CN115990285B - 多功能复合水凝胶及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

发明公开了一种多功能复合水凝胶及其制备方法与应用，包括以下原料：没食子酸、壳聚糖、葡聚糖。多功能复合水凝胶的制备方法，包括以下步骤：步骤一、制备没食子酸接枝壳聚糖；步骤二、制备醛基化葡聚糖；步骤三、将没食子酸接枝壳聚糖溶于质量分数为0.5%的乙酸溶液中，得第一溶液，将醛基化葡聚糖溶于磷酸缓冲盐溶液中，得第二溶液，将第一溶液与第二溶液混合即得到复合水凝胶。多功能复合水凝胶在促进伤口愈合方面的应用。本发明通过将没食子酸接枝在壳聚糖上，并与醛基化葡聚糖混合，通过席夫碱的化学交联反应制备抗菌抗氧化水凝胶。

Description

多功能复合水凝胶及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及医用敷料技术领域。更具体地说，本发明涉及一种多功能复合水凝胶及其制备方法与应用。

背景技术

细菌感染作为严重影响人类伤口愈合，全球每年有超千万的患者正在遭受细菌的侵害。抗生素作为细菌性疾病的克星为临床相关疾病的治疗开辟了全新的途径，挽救了无数患者。然而，由于抗生素的滥用或使用不当引发的细菌耐药性增加，严重影响抗生素的使用效率，导致医疗资源浪费所及临床高死亡率。因此，亟需开发全新的杀菌技术和抗菌材料消除或减缓耐药菌的出现。近年来，以抗菌材料为代表的新一代抗菌策略已经有望成为取代传统抗生素疗法的潜在手段。与单一方式相比通过结合多种杀菌手段的抗菌策略更有效、杀菌效率更高且不会或很少产生耐药菌。

在组织修复与再生过程中，其相对应的组织微环境过度表达的活性氧（ROS）严重影响受损组织的再生与重塑，引起组织生理环境紊乱，进而导致炎症性疾病的产生。因此，对受损组织部位过度表达的ROS进行及时有效地消除对于改善组织微环境的炎症水平促进组织部位的再生与修复具有十分重要的意义。

发明内容

本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。

本发明还有一个目的是提供一种多功能复合水凝胶，其通过将没食子酸接枝在壳聚糖上，并与醛基化葡聚糖混合，通过席夫碱的化学交联反应制备抗菌抗氧化水凝胶。

本发明还有另一个目的是提供一种多功能复合水凝胶的制备方法，其成胶方式温和、环保、无副产物产生，实施条件温和性能可调；

本发明还有另一个目的是提供一种多能复合水凝胶的应用，其通过改善抗菌抗氧化效果，实现促进伤口的愈合。

为了实现本发明的这些目的和其它优点，提供了一种多功能复合水凝胶，包括以下原料：没食子酸、壳聚糖、葡聚糖。

本发明还提供了一种多功能复合水凝胶的制备方法，包括以下步骤：

步骤一、制备没食子酸接枝壳聚糖；

步骤二、制备醛基化葡聚糖；

步骤三、将没食子酸接枝壳聚糖溶于质量分数为0.5%的乙酸溶液中，得第一溶液，将醛基化葡聚糖溶于磷酸缓冲盐溶液中，得第二溶液，将第一溶液与第二溶液混合即得到复合水凝胶。

优选的是，磷酸缓冲盐溶液的pH值为7.4。

优选的是，醛基化葡聚糖与没食子酸接枝壳聚糖的质量比为1:0.5~1.5，醛基化葡聚糖与磷酸缓冲盐溶液的质量体积比为1:40~60，没食子酸接枝壳聚糖与乙酸溶液的体积比为1:40~60。

