KR20090115133A - 골-관련 장애를 치료하기 위한 스클레로스틴 결합 파트너의 조절물질 - Google Patents

골-관련 장애를 치료하기 위한 스클레로스틴 결합 파트너의 조절물질 Download PDF

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쇼우-이 후
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Abstract

본 발명은 스클레로스틴-관련 장애, 예를 들어 골다공증 및 경화협착증, 및 스클레로스틴-관련 장애, 예를 들어 암 및 심혈관 장애의 치료, 개선 및 진단을 위한 스클레로스틴:스클레로스틴-결합-파트너 상호작용의 조절물질의 용도에 관한 것이다. 또한 본 발명은 스클레로스틴-관련 장애의 치료, 개선 및 진단을 위한 스클레로스틴-결합-파트너 모방체의 용도에 관한 것이다. 스클레로스틴:스클레로스틴-결합-파트너 상호작용의 조절물질, 뿐만 아니라 결과적인 신호전달의 확인을 위한 분석법이 또한 제공된다.
스클레로스틴, 스클레로스틴 결합 파트너, 골-관련 장애

Description

골-관련 장애를 치료하기 위한 스클레로스틴 결합 파트너의 조절물질{MODULATORS OF SCLEROSTIN BINDING PARTNERS FOR TREATING BONE-RELATED DISORDERS}
골다공증 (OP)은 낮은 골 질량 및 골 조직의 미세구조적 열화를 특징으로 하고, 결과적으로 골 취약성 및 골절에 대한 감수성이 증가되는 전신성 골격 장애이다. 50세 여성은 폐경후 일생에 걸쳐 골다공증성 골절이 있을 가능성이 50％인 것으로 추정된다. 골다공증성 증후군은 원발성 장애 예컨대 폐경후 또는 연령-관련 OP, 및 질환 상태 또는 투약을 수반하는 후속 상태를 포함하여 다방면에 걸쳐진다. 낮은 골 무기질 밀도 (BMD)는 OP에 대한 가장 중요한 위험 인자이다. 이는 청소년기에서의 손상된 최대 골 획득 또는 노화 동안의 골 손실로부터 초래된다.
골 손실은 가속화된 골 흡수 또는 결손성 골 형성의 결과로서 발생할 수 있고, 상기 2가지 과정은 성인기에서 정상적으로 커플링된다. 에스트로겐 결핍 및 가속화된 골 흡수의 결과로서의 급속한 골 손실이 OP의 가장 빈번한 원인이지만, 모든 초기 폐경후 여성의 약 1/4에만 높은 골 전환 골다공증이 있다. 따라서, 골다공증은 유전학적인 인자에 의해 주로 야기된다. 여러 연관 분석에서 강화된 골 전환 또는 낮은 골 질량에 기여하는 유전자들이 확인되었지만, 단일 유전자 결함이, 예를 들어 질환의 가장 빈번한 형태인 폐경후 OP의 원인이 되지 않는다는 것이 명확하다 ([Ralston SH. (2003) Curr. Opin. Pharmacol. 3(3):286]).
현재의 골다공증 유병률은 주요 시장에서 5090만명이고, 2010년에는 5580만명, 2015년에는 6150만명으로 상승할 것으로 예상된다. 집단의 노화로 인해 꾸준히 증가된다.
OP의 치료를 위한 대부분의 현재의 치료법은 골 흡수를 억제하여 추가적인 골 손실을 방지하는 것을 기초로 한다. 이에 대한 이유는 골을 흡수하는 (파괴하는) 세포인 파골세포가 뼈에 대해 특이적인 고도로 특수화된 세포이고, 이의 동원 및 활성화에서의 주요 메커니즘이 확인되었다는 것이다. 파골세포는 조혈 기원의 세포이고, 골수 내의 줄기 세포로부터 발달된다; 성숙한 기능성 파골세포는 다핵성 세포이고, 무기질화된 골 표면 상에 국소화되어, 이러한 특수화된 세포가 이를 흡수할 수 있다.
새로운 골 기질은 중간엽 계통에서 유래되는 골모세포에 의해 형성된다. 이러한 골 형성 세포의 추정되는 최종 운명은 3가지이다: 세포자멸사 (세포 사망)가 진행되거나, 내층 세포 (무기질화 골 표면 상의 편평한 세포)가 되거나, 또는 골 기질 내로 포획된다. 포획된 최종 분화 세포는 골세포로 칭해지고, 이들은 뼈의 가장 풍부한 세포이다. 이들은 규칙적인 간격으로 무기질화 골 기질 내에 매립되고, 이웃하는 골세포 및 뼈 세포에 표면 상에서 갭 정션을 통해 커플링된, 가지돌기로 칭해지는 기다란 세포성 융기물을 통해 서로 연결된다. 기초를 이루는 분자 메커니즘은 완전하게 이해되지 않았지만, 이들은 골 모델링 및 리모델링의 주요 조절물질인 것으로 생각된다.
감소된 골 질량으로 인해 골다공증이 골절 위험의 증가로 정의되었지만, 골격 장애에 대한 현재 이용가능한 치료 중 어느 것도 성인의 골 밀도를 실질적으로 증가시킬 수 없다. 대신, 현재의 골다공증 치료 원리는 항-흡수성이고, 새로운 척추 골절에 대한 위험을 약 35 내지 60％만큼 감소시킬 수 있다 ([Haeuselmann HJ, Rizzoli R (2003) Osteoporos. Int.; 14:2]; [Chesnut CH, III, et al (2004). J Bone Min Res; 19 (8)]). 엉덩이 골절 위험은 1가지 항-흡수성 치료 원리에 의해서만 감소되어, 골절 위험이 약 50％ 감소된다. 골감소증 및 골다공증의 위험이 있는 성인, 특히 손목, 척주 및 엉덩이의 뼈에서 골 밀도를 증가시킬 수 있는 약물에 대한 요구는 이 분야의 다년간 충족되지 않았다. 이에 따라, 다수의 OP 환자에서는 진단 시점에 이미 상당량의 뼈가 손실되어 있으므로, 새로운 골 형성을 자극함으로써 골 질량을 증가시키고, 50％를 초과하여 골절 위험을 감소시킬 수 있어야 하는 작용제를 개발하는 것이 요망된다.
반대로, 골 형성 및 침착이 흡수를 능가하여, 잠재적으로는 병리학적으로 증가된 골 질량 및 강도를 초래하는, 골 과성장 및 비정상적으로 높은 골 무기질 밀도 (BMD)와 관련된 다양한 골 장애가 있다. 예를 들어, 경화협착증은 이형접합성 보유자에서도 증가된 골 질량을 나타내는 열성 장애이다. 마찬가지로, 심슨-골라비-베흐멜(Simpson-Golabi-Behmel) 증후군 (SGBS)이 있는 환자는 전형적으로 겉모습이 넓고 땅딸막하고, 비대한 얼굴뼈를 특징으로 한다 (예를 들어, 돌출된 턱 및 비대한 콧등이 초래됨). 유사하게, 반 부헴(Van Buchem) 질환은 골격 과성장을 특징으로 하는 보통염색체 열성 질환이다. 이러한 질환은 대칭적으로 증가된 두께의 뼈를 특징으로 하고, 이는 비대한 턱뼈에서 가장 빈번하게 발견되지만, 두개골, 갈비뼈, 장골(長骨)의 골간, 뿐만 아니라 손 및 발의 관상골 또한 비대해져서, 증가된 피질골 밀도가 초래된다. 증가된 두개골 두께의 임상적인 결과는 안면 신경 마비를 포함하고, 이는 청각 손실, 시각 문제, 신경학적 통증을 야기하며, 매우 드물게는 시신경 위축의 결과로 실명을 야기한다.
본 발명은 비정상적인 골 무기질 밀도 (BMD)와 관련된 장애에 대한 조성물, 치료 방법, 및 진단 방법을 제공하는 것을 목표로 한다.
발명의 개요
본 발명은 스클레로스틴-결합-파트너 상호작용의 조절물질, 예를 들어 스클레로스틴:스클레로스틴-결합 파트너 상호작용의 조절물질을 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 골 무기질 밀도가 비정상적인 장애 및/또는 스클레로스틴-관련 장애를 치료하거나, 이의 증상들을 개선시키거나, 이를 보호하는 방법을 제공한다. 상기 조절물질은 (i) 스클레로스틴; (ii) 스클레로스틴-결합-파트너; (iii) 스클레로스틴:스클레로스틴-결합-파트너 상호작용에 의해 생성되는 신규 부위 (예를 들어, 새롭게 생성된 에피토프성 결정인자), 또는 (iv) 이들 중 임의의 것을 포함하는 단백질 복합체에 대해 지시된 항체, 항체-유사 스캐폴드(scaffold), 소분자, 키메라 또는 융합 단백질, 펩티드, 모방체, 또는 억제성 뉴클레오티드 (예를 들어, RNAi)를 포함할 수 있다. 상기 조성물은 본원에서 정의된 바와 같은 "제약 조성물"을 포함한다. "스클레로스틴-관련 장애," "골 무기질 밀도가 비정상적인 장애" 및 "스클레로스틴-결합-파트너"는 본원에서 추가로 정의되는 용어이다.
비-제한적인 예로서, 본 발명은 스클레로스틴:ALPL, 스클레로스틴:Frem2 또는 스클레로스틴:LRP4 상호작용의 조절물질을 투여함으로써 스클레로스틴-관련 장애 (예를 들어, 골다공증 또는 경화협착증) 및/또는 골 무기질 밀도가 비정상적인 장애를 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명은 작용제에 의해 야기된 스클레로스틴-결합-파트너와의 스클레로스틴 상호작용의 변경을 측정하는 것을 포함하는, 스클레로스틴:스클레로스틴-결합-파트너 상호작용을 조절할 수 있는 작용제를 확인하는 방법을 추가로 제공한다. 바람직하게는, 상기 방법은 a) 스클레로스틴-결합-파트너와 스클레로스틴의 상호작용을 허용하는 조건 하에 테스트 작용제의 존재 및 부재 하에 스클레로스틴을 스클레로스틴-결합-파트너와 접촉시키는 단계; 및 b) 상기 테스트 작용제의 존재 및 부재 하에서의 스클레로스틴-결합-파트너와 스클레로스틴의 상호작용을 측정하는 단계를 포함하고, 이 때 (i) 테스트 작용제의 부재 하에서의 상호작용에 비해 테스트 작용제의 존재 하에서의 스클레로스틴:스클레로스틴-결합-파트너 상호작용이 감소하면, 테스트 작용제가 스클레로스틴:스클레로스틴-결합-파트너 상호작용의 길항제로 확인되고, (ii) 테스트 작용제의 부재 하에서의 상호작용에 비해 테스트 작용제의 존재 하에서의 상호작용이 증가하면, 테스트 작용제가 스클레로스틴:스클레로스틴-결합-파트너 상호작용의 효능제로 확인된다.
비-제한적인 예로서, 본 발명은 작용제에 의해 야기된 LRP4에 대한 스클레로스틴 결합의 변경을 측정하는 것을 포함하는, 스클레로스틴:LRP4 상호작용을 조절할 수 있는 작용제를 확인하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 테스트 작용제 는 LRP4에 직접적으로 또는 간접적으로 결합하고, 이에 의해 스클레로스틴:LRP4 상호작용을 조절한다. 한 실시양태에서, 테스트 작용제는 소분자이다. 또다른 실시양태에서, 테스트 작용제는 억제성 뉴클레오티드이다. 또다른 실시양태에서, 테스트 작용제는 LRP4 단백질을 포함하는 융합 단백질이다.
스클레로스틴:스클레로스틴-결합-파트너 상호작용, 스클레로스틴 또는 스클레로스틴-결합-파트너 단백질 활성, 및/또는 스클레로스틴 경로 활성에서의 변경을 PCR, Taqman PCR, 파지 디스플레이 시스템, 젤 전기영동, 효모-2 하이브리드 분석법, 리포터 유전자 분석법, 노던(Northern) 또는 웨스턴(Western) 분석, 면역조직화학, 통상적인 섬광 카메라, 감마 카메라, 직선형 스캐너, PET 스캐너, SPECT 스캐너, MRI 스캐너, NMR 스캐너, 또는 X선 기계에 의해 측정할 수 있다. 스클레로스틴:스클레로스틴-결합-파트너 간의 상호작용에서의 변화를 검출함으로써, 스클레로스틴 또는 스클레로스틴-결합-파트너의 발현 또는 단백질 수준에서의 변화를 검출함으로써, 또는 스클레로스틴 경로 내의 단백질들 중 하나 이상의 발현 또는 단백질 수준에서의 변화를 검출함으로써, 바람직하게는 Wnt 신호전달 경로에서의 변화를 검출함으로써, 스클레로스틴, 스클레로스틴-결합-파트너 단백질 활성, 및/또는 스클레로스틴 경로 활성에서의 변화를 검출할 수 있다. 상기 기술된 것들이 검출될 수 있는 세포는 뼈, 중간엽, 신장 (예를 들어, HEK), 또는 조혈 기원의 세포일 수 있거나, 배양 세포일 수 있거나, 또는 트랜스제닉(transgenic) 생물로부터 수득되거나 이러한 생물 내에 존재할 수 있다. 이같은 트랜스제닉 생물에는 마우스, 래트, 토끼, 양, 소 또는 영장류가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명은 작용제의 존재 하에 스클레로스틴:스클레로스틴-결합-파트너 상호작용에 의해 유도된 신호전달 응답을 측정하는 단계, 및 이를 작용제의 부재 하에 스클레로스틴:스클레로스틴-결합-파트너 상호작용에 의해 유도된 신호전달 응답과 비교하는 단계를 포함하는, 스클레로스틴:스클레로스틴-결합-파트너 상호작용을 조절할 수 있는 작용제를 확인하는 방법을 또한 제공한다. 바람직하게는, 상기 방법은 a) 스클레로스틴-결합-파트너와 스클레로스틴의 상호작용을 허용하는 조건 하에 테스트 작용제의 존재 및 부재 하에 스클레로스틴을 스클레로스틴-결합-파트너와 접촉시키는 단계; 및 b) 스클레로스틴:스클레로스틴-결합-파트너 상호작용에 의해 유도된 신호전달 응답 또는 효소성 응답을 측정하는 단계를 포함하고, 이 때 테스트 작용제의 부재 하에서의 응답과 비교하여 적어도 10％, 20％ 또는 30％의 테스트 작용제의 존재 하에서의 응답의 변화는 테스트 작용제가 스클레로스틴:스클레로스틴-결합-파트너 상호작용을 조절할 수 있다는 것을 가리킨다. 바람직하게는, 단계 b)에서 측정된 신호전달 응답은 Wnt 신호전달 응답이다.
테스트 작용제의 부재 하에서의 응답과 비교하여 테스트 작용제의 존재 하에서의 신호전달 응답이 적어도 10％, 20％ 또는 30％ 증가하면, 테스트 작용제가 스클레로스틴:스클레로스틴-결합-파트너 상호작용의 효능제로 확인된다. 테스트 작용제의 부재 하에서의 응답과 비교하여 테스트 작용제의 존재 하에서의 신호전달 응답이 적어도 10％, 20％ 또는 30％ 감소하면, 테스트 작용제가 스클레로스틴:스클레로스틴-결합-파트너 상호작용의 길항제로 확인된다.
비-제한적인 예로서, 본 발명은 작용제의 존재 하에 스클레로스틴:LRP4 상호 작용에 의해 유도된 신호전달 응답을 측정하는 단계, 및 이를 작용제의 부재 하에 스클레로스틴:LRP4 상호작용에 의해 유도된 신호전달 응답과 비교하는 단계를 포함하는, 스클레로스틴:LRP4 상호작용을 조절할 수 있는 작용제를 확인하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 테스트 작용제는 LRP4에 직접적으로 또는 간접적으로 결합하고, 이에 의해 스클레로스틴:LRP4 상호작용을 조절한다. 한 실시양태에서, 테스트 작용제는 소분자이다. 또다른 실시양태에서, 테스트 작용제는 억제성 뉴클레오티드이다.
또한, 본 발명은 상기 기술된 바와 같은 방법에 따라 확인된 스클레로스틴:스클레로스틴-결합-파트너 상호작용을 조절할 수 있는 작용제를 포함하는 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 본원에서 정의된 바와 같은 "제약 조성물"을 포함한다.
스클레로스틴-결합 파트너를 조절할 수 있는 바람직한 작용제는 상기 스클레로스틴-결합 파트너에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체-유사 스캐폴드, 또는 상기 항체 또는 상기 항체-유사 스캐폴드의 항원-결합 부분을 포함하는 기능성 단백질이다.
본 발명은 (a) 대상에서 스클레로스틴:스클레로스틴-결합-파트너 상호작용을 측정하는 단계, 및 (b) 단계 (a)에서의 상호작용을 건강한 개체의 스클레로스틴:스클레로스틴-결합-파트너 상호작용과 비교하는 단계를 포함하고, 이 때 차이는 상기 대상에서의 스클레로스틴-관련 장애 또는 이에 대한 소질을 나타내는, 대상에서 스클레로스틴-관련 장애 및/또는 골 무기질 밀도가 비정상적인 장애, 또는 스클레로스틴-관련 장애 및/또는 골 무기질 밀도가 비정상적인 장애에 대한 소질을 진단하 는 방법을 또한 제공한다.
비-제한적인 예로서, 본 발명 대상에서 (a) 대상에서 스클레로스틴:LRP4 결합을 측정하는 단계, 및 (b) 단계 (a)에서의 결합을 건강한 개체 (즉, 경화협착증에 대한 고통 또는 소질이 없는 개체)의 스클레로스틴:LRP4 결합과 비교하고, 이 때 차이는 상기 대상에서의 골다공증 또는 경화협착증 또는 이에 대한 소질을 나타내는 단계에 의해, 골다공증 또는 경화협착증, 또는 이에 대한 소질을 진단하는 방법을 제공한다.
본 발명은 후보 모방체에 의한 스클레로스틴과의 상호작용을 측정하는 것을 포함하는, 스클레로스틴과의 스클레로스틴-결합-파트너 상호작용과 동일하거나, 유사하거나 또는 개선된 기능적 효과를 갖는 스클레로스틴-결합-파트너 모방체를 확인하는 방법을 제공한다. 바람직하게는, 상기 방법은 (a) 모방체와 스클레로스틴의 상호작용을 허용하는 조건 하에 스클레로스틴을 후보 모방체와 접촉시키는 단계; 및 (b) 모방체와 스클레로스틴의 상호작용을 측정하는 단계를 포함하고, 이 때 본원에 기술된 다양한 스클레로스틴:스클레로스틴-결합-파트너 상호작용에 대해 관찰된 것의 적어도 10％, 20％ 또는 30％인 상호작용에 의해 후보 모방체가 본 발명의 스클레로스틴-결합-파트너 모방체로 식별된다.
또한, 본 발명은 스클레로스틴-모방체 상호작용에 의해 유도된 신호전달 응답을 측정하는 단계, 및 이를 본원에 기술된 스클레로스틴:스클레로스틴-결합-파트너 상호작용에 의해 유도된 신호전달 응답과 비교하는 단계를 포함하는, 스클레로스틴과의 스클레로스틴-결합-파트너 상호작용과 동일하거나, 유사하거나 또는 개선 된 기능적 효과를 갖는 스클레로스틴-결합-파트너 모방체를 확인하는 방법을 제공한다. 바람직하게는, 상기 방법은 (a) 모방체와 스클레로스틴의 상호작용을 허용하는 조건 하에 스클레로스틴을 후보 모방체와 접촉시키는 단계; 및 (b) 스클레로스틴-모방체 상호작용에 의해 유도된 신호전달 응답을 측정하는 단계를 포함하고, 이 때 본원에 기술된 다양한 스클레로스틴:스클레로스틴-결합-파트너 상호작용에 대해 관찰된 것의 적어도 10％, 20％ 또는 30％인 신호전달 응답에 의해 후보 모방체가 본 발명의 스클레로스틴-결합-파트너 모방체로 식별된다.
비-제한적인 예로서, 본 발명은 정상적인 생리학적 조건 하에 LRP4와 스클레로스틴 간의 상호작용의 것과 동일하거나, 유사하거나 또는 개선된 기능적 효과를 갖는 LRP4 모방체를 확인하는 방법을 제공한다. 본원에 기술된 방법들을 사용함으로써 상기 모방체가 확인될 수 있다.
본 발명은 스클레로스틴-결합 파트너의 포유류 세포에서의 단백질 발현을 조절할 수 있는, 예를 들어 단백질 발현을 감소시킬 수 있는 siRNA를 추가로 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 기술된 바와 같은 방법에 따라 확인된 스클레로스틴-결합-파트너 모방체를 포함하는 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 본원에서 정의된 바와 같은 "제약 조성물"을 포함한다.
본 발명은 본원에 기술된 스클레로스틴과의 스클레로스틴-결합-파트너 상호작용과 동일하거나, 유사하거나 또는 개선된 기능적 효과를 갖는 스클레로스틴-결합-파트너 모방체를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 스클레로스틴-관 련 장애 및/또는 골 무기질 밀도가 비정상적인 장애를 치료하거나, 이의 증상들을 개선시키거나, 이를 보호하는 방법을 제공한다. 상기 기술된 방법들 (하기에 추가로 상술됨)을 사용함으로써 상기 모방체가 쉽게 확인될 수 있다. 특정 실시양태에서, 상기 모방체는 상기 스클레로스틴-결합-파트너에 대해 지시된 항체 또는 항체-유사 스캐폴드 또는 이의 단편 (예를 들어, 항-LRP4 항체 또는 단편)일 수 있다.
본 발명은 (a) 대상에서 스클레로스틴-결합-파트너 유전자의 뉴클레오티드 서열을 수득하는 단계, 및 (b) 이를 건강한 대상의 것과 비교하고, 이 때 각각의 스클레로스틴-결합-파트너 유전자에서의 돌연변이는 스클레로스틴-관련 장애 및/또는 골 무기질 밀도가 비정상적인 장애 또는 이에 대한 소질을 나타내는 단계를 포함하는, 대상에서 스클레로스틴-관련 장애 및/또는 골 무기질 밀도가 비정상적인 장애 또는 이에 대한 소질을 진단하는 방법을 추가적으로 제공한다.
본 발명은 스클레로스틴과 스클레로스틴-결합-파트너 간의 상호작용을 조절하는 방법을 또한 제공한다. 비-제한적인 예로서, 본 발명은 스클레로스틴 경로 활성을 조절하기 위해, 또는 스클레로스틴 또는 스클레로스틴-결합-파트너 단백질 수준을 조절하기 위해 스클레로스틴과 스클레로스틴-결합-파트너 간의 상호작용을 조절하는 방법을 포함한다.
본 발명은 스클레로스틴 또는 본원에 상술된 스클레로스틴-결합-파트너들 중 임의의 것의 천연 서열에 한정되지 않는다. 또한, 본 발명의 방법 및 조성물은 스클레로스틴 또는 본원에 상술된 스클레로스틴-결합-파트너들 중 임의의 것의 유도체 및 스플라이스 변이체를 포함한다. 일부분 또는 단편이 사용되는 경우에도, 이 러한 일부분 또는 단편의 아미노산 서열이 변경될 수 있다.
본 발명은 스클레로스틴-결합 파트너, 예를 들어 LRP4, 또는 스클레로스틴에 특이적으로 결합하는, 스클레로스틴-결합 파트너의 단편을 포함하는 가용성 폴리펩티드를 추가로 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 가용성 폴리펩티드는 LRP4의 세포외 부분으로 구성되고, 바람직하게는 폴리펩티드는 서열 3 (LRP4 aa 21-1763)으로 구성된다.
본 발명은 스클레로스틴-결합 파트너에 특이적으로 결합하는, 항체 또는 항체-유사 스캐폴드, 또는 상기 항체 또는 상기 항체-유사 스캐폴드의 항원-결합 부분을 포함하는 기능성 단백질을 또한 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 항체 또는 항체-유사 스캐폴드 또는 기능성 단백질은 스클레로스틴이 상기 스클레로스틴-결합 파트너에 결합하는 것을 억제한다. 또다른 실시양태에서, 상기 항체 또는 항체-유사 스캐폴드 또는 기능성 단백질은, 세포-기반 분석법에 의해 측정되는 바와 같이, Wnt 신호전달 경로를 조절한다. 한 관련된 실시양태에서, 상기 항체 또는 항체-유사 스캐폴드 또는 기능성 단백질은 LRP4 또는 ALPL에 특이적으로 결합한다.
도 1은 항-LRP4 siRNA, 및 LRP4 mRNA를 녹다운(knockdown)시키는 이들의 능력을 나타낸다.
도 2는 LRP4 mRNA 녹다운이 HEK293 세포에서 수퍼탑플래시(supertopflash) (STF) 활성을 억제하는 스클레로스틴의 능력을 감소시킨다는 것을 나타낸다.
도 3은 LRP4 mRNA 녹다운 후의 스클레로스틴 용량 응답 연구를 나타낸다.
도 4a는 Hek293 세포에서의 Wnt 1-유도 수퍼탑플래시 (STF)-Luc에 대한 LRP4 과발현의 효과를 나타낸다; 도 4b는 Hek293 세포에서의 Wnt 1-유도 수퍼탑플래시 (STF)-Luc에 대한 스클레로스틴 및 Dkk1의 작용에 대한 LRP4 과발현의 효과를 나타낸다; 도 4c는 Hek293 세포에서의 Wnt 1-유도 수퍼탑플래시 (STF)-Luc에 대한 스클레로스틴 및 Dkk1의 작용에 대한 LRP4 및 LRP5 과발현의 효과를 나타낸다; 도 4d는 Hek293 세포에서의 Wnt 1-유도 수퍼탑플래시 (STF)-Luc에 대한 스클레로스틴 및 Dkk1의 작용에 대한 LRP4 및 LRP6 과발현의 효과를 나타낸다.
도 5a는 C28a2 세포에서의 Wnt 1-유도 수퍼탑플래시 (STF)-Luc에 대한 LRP4 과발현의 효과를 나타낸다; 도 5b는 C28a2 세포에서의 Wnt 1-유도 수퍼탑플래시 (STF)-Luc에 대한 스클레로스틴 및 Dkk1의 작용에 대한 LRP4 과발현의 효과를 나타낸다.
도 6은 MC3T3에서의 GSK3베타 억제제-유도 알칼리성 포스파타제 활성에 대한 스클레로스틴의 효과를 나타낸다.
도 7은 무세포-기반 분석법에서의 알칼리성 포스파타제 활성에 대한 스클레로스틴의 효과를 나타낸다.
본 명세서에서, 용어 "치료"는 예방성 또는 방지성 치료, 뿐만 아니라 치유성 또는 질환 억제성 치료 양쪽 모두를 포함한다 (질병 (예를 들어, 스클레로스틴-관련 장애 및/또는 골 무기질 밀도가 비정상적인 장애)에 대한 소질이 있는 환자, 뿐만 아니라 질병에 걸린 환자의 치료 포함). 이러한 용어는 질환 진행의 지연을 위한 치료를 추가로 포함한다.
본원에서 사용된 "스클레로스틴-결합-파트너"에는 하기의 단백질들이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다: 베르시칸(Versican) (CSPG2), FREM2, 피브릴린(Fibrillin) 2 (FBN2), C6orf93, 신데칸(Syndecan)-4 (Sdc4), 아그린(Agrin) (AGRN), 세르핀2(Serpine2) (PN-1), LRP2, LRP6, SLIT2, 테나신(tenascin) C, TRIM26, TRIM41, 글리피칸1(glypican1), 알칼리성 포스파타제 (ALPL) 및 IL-17 수용체. 한 실시양태에서, LRP4 및 ALPL은 각각 서열 1 및 2의 상응하는 인간 LRP4 및 ALPL을 지칭한다.
"스클레로스틴:스클레로스틴-결합-파트너 상호작용"은 스클레로스틴과 본원에서 정의된 바와 같은 스클레로스틴-결합-파트너 간의 직접적인 또는 간접적인 상호작용을 의미한다. 상호작용의 비-제한적인 예로는 직접적인 물리적 결합 및 간접적인 입체적 억제가 포함된다.
본원에서 사용된 "스클레로스틴-관련 장애"에는 골 무기질 밀도 (BMD)가 건강한 대상에 비해 비정상적으로 및/또는 병적으로 높은 장애, 및 골 무기질 밀도 (BMD)가 건강한 대상에 비해 비정상적으로 및/또는 병적으로 낮은 장애가 포함된다. 높은 BMD를 특징으로 하는 장애에는 경화협착증, 반 부헴 질환, 골 과성장 장애, 및 심슨-골라비-베흐멜 증후군 (SGBS)이 포함되지만 이에 한정되지는 않는다. 낮은 BMD 및/또는 골 취약성을 특징으로 하는 장애에는 원발성 및 속발성 골다공증, 골감소증, 골연화증, 불완전 골생성증 (OI), 무혈성 괴사 (골괴사), 골절 및 임플란트 치료 (치과용 임플란트 및 엉덩이 임플란트), 또다른 장애로 인한 골 손실 (예를 들어, HIV 감염, 암 또는 관절염과 관련됨)이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 기타 "스클레로스틴-관련 장애"에는 류머티스성 관절염, 골관절염, 관절염, 및 골용해성 병변의 형성 및/또는 존재가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.
본원에서 사용된 "스클레로스틴-관련 장애"에는 스클레로스틴에 의해 매개되거나 또는 비정상적인 스클레로스틴 수준과 관련되거나 이를 특징으로 하는 상태가 포함된다. 여기에는 암 및 골다공증성 상태 (예를 들어, 골다공증 또는 골감소증)가 포함되고, 이들 중 일부는 본원에서 정의된 바와 같은 "스클레로스틴-관련 장애"와 중복된다. 스클레로스틴-관련 암에는 골수종 (예를 들어, 골용해성 병변이 있는 다발성 골수종), 유방암, 결장암, 흑색종, 간세포암, 상피암, 식도암, 뇌암, 폐암, 전립선암, 또는 췌장암, 뿐만 아니라 이의 임의의 전이물이 포함된다.
"스클레로스틴-관련 장애"는 적어도 신장 및 심혈관구조에서의 스클레로스틴의 발현으로 인한 신장 및 심혈관 상태를 또한 포함할 수 있다. 상기 장애에는 사구체 질환 (예를 들어, 급성 및 만성 사구체신염, 급속 진행성 사구체신염, 콩팥 증후군, 초점 증식성 사구체신염, 전신 홍반 루푸스, 굿패스처(Goodpasture) 증후군, 다발성 골수종, 당뇨병, 다낭성 신장 질환, 신생물, 겸상 적혈구 질환 및 만성 염증성 질환과 같은 전신 질환과 관련된 사구체 병변), 관 질환 (예를 들어, 급성 세뇨관 괴사 및 급성 신부전, 다낭성 신장 질환, 수질성 해면 신장, 수질 낭성 질환, 신원성 당뇨병, 및 신장 세뇨관 산증), 세뇨관간질성 질환 (예를 들어, 깔때기콩팥염, 약물 및 독소에 의해 유도된 세뇨관간질성 콩팥염, 고칼슘혈성 콩팥병증, 및 저칼륨혈성 콩팥병증), 급성 및 급속 진행성 신부전, 만성 신부전, 신석증, 통풍, 혈관 질환 (예를 들어, 고혈압 및 신장경화증, 미세혈관병성 용혈성 빈혈, 신장 죽상전색 질환, 미만성 피질 괴사, 및 신경색증), 또는 종양 (예를 들어, 신세포 암종 및 콩팥모세포종)과 같은 신장 장애가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.
상기 장애에는 허혈성 심장 질환 (예를 들어, 협심증, 심근 경색증, 및 만성 허혈성 심장 질환), 고혈압성 심장 질환, 폐성 심장 질환, 판막성 심장 질환 (예를 들어, 류머티스성 열 및 류머티스성 심장 질환, 심내막염, 승모판 탈출증, 및 대동맥 판막 협착증), 선천성 심장 질환 (예를 들어, 판막성 및 판막 폐쇄성 병변, 심방 또는 심실 중격 결손, 및 동맥관 개존증), 또는 심장근육 질환 (예를 들어, 심근염, 울혈성 심근병증, 및 비대성 심근병성)과 같은 심혈관 장애가 또한 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.
본원에서 사용된 "치유"는 치료를 통해 장애, 예를 들어 스클레로스틴-관련 장애 및/또는 골 무기질 밀도가 비정상적인 장애, 또는 이의 진행 중인 에피소드의 완화에 이르는 것을 의미한다.
용어 "예방" 또는 "방지"는 스클레로스틴-관련 장애 및/또는 골 무기질 밀도가 비정상적인 장애, 예를 들어 골다공증, 경화협착증, 또는 암의 발병 또는 재발을 지연시키는 것을 의미한다.
본원에서 사용된 "조정하다"는 직접적으로 또는 간접적으로 제어하거나 영향을 미칠 수 있는 능력을 나타내고, 비-제한적인 예로서, 억제 또는 자극, 작동 또는 길항, 방해 또는 촉진, 및 강화 또는 약화를 별법적으로 의미할 수 있다.
본원에서 사용된 "유기 소분자", 또는 "소분자"는 분자량이 3 킬로달톤 미만, 바람직하게는 1.5 킬로달콘 미만인 유기 화합물 (또는 무기 화합물 (예를 들어 금속)과 복합체를 형성한 유기 화합물)이다.
본원에서 사용된 "리포터" 유전자는 용어 "마커 유전자"와 상호교환가능하게 사용되고, 쉽게 검출가능하고/하거나 쉽게 검출가능한 유전자 생성물 예컨대 루시페라제를 코딩하는 핵산이다.
전사 및 번역 제어 서열은 숙주 세포 내에서 코딩 서열의 발현을 제공하는 DNA 조절 서열, 예컨대 프로모터, 인핸서, 종결인자 등이다. 진핵생물 세포에서, 폴리아데닐화 신호는 제어 서열이다.
