TW202126681A - 用於抑制α-突觸核蛋白(SYNUCLEIN)表現之鋅指蛋白轉錄因子 - Google Patents

用於抑制α-突觸核蛋白(SYNUCLEIN)表現之鋅指蛋白轉錄因子 Download PDF

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Abstract

本發明提供抑制神經系統中α-突觸核蛋白(alpha-synuclein)表現之鋅指融合蛋白，及使用該等蛋白質來治療帕金森氏症(Parkinson’s disease)、路易體癡呆(Lewy body dementia)、多重系統萎縮、阿茲海默氏症(Alzheimer’s disease)及其他神經退化性疾病之方法。

Description

用於抑制α-突觸核蛋白(SYNUCLEIN)表現之鋅指蛋白轉錄因子
本發明提供抑制神經系統中α-突觸核蛋白表現之鋅指融合蛋白，及使用該等蛋白質來治療帕金森氏症(Parkinson’s disease)、路易體癡呆(Lewy body dementia)、多重系統萎縮、阿茲海默氏症(Alzheimer’s disease)及其他神經退化性疾病之方法。
帕金森氏症(PD)係特徵在於運動缺陷之神經退化性病症。約50%的PD患者最終發展為癡呆。PD係僅次於阿茲海默氏症的第二普遍性神經退化性疾病。在美國，有約一百萬PD患者且每年有50,000至60,000新病例。PD之偶發性形式之典型發病年齡為60至70歲。自最初診斷至PD併發症死亡之時間跨度一般為15至20年。
PD患者展現一系列運動症狀，諸如運動遲緩、僵硬、駝背姿勢、隱藏面部表情、軀幹前傾、手臂擺動減少；肘部、手腕、臀部及膝蓋彎曲、姿勢不穩、休息時四肢震顫及拖著腳走、小碎步步態(short-stepped gait)。患者通常亦具有非運動症狀，包括失眠、睡眠障礙、腸運動降低、神經病變性疼痛及癡呆。參見，例如，Jeanjean與Aubert，Lancet (2011) 378(9805):1773-4；Kalia及Lang，Lancet (2015) 386(9996):896-912。
PD患者腦之特徵在於在稱為黑質之區域中損失產生多巴胺之(多巴胺能)神經元。PD患者腦之特徵亦在於存在路易體，其係神經元內部形成的蛋白質聚集體或凝塊；及路易神經元突(Lewy neurites)，其係含有類似於路易體之蛋白質聚集體之神經元突(神經元之突起)。路易體由Friedrich Lewy於1912年首次在PD患者腦中發現且後來發現含有經聚集且不可溶形式之α-突觸核蛋白之原纖維(Goedert與Spillantini，Mol Psychiatry . (1998) 3(6):462-5；Spillantini等人，Neurosci Lett . (1998) 251(3):205-8；Spillantini等人，Nature (1997) 388(6645):839-40)。於1997年，α-突觸核蛋白基因(SNCA )中之突變在PD家族中經識別(參見，例如，Polymeropoulos等人，Science (1997) 276(5321):2045-7)。後來，顯示SNCA 基因之複製及三倍複製以及α-突觸核蛋白之另外點突變與遺傳或家族形式之PD相關。此外，在大型無偏見人群研究(全基因組關聯研究，GWAS)中，已顯示基因組之控制α-突觸核蛋白表現程度之一部分之變化與PD風險增加相關聯。
α-突觸核蛋白係參與神經元之突觸前端子的囊泡釋放之膜結合蛋白。其亦可在DNA修復中發揮作用。成熟α-突觸核蛋白係具有含有疏水胺基酸之中央核心區域(殘基61至95) (稱為NAC(阿茲海默氏症澱粉樣蛋白之非A-β組分)區域)之小14-kD蛋白。NAC有助於蛋白質聚集。折疊錯誤之α-突觸核蛋白多肽會聚集成寡聚物及基原纖維，其然後共同形成在路易體中發現的大、不溶性聚集體。累積之證據指示，α-突觸核蛋白之折疊錯誤及聚集在PD中發生的細胞損傷中發揮核心作用且最終導致黑質中神經元之死亡。此外，已顯示較小α-突觸核蛋白聚集體在細胞之間移動且擴散於整個腦中，與在普里昂疾病(prion diseases)中所見類似。抑制α-突觸核蛋白聚集可減少對神經元之損傷且減慢或甚至阻止PD之進展。
降低α-突觸核蛋白含量之當前方法包括使用在RNA層級靶向α-突觸核蛋白之反義寡核苷酸(ASO)及靶向α-突觸核蛋白外部細胞之特定3D形狀或構型之單株抗體(mAb)。然而，仍迫切需要藉由靶向α-突觸核蛋白來治療PD之臨床有效方法。
本發明提供靶向人類SNCA 基因中或附近的位點之鋅指蛋白(ZFP)域。本發明之ZFP域可融合至轉錄因子以在DNA層級特異性抑制人類SNCA 基因之表現。此等融合蛋白含有(i)特異性結合至SNCA 基因中之靶區域之ZFP域及(ii)減少基因之轉錄之轉錄抑制子域。
在一個態樣中，本發明提供包含鋅指蛋白(ZFP)域及轉錄抑制子域之融合蛋白，其中該ZFP域結合至人類α-突觸核蛋白基因(SNCA 基因)之靶區域。在一些實施例中，靶區域(亦即靶位點)在SNCA 基因中之轉錄起始位點(TSS，例如TSS 1、2a或2b)的約1 kb之內。在其他實施例中，靶區域在SNCA 基因之TSS 2a上游約500 鹼基對之內，在TSS 2b下游內約500 鹼基對之內，及/或在TSS 1上游或下游約500 鹼基對之內，如圖 2B 及/或圖 4 中所顯示。靶區域之非限制性實例顯示於表 1 中。
在一些實施例中，融合蛋白包含一或多個(例如兩個、三個、四個、五個或六個)鋅指。其可將SNCA 基因之表現抑制至少約40%、75%、90%、95%或99%，較佳沒有或具有最小可檢測之脫靶結合或活性(例如結合至不為SNCA 基因之基因)。鋅指域之非限制性實例顯示於表 1 中。在一些實施例中，融合蛋白包含顯示於表 1 中之一或多個識別螺旋序列。在其他實施例中，融合蛋白包含來自該表單行，具有或不具有所指示的主鏈突變之一些或全部識別螺旋序列。在某些實施例中，融合蛋白包含顯示於表 2 中之胺基酸序列。
在一些實施例中，融合蛋白之轉錄抑制子域係來自KOX1蛋白之KRAB域。鋅指域可經由肽連接子連接至轉錄抑制子域。在另一態樣中，本發明提供包含本發明融合蛋白之編碼序列之核酸構築體，其中該編碼序列係可以操作方式連接至轉錄調節元件，諸如在腦細胞中具有組成性活性或可誘導之哺乳動物啟動子，且其中該啟動子視需要為人類突觸蛋白I啟動子。本發明亦提供包含核酸構築體之宿主細胞。宿主細胞可為人類細胞，諸如腦細胞或多能幹細胞，其中該幹細胞視需要為胚胎幹細胞或誘導型多能幹細胞(iPSC)。
在另一個態樣中，本發明提供一種抑制人類腦細胞中α-突觸核蛋白之表現之方法，該方法包括將本發明融合蛋白引入細胞中(例如經由引入核酸構築體或重組病毒，諸如AAV (例如AAV2、AAV6、AAV9或其雜交體)，由此抑制細胞中α-突觸核蛋白之表現。腦細胞可為神經元、神經膠質細胞、室管膜細胞或神經上皮細胞。該細胞可在罹患帕金森氏症、路易體癡呆、阿茲海默氏症、多重系統萎縮或其他突觸核蛋白病變(synucleinopathy)或處於發展該等疾病之風險中之患者之腦中。
本發明亦提供一種治療患者突觸核蛋白病變(例如減慢其進展)之方法，該方法包含對該患者投與編碼本發明之融合蛋白之重組AAV。在一些實施例中，將AAV經由靜脈內、鞘內、腦室內、大池內(intra-cisternal magna)、紋狀體內或黑質內注射或注射至任何腦區域中引入患者。患者可患有帕金森氏症、路易體癡呆、阿茲海默氏症或多重系統萎縮。
本發明亦提供用於以上方法中之融合蛋白及本發明融合蛋白於製造用於以上方法中的藥物之用途。
在隨後的詳細描述中當明瞭本發明之其他特徵、目標及優點。然而，應明瞭，雖然詳細描述指示本發明之實施例及態樣，但僅以說明而非限制方式給出。熟習此項技術者自詳細描述當明瞭本發明之範疇內的各種改變及修改。
相關申請案之交叉參考
本申請案主張2019年10月2日申請之美國臨時申請案62/909,496及2020年1月9日申請之美國臨時申請案62/959,153之優先權。前述臨時申請案之內容係以全文引用之方式併入本文中。 序列表
本申請案含有序列表，該序列表已以ASCII格式電子呈送且以全文引用之方式併入本文中。創建於2020年10月1日的該ASCII副本名為025297_WO011_SL.txt及係121,468個位元組大小。
本發明提供靶向人類SNCA 基因中或附近的位點(亦即，序列)之ZFP域。如本文所述的ZFP域可連接或融合至另一功能分子或域。本發明的ZFP域可融合至轉錄因子以抑制人類SNCA 基因轉錄成RNA。融合蛋白稱為鋅指蛋白轉錄因子(ZFP-TF)。此等ZFP-TF包含特異性結合至SNCA 基因中或附近的靶區域之鋅指蛋白(ZFP)域及減少該基因之轉錄之轉錄抑制子域。預期藉由將ZFP-TF引入患者腦中來降低神經元中α-突觸核蛋白含量可抑制(例如減少或停止) α-突觸核蛋白組裝為寡聚體(較小可溶性聚集體)或原纖(較大不溶性聚集體)形式。隨著α-突觸核蛋白聚集之減少，腦細胞將具有利用其細胞品質控制機制及時清除α-突觸核蛋白之折疊錯誤及毒性形式之能力。結果，將減少或防止α-突觸核蛋白之聚集及細胞間傳播。
吾人的ZFP-TF抑制α-突觸核蛋白之方法具有優於由其他人進行測試之當前方法的若干優點。與針對於反義寡核苷酸(ASO)所報導相比，ZFP-TF可達成更高程度之α-突觸核蛋白抑制(參見，例如，Luna等人，Acta Neuropathol. (2018) 135(6):855-75，其顯示ASO對SNCA 之抑制不超過75%)。此外，ZFP-TF可能僅需要投與一次(藉由對患者引入ZFP-TF表現構築體)，而ASO需要重複給藥。另外，ZFP-TF方法僅需要在各細胞之基因組中接合SNCA 基因之兩個對偶基因。相比之下，ASO需要在各細胞中接合SNCA mRNA之多個複本。