优选的是，第一溶液与第二溶液的体积比为2~4:1。

优选的是，制备没食子酸接枝壳聚糖的方法为：将没食子酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、 N-羟基琥珀酰亚胺加入至二甲亚砜中，在冰浴条件下搅拌0.5~2h，得到活化液；将壳聚糖溶解于醋酸溶液中，并调节pH值为5，再将活化液滴加至加入系中，并置于37℃条件下搅拌反应10~12h，反应结束后将体系转移至分子截断为7000Da的透析袋中，用去离子水透析2d，每天换水三次，将透析液冷冻并干燥，得到没食子酸接枝壳聚糖。

优选的是，壳聚糖与没食子酸的质量比为1:1~1.4，壳聚糖与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的质量比为1:1~1.4，壳聚糖与N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为1:0.5~0.9，壳聚糖与醋酸溶液的质量体积比为1:50~150。

优选的是，制备醛基化葡聚糖的方法为：将高碘酸钠加入葡聚糖溶液中，在室温下避光搅拌0.5~2h，加入乙二醇，将体系至于分子截断为7000Da的透析袋中并使用去离子水透析2d，最后将透析液冷冻干燥，得到醛基化葡聚糖，其中，高碘酸钠与葡聚糖的质量体积比为1:15~20。

本发明还提供了一种多功能复合水凝胶的应用，复合水凝胶在促进伤口愈合方面的应用。

本发明至少包括以下有益效果：

由于没食子酸具有优良的抗菌抗氧化性质，本发明通过将没食子酸接枝在壳聚糖上，并与醛基化葡聚糖混合，通过席夫碱的化学交联反应制备抗菌抗氧化水凝胶。由于该复合水凝胶成胶方式温和、环保、无副产物产生，实施条件温和性能可调，可广泛用于伤口修复、可穿戴设备及组织工程等生物医学领域。

本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

附图说明

图1为本发明其中一个技术方案所述的CSGA的红外及核磁表征谱图，其中，A为红外谱图，B为核磁谱图；

图2为本发明其中一个技术方案所述的Odex红外及核磁表征的红外及核磁表征谱图，其中，A为红外谱图，B为核磁谱图；

图3为本发明其中一个技术方案所述的CSGA和Ode混合前后的对照图；

图4为本发明其中一个技术方案所述的采用小瓶倾斜法测定凝胶时间的结果图；

图5为本发明其中一个技术方案所述的水凝胶的可注射性图；

图6为本发明其中一个技术方案所述的三种水凝胶（CSGA2/ODex1、CSGA3/ODex1、CSGA4/ODex1）的扫描电镜图；

图7为本发明其中一个技术方案所述的水凝胶黏附性及拉伸性能图；

图8为本发明其中一个技术方案所述的水凝胶的抗菌效果测定图；

图9为本发明其中一个技术方案所述的水凝胶的DPPH自由基清除能力图，其中，CS表示壳聚糖；

图10为本发明其中一个技术方案所述的水凝胶的ABTS自由基清除能力图，其中，CS表示壳聚糖；

图11为本发明其中一个技术方案所述的水凝胶的还原Fe³⁺能力测定图；

图12为本发明其中一个技术方案所述的荧光显微镜观察CSGA3/ODex1水凝胶对H₂O₂刺激L929产生 ROS 的影响；

图13为本发明其中一个技术方案所述的积分定量CSGA3/ODex1水凝胶对 H₂O₂刺激L929产生 ROS 的影响。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

实施例1

多功能复合水凝胶，包括以下原料：没食子酸、壳聚糖、葡聚糖。

包括以下步骤：

步骤一、制备没食子酸接枝壳聚糖（CSGA）；

步骤二、制备醛基化葡聚糖；

步骤三、将没食子酸接枝壳聚糖溶于质量分数为0.5%的乙酸溶液中，得第一溶液，将醛基化葡聚糖溶于磷酸缓冲盐溶液中，得第二溶液，将第一溶液与第二溶液混合即得到复合水凝胶。

