001。
发明详述
本发明提供了靶向人SNCA基因中或附近的位点(即，序列)的ZFP结构域。如本文所述的ZFP结构域可连接或融合至另一功能分子或结构域。本发明的ZFP结构域可融合至转录因子以抑制人SNCA基因转录成RNA。融合蛋白称为锌指蛋白转录因子(ZFP-TF)。这些ZFP-TF包含特异性结合至SNCA基因中或附近的靶区域的锌指蛋白(ZFP)结构域和减少该基因的转录的转录抑制结构域。预期通过将ZFP-TF引入患者脑中来降低神经元中α-突触核蛋白水平以抑制(例如减少或停止)α-突触核蛋白组装为寡聚体(较小可溶性聚集体)或纤维(较大不溶性聚集体)形式。随着α-突触核蛋白聚集的减少，脑细胞将具有利用其细胞质量控制机制及时清除α-突触核蛋白的错误折叠和毒性形式的能力。结果，将减少或防止α-突触核蛋白的聚集和细胞间增殖。
本发明的抑制α-突触核蛋白的ZFP-TF方法相较于由其他人进行测试的当前方法具有多个优点。与已报道的反义寡核苷酸(ASO)方法相比，ZFP-TF可以实现更高水平的α-突触核蛋白抑制(参见，例如，Luna等人，Acta Neuropathol.(2018)135(6):855-75，其显示ASO对SNCA的抑制不超过75％)。此外，ZFP-TF可以仅需要施用一次(通过向患者引入ZFP-TF表达构建体)，而ASO需要重复给药。另外，ZFP-TF方法仅需要在各细胞的基因组中接合SNCA基因的两个等位基因。相比之下，ASO需要在各细胞中接合SNCA mRNA的多个拷贝。
本发明的ZFP-TF方法优于抗体方法，因为抗体仅可结合α-突触核蛋白形状或构型的亚组。这可能不足以实现稳健治疗效果。相比之下，ZFP-TF在DNA水平抑制α-突触核蛋白表达且导致所有形式的α-突触核蛋白的水平降低。因此不同于抗体，ZFP-TF与毒性物质的形式无关。另外，抗体被认为主要作用于细胞上或细胞外的α-突触核蛋白，而ZFP-TF可直接或间接降低细胞内部的α-突触核蛋白，使其低于细胞外α-突触核蛋白水平。因此，鉴于α-突触核蛋白主要为细胞内蛋白，预期ZFP-TF方法会更有效。此外，抗体需要重复施用，而ZFP-TF仅需要其表达构建体的一次递送。
I.ZFP结构域的靶标
本发明融合蛋白的ZFP结构域特异性结合至人SNCA基因中或附近的靶区域。图1说明了ZFP结构域与靶SNCA基因序列的结合。该图中的ZFP结构域具有六个锌指；然而，如下文进一步描述的，也可以使用具有更少或更多个锌指的ZFP结构域。
人SNCA基因跨越约117kb且已被定位至chr4:89,724,099-89,838,315(GRCh38/hg38)。其核苷酸序列可在GenBank登录号NC_000004版本000004.12获得。该基因具有7个外显子(2个非蛋白编码，和5个蛋白编码)，且各转录本具有5个内含子(图2A)。该基因有三个转录起始位点(TSS)：一个在外显子1的开始处，且两个在外显子2中，从而导致外显子2a和2b的表达。第一蛋白编码外显子为外显子3。也可以参见Touchman等人，Genome Res.(2001)11:78-86。人α-突触核蛋白的同种型1(全长)如下所示：
Figure BDA0003579440330000081
同种型2至4与同种型1的不同之处在于氨基酸残基103至130的缺失。同种型2至5与同种型1的不同之处在于氨基酸残基41至54的缺失。α-突触核蛋白的遗传分析指出基因拷贝扩增(参见，例如，Brueggemann等人，Neurology(2008)71:1294；Troiano等人，Neurology(2008)71:1295；Uchiyama等人，Neurology(2008)71:1289-90)和某些点突变是例如PD和路易体痴呆的突触核蛋白病变的潜在原因。例如，在一些PD患者中已鉴别出以下α-突触核蛋白点突变：A30P(Kruger等人，Nature Genet.(1998)18:106-8)；E46K(Zarranz等人，Ann Neurol.(2004)55:164-73；Choi等人，FEBS Lett.(2004)576:363-8)；H50Q(Khalaf等人，J Biol Chem.(2014)289:21856-76)；G51D(Lesage等人，Ann Neurol.(2013)73:459-71)；和A53T(Polymeropoulos等人，Science(1997)276:2045-7)。
ZFP-TF的DNA结合ZFP结构域将融合蛋白引导至SNCA基因的靶区域并将融合蛋白的转录抑制结构域引导至靶区域。抑制结构域随后通过RNA聚合酶抑制SNCA基因的转录。ZFP-TF的靶区域可以是SNCA基因中或附近的允许抑制基因表达的任何合适位点。举例而言，靶区域包括或邻近于(在其下游或上游)SNCA TSS或SNCA转录调节元件(例如启动子、增强子、RNA聚合酶终止位点等)。
如上所述，人SNCA基因具有三个转录起始位点(TSS)。其自5’至3’为TSS 1、TSS 2a和TSS 2b，它们位于外显子1(TSS 1)、外显子2a和外显子2b(TSS 2a和2b)的5’端(图2B)。在三个TSS处的转录得到具有不同长度的RNA同种型。然而，由于α-突触核蛋白的翻译始于外显子3，因此从不同TSS产生的RNA导致相同蛋白质的形成。在一些实施方案中，本发明ZFP-TF的基因组靶区域跨越TSS 1(例如碱基对529至1529)或TSS 2a和2b(例如碱基对1613至2949)或在其附近。在某些实施方案中，靶区域在TSS 1上游或下游约500碱基对之内，和/或在TSS 2a上游或下游约500碱基对之内和/或在TSS 2b上游或下游约500碱基对之内。
在一些实施方案中，基因组靶区域长度为至少8碱基对。例如，靶区域长度可为8碱基对至40碱基对，如长度为12、15、18、21、24、27、30、33或36碱基对。被靶向的序列可在基因的正义链或基因的反义链上。为确保靶向的准确性并减少ZFP-TF的脱靶结合或活性，所选SNCA靶区域的序列优选与其他基因中的序列具有小于75％的同源性(例如小于70％、小于65％、小于60％或小于50％)。在某些实施方案中，本发明ZFP-TF的靶区域长度为15至18碱基对且位于TSS 1、2a或2b的500碱基对之内。靶区域的实例显示于图2B和表1中。
在一些实施方案中，本发明工程改造的ZFP结合至如表1单行中所显示的靶位点(即，结合序列)，优选没有或几乎没有可检测的脱靶结合或活性。
