CN113318276B - 一种多重交联可注射水凝胶及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种多重交联可注射水凝胶的制备方法，包括以下步骤：(1)没食子酸改性壳聚糖CG的制备；(2)多醛基海藻酸钠MASA的制备；(3)多重交联可注射水凝胶的制备。该方法以明胶、氧化海藻酸钠MASA、没食子酸改性壳聚糖CG、铜离子为原料，工艺简洁、易于控制。本发明还公开了采用上述多重交联可注射水凝胶的制备方法制备获得的多重交联可注射水凝胶。以及上述多重交联可注射水凝胶在制备具有可注射、湿粘接、抗菌、抗炎、抗氧化、自愈合、可降解、适宜力学性能与生物相容性以及促组织再生等功效的种植体术后软组织封闭材料方面的应用。

Description

一种多重交联可注射水凝胶及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物材料技术领域，具体涉及一种多重交联可注射水凝胶及其制备方法和应用，尤其是一种具有粘接封闭、抗菌、抗炎、促组织再生等功能的多重交联可注射水凝胶及其制备方法和应用。
背景技术
牙缺失非常普遍，被认为是一种慢性残疾。它不仅从生理和心理上显著降低与口腔健康相关的生活质量，还会增加许多诸如心血管和痴呆等疾病的风险。口腔种植是牙缺失修复的理想手段，其可恢复重建牙齿功能和美观，因此成为越来越多患者的选择。种植体植入后，软组织屏障的连续性——生物封闭即被破坏，此时迅速重建软组织的屏障(封闭)作用，对于抵御微生物及其成分入侵，维持种植体周围软硬组织的长期健康，从而获得种植体的长期成功至关重要。
但目前临床采用的术后间断缝合处理无法获得即刻屏障(封闭)作用。在口腔这样一种复杂的微生物环境中，此时细菌极易下行侵入种植体与软组织间隙并形成菌斑，从而影响健康软组织的再生并形成良好生物封闭，这可能是导致后续80％患者中有40～90％的种植体出现种植体周围粘膜炎，而其中20％的种植体进一步发展成种植体周围炎，最终导致种植失败的最大原因。相关的组织学研究也证实了这一点：与天然牙周围的牙龈相比，种植体周围结缔组织为修复与再生能力弱的类似炎症刺激形成的“瘢痕组织”；周围平行于种植体表面的纤维结缔组织脆弱、密封性差；软组织血管稀疏，抵御外来刺激能力与再生能力弱。
然而，由于口腔中的软组织尤其是粘膜再生迅速、对抗生素耐药的担忧、以及种植相对较短(不足60年)的发展历史，人们对植体植入后，种植体周围因不能形成即刻封闭而可能导致慢性炎症，从而影响种植体的长期成功这一问题未引起足够重视，目前临床上并未采取相应的干预措施。
发明内容
本发明的目的在于提供一种多重交联可注射水凝胶的制备方法，该方法以明胶、氧化海藻酸钠MASA、没食子酸改性壳聚糖CG、铜离子为原料，工艺简洁、易于控制。
本发明的目的还在于提供采用上述多重交联可注射水凝胶的制备方法制备获得的多重交联可注射水凝胶。
本发明的最后一个目的在于提供上述多重交联可注射水凝胶在制备具有可注射、湿粘接、抗菌、抗炎、抗氧化、自愈合、可降解、适宜力学性能与生物相容性以及促组织再生等功效的种植体术后软组织封闭材料方面的应用。
本发明以明胶、氧化海藻酸钠MASA、没食子酸改性壳聚糖CG、铜离子为原料，研制能强湿粘接封闭、自愈合、抗菌、促血管生成、可注射、可降解等生物活性水凝胶，利用它将牙龈软组织按需塑形粘接在种植体周围，介导种植体周围软组织实现从“材料介导的即刻粘接封闭→粘接/软组织混合封闭→再生富血管软组织介导的健康稳定生物封闭”，进而促进种植获得长期成功。本申请旨在为促进种植成功提供新思路，为经皮/粘膜装置领域相关用途材料的设计研发建立理论基础和实践经验。
本发明的上述第一个目的可以通过以下技术方案来实现：一种多重交联可注射水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
(1)没食子酸改性壳聚糖CG的制备
将壳聚糖CS溶于酸性水溶液中，搅拌溶解后，调节pH，得CS溶液；
将没食子酸GA溶解于无水乙醇，得GA溶液；
选取1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC和N-羟基琥珀酰亚胺NHS溶解于无水乙醇，得EDC-NHS混合液；
将GA溶液、EDC-NHS混合液加入搅拌中的CS溶液中，调节好pH值，在室温下搅拌反应，收集溶液经透析、冷冻干燥，得CG固体；
(2)多醛基海藻酸钠MASA的制备
将海藻酸钠磁搅拌分散于乙醇中，得海藻酸钠-无水乙醇悬浊液；