"프로모터 서열"은 세포 내에서 RNA 중합효소에 결합할 수 있고 하류 (3' 방향)의 코딩 서열의 전사를 개시시킬 수 있는 DNA 조절 영역이다. 본 발명을 정의하기 위해, 프로모터 서열은 이의 3' 말단에서 전사 개시 부위에 결합되고, 배경값을 초과하는 검출가능한 수준으로 전사를 개시시키는데 필요한 최소 개수의 염기 또는 요소를 포함하도록 상류 (5' 방향)으로 확장된다. 프로모터 서열 내에서, 전사 개시 부위 (뉴클레아제 S1으로의 지도화에 의해 편리하게 규정됨), 뿐만 아니라 RNA 중합효소의 결합을 담당하는 컨센서스(consensu) 서열이 확인될 것이다.
코딩 서열은 RNA 중합효소가 코딩 서열을 mRNA로 전사할 때 세포 내에서 전사 및 번역 제어 서열의 "제어 하"에 놓이고, 그후 상기 mRNA가 트랜스-RNA 스플라이싱되고, 코딩 서열에 의해 코딩되는 단백질로 번역된다.
"제약상 허용되는"이라는 구절은 생리학적으로 용인가능하고, 인간에게 투여되었을 때 전형적으로 알레르기성 또는 유사한 부적당한 반응, 예컨대 급성 위연동 이상항진, 현기증 등을 일으키지 않는 분자 본체 및 조성물을 지칭한다. 바람직하게는, 본원에서 사용된 용어 "제약상 허용되는"은 동물, 더욱 특히 인간에서의 사용에 대해 연방 정부 또는 주 정부의 관리 기관에 의해 허가되었거나 또는 미국 약전 또는 기타 일반적으로 인정되는 약전에 열거되었음을 의미한다.
용어 "담체"는 화합물이 이와 함께 투여되는 희석제, 보조제, 부형제, 또는 비히클을 지칭한다. 이같은 제약 담체는 무균성 액체, 예컨대 물 및 오일일 수 있고, 석유, 동물, 식물 또는 합성 기원의 담체, 예컨대 땅콩유, 대두유, 미네랄 오일, 참기름 등을 포함한다. 물 또는 수성 용액, 염수 용액, 및 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액이 담체로서 바람직하게 사용되고, 특히 주사용 용액에 대해 사용된다. 적절한 제약 담체는 ["Remington's Pharmaceutical Sciences", E. W. Martin]에 기술되어 있다.
"치료상 유효량" 및 "유효량"이라는 구절은 수용자의 활성, 기능 및 응답에서의 임상적으로 유의한 결손을 적어도 약 15％, 바람직하게는 적어도 50％, 더욱 바람직하게는 적어도 90％ 감소시키는데, 가장 바람직하게는 이를 방지하는데 충분한 양을 의미하는 것으로 본원에서 사용된다. 별법적으로, 치료상 유효량은 수용자에서 임상적으로 유의한 상태/증상에서의 개선을 야기하는데 충분한다.
"작용제"는 제약 및 진단 조성물을 제조하는데 사용될 수 있는 모든 물질, 또는 이같은 목적에 독립적으로 사용될 수 있는 화합물, 핵산 (억제성 핵산 예컨대 shRNA, RNAi 등 포함), 항체, 항체-유사 스캐폴드, 소분자, 폴리펩티드, 단편, 이소형(isoform), 변이체 또는 기타 물질일 수 있는 모든 물질을 지칭한다 (모두 본 발명에 따름).
"유도체"는 화합물, 아미노산 잔기 치환, 결실 또는 부가의 도입에 의해 변경된 모 단백질 또는 폴리펩티드의 아미노산 서열을 포함하는 단백질 또는 폴리펩티드, 또는 뉴클레오티드 치환 또는 결실, 부가 또는 돌연변이의 도입에 의해 변형된 핵산 또는 뉴클레오티드를 지칭한다. 유도체 핵산, 뉴클레오티드, 단백질 또는 폴리펩티드는 모 폴리펩티드와 유사한 또는 동일한 기능을 갖는다.
"억제제" 또는 "길항제"는 스클레로스틴 및/또는 스클레로스틴-결합-파트너 활성, 또는 관련된 단백질 또는 경로 (예를 들어, BMP, Wnt 등)의 활성의 억제성 분자 (본원에 기술된 스클레로스틴:스클레로스틴-결합-파트너 스크리닝 방법을 사용하여 확인된 것들 포함)를 지칭한다. 억제제 및 길항제는 경로를 통한 신호전달을 감소, 차단 또는 방지하고/하거나 단백질 상호작용 및 복합체의 형성을 방지하는 작용제일 수 있다.
본 발명에 따른 "모방체"는 폴리펩티드, 펩티드, 지질, 탄수화물, 뉴클레오티드, 유기 소분자, 및 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 모방체는 당해 단백질, 펩티드 또는 폴리펩티드 (예를 들어, 스클레로스틴 또는 스클레로스틴-결합-파트너)의 활성을 모방하는데 (또는 강화시키는데), 예를 들어 스클레로스틴:스클레로스틴-결합-파트너 상호작용의 효과를 복제하거나, 작동시키거나 증강시키기 위하여 사용될 수 있다.
후보 모방체는 천연 또는 합성 화합물일 수 있고, 예를 들어 합성 소분자, 동물, 식물, 박테리아 또는 진균류 세포의 추출물, 뿐만 아니라 이같은 세포로부터의 조건화 배지 내에 함유된 화합물을 포함한다. 하기에 기술된 방법을 사용하여 모방체 화합물을 결정할 수 있다. 모방체는 정상적인 폴리펩티드 기능을 모방할 수 있는 대상 단백질, 펩티드, 폴리펩티드의 결정적인 잔기의 지식을 기초로 생성될 수 있다. 모방체는 자신이 따라서 디자인된 폴리펩티드, 펩티드, 또는 단백질과 기능적인 성질이 동일할 수 있거나, 유사할 수 있거나, 또는 이에 비해 개선될 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "이중-가닥 RNA" 또는 "dsRNA"는 2개의 역평행 핵산 가닥 및 실질적으로 상보적인 핵산 가닥 (상기 정의된 바와 같음)을 포함하는 이합체 구조를 갖는 리보핵산 분자의 복합체를 지칭한다. 이합체 구조를 형성하는 2개의 가닥은 하나의 더 큰 RNA 분자의 상이한 부분들일 수 있거나, 또는 별도의 RNA 분자들일 수 있다. 별도의 RNA 분자들인 경우, 이같은 siRNA는 문헌에서 siRNA ("짧은 간섭 RNA")로 종종 지칭된다. 2개의 가닥이 하나의 더 큰 분자의 일부분이고, 따라서 한쪽 가닥의 3'-말단과 이합체 구조를 형성하는 각각의 다른쪽 가닥의 5' 말단 사이의 중단되지 않은 뉴클레오티드 사슬에 의해 연결되는 경우, 이들을 연결하는 RNA 사슬은 "헤어핀 루프", "짧은 헤어핀 RNA" 또는 "shRNA"로 지칭된다. 2개의 가닥이 한쪽 가닥의 3'-말단과 이합체 구조를 형성하는 각각의 다른쪽 가닥의 5' 말단 사이의 중단되지 않은 뉴클레오티드 사슬 이외의 수단에 의해 공유결합으로 연결되는 경우, 이들을 연결하는 구조는 "링커"로 지칭된다. RNA 가닥들에는 동일하거나 상이한 개수의 뉴클레오티드가 있을 수 있다. 염기쌍의 최대 개수는 siRNA의 가장 짧은 가닥 내의 뉴클레오티드 개수에서 이합체 내에 존재하는 임의의 오버행(overhang) 내의 개수를 뺀 것이다. 이합체 구조에 더하여, siRNA는 하나 이상의 뉴클레오티드 오버행을 포함할 수 있다. 또한, 본 명세서에서 사용된 "siRNA"는 리보뉴클레오티드에 대한 화학적 변형을 포함할 수 있고, 여기에는 다중 뉴클레오티드에서의 실질적인 변형이 포함되고, 본원에서 개시되고 당업계에 공지된 모든 유형의 변형이 포함된다. siRNA 유형 분자에서 사용된 임의의 이같은 변형은 본 명세서 및 청구항을 위한 "siRNA"에 포함된다.
본원에서 사용된 "뉴클레오티드 오버행"은 siRNA의 한쪽 가닥의 3'-말단이 다른쪽 가닥의 5'-말단을 넘어서 확장되는 경우 또는 반대의 경우, siRNA의 이합체 구조로부터 돌출된 쌍을 이루지 않은 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드들을 지칭한다. "평활" 또는 "평활 말단"은 siRNA의 말단에 쌍을 이루지 않은 뉴클레오티드가 없음, 즉 뉴클레오티드 오버행이 없음을 의미한다. "평활 말단" siRNA는 전체 길이에 걸쳐 이중-가닥인, 즉 분자의 어느 한쪽 말단에도 뉴클레오티드 오버행이 없는 siRNA이다. 명확하게 하기 위해, siRNA의 3' 말단 또는 5' 말단에 접합된 화학적 캡(cap) 또는 비-뉴클레오티드 화학 모이어티(moiety)는 siRNA에 오버행이 있는지 또는 siRNA가 평활 말단인지를 결정하는 것에서 고려되지 않는다.
용어 "안티센스 가닥"은 표적 서열에 대해 실질적으로 상보적인 영역을 포함하는 siRNA의 가닥을 지칭한다. 본원에서 사용된 용어 "상보성 영역"은 본원에서 정의된 바와 같은 서열, 예를 들어 표적 서열에 실질적으로 상보적인 안티센스 가닥의 영역을 지칭한다. 상보성 영역이 표적 서열에 완전하게 상보적이지 않은 경우, 미스매치는 말단 영역에서 가장 잘 허용되고, 존재하는 경우, 일반적으로 말단 영역 내에, 또는 5' 및/또는 3' 말단에서 예를 들어 뉴클레오티드 6개, 5개, 4개, 3개, 또는 2개 이내인 영역 내에 있다.
본원에서 사용된 용어 "센스 가닥"은 안티센스 가닥의 영역에 실질적으로 상보적인 영역을 포함하는 siRNA의 가닥을 지칭한다.
siRNA를 지칭할 때, "세포 내로 도입하기"는 당업자에게 이해되는 바와 같이 세포 내로의 섭취 또는 흡수를 용이하게 하는 것을 의미한다. siRNA의 흡수 또는 섭취는 도움을 받지 않은 확산성 또는 활성 세포 과정을 통해, 또는 보조제 또는 장치에 의해 달성될 수 있다. 이러한 용어의 의미는 시험관 내의 세포에 한정되지 않는다; siRNA는 세포가 살아 있는 생물의 일부분인 경우에 또한 "세포 내로 도입"될 수 있다. 이같은 경우에, 세로 내로의 도입은 생물에게의 전달을 포함할 수 있다. 예를 들어, 생체내 전달을 위해, siRNA가 조직 부위 내로 주사될 수 있거나, 또는 전신 투여될 수 있다. 세포 내로의 시험관내 도입은 당업계에 공지된 방법 예컨대 전기천공 및 리포펙션(lipofection)을 포함한다.
용어 "사일런싱시키다" 및 "발현을 억제하다"는, SOST 유전자 (즉, 스클레로스틴을 코딩하는 유전자), 스클레로스틴-결합-파트너를 코딩하는 유전자 (예를 들어, 베르시칸 (CSPG2), FREM2, 피브릴린 2 (FBN2), C6orf93, 신데칸-4 (Sdc4), 아그린 (AGRN), 세르핀2 (PN-1), LRP2, LRP4, LRP6, SLIT2, 테나신 C, TRIM26, TRJM41, 글리피칸1, 알칼리성 포스파타제 (ALPL) 및 IL-17 수용체를 코딩하는 유전자), 또는 스클레로스틴, BMP, 또는 Wnt 신호전달 경로에 수반되는 임의의 유전자를 지칭하는 한, 상기 유전자가 전사되고 상기 유전자의 발현이 억제되도록 처리된 제1 세포 또는 또는 세포들의 군으로부터 단리될 수 있는 상기 유전자로부터 전사된 mRNA의 양이 제1 세포 또는 세포들의 군과 실질적으로 동일하지만 이렇게 처리되지 않은 제2 세포 또는 세포들의 군 (대조군 세포)과 비교하여 감소되는 것에 의해 나타나는 상기 유전자의 발현의 적어도 부분적인 억제를 본원에서 지칭한다. 억제 정도는 하기의 식으로 일반적으로 표현된다:
{[(대조군 세포 내의 mRNA)-(처리된 세포 내의 mRNA)]/(대조군 세포 내의 mRNA)}ㆍ100％
별법적으로, 억제 정도는 SOST 유전자, 스클레로스틴-결합-파트너를 코딩하는 유전자, 또는 스클레로스틴, BMP, 또는 Wnt 신호전달 경로에 수반되는 임의의 유전자의 전사에 기능적으로 연관된 파라미터, 예를 들어 세포에 의해 분비되는 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 양, 또는 특정 표현형을 나타내는 세포의 개수에서의 감소에 의해 제공될 수 있다. 원칙적으로, SOST 유전자, 스클레로스틴-결합-파트너를 코딩하는 유전자, 또는 스클레로스틴, BMP, 또는 Wnt 신호전달 경로에서 수반되는 임의의 유전자의 사일런싱은 표적을 구성적으로 또는 게놈 조작에 의해 발현하는 임의의 세포에서, 임의의 적합한 분석법에 의해 결정될 수 있다. 그러나, 소정의 siRNA가 SOST 유전자, 스클레로스틴-결합-파트너를 코딩하는 유전자, 또는 스클레로스틴, BMP, 또는 Wnt 신호전달 경로에서 수반되는 임의의 유전자의 발현을 특정한 정도로 억제하는지, 및 따라서 본 발명에 포함되는지 여부를 결정하기 위해 기준이 필요한 경우, 하기 실시예에서 제공된 분석법이 이같은 기준으로 작용할 수 있다.
예를 들어, 특정 예에서, SOST 유전자, 스클레로스틴-결합-파트너를 코딩하는 유전자, 또는 스클레로스틴, BMP, 또는 Wnt 신호전달 경로에서 수반되는 임의의 유전자의 발현이 본 발명의 이중-가닥 올리고뉴클레오티드의 투여에 의해 적어도 약 20％, 25％, 35％, 또는 50％만큼 억제된다. 일부 실시양태에서, 상기 유전자가 본 발명의 이중-가닥 올리고뉴클레오티드의 투여에 의해 적어도 약 60％, 70％, 또는 80％만큼 억제된다. 일부 실시양태에서, 상기 유전자가 본 발명의 이중-가닥 올리고뉴클레오티드의 투여에 의해 적어도 약 85％, 90％, 또는 95％만큼 억제된다.
용어 "결합"은 한 성분 (예를 들어, 스클레로스틴)과 또다른 성분 (예를 들어, 스클레로스틴-결합-파트너)의 물리적 회합을 지칭한다. 결합의 측정은 해리 상수, 회합 상수, 온(on)-속도 또는 오프(off)-속도와 같은 값에 이를 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "결합을 허용하는 조건"은 이러한 조건 하에 결합이 일어날, 예를 들어 온도, 염 농도, pH 및 단백질 농도의 조건을 지칭한다. 정확한 결합 조건은 분석법의 성질, 예를 들어 분석법이 순수한 단백질 또는 부분적으로만 정제된 단백질을 사용하는지 여부에 따라 변할 것이다. 결합을 위한 온도는 15℃ 내지 37℃로 변할 수 있지만, 바람직하게는 실온 내지 약 30℃ 사이이다. 결합 반응에서의 스클레로스틴의 농도 또한 변할 것이지만, 바람직하게는 약 10 pM 내지 10 nM일 것이다 (예를 들어, 방사성표지된 성분을 사용하는 분석법에서).
이러한 용어가 본원에서 사용될 때, 1 mM 미만, 일반적으로는 100 nM 내지 10 pM 범위의 Kd로 결합이 발생하는 경우 결합은 "특이적"이다. 예를 들어, Kd가 100 nM, 50 nM, 10 nM, 1 nM, 950 pM, 900 pM, 850 pM, 800 pM, 750 pM, 700 pM, 650 pM, 600 pM, 550 pM, 500 pM, 450 pM, 350 pM, 300 pM, 250 pM, 200 pM, 150 pM, 100 pM, 75 pM, 50 pM, 25 pM, 10 pM 또는 그 이하이면 결합이 특이적이다.
본 발명은 스클레로스틴에 대한 단백질 결합제 (본원에서 "스클레로스틴-결합-파트너(들)"로 지칭됨)의 발견에 관한 것이다. 스클레로스틴은 상기 스클레로스틴-결합-파트너에 결합되었을 때 (또는 다른 방식으로 이와 상호작용할 때) 골 침착을 억제할 수 있고, 상기 결합 또는 상호작용의 부재 하에, 결합 파트너가 스클레로스틴 작용의 양성 매개물 또는 억제제로 작용하는지 여부에 따라 골 침착의 억제가 부분적으로 감퇴되거나 증가된다. 스클레로스틴은 또다른 단백질 및 신호전달 경로를 조절하는 것으로 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 스클레로스틴이 골 형태형성 단백질 (BMP) 신호전달의 정황-의존적 길항제로서 기능할 수 있는 것으로 연구에서 나타났다. 또한, 스클레로스틴은, 아마도 LRP5 및 LRP6 Wnt 공동-수용체에의 결합에 의해, 윙리스(Wingless)/INT (Wnt) 신호전달 경로의 억제제로서 또한 기능할 수 있다. 성체 골 형성을 조절하는 스클레로스틴의 능력은 Wnt 신호전달 억제를 통해 발생할 수 있고, 이러한 이론은 스클레로스틴에서의 기능 손실 돌연변이 및 LRP5에서의 기능 획득 돌연변이와 관련된 인간 골 과성장 장애에서의 높은 표현형 중복에 의해 뒷받침된다.
스클레로스틴이 또다른 단백질 및 신호전달 경로를 조절하는 것으로 당업계에 공지되어 있기 때문에, 마찬가지로 스클레로스틴:스클레로스틴-결합-파트너 상호작용의 조절은 또다른 단백질 및 신호전달 경로 (예를 들어, Wnt 및 BMP)에 영향을 미칠 수 있고, 또다른 방식으로 이에 대한 효과를 발휘할 수 있다. 따라서, 스클레로스틴:스클레로스틴-결합-파트너 상호작용의 조절 (예를 들어, 본 발명의 방법 및 조성물에 의한 조절)로 변경된 스클레로스틴 수준 또는 증가 또는 감소된 골 밀도가 초래될 수 있고, 각각 스클레로스틴-관련 장애, 또는 골 무기질 밀도가 비정상적인 장애의 치료에 영향을 줄 수 있다. 이것은 하기의 실시예 섹션에서 실연된다.
과거의 연구에서 다른 요인들이 Wnt 및 BMP 신호전달 경로를 통한 골 침착에 연루되었지만, 본원에서 상술된 (그리고 본 발명에 포함되는) 발견들은 스클레로스틴:스클레로스틴-결합-파트너 상호작용에 의한 이러한 경로들의 조절을 드러낸다는 점에서 중요하다. 달리 말하면, 스클레로스틴을 활성화 또는 억제함으로써 이의 생물학적 활성 (예를 들어, 골 침착을 억제함)을 달성할 수 있게 하기 위하여 스클레로스틴:스클레로스틴-결합-파트너 상호작용이 중요하다.
예를 들어, 피브릴린 2는 스클레로스틴의 중요한 결합 파트너이거나, 본원에 기술된 바와 같은, 적어도 스클레로스틴으로 구성되는 다중-복합체의 일부분이다. 이러한 상호작용은 더욱 안정적인 형상으로의 스클레로스틴의 리폴딩(refolding)을 유도할 수 있고/있거나, 피브릴린-2와 BMP 신호전달 간의 기능적인 상호작용을 개시시킴으로써, 스클레로스틴과 BMP 신호전달 간의 연결을 제공할 수 있다. 마찬가지로, 피브릴린 2와 스클레로스틴 간의 상호작용은 피브릴린-2과 Wnt 신호전달 간의 기능적인 상호작용을 개시시킴으로써, 스클레로스틴과 Wnt 신호전달 간의 연결을 제공할 수 있다. 15N-스클레로스틴 제제는 NMR에 의해 오직 25％만의 구조화를 나타내고, 이는 아마도 리간드(들) 예컨대 피브릴린 2에 결합할 때의 스클레로스틴 폴딩에 기인할 것이다.
이러한 발견들로부터 본 발명의 방법 및 조성물을 발명하였으며, 이들은 스클레로스틴-관련 장애 및/또는 골 무기질 밀도가 비정상적인 장애를 특히 치료, 예방 및 진단할 수 있다. 예를 들어, 스클레로스틴:스클레로스틴-결합-파트너 상호작용을 조절 (예를 들어, 파괴)함으로써 비정상적으로 낮은 골 무기질 밀도를 특징으로 하는 장애 (예를 들어, 골다공증)가 예방, 치료 또는 개선될 수 있다.
예를 들어, 스클레로스틴:피브릴린 2 상호작용의 파괴 (예를 들어, 항-피브릴린 2 항체 또는 억제성 뉴클레오티드의 사용을 통한 파괴)를 사용하여, 골다공증을 예방, 치료 또는 개선할 수 있다. 별법적으로, 스클레로스틴:스클레로스틴-결합-파트너 상호작용을 조절함으로써 (예를 들어 강화 또는 작동시킴), 또는 스클레로스틴에 대한 피브릴린 2 결합과 기능적 효과가 동일하거나 유사한 피브릴린 2 모방체를 투여함으로써, 비정상적으로 높은 골 무기질 밀도를 특징으로 하는 장애 (예를 들어, 골다공증)가 예방, 치료 또는 개선될 수 있다. 예를 들어, 스클레로스틴 작용을 강화시키는 방식으로, 스클레로스틴:피브릴린 2 상호작용을 작동시키는 것 (예를 들어, 피브릴린 2 모방체의 제공을 통해 작동시키는 것)을 사용하여, 경화협착증이 예방, 치료 또는 개선될 수 있다.
또한, 다수의 경우에, 스클레로스틴과 스클레로스틴-결합-파트너 간의 상호작용이 스클레로스틴-결합-파트너와 BMP 신호전달 간의 기능적인 상호작용을 개시시킴으로써, 스클레로스틴과 BMP 신호전달 간의 연결을 형성할 수 있다. 마찬가지로, 스클레로스틴:스클레로스틴-결합-파트너 상호작용이 스클레로스틴-결합-파트너와 Wnt 신호전달 간의 기능적인 상호작용을 개시시킴으로써, 스클레로스틴과 Wnt 신호전달 간의 연결을 제공할 수 있다.
예를 들어, 스클레로스틴과 아그린 간의 상호작용이 아그린과 BMP 신호전달 간의 기능적인 상호작용을 개시시킴으로써, 스클레로스틴과 BMP 신호전달 간의 연결을 형성할 수 있다. 마찬가지로, 스클레로스틴-아그린 상호작용이 아그린과 Wnt 신호전달 간의 기능적인 상호작용을 개시시킴으로써, 스클레로스틴과 Wnt 신호전달 간의 연결을 제공할 수 있다.
스클레로스틴/SOST
SOST 유전자에 의해 코딩되는 단백질인 스클레로스틴은 골세포에 의해 분비되는 골 형성의 강력한 음성 조절물이다 (Swiss-Prot 접속 번호 Q9BQB4). 스클레로스틴의 DAN 집단의 TGF-β 길항제들과의 시스테인-결절(knot)에서의 유사성으로 인해, 스클레로스틴은 처음에는 단지 골 형태형성 단백질 (BMP) 길항제인 것으로 가정되었으나 ([Brunkow et al (2001) Am J Hum Genet, 68:577-589]), 생체내에서 BMP와 직접적으로 상호작용하는 이의 능력은 여전히 확실하지 않다.
스클레로스틴 또는 SOST 발현이 손실되면, 예를 들어 경화협착증의 경우와 같이, 제어되지 않은 골 형성이 초래된다 ([Brunkow et al. (2001) Am J Hum Genet.;68(3):577]). 경화협착증에 걸린 환자에서 일생의 골 과성장이 지속되고, 결과적으로 골 질량 및 강도가 증가된다. 이러한 열성 장애에 대한 이종접합성 보유자 또한 증가된 골 질량을 나타낸다 ([Gardner et al. 2005 J Clin Endocrinol Metab. 90(12):6392]). 이러한 표현형은 SOST 결핍 마우스에서 반복될 수 있고, 이의 과발현은 골감소증을 초래한다 ([Loots et al. 2005 (Genome Res. 2005 15(7):928)]). 또한, 경화협착증의 표현형 복사본인 반 부헴 질환이 긴 범위 골 인핸서의 게놈 결실로 인한 SOST의 잘못된 조절에 의해 야기되는 것으로 발견되었다 ([Loots et al. 2005 (Genome Res. 2005 15(7):928)]). 마지막으로, SOST가 골 형성 동안 골 인핸서를 통해 부갑상선 호르몬 (유일하게 임상적으로 확인된 골 형성 성분)에 의해 하향-조절되는 것으로 연구에서 나타났다 ([Keller, Kneissel 2005, Bone. 2005 37(2):148]). 따라서, 스클레로스틴 작용의 억제는 골다공증에 대한 이상적인 치료법을 초래하여야 한다.
정확히 어떻게 스클레로스틴이 음성 골 형성 조절물로서 이의 영향을 발휘하는지는 여전히 불명확하지만, 스클레로스틴이 골 형태형성 단백질 (BMP) 및 윙리스/INT (WNT) 신호전달 (양쪽 모두 골 형성에 결정적임)을 억제하는 것으로 연구에서 나타났다. 스클레로스틴은 BMP 신호전달의 정황-의존적 길항제로서 기능할 수 있다. 더욱이, 스클레로스틴은 Wnt 신호전달 경로의 억제제로서 또한 기능할 수 있고, 이는 아마도 아직 확인되지 않은 공동-인자(들)의 존재 하에 Lrp5 및 Lrp6 ([Semenov MV, He X. J Biol Chem. 2006 ;281(50):3827]) Wnt 공동-수용체에 결합하는 것에 의해서일 것이다. 스클레로스틴이 Wnt 신호전달 억제를 통해 성인 골 형성에 영향을 미칠 수 있다는 가설은 스클레로스틴에서의 기능 손실 돌연변이 및 LRP5에서의 기능 획득 돌연변이와 관련된 인간 골 과성장 장애에서의 높은 표현형 중복에 의해 지지된다.
스클레로스틴에는 출생후 삶 동안 추가적인 역할이 있을 수 있다. 경화협착증 환자는 일반적으로 키가 크고 ([Van Hul et al. (2001) European Journal of Radiology 40 198]), 이는 연골 생물학에서의 스클레로스틴에 대한 추정되는 역할을 시사한다. 또한, 스클레로스틴이 신장에서 발현되고, 이는 스클레로스틴이 이러한 기관에서 아직 특성화되지 않은 역할을 할 수 있다는 것을 암시한다 ([Balemans et al. 2001 Hum Mol Genet.10(5):537], [Balemans and Van Hul (2002) Developmental Biology 250, 231]). 마지막으로, 심장혈관계에서 적어도 배아 발달 동안 스클레로스틴이 발현되는 것으로 나타났다 ([van Bezooijen et al. (2006) Dev Dyn. 2006;236(2):606]).
베르시칸 (CSPG2)
베르시칸은 아그리칸, 뉴로칸 및 브레비칸이 포함되는 렉티칸 부류의 구성원이다. 이는 대형 콘드로이틴 술페이트 프로테오글리칸이다. 이의 N-말단 구형 도메인 (G1)은 글리코사미노글리칸 히알루로난에 결합하고, 이의 카브록시-말단 구형 도메인 (G3)은 렉틴-유사 도메인 및 보체 조절 단백질-유사 도메인인 2개의 EGF-유사 도메인으로 구성된다. 베르시칸의 4개의 스플라이스 변이체 (V0-V4)가 공지되어 있다 ([Wight, TN (2002) Curr.Opin.Cell Biol.; 14 (5):617-23]). 베르시칸 V0 및 V1은 ADAMTS1 및 4 (아그리카나제(aggrecanase)-1)에 의해 절단되고 ([Sandy, et al. (2001) J.Biol.Chem.; 276 (16):13372-8], [Russell, et al. (2003) J. Biol. Chem.; 278 (43):42330-9]), 베르시칸 V2는 ADAMTS4에 의해 절단된다 ([Westling, et al. (2004) Biochem.J.; 377 (Pt. 3):787-95]).
베르시칸은 광범위한 조직에 분포된다. 나카무라(Nakamura) 등은 발달 중인 하악 및 뒷발에서 베르시칸 발현을 연구하였다. 이들의 결과를 기초로, 이들은 하기를 제안하였다. 베르시칸은 골모세포의 분화 전에 발현되고, 막내 골화 동안 풋뼈 내에 국소화된다. 연골내 골화에서, 베르시칸은 석회화 연골의 표면 상의 활성 골형성 영역 위에 놓인 골막 세포에서 발현된다. 그후, 어느 한쪽 유형의 골화를 겪고 있는 뼈에 골 발달의 통상적인 순차적인 과정이 진행된다. 골 기질이 확장되고, 베르시칸이 풍부한 무층뼈가 형성된다. 베르시칸 mRNA 및 단백질이 골모세포에서, 골세포의 한정된 집단에서, 뿐만 아니라 골 기질에서 검출된다. 무층뼈가 층판뼈로 변경됨에 따라, 골 기질에서의 베르시칸 발현이 감소된다. ADAMTS1, 4 및 5의 시간적 및 공간적 mRNA 발현은 베르시칸에 필적한다. ADAMTS를 분비함으로써 골모세포 및 골세포가 베르시칸의 생산 및 분해 양쪽 모두에 수반되는 것으로 가정되었다 ([Nakamura, et al. (2005) J. Histochem. Cytochem.; 53 (12): 1553-62]). 마지막으로, 래트 추간판 세포에서 절반 베르시칸 유전자 발현에 의해 BMP-2가 감소된다는 사실에 의해 베르시칸 및 BMP 신호전달이 연결된다 ([Li, et al. (2004) J.Spinal Disord.Tech.; 17(5):423-8]).
본원에서 추가적으로 상술된 바와 같이, 베르시칸 (CSPG, IPI00009802.1)은 TAP (Tandem Affinity Purification: 탠덤 친화력 정제) 결합 분석법의 Hek293 세포 배양물 상등액 분획에서 스클레로스틴의 결합 파트너로서 확인되었다. 베르시칸은 스클레로스틴의 중요한 결합 파트너인 것으로 생각되거나, 또는 적어도 스클레로스틴으로 구성된 다중-복합체의 일부분이고, 이들간의 상호작용은 스클레로스틴의 더욱 안정적인 형상으로의 리폴딩을 유도할 수 있다 (따라서, 스클레로스틴 작용을 조절할 수 있다). 스클레로스틴:베르시칸 상호작용은 또한 스클레로스틴과 Wnt 신호전달 간의 연계로서 작용한다.
FREM 2
my 유전자 (척수뇌 수포 유전자)에 의해 코딩되는 Frem2는 제안된 ECM 성분이고, Fras1 및 Frem1 (Fras1 관련 세포외 매트릭스)에 관련되며, 성게 ECM3 단백질에 대해 오르토로거스(orthologous)하다. 이의 예상 단백질 배열은 N-말단 신호 펩티드에 이어지는 13개의 직렬 배열된 콘드로이틴 술페이트 프로테오글리칸 도메인 (CSPG), 5개의 직렬 배열된 CALXβ 도메인, 막횡단 나선, 및 컨센서스 PDZ 상호작용 모티프가 있는 짧은 세포질 꼬리로 구성된다.
Frem2에서의 미스센스 돌연변이가 수포형성 돌연변이체 (my UcI), 및 잠복안구, 피부형 합지증, 귀 이상, 신장 무발육증 및 선천성 심장 결함을 일반적으로 포함하는 다기관 기형인 프레이저 증후군의 두 개체에서 검출되었다. 흥미롭게, my UcI 마우스는 골형 합지증이 종종 동반되는 피부형 합지증 및 다지증을 나타낸다. 아미노산 치환 E1972K가 초래되는 뉴클레오티드 변이 5914G → A가 관련되지 않은 두 가족에서 확인되었다. 이러한 돌연변이는 5개의 연속적인 CALXβ 도메인 중 2번째에서 발생하고, 모든 공지된 CALXβ 도메인에서 보존되는 잔기를 치환한다. 서열 유사성 검색은 CALXβ가 연속적인 도메인들 사이의 음성 전하를 띠는 주머니 내에 칼슘 이온을 끼워넣는 것으로 공지된 카드헤린 도메인과 관련된다는 것을 나타냈다. 구조 정렬에 대한 서열은 Glu 1972가 CALXB 도메인 2와 3의 계면의 Ca2+ 결합 주머니 내에 위치하고, Ca2+의 배위에 직접적으로 수반되는 보존된 위치에 상응한다는 것을 나타냈다. 이는 CALXβ-카드헤린 모티프에서의 칼슘 결합이 FREM2의 정상적인 기능수행에 중요하다는 것을 시사한다 ([Jadeja S, et al. (2005) Nat.Genet; 37 (5):520-5]).
본원에서 추가적으로 상술된 바와 같이, Frem2 (IPI00180707.7)는 TAP 결합 분석법의 Hek293 세포의 막 정제 분획에서 스클레로스틴의 결합 파트너로서 확인되었다. Frem2는 스클레로스틴의 중요한 결합 파트너인 것으로 생각되거나, 또는 적어도 스클레로스틴으로 구성된 다중-복합체의 일부분이고, 이들간의 상호작용은 스클레로스틴의 더욱 안정적인 형상으로의 리폴딩을 유도할 수 있다 (따라서, 스클레로스틴 작용을 조절할 수 있다).
