CN117169521A

CN117169521A - 一种种植体周围炎质谱负离子模式代谢组学生物标志物及其应用

Info

Publication number: CN117169521A
Application number: CN202311077435.1A
Authority: CN
Inventors: 占小珍; 黄瑞; 桂涛; 陈旭锋; 李国江
Original assignee: First Affiliated Hospital of Jinan University
Current assignee: First Affiliated Hospital of Jinan University
Priority date: 2023-08-25
Filing date: 2023-08-25
Publication date: 2023-12-05

Abstract

本发明提供了一种种植体周围炎质谱负离子模式代谢组学生物标志物及其应用，所述代谢组学生物标志物选自下述物质中的一种或多种：乙基8‑氯‑6‑(三氟甲基)咪唑并[1,2‑a]吡啶‑2‑羧酸酯、苯丙酸、反油酸、花生酸、肾上腺酸、芥酸。本发明通过进行种植体周围炎质谱负离子模式代谢组学的研究，最终筛选出种植体周围炎中表达水平具有显著差异的代谢产物作为生物标志物，开拓性地提供所述代谢组学生物标志物在种植体周围炎诊断方面的应用，为研究治疗种植体周围炎的药物提供新靶点，本发明具有着重要的临床、科研及药物转化价值。

Description

一种种植体周围炎质谱负离子模式代谢组学生物标志物及其应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及一种种植体周围炎质谱负离子模式代谢组学生物标志物及其应用。

背景技术

慢性牙周炎是一种最常见的口腔感染性疾病，在牙周炎期间，免疫细胞积聚在牙周病变处诱发局部炎症和牙槽骨的破坏，最终导致牙齿脱落[1]。慢性牙周炎已然成为成年人牙齿脱落的主要原因。目前，因种植义齿可以较好恢复牙齿外形色泽、重建患者原有的咬合关系、使用舒适度高、不对邻牙造成损伤等优势，成为慢性牙周炎患者牙齿缺失的重要修复方法之一。随着种植技术的不断发展以及越来越多的患者接受种植牙的治疗方式，种植成功率明显提高，但与种植体相关的一些疾病发生率也逐年升高。一项追踪种植体修复完成10年后的流行病学研究显示种植体周围炎和种植体周围黏膜炎平均患病率为22％和43％[2]。有研究表明，在接受种植手术治疗的患者中，长期患有牙周炎病史的患者比牙周健康的患者有更高几率发生种植体周围炎，牙周炎的进展、严重程度与种植体周围疾病发生的概率、种植体周围疾病的发展进程息息相关[3-5]。

种植体周围炎(peri-implantitis，PI)是一种发生于种植体周围组织中的以种植体表面生物膜沉积为特征的炎症性疾病，主要表现为种植体周软组织炎症和种植体周骨组织的进行性丧失[5]。而种植体周围粘膜炎(peri-implantmucositis，PIM)主要表现为种植体周软组织的炎性病变，无骨组织丧失，是由种植体粘膜界面的宿主微生物平衡被破坏而发生的一种可逆性疾病[6]。种植体周围病大多在种植体使用数年后出现。目前，用于种植体周围病诊断的传统临床方法如种植体周软组织探查、影像学检查等都有其局限性，这些指标异常只发生在组织破坏已经发生时，而无法判断当前种植体是否有发展为种植体周围病或经治疗后复发的风险[7]。因此，对种植体周围病的早期诊断仍然具有挑战性。截至目前，还没有预测种植体周围病进程的模型，而早期诊断对实现良好的预后非常重要。

目前种植体周围炎、慢性牙周炎两种疾病在微生物方面具有相似的表现，它们的始动因子均不约而同地指向菌斑微生物。与牙周炎相似，种植体周组织炎症的主要病因源于由多种微生物组成并定植在种植体表面的生物膜。但最近的一项研究表明，与牙周炎部位相比，在种植体周围炎的样本中检测出更高含量的连翘菌、核梭形杆菌、坏死梭杆菌和直肠弯曲菌。此外，种植体周围炎的微生物群具有高度多样性，包括革兰氏阳性需氧菌、革兰氏阴性厌氧菌和梭形病原体[8]。

