JP2010526766A - 骨関連障害を処置するためのスクレロスチン結合パートナーのモジュレーター - Google Patents

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Abstract

本発明は、スクレロスチン関連障害、例えば、骨粗鬆症および硬結性骨化症、ならびにスクレロスチン関連障害、例えば、癌および心血管障害の処置、改善、および診断のためのスクレロスチン:スクレロスチン結合パートナー相互作用のモジュレーターの使用に関する。本発明はまた、スクレロスチン関連障害の処置、改善、および診断のためのスクレロスチン結合パートナー模倣剤の使用に関する。スクレロスチン:スクレロスチン結合パートナー相互作用のモジュレーターの同定のための、ならびにその結果生じたシグナル伝達のためのアッセイを、また、提供する。

Description

発明の背景
骨粗鬆症(OP)は、低骨量および骨組織の微構造劣化(その結果、骨脆弱性および骨折に対する感受性の増加を有する)により特徴づけられる全身性の骨障害である。50歳の女性は、閉経後の生涯にわたって、50%の可能性で骨粗鬆症性骨折を患うことが概算されている。骨粗鬆症は、原発性障害、例えば、閉経後もしくは年齢関連OP、および疾患状態もしくは薬剤に伴って起こる続発性状態を含み多面的である。低骨塩密度(BMD)は、OPのための最も重要なリスク因子である。それは、思春期における減少したピーク骨獲得または加齢の間の骨量減少から生じる。
骨量の減少は、促進された骨吸収または骨形成の欠陥の結果として生じ得て、2つの過程は、通常、成人期に連結される。エストロゲン欠損および促進された骨吸収の結果としての素早い骨量減少は、OPの最も頻度の高い原因であるが、閉経後早期の女性全体の約4分の1のみが、高度の骨ターンオーバー骨粗鬆症を患う。したがって、骨粗鬆症は、主に、遺伝学的な要因により引き起こされる。いくつかの系統解析は、高められた骨ターンオーバーまたは低骨量に関与する遺伝子を同定したが、単一遺伝子の欠損が、例えば、最も高頻度の疾患の形態である閉経後OPを説明しないのは、明らかである(Ralston SH. (2003) Curr. Opin. Pharmacol. 3(3):286)。
現在の骨粗鬆症の有病率は、主要な市場で、50.9百万人の患者数であり、2010年までには、55.8百万人、2015年までには、61.5百万人まで上昇すると予期されている。人口の高齢化による着実な増加が存在する。
OPの処置のための最新の治療は、さらなる骨減少を予防するために、骨吸収を阻害することに基づく。この理由は、骨吸収(分解)細胞-破骨細胞-が、骨に対して特異的に高度に特殊化した細胞であり、その動員および活性化の重要な機構が同定されたからである。破骨細胞は、造血起源の細胞であり、骨髄の幹細胞から生じ; 成熟した機能的破骨細胞は、多核細胞であり、これらの特殊化した細胞が吸収できる石灰化した骨表面に局在する。
新規骨マトリクスは、間葉性系統から生じる骨芽細胞により形成される。これらの骨形成細胞は、3通りの推定上の運命を有し: それらは、アポトーシス(細胞死)を受け、表層細胞(石灰化した骨表面上の扁平細胞)になり、または骨マトリクスに取り込まれる。取り込まれた終末分化細胞は、骨細胞と呼ばれ、最も豊富な骨細胞である。それらは、石灰化した骨マトリクスに、規則正しい間隔で埋め込まれ、樹状突起と呼ばれる長い細胞過程を介して、相互に連結され、それは、隣の骨細胞およびギャップ結合による表面上の骨細胞に結合する。それらは、その元にある分子機構については完全に理解されていないが、骨モデリングおよびリモデリングの重要なレギュレーターであると考えられている。
骨粗鬆症は、減少した骨量による骨折のリスクの増加と定義されていたが、現在利用可能な骨障害の処置のいずれもが、実質的に、成人の骨密度を増加させることができない。現在の骨粗鬆症の治療原理は、吸収阻害的であり、新規脊椎骨折のリスクを約35％の幅で60%まで減少させることができる(Haeuselmann HJ, Rizzoli R (2003) Osteoporos. Int.; 14:2; Chesnut CH, III, et al (2004). J Bone Min Res; 19 (8))。股関節骨折のリスクは、1つの吸収阻害治療原理によってのみ減少し、骨折リスクの約50%の減少を生じる。該分野での長きにわたり満たされていない要求は、骨減少症および骨粗鬆症のリスクがある成人で、特に、手根骨、脊柱骨および股関節骨における骨密度を増加させることが可能な薬剤により示される。したがって、OP患者は、診断の時点で、すでにかなりの量の骨を失っているので、新たな骨形成を刺激することにより骨量を増加させる薬剤を開発する必要があり、それは、50%以上まで骨折のリスクを減少させることができる。
逆に、骨過成長および異常な高骨塩密度(BMD)と関連するさまざまな骨障害が存在し、そこでは、骨形成および沈着が吸収を超え、潜在的に、病的に増加した骨量および強度を生じる。例えば、硬結性骨化症は、ヘテロ接合保因者でさえ、増加した骨量を示す劣性疾患である。同様に、Simpson-Golabi-Behmel症候群(SGBS)を患う対象は、典型的には、太った、頑丈な外見を有し、拡大した顔面骨(例えば、突顎および拡大した鼻梁を生じる)により特徴づけられる。同様に、Van Buchem症候群は、骨の過成長により特徴づけられる常染色体劣性疾患である。この疾患は、拡大顎骨として最も頻繁に見出される対称的に増加した骨の肥厚、ならびに頭蓋骨、肋骨、長骨の骨幹、および手足の長管骨の拡大により特徴づけられ、増加した皮質骨密度を生じる。頭蓋骨の増加した肥厚の臨床的な結果は、難聴を引き起こす顔面神経麻痺、視覚の問題、神経学的苦痛、および視神経萎縮の結果としての非常に稀な盲目を含む。