用于进一步评估靶片段的其他标准包括ZFP结合至该片段或相关片段的先前可得性、设计新颖ZFP以结合所给定的靶片段的容易度及脱靶结合风险。
II.ZFP结构域
“锌指蛋白”或“ZFP”是指具有由锌稳定的DNA结合结构域的蛋白质。ZFP以序列特异性方式结合至DNA。ZFP的单个DNA结合单元称为锌“指”。每个指含有DNA结合“识别螺旋”，其通常由七个氨基酸残基构成且决定DNA结合特异性。ZFP结构域具有至少一个指，每个指结合DNA的两个至四个碱基对，通常DNA的三个或四个碱基对。每个锌指通常包含约30个氨基酸和螯合锌。与天然存在的ZFP相比，工程改造的ZFP可具有新颖结合特异性。工程改造方法包括但不限于合理设计和各种选择。合理设计包括例如使用包含三联体(或四联体)核苷酸序列和单独锌指氨基酸序列的数据库，其中每个三联体或四联体核苷酸序列与结合特定三联体或四联体序列的锌指的一或多个氨基酸序列相关联。参见，例如，详细描述于美国专利5,789,538；5,925,523；6,007,988；6,013,453；6,140,081；6,200,759；6,453,242；6,534,261；6,979,539；和8,586,526；及国际专利公开案WO 95/19431；WO 96/06166；WO 98/53057；WO 98/53058；WO 98/53059；WO 98/53060；WO 98/54311；WO 00/27878；WO 01/60970；WO 01/88197；WO 02/016536；WO 02/099084；和WO 03/016496中的ZFP设计方法。如本文所述的ZFP结构域可连接或融合至另一分子例如蛋白质。此种ZFP融合可包含能够实现基因活化(例如活化结构域)、基因抑制(例如抑制结构域)、配体结合(例如配体结合结构域)、高通量筛选(例如配体结合结构域)、局部化超突变(例如活化诱导的胞苷脱氨酶结构域)、染色质修饰(例如，组蛋白脱乙酰酶结构域)、重组(例如重组酶结构域)、靶向整合(例如整合酶结构域)、DNA修饰(例如DNA甲基转移酶结构域)、碱基编辑(例如碱基编辑结构域)或靶向DNA裂解(例如核酸酶结构域)的结构域。工程改造的ZFP结构域的实例显示于表1中。
本发明工程改造的ZFP融合蛋白的ZFP结构域可包括至少一个(例如，一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个、十二个、十三个或更多个)锌指。具有一个指的ZFP结构域通常识别包括3或4个核苷酸的靶位点。具有两个指的ZFP结构域通常识别包括6或8个核苷酸的靶位点。具有三个指的ZFP结构域通常识别包括9或12个核苷酸的靶位点。具有四个指的ZFP结构域通常识别包括12至15个核苷酸的靶位点。具有五个指的ZFP结构域通常识别包括15至18个核苷酸的靶位点。具有六个指的ZFP结构域可识别包括18至21个核苷酸的靶位点。
在一些实施方案中，本发明工程改造的ZFP包含显示于表1中的DNA结合识别螺旋序列。例如，工程改造的ZFP可包含如表1中所显示的F1、F2、F3、F4、F5或F6的序列。
在一些实施方案中，本发明工程改造的ZFP包含表1单行中所显示的两个相邻DNA结合识别螺旋序列。例如，工程改造的ZFP可包含如表1单行中所显示的F1-F2、F2-F3、F3-F4、F4-F5或F5-F6的序列。
在一些实施方案中，本发明工程改造的ZFP包含表1单行中所显示的DNA结合识别螺旋序列。例如，工程改造的ZFP可包含如表1单行中所显示的F1、F2、F3、F4、F5和F6(例如F1至F6)的序列。
ZFP结构域的靶特异性可通过例如在美国专利公开案2018/0087072中所述的对ZFP骨架序列进行突变加以改良。突变包括那些对ZFP骨架中残基进行的突变，所述残基可与DNA骨架上的磷酸酯非特异性相互作用但不参与核苷酸靶特异性。在一些实施方案中，突变包含将阳离子氨基酸残基突变成中性或阴离子氨基酸残基。在一些实施方案中，突变包含将极性氨基酸残基突变成中性或非极性氨基酸残基。在其他实施方案中，在相对于DNA结合螺旋的位置(-5)、(-9)和/或(-14)处进行突变。在一些实施方案中，锌指可包含在位置(-5)、(-9)及/或(-14)处的一个或多个突变。在其他实施方案中，多指ZFP结构域中的一个或多个锌指可包含在位置(-5)、(-9)和/或(-14)处的突变。在一些实施方案中，在位置(-5)、(-9)及/或(-14)处的氨基酸(例如，精氨酸(R)或赖氨酸(K))经突变为丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、丝氨酸(S)、天冬氨酸(N)、谷氨酸(E)、酪氨酸(Y)和/或谷氨酰胺(Q)。具有1、2或3个骨架突变的工程改造的ZFP的实例显示于图4和5及表1和2中。表1中的符号「^」指示在所指示识别螺旋中第1个氨基酸上游第4位的精氨酸(R)残基变成谷氨酰胺(Q)。在各识别螺旋序列中，将七个DNA结合氨基酸的位置编号为-1、+1、+2、+3、+4、+5和+6。因此，将R-取代为-Q的位置编号为(-5)。
在一些实施方案中，本发明工程改造的ZFP包含如表1中所显示的DNA结合识别螺旋序列和相关骨架突变。在一些实施方案中，本发明工程改造的ZFP包含表1单行中所显示的DNA结合识别螺旋序列和相关骨架突变。
在一些实施方案中，本文所述的工程改造的ZFP包含表2单行中所显示的序列的识别螺旋和骨架部分。在一些实施方案中，本文所述的工程改造的ZFP包含表2单行中所显示的序列的识别螺旋和骨架部分，因为该序列将在翻译后修饰后出现。例如，翻译后修饰可从如表2中所显示的序列除去引发剂甲硫氨酸残基。
在一些实施方案中，本发明的ZFP-TF包含一个或多个锌指结构域。这些结构域可经由可延伸的柔性接头连接在一起，使得例如一个结构域包含一个或多个(例如，4个、5个或6个)锌指，而另一结构域包含另外一个或多个(例如，4个、5个或6个)锌指。在一些实施方案中，接头为标准指间接头，使得接头阵列包含一个包含8个、9个、10个、11个或12个或更多个指的DNA结合结构域。在其他实施方案中，接头为诸如柔性接头的非典型接头。例如，两个ZFP结构域可以以下列构型(自N端至C端)连接至转录抑制物TF：ZFP-ZFP-TF、TF-ZFP-ZFP、ZFP-TF-ZFP或ZFP-TF-ZFP-TF(两个ZFP-TF融合蛋白经由接头融合在一起)。