将高碘酸钠磁搅拌避光溶于蒸馏水中得到透明溶液，随后将其加入搅拌着的海藻酸钠-无水乙醇悬浊液中，室温避光搅拌后，加入乙二醇中和未反应的高碘酸钠，随后将溶液倒入剧烈搅拌下无水乙醇中，将混合液体离心，收集沉淀，经透析、冷冻干燥后获得MASA固体；
(3)多重交联可注射水凝胶的制备
将明胶溶于水中，得明胶溶液，将步骤(1)获得的没食子酸改性壳聚糖CG溶于水中，得CG溶液，随后将明胶溶液与CG溶液混合，得明胶-CG混合溶液；
将步骤(2)获得的多醛基海藻酸钠MASA溶于硼砂溶液得多醛基海藻酸钠MASA溶液，再加入硫酸铜溶液混匀，得MASA-硫酸铜混合溶液，将MASA-硫酸铜混合溶液与明胶-CG混合溶液混匀，即制备得多重交联可注射水凝胶。
在上述多重交联可注射水凝胶的制备方法中：
本发明步骤(1)中CS是壳聚糖Chitosan的简写；GA是没食子酸Gallic acid的简写；NHS是N-羟基琥珀酰亚胺N-Hydroxy succinimide的简写；EDC是1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiim-idehydrochloride的简写。
优选的，步骤(1)中所述酸性水溶液是浓度为0.1mol/L的稀盐酸，调节pH值为5.0～5.5，更佳为5.5。
优选的，步骤(1)中所述没食子酸GA的羧基与所述壳聚糖CS的氨基的摩尔浓度比控制为1～3:1，其中3:1的比例可获得较高的接枝率与溶解度。
优选的，步骤(1)中所述没食子酸GA的羧基、所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC与所述N-羟基琥珀酰亚胺NHS的摩尔比为1:1:1。
优选的，步骤(1)中将GA溶液、EDC-NHS混合液加入搅拌中的CS溶液中，调节好pH值为5.0～5.5，更佳为5.0，在室温下搅拌反应24h。
步骤(2)中根据氧化度需求计算并称量高碘酸钠质量。
优选的，步骤(2)中所述高碘酸钠的用量为所述海藻酸钠总质量的80％，所述海藻酸钠的氧化度为40％。
优选的，步骤(2)中室温避光搅拌2小时。
优选的，步骤(1)～(2)中透析采用透析袋，透析袋的截留分子量为3500Da；透析时间为48-72小时，更佳为48小时，在透析的过程中需要更换透析介质DDW(超轻水)，更换透析介质的时间优选为0.5h、1h、4h、8h、12h、24h、36h、48h。
优选的，步骤(3)中所述明胶的浓度为0.15g/mL。
优选的，步骤(3)中所述没食子酸改性壳聚糖CG浓度为0.01g/mL。
优选的，步骤(3)中所述硼砂的浓度为0.1mol/L。
优选的，步骤(3)中所述多醛基海藻酸钠MASA溶液的浓度为0.1g/mL。
优选的，步骤(3)中所述明胶-CG混合溶液中所述明胶溶液与所述CG溶液的体积比为5:0～4。
更佳的，步骤(3)中所述明胶-CG混合溶液中所述明胶溶液与所述CG溶液的体积比为5:0、5:1、5:2、5:3、5:4。
优选的，步骤(3)中所述MASA-硫酸铜混合溶液中的MASA的醛基与所述明胶-CG混合溶液中的明胶上的氨基的摩尔比为1～5:1，进而制得不同CG含量、不同醛胺比的多重交联可注射水凝胶。
更佳的，步骤(3)中所述MASA-硫酸铜混合溶液中的MASA的醛基与所述明胶-CG混合溶液中的明胶上的氨基的摩尔比为2～5:1，进而制得不同CG含量、不同醛胺比的多重交联可注射水凝胶。
作为本发明的一种优选的实施方式，步骤(3)中以500μL明胶溶液，加入400μL、300μL、200μL、100μL、0μL CG溶液，获得CG4、CG3、CG2、CG1、CG0的明胶-CG混合溶液，并通过优化MASA溶液加入量为，MASA醛基浓度与体系中氨基摩尔浓度比为1:1、2:1、3:1、4:1、5:1，从而制备不同CG含量、不同醛胺比的水凝胶。
优选的，步骤(3)中所述硫酸铜溶液的浓度为0.1mol/L，铜离子加入量以计算GA接枝程度后，设置所述硫酸铜溶液中铜离子与所述没食子酸GA的摩尔比为3:1。
优选的，步骤(3)中将MASA-硫酸铜混合溶液与明胶-CG混合溶液在37℃充分混匀，即制备得多重交联可注射水凝胶。
本发明将没食子酸改性壳聚糖(Chitosan-Gallic acid,CG)、多醛基海藻酸钠(Multiple Aldehyde Sodium Alginate,MASA)、明胶和铜离子，利用CG、明胶表面氨基与MASA醛基发生席夫碱反应，同时通过大分子间的氢键、静电相互作用，GA与金属离子的配位键、GA上苯环的π-π堆叠、π-阳离子获得多重交联机制，制备一种理化性能良好，具有抗菌活性的水凝胶。