本発明は、異常な骨塩密度(BMD)に関連する障害の組成物、処置法、および診断法を提供することを目的とする。
発明の要約
本発明は、異常な骨塩密度障害および/またはスクレロスチン(sclerostin)関連障害の症状を処置し、改善し、それらを保護する方法であって、スクレロスチン結合パートナー相互作用のモジュレーター、例えば、スクレロスチン:スクレロスチン結合パートナー相互作用のモジュレーターを含む組成物を投与することを含む方法を提供する。該モジュレーターは、(i) スクレロスチン; (ii) スクレロスチン結合パートナー; (iii) スクレロスチン:スクレロスチン結合パートナー相互作用により生み出された新規部位(例えば、新しく生み出された抗原決定基)、または(iv) これらのいずれかを含むタンパク質複合体に対する抗体、抗体様スカホールド、小分子、キメラもしくは融合タンパク質、ペプチド、模倣剤、または阻害ヌクレオチド(例えば、RNAi)であり得る。該組成物は、本明細書に記載したとおり、“医薬組成物”を含む。“スクレロスチン関連障害”、“異常な骨塩密度障害”および“スクレロスチン結合パートナー”は、さらに、本明細書に記載した用語である。
例えば、本発明は、スクレロスチン:ALPL、スクレロスチン:Frem2またはスクレロスチン:LRP4相互作用のモジュレーターを投与することにより、スクレロスチン関連障害(例えば、骨粗鬆症または硬結性骨化症)および/または異常な骨塩密度障害を処置する方法を提供するが、これらに限定されない。
本発明はさらに、スクレロスチン:スクレロスチン結合パートナー相互作用を調節することができる薬剤を同定する方法を提供し、該方法は、該薬剤により引き起こされるスクレロスチンとスクレロスチン結合パートナーの相互作用の変化を測定することを含む。好ましくは、該方法は、
a) スクレロスチンとスクレロスチン結合パートナーの相互作用を許容する条件下、試験薬剤の存在および非存在で、スクレロスチンをスクレロスチン結合パートナーと接触させ; そして
b) 該試験薬剤の存在および非存在で、スクレロスチンとスクレロスチン結合パートナーの相互作用を測定する
工程を含み、
ここで、
(i) 試験薬剤の非存在下での相互作用と比較して、試験薬剤の存在下でのスクレロスチン:スクレロスチン結合パートナー相互作用の減少が、該薬剤を、スクレロスチン:スクレロスチン結合パートナー相互作用のアンタゴニストとして同定し、(ii) 試験薬剤の非存在下での相互作用と比較して、試験薬剤の存在下での相互作用の増加が、該薬剤を、スクレロスチン:スクレロスチン結合パートナー相互作用のアゴニストとして同定する方法を含む。
例えば、本発明は、スクレロスチン:LRP4相互作用を調節することができる薬剤を同定するための方法を提供し、該方法は、該薬剤により引き起こされるスクレロスチンのLRP4への結合の変化を測定することを含むが、これらに限定されない。1つの態様では、試験薬剤は、直接または間接的に、LRP4に結合し、それにより、スクレロスチン:LRP4相互作用を調節する。1つの態様では、試験薬剤は、小分子である。他の態様では、試験薬剤は、阻害ヌクレオチドである。また他の態様では、試験薬剤は、LRP4タンパク質を含む融合タンパク質である。
スクレロスチン:スクレロスチン結合パートナー相互作用、スクレロスチンもしくはスクレロスチン結合パートナータンパク質活性、および/またはスクレロスチン経路活性の変化は、PCR、Taqman PCR、ファージディスプレイ系、ゲル電気泳動、酵母ツーハイブリッドアッセイ、レポーター遺伝子アッセイ、ノザンもしくはウエスタン解析、免疫組織化学、慣用的なシンチレーションカメラ、ガンマカメラ、直線スキャナー、PETスキャナー、SPECTスキャナー、MRIスキャナー、NMRスキャナー、またはX線装置により測定し得る。スクレロスチンもしくはスクレロスチン結合パートナータンパク質活性、および/またはスクレロスチン経路活性の変化は、スクレロスチン:スクレロスチン結合パートナー間の相互作用の変化を検出することにより、スクレロスチンまたはスクレロスチン結合パートナーの発現もしくはタンパク質レベルの変化を検出することにより、またはスクレロスチン経路における1個またはそれ以上のタンパク質の発現もしくはタンパク質レベルの変化を検出することにより、好ましくは、Wntシグナル伝達経路の変化を検出することにより検出し得る。上記したことが検出され得る細胞は、骨、間葉性、腎臓(例えば、HEK)、もしくは造血由来の細胞であり得るか、培養細胞であり得るか、またはトランスジェニック生物から得られた、もしくはその内部に存在する細胞であり得る。そのようなトランスジェニック生物は、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ウシまたは霊長類を含むが、これらに限定されない。
本発明はまた、スクレロスチン:スクレロスチン結合パートナー相互作用を調節することができる薬剤を同定する方法を提供し、該方法は、該薬剤の存在下で、スクレロスチン:スクレロスチン結合パートナー相互作用により誘導されるシグナル伝達応答を測定し、それを、該薬剤の非存在下で、スクレロスチン:スクレロスチン結合パートナー相互作用により誘導されるシグナル伝達応答と比較することを含む。好ましくは、該方法は、