龈沟液(gingival crevicular fluid，GCF)是存在于龈沟中的生物渗出液，主要来源于血清，包含各种宿主和细菌产生的产物以及生物标志物。在正常情况下，龈沟中含有少量的GCF，然而在炎症期间GCF从由生物标志物组成的炎性结缔组织内的微毛细血管中渗出，包括炎症介质、细胞因子、酶、有机离子、组织分解产物和蛋白质在内的多种物质存于其中，这些生物标志物可以成为检测疾病过程中微小变化的可靠工具[9]。除了龈沟液外，目前没有发现任何其他的标本同时具备自然收集、价格低廉、生物相容性好且无术后并发症等优点[9]。

代谢组学是继基因组学、蛋白质组学等之后发展起来的一门新兴组学技术，它是指在特定时间和环境条件下对生物体、组织或细胞内的低分子量分子(通常<1500Da)进行定性、定量和动态研究[10]。代谢组分析就是通过定性和定量分析筛选出在不同组间具有重要生物学意义的显著差异性代谢物，并阐明生物体的代谢过程和生理病理变化机制。代谢组学主要分为靶向和非靶向两种研究方法。与传统的免疫测定方法相比，代谢组学技术检测相关指标时更灵敏、更简便[11]，近年来已经成为分析许多患者体液代谢物的首选技术。该技术目前在口腔疾病的诊断与预测领域广泛应用。

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发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提出一种种植体周围炎质谱负离子模式代谢组学生物标志物及其应用，可以用于为接受种植手术的慢性牙周炎患者早期诊断、早期治疗种植体周围炎及判断预后等。

本发明的目的之一在于，种植体周围炎质谱负离子模式代谢组学生物标志物，所述代谢组学生物标志物选自下述物质中的一种或多种：乙基8-氯-6-(三氟甲基)咪唑并[1,2-a]吡啶-2-羧酸酯、苯丙酸、反油酸、花生酸、肾上腺酸、芥酸。

进一步的，所述代谢组学生物标志物选自反油酸、花生酸、肾上腺酸、芥酸中的一种或多种。

本发明的另一个目的在于，质谱负离子模式代谢组学生物标志物在制备诊断种植体周围炎产品中的应用，所述代谢组学生物标志物选自下述物质中的一种或多种：乙基8-氯-6-(三氟甲基)咪唑并[1,2-a]吡啶-2-羧酸酯、苯丙酸、反油酸、花生酸、肾上腺酸、芥酸。

进一步的，所述产品为检测试剂、试剂盒、微阵列或生物芯片。

进一步的，所述代谢组学生物标志物用于通过代谢组学的分析手段对样品进行检测，所述样品来自龈沟液。

本发明的另一个目的在于，质谱负离子模式代谢组学生物标志物在制备种植体周围炎的药物中的应用，所述药物靶向所述代谢组学生物标志物，所述代谢组学生物标志物选自下述物质中的一种或多种：乙基8-氯-6-(三氟甲基)咪唑并[1,2-a]吡啶-2-羧酸酯、苯丙酸、反油酸、花生酸、肾上腺酸、芥酸。

本发明通过进行种植体周围炎质谱负离子模式代谢组学的研究，最终筛选出种植体周围炎中表达水平具有显著差异的代谢产物作为生物标志物，开拓性地提供所述代谢组学生物标志物在种植体周围炎诊断方面的应用，为研究治疗种植体周围炎的药物提供新靶点，本发明具有重要的临床、科研及药物转化价值。

附图说明

图1为本发明实施例1中所有样本和质控样本PCA图(CP牙周炎组，PI种植体周围炎组，QC质控样本)；

图2为本发明实施例1龈沟液样本的总离子流色谱图(A牙周炎组，B种植体周围炎组)；

图3为本发明实施例1负离子模式下样本PCA分析图；

图4为本发明实施例1负离子模式下样本PLS-DA分析得分图；

图5为本发明实施例1负离子模式下样本OPLS-DA分析得分图；

图6为本发明实施例1负离子模式下样本OPLS-DA置换检验图；

图7为本发明实施例1负离子模式下样本OPLS-DA模型载荷图；

图8为本发明实施例1负离子模式下差异代谢物数量图；

图9为本发明实施例1负离子模式下差异代谢物火山图；

图10为本发明实施例1负离子模式下VIP值分析图；

图11为本发明实施例1负离子模式下CP组与PI组差异代谢物相关性热图及聚类热图；

图12为本发明实施例1负离子模式下差异代谢物Z-score分析图；

图13为本发明实施例1负离子模式下差异代谢物ROC曲线图；

图14为本发明实施例1代谢产物KEGG统计图；

图15为本发明实施例1KEGG富集气泡图；

图16为本发明实施例1KEGG富集圈图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明设计、阳性样本验证和结果分析。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