피브릴린 2 CFBN2)
당단백질 피브릴린-1 및 2는 평균 직경이 10 nm인 세포외 칼슘-결합 미세원섬유의 주요 구조 성분이다. 피브릴린들은 아미노산 서열 상동성 정도가 높은 보존된 다중도메인 구조를 공유한다. 피브릴린-2는 잠복성 TGF-β1 결합 단백질 (LTBP)에서 또한 발견되는 8개의 시스테인을 함유하는 모듈들에 의해 중단된 47개의 EGF-유사 도메인 (이중 43개는 컨센서스 칼슘 결합 서열이 있음), 독특한 C- 및 N-말단 도메인 및 소형 글리신-풍부 도메인으로 구성된다. 피브릴린-2는 탄력 조직, 예컨대 탄력 연골 및 대동맥의 중간막층에 우선적으로 국소화된다 ([Putnam, et al. (1995) Nat.Genet.; 11 (4):456-8]). 뼈에서, 피브릴린-1과 함께, 피브릴린-2 mRNA는 근위 대퇴골로부터 유래된 해면골에 의해, 그리고 1차 배양물 내의 성숙한 뼈에서 유래된 인간 골모세포에 의해 풍부하게 발현된다 ([Kitahama, et al. (2000) Bone; 27 (1):61-7]).
피브릴린-2 돌연변이는 거미손발가락증, 거미팔다리증, 척추측만증, 다발성 선천적 구축 및 외이 이상을 특징으로 하는 보통염색체 우성 장애인 선천적 구축성 거미손발가락증 (CCA)을 초래한다. CCA는 피브릴린-1에서의 돌연변이로부터 초래되는 마르판(Marfan) 증후군과 표현형적으로 유사하지만, 대동맥 및 눈에 영향을 미치지 않는다. FBN2 미스센스 돌연변이는 2명의 CCA 환자에서 별도의 EGF-유사 반복부들 내의 별개의 시스테인 잔기들에서의 치환을 야기한다 ([Putnam, et al 1995]). 피브릴린-2-무효(null) 마우스는, 주로 결손성 중간엽 분화로 인해, 양측성 합지증 형태의 사지-패턴화 결함을 나타낸다. 합지증은 해체형(disorganized) 매트릭스와 관련되지만, 정상적인 BMP 유전자 발현과 관련된다. 무효 Fbn2 및 Bmp7 대립유전자에 대해 이중 이종접합성인 마우스는 양쪽 모두 무효인 접합체의 합쳐진 손발가닥 표현형 (합지증 및 다지증)을 나타낸다 ([Arteaga- Solis, et al. (2001) J.Cell Biol; 154 (2):275-81]). 다지증은 동종접합성 BMP-7 무효 마우스의 양상이고 (이종접합성은 아님), 이종접합성 피브릴린-2 마우스는 정상이기 때문에, 이중 이종접합성 마우스의 표현형은 사지 패턴화 동안의 피브릴린-2-풍부 미세원섬유와 BMP-7 신호전달 간의 기능적인 상호작용을 시사하였다.
피브릴린-2는 발달 중인 생물의 세포간 공간에서 형태형성 실마리들을 배열하는 구조적 스캐폴드를 제공할 수 있다. 이러한 기능은 비활성 성장 인자에 직접 결합함으로써 (예컨대 잠복성 TGF-β 복합체의 경우), 다른 매트릭스 성분 (예컨대 프로테오글리칸)과의 상호작용을 통해 간접적으로, 또는 양쪽 메커니즘의 조합에 의해 발휘될 수 있다 ([Arteaga-Solis, 상기 문헌]). 최근, BMP-7가 피브릴린-1 무효 마우스에서 피브릴린-2와 공동-국소화되는 것으로 나타났다. ([Gregory, et al. (2005) J.Biol.Chem.; 280 (30): 27970-80]).
본원에서 추가적인 상세설명에 기술된 바와 같이, 피브릴린 2 전구체 (FBN2, IPI00019439.1)는 TAP 결합 분석법에서 Hek293 세포의 막 정제 분획에서 스클레로스틴의 결합 파트너로서 확인되었다. 피브릴린 2는 스클레로스틴의 중요한 결합 파트너인 것으로 생각되거나, 또는 적어도 스클레로스틴으로 구성된 다중-복합체의 일부분이다. 이러한 결합은 스클레로스틴의 더욱 안정적인 형상으로의 리폴딩을 유도할 수 있고, 피브릴린-2와 BMP 신호전달 간의 기능적인 상호작용을 개시시킴으로써, 스클레로스틴과 BMP 신호전달 간의 연결을 형성할 수 있다. 마찬가지로, 스클레로스틴-피브릴린 2 상호작용이 피브릴린-2와 Wnt 신호전달 간의 기능적인 상호작용을 개시시킴으로써, 스클레로스틴과 Wnt 신호전달 간의 연결을 제공할 수 있다.
C6orf93
C6orf93은 LTV1 상동체로 또한 명명된 가상 단백질이다 (사카로마이세스 세레비지아에(S. cerevisiae)). 인간에서, 이는 프레임에서 2002년에 최초로 기술되었다 ([Strausberg, et al. (2002) PNAS; 99 (26): 16899-903]). 사카로마이세스 세레비지아에에서, 저온 생육성 단백질 LTV1은 비-필수적인 비-리보솜성 단백질을 코딩한다. LTV1 및 YAR1이 결여된 균주는 다양한 환경적 스트레스, 예컨대 삼투압 및 산화 스트레스, 저온 및 고온 및 특정 단백질 합성 억제제의 존재에 대한 과민성을 나타내어, 리보솜 생합성 인자들과 환경적 스트레스 민감성 간의 미지의 관계를 드러낸다 ([Loar, et al. (2004) Genetics.; 168 (4): 1877-89]). Ltv1은 유전학적으로 소형 리보솜 서브유닛 수출 인자 Yrb2와 상호작용하고, 이는 Ltv1이 핵 수출 장치를 소형 서브유닛에 연결시키는 여러 가능한 어댑터 단백질들 중 하나로 기능한다는 것을 시사한다 ([Seiser, et al. (2006) Genetics.; 174(2):679-691]).
본원에서 추가로 상술된 바와 같이, C6orf93 (IPI0053032.1)은 TAP 결합 분석법의 Hek293 및 UMR106 막 정제 분획에서 스클레로스틴의 결합 파트너로서 확인되었다. C6orf93은 스클레로스틴의 중요한 결합 파트너인 것으로 생각되거나, 또는 적어도 스클레로스틴으로 구성된 다중-복합체의 일부분이다. 스클레로스틴:C6orf93 상호작용은 스클레로스틴의 더욱 안정적인 형상으로의 리폴딩을 유도할 수 있고 (따라서 스클레로스탄 작용을 조절할 수 있고), C6orf93과 BMP 또는 Wnt 신호전달 간의 기능적인 상호작용을 개시시킬 수 있으며, 스클레로스틴과 이러한 경로들 간의 연결로서 작용한다. 스클레로스틴:C6orf93 상호작용은 환경적 스트레스에 대한 골세포의 민감성에 또한 연루된다.
신데칸-4 (Sdc4)
신데칸-1 내지 -4는 헤파란 술페이트 프로테오글리칸 부류의 구성원인 단일-통과 통합형 막 성분이다. 각각의 신데칸에는 짧은 세포질 도메인, 단일-통과 막횡단 도메인, 및 세포주변 환경이 세포 내부와 직접적으로 연결되도록 하는 3개 내지 5개의 글리코사미노글리칸 사슬에 대한 부착 부위들이 있는 세포외 도메인이 있다. 세포내 신호전달 케스케이드를 활성화시키고 포유류 세포에서 병소 부착 부위를 형성하는 능력으로 인해, 암피글리칸 또는 리우도칸으로 또한 명명된 신데칸-4는 독특한 구성원이다. 이는 이의 글리코사미노글리칸 사슬을 통해 피브로넥틴에 결합하고, PKCα 및 소형 GTPase RhoA를 활성화시키며, 인테그린과 함께 병소 부착 부위를 안정화시킨다 ([Tkachenko E, et al. (2005) Circ.Res.; 96 (5):488-500]). 제노푸스(Xenopus)에서, 피브로넥틴은 비-정규 Wnt 신호전달의 활성화에서의 랜드마크인, Dsh를 형질막으로 전위시키는 신데칸-4의 능력을 조절한다 ([Munoz R, et al. (2006) Nat.Cell Biol.; 8 (5):492-500]).
신데칸-4는 1차 래트 머리덮개뼈 골모세포를 포함하는 여러 세포 유형에서 편재(遍在)성으로 발현되고, 상기 세포에서 FGF2 처리에 의해 이의 mRNA 발현이 상향조절된다. 이러한 상향조절은 시클로헥시미드 처리 후의 신데칸-4 mRNA의 감소에 의해 시사되는 바와 같은 즉각적인 응답이 아니다. 골모세포 증식 및 무기질화, 뿐만 아니라 ERK 활성화가 FGF2에 의해 또한 강화되지만, 항-신데칸-4 항체 예비처리에 의해 명확하게 감소된다 ([Song SJ, et al. (2007) J.Cell Biochem.; 100(2):402-411]). C2C12 세포에서, 신데칸-2 및 -3이 BMP-2에 의해 상향조절되지만 ([Gutierrez J, et al. (2006) J. Cell Physiol; 206 (1):58-67]), 신데칸-3은 연골형성 동안 BMP-2 신호전달의 음성 조절물질이다 ([Fisher MC, et al. (2006) Matrix Biol.; 25 (1):27-39]). 초파리에서, 신데칸은 발달 중인 축삭에 국소화되고, SLIT 및 Robo와 유전학적으로 및 물리학적으로 상호작용하고, SLIT/Robo 신호전달을 통해 축삭성 및 근육대롱 안내물을 촉진한다 ([Johnson KG, et al. (2004) Curr.Biol.; 14 (6):499-504], [Steigemann P, et al. (2004) Curr.Biol.; 14 (3):225-30]). 마지막으로, 신데칸-4는 신데칸-4 항체 상에 시딩(seeding)되는 경우 활성화된 B 림프구에서 필로포디아(filopodia)-유사 구조를 유도할 수 있다 ([Yamashita Y, et al. (1999) J.Immunol.; 162 (10):5940-8]).
본원에서 추가로 상술된 바와 같이, 신데칸-4 (sdc4, IPI00199629.1)는 TAP 결합 분석법의 래트 골육종 UMR106 세포 배양물 상등액에서 스클레로스틴의 결합 파트너로서 확인되었다. 신데칸은 스클레로스틴의 중요한 결합 파트너 (본원에서 "스클레로스틴-결합-파트너"로 정의됨)인 것으로 생각되거나, 또는 적어도 스클레로스틴, SLIT 및 신데칸-4로 구성된 다중-복합체의 일부분이다. 이러한 결합은 골세포 가지돌기-유사 융기물의 개시를 조절할 수 있거나, 또는 스클레로스틴의 더욱 안정적인 형상으로의 리폴딩을 유도할 수 있고 따라서 스클레로스틴 작용을 조절할 수 있다. 또한, 신데칸-4는 스클레로스틴과 Wnt 및/또는 BMP 신호전달 간의 연결물로서 작용할 수 있다.
SLIT2
SLIT2는 세포 이동에서 분자성 안내물로 작용하는 분비형 단백질이고, 이의 기능은 라운드어바웃(roundabout) 상동성 수용체와의 상호작용에 의해 매개된다. 이는 척수에서 발현되고, 초기 신체축 형성 및 신경관의 세포 패턴화에서 수반된다.
스클레로스틴과 구조적으로 관련된 그레믈린(Gremlin) 및 댄(Dan)은 Slit1 및 Slit2 단백질과 물리적으로 및 기능적으로 상호작용하고, 이에 의해 단핵구 화학주성의 억제제로서 작용한다 ([Chen et al. (2004) J Immunol.; 173(10):5914]). 또한, Slit 단백질은 본 발명에 기술된 실험에서 스클레로스틴 상호작용 파트너로서 또한 확인된 헤파란 술페이트 프로테오글리칸 글리피칸-1의 고-친화력 리간드이다 ([Ronca et al. (2001) J Biol Chem. 276(31):29141]). 또한, 본 발명에서 또한 기술된 신데칸은 slit/robo 신호전달에 의해 축삭성 및 근육대롱 안내물을 촉진한다 ([Johnson KG, et al. (2004) Curr.Biol. 14 (6):499-504], [Steigemann P, et al. (2004) Curr.Biol. 14 (3):225-30])
SLIT2 (IPI00006288.1)는 TAP 결합 분석법의 HEK293 세포 배양물 막 분획에서 스클레로스틴의 결합 파트너로서 확인되었다. SLIT2는 스클레로스틴의 중요한 결합 파트너 (본원에서 "스클레로스틴-결합-파트너"로 정의됨)인 것으로 생각되거나, 또는 적어도 스클레로스틴, SLIT, 및 가능하게는 신데칸-4 및 글리피칸 1로 구성된 다중-복합체의 일부분이다. 이러한 결합은 골세포 가지돌기-유사 융기물의 생성을 조절할 수 있거나, 또는 스클레로스틴의 더욱 안정적인 형상으로의 리폴딩을 유도할 수 있고 따라서 스클레로스틴 작용을 조절할 수 있다. 또한, SLIT2는 스클레로스틴과 Wnt 및/또는 BMP 신호전달 간의 연결물로서 작용할 수 있다.
글리피칸1 (Gpc1)
글리피칸은 세포외 단백질 리간드와 공동-수용체로 작용하는 이의 수용체의 만남을 조절한다. 이는 Wnt 신호전달 ([Capurro et al. (2005), Cancer Res.;65(14):6245]) 및 BMP 신호전달 [예를 들어 BMP 길항제와 상호작용함으로써] ([Paine-Saunders et al. (2000) Dev Biol.;225(1):179])을 조절하는 것으로 공지되어 있다. 예를 들어, 글리피칸 3에서의 돌연변이로 골 과성장과 관련된 다양한 증후군이 초래된다. 예를 들어. 심슨-골라비-베흐멜 과성장 증후군 ([Pilia et al. (1996), Nat Genet.12(3):241])은 Wnt 신호전달에 대한 Gpc3 제어 상실의 결과이다 ([Song et al. (2005); Biol Chem 280(3):2116)]).
글리피칸은 골모세포성 계통의 세포에서 발현되고, 골 리모델링의 잠재적인 조절물질로서 제안되었다 ([Sheu et al. (2002) J Bone Miner Res.17 (5):915]).
또한, 글리피칸 1은 스클레로스틴 상호작용 파트너로서 본 발명에 또한 기술된 SLIT에 결합한다 ([Ronca et al. (2001) J Biol Chem. 276(31):29141]).
Gpc1 (IPI00137336.1)은 TAP 결합 분석법의 골모세포성 UMR-106 세포 배양물 상등액에서 스클레로스틴의 결합 파트너로서 확인되었다. Gpc1은 스클레로스틴의 중요한 결합 파트너 (본원에서 "스클레로스틴-결합-파트너"로 정의됨)인 것으로 생각되거나, 또는 적어도 스클레로스틴, Gpc1 및 가능하게는 신데칸-4 및 SLIT2로 구성된 다중-복합체의 일부분이다. 이러한 결합은 골세포 가지돌기-유사 융기물의 생성을 조절할 수 있거나, 또는 스클레로스틴의 더욱 안정적인 형상으로의 리폴딩을 유도할 수 있고 따라서 스클레로스틴 작용을 조절할 수 있다. 또한, 글리피칸 1은 스클레로스틴과 Wnt 및/또는 BMP 신호전달 간의 연결물로서 작용할 수 있다.
아그린 (AGRN)
아그린은 분자량이 약 600 kDa (200 kDa 단백질 코어)인 대형 세포외 매트릭스 헤파린 술페이트 프로테오글리칸이다. 별법적인 mRNA 스플라이싱으로 절단된 신호 서열에 이어지는 아미노-말단-아그린 도메인을 코딩하여 분비형 형태의 아그린 (NtA-아그린)이 초래되는 이소형, 및 내부의 절단되지 않은 신호 펩티드가 있는 더 짧은 아미노 말단을 함유하여, 단백질을 제II형 막횡단 단백질 (TM-아그린)로 전환시키는 이소형이 생성된다. 양쪽 이소형은 차별적으로 발현된다: NtA-아그린은 대부분의 기저판-함유 조직에서 편재성으로 발현되고, TM-아그린은 중추 신경계에서 우선적으로 발현된다 ([Burgess, et al. (2000) J.Cell Biol.; 151 (1):41- 52], [Neumann, et al. (2001) Mol.Cell Neurosci.; 17 (1):208-25]). 최근, 아그린이 마우스 연골세포에서 발현되고, 성장판에 국소화되는 것으로 나타났다 ([Hausser et al. (2007) Histochem Cell Biol.; 127:363]). NtA-아그린-결핍 마우스는 아그린이 골격근 내의 신경근육 접합부에서 시냅스후 발달 동안 아세틸콜린 수용체의 응집에 필요하다는 증거를 제공하였다 ([Gautam, et al. (1996) Cell.; 85 (4):525-35]). 아그린- 및 MuSK-결핍 마우스 표현형의 유사성에 의해 실연되는 바와 같이, 이러한 능력은 근육-특이적 수용체 타이로신 키나제 MuSK를 필요로 한다 ([DeChiara, et al. (1996) Cell.; 85 (4):501-12]). 래트 골격근 세포에서의 아그린의 과발현은 필로포디아의 형성을 유도한다 ([Uhm, et al. (2001) J.Neurosci.; 21 (24):9678-89]). 내인성 TM-아그린의 항체-유도 클러스터링은 중추 및 말초 뉴런의 축삭들을 따라서 필로포디아-유사 융기물의 형성이 증가되는 것에 이른다 ([Annies, et al. (2006) Mol. Cell Neurosci.; 31 (3):515-24]). 해마 뉴런 배양물에서의 TM-아그린의 과발현 및 siRNA를 통한 하향조절은 TM-아그린이 발달 중인 신경염 상의 필로포디아의 개수를 필로포디아의 개시 및 안정화 양쪽 모두에 대한 이의 효과에 의해 양성적으로 조절한다는 것을 시사한다 ([McCroskery, et al. (2006) Mol. Cell Neurosci.; 33(1): 15-28]).
본원에서 추가로 상술된 바와 같이, 아그린 (IPI00374563.2)은 TAP 결합 분석법의 Hek293 세포 배양물 상등액 분획에서 스클레로스틴의 결합 파트너로서 확인되었다. 아그린은 스클레로스틴의 중요한 결합 파트너인 것으로 생각되거나, 또는 적어도 스클레로스틴으로 구성된 다중-복합체의 일부분이고, 이들간의 상호작용은 골세포 필로포디아-유사 융기물의 개시 및 안정화를 조절할 수 있거나, 또는 스클레로스틴의 더욱 안정적인 형상으로의 리폴딩을 유도할 수 있다 (따라서 스클레로스틴 작용을 조절할 수 있다).
세르핀2 (PN-1)
세르핀 2는 프로테아제 넥신 I (PN-1) 또는 아교세포 유래 넥신 전구체 (PI7)로 또한 명명된 세르핀 펩티다제 억제제를 코딩한다. 이는 43 kDa의 분비형 단백질이고, 세린 프로테아제 억제제 (SERPIN) 거대부류의 구성원이며, 별아교세포, 평활근, 내피 세포 및 섬유모세포에 의해 합성되는 것으로 기술되었다 ([Scott, et al. (1985) J.Biol.Chem.; 260 (11):7029-34], [Rosenblatt, et al. (1987) Brain Res.; 415 (1):40-8], [Festoff, et al. (1991) J.Cell Physiol.; 147 (1):76-86], [Bouton, et al. (2003) Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.; 23 (1):142-7]). 이는 트롬빈 및 소변 플라스미노겐 활성화제 (uPA)의 강력한 억제제이고, 플라스민 및 트립신의 덜 강력하지만 여전히 효과적인 억제제이다 ([Scott, et al. (1985) DNA Cell Biol.; 22 (2):95-105]). 트롬빈-PN-1 복합체의 효율적인 이화작용은 LRP-1 및 헤파린 양쪽 모두를 필요로 하는 상승작용성 메커니즘이다: 먼저, 트롬빈-PN-1 복합체가 헤파린에 의해 세포 표면에 농축되고, 이어서 LRP-1에 의해 내재화된 후, 세포에 의해 분해된다 ([Knauer, et al. (1997) J. Biol. Chem.; 272 (46):29039-45], [Scott, et al. (2003) DNA Cell Biol.; 22(2):95-105]).
마우스 배아 섬유모세포에서, PN-1 복합체의 별법적인 내재화가 신데칸-1에 의해 매개되고, Ras-ERK 신호전달 경로를 활성화시킨다. 유리 PN-1 또한 내재화될 수 있다 ([Li, et al. (2006) J.Cell Biochem.; 99 (3):936-51]). PN-1은 혈관 평활근 세포 부착, 확산 및 이동을 조절한다 ([Richard, et al. (2006) J. Thromb. Haemost; 4(2):322-8]). PN-1 발현이 TNF알파, TGF베타 및 IL-1과 같은 손상-관련 인자에 의해 인간 골격근에서 상향-조절된다 ([Mbebi, et al. (1999) J.Cell Physiol.; 179 (3):305-14]). PN-1은 트롬빈을 억제함으로써 신경돌기 확장에서 수반되는 것으로 또한 보고되었다 ([Farmer, et al. (1990) Dev.Neurosci.; 12 (2):73-80]). 마지막으로, NIH3T3 세포에서, PN-1은 골격형성을 수정하는데 필요한 것으로 공지된 Prx2의 유전자를 표적으로 하는 것으로 나타났다 ([Scott, et al.(2003) DNA Cell Biol; 22(2):95-105]).
본원에서 추가로 상술된 바와 같이, PN-1 (IPI00203479.3)은 TAP 결합 분석법의 UMR106 세포 배양물 상등액 분획에서 스클레로스틴의 결합 파트너로서 확인되었다. PN-1은 스클레로스틴의 중요한 결합 파트너인 것으로 생각되거나, 또는 적어도 스클레로스틴으로 구성된 다중-복합체의 일부분이고, 이들간의 상호작용은 스클레로스틴의 더욱 안정적인 형상으로의 리폴딩을 유도할 수 있다 (따라서 스클레로스틴 작용을 조절할 수 있다). 스클레로스틴:PN-1 상호작용은 골세포 과성장 또는 스클레로스틴 내재화 및 분해에 또한 연루된다.
저밀도 지질단백질 수용체-관련 단백질 2 (LRP2, 메갈린)
저밀도 지질단백질 수용체 부류는 화물 운송, 세포 표면으로부터의 거대분자의 내재화 및 세포성 신호전달에서의 광범위한 기능이 있는 고도로 보존된 세포 표면 수용체들의 클래스이다. 메갈린은 멀티리간드 상피 세포내이입 수용체이고, 이는 이들이 단백질, 지질 및 비타민 섭취에 필수적인 복합체를 형성하는 성인 신장 및 회장에서 잘 특성화되어 있다. 이는 수컷 및 암컷 생식관의 특정 영역의 내면을 형성하는 상피 세포의 정점 표면 상에서, 및 정낭 (래트) (정낭에 대한 세포내이입 수용체로서 작용함)에서 또한 발현된다. 신장 내의 근위 세관에서 사구체 여과물로부터 DBP/25-(OH)D3 복합체를 포획하지 못하는 것으로 인해 메갈린 녹아웃(knockout) 마우스에서 비타민 D 결핍증 및 골 질환이 발달된다 ([Willnow et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 8460]). 동일한 방식으로, 완전한 메갈린 녹아웃 마우스처럼, 신장-특이적 메갈린 녹아웃 마우스에는 중증 혈장 비타민 D 결핍증, 저칼슘혈증 및 심각한 골 질환이 있다 ([Leheste et al. (2003) FASEB J. 17(2):247]). 이러한 마우스들의 골격은 골 무기질 함량의 감소, 풋뼈 표면의 증가, 및 무기질화 활성의 결여를 특징으로 한다. 이러한 특색들은 비타민 D 결핍증의 결과로서의 골연화증과 일치하고, 전신 칼슘 항상성 및 골 대사에 대한 메갈린 경로의 결정적인 중요성을 실연한다.
LRP2 (IPI00024292.1)는 TAP 결합 분석법의 인간 배아 신장 Hek293 막 정제 및 상등액 분획에서 스클레로스틴의 결합 파트너로서 확인되었다. LRP2는 스클레로스틴의 중요한 결합 파트너인 것으로 생각되거나, 또는 적어도 스클레로스틴으로 구성된 다중-복합체의 일부분이다. 신장에서 스클레로스틴이 발현된다 ([Balemans and Van Hul (2002) Developmental Biology 250, 231]). 따라서, LRP2가 신장에서 스클레로스틴과 상호작용하여 아직 특성화되지 않은 작용을 조절할 수 있다. 또한 LRP2는 뼈에서의 스클레로스틴 내재화 및 이어지는 분해에 수반되어, 이의 작용을 조절할 수 있다.
저밀도 지질단백질 수용체-관련 단백질 4 (LRP4, Megf7로 또한 공지됨)
Megf7은 저밀도 지질단백질 수용체 부류의 구성원이다. LRP4-결핍 마우스는 앞다리 및 뒷다리의 다발성 유합지를 나타낸다. 합지증 또한 비정상적인 스클레로스틴 수준의 전형적인 양상이다 (경화협착증 환자에서의 스클레로스틴의 부재 및 마우스에서의 스클레로스틴의 과발현 양쪽 모두 합지증을 초래한다). LRP4 및 스클레로스틴 단백질 양쪽 모두 꼭대기 외배엽 능선 (AER) 형성에서 중요한 역할을 하고, 배아 제9.5일에 발현된다. 또한, 스클레로스틴 및 LRP4 양쪽 모두 정규 Wnt 신호전달을 길항할 수 있다. ([Johnson EB, et al. (2005) Hum Mol Genet. 14(22):3523], [Simon-Chazottes D, et al. (2006) Genomics 87(5):673], [Loots GG, et al. (2005) Genome Res. 15(7):928-35])
본원에서 추가로 상술된 바와 같이, LRP4 (IPI00306851.3)은 TAP 결합 분석법의 UMR-106 및 Hek293 세포의 막 분획에서 스클레로스틴의 결합 파트너로서 확인되었다. LRP4는 스클레로스틴의 중요한 결합 파트너인 것으로 생각되거나, 또는 적어도 스클레로스틴으로 구성된 다중-복합체의 일부분이고, 이들간의 상호작용은 스클레로스틴의 더욱 안정적인 형상으로의 리폴딩을 유도할 수 있다 (따라서 스클레로스틴 작용을 조절할 수 있다). 또한, LRP4는 Wnt 신호전달 억제제로서의 이의 역할에서 스클레로스틴 작용의 인핸서로서 작용하는 것으로 나타났다.
저밀도 지질단백질 수용체-관련 단백질 6 (LRP6)
LRP6은 Wnt에 대한 프리즐드(Frizzled)와 함께 공동-수용체로서 작용함으로써 Wnt/베타 카테닌 신호전달 경로에 필수적이다. LRP6은 고-친화력으로 Dkk1과 결합한다. Dkk1과의 이러한 상호작용은 LRP6-매개 Wnt/베타 카테닌 신호전달을 차단한다. 스클레로스틴이, Dkk1과 유사하게, 시험관내에서 LRP6에 대한 결합 파트너로서 작용하고, 이에 의해 Wnt 신호전달을 억제하는 것으로 나타났다 ([Semenov et al. (2005) J Biol Chem. 280(29):26770]).
LRP6 (IPI00000203.1)은 TAP 결합 분석법의 Hek293 및 골모세포성 UMR 106 세포 배양물 막 분획에서 스클레로스틴의 결합 파트너로서 확인되었다. 이러한 발견은 스클레로스틴이 LRJP6 상호작용을 통해 생체내에서 이의 작용의 일부분을 발휘한다는 것을 시사한다. 또한 이는 TAP 결합 분석법 실험으로부터의 발견들의 관련성을 강조하고, 따라서 양성 대조군으로 간주된다.
테나신 C
테나신-C는 헵타드 반복부, EGF-유사 반복부, 제III형 피브로넥틴 도메인, 및 피브리노겐과 공유된 C-말단 구형 도메인을 포함하는 240 kDa의 대형 다량체성 세포외 매트릭스 단백질이다. 테나신은 결합 조직 내의 세포에 의해 주로 합성된다 ([Chiquet-Ehrismann R (2004) Int.J.Biochem.Cell Biol.; 36 (6):986]). 이들은 부착-조정 단백질로 분류되는데, 다른 세포외 매트릭스 단백질들과 달리, 테나신은 오직 약한 세포 부착만을 촉진하고 세포 확산이 한정되기 때문이다 ([Orend G and Chiquet-Ehrismann R (2000) Exp.Cell Res.; 261 (1):104]).
테나신-C는 여러 세포내 신호전달 분자들, 예컨대 FAK, RhoA, cGMP-의존적 단백질 키나제 및 14-3-3tau에 영향을 미칠 수 있다. 이는 또한 EGF 수용체에 직접적으로 결합하여 이를 활성화시킬 수 있다 ([Chiquet-Ehrismann R and Tucker RP (2004) Int.J.Biochem.Cell Biol.; 36 (6):1085]). 테나신-C는 배양된 골모세포-유사 세포의 분화를 지지한다 ([Mackie EJ and Ramsey S (1996) J.Cell Sci.; 109 (Pt 6): 1597]). 래트 척골에서, 면역조직화학적 검출은 로드(load)에 응답하여 형성된 새로운 뼈 내의 골세포만이 테나신-C에 대해 강하게 염색되었음을 나타낸다. 더욱 최근에 매립된 골세포, 즉 골막에 더욱 가까운 골세포는 염색되지 않았다 ([Webb CM, et al (1997) J.Bone Miner.Res.; 12 (1):52]). 테나신-C는 인테그린 및 신데칸 신호전달에 영향을 미친다 ([Huang W, et al (2001) Cancer Res.; 61 (23):8586]).
고혈압 환자에서, 돌연변이된 BMPR2에 응답하여 테나신-C가 유도된다 ([Ihida-Stansbury K, et al (2006) Am.J.Physiol Lung Cell Mol.Physiol.; 291 (4):L694]). 고밀도 닭 지아세포(limb bud cell) 배양물에서 Wnt7a에 의해 테나신-C 발현이 억제되고 ([Stott NS, Jiang TX and Chuong CM (1999) J.Cell Physiol; 180 (3):314]), 닭 배아 섬유모세포에서, TGFb는 테나신 발현을 유도한다 ([Pearson CA, et al (1988) EMBO J.; 7 (10):2977]). 테나신-C는 인테그린 알파7베타1과의 상호작용을 통해 래트 소뇌 과립 뉴런으로부터의 신경돌기 성장을 증가시킨다 ([Mercado ML, et al (2004) J.Neurosci.; 24 (1):238]).
본원에서 추가로 상술된 바와 같이, 테나신-C (IPI00403938.1)은 TAP 결합 분석법의 UMR 106 세포 배양물 상등액 분획에서 스클레로스틴의 결합 파트너로서 확인되었다. 테나신-C는 스클레로스틴의 중요한 결합 파트너인 것으로 생각되거나, 또는 적어도 스클레로스틴으로 구성된 다중-복합체의 일부분이다. 이러한 상호작용은 스클레로스틴의 더욱 안정적인 형상으로의 리폴딩을 유도할 수 있고/있거나, 테나신-C와 BMP 신호전달 간의 기능적인 상호작용을 개시시킴으로써, 스클레로스틴과 BMP 신호전달 간의 연결물을 형성할 수 있다. 마찬가지로, 테나신-C와 스클레로스틴 간의 상호작용이 테나신-C와 Wnt 신호전달 간의 기능적인 상호작용을 개시시킴으로써, 스클레로스틴과 Wnt 신호전달 간의 연결을 제공할 수 있다. 또한, 이는 골세포 성장 또는 이러한 메커니즘들의 조합에서 수반된다.
트리파타이트(tripartite) 모티프 (TRIM) 단백질 (TRIM26, TRIM41)
트리파타이트 모티프 (TRIM) 단백질 부류는 RBCC 모티프를 함유하기 때문에 RBCC 단백질로 또한 공지된 RING ("really interesting new gene")의 확장형 부류이고, RING 도메인, 1개 또는 2개의 B-박스 및 예상되는 코일드-코일(coiled-coil) 영역을 포함한다. TRIM/RBCC 단백질은 세포 증식, 분화, 발달, 종양형성 및 세포자멸사를 포함하는 광범위한 생물학적 과정에서 수반된다. RING 도메인의 존재 및 유비퀴틴화에 대한 이의 강력한 회합은 유비퀴틴화 과정에서의 이러한 단백질 부류에 대한 역할을 시사한다. ([Meroni G, et al. (2005) Bioessays. 27 (11):1147], [Nisole S, et al. (2005) NatRev.Microbiol. 3 (10):799])
본원에서 추가로 상술된 바와 같이, TRIM26 (IPI00010948.2)은 TAP 결합 분석법의 Hek293 막 분획에서, TRIM41 (IPI00414021.1)은 TAP 결합 분석법의 Hek293 및 UMR106 막 분획에서 스클레로스틴의 결합 파트너로서 확인되었다. TRIM26 및 TRIM41은 스클레로스틴의 중요한 결합 파트너인 것으로 생각되거나, 또는 적어도 스클레로스틴으로 구성된 다중-복합체의 일부분이고, 이들간의 상호작용은 스클레로스틴 분해를 유도할 수 있다. TRIM은, LRP2와 함께, 스클레로스틴 내재화 및 이어지는 분해에 수반될 수 있다.
IL-17 수용체
IL-17A에 대한 수용체 (IL17RA)는 약 130 kDa의 단일-통과 막횡단 단백질이고, 유별나게 큰 세포질 꼬리를 갖는다. IL-17A 사이토카인은 T-세포에 의해서만 발현되는 한편, 이의 수용체는 편재성으로 발현된다. 그 결과, IL-17은 광범위한 세포 상에 작용하여, 염증성 이펙터의 발현을 촉발할 수 있다. 대부분의 이러한 이펙터들은 파골세포형성을 촉진하거나 골 보호 효과를 발휘함으로써 골 대사에 대한 영향이 있는 것으로 나타났다 ([Gaffen SL (2004) Arthritis Res.Ther.; 6 (6):240]).