实施例2

多功能复合水凝胶，包括以下原料：没食子酸、壳聚糖、葡聚糖。

包括以下步骤：

步骤一、制备没食子酸接枝壳聚糖（CSGA）；

步骤二、制备醛基化葡聚糖（ODex）；

步骤三、将没食子酸接枝壳聚糖溶于质量分数为0.5%的乙酸溶液中，得第一溶液，将醛基化葡聚糖溶于磷酸缓冲盐溶液中，得第二溶液，将第一溶液与第二溶液混合即得到复合水凝胶。

磷酸缓冲盐溶液的pH值为7.4。

醛基化葡聚糖与没食子酸接枝壳聚糖的质量比为1:0.5，醛基化葡聚糖与磷酸缓冲盐溶液的质量体积比为1:40（g/mL），没食子酸接枝壳聚糖与乙酸溶液的体积比为1:40（g/mL）。

第一溶液与第二溶液的体积比为2:1。

制备没食子酸接枝壳聚糖的方法为：将没食子酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、 N-羟基琥珀酰亚胺加入至二甲亚砜中，在冰浴条件下搅拌0.5h，得到活化液；将壳聚糖溶解于醋酸溶液（体积分数为1%）中，并调节pH值为5，再将活化液滴加至加入系中，并置于37℃条件下搅拌反应10h，反应结束后将体系转移至分子截断为7000Da的透析袋中，用去离子水透析2d，每天换水三次，将透析液冷冻并干燥，得到没食子酸接枝壳聚糖（CSGA）。

壳聚糖与没食子酸的质量比为1:1，壳聚糖与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的质量比为1:1，壳聚糖与N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为1:0.5，壳聚糖与醋酸溶液的质量体积比为1:50（g/mL），壳聚糖与二甲亚砜的质量体积比为1:7（g/mL）。

制备醛基化葡聚糖的方法为：将高碘酸钠加入葡聚糖溶液（10% w/v，阿拉丁）中，在室温下避光搅拌0.5h，加入乙二醇，将体系至于分子截断为7000Da的透析袋中并使用去离子水透析2d，最后将透析液冷冻干燥，得到醛基化葡聚糖（ODex），其中，高碘酸钠与葡聚糖的质量体积比为1:15（g/mL）。

复合水凝胶在促进伤口愈合方面的应用。

实施例3

多功能复合水凝胶，包括以下原料：没食子酸、壳聚糖、葡聚糖。

包括以下步骤：

步骤一、制备没食子酸接枝壳聚糖（CSGA）；

步骤二、制备醛基化葡聚糖（ODex）；

步骤三、将没食子酸接枝壳聚糖溶于质量分数为0.5%的乙酸溶液中，得第一溶液，将醛基化葡聚糖溶于磷酸缓冲盐溶液中，得第二溶液，将第一溶液与第二溶液混合即得到复合水凝胶。

磷酸缓冲盐溶液的pH值为7.4。

醛基化葡聚糖与没食子酸接枝壳聚糖的质量比为1: 1.5，醛基化葡聚糖与磷酸缓冲盐溶液的质量体积比为1: 60（g/mL），没食子酸接枝壳聚糖与乙酸溶液的体积比为1: 60（g/mL）。

第一溶液与第二溶液的体积比为4:1。

制备没食子酸接枝壳聚糖的方法为：将没食子酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、 N-羟基琥珀酰亚胺加入至二甲亚砜中，在冰浴条件下搅拌2h，得到活化液；将壳聚糖溶解于醋酸溶液（体积分数为1%）中，并调节pH值为5，再将活化液滴加至加入系中，并置于37℃条件下搅拌反应12h，反应结束后将体系转移至分子截断为7000Da的透析袋中，用去离子水透析2d，每天换水三次，将透析液冷冻并干燥，得到没食子酸接枝壳聚糖（CSGA）。

壳聚糖与没食子酸的质量比为1: 1.4，壳聚糖与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的质量比为1: 1.4，壳聚糖与N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为1: 0.9，壳聚糖与醋酸溶液的质量体积比为1: 150（g/mL），壳聚糖与二甲亚砜的质量体积比为1:7（g/mL）。