吾人的ZFP-TF方法優於抗體方法，因為抗體僅可結合α-突觸核蛋白形狀或構型之子組。此可能不足以達成穩健治療效果。相比之下，ZFP-TF在DNA層級抑制α-突觸核蛋白表現且導致所有形式之α-突觸核蛋白之含量降低。因此，不像抗體，ZFP-TF對毒性物質之形式屏蔽。另外，認為抗體主要作用於細胞上或細胞外的α-突觸核蛋白，而ZFP-TF可直接或間接降低細胞內部的α-突觸核蛋白低於細胞外α-突觸核蛋白含量。因此，因為α-突觸核蛋白主要為細胞內蛋白，故預期ZFP-TF方法會更有效。此外，抗體需要重複投與，而ZFP-TF僅需要其表現構築體之一次遞送。I. ZFP 域之標靶
本發明融合蛋白之ZFP域特異性結合至人類SNCA 基因中或附近的靶區域。圖 1 說明ZFP域與靶SNCA 基因序列之結合。圖式中的ZFP域具有六個鋅指；然而，如下文進一步描述，亦可使用具有更少或更多個鋅指之ZFP域。
人類SNCA 基因跨越約117 kb且已經映射至chr4:89,724,099-89,838,315 (GRCh38/hg38)。其核苷酸序列可以GenBank登錄號NC_000004版本000004.12獲得。該基因具有7個外顯子(2個非蛋白編碼，及5個蛋白編碼)，且各轉錄本具有5個內含子(圖 2A )。該基因有三個轉錄起始位點(TSS)：一個在外顯子1的開始處，及兩個在外顯子2中，導致外顯子2a及2b之表現。第一蛋白質編碼外顯子為外顯子3。亦可參見Touchman等人，Genome Res . (2001) 11:78-86。人類α-突觸核蛋白之同功型1 (全長)如下所示：
Figure 02_image001
同功型2至4與同功型1之不同之處在於胺基酸殘基103至130缺失。同功型2至5與同功型1之不同之處在於胺基酸殘基41至54缺失。α-突觸核蛋白之遺傳分析指出基因複本擴增(參見，例如，Brueggemann等人，Neurology (2008) 71:1294；Troiano等人，Neurology (2008) 71:1295；Uchiyama等人，Neurology (2008) 71:1289-90)及某些點突變為突觸核蛋白病變(諸如PD及路易體癡呆)之潛在原因。例如，在一些PD患者中已識別出以下α-突觸核蛋白點突變：A30P (Kruger等人，Nature Genet . (1998) 18:106-8)；E46K (Zarranz等人，Ann Neurol . (2004) 55:164-73；Choi等人，FEBS Lett . (2004) 576:363-8)；H50Q (Khalaf等人，J Biol Chem . (2014) 289:21856-76)；G51D (Lesage等人，Ann Neurol . (2013) 73:459-71)；及A53T (Polymeropoulos等人，Science (1997) 276:2045-7)。
ZFP-TF之DNA結合ZFP域將融合蛋白引導至SNCA 基因之靶區域且將融合蛋白之轉錄抑制子域引導至靶區域。然後抑制子域藉由RNA聚合酶抑制SNCA 基因的轉錄。ZFP-TF之靶區域可為SNCA 基因中或附近的允許抑制基因表現的任何適宜位點。舉例而言，靶區域包括SNCA TSS或SNCA 轉錄調節元件(例如啟動子、增強子、RNA聚合酶終止位點及類似者)或與其相鄰(在其下游或上游)。
如上所述，人類SNCA 基因具有三個轉錄起始位點(TSS)。其自5’至3’為TSS 1、TSS 2a及TSS 2b，其位於外顯子1 (TSS 1)、外顯子2a及外顯子2b (TSS 2a及2b)之5’端(圖 2B )。在三個TSS處之轉錄得到具有不同長度之RNA同功型。然而，由於α-突觸核蛋白之轉譯始於外顯子3，故自不同TSS產生的RNA導致形成相同蛋白質。在一些實施例中，本發明ZFP-TF之基因組靶區域跨越TSS 1 (例如鹼基對529至1529)或TSS 2a及2b (例如鹼基對1613至2949)或在其附近。在某些實施例中，靶區域在TSS 1上游或下游約500鹼基對之內，及/或在TSS 2a上游或下游約500鹼基對之內及/或在TSS 2b上游或下游約500鹼基對之內。
在一些實施例中，基因組靶區域長度至少8鹼基對。例如，靶區域長度可為8鹼基對至40鹼基對，諸如長度12、15、18、21、24、27、30、33或36鹼基對。靶向序列可在基因之有義股或基因之反義股上。為確保靶向準確性且減少ZFP-TF之脫靶結合或活性，所選SNCA 靶區域之序列較佳與其他基因中之序列具有小於75%同源性(例如小於70%、小於65%、小於60%或小於50%)。在某些實施例中，本發明ZFP-TF之靶區域長度為15至18鹼基對且位於TSS 1、2a或2b之500鹼基對之內。靶區域之實例顯示於圖 2B 及表 1 中。
在一些實施例中，如表 1 單行中所顯示，本發明工程改造ZFP結合至靶位點(亦即，結合序列)，較佳沒有或幾乎沒有可檢測之脫靶結合或活性。
用於進一步評估靶片段之其他標準包括ZFP結合至此等片段或相關片段之先前可得性、設計新穎ZFP來結合所給定的靶片段之容易度及脫靶結合風險。II. ZFP 域
「鋅指蛋白」或「ZFP」係指具有藉由鋅穩定之DNA結合域之蛋白質。ZFP以序列特異性方式結合至DNA。ZFP之單個DNA結合單元稱為鋅「指」。各指含有DNA結合「識別螺旋」，其通常由七個胺基酸殘基組成且決定DNA結合特異性。ZFP域具有至少一個指，各指結合DNA之兩個至四個鹼基對，通常DNA之三個或四個鹼基對。各鋅指通常包含約30個胺基酸及螯合鋅。與天然生成之ZFP相比，工程改造ZFP可具有新穎結合特異性。工程改造方法包括(但不限於)合理設計及各種選擇。合理設計包括例如使用包含三聯體(或四聯體)核苷酸序列及個別鋅指胺基酸序列之資料庫，其中各三聯體或四聯體核苷酸序列與結合特定三聯體或四聯體序列之鋅指之一或多個胺基酸序列相關。參見，例如，詳細描述於美國專利5,789,538；5,925,523；6,007,988；6,013,453；6,140,081；6,200,759；6,453,242；6,534,261；6,979,539；及8,586,526；及國際專利公開案WO 95/19431；WO 96/06166；WO 98/53057；WO 98/53058；WO 98/53059；WO 98/53060；WO 98/54311；WO 00/27878；WO 01/60970；WO 01/88197；WO 02/016536；WO 02/099084；及WO 03/016496中之ZFP設計方法。如本文所述的ZFP域可連接或融合至另一分子，例如蛋白質。此種ZFP融合可包含使得基因活化(例如活化域)、基因抑制(例如抑制子域)、配位體結合(例如配位體結合域)、高通量篩選(例如配位體結合域)、局部化超突變(例如活化誘導之胞苷去胺酶域)、染色質修飾(例如，組蛋白脫乙醯酶域)、重組(例如重組酶域)、靶向整合(例如整合酶域)、DNA修飾(例如DNA甲基轉移酶域)、鹼基編輯(例如鹼基編輯域)或靶向DNA裂解(例如核酸酶域)之域。工程改造ZFP域之實例顯示於表 1 中。
本發明工程改造ZFP融合蛋白之ZFP域可包括至少一個(例如，一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個、十一個、十二個、十三個或更多個)鋅指。具有一個指之ZFP域通常識別包括3或4個核苷酸之靶位點。具有兩個指之ZFP域通常識別包括6或8個核苷酸之靶位點。具有三個指之ZFP域通常識別包括9或12個核苷酸之靶位點。具有四個指之ZFP域通常識別包括12至15個核苷酸之靶位點。具有五個指之ZFP域通常識別包括15至18個核苷酸之靶位點。具有六個指之ZFP域可識別包括18至21個核苷酸之靶位點。
在一些實施例中，本發明工程改造ZFP包含顯示於表 1 中之DNA結合識別螺旋序列。例如，工程改造ZFP可包含如表 1 中所顯示的F1、F2、F3、F4、F5或F6之序列。
在一些實施例中，本發明工程改造ZFP包含表1單行中所顯示的兩個相鄰DNA結合識別螺旋序列。例如，工程改造ZFP可包含如表 1 單行中所顯示的F1-F2、F2-F3、F3-F4、F4-F5或F5-F6之序列。
在一些實施例中，本發明工程改造ZFP包含表1單行中所顯示的DNA結合識別螺旋序列。例如，工程改造ZFP可包含如表 1 單行中所顯示的F1、F2、F3、F4、F5及F6 (例如F1至F6)之序列。
ZFP域之靶特異性可藉由例如在美國專利公開案2018/0087072中所述的對ZFP主鏈序列中之突變加以改良。突變包括彼等對ZFP主鏈中殘基進行之突變，該等殘基在DNA主鏈上可與磷酸鹽非特異性相互作用但不參與核苷酸靶特異性。在一些實施例中，此等突變包含將陽離子胺基酸殘基突變成中性或陰離子胺基酸殘基。在一些實施例中，此等突變包含將極性胺基酸殘基突變成中性或非極性胺基酸殘基。在其他實施例中，在相對於DNA結合螺旋之位置(-5)、(-9)及/或(-14)處進行突變。在一些實施例中，鋅指包含在位置(-5)、(-9)及/或(-14)處之一或多個突變。在其他實施例中，多指ZFP域中之一或多個鋅指包含在位置(-5)、(-9)及/或(-14)處突變。在一些實施例中，在位置(-5)、(-9)及/或(-14)處之胺基酸(例如，精胺酸(R)或離胺酸(K))經突變為丙胺酸(A)、白胺酸(L)、絲胺酸(S)、天冬胺酸(N)、麩胺酸(E)、酪胺酸(Y)及/或麩醯胺酸(Q)。具有1、2或3個主鏈突變之工程改造ZFP之實例顯示於圖4 及5 及表 1 及2 中。表 1 中的符號「^」指示在所指示識別螺旋中第1個胺基酸上游第4位的精胺酸(R)殘基變成麩醯胺酸(Q)。在各識別螺旋序列中，將七個DNA結合胺基酸之位置編號為-1、+1、+2、+3、+4、+5及+6。因此，將R-取代為-Q之位置編號為(-5)。
在一些實施例中，本發明工程改造ZFP包含如表 1 中所顯示的DNA結合識別螺旋序列及相關主鏈突變。在一些實施例中，本發明工程改造ZFP包含表 1 單行中所顯示的DNA結合識別螺旋序列及相關主鏈突變。
在一些實施例中，本文所述的工程改造ZFP包含表 2 單行中所顯示的序列之識別螺旋及主鏈部分。在一些實施例中，本文所述的工程改造ZFP包含表 2 單行中所顯示的序列之識別螺旋及主鏈部分，因為該序列將在轉譯後修飾後出現。例如，轉譯後修飾可自如表 2 中所顯示的序列除去引發劑甲硫胺酸殘基。