대부분의 IL-17-유도 인자들은 골 흡수성인 경향이 있다. 예를 들어, IL-6은 에스트로겐 매개 골 손실에 대한 기여 인자인 것으로 나타났다 ([Jilka RL, et al (1992) Science.; 257 (5066):88]). IL-17을 과발현하는 마우스에서, 골 침식이 RANKL에 의해 매개된다 ([Lubberts E, et al (2003) J.Immunol.; 170 (5):2655]). IL-17은 야생형 한배새끼와 비교하여 IL-17-/- 마우스에서 골 무기질 밀도, 골격 발달, 뿐만 아니라 골 흡수 및 골 형성 파라미터에서의 차이의 부재로 인해 골 항상성의 생리학적 조절에 수반되지 않는다. 그러나, 염증성 골 파괴의 LPS-유도 모델에서, 야생형 마우스와 비교하여 IL-17-/- 마우스에서 골 흡수 수준이 훨씬 덜 뚜렷하였고, 파골세포 형성이 현저하게 감소되었으며, 이는 Th17 세포가 T 세포-매개 파골세포형성에 수반된다는 것을 시사한다.
RANKL 및 염증성 사이토카인, 예컨대 TNFα 및 IL-1의 IL-17-매개 유도가 이러한 과정에 수반되는 것으로 제안되었다 ([Sato K, et al (2006) J.Exp.Med.; 203 (12):2673]). IL-17은 또한 중성구 동원 및 활성화의 강력한 유도물질이고, 주로 이는 케모카인 분비를 촉진하는 능력에 기인한다. 중성구는 만성 염증 동안 골 파괴에 기여하는 것으로 생각된다. 그러나, 일반적으로 중성구는 치주 질환-유도 골 손실의 정황에서 골 보호성인 것으로 간주된다 ([Kantarci A, Oyaizu Z and Van Dyke TE (2003) J.Periodontol.; 74 (1):66]). IL-17RA의 신호전달은 불량하게 정의되어 있다. 연루되는 경로는 NF-KB 경로, C/EBP 부류, 뿐만 아니라 MAPK 및 GSK3β (C/EBP 인산화에 수반됨), ERK1 및 2, JNK, p38 및 PI-3K/Akt를 포함할 것이다 ([Gaffen SL, et al (2006) Vitam.Horm.; 74:255-82.:255]).
본원에서 추가로 상술된 바와 같이, IL-17RA (IPI00304993.3)는 TAP 결합 분석법의 Hek293 막 분획에서 스클레로스틴의 결합 파트너로서 확인되었다. IL-17RA, 또는 IL-17RB, IL-17RC, IL-17RD 및 IL-17RE는 스클레로스틴의 중요한 결합 파트너인 것으로 생각되거나, 또는 적어도 스클레로스틴으로 구성된 다중-복합체의 일부분이고, 이들간의 상호작용은 스클레로스틴의 더욱 안정적인 형상으로의 리폴딩을 유도할 수 있고/있거나, IL-17 수용체와 BMP 신호전달 간의 기능적인 상호작용을 개시시킴으로써, 스클레로스틴과 BMP 신호전달 간의 연결을 형성할 수 있다. 마찬가지로, IL-17 수용체와 스클레로스틴 간의 상호작용이 IL-17 수용체와 Wnt 신호전달 간의 기능적인 상호작용을 개시시킴으로써, 스클레로스틴과 Wnt 신호전달 간의 연결을 제공할 수 있다. 또한, 이는 골세포 성장 또는 이러한 메커니즘들의 조합에서 수반된다.
알칼리성 포스타타제 ( ALPL )
대부분의 포유동물에서, 4가지 상이한 이소자임(isozyme)이 있다: 태반, 태반-유사, 소장, 및 조직 비-특이적 (간/뼈/신장, ALPL). 알칼리성 포스파타제 간/뼈/신장 (ALPL)에서의 결함은 결함성 골격 무기질화를 특징으로 하는 유전형 대사성 골 질환인 영아성 저인산산증의 원인이고, 이는 ALPL이 골격 무기질화에서 역할을 한다는 것을 시사한다 ([Fedde KN et al. (1999) JBMR 14(12):2015-2026]).
ALPL은 골 형성 마커이다. 골형성 동안, 알칼리성 포스파타제는 골선조세포에서 검출되지 않는다. 전-골모세포 콜로니의 증식성 능력이 손실되고, 결절 형성이 개시되면, 이의 발현이 시작된다. 이 시점부터 계속 발현이 유지된다 ([Liu et al. (1994) Devel Biol. 166:220-234]).
여러 BMP들이 골모세포-유사 세포에서 알카리성 포스파타제를 유도하는 것으로 기술되었다 ([Cheng H et al. (2003) J Bone Joint Surg Am. 85:1544-1552]). 또한, [Rawadi G et al. (2003) JBMR 18(10):1842-1853]에서는 BMP-2가 Wnt 자가분비 루프에 의해 알칼리성 포스파타제 발현을 제어하는 것으로 나타났다.
본원에서 추가로 상술된 바와 같이, ALPL (IPI00327143.1)은 TAP 결합 분석법의 UMR106 세포 배양물 상등액 분획에서 스클레로스틴의 결합 파트너로서 확인되었다. ALPL은 스클레로스틴의 중요한 결합 파트너인 것으로 생각되거나, 또는 적어도 스클레로스틴으로 구성된 다중-복합체의 일부분이다. 또한, SOST가 무세포-기반 분석법에서 ALPL 효소 활성을 직접적으로 억제하는 것으로 나타났다.
스크리닝 분석법
본 발명은 스클레로스틴 또는 스클레로스틴-결합-파트너에, 또는 관련된 복합체의 단백질 구성원에 결합하고, 예를 들어 스클레로스틴 발현 또는 활성에 대한 자극성 또는 억제성 효과가 있는 조절물질, 예를 들어 후보 또는 테스트 화합물 또는 작용제 (항체, 항체-유사 스캐폴드, 소분자, 융합 단백질, 펩티드, 모방체, 또는 억제성 뉴클레오티드 (예를 들어, RNAi))를 확인하는 방법 (본원에서 "스크리닝 분석법"으로 또한 지칭됨)을 제공한다.
상기 방법은 작용제에 의해 야기된 스클레로스틴-결합-파트너와의 스클레로스틴 상호작용의 변경을 측정하는 것을 포함하는, 스클레로스틴:스클레로스틴-결합-파트너 상호작용을 조절할 수 있는 후보 또는 테스트 화합물 또는 작용제를 확인하는 방법을 포함한다. 바람직하게는, 상기 방법은 a) 스클레로스틴-결합-파트너와 스클레로스틴의 상호작용을 허용하는 조건 하에 테스트 작용제의 존재 및 부재 하에 스클레로스틴을 스클레로스틴-결합-파트너와 접촉시키는 단계; 및 b) 상기 작용제의 존재 및 부재 하에서의 스클레로스틴-결합-파트너와 스클레로스틴의 상호작용을 측정하는 단계를 포함하고, 이 때 (i) 테스트 작용제의 부재 하에서의 상호작용에 비해 테스트 작용제의 존재 하에서의 스클레로스틴:스클레로스틴-결합-파트너 상호작용이 감소하면, 테스트 작용제가 스클레로스틴:스클레로스틴-결합-파트너 상호작용의 효능제로 확인되고, (ii) 테스트 작용제의 부재 하에서의 상호작용에 비해 테스트 작용제의 존재 하에서의 상호작용이 증가하면, 테스트 작용제가 스클레로스틴:스클레로스틴-결합-파트너 상호작용의 길항제로 확인된다.
스클레로스틴:스클레로스틴-결합-파트너 상호작용의 억제는 스클레로스틴 또는 스클레로스틴-결합-파트너의 길항제, 억제제, 음성 조절물질, 또는 음성 조절물의 경우에 발생한다. 길항제는 스클레로스틴에 대한 스클레로스틴-결합-파트너의 결합을 감소시키거나 완전히 차단하는 효과가 있다. 길항제는 스클레로스틴-결합-파트너에 대한 스클레로스틴의 결합을 길항제의 부재 하에서의 결합과 비교하여 길항제의 존재 하에 적어도 10％, 20％, 30％, 40％, 50％, 60％, 70％, 80％, 90％만큼, 또는 상기 언급된 값들 중 임의의 2개 사이의 범위의 양만큼 감소시킬 수 있다. 바람직하게는, 길항제는 상기 결합을 적어도 10％만큼 감소시킨다. 결합은, 예를 들어 본원에 기술된 바와 같은 생화학적 및/또는 생체물리학적 방법을 사용하여 결합 상수를 측정함으로써 결정될 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명은 작용제에 의해 야기된 Frem2에 대한 스클레로스틴 결합의 변경을 측정하는 것을 포함하는, 스클레로스틴:Frem2 상호작용을 조절할 수 있는 작용제를 확인하는 방법을 제공한다. 또다른 실시양태에서, 본 발명은 작용제에 의해 야기된 베르시칸에 대한 스클레로스틴 결합의 변경을 측정하는 것을 포함하는, 스클레로스틴:베르시칸 (CSPG2) 상호작용을 조절할 수 있는 작용제를 확인하는 방법을 제공한다. 또다른 실시양태에서, 본 발명은 작용제에 의해 야기된 피브릴린 2에 대한 스클레로스틴 결합의 변경을 측정하는 것을 포함하는, 스클레로스틴:피브릴린 2 (FBN2) 상호작용을 조절할 수 있는 작용제를 확인하는 방법을 제공한다. 또다른 실시양태에서, 본 발명은 작용제에 의해 야기된 C6orf93에 대한 스클레로스틴 결합의 변경을 측정하는 것을 포함하는, 스클레로스틴:C6orf93 상호작용을 조절할 수 있는 작용제를 확인하는 방법을 제공한다. 또다른 실시양태에서, 본 발명은 작용제에 의해 야기된 신데칸-4에 대한 스클레로스틴 결합의 변경을 측정하는 것을 포함하는, 스클레로스틴:신데칸-4 (Sdc4) 상호작용을 조절할 수 있는 작용제를 확인하는 방법을 제공한다. 또다른 실시양태에서, 본 발명은 작용제에 의해 야기된 아그린에 대한 스클레로스틴 결합의 변경을 측정하는 것을 포함하는, 스클레로스틴:아그린 (AGRN) 상호작용을 조절할 수 있는 작용제를 확인하는 방법을 제공한다. 또다른 실시양태에서, 본 발명은 작용제에 의해 야기된 세르핀2에 대한 스클레로스틴 결합의 변경을 측정하는 것을 포함하는, 스클레로스틴:세르핀2 (PN-1) 상호작용을 조절할 수 있는 작용제를 확인하는 방법을 제공한다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 작용제에 의해 야기된 SLIT2에 대한 스클레로스틴 결합의 변경을 측정하는 것을 포함하는, 스클레로스틴:SLIT2 상호작용을 조절할 수 있는 작용제를 확인하는 방법을 제공한다. 또다른 실시양태에서, 본 발명은 작용제에 의해 야기된 글리피칸1에 대한 스클레로스틴 결합의 변경을 측정하는 것을 포함하는, 스클레로스틴:글리피칸1 상호작용을 조절할 수 있는 작용제를 확인하는 방법을 제공한다. 또다른 실시양태에서, 본 발명은 작용제에 의해 야기된 LRP2에 대한 스클레로스틴 결합의 변경을 측정하는 것을 포함하는, 스클레로스틴:LRP2 상호작용을 조절할 수 있는 작용제를 확인하는 방법을 제공한다. 또다른 실시양태에서, 본 발명은 작용제에 의해 야기된 LRP4에 대한 스클레로스틴 결합의 변경을 측정하는 것을 포함하는, 스클레로스틴:LRP4 상호작용을 조절할 수 있는 작용제를 확인하는 방법을 제공한다. 또다른 실시양태에서, 본 발명은 작용제에 의해 야기된 LRP6에 대한 스클레로스틴 결합의 변경을 측정하는 것을 포함하는, 스클레로스틴:LRP6 상호작용을 조절할 수 있는 작용제를 확인하는 방법을 제공한다. 또다른 실시양태에서, 본 발명은 작용제에 의해 야기된 테나신 C에 대한 스클레로스틴 결합의 변경을 측정하는 것을 포함하는, 스클레로스틴:테나신 C 상호작용을 조절할 수 있는 작용제를 확인하는 방법을 제공한다. 또다른 실시양태에서, 본 발명은 작용제에 의해 야기된 TRIM26에 대한 스클레로스틴 결합의 변경을 측정하는 것을 포함하는, 스클레로스틴:TRIM26 상호작용을 조절할 수 있는 작용제를 확인하는 방법을 제공한다. 또다른 실시양태에서, 본 발명은 작용제에 의해 야기된 TRIM41에 대한 스클레로스틴 결합의 변경을 측정하는 것을 포함하는, 스클레로스틴:TRIM41 상호작용을 조절할 수 있는 작용제를 확인하는 방법을 제공한다. 또다른 실시양태에서, 본 발명은 작용제에 의해 야기된 IL17-R에 대한 스클레로스틴 결합의 변경을 측정하는 것을 포함하는, 스클레로스틴:IL17-R 상호작용을 조절할 수 있는 작용제를 확인하는 방법을 제공한다. 또다른 실시양태에서, 본 발명은 작용제에 의해 야기된 ALPL에 대한 스클레로스틴 결합의 변경을 측정하는 것을 포함하는, 스클레로스틴:ALPL 상호작용을 조절할 수 있는 작용제를 확인하는 방법을 제공한다.
후보 또는 테스트 화합물 또는 작용제는 (i) 스클레로스틴; (ii) 스클레로스틴-결합-파트너; (iii) 스클레로스틴:스클레로스틴-결합-파트너 상호작용에 의해 생성된 신규 부위 (예를 들어, 새롭게 생성된 에피토프성 결정인자), 또는 (iv) 이들 중 임의의 것을 포함하는 단백질 복합체에 대해 지시된 항체, 항체-유사 스캐폴드, 소분자, 융합 단백질, 펩티드, 모방체, 또는 억제성 뉴클레오티드 (예를 들어, RNAi)일 수 있다.
스클레로스틴:스클레로스틴-결합-파트너 상호작용, 스클레로스틴 또는 스클레로스틴-결합-파트너 단백질 활성, 및/또는 스클레로스틴 경로 활성에서의 변경은PCR, Taqman PCR, 파지 디스플레이 시스템, 젤 전기영동, 리포터 유전자 분석법, 효모-2 하이브리드 분석법, 노던 또는 웨스턴 분석, 면역조직화학, 통상적인 섬광 카메라, 감마 카메라, 직선형 스캐너, PET 스캐너, SPECT 스캐너, MRI 스캐너, NMR 스캐너, 또는 X선 기계에 의해 측정할 수 있다. 표지 치환, 표면 플라즈몬 공명, 형광 공명 에너지 전이 (FRET) 또는 생체발광 공명 에너지 전이 (BRET), 형광 켄칭(quenching), 및 형광 편광으로부터 선택된 방법을 사용함으로써 변경을 또한 측정할 수 있다.
스클레로스틴:스클레로스틴-결합-파트너 간의 상호작용에서의 변화를 검출함으로써, 스클레로스틴 또는 스클레로스틴-결합-파트너의 수준에서의 변화를 검출함으로써, 또는 스클레로스틴 경로 내의 단백질들 중 하나 이상의 수준에서의 변화를 검출함으로써, 스클레로스틴 또는 스클레로스틴-결합-파트너 단백질 활성 및/또는 스클레로스틴 경로 활성에서의 변화를 검출할 수 있다. 상기 기술된 것들이 검출될 수 있는 세포는 뼈, 중간엽, 신장 (예를 들어, HEK), 또는 조혈 기원의 세포일 수 있거나, 배양 세포일 수 있거나, 또는 트랜스제닉 생물로부터 수득되거나 이러한 생물 내에 존재할 수 있다. 이같은 트랜스제닉 생물에는 마우스, 래트, 토끼, 양, 소 또는 영장류가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.
스클레로스틴:스클레로스틴-결합-파트너 상호작용에서의 변경을 수반하는 스크리닝 실험을 위해, 스클레로스틴 또는 스클레로스틴-결합-파트너를 발현하는 세포를 증가하는 농도의 후보 작용제의 존재 또는 부재 하에 표지된 스클레로스틴-결합-파트너와 함께 결합 완충제 내에서 인큐베이션할 수 있다. 분석법을 입증하고 검정하기 위해, 증가하는 농도의 표지되지 않은 스클레로스틴-결합-파트너를 사용하는 대조군 경쟁 반응을 수행할 수 있다. 인큐베이션 후, 세정 단계를 수행하여 결합되지 않은 스클레로스틴-결합-파트너를 제거한다. 결합된 표지된 스클레로스틴-결합-파트너를 소정의 표지에 대해 적합하게 측정한다 (예를 들어, 섬광 카운팅, 형광, 항체-염료 등). 후보 작용제의 존재 하에 결합된 표지된 스클레로스틴-결합-파트너의 양에서의 적어도 10％ (예를 들어, 적어도 20％, 30％, 40％, 50 ％, 또는 60％)의 감소는 후보 작용제에 의한 결합의 치환을 가리킨다.
후보 작용제는 1 mM 이하의 농도에서 표지된 스클레로스틴-결합-파트너의 적어도 10％, 20％, 30％, 40％, 50％, 60％, 바람직하게는 적어도 10％ (준-포화(sub-saturating) 스클레로스틴-결합-파트너 용량)를 치환한다면 본원에 기술된 이러한 분석법 또는 기타 분석법에서 특이적으로 결합하는 것으로 간주될 수 있다. 물론, 스클레로스틴-결합-파트너 및 스클레로스틴의 역할이 전환될 수 있다; 당업자는 스클레로스틴:스클레로스틴-결합-파트너 상호작용에서의 변경을 결정하기 위해 다양한 농도의 후보 작용제의 존재 하에 스클레로스틴이 스클레로스틴-결합-파트너에 적용되도록 방법을 개조할 수 있다.
스클레로스틴:스클레로스틴-결합-파트너 상호작용의 변경을 표면 플라즈몬 공명 (SPR)에 의해 모니터링할 수 있다. 수성 상으로부터의 스클레로스틴-결합-파트너가 센서 상에 고정된 스클레로스틴에 결합하는 것 또는 이러한 결합의 손실에 의해 야기된 고정된 센서 근처에서의 질량 변화에 의해 2개의 분자 간의 결합을 측정하기 위한 정량적 방법으로서 표면 플라즈몬 공명 분석법이 사용될 수 있다. 이러한 질량 변화는 스클레로스틴-결합-파트너 또는 후보 작용제의 주입 또는 제거 후 시간에 대한 공명 단위로서 측정되고, 비아코어 바이오센서(Biacore Biosensor) (Biacore AB)를 사용하여 측정된다. 살라몬(Salamon) 등이 기술한 방법 ([Salamon et al., 1996, Biophys J. 71: 283-294]; [Salamon et al, 2001, Biophys. J. 80: 1557-1567]; [Salamon et al., 1999, Trends Biochem. Sci. 24: 213-219]; 각각 거명에 의해 본원에 포함됨)에 따라 스클레로스틴을 센서 칩 (예를 들어, 연구 등급 CM5 칩; Biacore AB) 상에 고정할 수 있다. 사리오(Sarrio) 등은 칩 상의 지질 층에 고정된 GPCR A(1) 아데노신 수용체에 대한 리간드 결합을 검출하기 위해 SPR을 사용할 수 있다는 것을 실연하였다 ([Sarrio et al., 2000, Mol. Cell. Biol. 20: 5164-5174]; 거명에 의해 본원에 포함됨). SPR 분석법에서의 스클레로스틴에 대한 스클레로스틴-결합-파트너 결합을 위한 조건은 사리오 등에 의해 보고된 조건을 출발점으로 사용하여 당업자에 의해 미세하게 조절될 수 있다.
SPR은 적어도 2가지 방식으로 결합 억제제를 분석할 수 있다. 첫번째로, 스클레로스틴-결합-파트너를 고정된 스클레로스틴에 예비-결합시킨 후, 0.1 nM 내지 1 μM 범위의 농도로 후보 작용제를 주입할 수 있다. 결합된 스클레로스틴-결합-파트너의 치환을 정량하여, 억제제 결합을 검출할 수 있다. 별법적으로, 칩에 결합된 스클레로스틴을 후보 작용제와 예비-인큐베이션하고, 스클레로스틴-결합-파트너를 챌린지(challenge)할 수 있다. 억제제에 예비-노출되지 않은 칩 상에서의 결합에 비해 억제제에 노출된 스클레로스틴에 대한 스클레로스틴-결합-파트너 결합에서의 차이는 억제제의 존재 하에서의 스클레로스틴-결합-파트너의 결합 또는 치환을 나타낼 것이다. 양쪽의 분석법에서, 후보 작용제의 부재 하에 결합된 스클레로스틴-결합-파트너의 양과 비교하여, 후보 작용제의 존재 하에 결합된 스클레로스틴-결합-파트너의 양에서의 10％ (예를 들어, 20％, 30％, 40％, 50％, 60％) 또는 그 이상의 감소는 후보 작용제가 스클레로스틴과 스클레로스틴-결합-파트너의 상호작용을 억제한다는 것을 가리킨다. 상기에서 스클레로스틴이 고정되었지만, 당업자는 스클레로스틴-결합-파트너가 고정된 성분이도록 방법을 쉽게 개조할 수 있다.
스클레로스틴에 대한 스클레로스틴-결합-파트너의 결합의 억제를 검출하는 또다른 방법은 형광 공명 에너지 전이 (FRET)를 사용한다. FRET은 형광 도너의 방출 스펙트럼이 형광 어셉터의 여기 스펙트럼과 중첩되는 경우에 서로 아주 근접한 (일반적으로 < 100 옹스트롬으로 분리됨) 형광 도너 (D)와 형광 어셉터 (A) 사이에서 발생하는 양자 역학적 현상이다. 테스트될 분자, 예를 들어 스클레로스틴-결합-파트너 및 스클레로스틴이 상보적인 쌍의 도너 및 어셉터 형광단으로 표지된다. 스클레로스틴:스클레로스틴-결합-파트너 상호작용에 의해 근접하게 결합되는 동안, 도너 형광단의 여기 시 방출되는 형광은 스클레로스틴-결합-파트너와 스클레로스틴이 결합되지 않았을 때의 여기 파장에 응답하여 방출되는 것과 파장이 상이할 것이고, 각각의 파장에서의 방출 강도의 측정에 의해 결합된 분자 대 결합되지 않은 분자의 정량을 제공한다. 스플레로스틴에 표지하기 위한 도너 형광단은 당업계에 주지되어 있다. 청색(Cyan) FP (CFP, 도너 (D)) 및 황색(Yellow) FP (YFP, 어셉터 (A))로 공지된 애쿠오레아 빅토리아(A. victoria) GFP의 변이체들이 특히 흥미롭다. 예를 들어, YFP 변이체를 스클레로스틴과의 융합 단백질로 만들 수 있다. 융합물로서의 GFP 변이체의 발현을 위한 벡터 (클론텍; Clontech), 뿐만 아니라 형광단으로 표지된 스클레로스틴-결합-파트너 화합물 (몰레큘라 프로브스; Molecular Probes)이 당업계에 공지되어 있다.
표지된 스클레로스틴-결합-파트너 및 YFP-스클레로스틴의 혼합물에 후보 작용제를 첨가하면, 후보 작용제가 없는 샘플과 비교하여, 예를 들어 YFP 형광에서의 감소에 의해 증명되는 에너지 전이의 억제가 초래될 것이다. 스클레로스틴:스클레로스틴-결합-파트너 상호작용의 검출을 위해 FRET를 사용하는 분석법에서, 후보 작용제가 없는 샘플과 비교하여 후보 작용제를 함유하는 샘플에서 어셉터 파장에서의 형광 방출 강도가 10％ 또는 그 이상 (예를 들어, 20％, 30％, 40％, 50％, 60％ 또는 그 이상) 감소하는 것은 후보 작용제가 스클레로스틴:스클레로스틴-결합-파트너 상호작용을 억제한다는 것을 가리킨다. 반대로, 후보 작용제가 없는 샘플과 비교하여 후보 작용제를 함유하는 샘플에서 어셉터 파장에서의 형광 방출 강도가 10％ 또는 그 이상 (예를 들어, 20％, 30％, 40％, 50％, 60％ 또는 그 이상) 증가하는 것은 후보 작용제가 형상 변화를 유도하고 스클레로스틴:스클레로스틴-결합-파트너 상호작용을 강화시킨다는 것을 가리킨다.
FRET의 변종은 형광 켄칭을 사용하여 분자성 상호작용을 모니터링한다. 상호작용하는 쌍 중 한 분자는 형광단으로, 또다른 분자는 형광단과 근접하게 병치되는 경우 이의 형광을 켄칭하는 분자로 표지될 수 있다. 여기 시 형광에서의 변화는 형광단으로 태그가 부착된 분자:켄처(quencher) 쌍의 회합에서의 변화를 가리킨다. 일반적으로, 표지된 스클레로스틴의 형광에서의 증가는 켄처를 보유하는 스클레로스틴-결합-파트너 분자가 교체되었음을 가리킨다. 물론, 스클레로스틴-결합-파트너가 형광 표지되고 스클레로스틴이 켄처를 보유하는 경우에 유사한 효과가 일어날 수 있다. 켄칭 분석법에 대해, 후보 작용제가 없는 샘플과 비교하여 후보 작용제를 함유하는 샘플에서 형광 방출 강도가 10％ 또는 그 이상 (예를 들어, 20％, 30％, 40％, 50％, 60％ 또는 그 이상) 감소하는 것은 후보 작용제가 스클레로스틴:스클레로스틴-결합-파트너 상호작용을 억제한다는 것을 가리킨다. 반대로, 후보 작용제가 없는 샘플과 비교하여 후보 작용제를 함유하는 샘플에서 형광 방출 강도가 10％ 또는 그 이상 (예를 들어, 20％, 30％, 40％, 50％, 60％ 또는 그 이상) 증가하는 것은 후보물이 형상 변화를 유도하고 스클레로스틴:스클레로스틴-결합-파트너 상호작용을 강화시킨다는 것을 가리킨다.
표면 플라즈몬 공명 및 FRET 방법에 더하여, 형광 편광 측정이 결합을 정량하는데 유용하다. 형광 태그가 부착된 분자에 대한 형광 편광 값은 회전 상관 시간 또는 텀블링률(tumbling rate)에 좌우된다. 복합체, 예컨대 형광 표지된 스클레로스틴-결합-파트너와 회합한 스클레로스틴에 의해 형성된 복합체는 복합체를 형성하지 않은 표지된 스클레로스틴-결합-파트너보다 편광 값이 더 높다. 후보 작용제가 스클레로스틴과 스클레로스틴-결합-파트너의 상호작용을 파괴 또는 억제하는 경우, 후보 작용제가 없는 혼합물과 비교하여 스클레로스틴:스클레로스틴-결합-파트너 상호작용의 후보 작용제의 포함은 형광 편광에서의 감소를 초래한다. 형광 편광은 복합체의 형성을 파괴하는 소분자의 확인에 꽤 적합하다. 후보 작용제가 없는 샘플에서의 형광 편광과 비교하여 후보 작용제를 함유하는 샘플에서 형광 편광이 10％ 또는 그 이상 (예를 들어, 20％, 30％, 40％, 50％, 60％ 또는 그 이상) 감소하는 것은 후보 작용제가 스클레로스틴:스클레로스틴-결합-파트너 상호작용을 억제한다는 것을 가리킨다.
또다른 검출 시스템은 생체발광 공명 에너지 전이 (BRET)이고, 이는 생체발광성 루시페라제 및 형광 어셉터를 함유하는 융합 단백질들 간의 빛 전이를 사용한다. 일반적으로, 스클레로스틴:스클레로스틴-결합-파트너 상호작용 쌍 중 하나의 분자는 루시페라제 기질 (예를 들어 DeepBlueC)의 존재 하에 약 395 nm의 파장의 빛을 방출하는 도너인 루시페라제 (예를 들어 레닐라(Renilla) 루시페라제(Rluc))에 융합된다. 쌍의 또다른 분자는 도너로부터 빛을 흡수할 수 있고 상이한 파장의 빛을 방출할 수 있는 어셉터 형광 단백질에 융합된다. 형광 단백질의 예는 약 510 nm의 빛을 방출하는 GFP (녹색 형광 단백질)이다. 도너가 융합된 스클레로스틴-결합-파트너 및 어셉터가 융합된 스클레로스틴의 혼합물에 후보 작용제를 첨가하면, 예를 들어 후보 작용제가 없는 샘플과 비교하여 어셉터 형광에서의 감소에 의해 증명되는 에너지 전이의 억제가 초래될 것이다. 스클레로스틴:스클레로스틴-결합-파트너 상호작용의 검출을 위해 BRET을 사용하는 분석법에서, 후보 작용제가 없는 샘플과 비교하여 후보 작용제를 함유하는 샘플에서 어셉터 파장에서의 형광 방출 강도가 10％ 또는 그 이상 (예를 들어, 20％, 30％, 40％, 50％, 60％ 또는 그 이상) 감소하는 것은 후보 작용제가 스클레로스틴:스클레로스틴-결합-파트너 상호작용을 억제한다는 것을 가리킨다. 반대로, 후보 작용제가 없는 샘플과 비교하여 후보 작용제를 함유하는 샘플에서 어셉터 파장에서의 형광 방출 강도가 10％ 또는 그 이상 (예를 들어, 20％, 30％, 40％, 50％, 60％ 또는 그 이상) 증가하는 것은 후보 작용제가 형상 변화를 유도하고 스클레로스틴:스클레로스틴-결합-파트너 상호작용을 강화시킨다는 것을 가리킨다.
임의의 본원에 기술된 결합 분석법을 스클레로스틴의 비-스클레로스틴-결합-파트너 리간드 (예를 들어, 효능제, 길항제 등), 예를 들어 본원에서 기술된 바와 같이 확인된 소분자 또는 스클레로스틴-결합-파트너 모방체 (천연 또는 합성 펩티드, 폴리펩티드, 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 지질, 탄수화물 및 유기 소분자를 포함하지만 이에 한정되지 않음)로 수행할 수 있는 것으로 이해되어야 한다.
임의의 본원에 기술된 결합 분석법을 사용하여, 스클레로스틴에 결합하거나 또는 스클레로스틴에 대한 스클레로스틴-결합-파트너의 결합에 영향을 미치는, 샘플, 예를 들어 조직 샘플 내의 억제제의 존재를 결정할 수 있다. 이를 위해, 샘플의 존재 또는 부재 하에 스클레로스틴을 스클레로스틴-결합-파트너와 반응시키고, 사용되는 결합 분석법에 적합하게 결합을 측정한다. 스클레로스틴-결합-파트너의 결합에서의 10％ 또는 그 이상 (예를 들어, 20％, 30％, 40％, 50％, 60％ 또는 그 이상)의 감소는 샘플이 스클레로스틴에 대한 스클레로스틴-결합-파트너 결합을 조절하는 억제제를 함유한다는 것을 가리킨다. 기술된 FRET 및 BRET 결합 분석법을 또한 사용하여, 스클레로스틴에 결합하거나 또는 스클레로스틴에 대한 스클레로스틴-결합-파트너의 결합에 영향을 미치는, 샘플, 예를 들어 조직 샘플 내의 인핸서의 존재를 결정할 수 있다. 이를 위해, 샘플의 존재 또는 부재 하에 스클레로스틴을 스클레로스틴-결합-파트너와 반응시키고, 사용되는 결합 분석법에 적합하게 결합을 측정한다. 스클레로스틴-결합-파트너의 결합에서의 10％ 또는 그 이상 (예를 들어, 20％, 30％, 40％, 50％, 60％ 또는 그 이상)의 증가는 샘플이 스클레로스틴에 대한 스클레로스틴-결합-파트너 결합을 조절하는 인핸서를 함유한다는 것을 가리킨다.
임의의 기술된 결합 분석법을 화합물들의 라이브러리 내의 억제제의 존재를 결정하는데 또한 사용할 수 있다. 기술된 FRET 및 BRET 결합 분석법을 화합물들의 라이브러리 내의 인핸서의 존재를 결정하는데 또한 사용할 수 있다. 예를 들어, 고처리량 스크리닝을 사용하는 이같은 스크리닝 기술은 당업계에 주지되어 있다.
본 발명은 작용제의 존재 하에 스클레로스틴:스클레로스틴-결합-파트너 상호작용에 의해 유도된 신호전달 응답을 측정하는 단계, 및 이를 작용제의 부재 하에 스클레로스틴:스클레로스틴-결합-파트너 상호작용에 의해 유도된 신호전달 응답과 비교하는 단계를 포함하는, 스클레로스틴:스클레로스틴-결합-파트너 상호작용을 조절할 수 있는 작용제를 확인하는 방법을 또한 제공한다. 바람직하게는, 상기 방법은 a) 스클레로스틴-결합-파트너와 스클레로스틴의 상호작용을 허용하는 조건 하에 테스트 작용제의 존재 및 부재 하에 스클레로스틴을 스클레로스틴-결합-파트너와 접촉시키는 단계; 및 b) 스클레로스틴:스클레로스틴-결합-파트너 상호작용에 의해 유도된 신호전달 응답을 측정하는 단계를 포함하고, 이 때 테스트 작용제의 부재 하에서의 응답과 비교하여 적어도 10％의 테스트 작용제의 존재 하에서의 응답의 변화는 테스트 작용제가 스클레로스틴:스클레로스틴-결합-파트너 상호작용을 조절할 수 있는 것으로 확인된다는 것을 가리킨다.
테스트 작용제의 부재 하에서의 응답과 비교하여 테스트 작용제의 존재 하에서 신호전달 응답이 적어도 10％ 증가하면 테스트 작용제가 스클레로스틴:스클레로스틴-결합-파트너 상호작용의 효능제로 확인된다. 테스트 작용제의 부재 하에서의 응답과 비교하여 테스트 작용제의 존재 하에서 신호전달 응답이 적어도 10％ 감소하면 테스트 작용제가 스클레로스틴:스클레로스틴-결합-파트너 상호작용의 길항제로 확인된다.
