KR20190137126A - 조직 선택적 트랜스진 발현 - Google Patents

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Abstract

트랜스진의 선택적 발현을 위한 조성물 및 방법이 본원에서 제공된다. 트랜스진의 선택적 발현을 위한 조성물 및 방법은 트랜스진에 작동가능하게 연결된 경우 적어도 하나 이상의 비-표적 세포에 비교하여 표적 세포에서의 트랜스진의 선택적 발현 (예를 들어, 세포-유형 선택적 발현)을 촉진할 수 있는 하나 이상의 인간 조절 요소를 포함한다.

Description

조직 선택적 트랜스진 발현
상호 참조
본 출원은 2017년 4월 3일에 출원된 미국 가출원 번호 62/480,998을 우선권 주장하고, 이는 전문이 본원에 참조로 포함된다.
서열 목록
본 출원은 ASCII 포맷으로 전자 제출되고, 이에 의해 전문이 참조로 포함되는 서열 목록을 함유한다. 2018년 3월 29일에 생성된 상기 ASCII 카피는 파일명이 46482-704_601_SL.txt이고, 크기가 78,248 바이트이다.
개시내용의 배경
유전자 요법은 어떻게 인간 질환에 접근하고 이를 치료하는지에서의 엄청난 잠재력에 대해 인정되어 왔다. 약물 또는 수술에 의존하는 대신, 환자, 특히 근원적인 유전적 요인이 있는 환자는 근원적인 원인을 직접적으로 표적화함으로써 치료될 수 있다. 또한, 근원적인 유전적 원인을 표적화함으로써, 유전자 요법은 환자를 효과적으로 치유하거나 또는 장기간에 걸쳐 지속적인 치료를 제공할 잠재력이 있다. 그러나, 그럼에도 불구하고, 유전자 요법의 임상 적용은 여전히 여러 측면에서 개선을 필요로 한다. 관심 영역 중 하나는 표적을 벗어나는 효과이다. 표적을 벗어나는 효과를 다루는 매력적인 접근법은 유전자 요법의 유전자 발현을 관심 세포 유형(들) 또는 조직(들), 또는 표적 세포 유형(들) 또는 조직(들)에 표적화하는 것이다. 이와 같이, 유전자 요법 또는 유전자 발현을 관심 조직 또는 세포 유형에 표적화하기 위한 요소 및 이의 사용 방법을 확인하는 것이 요구된다.
개시내용의 개요
표적을 벗어나는 효과를 감소시킬 수 있고, 표적 조직 및/또는 세포 유형에서의 치료 효능을 증가시킬 수 있으며, 효능을 달성하는데 요구되는 유효 용량을 감소시킴으로써 환자 안전 및 허용성을 증가시킬 수 있는, 생체 내에서의 원하는 조직 및/또는 세포 유형으로의 표적화 유전자 요법 및 이의 유전자/트랜스진 발현이 상당히 요구된다.
하나 이상의 비-표적 조직 또는 세포 유형에 비해 표적 조직 또는 세포 유형에서의 트랜스진의 선택적 발현을 위한 조성물 및 방법이 본원에서 제공된다. 트랜스진의 선택적 발현을 위한 조성물 및 방법은 트랜스진 (예를 들어, 이온 채널 서브유닛 또는 신경전달물질 조절인자, 또는 신택신-결합 단백질)에 작동가능하게 연결된 경우, 표적 조직 또는 세포 유형 (예를 들어, 파르브알부민 (PV) 뉴런)에서 하나 이상의 비-표적 세포 유형 (예를 들어, 비-PV 세포)에 비교하여 트랜스진의 선택적 또는 우선적 발현을 촉진하거나 발생시킬 수 있는 하나 이상의 조절 요소 (RE)를 포함한다. 일부 경우에, RE는 비-천연 발생 서열이다. 일부 경우에, RE는 인간 유래 조절 요소이다. 일부 경우에, RE는 비-인간 종, 예컨대 원숭이, 또는 개, 또는 토끼, 또는 마우스로부터의 서열을 포함한다. 일부 경우에, 본원에 기술된 조성물은 바이러스 벡터 및/또는 바이러스 입자, 예컨대 아데노-연관 바이러스 (AAV) 또는 렌티바이러스를 사용하여 생체 내에서, 생체 외에서, 또는 시험관 내에서 세포 내로 전달된다. 일부 경우에, 본원에 기술된 조성물은 유전자 요법으로서 세포 내로 전달된다. CNS에서의 유전 결손과 연관된 신경학적 병태 또는 장애를 치료하기 위한 방법 및 조성물이 본원에서 또한 구상된다. 일부 경우에, 유전 결손에 의해 영향을 받는 관련된 세포 유형 또는 조직은 PV 세포이다. 일부 예에서, 신경학적 병태 또는 질환은 드라벳 증후군, 알츠하이머병, 간질, 및/또는 발작이다. 일부 경우에, 신경학적 병태 또는 질환은 정신과 장애 (예를 들어, 정신분열병, 강박 장애, 중독, 우울증, 불안, 정신병); 자폐증 스펙트럼 장애 (예를 들어, 유약 X 증후군, 레트 증후군); 간질 (예를 들어, 만성 외상성 뇌병증, 열성 발작을 동반하는 전신 간질 (GEFS+), 간질성 뇌병증, 측두엽 간질, 국소 간질, 결절성 경화증); 또는 신경변성 (예를 들어, 알츠하이머병, 파킨슨병)이다. 일부 경우에, 신경학적 병태 또는 질환은 PV 뉴런이 연루되는 임의의 발작 및/또는 간질 관련 병태 또는 질환이다.
한 측면에서, 본 개시내용은 하나 이상의 비-표적 세포 유형, 또는 CNS 내의 비-PV 세포에 비해, 임의의 표적 세포 유형, 예를 들어, CNS 내의 PV 뉴런에서의 선택적 발현을 발생시키는 트랜스진에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 조절 요소를 포함하는 핵산 카세트를 구상한다. 일부 경우에, 각각의 조절 요소는 (i) 서열식별번호(SEQ ID NO): 1-32의 서열, (ii) 이의 기능성 단편 또는 조합물, 또는 (iii) (i) 또는 (ii)에 대한 서열 동일성이 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%인 서열을 포함한다. 일부 경우에, 서열 동일성은 BLAST를 사용하여 결정된다. 일부 경우에, 조절 요소 중 적어도 하나는 인간에서 유래된다. 일부 경우에, 조절 요소 중 적어도 하나는 비-인간 포유동물로부터 유래된다. 일부 경우에, 조절 요소는 비-천연 발생이다. 일부 경우에, 조절 요소는, 공동-국소화 검정법에 의해 측정 시, 비-선택적 조절 요소에 작동가능하게 연결된 경우의 동일한 트랜스진의 발현보다 더 큰 PV 뉴런에서의 트랜스진의 선택적 발현을 발생시킨다. 일부 경우에, 비-선택적 조절 요소는 구성적 프로모터이다. 일부 경우에, 비-선택적 조절 요소는 CAG, EF1α, SV40, CMV, UBC, PGK, 및 CBA 중 어느 하나이다. 일부 예에서, 조절 요소는, 공동-국소화 검정법에 의해 측정 시, 비-선택적 조절 요소에 작동가능하게 연결된 경우의 PV 뉴런에서의 트랜스진의 선택적 발현에 비교하여 적어도 1.5배, 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 6배, 적어도 7배, 적어도 8배, 적어도 9배, 적어도 10배, 적어도 15배, 또는 적어도 20배인 수준으로 PV 뉴런에서의 트랜스진의 선택적 발현을 발생시킨다. 일부 경우에, 조절 요소는 트랜스진이 비-선택적 조절 요소에 작동가능하게 연결된 경우의 PV 뉴런에서의 발현보다 적어도 2%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 더 높은 PV 뉴런에서의 선택적 발현을 발생시킨다. 일부 경우에, 조절 요소는 CNS에서의 PV 뉴런의 천연 분포에 대해 예상되는 것보다 약 1.5배, 2배, 2.5배, 3배, 3.5배, 4배, 4.5배, 5배, 5.5배, 6배, 6.5배, 7배, 7.5배, 8배, 8.5배, 9배, 9.5배, 10배, 15배, 20배, 25배, 30배, 40배, 50배, 또는 100배 더 높은 PV 뉴런에서의 선택적 발현을 발생시킨다. 일부 경우에, 공동-국소화 검정법은 면역조직화학 검정법이다. 일부 경우에, 면역조직화학 검정법은 항-PV 항체를 포함한다. 일부 경우에, 공동-국소화 검정법은 하기 실시예 5에서 제시된 바와 같이 수행된다. 일부 경우에, 트랜스진은 이온 채널 서브유닛, 신경전달물질 조절인자, DNA 결합 도메인, 유전자 편집 단백질, 또는 이의 변이체 또는 기능성 단편을 코딩한다. 일부 경우에, 이온 채널 서브유닛은 나트륨 이온 채널의 알파 서브유닛 또는 베타 서브유닛 또는 칼륨 이온 채널의 서브유닛이다. 일부 경우에, 트랜스진은 (i) 서열식별번호: 37-43; (ii) 이의 기능성 단편; 또는 (iii) (i) 또는 (ii)에 대한 서열 동일성이 적어도 80%인 서열 중 어느 하나를 포함한다. 일부 경우에, 서열 동일성은 BLAST를 사용하여 결정된다. 일부 경우에, 트랜스진은 (i) SCN1A, SNC2A, SNC8A, SCN1B, SCN2B, KV3.1, 또는 KV3.3; (ii) 이의 기능성 단편; 또는 (iii) (i) 또는 (ii)에 대한 서열 동일성이 적어도 80%인 서열을 포함한다. 일부 경우에, 트랜스진은 (i) STXBP1, (ii) 이의 기능성 단편, 또는 (iii) (i) 또는 (ii)에 대한 서열 동일성이 적어도 80%인 서열을 포함하는 신경전달물질 조절인자이다. 일부 경우에, 트랜스진은 내인성 유전자의 발현을 조정하는 DNA 결합 단백질을 포함한다. 일부 경우에, 내인성 유전자는 SCN1A, SNC2A, SNC8A, SCN1B, SCN2B, KV3.1, KV3.2, KV3.3, 또는 STXBP1이다. 일부 경우에, 트랜스진은 DNA 결합 단백질, 또는 DNA 절단 도메인 또는 뉴클레아제 도메인이 비활성화된 DNA 절단 단백질 (예를 들어, 뉴클레아제, 제한 효소, 리컴비나제 등), 예를 들어, 뉴클레아제-비활성화 Cas (dCas), 비활성화 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제, 또는 뉴클레아제-비활성화 아연 손가락 단백질의 DNA 결합 도메인을 포함하는 DNA 결합 단백질을 포함한다. 일부 경우에, 트랜스진은 전사 조정 도메인 (예를 들어, 전사 활성화제 또는 억제인자 도메인)에 연결된 DNA 결합 도메인을 포함한다. 일부 경우에, 유전자 편집 단백질은 Cas 단백질이다. 일부 경우에, 조합된 조절 요소는 크기가 2.5 kb 미만, 2 kb 미만, 1.5 kb 미만, 1 kb 미만, 또는 500 bp 미만이다. 일부 경우에, 비-PV 세포는 CNS 내의 비-PV 세포 유형 중 하나 이상을 포함한다. 일부 경우에, 비-PV 세포는 흥분 뉴런, 도파민작용성 뉴런, 별아교세포, 미세아교세포, 및 운동 뉴런 중 하나 이상을 포함한다. 일부 경우에, 핵산 카세트는 선형 구축물이다. 일부 경우에, 핵산 카세트는 벡터이다. 일부 경우에, 벡터는 플라스미드이다. 일부 경우에, 벡터는 바이러스 벡터이다. 일부 경우에, 바이러스 벡터는 아데노-연관 바이러스 (AAV) 벡터이다. 일부 경우에, AAV 벡터는 AAV1, AAV8, AAV9, scAAV1, scAAV8, 또는 scAAV9이다. 일부 경우에, 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터이다.
한 측면에서, 본원에 개시된 핵산 카세트 중 임의의 것의 조절 요소는 GAD2, GAD1, SYN1, NKX2.1, DLX1, DLX5/6, SST, PV, 및/또는 VIP의 전사 개시 부위로부터 10 kb 이내의 600 bp 미만의 인접한 서열을 함유한다.
한 측면에서, 신경학적 장애 또는 병태의 치료를 필요로 하는 대상체에서 신경학적 장애 또는 병태를 치료하는 방법은 치료적 유효량의 본원에 개시된 핵산 카세트 중 임의의 것을 전달하는 것을 포함한다. 일부 경우에, 신경학적 장애 또는 병태는 정신과 장애 (예를 들어, 정신분열병, 강박 장애, 중독, 우울증, 불안, 정신병); 자폐증 스펙트럼 장애 (예를 들어, 유약 X 증후군, 레트 증후군); 간질 (예를 들어, 만성 외상성 뇌병증, 열성 발작을 동반하는 전신 간질 (GEFS+), 간질성 뇌병증, 측두엽 간질, 국소 간질, 결절성 경화증); 또는 신경변성 (예를 들어, 알츠하이머병, 파킨슨병)이다. 일부 경우에, 신경학적 장애 또는 병태는 드라벳 증후군 또는 알츠하이머병이다. 일부 경우에, 신경학적 병태 또는 질환은 PV 뉴런이 연루되는 임의의 발작 및/또는 간질 관련 병태 또는 질환이다.
한 측면에서, CNS 내의 PV 뉴런에서의 트랜스진의 선택적 발현을 증가시키는 방법은 본원에 개시된 핵산 카세트와 세포를 접촉시키는 것을 포함한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 하나 이상의 PV 뉴런 선택적 조절 요소를 트랜스진에 작동가능하게 연결시키는 것을 포함하는, 임의의 트랜스진의 발현을 CNS 내의 PV 뉴런에 표적화하는 방법을 구상한다. 일부 경우에, 각각의 조절 요소는 (i) 서열식별번호: 1-32의 서열, (ii) 이의 기능성 단편 또는 조합물, 또는 (iii) (i) 또는 (ii)에 대한 서열 동일성이 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%인 서열을 포함한다. 일부 경우에, 서열 동일성은 BLAST를 사용하여 결정된다. 일부 경우에, 조절 요소는, 공동-국소화 검정법에 의해 측정 시, 비-선택적 조절 요소에 작동가능하게 연결된 경우의 동일한 트랜스진의 발현보다 더 큰 PV 뉴런에서의 트랜스진의 선택적 발현을 발생시킨다. 일부 경우에, 면역조직화학 검정법은 항-PV 항체를 포함한다 (예를 들어, 하기 실시예 5에 기술된 바와 같음). 일부 경우에, 비-선택적 조절 요소는 구성적 프로모터이다. 일부 경우에, 비-선택적 조절 요소는 CAG, EF1α, SV40, CMV, UBC, PGK, 및 CBA 중 어느 하나이다. 일부 경우에, 조절 요소는, 공동-국소화 검정법에 의해 측정 시, 트랜스진에 작동가능하게 연결된 경우의 비-선택적 조절 요소에 비교하여 적어도 1.5배, 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 6배, 적어도 7배, 적어도 8배, 적어도 9배, 적어도 10배, 적어도 15배, 또는 적어도 20배인 수준으로 PV 뉴런에서의 트랜스진의 선택적 발현을 발생시킨다. 일부 경우에, 조절 요소는 트랜스진이 비-선택적 조절 요소에 작동가능하게 연결된 경우의 PV 뉴런에서의 발현보다 적어도 2%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 더 높은 PV 뉴런에서의 선택적 발현을 발생시킨다. 일부 경우에, 조절 요소는 CNS에서의 PV 뉴런의 천연 분포에 대해 예상되는 것보다 약 1.5배, 2배, 2.5배, 3배, 3.5배, 4배, 4.5배, 5배, 5.5배, 6배, 6.5배, 7배, 7.5배, 8배, 8.5배, 9배, 9.5배, 10배, 15배, 20배, 25배, 30배, 40배, 50배, 또는 100배 더 높은 PV 뉴런에서의 선택적 발현을 발생시킨다. 일부 경우에, 트랜스진은 SCN1A, SNC2A, SNC8A, SCN1B, SCN2B, KV3.1, KV3.3, STXBP1, DNA 결합 단백질, 유전자 편집 단백질, 또는 이의 기능성 단편 중 어느 하나이다. 일부 경우에, 조절 요소 및 트랜스진은 AAV 내에 있다. 일부 경우에, AAV는 AAV1, AAV8, AAV9, scAAV1, scAAV8, 또는 scAAV9이다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 CNS 내의 하나 이상의 비-PV 세포에 비해 PV 뉴런에서의 트랜스진의 선택적 발현을 발생시키는 트랜스진에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 조절 요소를 포함하는 핵산 카세트와 세포를 접촉시키는 것을 포함하는, 신경학적 병태 또는 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에서 신경학적 병태 또는 장애를 치료하는 방법을 구상한다. 일부 경우에, 각각의 조절 요소는 (i) 서열식별번호: 1-32의 서열, (ii) 이의 기능성 단편 또는 조합물, 또는 (iii) (i) 또는 (ii)에 대한 서열 동일성이 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%인 서열을 포함한다. 일부 경우에, 서열 동일성은 BLAST를 사용하여 결정된다. 일부 경우에, 트랜스진은 전압-게이팅 이온 채널 서브유닛, 또는 이의 변이체 또는 기능성 단편이다. 일부 경우에, 서브유닛은 나트륨 이온 채널의 베타 서브유닛이다. 일부 경우에, 서브유닛은 나트륨 이온 채널의 알파 서브유닛이다. 일부 경우에, 서브유닛은 칼륨 이온 채널의 것이다. 일부 경우에, 트랜스진은 (i) SCN1A, SCN1B, SCN2B, KV3.1, 또는 KV3.3; (ii) 이의 기능성 단편; 또는 (iii) (i) 또는 (ii)에 대한 서열 동일성이 적어도 80%인 서열 중 어느 하나이다. 일부 경우에, 트랜스진은 DNA 결합 단백질이다. 일부 경우에, DNA 결합 단백질은 내인성 유전자를 조정한다. 일부 경우에, 내인성 유전자는 SCN1A, SNC2A, SNC8A, SCN1B, SCN2B, KV3.1, KV3.3, 또는 STXBP1이다. 일부 경우에, 트랜스진은 DNA 결합 단백질, 또는 DNA 절단 도메인 또는 뉴클레아제 도메인이 비활성화된 DNA 절단 단백질 (예를 들어, 뉴클레아제, 제한 효소, 리컴비나제 등), 예를 들어, 뉴클레아제-비활성화 Cas (dCas), 비활성화 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제, 또는 뉴클레아제-비활성화 아연 손가락 단백질의 DNA 결합 도메인을 포함하는 DNA 결합 단백질이다. 일부 경우에, 트랜스진은 전사 조정 도메인 (예를 들어, 전사 활성화제 또는 억제인자 도메인)에 연결된 DNA 결합 도메인을 포함한다. 일부 경우에, 트랜스진은 유전자 편집 단백질이다. 일부 경우에, 유전자 편집 단백질은 Cas 단백질, 예를 들어, Cas9이다. 일부 경우에, 신경학적 병태 또는 장애는 SCN1A, SNC2A, SNC8A, SCN1B, SCN2B, KV3.1, KV3.3, 또는 STXBP1 중 임의의 것에서의 반수체기능부전(haploinsufficiency) 또는 돌연변이와 연관된다. 일부 경우에, 신경학적 병태 또는 장애는 간질, 신경변성, 타우병증, 또는 뉴런 과소흥분성이다. 일부 경우에, 신경학적 병태 또는 장애는 드라벳 증후군이다. 일부 경우에, 신경학적 병태 또는 장애는 알츠하이머병이다. 일부 경우에, 신경학적 병태 또는 질환은 정신과 장애 (예를 들어, 정신분열병, 강박 장애, 중독, 우울증, 불안, 정신병); 자폐증 스펙트럼 장애 (예를 들어, 유약 X 증후군, 레트 증후군); 간질 (예를 들어, 만성 외상성 뇌병증, 열성 발작을 동반하는 전신 간질 (GEFS+), 간질성 뇌병증, 측두엽 간질, 국소 간질, 결절성 경화증); 또는 신경변성 (예를 들어, 알츠하이머병, 파킨슨병)이다. 일부 경우에, 신경학적 병태 또는 질환은 PV 뉴런이 연루되는 임의의 발작 및/또는 간질 관련 병태 또는 질환이다. 일부 경우에, 본 개시내용의 조절 요소는, 공동-국소화 검정법에 의해 측정 시, 비-선택적 조절 요소에 작동가능하게 연결된 경우의 동일한 트랜스진의 발현보다 더 큰 PV 뉴런에서의 트랜스진의 선택적 발현을 발생시킨다. 일부 경우에, 비-선택적 조절 요소는 구성적 프로모터이다. 일부 경우에, 비-선택적 조절 요소는 CAG, EF1α, SV40, CMV, UBC, PGK, 및 CBA 중 어느 하나이다. 일부 경우에, 조절 요소는, 공동-국소화 검정법에 의해 측정 시, 트랜스진에 작동가능하게 연결된 경우의 비-선택적 조절 요소에 비교하여 적어도 1.5배, 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 6배, 적어도 7배, 적어도 8배, 적어도 9배, 적어도 10배, 적어도 15배, 또는 적어도 20배인 수준으로 PV 뉴런에서의 선택적 발현을 발생시킨다. 일부 경우에, 조절 요소는 트랜스진이 비-선택적 조절 요소에 작동가능하게 연결된 경우의 PV 뉴런에서의 발현보다 적어도 2%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 더 높은 PV 뉴런에서의 선택적 발현을 발생시킨다. 일부 경우에, 조절 요소는 CNS에서의 PV 뉴런의 천연 분포에 대해 예상되는 것보다 약 1.5배, 2배, 2.5배, 3배, 3.5배, 4배, 4.5배, 5배, 5.5배, 6배, 6.5배, 7배, 7.5배, 8배, 8.5배, 9배, 9.5배, 10배, 15배, 20배, 25배, 30배, 40배, 50배, 또는 100배 더 높은 PV 뉴런에서의 선택적 발현을 발생시킨다. 일부 경우에, 핵산 카세트는 AAV 내에 있다. 일부 경우에, AAV는 AAV1, AAV8, AAV9, scAAV1, scAAV8, 또는 scAAV9이다.
한 측면에서, 본 개시내용은 세포를 트랜스진을 포함하는 AAV와 접촉시키는 것을 포함하는, 드라벳 증후군을 치료하는 방법이고, 여기서 트랜스진이 (i) SCN1A, SNC2A, SNC8A, SCN1B, SCN2B, 또는 DNA 결합 단백질, (ii) 이의 기능성 단편, 및 (iii) (i) 또는 (ii)에 대한 서열 동일성이 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%인 서열 중 어느 하나인 방법을 제공한다. 일부 경우에, 서열 동일성은 BLAST를 사용하여 측정된다. 일부 경우에, DNA 결합 단백질은 내인성 유전자를 조정한다. 일부 경우에, DNA 결합 단백질은 전사 조정인자이다. 일부 경우에, 트랜스진은 DNA 결합 단백질, 또는 DNA 절단 도메인 또는 뉴클레아제 도메인이 비활성화된 DNA 절단 단백질 (예를 들어, 뉴클레아제, 제한 효소, 리컴비나제 등), 예를 들어, 뉴클레아제-비활성화 Cas (dCas), 비활성화 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제, 또는 뉴클레아제-비활성화 아연 손가락 단백질의 DNA 결합 도메인을 포함하는 DNA 결합 단백질이다. 일부 경우에, DNA 결합 도메인은 전사 조정 도메인 (예를 들어, 전사 활성화제 또는 억제인자 도메인)에 연결된다. 일부 경우에, 트랜스진은 유전자 편집 단백질, 예를 들어, Cas 단백질, Cas9를 포함한다. 일부 경우에, 내인성 유전자는 SCN1A, SNC2A, SNC8A, SCN1B, 또는 SCN2B이다. 일부 경우에, AAV는 트랜스진에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 PV 뉴런 선택적 조절 요소 또는 하나 이상의 본원에 개시된 조절 요소를 추가로 포함한다. 일부 경우에, 각각의 조절 요소는 독립적으로 (i) 서열식별번호: 1-32의 서열, (ii) 이의 기능성 단편 또는 조합물, 또는 (iii) (i) 또는 (ii)에 대한 서열 동일성이 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%인 서열을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 세포를 트랜스진을 포함하는 AAV와 접촉시키는 것을 포함하는, 알츠하이머병을 치료하는 방법이고, 여기서 트랜스진이 (i) SCN1A, SNC2A, SNC8A, SCN1B, SCN2B, KV3.1, KV3.3, STXBP1, 또는 DNA 결합 단백질; (ii) 이의 기능성 단편; 또는 (iii) (i) 또는 (ii)에 대한 서열 동일성이 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%인 서열 중 어느 하나인 방법을 제공한다. 일부 경우에, 서열 동일성은 BLAST를 사용하여 측정된다. 일부 경우에, DNA 결합 단백질은 내인성 유전자를 조정한다. 일부 경우에, 내인성 유전자는 SCN1A, SNC2A, SNC8A, SCN1B, SCN2B, KV3.1, KV3.3, 또는 STXBP1이다. 일부 경우에, 트랜스진은 전사 조정인자를 포함하는 DNA 결합 단백질이다. 일부 경우에, 트랜스진은 DNA 결합 단백질, 또는 DNA 절단 도메인 또는 뉴클레아제 도메인이 비활성화된 DNA 절단 단백질 (예를 들어, 뉴클레아제, 제한 효소, 리컴비나제 등), 예를 들어, 뉴클레아제-비활성화 Cas (dCas), 비활성화 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제, 또는 뉴클레아제-비활성화 아연 손가락 단백질의 DNA 결합 도메인을 포함하는 DNA 결합 단백질이다. 일부 경우에, DNA 결합 도메인은 전사 조정 도메인 (예를 들어, 전사 활성화제 또는 억제인자 도메인)에 연결된다. 일부 경우에, 트랜스진은 유전자 편집 단백질, 예를 들어, Cas 단백질, Cas9를 포함한다. 일부 경우에, AAV는 트랜스진에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 PV 뉴런 선택적 조절 요소 또는 하나 이상의 본원에 개시된 조절 요소를 추가로 포함한다. 일부 경우에, 각각의 조절 요소는 독립적으로 (i) 서열식별번호: 1-32의 서열, (ii) 이의 기능성 단편 또는 조합물, 또는 (iii) (i) 또는 (ii)에 대한 서열 동일성이 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%인 서열을 포함한다.
참고로 포함됨
본 명세서에서 언급된 모든 간행물, 특허, 및 특허 출원은 각각의 개별적인 간행물, 특허 또는 특허 출원이 참조로 포함되는 것으로 명확하게, 그리고 개별적으로 지시되는 것과 동일한 정도로 본원에 참조로 포함된다.
도면의 간단한 설명
본 발명의 신규 특색이 첨부된 청구범위에서 구체적으로 기재된다. 본 발명의 원리가 활용된 예시적인 실시양태가 기재된 하기의 상세한 설명, 및 하기와 같은 첨부된 도면을 참조로 본 발명의 특색 및 장점에 대한 더 양호한 이해가 수득될 것이다.
도 1은 서열식별번호: 32의 서열을 포함하는 조절 요소에 작동가능하게 연결된 SCN1B 또는 eGFP를 포함하는 재조합 AAVDJ 벡터로의 처리 후의 SCN1A 이종접합 마우스에서의 발작의 빈도 (12시간 간격 당 발작)를 도해한다. 그래프는 평균의 표준 오차를 나타내는 오차 막대와 함께 각각의 날의 평균값을 도해한다.
도 2는 상이한 마우스들에서의 높은 감마파 (50-100 Hz)를 도해한다: 야생형 대조군 (WT), 미처리 트랜스제닉 APP/PS1 마우스 (APP/PS1), 또는 서열식별번호: 32의 서열을 포함하는 조절 요소에 작동가능하게 연결된 SCN1B를 포함하는 rAAV로 처리된 트랜스제닉 APP/PS1 마우스 (APP/PS1 + SCN1B).
도 3a는 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 8의 서열을 포함하는 조절 요소에 작동가능하게 연결된 eGFP 트랜스진을 포함하는 AAV9의 신생아 전신 주사 후의 새끼로부터의 CNS 세포의 면역형광 공동-국소화 검정법을 도해한다. CAG에 작동가능하게 연결된 eGFP 트랜스진을 포함하는 AAV9가 대조군으로서 사용되었다. 하부 열의 영상은 eGFP+ 세포를 도해한다. 중간열의 영상은 항-PV 항체로 염색된 PV+ 세포를 도해한다. 상부 열의 영상 (병합)은 PV+, eGFP+ 형광 (백색 또는 담회색 세포로서 제시되는 대표적인 eGFP+ 및 PV+ 세포가 화살촉에 의해 지시됨) 및 DAPI+의 오버레이를 도해한다.
도 3b는 도 3a에서 도해된 면역형광 공동-국소화 연구의 정량을 도해하고, 여기에서 PV 세포의 선택적 발현은 면역형광 공동-국소화 검정법에 의해 측정 시, CAG 대조군에 비교된 PV+이기도 한 eGFP+ 세포의 백분율로서 표현된다.
도 4a는 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 8의 서열을 포함하는 조절 요소에 작동가능하게 연결된 eGFP 트랜스진을 포함하는 AAV9의 전신 주사 후의 성체 마우스로부터의 CNS 세포의 면역형광 공동-국소화 검정법을 도해한다. EF1α에 작동가능하게 연결된 eGFP 트랜스진을 포함하는 AAV9가 대조군으로서 사용되었다. 하부 열의 영상은 eGFP+ 세포를 도해한다. 중간열의 영상은 항-PV 항체로 염색된 PV+ 세포를 도해한다. 상부 열의 영상 (병합)은 PV+, eGFP+ 형광 (대표적인 eGFP+ 및 PV+ 세포, 또는 백색 또는 담회색 세포가 화살촉에 의해 지시됨) 및 DAPI+의 오버레이를 도해한다.
도 4b는 도 4a에서 도해된 면역형광 공동-국소화 연구의 정량을 도해하고, 여기에서 PV 세포의 선택적 발현은 면역형광 공동-국소화 검정법에 의해 측정 시, EF1α 대조군에 비교된 PV+이기도 한 eGFP+ 세포의 백분율로서 표현된다.
도 5a-5f는 서열식별번호: 2-22의 서열을 포함하는 조절 요소에 작동가능하게 연결된 eGFP 트랜스진을 포함하는 AAVDJ의 직접적인 CNS 주사 후의 성체 마우스로부터의 CNS 세포의 면역형광 공동-국소화 검정법을 도해한다. 하부 열의 영상은 eGFP+ 세포를 도해한다. 중간열의 영상은 항-PV 항체로 염색된 PV 세포를 도해한다. 상부 열의 영상 (병합)은 PV+, eGFP+ 형광 (대표적인 eGFP+ 및 PV+ 세포, 또는 백색 또는 담회색 세포가 화살촉에 의해 지시됨) 및 DAPI+의 오버레이를 도해한다. 도 5a는 eGFP에 작동가능하게 연결된 서열식별번호: 2, 서열식별번호: 3, 서열식별번호: 4, 및 서열식별번호: 5 중 하나를 포함하는 AAVDJ로 수행된 면역형광 공동-국소화 검정법을 도해한다. 도 5b는 eGFP에 작동가능하게 연결된 서열식별번호: 6, 서열식별번호: 7, 및 서열식별번호: 9 중 하나를 포함하는 AAVDJ로 수행된 면역형광 공동-국소화 검정법을 도해한다. 도 5c는 eGFP에 작동가능하게 연결된 서열식별번호: 10, 서열식별번호: 11, 서열식별번호: 12, 및 서열식별번호: 13 중 하나를 포함하는 AAVDJ로 수행된 면역형광 공동-국소화 검정법을 도해한다. 도 5d는 eGFP에 작동가능하게 연결된 서열식별번호: 14, 서열식별번호: 15, 서열식별번호: 16, 및 서열식별번호: 17 중 하나를 포함하는 AAVDJ로 수행된 면역형광 공동-국소화 검정법을 도해한다. 도 5e는 eGFP에 작동가능하게 연결된 서열식별번호: 18, 서열식별번호: 19, 서열식별번호: 20, 및 서열식별번호: 21 중 하나를 포함하는 AAVDJ로 수행된 면역형광 공동-국소화 검정법을 도해한다. 도 5f는 eGFP에 작동가능하게 연결된 서열식별번호: 22 또는 서열식별번호: 34를 포함하는 AAVDJ로 수행된 면역형광 공동-국소화 검정법을 도해하고, 여기서 서열식별번호: 34는 이전에 특성화된 비-선택적 조절 요소이며, 비교용 대조군으로서 사용되었다.
도 6은 도 5a-5f에서 도해된 면역형광 공동-국소화 연구의 정량을 도해하고, 여기에서 PV 세포의 선택적 발현은 면역형광 공동-국소화 검정법에 의해 측정 시, 서열식별번호: 34에 비교된 PV+이기도 한 eGFP+ 세포의 백분율로서 표현된다.
도 7은 본 개시내용의 RE, 예를 들어, 인핸서, 프로모터, 및 안정성 요소를 함유하는 발현 카세트의 예의 개략도를 도해한다. RE는 플라스미드, 벡터, 또는 바이러스 벡터일 수 있는 발현 카세트 내에서 트랜스진의 상류 및/또는 하류에 위치할 수 있다.
개시내용의 상세한 설명
본 개시내용은 중추신경계 (CNS)와 연관된 질환 또는 병태, 예를 들어, 드라벳 증후군, 알츠하이머병, 간질, 및/또는 발작을 치료하기 위한 조성물 및 이같은 조성물을 유전자 요법에서 사용하는 방법을 구상한다.
유전자 요법은 세포에서 치료 효과를 부여하기 위해 유전자 또는 특정 핵산 서열, 예컨대 발현 카세트를 교체하거나, 변형시키거나, 결실시키거나 또는 부가할 수 있다. 일부 경우에, 유전자 요법은 치료 효과를 일으키거나 발생시키는 발현 카세트를 세포 내로 전달하는데 사용된다. 일부 경우에, 발현 카세트를 포함하는 바이러스 벡터를 포함하는 바이러스, 예컨대 AAV가 트랜스진을 세포 내로 전달하는데 사용될 수 있다. 발현 카세트는 세포에서 발현되는 경우 치료 효과를 제공하는 트랜스진을 함유할 수 있다.
유전자 요법에서의 난제 중 하나는 유전자 발현을 발생시키거나 표적화하기 위해 트랜스진이 적합한 관심 세포 유형 또는 표적 세포 유형에서 발현되는 것을 확실하게 하는 것이다. 유전자 요법을 표적화하는 전통적인 방법은 종종 전달 방법 및/또는 비히클 (예를 들어, 사용된 바이러스 또는 바이러스의 캡시드 서열을 변화시키는 것)에 의존하였다. 하나 이상의 비-표적 세포 유형에 비해 표적 세포 유형에서의 발현 카세트의 표적화 또는 선택적 발현에 더하여, 이러한 분야에서의 또 다른 난제는, 특히 유전자가 대형인 경우에, 치료 효과를 발휘하기 위해 표적 세포 유형 또는 조직에서 유전자 발현을 증가시키는 것이다.
본 개시내용은 임의의 트랜스진에 작동가능하게 연결되어 CNS, 예를 들어, PV 뉴런에서 트랜스진 발현의 선택성을 증가시키거나 개선할 수 있는, 비-코딩 뉴클레오티드 서열인 복수의 조절 요소를 제공한다. 하나 이상의 본원에 개시된 조절 요소를 사용하여 유전자 발현의 선택성을 증가시킴으로써, 유전자 요법의 효능을 개선할 수 있고/있거나, 치료 효과를 발생시키는데 필요한 유효 용량을 감소시킬 수 있고/있거나, 유해 효과 또는 표적을 벗어나는 효과를 최소화할 수 있고/있거나, 환자 안전 및/또는 내성을 증가시킬 수 있다.