在一些實施例中，本發明ZFP-TF包含一或多個鋅指域。該等域可經由可延伸之撓性連接子連接在一起，使得例如一個域包含一或多個(例如，4個、5個或6個)鋅指及另一域包含另外一或多個(例如，4個、5個或6個)鋅指。在一些實施例中，連接子為標準指間連接子，使得該指陣列包含一個包含8個、9個、10個、11個或12個或更多個指之DNA結合域。在其他實施例中，連接子為非典型連接子，諸如撓性連接子。例如，兩個ZFP域可以構型(自N端至C端) ZFP-ZFP-TF、TF-ZFP-ZFP、ZFP-TF-ZFP或ZFP-TF-ZFP-TF連接至轉錄抑制子TF (兩個ZFP-TF融合蛋白經由連接子融合在一起)。
在一些實施例中，ZFP-TF為「雙手型」，亦即其含有由介入胺基酸分開之兩個鋅指簇(兩個ZFP域)使得兩個ZFP域結合至兩個不連續靶位點。雙手型鋅指結合蛋白之一個實例為SIP1，其中四個鋅指簇位於該蛋白質之胺基端及三個指簇位於羧基端(參見Remacle等人，EMBO J. (1999) 18(18):5073-84)。此等蛋白質中之各鋅指簇均能夠結合至獨特靶序列且兩個靶序列之間的間距可包含許多核苷酸。
或者，DNA結合域可衍生自核酸酶。例如，歸巢核酸內切酶及大範圍核酸酶(諸如I-Sce I、I-Ceu I、PI-Psp I、PI-Sce 、I-Sce IV、I-Csm I、I-Pan I、I-Sce II、I-Ppo I、I-Sce III、I-Cre I、I-Tev I、I-Tev II及I-Tev III)之識別序列係已知的。亦可參見美國專利5,420,032及6,833,252；Belfort等人，Nucleic Acids Res. (1997) 25:3379-88；Dujon等人，Gene (1989) 82:115-8；Perler等人，Nucleic Acids Res. (1994) 22:1125-7；Jasin，Trends Genet. (1996) 12:224-8；Gimble等人，J Mol Biol. (1996) 263:163-80；Argast等人，J Mol Biol. (1998) 280:345-53；及the New England Biolabs catalogue。此外，歸巢核酸內切酶及大範圍核酸酶之DNA結合特異性可經工程改造以結合非天然靶位點。參見，例如，Chevalier等人，Mol Cell (2002) 10:895-905；Epinat等人，Nucleic Acids Res. (2003) 31:2952-62；Ashworth等人，Nature (2006) 441:656-59；Paques等人，Current Gene Therapy (2007) 7:49-66；及美國專利公開案2007/0117128。III. 鋅指蛋白轉錄因子
本文所述的ZFP域可融合至轉錄因子。在一些實施例中，本發明融合蛋白含有DNA結合鋅指蛋白(ZFP)域及轉錄因子域(亦即ZFP-TF)。在一些實施例中，轉錄因子可為轉錄抑制子域，其中該ZFP及抑制子域可藉由直接肽基鍵聯或肽連接子或藉由二聚化(例如，透過白胺酸拉鍊、STAT蛋白N端域或FK506結合蛋白)彼此締合。如本文所用，「融合蛋白」係指具有經共價連接之域之多肽以及經由非共價鍵彼此締合之多肽之複合物。轉錄抑制子域可在任何適宜位置(包括ZFP域的C端或N端)與ZFP域締合。
在一些實施例中，本發明ZFP-TF以小於約25 nM之KD 結合至其標靶且將人類SNCA 基因之轉錄抑制20%或更多(例如30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%或更多)。在一些實施例中，在患者中同時使用本發明ZFP-TF中之兩者或更多者，其中該等ZFP-TF結合至SNCA 基因中之不同靶區域，以便達成SNCA 表現之最佳抑制。A. 轉錄抑制子域
本發明ZFP-TF包含如本文所述的工程改造ZFP域及弱化SNCA 基因之轉錄活性之一或多個轉錄抑制子域。一或多個工程改造ZFP域及一或多個轉錄抑制子域可藉由撓性連接子接合。轉錄抑制子域之非限制性實例為KOX1、KAP-1、MAD、FKHR、EGR-1、ERD、SID、TGF-β誘導型早期基因(TIEG)、v-ERB-A、MBD2、MBD3、TRa、組蛋白甲基轉移酶、組蛋白脫乙醯酶(HDAC)、核激素受體(例如，雌激素受體或甲狀腺激素受體)、DNMT家族成員(例如DNMT1、DNMT3A、DNMT3B)、Rb及MeCP2之KRAB域。參見，例如，Bird等人(1999)Cell 99:451-454；Tyler等人(1999)Cell 99:443-446；Knoepfler等人(1999)Cell 99:447-450；及Robertson等人 (2000)Nature Genet . 25:338-342。另外示例性抑制子域包括(但不限於) ROM2及AtHD2A。參見，例如，Chem等人(1996)Plant Cell 8:305-321；及Wu等人(2000)Plant J . 22:19-27。
在一些實施例中，轉錄抑制子域包含來自人類鋅指蛋白10/KOX1 (ZNF10/KOX1) (例如GenBank號Nm_015394.4)之Kruppel相關盒(KRAB)域之序列。一個示例性KRAB域序列為：
Figure 02_image003
亦可使用該KRAB序列之變異體，只要其具有相同或相似轉錄抑制功能。
在一些實施例中，本文所述的工程改造ZFP-TF結合至如表 1 單行中所顯示的靶位點，較佳具有或幾乎沒有可檢測之脫靶結合或活性。脫靶結合可例如藉由測量脫靶基因處ZFP-TF之活性來確定。在一些實施例中，本文所述的工程改造ZFP-TF包含顯示於表 1 中之DNA結合識別螺旋序列。在一些實施例中，本文所述的工程改造ZFP-TF包含表 1 單行中所顯示的兩個相鄰DNA結合識別螺旋序列。在一些實施例中，本文所述的工程改造ZFP-TF包含表 1 單行中所顯示的DNA結合識別螺旋序列。在一些實施例中，本文所述的工程改造ZFP-TF包含表 2 單行中所顯示的序列之識別螺旋及主鏈部分。在一些實施例中，本文所述的工程改造ZFP-TF包含表 2 單行中所顯示的胺基酸序列。在一些實施例中，本文所述的工程改造ZFP-TF包含表 2 單行中所顯示的序列之識別螺旋及主鏈部分，因為該序列將在轉譯後修飾後出現。在一些實施例中，本文所述的工程改造ZFP-TF包含如表 2 單行中所顯示的胺基酸序列，因為該序列將在轉譯後修飾後出現。例如，轉譯後修飾可自如表 2 中所顯示的序列除去引發劑甲硫胺酸殘基。B. 肽連接子
本發明ZFP-TF之ZFP域及轉錄抑制子域及/或ZFP域內的鋅指可經由肽連接子連接，例如約5至200個胺基酸(例如5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個或更多個胺基酸)之不可裂解之肽連接子。較佳連接子通常為經合成為重組融合蛋白之撓性胺基酸子序列。參見，例如，以上所述；及美國專利6,479,626；6,903,185；7,153,949；8,772,453；及9,163,245；及WO 2011/139349。本文所述的蛋白質可包括適宜連接子之任何組合。連接子之非限制性實例為DGGGS (SEQ ID NO: 2)、TGEKP (SEQ ID NO: 3)、LRQKDGERP (SEQ ID NO: 4)、GGRR (SEQ ID NO: 5)、GGRRGGGS (SEQ ID NO: 6)、LRQRDGERP (SEQ ID NO: 7)、LRQKDGGGSERP (SEQ ID NO: 8)、LRQKD(G3 S)2 ERP (SEQ ID NO: 9)及TGSQKP (SEQ ID NO: 10)。
在一些實施例中，TGEKPFA (SEQ ID NO: 166)及/或TGSQKPFQ (SEQ ID NO: 167)連接ZFP域內的鋅指，及/或LRQKDAARGSGG (SEQ ID NO: 168)或LRGSGG (SEQ ID NO: 169)將ZFP域連接至轉錄抑制子域。
在一些實施例中，肽連接子長度為三個至20個胺基酸殘基且富含G及/或S。此種連接子之非限制性實例為G4 S型連接子(SEQ ID NO: 16)，亦即含有一或多個(例如2個、3個或4個) GGGGS (SEQ ID NO: 11)基序或該基序之變型(諸如來自基序之具有一個、兩個或三個胺基酸插入、缺失及取代之基序)之連接子。IV. ZFP-TF 之表現
本發明之ZFP-TF可經由編碼其之核酸分子引入患者。核酸分子可為RNA或cDNA分子。核酸分子可經由注射包含脂質:核酸複合物(例如脂質體)之組合物引入患者腦中。或者，ZFP-TF可經由包含編碼ZFP-TF之序列之核酸表現載體引入患者。表現載體可包括表現控制序列，諸如啟動子、增強子、轉錄信號序列及轉錄終止序列，其允許ZFP-TF之編碼序列在神經系統之細胞中表現。在一些實施例中，表現載體仍以穩定離合染色小體(episome)存在於細胞中。在其他實施例中，表現載體經整合於細胞之基因組中。
在一些實施例中，用於引導腦中ZFP-TF表現之載體上的啟動子為組成型活性啟動子或誘導型啟動子。適宜啟動子包括(但不限於)逆轉錄病毒RSV LTR啟動子(視需要具有RSV增強子)、CMV啟動子(視需要具有CMV增強子)、CMV立即早期啟動子、SV40啟動子、二氫葉酸還原酶(DHFR)啟動子、β-肌動蛋白啟動子、磷酸甘油酸激酶(PGK)啟動子、EFlα啟動子、MoMLV LTR、CK6啟動子、甲狀腺素運轉蛋白啟動子(TTR)、TK啟動子、四環素反應啟動子(TRE)、HBV啟動子、hAAT啟動子、嵌合肝臟特異性啟動子(LSP)、E2F啟動子、瑞粒酶(hTERT)啟動子、CMV增強子/雞β-肌動蛋白/兔β-球蛋白啟動子(CAG啟動子；Niwa等人，Gene (1991) 108(2):193-9)及RU-486反應啟動子。亦可使用神經元特異性啟動子，諸如突觸蛋白I啟動子、MeCP2啟動子、CAMKII啟動子、PrP啟動子、GFAP啟動子或將表現限制於神經元及神經膠質細胞之工程改造或天然啟動子。