a) スクレロスチンとスクレロスチン結合パートナーの相互作用を許容する条件下、試験薬剤の存在および非存在で、スクレロスチンをスクレロスチン結合パートナーと接触させ; そして
b) スクレロスチン:スクレロスチン結合パートナー相互作用により誘導されるシグナル伝達応答もしくは酵素学的応答を測定する
工程を含み、
ここで、試験薬剤の非存在下での応答と比較して、少なくとも10%、20%または30%の試験薬剤の存在下での応答の変化は、該試験薬剤がスクレロスチン:スクレロスチン結合パートナー相互作用を調節することができることを示す方法を含む。好ましくは、工程b)で測定されるシグナル伝達応答は、Wntシグナル伝達応答である。
試験薬剤の非存在下での応答と比較して、試験薬剤の存在下での、少なくとも、10%、20%または30%のシグナル伝達応答の増加は、該試験薬剤を、スクレロスチン:スクレロスチン結合パートナー相互作用のアゴニストとして同定する。試験薬剤の非存在下での応答と比較して、試験薬剤の存在下での、少なくとも、10%、20%または30%のシグナル伝達応答の減少は、該試験薬剤を、スクレロスチン:スクレロスチン結合パートナー相互作用のアンタゴニストとして同定する。
例えば、本発明は、スクレロスチン:LRP4相互作用を調節することができる薬剤を同定する方法を提供し、該方法は、該薬剤の存在下で、スクレロスチン:LRP4相互作用により誘導されるシグナル伝達応答を測定し、それを、該薬剤の非存在下で、スクレロスチン:LRP4相互作用により誘導されるシグナル伝達応答と比較することを含むが、これらに限定されない。1つの態様では、試験薬剤は、LRP4に直接または間接的に結合し、それにより、スクレロスチン:LRP4相互作用を調節する。1つの態様では、試験薬剤は、小分子である。他の態様では、試験薬剤は、阻害ヌクレオチドである。
また、本発明は、上記した方法により同定したスクレロスチン:スクレロスチン結合パートナー相互作用を調節することができる薬剤を含む組成物を提供する。該組成物は、本明細書に記載したとおりの“医薬組成物”を含む。
スクレロスチン結合パートナーを調節することができる好ましい薬剤は、該スクレロスチン結合パートナーに特異的に結合する抗体もしくは抗体様スカホールドまたは該抗体または該抗体様スカホールドの抗原結合部分を含む機能性タンパク質である。
本発明はまた、対象のスクレロスチン関連障害および/または異常な骨塩密度障害、またはスクレロスチン関連障害および/または異常な骨塩密度障害に対する素因を診断する方法であって、
a) 該対象内のスクレロスチン:スクレロスチン結合パートナー相互作用を測定し、そして
b) 工程a)の該相互作用と健常な個体でのスクレロスチン:スクレロスチン結合パートナー相互作用を比較する工程を含み、
差異が、該対象のスクレロスチン関連障害またはそれらに対する素因を示す方法を提供する。
例えば、本発明は、
a) 該対象内のスクレロスチン:LRP4結合を測定し、そして
b) 工程a)の結合と健常な個体(すなわち、硬結性骨化症を患っていないか、もしくはそれに対する素因がない個体)でのスクレロスチン:LRP4結合を比較すること
(ここで、差異が、該対象の骨粗鬆症もしくは硬結性骨化症またはそれらに対する素因を示す)
により、対象の骨粗鬆症もしくは硬結性骨化症、またはそれらに対する素因を診断する方法を提供する。
本発明は、スクレロスチン:スクレロスチン結合パートナー相互作用と同様の、類似の、または改善された機能的効果を有するスクレロスチン結合パートナー模倣剤を同定するための方法であって、候補模倣剤によるスクレロスチンとの相互作用を測定することを含む方法を提供する。好ましくは、該方法は、
a) スクレロスチンと候補模倣剤の相互作用を許容する条件下、スクレロスチンを候補模倣剤と接触させ; そして
b) スクレロスチンと模倣剤の相互作用を測定すること
を含み、
ここで、本明細書に記載したさまざまなスクレロスチン:スクレロスチン結合パートナー相互作用のために観察されるものの少なくとも10%、20%または30%での相互作用が、候補模倣剤を本発明のスクレロスチン結合パートナー模倣剤として特徴付ける。
さらに本発明は、スクレロスチン:スクレロスチン結合パートナー相互作用と同様の、類似の、または改善された機能的効果を有するスクレロスチン結合パートナー模倣剤を同定するための方法であって、スクレロスチン-模倣剤相互作用により誘導されるシグナル伝達応答を測定し、それを、本明細書に記載したスクレロスチン:スクレロスチン結合パートナー相互作用により誘導されるシグナル伝達応答と比較することを含む方法を提供する。好ましくは、該方法は、
a) スクレロスチンと候補模倣剤の相互作用を許容する条件下、スクレロスチンを候補模倣剤と接触させ; そして
b) スクレロスチン-模倣剤相互作用により誘導されるシグナル伝達応答を測定すること
を含み、
ここで、本明細書に記載したさまざまなスクレロスチン:スクレロスチン結合パートナー相互作用のために観察されるものの少なくとも10%、20%または30%でのシグナル伝達応答が、候補模倣剤を本発明のスクレロスチン結合パートナー模倣剤として特徴付ける。
例えば、本発明は、通常の生理学的な条件下で、LRP4とスクレロスチン間の相互作用のそれらと同様の、類似のまたは改善された機能効果を有するLRP4模倣剤を同定する方法を提供するが、これらに限定されない。該模倣剤は、本明細書に記載した方法を用いることにより同定し得る。
本発明はさらに、タンパク質発現を調節することができる、例えば、ほ乳動物細胞内で、スクレロスチン結合パートナータンパク質発現を減少させることができるsiRNAを提供する。