在一些实施方案中，ZFP-TF为“双手型”，即其含有由介入氨基酸分开的两个锌指簇(两个ZFP结构域)使得两个ZFP结构域结合至两个不连续靶位点。双手型锌指结合蛋白的实例为SIP1，其中四个锌指簇位于蛋白质的氨基端且三个指簇位于羧基端(参见Remacle等人，EMBO J.(1999)18(18):5073-84)。这些蛋白质中的各锌指簇能够结合至独特靶序列且两个靶序列之间的间距可包含许多核苷酸。
或者，DNA结合结构域可衍生自核酸酶。例如，已知归巢核酸内切酶和大范围核酸酶，如I-SceI、I-CeuI、PI-PspI、PI-Sce、I-SceIV、I-CsmI、I-PanI、I-SceII、I-PpoI、I-SceIII、I-CreI、I-TevI、I-TevII及I-TevIII的识别序列。也可以参见美国专利5,420,032和6,833,252；Belfort等人，Nucleic Acids Res.(1997)25:3379-88；Dujon等人，Gene(1989)82:115-8；Perler等人，Nucleic Acids Res.(1994)22:1125-7；Jasin，TrendsGenet.(1996)12:224-8；Gimble等人，J Mol Biol.(1996)263:163-80；Argast等人，J MolBiol.(1998)280:345-53；和the New England Biolabs catalogue。此外，归巢核酸内切酶和大范围核酸酶的DNA结合特异性可经工程改造以结合非天然靶位点。参见，例如，Chevalier等人，Mol Cell(2002)10:895-905；Epinat等人，Nucleic Acids Res.(2003)31:2952-62；Ashworth等人，Nature(2006)441:656-59；Paques等人，Current Gene Therapy(2007)7:49-66；和美国专利公开案2007/0117128。
III.锌指蛋白转录因子
本文所述的ZFP结构域可融合至转录因子。在一些实施方案中，本发明融合蛋白含有DNA结合锌指蛋白(ZFP)结构域和转录因子结构域(即ZFP-TF)。在一些实施方案中，转录因子可以是转录抑制结构域，其中ZFP和抑制结构域可通过直接的肽键或肽接头或通过二聚化(例如，通过亮氨酸拉链、STAT蛋白N端结构域或FK506结合蛋白)彼此缔合。如本文所用，“融合蛋白”是指具有经共价连接的结构域的多肽以及经由非共价键彼此缔合的多肽的复合物。转录抑制结构域可在任何合适位置(包括ZFP结构域的C端或N端)与ZFP结构域缔合。
在一些实施方案中，本发明的ZFP-TF以小于约25nM的KD结合其靶标且使人SNCA基因的转录抑制20％或更多(例如30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％或更多)。在一些实施方案中，在患者中同时使用两种或更多种本发明的ZFP-TF，其中ZFP-TF结合至SNCA基因中的不同靶区域，以便实现SNCA表达的最佳抑制。
A.转录抑制结构域
本发明的ZFP-TF包含如本文所述的工程改造的ZFP结构域和削弱SNCA基因的转录活性的一个或多个转录抑制结构域。一个或多个工程改造的ZFP结构域和一个或多个转录抑制结构域可通过柔性接头接合。转录抑制结构域的非限制性实例为KOX1、KAP-1、MAD、FKHR、EGR-1、ERD、SID、TGF-β诱导型早期基因(TIEG)、v-ERB-A、MBD2、MBD3、TRa、组蛋白甲基转移酶、组蛋白脱乙酰酶(HDAC)、核激素受体(例如，雌激素受体或甲状腺激素受体)、DNMT家族成员(例如DNMT1、DNMT3A、DNMT3B)、Rb和MeCP2的KRAB结构域。参见，例如，Bird等人(1999)Cell 99:451-454；Tyler等人(1999)Cell 99:443-446；Knoepfler等人(1999)Cell99:447-450；和Robertson等人(2000)Nature Genet.25:338-342。其他示例性抑制结构域包括但不限于ROM2和AtHD2A。参见，例如，Chem等人(1996)Plant Cell8:305-321；和Wu等人(2000)Plant J.22:19-27。
在一些实施方案中，转录抑制结构域包含来自人锌指蛋白10/KOX1(ZNF10/KOX1)(例如GenBank号Nm_015394.4)的Kruppel相关盒(KRAB)结构域的序列。示例性KRAB结构域序列为：
Figure BDA0003579440330000131
也可以使用该KRAB序列的变体，只要其具有相同或相似转录抑制功能即可。
在一些实施方案中，本文所述的工程改造的ZFP-TF结合至如表1单行中所显示的靶位点，优选地没有或几乎没有可检测的脱靶结合或活性。脱靶结合可例如通过测量脱靶基因处ZFP-TF的活性来确定。在一些实施方案中，本文所述的工程改造的ZFP-TF包含显示于表1中的DNA结合识别螺旋序列。在一些实施方案中，本文所述的工程改造的ZFP-TF包含表1单行中所显示的两个相邻DNA结合识别螺旋序列。在一些实施方案中，本文所述的工程改造的ZFP-TF包含表1单行中所显示的DNA结合识别螺旋序列。在一些实施方案中，本文所述的工程改造的ZFP-TF包含表2单行中所显示的序列的识别螺旋和骨架部分。在一些实施方案中，本文所述的工程改造的ZFP-TF包含表2单行中所显示的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文所述的工程改造的ZFP-TF包含表2单行中所显示的序列的识别螺旋和骨架部分，因为该序列将在翻译后修饰后出现。在一些实施方案中，本文所述的工程改造的ZFP-TF包含如表2单行中所显示的氨基酸序列，因为该序列将在翻译后修饰后出现。例如，翻译后修饰可从如表2中所显示的序列除去引发剂甲硫氨酸残基。
B.肽接头
本发明ZFP-TF的ZFP结构域和转录抑制结构域和/或ZFP结构域内的锌指可经由肽接头连接，例如约5至200个氨基酸(例如5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个或更多个氨基酸)的不可裂解的肽接头。优选接头通常为经合成为重组融合蛋白的柔性氨基酸子序列。参见，例如，以上所述；和美国专利6,479,626；6,903,185；7,153,949；8,772,453；和9,163,245；和WO2011/139349。本文所述的蛋白质可包括合适接头的任何组合。接头的非限制性实例为DGGGS(SEQ ID NO:2)、TGEKP(SEQ ID NO:3)、LRQKDGERP(SEQ ID NO:4)、GGRR(SEQ ID NO:5)、GGRRGGGS(SEQ ID NO:6)、LRQRDGERP(SEQ ID NO:7)、LRQKDGGGSERP(SEQ ID NO:8)、LRQKD(G3S)2ERP(SEQ ID NO:9)和TGSQKP(SEQ ID NO:10)。