制备醛基化葡聚糖的方法为：将高碘酸钠加入葡聚糖溶液（10% w/v，阿拉丁）中，在室温下避光搅拌2h，加入乙二醇，将体系至于分子截断为7000Da的透析袋中并使用去离子水透析2d，最后将透析液冷冻干燥，得到醛基化葡聚糖（ODex），其中，高碘酸钠与葡聚糖的质量体积比为1: 20（g/mL）。

复合水凝胶在促进伤口愈合方面的应用。

实施例4

多功能复合水凝胶，包括以下原料：没食子酸、壳聚糖、葡聚糖。

包括以下步骤：

步骤一、制备没食子酸接枝壳聚糖（CSGA）；

步骤二、制备醛基化葡聚糖（ODex）；

步骤三、将没食子酸接枝壳聚糖溶于质量分数为0.5%的乙酸溶液中，得第一溶液，将醛基化葡聚糖溶于磷酸缓冲盐溶液中，得第二溶液，将第一溶液与第二溶液混合即得到复合水凝胶。

磷酸缓冲盐溶液的pH值为7.4。

醛基化葡聚糖与没食子酸接枝壳聚糖的质量比为1: 1，醛基化葡聚糖与磷酸缓冲盐溶液的质量体积比为1:50（g/mL），没食子酸接枝壳聚糖与乙酸溶液的体积比为1:50（g/mL）。

第一溶液与第二溶液的体积比为2:1。

制备没食子酸接枝壳聚糖的方法为：将没食子酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、 N-羟基琥珀酰亚胺加入至二甲亚砜中，在冰浴条件下搅拌1h，得到活化液；将壳聚糖溶解于醋酸溶液（体积分数为1%）中，并调节pH值为5，再将活化液滴加至加入系中，并置于37℃条件下搅拌反应11h，反应结束后将体系转移至分子截断为7000Da的透析袋中，用去离子水透析2d，每天换水三次，将透析液冷冻并干燥，得到没食子酸接枝壳聚糖（CSGA）。

壳聚糖与没食子酸的质量比为1: 1.1，壳聚糖与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的质量比为1: 1.2，壳聚糖与N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为1:0.7，壳聚糖与醋酸溶液的质量体积比为1g:100（g/mL），壳聚糖与二甲亚砜的质量体积比为1:7（g/mL）。

制备醛基化葡聚糖的方法为：将高碘酸钠加入葡聚糖溶液（10% w/v，阿拉丁）中，在室温下避光搅拌1h，加入乙二醇，将体系至于分子截断为7000Da的透析袋中并使用去离子水透析2d，最后将透析液冷冻干燥，得到醛基化葡聚糖（ODex），其中，高碘酸钠与葡聚糖的质量体积比为1:17（g/mL）。

复合水凝胶在促进伤口愈合方面的应用。

实施例5

多功能复合水凝胶，包括以下原料：没食子酸、壳聚糖、葡聚糖。

包括以下步骤：

步骤一、制备没食子酸接枝壳聚糖（CSGA）；

步骤二、制备醛基化葡聚糖（ODex）；

步骤三、将没食子酸接枝壳聚糖溶于质量分数为0.5%的乙酸溶液中，得第一溶液，将醛基化葡聚糖溶于磷酸缓冲盐溶液中，得第二溶液，将第一溶液与第二溶液混合即得到复合水凝胶。

磷酸缓冲盐溶液的pH值为7.4。

醛基化葡聚糖与没食子酸接枝壳聚糖的质量比为1: 1，醛基化葡聚糖与磷酸缓冲盐溶液的质量体积比为1:50（g/mL），没食子酸接枝壳聚糖与乙酸溶液的体积比为1:50（g/mL）。