한 측면에서, 세포에서의 유전자 발현을 조정하기 위해, 예컨대 트랜스진의 발현을 하나 이상의 비-표적 세포 유형 또는 조직 (예를 들어, 비-PV CNS 세포-유형)에 비해 표적 세포 유형 또는 조직 (예를 들어, PV 세포) 내에 표적화하기 위해 하나 이상의 조절 요소가 발현 카세트 내의 임의의 트랜스진에 작동가능하게 연결될 수 있다. 일부 경우에, 트랜스진의 발현을 표적 세포 유형 또는 조직 내에 표적화하는 것은 표적 세포 유형 또는 조직에서의 유전자 발현 증가를 포함한다. 트랜스진에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 조절 요소는 발현 카세트의 일부일 수 있고, 이는 선형 또는 원형 구축물, 플라스미드, 벡터, 바이러스 벡터, 예를 들어, 아데노-연관 바이러스 (AAV)의 벡터일 수 있다. 이같은 발현 카세트는 유전자 요법 또는 대상체 (예를 들어, 인간, 환자, 또는 포유동물) 내로의 전달을 위해 개조될 수 있다. 일부 경우에, 하나 이상의 조절 요소를 유전자에 작동가능하게 연결시키는 것은 CNS 내의 표적 조직 또는 세포 유형, 예컨대 파르브알부민 (PV) 뉴런에서의 유전자의 표적화된 발현을 발생시킨다. 일부 경우에, 하나 이상의 조절 요소 (예를 들어, 서열식별번호: 1-32, 또는 이의 기능성 단편 또는 조합물, 또는 이에 대한 서열 동일성이 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%인 서열)는 CNS 내의 표적 조직 또는 세포 유형, 예컨대 PV 뉴런에서의 유전자 발현의 선택성을 증가시킨다. 일부 경우에, 유전자 요법은 하나 이상의 본원에 개시된 조절 요소를 포함하고, 여기서 조절 요소는 트랜스진에 작동가능하게 연결되고, PV 뉴런에서의 트랜스진의 선택적 발현을 구동시킨다.
일부 경우에, PV 뉴런에서의 유전자의 선택적 발현은 내인성 유전자에서의 반수체기능부전 및/또는 유전 결손과 연관된 질환 또는 병태를 치료하는데 사용되고, 여기서 유전 결손은 유전자의 돌연변이 또는 유전자의 조절곤란일 수 있다. 이같은 유전 결손은 유전자 산물의 수준 감소 및/또는 기능 및/또는 활성이 손상된 유전자 산물을 발생시킬 수 있다. 일부 경우에, 발현 카세트는 유전자, 이의 서브유닛, 변이체 또는 기능성 단편을 포함하고, 여기서 발현 카세트로부터의 유전자 발현은 내인성 유전자의 유전 결손, 손상된 기능 및/또는 활성, 및/또는 조절곤란과 연관된 질환 또는 병태를 치료하는데 사용된다. 일부 경우에, 질환 또는 병태는 드라벳 증후군, 알츠하이머병, 간질, 신경변성, 타우병증, 뉴런 과소흥분성 및/또는 발작이다.
일부 경우에, 트랜스진은 이온 채널 또는 신경전달물질 조절인자, DNA 결합 단백질, 또는 이의 서브유닛, 변이체, 또는 기능성 단편이다. 일부 경우에, 트랜스진은 나트륨 이온 채널 알파 서브유닛, 나트륨 이온 채널 베타 서브유닛, 또는 이의 변이체 또는 기능성 단편이다. 일부 경우에, 트랜스진은 칼륨 이온 채널 또는 이의 서브유닛이다. 일부 경우에, 트랜스진은 SCN1A, SNC2A, SNC8A, SCN1B, SCN2B, KV3.1, KV3.2, KV3.3, STXBP1, DNA 결합 단백질 (예를 들어, 내인성 유전자의 발현을 조정하는 DNA 결합 단백질), 또는 이의 변이체 또는 기능성 단편이다. 일부 경우에, 트랜스진은 SCN1A, SNC2A, SNC8A, SCN1B, SCN2B, KV3.1, KV3.2, KV3.3, STXBP1, DNA 결합 단백질, 또는 이의 변이체 또는 기능성 단편 중 어느 하나에 대한 서열 동일성이 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%인 서열을 포함한다. 일부 경우에, 트랜스진은 내인성 유전자의 발현을 조정하는 DNA 결합 단백질, 예컨대 SCN1A, SNC2A, SNC8A, SCN1B, SCN2B, KV3.1, KV3.2, KV3.3, 및 STXBP1 중 어느 하나이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 문맥 상 명확하게 달리 지시되지 않는 한, 단수 형태는 복수 형태를 또한 포함하도록 의도된다. 또한, 용어 "~을 포함하는", "~을 포함한다", "~을 갖는", "~을 갖는다", "~이 있는" 또는 이의 변형이 상세한 설명 및/또는 청구범위에서 사용되는 한, 이같은 용어들은 용어 "~을 포함하는"과 유사한 방식으로 포괄적인 것으로 의도된다.
용어 "약" 또는 "대략적으로"는 관련 분야의 통상의 기술자에 의해 결정된 바와 같은 특정 값에 대한 허용가능한 오차 범위 내인 것을 의미하고, 이는 어떻게 값이 측정 또는 결정되는지, 즉 측정 시스템의 한계에 부분적으로 좌우될 것이다. 예를 들어, "약"은 관련 분야의 관례에 따른 1 이상의 표준 편차 내인 것을 의미할 수 있다. 대안적으로, "약"은 소정의 값의 20% 이하, 15% 이하, 10% 이하, 5% 이하, 또는 1% 이하의 범위를 의미할 수 있다.
용어 "결정하는", "측정하는", "평가하는(evaluating)", "평가하는(assessing)", "검정하는", "분석하는" 및 이들의 문법적 등가물은 임의 형태의 측정을 지칭하도록 본원에서 상호교환가능하게 사용될 수 있고, 요소가 존재하는지 또는 그렇지 않은지를 결정하는 것 (예를 들어, 검출)을 포함한다. 이러한 용어들은 정량적 및/또는 정성적 결정 양쪽 모두를 포함할 수 있다. 평가는 상대적 또는 절대적일 수 있다.
용어 "발현"은 핵산 서열 또는 폴리뉴클레오티드가 DNA 주형으로부터 (예컨대 mRNA 또는 기타 RNA 전사체로) 전사되는 프로세스 및/또는 전사된 mRNA가 후속하여 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질로 번역되는 프로세스를 지칭한다. 전사체 및 코딩된 폴리펩티드는 총괄적으로 "유전자 산물"로 지칭될 수 있다. 폴리뉴클레오티드가 게놈 DNA로부터 유래되는 경우, 진핵생물 세포에서 발현은 mRNA의 스플라이싱을 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "작동가능하게 연결된", "작동가능한 연결", "작동적으로 연결된" 또는 이의 문법적 등가물은 요소들이 이들이 예상되는 방식으로 작동하도록 허용하는 관계에 있는, 유전 요소, 예를 들어, 프로모터, 인핸서, 폴리아데닐화 서열 등의 병치를 지칭한다. 예를 들어, 프로모터 및/또는 인핸서 서열을 포함할 수 있는 조절 요소가 코딩 서열의 전사를 개시하는 것을 돕는 경우에 조절 요소가 코딩 영역에 작동적으로 연결된다. 이러한 기능적 관계가 유지되는 한 조절 요소와 코딩 영역 사이에 개재 잔기가 있을 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같은 "벡터"는 폴리뉴클레오티드를 포함하거나 이와 회합되고 이러한 폴리뉴클레오티드를 세포에 전달하는 것을 매개하는데 사용될 수 있는 거대분자 또는 거대분자들의 연합을 지칭한다. 벡터의 예는 플라스미드, 바이러스 벡터, 리포솜, 및 기타 유전자 전달 비히클을 포함한다. 일반적으로 벡터는 표적에서의 유전자의 발현을 용이하게 하기 위해 유전자에 작동적으로 연결된 유전 요소, 예를 들어, 조절 요소를 포함한다. 조절 요소 및 발현을 위해 이들이 작동가능하게 연결된 유전자 또는 유전자들의 조합이 "발현 카세트"로서 지칭된다.
용어 "AAV"는 아데노-연관 바이러스의 약어이고, 바이러스 자체 또는 이의 유도체를 지칭하는데 사용될 수 있다. 이러한 용어는 다르게 요구되는 경우를 제외한 모든 혈청형, 아유형, 및 천연 발생 및 재조합 형태 양쪽 모두를 포괄한다. 약어 "rAAV"는 재조합 아데노-연관 바이러스를 지칭하고, 재조합 AAV 벡터 ("rAAV 벡터")로도 지칭된다. 용어 "AAV"는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, rh10, 및 이의 하이브리드, 조류 AAV, 소 AAV, 개 AAV, 말 AAV, 영장류 AAV, 비-영장류 AAV, 및 양 AAV를 포함한다. AAV의 다양한 혈청형의 게놈 서열, 뿐만 아니라 천연 말단 반복물 (TR), Rep 단백질, 및 캡시드 서브유닛의 서열이 관련 분야에 공지되어 있다. 이같은 서열들은 문헌에서 또는 공공 데이터베이스 예컨대 진뱅크(GenBank)에서 확인될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같은 "rAAV 벡터"는 AAV 기원이 아닌 폴리뉴클레오티드 서열 (즉, AAV에 대해 이종성인 폴리뉴클레오티드), 전형적으로는 세포의 유전적 형질전환을 위한 관심 서열을 포함하는 AAV 벡터를 지칭한다. 일반적으로, 적어도 1개, 일반적으로는 2개의 AAV 역위 말단 반복 서열 (ITR)이 이종성 폴리뉴클레오티드에 플랭킹된다. 용어 rAAV 벡터는 rAAV 벡터 입자 및 rAAV 벡터 플라스미드 양쪽 모두를 포괄한다. rAAV 벡터는 단일-가닥 (ssAAV) 또는 자가-상보적 (scAAV)일 수 있다. "AAV 바이러스" 또는 "AAV 바이러스 입자" 또는 "rAAV 벡터 입자"는 적어도 하나의 AAV 캡시드 단백질 및 캡시드화 폴리뉴클레오티드 rAAV 벡터로 구성된 바이러스 입자를 지칭한다. 입자가 이종성 폴리뉴클레오티드 (즉, 야생형 AAV 게놈 이외의 폴리뉴클레오티드 예컨대 포유동물 세포에 전달될 트랜스진)를 포함하는 경우, 전형적으로 이는 "rAAV 벡터 입자" 또는 간단히 "rAAV 벡터"로 지칭된다. 따라서, rAAV 입자의 생산은 rAAV 벡터의 생산을 필수적으로 포함하는데, 이같은 벡터가 rAAV 입자 내에 함유되기 때문이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "치료한다", "치료", "요법" 등은 완화시키는 것, 진행을 지연시키거나 느리게 하는 것, 효과 또는 증상을 감소시키는 것, 발병을 방지하는 것, 억제하는 것, 질환 또는 장애의 발병을 호전시키는 것, 질환, 장애 또는 의학적 병태와 관련된 이롭거나 원하는 결과, 예컨대 치료적 이익 및/또는 예방적 이익을 수득하는 것을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 원하는 약리적 및/또는 생리학적 효과를 수득하는 것을 지칭한다. 본원에서 사용된 바와 같은 "치료"는 포유동물, 특히 인간에서의 질환의 임의의 치료를 포괄하고, (a) 질환에 걸리기 쉬울 수 있거나 또는 질환에 걸릴 위험이 있을 수 있지만 아직 질환에 걸린 것으로 진단되지 않은 대상체에서 질환이 발생하는 것을 예방하는 것; (b) 질환을 억제하는 것, 즉, 이의 발달을 저지하는 것; 및 (c) 질환을 경감시키는 것, 즉 질환의 퇴행을 야기하는 것을 포함한다. 치료적 이익은 치료 중인 기저 장애의 근절 또는 호전을 포함한다. 또한, 기저 장애가 여전히 대상체를 괴롭힐 수 있음에도 불구하고, 개선이 대상체에서 관찰되도록 기저 장애와 연관된 생리학적 증상 중 하나 이상의 근절 또는 호전으로 치료적 이익이 달성된다. 일부 경우에, 예방적 이익을 위해, 특정 질환이 발달될 위험이 있는 대상체에게, 또는 질환 진단이 이루어지지 않았을 수 있더라도 이러한 질환의 생리학적 증상 중 하나 이상을 보고하는 대상체에게 조성물이 투여된다. 본 개시내용의 방법은 임의의 포유동물과 함께 사용될 수 있다. 일부 경우에, 치료는 증상의 감소 또는 중단 (예를 들어, 발작 빈도 또는 기간의 감소)을 발생시킬 수 있다. 예방적 효과는 질환 또는 병태의 출현을 지연시키거나 제거하는 것, 질환 또는 병태의 증상의 발병을 지연시키거나 제거하는 것, 질환 또는 병태의 진행을 느리게 하거나, 정지시키거나 역전시키는 것, 또는 이의 임의의 조합을 포함한다.
용어 "유효량" 또는 "치료적 유효량"은 하기 정의된 바와 같은, 질환 치료를 포함하지만 이에 제한되지 않는 의도된 용도에 영향을 미치는데 충분한 본원에 기술된 조성물의 양을 지칭한다. 치료적 유효량은 의도된 치료 용도 (생체내), 또는 치료되는 대상체 및 질환 병태, 예를 들어, 대상체의 체중 및 연령, 질환 병태의 중증도, 투여 방식 등에 따라 변할 수 있고, 이는 관련 분야의 통상적인 기술자에 의해 쉽게 결정될 수 있다. 이러한 용어는 표적 세포에서 특정 반응을 유도할 용량에 또한 적용된다. 구체적인 용량은 선택된 특정 조성물, 따를 투약 요법, 다른 화합물과 조합되어 투여되는지 여부, 투여 시기, 투여되는 조직, 및 이를 보유하는 물리적 전달 시스템에 따라 변할 것이다.
뉴클레오티드 또는 펩티드 서열의 "단편"은 "전장" 서열인 것으로 여겨지는 것보다 더 적은 서열을 지칭하도록 의도된다.
분자의 "변이체"는 이같은 서열의 대립유전자 변형물, 즉, 전체 분자 또는 이의 단편과 구조 및 생물학적 활성 면에서 실질적으로 유사한 서열을 지칭한다.
용어 "기능성 단편"은 분자의 "단편, "변이체", "유사체" 또는 "화학적 유도체"를 포함하도록 의도된다.
DNA 또는 단백질 서열의 "기능성 단편"은 서열의 생물학적으로 활성인 단편을 적어도 보유하고, 이는 전장 DNA 또는 단백질 서열의 생물학적 활성 (기능적 또는 구조적)과 실질적으로 유사한 생물학적 활성을 유지하는 단편을 지칭한다. DNA 서열의 생물학적 활성은 전장 서열에 기인하는 것으로 공지된 방식으로 발현에 영향을 미치는 이의 능력일 수 있다. 예를 들어, 조절 요소의 기능성 단편은 전장 RE로서 전사에 영향을 미치는 능력을 유지할 것이다.
용어 "대상체" 및 "개체"는 척추동물, 바람직하게는 포유동물, 더욱 바람직하게는 인간을 지칭하도록 본원에서 상호교환가능하게 사용된다. "대상체"는 동물, 예컨대 포유동물, 예를 들어 인간을 지칭한다. 본원에 기술된 방법은 인간 치료학, 척추동물 용도, 및/또는 질환 또는 병태의 동물 모델에서의 임상전 연구에서 유용할 수 있다. 일부 경우에 대상체는 포유동물이고, 일부 경우에 대상체는 인간이다.
용어 "생체내"는 대상체의 신체 내에서 일어나는 이벤트를 지칭한다.
용어 "시험관내"는 대상체의 신체 밖에서 일어나는 이벤트를 지칭한다. 예를 들어, 시험관내 검정법은 대상체의 외부에서 실행되는 임의의 검정법을 포함한다. 시험관내 검정법은 살아 있는 세포 또는 죽은 세포가 이용되는 세포-기반 검정법을 포함한다. 시험관내 검정법은 무손상 세포가 사용되지 않는 무세포 검정법을 또한 포함한다.
서열 비교, 예컨대 신원, 돌연변이, 또는 기준 서열의 하나 이상의 특정 위치와 관련하여 테스트 서열의 하나 이상의 위치가 위치하는 장소를 평가하기 위한 목적의 비교가 니들만-분쉬(Needleman-Wunsch) 알고리즘 (예를 들어, 임의적으로 디폴트 설정과 함께, www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/에서 입수가능한 EMBOSS 니들(Needle) 정렬기를 참조한다), BLAST 알고리즘 (예를 들어, 임의적으로 디폴트 설정과 함께, blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi에서 입수가능한 BLAST 정렬 도구를 참조한다), 및 스미스-워터맨(Smith-Waterman) 알고리즘 (예를 들어, 임의적으로 디폴트 설정과 함께, www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_water/에서 입수가능한 EMBOSS 워터(Water) 정렬기를 참조한다)을 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 적절한 정렬 알고리즘에 의해 수행될 수 있다. 디폴트 파라미터를 포함하여, 선택된 알고리즘의 임의의 적절한 파라미터를 사용하여 최적의 정렬을 평가할 수 있다.
일반적으로, 상호교환가능하게 사용될 수 있는 "서열 동일성" 또는 "서열 상동성"은 각각 2개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열의 정확한 뉴클레오티드-대-뉴클레오티드 또는 아미노산-대-아미노산 상응성을 지칭한다. 전형적으로, 서열 동일성을 결정하기 위한 기술은 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열을 결정하고/하거나 이에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 결정하고, 이러한 서열을 제2의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열과 비교하는 것을 포함한다. 2개 이상의 서열 (폴리뉴클레오티드 또는 아미노산)이 "퍼센트 상동성"으로도 지칭되는 이들의 "퍼센트 동일성"을 결정함으로써 비교될 수 있다. 더 긴 분자 (예를 들어, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드) 내의 서열일 수 있는 기준 서열 (예를 들어, 핵산 또는 아미노산 서열)에 대한 퍼센트 동일성을 2개의 최적으로 정렬된 서열 사이의 정확한 매칭의 개수를 기준 서열의 길이로 나누고 100을 곱함으로써 계산할 수 있다. 예를 들어, 국립보건원(National Institutes of Health)으로부터 입수가능한 버전 2.2.9를 포함하는 고급 BLAST 컴퓨터 프로그램을 사용하여 서열 정보를 비교함으로써, 퍼센트 동일성이 또한 결정될 수 있다. BLAST 프로그램은 문헌 [Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268 (1990)]의 정렬 방법을 기초로 하고, 문헌 [Altschul, et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)]; [Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877 (1993)]; 및 [Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997)]에 논의된 바와 같다. 간략하게, BLAST 프로그램은 동일한 정렬된 기호 (즉, 뉴클레오티드 또는 아미노산)의 개수를 2개의 서열 중 더 짧은 것 내의 기호의 총 개수로 나눈 것으로 동일성을 정의한다. 이러한 프로그램은 비교되는 서열들의 전체 길이에 걸쳐 퍼센트 동일성을 결정하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, blastp 프로그램과 함께, 짧은 질의 서열로의 검색을 최적화하기 위해 디폴트 파라미터가 제공된다. 이러한 프로그램은 문헌 [Wootton and Federhen, Computers and Chemistry 17: 149-163 (1993)]의 SEG 프로그램에 의해 결정된 바와 같은 질의 서열의 분절을 차폐하기 위해 SEG 필터를 사용하는 것을 또한 허용한다. 원하는 정도의 서열 동일성의 범위는 대략적으로 80% 내지 100% 및 이들 사이의 정수값이다. 전형적으로, 개시된 서열과 청구된 서열 사이의 퍼센트 동일성은 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%이다. 일반적으로, 정확한 매칭은 기준 서열의 길이에 걸친 100% 동일성을 나타낸다. 일부 경우에, 퍼센트 서열 동일성에 대한 언급은 BLAST (기본 국소 정렬 검색 도구(Basic Local Alignment Search Tool))를 사용하여 측정된 바와 같은 서열 동일성을 지칭한다. 다른 경우에, ClustalW이 다중 서열 정렬에 사용될 수 있다.
달리 지시되지 않는 한, 본원에서의 모든 용어는 관련 분야의 기술자에 대한 것과 동일한 의미를 갖고, 본 발명의 실행은 관련 분야의 기술자의 지식 내에 있는, 분자생물학, 미생물학 및 재조합 DNA 기술의 통상적인 기술을 사용할 것이다.
조절 요소
조절 요소는 유전자의 발현에 영향을 미칠 수 있고/있거나 (예를 들어, 이를 증가 또는 감소시킬 수 있고/있거나), 특정한 관심 조직 또는 세포 유형에서 유전자 (예를 들어, 리포터 유전자 예컨대 eGFP, 트랜스진, 또는 치료 유전자)의 선택적 발현을 부여할 수 있는 핵산 서열 또는 유전 요소이다. 일부 경우에, 조절 요소는 트랜스진, 인트론, 프로모터, 인핸서, UTR, 인슐레이터, 억제인자, 역위 말단 반복 (ITR) 서열, 긴 말단 반복 서열 (LTR), 안정성 요소, 번역후 반응 요소, 또는 폴리A 서열, 또는 이의 조합물일 수 있다. 일부 경우에, 조절 요소는 프로모터 또는 인핸서, 또는 이의 조합물이다. 일부 경우에, 조절 요소는 인간 서열로부터 유래된다.
일부 경우에, 관심 세포 유형은 PV 뉴런이다. 조절 요소는 DNA 및/또는 RNA 수준에서 기능할 수 있다. 조절 요소는 관심 세포 유형에서 유전자 발현 선택성을 조정하는 기능을 할 수 있다. 조절 요소는 유전자 발현의 전사 단계, 전사-후 단계, 또는 번역 단계에서 유전자 발현을 조정하는 기능을 할 수 있다. 조절 요소는 프로모터, 인핸서, 억제인자, 사일런서, 및 인슐레이터 서열을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. RNA 수준에서, 조절은 번역 (예를 들어, 번역을 위해 mRNA를 안정화시키는 안정성 요소), RNA 절단, RNA 스플라이싱, 및/또는 전사 종결의 수준에서 일어날 수 있다. 일부 경우에, 조절 요소는 관심 세포 유형에서 유전자 발현 선택성을 증가시키는 전사 인자를 코딩 영역으로 동원할 수 있다. 일부 경우에, 조절 요소는 RNA 전사체가 생산되는 속도를 증가시킬 수 있고/있거나, 생산된 RNA의 안정성을 증가시킬 수 있고/있거나, RNA 전사체로부터 단백질이 합성되는 속도를 증가시킬 수 있다. 일부 경우에, 조절 요소는 RNA 분해를 방지할 수 있고/있거나 이의 안정성을 증가시켜 단백질 합성을 용이하게 할 수 있다. 일부 경우에, 조절 요소는 표적을 벗어나는 세포 유형에서 전사 및/또는 번역 프로세스를 억제한다. 일부 경우에, 표적을 벗어나는 세포 유형은 흥분 뉴런, 비-PV CNS 세포 유형, 및 비-뉴런 CNS 세포 유형을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
DNAase 과민성, ATAC-Seq, 및 ChIP-Seq를 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 검정법을 사용하여 추정 비-코딩 조절 요소 (RE)를 확인할 수 있다. 각각의 이러한 검정법에서의 효소 반응은 조절 요소의 전조가 되는 것으로 생각되는 상태인 개방된/접근가능한 염색질 상태를 우선적으로 표적화한다. 세포-유형 선택적 조절 요소를 발견하기 위해, 관심 대상인 표적 세포 유형 (예를 들어, 파르브알부민 뉴런)에 대한 개방된 염색질 서열에 대해 검정할 수 있고, 이를 비-표적 세포 유형 (예를 들어, 흥분 뉴런)에 대한 개방된 염색질 서열에 비교할 수 있다. 세포-유형 선택적 유전자에 대한 근접성, 종 보존, 및/또는 서열 모티프, 예컨대 전사 인자 결합 부위를 포함하여, 표적 선택을 추가로 정련하기 위해 추가적인 필터가 적용될 수 있다. 표적 세포 유형에서 독특하게 확인되는 DNA 서열을 합성하여 발현 벡터 내로 클로닝할 수 있다. 공지된 세포-유형 선택적 단백질에 대한 공동-국소화를 정량하기 위해 면역조직화학 방법을 사용하여 조절 요소의 선택성을 결정할 수 있다.
예를 들어, 세포-유형 선택적 조절 요소를 단리하는 한 방법은 관심 조직 또는 세포 유형을 단리하는 친화도 정제 방법을 사용함으로써 (예를 들어, PV 뉴런을 단리하기 위해 항-PV 항체에 코팅된 비드를 사용함으로써) 달성될 수 있는, 동물 모델로부터의 관심 대상인 뇌 조직 또는 세포 유형으로부터 핵을 단리하는 단계, 고-처리량 천연 프라이밍 및 DNA 합성을 사용하여 핵 내의 개방된 염색질 영역으로부터의 서열의 풀을 생성시키는 단계, 서열 풀을 시퀀싱하여 관심 조직 또는 세포 유형에서 유전자 발현을 구동시키는 추정 서열을 확인하는 단계, 및 시험관 내의 세포주에서 및/또는 동물 모델에서 리포터 시스템에서 선택적 발현을 확인하는 단계를 포함한다.
관심 조직 또는 세포 유형에서 선택적인 후보 조절 요소를 확인하는 또 다른 방법은 관심 조직 또는 세포 유형을 수확하기 위해 R26-CAG-LSL-Sun1-sfGFP-Myc 녹인(knockin) 마우스를 사용하는 단계, 친화도 정제를 사용하여 이러한 계통의 마우스 신피질로부터 GFP+/Myc+ 핵을 단리하는 단계, 예를 들어, 항-GFP 또는 항-Myc 항체 및 단백질 G-코팅 자기 비드를 사용하여 신피질로부터 핵을 단리하는 단계를 포함한다. 정제된 핵 또는 전체 신피질 핵으로부터의 핵 RNA를 cDNA로 전환시킬 수 있고, 누젠 오베이션(Nugen Ovation) RNA-seq 시스템 V2 (누젠 7102)로 증폭시킬 수 있으며, 그 후 일루미나(Illumina) HiSeq 2500을 사용하여 시퀀싱할 수 있다. 정제된 핵으로부터의 게놈 DNA를 단편화할 수 있고, 메틸C-seq 라이브러리를 제조하는데 사용할 수 있으며, 이를 일루미나 HiSeq 2000을 사용하여 시퀀싱할 수 있다. ATAC-seq 라이브러리를 생성시키기 위해, 비드에 결합된 핵을 Tn5 트랜스포사제 (일루미나 FC-121-1030)를 사용하여 전치시킨다. 9-12 사이클의 PCR 증폭 후, 라이브러리를 일루미나 HiSeq 2500을 사용하여 시퀀싱한다. ChIP-seq 라이브러리를 생성시키기 위해, 마이크로코쿠스 뉴클레아제를 사용하여 흥분 뉴런 핵을 모노뉴클레오솜으로 소화시킨 후, 염색질의 염 추출, 및 천연 ChIP 및 라이브러리 구축이 이어질 수 있고, 이를 일루미나 HiSeq 2500을 사용하여 시퀀싱할 수 있다. 이러한 라이브러리들의 시퀀싱 후, 예를 들어, CG-풍부 영역 내의 세포-유형-특이적 과소메틸화에서의 상관관계, 히스톤 변형, 전사 인자 결합 부위, 및 고도로 발현된 전사 인자와 연관된 패턴을 확인하기 위해 서열을 지도화한다. 상기 기술된 다중 검정법 및/또는 라이브러리로부터의 중첩 특색 및 상관관계는 신피질로부터 단리된 세포에서의 선택적 발현 및/또는 높은 발현과 연관된 잠재적인 조절 요소로서 이같은 게놈 영역 내의 후보 서열을 확인하기 위한 증거를 제공한다. 예를 들어, 메틸C-seq 라이브러리에서 검출된 과소메틸화, ChIP 검정법, 및 동일한 영역에서의 전사 인자 결합 모티프의 강화 사이의 강한 중첩을 특징으로 하는 게놈 영역은 이러한 게놈 영역이 단리된 조직 또는 세포 유형에 대해 선택적인 추정 조절 요소의 서열을 함유한다는 것을 나타내는 수렴성 데이터를 제공한다. 또 다른 예로서, 후보 PV 뉴런 선택적 조절 요소를 확인하기 위해, 상기 기술된 다중 시퀀싱 검정법에서 활성인 것으로 확인된 게놈 서열, 예를 들어, ATAC-seq 검정법에서 활성이고 (개방된 염색질의 영역에 상응함), RNA-seq에서 활성이며 (영역에서의 활성 유전자 발현 및 낮은 DNA 메틸화 패턴을 나타냄), 메틸C-seq 검정법 (관심 세포 유형으로부터 단일-염기 해상 메틸옴(methylome) 지도를 생성시킴)에서 활성인 것으로 확인된 게놈 영역이 PV 세포-선택적 조절 요소일 가능성이 높도록, PV 뉴런을 단리하고, 단리된 PV 세포로부터 핵을 정제할 수 있다.
후보 게놈 영역이 관심 세포 유형에서 선택적으로 활성인 것으로 확인되었으면, 이러한 영역 내의 서열을 PCR 방법을 사용하여 생성시키고, 추가적인 시험관내 및/또는 생체내 검정법에서 테스트하여, 서열의 조직 또는 세포 유형 선택성을 검증할 수 있다. 이같은 검증 검정법은 항체 또는 임의의 검출가능한 마커가 관심 세포 유형을 표지하는데 사용되고, 제2의 검출가능한 마커, 예를 들어, 형광 트랜스진이 추정 조절 요소에 작동가능하게 연결된 면역조직화학 공동-국소화 검정법을 포함한다. 이같은 요소를 포함하는 발현 카세트가 시험관 내에서 및/또는 생체 내에서 세포 내로 전달된다. 관심 세포 유형 (이의 표지된 마커, 예를 들어, 항-PV 항체로부터의 검출가능한 신호 또는 형광에 의해 측정됨)과 조절 요소에 작동가능하게 연결된 트랜스진 (예를 들어, eGFP 또는 RFP)의 발현에 상응하는 제2의 검출가능한 마커 사이의 중첩을 측정함으로써 하나 이상의 추정 조절 요소에 의해 구동되는 선택적 발현을 검증할 수 있다. 관찰된 중첩의 양이 조절 요소가 대조군, 예컨대 CAG, EF1α, 구성적 프로모터 (예를 들어, SV40, CMV, UBC, PGK, 및 CBA), 비-선택적 조절 요소, 또는 이전에 특성화된 비-선택적 조절 요소로 교체된 경우에 관찰된 중첩보다 더 크면 양쪽의 검출가능한 마커로부터의 신호에서의 중첩이 표지된 세포 유형에서의 세포-유형 선택성을 나타낸다. 검출가능한 마커를 관심 세포 유형에서 발현시키기 위해 개조된 다양한 마우스 계통이 생체 내에서의 조절 요소의 세포 유형 선택성의 검증을 허용한다. 예를 들어, 세포-유형 선택적 Cre 발현이 관심 세포 유형에서의 형광 단백질, 예컨대 RFP의 Cre-유도 발현을 구동시킬 수 있기 때문에 특정 세포 유형에서 Cre를 발현하는 다수의 마우스 라인이 사용될 수 있다. 생체 내에서 이같은 관심 세포 유형을 표지하는 것은 동일한 마우스에서 형광 또는 리포터 트랜스진에 작동가능하게 연결된 추정 조절 요소와 연관된 세포-유형 선택적 발현의 수준을 결정할 수 있게 한다. 공동-국소화 검정법과 유사하게, CAG, EF1α, 구성적 프로모터 (예를 들어, SV40, CMV, UBC, PGK, 및 CBA), 또는 비-선택적 조절 요소에 대해 검출된 중첩을 초과하는 양쪽 마커로부터의 신호의 중첩은 테스트된 조절 요소의 세포 유형 선택성을 나타낸다. 일부 경우에, 사용된 마우스 계통은 B6 PV-Cre 마우스 (잭슨 래버러토리(Jackson Laboratory))이고, 이는 내인성 Pvalb 발현을 파괴하지 않으면서 파르브알부민-발현 뉴런 (예를 들어, 뇌 내의 개재뉴런, 및 후근신경절 내의 고유수용성 구심성 감각 뉴런)에서 Cre 리컴비나제를 발현하는 B6 PV-Cre 녹인 마우스이다.
특정 세포 유형에 대한 조절 요소의 세포 유형 선택성의 검증 시, 이같은 조절 요소의 서열이 이의 선택성을 개선하기 위해 다양한 돌연변이유발 방법, 예를 들어, 오류-빈발 PCR 방법을 사용하여 달라질 수 있다. 일부 경우에, 세포 선택성이 있는 2개 이상의 조절 요소가 조합될 수 있다. 일부 경우에, 조합된 조절 요소들은 관심 세포 유형에서 유전자 발현을 구동시키는 것에서 강화된 세포-유형 선택성을 나타낸다. 일부 예에서, 이같은 조절 요소는 이의 세포 유형 선택성을 유지하는 서열의 최소량을 결정하기 위해 한번에 하나 이상의 염기가 말단 절단된다. 세포 유형 선택성을 유지하는 더 작은 조절 요소가 대형 트랜스진을 포함하는 유전자 요법을 제조하는데, 또는 벡터 또는 플라스미드의 클로닝 용량이 유전자 요법을 사용하여 전달하려는 트랜스진의 크기의 관점에서 제한되는 경우에 도움이 된다.
본 개시내용은 조절 요소인 복수의 뉴클레오티드 서열을 제공한다. 일부 경우에, 본원에 개시된 조절 요소 중 임의의 하나 이상이 파르브알부민 세포에서의 유전자 발현의 선택성 증가를 발생시킨다. 일부 경우에, 본원에 개시된 조절 요소는 PV-세포-선택적이다. 일부 경우에, PV 세포 선택적 조절 요소는 비-PV CNS 세포-유형에서의 발현보다 더 많은 PV 세포에서의 선택적 유전자 발현과 연관된다. 일부 경우에, PV 세포 선택적 조절 요소는 비-PV CNS 세포 유형에서의 유전자 발현 감소와 연관된다.
조절 요소의 비제한적인 예는 하기 표 1에서 제공된 바와 같은 서열식별번호: 1-32를 포함한다.
<표 1> 본원에 개시된 핵산 서열의 목록.
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한 측면에서, 본원에 개시된 조절 요소는 세포-유형 선택적이다. 일부 경우에, 본원에 개시된 조절 요소는 PV 뉴런에 대해 선택적이다. 일부 경우에, 본원에 개시된 조절 요소는 CNS 내의 PV 뉴런에 대해 선택적이다. 일부 경우에, PV-세포 선택적 조절 요소 또는 임의의 본원에 개시된 조절 요소는 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 이상의 비-PV CNS 세포-유형에 비교하여 PV 뉴런에서의 선택적 유전자 발현을 발생시킬 수 있다.
일부 경우에, 본원에 개시된 조절 요소 중 임의의 하나 이상은 발현 카세트 내의 트랜스진에 작동가능하게 연결되어 표적 세포-유형, 예를 들어, PV 뉴런에서의 선택적 발현을 발생시킨다. 일부 경우에, 임의의 본원의 실시양태의 조절 요소는 (i) 서열식별번호: 1-33; (ii) 이의 변이체, 기능성 단편, 또는 조합물; 또는 (iii) (i) 또는 (ii) 중 어느 하나에 대한 서열 동일성이 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%인 서열 중 어느 하나를 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일부 경우에, 조절 요소는 서열식별번호: 1-32 중 어느 하나를 포함한다. 일부 경우에, 서열 동일성은 BLAST에 의해 측정된다.
일부 경우에, 서열식별번호: 1-32, 또는 이의 기능성 단편 또는 조합물, 또는 이에 대한 서열 동일성이 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%인 서열 중 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 또는 10개 이상이 조합되어 더 큰 조절 요소를 형성하거나, 또는 발현 카세트 내의 유전자에 작동가능하게 연결된다. 일부 경우에, 서열식별번호: 1-32, 또는 이의 기능성 단편 또는 조합물, 또는 이에 대한 서열 동일성이 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%인 서열 중 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 또는 10개 이상이 뉴클레오티드 1-50개의 링커 서열을 사용하여 조합된다. 일부 경우에, 서열식별번호: 1-32, 또는 이의 기능성 단편 또는 조합물, 또는 이에 대한 서열 동일성이 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%인 서열 중 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 또는 10개 이상이 링커 서열 없이 조합된다. 일부 경우에, 서열식별번호: 33의 서열이 임의의 2개의 조절 요소 사이의 링커로서 사용된다. 일부 경우에, 2개의 조절 요소 사이의 링커 서열은 서열식별번호: 33 또는 서열식별번호: 33에 대한 서열 동일성이 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%인 서열을 포함한다. 일부 경우에, 서열 동일성은 BLAST에 의해 측정된다.
일부 경우에, 2개 이상의 조절 요소가 조합되거나 발현 카세트에서 사용되는 경우, 조절 요소가 발현 카세트 내에서 인접하거나 또는 연결될 필요는 없다. 예를 들어, 하나의 조절 요소는 트랜스진의 상류에 위치할 수 있는 한편, 제2의 조절 요소 및/또는 추가적인 조절 요소는 트랜스진의 하류에 위치할 수 있다. 일부 경우에, 하나 이상의 조절 요소는 트랜스진의 상류에 위치할 수 있다. 일부 경우에, 하나 이상의 조절 요소는 트랜스진의 하류에 위치할 수 있다.