스클레로스틴:스클레로스틴-결합-파트너 상호작용의 조절물질 (예를 들어, 본 발명의 방법에 의해 확인된 것들)는 스클레로스틴:스클레로스틴-결합-파트너 상호작용에 의해 유도된 신호전달 응답을 조절물질의 부재 하에서의 신호전달과 비교하여 조절물질의 존재 하에 적어도 10％, 20％, 30％, 40％, 50％, 60％, 70％, 80％, 90％만큼 또는 상기 언급된 값들 중 임의의 2개 사이의 범위의 양만큼 변화시킬 수 있다. 바람직하게는, 조절물질은 상기 신호를 적어도 10％만큼 변화시킨다. 변화는 모니터링되는 활성에 따라 증가 또는 감소일 수 있다. 당업계에 주지된 방법에 의해, 예를 들어 하기에 기술된 바와 같은 리포터 구축물을 사용하여 신호전달 수준을 측정함으로써, 신호전달을 결정할 수 있다.
본 발명은 작용제의 존재 하에 스클레로스틴:Frem2 상호작용에 의해 유도된 신호전달 응답을 측정하는 단계, 및 이를 작용제의 부재 하에 스클레로스틴:Frem2 상호작용에 의해 유도된 신호전달 응답과 비교하는 단계를 포함하는, 스클레로스틴:Frem2 상호작용을 조절할 수 있는 작용제를 확인하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 작용제의 존재 하에 스클레로스틴:베르시칸 상호작용에 의해 유도된 신호전달 응답을 측정하는 단계, 및 이를 작용제의 부재 하에 스클레로스틴:베르시칸 상호작용에 의해 유도된 신호전달 응답과 비교하는 단계를 포함하는, 스클레로스틴:베르시칸 상호작용을 조절할 수 있는 작용제를 확인하는 방법을 제공한다. 또다른 실시양태에서, 본 발명은 작용제의 존재 하에 스클레로스틴:피브릴린 2 상호작용에 의해 유도된 신호전달 응답을 측정하는 단계, 및 이를 작용제의 부재 하에 스클레로스틴:피브릴린 2 상호작용에 의해 유도된 신호전달 응답과 비교하는 단계를 포함하는, 스클레로스틴:피브릴린 2 상호작용을 조절할 수 있는 작용제를 확인하는 방법을 제공한다. 또다른 실시양태에서, 본 발명은 작용제의 존재 하에 스클레로스틴:C6orf93 상호작용에 의해 유도된 신호전달 응답을 측정하는 단계, 및 이를 작용제의 부재 하에 스클레로스틴:C6orf93 상호작용에 의해 유도된 신호전달 응답과 비교하는 단계를 포함하는, 스클레로스틴:C6orf93 상호작용을 조절할 수 있는 작용제를 확인하는 방법을 제공한다. 또다른 실시양태에서, 본 발명은 작용제의 존재 하에 스클레로스틴:신데칸-4 상호작용에 의해 유도된 신호전달 응답을 측정하는 단계, 및 이를 작용제의 부재 하에 스클레로스틴:신데칸-4 상호작용에 의해 유도된 신호전달 응답과 비교하는 단계를 포함하는, 스클레로스틴:신데칸-4 상호작용을 조절할 수 있는 작용제를 확인하는 방법을 제공한다. 또다른 실시양태에서, 본 발명은 작용제의 존재 하에 스클레로스틴:아그린 상호작용에 의해 유도된 신호전달 응답을 측정하는 단계, 및 이를 작용제의 부재 하에 스클레로스틴:아그린 상호작용에 의해 유도된 신호전달 응답과 비교하는 단계를 포함하는, 스클레로스틴:아그린 상호작용을 조절할 수 있는 작용제를 확인하는 방법을 제공한다. 또다른 실시양태에서, 본 발명은 작용제의 존재 하에 스클레로스틴:세르핀2 상호작용에 의해 유도된 신호전달 응답을 측정하는 단계, 및 이를 작용제의 부재 하에 스클레로스틴:세르핀2 상호작용에 의해 유도된 신호전달 응답과 비교하는 단계를 포함하는, 스클레로스틴:세르핀2 상호작용을 조절할 수 있는 작용제를 확인하는 방법을 제공한다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 작용제의 존재 하에 스클레로스틴:LRP2 상호작용에 의해 유도된 신호전달 응답을 측정하는 단계, 및 이를 작용제의 부재 하에 스클레로스틴:LRP2 상호작용에 의해 유도된 신호전달 응답과 비교하는 단계를 포함하는, 스클레로스틴:LRP2 상호작용을 조절할 수 있는 작용제를 확인하는 방법을 제공한다. 또다른 실시양태에서, 본 발명은 작용제의 존재 하에 스클레로스틴:LRP4 상호작용에 의해 유도된 신호전달 응답을 측정하는 단계, 및 이를 작용제의 부재 하에 스클레로스틴:LRP4 상호작용에 의해 유도된 신호전달 응답과 비교하는 단계를 포함하는, 스클레로스틴:LRP4 상호작용을 조절할 수 있는 작용제를 확인하는 방법을 제공한다. 또다른 실시양태에서, 본 발명은 작용제의 존재 하에 스클레로스틴:LRP6 상호작용에 의해 유도된 신호전달 응답을 측정하는 단계, 및 이를 작용제의 부재 하에 스클레로스틴:LRP6 상호작용에 의해 유도된 신호전달 응답과 비교하는 단계를 포함하는, 스클레로스틴:LRP6 상호작용을 조절할 수 있는 작용제를 확인하는 방법을 제공한다. 또다른 실시양태에서, 본 발명은 작용제의 존재 하에 스클레로스틴:글리피칸1 상호작용에 의해 유도된 신호전달 응답을 측정하는 단계, 및 이를 작용제의 부재 하에 스클레로스틴:글리피칸1 상호작용에 의해 유도된 신호전달 응답과 비교하는 단계를 포함하는, 스클레로스틴:글리피칸1 상호작용을 조절할 수 있는 작용제를 확인하는 방법을 제공한다. 또다른 실시양태에서, 본 발명은 작용제의 존재 하에 스클레로스틴:SLIT2 상호작용에 의해 유도된 신호전달 응답을 측정하는 단계, 및 이를 작용제의 부재 하에 스클레로스틴:SLIT2 상호작용에 의해 유도된 신호전달 응답과 비교하는 단계를 포함하는, 스클레로스틴:SLIT2 상호작용을 조절할 수 있는 작용제를 확인하는 방법을 제공한다. 또다른 실시양태에서, 본 발명은 작용제의 존재 하에 스클레로스틴:테나신 C 상호작용에 의해 유도된 신호전달 응답을 측정하는 단계, 및 이를 작용제의 부재 하에 스클레로스틴:테나신 C 상호작용에 의해 유도된 신호전달 응답과 비교하는 단계를 포함하는, 스클레로스틴:테나신 C 상호작용을 조절할 수 있는 작용제를 확인하는 방법을 제공한다. 또다른 실시양태에서, 본 발명은 작용제의 존재 하에 스클레로스틴:IL17-R 상호작용에 의해 유도된 신호전달 응답을 측정하는 단계, 및 이를 작용제의 부재 하에 스클레로스틴:IL17-R 상호작용에 의해 유도된 신호전달 응답과 비교하는 단계를 포함하는, 스클레로스틴:IL17-R 상호작용을 조절할 수 있는 작용제를 확인하는 방법을 제공한다. 또다른 실시양태에서, 본 발명은 작용제의 존재 하에 스클레로스틴:TRIM26 상호작용에 의해 유도된 신호전달 응답을 측정하는 단계, 및 이를 작용제의 부재 하에 스클레로스틴:TRIM26 상호작용에 의해 유도된 신호전달 응답과 비교하는 단계를 포함하는, 스클레로스틴:TRIM26 상호작용을 조절할 수 있는 작용제를 확인하는 방법을 제공한다. 또다른 실시양태에서, 본 발명은 작용제의 존재 하에 스클레로스틴:TRIM41 상호작용에 의해 유도된 신호전달 응답을 측정하는 단계, 및 이를 작용제의 부재 하에 스클레로스틴:TRIM41 상호작용에 의해 유도된 신호전달 응답과 비교하는 단계를 포함하는, 스클레로스틴:TRIM41 상호작용을 조절할 수 있는 작용제를 확인하는 방법을 제공한다. 또다른 실시양태에서, 본 발명은 작용제의 존재 하에 스클레로스틴:ALPL 상호작용에 의해 유도된 신호전달 응답을 측정하는 단계, 및 이를 작용제의 부재 하에 스클레로스틴:ALPL 상호작용에 의해 유도된 신호전달 응답과 비교하는 단계를 포함하는, 스클레로스틴:ALPL 상호작용을 조절할 수 있는 작용제를 확인하는 방법을 제공한다.
신호전달 응답은 바람직하게는 Wnt 및/또는 BMP 경로의 응답이고, 이러한 경우에, 억제제는 Wnt 및/또는 BMP 경로 활성에서의 증가를 야기할 수 있다. 예를 들어, 리포터 구축물을 사용하여 신호전달 수준을 측정하여 신호전달 응답을 결정할 수 있다. 예를 들어, 스클레로스틴-결합-파트너 또는 스클레로스틴을 디스플레이하는 적절한 포유류 세포를 Wnt 및/또는 BMP에 응답성인 프로모터를 포함하는 리포터 구축물로 형질감염시킬 수 있다. 스클레로스틴이 스클레로스틴-결합-파트너에 결합하여 Wnt 및/또는 BMP 경로를 억제하는 경우, 리포터 단백질의 발현이 억제되고, 리포터 단백질의 성질에 따라, 예를 들어 면역분석법, 형광, 빛 측정 등에 의해, 이러한 감소를 측정할 수 있다. 후보 작용제의 존재 및 부재 하에 발현을 측정한다.
Wnt 신호전달을 측정하기 위한 세포-기반 분석법의 구체적인 예로서, 리포터 구축물은 반딧불이 루시페라제의 발현을 구동시키는, TCF-결합 부위를 함유하는 Wnt/β-카테닌 의존적 수퍼탑플래시 (STF) 루시페라제 리포터 벡터일 수 있다. 이를, Wnt 발현 벡터 (예컨대 마우스 Wnt1에 대한 발현 구축물) 및 레닐라(Renilla) 발현 벡터 (SV40에 의해 구동되고, 표준화를 위해 사용됨)와 함께, Hek293 세포 또는 임의의 또다른 적절한 세포주 내로 형질감염시킬 수 있다. 형질감염된 세포는 STF-루시페라제 리포터의 활성화에 이르고, 이러한 활성화가 스클레로스틴에 의해 차단될 수 있다.
본 발명은 후보 모방체에 의한 스클레로스틴과의 상호작용을 측정하는 것을 포함하는, 스클레로스틴과의 스클레로스틴-결합-파트너 상호작용과 동일하거나, 유사하거나 또는 개선된 기능적 효과를 갖는 스클레로스틴-결합-파트너 모방체를 확인하는 방법을 제공한다. 바람직하게는, 상기 방법은 a) 모방체와 스클레로스틴의 상호작용을 허용하는 조건 하에 스클레로스틴을 후보 모방체와 접촉시키는 단계; 및 b) 모방체와 스클레로스틴의 상호작용을 측정하는 단계를 포함하고, 이 때 본원에 기술된 다양한 스클레로스틴:스클레로스틴-결합-파트너 상호작용에 대해 관찰된 것의 적어도 10％인 상호작용에 의해 후보 모방체가 본 발명의 스클레로스틴-결합-파트너 모방체로 식별된다.
또한, 본 발명은 스클레로스틴-모방체 상호작용에 의해 유도된 신호전달 응답을 측정하는 단계, 및 이를 본원에 기술된 스클레로스틴:스클레로스틴-결합-파트너 상호작용에 의해 유도된 신호전달 응답과 비교하는 단계를 포함하는, 스클레로스틴과의 스클레로스틴-결합-파트너 상호작용과 동일하거나, 유사하거나 또는 개선된 기능적 효과를 갖는 스클레로스틴-결합-파트너 모방체를 확인하는 방법을 제공한다. 바람직하게는, 상기 방법은 a) 모방체와 스클레로스틴의 상호작용을 허용하는 조건 하에 스클레로스틴을 후보 모방체와 접촉시키는 단계; 및 b) 스클레로스틴-모방체 상호작용에 의해 유도된 신호전달 응답을 측정하는 단계를 포함하고, 이 때 본원에 기술된 다양한 스클레로스틴:스클레로스틴-결합-파트너 상호작용에 대해 관찰된 것의 적어도 10％인 신호전달 응답에 의해 후보 모방체가 본 발명의 스클레로스틴-결합-파트너 모방체로 식별된다.
비-제한적인 예로서, 본 발명은 정상적인 생리학적 조건 하에 Frem2 또는 LRP4와 스클레로스틴 간의 상호작용의 것과 동일하거나, 유사하거나 또는 개선된 기능적 효과를 갖는 Frem2 또는 LRP4 모방체를 확인하는 방법을 제공한다.
스클레로스틴-결합-파트너 모방체는 스클레로스틴에 대한 스클레로스틴-결합-파트너 결합과 기능적 효과가 동일하거나, 유사하거나, 또는 이에 비해 개선된 화합물이다. 이는 천연 스클레로스틴-결합-파트너 구조의 결합 영역의 활성 형상을 닮도록 종종 추가적인 소수성 기 또는 전하를 띠는 기들이 있는 관능기들의 배열을 함유하는 화합물일 수 있다. 스클레로스틴-결합-파트너 모방체는 천연 스클레로스틴-결합-파트너 또는 이의 유도체를 또한 포함할 수 있는 것으로 이해되어야 한다.
본 발명의 한 양상에 따르면, 모방체는 스클레로스틴에 대한 스클레로스틴-결합-파트너의 결합의 적어도 10％, 20％, 30％, 40％, 50％, 60％, 70％, 80％, 90％ 또는 상기 언급된 값들 중 임의의 2개 사이의 범위 내의 값을 나타낸다. 바람직하게는, 모방체는 스클레로스틴에 대한 스클레로스틴-결합-파트너의 결합 활성의 적어도 20％를 나타낸다.
본 발명의 한 양상에 따르면, 모방체는 스클레로스틴-결합-파트너의 신호전달 활성의 적어도 10％, 20％, 30％, 40％, 50％, 60％, 70％, 80％, 90％ 또는 상기 언급된 값들 중 임의의 2개 사이의 범위 내의 값을 나타낸다. 바람직하게는, 모방체는 스클레로스틴-결합-파트너의 신호전달 활성의 적어도 20％를 나타낸다.
스클레로스틴과의 상호작용의 모방체 신호전달 활성을 측정하는 것은 다른 분석법들에 대해 본원에 기술된 방법들, 예컨대 SPR 및 FRET에 의해 수행될 수 있다.
본 발명의 한 실시양태에 따르면, a) 스클레로스틴을 후보 모방체와 접촉시키는 단계; 및 b) 스클레로스틴-모방체 상호작용에 의해 유도된 신호전달 응답을 측정하는 단계를 포함하고, 이 때 스클레로스틴:스클레로스틴-결합-파트너 상호작용에 대해 관찰된 신호전달 응답의 적어도 10％ (예를 들어, 20％, 30％, 40％, 50％, 60％ 또는 그 이상)인 신호전달 응답은 후보 모방체가 본 발명의 스클레로스틴-결합-파트너 모방체로 확인된다는 것을 나타내는 방법에 의해 모방체를 확인할 수 있다.
신호전달 응답은 바람직하게는 Wnt 및/또는 BMP 경로의 응답이고, 이러한 경우에, 모방체는 자극되지 않은 상태와 비교하여 Wnt 및/또는 BMP 경로 활성에서의 감소를 야기할 수 있다. 예를 들어, 상기에서 이미 언급된 리포터 구축물을 사용하여 신호전달 수준을 측정함으로써, 신호전달 응답을 결정할 수 있다. 스클레로스틴이 스클레로스틴-결합-파트너 모방체에 결합하여 Wnt 및/또는 BMP 경로를 억제하는 경우, 리포터 단백질의 발현이 억제되고, 리포터 단백질의 성질에 따라, 예를 들어 면역분석법, 형광, 빛 측정 등에 의해, 이러한 감소를 측정할 수 있다. 스클레로스틴:스클레로스틴-결합-파트너 상호작용에 대해 발현을 또한 측정할 수 있다.
임의의 본원에 기술된 결합 분석법을 사용하여, 스클레로스틴에 결합하는, 샘플, 예를 들어 조직 샘플 내의 모방체의 존재를 결정할 수 있다. 이를 위해, 샘플의 존재 또는 부재 하에 스클레로스틴을 반응시키고, 사용되는 분석법에 적합하게 신호전달을 측정한다. 스클레로스틴의 신호전달에서의 10％ 또는 그 이상 (예를 들어, 20％, 30％, 40％, 50％, 60％ 또는 그 이상)의 증가는 샘플이 스클레로스틴에 결합하는 모방체를 함유한다는 것을 가리킨다.
임의의 기술된 신호전달 분석법을 화합물들의 라이브러리 내의 모방체의 존재를 결정하는데 또한 사용할 수 있다. 예를 들어, 고처리량 스크리닝을 사용하는 이같은 스크리닝 기술은 당업계에 주지되어 있다.
본 발명은 (a) 대상에서 스클레로스틴-결합-파트너 유전자의 뉴클레오티드 서열을 수득하는 단계, 및 (b) 이를 건강한 대상의 것과 비교하고, 이 때 각각의 스클레로스틴-결합-파트너 유전자에서의 돌연변이는 스클레로스틴-관련 장애 및/또는 골 무기질 밀도가 비정상적인 장애 또는 이에 대한 소질을 나타내는 단계를 포함하는, 대상에서 스클레로스틴-관련 장애 및/또는 골 무기질 밀도가 비정상적인 장애 또는 이에 대한 소질을 진단하는 방법을 추가적으로 제공한다.
대상 내의 SOST 또는 스클레로스틴-결합-파트너를 코딩하는 유전자에서의 돌연변이는 비정상적인 골 질량에 관련된 장애가 발달되는 것의 예보물일 수 있고/있거나, 진단하는데 사용될 수 있다. 이같은 돌연변이는 스클레로스틴과 스클레로스틴-결합-파트너 간의 상호작용을 변화시키고, 예를 들어 건강한 대상과 비교하여 결합 및 신호전달에서의 증가 또는 감소를 야기한다.
본 발명의 한 실시양태는 대상에서 SOST 또는 스클레로스틴-결합-파트너를 코딩하는 유전자의 DNA 뉴클레오티드 서열을 수득하는 단계 및 이를 건강한 대상의 것과 비교하고, 이 때 각각의 스클레로스틴 또는 스클레로스틴-결합-파트너를 코딩하는 유전자에서의 돌연변이는 비정상적인 골 질량과 관련된 장애 또는 이에 대한 감수성을 나타내는 단계를 포함하는, 대상에서 비정상적인 골 질량과 관련된 장애 또는 이에 대한 감수성을 진단하는 방법이다.
본 발명의 또다른 양상은 대상에서 SOST 또는 스클레로스틴-결합-파트너를 코딩하는 유전자의 DNA 뉴클레오티드 서열을 수득하는 단계 및 이를 건강한 대상의 것과 비교하고, 이 때 건강한 대상과 비교하여 각각 스클레로스틴 또는 스클레로스틴-결합-파트너에 대한 결합을 변화시키는 돌연변이의 존재는 비정상적인 골 질량과 관련된 장애 또는 이에 대한 감수성을 나타내는 단계를 포함하는, 대상에서 비정상적인 골 질량과 관련된 장애 또는 이에 대한 감수성을 진단하는 방법이다.
돌연변이는 유전자의 번역되지 않는 부분 (예를 들어, 인트론, 제어 서열, 프로모터) 내에 존재할 수 있는데, 이들 또한 발현된 단백질에서의 기능 장애에 이를 수 있기 때문이다. 이같은 돌연변이는 단일 핵 다형성 (SNP)일 수 있다.
돌연변이는 스클레로스틴과 스클레로스틴-결합-파트너 간의 상호작용을 감소시키는 효과가 있을 수 있다. 건강한 대상과 비교하여, 결합이 건강한 대상에서 관찰된 결합보다 적어도 10％, 20％, 30％, 40％, 50％, 60％, 70％, 80％, 바람직하게는 적어도 20％ 더 낮을 수 있다. 결합에서의 감소가 관찰되는 경우, 스클레로스틴 작용을 증가시키는 스클레로스틴-결합 파트너의 경우에 낮은 골 질량과 관련된 장애가 진단 또는 예측될 수 있다. 반대로, 스클레로스틴 작용을 감소시키는 스클레로스틴-결합 파트너의 경우에, 결합에서의 감소가 관찰되는 경우, 높은 골 질량과 관련된 장애가 진단 또는 예측될 수 있다.
돌연변이는 Wnt 및/또는 BMP 경로의 신호전달 응답을 증가시키는 효과가 있을 수 있다. 건강한 대상과 비교하여, 신호전달 응답이 건강한 대상에서 관찰된 응답보다 적어도 10％, 20％, 30％, 40％, 50％, 60％, 70％, 80％, 바람직하게는 적어도 20％ 더 높을 수 있다. 응답에서의 증가가 관찰되는 경우, 높은 골 질량과 관련된 장애가 진단 또는 예측될 수 있다.
별법적으로, 돌연변이는 스클레로스틴-결합-파트너와 스클레로스틴 간의 결합을 증가시키는 효과가 있을 수 있다. 건강한 대상과 비교하여, 결합이 건강한 대상에서 관찰된 결합보다 적어도 10％, 20％, 30％, 40％, 50％, 60％, 70％, 80％, 바람직하게는 적어도 20％ 더 높을 수 있다. 결합에서의 증가가 관찰되는 경우, 스클레로스틴 작용을 증가시키는 스클레로스틴-결합 파트너의 경우에 낮은 골 질량과 관련된 장애가 진단 또는 예측될 수 있다. 반대로, 스클레로스틴 작용을 감소시키는 스클레로스틴-결합 파트너의 경우에, 결합에서의 감소가 관찰되는 경우, 높은 골 질량과 관련된 장애가 진단 또는 예측될 수 있다.
돌연변이는 Wnt 및/또는 BMP 경로의 신호전달 응답을 감소시키는 효과가 있을 수 있다. 건강한 대상과 비교하여, 신호전달 응답이 건강한 대상에서 관찰된 응답보다 적어도 10％, 20％, 30％, 40％, 50％, 60％, 70％, 80％, 바람직하게는 적어도 20％ 더 낮을 수 있다. 응답에서의 감소가 관찰되는 경우, 낮은 골 질량과 관련된 장애가 진단 또는 예측될 수 있다.
결합 및 신호전달 분석법은 당업자의 일상적인 실행에 속하고, 상기에 기술되어 있다. 특정 유전자의 서열분석 방법은 주지되어 있고, 예를 들어 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1989)]에 기술되어 있다.
후보 작용제 및 화합물
생물학적 라이브러리; 공간적으로 지정가능한(spatially addressable) 병렬형 고체상 또는 액체상 라이브러리; 디컨볼루션(deconvolution)을 필요로 하는 합성 라이브러리 방법; "1-베드 1-화합물" 라이브러리 방법; 및 친화력 크로마토그래피 선별을 사용하는 합성 라이브러리 방법이 포함되는, 당업계에 공지된 조합형 라이브러리 방법에서의 수많은 접근법들 중 임의의 것을 사용하여 본 발명에 사용된 후보 또는 테스트 화합물 또는 작용제를 수득할 수 있다. 생물학적 라이브러리 접근법은 펩티드 라이브러리에 한정되는 한편, 나머지 4개의 접근법은 화합물들의 펩티드, 비-펩티드 올리고머 또는 소분자 라이브러리에 적용가능하다 ([Lam et al. (1997) Anticancer Drug Des. 12: 145]).
분자형 라이브러러의 합성을 위한 방법의 예를 당업계에서, 예를 들어 [De Witt et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90: 6909]; [Erb et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 11422]; [Zuckermann et al. (1994). J. Med. Chem. 37: 2678]; [Cho et al. (1993) Science 261: 1303]; [Carrell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2059]; [Carell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2061]; 및 [Gallop et al. (1994) J. Med. Chem. 37: 1233]에서 발견할 수 있다.
화합물들의 라이브러리는 용액 내에서 (예를 들어, [Houghten (1992) Biotechniques 13: 412]), 또는 비드 ([Lam (1991) Nature 354: 82]), 칩 ([Fodor (1993) Nature 364: 555]), 박테리아 (Ladner, 미국 특허 번호 5,223,409), 포자 (Ladner, 미국 특허 번호 5,223,409), 플라스미드 ([Cull et al. (1992) Proc Natl Acad Sci USA 89: 1865]) 또는 파지 ([Scott and Smith (1990) Science 249: 386]); [Devlin (1990) Science 249: 404]; [Cwirla et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. 87: 6378]; [Felici (1991) J. Mol. Biol. 222: 301]; [Ladner, 상기 문헌]) 상에서 제시될 수 있다.
한 실시양태에서, 분석법은 스클레로스틴-결합-파트너를 발현하는 세포를 후보 또는 테스트 화합물 또는 작용제와 접촉시키는 단계, 및 상기 스클레로스틴-결합-파트너의 활성을 조절 (예를 들어, 자극 또는 억제)하는 테스트 화합물의 능력을 결정하는 단계를 포함하는 세포-기반 분석법이다. 스클레로스틴-결합-파트너를 조절하는 테스트 화합물의 능력을 결정하는 단계는, 예를 들어 스클레로스틴:스클레로스틴-결합-파트너 상호작용을 조절하는 후보 또는 테스트 화합물 또는 작용제의 능력을 결정함으로써 달성될 수 있다.
직접적인 결합을 결정함으로써 스클레로스틴-결합-파트너를 조절하는 후보 또는 테스트 화합물 또는 작용제의 능력을 결정하는 것이 달성될 수 있다. 이러한 결정은, 예를 들어 후보 또는 테스트 화합물 또는 작용제에 대한 단백질의 결합이 복합체 내의 표지된 단백질을 검출함으로써 결정될 수 있도록 스클레로스틴-결합-파트너 단백질을 방사선동위원소 또는 효소 표지와 커플링시킴으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, 분자, 예를 들어 단백질을 125I, 35S, 14C, 또는 3H로 직접적으로 또는 간접적으로 표지할 수 있고, 방사선방출의 직접적인 카운팅에 의해 또는 섬광 카운팅에 의해 방사성동위원소를 검출할 수 있다. 별법적으로, 예를 들어 양고추냉이 과산화효소, 알칼리성 포스파타제, 또는 루시페라제로 분자를 효소에 의해 표지시키고, 적합한 기질의 생성물로의 전환의 결정에 의해 효소에 의한 표지를 검출할 수 있다.
어떠한 반응물도 표지시키지 않으면서, 스클레로스틴-결합-파트너 (또는 스클레로스틴:스클레로스틴-결합-파트너 상호작용)를 조절하는 후보 또는 테스트 화합물 또는 작용제의 능력을 결정하는 것 또한 본 발명의 범주 내에 속한다. 예를 들어, 마이크로피지오메터(microphysiometer)를 사용하여, 어떠한 반응물도 표지시키지 않으면서 테스트 화합물과 스클레로스틴-결합-파트너의 상호작용을 검출할 수 있다 ([McConnell et al. (1992) Science 257: 1906]). 본원에서 사용된 "마이크로피지오메터" (예를 들어, 사이토센서(Cytosensor))는 광-지시형(light-addressable) 전위차 센서 (LAPS)를 사용하여 세포가 자신의 환경을 산성화시키는 속도를 측정하는 분석 기기이다. 이러한 산성화 속도에서의 변화가 화합물과 수용체 간의 상호작용의 지표로 사용될 수 있다.
또다른 실시양태에서, 본 발명의 분석법은 단백질 또는 이의 생물학적으로 활성인 일부분이 후보 또는 테스트 화합물 또는 작용제 (예를 들어, 또는 스클레로스틴-결합-파트너를 조절하는 능력 또는 스클레로스틴:스클레로스틴-결합-파트너 상호작용로부터 초래된 신호전달을 조절하는 능력에 대해 테스트되는 화합물)와 접촉되고 스클레로스틴-결합-파트너 또는 이의 생물학적으로 활성인 일부분에 결합하는 테스트 화합물의 능력이 결정되는 무세포 분석법이다. 상기 기술된 바와 같이 직접적으로 또는 간접적으로 스클레로스틴-결합-파트너 단백질에 대한 테스트 화합물의 결합이 결정될 수 있다.
실시간 생체분자 상호작용 분석 (BIA: 분자 상호작용 분석)과 같은 기술을 사용하여 이같은 결정을 달성할 수 있다. [Sjolander et al., 1991 Anal. Chem. 63:2338-2345] 및 [Szabo et al., 1995 Curr. Opin. Struct. Biol. 5:699-705]. 본원에서 사용된 "BIA"는 어떠한 반응물도 표지시키지 않으면서 실시간으로 생체특이적 상호작용을 연구하기 위한 기술이다 (예를 들어, 비아코어(BIAcore)). 표면 플라즈몬 공명 (SPR)의 광학 현상에서의 변화가 생물학적 분자들 간의 실시간 반응의 지표로서 사용될 수 있다.
상기의 본 발명의 분석 방법들의 하나를 초과하는 실시양태에서, 복합체를 형성한 형태의 단백질을 복합체를 형성하지 않은 형태로부터 분리하는 것을 용이하게 하기 위해, 뿐만 아니라 분석법의 자동화를 도모하기 위해, 스클레로스틴 또는 스클레로스틴-결합-파트너를 고정시키는 것이 바람직할 수 있다. 스클레로스틴 또는 스클레로스틴-결합-파트너에 대한 테스트 화합물의 결합은 반응물들을 함유하는데 적절한 임의의 용기에서 달성될 수 있다. 이같은 용기의 예로는 미량역가 플레이트, 시험관, 및 미세원심분리 튜브가 포함된다. 한 실시양태에서, 단백질이 매트릭스에 결합되도록 하는 도메인을 부가하는 융합 단백질이 제공될 수 있다. 예를 들어, 글루타티온-S-트랜스페라제/키나제 융합 단백질 또는 글루타티온-S-트랜스페라제/표적 융합 단백질이 글루타티온 세파로스 비드 (시그마 케미컬(Sigma Chemical; St. Louis, Mo.)) 또는 글루타티온-유도체화 미량역가 플레이트 상에 흡착될 수 있고, 그후, 이를 테스트 화합물 또는 테스트 화합물 및 흡착되지 않은 스클레로스틴 또는 스클레로스틴-결합-파트너 단백질과 합치고, 혼합물을 복합체 형성에 도움이 되는 조건 (예를 들어, 염 및 pH에 대한 생리학적 조건) 하에 인큐베이션한다. 인큐베이션 후, 비드 또는 미량역가 플레이트 웰을 세정하여 모든 결합되지 않은 성분들을 제거하고, 비드의 경우 매트릭스를 고정시키고, 예를 들어 상기 기술된 바와 같이, 직접적으로 또는 간접적으로 복합체를 결정한다. 별법적으로, 복합체를 매트릭스로부터 해리시켜, 표준 기술을 사용하여 결합 수준을 결정할 수 있다.
단백질을 매트릭스 상에 고정시키기 위한 또다른 기술이 본 발명의 스크리닝 분석법에서 또한 사용될 수 있다. 예를 들어, 비오틴 및 스트렙타비딘의 접합을 사용하여 스클레로스틴 또는 스클레로스틴-결합-파트너를 고정시킬 수 있다. 비오틴화 스클레로스틴 또는 스클레로스틴-결합-파트너 단백질 또는 표적 분자를 당업계에 주지된 기술 (예를 들어, 피어스 케미컬(Pierce Chemicals; Rockford, Ill.)의 비오틴화 키트)을 사용하여 비오틴-NHS (N-히드록시-숙신이미드)로부터 제조하고, 스트렙타비딘이 코팅된 96웰 플레이트 (피어스 케미컬)의 웰에 고정시킬 수 있다. 별법적으로, 스클레로스틴 또는 스클레로스틴-결합-파트너 단백질 또는 표적 분자와 반응성인 항체를 플레이트의 웰에 유도체화시키고, 결합되지 않은 스클레로스틴 또는 스클레로스틴-결합-파트너 단백질을 항체 접합에 의해 웰 내에서 포획할 수 있다. 이같은 복합체를 검출하기 위한 방법에는, GST-고정 복합체에 대해 상기 기술된 것들에 더하여, 스클레로스틴 또는 스클레로스틴-결합-파트너 단백질 또는 표적 분자와 반응성인 항체를 사용하는 복합체의 면역검출이 포함된다.
본 발명의 또다른 양상에서, 스클레로스틴 또는 스클레로스틴-결합-파트너 단백질은 2-하이브리드 분석법 또는 3-하이브리드 분석법 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,283,317; [Zervos et al., 1993 Cell 72:223-232]; [Madura et al., 1993 J. Biol. Chem. 268:12046-12054]; [Bartel et al., 1993 Biotechniques 14:920-924]; [Iwabuchi et al., 1993 Oncogene 8:1693-1696]; 및 WO94/10300 (Brent))에서 스클레로스틴 또는 스클레로스틴-결합-파트너에 결합하는 또다른 단백질을 확인하기 위한 "미끼 단백질"로 사용될 수 있다. 또한 이같은 스클레로스틴 또는 스클레로스틴-결합-파트너-결합 단백질은 스클레로스틴 또는 스클레로스틴-결합-파트너 단백질에 의한 신호의 증식에서 수반될 것이다.
2-하이브리드 시스템은 분리가능한 DNA-결합 도메인 및 활성화 도메인으로 구성된 대부분의 전사 인자의 모듈형 성질을 기초로 한다. 간략하게, 이러한 분석법은 2개의 상이한 DNA 구축물을 사용한다. 한 구축물에서, 스클레로스틴 또는 스클레로스틴-결합-파트너 단백질을 코딩하는 유전자가 공지된 전사 인자 (예를 들어, GAL-4)의 DNA 결합 도메인을 코딩하는 유전자에 융합된다. 또다른 구축물에서, 확인되지 않은 단백질 ("먹이" 또는 "샘플")을 코딩하는, DNA 서열들의 라이브러리로부터의 DNA 서열이 공지된 전사 인자의 활성화 도메인을 코딩하는 유전자에 융합된다. "미끼" 및 "먹이" 단백질이 생체 내에서 상호작용하여 키나제 의존적 복합체를 형성할 수 있으면, 전사 인자의 DNA-결합 도메인 및 활성화 도메인이 아주 근접하게 놓인다. 이러한 근접은 전사 인자에 응답성인 전사 조절 부위에 작동가능하게 연결된 리포터 유전자 (예를 들어, LacZ)가 전사되도록 한다. 리포터 유전자의 발현을 검출할 수 있고, 기능성인 전사 인자를 함유하는 세포 콜로니를 단리하여, 단백질과 상호작용하는 스클레로스틴 또는 스클레로스틴-결합-파트너 단백질을 코딩하는 클로닝된 유전자를 수득하는데 사용할 수 있다.