本发明的上述第二个目的可以通过以下技术方案来实现：一种多重交联可注射水凝胶，采用上述任一项方法制备获得。
本发明通过明胶、CG、MASA、铜离子间的醛胺席夫碱反应、芳基偶连、Michael加成、金属配位键、氢键等多重交联机制获得一种新型具有抗菌活性水凝胶。
本发明的上述第三个目的可以通过以下技术方案来实现：上述多重交联可注射水凝胶在制备具有可注射、湿粘接、抗菌、抗炎、抗氧化、自愈合、可降解、适宜力学性能与生物相容性以及促组织再生功效的种植体术后软组织封闭材料方面的应用。
本发明首先制备没食子酸改性壳聚糖(Chitosan-Gallic acid,CG)、多醛基海藻酸钠(Multiple Aldehyde Sodium Alginate,MASA)，联合CG、MASA、明胶、铜离子制备抗菌活性水凝胶，并对其物理化学性能、细胞毒性、抗氧化性、抗菌性能进行表征，探讨其用于种植体术后软组织封闭对抗病原微生物的作用。
本发明利用上述方法制备不同CG含量、不同醛胺比的水凝胶，通过各项表征探索优化水凝胶性能的参数，并验证其抗氧化、抗感染的生物学效应。
本发明对水凝胶物理化学结构和细胞生物学效应进行表征，模拟其在物理阻隔抵御细菌入侵的作用。结果表明：该水凝胶具有可注射性、自愈合性能、可在14天内降解，并具有良好压缩性能、拉伸强度；体外生物学实验表明，水凝胶具有良好生物相容性、抗氧化性能，能有效抑制金黄色葡萄球菌(S.aureus)、变形链球菌(S.mutans)、伴放线放线杆菌(A.a)的活性；综合结果表明，该水凝胶具有性能良好、安全方便、高效抑菌等优点，可运用于临床种植术后，联合常规缝合方法封闭软组织与钛表面间隙。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
(1)本发明利用天然大分子制备一种生物、理化抗菌的水凝胶，避免了引入抗生素、消毒剂，可避免临床耐药菌的产生；
(2)本发明制备的抗菌活性水凝胶，制作工艺简便可行，原料来源丰富，可操作性强；
(3)本发明作为水凝胶类生物材料，内部疏松多孔的网状空间结构使其可负载药物、纳米颗粒等，有望作为药物递送载体使用。
附图说明
图1是实施例2中水凝胶凝胶化时间与体系中醛基与氨基的比值；
图2是实施例2中水凝胶表面形貌扫描电镜测试结果，其中A-D图为5:1-CG4、4:1-CG4、3:1-CG4、2:1-CG4，E-G图表示CG含量为5:1-CG3、5:1-CG2、5:1-CG0；
图3是实施例2中的可注射性测试结果，明胶(A)、37℃条件下明胶溶解(B)，5:1-CG4组水凝胶(C)室温下注射成胶，5:1-CG4组水凝胶37℃条件下结构稳定(D)；
图4是实施例2中的自愈合性能测试结果，制备不同颜色水凝胶(A)对半切开(B)，将其对接后(C)，DCH可完整夹持(D)；
图5是实施例2中水凝胶溶胀性能测试结果，不同CG浓度(A、B)与醛胺比(C、D)的溶胀曲线与最大溶胀率；
图6是实施例2中水凝胶降解实验结果，左图和右图分别为不同醛胺比(A)与不同CG投料量(B)水凝胶的降解速率；
图7是实施例2中的水凝胶流变学性能，不同水凝胶随剪切频率变化的储能模量(G’)与损耗模量(G”)(A)，不同醛胺比(B)、不同CG投料(C)下水凝胶储能模量的变化；
图8是实施例2中的水凝胶压缩强度与拉伸强度，不同DCH的压缩曲线与压缩模量，(A、B)不同醛胺比水凝胶；(C、D)不同CG投料的水凝胶；
图9是实施例2中不同水凝胶的拉伸曲线与最大拉伸强度，(A、B)不同醛胺比的水凝胶；(C、D)不同CG投料的水凝胶；
图10是实施例2中的水凝胶的粘接性能，不同水凝胶的粘接性能，不同CG投料(A)；不同醛胺比(B)；
图11是实施例3中的水凝胶的DPPH清除实验结果；
图12是实施例3中的水凝胶的ABTS自由基清除实验；
图13是实施例3中的水凝胶的生物相容性，不同水凝胶的浸提液第1、2、3天细胞毒性(A、B)；第1、4、7天细胞增殖实验(C、D)；
图14是实施例3中不同水凝胶组活死细胞染色结果；
图15是实施例3中的水凝胶的抑菌效率与稀释涂布平板图；水凝胶与S.aureus(A、B)、S.mutans(C、D)、A.a(E、F)与共培养后稀释涂布平板结果与抑菌效率，a-g分别为：5:1-CG4、4:1-CG4、3:1-CG4、5:1-CG3、5:1-CG2、5:1-CG0、5:1-CG0Cu0，h为空白对照组；
