CN110195103A

CN110195103A - 一种监测miRNA表达变化报告基因影像探针及其构建方法

Info

Publication number: CN110195103A
Application number: CN201910465699.1A
Authority: CN
Inventors: 王福; 陈思; 王希楠; 郑海锋; 解锦荣; 毛文杰; 郭镔; 施潇蕊
Original assignee: Xidian University
Current assignee: Xidian University
Priority date: 2019-05-30
Filing date: 2019-05-30
Publication date: 2019-09-03
Anticipated expiration: 2039-05-30
Also published as: CN110195103B

Abstract

本发明公开了一种监测miRNA表达变化报告基因影像探针及其构建方法。所述的探针包括pcDNA3.1载体、基因片段A和B以及pG5 luc载体，所述的基因片段A、B按照A‑B顺序与线性化的pcDNA3.1载体重组，所述的片段A由CopT、BD、AD和4xmiR targets序列组成，所述的片段B为CopA，所述的pG5 luc载体包含Fluc基因。本发明的报告基因分子影像探针可以实时监测活体miRNA的表达变化，为活体miRNA表达的动态变化提供了一种实时、无创的监测工具。

Description

一种监测miRNA表达变化报告基因影像探针及其构建方法

技术领域

本发明属于分子生物学和基因工程技术领域，涉及一种监测miRNA表达变化的报告基因影像探针及其构建方法，具体为一种CopT-BD-AD-4x miR targets-CopA/pG5 luc报告基因影像探针系统的构建及其在体分子显像监测。

背景技术

微小RNA(miRNA)是一类由长度约为22个核苷酸组成的小分子单链非编码RNA。它们广泛存在于真核生物中，具有高度保守性及时空特异性，通过与mRNA的3’端非编码区(3’UTR)互补配使mRNA发生降解或干扰其转录后翻译，从而实现对靶基因转录后调控。miRNA参与细胞增殖、凋亡、分化等多种生物学进程，超过30％的基因受到miRNA调控。miRNA与细胞分化密切相关，如miR-9和miR-124a与神经分化过程密切相关，miR-1和miR-133与肌肉分化过程密切相关，并随着分化进程的变化，其表达也会发生变化。

酵母表达质粒转录激活因子的DNA结合结构域(binding domain,BD)和转录激活结构域(activation domain，AD)形成的杂合蛋白可激活pG5 luc载体(该载体含有Fluc基因，购自Promega公司)上游激活序列(UAS)3`端的启动子，启动下游基因表达。CopA是细菌中从repAmRNA前导区的一段互补链转录而来，长度约90nt，有2个茎一环(一大一小)，repAmRNA前导区中与之互补的一段序列称为CopT。将CopT和CopA序列插入到mRNA的5’UTR和3’UTR会抑制中间编码序列的翻译。本发明，我明利用COPT、COPA对插入其中间的序列BD-AD的抑制作用及miRNA引导的mRNA序列降解，动态监测miRNA的动态变化。

传统的检测miRNA的方法如测序法PCR、Northern杂交、微阵列芯片、放射性原位杂交等都是体外、破坏性的检测法，这些方法自身有许多局限性，如样本处理过程复杂，均为侵入性的检测方法，不能在体实时动态监测miRNA的表达变化。

本发明运用分子影像手段，通过载体报告基因系统在活体中的稳定表达，通过抑制RNA二级结构的形成，结合双酵母杂交系统无创、连续的提供了活体实时、动态的miRNA表达变化信息，并通过荧光强度进行定量研究，获得的数据与常规研究手段所获得的数据比较，更加接近机体的真实情况。实现实时、动态监测miRNA的表达变化。为利用酵母双杂交系统监测miRNA的动态变化提供了一种技术思路，同时为临床深入探索与miRNA相关的疾病治疗、优化与此相关的治疗方案和评估疗效起着关键作用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是监测miRNA表达变化的报告基因影像探针及其构建方法，提供了一种CopT-BD-AD-4x miR targets-CopA/pG5 luc报告基因影像探针系统，利用CopT-CopA对中间编码序列的翻译抑制作用，结合酵母双杂交系统在体监测miRNA表达变化。