본 발명은 또한 상기 기술된 스크리닝 분석법에 의해 확인된 신규 작용제에 관한 것이다. 따라서, 적합한 동물 모델에서 본원에 기술된 바와 같이 확인된 작용제를 추가로 사용하는 것은 본 발명의 범주 내에 속한다. 예를 들어, 본원에 기술된 바와 같이 확인된 작용제 (예를 들어, 스클레로스틴:스클레로스틴-결합-파트너 상호작용을 조절할 수 있는 작용제)를 이같은 작용제로의 치료의 효능, 독성 또는 부작용을 결정하기 위해 동물 모델에서 사용할 수 있다. 별법적으로, 본원에 기술된 바와 같이 확인된 작용제를 이같은 작용제의 작용 메커니즘을 결정하기 위해 동물 모델에서 사용할 수 있다. 또한, 본 발명은 본원에 기술된 바와 같은 치료를 위한 상기 기술된 스크리닝 분석법에 의해 확인된 신규 작용제의 용도에 관한 것이다.
제약 조성물
본원에 기술된 바와 같은 조성물은 제약 조성물일 수 있다. 본 발명은 생리학적으로 혼화성인 담체와 부가혼합된, 본 발명에 따른 (i) 스클레로스틴:스클레로스틴-결합-파트너 상호작용의 조절물질 (예를 들어, 소분자 조절물질), 또는 (ii) 스클레로스틴-결합-파트너 모방체를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 활성 성분에 더하여, 이러한 제약 조성물은 상당량의 하나 이상의 제약상 허용되는 무기 또는 유기, 고체 또는 액체 담체, 및 제약용으로 사용될 수 있는, 생리학적으로 허용되는 희석제 (예컨대 물, 포스페이트 완충 염수 또는 염수)를 함유할 수 있다.
본 발명에 따른 제약 조성물은 스클레로스틴-관련 장애 및/또는 골 무기질 밀도가 비정상적인 장애의 치료, 개선, 진단 또는 예방을 위해 온혈 동물, 특히 인간 (또는 온혈 포유동물, 특히 인간으로부터 유래된 세포 또는 세포주, 예를 들어 골모세포 또는 파골세포)에게 투여하는데 적절하다.
본 발명에 따른 제약 조성물은 온혈 포유동물 (특히 인간)에게 장, 예컨대 비강, 직장 또는 경구, 또는 비경구, 예컨대 근육내 또는 정맥내 투여하기 위한 것이다. 활성 성분의 용량은 온혈 포유동물의 종, 체중, 연령 및 개별적인 상태, 개별적인 약동학적 데이터, 치료하려는 질환 및 투여 방식에 따라 좌우된다. 예를 들어, 온혈 포유동물, 예를 들어 체중이 약 70 ㎏인 인간에게 투여되는 조절물질 (예를 들어, 소분자 조절물질) 또는 이의 제약상 허용되는 염의 용량은 바람직하게는 1인당 하루 약 3 ㎎ 내지 약 10 g, 더욱 바람직하게는 약 10 mg 내지 약 1.5 g, 가장 바람직하게는 약 100 mg 내지 약 1000 mg이고, 이는 바람직하게는 1-3개의 단일 용량 (예를 들어, 동일한 크기일 수 있음)으로 분할될 수 있다. 일반적으로, 아동에게는 성인 용량의 절반을 제공한다.
먼저 적합한 동물 모델에서의 실험에 이어지는 치료할 종에서의 실험에서 적합한 투여량이 또한 결정될 수 있다. 물론, 투여량 및 투여 빈도는 치료될 적응증의 성질 및 중증도, 원하는 응답, 치료될 개체의 상태 등과 같은 요인에 따라 좌우될 것이다. 적합한 투여량은 각각 또는 조합되어 약 10 ng/㎏/일 내지 약 100 ㎍/㎏/일의 범위이다. 바람직하게는, 1-20일 동안의 100 ng/㎏/일 내지 약 1000 ng/㎏/일의 용량이 적합한 생물학적 효과를 유도할 것으로 예상될 수 있다. 별법적으로, 대식세포/단핵구에 의해 매개되는 면역 및/또는 염증성 응답의 증대를 통해 항균 효과를 발휘하도록 약 1 ㎍/㎏/일 내지 약 100 ㎍/㎏/일의 볼루스 주사가 약 4일 간격으로 제공될 수 있다.
제약 조성물은 약 1％ 내지 약 95％, 바람직하게는 약 20％ 내지 약 90％의 활성 성분을 포함한다. 본 발명에 따른 제약 조성물은, 예를 들어 단위 용량 형태, 예컨대 앰풀, 바이알, 좌약, 당의정, 정제 또는 캡슐의 형태일 수 있다.
본 발명의 제약 조성물은 당업계에 공지된 방식으로, 예를 들어 통상적인 용해, 동결건조, 혼합, 과립화 또는 당의처리(confectioning) 공정에 의해 제조된다.
활성 성분의 용액, 및 또한 현탁액, 특히 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하게 사용되고, 예를 들어 활성 성분을 단독으로 또는 담체 (예를 들어 만니톨)과 함께 포함하는 동결건조 조성물의 경우에는, 이같은 용액 또는 현탁액이 사용전에 제조될 수 있다. 제약 조성물은 멸균될 수 있고/있거나, 부형제, 예를 들어 방부제, 안정화제, 습윤화 및/또는 에멀션화 작용제, 가용화제, 삼투압 조절용 염 및/또는 완충제를 포함할 수 있으며, 그 자체로 당업계에 공지된 방법으로, 예를 들어 통상적인 용해 또는 동결건조 공정에 의해 제조된다. 상기 용액 또는 현탁액은 점도를 증가시키는 물질, 예컨대 소듐 카르복시메틸셀룰로스, 카르복시메틸셀룰로스, 덱스트란, 폴리비닐피롤리돈 또는 젤라틴을 포함할 수 있다.
오일 내의 현탁액은 오일 성분으로서 주사 목적에 통상적인 식물성, 합성 또는 반합성 오일을 포함한다. 산 성분으로서 탄소수 8-22, 특히 12-22의 장쇄 지방산, 예를 들어 라우르산, 트리데실산, 미리스트산, 펜타데실산, 팔미트산, 마르가르산, 스테아르산, 아라키드산, 베헨산 또는 상응하는 불포화 산, 예를 들어 올레산, 엘라이드산, 에루크산, 브라시드산 또는 리놀레산을 함유하는 액체 지방산 에스테르가 특히 언급될 수 있고, 원한다면, 항산화제, 예를 들어 비타민 E, β-카로틴 또는 3,5-디-tert-부틸-4-히드록시톨루엔이 부가된다. 이러한 지방산 에스테르의 알콜 성분은 탄소수가 최대 6이고, 모노-또는 폴리-히드록시, 예를 들어 모노-, 디- 또는 트리-히드록시 알콜, 예를 들어 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 또는 펜탄올, 또는 이의 이성질체, 특히 글리콜 및 글리세롤이다. 따라서, 지방산 에스테르의 하기의 예가 언급된다: 에틸 올레에이트, 이소프로필 미리스테이트, 이소프로필 팔미테이트, "라브라필(Labrafil) M 2375" (폴리옥시에틸렌 글리세롤 트리올레에이트; 가테포세(Gattefosse) (Paris)), "미글리올(Miglyol) 812" (사슬 길이가 C8 내지 C12인 포화 지방산의 트리글리세리드; 휴엘스 아게(Huels AG; 독일)), 특히 식물성 오일, 예컨대 면실유, 아몬드유, 올리브유, 피마자유, 참기름, 대두유, 더욱 특히 땅콩유.
주사 조성물은 통상적인 방식으로 무균성 조건 하에 제조된다; 또한 이는 조성물을 앰풀 또는 바이알에 도입하는 과정 및 컨테이너를 밀봉하는 과정에 동일하게 적용된다.
활성 성분을 고체 담체로 코팅하고, 원한다면 생성된 혼합물을 과립화시키고, 혼합물을, 원한다면 또는 필요하다면 적합한 부형제의 첨가 후에, 정제, 당의정 코어 또는 캡슐로 가공함으로써 경구 투여용 제약 조성물을 수득할 수 있다. 이들을 활성 성분들이 계량된 양으로 확산 또는 방출되도록 하는 플라스틱 캐리어 내로 혼입시킬 수도 있다.
적절한 담체는 특히 충전제, 예컨대 당, 예를 들어 락토스, 사카로스, 만니톨 또는 소르비톨, 셀룰로스 제제 및/또는 인산칼슘, 예를 들어 인산3칼슘 또는 인산수소칼슘, 및 결합제, 예컨대 옥수수, 밀, 쌀 또는 감자 전분을 예를 들어 사용하는 전분 페이스트, 젤라틴, 트라가칸트, 메틸셀룰로스, 히드록시프로필메틸셀룰로스, 소듐 카르복시메틸셀룰로스 및/또는 폴리비닐피롤리돈, 및/또는 원하는 경우의 붕해제, 예컨대 상기 언급된 전분, 및/또는 카르복시메틸 전분, 가교 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 이의 염, 예컨대 알긴산나트륨이다. 부형제는 특히 유동 조절제 및 윤활제, 예를 들어 규산, 탈크, 스테아르산 또는 이의 염, 예컨대 스테아르산 마그네슘 또는 칼슘, 및/또는 폴리에틸렌 글리콜이다. 당의정 코어에 적절한 코팅제 (임의로는 장용성임)가 제공되고, 아라비아 고무, 탈크, 폴리비닐피롤리돈, 폴리에틸렌 글리콜 및/또는 이산화티탄을 포함할 수 있는 진한 당 용액, 또는 적절한 유기 용매 내의 코팅 용액, 또는 장용성 코팅제의 제조를 위한 적절한 셀룰로스 제제, 예컨대 에틸셀룰로스 프탈레이트 또는 히드록시프로필메틸셀룰로스 프탈레이트의 용액이 특히 사용된다. 캡슐은 젤라틴으로 제조된 건식 충전 캡슐, 및 젤라틴 및 가소제, 예컨대 글리세롤 또는 소르비톨로 제조된 연질 밀봉 캡슐이다. 건식 충전 캡슐은, 예를 들어 충전제 예컨대 락토스, 결합제 예컨대 전분, 및/또는 활택제 예컨대 탈크 또는 스테아르산마그네슘, 및 원하는 경우의 안정화제와 함께, 과립 형태의 활성 성분을 포함할 수 있다. 연질 캡슐에서, 바람직하게는 활성 성분은 적절하게 유성인 부형제, 예컨대 지방유, 파라핀 오일 또는 액체 폴리에틸렌 글리콜 내에 용해 또는 현탁되고, 안정화제 및/또는 항균제가 또한 첨가될 수 있다. 예를 들어 확인 목적, 또는 활성 성분의 여러 용량의 지시를 위해 염료 또는 안료가 정제 또는 당의정 코팅제 또는 캡슐 포장재에 첨가될 수 있다.
항체
스클레로스틴-결합-파트너를 폴리클로날 및 모노클로날 항체 제조를 위한 표준 기술을 사용하여 항체를 생성시키기 위한 면역원으로서 사용할 수 있다. 전장 폴리펩티드 또는 단백질이 사용될 수 있거나, 별법적으로, 본 발명은 면역원으로서 사용하기 위한 항원성 펩티드 단편을 제공한다. 본 발명의 단백질의 항원성 펩티드는 스클레로스틴-결합-파트너의 아미노산 서열의 적어도 8개 (바람직하게는 10개, 15개, 20개, 또는 30개)의 아미노산 잔기를 포함하고, 펩티드에 대해 상승된 항체가 단백질과의 특이적 면역 복합체를 형성하도록 단백질의 에피토프를 포함한다.
항원성 펩티드가 포함하는 바람직한 에피토프는 단백질의 표면 상에 위치하는 영역, 예를 들어 친수성 영역이다. 친수도(hydropathy) 플롯 또는 유사한 분석법을 사용하여 친수성 영역을 확인할 수 있다.
전형적으로 면역원은 적절한 대상 (예를 들어, 토끼, 염소, 마우스 또는 기타 포유동물)을 면역화시킴으로써 항체를 제조하는데 사용된다. 적합한 면역원성 제제는, 예를 들어 재조합에 의해 발현된 또는 화학적으로 합성된 폴리펩티드를 포함한다. 제제는 애쥬번트, 예컨대 프로인트 완전 또는 불완전 애쥬번트, 또는 유사한 면역자극제를 추가로 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 용어 항체는 면역글로불린 분자 및 면역글로불린 분자의 면역학적으로 활성인 일부분, 즉 스클레로스틴-결합-파트너와 같은 항원에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위를 함유하는 분자를 지칭한다. 항체는 통상적인 면역글로불린 분자, 뿐만 아니라 스클레로스틴-결합-파트너 및/또는 스클레로스틴과 또한 특이적으로 반응성인 이의 단편을 포함한다. 통상적인 기술을 사용하여 항체를 단편화시킬 수 있고, 전체 항체에 대해 본원에서 하기에 기술된 것과 동일한 방식으로 효용에 대해 단편들을 스크리닝할 수 있다. 면역글로불린 분자의 면역학적으로 활성인 부분의 예로는 항체를 펩신과 같은 효소로 처리함으로써 생성될 수 있는 F(ab) 및 F(ab')2 단편이 포함된다. 본 발명은 폴리클로날 및 모노클로날 항체를 제공한다. 본원에서 사용된 용어 "모노클로날 항체" 또는 "모노클로날 항체 조성물"은 특정 에피토프와 면역반응할 수 있는 1가지 종의 항원 결합 부위만을 함유하는 항체 분자들의 집단을 지칭한다.
면역원으로서의 본 발명의 폴리펩티드로 적절한 대상을 면역화시킴으로써 상기 기술된 바와 같이 폴리클로날 항체를 제조할 수 있다. 면역화된 대상에서의 항체 역가를 표준 기술에 의해, 예컨대 고정된 폴리펩티드를 사용하는 효소 결합 면역흡착 분석법 (ELISA)으로 경시적으로 모니터링할 수 있다. 원한다면, 항체 분자를 포유동물 (예를 들어, 혈액)으로부터 단리하고, 주지된 기술, 예컨대 단백질 A 크로마토그래피에 의해 추가로 정제하여, IgG 분획을 수득할 수 있다. 면역화 후 적절한 시간에, 예를 들어 특정 항체 역가가 최고일 때, 항체 생산 세포를 대상으로부터 분리하여, 표준 기술, 예컨대 [Kohler and Milstein (1975) Nature 256:495 497]에 최초로 기술된 하이브리도마 기술, 인간 B-세포 하이브리도마 기술 ([Kozbor et al. (1983) Immunol. Today 4:72]), EBV 하이브리도마 기술 ([Cole et al. (1985), Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77 96]) 또는 트리오마(trioma) 기술에 의해 모노클로날 항체를 제조하는데 사용할 수 있다. 하이브리도마를 생산하는 기술은 주지되어 있다 (일반적으로, [Current Protocols in Immunology (1994) Coligan et al. (eds.) John Wiley & Sons, Inc., New York, NY] 참조). 예를 들어, 표준 ELISA 분석법을 사용하여, 당해 폴리펩티드에 결합하는 항체에 대해 하이브리도마 배양물 상등액을 스크리닝함으로써, 본 발명의 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마 세포가 검출된다.
모노클로날 항체를 분비하는 하이브리도마를 제조하는 것에 대한 별법으로서, 조합형 재조합 면역글로불린 라이브러리 (예를 들어, 항체 파지 디스플레이 라이브러리)를 당해 폴리펩티드로 스크리닝함으로써 본 발명의 폴리펩티드에 대해 지시된 모노클로날 항체를 확인하고 단리할 수 있다. 파지 디스플레이 라이브러리의 생성 및 스크리닝을 위한 키트가 시판된다 (예를 들어, 파마시아(Pharmacia)의 제조합 파지 항체 시스템(Recombinant Phage Antibody System), 카탈로그 번호 27 9400 01; 및 스트라타진(Stratagene)의 SurfZAP™ 파지 디스플레이 키트(Phage Display Kit), 카탈로그 번호 240612). 추가적으로, 항체 디스플레이 라이브러리의 생성 및 스크리닝에서 사용하기에 특히 가능한 방법 및 시약의 예를, 예를 들어 미국 특허 번호 5,223,409; PCT 공개 번호 WO 92/18619; PCT 공개 번호 WO 91/17271; PCT 공개 번호 WO 92/20791; PCT 공개 번호 WO 92/15679; PCT 공개 번호 WO 93/01288; PCT 공개 번호 WO 92/01047; PCT 공개 번호 WO 92/09690; PCT 공개 번호 WO 90/02809; [Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9:1370 1372]; [Hay et al. (1992) Hum. Antibod. Hybridomas 3:81 85]; [Huse et al. (1989) Science 246:1275 1281]; [Griffiths et al. (1993) EMBO J. 12:725 734]에서 발견할 수 있다.
추가적으로, 표준 재조합 DNA 기술을 사용하여 제조할 수 있는, 재조합 항체, 예컨대 키메라 및 인간화 모노클로날 항체 (인간 부분 및 비-인간 부분 양쪽 모두를 포함함)가 본 발명의 범주 내에 속한다. 키메라 항체는 상이한 부분들이 상이한 동물 종으로부터 유래된 분자, 예컨대 뮤린(murine) mAb로부터 유래된 가변 영역 및 인간 면역글로불린 불변 영역이 있는 분자이다. (예를 들어, 카빌리(Cabilly) 등의 미국 특허 번호 4,816,567; 및 보스(Boss) 등의 미국 특허 번호 4,816397을 참조하고, 이들은 거명에 의해 전체적으로 본원에 포함된다.) 인간화 항체는 비-인간 종으로부터의 하나 이상의 상보성 결정 영역 (CDR) 및 인간 면역글로불린 분자로부터의 프레임워크 영역이 있는, 비-인간 종으로부터의 항체 분자이다. (예를 들어, 퀸(Queen)의 미국 특허 번호 5,585,089를 참조하고, 이는 거명에 의해 전체적으로 본원에 포함된다.) 이같은 키메라 및 인간화 모노클로날 항체는 당업계에 공지된 재조합 DNA 기술에 의해, 예를 들어 PCT 공개 번호 WO 87/02671; 유럽 특허 출원 184,187; 유럽 특허 출원 171,496; 유럽 특허 출원 173,494; PCT 공개 번호 WO 86/01533; 미국 특허 번호 4,816,567; 유럽 특허 출원 125,023; [Better et al. (1988) Science 240:1041 1043]; [Liu et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3439 3443]; [Liu et al. (1987) J. Immunol. 139:3521 3526]; [Sun et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:214 218]; [Nishimura et al. (1987) Cane. Res. 47:999 1005]; [Wood et al. (1985) Nature 314:446 449]; 및 [Shaw et al. (1988) J. Natl. Cancer Inst. 80: 1553 1559]; [Morrison (1985) Science 229:1202 1207]; [Oi et al. (1986) Bio/Techniques 4:214]; 미국 특허 5,225,539; [Jones et al. (1986) Nature 321:552 525]; [Verhoeyan et al. (1988) Science 239:1534]; 및 [Beidler et al. (1988) J. Immunol. 141:4053 4060]에 기술된 방법을 사용하여 생산할 수 있다.
완전히 인간형인 항체가 인간 환자의 치료적 처치에 특히 바람직하다. 내인성 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 유전자를 발현할 수 없지만 인간 중쇄 및 경쇄 유전자를 발현할 수 있는 트랜스제닉 마우스를 사용하여 이같은 항체를 생산할 수 있다. 트랜스제닉 마우스를 선택된 항원, 예를 들어 본 발명의 폴리펩티드 전부 또는 일부분으로 일반적인 방식으로 면역화시킨다. 항원에 대해 지시된 모노클로날 항체를 통상적인 하이브리도마 기술을 사용하여 수득할 수 있다. 트랜스제닉 마우스가 보유하는 인간 면역글로불린 트랜스진이 B-세포 분화 동안 재배열되고, 이어서 클래스 전환 및 체세포 돌연변이가 진행된다. 따라서, 이같은 기술을 사용하여, 치료적으로 유용한 IgG, IgA 및 IgE 항체를 생산할 수 있다. 인간 항체를 생산하기 위한 이러한 기술의 개관을 위해서, [Lonberg and Huszar (1995, Int. Rev. Immunol. 13:65-93)]을 참조한다. 인간 항체 및 인간 모노클로날 항체를 생산하기 위한 이러한 기술 및 이같은 항체를 생산하기 위한 프로토콜의 상세한 논의를 위해, 예를 들어 미국 특허 5,625,126; 미국 특허 5,633,425; 미국 특허 5,569,825; 미국 특허 5,661,016; 및 미국 특허 5,545,806를 참조한다. 또한, 상기 기술된 것과 유사한 기술을 사용하여 선별된 항원에 대해 지시된 인간 항체를 제공하도록 Abgenix, Inc. (Freemont, CA)와 같은 회사와 계약할 수 있다.
"유도 선별(guided selection)"로 지칭되는 기술을 사용하여, 선별된 에피토프를 인식하는 완전히 인간형인 항체를 생성시킬 수 있다. 이러한 접근법에서, 선별된 비-인간 모노클로날 항체, 예를 들어 마우스 항체가 동일한 에피토프를 인식하는 완전히 인간형인 항체의 선별을 유도하는데 사용된다. ([Jespers et al. (1994) Bio/technology 12:899 903]).
본 발명의 폴리펩티드에 대해 지시된 항체 (예를 들어, 모노클로날 항체)를 표준 기술, 예컨대 친화력 크로마토그래피 또는 면역침전에 의해 폴리펩티드를 단리하는데 사용할 수 있다. 또한, 이같은 항체를 폴리펩티드의 발현의 과다도 및 패턴을 평가하기 위해 단백질 (예를 들어, 세포 용해물 또는 세포 상등액 내의 단백질)을 검출하는데 사용할 수 있다. 임상 테스트 절차의 일부로서 조직 내의 단백질 수준을 모니터링하기 위해, 예를 들어 소정의 치료 요법의 효능을 결정하기 위해, 진단용으로 항체를 또한 사용할 수 있다. 항체를 검출가능한 물질에 커플링시킴으로써 검출이 용이해질 수 있다. 검출가능한 물질의 예로는 다양한 효소, 보조군(prosthetic group), 형광 물질, 발광 물질, 생체발광 물질, 및 방사성 물질이 포함된다. 적절한 효소의 예로는 양고추냉이 과산화효소, 알칼리성 포스파타제, 베타 갈락토시다제, 또는 아세틸콜린에스테라제가 포함되고, 적절한 보조군 복합체의 예로는 스트렙타비딘/비오틴 및 아비딘/비오틴이 포함되며, 적절한 형광 물질의 예로는 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 단실 클로라이드 또는 파이코에리트린이 포함되며, 발광 물질의 예로는 루미놀이 포함되고, 생체발광 물질의 예로는 루시페라제, 루시페린, 및 에쿼린이 포함되고, 적절한 방사성 물질의 예로는 125I, 131I, 35S 또는 3H가 포함된다.
항체-유사 (예를 들어, 비-면역글로불린) 스캐폴드
생성된 폴리펩티드가 표적 단백질에 특이적인 결합 영역을 1개 이상 포함하는 한 광범위한 항체/면역글로불린 프레임워크 또는 스캐폴드가 사용될 수 있다. 이같은 프레임워크 또는 스캐폴드는 인간 면역글로불린의 5가지 주요 이디오타입(idiotype), 또는 이의 단편 (예컨대 본원의 다른 곳에 기술된 것들)을 포함하고, 다른 동물 종 (바람직하게는 인간화 양상이 있음)의 면역글로불린을 포함한다. 단일 중쇄 항체 예컨대 카멜리드(camelid)에서 확인된 것들이 이와 관련하여 특히 흥미롭다. 당업자에 의해 신규 프레임워크, 스캐폴드 및 단편이 계속 발견 및 발달된다.
한 양상에서, 본 발명은 스클레로스틴-결합 파트너에 대해 비-면역글로불린 스캐폴드 라이브러리를 스크리닝함으로써 비-면역글로불린을 기초로 하는 스캐폴드 분자를 생성시키는 것에 관한 것이다. 비-면역글로불린 스캐폴드 라이브러리를 스크리닝하기 위해, 파지 디스플레이, 리보솜 디스플레이, RNA 디스플레이 또는 효모 디스플레이를 포함하지만 이에 한정되지 않는, 항체 라이브러리에 대해 사용된 유사한 디스플레이 기술을 사용할 수 있다. 또다른 양상에서, 본 발명은 본 발명의 CDR이 그래프트될 수 있는 비-면역글로불린 스캐폴드를 사용하여 비-면역글로불린을 기초로 하는 항체를 생성시키는 것에 관한 것이다. 표적 단백질에 특이적인 결합 영역을 포함하는 한, 공지된 또는 추후의 비-면역글로불린 프레임워크 및 스캐폴드를 사용할 수 있다. 이같은 화합물은 본원에서 "표적-특이적 결합 영역을 포함하는 폴리펩티드" 또는 항체-유사 스캐폴드로 공지된다. 공지된 비-면역글로불린 프레임워크 또는 스캐폴드에는 피브로넥틴 III을 기초로 하는 유도 분자 예컨대 아드넥틴(Adnectin) (피브로넥틴) (아드넥서스, 인크.(Adnexus, Inc.; Waltham, MA)), 안키린 (몰레큘라 파트너스 아게(Molecular Partners AG; Zurich, Switzerland)), 도메인 항체 (도만티스 리미티드(Domantis, Ltd; Cambridge, MA) 및 Ablynx nv (Zwijnaarde, Belgium)), 리포칼린 (안티칼린(Anticalin)) (피에리스 프로테오랩 아게(Pieris Proteolab AG; Freising, Germany)), 소형 모듈형 면역제약 (트루비온 파마슈티칼스 인크(Trubion Pharmaceuticals Inc.; Seattle, WA)), 맥시바디(maxybody) (아비디아 인크(Avidia, Inc.; Mountain View, CA)), 단백질 A (어피바디 아게 (Affibody AG; 스웨덴)) 및 아필린 (감마-크리스탈린 또는 유비퀴틴) (실 프로테인스 게엠베하(Scil Proteins GmbH; Halle, Germany))이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에 따르면, 항-스클레로스틴 또는 항-스클레로스틴-결합-파트너 단백질 항체 또는 이의 단편, 또는 스클레로스틴-특이적 또는 스클레로스틴-결합-파트너-특이적 결합 영역을 포함하는 폴리펩티드는, 사용된 프레임워크 또는 스캐폴드와 상관 없이, 추가적인 모이어티에 공유결합에 의해 또는 비-공유결합에 의해 결합될 수 있다. 추가적인 모이어티는 폴리펩티드, 불활성 중합체 예컨대 PEG, 소분자, 방사성동위원소, 금속, 이온, 핵산 또는 기타 유형의 생물학적으로 관련된 분자일 수 있다. 면역접합체, 면역독소 등으로 공지될 수 있는 이같은 구축물 또한 본원에서 사용된 바와 같은 스클레로스틴-특이적 또는 스클레로스틴-결합-파트너-특이적 결합 영역을 포함하는 항체, 항체 단편 또는 폴리펩티드의 의미 내에 포함된다.
(i) 제III형 피브로넥틴을 기초로 하는 스캐폴드
제III형 피브로넥틴을 기초로 하는 스캐폴드는 제III형 피브로넥틴 도메인 (예를 들어, 제III형 피브로넥틴의 10번째 모듈 (10 Fn3 도메인))을 기초로 한다. 제III형 피브로넥틴 도메인은 단백질의 코어를 형성하도록 서로에 대해 패킹된 2개의 베타 시트 사이에 분포된 7개 또는 8개의 베타 가닥이 있고, 베타 가닥들을 서로 연결하고 용매-노출된 루프 (CDR과 유사)를 추가로 함유한다. 베타 시트 샌드위치의 각각의 가장자리에 3개 이상의 이같은 루프가 있고, 이 때 가장자리는 베타 가닥의 방향에 직각인 단백질의 경계이다. (미국 6,818,418).
전체적인 폴드(fold)는 낙타 및 라마 IgG 내의 전체 항원 인식 단위를 포함하는, 중쇄의 가변 영역인 가장 작은 기능성 항체 단편의 것과 밀접하게 관련되지만, 이러한 피브로넥틴을 기초로 하는 스캐폴드는 면역글로불린이 아니다. 이러한 구조로 인해, 비-면역글로불린 항체는 항체의 것과 본성 및 친화력이 유사한 항원 결합 성질을 모방한다. 이러한 스캐폴드는 생체 내에서의 항체의 친화력 돌연변이의 과정과 유사한 시험관 내에서의 루프 무작위화 및 셔플링(shuffling) 전략에서 사용될 수 있다. 이러한 피브로넥틴을 기초로 하는 분자는 표준 클로닝 기술을 사용하여 분자의 루프 영역이 본 발명의 CDR로 대체될 수 있는 스캐폴드로 사용될 수 있다.
(ii) 안키린 - 몰레큘라 파트너스
이 기술은 안키린에서 유래된 반복 모듈이 있는 단백질을 상이한 표적들에 대한 결합에 사용될 수 있는 가변 영역을 지니기 위해 스캐폴드로 사용하는 것을 기초로 한다. 안키린 반복 모듈은 2개의 역평행 α-나선 및 회전으로 구성된 아미노산 33개의 폴리펩티드이다. 가변 영역의 결합은 리보솜 디스플레이를 사용함으로써 대부분 최적화된다.
(iii) 맥시바디/아비머(Avimer) - 아비디아
아비머는 천연 A-도메인 함유 단백질 예컨대 LRP-1로부터 유래된다. 이러한 도메인은 본래 단백질-단백질 상호작용에 대해 사용되고, 인간에서, 250개를 초과하는 단백질이 A-도메인을 구조적으로 기초로 한다. 아비머는 아미노산 링커를 통해 연결된 다수의 상이한 "A-도메인" 단량체들 (2-10개)로 구성된다. 20040175756; 20050053973; 20050048512; 및 20060008844에 예를 들어 기술된 방법을 사용하여 표적 항원에 결합할 수 있는 아비머가 생성될 수 있다.
(vi) 단백질 A - 어피바디
어피바디® 친화력 리간드는 단백질 A의 IgG-결합 도메인들 중 하나의 스캐폴드를 기초로 하는 나선 3개의 다발로 구성된 작고 간단한 단백질이다. 단백질 A는 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 박테리아로부터의 표면 단백질이다. 이러한 스캐폴드 도메인은 58개의 아미노산으로 구성되고, 이중 13개가 무작위화되어 다수의 리간드 변이체가 있는 어피바디® 라이브러리가 생성된다 (예를 들어, 미국 5,831,012 참조). 어피바디® 분자는 항체를 모방하고, 150 kDa인 항체의 분자량과 비교하여 이의 분자량은 6 kDa이다. 작은 크기에도 불구하고, 어피바디® 분자의 결합 부위는 항체의 것과 유사하다.
(v) 안티칼린 - 피에리스
안티칼린®은 피에리스 프로테오랩 아게 회사에 의해 개발된 제품이다. 이는 화학적으로 민감하거나 불용성인 화합물의 생리학적인 수송 또는 보관에 일반적으로 수반되는 작고 강건한(robust) 단백질의 광범위한 군인 리포칼린으로부터 유래된다. 여러 천연 리포칼린이 인간 조직 또는 체액에서 발생한다.
단백질 구조는 초가변성 루프가 경직성 프레임워크의 상부에 있으면서, 면역글로불린을 연상시킨다. 그러나, 항체 또는 이의 재조합 단편과 대조적으로, 리포칼린은 아미노산 잔기 160개 내지 180개의 단일 폴리펩티드 사슬로 구성되어, 단일 면역글로불린 도메인보다 약간 더 크다.
결합 주머니를 이루는, 루프 4개의 셋트는 두드러진 구조적 유연성을 나타내고, 다양한 측쇄를 허용한다. 따라서, 상이한 형상의 규정된 표적 분자들을 높은 친화력 및 특이성으로 인식하기 위하여 독점적인 과정에서 결합 부위가 재성형될 수 있다.
리포칼린 부류의 한 단백질인, 피에리스 브라시카(Pieris Brassicae)의 빌린(bilin)-결합 단백질 (BBP)이 루프 4개의 셋트를 돌연변이유발시킴으로써 안티칼린을 개발하는데 사용되었다. "안티칼린"이 기술된 특허 출원의 한 예는 PCT WO 199916873이다.
(vi) 애필린 - 실 프로테인스
애필린™ 분자는 단백질 및 소분자에 대한 특이적 친화력을 위해 디자인된 소형 비-면역글로불린 단백질이다. 신규 애필린™ 분자가 상이한 인간-유래 스캐폴드 단백질을 각각 기초로 하는 2개의 라이브러리로부터 매우 신속하게 선별될 수 있다.
애필린™ 분자는 면역글로불린 단백질에 대해 어떠한 구조적 상동성도 나타내지 않는다. 실 프로테인스는 하나는 인간의 구조적 눈 렌즈 단백질인 감마 크리스탈린이고 다른 하나는 "유비퀴틴" 거대부류 단백질인 2개의 애필린™ 스캐폴드를 사용한다. 양쪽 모두의 인간 스캐폴드는 매우 작고, 높은 온도 안정성을 나타내며, pH 변화 및 변성제에 대해 거의 저항성이다. 이러한 높은 안정성은 주로 단백질의 확장된 베타 시트 구조로 인한 것이다. 감마 크리스탈린 유래 단백질의 예가 WO200104144에 기술되어 있고, "유비퀴틴-유사" 단백질의 예가 WO2004106368에 기술되어 있다.