可採用將核苷酸序列引入細胞中之任何方法，包括(但不限於)電穿孔、磷酸鈣沉澱、微注射、陽離子或陰離子脂質體、與核定位信號組合之脂質體、天然生成之脂質體(例如外泌體)或病毒轉導。
為活體內遞送表現載體，可使用病毒轉導。此項技術中已知的多種病毒載體可經熟習此項技術者調適用於本發明，例如牛痘載體、腺病毒載體、慢病毒載體、氧合病毒(poxyviral)載體、腺相關病毒(AAV)載體、逆轉錄病毒載體及雜種病毒載體。在一些實施例中，本文所使用的病毒載體為重組AAV (rAAV)載體。AAV載體特別適合CNS基因遞送，因為其既感染分裂細胞又感染非分裂細胞，以穩定游離體型結構存在以進行長期表現，及具有極低免疫原性(Hadaczek等人，Mol Ther . (2010) 18:1458-61；Zaiss等人，Gene Ther. (2008) 15:808-16)。可使用任何適宜AAV血清型。例如，AAV可為AAV1、AAV2、AAV3、AAV3B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV8.2、AAV9或AAVrh10、或假型(諸如AAV2/8、AAV2/5、AAV2/6或AAV2/9)、或為本文所列的AAV血清型中之一者之變異體或衍生物的血清型(亦即衍生自多種血清型之AAV；例如，rAAV在其基因組中包含AAV2反向末端重複序列(ITR)及AAV8、5、6或9衣殼)。在一些實施例中，表現載體為AAV病毒載體且藉由重組AAV病毒粒子引入靶人類細胞，該重組AAV病毒粒子之基因組包含構築體，包括在兩端具有AAV反向末端重複序列(ITR)序列以允許產生生產系統(諸如昆蟲細胞/桿狀病毒生產系統或哺乳動物細胞生產系統)中之AAV病毒粒子。AAV可經工程改造使得其衣殼蛋白在人類或非人類靈長類動物中具有降低之免疫原性或增強之轉導能力。在一些實施例中，使用AAV9。本文所述的病毒載體可使用此項技術中已知的方法來產生。任何適宜允許或封裝細胞均可用於產生病毒顆粒。例如，哺乳動物或昆蟲細胞可用作封裝細胞系。V. 醫藥應用
本發明ZFP-TF可用於治療需要下調α-突觸核蛋白表現的患者。患者罹患神經退化性疾病，諸如帕金森氏症、路易體癡呆、阿茲海默氏症、多重系統萎縮及任何其他突觸核蛋白病變，或處於發展該等疾病之風險中。處於風險中的患者包括彼等遺傳易感者、彼等罹患復發型腦損傷(諸如震盪)者及彼等已暴露於環境神經毒素者。本發明提供一種治療個體(諸如有此需要的人類患者)之神經疾病(例如神經退化性疾病)之方法，該方法包括將治療有效量(例如，允許充分抑制SNCA 表現之量)之ZFP-TF (例如表現其之rAAV載體)引入該個體之神經系統。術語「治療」包涵緩解症狀，預防症狀發作，減緩疾病進展，改良生活品質，及增加存活期。
本發明提供包含病毒載體(諸如重組AAV (rAAV))之醫藥組合物，該病毒載體之重組基因組包含ZFP-TF之表現盒。醫藥組合物可進一步包含醫藥上可接受之載劑，諸如水、鹽水(例如，磷酸鹽緩衝鹽水)、右旋糖、甘油、蔗糖、乳糖、明膠、聚葡萄糖(dextran)、白蛋白或果膠。另外，組合物可含有輔助物質，諸如濕潤劑或乳化劑、pH緩衝劑、穩定劑或增強醫藥組合物之有效性之其他試劑。醫藥組合物可含有遞送媒劑，諸如脂質體、奈米膠囊、微粒、微球、脂質顆粒及囊泡。
本發明之治療劑所靶向的細胞為腦中之細胞，包括(但不限於)神經元細胞(例如，運動神經元、感覺神經元、多巴胺能神經元、膽鹼能神經元、麩胺酸能神經元、GABA能神經元或血清素能神經元)；神經膠質細胞(例如寡突膠質細胞、星形膠質細胞、外被細胞(pericyte)、雪旺氏細胞(Schwann cell)或微神經膠質細胞)；室管膜細胞或神經上皮細胞。治療劑所靶向的腦區域可為彼等在突觸核蛋白病變中受影響最顯著之區域，諸如紋狀體、尾核、殼核、黑質、中腦、嗅球、小腦、藍斑、橋腦、延腦、腦幹、蒼白球、海馬體及大腦皮質或其他腦區域。此等區域可直接透過紋狀體內注射、黑質內注射、腦內注射、大池內(ICM)注射，或更一般地透過實質內注射、腦室內(ICV)注射、鞘內注射或靜脈內注射達成。其他投與途徑包括(但不限於)腦內、室內、鼻內或眼內投與。在一些實施例中，病毒載體在例如經由鞘內及/或腦室內注射或大池內注射直接投與至腦脊髓液(CSF)中後擴散於整個CNS組織中。在其他實施例中，在靜脈內投與後病毒載體穿過血腦屏障且在個體之整個CNS組織中達成廣泛擴散式分佈。在其他實施例中，病毒載體經由實質內注射直接遞送於靶區域。在一些情況下，在實質內遞送後病毒載體可能經歷逆行或順行轉運至其他腦區域。在一些態樣中，病毒載體具有獨特CNS組織靶向能力(例如CNS組織向性)，其以高效率達成穩定且非毒性之基因轉移。
舉例而言，醫藥組合物可經由腦室內投與，例如投與至患者前腦之腦室區域(諸如右側腦室、左側腦室、第三腦室或第四腦室)中而提供給患者。醫藥組合物可透過腦內投與，例如將組合物注射於紋狀體、尾核、殼核、黑質、中腦、嗅球、大腦、延腦、橋腦、小腦、藍斑、腦乾、蒼白球、海馬體、大腦皮質、顱內腔、腦膜、硬腦膜、蛛網膜或腦軟膜中或附近而提供給患者。在一些情況下，腦內投與可包括將一種藥劑投與至腦周圍蛛網膜下腔之腦脊髓液(CSF)中。
在一些情況下，腦內投與涉及使用立體定位程序進行注射。立體定位程序係此項技術中熟知的且通常涉及使用電腦及3維掃描裝置，其一起用於導引注射至特定腦內區域，例如腦室區域。亦可使用微注射泵(例如，來自World Precision Instruments)。在一些情況下，微注射泵用於遞送包含病毒載體之組合物。在一些情況下，組合物之輸注速率在0.1 µl/min至100 µl/min之範圍內。如熟練技術者將瞭解，輸注速率將取決於多種因素，包括例如個體之人種、個體年齡、個體體重/大小、AAV之血清型、所需的劑量及所靶向的腦內區域。因此，熟練技術者可認為其他輸注速率在某些情況下係適宜的。
可例如藉由靜脈內投與來達成遞送rAAV至個體。在某些情況下，可能希望將rAAV局部遞送至腦組織、脊髓、腦脊髓液(CSF)、神經元細胞、神經膠質細胞、腦膜、星形膠質細胞、寡突膠質細胞、微神經膠質細胞、間質空間及類似者。在一些情況下，重組AAV可藉由注射至腦室區域中以及注射至紋狀體、尾核、殼核、黑質、中腦、嗅球、小腦、藍斑、橋腦、延腦、腦幹、蒼白球、海馬體及大腦皮質或其他腦區域直接遞送至CNS。AAV可使用此項技術中已知的神經外科技術，諸如藉由立體定位注射(參見，例如，Stein等人，J Vir . (1999) 73:3424-9；Davidson等人，PNAS . (2000) 97:3428-32；Davidson等人，Nat Genet . (1993) 3:219-223；及Alisky及Davidson，Hum. Gene Ther . (2000) 11:2315-29)，用針、導管或相關裝置來遞送。
除非本文另外定義，否則與本發明結合使用的科學及技術術語應具有熟習此項技術者通常所理解的含義。下文描述示例性方法及材料，儘管類似或等效於彼等本文所述者之方法及材料亦可用於實踐或測試本發明中。若發生衝突，則以本說明書(包括定義)為準。一般而言，本文所述的與神經病學、醫學、藥物及醫藥化學及細胞生物學結合使用的命名法及神經病學、醫學、藥物及醫藥化學及細胞生物學技術為彼等此項技術中熟知且常用者。酶促反應及純化技術根據製造商之說明書進行，如通常在此項技術中實現或如本文所述。此外，除非上下文另外要求，否則單數術語應包括複數且複數術語應包括單數。在整篇該說明書及實施例中，字詞「具有(have)」及「包含(comprise)」或變型諸如「具有(has)」、「具有(having)」、「包含(comprises)」或「包含(comprising)」將被理解為意指包括所述整數或整數組但不排除任何其他整數或整數組。本文提及的所有公開案及其他參考文獻之全部內容係以引用之方式併入。儘管本文引用許多文件，但該引用並不意味著承認此等文件中之任何文件構成此項技術中公知常識之一部分。如本文所用，術語「大約(approximately)」或「約(about)」應用於一或多個受關注值係指類似於所述參考值之值。在某些實施例中，該術語係指落在所述參考值之10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%或更小(在任一方向上，大於或小於)內之一系列值，除非另有說明或另外從上下文明顯可見。
為了可更佳地理解本發明，提出以下實例。此等實例僅出於說明之目的而不應以任何方式解釋為限制本發明之範疇。 實例實例 1 ： ZFP-TF 之篩選
為了識別抑制α-突觸核蛋白之表現之ZFP-TF，吾人設計且篩選416個ZFP-TF的文庫，該等ZFP-TF預計結合人類SNCA 基因之跨越TSS 1上游500鹼基對至TSS 1下游500鹼基對或TSS 2a上游500鹼基對至TSS 2b下游500鹼基對之區域中之15或18鹼基對序列(圖 2B )。ZFP-TF之靶區域由圖 2B 中的箭頭表示，其中該箭頭之方向指示ZFP-TF所結合的DNA股(5’至3’)。圖 4 顯示與具有1個、2個或3個靶向SNCA 基因之TSS 2a及2b之磷酸鹽接觸改變之ZFP-TF之彼等展現於圖 2B 中之資料相似的資料。在該研究中，KRAB域序列(SEQ ID NO: 12)用作轉錄抑制子且融合至ZFP域的C端。20個代表性ZFP-TF之序列顯示於以下表 2 中。自pVAX-ZFP或pVAX-GFP質體使用PCR (正向引子GCAGAGCTCTCTGGCTAACTAGAG (SEQ ID NO: 13)；反向引子T(180)CTGGCAACTAGAAGGCACAG (SEQ ID NO: 14)來產生用於活體外轉錄之模板。信使RNA係使用mMESSAGE mMACHINE T7 ULTRA轉錄套組(Thermo Fisher Scientific)按照製造商之說明書來合成且使用RNeasy96管柱(Qiagen)進行純化。然後將編碼各ZFP-TF之RNA以6劑量稀釋等分於96孔板中。