图16是实施例3中水凝胶与S.aureus(A、B、C)、S.mutans(D、E、F)、A.a(G、H、I)共培养后菌落计数结果；
图17是实施例3中的水凝胶的扫描电镜图，扫面电镜观察琼脂凝胶表面S.aureus(A)、S.mutans(C)、A.a(E)的正常形态，水凝胶表面S.aureus(B)、S.mutans(D)、A.a(F)形态；
图18是实施例3中的水凝胶的活死细菌染色，水凝胶与A.a(A)、S.aureus(B)、S.mutans(C)共培养后表面活死菌染色结果；
图19是实施例3中的水凝胶的Transwell模拟水凝胶阻隔细菌下行，水凝胶与A.a(A)、S.aureus(B)、S.mutans(C)共培养后表面活死菌染色结果。
具体实施方式
下面将结合具体实施方式进一步说明本发明，但本发明要求保护的范围并不局限于下列实施方式。
平均分子量为10w的壳聚糖为上海贝博生物有限公司购得。
平均分子量为10w的海藻酸钠为美国Sigma公司购得。
Type A型猪皮明胶(～300bloom)由美国Sigma公司购得。
高碘酸钠(分子量213.89)为上海麦克林生物科技有限公司购得。
碳二亚胺(EDC)(分子量191)、N-琥珀酰亚胺(分子量115.09)为美国Aladdin公司购得。
实施例1
(1)CG的合成
CG的合成方案如下式所示：
Figure GDA0003271777340000071
具体步骤为：
称取1g壳聚糖(95％脱乙酰度，MW＝10W)加入50毫升0.1mol·L-1稀盐酸，搅拌至完全溶解后，逐滴加入NaOH调节pH至5.5，补足去离子水至CS浓度为1％。
准确称取没食子酸3g溶于25mL乙醇，称取3.39g EDC与2.04g NHS溶解于25mL乙醇。待溶液完全溶解，将GA溶液与EDC、NHS混合溶液缓慢逐滴倒入搅拌中的壳聚糖溶液，室温下搅拌反应24h，反应过程中保持pH＝5.0。
将反应溶液于截留分子量为3500的透析袋中，于pH＝5的DDW中透析48h，收集透析后溶液抽滤除去杂质，冷冻干燥后于室温下密封干燥保存。
(2)MASA的合成
将50.00g海藻酸钠通过磁搅拌分散在250mL乙醇中得均一悬浊液。
根据不同氧化程度，按高碘酸钠：海藻酸钠糖单元比例为80％计算高碘酸钠质量，将高碘酸钠(白色晶体)通过磁搅拌避光溶于250mL蒸馏水中得均一透明溶液，随后将其加入搅拌着的海藻酸钠-无水乙醇悬浊液中，室温避光搅拌2h后，将约等于高碘酸钠5倍摩尔量的乙二醇至反应液中，室温避光搅拌30min以中和未反应的NaIO4，随后将溶液徐徐倒入剧烈搅拌下的750mL无水乙醇中，继续搅拌5min使海藻酸钠析出，将混合液体离心，弃去上清后收集底层多醛基海藻酸钠沉淀，配成20％溶液后于截留分子量3500透析袋中透析48h，在透析的过程中需要更换透析介质DDW(超轻水)，更换透析介质的时间为0.5h、1h、4h、8h、12h、24h、36h、48h。透析结束后，收集样品经冷冻干燥后于4℃环境中密封保存。
盐酸羟胺－电位滴定法测定其醛基浓度并计算出氧化程度，核磁共振氢谱(NMR-H)和傅里叶红外光谱(FTIR)定性检测MASA的醛基。
(3)水凝胶的制备
将CG溶于DDW配制成1％(w/v)溶液，取0、100、200、300、400μL CG溶液加入0.5mL15％的明胶(Gelatin,Gel)水溶液中，37℃环境下水浴搅拌使其混合均匀。
将0.1g MASA溶于1mL 0.1M硼砂溶液中配制10％MASA-硼砂溶液，以摩尔比GA:Cu2+＝1:3，计算并吸取对应体积的0.01M CuSO4溶液滴加于MASA溶液中，吹打混合均匀。
将MASA-CuSO4混合溶液加入搅拌中的CG-Gel混合溶液中，37℃水浴恒温搅拌至交联成胶。
以500μL明胶溶液为例，加入400μL、300μL、200μL、100μL、0μL CG溶液，获得CG4、CG3、CG2、CG1、CG0的明胶-CG混合溶液，并通过优化MASA溶液加入量为，MASA醛基浓度与体系中氨基摩尔浓度比为1:1、2:1、3:1、4:1、5:1，从而制备不同CG含量、不同醛胺比的水凝胶。
实施例2
具体为将实施例1中的方案，制备不同CG含量、不同醛胺比的水凝胶，通过表征各项性能表征研究水凝胶理化性能对于其应用的优越性与可行性。
(1)凝胶化时间
水凝胶制备方案实施例1。