本发明具体通过以下技术方案实现：

一种监测miRNA表达变化的报告基因影像探针，所述的探针包括pcDNA3.1载体、基因片段A和B以及pG5 luc载体，所述的基因片段A、B按照A-B顺序与线性化的pcDNA3.1载体重组，所述的片段A由CopT、BD、AD和4xmiR targets序列组成，所述的片段B为CopA，所述的pG5 luc载体包含Fluc基因。

所述的片段A的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的片段B的核苷酸序列如SEQID NO.2所示。

本发明所述的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

在本发明的另一方面，提供了上述组成型剪接报告基因影像探针的制备方法，包括以下步骤：

1)用NheI和HindIII酶切载体pcDNA3.1，使其线性化；

2)PCR扩增A、B片段；

3)通过基因重组技术将各个片段按A-B顺序与线性化的pcDNA3.1载体重组；

4)重组载体经转化、提取质粒、酶切鉴定，获得CopT-BD-AD-4x miR targets-CopA载体。

5)CopT-BD-AD-4x miR targets-CopA载体作用于pG5 luc载体，获得CopT-BD-AD-4x miR targets-CopA/pG5 luc报告基因探针系统。

步骤(2)中扩增得到的基因片段核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

所述的片段A由CopT、BD、AD和4xmiR targets序列组成，所述的片段B为CopA，所述的pG5 luc载体包含Fluc基因。

本发明的有益效果为：

本发明构建了一种CopT-BD-AD-4x miR targets-CopA/pG5 luc报告基因显像系统，由于其能够很好地在生物体内表达，具有以下优点：

(1)为监测活体miRNA的动态变化提供了一种实时、无创的监测工具。

(2)克服了传统方法体外含量分析可能与体内实际作用出现偏差的不足。

(3)构建基于报告基因的显像系统用于监测miRNA的定量研究，有着重要的意义，为miRNA的动态变化提供了有效的监测工具。

附图说明

图1是本发明载体CopT-BD-AD-4x miR targets-CopA结构图

图2是本发明分子探针构建示意图；

图3是本发明不同浓度miR-124a作用下报告基因活性监测；

图4是本发明CopT-BD-AD-miR124a-CopA诱导分化实验。

具体实施方式

下面将结合本发明具体的实施例，对本发明技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明提供了一种CopT-BD-AD-4x miR targets-CopA/pG5 luc报告基因影像探针的构建方法，包括以下步骤：(1)用NheI/HindIII双酶切载体pCDNA3.1(+),使其线性化；(2)PCR扩增CopT、BD、AD、4xmiR targets和CopA片段；(3)通过基因重组技术将上述各个片段按照CopT-BD-AD-4x miR targets-CopA顺序与线性化的pCDNA3.1(+)载体重组；(4)重组质粒经转化、质粒提取、酶切鉴定，获得CopT-BD-AD-4x miR targets-CopA载体，(5)CopT-BD-AD-4x miR targets-CopA载体作用于pG5 luc载体，获得CopT-BD-AD-4x miR targets-CopA/pG5 luc报告基因探针系统。

载体CopT-BD-AD-4x miR targets-CopA结构如图1。载体pG5 luc购自Promega公司。

其包含CopT、BD、AD、4xmiR targets和CopA片段，构建示意图如图2。

该分子探针的作用原理为：当细胞中不存在目的miR124a时，CopT RNA与CopARNA形成复合物，由于空间位阻的关系，不能使BD/AD激活上游激活序列(UAS)的下游启动子，从而不能使启动子下游基因Fluc得到转录；当细胞中存在目的miR124a时，目的miR124a会结合到4x miR124a靶序列上，CopAmRNA分子的裂解导致其快速降解，使4xmiR124a靶序列被降解，CopT与CopA不能形成复合物，不会形成空间位阻，BD/AD可激活pG5 luc载体的上游激活序列(UAS)的下游启动子，启动子下游基因Fluc得到转录，使Fluc表达，产生可以检测的荧光信号。

