CN115998962A - 一种组织粘附性复合水凝胶的合成方法及其绿色序列治疗种植体周围炎的应用 - Google Patents
一种组织粘附性复合水凝胶的合成方法及其绿色序列治疗种植体周围炎的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种组织粘附性复合水凝胶的合成方法及其绿色序列治疗种植体周围炎的应用。本发明首先利用儿茶酚改性的壳聚糖及β‑GP合成了cCP水凝胶，cCP水凝胶能通过与钛种植体表面及周围软组织相互粘附，建立理想的种植体周围颈部封闭，可阻断微生物入侵，进一步地，为提高Ag及Sr的协同抗菌及成骨活性，通过在SrMBGN表面原位掺入Ag，合成Ag‑pSrMBGN颗粒，并将该颗粒及牙龈间充质干细胞(GMSCs)掺杂入组织粘附性水凝胶基质cCP中，得到温敏可注射组织粘附性复合水凝胶。该复合水凝胶能够通过时序性释放Ag、Sr离子，提高材料的协同抗菌及成骨作用，最终实现绿色序列治疗PI的目的，具有临床转化价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种组织粘附性复合水凝胶的合成方法及其绿色序列治疗种植体周围炎的应用，属于生物医用材料技术领域。
背景技术
经过近半个世纪的发展，现代口腔种植技术已成为我国牙列缺损或缺失患者首选的治疗方式。种植技术的广泛应用快速提高了国民的口腔健康水平，但种植术后并发症的发生也大大增加了患者的经济以及精神负担。种植体周围炎(Peri-implantitis，PI)是其中一种常见且后果较严重的术后并发症。研究表明有47.1％的患者会在种植术后发生PI。PI不仅会降低种植手术的成功率，浪费大量医疗资源，也会影响患者的就诊满意度，增加患者的身心负担。因此，寻找有效治疗PI的可行策略是口腔种植领域亟待解决的重要临床问题，对提高全民口腔健康水平有重要意义。
目前临床上多采用非手术和手术相结合的方式治疗PI。临床医生采用机械刮治辅以局部或全身应用抗生素的方式去除种植体表面的菌斑及牙石，再进行外科手术，利用骨粉等生物材料修复缺失的骨组织。该治疗方案的不足在于：1)机械刮治容易破坏种植体与周围软组织间的颈部封闭，造成外界细菌再次入侵，导致PI复发；2)抗生素虽然有一定的抗菌作用，但其抗药性也对人体健康有重大威胁；3)临床上缺乏同时具有抗菌及成骨作用的生物材料，导致整体治疗周期较长，治疗效果有限。由此，PI治疗领域依然需要一种能建立完整种植体颈部封闭，在不依赖抗生素的条件下，绿色高效发挥抗菌及促成骨作用的微创治疗手段。
可注射性的温敏水凝胶为PI的微创治疗提供了一种有效策略。之前的研究中，Zhou等人利用壳聚糖(Chitosan，CS)及β-甘油磷酸酯(β-glycerophosphate，β-GP)合成了可注射的温敏水凝胶。该水凝胶能够在生理pH值和温度下快速成胶，有利于临床医生微创修复PI导致的各种形状骨缺损。但由于患牙位点经常出现牙龈出血等情况，水凝胶很难在龈沟湿润的环境中与种植体表面及牙龈软组织紧密粘附，形成良好的颈部封闭，阻断外界微生物的进一步定植。此外，单纯的温敏水凝胶清除菌斑及再生骨组织的能力有限，仍需负载其他组分形成复合水凝胶以绿色高效治疗PI。之前学者报道的Ag、Sr改性的MBGN(Ag-SrMBGN)虽然有一定抗菌及成骨作用，但Sr的掺入会减弱颗粒中Ag的抗菌性能，两种离子不能协同发挥生物学作用。
发明内容
本发明的目的是：针对目前采用抗生素及骨再生材料联合治疗PI的方法存在过程繁杂，效果不佳，而现有温敏水凝胶材料在口腔湿润环境中粘附性能不足、生物活性有限等问题，设计合成一种组织粘附性复合水凝胶，实现种植体周围炎的绿色高效序列治疗。