在一些实施方案中，TGEKPFA(SEQ ID NO:166)和/或TGSQKPFQ(SEQ ID NO:167)连接ZFP结构域内的锌指，和/或LRQKDAARGSGG(SEQ ID NO:168)或LRGSGG(SEQ ID NO:169)将ZFP结构域连接至转录抑制结构域。
在一些实施方案中，肽接头长度为三个至20个氨基酸残基且富含G和/或S。此种接头的非限制性实例为G4S型接头(SEQ ID NO:16)，即含有一个或多个(例如2个、3个或4个)GGGGS(SEQ ID NO:11)基序或该基序的变体(如来自该基序的具有一个、两个或三个氨基酸插入、缺失和取代的基序)的接头。
IV.ZFP-TF的表达
本发明的ZFP-TF可经由编码其的核酸分子引入患者。核酸分子可以是RNA或cDNA分子。核酸分子可经由注射包含脂质:核酸复合物(例如脂质体)的组合物引入患者脑中。或者，ZFP-TF可经由包含编码ZFP-TF序列的核酸表达载体引入患者。表达载体可包括表达控制序列，如启动子、增强子、转录信号序列和转录终止序列，其允许ZFP-TF的编码序列在神经系统的细胞中表达。在一些实施方案中，表达载体仍作为稳定游离体(episome)存在于细胞中。在其他实施方案中，表达载体整合至细胞的基因组中。
在一些实施方案中，用于引导脑中ZFP-TF表达的载体上的启动子为组成型活性启动子或诱导型启动子。合适的启动子包括但不限于逆转录病毒RSV LTR启动子(任选地具有RSV增强子)、CMV启动子(任选地具有CMV增强子)、CMV立即早期启动子、SV40启动子、二氢叶酸还原酶(DHFR)启动子、β-肌动蛋白启动子、磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子、EFlα启动子、MoMLV LTR、CK6启动子、甲状腺素运转蛋白启动子(TTR)、TK启动子、四环素反应启动子(TRE)、HBV启动子、hAAT启动子、嵌合肝脏特异性启动子(LSP)、E2F启动子、端粒酶(hTERT)启动子、CMV增强子/鸡β-肌动蛋白/兔β-球蛋白启动子(CAG启动子；Niwa等人，Gene(1991)108(2):193-9)和RU-486反应启动子。也可以使用神经元特异性启动子，如突触蛋白I启动子、MeCP2启动子、CAMKII启动子、PrP启动子、GFAP启动子或将表达限制于神经元及神经胶质细胞的工程改造或天然启动子。
可采用将核苷酸序列引入细胞中的任何方法，包括但不限于电穿孔、磷酸钙沉淀、微注射、阳离子或阴离子脂质体、与核定位信号组合的脂质体、天然生成的脂质体(例如外泌体)或病毒转导。
为体内递送表达载体，可使用病毒转导。本领域中已知的多种病毒载体可由本领域技术人员改造以用于本发明，例如牛痘载体、腺病毒载体、慢病毒载体、氧合病毒(poxyviral)载体、腺相关病毒(AAV)载体、逆转录病毒载体及杂种病毒载体。在一些实施方案中，本文所使用的病毒载体为重组AAV(rAAV)载体。AAV载体特别适合CNS基因递送，因为其既感染分裂细胞又感染非分裂细胞，以稳定游离体结构存在以进行长期表达，且具有极低免疫原性(Hadaczek等人，Mol Ther.(2010)18:1458-61；Zaiss等人，Gene Ther.(2008)15:808-16)。可使用任何合适的AAV血清型。例如，AAV可以是AAV1、AAV2、AAV3、AAV3B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV8.2、AAV9或AAVrh10、或假型(如AAV2/8、AAV2/5、AAV2/6或AAV2/9)、或为本文所列的AAV血清型之一的变体或衍生物的血清型(即衍生自多种血清型的AAV；例如，rAAV在其基因组中包含AAV2反向末端重复序列(ITR)及AAV8、5、6或9衣壳)。在一些实施方案中，表达载体为AAV病毒载体且通过基因组包含构建体的重组AAV病毒粒子引入靶人细胞，包括在两端具有AAV反向末端重复序列(ITR)序列以允许产生生产系统(如昆虫细胞/杆状病毒生产系统或哺乳动物细胞生产系统)中的AAV病毒粒子。AAV可经工程改造使得其衣壳蛋白在人类或非人类灵长类动物中具有降低的免疫原性或增强的转导能力。在一些实施方案中，使用AAV9。本文所述的病毒载体可使用此项技术中已知的方法来产生。任何适合允许或封装的细胞均可用于产生病毒颗粒。例如，哺乳动物或昆虫细胞可用作封装细胞系。
V.药学应用
本发明的ZFP-TF可用于治疗需要下调α-突触核蛋白表达的患者。患者患有神经退行性疾病，如帕金森病、路易体痴呆、阿尔兹海默症、多系统萎缩和任何其他突触核蛋白病变，或处于发展此类疾病的风险中。处于风险中的患者包括那些遗传易感者、那些患有复发型脑损伤(诸如震荡)者及那些已暴露于环境神经毒素者。本发明提供治疗个体(诸如有需要的人类患者)的神经疾病(例如神经退行性疾病)的方法，该方法包括将治疗有效量(例如，允许充分抑制SNCA表达的量)的ZFP-TF(例如表达其的rAAV载体)引入该个体的神经系统。术语“治疗”包含缓解症状，预防症状发作，减缓疾病进展，改良生活质量，及增加存活期。
本发明提供包含病毒载体(诸如重组AAV(rAAV))的药物组合物，该病毒载体的重组基因组包含ZFP-TF的表达盒。药物组合物可进一步包含药学上可接受的载体，诸如水、盐水(例如，磷酸盐缓冲盐水)、右旋糖、甘油、蔗糖、乳糖、明胶、右旋糖酐、白蛋白或果胶。另外，组合物可含有辅助物质，诸如湿润剂或乳化剂、pH缓冲剂、稳定剂或增强药物组合物的有效性的其他试剂。药物组合物可含有递送载剂，诸如脂质体、纳米胶囊、微粒、微球、脂质颗粒和囊泡。