实施例1 CopT-BD-AD-4x miR targets-CopA/pG5 luc报告基因合成

1.1实验材料

1.1.1主要仪器

PCR扩增仪：北京东胜创新生物科技有限公司；电泳仪：北京君意东方电泳设备公司；Genosens 800凝胶成像系统：上海勤翔科技有限公司。

1.1.2酶和试剂

1.1.3实验所用溶液

LB培养基：10g Nacl，10g胰蛋白胨，5g酵母提取物溶于1L双蒸水，高压灭菌。

琼脂糖凝胶制备：5.6g琼脂糖，置于500ml锥形瓶，加入1×TAE 480ml，加热完全溶解后再冷却50-60℃，倒入事先准备好的制胶板中。

TAE琼脂糖凝胶电泳液：50×TAE贮存液配置：242g Tris，57.1ml乙酸，37.2gNa₂EDTA.2H₂O溶于1L水，并调PH至8.0。

1×TAE：电泳时将50×TAE配置成1×工作液使用。

2×上样缓冲液：0.5mol/L(PH6.8)Tris-Hcl 2ml，甘油2ml，20％SDS(W/V)2ml，0.1％溴酚蓝0.5mlβ-巯基乙醇1.0ml，双蒸水2.5ml，室温存放备用。

1.1.4实验所用菌株和载体

菌株：XL10-gold。

载体:pCDNA3.1(+)。

1.2实验过程

1.2.1实验方案设计及引物合成

根据全基因序列，合成引物进行PCR扩增。本实验中所使用的所有引物均由上海捷瑞生物工程有限公司引物合成部合成。

1.2.2 PCR扩增

A、B片段合成：将A片段合成的1-38、r条引物，B片段合成的a-f条引物每条吸5ul混在一起，震匀，然后吸5ul混好的引物+25ul Pfu–MasterMix+A、B的1和R首尾引物各2UL+H₂O16ul。做成50ul体系上PCR仪反应扩增。

反应体系为(25ul)：1号引物2ul，r号引物2ul，混好的引物5ul，ddH₂O 16ul。

引物信息：

反应条件为：

其中2-4进行20个循环。

反应结束后，1.2％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，并回收，并进行下一步反应，直至做出全长基因，序列如SEQ ID NO.3所示。

1.2.3克隆

30ul，150ng/ul待切的载体，NheI/HindIII各1ul酶，5ul Buffer，加水补齐至50ul体系，放入恒温培养培养箱2-3h后，回收所需的载体骨架备用。

将上述PCR扩增得到的基因全长PCR序列和载体各4ul，加同源重组酶重组1.4ul，同源重组酶Buffer 1.2ul，混匀，室温放置45min，立即转化挑取单克隆进行鉴定测序，测序结果如SEQ ID NO.5所示。

获得CopT-BD-AD-4x miR targets-CopA/pG5 luc探针，其包含CopT、BD-AD、4xmiR targets、CopA和载体pG5 luc。当有miRNA表达时，miRNA能够与其4x miR targets结合使CopA产生降解，从而解除CopT-CopA形成的二级结构对BD/AD的抑制作用，使BD/AD表达量升高，启动pG5 luc载体上的Fluc表达增高。

荧光素酶催化底物形成荧光的强度能够反映miRNA的含量变化。本发明的分子影像探针可以实时监测体内miRNA的表达变化，克服了目前常用的检测手段的有创、操作繁琐、不能提供miRNA完整动态变化的缺陷,为在体miRNA生成过程的发生发展提供了有效的监测工具。

实施例2 CopT-BD-AD-4x miR targets-CopA/pG5 luc报告基因影像探针在体分子显像监测

2.1实验材料

2.1.1主要仪器

Glomax-20/20Luminometer，美国Promega公司。

2.1.2酶和试剂

2.2实验过程

2.2.1 miR-124a作用下CopT-BD-AD-4x miR targets-CopA荧光活性检测

24孔板培养293细胞，待细胞汇集到80％时，使用Lipofectamine 2000，将0.25μg的CopT-BD-AD-CopA质粒DNA、0.25μg pG5 luc质粒DNA与miR-124a共转染293细胞，miR-124a的浓度分别是0nM、10nM、20nM、40nM、80nM。12小时后收集细胞，用100μl/孔细胞裂解液裂解细胞。取10μl裂解后的液体，加入10μl的luciferin，使用Glomax-20/20Luminometer进行荧光强度测定。