일부 경우에, 서열식별번호: 1-22, 또는 이의 기능성 단편 또는 조합물, 또는 이에 대한 서열 동일성이 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%인 서열 중 임의의 하나 이상이 서열식별번호: 23-30, 또는 이의 기능성 단편 또는 조합물, 또는 이에 대한 서열 동일성이 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%인 서열 중 임의의 하나 이상과 조합되어, 더 큰 조절 요소를 형성할 수 있다. 예를 들어, 조절 요소는 서열식별번호: 1 및 서열식별번호: 30을 포함한다. 조절 요소는 서열식별번호: 8 및 서열식별번호: 30을 포함한다. 조절 요소는 서열식별번호: 1 및 서열식별번호: 23-29를 포함한다. 조절 요소는 서열식별번호: 8 및 서열식별번호: 23-29를 포함한다. 일부 경우에, 조절 요소는 서열식별번호: 30, 또는 서열식별번호: 23-29, 또는 이의 기능성 단편 또는 조합물, 또는 이에 대한 서열 동일성이 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%인 서열 중 임의의 하나 이상을 포함한다.
일부 경우에, 본 개시내용의 하나 이상의 조절 요소는 PV 세포에서의 선택적 유전자 발현을 발생시킨다. 일부 경우에, 표적 세포 유형에서 선택적 활성 또는 기능을 나타내는 조절 요소는 하나 이상의 표적을 벗어나는 세포-유형, 예를 들어, 비-PV CNS 세포-유형, 비-억제 뉴런 또는 흥분 뉴런, 비-PV 세포에서 최소의 활성 또는 기능을 또한 나타낸다.
일부 경우에, 유전자에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 조절 요소는 세포에서의 유전자 발현을 조정하고, 이는 비-표적 세포-유형에 비교하여 표적 세포-유형에서의 선택적 발현을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 표적 세포 또는 세포 유형에서의 선택적 발현은 세포-선택적 발현 또는 세포-유형 선택적 발현으로 또한 지칭될 수 있다.
일반적으로 선택적 발현은 다른 세포 (또는 비-표적 세포 유형)에 비교하여 높은 분율의 관심 세포 유형 (또는 표적 세포 유형)의 세포에서의 발현을 지칭한다. 선택적 발현은 하나 이상의 비-표적 세포 또는 세포-유형에 비해 표적 세포 또는 표적 세포 유형에서 우선적으로 발현되는 것으로 볼 수도 있다. 일부 경우에, 본 개시내용의 하나 이상의 조절 요소의 선택적 발현은 CAG, EF1α, 구성적 프로모터 (예를 들어, SV40, CMV, UBC, PGK, 및 CBA), 또는 선택성 없이 임의의 세포 또는 세포 유형에서 발현을 구동시키는 것으로 공지된 비-선택적 조절 요소에 비교된다. 일부 경우에, 본 개시내용의 하나 이상의 조절 요소의 선택적 발현은 CAG, EF1α, 구성적 프로모터 (예를 들어, SV40, CMV, UBC, PGK, 및 CBA), 비-선택적 조절 요소, 또는 이러한 조절 요소가 없는 발현 카세트에 비교된다.
비-표적 세포 유형은 표적 세포 또는 표적 세포 유형에 비교된 바와 같은 상이한 부분집합, 아유형, 또는 유형의 세포, 또는 모든 비-표적 세포 유형을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 유전자에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 조절 요소는 적어도 하나의 유형의 비-표적 세포, 또는 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 또는 5개 초과의 유형의 비-표적 세포에 비해 표적 세포 유형에서의 선택적 발현을 발생시킨다. 일부 경우에, 비-표적 세포 유형은 표적 세포 유형을 포함하지 않는 모든 다른 세포 유형을 지칭한다. 일부 경우에, 비-표적 세포 유형은 표적 세포 유형을 포함하지 않는 관련 조직 또는 기관 내의 모든 다른 세포 유형, 예를 들어, CNS 내의 모든 비-표적 세포 유형, 해마 내의 모든 비-표적 세포 유형이다. 일부 경우에, 비-표적 세포 또는 비-표적 세포 유형은 표적 세포가 아닌 세포의 부분집합 또는 아유형을 포함한다. 예를 들어, 비-PV CNS 세포-유형은 파르브알부민 대신 칼레티닌 및/또는 소마토스타틴을 발현하는 GABA작용성 세포, 또는 파르브알부민을 발현하지 않는 모든 GABA작용성 세포를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 세포 유형은 상이한 세포 마커, 형태학, 표현형, 유전자형, 기능, 및/또는 세포 유형을 분류하기 위한 임의의 다른 수단이 있는 것에 의해 구별된다.
관심 세포 또는 세포 유형에서의 조절 요소에 의해 구동되는 발현의 선택성을 다수의 방식으로 측정할 수 있다. 비-표적 세포 유형에 비교된 표적 세포 유형에서의 유전자 발현의 선택성을 하나 이상의 조절 요소에 작동가능하게 연결된 유전자로부터 검출가능한 수준의 전사체를 발현하는 표적 세포의 개수를 이러한 유전자를 발현하는 세포의 총 개수에 비교함으로써 측정할 수 있다. 이같은 측정, 검출, 및 정량은 생체 내에서 또는 시험관 내에서 행해질 수 있다.
일부 예에서, 공동-국소화 검정법을 사용하여 PV 뉴런에 대한 선택성이 결정될 수 있다. 일부 경우에, 공동-국소화 검정법은 면역조직화학을 기초로 한다. 일부 경우에, 검출가능한 리포터 유전자가 트랜스진으로서 사용되어 세포에서의 유전자 발현의 검출 및/또는 측정을 허용한다. 일부 경우에, 표적 세포를 특이적으로 표지하는 검출가능한 마커, 예를 들어, 형광 마커 또는 항체가 표적 세포를 검출 및/또는 측정하는데 사용된다. 일부 경우에, 공동-국소화 검정법은 영상화, 예를 들어, 형광 영상화를 사용하여 상이한 형광 표지들 사이의 중첩, 예를 들어, 표적 세포를 지시하는 형광 신호와 유전자 발현을 지시하는 또 다른 형광 신호 사이의 중첩을 결정한다. 일부 경우에, 공동-국소화 검정법에 사용되는 형광 표지는 적색 형광 단백질 (RFP), 예컨대 tdTomato 리포터 유전자, 및 녹색 형광 리포터 단백질, 예컨대 eGFP를 포함한다.
일부 예에서, 하나 이상의 조절 요소에 작동가능하게 연결된 유전자는 형광 단백질, 예를 들어, eGFP 또는 RFP이고, 여기서 트랜스진의 발현은 검출가능한 신호를 제공한다. 일부 경우에, eGFP에 대해 조직이 염색되거나 또는 eGFP로부터의 형광이 형광 현미경을 사용하여 직접적으로 검출된다. 상이한 형광 또는 검출가능한 신호가 있는 제2의 형광 마커 또는 리포터 유전자, 예컨대 표적 세포를 확인하는 항체가 표적 세포를 지시하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, PV 뉴런과 특이적으로 상호작용하는 항-PV 항체가 유전자 발현을 측정하는데 사용된 형광과 구별될 수 있는 검출가능한 신호, 예컨대 적색 형광 또는 적색 염색을 산출하는데 사용될 수 있다. 따라서, eGFP가 PV 뉴런에서의 선택적 발현을 구동시키는 하나 이상의 조절 요소에 작동가능하게 연결된 트랜스진이고, PV 뉴런이 항-PV 항체로 표지된 예에서, PV 세포에서의 유전자 발현의 선택성이 PV+이기도 한 eGFP+ 세포의 백분율로서 측정된다. 이같은 검정법에서, 양쪽 형광 신호의 중첩, 즉, 적색 및 녹색 형광의 중첩에 의해 eGFP+이기도 한 PV+ 세포가 지시된다. 이같은 측정, 분석, 및/또는 검출은 육안 검사에 의해 또는 컴퓨터에 의해 행해질 수 있다.
일부 경우에, 트랜스진에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 조절 요소의 선택성을 평가하기 위해 트랜스진을 발현하는 비-표적 세포 유형 (또는 다른 세포)의 비율에 비교된 바와 같은 트랜스진을 발현하는 관심 세포 유형 (또는 표적 세포 유형)의 비율을 또한 측정할 수 있다. 유사하게, 하나 이상의 조절 요소에 작동가능하게 연결된 트랜스진을 발현하는 표적 세포의 개수를 이러한 트랜스진을 발현하는 모든 세포의 총 개수에 비교함으로써 발현의 선택성을 또한 측정할 수 있다. 양쪽 접근법에서, 트랜스진을 발현하는 표적 세포의 개수가 높을수록, 조절 요소가 표적 세포에 대해 더욱 선택적이다. 일부 경우에, 표적 세포는 PV 뉴런이다.
일부 경우에, 하나 이상의 본원에 개시된 조절 요소는 PV 뉴런에서의 유전자 발현의 선택성 증가를 발생시킨다. 일부 경우에, 하나 이상의 본원에 개시된 조절 요소는 비-PV CNS 세포-유형에 비교하여 PV 뉴런에서의 유전자 발현의 선택성 증가를 발생시킨다. 일부 경우에, 하나 이상의 본원에 개시된 조절 요소는 비-PV GABA작용성 세포에 비교하여 PV 뉴런에서의 유전자 발현의 선택성 증가를 발생시키고, 여기서 비-PV GABA작용성 세포는 칼레티닌 (CR), 소마토스타틴 (SOM), 콜레시스토키닌 (CCK), 뉴로펩티드 Y (NPY), 혈관장 폴리펩티드 (VIP), 콜린 아세틸트랜스퍼라제 (ChAT), 또는 이의 조합물을 발현하는 GABA작용성 세포 중 임의의 하나 이상일 수 있다. 일부 경우에, 하나 이상의 본원에 개시된 조절 요소는 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 또는 5개 초과의 비-PV GABA작용성 아유형에 비교하여 PV 뉴런에서의 유전자 발현의 선택성 증가를 발생시킨다. 일부 경우에, 하나 이상의 본원에 개시된 조절 요소는 모든 다른 비-PV GABA작용성 세포, 또는 PV를 발현하지 않는 모든 다른 GABA작용성 세포, 또는 PV를 발현하지 않는 모든 다른 CNS 세포, 또는 PV를 발현하지 않는 모든 다른 뉴런에 비교하여 PV 뉴런에서의 유전자 발현의 선택성 증가를 발생시킨다. 일부 경우에, 하나 이상의 본원에 개시된 조절 요소는 CNS 내의 모든 비-PV 세포 또는 모든 비-PV 뉴런에 비교하여 PV 뉴런에서의 유전자 발현의 선택성 증가를 발생시킨다.
일부 경우에, 트랜스진에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 조절 요소는 PV 세포에서의 트랜스진의 선택적 발현을 발생시키고, 여기서 트랜스진을 발현하는 PV 세포의 백분율은 트랜스진이 CAG, EF1α, 구성적 프로모터 (예를 들어, SV40, CMV, UBC, PGK, 및 CBA), 또는 비-선택적 조절 요소, 예컨대 서열식별번호: 34, 또는 이의 기능성 단편, 또는 이에 대한 서열 동일성이 적어도 80%인 서열에 작동가능하게 연결된 PV 세포에서의 유전자 발현보다 더 높은 백분율이다. 일부 경우에, 하나 이상의 조절 요소는 CAG, EF1α, 구성적 프로모터 (예를 들어, SV40, CMV, UBC, PGK, 및 CBA), 또는 비-선택적 조절 요소 예컨대 서열식별번호: 34, 또는 이의 기능성 단편, 또는 이에 대한 서열 동일성이 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%인 서열에 작동가능하게 연결된 유전자의 발현에 비교하여 적어도 1.5배, 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 6배, 적어도 7배, 적어도 8배, 적어도 9배, 적어도 10배, 적어도 15배, 적어도 20배, 적어도 25배, 또는 적어도 50배인 수준으로 PV 뉴런에서의 선택적 발현을 발생시킨다.
일부 측면에서, 조절 요소는 인간 유래이거나, 또는 인간 유래인 서열을 포함한다. 일부 경우에, 조절 요소는 마우스 유래이거나, 또는 마우스 유래인 서열을 포함한다. 일부 경우에, 조절 요소는 비-천연 발생 서열을 포함한다. 일부 경우에, 조절 요소는 비-천연 발생이다. 일부 경우에, 비-천연 발생 조절 요소가 생성되도록 하나 이상의 인간 유래 조절 요소가 또 다른 조절 요소와 조합된다. 일부 경우에, 인간 유래 조절 요소가 마우스 유래 조절 요소와 조합된다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "인간 유래"는 인간 게놈 (또는 인간 게놈 구축물)에서 발견되는 서열, 또는 이와 상동성인 서열을 지칭한다. 상동성 서열은 인간 게놈의 영역에 비교하여 (예를 들어, BLAST에 의해 측정 시) 서열 동일성이 적어도 80%인 영역이 있는 서열일 수 있다. 예를 들어, 인간 서열에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 상동성인 서열이 인간 유래로 간주된다. 일부 경우에, 전체적으로는 조절 요소가 인간 게놈에 대한 서열 동일성이 낮은 한편, 조절 요소의 일부는 인간 게놈 내의 서열에 대한 서열 동일성 (또는 국소적 서열 동일성)이 100%이도록, 조절 요소는 인간 유래 서열 및 비-인간 유래 서열을 함유한다.
일부 경우에, 인간 유래 조절 요소는 인간 서열에 대해 100% 동일한 서열이다. 일부 예에서, 세포-유형 선택적 조절 요소의 서열은 100% 인간 유래이다.
다른 예에서, 조절 요소 서열의 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 또는 99%가 인간 유래이다. 예를 들어, 조절 요소는 이의 서열의 50%가 인간 유래일 수 있고, 나머지 50%가 비-인간 유래일 수 있다 (예를 들어, 마우스 유래이거나 또는 완전히 합성일 수 있다). 추가 예를 위해, 50% 인간 유래인 것으로 간주되고 300 bp를 포함하는 조절 요소가 인간 게놈 내의 서열에 대한 전체적인 서열 동일성이 45%일 수 있는 한편, 이러한 RE의 염기쌍 1-150은 인간 게놈의 유사한 크기의 영역에 대한 동일성 (국소적 서열 동일성)이 90%일 수 있다.
일부 예에서, 인간 유래 조절 서열과 상동성인 서열은 인간 서열과 적어도 90% 동일하다. 일부 경우에, 본원에서의 조절 요소는 서열식별번호: 1, 23-31, 및 33 중 어느 하나에 대한 동일성이 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%인 서열을 포함한다. 일부 경우에, 서열 동일성은 BLAST에 의해 측정된다. 조절 요소가 서열식별번호: 23-29, 또는 이의 기능성 단편 또는 조합물 중 임의의 하나 이상과 상동성인 서열 (예를 들어, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 서열 동일성)을 포함하는 경우, 조절 요소가 없는 유사한 벡터에 비교하여, 이같은 조절 요소는 (프로모터가 발현 벡터 또는 카세트 내에 또한 존재하는 경우) 작동가능하게 연결된 트랜스진의 더 높은 발현을 발생시킨다. 예를 들어, HEK293T 또는 CHO 세포에서 트랜스진의 이같은 더 높은 발현이 관찰될 수 있다.
일부 경우에, 하나 이상의 조절 요소는 링커 서열 예컨대 서열식별번호: 33의 존재 또는 부재 하에 서열식별번호: 1-22 중 임의의 하나 이상과 조합된 또는 이와 조합되어 사용되는 서열식별번호: 23-29 중 임의의 하나 이상을 포함한다. 일부 경우에, 본 개시내용의 임의의 2개의 조절 요소는 1-50개의 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드 링커, 예컨대 서열식별번호: 33 또는 이의 변이체를 사용하여 함께 연결된다. 일부 경우에, 링커 서열은 인간 유래 서열이다. 일부 경우에, 링커 서열은 마우스 유래 또는 비-천연 발생이다. 일부 경우에, 2개의 조절 요소는 링커 없이 또는 어떠한 개재 서열도 없이 연결된다. 일부 경우에, 링커는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30개의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 경우에, 링커 서열은 제한 효소 부위, 결찰, PCR, 및/또는 클로닝의 결과이다.
일부 경우에, 인간 유래 조절 요소는 마우스 유래 조절 요소, 예컨대 서열식별번호: 32와 조합되고, 이는 서열식별번호: 8 (마우스 유래 서열) 및 서열식별번호: 23-29 (인간 유래 서열)의 조합물이다. 일부 경우에, 세포-유형 선택적 조절 요소들은 추가적인 링커 서열 없이 직접적으로 조합된다. 다른 경우에, 세포-유형 선택적 조절 요소들은 의도적 또는 클로닝 인공물일 수 있는 하나 이상의 짧은 링커 서열로 조합된다. 일부 경우에, 링커 서열은 1-50개의 염기를 포함한다. 예를 들어, 서열식별번호: 31은 서열식별번호: 1의 서열에 바로 이어지는 추가적인 19 bp의 게놈 서열 (서열식별번호: 33)과 함께 서열식별번호: 1 및 23-29의 서열을 포함한다. 서열식별번호: 32 또한 이러한 19 bp를 포함하지만, 서열식별번호: 1의 서열이 없다. 다른 예에서, 조합된 세포-유형 선택적 조절 요소들은 클로닝 플라스미드 또는 제한 효소 인식 부위로부터의 짧은 서열, 일반적으로는 50 bp 미만, 20 bp 미만, 15 bp 미만, 또는 10 bp 미만을 포함할 수 있다.
일부 경우에, 조절 요소는 비-코딩 DNA 서열로부터 유래될 수 있다. 일부 경우에, 비-코딩 DNA로부터 유래된 조절 요소, 예컨대 상류 서열, 인트론, 3' 및 5' 비번역 영역 (UTR), 및/또는 하류 영역이 유전자와 회합된다. 다른 경우에, 비-코딩 DNA 서열로부터 유래된 조절 요소가 유전자와 회합되지 않는다. 일부 경우에, 조절 요소는 코딩 서열로부터 유래된다. 일부 경우에, 조절 요소가 유래되는 게놈 영역은 작동가능하게 연결된 트랜스진이 유래되는 게놈 영역과 별개이다. 일부 경우에, RE는 트랜스진 (예컨대 천연 발생 또는 내인성 버전의 트랜스진)이 유래되는 게놈 영역 또는 위치와 관련하여 원위부의 게놈 영역 또는 위치로부터 유래된다.
한 측면에서, 조절 요소는 유전자 발현, 예를 들어, 표적 세포에서의 발현의 선택성을 조정하는 임의의 비-코딩 서열이다. 일부 경우에, 표적 세포는 PV 뉴런이다. 일부 경우에, 조절 요소는 전사 개시 부위의 상류의 게놈 서열, 5' UTR 서열, 엑손성 서열, 인트론성 서열, 또는 3' UTR 서열로부터 유래된다. 일부 경우에, 인간 유래 조절 요소는 인트론성 인간 유래 서열을 포함한다. 일부 경우에, 조절 요소는 인핸서를 포함하고, 인핸서가 프로모터와 함께 발현 카세트 내에 존재하는 것이 표적 세포-유형 (예를 들어, PV 뉴런)에서의 작동가능하게 연결된 트랜스진의 발현을 인핸서의 부재 하의 프로모터에 의한 동일한 트랜스진의 발현에 비교하여 증가시킨다. 일부 경우에, 인핸서는 작동가능하게 연결된 트랜스진의 발현을 전사 메커니즘, 전사-후 메커니즘 또는 양쪽 모두를 통해 증가시킨다. 일부 경우에, 조절 요소는 인핸서 서열, 프로모터 서열, 또는 인핸서 및 프로모터 서열의 조합물을 포함한다. 일부 경우에, 조절 요소는 인간 유래 인핸서 서열, 인간 유래 프로모터 서열, 인간 유래 인트론성 서열, 및/또는 이의 조합물 중 하나 이상을 포함한다.
일부 경우에, 조절 요소는 서열식별번호: 1-32, 또는 이의 단편 또는 조합물, 또는 이에 대한 서열 동일성이 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%인 서열 중 하나 이상을 포함한다. 일부 경우에, 조절 요소는 서열식별번호: 1-22, 또는 이의 단편 또는 조합물, 또는 이에 대한 서열 동일성이 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%인 서열 중 하나 이상을 포함한다. 일부 경우에, 조절 요소는 서열식별번호: 23-29, 또는 이의 단편 또는 조합물, 또는 이에 대한 서열 동일성이 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%인 서열 중 하나 이상을 포함한다. 일부 경우에, 조절 요소는 서열식별번호: 30-32, 또는 이의 단편 또는 조합물, 또는 이에 대한 서열 동일성이 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%인 서열 중 하나 이상을 포함한다. 일부 경우에, 조절 요소는 서열식별번호: 30-32의 서열, 또는 이의 단편 또는 조합물, 또는 이에 대한 서열 동일성이 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%인 서열을 포함한다.
일부 예에서, 조절 요소는 비-인간 DNA 서열, 또는 인간 및 비-인간 게놈 서열 양쪽 모두로부터 유래된다. 일부 경우에, 세포-유형 선택적 조절 요소, 또는 이의 일부분은 포유동물 게놈 서열과 상동성이다. 일부 경우에, 조절 요소는 포유동물 게놈 서열에 대한 동일성이 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%이다. 일부 경우에, 조절 요소는 마우스 게놈 서열로부터 유래된다. 일부 경우에, 조절 요소, 또는 이의 단편은 마우스 게놈 서열 또는 비-인간 포유동물 게놈 서열에 대한 동일성이 적어도 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 99% 초과이다. 일부 경우에, 서열 동일성은 BLAST에 의해 측정된다. 일부 경우에, 조절 요소는 서열식별번호: 1-33, 또는 이의 단편 또는 조합물, 또는 이에 대한 서열 동일성이 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%인 서열 중 임의의 것을 포함할 수 있다.
일부 경우에, 세포-유형 선택적 조절 요소는 짧다. 일부 경우에, 트랜스진 및 하나 이상의 조절 요소의 조합된 크기가 벡터의 클로닝 용량을 초과하지 않도록, 조절 요소의 크기는 벡터, 예를 들어, 바이러스 벡터 또는 rAAV의 클로닝 용량과 상용성이다. 일부 경우에, 세포-유형 선택적 조절 요소는 길이가 최대 약 2050 bp, 2000 bp, 1900 bp, 1800 bp, 1700 bp, 1600 bp, 1500 bp, 1400 bp, 1300 bp, 1200 bp, 1100 bp, 1000 bp, 900 bp, 800 bp, 700 bp, 600 bp, 500 bp, 400 bp, 300 bp, 200 bp, 또는 100 bp이다. 일부 경우에, 세포-유형 선택적 조절 요소는 총 길이가 최대 약 20 bp, 30 bp, 40 bp, 50 bp, 60 bp, 70 bp, 80 bp, 90 bp, 100 bp, 200 bp, 300 bp, 400 bp, 500 bp, 600 bp, 700 bp, 800 bp, 900 bp, 1000 bp, 1010 bp, 1020 bp, 1030 bp, 1040 bp, 1050 bp, 1060 bp, 1070 bp, 1080 bp, 1090 bp, 1100 bp, 1200 bp, 1300 bp, 1500 bp, 1600 bp, 1700 bp, 1800 bp, 1900 bp, 또는 2000 bp이다. 일부 경우에, 세포-유형 선택적 조절 요소는 길이가 약 100 bp-1100 bp, 100 bp-1000 bp, 100 bp-900 bp, 200 bp-900 bp, 200 bp-800 bp, 300 bp-600 bp, 400 bp-800 bp, 500 bp-600 bp, 또는 600 bp-900 bp이다. 일부 경우에, 조절 요소는 약 400-600 bp, 400-600 bp, 400-700 bp, 400-800 bp, 400-900 bp, 400-1000 bp, 또는 400-1500 bp이다. 일부 경우에, 조절 요소는 약 500-600 bp, 500-700 bp, 500-800 bp, 500-900 bp, 500-1000 bp, 또는 500-1500 bp이다. 일부 경우에, 2개 이상의 조절 요소가 조합되어 1300-2500 bp, 1300-2060 bp, 약 1350 bp, 약 2050 bp, 또는 약 1880 bp의 더 큰 세포-유형 선택적 조절 요소를 형성한다.
일부 경우에, 2개 이상의 세포-유형 선택적 조절 요소가 조합될 수 있다. 예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 세포-유형 선택적 조절 요소가 조합될 수 있다. 예를 들어, 서열식별번호: 30은 7개의 조절 요소로부터의 서열, 즉, 서열식별번호: 23-29를 포함하고, 이들은 모두 인간 게놈 서열로부터 유래된다. 일부 경우에, 세포-유형 선택적 조절 요소는 PV-뉴런 선택적 조절 요소를 지칭한다.
일부 경우에, 세포-유형 선택적 조절 요소가 2회 이상 반복되어, 또한 세포-유형 선택적이거나 또는 세포-유형 선택적 성질이 강화된 조합된 조절 요소가 제조된다. 일부 경우에, 세포-유형 선택성이 상이한 2개 이상의 조절 요소가 조합된다. 일부 경우에, 세포-유형 선택적 조절 요소가 비-선택적 조절 요소, 예를 들어, 높은 유전자 발현을 구동시키는 비-선택적 인핸서 요소와 조합된다. 예를 들어, 표적 세포에 대한 선택성이 높은 프로모터 조절 요소가 발현 효율이 높은 조절 요소와 조합될 수 있다. 일부 경우에, 하나 이상의 세포 유형-선택적 조절 요소가 하나 이상의 고효율 조절 요소와 조합된다. 예를 들어, 서열식별번호: 1-32, 또는 이의 단편 또는 조합물, 또는 이에 대한 서열 동일성이 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%인 서열 중 임의의 하나 이상이 구성적 프로모터, 예컨대 GAD2 프로모터, 인간 시냅신 프로모터, minCMV 프로모터, TATA 박스, 수퍼 코어 프로모터, 또는 EF1α 프로모터, 또는 이의 조합물과 조합될 수 있다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 하나 이상의 비-표적 세포 유형, 예컨대 흥분 세포 및/또는 비-PV GABA작용성 세포를 포함하지만 이에 제한되지 않는 비-PV CNS 세포에 비해 표적 세포 유형, 예컨대 PV 뉴런에서의 선택적 유전자 발현을 발생시키도록 임의의 유전자 요법에 첨가될 수 있는 조절 요소의 목록을 제공한다.
일부 경우에, 세포-유형 선택적 조절 요소는 다른 조절 요소 예컨대 고-발현 프로모터 또는 mRNA 안정성을 증가시키는 서열과 조합될 수 있다. 일부 경우에, 하나 이상의 세포-유형 선택적 조절 요소가 인간, 비-인간, 또는 비-포유동물 서열, 예를 들어 hSyn1 프로모터, CBA 프로모터, CMV 프로모터, EF1α 프로모터, 폴리A 신호 (예를 들어, SV40 폴리A 신호), 또는 전사후 조절 요소 예컨대 우드척 간염 바이러스 전사후 조절 요소 (WPRE)와 조합된다.
일부 경우에, 조합된 조절 요소들은 상이한 종으로부터 유래될 수 있다. 조합된 조절 요소들은 하나의 종 내의 상이한 게놈 영역으로부터 유래될 수 있다. 일부 경우에, 조절 요소는 원위부 게놈 서열, 예를 들어, 정상적 또는 자연적으로는 서로 또는 관심 세포 유형과 회합되지 않는 서열로부터 유래된다. 일부 경우에, 조합된 조절 요소를 제조하도록 사용된 개별적인 조절 요소들은 상이한 인간 염색체로부터 유래될 수 있다.
한 측면에서, 본 개시내용의 조절 요소는 서열식별번호: 1-32, 또는 이의 조합물, 또는 이에 대한 서열 동일성이 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%인 서열 중 임의의 것의 기능성 단편을 포함한다. 이같은 기능성 단편은 이러한 조절 요소가 없는 유사한 발현 카세트 또는 벡터에 비교하는 경우 발현 카세트 또는 벡터 내의 트랜스진의 발현을 증가시킬 수 있다. 이같은 기능성 단편은 기능성 단편이 없는 유사한 벡터 또는 카세트에 비교하여 단편이 트랜스진에 작동가능하게 연결된 경우 세포-유형 선택적 발현을 증가시키는 인핸서로서 기능할 수 있다. 바람직하게는 단편은 길이가 30, 40, 50, 또는 60 bp를 초과한다.
일부 경우에, PV 세포 선택적 조절 요소 또는 임의의 본 개시내용의 조절 요소는 서열식별번호: 1-32, (ii) 서열식별번호: 1-32 중 어느 하나에 대한 서열 동일성이 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%인 핵산 서열, (iii) (i) 또는 (ii) 중 임의의 서열의 기능성 단편, 또는 (iv) (i), (ii) 및/또는 (iii) 중 임의의 서열의 조합물 중 어느 하나를 포함한다. 일부 경우에, 서열 동일성은 BLAST에 의해 측정된다. 일부 경우에, 서열식별번호: 1-29, 또는 이의 기능성 단편 또는 조합물, 또는 이에 대한 서열 동일성이 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%인 서열 중 2개 이상이 조절 요소로서 사용되어, 비-PV CNS 세포에 비교하여 PV 세포에서, 또는 비-표적 세포 유형에 비교하여 임의의 표적 세포 유형에서 선택적으로 트랜스진 발현을 증가시킨다. 일부 경우에, 기능성 단편은 하나 이상의 비-표적 세포 유형에 비해 표적 세포 유형에서 선택적 발현을 발생시키는 것이다.
일부 경우에, 조절 요소의 2개 이상의 카피, 예를 들어, 서열식별번호: 1-29, 또는 이의 단편 또는 조합물, 또는 이에 대한 서열 동일성이 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%인 서열 중 어느 하나의 2개 이상의 카피가 표적 세포에서 선택적 발현을 강화하는데 사용될 수 있다.
다른 경우에, 서열식별번호: 1-32, 또는 이의 단편 또는 조합물, 또는 이에 대한 서열 동일성이 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%인 서열 중 하나 이상이 표적 세포에서의 선택적 발현을 추가로 증가시도록 또 다른 조절 요소, 예컨대 프로모터 또는 인핸서에 작동가능하게 연결된다. 일부 경우에, 비-표적 세포에 비교하여 표적 세포에서의 유전자 요법으로부터의 발현을 개선하거나 증가시키도록 본원에 개시된 바와 같은 하나 이상의 조절 요소를 부가함으로써 임의의 유전자 요법을 강화할 수 있다. 일부 경우에, 표적 세포는 파르브알부민을 발현하는 PV 뉴런 또는 GABA작용성 세포이다.
일부 측면에서, 하나 이상의 본원에 개시된 조절 요소 (예를 들어, 서열식별번호: 1-32, 또는 이의 단편 또는 조합물, 또는 이에 대한 서열 동일성이 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%인 서열 중 임의의 하나 이상)가 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 또는 5개 초과의 비-표적 세포 유형에 비해 표적 세포 유형에 대한 세포-유형 선택성을 나타낸다. 일부 경우에, 조절 요소는 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 또는 5개 초과의 비-표적 아유형, 또는 모든 다른 공지된 아유형의 세포에 비해 표적 세포 아유형에서 선택적 발현 또는 우선적 발현을 구동시킨다. 예를 들어, GABA작용성 세포는 PV 세포를 포함하여 상이한 아유형들을 포함한다. 일부 경우에, 표적 세포 유형은 PV 세포이다. 일부 경우에, 하나 이상의 조절 요소는 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 또는 5개 초과의 비-표적 세포 유형에 비해 PV 세포에 대해 선택적이다. 일부 예에서, 하나 이상의 조절 요소는 모든 다른 공지된 CNS 세포-유형에 비해 PV 세포에 대해 선택적이다.
일부 경우에, 서열식별번호: 1-32, 또는 이의 단편 또는 조합물, 또는 이에 대한 서열 동일성이 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%인 서열 중 임의의 하나 이상이 서열식별번호: 1-32, 또는 이의 단편 또는 조합물, 또는 이에 대한 서열 동일성이 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%인 서열 중 임의의 하나 이상과 조합될 수 있다. 일부 경우에, 이같은 조합된 조절 요소들은 1-50개의 뉴클레오티드의 링커를 사용하여 연결된다. 일부 경우에, 이같은 조합된 조절 요소들은 연결되지 않는다.
일부 경우에, 하나 이상의 본원에 개시된 조절 요소는, 임의의 트랜스진 (예를 들어, 리포터 트랜스진 또는 치료용 트랜스진)에 작동가능하게 연결된 경우, 동일한 트랜스진에 작동가능하게 연결된 경우의 CAG, EF1α, 구성적 프로모터 (예를 들어, SV40, CMV, UBC, PGK, 및 CBA), 또는 비-선택적 조절 요소 (예를 들어, 서열식별번호: 34, 또는 이의 단편, 또는 이에 대한 서열 동일성이 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%인 서열)에 의해, 또는 조절 요소가 없는 동일한 구축물에 의해 구동되는 발현보다 통계적으로 유의하게 더 높은 수준으로 적어도 하나의 표적 세포 유형에서 선택적 발현 또는 우선적 발현을 구동시킨다. 일부 경우에, 통계적으로 유의하게 더 높음은 동일한 트랜스진에 작동가능하게 연결된 경우의 CAG, EF1α, 구성적 프로모터 (예를 들어, SV40, CMV, UBC, PGK, 및 CBA), 또는 비-선택적 조절 요소에 의한 또는 조절 요소가 없는 동일한 구축물에 의한 발현 수준의 적어도 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 10.5, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 100배인 수준으로 조절 요소가 표적 세포 유형에서 선택적 발현을 구동시킨다는 것을 의미한다. 일부 경우에, 본원에 기술된 바와 같은 공동-국소화 검정법을 사용하여 이같은 세포-유형 선택적 발현이 검정된다. 일부 경우에, 표적 세포 유형은 파르브알부민 세포이다. 일부 경우에, 이같은 공동-국소화 검정법은 항-PV 항체를 사용하여 수행된다. 일부 경우에, 이같은 공동-국소화 검정법은 본원에 개시된 바와 같은 PV-Cre 마우스를 사용하여 수행된다. 일부 경우에, 비-선택적 조절 요소는 서열식별번호: 34, 또는 이의 단편, 또는 이에 대한 서열 동일성이 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%인 서열이다.
발현 카세트
용어 "발현 카세트" 및 "핵산 카세트"는 폴리뉴클레오티드 분자 또는 핵산 서열을 지칭하도록 상호교환가능하게 사용된다. 일부 경우에, 발현 카세트는 트랜스진에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 본원에 개시된 조절 요소를 포함한다. 일부 경우에, 발현 카세트는 하나 이상의 조절 요소를 포함한다. 일부 경우에, 발현 카세트는 하나 이상의 본원에 개시된 세포-유형 선택적 조절 요소를 포함한다. 일부 경우에, 발현 카세트는 하나 이상의 본원에 개시된 PV 세포 선택적 조절 요소를 포함한다. 일부 경우에, 발현 카세트는 프로모터를 추가로 포함한다. 일부 경우에, 발현 카세트는 서열식별번호: 1-32 및/또는 이의 임의의 조합물 중 하나 이상의 서열을 포함한다. 일부 경우에, 발현 카세트는 서열식별번호: 1-32, (ii) 서열식별번호: 1-32 중 어느 하나에 대한 서열 동일성이 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%인 핵산 서열, (iii) (i) 또는 (ii) 중 임의의 서열의 기능성 단편, 또는 (iv) (i), (ii) 및/또는 (iii) 중 임의의 서열의 조합물 중 하나 이상을 포함한다. 일부 경우에, 서열 동일성은 BLAST에 의해 측정된다. 일부 경우에, 조절 요소는 발현 카세트 내에서 트랜스진의 상류에 위치한다. 일부 경우에, 조절 요소는 발현 카세트 내에서 트랜스진의 하류에 위치한다. 일부 경우에, 발현 카세트는 프로모터, 예를 들어, hSyn1 프로모터, CBA 프로모터, CMV 프로모터, EF1α프로모터, 폴리A 신호 (예를 들어, SV40 폴리A 신호), 또는 전사후 조절 요소 예컨대 우드척 간염 바이러스 전사후 조절 요소 (WPRE)를 추가로 포함한다.