本发明的治疗剂所靶向的细胞为脑中的细胞，包括但不限于神经元细胞(例如，运动神经元、感觉神经元、多巴胺能神经元、胆碱能神经元、谷氨酸能神经元、GABA能神经元或血清素能神经元)；神经胶质细胞(例如寡突胶质细胞、星形胶质细胞、周皮细胞、Schwann细胞或小胶质细胞)；室管膜细胞或神经上皮细胞。治疗剂所靶向的脑区域可以是那些在突触核蛋白病变中受影响最显著的区域，诸如纹状体、尾核、壳核、黑质、中脑、嗅球、小脑、蓝斑、桥脑、延脑、脑干、苍白球、海马体及大脑皮质或其他脑区域。这些区域可直接通过纹状体内注射、黑质内注射、脑内注射、小脑延髓池内(intra-cisternal magna，ICM)注射，或更通常地通过实质内注射、脑室内(ICV)注射、鞘内注射或静脉内注射而到达。其他施用途径包括但不限于脑内、室内、鼻内或眼内施用。在一些实施方案中，病毒载体在例如经由鞘内和/或脑室内注射或小脑延髓池内注射直接施用至脑脊髓液(CSF)中后扩散于整个CNS组织中。在其他实施方案中，在静脉内施用后病毒载体穿过血脑屏障且在个体的整个CNS组织中实现广泛扩散的分布。在其他实施方案中，病毒载体经由实质内注射直接递送于靶区域。在一些情况下，在实质内递送后病毒载体可能经历逆行或顺行转运至其他脑区域。在一些方面中，病毒载体具有独特CNS组织靶向能力(例如CNS组织向性)，其以高效率实现稳定且非毒性的基因转移。
举例而言，药物组合物可经由脑室内施用，例如施用至患者前脑的脑室区域(诸如右侧脑室、左侧脑室、第三脑室或第四脑室)中而提供给患者。药物组合物可通过脑内施用，例如将组合物注射于纹状体、尾核、壳核、黑质、中脑、嗅球、大脑、延脑、桥脑、小脑、蓝斑、脑干、苍白球、海马体、大脑皮质、颅内腔、脑膜、硬脑膜、蛛网膜或脑软膜中或附近而提供给患者。在一些情况下，脑内施用可包括将药剂施用至脑周围蛛网膜下腔的脑脊髓液(CSF)中。
在一些情况下，脑内施用涉及使用立体定位程序进行注射。立体定位程序为本领域所熟知且通常涉及使用计算机和3维扫描装置，其一起用于引导注射至特定脑内区域，例如脑室区域。也可以使用微注射泵(例如，来自World Precision Instruments)。在一些情况下，微注射泵用于递送包含病毒载体的组合物。在一些情况下，组合物的输注速率在0.1μl/min至100μl/min的范围内。技术人员将理解，输注速率将取决于多种因素，包括例如受试者人种、受试者年龄、受试者体重/体型、AAV血清型、所需的剂量及所靶向的脑内区域。因此，技术人员可认为其他输注速率在某些情况下是合适的。
可例如通过静脉内施用施用来实现递送rAAV至受试者。在某些情况下，可能期望将rAAV局部递送至脑组织、脊髓、脑脊髓液(CSF)、神经元细胞、神经胶质细胞、脑膜、星形胶质细胞、寡突胶质细胞、小胶质细胞、间质空间等。在一些情况下，重组AAV可通过注射至脑室区域中以及注射至纹状体、尾核、壳核、黑质、中脑、嗅球、小脑、蓝斑、桥脑、延脑、脑干、苍白球、海马体及大脑皮质或其他脑区域而直接递送至CNS。AAV可使用本领域中已知的神经外科技术，诸如通过立体定位注射，用注射器、导管或相关装置来递送(参见，例如，Stein等人，J Vir.(1999)73:3424-9；Davidson等人，PNAS.(2000)97:3428-32；Davidson等人，NatGenet.(1993)3:219-223；和Alisky及Davidson，Hum.Gene Ther.(2000)11:2315-29)。
除非本文另外定义，否则与本发明结合使用的科学及技术术语应具有本领域技术人员通常所理解的含义。下文描述示例性方法及材料，尽管类似或等效于本文所述的那些的方法及材料也可以用于本发明的实践或测试中。若发生冲突，则以本说明书(包括限定)为准。一般而言，本文所述的与神经病学、医学、药物及医药化学及细胞生物学结合使用的命名法及技术为本领域广为人知且通常使用的那些。酶促反应及纯化技术根据制造商的说明书进行，如通常在此项技术中实现的或如本文所述的。此外，除非上下文另外要求，否则单数术语应包括复数且复数术语应包括单数。在整篇该说明书及实施方案中，词语“具有”和“包含”或变体如“有”、“含”、“包括”或“含有”将被理解为意指包括所述整数或整数组但不排除任何其他整数或整数组。本文提及的所有公开案及其他参考文献的全部内容通过引用并入。尽管本文引用许多文件，但该引用并不意味着承认这些文件中的任何文件构成本领域公知常识的一部分。如本文所用，术语“大约”或“约”应用于一个或多个目标值是指类似于所述参考值的值。在某些实施方案中，该术语是指在任一方向上(大于或小于)落在所述参考值的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更小内的一系列值，除非另有说明或另外从上下文明显可见。
为了更好地理解本发明，提出以下实施例。这些实施例仅出于说明的目的而不应以任何方式解释为限制本发明的范围。
实施例
实施例1：ZFP-TF的筛选
为了鉴别抑制α-突触核蛋白的表达的ZFP-TF，设计并筛选416种ZFP-TF的文库，该ZFP-TF预期结合人SNCA基因的跨越TSS 1上游500碱基对至TSS 1下游500碱基对或TSS 2a上游500碱基对至TSS 2b下游500碱基对的区域中的15或18碱基对序列(图2B)。ZFP-TF的靶区域由图2B中的箭头表示，其中该箭头的方向指示ZFP-TF所结合的DNA链(5’至3’)。图4显示了与图2B中针对具有1个、2个或3个靶向SNCA基因的TSS 2a和2b的磷酸盐接触改变的ZFP-TF所展现的数据类似的数据。在该研究中，KRAB结构域序列(SEQ ID NO:12)用作转录抑制物并融合至ZFP结构域的C端。20种代表性ZFP-TF的序列显示于下表2中。使用PCR(正向引物GCAGAGCTCTCTGGCTAACTAGAG(SEQ ID NO:13)；反向引物T(180)CTGGCAACTAGAAGGCACAG(SEQ ID NO:14)从pVAX-ZFP或pVAX-GFP质粒产生用于体外转录的模板。使用mMESSAGEmMACHINE T7 ULTRA转录试剂盒(Thermo Fisher Scientific)按照制造商的说明书来合成信使RNA并使用RNeasy96柱(Qiagen)进行纯化。然后将编码各ZFP-TF的RNA以6剂量稀释等分至96孔板中。
根据熟知的方法，在HEK293细胞中产生携带ZFP-TF编码序列的重组rAAV载体。用编码AAV辅助基因及rAAV基因组的质粒转染细胞三天后，收获细胞。然后通过三轮冷冻/解冻裂解细胞并通过离心移除细胞碎片。使用聚乙二醇沉淀rAAV病毒粒子。重悬后，通过基于氯化铯梯度超速离心过夜来纯化病毒粒子。通过透析配制病毒粒子，然后进行过滤灭菌。将AAV等分并储存在-80℃下直至使用。AAV在解冻后不重新冷冻。