융합 단백질
본 발명은 키메라 또는 융합 단백질을 제공한다. 본원에서 사용된 "키메라 단백질" 또는 "융합 단백질"은 이종성 폴리펩티드 (즉, 동일한 본 발명의 폴리펩티드 이외의 폴리펩티드)에 작동가능하게 연결된 본 발명의 폴리펩티드의 전부 또는 일부분 (바람직하게는 생물학적으로 활성인 일부분)을 포함한다. 융합 단백질에서, 용어 "작동가능하게 연결된"은 본 발명의 폴리펩티드와 이종성 폴리펩티드가 서로 인-프레임(in frame)으로 융합되는 것을 가리키도록 의도된다. 이종성 폴리펩티드는 본 발명의 폴리펩티드의 N 말단 또는 C 말단에 융합될 수 있다.
한 유용한 융합 단백질은 본 발명의 폴리펩티드가 GST 서열의 C 말단에 융합된 GST 융합 단백질이다. 이같은 융합 단백질은 본 발명의 재조합 폴리펩티드의 정제를 용이하게 할 수 있다.
또다른 실시양태에서, 융합 단백질은 이의 N 말단에 이종성 신호 서열을 함유한다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드의 천연 신호 서열이 제거되고, 또다른 단백질로부터의 신호 서열로 교체될 수 있다. 예를 들어, 배큘로바이러스 껍질 단백질의 gp67 분비 신호가 이종성 신호 서열로 사용될 수 있다 ([Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons, 1992]). 진핵생물 이종성 신호 서열의 또다른 예로는 멜리틴 및 인간 태반 알칼리성 포스파타제의 분비 서열 (스트라타진 (La Jolla, California))이 포함된다. 또다른 예에서, 유용한 원핵생물 이종성 신호 서열에는 phoA 분비 신호 ([Sambrook et al., 상기 문헌]) 및 단백질 A 분비 신호 (파마시아 바이오텍(Pharmacia Biotech; Piscataway, New Jersey))가 포함된다
또다른 실시양태에서, 융합 단백질은 본 발명의 폴리펩티드의 전체 또는 일부분이 면역글로불린 단백질 부류의 구성원으로부터 유래된 서열에 융합된 면역글로불린 융합 단백질이다. 본 발명의 면역글로불린 융합 단백질은 제약 조성물 내로 혼입되어, 리간드 (가용성 또는 막-결합형)와 세포 표면 상의 단백질 (수용체) 간의 상호작용을 억제함으로써 생체내에서 신호 전달을 억제하기 위해 대상에게 투여될 수 있다. 면역글로불린 융합 단백질은 본 발명의 폴리펩티드의 동족 리간드의 생체이용률에 영향을 미치기 위해 사용될 수 있다. 리간드/수용체 상호작용의 억제는 증식성 및 분화성 장애의 치료 및 세포 생존의 조절 (예를 들어, 촉진 또는 억제) 양쪽 모두를 위해 치료적으로 유용할 수 있다. 또한, 본 발명의 면역글로불린 융합 단백질은 대상에서 본 발명의 폴리펩티드에 대해 지시된 항체를 생산하기 위한 면역원으로서 사용될 수 있고, 리간드를 정제하기 위해 사용될 수 있으며, 스크리닝 분석법에서 수용체와 리간드의 상호작용을 억제하는 분자를 확인하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 키메라 및 융합 단백질은 표준 재조합 DNA 기술에 의해 생산될 수 있다. 또다른 실시양태에서, 자동화 DNA 합성기를 포함하는 통상적인 기술에 의해 융합 유전자가 합성될 수 있다. 별법적으로, 2개의 연속적인 유전자 단편들 사이에 상보적 오버행을 발생시키는 앵커(anchor) 프라이머를 사용하여 유전자 단편의 PCR 증폭을 수행할 수 있고, 이어서 상기 단편들이 어닐링(annealing) 및 재증폭되어 키메라 유전자 서열이 생성될 수 있다 (예를 들어, [Ausubel et al., 상기 문헌] 참조). 또한, 융합 모이어티 (예를 들어, GST 폴리펩티드)를 이미 코딩하는 다수의 발현 벡터가 시판된다. 융합 모이어티가 본 발명의 폴리펩티드에 인-프레임으로 연결되도록 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 이같은 발현 벡터 내로 클로닝할 수 있다.
이같은 융합 단백질의 예는 LRP4의 세포외 부분, 예를 들어 서열 3으로 구성되는 세포외 부분을 포함하는 단백질 융합물이다. 이같은 융합 단백질의 예는 서열 4의 폴리펩티드이다.
RNAi
본 발명은 소형 간섭 리보핵산 서열 (siRNA), 뿐만 아니라 siRNA를 사용하여 세포 또는 포유동물에서 SOST 유전자 또는 스클레로스틴-결합-파트너를 코딩하는 유전자의 발현을 억제하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 본 발명은 siRNA를 사용하여, SOST 유전자 또는 스클레로스틴-결합-파트너를 코딩하는 유전자의 비정상적인 발현에 의해 야기되거나 상기 유전자가 필수적인 구성원인 경로의 비정상적인 신호전달에 의해 야기되는 포유동물에서의 생리학적 상태 및 질환을 치료하기 위한 조성물 및 방법을 또한 제공한다. siRNA는 RNA 간섭 (RNAi)으로 공지된 과정을 통해 mRNA의 서열-특이적 파괴를 지시한다.
본 발명의 siRNA는 길이가 뉴클레오티드 30개 미만, 일반적으로 뉴클레오티드 19-24개이고, SOST 유전자 또는 스클레로스틴-결합-파트너를 코딩하는 유전자의 mRNA 전사물의 적어도 일부분에 실질적으로 상보적인 영역이 있는 RNA 가닥 (안티센스 가닥)을 포함한다. 이러한 siRNA의 사용은 스클레로스틴, BMP, 또는 Wnt 신호전달 경로에 연루된 유전자들의 mRNA의 표적화된 분해를 가능하게 한다.
본 발명에 따른 siRNA 분자는 RNA 간섭 ("RNAi")을 매개한다. 용어 "RNAi"는 당업계에 주지되어 있고, 표적 유전자에 상보적인 영역이 있는 siRNA에 의한 세포 내의 하나 이상의 표적 유전자의 억제를 의미하는 것으로 통상적으로 이해된다. siRNA를 RNAi를 매개하는 이의 능력에 대해 테스트하기 위한 다양한 분석법이 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어, [Elbashir et al., Methods 26 (2002), 199-213] 참조). 유전자 발현에 대한 본 발명에 따른 siRNA의 효과는 전형적으로 표적 유전자의 발현이 본 발명에 따른 RNA 분자로 처리되지 않은 세포와 비교하여 적어도 10％, 33％, 50％, 90％, 95％ 또는 99％만큼 억제되는 것을 초래할 것이다.
본 발명에 따른 "siRNA" 또는 "소형-간섭 리보핵산"은 하기의 양상을 포함하는 당업계에 공지된 의미를 갖는다. siRNA는 생리학적 조건 하에 상보성 영역을 따라 혼성화하는 2가닥의 리보뉴클레오티드로 구성된다. 가닥들은 분리되어 있지만, 특정 실시양태에서는 분자성 링커에 의해 연결될 수 있다. 개별적인 리보뉴클레오티드들은 변형되지 않은 천연 발생 리보뉴클레오티드, 변형되지 않은 천연 발생 데옥시리보뉴클레오티드일 수 있거나, 또는 본원의 다른 곳에 기술된 바와 같이 화학적으로 변형되거나 합성 물질일 수 있다.
본 발명에 따른 siRNA 분자는 표적 유전자의 mRNA의 영역과 실질적으로 동일한 이중-가닥 영역을 포함한다. 표적 유전자의 상응하는 서열에 대해 100％ 동일한 영역이 적절하다. 이러한 상태는 "완전히 상보적"인 것으로 지칭된다. 그러나, 영역은 표적화되는 mRNA의 영역의 길이에 따라, 표적 유전자의 상응하는 영역과 비교하여 1개, 2개 또는 3개의 미스매치를 또한 함유할 수 있고, 따라서 완전히 상보적이지 않을 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 RNA 분자는 1개의 소정의 유전자를 특이적으로 표적으로 한다. 원하는 mRNA만을 표적으로 하기 위해, siRNA 시약은 표적 mRNA에 대한 100％의 상동성, 및 세포 또는 생물 내에 존재하는 모든 다른 유전자에 대한 2개 이상의 미스매칭된 뉴클레오티드를 가질 수 있다. 특이적 표적 서열의 발현을 효과적으로 억제하기 위해 충분한 서열 동일성이 있는 siRNA를 분석 및 확인하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 당업계에 공지된 서열 비교 및 정렬 알고리즘 ([Gribskov and Devereux, Sequence Analysis Primer, Stockton Press, 1991] 및 이에 인용된 참고문헌 참조), 및 뉴클레오티드 서열들 간의 차이 백분율을, 예를 들어 디폴트 파라미터를 사용하는 BESTFIT 소프트웨어 프로그램 (예를 들어, University of Wisconsin Genetic Computing Group)에서 실행된 바와 같이 스미스-워터만(Smith-Waterman) 알고리즘에 의해 계산하는 것에 의해 서열 동일성을 최대화할 수 있다.
RNAi 시약의 효율성에 영향을 미치는 또다른 인자는 표적 유전자의 표적 영역이다. RNAi 시약에 의한 억제에 효과적인 표적 유전자의 영역은 실험에 의해 결정될 수 있다. 적절한 mRNA 표적 영역은 코딩 영역일 것이다. 5'-UTR, 3'-UTR, 및 스플라이스 연결부(juction)과 같은 비번역 영역 또한 적절하다. 예를 들어, [Elbashir S.M. et al, 2001 EMBO J., 20, 6877-6888]에 기술된 바와 같은 형질감염 분석법을 이러한 목적을 위해 수행할 수 있다. 다수의 또다른 적절한 분석법 및 방법이 당업계에 존재하고, 이들은 당업자에게 주지되어 있다.
본 발명에 따른, 표적에 상보적인 siRNA의 영역의 길이는 뉴클레오티드 10개 내지 100개, 뉴클레오티드 12개 내지 25개, 뉴클레오티드 14개 내지 22개, 또는 뉴클레오티드 15개, 16개, 17개 또는 18개일 수 있다. 상응하는 표적 영역에 대한 미스매치가 있는 경우, 상보성 영역의 길이는 일반적으로 약간 더 길 필요가 있다.
siRNA가 오버행 말단 (표적에 상보적일 수 있거나 상보적이지 않을 수 있음) 또는 자신에게는 상보적이지만 표적 유전자에게는 상보적이지 않은 추가적인 뉴클레오티드를 보유할 수 있기 때문에, siRNA의 각각의 별도의 가닥의 전체 길이는 뉴클레오티드 10개 내지 100개, 뉴클레오티드 15개 내지 49개, 뉴클레오티드 17개 내지 30개, 또는 뉴클레오티드 19개 내지 25개일 수 있다.
"각각의 가닥은 뉴클레오티드 49개 미만이다"라는 구절은 모든 변형 또는 비-변형 뉴클레오티드를 포함하지만 가닥의 3' 또는 5' 말단에 부가될 수 있는 어떠한 화학 모이어티도 포함하지 않는, 가닥 내의 연속적인 뉴클레오티드의 전체 개수를 의미한다. 가닥 내로 삽입된 짧은 화학 모이어티는 계산되지 않지만, 2개의 별도의 가닥을 연결하도록 디자인된 화학 링커는 연속적인 뉴클레오티드를 생성시키는 것으로 간주되지 않는다.
"5' 말단 또는 3' 말단 중 하나 이상 상의 뉴클레오티드 1개 내지 6개의 오버행"이라는 구절은 생리학적 조건 하에 2개의 별도의 가닥으로부터 형성된 상보적 siRNA의 구조를 지칭한다. 말단 뉴클레오티드가 siRNA의 이중-가닥 영역의 일부이면, siRNA는 평활 말단인 것으로 간주된다. 하나 이상의 뉴클레오티드가 말단에서 쌍을 이루지 않고 있으면 오버행이 생성된다. 오버행 길이는 오버행되어 있는 뉴클레오티드의 개수에 의해 측정된다. 오버행되어 있는 뉴클레오티드는 어느 한쪽 가닥의 5' 말단 또는 3' 말단 중 어느 하나 상에 있을 수 있다.
본 발명에 따른 siRNA는 가닥들 중 하나 이상 내에 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드를 포함함으로써 경구 전달에 적절한 높은 생체내 안정성을 부여한다. 따라서, 본 발명에 따른 siRNA는 하나 이상의 변형된 또는 비-천연 리보뉴클레오티드를 함유한다. 다수의 공지된 화학적 변형의 상세한 기술이 PCT 특허 출원 WO 200370918에 기재되어 있고, 본원에서 반복되지 않을 것이다. 경구 전달에 대한 적절한 변형이 본원의 실시예 및 상세한 설명에 더욱 구체적으로 기재된다. 적절한 변형은 당 모이어티 (즉, 당 모이어티의 2' 위치, 예를 들어 2'-O-(2-메톡시에틸) 또는 2'-MOE) ([Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504]) 즉, 알콕시알콕시 기) 또는 염기 모이어티 (즉, 교대되는 뉴클레오티드 사슬 내의 또다른 특정 염기와 쌍을 형성하는 능력이 유지된 비-천연 또는 변형 염기)에 대한 변형을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 또다른 변형에는 포스포에스테르 기 (인접한 리보뉴클레오티드들을 예를 들어 포스포로티오에이트, 키랄 포스포로티오에이트 또는 포스포로디티오에이트와 연결시킴)를 교체하는 것을 포함하지만 이에 한정되지 않는 소위 '골격' 변형이 포함된다. 마지막으로, 종종 본원에서 3' 캡 또는 5' 캡으로 지칭되는 말단 변형이 중요할 수 있다. 캡은 당업자에게 공지된 더욱 복합적인 화학물질로 구성될 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명은 SOST 유전자 또는 스클레로스틴-결합-파트너를 코딩하는 유전자의 발현을 억제하기 위한 이중-가닥 리보핵산 (dsRNA) 분자를 제공한다. dsRNA는 서로 상보적인 2개 이상의 서열을 포함한다. dsRNA는 제1 가닥을 포함하는 센스 가닥 및 제2 가닥을 포함하는 안티센스 가닥을 포함한다. 안티센스 가닥은 SOST 유전자 또는 스클레로스틴-결합-파트너를 코딩하는 유전자를 코딩하는 mRNA의 적어도 일부분에 대해 실질적으로 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상보성 영역은 길이가 뉴클레오티드 30개 미만, 일반적으로는 뉴클레오티드 19-24개이다. dsRNA는, SOST 유전자 또는 스클레로스틴-결합-파트너를 코딩하는 유전자를 발현하는 세포와의 접촉 시, 상기 유전자의 발현을 적어도 40％만큼 억제한다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 dsRNA 중 하나를 포함하는 세포를 제공한다. 세포는 일반적으로 포유류 세포, 예컨대 마우스, 래트, 토끼, 양, 소 또는 영장류로부터의 세포이다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 하나 이상의 본 발명의 dsRNA 및 제약상 허용되는 담체 또는 전달 비히클을 포함하는, 생물, 일반적으로 인간 대상에서 SOST 유전자 또는 스클레로스틴-결합-파트너를 코딩하는 유전자의 발현을 억제하기 위한 제약 조성물을 제공한다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 세포에서 SOST 유전자 또는 스클레로스틴-결합-파트너를 코딩하는 유전자의 발현을 억제하는 방법을 제공한다:
(a) 서로 상보적인 2개 이상의 서열을 포함하는 이중-가닥 리보핵산 (dsRNA)을 세포 내로 도입하는 단계. dsRNA는 제1 가닥을 포함하는 센스 가닥 및 제2 가닥을 포함하는 안티센스 가닥을 포함한다. 안티센스 가닥은 SOST 유전자 또는 스클레로스틴-결합-파트너를 코딩하는 유전자를 코딩하는 mRNA의 적어도 일부분에 대해 실질적으로 상보적인 상보성 영역을 포함하고, 상보성 영역은 길이가 뉴클레오티드 30개 미만, 일반적으로는 뉴클레오티드 19-24개이며, dsRNA는, SOST 유전자 또는 스클레로스틴-결합-파트너를 코딩하는 유전자를 발현하는 세포와의 접촉 시, 상기 유전자의 발현을 적어도 40％만큼 억제한다; 및
(b) 단계 (a)에서 생산된 세포를 SOST 유전자 또는 스클레로스틴-결합-파트너를 코딩하는 유전자의 mRNA 전사물의 분해를 수득하는데 충분한 시간 동안 유지시킴으로써, 세포 내에서 상기 유전자의 발현을 억제하는 단계.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 스클레로스틴, BMP, 또는 Wnt 신호전달에 의해 매개되는 병리학적 과정, 예를 들어 스클레로스틴-관련 장애 및/또는 골 무기질 밀도가 비정상적인 장애를 치료, 예방 또는 관리하는 방법으로, 이같은 치료, 예방 또는 관리를 필요로 하는 환자에게 치료적 또는 예방적 유효량의 하나 이상의 본 발명의 siRNA를 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 siRNA 중 하나의 하나 이상의 가닥을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 조절 서열을 포함하는, 세포 내에서 SOST 유전자 또는 스클레로스틴-결합-파트너를 코딩하는 유전자의 발현을 억제하기 위한 벡터를 제공한다.
본 발명의 억제성 핵산 화합물을 시판되는 자동화 DNA 합성기, 예를 들어 어플라이드 바이오시스템스(Applied Biosystems; Foster City, CA)의 380B, 392 또는 394 모델 DNA/RNA 합성기, 또는 유사한 장치 상에서 통상적인 수단에 의해 합성할 수 있다. 포스포르아미디트 화학을 사용할 수 있다. 본 발명의 억제성 핵산 화합물 또한 변형될 수 있고, 예를 들어 다수의 참고문헌에 기술된 뉴클레아제 저항성 골격 예컨대 포스포르티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포르아미데이트 등이 사용될 수 있다. 억제성 핵산의 길이는 생물학적 활성이 억제되는 것을 확실히 하는데 충분하여야 한다. 따라서, 예를 들어 안티센스 올리고뉴클레오티드의 경우, 원하는 표적 폴리뉴클레오티드에서만 특이적 결합이 일어나고 다른 우연한 부위에서는 일어나지 않는 것을 확실히 하도록 충분히 커야 한다. 길이의 상한은 길이가 뉴클레오티드 약 30-40개를 초과하는 올리고머를 합성 및 정제하는 것의 불편함 및 비용, 더 긴 올리고뉴클레오티드가 더 짧은 올리고뉴클레오디드보다 미스매치에 대해 더 크게 허용성인 것 등을 포함하는 여러 요인에 의해 결정된다. 바람직하게는, 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 길이가 뉴클레오티드 약 15개 내지 40개 범위이다. 더욱 바람직하게는, 올리고뉴클레오티드 모이어티의 길이가 뉴클레오티드 약 18개 내지 약 25개이다.
소형 간섭 RNA (siRNA) 분자로 또한 명명된 이중-가닥 RNA, 즉, 센스-안티센스 RNA를 SOST 유전자 또는 스클레로스틴-결합-파트너를 코딩하는 유전자에 대한 핵산의 발현을 억제하는데 또한 사용할 수 있다. RNA 간섭은 한 가닥이 표적 mRNA의 코딩 영역에 상응하는 짧은 외인성 RNA 이합체가 투여되는 방법이다 ([Elbashir et al.(2001) Nature 411: 494]). 세포 내로의 진입 시, siRNA 분자는 외인성 RNA 이합체의 분해뿐만 아니라, 내인성 전령 RNA를 포함하는, 동일한 서열의 단일-가닥 RNA의 분해를 또한 야기한다. 따라서, 촉매적 메커니즘을 통해 기술이 작용하는 것으로 여겨지기 때문에, siRNA는 전통적인 안티센스 RNA 방법보다 더욱 강력하고 효과적일 수 있다. 바람직한 siRNA 분자는 전형적으로 뉴클레오티드 19개 내지 25개의 길이이고, 바람직하게는 뉴클레오티드 약 21개의 길이이다. siRNA를 표적 세포에 전달하기 위한 효과적인 전략은, 예를 들어 물리적 또는 화학적 형질감염을 사용하는 형질도입을 포함한다.
별법적으로, 기능성 siRNA 또는 이의 전구체가 전사되도록 하는 다양한 PolIII 프로모터 발현 카셋트를 예를 들어 사용하여 세포 내에서 siRNA를 발현시킬 수 있다. 예를 들어, [Scherr et al. (2003) Curr. Med. Chem. 10(3):245]; [Turki et al. (2002) Hum. Gene Ther. 13(18):2197]; [Cornell et al. (2003) Nat. Struct. Biol. 10(2):91] 참조. 본 발명은 RNA 간섭 (RNAi)을 매개할 수 있는 또다른 소형 RNA, 예를 들어 마이크로-RNA (miRNA) 및 짧은 헤어핀 RNA (shRNA)를 또한 포함한다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자가 통상적으로 이해하는 것과 동일한 의미이다. 본원에 기술된 것들과 유사하거나 등가인 방법 및 물질이 본 발명의 실행 또는 테스트에서 사용될 수 있지만, 적절한 방법 및 물질이 하기에 기술된다. 본원에서 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허 및 기타 참고문헌은 거명에 의해 전체적으로 포함된다. 상충되는 경우, 정의가 포함되는 본 명세서가 제어할 것이다. 또한, 물질, 방법 및 예는 단지 설명적인 것이고, 한정적인 것으로 의도되지 않는다.
하기의 실시예는 단지 설명적인 것이고, 어떠한 방식으로도 본 발명의 청구항의 범주를 한정하도록 의도되지 않는다.
실시예 1: 스클레로스틴과 스클레로스틴 -결합-파트너 간의 회합의 발견
스클레로스틴, BMP, 및 Wnt 경로의 신규 조절물질을 확인하기 위해, 스클레로스틴에 대해 체계적인 TAP 방법을 적용하였다. [Rigaut et al. (Nat Biotechnol. (1999) 17(10): 1030)], WO 00/09716 특허 출원 (Seraphin & Rigaut) (이들의 내용은 거명에 의해 본원에 포함됨)에 기술된 바와 같이, TAP 정제 방법은 TAP 태그를 당해 표적 단백질에 융합시키는 것 및 구축물을 동족 숙주 세포 또는 생물 내로 도입하는 것을 수반한다.
TAP 태그는 TEV 프로테아제 절단 부위에 의해 분리된, (i) 스타필로코쿠스 아루레우스(Staphylococcus aureus)로부터의 단백질 A (ProtA)의 IgG-결합 단위; 및 (ii) 칼모듈린 결합 펩티드 (CBP)의 직렬 융합물이다. 이는 복합체 조성, 활성 또는 기능의 사전 지식 없이 비교적 작은 개수의 세포로부터 복합체가 신속하게 정제되도록 한다. 질량 분광법과 조합되어, TAP 전략은 소정의 표적 단백질과 상호작용하는 단백질이 확인되도록 한다.
N 및 C 말단 양쪽에서 태그가 부착된 스클레로스틴을 50 ng/㎖ BMP-2로 4시간 및 20시간 동안 처리된 또는 처리되지 않은 HEK293T 및 골모세포성 UMR-106 세포에서 발현시켰다. N-말단 TAP-태그는 CD33 단백질로부터의 인공 신호전달 서열 을 또한 함유하였다. UMR-106 및 관련된 HEK293 세포가 내인성 SOST mRNA를 발현한다는 것을 본 발명가들이 이전에 발견하였기 때문에 UMR-106 및 HEK293T 세포를 선택하였다 ([Keller, H. and Kneissel, M (2005) Bone 37:148]).
SOST TAP-태그가 부착된 양쪽 단백질들의 적합한 세포하 국소화를 간접적인 면역형광에 의해 모니터링하였다. 예비-테스트는 충분한 양의 TAP-태그부착 스클레로스틴이 TAP 접근법을 시작하기 위한 생화학적으로 제조된 막 분획 내에서 발견되었음을 나타냈다. 또한, 스클레로스틴의 태그부착 구축물 양쪽 모두가 어느 쪽이든 세포 유형의 배지 내에 분비되는 것으로 발견되었다. UMR-106 세포로부터의 막 분획 내의 C-TAP 스클레로스틴의 발현 수준은 TAP 정제에 불충분한 것으로 발견되었다. 이러한 샘플들의 추가적인 프로세싱을 중단하였다.
세포들을 10％ FCS가 있는 DMEM 배지에서 성장시켰다. 자극을 위해, 배지를 50 ng/㎖ BMP2를 함유하는 신선한 배지 또는 신선한 배지 단독으로 교체하였다. 세포를 4시간 및 20시간 동안 자극한 후, 기계적 탈착에 의해 수확하고, 얼음 상에서 과량의 PBS로 세정하고, 면역침전 완충제에서 용해시켰다.
미정제 용해물에 세포하 분획화를 수행하여, 막-회합 단백질을 강화시켰다.
막 분획을 사용하여 TAP 정제를 수행하였다. 분비된 TAP-태그부착 SOST 복합체의 정제를 위해, 세포 배양물 상등액을 여러 세포 배양 플레이트로부터 수집하였다.
막 분획에 대해서 삼중 정제를 수행하는 한편, 세포 배양물 상등액 정제는 1회만 수행하였다.
정제된 단백질 복합체를 1D-SDS-PAGE에 의해 분리하고, 콜로이드성 쿠마시 블루에 의해 염색하였다. [Shevchenko, A., Wilm, M., Vorm, O. & Mann, M. Mass spectrometric sequencing of proteins silver-stained polyacrylamide gels. Anal. Chem. 68, 850-858 (1996)]에 기술된 바와 같이, 전체 젤 레인을 슬라이스로 체계적으로 절단하고, 단백질을 젤 내에서 트립신으로 소화시켰다. LC-MS/MS에 의해 단백질을 확인하고, MS 데이터를 EBI (Hinxton, UK)에서 유지되는 인터내셔널 프로테인 인덱스(International Protein Index; IPI)의 인-하우스 큐레이트(cureted) 버젼에 대해 검색하였다. 데이터베이스 검색 결과를 추가적인 바이오인포매틱스 분석을 위한 데이터베이스 시스템에서 판독하였다 (히트(hit)를 컴퓨터 보조 표적 선별(Computer Aided Target Selection; CATS) 분석에 적용하는 것 포함).
총 약 100개의 단백질이 양쪽 세포주로부터 확인되었고, 이 때 E-값은 10 이하, R-값은 0.67 이상이었다.
리보솜 단백질 및 RNA 결합 단백질, 및 기타 풍부한 세포질 단백질에 대해 필터링한 후 히트들을 명단으로 추려내었다. 스클레로스틴은 RNA 결합 단백질에 대한 경향을 나타내는 것으로 보였다 (10 이하의 E-값으로 약 60개의 후보물이 남음). 여기에서 사용된 값들은 하기와 같았다:
IPI= IPI 데이터베이스로부터의 단백질 기준 번호
R= 삼중 정제 셋트 내에서의 확인의 재현성
E= 단백질이 소정의 기준 데이터셋트에 대해 TAP에 의해 확인되는 진입점의 총 개수
MS= 펩티드의 개수 (각각의 단백질이 MS에 의해 확인되었다).
Figure 112009047076030-PCT00001
Figure 112009047076030-PCT00002
표 I 및 표 II에 나타난 바와 같이, 하기의 스클레로스틴 상호작용 파트너들이 이러한 접근법에 의해 확인되었다: 베르시칸 (CSPG2), FREM2, 피브릴린 2 (FBN2), C6orf93, 신데칸-4 (Sdc4), 아그린 (AGRN), 세르핀2 (PN-1), LRP2, LRP4, LRP6, SLIT2, 테나신 C, TRIM26, TRIM41, 글리피칸1, 알칼리성 포스파타제 (ALPL) 및 IL-17 수용체.
Wnt1/STF 분석법에서의 스클레로스틴의 작용에 대한 상호작용 파트너 하향-조절 (siRNA) 또는 상향-조절 (과발현)의 효과를 HEK293 (인간 배아 신장 세포), C28a2 (스클레로스틴이 검출되지 않을 수 있는 인간 연골세포 세포주) 및/또는 UMR106 (래트 골육종 세포) 세포에서 테스트하였고, 생화학적 분석법을 수행하였다 (예: ALPL)
실시예 2: LRP4 데이터
간략하게, siRNA를 HEK293 세포에서 Wnt1 유도 Wnt 신호전달 리포터 분석법 (수퍼탑플래시 (STF))에서 LRP4에 대해 스크리닝하였다. LRP4에 대한 모든 siRNA는 LRP4 mRNA를 녹다운시킬 수 있었다 (도 1). LRP4 mRNA 녹다운은 HEK293 세포에서 STF 활성을 억제하는 스클레로스틴의 능력을 감소시켰다 (도 2). 스클레로스틴 용량 응답 연구는, 대조군과 비교하여, LRP4 녹다운이 STF/Wnt1 분석법에서 SOST의 IC50에서 5배까지의 증가를 초래하였음을 나타냈다.
HEK293 세포에서의 LRP4 과발현은 STF 분석법에 의해 측정되는 바와 같이 Wnt 신호전달을 감소시켰다 (도 4a). HEK293 세포에서 LRP4의 과발현은 SOST IC50에서의 5배 증가를 초래하였고, Dkk1 IC50에 대한 효과는 없었다 (도 4b). HEK 세포에서 LRP5와 함께 LRP4의 과발현은 Dkk1 IC50에 대한 효과가 없었지만, LRP5만을 과발현하는 대조군 세포와 비교하여 SOST IC50에서 35배 감소를 초래하였다 (도 4c). HEK 세포에서 LRP6과 함께 LRP4의 과발현은 Dkk1 IC50에 대한 효과가 없었지만, LRP6만을 과발현하는 대조군 세포와 비교하여 SOST IC50에서 20배 감소를 초래하였다 (도 4d). 이러한 데이터는 LRP4가 HEK 세포에서 스클레로스틴 작용의 특이적 촉진물이라는 것을 실연한다.
SOST가 없는 C28a2 세포에서의 LRP4 과발현은 LRP5로 일시적으로 형질감염된 세포에서 STF 분석법에 의해 측정했을 때 정규 Wnt 신호전달에서 2.5배 감소를 유도하였다 (도 5a). C28a2 세포에서의 LRP4 및 LRP5의 과발현은 Dkk1 IC50에 대한 효과는 없었지만, LRP5만을 과발현하는 대조군 세포와 비교하여 SOST IC50에서 16배 감소를 초래하였다 (도 5b). 600 nM에서의 SOST 작용의 효능이 52％에서 72％로 증가하였다. 따라서 이러한 데이터는 LRP4가 C28a2 세포에서 스클레로스틴 작용의 촉진물이지만, Dkk1 활성에는 영향을 미치지 않는다는 것을 실연한다.
이러한 발견을 기초로, LRP4는 스클레로스틴 작용을 강화시키는, 스클레로스틴에 대한 중요한 상호작용 파트너인 것으로 가정된다. 결과적으로, 이러한 상호작용의 조절은 골격 조직에서 스클레로스틴 작용을 억제하는 신규 방식을 제공할 수 있다.
실시예 3: 알칼리성 포스파타제 데이터
MC3T3 세포에서의 세포-기반 알칼리성 포스파타제 분석법에서 알칼리성 포스파타제에 대한 스클레로스틴의 효과를 추가로 테스트하였다. 이러한 분석법은 p-니트로페닐 포스페이트의 탈인산화를 분광광도법으로 측정하는 것에 의한 내인성 알칼리성 포스파타제의 활성의 검출을 기초로 한다. 스클레로스틴이 BMP, Wnt 및 LRP5/6 하류의 알칼리성 포스파타제를 억제할 수 있는지 여부를 테스트하기 위해, GK3베타 억제제-유도 알칼리성 포스파타제에 대한 스클레로스틴의 효과를 테스트하였다 (도 6). 스클레로스틴은 LiCl-유도 알칼리성 포스파타제 및 GSK-3 억제제 IX (칼바이오켐(Calbiochem) #361550)-유도 알칼리성 포스파타제를 감소시켰다. 그후, 본 발명가들은 4-메틸움벨리페릴 포스페이트의 탈인산화의 형광 검출을 기초로 무세포 분석법에서 ALPL 자체에 대한 스클레로스틴의 효과를 테스트하였다 (도 7). 스클레로스틴 용량 응답 연구는, 대조군과 비교하여, 고농도의 스클레로스틴이 알칼리성 포스파타제 활성을 억제한다는 것을 나타냈다. 이러한 데이터는 알칼리성 포스파타제 활성에 대한 SOST의 직접적인 억제성 효과를 시사한다.
본 발명은 본원에 기술된 구체적인 실시양태들에 의해 범주가 한정되지 않는다. 실제로, 본원에 기술된 것들에 더하여 본 발명의 다양한 변형이 상기의 상세한 설명 및 첨부된 도면으로부터 당업자에게 명백해질 것이다. 이같은 변형은 첨부된 청구항의 범주 내에 속하는 것으로 의도된다.