1实验材料与仪器

1.1实验材料

0.02taper30#牙科吸潮纸尖(河南丁尔医疗器械贸易有限公司，中国1.5ml进口冻存管(19335-4SPRCrystalgen公司，美国)；牙周探针、刻度尺(成都骅光医疗器械有限公司，中国)；树脂探针(唐山恒新医疗器材有限公司，中国)。

1.2主要实验试剂

甲醇(LC-MS级，67-56-1，Thermo Fisher公司，美国)；水(LC-MS级，7732-18-5，Merck公司，德国)；甲酸(LC-MS级，64-18-6，Thermo Fisher公司，美国)；醋酸铵(LC-MS级，631-61-8，Thermo Fisher公司，美国)。

1.3主要实验仪器

液氮罐(YDS-80，海尔集团，中国)；-80℃超低温冰箱(海尔集团，中国)；质谱仪(QExactive^TMHF-X，Thermo Fisher公司，美国)；色谱仪(Vanquish UHPLC，Thermo Fisher公司，美国)；色谱柱(Hypesil Gold column，100×2.1mm，1.9μ，Thermo Fisher公司，美国)；低温离心机(D3024R，Scilogex公司，美国)。

1.4实验材料的准备

先将准备放置0.02taper30#牙科吸潮纸尖的冻存管高温高压消毒每个冻存管内预先装入10-15根吸潮纸尖以便后期采样用。随后将装有吸潮指尖的冻存管经紫外线照射0.5h后包装以待后期使用。牙周探针、树脂探针等实验器材分别经高温高压消毒后包装。

2实验方法

2.1样本来源

选取2021年06月至2022年01月在暨南大学附属第一医院口腔科进行牙种植手术并且已经完成种植冠修复至少六个月的伴有慢性牙周炎的种植体周围炎患者病例。对照组来自伴有慢性牙周炎的种植体病例口内的余留天然牙，选择顺序依次是发生种植体周围炎种植体的对侧同名牙、对颌同名牙，以上条件均不满足时则选取不相邻天然牙。本次实验共收集样本14例，其中牙周炎组(CP组)7例，种植体周围炎组(PI组)7例。龈沟液样本基本信息见表1。在实验开始前，需告知患者本次实验所有相关内容及实验相关风险，在患者自愿签署实验知情同意书(见附页)的条件下才可进行样本收集工作。本实验经暨南大学附属第一医院伦理委员会专家上会讨论审查并批准。(伦理批件号KY-2021-098)

表1龈沟液样本基本信息

2.1.1纳入标准

①患者确诊患有慢性牙周炎，处于牙周炎活动期，且无系统性疾病，平日健康状况良好；②种植过程中，在一期手术后3个月行二期手术；③距离种植体上部牙冠修复完成行使功能至少6个月，期间口内至少1颗种植牙确诊为种植体周围炎；④患者咬合关系较好，种植义齿无咬合创伤；⑤年龄范围在20-70岁，男女不限。

2.1.2排除标准

①有全身系统性疾病者，如糖尿病、血液性疾病、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎等免疫性疾病患者；②收集样本时处于妊娠期、月经期及哺乳期的妇女；③3个月内服用抗生素、类固醇激素、治疗免疫性疾病药物以及各类用以预防口腔疾病的漱口水患者；④3个月内接受过牙周或种植牙周治疗者；⑤依从性差的患者。

2.1.3实验分组

CP组(慢性牙周炎组)：牙龈出血不同程度的炎症改变，探诊深度大于3mm附着丧失，可有探诊出血或自发性出血，X线片示牙槽骨出血不同程度的吸收

PI组(种植体周围炎组)：种植体周围软组织不同程度的炎症改变，可有脓液从龈沟溢出探诊可有出血，探诊深度≥3mm，种植体可松动X线片示种植体周围存在骨性吸收，骨吸收水平≥3mm。