在SK-N-MC人神经上皮细胞系中进行筛选。SK-N-MC细胞以高水平表达人α-突触核蛋白并因此适于测试降低α-突触核蛋白表达的ZFP-TF。将SK-N-MC细胞在组织培养瓶中培养直至汇合。将细胞以每孔150,000个细胞接种于96孔板上并重悬于
Figure BDA0003579440330000192
SF溶液中。然后将细胞与ZFP-TF RNA(6剂：3、10、30、100、300及1000ng)混合并转移至
Figure BDA0003579440330000193
梭板孔。使用
Figure BDA0003579440330000191
装置(Lonza；程序CM-137)转染细胞。将伊格尔氏MEM细胞培养基(Eagle’s MEM cell media)添加于板的各个孔中。将细胞转移至96孔组织培养板并在37℃下孵育24小时。
还在人iPSC衍生的GABA能神经元(Cellular Dynamics International)中测试ZFP-TF。根据制造商的说明书，将细胞以每孔40,000个细胞的密度接种于聚-L-鸟氨酸和层黏连蛋白(laminin)包被的96孔板上，然后进行维持。接种后48小时，在6种不同MOI(1E3、3E3、1E4、3E4、1E5及3E5)下用表达期望的ZFP-TF的AAV6转染细胞。经转导的细胞维持最长达32天(每3至5天进行50％至75％培养基更换)。在AAV转染后28至30天收获细胞。
裂解所收获的细胞并使用C2CT试剂盒，遵循制造商的说明书进行逆转录。TaqMan定量聚合酶链反应(qPCR)用于测量SNCA的表达水平。将SNCA表达水平相对于管家基因EIF4A2、ATP5B及GAPDH的表达水平的几何平均值进行归一化。假转染(mock transfection)和用已知不靶向SNCA的ZFP-TF转染用作阴性对照。
证实了许多所测试的ZFP-TF对α-突触核蛋白的剂量依赖性抑制。实现的最大抑制超过99％，但同样鉴别出在更小程度上(例如在最高剂量下约90％、约75％或约40％)抑制α-突触核蛋白的ZFP-TF。图3A至3E和图5显示了筛选数据。
40种ZFP-TF实例的剂量依赖性活性显示于图6A和6B中。这些图中的数据显示，ZFP-TF展现了宽范围的α-突触核蛋白抑制活性谱，其中在所测试的最高剂量下，α-突触核蛋白mRNA的抑制在约40％至大于99％的范围内。例如，ZFP-TF 81966、81970、81972、82002、82008、82012、82049、82054、82090、82092、82096、82097、82107、82150、82190、82195、82197、82215、82225和82294证实了对人SNCA基因的95％或更大抑制；ZFP-TF81965、81971、82076、82135、82136、82158、82167、82242、82264、82285和82329证实了80％至94％的抑制；及ZFP-TF 82001、82056、82058、82110、82144、82148、82151、82208和82288证实了41％至79％的抑制。
实施例2：α-突触核蛋白ZFP-TF的脱靶活性
为评估α-突触核蛋白ZFP-TF在整体基因表达上的脱靶影响，对分离自经编码代表性α-突触核蛋白ZFP-TF的AAV处理的人iPSC衍生的神经元和原代小鼠皮质神经元的总RNA进行微阵列实验。
如实施例1中所述处理人iPSC衍生的神经元。为进行微阵列分析，将细胞以每孔260,000个细胞的密度接种于聚L-鸟氨酸和层黏连蛋白包被的24孔板上，接种后48小时用1E5 VG/细胞转染，并在病毒转染后19天收获。分离自所收获的细胞的RNA用于微阵列分析。
原代小鼠皮质神经元购自Gibco。将细胞以200,000个细胞/孔接种于聚-D-赖氨酸包被的24孔板上并根据制造商的说明书使用含有GlutaMAXTM I补充剂、B27补充剂及青霉素/链霉素的Gibco神经元基础培养基进行维持。接种后四十八小时(在DIV2)，用AAV6以1E5VG/细胞的MOI感染细胞并在7天后收获(在DIV9；每3至4天进行50％培养基更换)。此后进行RNA分离及微阵列分析。
脱靶分析使用GeneTitanTM平台(Clariom S试剂盒)根据制造商的说明书来进行。使用TAC软件分析测定结果。分析中调出经FDR校正的p值≤0.05的差异调节基因(其调节>2倍)。已知具有最小脱靶的ZFP-TF和假转染用作阴性对照。
图7A至7D显示了人iPSC衍生的神经元和原代小鼠皮质神经元中40种代表性α-突触核蛋白ZFP-TF的微阵列结果。存在一系列脱靶活性，其中一些ZFP-TF展现出极低至检测不到的脱靶活性。
实施例3：α-突触核蛋白mRNA表达的体内抑制
使用表达两种代表性ZFP-TF(82195和82264)的AAV6构建体来证实PAC突触核蛋白小鼠模型中人SNCA的体内抑制，这些ZFP-TF在人和小鼠神经元中具有最小至检测不到的脱靶活性且在人iPSC衍生的神经元中具有不同的最大抑制活性(82195，～95％；82264，～80％)(Kuo等人，Hum Mol Genet.(2010)19(9):1633-50)。该小鼠模型在小鼠α-突触核蛋白无效背景下表达完整人SNCA序列及其上游调节序列。在8周龄雌性PAC突触核蛋白小鼠(每组n＝3只)的两个位点，将表达各ZFP-TF的AAV6载体和载剂以0.5μL/分钟的速率双侧施用于纹状体(每半球2个位点：5μL施用至前纹状体及4μl施用至后纹状体，总共9μL/半球及18μL/动物)。输注后，将注射器留在适当位置5分钟以使测试制品扩散。然后历时1至2分钟将注射器缓慢收回。用于注射的立体定位坐标如下(前纹状体-AP：+1.4mm，ML：+/-1.7mm，DV：-3.0mm；后纹状体：AP：+0.2mm，ML：+/-2.3mm，DV：-2.7mm)。3周后对小鼠实施安乐死并收集其脑以进行分子分析。安乐死时，动物经心脏灌注0.9％生理盐水，且取出脑并切成对半。左脑半球进一步切为12个不同区域(嗅球；吻侧、内侧及尾侧皮质；吻侧、内侧及尾侧纹状体；海马体；丘脑；腹侧中脑；延脑；和小脑)。将切下的组织置于RNALater中以保持RNA完整性。24小时后，移除RNALater且将组织在液氮中速冻并维持在干冰上直至在-80℃下储存。