根據熟知的方法，在HEK293細胞中產生攜帶ZFP-TF編碼序列之重組rAAV載體。用編碼AAV輔助基因及rAAV基因組之質體轉染細胞三天後，收穫細胞。然後藉由三輪冷凍/解凍裂解細胞且藉由離心移除細胞碎片。使用聚乙二醇沉澱rAAV病毒粒子。再懸浮後，藉由基於氯化銫梯度超速離心來純化病毒粒子過夜。藉由透析調配病毒粒子且然後進行過濾滅菌。將AAV等分且儲存在-80℃下直至使用。解凍後，AAV並未重新冷凍。
篩選係在SK-N-MC人類神經上皮細胞系中進行。SK-N-MC細胞高程度表現人類α-突觸核蛋白且因此適於測試降低α-突觸核蛋白表現之ZFP-TF。將SK-N-MC細胞在組織培養瓶中培養直至匯合。將細胞以每孔150,000個細胞接種於96孔板上且再懸浮於Amaxa® SF溶液中。然後將細胞與ZFP-TF RNA (6劑：3、10、30、100、300及1000 ng)混合且轉移至Amaxa® 梭板孔。使用Amaxa® Nucleofector® 裝置(Lonza；程式CM-137)轉染細胞。將依格氏MEM細胞培養基(Eagle’s MEM cell media)添加於板各孔。將細胞轉移至96孔組織培養板且在37℃下培養24小時。
ZFP-TF亦在人類iPSC衍生之GABA能神經元(Cellular Dynamics International)中進行測試。根據製造商之說明書，將細胞以每孔40,000個細胞之密度接種於聚-L-鳥胺酸-及層黏連蛋白(laminin)塗覆之96孔板上且然後進行維持。接種後48小時，在6種不同MOI (1E3、3E3、1E4、3E4、1E5及3E5)下用表現所需ZFP-TF之AAV6轉染細胞。經轉導之細胞維持長達32天(每3至5天進行50至75%培養基更換)。在AAV轉染後28至30天收穫細胞。
裂解所收穫的細胞且使用C2CT套組遵循製造商之說明書進行逆轉錄。TaqMan定量聚合酶鏈反應(qPCR)用於測量SNCA 之表現程度。將SNCA 表現程度標準化為管家基因EIF4A2 、ATP5B 及GAPDH 之表現程度之幾何平均值。假轉染及用已知不靶向SNCA 之ZFP-TF轉染用作陰性對照。
許多所測試的ZFP-TF證實α-突觸核蛋白之劑量依賴性抑制。達成的最大抑制超過99%，但吾人亦識別出在較小程度上(例如在最高劑量下之約90%、約75%或約40%)抑制α-突觸核蛋白的ZFP-TF。圖 3A 至 E 及5 顯示篩選資料。
40個ZFP-TF實例之劑量依賴性活性顯示於圖 6A 及6B 中。此等圖式中之資料顯示，ZFP-TF展現寬廣範圍之α-突觸核蛋白抑制活性譜，其中在所測試的最高劑量下之α-突觸核蛋白mRNA抑制在約40%至大於99%範圍內。例如，ZFP-TF 81966、81970、81972、82002、82008、82012、82049、82054、82090、82092、82096、82097、82107、82150、82190、82195、82197、82215、82225及82294證實人類SNCA 基因之95%或更大抑制；ZFP-TF 81965、81971、82076、82135、82136、82158、82167、82242、82264、82285及82329證實80%至94%抑制；及ZFP-TF 82001、82056、82058、82110、82144、82148、82151、82208及82288證實41%至79%抑制。實例 2 ： α- 突觸核蛋白 ZFP-TF 之脫靶活性
為評估α-突觸核蛋白ZFP-TF於整體基因表現上之脫靶影響，吾人對自經編碼代表性α-突觸核蛋白ZFP-TF之AAV處理之人類iPSC衍生之神經元及初級小鼠皮質神經元分離的總RNA進行微陣列實驗。
如實例1中所述處理人類iPSC衍生之神經元。為進行微陣列分析，將細胞以每孔260,000個細胞之密度接種於聚L-鳥胺酸及層黏連蛋白塗覆之24孔板上，接種後48小時用1E5 VG/細胞轉染，且在病毒轉染後19天收穫。自所收穫的細胞分離之RNA用於微陣列分析。
初級小鼠皮質神經元購自Gibco。將細胞以200,000個細胞/孔接種於聚-D-離胺酸塗覆之24孔板上且根據製造商之說明書使用含有GlutaMAXTM I補充劑、B27補充劑及青黴素/鏈黴素之Gibco神經元基礎培養基進行維持。接種後四十八小時(在DIV2)，用AAV6以1E5 VG/細胞之MOI感染細胞且7天後收穫(在DIV9；每3至4天進行50%培養基更換)。此後接著RNA分離及微陣列分析。
脫靶分析係使用GeneTitanTM 平臺(Clariom S套組)根據製造商之說明書來進行。使用TAC軟體分析測定結果。分析中調出經FDR校正之p值≤0.05的經差異調節之基因(其調節＞2倍)。已知具有最小脫靶之ZFP-TF及假轉染用作陰性對照。
圖 7A 至 D 顯示人類iPSC衍生之神經元及初級小鼠皮質神經元中40種代表性α-突觸核蛋白ZFP-TF之微陣列結果。存在一系列脫靶活性，其中一些ZFP-TF展現極低至沒有可檢測之脫靶活性。實例 3 ： 活 體內抑制 α- 突觸核蛋白 mRNA 表現
使用表現兩個代表性ZFP-TF (82195及82264)之AAV6構築體來證實PAC突觸核蛋白小鼠模型中人類SNCA 之活體內抑制，該ZFP-TF在人類及小鼠神經元中具有最小至沒有可檢測之脫靶活性且在人類iPSC衍生之神經元中具有不同的最大抑制活性(82195，~95%；82264，~80%) (Kuo等人，Hum Mol Genet. (2010) 19(9):1633-50)。該小鼠模型在小鼠α-突觸核蛋白無效背景上表現出完整人類SNCA 序列以及其上游調節序列。將表現各ZFP-TF之AAV6載體及媒介體在8週齡雌性PAC突觸核蛋白小鼠(每組n = 3隻)之兩個位點以0.5 µL/分鐘之速率雙側投與給紋狀體(每半球2個位點：5 µL至前紋狀體及4 µl至後紋狀體，總共9 µL/半球及18 µL/動物)。輸注後，將針留在適當位置5分鐘以使測試製品擴散。然後歷時1至2分鐘將針緩慢收回。用於注射之立體定位座標如下(前紋狀體-AP：+ 1.4 mm，ML：+/-1.7 mm，DV：-3.0 mm；後紋狀體：AP：+0.2 mm，ML：+/-2.3 mm，DV：-2.7 mm)。3週後對小鼠實施安樂死且收集其腦以進行分子分析。安樂死時，動物經心臟灌注0.9%生理鹽水，且取出腦並半切。左半球經進一步切為12個不同區域(嗅球；吻側、內側及尾側皮質；吻側、內側及尾側紋狀體；海馬體；丘腦；腹側中腦；延腦；及小腦)。將切下的組織置於RNALater中以保持RNA完整性。24小時後，移除RNALater且將組織在液氮中閃凍並維持在乾冰上直至在-80℃下儲存。
將腦組織轉移至置於冰上之內裝有0.6 mL TRI試劑(Thermo Fisher)及兩個3.2 mm鋼珠(BioSpec Products)之1.5 mL 微量離心管。使用Qiagen組織裂解儀在4℃下使用以下參數裂解樣品：5個週期，90秒持續時間及25.1頻率。短暫離心後，在室溫下將70 μL 1-溴-3-氯丙烷加至各樣品中。將樣品渦轉10秒，在4℃下以12,000 ×g離心10分鐘，且將來自各樣品之120 μL水相轉移至96孔板之孔。
將六十微升異丙醇及12 μL MagMax磁珠(Thermo Scientific)加入含有組織裂解物之水相之各孔。使用Kingfisher 96機器人(Thermo Scientific)及MagMax套組(Thermo Fisher)以遵循製造商之協定自組織裂解物分離核糖核酸(RNA)。使用磁性架自磁珠分離得一百微升經溶離之RNA。使用Nanodrop 8000儀器(Thermo Scientific)評估RNA產量及品質。
使用高容量cDNA逆轉錄套組(Applied Biosystems)，利用10 μL RNA及10 μL RT主混合物(Master Mix) (10x RT緩衝液、10x隨機引子、25x dNTP混合物、Multiscribe酵素及無RNA酶水)按預設製備互補去氧核糖核酸(cDNA)。若需要，則可調整RNA及RT主混合物體積以確保輸入物在100至1,000 ng範圍內。使用以下程式在C1000 Touch Biorad熱循環儀上進行逆轉錄：25℃持續10分鐘，37℃持續120分鐘，85℃持續5分鐘，且保持在4℃。
使用Biorad CFX384熱循環儀使cDNA經歷RT-qPCR。將cDNA在無核酸酶水中稀釋10倍，且將4 μL經稀釋之cDNA加入各10 μL PCR反應。各樣品技術上一式四份進行測定。2x快速多路PCR (Qiagen)主混合物用於三重測定，及SsoAdvanced通用探針超級混合物(Biorad)用於其他測定。
使用以下循環條件：Qiagen快速多路主混合物à 95℃持續5分鐘，95℃持續45秒，60℃持續45秒，板讀取，40個週期；Biorad SsoAdvanced主混合物 à95℃持續90秒，95℃持續12秒，60℃持續40秒，板讀取，42個週期。
使用在RNA分離步驟之前相對於之後的外加GFP RNA以評估RNA回收率%。該研究中自動物匯集的RNA之4樣品5倍稀釋系列用作標準曲線。將樣品數據標準化為三個管家基因ATP5B 、 EIF4A2 及GAPDH 之幾何平均值。
來自該實驗之α-突觸核蛋白、ZFP-TF、GFAP、IBA1及NeuN mRNA表現資料顯示於圖 8A 及8B 中。資料顯示，在具有顯著ZFP-TF表現之腦區域中存在α-突觸核蛋白之抑制。此外，GFAP、IBA1及NeuN表現資料指示，ZFP-TF良好耐受，因而其投與並未導致神經發炎標記物之表現升高或神經元標記物NeuN之表現降低。 序列表
以下表 1 列出本發明之33個示例性工程改造ZFP。對於各ZFP，ZFP域內各鋅指之基因組靶序列(結合序列)及DNA結合識別螺旋序列(亦即，F1至F6)顯示於單行中。下表中的「^」指示，在所指示螺旋中第1個胺基酸上游第4位的精胺酸(R)殘基變為麩醯胺酸(Q)。該等序列之序列表編號(SEQ ID NO: #)顯示於圓括號中。表 1 示例性 ZFP
ZFP (SBS-) 結合序列 ( 大寫字母 ) F1 F2 F3 F4 F5 F6
82090 aTCCGAGATAGGGaCGAGGAg (17) QSGHLAR (37) QRKDLTQ (61) RSDHLSR (47) TRDGLRQ (97) RSANLAR (110) DSSDRKK (120)