2.2临床采集方法

为避免临床检查时唾液、龈沟内渗出血液等对龈沟液的采集造成污染，在无菌操作下，将事先消毒的0.02taper30#牙科吸潮纸尖轻轻插入受试牙位的牙周袋内，直至遇到轻微阻力时停止，并保持60s。取样部位为受试牙龈沟内唇(颊)近中、唇(颊)远中、舌(腭)近中、舌(腭)远中4个位点。直至龈沟液浸湿吸潮纸尖3/4以上取出，置入1.5ml冻存管中，若吸潮纸尖带血，则弃之。使用上述方法采集龈沟液，保证每个受试牙至少获取6-8根沾有龈沟液的吸潮纸尖，随后转移至液氮罐中固定5min使龈沟液内的代谢停止。再集中转移至-80℃冰箱保存，待检测时取出。所有操作在1小时内完成。

2.3LC-MS分析

2.3.1样本处理

将装有龈沟液吸潮纸尖的冻存管从-80℃冰箱取出，冰上解冻后，取100μL样本置于EP管中，加入400μL的80％甲醇水溶液；随即漩涡震荡，冰浴静置5分钟，15000g、4℃离心20分钟；取一定量的上清液加质谱级水稀释至甲醇含量为53％；15000g、4℃条件下再次离心20分钟，收集上清液，以用于LC-MS分析。

2.3.2制备质控样本

从每个实验样本中取等体积20μL样本混匀作为质控样本，用于校正混合样本分析结果的偏差，以及分析仪器自身原因所造成的失误。在进行检测时，采用负离子模式(Negative ion mode,NEG)的电离方式进行检测。

2.3.3色谱条件

本次实验使用C18色谱保护柱，柱温箱温度设置为40℃，流动相的流速设置为0.2mL/min。负离子模式：流动相A选择5mM醋酸铵，pH9.0；流动相B选择甲醇。色谱梯度洗脱程序见表5。

表5色谱梯度洗脱程序

2.3.4质谱条件

扫描范围选择质子数/电荷数的比值100-1500；电喷雾离子源的各参数设置如下：电喷雾电压为3.2kV，鞘层气体流速为40arb，辅助气的流速10arb，离子导管的温度为320℃，极性设置为负离子模式，MS/MS二级扫描为数据依赖性扫描模式。

2.3.5代谢物鉴定

将下机数据文件导入CD搜库软件中，通过保留时间、质荷比等参数进行筛选在设置保留时间偏差0.2min，质量偏差5ppm条件下对慢性牙周炎组、种植体周围炎组龈沟液样品进行峰对齐。随后根据设置的质量偏差5ppm、信号强度偏差30％、信噪比3、最小信号强度100000、加和离子等信息进行峰提取，同时对峰面积进行定量，再整合目标离子，然后通过分子离子峰和碎片离子进行分子式的预测并与mzCloud、mzVault和Masslist数据库进行比对，用blank样本去除背景离子，并对定量结果进行归一化，最后得到数据的鉴定和定量结果。

2.4统计学方法

临床检测指标资料应用SPSS27.0统计软件进行两独立样本t检验分析比较，以P<0.05为差异有统计学意义。计量资料进行正态性及方差齐性检验，符合正态分布的以均数±标准差描述。

本次代谢组学检测数据采用聚类分析、多元统计分析，其中多元统计分析包括无监督的多维统计分析方法主成分分析(PCA)、有监督的偏最小二乘法判别分析(PLS-DA)和正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)。PCA主要用于观察所有样本之间的总体分布趋势，找出可能存在的离散点。而PLS-DA、OPLS-DA两种分析方法能够满足从组间、组内分析寻找差异性代谢产物的要求，在提高模型可信度的同时最大程度发现组间差异。VIP(Variableimportant in projection)是(O)PLS-DA模型变量的变量权重值，可用于衡量各代谢物积累差异对各组样本分类判别的影响强度和解释能力通常当某个变量的VIP＞1时，将此作为潜在生物标记物的筛选条件之一。