また本発明は、上記したとおりの方法により同定した、スクレロスチン結合パートナー模倣剤を含む組成物を提供する。該組成物は、本明細書に記載したとおり、“医薬組成物”を含む。
本発明は、本明細書に記載したスクレロスチン:スクレロスチン結合パートナー相互作用と同様の、類似の、または改善された機能的効果を有する、スクレロスチン結合パートナー模倣剤を含んだ組成物を投与することを含む、スクレロスチン関連障害および/または異常な骨塩密度障害の症状を処置し、改善し、そしてそれらを保護する方法を提供する。該模倣剤は、上記の(および、さらに本明細書で詳述した)方法を用いることにより、容易に同定し得る。ある態様では、該模倣剤は、該スクレロスチン結合パートナーに対する抗体または抗体様スカホールドまたはその断片(例えば、抗LRP4抗体または断片)であり得る。
本発明はさらに、対象のスクレロスチン関連障害および/または異常な骨塩密度障害に対する障害もしくは素因を診断する方法であって、
(a) 該対象内のスクレロスチン結合パートナー遺伝子のヌクレオチド配列を取得し、そして
b) それを、健常な対象のそれと比較する工程を含み、
ここで、各スクレロスチン結合パートナー遺伝子における突然変異が、スクレロスチン関連障害および/もしくは異常な骨塩密度障害またはそれらに対する素因を示す方法を提供する。
本発明はまた、スクレロスチンとスクレロスチン結合パートナー間の相互作用を調節する方法を提供する。非限定的な例では、本発明は、スクレロスチン経路活性を調節するか、またはスクレロスチンもしくはスクレロスチン結合パートナータンパク質レベルを調節するために、スクレロスチンとスクレロスチン結合パートナー間の相互作用を調節する方法を含む。
本発明は、本明細書に詳述したスクレロスチンまたはスクレロスチン結合パートナーのいずれかの天然配列に限定されない。さらに、本発明の方法および組成物は、本明細書に詳述したスクレロスチンまたはスクレロスチン結合パートナーのいずれかの誘導体およびスプライス変異形を包含する。部分または断片を使用するときでさえ、これらの部分または断片は、改変されたアミノ酸配列を有し得る。
本発明はさらに、スクレロスチン結合パートナーの断片を含む可溶性ポリペプチドを提供し、ここで、該可溶性ポリペプチドは、スクレロスチン結合パートナー、例えば、LRP4、またはスクレロスチンに特異的に結合する。1つの態様では、該可溶性ポリペプチドは、LRP4の細胞外部分、好ましくは、配列番号3からなるポリペプチド(LRP4 aa 21-1763)からなる。
本発明はまた、抗体または抗体様スカホールドまたは該抗体または該抗体様スカホールドの抗原結合部分を含む機能性タンパク質を提供し、ここで、該抗体または抗体様スカホールドまたは機能性タンパク質は、スクレロスチン結合パートナーに特異的に結合する。1つの態様では、該抗体または抗体様スカホールドまたは機能性タンパク質は、スクレロスチンの該スクレロスチン結合パートナーへの結合を阻害する。他の態様では、該抗体または抗体様スカホールドまたは機能性タンパク質は、細胞に基づくアッセイで測定したとおり、Wntシグナル伝達経路を調節する。1つの関連する態様では、該抗体または抗体様スカホールドまたは機能性タンパク質は、LRP4またはALPLに特異的に結合する。
図1は、抗LRP4 siRNA、およびLRP4 mRNAをノックダウンするそれらの能力を示す。 図2は、LRP4 mRNAノックダウンが、HEK293細胞で、supertopflash (STF)活性を阻害するスクレロスチンの能力を減退させることを示す。 図3は、LRP4 mRNAノックダウン後のスクレロスチン用量応答曲線を示す。 図4aは、Hek293細胞で、Wnt1誘導supertopflash (STF)-LucでのLRP4過剰発現の効果を示し; 図4bは、Hek293細胞で、Wnt1誘導supertopflash (STF)-LucでのスクレロスチンおよびDkk1の作用に関するLRP4過剰発現の効果を示し; 図4cは、Hek293細胞で、Wnt1誘導supertopflash (STF)-LucでのスクレロスチンおよびDkk1の作用に関するLRP4およびLRP5過剰発現の効果を示し; 図4dは、Hek293細胞で、Wnt1誘導supertopflash (STF)-LucでのスクレロスチンおよびDkk1の作用に関するLRP4およびLRP6過剰発現の効果を示す。 図5aは、C28a2細胞で、Wnt1誘導supertopflash (STF)-LucでのLRP4過剰発現の効果を示し; 図5bは、C28a2細胞で、Wnt1誘導supertopflash (STF)-LucでのスクレロスチンおよびDkk1の作用に関するLRP4過剰発現の効果を示す。 図6は、MC3T3細胞で、GSK3β阻害剤誘導アルカリホスファターゼ活性におけるスクレロスチンの効果を示す。 図7は、無細胞に基づくアッセイで、アルカリホスファターゼ活性におけるスクレロスチンの効果を示す。
発明の詳細な説明
本明細書において、“処置”なる用語は、病気(例えば、スクレロスチン関連障害および/または異常な骨塩密度障害)にかかりやすい傾向を有する患者および病気の患者の処置を含む、予防的処置および治癒的もしくは疾患抑制的処置を含む。この用語はさらに、疾患の進行の遅延のための処置を含む。