다양한 간행물들이 본원에서 인용되고, 이들의 개시내용은 전체적으로 거명에 의해 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> Novartis AG <120> Sclerostin Binding Partner <130> 50511A <160> 4 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 1950 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Arg Arg Gln Trp Gly Ala Leu Leu Leu Gly Ala Leu Leu Cys Ala 1 5 10 15 His Ala Val Ala Leu Gly Leu Arg Ala Gly Glu Arg Thr Arg Ser Gly 20 25 30 Pro Gly Ser Ser Ser Pro Ser Gly Gly Ile Ser Gly Gly Ala Ser Ala 35 40 45 Gly Ser Gly Leu Gly Arg Gly Ala Gly Leu Gly Arg Gly Ala Gly Leu 50 55 60 Ala Ser Ser Pro Glu Cys Ala Cys Gly Arg Ser His Phe Thr Cys Ala 65 70 75 80 Val Ser Ala Leu Gly Glu Cys Thr Cys Ile Pro Ala Gln Trp Gln Cys 85 90 95 Asp Gly Asp Asn Asp Cys Gly Asp His Ser Asp Glu Asp Gly Cys Ile 100 105 110 Leu Pro Thr Cys Ser Pro Leu Asp Phe His Cys Asp Asn Gly Lys Cys 115 120 125 Ile Arg Arg Ser Trp Val Cys Asp Gly Asp Asn Asp Cys Glu Asp Asp 130 135 140 Ser Asp Glu Gln Asp Cys Pro Pro Arg Glu Cys Glu Glu Asp Glu Phe 145 150 155 160 Pro Cys Gln Asn Gly Tyr Cys Ile Arg Ser Leu Trp His Cys Asp Gly 165 170 175 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Leu 1370 1375 1380 Phe Ser Ser Arg Gly Ser Ile Arg Arg Ile Ser Leu Asp Thr Ser 1385 1390 1395 Asp His Thr Asp Val His Val Pro Val Pro Glu Leu Asn Asn Val 1400 1405 1410 Ile Ser Leu Asp Tyr Asp Ser Val Asp Gly Lys Val Tyr Tyr Thr 1415 1420 1425 Asp Val Phe Leu Asp Val Ile Arg Arg Ala Asp Leu Asn Gly Ser 1430 1435 1440 Asn Met Glu Thr Val Ile Gly Arg Gly Leu Lys Thr Thr Asp Gly 1445 1450 1455 Leu Ala Val Asp Trp Val Ala Arg Asn Leu Tyr Trp Thr Asp Thr 1460 1465 1470 Gly Arg Asn Thr Ile Glu Ala Ser Arg Leu Asp Gly Ser Cys Arg 1475 1480 1485 Lys Val Leu Ile Asn Asn Ser Leu Asp Glu Pro Arg Ala Ile Ala 1490 1495 1500 Val Phe Pro Arg Lys Gly Tyr Leu Phe Trp Thr Asp Trp Gly His 1505 1510 1515 Ile Ala Lys Ile Glu Arg Ala Asn Leu Asp Gly Ser Glu Arg Lys 1520 1525 1530 Val Leu Ile Asn Thr Asp Leu Gly Trp Pro Asn Gly Leu Thr Leu 1535 1540 1545 Asp Tyr Asp Thr Arg Arg Ile Tyr Trp Val Asp Ala His Leu Asp 1550 1555 1560 Arg Ile Glu Ser Ala Asp Leu Asn Gly Lys Leu Arg Gln Val Leu 1565 1570 1575 Val Gly His Val Ser His Pro Phe Ala Leu Thr Gln Gln Asp Arg 1580 1585 1590 Trp Ile Tyr Trp Thr Asp Trp Gln Thr Lys Ser Ile Gln Arg Val 1595 1600 1605 Asp Lys Tyr Ser Gly Arg Asn Lys Glu Thr Val Leu Ala Asn Val 1610 1615 1620 Glu Gly Leu Met Asp Ile Ile Val Val Ser Pro Gln Arg Gln Thr 1625 1630 1635 Gly Thr Asn Ala Cys Gly Val Asn Asn Gly Gly Cys Thr His Leu 1640 1645 1650 Cys Phe Ala Arg Ala Ser Asp Phe Val Cys Ala Cys Pro Asp Glu 1655 1660 1665 Pro Asp Ser Gln Pro Cys Ser Leu Val Pro Gly Leu Val Pro Pro 1670 1675 1680 Ala Pro Arg Ala Thr Gly Met Ser Glu Lys Ser Pro Val Leu Pro 1685 1690 1695 Asn Thr Pro Pro Thr Thr Leu Tyr Ser Ser Thr Thr Arg Thr Arg 1700 1705 1710 Thr Ser Leu Glu Glu Val Glu Gly Arg Cys Ser Glu Arg Asp Ala 1715 1720 1725 Arg Leu Gly Leu Cys Ala Arg Ser Asn Asp Ala Val Pro Ala Ala 1730 1735 1740 Pro <210> 4 <211> 1998 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Pro Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu Trp Ala Gly Ala Leu Ala 1 5 10 15 Ala Leu Gly Leu Arg Ala Gly Glu Arg Thr Arg Ser Gly Pro Gly Ser 20 25 30 Ser Ser Pro Ser Gly Gly Ile Ser Gly Gly Ala Ser Ala Gly Ser Gly 35 40 45 Leu Gly Arg Gly Ala Gly Leu Gly Arg Gly Ala Gly Leu Ala Ser Ser 50 55 60 Pro Glu Cys Ala Cys Gly Arg Ser His Phe Thr Cys Ala Val Ser Ala 65 70 75 80 Leu Gly Glu Cys Thr Cys Ile Pro Ala Gln Trp Gln Cys Asp Gly Asp 85 90 95 Asn Asp Cys Gly Asp His Ser Asp Glu Asp Gly Cys Ile Leu Pro Thr 100 105 110 Cys Ser Pro Leu Asp Phe His Cys Asp Asn Gly Lys Cys Ile Arg Arg 115 120 125 Ser Trp Val Cys Asp Gly Asp Asn Asp Cys Glu Asp Asp Ser Asp Glu 130 135 140 Gln Asp Cys Pro Pro Arg Glu Cys Glu Glu Asp Glu Phe Pro Cys Gln 145 150 155 160 Asn Gly Tyr Cys Ile Arg Ser Leu Trp His Cys Asp Gly Asp Asn Asp 165 170 175 Cys Gly Asp Asn Ser Asp Glu Gln Cys Asp Met Arg Lys Cys Ser Asp 180 185 190 Lys Glu Phe Arg Cys Ser Asp Gly Ser Cys Ile Ala Glu His Trp Tyr 195 200 205 Cys Asp Gly Asp Thr Asp Cys Lys Asp Gly Ser Asp Glu Glu Asn Cys 210 215 220 Pro Ser Ala Val Pro Ala Pro Pro Cys Asn Leu Glu Glu Phe Gln Cys 225 230 235 240 Ala Tyr Gly Arg Cys Ile Leu Asp Ile Tyr His Cys Asp Gly Asp Asp 245 250 255 Asp Cys Gly Asp Trp Ser Asp Glu Ser Asp Cys Ser Ser His Gln Pro 260 265 270 Cys Arg Ser Gly Glu Phe Met Cys Asp Ser Gly Leu Cys Ile Asn Ala 275 280 285 Gly Trp Arg Cys Asp Gly Asp Ala Asp Cys Asp Asp Gln Ser Asp Glu 290 295 300 Arg Asn Cys Thr Thr Ser Met Cys Thr Ala Glu Gln Phe Arg Cys His 305 310 315 320 Ser Gly Arg Cys Val Arg Leu Ser Trp Arg Cys Asp Gly Glu Asp Asp 325 330 335 Cys Ala Asp Asn Ser Asp Glu Glu Asn Cys Glu Asn Thr Gly Ser Pro 340 345 350 Gln Cys Ala Leu Asp Gln Phe Leu Cys Trp Asn Gly Arg Cys Ile Gly 355 360 365 Gln Arg Lys Leu Cys Asn Gly Val Asn Asp Cys Gly Asp Asn Ser Asp 370 375 380 Glu Ser Pro Gln Gln Asn Cys Arg Pro Arg Thr Gly Glu Glu Asn Cys 385 390 395 400 Asn Val Asn Asn Gly Gly Cys Ala Gln Lys Cys Gln Met Val Arg Gly 405 410 415 Ala Val Gln Cys Thr Cys His Thr Gly Tyr Arg Leu Thr Glu Asp Gly 420 425 430 His Thr Cys Gln Asp Val Asn Glu Cys Ala Glu Glu Gly Tyr Cys Ser 435 440 445 Gln Gly Cys Thr Asn Ser Glu Gly Ala Phe Gln Cys Trp Cys Glu Thr 450 455 460 Gly Tyr Glu Leu Arg Pro Asp Arg Arg Ser Cys Lys Ala Leu Gly Pro 465 470 475 480 Glu Pro Val Leu Leu Phe Ala Asn Arg Ile Asp Ile Arg Gln Val Leu 485 490 495 Pro His Arg Ser Glu Tyr Thr Leu Leu Leu Asn Asn Leu Glu Asn Ala 500 505 510 Ile Ala Leu Asp Phe His His Arg Arg Glu Leu Val Phe Trp Ser Asp 515 520 525 Val Thr Leu Asp Arg Ile Leu Arg Ala Asn Leu Asn Gly Ser Asn Val 530 535 540 Glu Glu Val Val Ser Thr Gly Leu Glu Ser Pro Gly Gly Leu Ala Val 545 550 555 560 Asp Trp Val His Asp Lys Leu Tyr Trp Thr Asp Ser Gly Thr Ser Arg 565 570 575 Ile Glu Val Ala Asn Leu Asp Gly Ala His Arg Lys Val Leu Leu Trp 580 585 590 Gln Asn Leu Glu Lys Pro Arg Ala Ile Ala Leu His Pro Met Glu Gly 595 600 605 Thr Ile Tyr Trp Thr Asp Trp Gly Asn Thr Pro Arg Ile Glu Ala Ser 610 615 620 Ser Met Asp Gly Ser Gly Arg Arg Ile Ile Ala Asp Thr His Leu Phe 625 630 635 640 Trp Pro Asn Gly Leu Thr Ile Asp Tyr Ala Gly Arg Arg Met Tyr Trp 645 650 655 Val Asp Ala Lys His His Val Ile Glu Arg Ala Asn Leu Asp Gly Ser 660 665 670 His Arg Lys Ala Val Ile Ser Gln Gly Leu Pro His Pro Phe Ala Ile 675 680 685 Thr Val Phe Glu Asp Ser Leu Tyr Trp Thr Asp Trp His Thr Lys Ser 690 695 700 Ile Asn Ser Ala Asn Lys Phe Thr Gly Lys Asn Gln Glu Ile Ile Arg 705 710 715 720 Asn Lys Leu His Phe Pro Met Asp Ile His Thr Leu His Pro Gln Arg 725 730 735 Gln Pro Ala Gly Lys Asn Arg Cys Gly Asp Asn Asn Gly Gly Cys Thr 740 745 750 His Leu Cys Leu Pro Ser Gly Gln Asn Tyr Thr Cys Ala Cys Pro Thr 755 760 765 Gly Phe Arg Lys Ile Ser Ser His Ala Cys Ala Gln Ser Leu Asp Lys 770 775 780 Phe Leu Leu Phe Ala Arg Arg Met Asp Ile Arg Arg Ile Ser Phe Asp 785 790 795 800 Thr Glu Asp Leu Ser Asp Asp Val Ile Pro Leu Ala Asp Val Arg Ser 805 810 815 Ala Val Ala Leu Asp Trp Asp Ser Arg Asp Asp His Val Tyr Trp Thr 820 825 830 Asp Val Ser Thr Asp Thr Ile Ser Arg Ala Lys Trp Asp Gly Thr Gly 835 840 845 Gln Glu Val Val Val Asp Thr Ser Leu Glu Ser Pro Ala Gly Leu Ala 850 855 860 Ile Asp Trp Val Thr Asn Lys Leu Tyr Trp Thr Asp Ala Gly Thr Asp 865 870 875 880 Arg Ile Glu Val Ala Asn Thr Asp Gly Ser Met Arg Thr Val Leu Ile 885 890 895 Trp Glu Asn Leu Asp Arg Pro Arg Asp Ile Val Val Glu Pro Met Gly 900 905 910 Gly Tyr Met Tyr Trp Thr Asp Trp Gly Ala Ser Pro Lys Ile Glu Arg 915 920 925 Ala Gly Met Asp Ala Ser Gly Arg Gln Val Ile Ile Ser Ser Asn Leu 930 935 940 Thr Trp Pro Asn Gly Leu Ala Ile Asp Tyr Gly Ser Gln Arg Leu Tyr 945 950 955 960 Trp Ala Asp Ala Gly Met Lys Thr Ile Glu Phe Ala Gly Leu Asp Gly 965 970 975 Ser Lys Arg Lys Val Leu Ile Gly Ser Gln Leu Pro His Pro Phe Gly 980 985 990 Leu Thr Leu Tyr Gly Glu Arg Ile Tyr Trp Thr Asp Trp Gln Thr Lys 995 1000 1005 Ser Ile Gln Ser Ala Asp Arg Leu Thr Gly Leu Asp Arg Glu Thr 1010 1015 1020 Leu Gln Glu Asn Leu Glu Asn Leu Met Asp Ile His Val Phe His 1025 1030 1035 Arg Arg Arg Pro Pro Val Ser Thr Pro Cys Ala Met Glu Asn Gly 1040 1045 1050 Gly Cys Ser His Leu Cys Leu Arg Ser Pro Asn Pro Ser Gly Phe 1055 1060 1065 Ser Cys Thr Cys Pro Thr Gly Ile Asn Leu Leu Ser Asp Gly Lys 1070 1075 1080 Thr Cys Ser Pro Gly Met Asn Ser Phe Leu Ile Phe Ala Arg Arg 1085 1090 1095 Ile Asp Ile Arg Met Val Ser Leu Asp Ile Pro Tyr Phe Ala Asp 1100 1105 1110 Val Val Val Pro Ile Asn Ile Thr Met Lys Asn Thr Ile Ala Val 1115 1120 1125 Gly Val Asp Pro Gln Glu Gly Lys Val Tyr Trp Ser Asp Ser Thr 1130 1135 1140 Leu His Arg Ile Ser Arg Ala Asn Leu Asp Gly Ser Gln His Glu 1145 1150 1155 Asp Ile Ile Thr Thr Gly Leu Gln Thr Thr Asp Gly Leu Ala Val 1160 1165 1170 Asp Ala Ile Gly Arg Lys Val Tyr Trp Thr Asp Thr Gly Thr Asn 1175 1180 1185 Arg Ile Glu Val Gly Asn Leu Asp Gly Ser Met Arg Lys Val Leu 1190 1195 1200 Val Trp Gln Asn Leu Asp Ser Pro Arg Ala Ile Val Leu Tyr His 1205 1210 1215 Glu Met Gly Phe Met Tyr Trp Thr Asp Trp Gly Glu Asn Ala Lys 1220 1225 1230 Leu Glu Arg Ser Gly Met Asp Gly Ser Asp Arg Ala Val Leu Ile 1235 1240 1245 Asn Asn Asn Leu Gly Trp Pro Asn Gly Leu Thr Val Asp Lys Ala 1250 1255 1260 Ser Ser Gln Leu Leu Trp Ala Asp Ala His Thr Glu Arg Ile Glu 1265 1270 1275 Ala Ala Asp Leu Asn Gly Ala Asn Arg His Thr Leu Val Ser Pro 1280 1285 1290 Val Gln His Pro Tyr Gly Leu Thr Leu Leu Asp Ser Tyr Ile Tyr 1295 1300 1305 Trp Thr Asp Trp Gln Thr Arg Ser Ile His Arg Ala Asp Lys Gly 1310 1315 1320 Thr Gly Ser Asn Val Ile Leu Val Arg Ser Asn Leu Pro Gly Leu 1325 1330 1335 Met Asp Met Gln Ala Val Asp Arg Ala Gln Pro Leu Gly Phe Asn 1340 1345 1350 Lys Cys Gly Ser Arg Asn Gly Gly Cys Ser His Leu Cys Leu Pro 1355 1360 1365 Arg Pro Ser Gly Phe Ser Cys Ala Cys Pro Thr Gly Ile Gln Leu 1370 1375 1380 Lys Gly Asp Gly Lys Thr Cys Asp Pro Ser Pro Glu Thr Tyr Leu 1385 1390 1395 Leu Phe Ser Ser Arg Gly Ser Ile Arg Arg Ile Ser Leu Asp Thr 1400 1405 1410 Ser Asp His Thr Asp Val His Val Pro Val Pro Glu Leu Asn Asn 1415 1420 1425 Val Ile Ser Leu Asp Tyr Asp Ser Val Asp Gly Lys Val Tyr Tyr 1430 1435 1440 Thr Asp Val Phe Leu Asp Val Ile Arg Arg Ala Asp Leu Asn Gly 1445 1450 1455 Ser Asn Met Glu Thr Val Ile Gly Arg Gly Leu Lys Thr Thr Asp 1460 1465 1470 Gly Leu Ala Val Asp Trp Val Ala Arg Asn Leu Tyr Trp Thr Asp 1475 1480 1485 Thr Gly Arg Asn Thr Ile Glu Ala Ser Arg Leu Asp Gly Ser Cys 1490 1495 1500 Arg Lys Val Leu Ile Asn Asn Ser Leu Asp Glu Pro Arg Ala Ile 1505 1510 1515 Ala Val Phe Pro Arg Lys Gly Tyr Leu Phe Trp Thr Asp Trp Gly 1520 1525 1530 His Ile Ala Lys Ile Glu Arg Ala Asn Leu Asp Gly Ser Glu Arg 1535 1540 1545 Lys Val Leu Ile Asn Thr Asp Leu Gly Trp Pro Asn Gly Leu Thr 1550 1555 1560 Leu Asp Tyr Asp Thr Arg Arg Ile Tyr Trp Val Asp Ala His Leu 1565 1570 1575 Asp Arg Ile Glu Ser Ala Asp Leu Asn Gly Lys Leu Arg Gln Val 1580 1585 1590 Leu Val Gly His Val Ser His Pro Phe Ala Leu Thr Gln Gln Asp 1595 1600 1605 Arg Trp Ile Tyr Trp Thr Asp Trp Gln Thr Lys Ser Ile Gln Arg 1610 1615 1620 Val Asp Lys Tyr Ser Gly Arg Asn Lys Glu Thr Val Leu Ala Asn 1625 1630 1635 Val Glu Gly Leu Met Asp Ile Ile Val Val Ser Pro Gln Arg Gln 1640 1645 1650 Thr Gly Thr Asn Ala Cys Gly Val Asn Asn Gly Gly Cys Thr His 1655 1660 1665 Leu Cys Phe Ala Arg Ala Ser Asp Phe Val Cys Ala Cys Pro Asp 1670 1675 1680 Glu Pro Asp Ser Gln Pro Cys Ser Leu Val Pro Gly Leu Val Pro 1685 1690 1695 Pro Ala Pro Arg Ala Thr Gly Met Ser Glu Lys Ser Pro Val Leu 1700 1705 1710 Pro Asn Thr Pro Pro Thr Thr Leu Tyr Ser Ser Thr Thr Arg Thr 1715 1720 1725 Arg Thr Ser Leu Glu Glu Val Glu Gly Arg Cys Ser Glu Arg Asp 1730 1735 1740 Ala Arg Leu Gly Leu Cys Ala Arg Ser Asn Asp Ala Val Pro Ala 1745 1750 1755 Ala Pro Leu Glu Val Leu Phe Gln Gly Pro Lys Ser Cys Asp Lys 1760 1765 1770 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 1775 1780 1785 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 1790 1795 1800 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 1805 1810 1815 His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 1820 1825 1830 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn 1835 1840 1845 Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 1850 1855 1860 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 1865 1870 1875 Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 1880 1885 1890 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 1895 1900 1905 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 1910 1915 1920 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro 1925 1930 1935 Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly 1940 1945 1950 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 1955 1960 1965 Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 1970 1975 1980 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 1985 1990 1995

Claims (39)

  1. 베르시칸(Versican) (CSPG2), FREM2, 피브릴린(Fibrillin) 2 (FBN2), C6orf93, 신데칸(Syndecan)-4 (Sdc4), 아그린(Agrin) (AGRN), 세르핀2(Serpine2) (PN-1), LRP2, LRP6, SLIT2, 테나신(tenascin) C, TRIM26, TRIM41, 글리피칸1(glypican1), IL-17 수용체, 알칼리성 포스파타제 (ALPL) 및 LRP4 중 하나인 스클레로스틴-결합-파트너의 조절물질을 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 스클레로스틴에 의해 매개되거나 비정상적인 수준의 스클레로스틴과 관련된 병리학적 장애를 치료하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 조절물질이 상기 스클레로스틴-결합 파트너에 특이적으로 결합하는 작용제인 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 조절물질이 스클레로스틴이 상기 스클레로스틴-결합 파트너에 결합하는 것을 억제하는 작용제인 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 조절물질이 세포-기반 분석법에 의해 측정되는 바와 같이 Wnt 신호전달 경로를 조절하는 작용제인 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 조절물질이 항체, 또는 상기 항 체의 항원-결합 부분을 포함하는 기능성 단백질인 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 병리학적 장애가 골 무기질 밀도가 비정상적인 장애, 예를 들어 골다공증 또는 경화협착증인 방법.
  7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 병리학적 장애가 암, 예를 들어 골용해성 병변이 있는 다발성 골수종인 방법.
  8. a) 스클레로스틴-결합-파트너와 스클레로스틴의 상호작용을 허용하는 조건 하에 테스트 작용제의 존재 및 부재 하에 스클레로스틴을 스클레로스틴-결합-파트너와 접촉시키는 단계; 및
    b) 상기 테스트 작용제의 존재 및 부재 하에서의 스클레로스틴-결합-파트너와 스클레로스틴의 상호작용을 측정하는 단계
    를 포함하며, 이 때 (i) 테스트 작용제의 부재 하에서의 상호작용에 비해 테스트 작용제의 존재 하에서의 스클레로스틴:스클레로스틴-결합-파트너 상호작용이 감소하면, 테스트 작용제가 (1) 결합된 스클레로스틴-결합-파트너가 스클레로스틴 작용을 감소시킬 때는 스클레로스틴:스클레로스틴-결합-파트너 상호작용의 효능제로서 확인되고, (2) 결합된 스클레로스틴-결합-파트너가 스클레로스틴 작용을 증가시킬 때는 스클레로스틴:스클레로스틴-결합-파트너 상호작용의 길항제로서 확인되고, (ii) 테스트 작용제의 부재 하에서의 상호작용에 비해 테스트 작용제의 존재 하에 서의 상호작용이 증가하면, 테스트 작용제가 (1) 결합된 스클레로스틴-결합-파트너가 스클레로스틴 작용을 감소시킬 때는 스클레로스틴:스클레로스틴-결합-파트너 상호작용의 길항제로서 확인되고, (2) 결합된 스클레로스틴-결합-파트너가 스클레로스틴 작용을 증가시킬 때는 스클레로스틴:스클레로스틴-결합-파트너 상호작용의 효능제로서 확인되고,
    스클레로스틴-결합-파트너는 베르시칸 (CSPG2), FREM2, 피브릴린 2 (FBN2), C6orf93, 신데칸-4 (Sdc4), 아그린 (AGRN), 세르핀2 (PN-1), LRP2, LRP6, SLIT2, 테나신 C, TRIM26, TRIM41, 글리피칸1, IL-17 수용체, 알칼리성 포스파타제 (ALPL) 및 LRP4 중 하나인,
    스클레로스틴:스클레로스틴-결합-파트너 상호작용을 조절할 수 있는 작용제를 확인하는 방법.
  9. a) 스클레로스틴-결합-파트너와 스클레로스틴의 상호작용을 허용하는 조건 하에 테스트 작용제의 존재 및 부재 하에 스클레로스틴을 스클레로스틴-결합-파트너와 접촉시키는 단계; 및
    b) 스클레로스틴:스클레로스틴-결합-파트너 상호작용에 의해 유도된 신호전달 응답 또는 효소성 응답을 측정하는 단계
    를 포함하며, 이 때 테스트 작용제의 부재 하에서의 응답과 비교하여 적어도 10％, 20％ 또는 30％의 테스트 작용제의 존재 하에서의 응답의 변화는 테스트 작용제가 스클레로스틴:스클레로스틴-결합-파트너 상호작용을 조절할 수 있는 것으로 확인된 다는 것을 나타내고,
    스클레로스틴-결합-파트너는 베르시칸 (CSPG2), FREM2, 피브릴린 2 (FBN2), C6orf93, 신데칸-4 (Sdc4), 아그린 (AGRN), 세르핀2 (PN-1), LRP2, LRP6, SLIT2, 테나신 C, TRIM26, TRIM41, 글리피칸1, IL-17 수용체, 알칼리성 포스파타제 (ALPL) 및 LRP4 중 하나인,
    스클레로스틴:스클레로스틴-결합-파트너 상호작용을 조절할 수 있는 작용제를 확인하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, wnt 신호전달 활성이 신호전달 응답으로 측정되는 방법.
  11. 항체 또는 상기 항체의 항원-결합 부분을 포함하는 기능성 단백질 또는 siRNA인, 제6항 내지 제10항 중 어느 한 항의 방법에 의해 확인된 스클레로스틴-결합-파트너의 조절물질.
  12. 베르시칸 (CSPG2), FREM2, 피브릴린 2 (FBN2), C6orf93, 신데칸-4 (Sdc4), 아그린 (AGRN), 세르핀2 (PN-1), LRP2, LRP6, SLIT2, 테나신 C, TRIM26, TRIM41, 글리피칸1, IL-17 수용체, 알칼리성 포스파타제 (ALPL) 및 LRP4로 구성된 군으로부터 선택된 스클레로스틴-결합 파트너에 특이적으로 결합하는, 항체 또는 상기 항체의 항원-결합 부분을 포함하는 기능성 단백질.
  13. 제12항에 있어서, 스클레로스틴이 상기 스클레로스틴-결합 파트너에 결합하는 것을 억제하는 항체 또는 기능성 단백질.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서, 상기 항체 또는 기능성 단백질이 세포-기반 분석법에 의해 측정되는 바와 같이 Wnt 신호전달 경로를 조절하는 항체 또는 기능성 단백질.
  15. 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 스클레로스틴-결합 파트너가 LRP4인 항체 또는 기능성 단백질.
  16. (내용없음)
  17. 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 스클레로스틴-결합 파트너가 ALPL인 항체 또는 기능성 단백질.
  18. 제11항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 약물로서 사용하기 위한 조절물질 또는 항체 또는 기능성 단백질.
  19. 제11항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 골 무기질 밀도가 비정상적인 장애의 치료에서 사용하기 위한 조절물질 또는 항체 또는 기능성 단백질.
  20. 제19항에 있어서, 골 무기질 밀도가 비정상적인 장애가 골다공증 또는 경화협착증인 조절물질 또는 항체 또는 기능성 단백질.
  21. 제11항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 암의 치료에서 사용하기 위한 조절물질 또는 항체 또는 기능성 단백질.
  22. 제21항에 있어서, 상기 암이 골수종인 조절물질 또는 항체 또는 기능성 단백질.
  23. 제22항에 있어서, 상기 골수종이 골용해성 병변이 있는 다발성 골수종인 조절물질 또는 항체 또는 기능성 단백질.
  24. 베르시칸 (CSPG2), FREM2, 피브릴린 2 (FBN2), C6orf93, 신데칸-4 (Sdc4), 아그린 (AGRN), 세르핀2 (PN-1), LRP2, LRP6, SLIT2, 테나신 C, TRIM26, TRIM41, 글리피칸1, IL-17 수용체, 알칼리성 포스파타제 (ALPL) 및 LRP4로 구성된 군으로부터 선택된 스클레로스틴-결합-파트너의 포유류 세포에서의 단백질 발현을 감소시킬 수 있는 siRNA.
  25. 제24항에 있어서, 상기 스클레로스틴-결합-파트너가 LRP4인 siRNA.
  26. 제24항 또는 제25항에 있어서, 약물로서 사용하기 위한 siRNA.
  27. 제24항 또는 제25항에 있어서, 골 무기질 밀도가 비정상적인 장애 또는 암의 치료에서 사용하기 위한 siRNA.
  28. a) 대상에서 스클레로스틴:스클레로스틴-결합-파트너 상호작용을 측정하는 단계, 및
    b) 단계 a)의 상호작용을 건강한 개체의 스클레로스틴:스클레로스틴-결합-파트너 상호작용과 비교하며, 이 때 대상과 건강한 개체 간에 관찰된 상호작용에서의 차이는 상기 대상에서의 골 무기질 밀도가 비정상적인 장애 또는 이에 대한 소질을 나타내는 단계
    를 포함하며, 이 때 스클레로스틴-결합-파트너는 베르시칸 (CSPG2), FREM2, 피브릴린 2 (FBN2), C6orf93, 신데칸-4 (Sdc4), 아그린 (AGRN), 세르핀2 (PN-1), LRP2, LRP6, SLIT2, 테나신 C, TRIM26, TRIM41, 글리피칸1, IL-17 수용체, 알칼리성 포스파타제 (ALPL) 및 LRP4 중 하나인,
    대상에서 골 무기질 밀도가 비정상적인 장애 또는 골 무기질 밀도가 비정상적인 장애에 대한 소질을 진단하는 방법.
  29. a) 모방체와 스클레로스틴의 상호작용을 허용하는 조건 하에 스클레로스틴을 후보 모방체와 접촉시키는 단계; 및
    b) 모방체와 스클레로스틴의 상호작용을 측정하는 단계
    를 포함하며, 이 때 본원에 기술된 다양한 스클레로스틴:스클레로스틴-결합-파트너 상호작용에 대해 관찰된 것의 적어도 10％인 상호작용에 의해 후보 모방체가 본 발명의 스클레로스틴-결합-파트너 모방체로 식별되고,
    스클레로스틴-결합-파트너는 베르시칸 (CSPG2), FREM2, 피브릴린 2 (FBN2), C6orf93, 신데칸-4 (Sdc4), 아그린 (AGRN), 세르핀2 (PN-1), LRP2, LRP6, SLIT2, 테나신 C, TRIM26, TRIM41, 글리피칸1, IL-17 수용체, 알칼리성 포스파타제 (ALPL) 및 LRP4 중 하나인,
    스클레로스틴과의 스클레로스틴-결합-파트너 상호작용과 동일하거나, 유사하거나 또는 개선된 기능적 효과를 갖는 스클레로스틴-결합-파트너 모방체를 확인하는 방법.
  30. 제29항에 있어서, 상기 상호작용이 스클레로스틴-모방체 상호작용에 의해 유도된 wnt 신호전달 응답에 의해 측정되는 방법.
  31. 스클레로스틴에 특이적으로 결합하는 스클레로스틴-결합 파트너의 단편을 포함하며, 이 때 스클레로스틴-결합 파트너는 베르시칸 (CSPG2), FREM2, 피브릴린 2 (FBN2), C6orf93, 신데칸-4 (Sdc4), 아그린 (AGRN), 세르핀2 (PN-1), LRP2, LRP6, SLIT2, 테나신 C, TRIM26, TRIM41, 글리피칸1, IL-17 수용체, 알칼리성 포스파타제 (ALPL) 및 LRP4 중 하나인 가용성 폴리펩티드.
  32. 제31항에 있어서, 스클레로스틴-결합 파트너가 스클레로스틴에 결합하는 것을 억제하는 가용성 폴리펩티드.
  33. 제31항 또는 제32항에 있어서, LRP4의 스클레로스틴-결합 단편을 포함하는 가용성 폴리펩티드.
    <청구항 33> (번호 중복됨)
    제32항에 있어서, LRP4의 세포외 부분으로 구성된 LRP4의 단편, 바람직하게는 서열 3으로 구성된 폴리펩티드인 가용성 폴리펩티드.
  34. 제31항 내지 제33항 중 어느 한 항에 따른 가용성 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 골 무기질 밀도가 비정상적인 장애를 치료하는 방법.
  35. 제34항에 있어서, 골 무기질 밀도가 비정상적인 장애가 골다공증인 방법.
  36. 제34항에 있어서, 골 무기질 밀도가 비정상적인 장애가 경화협착증인 방법.
  37. (a) 대상에서 스클레로스틴-결합-파트너 유전자의 뉴클레오티드 서열을 수득 하는 단계, 및
    (b) 이를 건강한 대상의 것과 비교하며, 이 때 각각의 스클레로스틴-결합-파트너 유전자에서의 돌연변이는 스클레로스틴-관련 장애 또는 이에 대한 소질을 나타내고, 스클레로스틴-결합-파트너는 베르시칸 (CSPG2), FREM2, 피브릴린 2 (FBN2), C6orf93, 신데칸-4 (Sdc4), 아그린 (AGRN), 세르핀2 (PN-1), LRP2, LRP6, SLIT2, 테나신 C, TRIM26, TRIM41, 글리피칸1, IL-17 수용체, 알칼리성 포스파타제 (ALPL) 및 LRP4 중 하나인 단계
    를 포함하는, 대상에서 비정상적인 골 무기질 밀도 또는 스클레로스틴-관련 장애에 대한 소질을 진단하는 방법.
  38. a) 대상에서 스클레로스틴:스클레로스틴-결합-파트너 상호작용을 측정하는 단계, 및
    b) 단계 a)의 상호작용을 건강한 개체의 스클레로스틴:스클레로스틴-결합-파트너 상호작용과 비교하며, 이 때 대상과 건강한 개체 간에 관찰된 상호작용에서의 차이는 상기 대상에서의 스클레로스틴-관련 장애 또는 이에 대한 소질을 나타내고, 스클레로스틴-결합-파트너는 베르시칸 (CSPG2), FREM2, 피브릴린 2 (FBN2), C6orf93, 신데칸-4 (Sdc4), 아그린 (AGRN), 세르핀2 (PN-1), LRP2, LRP6, SLIT2, 테나신 C, TRIM26, TRIM41, 글리피칸1, IL-17 수용체, 알칼리성 포스파타제 (ALPL) 및 LRP4 중 하나인 단계
    를 포함하는, 대상에서 스클레로스틴-관련 장애 또는 스클레로스틴-관련 장애에 대 한 소질을 진단하는 방법.
  39. a) 대상에서 스클레로스틴-결합-파트너 유전자의 뉴클레오티드 서열을 수득하며, 이 때 스클레로스틴-결합-파트너는 베르시칸 (CSPG2), FREM2, 피브릴린 2 (FBN2), C6orf93, 신데칸-4 (Sdc4), 아그린 (AGRN), 세르핀2 (PN-1), LRP2, LRP6, SLIT2, 테나신 C, TRIM26, TRIM41, 글리피칸1, IL-17 수용체, 알칼리성 포스파타제 (ALPL) 및 LRP4 중 하나인 단계, 및
    (b) 이를 건강한 대상의 것과 비교하며, 이 때 각각의 스클레로스틴-결합-파트너 유전자에서의 돌연변이는 스클레로스틴-관련 장애 또는 이에 대한 소질을 나타내는 단계
    를 포함하는, 대상에서 스클레로스틴-관련 장애 또는 스클레로스틴-관련 장애에 대한 소질을 진단하는 방법.
KR1020097016132A 2007-02-02 2008-01-30 골-관련 장애를 치료하기 위한 스클레로스틴 결합 파트너의 조절물질 KR20090115133A (ko)

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