制备CG-Gel混合溶液，将MASA-CuSO4混合溶液滴加于500r/s搅拌中的CG-Gel混合溶液，待混合均匀后，调整搅拌速度至10r/s，观察搅拌子转动受限或停止搅拌时记录凝胶化时间。
结果如图1所示，该水凝胶凝胶化时间与体系中醛基与氨基的比值成负相关，在醛胺比控制为2:1及以上时，水凝胶凝胶化时间可控制于8min内；醛胺比调整为5:1时，水凝胶凝胶化时间最快可为3～4min。
通过凝胶化时间，为了获得可注射的水凝胶，可初步筛选出凝胶化时间小于10min的醛氨比为2:1～5:1水凝胶。
体系中丰富的醛基可迅速与壳聚糖、明胶氨基侧链丰富的氨基发生席夫碱反应形成共价结合，此外由于离子与儿茶酚基团间、羧基与铜离子间形成的金属配位键、大分子链间的氢键、席夫碱反应形成的碳亚胺键、羧基和氨基的静电相互作用、苯环的π-π堆叠等，这些丰富的交联机制使得其可迅速交联成胶。
(2)水凝胶表面形貌测试
将制备的水凝胶样品冷冻干燥48h，取出样品放入液氮中浸泡10s后切断暴露断面，扫描电镜观察水凝胶表面与断面形貌并分析其孔径大小。
图2结果显示，该水凝胶的内部结构疏松多孔，内部孔径均在150μm以下，其中孔径大小随着醛胺比增加而逐渐降低，提示内部交联密度增加。这种现象在CG含量变化中也有所体现，但CG的降低，孔径大小变化较小。
(3)可注射性测试
如图3所示，通过将水凝胶前体溶液CG-Gel与MASA-Cu按比例混合后加入注射器中，37℃条件下将混合溶液以注射形式涂布于培养皿表面形成特定形状，待其交联成胶后放置于50℃条件中，将平板垂直放置，观察水凝胶流动性。
对照组为未经交联的明胶溶液，在室温下同样可注射成特定形状水凝胶，但在温度升高至50℃时，因高温导致氢键的破坏，水凝胶溶解成液体。
丰富的交联机制是该水凝胶快速成胶的原因，这赋予了其可注射的性能。可注射性满足了临床应用微创、操作方便的要求。
(4)自愈合性能测试
在模具中制备圆柱状水凝胶(直径为10mm，厚2mm)，通过在前体溶液中加入美蓝溶液制备蓝色水凝胶A，制备未染色水凝胶B，将A、B样品分别对半切开后将断面两两对接，放置于37℃恒温恒湿培养箱中，每间隔5min利用镊子夹持水凝胶样品，由图4可见，可在5-10min时可用镊子夹起重新愈合成整体的水凝胶块，并在重力作用下依旧保持完整，证明其具有自愈合性能。水凝胶的自愈合性能是由于该水凝胶的多重交联机制中含有多种可逆的交联机制，这使其在受外源刺激而导致部分交联结构被破坏后，通过可逆的物理或化学键合实现自我修复。
(5)水凝胶溶胀与降解实验
由图5可见，水凝胶溶胀性能与CG含量无关，主要与醛基即MASA的投料量有关。醛胺比浓度为5:1时，约在48h可达溶胀平衡；其余2:1-4:1组在约12h时即达溶胀平衡。通过测试水凝胶的最大溶胀率发现，随着CG浓度增加，醛胺比1:1、2:1、3:1、4:1、5:1对应的最大溶胀率为：20.33％±0.10％、24.41％±1.95％、33.04％±2.21％、35.67％±2.00％、49.63％±3.54％。醛胺比对溶胀性能的影响，可能是因为当醛基浓度升高时，内部丰富的醛基可与大量水分子形成氢键，进而吸收水分充盈其内部结构。
(6)水凝胶降解实验
采用称重法测定水凝胶体外降解性能。将水凝胶浸泡于装有15mL人工唾液的离心管中，于不同时间取出水凝胶样品，将其冷冻干燥，称重质量计算剩余质量比。
图6显示水凝胶降解速率几乎不随醛胺比的改变而变化，呈现较为稳定的降解速率。在第1～12天降解速率适中，约在第12天所测得样品质量约为初始质量55％～70％，并在第13～14天完全溃散。
临床目前认为，种植体术后牙龈切口常规于术后1周可拆除缝线。种植体周围软组织在植入后第4天可建立最初的粘膜密封。随后，成纤维细胞与胶原蛋白占据种植体-组织界面顶部，并在1-2周，种植体周围交界上皮位于粘膜边缘顶端约0.5mm。第14天时种植体周围结合上皮已经开始向根尖方向延伸，种植体周围粘膜此时开始富含血管，抵御外源性刺激的能力得以提升。该水凝胶在1-12天的完整性有望抵御细菌的下行入侵，为下方软组织愈合提供良好的愈合环境。
(7)水凝胶流变学性能
水凝胶流变学性能由高级旋转流变仪进行测试。
图7显示，在不同醛胺比的水凝胶中，储能模量随着醛基投料降低而逐渐降低。在MASA醛基浓度固定而CG投料不同的DCH中，储能模量在CG4时最高。各水凝胶的储能模量与损耗模量随着扫描频率增加，无明显变化，G＇始终维持在远高于G＂的状态，表明水凝胶的频率独立性。
(8)水凝胶压缩强度与拉伸强度