82092 cCGAGATAGGGACGAGGAGc (18) RSDNLST (38) RSDNLTR (62) DRSDLSR (64) RREHLRA (98) TSGNLTR (111) QRSHLSD (121)
82107 cAGGGAAaGCAGCGAGCGCCg (19) ERGTLAR (39) MACCRYA (63) RSADLTR (80) QSGDLTR (99) QSGNLAR (85) RQEHRVA (122)
82110 gAAAGCAGCGAGCGCCGGGa (20) RSAHLSR (40) DRSDLSR (64) MSCCRSA (81) RSADLSR (100) QSGDLTR (99) QRSNLNI (123)
82136 gGACGGCGACGACCAGAAGg (21) RSDNLSV (41) ASWTLTQ (65) DRSDLSR (64) DRSNLTR (75) DRSHLTR (45) DRSNLTR (75)
82148 cGCGACGCGGAAGTGAGGTg (22) LRHHLTR (42) VAEYRYK (66) RSDNLSV (41) RHSHLTS (101) RSDTLSA (112) RSADLSR (100)
82190 cGCTCACGAGGGTGGAAAGg (23) RSDNLST (38) QSGHLSR (67) DAHHLHR (82) RSANLTR (102) DRSNRTT (113) HRSSLRR (124)
82195 aTTCGACGACAGGTTAGCGg (24) RSDDLTR (43) QKFPRDS (68) RSDHLTQ (83) DSANLSR (103) DRSNLSR (44) DRTSLKW (125)
82208 gGCCGCTGTGAGCcGGCGACg (25) DRSNLSR (44) HLCCLGR (69) RSCCLHL (84) RNASRTR (104) QSSDLSR (51) HRKSLSR (126)
82215 aGGCGGCACCCGGgGGGGACt (26) DRSNLSR (44) DRSHLAR (70) RSDHLSE (54) TSSDRTK (105) DRSHLSR (114) DRSHLAR (70)
82225 gAGCGCACAGGAAgGGCGGAg (27) DRSHLTR (45) DRSHLAR (70) QSGNLAR (85) AKWNLDA (106) QSGDLTR (99) TQGYLRK (127)
82242 gGCGGGGaGGAGTCGGAGTTg (28) TSGSLSR (46) QAGHLAK (71) DRSARTR (86) QSGHLSR (67) RSAHLSR (40) QSSDLRR (128)
82294 gGTCGTGgGCACCGGGAGGGg(29) RSDHLSR (47) QHAHRNT (72) RPDTLRD (87) QNATRTK (107) RSDALSR (115) DRSALAR (76)
82329 gGCTGCTTCTCCGgGATCCGc (30) NNRDLIN (48) TSSNLSR (73) RSDTLSE (88) NNRDRTK (108) QSSDLSR (51) HRSTRNR (129)
82135 gGAGGACGGCGACgACCAGAa (31) QNAHRKT (49) DNSTRIK (74) DRSNLSR (44) HLCCLGR (69) DRSNLSR (44) TSANLSR (130)
82144 aGAGGGGGCGAGCGACCGAg (32) QRNHRTT (50) DRSNLTR (75) MSCCRSA (81) RSADLSR (100) RSAHLSR (40) TSANLSR (130)
82150 cGTCGCGGCGCTCgGTCGCTc (33) QSSDLSR (51) DRSALAR (76) DRSYRNT (89) RRSDLKR (109) RSADLTR (80) DRSALAR (76)
82158 cTGCGCTGCAGCCcGCACGCa (34) DSSTRKT (52) QSATRTK (77) ERGTLAR (39) QSGDLTR (99) QSSDLSR (51) AASNRSK (131)
82197 cGTCGAAtGGCCACTCCCAGt (35) RSDNLSQ (53) ASNDRKK (78) YDYGRYT (90) DRSHLAR (70) QSGNLAR (85) DRSALAR (76)
82264 gTACCTGtGGATCTAAACGGg (36) RSDHLSE (54) QSNHRKT (79) VYEGLKK (91) QSGHLSR (67) RSDVLSE (116) DRSNRIK (132)
85054 gGAGGACGGCGACgACCAGAa (31) ^QNAHRKT (55) DNSTRIK (74) DRSNLSR (44) HLCCLGR (69) DRSNLSR (44) TSANLSR (130)
85055 gGAGGACGGCGACgACCAGAa (31) ^QNAHRKT (55) DNSTRIK (74) ^DRSNLSR (92) HLCCLGR (69) DRSNLSR (44) TSANLSR (130)
85056 gGAGGACGGCGACgACCAGAa (31) ^QNAHRKT (55) DNSTRIK (74) ^DRSNLSR (92) HLCCLGR (69) ^DRSNLSR (92) TSANLSR (130)
85072 aGAGGGGGCGAGCGACCGAg (32) ^QRNHRTT (56) DRSNLTR (75) MSCCRSA (81) RSADLSR (100) RSAHLSR (40) TSANLSR (130)
85073 aGAGGGGGCGAGCGACCGAg (32) ^QRNHRTT (56) DRSNLTR (75) ^MSCCRSA (93) RSADLSR (100) RSAHLSR (40) TSANLSR (130)
85074 aGAGGGGGCGAGCGACCGAg (32) ^QRNHRTT (56) DRSNLTR (75) ^MSCCRSA (93) RSADLSR (100) ^RSAHLSR (117) TSANLSR (130)
85083 cGTCGCGGCGCTCgGTCGCTc (33) ^QSSDLSR (57) DRSALAR (76) ^DRSYRNT (94) RRSDLKR (109) ^RSADLTR (118) DRSALAR (76)
85099 cTGCGCTGCAGCCcGCACGCa (34) ^DSSTRKT (58) QSATRTK (77) ERGTLAR (39) QSGDLTR (99) QSSDLSR (51) AASNRSK (131)
85100 cTGCGCTGCAGCCcGCACGCa (34) ^DSSTRKT (58) QSATRTK (77) ^ERGTLAR (95) QSGDLTR (99) QSSDLSR (51) AASNRSK (131)
85126 cGTCGAAtGGCCACTCCCAGt (35) ^RSDNLSQ (59) ASNDRKK (78) YDYGRYT (90) DRSHLAR (70) QSGNLAR (85) DRSALAR (76)
85127 cGTCGAAtGGCCACTCCCAGt (35) ^RSDNLSQ (59) ASNDRKK (78) ^YDYGRYT (96) DRSHLAR (70) QSGNLAR (85) DRSALAR (76)
85128 cGTCGAAtGGCCACTCCCAGt (35) ^RSDNLSQ (59) ASNDRKK (78) ^YDYGRYT (96) DRSHLAR (70) ^QSGNLAR (119) DRSALAR (76)
85219 gTACCTGtGGATCTAAACGGg (36) ^RSDHLSE (60) QSNHRKT (79) VYEGLKK (91) QSGHLSR (67) RSDVLSE (116) DRSNRIK (132)
下表 2 列出本發明之33個示例性ZFP-TF之完整胺基酸序列，其中該等DNA結合識別螺旋序列以粗體字表示，模組內及模組間連接子為加底線。R(-5)Q主鏈突變以粗體字且加底線表示。該等序列之序列表編號(SEQ ID NO: #)顯示於圓括號中。表 2 示例性 ZFP-TF 序列
ZFP-TF 胺基酸序列
SBS-82090 (133) MAPKKKRKVGVPAAMAERPFQCRICMRNFSQSGHLAR HIRTHTGEKPFA CDICGRKFAQRKDLTQ HTKIHTHPRAPIPKPFQ CRICMRNFSRSDHLSR HIRTHTGEKPFA CDICGRKFATRDGLR QHTKIHTGSQKPFQC RICMRNFSRSANLAR HIRTHTGEKPFA CDICGRKFADSSDRKK HTKIHLRQKDAARGSGG DAKSLTAWSRTLVTFKDVFVDFTREEWKLLDTAQQIVYRNVMLENYKNLVSLGYQLTKPDVILRLEKGEEPWLVEREIHQETHPDSETAFEIKSSVRS
SBS-82092 (134) MAPKKKRKVGVPAAMAERPFQCRICMRNFSRSDNLST HIRTHTGEKPFA CDICGRKFARSDNLTR HTKIHTGSQKPFQ CRICMRNFSDRSDLSR HIRTHTGEKPFA CDICGRKFARREHLRA HTKIHTGSQKPFQ CRICMRNFSTSGNLTR HIRTHTGEKPFA CDICGRKFAQRSHLSD HTKIHLRQKDAARGSGG DAKSLTAWSRTLVTFKDVFVDFTREEWKLLDTAQQIVYRNVMLENYKNLVSLGYQLTKPDVILRLEKGEEPWLVEREIHQETHPDSETAFEIKSSVRS