本明細書で使用する“スクレロスチン結合パートナー”は、下記のタンパク質を含むが、これらに限定されない: バーシカン(CSPG2)、FREM2、フィブリリン2 (FBN2)、C6orf93、シンデカン4 (Sdc4)、アグリン(AGRN)、セルピン2 (PN-1)、LRP2、LRP4、LRP6、SLIT2、テナシンC、TRIM26、TRIM41、グリピカン1、アルカリホスファターゼ(ALPL)およびIL-17受容体。1つの態様では、LRP4およびALPLは、それぞれ、配列番号1および2を有する、相当するヒトLRP4およびALPLを意味する。
“スクレロスチン:スクレロスチン結合パートナー相互作用”は、本明細書で記載したとおり、スクレロスチンとスクレロスチン結合パートナー間の直接的もしくは間接的な相互作用を意味する。相互作用の例は、直接の物理的結合および間接的な立体阻害を含むが、これらに限定されない。
本明細書で使用する“スクレロスチン関連障害”は、骨塩密度(BMD)が、健常な対象と比較して、異常に、および/または病的に高い障害、ならびに骨塩密度(BMD)が、健常な対象と比較して、異常に、および/または病的に低い障害を含む。高BMDにより特徴づけられる障害は、硬結性骨化症、Van Buchem症候群、骨過成長障害、およびSimpson-Golabi-Behmel症候群(SGBS)を含むが、これらに限定されない。低BMDおよび/または骨の脆弱症により特徴づけられる障害は、原発性および続発性(primary and secondary)骨粗鬆症、骨減少症、骨軟化症、骨形成不全症(OI)、無血管性壊死(骨壊死)、骨折およびインプラント治癒(人工歯根および股関節インプラント)、他の障害による骨減少(例えば、HIV感染、癌、または関節炎に付随する)を含むが、これらに限定されない。他の“スクレロスチン関連障害”は、リウマチ性関節炎、骨関節症、関節炎、および溶骨性病変の形成および/または存在を含むが、これらに限定されない。
本明細書で使用する“スクレロスチン関連障害”は、スクレロスチンが介在するか、または異常なスクレロスチンレベルと関連するか、もしくはそれらにより特徴づけられる状態を含む。これらは、癌および骨粗鬆症の状態(例えば、骨粗鬆症または骨減少症)を含み、そのいくつかは、本明細書に記載したとおり、“スクレロスチン関連障害”と重複する。スクレロスチン関連癌は、骨髄腫(例えば、溶骨性病変を伴う多発性骨髄腫)、乳癌、大腸癌、黒色腫、肝細胞癌、上皮性癌、食道癌、脳腫瘍、肺癌、前立腺癌、または膵臓癌、およびそのすべての転移癌を含み得る。
“スクレロスチン関連障害”はまた、腎臓および心臓血管系での少なくともスクレロスチンの発現による、腎臓および心臓血管の疾患を含み得る。該障害は、腎臓障害、例えば、糸球体疾患(例えば、急性および慢性糸球体腎炎、急速進行性糸球体腎炎、ネフローゼ症候群、巣状増殖性糸球体腎炎、全身性疾患に付随する糸球体病変、例えば、全身性エリテマトーデス、グッドパスチャー症候群、多発性骨髄腫、糖尿病、多嚢性腎臓疾患、新生物、鎌状細胞疾患、および慢性炎症性疾患)、管状疾患(例えば、急性管状壊死および急性腎不全、多嚢性腎臓疾患、海綿腎、髄質嚢胞性疾患、腎性糖尿病、および尿細管性アシドーシス)、尿細管間質性疾患(例えば、腎盂腎炎、薬剤および毒素誘導性管状間質性腎炎、高カルシウム血症性腎症、および低カリウム性腎症)急性および急速進行性腎不全、慢性腎不全、腎結石症、痛風、血管疾患(例えば、高血圧および腎硬化症、微小血管症性溶血性貧血、アテローム塞栓性腎臓疾患、大脳皮質のびまん性壊死、および腎臓梗塞症)、または腫瘍(例えば、腎細胞癌および腎芽細胞腫)を含むが、これらに限定されない。
該障害はまた、心血管障害、例えば、虚血性心疾患(例えば、狭心症、心筋梗塞、および慢性虚血性心疾患)、高血圧性心疾患、肺性心疾患、弁膜症性心疾患(例えば、リウマチ熱およびリウマチ性心疾患、心内膜炎、僧帽弁逸脱症、および大動脈弁狭窄症)、先天性心疾患(例えば、弁膜および血管閉塞性病変、心房もしくは心室中隔欠損、および動脈管開存症)、または心筋症(例えば、心筋症、鬱血性心筋症、および肥大型心筋症)を含むが、これらに限定されない。
本明細書で使用する“治療”は、処置を介した、障害、例えば、スクレロスチン関連障害および/または異常な骨塩密度障害の、またはその進行中のエピソードの寛解を生じることを意味する。
“予防”なる用語は、スクレロスチン関連障害および/または異常な骨塩密度障害、例えば、骨粗鬆症、硬結性骨化症、もしくは癌の発症または再発を阻害することを意味する。
本明細で使用する“調節する”は、直接的または間接的に、制御するか、もしくは影響を与えることを示し、例えば、阻害するか、もしくは刺激すること、アゴナイズするか、もしくはアンタゴナイズすること、妨げるか、もしくは促進すること、および強めるか、もしくは弱めることを意味し得るが、これらに限定されない。
本明細書で使用する“有機低分子”または“低分子”は、3キロダルトン未満、好ましくは、1.5キロダルトン未満の分子量を有する有機化合物(または無機化合物(例えば、金属)と複合体を形成する有機化合物)である。
本明細書で使用する“レポーター遺伝子”は、“マーカー遺伝子”なる用語とほとんど同じ意味で使用され、容易に検出可能か、および/または容易に検出可能な遺伝子産物、例えば、ルシフェラーゼをコードする核酸である。
転写および翻訳制御配列は、宿主細胞内で、コード配列の発現を提供するDNA制御配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、ターミネーターなどである。真核細胞では、ポリアデニル化シグナルは、制御配列である。