第一溶液与第二溶液的体积比为3:1。

制备没食子酸接枝壳聚糖的方法为：将没食子酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、 N-羟基琥珀酰亚胺加入至二甲亚砜中，在冰浴条件下搅拌1h，得到活化液；将壳聚糖溶解于醋酸溶液（体积分数为1%）中，并调节pH值为5，再将活化液滴加至加入系中，并置于37℃条件下搅拌反应11h，反应结束后将体系转移至分子截断为7000Da的透析袋中，用去离子水透析2d，每天换水三次，将透析液冷冻并干燥，得到没食子酸接枝壳聚糖（CSGA）。

壳聚糖与没食子酸的质量比为1: 1.1，壳聚糖与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的质量比为1: 1.2，壳聚糖与N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为1:0.7，壳聚糖与醋酸溶液的质量体积比为1g:100（g/mL），壳聚糖与二甲亚砜的质量体积比为1:7（g/mL）。

制备醛基化葡聚糖的方法为：将高碘酸钠加入葡聚糖溶液（10% w/v，阿拉丁）中，在室温下避光搅拌1h，加入乙二醇，将体系至于分子截断为7000Da的透析袋中并使用去离子水透析2d，最后将透析液冷冻干燥，得到醛基化葡聚糖（ODex），其中，高碘酸钠与葡聚糖的质量体积比为1:17（g/mL）。

复合水凝胶在促进伤口愈合方面的应用。

实施例6

多功能复合水凝胶，包括以下原料：没食子酸、壳聚糖、葡聚糖。

包括以下步骤：

步骤一、制备没食子酸接枝壳聚糖（CSGA）；

步骤二、制备醛基化葡聚糖（ODex）；

步骤三、将没食子酸接枝壳聚糖溶于质量分数为0.5%的乙酸溶液中，得第一溶液，将醛基化葡聚糖溶于磷酸缓冲盐溶液中，得第二溶液，将第一溶液与第二溶液混合即得到复合水凝胶。

磷酸缓冲盐溶液的pH值为7.4。

醛基化葡聚糖与没食子酸接枝壳聚糖的质量比为1: 1，醛基化葡聚糖与磷酸缓冲盐溶液的质量体积比为1:50（g/mL），没食子酸接枝壳聚糖与乙酸溶液的体积比为1:50（g/mL）。

第一溶液与第二溶液的体积比为4:1。

制备没食子酸接枝壳聚糖的方法为：将没食子酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、 N-羟基琥珀酰亚胺加入至二甲亚砜中，在冰浴条件下搅拌1h，得到活化液；将壳聚糖溶解于醋酸溶液（体积分数为1%）中，并调节pH值为5，再将活化液滴加至加入系中，并置于37℃条件下搅拌反应11h，反应结束后将体系转移至分子截断为7000Da的透析袋中，用去离子水透析2d，每天换水三次，将透析液冷冻并干燥，得到没食子酸接枝壳聚糖（CSGA）。

壳聚糖与没食子酸的质量比为1: 1.1，壳聚糖与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的质量比为1: 1.2，壳聚糖与N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为1:0.7，壳聚糖与醋酸溶液的质量体积比为1g:100（g/mL），壳聚糖与二甲亚砜的质量体积比为1:7（g/mL）。

制备醛基化葡聚糖的方法为：将高碘酸钠加入葡聚糖溶液（10% w/v，阿拉丁）中，在室温下避光搅拌1h，加入乙二醇，将体系至于分子截断为7000Da的透析袋中并使用去离子水透析2d，最后将透析液冷冻干燥，得到醛基化葡聚糖（ODex），其中，高碘酸钠与葡聚糖的质量体积比为1:17（g/mL）。

复合水凝胶在促进伤口愈合方面的应用。

对比例1

采用实施例5的方法制备复合水凝胶，其中，不同的是用壳聚糖与醛基化葡聚糖制备水凝胶，具体步骤如下：

步骤一、制备醛基化葡聚糖；

步骤二、将壳聚糖溶于质量分数为0.5%的乙酸溶液中，得第三溶液，将醛基化葡聚糖溶于磷酸缓冲盐溶液中，得第二溶液，将第一溶液与第二溶液混合即得到复合水凝胶（CS/ODex）。