2.3结果验证

不同浓度miR-124a作用下报告基因活性监测如图3所示，当miRNA增大时，荧光素酶表达增多，催化底物残剩的荧光信号增强，并呈现出浓度依耐性。

CopT-BD-AD-miR124a-CopA诱导分化实验如图4所示，随着分化进程的加深，miRNA的表达含量增多，启动荧光探针产生的荧光信号增强，即本发明构建的荧光探针系统能够进行miRNA检测。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

序列表

<110> 西安电子科技大学

<120> 一种监测miRNA表达变化报告基因影像探针及其构建方法

<160> 49

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1026

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

agcaaaaacc ccgataatct tcttcaactt tggcgagtac gaaaagatta ccggggccca 60

cttaaaccgt atagccaaca attcagctat gcggggagac cggtatgaag ctactgtctt 120

ctatcgaaca agcatgcgat atttgccgac ttaaaaagct caagtgctcc aaagaaaaac 180

cgaagtgcgc caagtgtctg aagaacaact gggagtgtcg ctactctccc aaaaccaaaa 240

ggtctccgct gactagggca catctgacag aagtggaatc aaggctagaa agactggaac 300

agctatttct actgattttt cctcgagaag accttgacat gattttgaaa atggattctt 360

tacaggatat aaaagcattg ttaacaggat tatttgtaca agataatgtg aataaagatg 420

ccgtcacaga tagattggct tcagtggaga ctgatatgcc tctaacattg agacagcata 480

gaataagtgc gacatcatca tcggaagaga gtagtaacaa aggtcaaaga cagttgactg 540

tatcgccaaa aaagaagaga aaggtagatg aattcccggg gatctcgacg gcccccccga 600

ccgatgtcag cctgggggac gagctccact tagacggcga ggacgtggcg atggcgcatg 660

ccgacgcgct agacgatttc gatctggaca tgttggggga cggggattcc ccgggtccgg 720

gatcgccagg gatccgtcga cttgacgcgt tgatatcatc tagagcggcc gcaggtacct 780

gaggcgcgcc aacttgttta ttgcagctta taatggttac aaataaagca atagcatcac 840

aaatttcaca aataaagcat ttttttcact gcattctagt tgtggtttgt ccaaactcat 900

caatgtatct taatcgattg gcattcaccg cgtgccttaa tagtatggca ttcaccgcgt 960

gccttaatag tatggcattc accgcgtgcc ttaatagtat ggcattcacc gcgtgcctta 1020

atagta 1026

<210> 2

<211> 90

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tagctgaatt gttggctata cggtttaagt gggccccggt aatcttttcg tactcgccaa 60

agttgaagaa gattatcggg gtttttgctt 90

<210> 3

<211> 1088

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

agcaaaaacc ccgataatct tcttcaactt tggcgagtac gaaaagatta ccggggccca 60

cttaaaccgt atagccaaca attcagctat gcggggagac cggtatgaag ctactgtctt 120

ctatcgaaca agcatgcgat atttgccgac ttaaaaagct caagtgctcc aaagaaaaac 180

cgaagtgcgc caagtgtctg aagaacaact gggagtgtcg ctactctccc aaaaccaaaa 240

ggtctccgct gactagggca catctgacag aagtggaatc aaggctagaa agactggaac 300

agctatttct actgattttt cctcgagaag accttgacat gattttgaaa atggattctt 360

tacaggatat aaaagcattg ttaacaggat tatttgtaca agataatgtg aataaagatg 420

ccgtcacaga tagattggct tcagtggaga ctgatatgcc tctaacattg agacagcata 480

gaataagtgc gacatcatca tcggaagaga gtagtaacaa aggtcaaaga cagttgactg 540

tatcgccaaa aaagaagaga aaggtagatg aattcccggg gatctcgacg gcccccccga 600

ccgatgtcag cctgggggac gagctccact tagacggcga ggacgtggcg atggcgcatg 660

ccgacgcgct agacgatttc gatctggaca tgttggggga cggggattcc ccgggtccgg 720

gatcgccagg gatccgtcga cttgacgcgt tgatatcatc tagagcggcc gcaggtacct 780

gaggcgcgcc aacttgttta ttgcagctta taatggttac aaataaagca atagcatcac 840

aaatttcaca aataaagcat ttttttcact gcattctagt tgtggtttgt ccaaactcat 900

caatgtatct taatcgattg gcattcaccg cgtgccttaa tagtatggca ttcaccgcgt 960

gccttaatag tatggcattc accgcgtgcc ttaattaata gctgaattgt tggctatacg 1020

gtttaagtgg gccccggtaa tcttttcgta ctcgccaaag ttgaagaaga ttatcggggt 1080

ttttgctt 1088

<210> 4

<211> 6506

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg 60

ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg 120

cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc 180

ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgcg atgtacgggc cagatatacg cgttgacatt 240

gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata 300

tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc 360

cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc 420

attgacgtca atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt 480

atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt 540

atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca 600

tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg 660

actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc 720

aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg 780

gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctct ctggctaact agagaaccca 840

ctgcttactg gcttatcgaa attaatacga ctcactatag ggagacccaa gctggctagc 900

agcaaaaacc ccgataatct tcttcaactt tggcgagtac gaaaagatta ccggggccca 960

cttaaaccgt atagccaaca attcagctat gcggggagac cggtatgaag ctactgtctt 1020

ctatcgaaca agcatgcgat atttgccgac ttaaaaagct caagtgctcc aaagaaaaac 1080

cgaagtgcgc caagtgtctg aagaacaact gggagtgtcg ctactctccc aaaaccaaaa 1140

ggtctccgct gactagggca catctgacag aagtggaatc aaggctagaa agactggaac 1200

agctatttct actgattttt cctcgagaag accttgacat gattttgaaa atggattctt 1260

tacaggatat aaaagcattg ttaacaggat tatttgtaca agataatgtg aataaagatg 1320

ccgtcacaga tagattggct tcagtggaga ctgatatgcc tctaacattg agacagcata 1380

gaataagtgc gacatcatca tcggaagaga gtagtaacaa aggtcaaaga cagttgactg 1440

tatcgccaaa aaagaagaga aaggtagatg aattcccggg gatctcgacg gcccccccga 1500

ccgatgtcag cctgggggac gagctccact tagacggcga ggacgtggcg atggcgcatg 1560

ccgacgcgct agacgatttc gatctggaca tgttggggga cggggattcc ccgggtccgg 1620

gatcgccagg gatccgtcga cttgacgcgt tgatatcatc tagagcggcc gcaggtacct 1680

gaggcgcgcc aacttgttta ttgcagctta taatggttac aaataaagca atagcatcac 1740

aaatttcaca aataaagcat ttttttcact gcattctagt tgtggtttgt ccaaactcat 1800

caatgtatct taatcgattg gcattcaccg cgtgccttaa tagtatggca ttcaccgcgt 1860

gccttaatag tatggcattc accgcgtgcc ttaattaata gctgaattgt tggctatacg 1920

gtttaagtgg gccccggtaa tcttttcgta ctcgccaaag ttgaagaaga ttatcggggt 1980

ttttgcttaa gcttggtacc gagctcggat ccactagtcc agtgtggtgg aattctgcag 2040

atatccagca cagtggcggc cgctcgagtc tagagggccc gtttaaaccc gctgatcagc 2100

ctcgactgtg ccttctagtt gccagccatc tgttgtttgc ccctcccccg tgccttcctt 2160

gaccctggaa ggtgccactc ccactgtcct ttcctaataa aatgaggaaa ttgcatcgca 2220

ttgtctgagt aggtgtcatt ctattctggg gggtggggtg gggcaggaca gcaaggggga 2280

ggattgggaa gacaatagca ggcatgctgg ggatgcggtg ggctctatgg cttctgaggc 2340

ggaaagaacc agctggggct ctagggggta tccccacgcg ccctgtagcg gcgcattaag 2400

cgcggcgggt gtggtggtta cgcgcagcgt gaccgctaca cttgccagcg ccctagcgcc 2460

cgctcctttc gctttcttcc cttcctttct cgccacgttc gccggctttc cccgtcaagc 2520

tctaaatcgg gggctccctt tagggttccg atttagtgct ttacggcacc tcgaccccaa 2580

aaaacttgat tagggtgatg gttcacgtag tgggccatcg ccctgataga cggtttttcg 2640

ccctttgacg ttggagtcca cgttctttaa tagtggactc ttgttccaaa ctggaacaac 2700

actcaaccct atctcggtct attcttttga tttataaggg attttgccga tttcggccta 2760

ttggttaaaa aatgagctga tttaacaaaa atttaacgcg aattaattct gtggaatgtg 2820

tgtcagttag ggtgtggaaa gtccccaggc tccccagcag gcagaagtat gcaaagcatg 2880