通过在模具中制备圆柱状水凝胶(直径为7mm，高8.5mm)，在水凝胶表面均匀涂布薄层凡士林以避免水凝胶在实验过程中大量脱水。万能力学测试机以1mm/min的速度对水凝胶进行压缩，水凝胶的压缩模量根据应力应变曲线20-40％的线性应变的斜率进行计算。
结果如图8显示，水凝胶在CG投料量固定为CG3时，醛胺比为1:1、2:1、3:1、4:1、5:1的压缩模量分别为6.86KPa±5.09KPa、7.93KPa±4.66KPa、8.65KPa±4.86KPa、14.04KPa±5.05KPa、17.20KPa±6.57KPa。
统计分析表明，醛胺比为5:1、4:1时压缩模量明显高于1:1、2:1、3:1组，而1:1、2:1、3:1组组间无明显差异。
根据实施例1中水凝胶制备方案，当固定醛胺比5:1时，调整CG浓度获得不同水凝胶组：CG-0、CG-1、CG-2、CG-3、CG-4，各组对应的压缩模量分别为3.69KPa±3.46KPa、6.13KPa±4.64KPa、7.65KPa±5.71KPa、13.68KPa±5.32KPa、28.79KPa±6.35KPa。
统计分析见CG3、CG4弹性模量明显高于CG0、CG1、CG2(P＜0.05)，而CG0、CG1、CG2三组间未见明显差异。
上述结果可以说明MASA与CG投料量可影响水凝胶压缩模量，其中当醛胺比为5：1时，CG投料组为CG4时，材料可获得最大弹性模量。
由压缩测试筛选出较高压缩性能组进行拉伸测试，该水凝胶拉伸性能表征结果如图9所示。当醛基投料量相同，CG投料量越高，拉伸强度逐渐增加，CG0、CG2、CG3、CG4时拉伸强度分别为79.00KPa±19.07KPa、95.67KPa±17.04KPa、124.33KPa±35.16KPa、278.67KPa±67.00KPa。当固定醛基为CG-4，醛胺比3:1、4:1、5:1拉伸强度分别为124KPa±17.06KPa、217.33KPa±21.96KPa、278.67KPa±67.00KPa。因此可以通过调整醛胺比与CG投料量可改变该水凝胶的压缩、拉伸性能。
(9)水凝胶粘接性能测试
水凝胶组织粘合强度性能测试主要测试其在软组织表面的粘接强度。
结果如图10显示：CG0、CG2、CG3、CG4最大粘接强度为：7.12KPa±0.71KPa、5.27KPa±0.78KPa、8.04KPa±0.15KPa、10.31KPa±1.56KPa。
统计分析显示CG-4粘合强度明显高于CG0、CG2、CG3组，CG2、CG3、CG4粘合强度随着CG浓度增加而升高。CG的粘接机理主要与壳聚糖质子化氨基、没食子酸的邻苯三酚基团有关。壳聚糖主链上的质子化氨基与猪皮表面细胞膜磷脂的静电相互作用，羟基可与组织表面形成氢键。没食子酸的邻苯三酚基团在转化为反应性醌基之后可与组织表面的巯基、氨基等亲核基团反应；此外邻苯三酚基团可通过交联阳离子基团或通过阳离子π键作用于组织表面。因此，在醛基投料相同时，随着CG的增加，其粘接性能也逐渐增加。
在不同醛胺比的分组中，3:1、4:1、5:1组粘接强度分别为：7.80KPa±1.16KPa、8.81KPa±1.42KPa、10.31KPa±1.56KPa，粘接强度与醛胺比正相关的趋势。这可能是由于猪皮作为生物组织，表面丰富的蛋白质、多糖等大分子具有较多活性基团可与该水凝胶中游离的活泼醛基发生反应，如氨基与醛基形成碳亚胺键、醛基与醛基形成缩醛等。因此，该水凝胶发挥的组织粘接性能主要为体系中的活泼醛基、没食子酸儿茶酚基团、壳聚糖分子的质子化氨基所提供。
通过实施例2的各项实验，结果表明，该水凝胶具有良好可注射性、自愈合性能，并且在对抗压缩、拉伸应力下表现出良好的机械性能。下一步将验证水凝胶的生物相容性、抗氧化性、抗菌性能，以证明其用于预防种植体周围感染，促进种植体周围软组织愈合的功效。
实施例3
(1)抗菌活性水凝胶的抗氧化性能
利用DPPH、ABTS自由基清除实验探究实施例1中水凝胶的DPPH、ABTS自由基清除能力，并探索其厚度对清除能力的影响以评估其抗氧化性能。
结果如图11显示，该水凝胶自由基清除能力与厚度相关，相同体积该水凝胶在96孔板、48孔板、24孔板中厚度逐渐降低，清除效率逐渐升高。将其制备于96孔板、48孔板中时，发现自由基清除效率随着CG浓度增高而增高，当厚度为24孔板组时，水凝胶厚度较薄，该水凝胶自由基清除效率随着CG浓度增高未见明显变化，最高清除率可达约46.6％。