3结果

3.1代谢物定性定量分析

本次实验在负离子模式下鉴定，首先确认代谢物精确分子量，后根据所得碎片信息进行数据库搜索以获得代谢物的准确信息。此次实验负离子模式下检测到817种代谢产物所有的代谢产物均可鉴定定性。

3.1.1质量控制分析

在进行基于质谱技术的代谢组学研究时，为了获得可靠且高质量的代谢组学数据，通常在检测时利用QC样本进行质控。在实际操作过程中会产生系统误差，从而导致各QC样本间出现差异。而样本间差异越小表明数据质量越好，体现在质量控制PCA分析图上则表现出QC样本密集分布在一起。图1为所有样本和质控样本在负离子模式下的PCA图，可以从图中得知本次实验QC样本分布高度聚集，表明此次实验结果具有较高的准确性。

3.1.2CP组与PI组龈沟液总离子流色谱图

为了对实验进行质量控制，QC样本用于平衡色谱质谱系统和监测仪器状态，在整个实验过程中对系统稳定性进行评价(实验前、检测过程中、实验后都可检测QC样本)。同时设置blank样本，主要用于去除背景离子。总离子流图是对样本整体信息的反映，是一个样本所有代谢物出的负离子峰图。在总离子流色谱图中，横坐标为出峰时间；纵坐标为峰响应值。

总离子流色谱图可以用来比较组内样本的重复性。根据图2可以看出，在负离子模式下检测发现牙周炎组与种植体周围炎组的出峰时间、出峰时间对应的峰响应值均有明显差异，这可能与取样时所获得的龈沟液量及两组龈沟液代谢产物的成分有关。负离子模式下，两组间整体峰形仍然基本保持一致，在0-2min、10-12min、14-16min时，种植体周围炎组离子强度高于牙周炎组，在13min左右牙周炎组离子强度稍高于种植体周围炎组。

图谱结果表明：与牙周炎组相比较，种植体周围炎组的代谢产物有部分改变。在负离子模式下，谱图的差异主要出现在10-16min。然而，仅通过直接观察总离子色谱图并不能获得特定的代谢物数据。因此，需要对数据进行多元统计相关分析，以筛选出准确的具有标志性的差异代谢产物。

3.2多元统计分析

3.2.1主成分分析(PCA)

本次实验将原始数据压缩成2个主成分来描述原始数据集的特征，PC1表示能描述多维数据矩阵中最明显的特征，括号中的百分比则表示第一主成分对样品差异的贡献值；PC2表示除PC1之外的所能描述数据矩阵中最显著的特征，括号中的百分比表示第二主成分对样品差异的贡献值。在负离子模式下，观察各组样本的总体代谢情况，并发现离群样本。图3中蓝色代表种植体周围炎组，红色代表牙周炎组，同一组样本距离越近，说明样本重复性越好。从图3可以看出，种植体周围炎组和牙周炎组的代谢产物情况在负离子模式下均不能通过主成分分析得到明显区分，种植体周围炎组和牙周炎组部分样本甚至在主成分分析中出现重叠现象。因此，可以认为种植体周围炎组与牙周炎组样品差异性在主成分分析建立的模型中不能很好的区分开来，需要进一步采用分离效果更佳的偏最小二乘法判别分析和正交偏最小二乘判别分析等两种分析方法进行分析。

3.2.2偏最小二乘法判别分析(PLS-DA)

与PCA分析类似，有监督模式识别的PLS-DA分析方法可以使组间区分最大化，有利于寻找差异代谢物。目前已知R²X、R²Y和Q²是用于评价构建的PLS-DA模型结果是否稳定可靠的三个参数，正常情况下它们越接近于1表示模型可信度越高。其中对构建的PLS-DA模型中X和Y矩阵的解释率分别用R²X和R²Y来表示，而Q²表示模型的预测能力。

Q²＞0.5时表示模型预测能力较好，Q²＞0.9时为出色的模型。本次实验中，负离子模式下得到的模型参数如下：R²X＝0.56，R²Y＝0.89，Q²＝0.801。根据模型参数表明此次实验构建模型的预测能力具有较高的可信度。如图4所示，在负离子模式下，种植体周围炎组与牙周炎组两个集合均可明显区分开来，充分表明两组代谢产物之间存在明显差异。