磷酸缓冲盐溶液的pH值为7.4。

醛基化葡聚糖与壳聚糖的质量比为1: 1，醛基化葡聚糖与磷酸缓冲盐溶液的质量体积比为1:50（g/mL），壳聚糖与乙酸溶液的体积比为1:50（g/mL）。

第三溶液与第二溶液的体积比为3:1。

制备醛基化葡聚糖的方法为：将高碘酸钠加入葡聚糖溶液（10% w/v，阿拉丁）中，在室温下避光搅拌1h，加入乙二醇，将体系至于分子截断为7000Da的透析袋中并使用去离子水透析2d，最后将透析液冷冻干燥，得到醛基化葡聚糖，其中，高碘酸钠与葡聚糖的质量体积比为1:17（g/mL）。

实验表征

采用实施例4、实施例5、实施例6的方法制备复合水凝胶，由实施例4获得的水凝胶命名为CSGA2/ODex1，由实施例5获得的的水凝胶命名为CSGA3/ODex1、由实施例6获得的水凝胶命名为CSGA4/ODex1；以实施例5为例，CSGA和ODex混合后基于席夫碱反应迅速形成凝胶态，有利于粘合伤口，CSGA和ODex混合前后的状态如图3所示；由对比例1的方法制备的水凝胶命名为CS/ODex。

1、结构表征

1.1 CSGA的红外及核磁表征

取实施例4获得的CSGA，在红外光谱中，与壳聚糖相比，CSGA的C=O拉伸酰胺I带明显移动到约1613 cm⁻¹；在GA中出现的许多尖锐峰在CSGA中消失；由于GA的芳香羟基的拉伸，在1538 cm⁻¹处出现了一个新的尖锐带，这验证了CSGA的成功合成如图1中A所示；

在核磁谱图中，7.0 ppm处的化学位移验证了CSGA中苯环的出现，如图1中B所示。

1.2 Odex红外及核磁表征

取实施例4获得的Odex，在红外光谱中，与葡聚糖相比，Odex的1730 cm⁻¹峰代表醛基的引入，这验证了葡聚糖的成功氧化，如图2中A所示；

在核磁谱图中，ODex在9.16 ppm处出现了一个新的共振峰，这也表示醛基的存在，如图2中B所示。

1.3 CSGA/ODex复合水凝胶表征

使用小瓶倾斜法测定凝胶时间，若倒转30 s不流动则认为形成凝胶，如图4所示；

采用注射针（27 G）考察了了CSGA3/ODex1水凝胶的可注射性，如图5所示，所制备的CSGA3/ODex1水凝胶能够顺利的通过27 G的注射针头，并书写了字母“BIRM”；

采用扫描电镜观察CSGA2/ODex1、CSGA3/ODex1、CSGA4/ODex1三种水凝胶的形貌，如图6所示，所有的水凝胶冻干后均具有多孔形貌；

将CSGA3/ODex1水凝胶置于手指关节上，通过弯曲指关节考察了水凝胶的黏附及拉伸性能，如图7所示。

2、CSGA/ODex复合水凝胶的抗菌效果测定

使用菌落数法定量表征CSGA/ODex的对铜绿假单胞菌（P.aeru）及大肠杆菌（E. coli）的抗菌作用。P.aeru和E. coli与Luria–Bertani（LB）在摇床（200 rpm，37℃）中培养复苏。将细菌重新悬浮在PBS中，浓度为1×10⁶CFU mL−1。然后，在24孔板中制备水凝胶。将细菌悬浮液（20μL，106 CFU/mL）添加到水凝胶（CSGA2/ODex1、CSGA3/ODex1、CSGA4/ODex1、CS/ODex，共四种水凝胶）表面。接种后，将水凝胶在37°C下孵育2小时。然后，将无菌PBS（1ml）添加到24孔板中，以重新悬浮细菌并搅拌细菌悬浮液，直至充分混合。将等量的细菌悬浮液分散在PBS（磷酸缓冲盐溶液，pH值为7.4）中作为阴性对照组，随后，将混合细菌悬浮液（100μL）均匀接种在含有固体培养基的培养皿中。在37°C下孵育18小时后，计数琼脂平板上的菌落数。每组重复3次。