일부 측면에서, 하나 이상의 본원에 기술된 조절 요소는 발현 카세트 내의 트랜스진에 작동가능하게 연결된다. 일부 경우에, 유전자 요법은 표적 조직 또는 세포 유형, 예컨대 PV 뉴런에서의 트랜스진의 선택적 발현을 발생시키도록 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상 또는 5개 이상의 본 개시내용의 조절 요소에 작동가능하게 연결된 트랜스진을 포함하는 발현 카세트를 포함한다. 일부 경우에, 발현 카세트는 트랜스진, 예를 들어, 리포터 유전자, eGFP, SCN1A, SNC2A, SNC8A, SCN1B, SCN2B, KV3.1, KV3.2, KV3.3, STXBP1, DNA 결합 단백질, 또는 이의 변이체 또는 단편, 또는 이에 대한 서열 동일성이 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%인 서열에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 PV 세포 선택적 조절 요소 또는 하나 이상의 본원에 개시된 조절 요소를 포함한다.
일부 경우에, 발현 카세트는 유전자 요법을 통한 전달을 위해 개조된다. 일부 경우에, 발현 카세트는 선형 또는 원형 구축물이다. 일부 경우에, 발현 카세트는 플라스미드, 벡터, 바이러스 벡터, 또는 rAAV의 일부분이다.
일부 경우에, 유전자 요법은 이를 필요로 하는 대상체의 CNS 내로 직접적으로 또는 주사 및/또는 주입을 통해 전신적으로 투여된다. 일부 경우에, 이같은 대상체는 반수체기능부전 또는 유전자 돌연변이, 예컨대 하기 유전자 중 어느 하나에서의 반수체기능부전 또는 돌연변이와 연관된 질환 또는 병태로 진단되었다: SCN1A, SNC2A, SNC8A, SCN1B, SCN2B, KV3.1, KV3.2, KV3.3, 또는 STXBP1. 일부 경우에, 대상체는 드라벳 증후군, 알츠하이머병, 간질, 신경변성, 타우병증, 뉴런 과소흥분성 및/또는 발작의 위험이 있거나 또는 드라벳 증후군, 알츠하이머병, 간질, 신경변성, 타우병증, 뉴런 과소흥분성 및/또는 발작이 있다. 일부 경우에, 이같은 유전자 요법은 바이러스 또는 바이러스 벡터, 예컨대 rAAV를 사용하여 전달된다. 일부 경우에, CNS 세포에 대한 향성 및/또는 혈액 뇌 장벽을 가로지르는 능력이 있는 AAV 혈청형, 예컨대 AAV9 또는 이의 변이체가 사용된다.
일부 경우에, 발현 카세트 내의 트랜스진에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 조절 요소 (예를 들어, 서열식별번호: 1-32, 또는 이의 단편 또는 조합물, 또는 이에 대한 서열 동일성이 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%인 서열 중 하나 이상)는 비-PV CNS 세포에 비교하여, 또는 대조군 요소예컨대 CAG, EF1α, 구성적 프로모터 (예를 들어, SV40, CMV, UBC, PGK, 및 CBA), 또는 비-선택적 조절 요소 (예를 들어, 서열식별번호: 34, 또는 이의 기능성 단편, 또는 이에 대한 서열 동일성이 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%인 서열)에 비교하여 PV 세포에서의 선택적 유전자 발현을 발생시킨다. 일부 경우에, 조절 요소는 트랜스진을 발현하는 모든 세포의 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 또는 적어도 90%가 PV 뉴런인 것을 발생시킨다. 일부 경우에, 조절 요소는 CNS 내의 PV 뉴런의 천연 분포에 대해 예상되는 것보다 약 1.5배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 7.5배, 8배, 9배, 또는 10배 더 높은 PV 뉴런에서의 선택적 유전자 발현을 발생시킨다. 일부 경우에, 조절 요소는 PV 세포에서의 선택적 발현을 구동시키고, 여기서 트랜스진을 발현하는 PV 세포의 백분율은, 면역조직화학 공동-국소화 검정법에서 측정한 경우, CNS에서의 PV 세포의 예상되는 분포보다 적어도 1.5배, 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 6배, 적어도 7배, 적어도 8배, 적어도 9배, 또는 적어도 10배 더 높거나, 또는 트랜스진이 CAG, EF1α, 구성적 프로모터 (예를 들어, SV40, CMV, UBC, PGK, 및 CBA), 또는 서열식별번호: 34의 서열, 또는 이의 기능성 단편, 또는 이에 대한 서열 동일성이 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%인 서열이 있는 비-선택적 조절 요소에 작동가능하게 연결된 경우의 PV 세포에서의 발현보다 적어도 1-5%, 5%-10%, 10-15%, 15-20%, 20-25%, 25-30%, 30-35%, 35-40%, 40-45%, 45-50%, 50-55%, 55-60%, 65-70%, 70-75%, 75-80%, 80-85%, 85-90%, 또는 90-95% 더 높은 백분율이다. 일부 경우에, 발현 카세트 내의 조절 요소, 또는 이같은 조절 요소를 발현 카세트에서 사용하는 것은 PV 세포, 또는 CNS 내의 PV 세포, 또는 PV 뉴런에서의 선택적 유전자 발현을 발생시키고, 여기서 트랜스진을 발현하는 세포의 약 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%가 PV 양성이다.
일부 경우에, 발현 카세트 또는 유전자 요법은 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 또는 10개 이상의 표 1에 기술된 바와 같은 조절 요소, 예를 들어, 서열식별번호: 1-32, 또는 이의 기능성 단편 또는 조합물, 또는 이에 대한 서열 동일성이 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%인 서열을 포함한다.
일부 경우에, 하나 이상의 PV 세포 선택적 조절 요소 또는 하나 이상의 본원에 개시된 조절 요소는 발현 카세트 내의 임의의 트랜스진에 작동가능하게 연결된다. 일부 경우에, 발현 카세트는 유전자 요법이다. 일부 경우에, 발현 카세트는 벡터 또는 플라스미드, 예를 들어, 바이러스 벡터 또는 rAAV 벡터의 일부분이다. 일부 경우에, 발현 카세트는 AAV1, AAV8, AAV9, 또는 AAVDJ 또는 이의 변이체 또는 하이브리드의 일부분이다. 일부 경우에, 발현 카세트는 트랜스진에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 PV 세포 선택적 조절 요소 또는 하나 이상의 본원에 개시된 조절 요소를 포함하고, 여기서 트랜스진은 SCN1A, SNC2A, SNC8A, SCN1B, SCN2B, KV3.1, KAV3.2, KV3.3, STXBP1, DNA 결합 단백질 (예를 들어, 내인성 유전자의 전사 조정인자), 또는 이의 변이체 또는 기능성 단편, 또는 이에 대한 서열 동일성이 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%인 서열이다. 일부 경우에, 이같은 조절 요소는 비-PV CNS 세포-유형에 비교하여 PV 뉴런에서의 트랜스진의 선택적 발현을 증가시킨다. 일부 경우에, 이같은 조절 요소는 표적 세포 유형, 예컨대 PV 뉴런에서 선택적으로 트랜스진의 발현을 증가시킨다. 일부 경우에, 표적 세포 유형은 PV 세포이다.
체세포의 유전자 요법에 대해 본원에서 구상되는 기술은 바이러스 벡터 (예를 들어, 레트로바이러스, 아데노바이러스, AAV, 헬퍼-의존적 아데노바이러스 시스템, 하이브리드 아데노바이러스 시스템, 헤르페스 심플렉스, 폭스 바이러스, 렌티바이러스, 및 엡스타인-바 바이러스), 및 비-바이러스 시스템, 예컨대 물리적 시스템 (네이키드 DNA, DNA 포격, 전기천공, 수력학, 초음파, 및 마그네토펙션), 및 화학적 시스템 (양이온성 지질, 상이한 양이온성 중합체, 및 지질 중합체)을 통한 전달을 포함한다.
벡터 또는 바이러스 발현 벡터의 클로닝 용량은 대형 트랜스진의 발현을 위한 특별한 난제이다. 예를 들어, AAV 벡터는 전형적으로 패키징 용량이 ~4.8 kb이고, 렌티바이러스는 전형적으로 용량이 ~8 kb이고, 아데노바이러스는 전형적으로 용량이 ~7.5 kb이며, 알파바이러스는 전형적으로 용량이 ~7.5 kb이다. 일부 바이러스는 패키징 용량이 더 클 수 있고, 예를 들어, 헤르페스바이러스는 용량이 >30 kb일 수 있고, 우두는 용량이 ~25 kb일 수 있다. 유전자 요법에 AAV를 사용하는 것의 장점은 낮은 병원성, 숙주 게놈 내로의 매우 낮은 통합 빈도, 및 분열 세포 및 비-분열 세포를 감염시키는 능력을 포함한다.
특정 바이러스 벡터의 크기 제약을 다루기 위해 또는 바이러스 벡터로부터의 발현을 개선하기 위해, 본 개시내용은 길이가 2.5 kb, 2 kb, 1.5 kb, 1 kb, 900 bp, 800 bp, 700 bp, 600 bp, 500 bp, 400 bp, 300 bp, 200 bp, 150 bp, 또는 110 bp보다 짧지만, 적어도 10 bp, 50 bp 또는 100 bp인 조절 요소를 사용하는 것을 구상한다. 일부 경우에, 조합된 조절 요소의 크기는 약 2500 bp, 2000 bp, 1500 bp, 1400 bp, 1300 bp, 1200 bp, 1100 bp, 또는 1000 bp이다. 일부 경우에, 각각의 조합된 조절 요소는 총 길이가 약 100 bp, 200 bp, 300 bp, 400 bp, 500 bp, 600 bp, 700 bp, 800 bp, 900 bp, 1000 bp, 1100 bp, 1200 bp, 1300 bp, 1400 bp, 1500 bp, 1600 bp, 1700 bp, 1800 bp, 1900 bp, 2000 bp, 2100 bp, 2200 bp, 2300 bp, 2400 bp, 또는 2500 bp이다. 일부 경우에, 조합된 RE의 크기는 총 길이가 약 200 bp-3000 bp, 200 bp-2500 bp, 200 bp-2100 bp, 500 bp-2500 bp, 1000 bp-2500 bp, 1500 bp-2500 bp, 1500b-2000 bp, 또는 2000 bp-2500 bp이다.
일부 경우에, 본 개시내용의 조절 요소는 바람직하게는 (i) 선택적으로 관심 세포-유형, 예컨대 PV 세포에서의 발현을 구동시키는 것이고; (ii) 인간 유래 서열을 포함하며, (iii) 2.5 kb, 2 kb, 1.5 kb, 또는 1 kb보다 작다.
원형 또는 선형 핵산 분자일 수 있는 발현 카세트가 본원에서 또한 구상된다. 일부 경우에, 발현 카세트는 벡터 (예를 들어, 발현 벡터) 내에서 세포 (예를 들어, 표적 세포 또는 세포 유형 및/또는 비-표적 세포 유형을 포함하는 복수의 상이한 세포 또는 세포 유형)에 전달된다. 벡터가 발현 카세트 및/또는 트랜스진을 세포의 게놈 내로 통합시키는 능력과 관련하여, 벡터는 통합 또는 비-통합 벡터일 수 있다. 통합 벡터 또는 비-통합 벡터가 조절 요소에 작동가능하게 연결된 트랜스진을 함유하는 발현 카세트를 전달하는데 사용될 수 있다. 벡터의 예는 (a) 비-바이러스 벡터 예컨대 선형 올리고뉴클레오티드 및 원형 플라스미드를 포함하는 핵산 벡터; 인공 염색체 예컨대 인간 인공 염색체 (HAC), 효모 인공 염색체 (YAC), 및 박테리아 인공 염색체 (BAC 또는 PAC); 에피솜 벡터; 트랜스포존 (예를 들어, 피기백(PiggyBac)); 및 (b) 바이러스 벡터 예컨대 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 및 AAV 벡터를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 바이러스는 특정 표적 세포 또는 조직에 대한 높은 감염력 및/또는 향성을 포함하여 핵산 전달을 위한 여러 장점이 있다. 일부 경우에, 바이러스는 트랜스진에 작동가능하게 연결된 본원에 기술된 바와 같은 하나 이상의 조절 요소를 포함하는 핵산 분자 또는 발현 카세트를 전달하는데 사용된다.
바이러스 유전자 요법 벡터 또는 유전자 전달 벡터의 바람직한 특성은 재현가능하고, 안정적으로 번식되며, 높은 역가로 정제되는 능력; 표적화된 전달을 매개하는 능력 (예를 들어, 다른 곳으로의 광범위한 벡터 보급 또는 표적을 벗어나는 전달 없이 트랜스진을 관심 조직 또는 기관으로 특이적으로 전달하는 능력); 및 해로운 부작용 또는 표적을 벗어나는 효과를 유도하지 않으면서 유전자 전달 및/또는 트랜스진 발현을 매개하는 능력을 포함한다. 잠재적인 유해한 부작용을 피하기 위해, 트랜스진을 세포-유형-선택적 조절 요소, 예를 들어, 서열식별번호: 1-32, 또는 이의 기능성 단편 또는 조합물, 또는 이에 대한 서열 동일성이 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%인 서열, 인핸서, 프로모터, 안정성 요소, UTR, 또는 이의 조합물 중 하나 이상의 제어 하에 놓음으로써 표적화된 발현 또는 조직/세포-유형 선택적 발현이 달성될 수 있다. 예를 들어, 다수의 상이한 세포 유형을 감염시키도록 바이러스 벡터를 함유하는 바이러스 입자가 디자인될 수 있지만, 트랜스진의 발현이 관심 세포 유형 (예를 들어 PV 뉴런)에서 강화 및/또는 최적화되고, 다른 비-표적 세포 유형 (예를 들어, 비-PV CNS 세포)에서는 트랜스진의 발현이 감소 및/또는 최소화된다. 상이한 세포 유형에서의 트랜스진의차등 발현이 하나 이상의 세포 유형에 대해 선택적인 상이한 전사 인자 또는 조절 요소를 사용하여 제어, 조작, 또는 조종될 수 있다. 일부 경우에, 하나 이상의 조절 요소, 예컨대 프로모터 또는 인핸서, 또는 이의 조합물이 트랜스진에 작동가능하게 연결되어 트랜스진의 조직- 또는 세포-선택적 발현을 구동시킨다. 일부 경우에, 유전자 요법 또는 벡터에서 사용된 하나 이상의 조절 요소가 세포-유형 선택적 방식으로 유전자 발현을 구동시키고, 즉, 표적 세포, 세포 유형, 또는 조직에서의 선택적 유전자 발현을 부여하고/하거나, 하나 이상 (예를 들어, 적어도 1개, 2개, 3개 또는 4개)의 표적을 벗어나는 세포 또는 세포 유형에서는 유전자 발현을 구동시키지 않는다. 일부 경우에, 트랜스진에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 조절 요소가 표적 세포, 세포 유형, 또는 조직에서의 트랜스진의 선택적 발현을 강화하는 한편, 이러한 하나 이상의 조절 요소는 표적을 벗어나는 세포, 세포 유형, 또는 조직에서 트랜스진 발현을 억제하거나, 또는 하나 이상의 표적을 벗어나는 세포, 세포 유형, 또는 조직에서 유의하게 더 낮은, 미소한, 또는 통계적으로 더 낮은 유전자 발현을 부여한다.
비-병원성 파르보바이러스인 AAV의 여러 혈청형이 유전자 전달의 목적을 위해 조작되었고, 이들 중 일부는 특정 조직 또는 세포 유형에 대한 향성이 있는 것으로 공지되어 있다. 다양한 유전자 요법 용도에 사용되는 바이러스는 복제-결핍성이도록 또는 대상체 또는 숙주 내에서 독성이 낮고 병원성이 낮도록 조작될 수 있다. 바이러스 게놈으로부터의 코딩 영역 전체 또는 일부를 결실시키고, 벡터 게놈을 바이러스 캡시드 내로 패키징하는 것과 같은 기능 또는 숙주 염색질 내로의 벡터 핵산 (예를 들어, DNA)의 통합에 필요한 서열 (예를 들어, 역위 말단 반복 서열)을 무손상으로 남김으로써 이같은 바이러스-기반 벡터를 수득할 수 있다. 트랜스진을 포함하는 발현 카세트를, 예를 들어, 바이러스 유전자가 결여된 변형 또는 조작된 바이러스 백본과 같은 바이러스 백본 내로 클로닝할 수 있고, 추가적인 벡터 (예를 들어, 패키징 벡터)와 함께 사용할 수 있으며, 이는, 예를 들어, 공동-형질감염되는 경우, 재조합 바이러스 벡터 입자를 형성할 수 있다. 일부 경우에, 혈액 뇌 장벽을 가로지르거나 또는 CNS의 세포를 감염시킬 수 있는 AAV 혈청형이 바람직하다. 일부 경우에, AAV9 또는 이의 변이체가 트랜스진에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 PV 선택적 조절 요소를 포함하는 본 개시내용의 발현 카세트를 전달하는데 사용된다.
본원에 기술된 바와 같이, 유전자 요법, 예를 들어, rAAV를 사용하여 본 개시내용의 발현 카세트를 전달하는 것의 한 장점은 이같은 요법이 더욱 표적화되고 지속되는 치료 효과를 경시적으로 제공할 수 있다는 것이다. 추가적으로, 바이러스 유전자 요법은 비-표적 세포 유형 또는 조직에 비해 관심 세포 유형 또는 조직에 대한 향성이 있도록 조작될 수 있다. 예를 들어, 표적을 벗어나는 조직 또는 세포 유형 (예를 들어, 비-CNS 조직 또는 세포 유형, 비-PV CNS 세포) 상에서의 효과가 최소이면서, 페이로드 또는 치료제, 예를 들어, 전사 조정인자 또는 트랜스진을 CNS 내의 하나 이상의 영역, 조직 또는 세포 유형 (예를 들어, PV 세포)에 감염시키고 전달하도록 바이러스 유전자 요법이 조작될 수 있다. 일부 경우에, 혈액 뇌 장벽을 가로질러 트랜스진을 전달하고/하거나 CNS 내의 특정 영역 또는 조직 (예를 들어, 해마) 또는 CNS 내의 세포 유형, 예를 들어, PV 세포를 표적화하도록 바이러스 유전자 요법이 조작될 수 있다.
일부 경우에, 생체 내에서 또는 시험관 내에서 세포, 세포 유형, 또는 조직 내로 하나 이상의 조절 요소 및 트랜스진을 전달하는데 사용된 AAV 벡터 또는 AAV 바이러스 입자, 또는 비리온은 바람직하게는 복제-결핍성이다. 일부 경우에, AAV 바이러스는 헬퍼 인자의 존재 하에서만 복제 및 비리온 생성이 가능하도록 조작되거나 또는 유전적으로 변형될 수 있다.
일부 경우에, 발현 카세트는 AAV 또는 재조합 AAV (rAAV)에 의한 전달용으로 디자인된다. 일부 경우에, 발현 카세트는 렌티바이러스 또는 렌티바이러스 벡터를 사용하여 전달된다. 일부 경우에, 더 큰 트랜스진, 즉, AAV의 클로닝 용량을 초과하는 유전자가 렌티바이러스 또는 렌티바이러스 벡터를 사용하여 바람직하게 전달된다.
본원에 기술된 조성물 및 방법에서 사용되는 AAV는 하이브리드 또는 키메라 AAV 혈청형을 포함하여 임의의 혈청형 (예를 들어, AAV1, AAV2, AAV5, AAV8, AAV9, 및 AAVDJ)의 것일 수 있다. 일부 경우에, AAV는 비-PV CNS 세포에 비교하여 PV 뉴런에 대해 선택적인 하나 이상의 조절 요소에 작동가능하게 연결된 트랜스진을 전달하고/하거나 발현시키는데 사용된다. 일부 경우에, CNS 세포에 대한 향성이 높고/높거나 혈액 뇌 장벽을 가로지르는 AAV가 사용된다. 일부 경우에, AAV1, AAV8, AAV9, 및/또는 AAVDJ가 본원에 기술된 발현 카세트를 전달하는데 사용된다.
일부 경우에, 발현 카세트는 생체 내에서, 예컨대 유전자에서의 반수체기능부전과 연관된 질환 또는 병태에서 불충분하게 발현되는 것으로 공지된 트랜스진에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 PV 세포 선택적 조절 요소 또는 하나 이상의 본원에 개시된 조절 요소를 포함한다. 일부 경우에, 트랜스진은 전압-게이팅 이온 채널 (예를 들어, 나트륨 이온 채널 또는 칼륨 이온 채널), 신경전달물질 조절인자, 또는 이의 서브유닛 또는 기능성 단편이다. 일부 측면에서, 트랜스진은 DNA 결합 단백질, 이온 채널, 신경전달물질 조절인자, 또는 이온 채널 또는 신경전달물질 조절인자의 서브유닛이다. 일부 경우에, 트랜스진은 하나 이상의 아연 손가락을 포함하는 DNA 결합 단백질이다. 일부 경우에, DNA 결합 단백질은 Cas9, Cas 패밀리 단백질, 뉴클레아제-불활성화 Cas9 (또는 dCas9), dCas 패밀리 단백질, 또는 전사 활성화제 유사 이펙터 (TALE)의 도메인을 포함한다. 일부 경우에, 트랜스진은 DNA 결합 단백질, 또는 DNA 절단 도메인 또는 뉴클레아제 도메인이 비활성화된 DNA 절단 단백질 (예를 들어, 뉴클레아제, 제한 효소, 리컴비나제 등), 예를 들어, 뉴클레아제-비활성화 Cas (dCas), 비활성화 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제, 또는 뉴클레아제-비활성화 아연 손가락 단백질의 DNA 결합 도메인을 포함하는 DNA 결합 단백질이다. 일부 경우에, DNA 결합 도메인은 전사 조정 도메인 (예를 들어, 전사 활성화제 또는 억제인자 도메인)에 연결된다. 일부 경우에, 트랜스진은 유전자 편집 단백질, 예를 들어, Cas 단백질, Cas9를 포함한다.
일부 측면에서, 트랜스진은 전압-게이팅 이온 채널 또는 이의 서브유닛, 예컨대 SCN1A, SNC2A, SNC8A, SCN1B, SCN2B, KV3.1, KV3.2, 또는 KV3.3, 또는 이의 기능성 단편 또는 변이체이다. 일부 경우에, 트랜스진은 나트륨 이온 채널의 알파 서브유닛이다. 일부 경우에, 트랜스진은 나트륨 이온 채널의 베타 서브유닛이다. 일부 측면에서, 신경전달물질 조절인자는 STXBP1 또는 이의 기능성 단편 또는 변이체이다.
일부 측면에서, 발현 카세트는 바이러스 벡터, 예컨대 AAV로서 전달된다. 일부 측면에서, AAV는 AAV1, AAV8, AAV9, AAV-DJ, scAAV1, scAAV8, 또는 scAAV9이다. 일부 측면에서, 본 개시내용의 발현 카세트를 포함하는 유전자 요법은 이를 필요로 하는 대상체 (예를 들어, 인간 환자, 포유동물, 트랜스제닉 동물, 또는 동물 모델)에게 투여된다. 일부 경우에, 이를 필요로 하는 대상체는 알츠하이머병, 드라벳 증후군, 간질, 신경변성, 타우병증, 뉴런 과소흥분성, 및/또는 발작의 증상이 있거나, 알츠하이머병, 드라벳 증후군, 간질, 신경변성, 타우병증, 뉴런 과소흥분성, 및/또는 발작으로 진단되었거나, 또는 알츠하이머병, 드라벳 증후군, 간질, 신경변성, 타우병증, 뉴런 과소흥분성, 및/또는 발작이 발달될 위험이 있다. 일부 경우에, 이를 필요로 하는 대상체는 SCN1A, SNC2A, SNC8A, SCN1B, SCN2B, KV3.1, KV3.2, KV3.3, 및 STXBP1 중 임의의 하나 이상에서의 불충분한 유전자 발현 또는 돌연변이가 있다.
일부 경우에, 유전자 요법, 예컨대 rAAV9가 트랜스진에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 PV 세포 선택적 조절 요소 또는 하나 이상의 본원에 개시된 조절 요소를 포함하는 발현 카세트를 전달하는데 사용되고, 여기서 트랜스진은 SCN1A, SNC2A, SNC8A, SCN1B, SCN2B, KV3.1, KV3.2, KV3.3, STXBP1, DNA 결합 단백질, 또는 이의 기능성 단편, 또는 SCN1A, SNC2A, SNC8A, SCN1B, SCN2B, KV3.1, KV3.2, KV3.3, STXBP1, DNA 결합 단백질, 또는 이의 기능성 단편 중 어느 하나에 대한 서열 동일성이 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%인 서열이다. 일부 경우에, 트랜스진은 하기 표 2에서 제공된 바와 같은 서열식별번호: 37-43, 또는 이의 기능성 단편 중 어느 하나에 대한 서열 동일성이 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%인 서열을 포함한다.
일부 경우에, 트랜스진은 서열식별번호: 36-43, 또는 이의 기능성 단편, 또는 이에 대한 서열 동일성이 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%인 서열 중 어느 하나이다. 일부 경우에, 하나 이상의 본원에 개시된 조절 요소가 발현 카세트 내의 서열식별번호: 36-43, 또는 이의 기능성 단편, 또는 이에 대한 서열 동일성이 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%인 서열 중 어느 하나에 작동가능하게 연결된다.
<표 2> 본원에 개시된 아미노산 서열의 목록
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
일부 경우에, 하나 이상의 PV 세포 선택적 조절 요소는 서열식별번호: 1-32의 서열, 이의 기능성 단편 또는 조합물, 또는 이에 대한 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 서열을 포함한다. 일부 경우에, 서열 동일성은 BLAST에 의해 측정된다. 일부 경우에, 이같은 유전자 요법은 간질, 신경변성, 타우병증, 뉴런 과소흥분성, 드라벳 증후군 및/또는 알츠하이머병을 치료하는데 사용된다. 일부 경우에, 이같은 유전자 요법은 드라벳 증후군 및/또는 알츠하이머병과 연관된 간질 및/또는 발작을 치료하는데 사용된다. 일부 경우에, 본원에 기술된 유전자 요법을 사용하는 치료는 발작 빈도 및/또는 기간 감소를 발생시킨다. 일부 경우에, 본원에 기술된 유전자 요법을 사용하는 치료는 생체 내에서 기능성 나트륨 이온 채널, 기능성 칼륨 이온 채널, 또는 기능성 신경전달물질 조절의 형성 증가를 발생시킨다.
일부 경우에, AAV 혈청형 1, 8, 및/또는 9, 또는 이의 하이브리드가 PV 세포에서의 선택적 발현을 표적화하도록 본원에 기술된 발현 카세트와 함께 사용될 수 있다. 일부 경우에, AAV에 의한 전달용으로 디자인된 발현 카세트는 5' ITR, 하나 이상의 세포-유형 선택적 조절 요소, 임의적인 인핸서, 임의적인 최소 프로모터, 트랜스진, 임의적인 하나 이상의 인트론, 임의적인 폴리A 신호, 및 3' ITR을 포함한다. 일부 예에서, 발현 카세트는 5' ITR, 2개의 세포-유형 선택적 RE, 기본 프로모터, 트랜스진, 하나 이상의 전사후 RNA 조절 요소, 및 3'ITR을 함유할 수 있다.
예시적인 AAV 발현 카세트가 도 7에서 도해된다. 일부 경우에, 발현 카세트는 5' AAV ITR, 인핸서 (예를 들어, PV 세포 선택적 인핸서 또는 하나 이상의 조합된 조절 요소), 프로모터 (예를 들어, 하나 이상의 PV 세포 선택적 프로모터 또는 조절 요소), 트랜스진 (예를 들어, SCN1A, SNC2A, SNC8A, SCN1B, SCN2B, KV3.1, KV3.2, KV3.3, STXBP1, 또는 DNA 결합 단백질), 전사후 조절 요소, 및 3' AAV ITR을 함유한다. 프로모터는 PV 세포 선택적, 또는 구성적 프로모터일 수 있다. 일부 경우에, 트랜스진은 리포터 유전자, 예를 들어, eGFP, RFP, 또는 형광 마커에 대한 코딩 서열이다. 다른 경우에, 트랜스진은 유전자 발현을 조정하는 DNA 결합 단백질이다.
일부 경우에, 트랜스진은 치료용 트랜스진, 예를 들어, SCN1A, SNC2A, SNC8A, SCN1B, SCN2B, KV3.1, KV3.2, KV3.3, STXBP1, 또는 DNA 결합 단백질, 또는 기능성 단편 또는 이에 대한 서열 동일성이 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%인 서열에 대한 코딩 서열이다. 전사후 조절 요소는 mRNA로부터의 단백질의 발현 또는 RNA의 안정성에 영향을 미칠 수 있는 임의의 서열, 예를 들어, 인트론, 내부 리보솜 진입 부위 (IRES), 또는 우드척 간염 바이러스 전사후 조절 요소일 수 있다. 일부 경우에, 전사후 조절 요소는 2개 이상의 전사후 조절 요소의 조합물이다.
발현 카세트는 최적화된 치료용 레트로바이러스 벡터, 예를 들어, 렌티바이러스 벡터에 의한 전달용으로 디자인될 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 좌측 (5') LTR; 바이러스의 패키징 및/또는 핵 유입을 보조하는 서열, 적어도 하나의 세포-유형 선택적 조절 요소, 임의적인 렌티바이러스 역반응 요소 (RRE); 임의적인 프로모터 또는 이의 활성 부분; 하나 이상의 조절 요소에 작동가능하게 연결된 트랜스진; 임의적인 인슐레이터; 및 우측 (3') 레트로바이러스 LTR을 포함하는 렌티바이러스 벡터일 수 있다.
일부 경우에, 발현 카세트는 하나 이상의 본원에 개시된 세포-유형 선택적 조절 요소를 포함한다. 일부 경우에, 발현 카세트는 조합된 2개 이상의 조절 요소를 포함한다. 일부 예에서, 발현 카세트는 조합되지 않은 2개 이상의 조절 요소, 예를 들어, 트랜스진의 상류의 프로모터 및 트랜스진의 하류에 위치하는 인핸서 또는 안정성 요소를 포함한다.
일부 경우에, 발현 카세트는 관심 세포 유형에서 선택적 활성이 있는 추정 세포-유형 선택적 조절 요소, 예를 들어, 추정 PV 세포 선택적 조절 요소를 함유한다. 추정 조절 요소를 함유하는 발현 카세트를 바이러스 벡터 내로 패키징할 수 있고, 동물 모델 내로 형질감염시켜 추정 세포-유형 선택적 조절 요소의 활성을 평가할 수 있다. 일부 경우에, 추정 세포-유형 선택적 조절 요소를 함유하는 벡터를 표적 세포 또는 세포 유형을 포함하는 복수의 세포 또는 세포 유형 내로 전달한 후, 추정 조절 요소의 세포-유형 선택적 활성을 대조군 조절 요소, 예컨대 구성적 프로모터 또는 조절 요소, 또는 이전에 공지된 조절 요소에 비교함으로써, 추정 세포-유형 선택적 조절 요소를 시험관 내에서 또는 생체 외에서 평가할 수 있다.
일부 경우에, 선택적 발현은 치료용 모이어티 또는 트랜스진을 관심 세포-유형 (또는 관심 조직-유형), 예컨대 CNS 내의 PV 뉴런에서 선택적으로 발현시키는데 사용된다. 일부 경우에, 트랜스진에 작동가능하게 연결된 세포-유형 선택적 조절 요소를 포함하는 벡터는 하나 이상 (예를 들어, 적어도 2개, 3개, 4개, 또는 5개)의 다른 세포, 세포 유형, 조직 또는 조직 유형에 비교하여 관심 세포-유형에서 트랜스진의 선택적 발현 증가를 발생시키거나, 또는 하나 이상의 세포 또는 세포 유형, 예를 들어, 적어도 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 비-표적 세포 유형에 비교하여 관심 세포-유형에서 트랜스진의 우선적인 발현을 발생시킨다.
임의의 공지된 기술을 세포-유형 선택적 방식으로 트랜스진의 시험관내, 생체내 또는 생체외 발현을 부여하거나 유도하기 위해 조절 요소 및 트랜스진, 또는 조절 요소 및 트랜스진을 포함하는 조성물을 관심 세포 (또는 표적 세포 또는 세포 유형)에 전달하는데 사용할 수 있다.
본 개시내용의 세포-유형 선택적 조절 요소를 함유하는 발현 카세트는 하나 이상의 트랜스진을 추가로 포함한다. 트랜스진은 단백질-코딩 유전자일 수 있다. 일부 경우에, 발현 카세트는 트랜스진을 함유한다. 트랜스진은 부재하거나 결함이 있는 유전자를 교체할 수 있거나, 또는 세포 내부에서의 단백질의 부족한 발현을 보상할 수 있다. 트랜스진은 세포 신호전달 경로에서 수반될 수 있다. 일부 경우에, 트랜스진은 야생형 단백질, 이의 기능성 단편, 치료용 성질이 강화된, 예를 들어 활성이 강화된 변이체 또는 돌연변이체 단백질을 코딩할 수 있다. 일부 경우에, 트랜스진은 하나 이상의 아연 손가락 또는 dCas9의 도메인을 포함하는 DNA 결합 단백질, 이온 채널, 예컨대 칼륨 이온 채널 또는 나트륨 이온 채널, 또는 이의 서브유닛, 신경전달물질 인자 또는 신경전달물질 조절인자를 코딩할 수 있다. 일부 경우에, 트랜스진은 이온 채널 서브유닛, 이의 변이체, 또는 돌연변이체를 코딩할 수 있다. 일부 경우에, 트랜스진은 DNA 결합 단백질, 또는 DNA 절단 도메인 또는 뉴클레아제 도메인이 비활성화된 DNA 절단 단백질 (예를 들어, 뉴클레아제, 제한 효소, 리컴비나제 등), 예를 들어, 뉴클레아제-비활성화 Cas (dCas), 비활성화 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제, 또는 뉴클레아제-비활성화 아연 손가락 단백질의 DNA 결합 도메인을 포함하는 DNA 결합 단백질이다. 일부 경우에, DNA 결합 도메인은 전사 조정 도메인 (예를 들어, 전사 활성화제 또는 억제인자 도메인)에 연결된다. 일부 경우에, 트랜스진은 유전자 편집 단백질, 예를 들어, Cas 단백질, Cas9를 포함한다.
본원에 개시된 조절 요소는 발현 벡터 또는 카세트 내의 임의의 위치에 위치할 수 있다. 예를 들어, 조절 요소는 인핸서의 상류, 인핸서의 하류이지만 프로모터의 상류, 트랜스진의 5' UTR 내, 트랜스진의 인트론 내, 트랜스진의 3' UTR 내, 또는 트랜스진의 하류에 위치할 수 있다. 일부 경우에, 하나 이상의 조절 요소는 작동가능하게 연결된 트랜스진의 상류 또는 하류에 위치한다.
일부 예에서, 본 개시내용의 조절 요소는 ELISA에 의해 측정 시 표적 세포 유형 (예를 들어, PV 세포)에서 적어도 0.5, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.5, 또는 3 IU/ml인 수준으로 작동가능하게 연결된 트랜스진의 선택적 발현을 발생시킨다. 일부 경우에, 조절 요소가 트랜스진 발현을 증가시키는 능력을 전체 마우스에서의 트랜스진 발현의 총량 및/또는 트랜스진 발현이 있는 세포 유형 또는 조직 유형의 총 개수가 측정되는 마우스에서 평가할 수 있다.
발현 카세트 또는 벡터의 활성을 평가하는 경우, 활성 또는 발현은 단위 용량 당 활성 또는 발현 수준으로 표현될 수 있거나, 또는 세포, 마우스 또는 대상체에게 투여 또는 전달된 발현 카세트 또는 벡터의 용량에 대해 정규화될 수 있다. 일부 경우에, 트랜스진의 발현 또는 활성이 조절 요소의 존재 또는 부재 하의 상이한 발현 벡터 또는 카세트에 걸친 비교를 허용하도록 사용된 플라스미드 또는 DNA (예를 들어, 마우스 당 ㎍/kg), 또는 바이러스 입자의 양에 대해 정규화된다 (예를 들어, 마우스 또는 대상체 당 게놈 카피/kg의 양에 대해 정규화된다). 예를 들어, 마우스에서의 조절 요소의 활성을 평가하는 경우, 검정된 PV 세포에서의 선택적 발현 또는 활성이 마우스 당 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 또는 10 초과 또는 720 ㎍의 발현 벡터, 카세트, 또는 플라스미드의 용량에 대해 정규화될 수 있다. 일부 경우에, 발현 수준 또는 활성이 마우스 당 본원에 개시된 바와 같은 발현 벡터 또는 카세트를 함유하는 1010, 1011, 1012, 1013, 1014, 또는 1015 gc/kg의 바이러스 입자에 대해 정규화될 수 있다.