“プロモーター配列”は、細胞内でRNAポリメラーゼと結合し、下流(3'方向)のコード配列の転写を開始することができるDNA制御領域である。本発明を明確にする目的のために、プロモーター配列は、転写開始点によりその3'末端で結合し、上流に伸長し(5'方向)、バックグラウンドを超えた検出可能なレベルで、転写を開始するのに必要な最小数の塩基または要素を含む。転写開始点(例えば、S1ヌクレアーゼを用いたマッピングにより、便宜上、定義される)、およびRNAポリメラーゼの結合に関与するタンパク質結合ドメイン(コンセンサス配列)は、プロモーター配列内に見出され得る。
コード配列は、RNAポリメラーゼがコード配列をmRNAに転写する(次いで、それは、トランス-RNAスプライスされ、コード配列によりコードされるタンパク質に翻訳される)とき、細胞内で、転写および翻訳制御配列の“制御下”にある。
“薬学的に許容される”なる句は、生理学的に耐容性があり、一般に、ヒトに投与したときに、アレルギー性もしくは同様の有害反応、例えば、異常高進、目まいなどを生じない化学物質および組成物を意味する。好ましくは、本明細書で使用するとき、“薬学的に許容される”なる用語は、動物での使用のために、およびより特には、ヒトでの使用のために、連邦もしくは州政府の規制機関または米国薬局方もしくは他の一般に認識された薬局方に記載された規制機関により承認されることを意味する。
“担体”なる用語は、化合物が投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルを意味する。そのような医薬担体は、滅菌液体、例えば、水および石油、動物、植物もしくは合成起源のものを含む油状物、例えば、ピーナッツ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油などであり得る。水または水性溶液生理食塩水溶液ならびに水性デキストロースおよびグリセロール溶液は、好ましくは、担体として、特に、注射用溶液のために使用される。適当な医薬担体は、E. W. Martinによる“Remington's Pharmaceutical Sciences”に記載されている。
本明細書で使用する“治療上有効量”および“有効量”なる句は、宿主の活性、機能および応答における臨床上の重大な欠損を、少なくとも、約15%、好ましくは、少なくとも、50%、より好ましくは、少なくとも、90%まで減少させるために、最も好ましくは、予防するのに十分な量を意味する。あるいは、治療上有効量は、宿主の臨床上重大な状態/症状を改善するのに十分である。
“薬剤”は、医薬および診断組成物を製造するために使用し得るか、もしくは化合物、核酸(阻害性核酸、例えば、shRNA、RNAiなどを含む)、抗体、抗体様スカホールド、低分子、ポリペプチド、断片、アイソフォーム、変異形であり得るすべての物質、またはそのような目的のために独立して使用し得る他の物質を意味する(そのすべては、本発明による)。
“誘導体”は、化合物、アミノ酸残基置換、欠失もしくは付加の導入により改変された親タンパク質もしくはポリペプチドのアミノ酸配列を含むタンパク質もしくはポリペプチド、またはヌクレオチド置換もしくは欠失、付加または突然変異の導入により修飾された核酸もしくはヌクレオチドを意味する。誘導体核酸、ヌクレオチド、タンパク質もしくはポリペプチドは、親ポリペプチドと類似のまたは同一の機能を有する。
“阻害剤”または“アンタゴニスト”は、本明細書に記載したスクレロスチン:スクレロスチン結合パートナースクリーニング法を用いて同定したものを含む、スクレロスチンおよび/またはスクレロスチン結合パートナー活性、または関連タンパク質もしくは経路(例えば、BMP、Wntなど)活性の阻害分子を意味する。阻害剤およびアンタゴニストは、ある経路によるシグナル伝達を減少させるか、妨げるか、もしくは妨害する薬剤および/またはタンパク質相互作用および複合体の形成を妨害する薬剤であり得る。
本発明による“模倣剤”は、ポリペプチド、ペプチド、脂質、炭水化物、ヌクレオチド、有機低分子、および抗体またはその抗原結合断片を含むが、これらに限定されない。模倣剤は、例えば、スクレロスチン:スクレロスチン結合パートナー相互作用の効果を複製するか、作動させるか、または促進する目的で、興味のあるタンパク質、ペプチド、もしくはポリペプチド(例えば、スクレロスチンまたはスクレロスチン結合パートナー)の活性を模写する(または促進する)ために使用し得る。
候補模倣剤は、天然もしくは合成化合物であり得て、例えば、合成小分子、動物、植物、細菌もしくは真菌細胞の抽出物に含まれる化合物、およびそのような細胞からの条件培地を含む。模倣剤化合物は、下記の方法を用いて決定し得る。模倣剤は、対象タンパク質、ペプチド、ポリペプチドの重要な残基の知識に基づいて作製し得て、それは、正常なポリペプチド機能を模倣し得る。模倣剤は、それが設計された後のポリペプチド、ペプチド、もしくはタンパク質と、同様の、類似の、または改善された機能を有し得る。