catctcaatt agtcagcaac caggtgtgga aagtccccag gctccccagc aggcagaagt 2940

atgcaaagca tgcatctcaa ttagtcagca accatagtcc cgcccctaac tccgcccatc 3000

ccgcccctaa ctccgcccag ttccgcccat tctccgcccc atggctgact aatttttttt 3060

atttatgcag aggccgaggc cgcctctgcc tctgagctat tccagaagta gtgaggaggc 3120

ttttttggag gcctaggctt ttgcaaaaag ctcccgggag cttgtatatc cattttcgga 3180

tctgatcaag agacaggatg aggatcgttt cgcatgattg aacaagatgg attgcacgca 3240

ggttctccgg ccgcttgggt ggagaggcta ttcggctatg actgggcaca acagacaatc 3300

ggctgctctg atgccgccgt gttccggctg tcagcgcagg ggcgcccggt tctttttgtc 3360

aagaccgacc tgtccggtgc cctgaatgaa ctgcaggacg aggcagcgcg gctatcgtgg 3420

ctggccacga cgggcgttcc ttgcgcagct gtgctcgacg ttgtcactga agcgggaagg 3480

gactggctgc tattgggcga agtgccgggg caggatctcc tgtcatctca ccttgctcct 3540

gccgagaaag tatccatcat ggctgatgca atgcggcggc tgcatacgct tgatccggct 3600

acctgcccat tcgaccacca agcgaaacat cgcatcgagc gagcacgtac tcggatggaa 3660

gccggtcttg tcgatcagga tgatctggac gaagagcatc aggggctcgc gccagccgaa 3720

ctgttcgcca ggctcaaggc gcgcatgccc gacggcgagg atctcgtcgt gacccatggc 3780

gatgcctgct tgccgaatat catggtggaa aatggccgct tttctggatt catcgactgt 3840

ggccggctgg gtgtggcgga ccgctatcag gacatagcgt tggctacccg tgatattgct 3900

gaagagcttg gcggcgaatg ggctgaccgc ttcctcgtgc tttacggtat cgccgctccc 3960

gattcgcagc gcatcgcctt ctatcgcctt cttgacgagt tcttctgagc gggactctgg 4020

ggttcgaaat gaccgaccaa gcgacgccca acctgccatc acgagatttc gattccaccg 4080

ccgccttcta tgaaaggttg ggcttcggaa tcgttttccg ggacgccggc tggatgatcc 4140

tccagcgcgg ggatctcatg ctggagttct tcgcccaccc caacttgttt attgcagctt 4200

ataatggtta caaataaagc aatagcatca caaatttcac aaataaagca tttttttcac 4260

tgcattctag ttgtggtttg tccaaactca tcaatgtatc ttatcatgtc tgtataccgt 4320

cgacctctag ctagagcttg gcgtaatcat ggtcatagct gtttcctgtg tgaaattgtt 4380

atccgctcac aattccacac aacatacgag ccggaagcat aaagtgtaaa gcctggggtg 4440

cctaatgagt gagctaactc acattaattg cgttgcgctc actgcccgct ttccagtcgg 4500

gaaacctgtc gtgccagctg cattaatgaa tcggccaacg cgcggggaga ggcggtttgc 4560

gtattgggcg ctcttccgct tcctcgctca ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc 4620

ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa tcaggggata 4680

acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg 4740

cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct 4800

caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa 4860

gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc 4920

tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcata gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt 4980

aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg 5040

ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca acccggtaag acacgactta tcgccactgg 5100

cagcagccac tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct 5160

tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta gaagaacagt atttggtatc tgcgctctgc 5220

tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg 5280

ctggtagcgg tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag 5340

aagatccttt gatcttttct acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag 5400