일부 측면에서, 발현 카세트는 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 또는 5개 초과의 비-표적 세포 유형에 비해 표적 세포 유형에서 트랜스진의 세포-유형 선택적 발현 또는 우선적 발현을 발생시키도록 트랜스진에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 본원에 개시된 조절 요소 (예를 들어, 서열식별번호: 1-32, 또는 이의 기능성 단편 또는 조합물, 또는 이에 대한 서열 동일성이 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%인 서열 중 임의의 하나 이상)를 포함한다. 일부 경우에, 발현 카세트는 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 또는 5개 초과의 비-표적 아유형 또는 세포의 모든 다른 공지된 아유형에 비해 표적 세포 아유형에서 세포-유형 선택적 발현 또는 우선적 발현을 발생시키도록 트랜스진에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 조절 요소를 포함한다. 일부 경우에, 트랜스진은 SCN1A, SNC2A, SNC8A, SCN1B, SCN2B, KV3.1, KV3.3, 및 STXBP1, 또는 이의 기능성 단편, 또는 이에 대한 서열 동일성이 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%인 서열 중 어느 하나이다. 일부 경우에, 트랜스진은 내인성 유전자 (예를 들어, 내인성 SCN1A, SNC2A, SNC8A, SCN1B, SCN2B, KV3.1, KV3.2, KV3.3, 또는 STXBP1)를 조정하는 DNA 결합 단백질이다. 일부 경우에, 트랜스진은 서열식별번호: 36-43, 또는 이의 기능성 단편, 또는 이에 대한 서열 동일성이 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%인 서열 중 어느 하나이다. 일부 경우에, 트랜스진은 전사 조정인자이다. 일부 경우에, 트랜스진은 DNA 결합 단백질, 또는 DNA 절단 도메인 또는 뉴클레아제 도메인이 비활성화된 DNA 절단 단백질 (예를 들어, 뉴클레아제, 제한 효소, 리컴비나제 등), 예를 들어, 뉴클레아제-비활성화 Cas (dCas), 비활성화 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제, 또는 뉴클레아제-비활성화 아연 손가락 단백질의 DNA 결합 도메인을 포함하는 DNA 결합 단백질이다. 일부 경우에, DNA 결합 도메인은 전사 조정 도메인 (예를 들어, 전사 활성화제 또는 억제인자 도메인)에 연결된다. 일부 경우에, 트랜스진은 유전자 편집 단백질, 예컨대 Cas 패밀리 단백질, Cas9, 아연 손가락 뉴클레아제, 아연 손가락 뉴클레아제, 또는 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제이다. 일부 경우에, 트랜스진은 리포터 유전자 또는 형광 마커이다. 일부 경우에, 본원에 개시된 발현 카세트는 바이러스 벡터이다. 일부 경우에, 본원에 개시된 발현 카세트는 rAAV, 예컨대 rAAV9 또는 rAAVDJ 내에 패키징된다. 일부 경우에, 본원에 개시된 발현 카세트는 유전자 요법으로서 세포 내로 전달된다. 일부 경우에, 대상체, 바람직하게는 인간 또는 포유동물 내로 본원에 개시된 유전자 요법이 전달된다. 일부 경우에, 본원에 개시된 발현 카세트는 신경학적 병태 또는 질환, 예컨대 간질, 신경변성 질환, 타우병증, 뉴런 과소흥분성, 드라벳 증후군 또는 알츠하이머병을 치료하는데 사용된다.
일부 경우에, 발현 카세트 (예를 들어, 유전자 요법, 바이러스 벡터, 벡터, 또는 플라스미드)는 트랜스진에 작동가능하게 연결된, 서열식별번호: 1-32, 또는 이의 기능성 단편 또는 조합물, 또는 이에 대한 서열 동일성이 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%인 서열 중 임의의 하나 이상을 포함한다. 일부 경우에, 이같은 조합된 조절 요소들은 뉴클레오티드 1-50개의 링커를 사용하여 연결된다. 일부 경우에, 이같은 조합된 조절 요소들은 연결되지 않는다. 일부 경우에, 2개 이상의 조절 요소가 프로모터의 상류 및/또는 하류에 위치한다. 일부 경우에, 2개 이상의 조절 요소가 트랜스진의 상류 및/또는 하류에 위치한다.
일부 경우에, 하나 이상의 본원에 개시된 조절 요소를 포함하는 발현 카세트는, 임의의 트랜스진 (예를 들어, 리포터 트랜스진 또는 치료용 트랜스진)에 작동가능하게 연결된 경우, 동일한 트랜스진에 작동가능하게 연결된 경우의 CAG, EF1α, 구성적 프로모터, 또는 비-선택적 조절 요소에 의해 또는 조절 요소가 없는 동일한 구축물에 의해 구동되는 발현보다 통계적으로 유의하게 더 높은 수준으로 적어도 하나의 표적 세포 유형에서 선택적 발현 또는 우선적 발현을 구동시킨다. 일부 경우에, 통계적으로 유의하게 더 높음은 표적 세포 유형에서 동일한 트랜스진에 작동가능하게 연결된 경우의 CAG, EF1α, 구성적 프로모터, 또는 비-선택적 조절 요소에 의한, 또는 조절 요소가 없는 동일한 구축물에 의한 발현 수준의 적어도 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 10.5, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 100배인 수준으로 조절 요소가 표적 세포 유형에서 선택적 발현을 구동시킨다는 것을 의미한다. 일부 경우에, 본원에 기술된 바와 같은 공동-국소화 검정법을 사용하여 이같은 세포-유형 선택적 발현이 검정된다.
다른 측면에서, 본원에 개시된 임의의 트랜스진에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 본원에 개시된 조절 요소를 포함하는 발현 카세트는 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 또는 5개 초과의 비-표적 세포 유형 또는 비-표적 아유형에 비해 표적 세포 유형에서의 트랜스진의 선택적 발현 또는 우선적 발현을 발생시킨다.
일부 예에서, 표적 세포 유형은 PV 세포이다. 일부 경우에, 비-표적 세포 아유형은 본원에 개시된 비-PV GABA작용성 아유형 중 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개 또는 적어도 4개이다. 일부 경우에, 본원에 개시된 조절 요소를 포함하는 발현 카세트는 모든 비-PV GABA작용성 세포 또는 모든 비-PV CNS 세포에 비해 PV 세포에 대해 선택적이다. 일부 경우에, 세포-유형 선택성은 본원에 개시된 공동-국소화 검정법에 따라 측정된다. 일부 경우에, 세포-유형 선택성은 표적 세포 유형에서 Cre를 발현하는 마우스를 사용하여 측정된다.
파르브알부민 (PV) 뉴런
GABA작용성 뉴런은 CNS 내의 주요 억제성 신경전달물질인 감마 아미노부티르산 (GABA)을 생산한다. GABA는 신경계 전반에 걸쳐 신경 흥분성을 감소시키는데 중요하다. GABA는 특이적인 막횡단 수용체에 결합하여 막 극성을 음으로 변화시키는 이온 채널의 개방을 야기함으로써 억제 시냅스에서 작용한다. 일반적으로 이는 세포의 과다분극을 발생시키고, 활동 전위를 유발하는데 요구되는 신호를 증가시킨다. GABA작용성 뉴런에서의 결함은 흥분성 신호전달과 억제성 신호전달 사이의 불균형을 발생시킬 수 있고, 드라벳 증후군, 간질, 신경변성, 타우병증 및 알츠하이머병을 포함하는 다수의 신경학적 질환에 연루되었다. 연루된 다른 신경학적 병태 또는 질환은 정신과 장애 (예를 들어, 정신분열병, 강박 장애, 중독, 우울증, 불안, 정신병); 자폐증 스펙트럼 장애 (예를 들어, 유약 X 증후군, 레트 증후군); 간질 (예를 들어, 만성 외상성 뇌병증, 열성 발작을 동반하는 전신 간질 (GEFS+), 간질성 뇌병증, 측두엽 간질, 국소 간질, 결절성 경화증); 및/또는 신경변성 (예를 들어, 알츠하이머병, 파킨슨병)을 포함한다. 일부 경우에, 신경학적 병태 또는 질환은 PV 뉴런이 연루되는 임의의 발작 및/또는 간질 관련 병태 또는 질환이다.
파르브알부민은 체성감각 피질 내의 전체 GABA작용성 개재뉴런의 약 40%에서 발현되는 칼슘-결합 단백질이다. CNS 내에서, PV 세포는 일반적으로 GABA작용성 세포로 간주된다. 다양한 연구에서, GABA작용성 세포는 PV, SOM, CR, CCK, NPY, VIP, 또는 이들의 조합물을 발현하는 세포를 포함하여 별개의 아유형의 세포들을 포함하는 것으로 또한 확인되었다.
PV 뉴런은 다양한 신경학적 질환 또는 병태, 예컨대 드라벳 증후군, 알츠하이머병, 간질, 신경변성, 타우병증 및/또는 발작과 특히 관련된다. 일부 경우에, PV 뉴런-연관 신경학적 병태 또는 질환은 정신과 장애 (예를 들어, 정신분열병, 강박 장애, 중독, 우울증, 불안, 정신병); 자폐증 스펙트럼 장애 (예를 들어, 유약 X 증후군, 레트 증후군); 간질 (예를 들어, 만성 외상성 뇌병증, 열성 발작을 동반하는 전신 간질 (GEFS+), 간질성 뇌병증, 측두엽 간질, 국소 간질, 결절성 경화증); 또는 신경변성 (예를 들어, 알츠하이머병, 파킨슨병)이다. 일부 경우에, 신경학적 병태 또는 질환은 PV 뉴런이 연루되는 임의의 발작 및/또는 간질 관련 병태 또는 질환이다. 다양한 측면에서, 표적 세포는 CNS 내의 PV 세포, 또는 PV를 발현하는 GABA작용성 세포이다.
다양한 측면에서, PV-발현 개재뉴런은 바구니 세포로 또한 칭해지고, 이는 세포체의 크기 (예를 들어, 대형 바구니 세포, 소형 바구니 세포, 및 둥지 바구니 세포), 및 수상돌기 및 축삭 돌출에 의해 추가로 세분될 수 있다. 생리학적으로, 종종 PV-발현 바구니 세포는 적응이 거의 없는 활동 전위 (AP)의 고주파 트레인을 특징으로 하는 급속-스파이킹 (FS)이다. PV 바구니 뉴런은 흥분성 피라미드 뉴런의 세포체 및 근위 수상돌기에 신경자극을 전달하는 것으로 널리 인정된다. FS PV-발현 바구니 뉴런을 통해 매개되는 피드포워드 억제가 시상피질, 층횡단(translaminar), 및 영역간(interareal) 회로를 포함하는 여러 피질 네트워크에서 발견될 수 있다. FS PV 바구니 뉴런은 이웃하는 흥분성 피라미드 뉴런을 강하게 억제한다. 공통되는 흥분성 입력을 공유하는 PV 바구니 뉴런 및 피라미드 뉴런이 상호 연결되는 경향이 있는 것으로 나타났다 (피드백 억제). 이러한 연결은 흥분성 드라이브에 반응하여 흥분 뉴런이 스파이크를 생성시킬 수 있는 정확한 시간 창을 조절하는 역할을 할 수 있다. 추가적으로, FS PV 바구니 뉴런 상으로의 시상피질 및 피질내 흥분성 입력이 고주파 자극에 의해 억제되고, 이는 활성-의존적 피드포워드 억제를 매개한다. PV-발현 바구니 세포는 다른 바구니 세포를 포함하는 다른 개재뉴런에 또한 신경자극을 전달하고, 틈새 이음을 통해 서로 전기적으로 커플링된다. 이러한 특색이 피질 네트워크 동기화 및 진동을 생성시키고 유지하는데 도움이 될 있는 것으로 제안되었다.
일부 경우에, 하나 이상의 본원에 개시된 조절 요소는 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개 또는 적어도 5개의 비-PV 발현 뉴런에 비교하여 PV 뉴런에서 유전자 발현의 선택성 증가를 발생시킨다. 일부 경우에, 비-PV 세포는 모든 비-PV GABA작용성 세포를 포함한다. 일부 경우에, 비-PV GABA작용성 뉴런은 칼레티닌 (CR), 소마토스타틴 (SOM), 콜레시스토키닌 (CCK), CR + SOM, CR + 뉴로펩티드 Y (NPY), CR + 혈관장 폴리펩티드 (VIP), SOM + NPY, SOM + VIP, VIP + 콜린 아세틸트랜스퍼라제 (ChAT), CCK + NPY, CR + SOM + NPY, 및 CR + SOM + VIP 발현 세포를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
일부 경우에, CAG, EF1α, 구성적 프로모터 (예를 들어, SV40, CMV, UBC, PGK, 및 CBA), 또는 비-세포-유형 선택적 방식으로 유전자 발현을 구동시키는 비-선택적 조절 요소 중 어느 하나가 본원에 개시된 PV 선택적 조절 요소 또는 임의의 세포-유형 선택적 조절 요소와의 비교에 사용될 수 있다. 일부 경우에, CAG 또는 EF1α 대조군에 작동가능하게 연결된 유전자의 발현을 초과하는 수준으로 PV 세포에서 선택적 발현을 발생시키는 조절 요소가 PV 세포에 대한 선택성의 지표이다. 일부 경우에, 본원에 개시된 조절 요소는 CAG, EF1α, 구성적 프로모터 (예를 들어, SV40, CMV, UBC, PGK, 및 CBA), 또는 비-선택적 조절 요소 (예를 들어, 서열식별번호: 34, 또는 이의 기능성 단편, 또는 이에 대한 서열 동일성이 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%인 서열)에 작동가능하게 연결된 트랜스진으로부터의 것이고 공동-국소화 검정법에서 측정된 바와 같은 PV 발현 수준보다 적어도 2%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 더 높은 PV 세포에서의 선택적 유전자 발현을 나타낸다. 일부 경우에, 본원에 개시된 조절 요소는 CAG, EF1α, 구성적 프로모터 (예를 들어, SV40, CMV, UBC, PGK, 및 CBA), 또는 비-선택적 조절 요소 (예를 들어, 서열식별번호: 34, 또는 이의 기능성 단편, 또는 이에 대한 서열 동일성이 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%인 서열) 하의 것이고 본원에 기술된 공동-국소화 검정법에서 측정된 바와 같은 발현 수준의 적어도 1.5배, 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 6배, 적어도 7배, 적어도 8배, 적어도 9배, 또는 적어도 10배인 PV 세포에서의 선택적 유전자 발현을 나타낸다.
바람직한 경우에, 하나 이상의 본원에 기술된 조절 요소는 적어도 하나의 다른 CNS 세포 유형 (예를 들어, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개의 비-PV 세포, 또는 2개 이상, 3개 이상, 또는 4개 이상의 비-PV 세포 및/또는 비-PV GABA작용성 뉴런)에 비해 GABA작용성 세포, 예컨대 파르브알부민을 발현하는 GABA작용성 세포에서 트랜스진의 발현을 선택적으로 구동시킨다.
일부 경우에, 표적 세포 유형은 파르브알부민을 발현하는 GABA작용성 뉴런, 또는 PV 세포이다.
뇌 내의 세포 소집단에서 트랜스진을 선택적으로 발현시키는 한 방식은 세포-유형 선택적 조절 요소, 또는 뇌 내의 세포 소집단, 예를 들어, PV 세포에서 선택적인 (또는 선택적인 활성이 있는) 조절 요소에 작동가능하게 연결된 트랜스진을 포함하는 바이러스 벡터를 사용하는 것이다. 바이러스 벡터는 특정 세포 유형에 대한 선택성이 없이 감염력이 높도록 선택될 수 있는 한편, 조절 요소가 선택성을 부여한다. 예를 들어, 세포-유형 선택적 조절 요소가 PV 뉴런에서 트랜스진의 발현을 구동시킬 수 있고, 다른 뉴런에서는 그렇지 않을 수 있다.
일부 경우에, 본 개시내용은 PV 뉴런에서 선택적으로 발현을 구동시키는 조절 요소 (즉, PV 세포 선택적 조절 요소)를 사용하는 것을 수반한다.
GABA작용성 세포는 감마-아미노부티르산을 생산하는 억제 뉴런이다. GABA작용성 세포는 글루탐산 데카르복실라제 2 (GAD2)의 발현에 의해 확인될 수 있다. GABA작용성 세포의 다른 마커는 GAD1, NKX2.1, DLX1, DLX5, SST, PV 및 VIP를 포함한다.
일부 예에서, 비-PV CNS 세포는 흥분 뉴런, 도파민작용성 뉴런, 별아교세포, 미세아교세포, 운동 뉴런 또는 혈관 세포이다. 일부 예에서, 비-GABA작용성 뉴런은 GAD2, GAD1, NKX2.1, DLX1, DLX5, SST 및 VIP 중 하나 이상을 발현하지 않는 세포이다. 일부 예에서, 비-PV 뉴런은 파르브알부민을 발현하지 않는 GABA작용성 뉴런이다. 일부 예에서, 다른 CNS 세포는 PV, GAD2, GAD1, NKX2.1, DLX1, DLX5, SST 및 VIP 중 어느 것도 발현하지 않은 CNS 세포 유형을 지칭한다.
일부 예에서, 본원에 개시된 조절 요소는 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 5개 초과의 비-PV CNS 세포-유형에 비해 PV 발현 세포에 대해 선택적이다. 일부 경우에, 비-PV 세포 유형은 비-PV GABA작용성 세포를 포함한다. 일부 경우에, 관심 세포 유형은 PV 세포이다. 일부 경우에, PV 세포에 대해 선택적인 RE가 PV 세포 선택적 조절 요소로 지칭된다.
일부 경우에, 본원에 개시된 PV 세포 선택적 조절 요소는 서열식별번호: 1-32의 서열, 또는 이의 임의의 조합물을 포함한다.
일부 경우에, 하나 이상의 PV 세포 선택적 조절 요소 또는 하나 이상의 본원에 개시된 조절 요소는 조절 요소 부재 하의 발현에 비교하여 적어도 2, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100배 이상만큼 PV-발현 세포에서 트랜스진의 발현을 증가시키도록 사용된다. 일부 경우에, 발현 카세트 내의 RE는 조절 요소 부재 하의 발현에 비교하여 적어도 1.5%, 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 또는 50%, 또는 more than 1.5%, 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100%만큼 유전자 발현을 증가시킨다. 일부 경우에, 조성물 및 이의 사용 방법은 조절 요소의 부재 하의 수준에 비교하여 또는 비-선택적 조절 요소 (예를 들어, CAG, EF1α, 구성적 프로모터, 또는 서열식별번호: 34, 또는 이의 기능성 단편, 또는 이에 대한 서열 동일성이 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%인 서열)에 비교하여, 트랜스진 발현, 예를 들어, SCN1A, SNC2A, SNC8A, SCN1B, SCN2B, KCNC1 (일명 KV3.1), KCNC3 (일명 KV3.3), STXBP1, DNA 결합 단백질, 또는 이의 변이체 또는 기능성 단편, 또는 이의 단백질의 발현에서 10-500% 증가를 발생시키는 하나 이상의 조절 요소를 함유하는 발현 카세트를 포함한다. 일부 경우에, SCN1A, SNC2A, SNC8A, SCN1B, SCN2B, KCNC1, KCNC3, 및 STXBP1 중 어느 하나의 유전자 발현 및/또는 단백질 수준의 증가는 발현 카세트 또는 조절 요소의 부재 하의 수준에 비교하여 1.5-5%, 5%-10%, 10-15%, 15-20%, 20-30%, 30-40%, 40-50%, 50-60%, 60-70%, 70-80%, 80-90%, 90-100%, 100-150%, 150-200%, 250-300%, 300-350%, 350-400%, 400-450%, 450-500%, 또는 1.5-20%, 20%-50%, 50%-100%, 100-200%, 200-300%, 300-400%, 또는 400-500%이다. 일부 경우에, 이같은 유전자 또는 단백질 발현은 대조군 (예를 들어, CAG, EF1α, 구성적 프로모터 (예를 들어, SV40, CMV, UBC, PGK, 및 CBA), 또는 비-선택적 조절 요소) 또는 비-세포-유형 선택적 조절 요소 (예를 들어, 서열식별번호: 34, 또는 이의 기능성 단편, 또는 이에 대한 서열 동일성이 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%인 서열)를 포함하는 발현 카세트에 비교하여 PV 세포에서 선택적이다.
일부 경우에, PV 및 eGFP (하나 이상의 조절 요소에 작동가능하게 연결된 트랜스진) 양쪽 모두를 발현하는 세포의 개수를 eGFP를 발현하는 세포의 총 개수로 나누고, 100을 곱하여 백분율로 변환시킴으로써, PV 세포에서의 발현의 선택성이 계산될 수 있다. 본원에 기술된 바와 같은 PV 세포 선택적 조절 요소는 PV 세포에서의 발현에 대해 고도로 선택적일 수 있다. 예를 들어, PV 세포 선택적 조절 요소 또는 하나 이상의 본원에 개시된 조절 요소는 PV 뉴런에 대해 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 약 99% 초과의 선택성을 나타낼 수 있다.
일부 경우에, PV 세포 선택적 조절 요소 또는 본원에 개시된 임의의 조절 요소는 대조군 조절 요소, 예를 들어, EF1α, 또는 이전에 공지된 조절 요소보다 통계적으로 더 높은 수준으로 PV 뉴런에서 트랜스진을 발현시키는 것에 선택성을 부여한다. 일부 예에서, PV 세포 선택적 조절 요소와 대조군 조절 요소 사이의 통계적 차이는 본원에 기술된 방법 중 어느 하나, 예컨대 공동-국소화 검정법에 의해 결정된 바와 같은 적어도 2배, 5배, 10배, 20배, 또는 2배 초과의 차이, 또는 5배, 10배, 또는 20배 초과의 차이이다.
본 개시내용은 PV 세포에 대해 선택적인 조절 요소를 포함한다. 이러한 PV 세포 선택적 RE 또는 임의의 세포-유형 선택적 RE는 바람직하게는 짧고, 바람직하게는 약 1100 염기쌍, 1000 bp, 900 bp, 800 bp, 700 bp, 600 bp, 500 bp, 400 bp, 300 bp, 200 bp 미만, 또는 약 110 bp 미만이다. PV 세포 선택적 RE 또는 임의의 세포-유형 선택적 RE는 1050 bp 내지 100 bp, 100 bp 내지 500 bp, 또는 500 bp 내지 1050 bp일 수 있다. PV 세포 선택적 조절 요소의 일부 예가 서열식별번호: 1-32, 또는 이의 기능성 단편 또는 조합물에 의해 제공된다. 본 개시내용에 의해 구상되는 다른 PV 세포 선택적 조절 요소는 본원에 기술된 이러한 서열 중 임의의 것, 또는 본원에 기술된 서열 중 하나의 일부분 도는 단편에 대한 서열 동일성이 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%인 서열을 포함한다.
일부 경우에, PV 세포 선택적 조절 요소 또는 임의의 본원에 개시된 조절 요소는 본원에 기술된 서열, 또는 본원에 기술된 서열의 단편에 대한 동일성이 적어도 약 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 99% 초과이다. 일부 경우에, PV 세포 선택적 조절 요소는 본원에 기술된 서열 또는 이의 기능성 단편의 적어도 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95%에 대한 동일성이 적어도 약 80%이다.
일부 경우에, PV 세포 선택적 조절 요소는 서열식별번호: 1-32, 또는 이의 기능성 단편 또는 조합물, 또는 이에 대한 서열 동일성이 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%인 서열 중 임의의 하나 이상에 대해 적어도 80%의 동일성을 포함한다. 일부 경우에, PV 세포 선택적 조절 요소는 서열식별번호: 1-22의 서열의 50% 이상에 대해 동일성이 90%이다. 일부 예에서, PV-선택적 조절 요소는 서열식별번호: 1-32 중 임의의 것의 기능성 단편 또는 이의 조합물이다. 일부 경우에, 기능성 단편은 PV 세포에서의 발현의 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 95% 초과의 선택성으로 PV 세포에서 트랜스진을 선택적으로 발현시킬 수 있다.
일부 경우에, 2개 이상의 본 개시내용의 PV 세포 선택적 조절 요소 또는 임의의 2개 이상의 본원에 개시된 조절 요소가 조합되어 조합 조절 요소를 형성한다. 일부 예에서, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 또는 10개 이상의 PV 세포 선택적 조절 요소, 또는 복수의 본원에 개시된 조절 요소가 조합된다. 예를 들어, 서열식별번호: 31은 서열식별번호: 1 및 23-29의 조합물이다. 또 다른 예로서, 서열식별번호: 32는 서열식별번호: 8 및 서열식별번호: 23-29의 조합물이다. 일부 경우에, 2개 이상의 PV-선택적 조절 요소의 단편이 조합되어 조합 조절 요소를 형성할 수 있다. 예를 들어, 서열식별번호: 1의 50%가 서열식별번호: 8의 30% 및 서열식별번호: 30의 90%와 조합되어 조합 조절 요소를 형성할 수 있다.
일부 경우에, 하나 이상의 본 개시내용의 PV 세포 선택적 조절 요소 또는 임의의 하나 이상의 본원에 개시된 조절 요소가 작동가능하게 연결된 트랜스진을 하나 이상의 다른 CNS 세포 유형에 비교하여 PV 뉴런에서 선택적으로 발현시킨다. 이러한 선택적 발현은 검출가능한 수준의 연결된 트랜스진을 발현하는 PV 뉴런의 개수를 트랜스진을 발현하는 비-PV 뉴런의 개수를 포함하는 트랜스진을 발현하는 세포의 총 개수의 백분율로서 계수함으로써 정량될 수 있다. 달리 말하면, 트랜스진을 발현하는 비-표적 세포 유형의 개수 (또는 트랜스진을 발현하는 세포의 총 개수)에 비교하여 조절 요소에 작동가능하게 연결된 트랜스진을 발현하는 PV 뉴런 (또는 표적 세포)의 개수를 측정하고/하거나 비교함으로써 특정 세포 유형 또는 표적 세포에서의 PV 조절 요소의 선택성이 결정될 수 있다.
일부 경우에, PV 세포 선택적 조절 요소는 PV 뉴런, CNS 내의 PV 뉴런, 또는 PV를 또한 발현하는 GABA작용성 뉴런에 대해 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 약 99% 초과의 선택성을 나타낼 수 있다. 일부 경우에, 하나 이상의 본 개시내용의 조절 요소는 CAG 또는 EF1α 또는 비-세포-유형 선택적 요소에 비교하여, 또는 비-PV CNS 세포에 비교하여, 또는 CNS 내의 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개 또는 적어도 5개의 다른 비-PV GABA작용성 뉴런 아유형에 비교하여 PV 뉴런에 대한 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 약 99% 초과의 선택성을 나타낼 수 있다.
일부 경우에, PV 선택적 조절 요소는 대조군 조절 요소, 예를 들어, CAG, EF1α, 구성적 프로모터 (예를 들어, SV40, CMV, UBC, PGK, 및 CBA), 비-선택적 조절 요소, 또는 이전에 공지된 조절 요소보다 통계적으로 더 높은 수준으로 PV 뉴런에서 트랜스진을 발현시키는 것에 선택성을 부여한다. 일부 예에서, PV 세포 선택적 RE와 대조군 요소 사이의 통계적 차이는 본원에 기술된 방법 중 어느 하나에 의해 결정된 바와 같은 적어도 2배, 5배, 10배, 20배, 또는 2배 초과의 차이, 또는 5배, 10배, 또는 20배 초과의 차이이다. 일부 경우에, PV에서의 선택성은 본원에 기술된 바와 같은 공동-국소화 검정법을 사용하여 측정된다.
일부 측면에서, 본원에 기술된 세포-유형 선택적 조절 요소는 한 CNS 세포 유형에서 다른 CNS 세포 유형에 비교하여 트랜스진의 발현을 선택적으로 조정하는데 유용하다. 예를 들어, 본원에 기술된 세포-유형 선택적 조절 요소는 다른 유형의 뉴런을 포함하는 다른 CNS 세포에 비해 PV 세포에서 트랜스진의 발현을 선택적으로 조정하는데 유용할 수 있다. 유전자 요법을 위해, 표적 세포 유형에서의 트랜스진의 선택적 발현 및/또는 비-표적 세포 유형에서의 트랜스진의 발현 최소화를 원할 수 있다. 의도되지 않은 세포-유형 (예를 들어, 비-표적 세포 유형)에서의 트랜스진의 발현은 대상체에 대한 유해 효과를 발생시킬 수 있다. 의도되지 않은 세포-유형에서의 트랜스진의 발현은 의도된 세포 유형에서의 트랜스진의 치료 효과에 대항할 수 있다. 예를 들어, PV 세포에서의 발현이 의도되는 트랜스진은 글루타메이트성 뉴런에서 발현되는 경우 대상체에 대한 부정적인 효과가 있을 수 있다. 본원에 기술된 세포-유형 선택적 조절 요소는 트랜스진의 적합한 발현을 확실히 하고/하거나 유전자 요법의 표적을 벗어나는 효과를 감소시키도록 발현 카세트에서 사용될 수 있다.
본원에서의 세포-유형 선택적 조절 요소는 유전자 발현 카세트에서 사용될 수 있고, 이에 의해 하나 이상의 트랜스진에 작동가능하게 연결된다. 이같은 유전자 발현 카세트는 발현을 위해 세포 내로 트랜스진을 전달하는데 사용된다. 발현 카세트는 트랜스진에 작동가능하게 연결된 본원에 기술된 바와 같은 세포-유형 선택적 조절 요소, 세포-유형 선택적 조절 요소의 조합물, 또는 본원에 기술된 바와 같은 세포-유형 선택적 조절 요소의 단편을 함유할 수 있다.
바람직하게는, 본원에서의 발현 카세트는 트랜스진에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 세포-유형 선택적 조절 요소를 포함하고, 이에 의해 이 둘은 생체 내에서의 이들의 내인성 환경에서는 함께 기능하지 않는다. 예를 들어, 나트륨 이온 채널 베타 서브유닛에 대한 트랜스진, 예컨대 SCN1B가 생체 내에서 동일한 맥락에서 기능하지 않거나 또는 내인성으로 SCN1B의 발현을 검출가능하게 구동시키지 않는 하나 이상의 조절 요소에 작동가능하게 연결될 수 있다. 유사하게, 내인성으로 또는 생체 내에서 동일한 맥락에서 기능하지 않거나, 또는 동일한 오픈 리딩 프레임 내에 있지 않거나, 또는 동일한 인간 염색체 상에 있지 않거나, 또는 생체 내에서 STXBP1의 발현을 검출가능하게 구동시키지 않는 조절 요소에 작동가능하게 연결된 신경전달물질 조절인자, 예컨대 STXBP1을 핵산 카세트가 포함할 수 있다. 일부 경우에, 세포-유형 선택적 조절 요소는 트랜스진에 연결되고, 여기서 세포-유형 선택적 조절 요소는 생체 내에서 트랜스진에 상응하는 내인성 유전자를 조절하지 않는다.
일부 측면에서, 본원에 개시된 세포-유형 선택적 조절 요소는 트랜스진에 상응하는 천연 유전자의 유전자좌와 상이한 인간 염색체 유전자좌로부터 단리된 서열로부터 유래된다. 따라서, 일부 예에서, 발현 카세트는 동일한 카세트 상의 트랜스진에 상응하는 염색체와 상이한 염색체로부터 유래된 서열을 갖는 세포-유형 선택적 조절 요소(들)를 포함한다. 다른 예에서, 본 개시내용의 조절 요소(들) 및 발현 카세트 내에서 작동가능하게 연결된 트랜스진은 인간 게놈 내에서 20 kb 초과로 떨어져 위치하거나 또는 원위 게놈 위치에 있는 서열로부터 유래된다. 2개 이상의 인간 유래 조절 요소가 발현 카세트 상에서 이용되는 경우, 2개 이상의 조절 요소는 인간 게놈에서 5 kb 초과, 10 kb 초과, 15 kb 초과, 또는 20 kb 초과로 떨어져 위치하는 서열을 가질 수 있거나, 또는 2개 이상의 조절 요소는 천연적으로 게놈 내에서 서로 상호작용하지 않는다.
일부 경우에, PV-선택적 조절 요소를 포함하는 발현 카세트는 hSyn1 또는 GAD2 프로모터 서열로부터 유래된 공지된 서열을 배제할 수 있다. 일부 예에서, PV-선택적 조절 요소는 GAD2, GAD1, SYN1, NKX2.1, DLX1, DLX5, SST 및 VIP 프로모터 중 어느 하나의 전체 프로모터 서열을 포함하지 않는다. 일부 예에서, PV-선택적 조절 요소는 GAD2, GAD1, SYN1, NKX2.1, DLX1, DLX5, SST 및 VIP 중 하나 이상의 프로모터로부터 유래된 서열의 500개를 초과하는 인접한 염기쌍을 포함하지 않는다. 일부 예에서, PV-선택적 조절 요소는 GAD2, SYN1, NKX2.1, DLX1, DLX5, SST, 및 VIP 중 어느 하나의 전사 개시 부위로부터 1 kb, 2 kb, 3 kb, 4 kb, 5 kb, 6 kb, 7 kb, 8 kb, 9 kb, 또는 10 kb 이내에 있는 서열을 포함하지 않는다.
일부 경우에, 트랜스진은 특정한 관심 세포 유형과 연관된 질환을 치료하는데 유용하다. 일부 경우에, 관심 세포 유형은 뉴런, 억제 뉴런, GABA작용성 뉴런, 또는 PV 뉴런이다. 일부 경우에, 트랜스진은 SCN1A, SNC2A, SNC8A, SCN1B, SCN2B, KV3.1, KV3.3, 및 STXBP1 중 임의의 하나 이상이다. 일부 경우에, 트랜스진은 유전자의 발현을 조정하는 DNA 결합 단백질 (예를 들어, 내인성 유전자의 발현을 조정하는 전사 활성화제 또는 전사 억제인자)이다. 일부 경우에, 트랜스진은 유전자 편집 단백질, 예컨대 아연 손가락 뉴클레아제, 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제, Cas 패밀리 단백질이다. 일부 경우에, 트랜스진은 리포터 유전자 또는 검출가능한 마커, 예컨대 eGFP, tdTomato, 또는 RFP이다. 일부 경우에, 트랜스진은 Cas 단백질, 예컨대 Cas9이다.
PV 뉴런 세포와 연관된 병태를 치료하는데 유용한 트랜스진이 본원에 기술된 바와 같은 벡터, 핵산 카세트, 또는 방법에 혼입될 수 있다. 본원에서 사용되는 트랜스진은 일반적으로 인트론을 함유하지 않거나 또는 1개를 초과하는 인트론을 함유하지 않는다. 트랜스진은 게놈 서열로부터보다는 cDNA 서열로부터 수득될 수 있다. 일부 경우에, 트랜스진은 이의 내인성 인트론 중 일부 또는 전체를 함유할 수 있다. 일부 예에서, 이같은 트랜스진은 DNA 결합 도메인 또는 이온 채널을 코딩한다. 본 개시내용의 발현 카세트에서 코딩될 수 있는 DNA 결합 도메인의 예는 아연 손가락, Cas9, Cas 패밀리 단백질, dCas9, dCas 패밀리 단백질 또는 전사 활성화제 유사 이펙터 (TALE)를 포함한다. 일부 경우에, 트랜스진은 DNA 결합 단백질, 또는 DNA 절단 도메인 또는 뉴클레아제 도메인이 비활성화된 DNA 절단 단백질 (예를 들어, 뉴클레아제, 제한 효소, 리컴비나제 등), 예를 들어, 뉴클레아제-비활성화 Cas (dCas), 비활성화 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제, 또는 뉴클레아제-비활성화 아연 손가락 단백질의 DNA 결합 도메인을 포함하는 DNA 결합 단백질이다. 일부 경우에, DNA 결합 도메인은 전사 조정 도메인 (예를 들어, 전사 활성화제 또는 억제인자 도메인)에 연결된다. 일부 경우에, 트랜스진은 유전자 편집 단백질, 예를 들어, Cas 단백질, Cas9를 포함한다. 일부 경우에, 트랜스진은 이온 채널 또는 막 단백질의 서브유닛 또는 성분, 또는 본원에 개시된 신경학적 병태 또는 질환과 연관된 유전자이다. 본 개시내용의 발현 카세트에서 사용될 수 있는 이온 채널 트랜스진의 예는 전압 게이팅 및 리간드 게이팅 이온 채널을 포함한다. 전압 게이팅 이온 채널은 나트륨 채널, 칼슘 채널, 칼륨 채널 및 양자 채널을 포함한다. 일부 예에서, 트랜스진은 전압 게이팅 나트륨 채널의 서브유닛을 코딩한다. 전압 게이팅 나트륨 채널 서브유닛의 예는 SCN1B (NM_001037.4), SCN1A (NM_001165963.1), 및 SCN2B (NM_004588.4)를 포함한다.