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种组织粘附性复合水凝胶，该复合水凝胶的组成表达式为GMSCs@Ag-pSrMBGN@cCP，其中，cCP为由儿茶酚改性的壳聚糖与β-甘油磷酸酯合成的组织粘附性温敏水凝胶，GMSCs为牙龈间充质干细胞，Ag-pSrMBGN为Sr掺杂的介孔生物活性玻璃接枝聚多巴胺后再掺杂Ag离子制备而成的纳米颗粒；所述的GMSCs与Ag-pSrMBGN掺杂于cCP水凝胶中。
优选地，所述Ag-pSrMBGN与cCP水凝胶的质量体积比为0～0.2:100g/mL，所述GMSCs的密度为0.5×106～2×106个/mL cCP水凝胶。
本发明还提供了上述的组织粘附性复合水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：分别制备儿茶酚改性的壳聚糖c-CS粉末和Ag-pSrMBGN纳米颗粒；
步骤2：取上述步骤1制备所得的c-CS粉末加入乙酸水溶液中，搅拌得到c-CS溶液；向c-CS溶液中加入β-甘油磷酸酯β-GP溶液，得到cCP抗菌温敏水凝胶前驱溶液；
步骤3：将上述步骤1制备得到的Ag-pSrMBGN纳米颗粒分散到cCP水凝胶前驱溶液中，再加入GMSCs细胞，得到组织粘附性复合水凝胶GMSCs@Ag-pSrMBGN@cCP。
优选地，所述步骤1中Ag-pSrMBGN纳米颗粒的制备过程包括以下步骤：
步骤1.1：以西曲溴铵为催化剂，以原硅酸四乙酯、四水硝酸钙和硝酸锶为原料，使用溶胶-凝胶法合成SrMBGN前驱体，所得前驱体经过干燥和煅烧后得到SrMBGN粉末；
步骤1.2：将上述步骤1.1制备所得的SrMBGN粉末及盐酸多巴胺溶于TrisHCl缓冲溶液中，搅拌反应，反应结束后离心并收集固体沉淀物，所得固体沉淀物依次经过洗涤和干燥后得到pSrMBGN粉末；
步骤1.3：将AgNO3颗粒溶于去离子水中得到Ag+水溶液，将上述步骤1.2制备所得的pSrMBGN粉末添加到新鲜制备的Ag+水溶液中，在室温下搅拌反应，反应结束后离心并收集固体沉淀物，所得固体沉淀物依次经过洗涤和干燥后得到Ag-pSrMBGN纳米颗粒。
优选地，所述步骤1.1中合成的SrMBGN粉末由摩尔比为70：15:15的SiO2、CaO和SrO组成。
优选地，所述步骤1中c-CS粉末的制备方法包括：将壳聚糖粉末溶于乙酸水溶液中，得到CS溶液，在EDC和NHS的催化作用下，CS溶液与3.4-二羟基苯丙酸(Hydrocaffeate，HCA)反应，纯化并干燥后得到c-CS粉末。
优选地，所述反应的工艺条件为：pH 4.5-5.5，反应时间8～12h；所述纯化的方法包括：依次采用盐酸水溶液和蒸馏水透析纯化。
本发明还提供了上述组织粘附性复合水凝胶在制备治疗种植体周围炎产品中的应用，所述水凝胶首先释放Ag离子发挥抗菌作用，然后释放Sr离子发挥成骨作用。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
(1)本发明设计合成了一种组织粘附性复合水凝胶GMSCs@Ag-pSrMBGN@cCP。首先，本发明利用儿茶酚改性的壳聚糖(catechol modified chitosan，c-CS)及β-GP合成了一种可注射的组织粘附性水凝胶基质(cCP)，cCP水凝胶基质能通过与钛种植体表面及周围软组织相互粘附，建立理想的种植体周围颈部封闭，在阻断微生物入侵的同时，微创治疗PI；