而在ABTS实验中，如图12所示：该水凝胶的ABTS自由基清除能力与厚度的关系与DPPH自由基清除实验中相同，即相同体积水凝胶在96孔板、48孔板、24孔板中厚度逐渐降低，清除率逐渐升高，且随着CG浓度增高而增高。5:1-CG2、5:1-CG3、5:1-CG4组清除率可达分别为98.59％、98.57％、97.89％。
上述结果显示，该水凝胶具有良好的自由基清除能力，显示出一定的抗氧化潜在性能。其中的机理可能主要与没食子酸改性壳聚糖的抗氧化效应有关。而在DPPH自由基清除实验中表现出的相对于ABTS自由基清除实验较低的清除率，我们考虑一方面可能与两者的自由基清除机理不同有关，另一方面有文献报道部分抗氧化剂在对DPPH不敏感时，可呈现出对ABTS自由基清除的敏感性，但具体原因尚未阐明。
(2)体外生物相容性表征
为探究该水凝胶可安全、无毒地运用于生物体内的潜在效应，本发明通过浸提液的细胞毒性实验、细胞增殖实验、活死细胞染色实验对其生物相容性进行初步验证。
浸提液在前三天的细胞毒性实验结果如图13所示，不同醛胺比、不同CG投料量的水凝胶组在第1、2、3天细胞存活率均大于85％。但醛胺比5:1组的细胞存活率在第3天略有降低。随着培养时间的延长，细胞数量与对照组细胞呈现相近的增殖趋势。在不同CG投料组中，CG2、CG3、CG4、CG0在1、4、7天里细胞增殖数目组间未见明显差异。CG4组在第7天吸光度(OD)值较空白组偏低。而在不同醛胺比分组中，5:1、4:1、3:1与空白组相比，细胞增殖速度略有减缓。
因此可以认为，该水凝具有良好的生物相容性，可不影响细胞增殖与活力。其中在醛胺比为5:1、4:1、3:1组表现出相对于空白组增殖速度减低的趋势，可能与MASA氧化过程中产生的α，β-不饱和醛类有关，但这种小分子醛可通过MASA制备后充分透析得以除去。
通过水凝胶表面的活死细胞染色，结果如图14所示:各组水凝胶表面细胞随着培养时间延长，密度逐渐升高，水凝胶为呈现出对细胞明显的抑制生长作用。因此可以认为，该水凝胶具有良好的生物相容性，有望安全无毒地运用于体内。
(3)体外抑菌实验
为充分表征水凝胶的抗菌活性，本申请主要通过抑菌效率、稀释涂布平板计数、活死细菌染色、扫描电镜观察细菌形貌、Transwell小室模拟水凝胶阻隔细菌下行效应进行实验。结果分析如下：
采用菌落计数法与吸光度法评估该水凝胶的抑菌效率，结果如图15、图16所示。水凝胶对金黄色葡萄球菌、变形链球菌、伴放线放线杆菌均呈现出良好的抑菌效果，抑菌效率均达到80％以上。稀释涂布平板结果显示，与空白组相比，该水凝胶各组的菌落数目均明显减少。调整稀释倍数对细菌进行计数，发现不同醛胺比、不同CG的水凝胶之间金黄色葡萄球菌、伴放线放线杆菌细菌密度无明显差异。而在变形链球菌中发现，MASA投料、CG投料可能对提高水凝胶对变形链球菌的抑菌效果有促进作用。掺铜水凝胶与不掺铜组相比，金黄色葡萄球菌、变形链球菌的密度明显降低，这也提示了铜离子在抗金葡菌、变形链球菌中发挥的促进功效。
综合上述结果表明，该水凝胶抗菌机制丰富，可对金黄色葡萄球菌、变形链球菌、伴放线放线杆菌发挥明显的抑菌作用。
将细菌种植于水凝胶表面，并通过活死细菌染色观察水凝胶表面的活细菌、死细菌荧光强度与密度，利用扫描电镜观察表面粘附细菌的密度与形态。
扫描电镜结果如图17显示，健康状态下金黄色葡萄球菌成团状球型，接触水凝胶表面后表面皱缩成团。变形链球菌为链球状或短棒状，镜下表面较为光滑平整，接触水凝胶表面后可见细菌表面皱缩。伴放线放线杆菌镜下成为杆状，可多个菌聚集成团。接触水凝胶表面后见聚集的杆状细菌裂解，结构难以分辨。
活死细菌染色结果如图18显示，各组该水凝胶表面活细菌数量明显低于BHI-琼脂凝胶。不同醛胺比间5:1-CG4、4:1-CG4、3:1-CG4表面荧光强度无明显区别。5:1-CG0、5:1-CG0Cu0表面活细菌较其余组明显增多，且5:1-CG4组的活细菌绿色荧光强度明显低于4:1-CG4、3:1-CG4组。
上述结果均提示MASA、CG、铜离子在水凝胶体系中发挥着抑菌作用。
为验证该水凝胶的物理化学协同阻隔作用，本申请通过在体外建立模拟细菌下行入侵的Transwell三维系统，发现该水凝胶涂层后在底部富营养的培养基中未发现活/死细菌的荧光信号。尽管材料孔径约为50-150μm，该孔径远大于细菌的尺寸大小，理论上细菌可通过该水凝胶内部孔隙到达底层富营养的培养基环境中。因此可以认为，该材料的阻隔作用可能主要与其内部丰富的抗菌效果有关，即细菌在进入内部时由于MASA、CG、铜离子协同抗菌，使其在内部即已失活，随后在该水凝胶丰富的保水能力下使其固定于内部而无法继续向下入侵。