ggattttggt catgagatta tcaaaaagga tcttcaccta gatcctttta aattaaaaat 5460

gaagttttaa atcaatctaa agtatatatg agtaaacttg gtctgacagt taccaatgct 5520

taatcagtga ggcacctatc tcagcgatct gtctatttcg ttcatccata gttgcctgac 5580

tccccgtcgt gtagataact acgatacggg agggcttacc atctggcccc agtgctgcaa 5640

tgataccgcg agacccacgc tcaccggctc cagatttatc agcaataaac cagccagccg 5700

gaagggccga gcgcagaagt ggtcctgcaa ctttatccgc ctccatccag tctattaatt 5760

gttgccggga agctagagta agtagttcgc cagttaatag tttgcgcaac gttgttgcca 5820

ttgctacagg catcgtggtg tcacgctcgt cgtttggtat ggcttcattc agctccggtt 5880

cccaacgatc aaggcgagtt acatgatccc ccatgttgtg caaaaaagcg gttagctcct 5940

tcggtcctcc gatcgttgtc agaagtaagt tggccgcagt gttatcactc atggttatgg 6000

cagcactgca taattctctt actgtcatgc catccgtaag atgcttttct gtgactggtg 6060

agtactcaac caagtcattc tgagaatagt gtatgcggcg accgagttgc tcttgcccgg 6120

cgtcaatacg ggataatacc gcgccacata gcagaacttt aaaagtgctc atcattggaa 6180

aacgttcttc ggggcgaaaa ctctcaagga tcttaccgct gttgagatcc agttcgatgt 6240

aacccactcg tgcacccaac tgatcttcag catcttttac tttcaccagc gtttctgggt 6300

gagcaaaaac aggaaggcaa aatgccgcaa aaaagggaat aagggcgaca cggaaatgtt 6360

gaatactcat actcttcctt tttcaatatt attgaagcat ttatcagggt tattgtctca 6420

tgagcggata catatttgaa tgtatttaga aaaataaaca aataggggtt ccgcgcacat 6480

ttccccgaaa agtgccacct gacgtc 6506

<210> 5

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

acttagctag cagcaaaaac cccgataatc ttcttcaact ttggcgagta 50

<210> 6

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

taagtgggcc ccggtaatct tttcgtactc gccaaagttg aagaagatta 50

<210> 7

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cgaaaagatt accggggccc acttaaaccg tatagccaac aattcagcta 50

<210> 8

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gtagcttcat accggtctcc ccgcatagct gaattgttgg ctatacggtt 50

<210> 9

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tgcggggaga ccggtatgaa gctactgtct tctatcgaac aagcatgcga 50

<210> 10

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

cttgagcttt ttaagtcggc aaatatcgca tgcttgttcg atagaagaca 50

<210> 11

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

tatttgccga cttaaaaagc tcaagtgctc caaagaaaaa ccgaagtgcg 50

<210> 12

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

tcccagttgt tcttcagaca cttggcgcac ttcggttttt ctttggagca 50

<210> 13

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

ccaagtgtct gaagaacaac tgggagtgtc gctactctcc caaaaccaaa 50

<210> 14

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gatgtgccct agtcagcgga gaccttttgg ttttgggaga gtagcgacac 50