3.2.3正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)

相对于PLS-DA模型，OPLS-DA在保证模型预测能力不下降的基础上，使模型变得更加简便，同时使模型对实验结果的解释能力显著提升，从而可以满足最大程度查看组间差异的要求。与PLS-DA模型相同，通过OPLS-DA构建的模型同样可以用R²X、R²Y、Q²等参数来评价。在本次实验中，VIP值用于衡量各代谢产物积累差异对慢性牙周炎及种植体周围炎两组样本分类判别的影响强度和解释能力。通常当某个变量的VIP＞1时，将此作为潜在生物标记物的筛选条件之一。本次实验中，负离子模式下得到的模型参数如下：R²X＝0.478，R²Y＝0.967，Q²＝0.789。根据模型参数表明此次实验构建模型的稳定性及预测能力都比较可靠。如图5所示，在负离子模式下，种植体周围炎组与牙周炎组两个集合均可明显区分开来，充分表明两组代谢产物之间存在明显差异。

同时，为了验证OPLS-DA模型的可靠性，进一步对模型进行了置换检验。置换检验是在我们得到的模型基础上，将所得数据随机排序后再次进行检验的方法。如图6所示，最右边两个点(x＝1.0)为原始模型的R2和Q2，左边的所有点是Y置换后模型的R2’和Q2’，所有蓝色的Q2点的回归线在纵坐标的交叉点小于0(负离子模式下Q2纵坐标为-0.28)，说明模型预测结果可靠。

为了进一步找出对比较组间代谢物模式变化贡献最大的代谢物，我们构建了OPLS-DA模型载荷图(如图7所示)。在横坐标方向上离原点越远的变量对区分两组样本的作用越大。除此之外，载荷图某个位置上的变量往往对得分图上相同位置的样本有重要贡献在不同的象限区域中发现了贡献程度最大的2-3种代谢产物，很有可能是具有代表性的差异代谢产物。

3.3差异代谢物的鉴定及分析

3.3.1差异代谢物的鉴定

我们根据准确的相对分子质量，保留时间，离子模式和二级质谱信息，搜索在线数据库Metlinlibrary和人类代谢物数据库进行精确分子量的比对，随后结合多元统计分析OPLS-DA的VIP值(VIP＞1)和单变量统计分析T检验P值(P<0.05)来筛选不同比较组间的差异代谢物。最终在负离子模式下筛选出牙周炎组与种植体周围炎组共15种具有显著差异性的代谢产物。与牙周炎组相比，在种植体周围炎组中呈上调趋势的差异代谢产物有乙基8-氯-6-(三氟甲基)咪唑并[1,2-a]吡啶-2-羧酸酯、苯丙酸；呈下调趋势的差异代谢产物有反油酸、花生酸、肾上腺酸、芥酸。

用柱状图对两组具有统计学意义的差异代谢物进行数量统计，红色代表种植体周围炎组较牙周炎组相比显著上调的差异代谢产物数量，蓝色代表种植体周围炎组较牙周炎组相比显著下调的差异代谢产物数量，结果如图8所示。

3.3.2差异代谢物火山图分析

为了进一步了解差异代谢物丰度上下调地变化，对牙周炎组、种植体周围炎组差异代谢物丰度进行差异倍数的计算，并根据VIP值、P值筛绘制差异代谢物火山图如图9所示。横坐标为代谢物丰度在两组中的差异倍数取log2后的值，纵坐标为T检验之后的P值取-log10，垂直于y轴的虚线为差异代谢物筛选的P值阈值，即P<0.05。红色的点代表VIP＞1且P<0.05，发生上调的差异代谢物；蓝色的点代表VIP＞1且P<0.05，发生下调的差异代谢物。点越大代表代谢物VIP值越大。