SBS-82107 (135) MAPKKKRKVGVPAAMAERPFQCRICMRNFSERGTLAR HIRTHTGEKPFA CDICGRKFAMACCRYA HTKIHTGSQKPFQ CRICMRNFSRSADLTR HIRTHTGEKPFA CDICGRKFAQSGDLTR HTKIHTHPRAPIPKPFQ CRICMRNFSQSGNLAR HIRTHTGEKPFA CDICGRKFARQEHRVA HTKIHLRQKDAARGSGG DAKSLTAWSRTLVTFKDVFVDFTREEWKLLDTAQQIVYRNVMLENYKNLVSLGYQLTKPDVILRLEKGEEPWLVEREIHQETHPDSETAFEIKSSVRS
SBS-82110 (136) MAPKKKRKVGVPAAMAERPFQCRICMRNFSRSAHLSR HIRTHTGEKPFA CDICGRKFADRSDLSR HTKIHTGSQKPFQ CRICMRNFSMSCCRSA HIRTHTGEKPFA CDICGRKFARSADLSR HTKIHTGSQKPFQ CRICMRNFSQSGDLTR HIRTHTGEKPFA CDICGRKFAQRSNLNI HTKIHLRQKDAARGSGG DAKSLTAWSRTLVTFKDVFVDFTREEWKLLDTAQQIVYRNVMLENYKNLVSLGYQLTKPDVILRLEKGEEPWLVEREIHQETHPDSETAFEIKSSVRS   
SBS-82135 (137) MAPKKKRKVGVPAAMAERPFQCRICMRNFSQNAHRKT HIRTHTGEKPFA CDICGRKFADNSTRIK HTKIHTHPRAPIPKPFQ CRICMRNFSDRSNLSR HIRTHTGEKPFA CDICGRKFAHLCCLGR HTKIHTGSQKPFQ CRICMRNFSDRSNLSR HIRTHTGEKPFACDICGRKFATSANLSR HTKIHLRQKDAARGSGG DAKSLTAWSRTLVTFKDVFVDFTREEWKLLDTAQQIVYRNVMLENYKNLVSLGYQLTKPDVILRLEKGEEPWLVEREIHQETHPDSETAFEIKSSVRS
SBS-82136 (138) MAPKKKRKVGVPAAMAERPFQCRICMRNFSRSDNLSV HIRTHTGEKPFA CDICGRKFAASWTLTQ HTKIHTGSQKPFQ CRICMRNFSDRSDLSR HIRTHTGEKPFA CDICGRKFADRSNLTR HTKIHTGSQKPFQ CRICMRNFSDRSHLTR HIRTHTGEKPFA CDICGRKFADRSNLTR HTKIHLRQKDAARGSGG DAKSLTAWSRTLVTFKDVFVDFTREEWKLLDTAQQIVYRNVMLENYKNLVSLGYQLTKPDVILRLEKGEEPWLVEREIHQETHPDSETAFEIKSSVRS
SBS-82144 (139) MAPKKKRKVGVPAAMAERPFQCRICMRNFSQRNHRTT HIRTHTGEKPFA CDICGRKFADRSNLTR HTKIHTGSQKPFQ CRICMRNFSMSCCRSA HIRTHTGEKPFA CDICGRKFARSADLSR HTKIHTGSQKPFQ CRICMRNFSRSAHLSR HIRTHTGEKPFA CDICGRKFATSANLSR HTKIHLRQKDAARGSGG DAKSLTAWSRTLVTFKDVFVDFTREEWKLLDTAQQIVYRNVMLENYKNLVSLGYQLTKPDVILRLEKGEEPWLVEREIHQETHPDSETAFEIKSSVRS
SBS-82148 (140) MAPKKKRKVGVPAAMAERPFQCRICMRNFSLRHHLTR HIRTHTGEKPFA CDICGRKFAVAEYRYK HTKIHTGSQKPFQ CRICMRNFSRSDNLSV HIRTHTGEKPFA CDICGRKFARHSHLTS HTKIHTGSQKPFQ CRICMRNFSRSDTLSA HIRTHTGEKPFA CDICGRKFARSADLSR HTKIHLRQKDAARGSGG DAKSLTAWSRTLVTFKDVFVDFTREEWKLLDTAQQIVYRNVMLENYKNLVSLGYQLTKPDVILRLEKGEEPWLVEREIHQETHPDSETAFEIKSSVRS
SBS-82150 (141) MAPKKKRKVGVPAAMAERPFQCRICMRNFSQSSDLSR HIRTHTGEKPFA CDICGRKFADRSALAR HTKIHTHPRAPIPKPFQ CRICMRNFSDRSYRNT HIRTHTGEKPFA CDICGRKFARRSDLKR HTKIHTGSQKPFQ CRICMRNFSRSADLTR HIRTHTGEKPFA CDICGRKFADRSALAR HTKIHLRQKDAARGSGG DAKSLTAWSRTLVTFKDVFVDFTREEWKLLDTAQQIVYRNVMLENYKNLVSLGYQLTKPDVILRLEKGEEPWLVEREIHQETHPDSETAFEIKSSVRS
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SBS-85126 (162) MAPKKKRKVGVPAAMAERPFQCRICM Q NFSRSDNLSQ HIRTHTGEKPFA CDICGRKFAASNDRKK HTKIHTGSQKPFQ CRICMRNFSYDYGRYT HIRTHTGEKPFA CDICGRKFADRSHLAR HTKIHTHPRAPIPKPFQ CRICMRNFSQSGNLAR HIRTHTGEKPFA CDICGRKFADRSALAR HTKIHLRQKDAARGSGG DAKSLTAWSRTLVTFKDVFVDFTREEWKLLDTAQQIVYRNVMLENYKNLVSLGYQLTKPDVILRLEKGEEPWLVEREIHQETHPDSETAFEIKSSVRS
SBS-85127 (163) MAPKKKRKVGVPAAMAERPFQCRICM Q NFSRSDNLSQ HIRTHTGEKPFA CDICGRKFAASNDRKK HTKIHTGSQKPFQ CRICM Q NFSYDYGRYT HIRTHTGEKPFA CDICGRKFADRSHLAR HTKIHTHPRAPIPKPFQ CRICMRNFSQSGNLAR HIRTHTGEKPFA CDICGRKFADRSALAR HTKIHLRQKDAARGSGG DAKSLTAWSRTLVTFKDVFVDFTREEWKLLDTAQQIVYRNVMLENYKNLVSLGYQLTKPDVILRLEKGEEPWLVEREIHQETHPDSETAFEIKSSVRS
SBS-85128 (164) MAPKKKRKVGVPAAMAERPFQCRICM Q NFSRSDNLSQ HIRTHTGEKPFA CDICGRKFAASNDRKK HTKIHTGSQKPFQ CRICM Q NFSYDYGRYT HIRTHTGEKPFA CDICGRKFADRSHLAR HTKIHTHPRAPIPKPFQ CRICM Q NFSQSGNLAR HIRTHTGEKPFA CDICGRKFADRSALAR HTKIHLRQKDAARGSGG DAKSLTAWSRTLVTFKDVFVDFTREEWKLLDTAQQIVYRNVMLENYKNLVSLGYQLTKPDVILRLEKGEEPWLVEREIHQETHPDSETAFEIKSSVRS
SBS-85219 (165) MAPKKKRKVGVPAAMAERPFQCRICM Q NFSRSDHLSE HIRTHTGEKPFA CDICGRKFAQSNHRKT HTKIHTGSQKPFQ CRICMRNFSVYEGLKK HIRTHTGEKPFA CDICGRKFAQSGHLSR HTKIHTHPRAPIPKPFQ CRICMRNFSRSDVLSE HIRTHTGEKPFA CDICGRKFADRSNRIK HTKIHLRQKDAARGSGG DAKSLTAWSRTLVTFKDVFVDFTREEWKLLDTAQQIVYRNVMLENYKNLVSLGYQLTKPDVILRLEKGEEPWLVEREIHQETHPDSETAFEIKSSVRS
圖 1 說明藉由工程改造6指鋅指蛋白轉錄因子(ZFP-TF)特異性靶向SNCA 基因，該因子識別該基因中之18個鹼基對。ZFP-TF結合至該基因導致減少之SNCA 轉錄，此繼而導致減少之SNCA mRNA及α-突觸核蛋白含量。該圖揭示SEQ ID NO: 20。
圖 2A 為說明人類SNCA 基因之基因組結構的圖。該基因具有7個外顯子(2個非蛋白編碼及5個蛋白編碼)，且各轉錄本含有5個內含子。存在三個轉錄起始位點(TSS)，稱為TSS 1、TSS 2a及TSS 2b，其分別產生以非編碼外顯子1、2a及2b開始之轉錄本。所有轉錄本中之第一蛋白質編碼外顯子為外顯子3。
圖 2B 為說明人類SNCA 基因之上游基因組區域的圖。SNCA mRNA序列顯示為紅色條。該基因下方簇中的小三角形描繪SNCA 基因中藉由本文所例示的416個代表性ZFP-TF所靶向之區域。該圖亦顯示ZFP-TF中之各者對減少用ZFP-TF mRNA轉染後24小時收穫的SK-N-MC人類神經母細胞瘤細胞中人類SNCA mRNA表現之影響。藉由RT-qPCR測量信使RNA含量。標準化SNCA 表現程度由梯度條「SNCA mRNA」指示。最深(紅色)顏色表示減少100%。最淺顏色(白色)表示減少0%。將RT-qPCR數據標準化為兩個管家基因(ATP5B 及EIF4A2 )之mRNA含量之平均值。指向右側的三角形指示ZFP-TF結合該基因之有義股。指向左側的三角形指示ZFP-TF結合該基因之反義股。