与阴性对照组及CS/ODex水凝胶相比，CSGA2/ODex1、CSGA3/ODex1、CSGA4/ODex1组中的菌落数大幅减少，说明经过GA改性后的水凝胶具有良好的抗菌性，结果如图8。

3、CSGA/ODex复合水凝胶的抗氧化能力的测定

3.1 DPPH自由基清除能力

依次取50μL样品溶液，200μLDPPH甲醇溶液（0.4 mM）加入96孔板中，避光静置30min使二者充分共混。采用全波长酶标仪测定其在517 nm 处的吸光值。DPPH自由基清除能力（ROS scavenging）的计算公式如下：

ROS scavenging=(1-(A_S1-A_S2)/A_W)×100%

其中：A_S1表示实验组的吸光值；A_S2表示以甲醇代替DPPH甲醇溶液所测的干扰吸光值；A_W表示以超纯水代替样品溶液所测的背景干扰吸光值。

结果如图9所示，通过经典的 DPPH自由基清除法，验证了CSGA/ODex对DPPH自由基的清除能力。与单独的壳聚糖溶液相比，接枝没食子酸后壳聚糖/葡聚糖水凝胶的DPPH自由基清除能力大幅提升。

3.2 ABTS自由基清除能力

ABTS 自由基是通过7 mM ABTS 溶液和2.45 mM 过硫酸钾在黑暗中反应16小时产生的。采用无水乙醇稀释法，在734 nm 处获得了吸光度为0.9的工作溶液。然后将200 μL水凝胶与2.8 mL 工作溶液在黑暗中共孵育30 min。OD_control和OD_gel表示与水凝胶孵育前后工作溶液的吸光度。用以下公式计算 ABTS 清除自由基的效果：

SA%=OD_gel/OD_control×100

其中 SA 表示 ABTS 自由基的清除作用。OD_ge和OD_control分别表示水凝胶和对照组在734nm 处的吸光度。

结果如图10所示，；通过经典的ABTS自由基清除法，验证了CSGA/ODex对ABTS自由基的清除能力。与单独的壳聚糖溶液相比，接枝没食子酸后壳聚糖/葡聚糖水凝胶的ABTS自由基清除能力大幅提升，水凝胶中CSGA的浓度越高，还原能力越强。

3.3还原Fe³⁺能力测定

没食子酸具有一定的还原性，能够将铁氰化钾（K₃Fe（CN）6）中的Fe³⁺还原成Fe²⁺，形成在 700 nm处有特定吸收波长的有色络合物，因此可通过吸光值的变化来衡量CSGA/ODex的还原能力。具体操作如下：A. 在1mL不同浓度的样品液中依次加入1 mL PBS缓冲液（pH=6.6，0.2 M）、2.5 mL K₃Fe（CN）₆（1%，w/v）溶液，待充分混合后在50℃下共孵育20 min。B.向上述溶液中各加入2.5 mL CCl₃COOH（10%，w/v），在转速为3000 rpm下离心10 min后，取2.5mL上清液加入等体积的超纯水中，最后加入0.5 mL FeCl₃（0.1%，w/v），室温下共孵育10min后采用全波长酶标仪测定其在700 nm处的吸光值。还原能力（Reducibility）的计算公式如下：