本明細書で使用する“二本鎖RNA”または“dsRNA”なる用語は、上記したとおり、2つの逆平行および実質的に相補的な核酸鎖を含む二本鎖構造を有する、リボ核酸分子の複合体を意味する。二本鎖構造を形成する2つの鎖は、1つの大きなRNA分子の異なる部分であり得るか、またはそれらは、別々のRNA分子であり得る。別々のRNA分子であるとき、そのようなRNAは、しばしば、文献で、siRNA(“低分子干渉RNA”)と呼ばれる。二本の鎖が、1つの大きな分子の一部であり、したがって、二本鎖構造を形成する一方の鎖の3’末端と各他の鎖の5’末端間のヌクレオチドの中断されない鎖により結合する場合には、結合したRNA鎖は、“ヘアピンループ”、“短鎖ヘアピン型RNA”または“shRNA”と呼ばれる。二本の鎖が、二本鎖構造を形成する一方の鎖の3’末端と各他の鎖の5’末端間のヌクレオチドの中断されない鎖以外の方法で、共有的に結合する場合には、結合構造は、“リンカー”と呼ばれる。RNA鎖は、同じであるか、または異なる数のヌクレオチドを有し得る。塩基対の最大数は、二本鎖に存在するすべてのオーバーハングを除いた、siRNAの最も短い鎖中のヌクレオチドの数である。二本鎖構造に加えて、siRNAは、1個またはそれ以上のヌクレオチドオーバーハングを含み得る。さらに、本明細書で使用されるとき、“siRNA”は、リボヌクレオチドに対する化学的修飾を含み得て、それは、複数のヌクレオチドでの実質的な修飾および本明細書に開示するか、もしくは当業者に既知のすべての型の修飾を含む。siRNA型分子で使用されるすべてのそのような修飾は、本明細書および特許請求の範囲の目的のために、“siRNA”に包含される。
本明細書で使用する“ヌクレオチドオーバーハング”は、siRNAの1つの鎖の3’末端が、他の鎖の5’末端を超えて伸長するとき(逆もまた然り)、siRNAの二本鎖構造から突出した対を形成しないヌクレオチドを意味する。“平滑”または“平滑末端”は、siRNAの末端に、対を形成しないヌクレオチドが存在しないこと、すなわち、ヌクレオチドオーバーハングが存在しないことを意味する。“平滑末端”siRNAは、その全体の長さにわたる二本鎖、すなわち、分子のいずれの末端でもヌクレオチドオーバーハングが存在しないsiRNAである。明確にするために、siRNAの3’末端または5’末端に結合した化学キャップまたは非ヌクレオチド化学部分は、siRNAがオーバーハングであるか、または平滑末端であるかを決定するに際して考慮されない。
“アンチセンス鎖”なる用語は、標的配列に実質的に相補的な領域を含むsiRNAの鎖を意味する。本明細書で使用する“相補性領域”なる用語は、配列、例えば、本明細書に記載したとおりの標的配列に実質的に相補的なアンチセンス鎖上の領域を意味する。相補性領域が標的配列と完全に相補的ではないとき、ミスマッチは、末端領域で最も寛容であり、存在するならば、一般には、末端領域または例えば、5'および/または3'末端の6、5、4、3、もしくは2ヌクレオチド内の領域である。
本明細書で使用する“センス鎖”なる用語は、アンチセンス鎖の領域に実質的に相補的な領域を含むsiRNAの鎖を意味する。
siRNAに言及するとき、“細胞へ導入すること”は、当業者に理解されているとおり、細胞への吸収もしくは摂取を促進することを意味する。siRNAの吸収もしくは摂取は、自然な拡散または活性な細胞過程を介して、または補助剤もしくは装置により生じ得る。この用語の意味は、インビトロの細胞に限定されず; siRNAはまた、生きた生物の一部である“細胞に導入され”得る。そのような例では、細胞への導入は、生物への送達を含む。例えば、インビボ送達のために、siRNAを組織部位に注射するか、または全身的に投与し得る。細胞へのインビトロ導入は、当分野で既知の方法、例えば、エレクトロポレーションおよびリポフェクションを含む。
“サイレンス”および“の発現を阻害する”なる用語は、それらが、SOST遺伝子(すなわち、スクレロスチンをコードする遺伝子)、スクレロスチン結合パートナーをコードする遺伝子(例えば、バーシカン(CSPG2)、FREM2、フィブリリン2 (FBN2)、C6orf93、シンデカン4 (Sdc4)、アグリン(AGRN)、セルピン2 (PN-1)、LRP2、LRP4、LRP6、SLIT2、テナシンC、TRIM26、TRIM41、グリピカン1、アルカリホスファターゼ(ALPL)およびIL-17受容体をコードする遺伝子)、またはスクレロスチン、BMP、またはWntシグナル伝達経路に関与する遺伝子を意味する場合、本明細書では、第1細胞もしくは細胞集団と実質的に同一ではあるが、処理されていない第2細胞もしくは細胞集団(コントロール細胞)と比較して、該遺伝子が転写され、処理された結果、該遺伝子の発現が阻害される第1細胞もしくは細胞集団から単離され得る該遺伝子から転写されるmRNA量の減少で見られるとおり、該遺伝子の発現の少なくとも部分的な抑制を意味する。阻害の程度は、通常、下記で示される。
Figure 2010526766
あるいは、阻害の程度は、SOST遺伝子、スクレロスチン結合パートナーをコードする遺伝子、またはスクレロスチン、BMP、もしくはWntシグナル伝達経路転写に関与するすべての遺伝子と機能的に関連するパラメーター、例えば、細胞により分泌される、該遺伝子によりコードされたタンパク質の量の減少、またはある表現型を示す細胞の数の観点で提供され得る。原則として、SOST遺伝子、スクレロスチン結合パートナーをコードする遺伝子、またはスクレロスチン、BMP、もしくはWntシグナル伝達経路に関与するすべての遺伝子のサイレンシングは、構成的に、またはゲノム改変で、およびすべての適当なアッセイで、標的を発現するすべての細胞で決定し得る。しかしながら、特定のsiRNAが、ある程度まで、SOST遺伝子、スクレロスチン結合パートナーをコードする遺伝子、またはスクレロスチン、BMP、もしくはWntシグナル伝達経路に関与するすべての遺伝子の発現を阻害する(したがって、本発明に包含される)か否かを決定するために、参照が必要とされるとき、下記の実施例で提供されるアッセイは、そのような参照として役立つ。例えば、ある例では、SOST遺伝子、スクレロスチン結合パートナーをコードする遺伝子、またはスクレロスチン、BMP、もしくはWntシグナル伝達経路に関与するすべての遺伝子の発現は、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドの投与により、少なくとも、約20%、25%、35%、または50%まで抑制される。ある態様では、該遺伝子は、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドの投与により、少なくとも、約60%、70%、または80%まで抑制される。ある態様では、該遺伝子は、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドの投与により、少なくとも、約85%、90%、または95%まで抑制される。