(2)进一步地，本发明将GMSCs作为种子细胞，掺入cCP水凝胶体系，有利于提高材料的原位成骨活性；
(3)更进一步地，本发明的水凝胶基质中掺入了Ag-polydopamine-SrMBGN，形成组织粘附性复合水凝胶。本发明借助聚多巴胺(polydopamine)设计合成一种时序性释放Ag离子及Sr离子的无机颗粒(Ag-polydopamine-SrMBGN，Ag-pSrMBGN)，将Sr离子原位掺入到MBGN体系内部，得到具有成骨活性的SrMBGN，继而将Ag离子通过聚多巴胺接枝到SrMBGN表面，使得Ag离子在SrMBGN表面原位合成纳米颗粒，最终保证Ag-pSrMBGN在治疗早期释放Ag离子发挥抗菌作用，治疗后期释放Sr离子发挥成骨作用，序列治疗PI；
(4)本发明的组织粘附性复合水凝胶GMSCs@Ag-pSrMBGN@cCP未掺入药物或抗生素，不依赖于药物或抗生素作用，有望实现绿色序列治疗PI，具有良好的临床应用前景。
附图说明
图1为本发明的GMSCs@Ag-pSrMBGN@cCP水凝胶合成及应用示意图；
图2为cCP水凝胶的SEM扫描结果；
图3为不同金属离子掺杂的MBGN的FTIR结果；
图4为不同金属离子掺杂的MBGN的XRD结果；
图5为不同金属离子掺杂的MBGN的SEM扫描结果；
图6为GMSCs@0.05Ag-pSrMBGN水凝胶中GMSCs细胞形态。
具体实施方式
为使本发明更明显易懂，兹以优选实施例，并配合附图作详细说明如下。
实施例1Ag-pSrMBGN@cCP水凝胶的合成及表征
1.Ag-pSrMBGN@cCP水凝胶的合成
(1)Ag-pSrMBGN的合成
a.SrMBGN的合成：使用溶胶-凝胶法合成SrMBGN(70SiO2-15CaO-15SrO，mol％)。将5.6g西曲溴铵在35℃条件下溶解于264mL去离子水中。当溶液由乳白色变为澄清透明时，将温度降至20℃。加入80mL乙酸乙酯。搅拌30分钟后，加入56mL氨水(1M)。然后将28.8mL原硅酸四乙酯和6.52g四水硝酸钙间隔30分钟依次加入上述混合溶液中。接着加入5.86g硝酸锶。将所得溶液继续搅拌4小时。通过离心和过滤收集形成的白色沉淀，用去离子水和无水乙醇清洗沉淀后，放于60℃真空干燥箱中过夜烘干，最后在700℃下以2℃/min的加热速率煅烧3小时。
b.pSrMBGN的合成：将4g SrMBGN及2g盐酸多巴胺溶于1000mL TrisHCl(10mM)缓冲溶液中。在此过程中，由于聚多巴胺的形成，混合物的颜色逐渐变为深棕色。搅拌6小时后，将混合物以6000rpm的转速离心15分钟。随后，用去离子水洗涤沉淀物以除去未附着的聚多巴胺和未反应的多巴胺。最后将沉淀物干燥并标记为pSrMBGN。
c.Ag-pSrMBGN的合成：将AgNO3颗粒溶解于去离子水中制备60mM Ag+水溶液。分别取1g上述步骤a合成的SrMBGN和步骤b合成的pSrMBGN粉末添加到250mL新制备的Ag+水溶液中，并在室温下以100rpm的速度磁力搅拌5小时。反应结束后收集固体物并用过量的去离子水反复洗涤，离心收集，然后在真空烘箱中干燥12小时，得到相应的Ag-SrMBGN及Ag-pSrMBGN纳米颗粒。
(2)儿茶酚改性壳聚糖的合成