일부 예에서, 트랜스진은 전압 게이팅 칼륨 채널의 서브유닛을 코딩한다. 전압 게이팅 나트륨 채널 서브유닛의 예는 KCNC1 (NM_001112741.1), 및 KCNC3 (NM_004977.2)을 포함한다. 일부 경우에, 트랜스진은 SCN1A, SNC2A, SNC8A, SCN1B, SCN2B, KV3.1, KV3.3, STXBP1, 이의 변이체 및 기능성 단편 중 임의의 하나 이상이다. 일부 경우에, 트랜스진은 SCN1A, SNC2A, SNC8A, SCN1B, SCN2B, KV3.1, KV3.3, STXBP1, 이의 변이체 또는 기능성 단편 중 어느 하나에 대한 서열 동일성이 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5%인 서열이다. 일부 경우에, 이같은 서열 동일성은 BLAST를 사용하여 측정된다.
일부 경우에, 본원에 개시된 발현 카세트는 서열식별번호: 37-43, 또는 이의 기능성 단편 또는 변이체, 또는 서열식별번호: 37-43에 상응하는 진뱅크 서열 중 어느 하나를 코딩하는 서열에 대한 서열 동일성이 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5%인 트랜스진에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 PV-선택적 조절 요소 또는 하나 이상의 본 개시내용의 조절 요소를 포함한다. 일부 경우에, 본원에 개시된 발현 카세트는 (i) 서열식별번호: 37-43의 서열, 또는 (ii) 이의 기능성 단편, 또는 (iii) (i) 또는 (ii)에 대한 서열 동일성이 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5%인 서열에 따른 서열을 갖는 트랜스진을 포함한다.
일부 예에서, 트랜스진은 신경전달물질 조절인자, 또는 이의 변이체 또는 기능성 단편이다. 신경전달물질 조절인자는 CNS에서 신경전달물질의 생산 또는 방출을 조절하는데 수반될 수 있다. 예를 들어, 신경전달물질 조절인자는 신경전달물질을 방출하도록 시냅스 융합을 보조할 수 있다. 신경전달물질 조절인자의 예는 STXBP1 (NM_001032221.3) 또는 이의 기능성 단편, 또는 이에 대한 서열 동일성이 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%인 서열이다. 또한 트랜스진은 신경전달물질 조절인자의 서브유닛일 수 있다.
일부 경우에, 본 개시내용의 발현 카세트는 AAV2 5' ITR, PV-선택적 인핸서, PV-선택적 프로모터, 또는 하나 이상의 PV-선택적 프로모터 및 인핸서의 조합물, SCN1B의 cDNA, WPRE, hGH 폴리A 신호, PV-선택적 조절 요소, 및 AAV2 3'ITR을 함유할 수 있다. 한 예에서, 발현 카세트는 AmpR 프로모터, 및 AmpR 코딩 서열, 박테리아 복제 기점, AAV2 ITR, 서열식별번호: 8, 서열식별번호: 23-29, 트랜스진 (코딩 서열, WPRE, 인간 성장 호르몬 폴리 A 신호, AAV2 ITR, 및 f1 기점을 포함한다.
또 다른 예로서, 본 개시내용의 발현 카세트는 AAV2 5' ITR, 인핸서, 프로모터, 내인성 SCN1A 유전자의 전사 활성화제, WPRE, hGH 폴리A 신호, 조절 요소, 및 AAV2 3'ITR을 함유할 수 있다. 일부 경우에, 발현 카세트는 AAV2 5' ITR, 프로모터, 인트론 요소, 전사 변형제, 합성 폴리A, 및 AAV2 3' ITR을 포함한다. 일부 경우에, 본 개시내용의 발현 카세트는 AAV2 5' ITR, PV-선택적 인핸서, PV-선택적 프로모터, SCN1A 또는 SCN1B의 전사 활성화제를 코딩하는 서열, WPRE, hGH 폴리A 신호, PV-선택적 조절 요소 또는 임의의 본원에 개시된 조절 요소, 및 AAV2 3'ITR을 함유할 수 있다.
하나 이상의 본 개시내용의 조절 요소를 포함하는 발현 카세트를 사용하여 의학적 병태를 치료할 수 있다. 일부 경우에, 본 개시내용의 조절 요소를 함유하는 발현 카세트는 신경학적 병태 또는 신경변성 병태를 치료하는데 사용된다. 신경학적 병태는 공지된 유전적 이벤트에 의해 야기될 수 있거나 또는 원인이 미지일 수 있다.
신경학적 병태는 PV 뉴런과 연관된 질환일 수 있다. 신경학적 병태는 억제 뉴런, 예컨대 PV 뉴런과 연관된 질환일 수 있다. PV 뉴런과 연관된 질환 또는 병태가 트랜스진 및 하나 이상의 PV 세포-선택적 조절 요소 또는 임의의 본원에 기술된 바와 같은 조절 요소를 보유하는 발현 카세트를 생체 내에서 세포에 전달함으로써 치료될 수 있다. 일부 측면에서, 하나 이상의 PV 세포-선택적 조절 요소 또는 임의의 본원에 개시된 조절 요소에 작동가능하게 연결된 트랜스진을 포함하는 발현 카세트는 드라벳 증후군, 알츠하이머병, 간질, 신경변성 장애, 타우병증, 뉴런 과소흥분성 및/또는 발작을 치료하는데 사용될 수 있다. 일부 경우에, 본 개시내용의 발현 카세트는 정신과 장애 (예를 들어, 정신분열병, 강박 장애, 중독, 우울증, 불안, 정신병); 자폐증 스펙트럼 장애 (예를 들어, 유약 X 증후군, 레트 증후군); 간질 (예를 들어, 드라벳 증후군, 만성 외상성 뇌병증, 열성 발작을 동반하는 전신 간질 (GEFS+), 간질성 뇌병증, 측두엽 간질, 국소 간질, 결절성 경화증); 및/또는 신경변성 (예를 들어, 알츠하이머병, 파킨슨병)을 치료하는데 사용된다. 일부 경우에, 신경학적 병태 또는 질환은 PV 뉴런이 연루되는 임의의 발작 및/또는 간질 관련 병태 또는 질환이다.
대부분의 드라벳 증후군 사례는 SCN1A 및/또는 SCN2A 유전자에서의 돌연변이와 연관된다. SCN1A에서의 돌연변이 또는 이상은 발작 장애, 간질, 자폐증, 가족성 편마비 편두통 3형 (FHM3), 열성 발작을 동반하는 유전적 간질 (GEFS+), 및 특정 항-발작 의약의 유효성과 또한 연관되었다. 예를 들어, SCN1A에서의 ICS5N+5G>A 돌연변이가 항-발작 약물 페니토인 및 카르바마제핀의 최대 안전량 (용량)과 연관된다.
일부 알츠하이머 환자에서, 아밀로이드 β (Aβ)의 생산은 뉴런의 흥분성에 영향을 미칠 수 있는 다수의 펩티드 및 프로테아제를 수반하여, PV 뉴런에서의 Nav1.1 나트륨 채널의 하향조절 및 발작을 야기한다.
기능장애 PV 뉴런과 연관된 질환 예컨대 SCN1A 또는 Nav1.1에서의 기능 상실 돌연변이로 인한 것은 하기를 포함한다: 드라벳 증후군, 오타하라 증후군, 간질, 조기 영아 간질성 뇌병증 6 (EIEE6), 가족성 열성 발작 3A (FEB3A), 전신성 긴장 간대 발작이 있는 난치성 소아 간질 (ICEGTC), 편두통, 가족성 편마비 3 (FHM3), 파나이오토폴로스(Panayiotopoulos) 증후군, 가족성 심방 세포 13 (ATFB13), 열성 발작을 동반하는 전신 간질 1형 (gefs+ 1형), 브루가다(Brugada) 증후군, 비-특이적 심장 전도 결함, 열성 발작을 동반하는 전신 간질, 양성 가족성 영아 발작, 조기 영아 간질성 뇌병증 11 (EIEE11), 양성 가족성 영아 간질, 신경변성, 타우병증 및 알츠하이머병. 일부 경우에, 신경학적 병태는 드라벳 증후군이다. 드라벳 증후군은 SCN1A 및/또는 SCN2A 유전자에서의 돌연변이와 연관된다. 일부 경우에, 하나 이상의 본 개시내용의 조절 요소는 PV 뉴런과 연관된 신경학적 병태 또는 질환, 예를 들어, 정신과 장애 (예를 들어, 정신분열병, 강박 장애, 중독, 우울증, 불안, 정신병); 자폐증 스펙트럼 장애 (예를 들어, 유약 X 증후군, 레트 증후군); 간질 (예를 들어, 드라벳 증후군, 만성 외상성 뇌병증, 열성 발작을 동반하는 전신 간질 (GEFS+), 간질성 뇌병증, 측두엽 간질, 국소 간질, 결절성 경화증); 또는 신경변성 (예를 들어, 알츠하이머병, 파킨슨병)을 치료하기 위한 유전자 요법 또는 발현 카세트에서 사용된다. 일부 경우에, 하나 이상의 본 개시내용의 조절 요소 (예를 들어, PV 뉴런 선택적 조절 요소)는 (예를 들어, 발현 카세트, 벡터, 또는 유전자 요법에서) 드라벳 증후군 및/또는 알츠하이머병을 치료하는데 사용된다. 일부 경우에, 신경학적 병태 또는 질환은 PV 뉴런이 연루되는 임의의 발작 및/또는 간질 관련 병태 또는 질환이다.
본 개시내용의 방법 및 조성물은 질환, 예를 들어, 신경학적 또는 신경변성 질환으로 진단된 대상체를 치료하는데 사용될 수 있다. 대상체는 간질 형태를 앓고 있는 환자일 수 있다. 일부 예에서, 대상체는 드라벳 증후군 환자이다. 대상체는 신경변성 질환을 앓고 있는 환자, 예를 들어, 알츠하이머병 환자일 수 있다. 일부 예에서, 간질, 뇌병증, 및/또는 발작은 SCN8A에서의 유전자 돌연변이와 연관된다. 일부 경우에, SCN8A에서의 유전자 돌연변이가 간질 증후군, 예를 들어, 드라벳 증후군을 일으킬 수 있다. 일부 예에서, STXBP1에서의 유전자 돌연변이가 재발성 발작을 특징으로 하는, 간질이 수반되는 뇌병증과 연관된다.
일부 예에서, 하나 이상의 본원에 기술된 조성물로 치료되는 대상체는 이온 채널 또는 신경전달물질 조절인자 (예를 들어, 신택신 결합 단백질)에서의 돌연변이 또는 유전자 이상으로 진단된 대상체이다. 이같은 돌연변이의 예는 SCN1A, SNC2A, SNC8A, SCN1B, SCN2B, KCNC1, KCNC3, 및/또는 STXBP1, 또는 이들의 조합물에서의 돌연변이를 포함한다. 본원에 기술된 바와 같은 세포-유형 선택적 조절 요소를 함유하는 발현 카세트가 특정 세포 유형과 연관된 증상이 있는 질환을 치료 또는 예방하기 위해 대상체에게 전달될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 PV 세포 선택적 조절 요소에 작동가능하게 연결된 트랜스진을 포함하는 발현 카세트가 PV 뉴런와 연관된 증상이 있거나 또는 이러한 증상이 발달될 위험이 있는 대상체에게 전달된다.
일부 경우에, 치료는 드라벳 증후군에 걸린 또는 드라벳 증후군이 발달될 위험이 있는 대상체에게 투여될 수 있다. 드라벳 증후군과 연관된 증상은 발작, 기억 결함, 발달 지연, 근력 불량 및/또는 인지 문제를 포함한다. 본 개시내용의 발현 카세트로의 치료는 하나 이상의 증상의 개선, 예컨대 발작 횟수, 기간 및/또는 강도의 감소를 발생시킬 수 있다. 드라벳 증후군이 발달될 위험이 있는 대상체에게 본원에 기술된 바와 같은 유전자 요법을 투여하는 것은 하나 이상의 증상의 발달을 방지하거나 또는 이의 진행을 늦출 수 있다.
또 다른 예에서, 치료는 알츠하이머병을 앓고 있는 대상체에게 투여될 수 있다. 알츠하이머병과 연관된 증상은 단기 기억 상실, 인지 곤란, 발작, 및 언어, 실행 기능, 지각 (실인증) 및 운동 실행 (실행증)의 곤란을 포함한다. 본 개시내용의 발현 카세트로의 치료는 하나 이상의 알츠하이머병 증상의 개선, 예컨대 기억 상실 진행의 감소, 또는 하나 이상의 증상의 예방을 발생시킬 수 있다. 일부 경우에, 치료는 높은 감마파 뇌 활성의 교정을 발생시킬 수 있다. 치료는 발작 빈도 및/또는 발작 중증도의 감소, 또는 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 또는 70%만큼의 높은 감마파 활성의 감소를 발생시킬 수 있다. 일부 경우에, 치료는 인지 기능에서의 개선을 발생시킬 수 있다. 학습 및/또는 기억이 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 또는 100% 초과만큼 개선될 수 있다.
본 개시내용의 방법 및 조성물은 질환이 발달될 위험이 있는 대상체를 치료하는데 사용될 수 있다. 대상체는 질환, 예를 들어, 신경학적 질환 또는 간질, 발작, 및/또는 뇌병증과 연관된 질환에 걸리기 쉬운 것으로 알려져 있을 수 있다. 대상체는 유전적 이벤트로 인해 또는 공지된 위험 요인으로 인해 질환에 걸리기 쉬울 수 있다. 예를 들어, 대상체는 드라벳 증후군과 연관된 SCN1A에서의 돌연변이를 보유할 수 있다. 일부 경우에, 대상체는 대상체의 연령으로 인해 알츠하이머병과 같은 질환에 걸리기 쉬울 수 있다.
치료는 증상의 감소 또는 중단을 발생시킬 수 있다. 예를 들어, 치료는 학습, 기억, 인지 기능 및/또는 운동 기능을 개선할 수 있고/있거나; 발작 빈도 및/또는 기간을 감소시킬 수 있고/있거나; 온도 민감성을 감소시킬 수 있다 (예를 들어, 발작을 유발하기 위한 온도 역치를 증가시킬 수 있다).
일부 예에서, 본원에 개시된 유전자 요법 또는 발현 카세트의 표적 세포 유형은 PV 세포이다. 일부 경우에, 비-표적 세포 아유형은 본원에 개시된 비-PV GABA작용성 아유형 중 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개 또는 적어도 4개이다. 일부 경우에, 본원에 개시된 조절 요소를 포함하는 발현 카세트는 모든 비-PV CNS 세포에 비해 PV 세포에 대해 선택적이다. 일부 경우에, 세포-유형 선택성은 본원에 개시된 공동-국소화 검정법에 따라 측정된다. 일부 경우에, 세포-유형 선택성은 표적 세포 유형에서 Cre를 발현하는 마우스를 사용하여 측정된다.
일부 예에서, 치료는 대상체에 대한 유해 반응을 발생시키지 않는다. PV-선택적 조절 요소를 함유하는 유전자 요법으로의 치료는 대상체에서 비-선택적 조절 요소에 연결된 동일한 트랜스진을 함유하는 유사한 유전자 요법으로의 처리보다 더 적은 또는 덜 중증인 유해 반응을 야기할 수 있다.
다양한 측면에서, 임의의 본원에 개시된 발현 카세트는 드라벳 증후군, 알츠하이머병, 간질, 신경변성, 타우병증, 뉴런 과소흥분성 및/또는 발작 중 임의의 하나 이상을 치료하기 위한 유전자 요법 (예를 들어, rAAV 또는 rAAV9 유전자 요법)을 위해 개조될 수 있거나 또는 이러한 요법에서 사용될 수 있다. 일부 경우에, 유전자 요법은 트랜스진에 작동가능하게 연결된, 서열식별번호: 1-32, 또는 이의 기능성 단편 또는 조합물, 또는 이에 대한 서열 동일성이 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%인 서열 중 임의의 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 또는 10개 이상을 포함한다. 일부 경우에, 유전자 요법은 본 개시내용의 발현 카세트를 포함한다. 일부 경우에, 유전자 요법은 조절 요소가 동일한 트랜스진에 작동가능하게 연결된 경우의 CAG 또는 EF1α 또는 비-선택적 조절 요소에 의해 또는 조절 요소가 없는 동일한 구축물에 의해 구동되는 발현보다 통계적으로 유의하게 더 높은 수준으로 적어도 하나의 표적 세포 유형에서 선택적 발현 또는 우선적 발현을 구동시키도록 임의의 트랜스진 (예를 들어, 리포터 트랜스진 또는 치료용 트랜스진)에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 본원에 개시된 조절 요소를 포함한다. 일부 경우에, 통계적으로 유의하게 더 높음은 표적 세포 유형에서 동일한 트랜스진에 작동가능하게 연결된 경우의 CAG, EF1α, 구성적 프로모터, 또는 비-선택적 조절 요소에 의한, 또는 조절 요소가 없는 동일한 구축물에 의한 발현 수준의 적어도 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 10.5, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 100배인 수준으로 조절 요소가 표적 세포 유형에서 선택적 발현을 구동시킨다는 것을 의미한다. 일부 경우에, 본원에 기술된 바와 같은 공동-국소화 검정법을 사용하여 이같은 세포-유형 선택적 발현이 검정된다. 일부 경우에, 트랜스진은 SCN1A, SNC2A, SNC8A, SCN1B, SCN2B, KV3.1, KV3.3, STXBP1, 및 이의 기능성 단편 중 임의의 하나 이상이다. 일부 경우에, 트랜스진은 내인성 유전자의 발현을 조정하는 DNA 결합 단백질, 예컨대 전사 조정인자, 전사 활성화제, 또는 전사 억제인자이다. 일부 경우에, 트랜스진은 DNA 결합 단백질, 또는 DNA 절단 도메인 또는 뉴클레아제 도메인이 비활성화된 DNA 절단 단백질 (예를 들어, 뉴클레아제, 제한 효소, 리컴비나제 등), 예를 들어, 뉴클레아제-비활성화 Cas (dCas), 비활성화 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제, 또는 뉴클레아제-비활성화 아연 손가락 단백질의 DNA 결합 도메인을 포함하는 DNA 결합 단백질이다. 일부 경우에, DNA 결합 도메인은 전사 조정 도메인 (예를 들어, 전사 활성화제 또는 억제인자 도메인)에 연결된다. 일부 경우에, 트랜스진은 유전자 편집 단백질, 예컨대 아연 손가락 뉴클레아제 또는 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제이다. 일부 경우에, 트랜스진은 리포터 유전자 또는 검출가능한 마커, 예컨대 eGFP, tdTomato, 또는 RFP이다. 일부 경우에, 트랜스진은 Cas 단백질, 예컨대 Cas9이다.
일부 경우에, 본원에 개시된 발현 카세트를 포함하는 유전자 요법은 신경학적 병태 또는 질환을 치료하는데 사용된다. 일부 경우에, 본원에 개시된 발현 카세트를 포함하는 유전자 요법은 신경학적 병태 또는 질환을 치료하는데 사용되고, 여기서 발현 카세트는 트랜스진에 작동가능하게 연결된, 서열식별번호: 1-32, 또는 이의 기능성 단편 또는 조합물, 또는 이에 대한 서열 동일성이 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%인 서열 중 임의의 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 또는 10개 이상을 포함한다. 일부 경우에, 트랜스진은 SCN1A, SNC2A, SNC8A, SCN1B, SCN2B, KV3.1, KV3.3, STXBP1, DNA 결합 단백질 및 이의 기능성 단편 중 임의의 하나 이상이다. 일부 경우에, 본원에 개시된 발현 카세트를 포함하는 유전자 요법은 드라벳 증후군을 치료하는데 사용된다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 발현 카세트를 포함하는 유전자 요법은 알츠하이머병을 치료하는데 사용된다. 일부 경우에, 본원에 개시된 발현 카세트를 포함하는 유전자 요법은 드라벳 증후군 및/또는 알츠하이머병과 연관된 간질 및/또는 발작 증상을 치료하는데 사용된다. 일부 경우에, 드라벳 증후군, 알츠하이머병, 간질, 신경변성, 타우병증, 뉴런 과소흥분성 및/또는 발작 중 어느 하나를 치료하는 것은 본 개시내용의 유전자 요법을 치료를 필요로 하는 대상체의 세포에 전달 또는 투여하는 것을 포함한다. 일부 경우에, 치료를 필요로 하는 대상체는 드라벳 증후군, 알츠하이머병, 간질, 및/또는 발작 중 어느 하나에 걸렸거나 또는 이의 위험이 있다. 일부 경우에, 대상체는 아동 또는 미성년자이다. 일부 경우에, 본원에 개시된 발현 카세트를 포함하는 유전자 요법은 드라벳 증후군으로 진단되었거나 드라벳 증후군이 발달될 위험이 있는 영아, 소아, 또는 미성년자를 치료하는데 사용된다. 일부 경우에, 본원에 개시된 발현 카세트를 포함하는 유전자 요법은 SCN1A, SNC2A, SNC8A, SCN1B, SCN2B, KV3.1, KV3.3, 및 STXBP1 중 임의의 하나 이상에서의 돌연변이 또는 유전 결손을 포함하는 대상체를 치료하는데 사용된다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 본원에 개시된 발현 카세트를 포함하는 유전자 요법을 대상체의 세포 내로 투여하는 것을 포함하는, 드라벳 증후군, 알츠하이머병, 간질, 신경변성, 타우병증, 뉴런 과소흥분성 및/또는 발작 중 어느 하나를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 경우에, 이같은 발현 카세트는 트랜스진에 작동가능하게 연결된, 서열식별번호: 1-32, 또는 이의 기능성 단편 또는 조합물, 또는 이에 대한 서열 동일성이 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%인 서열 중 임의의 하나 이상을 포함하고, 여기서 트랜스진은 SCN1A, SNC2A, SNC8A, SCN1B, SCN2B, KV3.1, KV3.3, STXBP1, 및 이의 기능성 단편 중 어느 하나이다. 일부 경우에, 트랜스진은 나트륨 이온 채널 또는 칼륨 이온 채널의 서브유닛이다. 일부 경우에, 트랜스진은 신택신 결합 단백질이다. 일부 경우에, 트랜스진은 전사 조정인자, 예를 들어, 전사 활성화제 또는 전사 억제인자이다. 일부 경우에, 트랜스진은 내인성 유전자 (예를 들어, SCN1A, SNC2A, SNC8A, SCN1B, SCN2B, KV3.1, KV3.3, 또는 STXBP1)의 발현을 조정하는 전사 조정인자이다. 일부 경우에, 트랜스진은 유전자 편집 단백질, 예컨대 아연 손가락 뉴클레아제 또는 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제이다. 일부 경우에, 트랜스진은 Cas 단백질, 예컨대 Cas9이다.
다른 측면에서, 본 개시내용은 하나 이상의 본원에 개시된 조절 요소를 부가하여 유전자 요법의 세포-유형 선택성을 개선함으로써 드라벳 증후군, 알츠하이머병, 간질, 신경변성, 타우병증, 뉴런 과소흥분성 및/또는 발작을 치료하기 위해 디자인된 임의의 유전자 요법을 변형시키는 방법을 제공한다. 일부 경우에, 유전자 요법은 rAAV 유전자 요법이다.
일부 경우에, 본원에 개시된 발현 카세트로의 치료는 발작 기간 및/또는 빈도, 예를 들어, 드라벳 증후군과 연관된 발작을 미치료 대조군에 비교하여 또는 치료 전의 수준에 비교하여 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%만큼 감소시킨다.
일부 경우에, 본원에 개시된 발현 카세트로의 치료는 높은 감마파 활성 (예를 들어, 알츠하이머병과 연관된 높은 감마파 활성)을 미치료 대조군에 비교하여 또는 치료 전의 수준에 비교하여 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%만큼 감소시킨다.
한 측면에서, 본 개시내용은 하나 이상의 비-표적 세포 유형에 비해 표적 세포 유형에서의 선택적 발현, 예를 들어, 하나 이상의 비-PV CNS 세포 유형에 비해 CNS 내의 PV 뉴런에서의 선택적 발현을 발생시키는 트랜스진에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 조절 요소를 포함하는 본 개시내용의 핵산 카세트를 제공한다. 일부 경우에, 각각의 조절 요소는 (i) 서열식별번호: 1-32의 서열, (ii) 이의 기능성 단편 또는 조합물, 또는 (iii) (i) 또는 (ii)에 대한 서열 동일성이 적어도 80%인 서열을 포함한다. 일부 경우에, BLAST를 사용하여 퍼센트 서열 동일성이 측정될 수 있다. 일부 경우에, 조절 요소 중 적어도 하나는 인간 유래이다. 일부 경우에, 조절 요소 중 적어도 하나는 비-인간 포유동물 유래이다. 일부 경우에, 조절 요소는 비-천연 발생이다. 일부 경우에, 조절 요소는 공동-국소화 검정법에 의해 측정 시 CAG 또는 EF1α 또는 비-선택적 조절 요소에 작동가능하게 연결된 트랜스진의 발현보다 더 큰 PV 세포에서의 발현의 선택성을 발생시킨다. 일부 경우에, 트랜스진은 SCN1A, SNC2A, SNC8A, SCN1B, SCN2B, KV3.1, KV3.3, 및 STXBP1, 또는 이의 기능성 단편, 또는 이에 대한 서열 동일성이 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%인 서열 중 임의의 하나 이상이다. 일부 경우에, 트랜스진은 유전자 (예를 들어, 내인성 유전자 예컨대 SCN1A, SNC2A, SNC8A, SCN1B, SCN2B, KV3.1, KV3.3, 및 STXBP1)의 발현을 조정하는 DNA 결합 단백질, 예컨대 전사 조정인자, 전사 활성화제, 또는 전사 억제인자이다. 일부 경우에, 트랜스진은 유전자 편집 단백질, 예컨대 아연 손가락 뉴클레아제 또는 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제이다. 일부 경우에, 트랜스진은 리포터 유전자 또는 검출가능한 마커, 예컨대 eGFP, tdTomato, 또는 RFP이다. 일부 경우에, 트랜스진은 Cas 단백질, 예컨대 Cas9이다. 일부 경우에, 조절 요소는, 공동-국소화 검정법에 의해 측정 시, CAG 또는 EF1α 또는 비-선택적 조절 요소의 것에 비교하여 적어도 0.5배, 적어도 0.6배, 적어도 0.7배 , 적어도 0.8배 , 적어도 0.9배 , 적어도 1.1배, 적어도 1.2배, 적어도 1.3배, 적어도 1.4배, 적어도 1.5배, 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 6배, 적어도 7배, 적어도 8배, 적어도 9배, 적어도 10배, 적어도 11배, 적어도 12배, 적어도 13배, 적어도 14배, 적어도 15배, 적어도 16배, 적어도 17배, 적어도 18배, 적어도 19배, 적어도 20배, 적어도 25배, 적어도 30배, 적어도 40배, 적어도 50배, 적어도 60배, 적어도 70배, 적어도 80배, 적어도 90배, 적어도 100배인 수준으로 PV 세포에서의 선택적 발현을 발생시킨다. 일부 경우에, 배수 차이는 하나 이상의 조절 요소로부터 발생된 eGFP+, PV+ 세포의 백분율과 비-선택적 조절 요소의 것 사이의 배수 차이를 지칭한다. 일부 경우에, 공동-국소화 검정법은 하기 실시예 5에 기술된 바와 같은 면역조직화학 검정법이다. 일부 예에서, 공동-국소화 검정법은 시판되는 항-PV 항체를 사용하여 수행된다. 일부 경우에, 트랜스진은 이온 채널 서브유닛, 신경전달물질 조절인자, 또는 이의 변이체 또는 기능성 단편을 코딩한다. 일부 경우에, 이온 채널 서브유닛은 나트륨 이온 채널의 알파 서브유닛 또는 베타 서브유닛 또는 칼륨 이온 채널의 서브유닛이다. 일부 경우에, 트랜스진은 (i) SCN1A, SNC2A, SNC8A, SCN1B, SCN2B, KV3.1, KV3.3, 또는 DNA 결합 단백질; (ii) 이의 기능성 단편; 또는 (iii) (i) 또는 (ii)에 대한 서열 동일성이 적어도 80%인 서열 중 어느 하나이다. 일부 경우에, 신경전달물질 조절인자는 (i) STXBP1, (ii) 이의 기능성 단편, 또는 (iii) (i) 또는 (ii)에 대한 서열 동일성이 적어도 80%인 서열이다. 일부 경우에, 조절 요소 및 작동가능하게 연결된 트랜스진은 상이한 염색체 상에 위치한다. 일부 경우에, 조합된 조절 요소는 크기가 2.5 kb 미만, 1.5 kb 미만, 1 kb 미만, 또는 500 bp 미만이다. 일부 경우에, 비-PV 세포는 흥분 뉴런, 도파민작용성 뉴런, 별아교세포, 미세아교세포, 또는 운동 뉴런을 포함하지만 이에 제한되지 않는 비-PV CNS 세포 유형 중 임의의 하나 이상을 포함한다. 일부 경우에, 핵산 카세트는 선형 구축물이다. 일부 경우에, 핵산 카세트는 벡터이다. 일부 경우에, 핵산 카세트는 플라스미드이다. 일부 경우에, 벡터는 바이러스 벡터이다. 일부 경우에, 바이러스 벡터는 아데노-연관 바이러스 (AAV) 벡터이다. 일부 경우에, AAV 벡터는 AAV1, AAV8, AAV9, scAAV1, scAAV8, 또는 scAAV9이다. 일부 경우에, 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터이다. 일부 경우에, 조절 요소는 GAD2, GAD1, SYN1, NKX2.1, DLX1, DLX5/6, SST, PV, 및/또는 VIP의 전사 개시 부위로부터 10 kb 이내의 600 bp 미만의 인접한 서열을 함유한다.
본원에 개시된 다양한 실시양태에서, 조절 요소는 2050 bp, 2000 bp, 1900 bp, 1800 bp, 1700 bp, 1600 bp, 1500 bp, 1400 bp, 1300 bp, 1200 bp, 1100 bp, 1000 bp, 900 bp, 800 bp, 700 bp, 600 bp, 500 bp, 400 bp, 300 bp, 200 bp, 100 bp, 90 bp, 80 bp, 70 bp, 60 bp, 50 bp, 40 bp, 30 bp, 20 bp, 10 bp, 또는 5 bp 미만이다. 본원에 개시된 다양한 실시양태에서, 발현 카세트는 통상적인 바이러스 벡터, 예를 들어, AAV 내에 전형적인 트랜스진 크기보다 큰 트랜스진을 포함한다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 임의의 실시양태의 발현 카세트는 적어도 1 kb, 1.5 kb, 2 kb, 2.5 kb, 3 kb, 3.5 kb, 4 kb, 4.5 kb, 5 kb, 5.5 kb, 6 kb, 6.5 kb, 7 kb, 7.5 kb, 또는 8 kb인 트랜스진을 포함한다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 임의의 실시양태는 크기 면에서 1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 또는 4 kb보다 큰 트랜스진을 포함하는 발현 카세트 (예를 들어, AAV)를 포함한다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 임의의 실시양태는 하나 이상의 이종성 핵산 서열 또는 요소를 추가로 포함할 수 있다.
한 측면에서, 신경학적 장애 또는 병태의 치료를 필요로 하는 대상체에서 신경학적 장애 또는 병태를 치료하는 방법은 치료적 유효량의 본원에 기술된 핵산 카세트를 전달하는 것을 포함한다. 또 다른 측면에서, PV 뉴런에서 트랜스진의 선택적 발현을 증가시키는 방법은 세포를 본원에 기술된 핵산 카세트와 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 경우에, 본원에 개시된 임의의 실시양태의 방법은 신경학적 병태 또는 질환, 예를 들어, 정신과 장애 (예를 들어, 정신분열병, 강박 장애, 중독, 우울증, 불안, 정신병); 자폐증 스펙트럼 장애 (예를 들어, 유약 X 증후군, 레트 증후군); 간질 (예를 들어, 드라벳 증후군, 만성 외상성 뇌병증, 열성 발작을 동반하는 전신 간질 (GEFS+), 간질성 뇌병증, 측두엽 간질, 국소 간질, 결절성 경화증); 또는 신경변성 (예를 들어, 알츠하이머병, 파킨슨병)을 치료하는데 사용된다. 일부 경우에, 본원에 개시된 임의의 실시양태의 방법은 드라벳 증후군을 치료하는데 사용될 수 있다. 본원에 개시된 임의의 실시양태의 방법은 알츠하이머병을 치료하는데 사용될 수 있다. 일부 경우에, 본 개시내용의 방법 및/또는 조성물은 발작 및/또는 간질과 연관되고/되거나 PV 뉴런이 연루되는 임의의 신경학적 병태 또는 질환을 치료하는데 사용될 수 있다.
한 측면에서, 본원에 기술된 신경학적 병태는 유전자 요법, 바람직하게는 공동-국소화 검정법을 통해 결정 시 또 다른 유형에 비해 하나의 조직 유형 또는 세포 유형, 예를 들어, PV 뉴런에서 우선적 발현을 발생시키는 요법으로 치료된다. 일부 경우에, 유전자 요법은 AAV이다.
한 측면에서, CNS 내의 PV 뉴런으로 임의의 트랜스진의 발현을 표적화하는 방법은 하나 이상의 PV 뉴런 선택적 조절 요소를 트랜스진에 작동가능하게 연결시키는 것을 포함한다. 일부 경우에, 조절 요소는 서열식별번호: 1-32, 또는 서열식별번호: 1-32에 대한 서열 동일성이 적어도 80%인 서열, 또는 이의 기능성 단편 중 하나 이상의 서열을 포함한다. 일부 경우에, 조절 요소는, 공동-국소화 검정법에 의해 측정 시, 트랜스진에 작동가능하게 연결된 CAG 또는 EF1α 또는 비-선택적 조절 요소에 비교하여 적어도 2배, 적어도 5배, 또는 적어도 7배, 또는 적어도 10배인 수준으로 PV 뉴런에서의 선택적 발현을 발생시킨다. 일부 경우에, 트랜스진은 SCN1A, SNC2A, SNC8A, SCN1B, SCN2B, KV3.1, KV3.3, STXBP1, DNA 결합 단백질, 또는 이의 기능성 단편이다. 일부 경우에, 조절 요소 및 트랜스진은 AAV 내에 있다. 일부 경우에, AAV는 AAV9이다.
한 측면에서, 신경학적 병태 또는 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에서 신경학적 병태 또는 장애를 치료하는 방법은 하나 이상의 비-PV CNS 세포에 비해 PV 뉴런에서의 선택적 발현을 발생시키는 트랜스진에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 조절 요소를 포함하는 핵산 카세트와 세포를 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 경우에, 조절 요소는 서열식별번호: 1-32, 또는 이의 기능성 단편 또는 조합물, 또는 이에 대한 서열 동일성이 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%인 서열 중 하나 이상을 포함한다. 일부 경우에, 트랜스진은 전압-게이팅 이온 채널 서브유닛, 또는 이의 변이체 또는 기능성 단편이다. 일부 경우에, 서브유닛은 나트륨 이온 채널의 베타 서브유닛이다. 일부 경우에, 서브유닛은 나트륨 이온 채널의 알파 서브유닛이다. 일부 경우에, 서브유닛은 칼륨 이온 채널의 것이다. 일부 경우에, 트랜스진은 (i) SCN1A, SNC2A, SNC8A, SCN1B, SCN2B, KV3.1, KV3.3, DNA 결합 단백질 또는 STXBP1; (ii) 이의 기능성 단편; 또는 (iii) (i) 또는 (ii)에 대한 서열 동일성이 적어도 80%인 서열 중 어느 하나이다. 일부 경우에, 신경학적 병태 또는 장애는 SCN1A, SCN1B, SCN2B, KV3.1, 및 KV3.3 중 임의의 것에서의 반수체기능부전 또는 돌연변이와 연관된다. 일부 경우에, 신경학적 병태 또는 장애는 드라벳 증후군이다. 일부 경우에, 신경학적 병태 또는 장애는 알츠하이머병이다. 일부 경우에, 신경학적 병태 또는 질환은 정신과 장애 (예를 들어, 정신분열병, 강박 장애, 중독, 우울증, 불안, 정신병); 자폐증 스펙트럼 장애 (예를 들어, 유약 X 증후군, 레트 증후군); 간질 (예를 들어, 만성 외상성 뇌병증, 열성 발작을 동반하는 전신 간질 (GEFS+), 간질성 뇌병증, 측두엽 간질, 국소 간질, 결절성 경화증); 또는 신경변성 (예를 들어, 알츠하이머병, 파킨슨병)이다. 일부 경우에, 신경학적 병태 또는 질환은 PV 뉴런이 연루되는 임의의 발작 및/또는 간질 관련 병태 또는 질환이다. 일부 경우에, 핵산 카세트는 공동-국소화 검정법에 의해 측정 시, 트랜스진에 작동가능하게 연결된 CAG 또는 EF1α 또는 비-선택적 조절 요소에 비교하여 적어도 2배, 적어도 5배, 또는 적어도 7배, 또는 적어도 10배인 수준으로 PV 뉴런에서의 선택적 발현을 발생시킨다. 일부 경우에, 핵산 카세트는 AAV 내에 있다. 일부 경우에, AAV는 AAV9이다.