<210> 15

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

aggtctccgc tgactagggc acatctgaca gaagtggaat caaggctaga 50

<210> 16

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

cagtagaaat agctgttcca gtctttctag ccttgattcc acttctgtca 50

<210> 17

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

aagactggaa cagctatttc tactgatttt tcctcgagaa gaccttgaca 50

<210> 18

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

tgtaaagaat ccattttcaa aatcatgtca aggtcttctc gaggaaaaat 50

<210> 19

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

tgattttgaa aatggattct ttacaggata taaaagcatt gttaacagga 50

<210> 20

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

tattcacatt atcttgtaca aataatcctg ttaacaatgc ttttatatcc 50

<210> 21

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

ttatttgtac aagataatgt gaataaagat gccgtcacag atagattggc 50

<210> 22

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

tagaggcata tcagtctcca ctgaagccaa tctatctgtg acggcatctt 50

<210> 23

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

ttcagtggag actgatatgc ctctaacatt gagacagcat agaataagtg 50

<210> 24

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

ctactctctt ccgatgatga tgtcgcactt attctatgct gtctcaatgt 50

<210> 25

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

cgacatcatc atcggaagag agtagtaaca aaggtcaaag acagttgact 50

<210> 26

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

cctttctctt cttttttggc gatacagtca actgtctttg acctttgtta 50

<210> 27

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

gtatcgccaa aaaagaagag aaaggtagat gaattcccgg ggatctcgac 50

<210> 28

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

caggctgaca tcggtcgggg gggccgtcga gatccccggg aattcatcta 50

<210> 29

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

ggcccccccg accgatgtca gcctggggga cgagctccac ttagacggcg 50

<210> 30

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

tcggcatgcg ccatcgccac gtcctcgccg tctaagtgga gctcgtcccc 50

<210> 31

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

aggacgtggc gatggcgcat gccgacgcgc tagacgattt cgatctggac 50

<210> 32

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

ccggggaatc cccgtccccc aacatgtcca gatcgaaatc gtctagcgcg 50

<210> 33

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

atgttggggg acggggattc cccgggtccg ggatcgccag ggatccgtcg 50

<210> 34

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

tctagatgat atcaacgcgt caagtcgacg gatccctggc gatcccggac 50

<210> 35

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

acttgacgcg ttgatatcat ctagagcggc cgcaggtacc tgaggcgcgc 50

<210> 36

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 36

attataagct gcaataaaca agttggcgcg cctcaggtac ctgcggccgc 50

<210> 37

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 37

caacttgttt attgcagctt ataatggtta caaataaagc aatagcatca 50

<210> 38

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 38

aaaaatgctt tatttgtgaa atttgtgatg ctattgcttt atttgtaacc 50

<210> 39

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 39

caaatttcac aaataaagca tttttttcac tgcattctag ttgtggtttg 50

<210> 40

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 40

attaagatac attgatgagt ttggacaaac cacaactaga atgcagtgaa 50

<210> 41

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 41

tccaaactca tcaatgtatc ttaatcgatt ggcattcacc gcgtgcctta 50

<210> 42

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 42

gtctcagcgg tgaatgccat actattaagg cacgcggtga atgccaatcg 50

<210> 43

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 43

acttaccatg ggcagtcgtc tcagcggtga atgccatact at 42

<210> 44

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 44

acttagctag cactgccgtc tctccgcgtg ccttaatagt atggcattca 50

<210> 45

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 45

ttcagctatt aattaaggca cgcggtgaat gccatactat taaggcacgc 50

<210> 46

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 46

ccgcgtgcct taattaatag ctgaattgtt ggctatacgg tttaagtggg 50

<210> 47

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 47

ggcgagtacg aaaagattac cggggcccac ttaaaccgta tagccaacaa 50

<210> 48

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 48

ccccggtaat cttttcgtac tcgccaaagt tgaagaagat tatcggggtt 50

<210> 49

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 49

acttaccatg gaagcttaag caaaaacccc gataatcttc ttcaacttt 49

Claims

1.一种监测miRNA表达变化的报告基因影像探针，其特征在于，所述的探针包括pcDNA3.1载体、基因片段A和B以及pG5 luc载体，所述的基因片段A、B按照A-B顺序与线性化的pcDNA3.1载体重组，所述的片段A由CopT、BD、AD和4xmiR targets序列组成，所述的片段B为CopA，所述的pG5 luc载体包含Fluc基因。

2.根据权利要求1所述的一种监测miRNA表达变化的报告基因影像探针，其特征在于，所述的片段A的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的片段B的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.根据权利要求1所述的一种监测miRNA表达变化的报告基因影像探针，其特征在于，所述的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

4.权利要求1所述的监测miRNA表达变化的报告基因影像探针的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)用NheI和HindIII酶切载体pcDNA3.1，使其线性化；

2)PCR扩增A、B片段；

4)重组载体经转化、提取质粒、酶切鉴定，获得CopT-BD-AD-4x miRtargets-CopA载体。

5)CopT-BD-AD-4x miR targets-CopA载体作用于pG5 luc载体，获得CopT-BD-AD-4xmiRtargets-CopA/pG5 luc报告基因探针系统。

5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述的片段A由CopT、BD、AD和4xmiRtargets序列组成，所述的片段B为CopA，所述的pG5 luc载体包含Fluc基因。

6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述的片段A的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，所述的片段B的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

7.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，步骤(2)中扩增得到的基因片段核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。