3.3.3差异代谢物VIP值分析

通过对差异代谢物的VIP值进行分析，可以显示出各种差异代谢产物的重要程度以及它们在样本区分中的贡献大小。图10所示为PI组、CP组中具有统计意义的差异代谢物所对应的VIP结果。图中横坐标为VIP值，纵坐标为差异代谢物，对两组中各样本代谢物丰度取均值，再对每组做z-score分析，用右侧的颜色表示此代谢物在不同组中丰度的高低，红色标色上调，绿色表示下调。在图10中横坐标上VIP值从左至右依次增大，每个差异代谢产物所对应的VIP值越靠近右侧说明它们在慢性牙周炎和种植体周围炎两组的鉴别区分中作用越大。通过分析可以发现，反油酸是负离子模式下最具差异性的代谢产物。

3.3.4差异代谢物相关性热图分析

差异代谢物关联分析的目的是通过计算所有差异代谢物两两之间的皮尔森相关系数研究差异代谢物两两之间的变化趋势。当两种代谢物的线性关系增强时，相关系数趋于1或-1，数值越趋近于1时表示这两种代谢产物正相关程度越强，数值越趋近于-1时表示这两种代谢产物负相关程度越强。图11为在负离子模式下牙周炎组与种植体周围炎组差异代谢物相关性热图分析结果及聚类热图。在相关性热图中，纵坐标、三角斜边均代表差异代谢产物，三角形中每一小方格代表两组代谢产物之间的相关性，颜色越红表示两种代谢产物之间负相关程度越强，颜色越蓝表示两种代谢产物之间正相关程度越强。

3.3.5差异代谢物Z-score图分析

本次实验中，Z-score图是基于慢性牙周炎组代谢产物的相对含量转换而来，通过Z-score图可以衡量同一水平上代谢物相对含量的高低，以此直观发现具有差异性的代谢产物在不同组别中丰度变化的情况。如图12所示，红色圆圈代表CP组，蓝色圆圈代表PI组，若蓝色圆圈处于红色圆圈左边即表示此行对应的代谢产物相较于CP组，在PI组中处于下调趋势；若蓝色圆圈处于红色圆圈右边即表示此行对应的代谢产物相较于CP组，在PI组中处于上调趋势。

3.3.6差异代谢物ROC分析

需要通过ROC分析来评判代谢产物是否可以作为具有显著诊断意义的生物标志物。ROC分析共有真阳性(TP)、假阳性(FP)、真阴性(TN)、假阴性(FN)四种结果。将不同阈值下的灵敏度、特异度根据相应的公式计算并统计出，随后以特异度为横坐标，以灵敏度为纵坐标，逐一绘制出ROC曲线图，计算点连线后的面积，即AUC值，根据AUC值判断代谢物的组间指示能力，即该代谢产物作为潜在的生物标志物的可靠性。当AUC值在0.5～0.7范围内时，说明将此代谢产物作为潜在生物标志物的准确性较低；当AUC值在0.7～0.9范围内时，说明有一定的代表性和特异性；当AUC值在0.9以上时表示该代谢产物具有较高的代表性和特异性，可以考虑作为潜在的生物标志物应用于临床。本次实验中，如图13所示，在负离子模式下筛选出的6种代谢产物作为具有诊断价值的生物标志物时均具有较高的准确性。由于6种代谢产物均具有较高的准确性，AUC值均为1，导致每种代谢产物自身曲线重叠，故ROC曲线图上表现为只有1条曲线。

3.4代谢产物代谢通路分析

3.4.1代谢产物KEGG通路分析

KEGG(Kyoto Encyclopedia ofGenes and Genomes)是一个涵盖各个生物组在基因组、化学和系统功能信息方面大量生物通路注释信息的集合，包括碳水化合物、核苷、氨基酸等代谢及有机物的生物降解途径、信号转导过程等都可以通过KEGG通路分析加以了解。通过KEGG通路分析可以了解到在此次代谢组学分析中得到的差异代谢物在哪些环节中产生影响。图14是对本实施例所得代谢产物进行KEGG通路分析后得出的统计图，横坐标表示注释到每一种代谢通路中所包含的代谢产物数量，纵坐标每一行即表示一种代谢通路，不同颜色代表了不同的KEGG种类其中大多数与氨基酸代谢、脂质代谢、消化系统等通路密切相关。