将脑组织转移至置于冰上的含有0.6mL TRI试剂(Thermo Fisher)和两个3.2mm钢珠(BioSpec Products)的1.5mL微量离心管。使用Qiagen组织裂解仪在4℃下使用以下参数裂解样品：5个循环，90秒持续时间和25.1频率。短暂旋转后，在室温下将70μL 1-溴-3-氯丙烷加至各样品中。将样品涡转10秒，在4℃下以12,000×g离心10分钟，并将来自各样品的120μL水相转移至96孔板的孔中。
将六十微升异丙醇和12μL MagMax磁珠(Thermo Scientific)加入含有组织裂解物的水相的各孔。使用Kingfisher 96机器人(Thermo Scientific)和MagMax试剂盒(Thermo Fisher)，遵循制造商的方案从组织裂解物分离核糖核酸(RNA)。使用磁性架从磁珠分离出一百微升洗脱的RNA。使用Nanodrop8000仪器(Thermo Scientific)评估RNA产量和质量。
使用高容量cDNA逆转录试剂盒(Applied Biosystems)，利用10μL RNA和10μL RT主混合物(Master Mix)(10x RT缓冲液、10x随机引物、25x dNTP混合物、Multiscribe酶和无RNA酶水)按默认值制备互补脱氧核糖核酸(cDNA)。若需要，则可调整RNA和RT主混合物体积以确保进样量在100至1,000ng范围内。使用以下程序在C1000 Touch Biorad热循环仪上进行逆转录：25℃持续10分钟，37℃持续120分钟，85℃持续5分钟，并且保持在4℃。
使用Biorad CFX384热循环仪使cDNA经历RT-qPCR。将cDNA在无核酸酶水中稀释10倍，并将4μL经稀释的cDNA加入各10μL PCR反应。各样品在技术上一式四份进行测定。2x快速多路PCR(Qiagen)主混合物用于三重测定，SsoAdvanced通用探针超级混合物(Biorad)用于其他测定。
使用以下循环条件：Qiagen快速多路主混合物→95℃持续5分钟，95℃持续45秒，60℃持续45秒，板读取，40个循环；Biorad SsoAdvanced主混合物→95℃持续90秒，95℃持续12秒，60℃持续40秒，板读取，42个循环。
使用RNA分离步骤之前相对于分离步骤之后的外加GFP RNA以评估RNA回收率％。该研究中从动物汇集的RNA的4个样品5倍稀释系列用作标准曲线。将样品数据相对于三个管家基因ATP5B、EIF4A2和GAPDH的几何平均值进行归一化。
来自该实验的α-突触核蛋白、ZFP-TF、GFAP、IBA1和NeuN mRNA表达数据显示于图8A及8B中。数据显示，在具有显著ZFP-TF表达的脑区中存在α-突触核蛋白的抑制。此外，GFAP、IBA1和NeuN表达数据指示，ZFP-TF耐受良好，因而它们的施用并未导致神经炎症标志物的表达升高或神经元标志物NeuN的表达降低。
序列表
以下表1列出了本发明的33种示例性工程改造的ZFP。对于各ZFP，ZFP结构域内各锌指的基因组靶序列(结合序列)和DNA结合识别螺旋序列(即，F1至F6)显示于单行中。下表中的「^」表示，在所指示螺旋中的第1个氨基酸上游第4位的精氨酸(R)残基变为谷氨酰胺(Q)。序列的序列表编号(SEQ ID NO:#)显示于括号中。
表1示例性ZFP
Figure BDA0003579440330000231
Figure BDA0003579440330000241
Figure BDA0003579440330000251
下表2列出了本发明的33种示例性ZFP-TF的完整氨基酸序列，其中DNA结合识别螺旋序列以粗体表示，模块内及模块间接头以下划线表示。R(-5)Q骨架突变以粗体和下划线表示。序列的序列表编号(SEQ ID NO:#)显示于括号中。
表2示例性ZFP-TF序列
Figure BDA0003579440330000252
Figure BDA0003579440330000261
Figure BDA0003579440330000271
Figure BDA0003579440330000281
Figure BDA0003579440330000291
Figure BDA0003579440330000301
序列表
<110> 桑格摩生物治疗股份有限公司
<120> 用于抑制α-突触核蛋白表达的锌指蛋白转录因子
<130> 025297.WO011
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<141>
<150> 62/959,153
<151> 2020-01-09
<150> 62/909,496
<151> 2019-10-02
<160> 169
<170> PatentIn 版本 3.5
<210> 1
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
Met Asp Val Phe Met Lys Gly Leu Ser Lys Ala Lys Glu Gly Val Val
1 5 10 15
Ala Ala Ala Glu Lys Thr Lys Gln Gly Val Ala Glu Ala Ala Gly Lys
20 25 30
Thr Lys Glu Gly Val Leu Tyr Val Gly Ser Lys Thr Lys Glu Gly Val
35 40 45
Val His Gly Val Ala Thr Val Ala Glu Lys Thr Lys Glu Gln Val Thr
50 55 60
Asn Val Gly Gly Ala Val Val Thr Gly Val Thr Ala Val Ala Gln Lys
65 70 75 80
Thr Val Glu Gly Ala Gly Ser Ile Ala Ala Ala Thr Gly Phe Val Lys
85 90 95
Lys Asp Gln Leu Gly Lys Asn Glu Glu Gly Ala Pro Gln Glu Gly Ile
100 105 110
Leu Glu Asp Met Pro Val Asp Pro Asp Asn Glu Ala Tyr Glu Met Pro
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Asp Gly Gly Gly Ser