将2g纯化CS溶于100mL 1％乙酸中，得到2％ CS溶液，将1.82g 3.4-二羟基苯丙酸(Hydrocaffeate，HCA)溶于10mL蒸馏水中，得到HCA溶液，将1.92g碳二亚胺盐酸盐(1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride，EDC)和1.15g N-羟基琥珀酰亚胺(N-Hydroxysuccinimide，NHS)溶于90mL乙醇/水(体积比为1:1)中。将HCA溶液加到CS溶液中，得到CS/HCA溶液，再将EDC/NHS溶液滴加到CS/HCA溶液中，反应10小时，pH保持在4.5-5.5之间，反应完成后，在pH为5的盐酸水溶液中透析三天，再用蒸馏水透析4小时，冷冻干燥即得儿茶酚改性后的壳聚糖(Catechol modified chitosan，c-CS)。
(3)Ag-pSrMBGN@cCP温敏水凝胶的合成
将1.5g c-CS粉末加到150mL 1％v/v的乙酸水溶液中，室温搅拌2-3小时，得到c-CS溶液。向上述溶液中加入25.16mLβ-GP溶液(0.5g/mL)，得到抗菌温敏水凝胶前驱溶液(cCP)，继续搅拌15分钟，将溶液加热到37℃成胶，即得189mL cCP水凝胶。将Ag-pSrMBGN颗粒以0，0.05，0.1，0.2％(g/mL)的比例分散到cCP水凝胶前驱溶液中得到cCP、0.05Ag-pSrMBGN@cCP、0.1Ag-pSrMBGN@cCP、0.2Ag-pSrMBGN@cCP水凝胶。
2.合成的相关材料的表征：
(1)温敏水凝胶cCP能够在体温37℃下成胶，由图2所示的SEM结果可知，所获水凝胶为疏松多孔的支架材料结构，有利于后续细胞的长入。
(2)对合成的SrMBGN、pSrMBGN、Ag-SrMBGN及Ag-pSrMBGN颗粒进行材料学表征(FTIR、XRD及SEM)，如图3～5所示。结果证实四种颗粒均被成功合成，形态为球形，Ag-pSrMBGN颗粒表面可见接枝的Ag纳米颗粒。
实施例2GMSCs@Ag-pSrMBGN@cCP的合成及Ag-pSrMBGN的浓度筛选
1.GMSCs的提取及鉴定
选择10名年轻(18至22岁)的健康男性或女性个体进行第三磨牙拔牙手术，提取牙龈组织。用PBS(含5％双抗)洗净牙龈组织表面血污，将组织块置于中性蛋白酶溶液(2.5mg/mL)中，4℃消化过夜，第二天用无菌镊子小心将牙龈上皮层与固有层分开。将固有层用无菌刀片及无菌剪刀剪切成糊状，后置于I型胶原酶(2.5mg/mL)溶液中37℃摇动消化30分钟。1000rpm离心5分钟后，弃去上清液，用普通培养基重悬沉淀后置于培养皿中，于细胞培养箱中继续培养。为了确认细胞的间充质干细胞特征，使用流式细胞仪分析，确认细胞对间充质干细胞表面标记CD73、CD146、CD166和Sca-1呈阳性，对造血细胞标记CD31、CD34和CD45呈阴性。实施例中使用培养至第四代的细胞进行后续实验。
2.GMSCs@Ag-pSrMBGN@cCP的合成
将Ag-pSrMBGN颗粒以0，0.05，0.1，0.2％(g/mL)的比例分散到cCP水凝胶前驱溶液中，再将GMSCs细胞以106个细胞/mL的密度悬浮在上述溶液中，得到GMSCs@cCP、GMSCs@0.05Ag-pSrMBGN@cCP、GMSCs@0.1Ag-pSrMBGN@cCP、GMSCs@0.2Ag-pSrMBGN@cCP水凝胶。
3.水凝胶中GMSCs的细胞形态
用PBS清洗水凝胶三次，并将水凝胶放于标准干细胞培养基中培养3天。使用鬼笔环肽及DAPI观察水凝胶内部GMSCs的细胞形态，结果如图6所示。
综上所述，本发明合成了一种负载GMSCs及Ag-pSrMBGN粒子的可注射组织粘附性复合水凝胶(GMSCs@Ag-pSrMBGN@cCP)。水凝胶的可注射组织粘附性能保证材料高效阻断微生物的继发感染，微创修复各种形状的骨缺损；水凝胶内部的Ag-pSrMBGN颗粒能够在不依赖抗生素和其他成骨活性成分的条件下，有效抑制种植体表面细菌的生长，改善成骨微环境，促进新骨形成，发挥序列治疗PI的作用；同时，水凝胶内部包裹的GMSCs也能通过成骨分化，促进种植体周围骨组织的再生。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