한 측면에서, 드라벳 증후군을 치료하는 방법은 (i) SCN1A, SCN1B, SCN2B, DNA 결합 단백질 (ii) 이의 기능성 단편, 또는 (iii) (i) 또는 (ii)에 대한 서열 동일성이 적어도 80%인 서열 중 어느 하나인 트랜스진을 포함하는 AAV와 세포를 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 경우에, AAV는 트랜스진에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 PV 뉴런 선택적 조절 요소 또는 임의의 본원에 개시된 조절 요소를 추가로 포함한다. 일부 경우에, 각각의 조절 요소는 서열식별번호: 1-32, 또는 이의 임의의 기능성 단편 또는 조합물, 또는 서열식별번호: 1-32 중 어느 하나에 대한 서열 동일성이 적어도 80%인 서열 중 어느 하나를 포함하는 서열을 독립적으로 포함한다.
또 다른 측면에서, 알츠하이머병을 치료하는 방법은 (i) SCN1A, SCN2B, KV3.1, KV3.3, 및 STXBP1, (ii) 이의 기능성 단편, 및 (iii) (i) 또는 (ii)에 대한 서열 동일성이 적어도 80%인 서열 중 어느 하나인 트랜스진을 포함하는 AAV와 세포를 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 경우에, AAV는 트랜스진에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 PV 뉴런 선택적 조절 요소를 추가로 포함한다. 일부 경우에, 각각의 조절 요소는 서열식별번호: 1-32, 또는 이의 임의의 기능성 단편 또는 조합물, 또는 서열식별번호: 1-32 중 어느 하나에 대한 서열 동일성이 적어도 80%인 서열 중 어느 하나를 포함하는 서열을 독립적으로 포함한다.
실시예
이러한 실시예는 설명의 목적으로만 제공되고, 본원에서 제공되는 청구범위의 범주를 제한하지 않아야 한다.
실시예 1
추정 PV-선택적 조절 요소의 확인
PV 세포에 대해 선택적인 추정 조절 요소를 확인하고 스크리닝하기 위해, 친화도 정제를 사용하여, 예를 들어, 항-GFP 또는 항-Myc 항체 및 단백질 G-코팅 자기 비드를 사용하여 R26-CAG-LSL-Sun1-sfGFP-Myc 녹인 마우스로부터 PV 세포를 수확할 수 있다. 항-PV 항체 코팅 비드 또는 친화도 정제 매트릭스를 사용함으로써 PV 세포가 강화될 수 있다. 그 후, PV 세포로부터 핵을 단리한다. 핵 RNA를 핵으로부터 정제하여 cDNA로 변환시킬 수 있고, 누젠 오베이션 RNA-seq 시스템 V2 (누젠 7102)로 증폭시킨 후, 일루미나 HiSeq 2500을 사용하여 시퀀싱할 수 있다. 게놈 DNA를 핵으로부터 정제하고, 단편화하여, 메틸C-seq 라이브러리를 제조하는데 사용할 수 있으며, 이를 일루미나 HiSeq 2000을 사용하여 시퀀싱할 수 있다. ATAC-seq 라이브러리를 생성시키기 위해, 비드에 결합된 핵을 Tn5 트랜스포사제 (일루미나 FC-121-1030)를 사용하여 전치시킨다. 9-12 사이클의 PCR 증폭 후, 라이브러리를 일루미나 HiSeq 2500을 사용하여 시퀀싱한다. ChIP-seq 라이브러리를 생성시키기 위해, 마이크로코쿠스 뉴클레아제를 사용하여 PV 세포의 핵을 모노뉴클레오솜으로 소화시킨 후, 염색질의 염 추출, 및 천연 ChIP 및 라이브러리 구축이 이어지고, 이를 일루미나 HiSeq 2500에서 시퀀싱할 수 있다. 이러한 라이브러리들의 시퀀싱 후, CG-풍부 영역 내의 과소메틸화에서의 상관관계 및 패턴, 히스톤 변형, 전사 인자 결합 부위, 및 PV 세포 내의 고도로 발현된 전사 인자와 연관된 패턴을 확인하기 위해 서열을 지도화한다. 상기 기술된 다중 검정법 및/또는 라이브러리로부터의 중첩 특색 및 상관관계는 추정 PV-선택적 조절 요소인 후보 서열을 확인하기 위한 수렴성 증거를 제공한다. 추정 PV-선택적 조절 요소를 하기 실시예 5에 기술된 바와 같은 공동-국소화 검정법을 사용하여 추가로 테스트할 수 있다. 하기 실시예 2에 기술된 바와 같이, 파르브알부민-발현에서 Cre 리컴비나제를 발현하는 B6 PV-Cre 녹-인 마우스인 B6 PV-Cre 마우스 (잭슨 래버러토리)에서 추정 PV-선택적 조절 요소를 또한 테스트할 수 있다. 조절 요소의 PV-선택성을 검증한 후, 조절 요소를 트랜스진에 작동가능하게 연결시켜 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 5개 초과의 비-PV 세포에 비해 PV 세포에 대해 선택적으로 발현을 표적화할 수 있다.
실시예 2
PV-Cre 마우스에서의 PV 뉴런에 대한 선택성
PV 뉴런에 대한 선택성을 형광 영상화를 사용하여 결정할 수 있다. (i) 대조군 프로모터 (EF1a); 또는 (ii) 상기 실시예 1에서 확인된 PV-선택적 RE; 또는 (iii) 서열식별번호: 1-32로부터 선택된 PV-선택적 RE에 작동가능하게 연결된 eGFP를 함유하는 AAV9 벡터; 및 Cre 의존적 tdTomato를 함유하는 AAV9 벡터를 B6 PV-Cre 마우스 (잭슨 랩스(Jackson Labs)) 내로 공동-주사한다. PV-Cre는 내인성 Pvalb 발현을 파괴하지 않으면서 파르브알부민-발현 뉴런 (예컨대 뇌 내의 개재뉴런 및 후근신경절 내의 고유수용성 구심성 감각 뉴런)에서 Cre 리컴비나제를 발현하는 녹-인 마우스이다.
0.3 ㎕/분의 속도 + 주사 후 4분의 휴지 기간으로 마우스의 등쪽 및 배쪽 해마 내로 1.5 ㎕의 AAV9 벡터 (512 내지 113 gc/ml)를 양측으로 주입하였다. 주사를 위해 마우스를 마취한다. 동물을 하기의 좌표를 사용하여 정위 프레임 (콥프 인스트루먼츠(Kopf instruments), 미국) 내에 놓는다: 등쪽 해마 (AP -2.0 mm, 측면 ±1.5, 경막으로부터 DV -1.4 mm) 및 배쪽 해마 (AP -3.1 mm, 측면 ±2.8, 경막으로부터 DV -3.8 mm). 해밀턴(Hamilton) 주사기 (모델 # 80308; 상응하는 30 ga 블런트 팁 바늘이 있는 10 ㎕ 주사기)를 정위 미세조작기와 함께 사용하여, 천두공을 지정하고 뚫을 수 있다. 드릴은 뼈를 관통하는데만 사용된다. 천공 후, 주사, 예를 들어, 주사 부피: 1.5 ㎕; 주사 속도: 0.3 ㎕/분을 위한 원하는 위치의 깊이로 주입 캐뉼러를 뇌 내로 내린다. 주입 전, 바늘을 1분 동안 평형화되게 한다. 전달이 완료되면, 바늘을 4분 동안 방치한 후, 대략적으로 1분에 걸쳐 꺼낸다. 모든 주입이 완료되면, 피부 절개를 봉합하여 닫고, 수술 후 진통제를 투여한다. 처리된 마우스를 나머지 연구 동안 매일 건강 검진하고, 매주 1회 칭량하여 체중을 모니터링한다.
조직 수집을 위해, 마우스를 이소플루란 과용량으로 안락사시키고, 4% 파라포름알데히드 (PFA)를 관류시킨다. 해마를 함유하는 뇌 조직 조각을 추출하고, 4℃에서 적어도 12시간 동안 4% PFA 내에 놓는다. 그 후, 뇌 조직을 조직이 튜브 바닥으로 가라앉을 때까지 4℃에서 30% 수크로스 (포스페이트 완충 염수 내)에서 탈수시킨다. 냉동미세절단기에서 절편화하기 위해 뇌 조직을 티슈-텍(Tissue-Tek) OCT에 매립한다. 절편화된 뇌 조직을 항-RFP 폴리클로날 토끼 항체 (록랜드 안티바디즈 앤드 어세이(Rockland Antibodies and Assay)) 및 항-eGFP 폴리클로날 닭 항체 (아베스 랩스(Aves Labs))로 표준 면역조직화학 절차를 사용하여 eGFP 및 tdTomato에 대해 염색한다. 형광 현미경 영상화를 사용하여 세포를 가시화한다. eGFP, 또는 녹색 형광은 모든 유전자 발현에 상응한다. tdTomato로부터의 적색 형광은 PV+ 세포에 상응한다. 황색 또는 백색 세포로서 가시화될 수 있는 이러한 2개의 형광 신호의 중첩은 eGFP 트랜스진을 발현하는 PV+ 세포를 나타낸다. PV-선택적 조절 요소를 포함하는 AAV9 벡터가 대조군 프로모터 (EF1a)에 비교하여 더 높은 개수의 eGFP+ 및 PV+인 세포를 산출할 것으로 예상된다. 예를 들어, PV-선택적 RE (예를 들어, 서열식별번호: 1-32 또는 실시예 1에서 확인된 추정 RE) 중 어느 하나를 포함하는 AAV9가 주사된 마우스로부터의 세포의 형광 영상화는 더 높은 개수의 PV+이기도 한 eGFP+ 세포를 나타낼 것으로 예상된다. PV 세포에 대한 선택성을 PV+이기도 한 모든 eGFP+ 세포의 백분율로서 정량할 수 있다.
실시예 3
드라벳 마우스 모델에서의 발작 감소
B6(Cg)-Scn1a tm1.1Dsf /J 마우스를 잭슨 래버러토리즈를 통해 드라벳 증후군 유럽 연합으로부터 수득하였다. 이러한 마우스는 SCN1A의 엑손 24 (A에서 위치 1783의 V까지) 내에 드라벳 증후군 연관 돌연변이를 함유한다. 이러한 마우스는 야생형 서열의 플록스드(floxed) 엑손 24를 또한 함유한다. 조작되지 않은 경우, 이러한 계통의 마우스는 SCN1A의 WT 대립유전자의 2개의 카피를 발현한다. 그러나, Cre 리컴비나제를 발현하는 AAV의 전달 시, AAV가 표적으로 하는 임의의 세포는 돌연변이체 대립유전자의 1개의 카피를 발현하는 것으로 전환될 것이다. 돌연변이체 SCN1A 서브유닛의 발현 시, 마우스는 10일 이내에 자발적 발작이 나타난다.
B6(Cg)-Scn1a tm1.1Dsf /J 및 대조군 C57Bl6 마우스에, 실시예 2에서와 같이, EF1α 프로모터의 제어 하에 CRE 리컴비나제를 발현하는 AAV 및 eGFP (서열식별번호: 36) 또는 SCN1B (서열식별번호: 37)의 발현을 구동시키는 PV 세포 선택적 조절 요소 서열식별번호: 32를 포함하는 AAV를 주사하였다. 4회의 주입 모두가 완료되면, 원격측정 이식이 즉각적으로 수행되었다 (F20-EET, 데이터 사이언시즈 인터내셔널(Data Sciences International)). 피질뇌파도 데이터를 수술 후 10일부터 14일 동안 계속 모니터링하였다. 피질뇌파도 데이터를 분석하고, 날짜, 시작 시간, 정지 시간, 발작 기간 및 중증도 점수를 주석으로 달아서 모든 발작 이벤트를 기록하였다. 도 1은 처리 후 14일에 걸친 12시간 창에서의 발작의 빈도를 도해한다. SCN1B로 처리된 마우스가 대조군 동물에 비교하여 더 낮은 발작 빈도를 향하는 경향을 나타냈다.
이러한 관찰은 나트륨 이온 채널의 베타 유닛, 예를 들어, SCN1B가 나트륨 이온 채널의 수송 및 조립에 기여할 수 있고, PV 뉴런에서 베타 유닛의 발현을 선택적으로 증가시키는 것이 Nav1.1 채널의 수송 및 조립 증가를 발생시킬 수 있어, SCN1B 유전자 요법으로 처리된 마우스에서 더 낮은 발작 빈도 및 기간을 향하는 경향에 이른다는 개념과 일관되었다.
실시예 4
마우스 모델에서의 알츠하이머병 치료
사이코제닉스(PsychoGenics)에서 육종된 암컷 APP/PS1 및 WT 마우스를 연구에서 사용하였다. APP/PS1 마우스는 스웨덴 돌연변이 (670 G-T 및 671 A-C)를 보유하는 아밀로이드 베타 전구체 단백질 (APP) 및 L166P 돌연변이를 함유하는 프리세닐린(Presenilin) 1 (PSEN1) 양쪽 모두에 대한 인간 트랜스진을 함유하고, 양쪽 모두 Thy1 프로모터의 제어 하에 있다. 이러한 마우스는 아밀로이드 플라크 및 기억력 결함을 포함하여 알츠하이머병의 증상을 나타낸다. 이러한 마우스에 대한 추가 설명을 문헌 [Radde et al., 2006 (Radde, Rebecca, et al. "Aβ42-driven cerebral amyloidosis in transgenic mice reveals early and robust pathology." EMBO reports 7.9 (2006): 940-946)]에서 확인할 수 있다.
APP/PS1 마우스가 알츠하이머병의 증상에 대한 RE의 제어 하의 SCN1B로의 처리의 효과를 결정하기 위한 모델로서 사용되었다. APP/PS1 마우스 및 비-트랜스제닉 대조군에 양쪽 모두 서열식별번호: 32의 제어 하에 있는 eGFP를 발현하는 대조군 벡터 또는 SCN1B를 발현하는 처리 벡터를 주사하였고, 실시예 3에서와 같이 EET 트랜스미터를 이식하였다. 수술 4주 후에 24시간에 걸쳐 뇌 활성을 평가하였다. 피질뇌파도 데이터가 자동으로 분석되었고, 상이한 주파수 대역에서의 감마파 수준이 비교되었다. 도 2는 비-트랜스제닉 대조군 (WT), APP/PS1, 및 SCN1B로 처리된 APP/PS1 마우스에서의 높은 감마파 (50-100Hz)를 도해한다. 높은 감마파 활성 증가는 알츠하이머 환자 및 간질 환자에서의 발작과 연관된다. APP/PS1 마우스가 대조군 마우스보다 더 높은 수준의 높은 감마파 활성을 나타냈다. 그러나, 처리된 마우스에 벡터로의 효과적인 치료를 나타내는 증가가 부재하였다.
실시예 5
C57BL/6J (WT) 마우스에서의 PV 뉴런에 대한 선택성
본원에 개시된 다양한 RE의 선택성을 면역조직화학 방법을 사용하여 PV 뉴런에서의 선택적 유전자 발현에 대해 테스트하였다. C57BL/6J (WT) 마우스 라인이 PV 면역조직화학 검정법에 사용되었다. AAV9 구축물 내의 조절 요소 (서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 8) 또는 CAG 프로모터에 작동가능하게 연결된 리포터 트랜스진 eGFP를 포함하는 발현 카세트.
새끼 전신 주입: 생후 1일의 C57BL/6J 마우스에 31 G 바늘이 있는 300 U 인슐린 주사기를 사용하여 AA9 벡터 (1 E12 내지 3 E12)를 안면 정맥을 통해 주입하였다. 조직 수집을 위해, 주입 21일 후에 과용량의 소듐 펜토바르비탈 (i.p.)을 통해 마우스를 안락사시키고, 헤파린처리 (2.5 IU/ml) 염수를 관류시킨 후, 4% 포름알데히드를 관류시켰다. 뇌를 제거하고, 이어서 4℃에서 24-48시간 동안 4% 포름알데히드에 침지-고정시켰다. 그 후, 뇌를 30% 수크로스를 함유하는 PBS 내에 놓고, 4℃에서 가라앉게 하였다 (~2-3일). 가라앉으면, 개별적인 뇌 반구를 정중선을 아래로 향하게 하여 티슈-텍 OCT에서 냉동시켰다. 냉동된 뇌를 냉동미세절단기 상에서의 시상 절단용으로 가공하고, PBS 내로 자유롭게 부유되게 두었다. 절편을 닭 항-GFP (아베스 랩, GFP-1020) 및 마우스 항-PV (시그마(Sigma), P3088)로 표준 면역조직화학 절차를 사용하여 eGFP 및 파르브알부민 (PV)에 대해 염색하였다.
성체 전신 주입: 4주령 C57BL/6 마우스에 eGFP를 발현하는 60 ㎕의 AAV9 벡터 (4.913 to 114 gc/ml)를 꼬리 정맥 주사를 통해 주입하였다. 조직 수집을 위해, 주입 21일 후에 이소플루란 과용량을 통해 마우스를 안락사시키고, 전체 뇌를 추출하고, PBS로 세정하고, 빙냉 4% 포름알데히드를 함유하는 별개의 5 ml 튜브 내에 놓았다. 4℃에서 철야로 조직을 고정시켰다. 다음 날, 뇌를 30% 수크로스를 함유하는 PBS 내에 놓고, 4℃에서 가라앉게 하였다. 가라앉으면, 개별적인 뇌 반구를 정중선을 아래로 향하게 하여 티슈-텍 OCT에서 냉동시켰다. 냉동된 뇌를 냉동미세절단기 상에서의 시상 절단용으로 가공하고, PBS 내로 자유롭게 부유되게 두었다. 절편을 닭 항-GFP (아베스 랩, GFP-1020) 및 마우스 항-PV (시그마, P3088)로 표준 면역조직화학 절차를 사용하여 EGFP 및 파르브알부민 (PV)에 대해 염색하였다.
면역조직화학 프로토콜: 면역조직화학을 항-PV 항체를 사용하여 eGFP 신호 및 PV 신호의 공동-국소화를 분석하는데 사용하였고, 여기서 신호의 오버레이는 상부 패널 영상 (병합)에서 백색 또는 담회색 점으로서 나타났고, 대표적인 오버레이가 화살촉에 의해 지시되었다. eGFP 및 PV 형광의 오버레이는 PV 세포에서의 발현을 지시한다. 이같은 실험을 사용하여 PV 세포에서의 발현의 선택적 발현을 결정할 수 있다. 면역조직화학 실험을 수행하기 위해, 각각의 마우스로부터 수득된 조직을 차단 완충제 용액 (1× PBS 내의 3% BSA, 3%NGS, 0.3% 트리톤 X-100, 0.2% 트윈-20을 포함함)으로 1시간 동안 실온에서 차단시켰다. 그 후, 조직을 차단 완충액 내의 1차 항체와 함께 4℃에서 철야로 인큐베이션하고, 각각 5분 간격으로 1 mL 1× PBS로 3회 세정하였다. 그 후, 조직을 차단 완충액 내의 2차 항체와 함께 1시간 동안 실온에서 인큐베이션 하고, 각각 1 mL 1× PBS 및 5분 간격으로 3회 세정하였다. 조직을 5분 동안 PBS 완충제 내의 DAPI (1:1000)와 함께 인큐베이션하고, 1 mL 1× PBS로 2회 세정하였다. 조직을 슬라이드 상에 장착하고, 영상화하고, 형광 현미경을 사용하여 분석하였다. 벡트라(Vectra) 3 영상화 시스템 (퍼킨 엘머(Perkin Elmer))를 사용하여 영상을 찍고, eGFP 및 PV 염색의 공동-표지화에 대해 고급 영상 분석 소프트웨어인 인폼-티슈 파인더(inform-Tissue finder)를 사용하여 정량하거나 또는 수동으로 채점하였다. 적어도 80개의 GFP 양성 세포가 각각의 패널에서 계수된 후, 공동-국소화의 백분율을 결정하였다.
도 3a-3c는 전신 AAV9 주사 후 새끼에서 수행된 면역조직화학 실험의 결과를 도해한다. 도 4a-4c는 AAV9 주사 후 성체 마우스에서 수행된 유사한 면역조직화학 실험의 결과를 도해한다.
도 3a는 전신 AAV9 주사 후 새끼에서 수행된 면역조직화학 실험의 오버레이를 도해한다. 도 3b는 면역조직화학 실험의 공동-국소화의 정량을 도해하고, 여기에서 PV 세포에 대한 선택성은 CAG 프로모터의 제어 하에서의 eGFP 발현에 비교된, PV+이기도 한 GFP+ 세포의 백분율로서 측정되었다.
도 4a는 AAV9 주사 후 성체 마우스에서 수행된 면역조직화학 실험의 오버레이를 도해한다. 도 4b는 면역조직화학 실험의 공동-국소화의 정량을 도해하고, 여기에서 PV 세포에 대한 선택성은 EF1α의 제어 하에서의 eGFP 발현에 비교된, PV+이기도 한 GFP+ 세포의 백분율로서 측정되었다.
GABA작용성 뉴런이 CNS의 약 20%를 구성하는 한편, PV 세포가 GABA작용성 뉴런의 약 40%를 구성하는 것으로 추정되고, 이는 PV 세포가 CNS 내의 모든 뉴런의 대략적으로 8%를 구성한다는 것을 의미한다. 문헌 [Pelkey, KA et al., 2017]; 및 [Lee, S. et al., 2010]을 참조한다. 따라서, 비-선택적 조절 요소 (예를 들어, CAG, EF1α 또는 구성적 프로모터)에 의해 표지된 세포의 약 8%가 PV 양성이거나 또는 이러한 범위 내에 있을 것으로 예상될 것이다. 따라서, 8%를 초과하는 PV 세포에서의 발현은 PV 세포에서의 선택성 증가를 나타낸다. 특히, 서열식별번호: 8의 조절 요소를 포함하는 AAV9 주사가 세포의 약 60%가 PV 양성인 것을 발생시켰고, 이는 PV 세포의 분포에 의해 예상된 것보다 7.5배 더 높았다.
서열식별번호: 34의 서열을 갖는 비-선택적 조절 요소에 비교하여 추가적인 조절 요소인 서열식별번호: 2-7 및 9-22의 선택적 발현을 결정하기 위해 상기 기술된 것과 유사한 면역조직화학 실험을 수행하였고, 단 AAVDJ 바이러스 벡터가 조절 요소에 작동가능하게 연결된 eGFP를 C57BL/6J (WT) 마우스 내로 전달하는데 사용되었다. 이같은 AAVDJ 바이러스를 성체 마우스의 해마 내의 CNS 내로 직접적으로 주사하였다. 적어도 80개의 GFP 양성 세포가 각각의 실험에서 계수된 후, PV 양성이기도 한 GFP 양성 세포의 백분율로서 공동-국소화의 백분율, 또는 선택성을 계산하였다. 도 5a-5f는 비-선택적 조절 요소인 서열식별번호: 34의 신호에 비교하여 PV 양성이기도 한 eGFP 양성 세포의 백분율로서 측정된, 공동-국소화 또는 선택성을 결정하는데 사용된 형광 영상화를 도해한다. 마커에 대해 양성인 세포는 영상에서 백색/회색 세포로 나타난다. 병합 영상은 상응하는 eGFP와 항-PV 영상 사이의 중첩을 도해한다. eGFP 및 PV 양쪽 모두에 대해 양성인 세포는 병합 영상에서 백색/담회색 세포로서 나타난다. 도 6은 PV+이기도 한 eGFP+ 세포의 백분율로서 측정된, 공동-국소화 분석의 정량을 도해한다.
실시예 6
상이한 마우스 라인들에서의 드라벳 증후군의 치료
본원에 기술된 발현 카세트를 사용하는 드라벳 증후군 및/또는 이의 증상의 치료를 다양한 마우스 라인, 예컨대 상기 기술된 바와 같은 B6(Cg)-Scn1a tm1.1Dsf /J, Scn1atm1Kea, 및 Scn1a-R1470X 마우스 라인에서 테스트할 수 있다. 이러한 마우스 라인들은 드라벳 증후군에 대한 확립된 마우스 모델이다. Scn1a tm1Kea 및 Scn1a-R1470X 마우스 라인은 CRE 리컴비나제를 필요로 하지 않는다.
Scn1a tm1Kea 마우스 (잭슨 래버러토리에서 입수가능하고, 문헌 [Hawkins et al., Scientific Reports, vol. 7: 15327 (2017)]에 기술되어 있음)는 SCN1A의 제1 코딩 엑손의 결실을 포함한다. SCN1A 녹아웃 대립유전자에 대해 동종접합성인 마우스는 떨림, 실조, 발작, 및 생후 제16일까지의 사망을 특징으로 한다. C57BL/6 배경의 이종접합성 마우스는 자발적 발작을 일으키고, 수주 내에 사망한다. 이같은 마우스 계통을 사용하여 간질 및 드라벳 증후군 치료의 안전성 및 효능을 연구할 수 있다. 추가적인 정보에 대해 문헌 [Miller et al., Genes Brain Behav. 2014 Feb;13(2):163-72]을 참조한다.
Scn1a-R1470X 마우스는 SCN1A 유전자의 엑손 21 내에 조기 정지 코돈인 R1407X를 보유하는 녹-인 마우스이다. 동일한 돌연변이가 3마리의 관련되지 않은 SMEI 환자에서 병원성 돌연변이로서 확인되었다. Scn1aRX/RX 새끼는 생후 12-16일의 강직성 간대 및 간대 발작을 포함하는 생후 12일의 재발성 자발적 발작, 및 율동성 경련 운동 및 불수의근 수축을 특징으로 한다. 추가적인 정보를 위해 문헌 [Ogiwara et al., Journal of Neuroscience, May 30, 2007, 27 (22) 5903-5914]을 참조한다.
본원에 기술된 조성물, 예컨대 AAV 유전자 요법 및 이같은 유전자 요법을 사용하는 치료를 테스트하기 위해, 상기 기술된 각각의 마우스 계통의 드라벳 마우스 및 대조군 마우스 (예를 들어, 계통에 대한 야생형 마우스 또는 미처리 드라벳 마우스)에 eGFP 또는 또 다른 리포터 유전자, 또는 본원에 개시된 트랜스진, 예컨대 SCN1A, SCN1B, 또는 SCN2B, 또는 서열식별번호: 37-39, 또는 이의 변이체 또는 기능성 단편 중 임의의 것에 작동가능하게 연결된 본원에 기술된 바와 같은 하나 이상의 PV-선택적 RE (예를 들어, 서열식별번호: 1-32)를 포함하는 발현 카세트를 발현하는 AAV를 주사한다 (예를 들어, 복막내 주사에 의해 투여한다). AAV 주사 후, 마우스 생존을 경시적으로 모니터링한다. 모든 마우스를 일반적인 건강 (예를 들어, 체중, 수화, 손질 및 이동성)에 대해 매일 모니터링하고, 사망을 기록하였다. AAV 주사 직후 원격측정 이식을 수행할 수 있다 (F20-EET, 데이터 사이언시즈 인터내셔널). 피질뇌파도 데이터를 수술 10일 후부터 적어도 14일 동안 계속 기록 및 모니터링할 수 있다. 날짜, 시작 시간, 정지 시간, 기간 및 중증도 점수를 주석으로 달아서, 모든 발작 이벤트를 AAV 처리 후 적어도 14일 동안 기록할 수 있다. eGFP 대조군 또는 미처리 대조군에 비교하여 상기 기술된 바와 같은 AAV로의 처리 후의 발작의 빈도 및/또는 기간이 감소되는 것은 드라벳 증후군의 증상 및/또는 중증도를 감소시키는 것에서의 유전자 요법의 효능을 나타낸다.
마우스를 AAV로 처리한 후, 트랜스진 (예를 들어, SCN1A; SCN1B; SCN2B; 내인성 SCN1A, SCN1B, 또는 SCN2B를 조정하는 DNA 결합 단백질, 예컨대 전사 활성화제; 서열식별번호: 37-39; 또는 이의 임의의 변이체 또는 기능성 단편 중 임의의 것)의 발현 수준을 다양한 PCR 및/또는 시퀀싱 방법을 사용하여 경시적으로 모니터링하여, AAV 처리가 PV 세포에서의 유전자 발현의 증가를 발생시킬 수 있다는 것을 나타낼 수 있다. 생체 내에서 트랜스진 발현을 분석하기 위해 노던 블롯 분석 및 원위치 혼성화를 또한 사용할 수 있다. 트랜스진 발현의 증가가 생체 내에서의 상응하는 단백질의 증가와 상호관련된다는 것을 나타내기 위해 단백질로부터 발현된 단백질의 수준을 처리 후에 모니터링할 수도 있다. 웨스턴 블롯 분석, 면역조직화학, 면역형광 조직화학, 및/또는 ELISA 검정법을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 방법을 사용하여 단백질 수준을 검정할 수 있다. 전류-클램프 분석을 사용하여 기능성 전압-게이팅 나트륨 이온 채널의 형성을 또한 검정할 수 있다.
온열요법-유도 발작을 평가하여, 야생형 마우스 및/또는 미처리 드라벳 마우스를 본원에 기술된 발현 카세트 (예를 들어, 본 개시내용의 트랜스진, 예컨대 SCN1A, SNC2A, SNC8A, SCN1B, SCN2B, 이의 기능성 단편, 또는 내인성 SCN1A, SNC2A, SNC8A, SCN1B, 또는 SCN2B를 조정하는 DNA 결합 단백질에 작동가능하게 연결된 본 개시내용의 하나 이상의 RE를 포함하는 발현 카세트)를 포함하는 AAV 유전자 요법으로 처리된 드라벳 마우스와 비교할 수 있다. 이같은 실험에서, 심부 체온을 RET-3 직장 온도 프로브 (피지템프 인스트루먼츠 인크(Physitemp Instruments, Inc), 미국 뉴저지)로 모니터링하고, 파트로우(Partlow) 1160+ 제어기 (웨스트 컨트롤 솔루션스(West Control Solutions), 영국 브라이튼)로 재구성된 설치류 온도 조절기 (TCAT-2DF, 피지템프)에 연결된 열 램프로 제어한다. 1차 간대 경련이 발병할 때까지 체온이 2분마다 0.5℃ 상승된다. 미처리 드라벳 마우스에 비교하여, AAV 유전자 요법으로 처리된 드라벳 마우스는 1차 간대 경련의 발병 전의 역치 온도가 더 높고/높거나 테스트된 최대 온도에서 발작 없이 유지되는 마우스의 비율이 더 높을 것으로 예상된다.
발현 카세트를 포함하는 상이한 용량의 AAV를 또한 마우스에 투여하여, 각각의 유전자 요법 처리의 안전성 및 효능 프로파일을 결정할 수 있다. 이러한 임상전 연구는 드라벳 증후군을 치료하는데 사용하기 위한 유전자 요법의 최적의 용량(들)에 관한 정보를 제공할 수도 있다.
실시예 7
마우스에서의 알츠하이머병의 치료
사이코제닉스에서 육종되고 알츠하이머병의 확립된 마우스 모델인 암컷 APP/PS1 및 야생형 (WT) 마우스를 사용하여, 하나 이상의 PV-선택적 RE를 포함하는 본원에 기술된 조성물의 알츠하이머병을 치료하는 것에서의 안전성 및 효능을 연구할 수 있다. APP/PS1 마우스는 상기 실시예 4에서 기술된다.
APP/PS1 마우스 및 비-트랜스제닉 대조군에 eGFP를 발현하는 대조군 AAV 벡터, 또는 알츠하이머병에서 결핍 또는 손상되는 트랜스진, 예컨대 SCN1A, SNC2A, SNC8A, SCN1B, SCN2B, KV3.1, KV3.3, STXBP1, 내인성 유전자 (예를 들어, SCN1A, SNC2A, SNC8A, SCN1B, SCN2B, KV3.1, KV3.3, 또는 STXBP1)를 조정하는 DNA 결합 단백질, 또는 서열식별번호: 37-43, 또는 이의 기능성 단편 중 어느 하나에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 본원에 개시된 PV-선택적 RE, 예를 들어 서열식별번호 1-32를 포함하는 치료용 AAV 벡터를 주사한다.
AAV 주사 후, 마우스 생존을 경시적으로 모니터링한다. 모든 마우스를 일반적인 건강 (예를 들어, 체중, 수화, 손질 및 이동성)에 대해 매일 모니터링하고, 사망을 기록하였다. AAV 주사 후, 상기 실시예 3에 기술된 바와 같이 마우스에 EET 트랜스미터를 또한 이식한다. 수술 후 적어도 4주 동안 24시간에 걸쳐 뇌 활성을 기록 및 모니터링할 수 있다. 피질뇌파도 데이터가 자동으로 분석될 수 있고, 상이한 주파수 대역 (50-100 Hz)에서의 감마파 수준이 상이한 군들에 걸쳐 비교될 수 있다: WT 마우스, 미처리 APP/PS1 마우스, 및 각각 상기 기술된 바와 같이 AAV 유전자 요법으로 처리된 AAV-처리 APP/PS1 마우스. 높은 감마파 활성 증가는 알츠하이머 환자 및 간질 환자에서의 발작과 연관된다. 따라서, 미처리 APP/PS1 마우스가 대조군 마우스보다 더 높은 수준의 높은 감마파 활성을 나타낼 것으로 예상되는 한편, 처리된 마우스에서는 이러한 증가가 부재하거나 감소될 것으로 예상되고, 이는 AAV 유전자 요법으로의 효과적인 치료를 나타낸다.
마우스를 AAV로 처리한 후, 트랜스진의 발현 수준을 다양한 PCR 및/또는 시퀀싱 방법을 사용하여 경시적으로 모니터링하여, AAV 처리가 트랜스진의 내인성 발현의 증가를 발생시킬 수 있다는 것을 나타낼 수 있다. 생체 내에서 유전자 발현을 분석하기 위해 노던 블롯 분석 및 원위치 혼성화를 또한 사용할 수 있다. 유전자 발현의 증가가 단백질 수준의 증가와 상호관련된다는 것을 나타내기 위해 트랜스진으로부터 발현된 단백질의 수준을 처리 후에 모니터링할 수도 있다. 웨스턴 블롯 분석, 면역조직화학, 및/또는 ELISA 검정법을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 방법을 사용하여 단백질 수준을 검정할 수 있다. 전류-클램프 분석을 사용하여 기능성 전압-게이팅 나트륨 또는 칼륨 이온 채널의 형성을 또한 검정할 수 있다.
발현 카세트를 포함하는 상이한 용량의 AAV를 또한 마우스에 투여하여, 각각의 유전자 요법 처리의 안전성 및 효능 프로파일을 결정할 수 있다. 이러한 임상전 연구는 알츠하이머병을 치료하는데 사용하기 위한 유전자 요법의 최적의 용량(들)에 관한 정보를 제공할 수도 있다.