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<221> 部位
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<221> 来源
<223> /注解=「关于替代及优选实施方案的详细描述，参见如所归档的说明书」
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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
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Gly Gly Gly Ser
20
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tacccaacgc gaattgcg 18
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ccgagatagg gacgaggagc 20
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<221> 来源
<223> /注解=「人工序列的描述：合成肽」
<400> 120
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1 5
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解=「人工序列的描述：合成肽」
<400> 121
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
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<220>
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<220>
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<220>
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Leu Arg Gly Ser Gly Gly
1 5

Claims (27)

1.融合蛋白，其包含锌指蛋白(ZFP)结构域和转录抑制结构域，其中所述ZFP结构域结合至人α-突触核蛋白基因(SNCA基因)中的靶区域。
2.权利要求1的融合蛋白，其中所述靶区域在所述SNCA基因中转录起始位点(TSS)的1kb之内。
3.权利要求2的融合蛋白，其中所述TSS为TSS 1、TSS 2a或TSS 2b。
4.权利要求3的融合蛋白，其中所述靶区域在所述SNCA基因的TSS 1上游500bp之内，TSS 1下游500bp之内，TSS 2a上游500bp之内，和/或TSS 2b下游500bp之内。
5.前述权利要求中任一项的融合蛋白，其中所述ZFP结构域包含六个锌指且所述融合蛋白任选地抑制所述SNCA基因的表达至少约40％、75％、90％、95％或99％，而没有或具有最小可检测的脱靶结合或活性。
6.前述权利要求中任一项的融合蛋白，其中所述转录抑制结构域包含来自人KOX1的KRAB结构域的氨基酸序列。
7.前述权利要求中任一项的融合蛋白，其中所述ZFP结构域通过肽接头连接至转录抑制物。
8.前述权利要求中任一项的融合蛋白，其中所述ZFP结构域包含表1中所示的DNA结合识别螺旋序列。
9.前述权利要求中任一项的融合蛋白，其中所述ZFP结构域包含如表1单行中所示的DNA结合识别螺旋序列。
10.核酸构建体，其包含权利要求1至9中任一项的融合蛋白的编码序列，其中所述编码序列可操作地连接至转录调节元件。
11.权利要求10的核酸构建体，其中所述转录调节元件为脑细胞中组成型活性或诱导型的哺乳动物启动子，且其中所述启动子任选地为人突触蛋白I启动子。
12.重组病毒，其包含权利要求10或11的核酸构建体。
13.权利要求12的重组病毒，其中所述重组病毒为腺相关病毒载体、腺病毒载体或慢病毒载体。
14.药物组合物，其包含权利要求10或11的核酸构建体或权利要求12或13的重组病毒及药学上可接受的载体。
15.宿主细胞，其包含权利要求10或11的核酸构建体或权利要求12或13的重组病毒。
16.权利要求15的宿主细胞，其中所述宿主细胞为人细胞。
17.权利要求15的宿主细胞，其中所述宿主细胞为脑细胞或多能干细胞，其中所述干细胞任选地为胚胎干细胞或诱导多能干细胞(iPSC)。
18.抑制人脑细胞中α-突触核蛋白的表达的方法，其包括任选地通过引入权利要求10或11的核酸构建体或权利要求12或13的重组病毒，将权利要求1至9中任一项的融合蛋白引入所述细胞中，从而抑制所述细胞中α-突触核蛋白的表达。
19.权利要求18的方法，其中所述人脑细胞为神经元、神经胶质细胞、室管膜细胞或神经上皮细胞。
20.权利要求18或19的方法，其中所述细胞在患者的脑中，所述患者患有以下疾病或具有发展出以下疾病的风险：帕金森病、路易体痴呆、阿尔兹海默症、多系统萎缩或其他突触核蛋白病变(synucleinopathy)。
21.权利要求18至20中任一项的方法，其包括将表达所述融合蛋白的重组病毒引入所述细胞中。
22.权利要求21的方法，其中所述重组病毒为腺相关病毒(AAV)，任选地为血清型9。
23.治疗患者的突触核蛋白病变的方法，其包括向所述患者施用编码权利要求1至9中任一项的融合蛋白的重组AAV。
24.权利要求23的方法，其中所述AAV经由静脉内、鞘内、脑室内、小脑延髓池内(intra-cisternalmagna)、纹状体内或黑质内注射或注射入任何脑区中而引入所述患者。
25.权利要求23或24的方法，其中所述突触核蛋白病变为帕金森病、路易体痴呆、阿尔兹海默症或多系统萎缩。
26.权利要求1至9中任一项的融合蛋白、权利要求10或11的核酸构建体、权利要求12或13的重组病毒、权利要求14的药物组合物，其用于权利要求18至25中任一项的方法中。
27.权利要求1至9中任一项的融合蛋白、权利要求10或11的核酸构建体、权利要求12或13的重组病毒在制备用于权利要求18至25中任一项的方法中的药物中的用途。
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