Claims (8)
1.一种组织粘附性复合水凝胶，其特征在于，该复合水凝胶的组成表达式为GMSCs@Ag-pSrMBGN@cCP，其中，cCP为由儿茶酚改性的壳聚糖与β-甘油磷酸酯合成的组织粘附性温敏水凝胶，GMSCs为牙龈间充质干细胞，Ag-pSrMBGN为Sr掺杂的介孔生物活性玻璃接枝聚多巴胺后再掺杂Ag离子制备而成的纳米颗粒；所述GMSCs与Ag-pSrMBGN掺杂于cCP水凝胶中。
2.如权利要求1所述的组织粘附性复合水凝胶，其特征在于，所述的Ag-pSrMBGN与cCP水凝胶的质量体积比为0～0.2:100g/mL，所述GMSCs的密度为0.5×106～2×106个/mL cCP水凝胶。
3.权利要求1或2所述的组织粘附性复合水凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：分别制备儿茶酚改性的壳聚糖c-CS粉末和Ag-pSrMBGN纳米颗粒；
步骤2：取上述步骤1制备所得的c-CS粉末加入乙酸水溶液中，搅拌得到c-CS溶液；向c-CS溶液中加入β-甘油磷酸酯β-GP溶液，得到cCP抗菌温敏水凝胶前驱溶液；
步骤3：将上述步骤1制备得到的Ag-pSrMBGN纳米颗粒分散到cCP水凝胶前驱溶液中，再加入GMSCs细胞，得到组织粘附性复合水凝胶GMSCs@Ag-pSrMBGN@cCP。
4.如权利要求3所述的组织粘附性水凝胶的制备方法，其特征在于，所述步骤1中Ag-pSrMBGN纳米颗粒的制备过程包括以下步骤：
步骤1.1：以西曲溴铵为催化剂，以原硅酸四乙酯、四水硝酸钙和硝酸锶为原料，使用溶胶-凝胶法合成SrMBGN前驱体，所得前驱体经过干燥和煅烧后得到SrMBGN粉末；
步骤1.2：将上述步骤1.1制备所得的SrMBGN粉末及盐酸多巴胺溶于TrisHCl缓冲溶液中，搅拌反应，反应结束后离心并收集固体沉淀物，所得固体沉淀物依次经过洗涤和干燥后得到pSrMBGN粉末；
步骤1.3：将AgNO3颗粒溶于去离子水中得到Ag+水溶液，将上述步骤1.2制备所得的pSrMBGN粉末添加到新鲜制备的Ag+水溶液中，在室温下搅拌反应，反应结束后离心并收集固体沉淀物，所得固体沉淀物依次经过洗涤和干燥后得到Ag-pSrMBGN纳米颗粒。
5.如权利要求4所述的组织粘附性复合水凝胶的制备方法，其特征在于，所述步骤1.1中合成的SrMBGN粉末由摩尔比为70：15：15的SiO2、CaO和SrO组成。
6.如权利要求3所述的组织粘附性复合水凝胶的制备方法，其特征在于，所述步骤1中c-CS粉末的制备方法包括：将壳聚糖粉末溶于乙酸水溶液中，得到CS溶液，在EDC和NHS的催化作用下，CS溶液与3.4-二羟基苯丙酸(Hydrocaffeate，HCA)反应，纯化并干燥后得到c-CS粉末。
7.如权利要求3所述的组织粘附性复合水凝胶的制备方法，其特征在于，所述反应的工艺条件为：pH 4.5-5.5，反应时间8～12小时；所述纯化的方法包括：依次采用盐酸水溶液和蒸馏水透析纯化。
8.权利要求1或2所述的组织粘附性复合水凝胶在制备治疗种植体牙周炎产品中的应用，其特征在于，所述复合水凝胶首先释放Ag离子发挥抗菌作用，然后释放Sr离子发挥成骨作用。
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