SEQUENCE LISTING <110> ENCODED GENOMICS, INC. <120> TISSUE SELECTIVE TRANSGENE EXPRESSION <130> 46482-704.601 <140> <141> <150> 62/480,998 <151> 2017-04-03 <160> 43 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 681 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 ggaggaagcc atcaactaaa ctacaatgac tgtaagatac aaaattggga atggtaacat 60 attttgaagt tctgttgaca taaagaatca tgatattaat gcccatggaa atgaaagggc 120 gatcaacact atggtttgaa aagggggaaa ttgtagagca cagatgtgtt cgtgtggcag 180 tgtgctgtct ctagcaatac tcagagaaga gagagaacaa tgaaattctg attggcccca 240 gtgtgagccc agatgaggtt cagctgccaa ctttctcttt cacatcttat gaaagtcatt 300 taagcacaac taactttttt tttttttttt tttttttgag acagagtctt gctctgttgc 360 ccaggacaga gtgcagtagt gactcaatct cggctcactg cagcctccac ctcctaggct 420 caaacggtcc tcctgcatca gcctcccaag tagctggaat tacaggagtg gcccaccatg 480 cccagctaat ttttgtattt ttaatagata cgggggtttc accatatcac ccaggctggt 540 ctcgaactcc tggcctcaag tgatccacct gcctcggcct cccaaagtgc tgggattata 600 ggcgtcagcc actatgccca acccgaccaa ccttttttaa aataaatatt 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actgtggttc 1500 ttctctggcc aagtccgagg gagaacgtaa agatatgggc ctttttcccc ctctcacctt 1560 gtctcaccaa agtccctagt ccccggagca gttagcctct ttctttccag ggaattagcc 1620 agacacaaca acgggaacca gacaccgaac cagacatgcc cgccccgtgc gccctccccg 1680 ctcgctgcct ttcctccctc ttgtctctcc agagccggat cttcaagggg agcctccgtg 1740 cccccggctg ctcagtccct ccggtgtgca ggaccccgga agtcctcccc gcacagctct 1800 cgcttctctt tgcagcctgt ttctgcgccg gaccagtcga ggactctgga cagtagaggc 1860 cccgggacga ccgagctg 1878 <210> 33 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 33 atttacattt atccacaca 19 <210> 34 <211> 800 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 34 tgccgctgga ctctcttcca aggaactagg agaaccaaga tccgtttttc tgccaagggc 60 tgcccccccc acgcccccaa ccccctcacc ccgatcccca cagaaagaaa tcttgaggta 120 gctggagctt cttctgtggg tgtgacagga ctgccattct cctctgtagt ctgcagaagc 180 ctgccattcc accatttaaa cctgtgactc caggccttaa gcctgttgaa ggtcgagtcc 240 cagaagggtc atatgtgcaa ctgcctaggg agagttccca ctcgcagggc caagaggagt 300 cccccggtct gaggtgtggg ggcggggacg tgcactgggc 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tctcgagctt ttggagtacg 1140 tcgtctttag gttgggggga ggggttttat gcgatggagt ttccccacac tgagtgggtg 1200 gagactgaag ttaggccagc ttggcacttg atgtaattct ccttggaatt tgcccttttt 1260 gagtttggat cttggttcat tctcaagcct cagacagtgg ttcaaagttt ttttcttcca 1320 tttcaggtgt cgtga 1335 <210> 36 <211> 222 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 36 Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu 1 5 10 15 Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly 20 25 30 Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile 35 40 45 Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr 50 55 60 Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys 65 70 75 80 Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu 85 90 95 Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu 100 105 110 Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly 115 120 125 Ile Asp 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Gly 260 265 270 Glu Ala Arg Val Lys Glu Val Leu Leu Asp Glu Asp Asp Asp Leu Trp 275 280 285 Ile Ala Leu Arg His Lys His Ile Ala Glu Val Ser Gln Glu Val Thr 290 295 300 Arg Ser Leu Lys Asp Phe Ser Ser Ser Lys Arg Met Asn Thr Gly Glu 305 310 315 320 Lys Thr Thr Met Arg Asp Leu Ser Gln Met Leu Lys Lys Met Pro Gln 325 330 335 Tyr Gln Lys Glu Leu Ser Lys Tyr Ser Thr His Leu His Leu Ala Glu 340 345 350 Asp Cys Met Lys His Tyr Gln Gly Thr Val Asp Lys Leu Cys Arg Val 355 360 365 Glu Gln Asp Leu Ala Met Gly Thr Asp Ala Glu Gly Glu Lys Ile Lys 370 375 380 Asp Pro Met Arg Ala Ile Val Pro Ile Leu Leu Asp Ala Asn Val Ser 385 390 395 400 Thr Tyr Asp Lys Ile Arg Ile Ile Leu Leu Tyr Ile Phe Leu Lys Asn 405 410 415 Gly Ile Thr Glu Glu Asn Leu Asn Lys Leu Ile Gln His Ala Gln Ile 420 425 430 Pro Pro Glu Asp Ser Glu Ile Ile Thr Asn Met Ala His Leu Gly Val 435 440 445 Pro Ile Val Thr Asp Ser Thr Leu Arg Arg Arg Ser Lys Pro Glu Arg 450 455 460 Lys Glu Arg Ile Ser Glu Gln Thr Tyr Gln Leu Ser Arg Trp Thr Pro 465 470 475 480 Ile Ile Lys Asp Ile Met Glu Asp Thr Ile Glu Asp Lys Leu Asp Thr 485 490 495 Lys His Tyr Pro Tyr Ile Ser Thr Arg Ser Ser Ala Ser Phe Ser Thr 500 505 510 Thr Ala Val Ser Ala Arg Tyr Gly His Trp His Lys Asn Lys Ala Pro 515 520 525 Gly Glu Tyr Arg Ser Gly Pro Arg Leu Ile Ile Phe Ile Leu Gly Gly 530 535 540 Val Ser Leu Asn Glu Met Arg Cys Ala Tyr Glu Val Thr Gln Ala Asn 545 550 555 560 Gly Lys Trp Glu Val Leu Ile Gly Ser Thr His Ile Leu Thr Pro Thr 565 570 575 Lys Phe Leu Met Asp Leu Arg His Pro Asp Phe Arg Glu Ser Ser Arg 580 585 590 Val Ser Phe Glu Asp Gln Ala Pro Thr Met Glu 595 600 <210> 41 <211> 511 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Kv3.1 sequence <400> 41 Met Gly Gln Gly Asp Glu Ser Glu Arg Ile Val Ile Asn Val Gly Gly 1 5 10 15 Thr Arg His Gln Thr Tyr Arg Ser Thr Leu Arg Thr Leu Pro Gly Thr 20 25 30 Arg Leu Ala Trp Leu Ala Glu Pro Asp Ala His Ser His Phe Asp Tyr 35 40 45 Asp Pro Arg Ala Asp Glu Phe Phe Phe Asp Arg His Pro Gly Val Phe 50 55 60 Ala His Ile Leu Asn Tyr Tyr Arg Thr Gly Lys Leu His Cys Pro Ala 65 70 75 80 Asp Val Cys Gly Pro Leu Tyr Glu Glu Glu Leu Ala Phe Trp Gly Ile 85 90 95 Asp Glu Thr Asp Val Glu Pro Cys Cys Trp Met Thr Tyr Arg Gln His 100 105 110 Arg Asp Ala Glu Glu Ala Leu Asp Ser Phe Gly Gly Ala Pro Leu Asp 115 120 125 Asn Ser Ala Asp Asp Ala Asp Ala Asp Gly Pro Gly Asp Ser Gly Asp 130 135 140 Gly Glu Asp Glu Leu Glu Met Thr Lys Arg Leu Ala Leu Ser Asp Ser 145 150 155 160 Pro Asp Gly Arg Pro Gly Gly Phe Trp Arg Arg Trp Gln Pro Arg Ile 165 170 175 Trp Ala Leu Phe Glu Asp Pro Tyr Ser Ser Arg Tyr Ala Arg Tyr Val 180 185 190 Ala Phe Ala Ser Leu Phe Phe Ile Leu Val Ser Ile Thr Thr Phe Cys 195 200 205 Leu Glu Thr His Glu Arg Phe Asn Pro Ile Val Asn Lys Thr Glu Ile 210 215 220 Glu Asn Val Arg Asn Gly Thr Gln Val Arg Tyr Tyr Arg Glu Ala Glu 225 230 235 240 Thr Glu Ala Phe Leu Thr Tyr Ile Glu Gly Val Cys Val Val Trp Phe 245 250 255 Thr Phe Glu Phe Leu Met Arg Val Ile Phe Cys Pro Asn Lys Val Glu 260 265 270 Phe Ile Lys Asn Ser Leu Asn Ile Ile Asp Phe Val Ala Ile Leu Pro 275 280 285 Phe Tyr Leu Glu Val Gly Leu Ser Gly Leu Ser Ser Lys Ala Ala Lys 290 295 300 Asp Val Leu Gly Phe Leu Arg Val Val Arg Phe Val Arg Ile Leu Arg 305 310 315 320 Ile Phe Lys Leu Thr Arg His Phe Val Gly Leu Arg Val Leu Gly His 325 330 335 Thr Leu Arg Ala Ser Thr Asn Glu Phe Leu Leu Leu Ile Ile Phe Leu 340 345 350 Ala Leu Gly Val Leu Ile Phe Ala Thr Met Ile Tyr Tyr Ala Glu Arg 355 360 365 Ile Gly Ala Gln Pro Asn Asp Pro Ser Ala Ser Glu His Thr His Phe 370 375 380 Lys Asn Ile Pro Ile Gly Phe Trp Trp Ala Val Val Thr Met Thr Thr 385 390 395 400 Leu Gly Tyr Gly Asp Met Tyr Pro Gln Thr Trp Ser Gly Met Leu Val 405 410 415 Gly Ala Leu Cys Ala Leu Ala Gly Val Leu Thr Ile Ala Met Pro Val 420 425 430 Pro Val Ile Val Asn Asn Phe Gly Met Tyr Tyr Ser Leu Ala Met Ala 435 440 445 Lys Gln Lys Leu Pro Lys Lys Lys Lys Lys His Ile Pro Arg Pro Pro 450 455 460 Gln Leu Gly Ser Pro Asn Tyr Cys Lys Ser Val Val Asn Ser Pro His 465 470 475 480 His Ser Thr Gln Ser Asp Thr Cys Pro Leu Ala Gln Glu Glu Ile Leu 485 490 495 Glu Ile Asn Arg Ala Gly Arg Lys Pro Leu Arg Gly Met Ser Ile 500 505 510 <210> 42 <211> 639 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Kv3.2 sequence <400> 42 Met Gly Lys Ile Glu Ser Asn Glu Arg Val Ile Leu Asn Val Gly Gly 1 5 10 15 Thr Arg His Glu Thr Tyr Arg Ser Thr Leu Lys Thr Leu Pro Gly Thr 20 25 30 Arg Leu Ala Leu Leu Ala Ser Ser Glu Pro Gln Gly Asp Cys Leu Thr 35 40 45 Ala Ala Gly Asp Lys Leu Gln Pro Leu Pro Pro Pro Leu Ser Pro Pro 50 55 60 Pro Arg Pro Pro Pro Leu Ser Pro Val Pro Ser Gly Cys Phe Glu Gly 65 70 75 80 Gly Ala Gly Asn Cys Ser Ser His Gly Gly Asn Gly Gly Asn Gly Gly 85 90 95 Ser Asp His Pro Gly Gly Gly Arg Glu Phe Phe Phe Asp Arg His Pro 100 105 110 Gly Val Phe Ala Tyr Val Leu Asn Tyr Tyr Arg Thr Gly Lys Leu His 115 120 125 Cys Pro Ala Asp Val Cys Gly Pro Leu Phe Glu Glu Glu Leu Ala Phe 130 135 140 Trp Gly Ile Asp Glu Thr Asp Val Glu Pro Cys Cys Trp Met Thr Tyr 145 150 155 160 Arg Gln His Arg Asp Ala Glu Glu Ala Leu Asp Ile Phe Glu Thr Pro 165 170 175 Asp Leu Ile Gly Gly Asp Pro Gly Asp Asp Glu Asp Leu Ala Ala Lys 180 185 190 Arg Leu Gly Ile Glu Asp Ala Ala Gly Leu Gly Gly Pro Asp Gly Lys 195 200 205 Ser Gly Arg Trp Arg Lys Leu Gln Pro Arg Met Trp Ala Leu Phe Glu 210 215 220 Asp Pro Tyr Ser Ser Arg Ala Ala Arg Phe Ile Ala Phe Ala Ser Leu 225 230 235 240 Phe Phe Ile Leu Val Ser Ile Thr Thr Phe Cys Leu Glu Thr His Glu 245 250 255 Ala Phe Asn Ile Val Lys Asn Lys Thr Glu Pro Val Ile Asn Gly Thr 260 265 270 Ser Pro Val Leu Gln Tyr Glu Ile Glu Thr Asp Pro Ala Leu Thr Tyr 275 280 285 Val Glu Gly Val Cys Val Val Trp Phe Thr Phe Glu Phe Leu Val Arg 290 295 300 Ile Val Phe Ser Pro Asn Lys Leu Glu Phe Ile Lys Asn Leu Leu Asn 305 310 315 320 Ile Ile Asp Phe Val Ala Ile Leu Pro Phe Tyr Leu Glu Val Gly Leu 325 330 335 Ser Gly Leu Ser Ser Lys Ala Ala Lys Asp Val Leu Gly Phe Leu Arg 340 345 350 Val Val Arg Phe Val Arg Ile Leu Arg Ile Phe Lys Leu Thr Arg His 355 360 365 Phe Val Gly Leu Arg Val Leu Gly His Thr Leu Arg Ala Ser Thr Asn 370 375 380 Glu Phe Leu Leu Leu Ile Ile Phe Leu Ala Leu Gly Val Leu Ile Phe 385 390 395 400 Ala Thr Met Ile Tyr Tyr Ala Glu Arg Val Gly Ala Gln Pro Asn Asp 405 410 415 Pro Ser Ala Ser Glu His Thr Gln Phe Lys Asn Ile Pro Ile Gly Phe 420 425 430 Trp Trp Ala Val Val Thr Met Thr Thr Leu Gly Tyr Gly Asp Met Tyr 435 440 445 Pro Gln Thr Trp Ser Gly Met Leu Val Gly Ala Leu Cys Ala Leu Ala 450 455 460 Gly Val Leu Thr Ile Ala Met Pro Val Pro Val Ile Val Asn Asn Phe 465 470 475 480 Gly Met Tyr Tyr Ser Leu Ala Met Ala Lys Gln Lys Leu Pro Arg Lys 485 490 495 Arg Lys Lys His Ile Pro Pro Ala Pro Leu Ala Ser Ser Pro Thr Phe 500 505 510 Cys Lys Thr Glu Leu Asn Met Ala Cys Asn Ser Thr Gln Ser Asp Thr 515 520 525 Cys Leu Gly Lys Glu Asn Arg Leu Leu Glu His Asn Arg Ser Val Leu 530 535 540 Ser Gly Asp Asp Ser Thr Gly Ser Glu Pro Pro Leu Ser Pro Pro Glu 545 550 555 560 Arg Leu Pro Ile Arg Arg Ser Ser Thr Arg Asp Lys Asn Arg Arg Gly 565 570 575 Glu Thr Cys Phe Leu Leu Thr Thr Gly Asp Tyr Thr Cys Ala Ser Asp 580 585 590 Gly Gly Ile Arg Lys Ala Ser Thr Leu Glu Pro Met Glu Ser Thr Ala 595 600 605 Gln Thr Lys Gly Asp Thr Arg Pro Glu Ala His Trp Asn Cys Ala His 610 615 620 Leu Leu Asn Phe Gly Cys Pro Thr Gly Ser Ser Phe Pro Thr Leu 625 630 635 <210> 43 <211> 757 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Kv3.3 sequence <400> 43 Met Leu Ser Ser Val Cys Val Ser Ser Phe Arg Gly Arg Gln Gly Ala 1 5 10 15 Ser Lys Gln Gln Pro Ala Pro Pro Pro Gln Pro Pro Glu Ser Pro Pro 20 25 30 Pro Pro Pro Leu Pro Pro Gln Gln Gln Gln Pro Ala Gln Pro Gly Pro 35 40 45 Ala Ala Ser Pro Ala Gly Pro Pro Ala Pro Arg Gly Pro Gly Asp Arg 50 55 60 Arg Ala Glu Pro Cys Pro Gly Leu Pro Ala Ala Ala Met Gly Arg His 65 70 75 80 Gly Gly Gly Gly Gly Asp Ser Gly Lys Ile Val Ile Asn Val Gly Gly 85 90 95 Val Arg His Glu Thr Tyr Arg Ser Thr Leu Arg Thr Leu Pro Gly Thr 100 105 110 Arg Leu Ala Gly Leu Thr Glu Pro Glu Ala Ala Ala Arg Phe Asp Tyr 115 120 125 Asp Pro Gly Ala Asp Glu Phe Phe Phe Asp Arg His Pro Gly Val Phe 130 135 140 Ala Tyr Val Leu Asn Tyr Tyr Arg Thr Gly Lys Leu His Cys Pro Ala 145 150 155 160 Asp Val Cys Gly Pro Leu Phe Glu Glu Glu Leu Gly Phe Trp Gly Ile 165 170 175 Asp Glu Thr Asp Val Glu Ala Cys Cys Trp Met Thr Tyr Arg Gln His 180 185 190 Arg Asp Ala Glu Glu Ala Leu Asp Ser Phe Glu Ala Pro Asp Pro Ala 195 200 205 Gly Ala Ala Asn Ala Ala Asn Ala Ala Gly Ala His Asp Gly Gly Leu 210 215 220 Asp Asp Glu Ala Gly Ala Gly Gly Gly Gly Leu Asp Gly Ala Gly Gly 225 230 235 240 Glu Leu Lys Arg Leu Cys Phe Gln Asp Ala Gly Gly Gly Ala Gly Gly 245 250 255 Pro Pro Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Thr Trp Trp Arg Arg Trp 260 265 270 Gln Pro Arg Val Trp Ala Leu Phe Glu Asp Pro Tyr Ser Ser Arg Ala 275 280 285 Ala Arg Tyr Val Ala Phe Ala Ser Leu Phe Phe Ile Leu Ile Ser Ile 290 295 300 Thr Thr Phe Cys Leu Glu Thr His Glu Gly Phe Ile His Ile Ser Asn 305 310 315 320 Lys Thr Val Thr Gln Ala Ser Pro Ile Pro Gly Ala Pro Pro Glu Asn 325 330 335 Ile Thr Asn Val Glu Val Glu Thr Glu Pro Phe Leu Thr Tyr Val Glu 340 345 350 Gly Val Cys Val Val Trp Phe Thr Phe Glu Phe Leu Met Arg Ile Thr 355 360 365 Phe Cys Pro Asp Lys Val Glu Phe Leu Lys Ser Ser Leu Asn Ile Ile 370 375 380 Asp Cys Val Ala Ile Leu Pro Phe Tyr Leu Glu Val Gly Leu Ser Gly 385 390 395 400 Leu Ser Ser Lys Ala Ala Lys Asp Val Leu Gly Phe Leu Arg Val Val 405 410 415 Arg Phe Val Arg Ile Leu Arg Ile Phe Lys Leu Thr Arg His Phe Val 420 425 430 Gly Leu Arg Val Leu Gly His Thr Leu Arg Ala Ser Thr Asn Glu Phe 435 440 445 Leu Leu Leu Ile Ile Phe Leu Ala Leu Gly Val Leu Ile Phe Ala Thr 450 455 460 Met Ile Tyr Tyr Ala Glu Arg Ile Gly Ala Asp Pro Asp Asp Ile Leu 465 470 475 480 Gly Ser Asn His Thr Tyr Phe Lys Asn Ile Pro Ile Gly Phe Trp Trp 485 490 495 Ala Val Val Thr Met Thr Thr Leu Gly Tyr Gly Asp Met Tyr Pro Lys 500 505 510 Thr Trp Ser Gly Met Leu Val Gly Ala Leu Cys Ala Leu Ala Gly Val 515 520 525 Leu Thr Ile Ala Met Pro Val Pro Val Ile Val Asn Asn Phe Gly Met 530 535 540 Tyr Tyr Ser Leu Ala Met Ala Lys Gln Lys Leu Pro Lys Lys Lys Asn 545 550 555 560 Lys His Ile Pro Arg Pro Pro Gln Pro Gly Ser Pro Asn Tyr Cys Lys 565 570 575 Pro Asp Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro His Pro His His Gly Ser Gly 580 585 590 Gly Ile Ser Pro Pro Pro Pro Ile Thr Pro Pro Ser Met Gly Val Thr 595 600 605 Val Ala Gly Ala Tyr Pro Ala Gly Pro His Thr His Pro Gly Leu Leu 610 615 620 Arg Gly Gly Ala Gly Gly Leu Gly Ile Met Gly Leu Pro Pro Leu Pro 625 630 635 640 Ala Pro Gly Glu Pro Cys Pro Leu Ala Gln Glu Glu Val Ile Glu Ile 645 650 655 Asn Arg Ala Asp Pro Arg Pro Asn Gly Asp Pro Ala Ala Ala Ala Leu 660 665 670 Ala His Glu Asp Cys Pro Ala Ile Asp Gln Pro Ala Met Ser Pro Glu 675 680 685 Asp Lys Ser Pro Ile Thr Pro Gly Ser Arg Gly Arg Tyr Ser Arg Asp 690 695 700 Arg Ala Cys Phe Leu Leu Thr Asp Tyr Ala Pro Ser Pro Asp Gly Ser 705 710 715 720 Ile Arg Lys Ala Thr Gly Ala Pro Pro Leu Pro Pro Gln Asp Trp Arg 725 730 735 Lys Pro Gly Pro Pro Ser Phe Leu Pro Asp Leu Asn Ala Asn Ala Ala 740 745 750 Ala Trp Ile Ser Pro 755

Claims (80)

  1. CNS 내의 파르브알부민 (PV) 뉴런에서 CNS 내의 하나 이상의 비-PV 세포에 비해 선택적 발현을 발생시키는 트랜스진에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 조절 요소를 포함하는 핵산 카세트.
  2. 제1항에 있어서, 각각의 조절 요소가 (i) 서열식별번호(SEQ ID NO): 1-32의 서열, (ii) 이의 기능성 단편 또는 조합물, 또는 (iii) (i) 또는 (ii)에 대한 서열 동일성이 적어도 80%인 서열을 포함하는 것인 핵산 카세트.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 조절 요소 중 적어도 하나가 인간에서 유래되는 것인 핵산 카세트.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 조절 요소 중 적어도 하나가 비-인간 포유동물로부터 유래되는 것인 핵산 카세트.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 조절 요소가 비-천연 발생인 것인 핵산 카세트.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 조절 요소가, 공동-국소화 검정법에 의해 측정 시, 비-선택적 조절 요소에 작동가능하게 연결된 경우의 동일한 트랜스진의 발현보다 더 큰 PV 뉴런에서의 트랜스진의 선택적 발현을 발생시키는 것인 핵산 카세트.
  7. 제6항에 있어서, 비-선택적 조절 요소가 구성적 프로모터인 핵산 카세트.
  8. 제6항에 있어서, 비-선택적 조절 요소가 CAG, EF1α, SV40, CMV, UBC, PGK, 및 CBA 중 어느 하나인 핵산 카세트.
  9. 제6항에 있어서, 조절 요소가, 공동-국소화 검정법에 의해 측정 시, 비-선택적 조절 요소에 작동가능하게 연결된 경우의 PV 뉴런에서의 트랜스진의 선택적 발현에 비교하여 적어도 2배, 적어도 5배, 또는 적어도 10배인 수준으로 PV 뉴런에서의 트랜스진의 선택적 발현을 발생시키는 것인 핵산 카세트.
  10. 제6항에 있어서, 조절 요소가 트랜스진이 비-선택적 조절 요소에 작동가능하게 연결된 경우의 PV 뉴런에서의 발현보다 적어도 2%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 더 높은 PV 뉴런에서의 선택적 발현을 발생시키는 것인 핵산 카세트.
  11. 제6항에 있어서, 조절 요소가 CNS에서의 PV 뉴런의 천연 분포에 대해 예상되는 것보다 약 1.5배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 7.5배, 8배, 9배, 또는 10배 더 높은 PV 뉴런에서의 선택적 발현을 발생시키는 것인 핵산 카세트.
  12. 제6항에 있어서, 공동-국소화 검정법이 면역조직화학 검정법인 핵산 카세트.
  13. 제12항에 있어서, 면역조직화학 검정법이 항-PV 항체를 포함하는 것인 핵산 카세트.
  14. 제1항 또는 제2항에 있어서, 트랜스진이 이온 채널 서브유닛, 신경전달물질 조절인자, DNA 결합 도메인, 유전자 편집 단백질, 또는 이의 변이체 또는 기능성 단편을 코딩하는 것인 핵산 카세트.
  15. 제14항에 있어서, 이온 채널 서브유닛이 나트륨 이온 채널의 알파 서브유닛 또는 베타 서브유닛 또는 칼륨 이온 채널의 서브유닛인 핵산 카세트.
  16. 제15항에 있어서, 트랜스진이 (i) 서열식별번호: 37-43; (ii) 이의 기능성 단편; 또는 (iii) (i) 또는 (ii)에 대한 서열 동일성이 적어도 80%인 서열 중 어느 하나를 포함하는 것인 핵산 카세트.
  17. 제15항에 있어서, 트랜스진이 (i) SCN1A, SNC2A, SNC8A, SCN1B, SCN2B, KV3.1, 또는 KV3.3; (ii) 이의 기능성 단편; 또는 (iii) (i) 또는 (ii)에 대한 서열 동일성이 적어도 80%인 서열을 포함하는 것인 핵산 카세트.
  18. 제14항에 있어서, 트랜스진이 (i) STXBP1, (ii) 이의 기능성 단편, 또는 (iii) (i) 또는 (ii)에 대한 서열 동일성이 적어도 80%인 서열을 포함하는 신경전달물질 조절인자인 핵산 카세트.
  19. 제14항에 있어서, 트랜스진이 내인성 유전자의 발현을 조정하는 DNA 결합 단백질을 포함하는 것인 핵산 카세트.
  20. 제19항에 있어서, 내인성 유전자가 SCN1A, SNC2A, SNC8A, SCN1B, SCN2B, KV3.1, KV3.2, KV3.3, 또는 STXBP1인 핵산 카세트.
  21. 제14항에 있어서, 트랜스진이 유전자 편집 단백질을 포함하는 것인 핵산 카세트.
  22. 제21항에 있어서, 유전자 편집 단백질이 Cas 단백질인 핵산 카세트.
  23. 제1항 또는 제2항에 있어서, 조합된 조절 요소가 크기가 2.5 kb 미만, 1.5 kb 미만, 1 kb 미만, 또는 500 bp 미만인 핵산 카세트.
  24. 제1항 또는 제2항에 있어서, 비-PV 세포가 CNS 내의 비-PV 세포 유형 중 하나 이상을 포함하는 것인 핵산 카세트.
  25. 제24항에 있어서, 비-PV 세포가 흥분 뉴런, 도파민작용성 뉴런, 별아교세포, 미세아교세포, 및 운동 뉴런 중 하나 이상을 포함하는 것인 핵산 카세트.
  26. 제1항 또는 제2항에 있어서, 핵산 카세트가 선형 구축물인 핵산 카세트.
  27. 제1항 또는 제2항에 있어서, 핵산 카세트가 벡터인 핵산 카세트.
  28. 제27항에 있어서, 벡터가 플라스미드인 핵산 카세트.
  29. 제28항에 있어서, 벡터가 바이러스 벡터인 핵산 카세트.
  30. 제29항에 있어서, 바이러스 벡터가 아데노-연관 바이러스 (AAV) 벡터인 핵산 카세트.
  31. 제30항에 있어서, AAV 벡터가 AAV1, AAV8, AAV9, scAAV1, scAAV8, 또는 scAAV9인 핵산 카세트.
  32. 제29항에 있어서, 바이러스 벡터가 렌티바이러스 벡터인 핵산 카세트.
  33. 제1항 또는 제2항에 있어서, 조절 요소가 GAD2, GAD1, SYN1, NKX2.1, DLX1, DLX5/6, SST, PV, 또는 VIP의 전사 개시 부위로부터 10 kb 이내의 600 bp 미만의 인접한 서열을 함유하는 것인 핵산 카세트.
  34. 치료적 유효량의 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항의 핵산 카세트를 전달하는 것을 포함하는, 신경학적 장애 또는 병태의 치료를 필요로 하는 대상체에서 신경학적 장애 또는 병태를 치료하는 방법.
  35. 세포를 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항의 핵산 카세트와 접촉시는 것을 포함하는, CNS 내의 PV 뉴런에서 트랜스진의 선택적 발현을 증가시키는 방법.
  36. 하나 이상의 PV 뉴런 선택적 조절 요소를 트랜스진에 작동가능하게 연결시키는 것을 포함하는, 임의의 트랜스진의 발현을 CNS 내의 PV 뉴런에 표적화하는 방법.
  37. 제36항에 있어서, 각각의 조절 요소가 (i) 서열식별번호: 1-32의 서열, (ii) 이의 기능성 단편 또는 조합물, 또는 (iii) (i) 또는 (ii)에 대한 서열 동일성이 적어도 80%인 서열을 포함하는 것인 방법.
  38. 제36항 또는 제37항에 있어서, 조절 요소가, 공동-국소화 검정법에 의해 측정 시, 비-선택적 조절 요소에 작동가능하게 연결된 경우의 동일한 트랜스진의 발현보다 더 큰 PV 뉴런에서의 트랜스진의 선택적 발현을 발생시키는 것인 방법.
  39. 제38항에 있어서, 비-선택적 조절 요소가 구성적 프로모터인 방법.
  40. 제38항에 있어서, 비-선택적 조절 요소가 CAG, EF1α, SV40, CMV, UBC, PGK, 및 CBA 중 어느 하나인 방법.
  41. 제38항에 있어서, 조절 요소가, 공동-국소화 검정법에 의해 측정 시, 트랜스진에 작동가능하게 연결된 경우의 비-선택적 조절 요소에 비교하여 적어도 2배, 적어도 5배, 또는 적어도 7배, 또는 적어도 10배인 수준으로 PV 뉴런에서의 트랜스진의 선택적 발현을 발생시키는 것인 방법.
  42. 제38항에 있어서, 조절 요소가 트랜스진이 비-선택적 조절 요소에 작동가능하게 연결된 경우의 PV 뉴런에서의 발현보다 적어도 2%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 더 높은 PV 뉴런에서의 선택적 발현을 발생시키는 것인 방법.
  43. 제38항에 있어서, 조절 요소가 CNS에서의 PV 뉴런의 천연 분포에 대해 예상되는 것보다 약 1.5배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 7.5배, 8배, 9배, 또는 10배 더 높은 PV 뉴런에서의 선택적 발현을 발생시키는 것인 방법.
  44. 제36항 또는 제37항에 있어서, 트랜스진이 SCN1A, SNC2A, SNC8A, SCN1B, SCN2B, KV3.1, KV3.3, STXBP1, DNA 결합 단백질, 유전자 편집 단백질, 또는 이의 기능성 단편 중 어느 하나인 방법.
  45. 제36항 또는 제37항에 있어서, 조절 요소 및 트랜스진이 AAV 내에 있는 것인 방법.
  46. 제45항에 있어서, AAV가 AAV9인 방법.
  47. CNS 내의 하나 이상의 비-PV 세포에 비해 PV 뉴런에서의 트랜스진의 선택적 발현을 발생시키는 트랜스진에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 조절 요소를 포함하는 핵산 카세트와 세포를 접촉시키는 것을 포함하는, 신경학적 병태 또는 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에서 신경학적 병태 또는 장애를 치료하는 방법.
  48. 제47항에 있어서, 각각의 조절 요소가 (i) 서열식별번호: 1-32의 서열, (ii) 이의 기능성 단편 또는 조합물, 또는 (iii) (i) 또는 (ii)에 대한 서열 동일성이 적어도 80%인 서열을 포함하는 것인 방법.
  49. 제47항 또는 제48항에 있어서, 트랜스진이 전압-게이팅 이온 채널 서브유닛, 또는 이의 변이체 또는 기능성 단편인 방법.
  50. 제49항에 있어서, 서브유닛이 나트륨 이온 채널의 베타 서브유닛인 방법.
  51. 제49항에 있어서, 서브유닛이 나트륨 이온 채널의 알파 서브유닛인 방법.
  52. 제49항에 있어서, 서브유닛이 칼륨 이온 채널의 것인 방법.
  53. 제47항 또는 제48항에 있어서, 트랜스진이 (i) SCN1A, SCN1B, SCN2B, KV3.1, 및 KV3.3; (ii) 이의 기능성 단편; 또는 (iii) (i) 또는 (ii)에 대한 서열 동일성이 적어도 80%인 서열 중 어느 하나인 방법.
  54. 제47항 또는 제48항에 있어서, 트랜스진이 DNA 결합 단백질인 방법.
  55. 제54항에 있어서, DNA 결합 단백질이 내인성 유전자를 조정하는 것인 방법.
  56. 제55항에 있어서, 내인성 유전자가 SCN1A, SNC2A, SNC8A, SCN1B, SCN2B, KV3.1, KV3.3, 또는 STXBP1인 방법.
  57. 제47항 또는 제48항에 있어서, 트랜스진이 유전자 편집 단백질인 방법.
  58. 제57항에 있어서, 유전자 편집 단백질이 Cas 단백질인 방법.
  59. 제47항 또는 제48항에 있어서, 신경학적 병태 또는 장애가 SCN1A, SNC2A, SNC8A, SCN1B, SCN2B, KV3.1, KV3.3, 및 STXBP1 중 임의의 것에서의 반수체기능부전(haploinsufficiency) 또는 돌연변이와 연관되는 것인 방법.
  60. 제47항 또는 제48항에 있어서, 신경학적 병태 또는 장애가 간질, 신경변성, 타우병증, 또는 뉴런 과소흥분성인 방법.
  61. 제47항 또는 제48항에 있어서, 신경학적 병태 또는 장애가 드라벳 증후군인 방법.
  62. 제47항 또는 제48항에 있어서, 신경학적 병태 또는 장애가 알츠하이머병인 방법.
  63. 제47항 또는 제48항에 있어서, 조절 요소가, 공동-국소화 검정법에 의해 측정 시, 비-선택적 조절 요소에 작동가능하게 연결된 경우의 동일한 트랜스진의 발현보다 더 큰 PV 뉴런에서의 트랜스진의 선택적 발현을 발생시키는 것인 방법.
  64. 제63항에 있어서, 비-선택적 조절 요소가 구성적 프로모터인 방법.
  65. 제64항에 있어서, 비-선택적 조절 요소가 CAG, EF1α, SV40, CMV, UBC, PGK, 및 CBA 중 어느 하나인 방법.
  66. 제64항 또는 제65항에 있어서, 조절 요소가, 공동-국소화 검정법에 의해 측정 시, 트랜스진에 작동가능하게 연결된 경우의 비-선택적 조절 요소에 비교하여 적어도 2배, 적어도 5배, 또는 적어도 7배, 또는 적어도 10배인 수준으로 PV 뉴런에서의 선택적 발현을 발생시키는 것인 방법.
  67. 제64항 또는 제65항에 있어서, 조절 요소가 트랜스진이 비-선택적 조절 요소에 작동가능하게 연결된 경우의 PV 뉴런에서의 발현보다 적어도 2%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 더 높은 PV 뉴런에서의 선택적 발현을 발생시키는 것인 방법.
  68. 제64항 또는 제65항에 있어서, 조절 요소가 CNS에서의 PV 뉴런의 천연 분포에 대해 예상되는 것보다 약 1.5배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 7.5배, 8배, 9배, 또는 10배 더 높은 PV 뉴런에서의 선택적 발현을 발생시키는 것인 방법.
  69. 제47항 또는 제48항에 있어서, 핵산 카세트가 AAV 내에 있는 것인 방법.
  70. 제69항에 있어서, AAV가 AAV9인 방법.
  71. 세포를 트랜스진을 포함하는 AAV와 접촉시키는 것을 포함하는, 드라벳 증후군을 치료하는 방법이고, 여기서 트랜스진이 (i) SCN1A, SNC2A, SNC8A, SCN1B, SCN2B, 또는 DNA 결합 단백질, (ii) 이의 기능성 단편, 및 (iii) (i) 또는 (ii)에 대한 서열 동일성이 적어도 80%인 서열 중 어느 하나인 방법.
  72. 제71항에 있어서, DNA 결합 단백질이 내인성 유전자를 조정하는 것인 방법.
  73. 제72항에 있어서, 내인성 유전자가 SCN1A, SNC2A, SNC8A, SCN1B, 또는 SCN2B인 방법.
  74. 제71항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, AAV가 트랜스진에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 PV 뉴런 선택적 조절 요소를 추가로 포함하는 것인 방법.
  75. 제74항에 있어서, 각각의 조절 요소가 독립적으로 (i) 서열식별번호: 1-32의 서열, (ii) 이의 기능성 단편 또는 조합물, 또는 (iii) (i) 또는 (ii)에 대한 서열 동일성이 적어도 80%인 서열을 포함하는 것인 방법.
  76. 세포를 트랜스진을 포함하는 AAV와 접촉시키는 것을 포함하는, 알츠하이머병을 치료하는 방법이고, 여기서 트랜스진이 (i) SCN1A, SNC2A, SNC8A, SCN1B, SCN2B, KV3.1, KV3.3, STXBP1, 또는 DNA 결합 단백질; (ii) 이의 기능성 단편; 및 (iii) (i) 또는 (ii)에 대한 서열 동일성이 적어도 80%인 서열 중 어느 하나인 방법.
  77. 제76항에 있어서, DNA 결합 단백질이 내인성 유전자를 조정하는 것인 방법.
  78. 제77항에 있어서, 내인성 유전자가 SCN1A, SNC2A, SNC8A, SCN1B, SCN2B, KV3.1, KV3.3, 또는 STXBP1인 방법.
  79. 제76항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, AAV가 트랜스진에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 PV 뉴런 선택적 조절 요소를 추가로 포함하는 것인 방법.
  80. 제79항에 있어서, 각각의 조절 요소가 독립적으로 (i) 서열식별번호: 1-32의 서열, (ii) 이의 기능성 단편 또는 조합물, 또는 (iii) (i) 또는 (ii)에 대한 서열 동일성이 적어도 80%인 서열을 포함하는 것인 방법.
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