Reducibility=A_S1-A_S2

其中：A_S1表示实验组的吸光值；A_S2表示样品本身的吸光值（以超纯水代替FeCl₃溶液）。

结果如图11所示，通过铁氰化钾还原法验证了CSGA/ODex具有很强的还原能力，其还原能力与水凝胶的浓度成正比。

3.4用 L929细胞考察了CSGA3/ODex水凝胶对胞内ROS的清除能力

将L929细胞接种在24孔板（2×10⁴个细胞/孔）中，并在补充有10%FBS的DMEM培养基中培养24小时。然后将细胞用1 mM H₂O₂处理3小时，同时加入或不加入10 μL冻干的CSGA3/ODex1水凝胶作为实验组。以不加H₂O₂的细胞作为正常组。随后，吸出培养基和水凝胶，用PBS小心地洗涤细胞2次。将细胞与10 µM DCFH-DA（荧光探针）溶液在37°C的黑暗中孵育1小时，并通过荧光显微镜观察荧光强度，结果如图12和13所示；

由图12和图13可以看出，正常L929细胞中ROS的表达量很低，绿色荧光通道下几乎观察不到细胞，其绿色荧光值积分结果为1.18±0.21；使用H₂O₂对L929细胞进行刺激后，绿色荧光通道下观察到大量带有绿色荧光的细胞，说明细胞分泌了大量的ROS，其绿色荧光值积分结果为7.39±0.42；使用CSGA3/ODex水凝胶对L929处理后，细胞分泌的ROS显著减少，绿色荧光通道下观察到带有绿色荧光的细胞大量减少，其绿色荧光值积分结果为1.44±0.46。说明CSGA3/ODex水凝胶有效的清除了胞内ROS。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的实施例。

Claims (4)

1.多功能复合水凝胶的应用，其特征在于，复合水凝胶在促进伤口愈合方面的应用；

其中，复合水凝胶的制备方法包括以下步骤：

步骤一、制备没食子酸接枝壳聚糖；

步骤二、制备醛基化葡聚糖；

步骤三、将没食子酸接枝壳聚糖溶于质量分数为0.5%的乙酸溶液中，得第一溶液，将醛基化葡聚糖溶于磷酸缓冲盐溶液中，得第二溶液，将第一溶液与第二溶液混合即得到复合水凝胶；

磷酸缓冲盐溶液的pH值为7.4；

制备没食子酸接枝壳聚糖的方法为：将没食子酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、 N-羟基琥珀酰亚胺加入至二甲亚砜中，在冰浴条件下搅拌0.5~2h，得到活化液；将壳聚糖溶解于醋酸溶液中，并调节pH值为5，再将活化液滴加至加入系中，并置于37℃条件下搅拌反应10~12h，反应结束后将体系转移至分子截断为7000Da的透析袋中，用去离子水透析2d，每天换水三次，将透析液冷冻并干燥，得到没食子酸接枝壳聚糖；

制备醛基化葡聚糖的方法为：将高碘酸钠加入葡聚糖溶液中，在室温下避光搅拌0.5~2h，加入乙二醇，将体系至于分子截断为7000Da的透析袋中并使用去离子水透析2d，最后将透析液冷冻干燥，得到醛基化葡聚糖，其中，高碘酸钠与葡聚糖的质量体积比为1:15~20。

2.如权利要求1所述的多功能复合水凝胶的应用，其特征在于，醛基化葡聚糖与没食子酸接枝壳聚糖的质量比为1:0.5~1.5，醛基化葡聚糖与磷酸缓冲盐溶液的质量体积比为1:40~60，没食子酸接枝壳聚糖与乙酸溶液的体积比为1:40~60。

3.如权利要求1所述的多功能复合水凝胶的应用，其特征在于，第一溶液与第二溶液的体积比为2~4:1。

4.如权利要求1所述的多功能复合水凝胶的应用，其特征在于，壳聚糖与没食子酸的质量比为1:1~1.4，壳聚糖与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的质量比为1:1~1.4，壳聚糖与N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为1:0.5~0.9，壳聚糖与醋酸溶液的质量体积比为1:50~150。

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