3.4.2代谢产物KEGG通路富集分析

对慢性牙周炎、种植体周围炎两组差异代谢物进行初步筛选后，进一步采用超几何检验来确定参与上述两组疾病发生发展的差异代谢物中最显著的生化代谢途径和信号转导途径，结果如图15、图16所示。图15为KEGG富集泡图，在图中展示出本实施例分析得出富集程度排名前20的KEGG通路名称。纵坐标代表通路名称，包括不饱和脂肪酸的生物合成、苯丙氨酸代谢、芳香族化合物降解等；横坐标表示该通路中差异代谢产物的数量占该通路中所有代谢产物的比例，即富集因子值。圆圈越大表示数量越多反之；而圆圈颜色越红表示该通路富集程度越高，本实施例中可以观察到富集程度最高的KEGG通路是不饱和脂肪酸的生物合成。图16为KEGG富集圈图。最外层一圈表示经统计分析得出本次实验富集程度排名前20的KEGG通路代码圈外为差异代谢物数目的坐标尺第二圈表示该通路中富集的代谢产物数目以及该通路的富集程度代谢产物的数目越多，与之相对应的图形越长，而该通路的富集程度越高，与之相对应的图形颜色则越红；第三圈表示上、下调差异代谢物比例条形图，紫色代表上调差异代谢物比例，蓝色代表下调差异代谢物比例；第四圈表示各通路中的富集因子值背景网格线，每一格代表0.1。

经过分析可以发现，慢性牙周炎组与种植体周围炎组相比较，其差异代谢产物参与通路主要包括不饱和脂肪酸的生物合成、苯丙氨酸代谢、芳香族化合物的降解、色氨酸代谢、不同环境中的微生物代谢等代谢途径。其中不饱和脂肪酸的生物合成代谢通路的富集程度最显著P-value＝0.000242Q-value＝0.001453)。参与不饱和脂肪酸的生物合成代谢通路的代谢产物包括花生酸、肾上腺酸、芥酸。

综上所述，乙基8-氯-6-(三氟甲基)咪唑并[1,2-a]吡啶-2-羧酸酯、苯丙酸、反油酸、花生酸、肾上腺酸、芥酸等代谢产物，尤其是反油酸、花生酸、肾上腺酸、芥酸，具有诊断意义的生物标志物，可以为接受种植手术的慢性牙周炎患者早期诊断、早期治疗种植体周围炎及判断预后提供参考。

以上对本发明优选的具体实施方式和实施例作了详细说明，但是本发明并不限于上述实施方式和实施例，在本领域技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明构思的前提下作出各种变化。

Claims

1.一种种植体周围炎质谱负离子模式代谢组学生物标志物，其特征在于：所述代谢组学生物标志物选自下述物质中的一种或多种：乙基8-氯-6-(三氟甲基)咪唑并[1,2-a]吡啶-2-羧酸酯、苯丙酸、反油酸、花生酸、肾上腺酸、芥酸。

2.如权利要求1所述的种植体周围炎质谱负离子模式代谢组学生物标志物，其特征在于：所述代谢组学生物标志物选自反油酸、花生酸、肾上腺酸、芥酸中的一种或多种。

3.质谱负离子模式代谢组学生物标志物在制备诊断种植体周围炎产品中的应用，其特征在于：所述代谢组学生物标志物选自下述物质中的一种或多种：乙基8-氯-6-(三氟甲基)咪唑并[1,2-a]吡啶-2-羧酸酯、苯丙酸、反油酸、花生酸、肾上腺酸、芥酸。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述代谢组学生物标志物选自反油酸、花生酸、肾上腺酸、芥酸中的一种或多种。

5.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述产品为检测试剂、试剂盒、微阵列或生物芯片。

6.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述代谢组学生物标志物用于通过代谢组学的分析手段对样品进行检测，所述样品来自龈沟液。

7.质谱负离子模式代谢组学生物标志物在制备种植体周围炎的药物中的应用，其特征在于：所述药物靶向所述代谢组学生物标志物，所述代谢组学生物标志物选自下述物质中的一种或多种：乙基8-氯-6-(三氟甲基)咪唑并[1,2-a]吡啶-2-羧酸酯、苯丙酸、反油酸、花生酸、肾上腺酸、芥酸。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于：所述代谢组学生物标志物选自反油酸、花生酸、肾上腺酸、芥酸中的一种或多种。