圖 3A 至 3E 為顯示來自如本文所述的416個ZFP-TF文庫之篩選結果的圖。篩選係在SK-N-MC人類神經上皮細胞系中進行。各圖中的y軸係標準化為兩個管家基因(EIF4A2 及ATP5B )之幾何平均值且在用編碼不同ZFP-TF之RNA轉染後24小時評估之α-突觸核蛋白mRNA表現。RNA劑量自左至右增加(3、10、30、100、300及1,000 ng)。條線代表四次技術重複之平均值及誤差條代表標準偏差。圖表下方的數字為ZFP-TF之內部參考編號。
圖 4 為說明人類SNCA 基因之上游基因組區域的圖。SNCA mRNA序列顯示為紅色條。該基因下方簇中的小三角形描繪SNCA 基因中藉由50個具有1、2或3個磷酸鹽接觸突變之代表性ZFP-TF靶向之區域。該圖亦顯示ZFP-TF中之各者對減少用ZFP-TF mRNA轉染後24小時收穫的SK-N-MC人類神經母細胞瘤細胞中人類SNCA mRNA表現之影響。藉由RT-qPCR測量信使RNA含量。標準化SNCA 表現程度由梯度條「SNCA mRNA」指示。最深(紅色)顏色表示減少100%。最淺顏色(白色)表示減少0%。將RT-qPCR數據標準化為兩個管家基因(ATP5B 及EIF4A2 )之mRNA含量之平均值。指向右側的三角形指示ZFP-TF結合該基因之有義股。指向左側的三角形指示ZFP-TF結合該基因之反義股。
圖 5 顯示來自50個具有1、2或3個磷酸鹽接觸突變之代表性ZFP-TF的文庫之例示性篩選結果。篩選係在SK-N-MC人類神經上皮細胞系中進行。各圖中的y軸係標準化為兩個管家基因(EIF4A2 及ATP5B )之幾何平均值且在用編碼不同ZFP-TF之RNA轉染後24小時評估之α-突觸核蛋白mRNA表現。RNA劑量自左至右增加(3、10、30、100、300及1,000 ng)。條線代表四次技術重複之平均值及誤差條代表標準偏差。圖表下方的數字為ZFP-TF之內部參考編號。
圖 6A 及6B 為圖之分圖，該等圖顯示，40個α-突觸核蛋白ZFP-TF展現在SK-N-MC人類神經母細胞瘤細胞及人類iPSC衍生之神經元中之一系列α-突觸核蛋白抑制活性。描述於表 1 及 2 中之二十個例示性ZFP-TF顯示於分圖A中。於圖 3A 至 3E 中表徵但未於表 1 及2 中描述之例示性ZFP-TF顯示於分圖B中。y軸係經標準化為兩個管家基因(ATP5B 及EIF4A2 )且在用編碼不同ZFP-TF之RNA轉染SK-N-MC細胞後24小時或在用編碼不同ZFP-TF之AAV6轉導iPSC衍生之神經元後28天進行評估之α-突觸核蛋白mRNA表現。在x軸指示所使用的RNA或AAV6的量，其中RNA (3、10、30、100、300及1,000 ng)或AAV6 (1E3、3E3、1E4、3E4、1E5及3E5)劑量自左至右增加。藍色及橙色條線代表四次技術重複之平均值及誤差條代表標準偏差。滴定標度之放大形式顯示於圖式底部。
圖 7A 至 7D 為火山圖之分圖，該等火山圖描繪40個α-突觸核蛋白ZFP-TF在小鼠初級神經元(A及B)及人類iPSC衍生之神經元(C及D)中之脫靶活性。為便於參考，在相應ZFP-TF之火山圖附近顯示說明ZFP-TF在人類iPSC衍生之神經元中之抑制活性的圖 6A-6B 之條形圖。火山圖概述微陣列資料，其顯示轉導後7天小鼠初級神經元(A及B)或轉導後19天人類iPSC衍生之神經元(C及D)之總轉錄本(transcriptome)之變化。在火山圖中，以紅色及綠色顯示的數字分別指示下調及上調之脫靶基因之計數。黃色圓圈指示人類α-突觸核蛋白。綠色圓圈(各火山圖的右側)代表顯著上調＞2倍之基因。紅色圓圈代表顯著下調＞2倍之基因。
圖 8A 及8B 為圖之分圖，該圖顯示雌性PAC突觸核蛋白小鼠之不同腦區域中之(A) ZFP-TF及α-突觸核蛋白mRNA表現程度或(B)神經膠質原纖維酸性蛋白(GFAP)、電離鈣結合承接分子1 (IBA1)及NeuN之mRNA表現程度(Kuo等人，Hum Mol Genet. (2010) 19(9):1633-50)。在紋狀體的兩個位點對該動物雙側投與編碼所指示測試製品或媒劑之AAV9。將所有基因表現數據標準化為3個管家基因(ATP5B 、EIF4A2 及GAPDH )之幾何平均值。y軸為所指示基因之mRNA表現程度及x軸為腦區域。紅色正方形指示經投與ZFP-TF 82195的n = 3隻動物之平均表現數據，及綠色三角形指示經投與ZFP-TF 82264的n = 3隻動物之平均表現數據。在圖A中，將α-突觸核蛋白mRNA表現標準化為3隻經媒劑處理之動物之平均值，及ZFP-TF表現在對數標度上以每ng輸入RNA的複本數提供。在圖B中，將所有表現數據標準化為3隻經媒劑處理之動物之平均值。使用單向方差分析(ANOVA)接著進行鄧恩多重比較檢驗(Dunnett’s multiple comparisons test)進行統計分析。* p ＜ 0.05，** p ＜ 0.01，*** p ＜ 0.001，*** p ＜ 0.0001。
Figure 12_A0101_SEQ_0001
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Figure 12_A0101_SEQ_0095

Claims (27)

  1. 一種包含鋅指蛋白(zinc finger protein；ZFP)域及轉錄抑制子域(transcription repressor domain)之融合蛋白，其中該ZFP域結合至人類α-突觸核蛋白基因(SNCA 基因)之靶區域。
  2. 如請求項1之融合蛋白，其中該靶區域係在該SNCA 基因中轉錄起始位點(transcription start site；TSS)之1 kb之內。
  3. 如請求項2之融合蛋白，其中該TSS為TSS 1、TSS 2a或TSS 2b。
  4. 如請求項3之融合蛋白，其中該靶區域係在該SNCA 基因之TSS 1上游500鹼基對之內，在TSS 1下游500鹼基對之內，在TSS 2a上游500鹼基對之內，及/或在TSS 2b下游500鹼基對之內。
  5. 如前述請求項中任一項之融合蛋白，其中該ZFP域包含六個鋅指且該融合蛋白視需要抑制該SNCA 基因之表現至少約40%、75%、90%、95%或99%，而沒有或具有最小可檢測之脫靶結合或活性。
  6. 如前述請求項中任一項之融合蛋白，其中該轉錄抑制子域包含來自人類KOX1之KRAB域胺基酸序列。
  7. 如前述請求項中任一項之融合蛋白，其中該ZFP域係經由肽連接子連接至轉錄抑制子。
  8. 如前述請求項中任一項之融合蛋白，其中該ZFP域包含表1中所示之DNA結合識別螺旋序列。
  9. 如前述請求項中任一項之融合蛋白，其中該ZFP域包含如表1單行中所示之DNA結合識別螺旋序列。
  10. 一種包含如請求項1至9中任一項之融合蛋白之編碼序列之核酸構築體，其中該編碼序列係可以操作方式連接至轉錄調節元件。
  11. 如請求項10之核酸構築體，其中該轉錄調節元件為腦細胞中具有組成性活性或可誘導之哺乳動物啟動子，且其中該啟動子視需要為人類突觸蛋白I啟動子。
  12. 一種包含如請求項10或11之核酸構築體之重組病毒。
  13. 如請求項12之重組病毒，其中該重組病毒為腺相關病毒載體、腺病毒載體或慢病毒載體。
  14. 一種醫藥組合物，其包含如請求項10或11之核酸構築體或如請求項12或13之重組病毒及醫藥上可接受之載劑。
  15. 一種宿主細胞，其包含如請求項10或11之核酸構築體或如請求項12或13之重組病毒。
  16. 如請求項15之宿主細胞，其中該宿主細胞為人類細胞。
  17. 如請求項15之宿主細胞，其中該宿主細胞為腦細胞或多能幹細胞，其中該幹細胞視需要為胚胎幹細胞或誘導型多能幹細胞(inducible pluripotent stem cell；iPSC)。
  18. 一種抑制人類腦細胞中α-突觸核蛋白之表現之方法，該方法包括將如請求項1至9中任一項之融合蛋白，視需要透過引入如請求項10或11之核酸構築體或如請求項12或13之重組病毒引入該細胞中，藉此抑制該細胞中α-突觸核蛋白之表現。
  19. 如請求項18之方法，其中該人類腦細胞為神經元、神經膠質細胞、室管膜細胞或神經上皮細胞。
  20. 如請求項18或19之方法，其中該細胞係在患者腦中，該患者罹患帕金森氏症(Parkinson’s disease)、路易體癡呆(Lewy body dementia)、阿茲海默氏症(Alzheimer’s disease)、多重系統萎縮或另一突觸核蛋白病變或處於發展該等疾病之風險。
  21. 如請求項18至20中任一項之方法，該方法包括將表現該融合蛋白之重組病毒引入該細胞中。
  22. 如請求項21之方法，其中該重組病毒為腺相關病毒(adeno-associated virus；AAV)，視需要係血清型9。
  23. 一種治療患者中突觸核蛋白病變之方法，該方法包括對該患者投與編碼如請求項1至9中任一項之融合蛋白之重組AAV。
  24. 如請求項23之方法，其中該AAV係經由靜脈內、鞘內、腦室內、大池內(intra-cisternal magna)、紋狀體內或黑質內注射或注射至任何腦區域中引入該患者。
  25. 如請求項23或24之方法，其中該突觸核蛋白病變為帕金森氏症、路易體癡呆、阿茲海默氏症或多重系統萎縮。
  26. 如請求項1至9中任一項之融合蛋白、如請求項10或11之核酸構築體、如請求項12或13之重組病毒、如請求項14之醫藥組合物，其係用於如請求項18至25中任一項之方法中。
  27. 一種如請求項1至9中任一項之融合蛋白、如請求項10或11之核酸構築體、如請求項12或13之重組病毒之用途，其用於製造如請求項18至25中任一項之方法中之藥物。
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