综上所述，本发明可有效提供一种可注射、自愈合、机械性能良好、具有一定粘接性能的抗菌活性水凝胶，其良好的生物相容性使其具有潜在的临床应用前景，有望运用于预防种植体周围软组织感染的发生。
上面列举一部分具体实施例对本发明进行说明，有必要在此指出的是以上具体实施例只用于对本发明作进一步的说明，不代表对本发明保护范围的限制。其他人根据本发明作出的一些非本质的修改和调整仍属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种多重交联可注射水凝胶的制备方法，其特征是包括以下步骤：
（1）没食子酸改性壳聚糖CG的制备
将壳聚糖CS溶于酸性水溶液中，搅拌溶解后，调节pH，得CS溶液；
将没食子酸GA溶解于无水乙醇，得GA溶液；
选取1-(3 -二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC和N-羟基琥珀酰亚胺NHS溶解于无水乙醇，得EDC- NHS混合液；
将GA溶液、EDC- NHS混合液加入搅拌中的CS溶液中，调节好pH值，在室温下搅拌反应，收集溶液经透析、冷冻干燥，得CG固体；
（2）多醛基海藻酸钠（MASA）的制备
将海藻酸钠磁搅拌分散于乙醇中，得海藻酸钠-无水乙醇悬浊液；
将高碘酸钠磁搅拌避光溶于蒸馏水中得到透明溶液，随后将其加入搅拌着的海藻酸钠-无水乙醇悬浊液中，室温避光搅拌后，加入乙二醇中和未反应的高碘酸钠，随后将溶液倒入剧烈搅拌下无水乙醇中，将混合液体离心，收集沉淀，经透析、冷冻干燥后获得MASA固体；
（3）多重交联可注射水凝胶的制备
将明胶、步骤（1）获得的没食子酸改性壳聚糖CG分别溶于水后，随后将明胶溶液与CG溶液混合，得明胶-CG混合溶液；
将步骤（2）获得的多醛基海藻酸钠MASA溶于硼砂溶液，待溶解后加入硫酸铜溶液混匀，得MASA-硫酸铜混合溶液，将MASA-硫酸铜混合溶液与明胶-CG混合溶液混匀，即制备得多重交联可注射水凝胶；
步骤（1）中所述没食子酸GA的羧基与所述壳聚糖CS的氨基的摩尔浓度比为1~3：1；
步骤（2）中所述高碘酸钠的用量为所述海藻酸钠总质量的80%，所述海藻酸钠的氧化度为40%。
2.根据权利要求1所述的多重交联可注射水凝胶的制备方法，其特征是：步骤（1）中所述酸性水溶液是浓度为0.1mol/L的稀盐酸，调节pH值为5.0~5.5；所述没食子酸GA的羧基、所述1-(3 -二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC与所述N-羟基琥珀酰亚胺NHS与的摩尔比为1：1：1。
3.根据权利要求1所述的多重交联可注射水凝胶的制备方法，其特征是：步骤（1）中将GA溶液、EDC- NHS混合液加入搅拌中的CS溶液中，调节好pH值为5.0~5.5，在室温下搅拌反应24h。
4.根据权利要求1所述的多重交联可注射水凝胶的制备方法，其特征是：步骤（2）中室温避光搅拌2小时。
5.根据权利要求1所述的多重交联可注射水凝胶的制备方法，其特征是：步骤（1）~（2）中透析采用透析袋，透析袋的截留分子量为3500 Da；透析时间为48~72小时。
6.根据权利要求1所述的多重交联可注射水凝胶的制备方法，其特征是：步骤（3）中所述明胶的浓度为0.15 g/mL，所述CG浓度为0.01g/mL；所述硼砂的浓度为0.1mol/L，所述多醛基海藻酸钠MASA的浓度为0.1g/mL。
7.根据权利要求1所述的多重交联可注射水凝胶的制备方法，其特征是：步骤（3）中所述明胶-CG混合溶液中所述明胶溶液与所述CG溶液的体积比为5：0~4，所述MASA-硫酸铜混合溶液中的MASA的醛基与所述明胶-CG混合溶液中的氨基的摩尔浓度比为1~5：1，进而制得不同CG含量、不同醛胺比的多重交联可注射水凝胶。
8.根据权利要求1所述的多重交联可注射水凝胶的制备方法，其特征是：步骤（3）中所述硫酸铜溶液的浓度为0.1mol/L，所述硫酸铜溶液中铜离子与所述没食子酸GA的摩尔比为3：1；步骤（3）中将MASA-硫酸铜混合溶液与明胶-CG混合溶液在37℃充分混匀，即制备得多重交联可注射水凝胶。
9.一种多重交联可注射水凝胶，其特征是采用权利要求1-8中任一项方法制备获得。
10.权利要求9所述的多重交联可注射水凝胶在制备具有可注射、湿粘接、抗菌、抗炎、抗氧化、自愈合、可降解、适宜力学性能与生物相容性以及促组织再生功效的种植体术后软组织封闭材料方面的应用。
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