“結合”なる用語は、構成要素(例えば、スクレロスチン)と他の構成要素(例えば、スクレロスチン結合パートナー)との物理的結合を意味する。結合の測定は、解離定数、結合定数、on-rateもしくはoff-rateのような値を生じ得る。
本明細書で使用する“結合が可能な条件”なる用語は、例えば、結合が生じるときの温度、塩濃度、pHおよびタンパク質濃度の条件を意味する。正確な結合条件は、アッセイの性質に依存して、例えば、アッセイが、純粋なタンパク質を使用するか、または部分的にのみ精製されたタンパク質を使用するか否かに依存して変わる。結合のための温度は、15℃から37℃で変わり得るが、好ましくは、室温から約30℃の間である。結合反応におけるスクレロスチンの濃度は、また、変わり得るが、好ましくは、約10 pMから10 nMである(例えば、放射性要素を用いた反応で)。
“特異的な”なる用語が本明細書で使用されるとき、結合は、それが、1 mMまたはそれ未満、一般には、100 nMから10 pMの範囲のKdで生じる場合に、“特異的”である。例えば、結合は、Kdが、100 nM、50 nM、10 nM、1 nM、950 pM、900 pM、850 pM、800 pM、750 pM、700 pM、650 pM、600 pM、550 pM、500 pM、450 pM、350 pM、300 pM、250 pM、200 pM、150 pM、100 pM、75 pM、50 pM、25 pM、10 pMまたはそれ未満であるとき、特異的である。
本発明は、スクレロスチンに対するタンパク質結合剤(本明細書では、“スクレロスチン結合パートナー”と呼ばれる)の発見に関する。スクレロスチンは、該スクレロスチン結合パートナーに結合する(または、それらと相互作用する)とき、骨沈着を阻害することができ、該結合または相互作用が存在しない場合には、骨沈着の阻害は、結合パートナーがスクレロスチン作用のポジティブメディエーターもしくは阻害剤として作用するか否かに依存して、部分的に減少するか、または増加する。スクレロスチンは、他のタンパク質およびシグナル伝達経路を調節することが、当分野では既知である。例えば、スクレロスチンは、骨形態形成タンパク質(BMP)シグナル伝達の状況依存性(context-dependent)アンタゴニストとして機能することができることが研究で示された。さらに、スクレロスチンはまた、おそらく、LRP5およびLRP6のWnt共受容体に結合することにより、Wingless/INT (Wnt)シグナル伝達経路の阻害剤として機能し得る。成体の骨形成を調節するスクレロスチンの能力は、Wntシグナル伝達阻害により生じ得て、該理論は、スクレロスチンの機能喪失型突然変異とLRP5の機能獲得型突然変異に関連するヒト骨過成長障害で、高度に表現型が重複することにより支持される。
スクレロスチンは、他のタンパク質およびシグナル伝達経路を調節することが当分野で既知であるので、スクレロスチン:スクレロスチン結合パートナー相互作用の調節は、同様に、他のタンパク質およびシグナル伝達経路(例えば、WntおよびBMP)に影響し、それに対して影響を及ぼす。スクレロスチン:スクレロスチン結合パートナー相互作用の調節(例えば、本発明の方法および組成物による)は、したがって、改変されたスクレロスチンレベルまたは増加もしくは減少した骨密度を生じ得て、それぞれ、スクレロスチン関連障害、または異常な骨塩密度障害の処置のために利用され得る。これは、本明細書の実施例の節で証明する。
過去の研究では、他の因子が、WntおよびBMPシグナル伝達経路による骨沈着に関与していたが、本明細書に記載した発見は、それらが、スクレロスチン:スクレロスチン結合パートナー相互作用によるこれらの経路の調節を明らかにしたと言う点で重要である。すなわち、スクレロスチン:スクレロスチン結合パートナー相互作用は、スクレロスチンを活性化するか、または阻害するために重要であり、それにより、その生物学的活性を達成すること(例えば、骨沈着を阻害すること)ができる。
例えば、フィブリリン2は、スクレロスチンの重要な結合パートナーであるか、または本明細書に記載したとおり、少なくともスクレロスチンからなる多複合体の一部である。この相互作用は、スクレロスチンのより安定な配座へのリフォールディングを誘導し、および/またはフィブリリン2とBMPシグナル伝達間の機能的相互作用を開始することができ、それにより、スクレロスチンとBMPシグナル伝達間の連結を提供できる。同様に、フィブリリン2とスクレロスチン間の相互作用は、フィブリリン2とWntシグナル伝達間の機能的相互作用を開始することができ、それにより、スクレロスチンとWntシグナル伝達間の連結を提供できる。15N-スクレロスチン調製物は、おそらく、結合リガンド、例えば、フィブリリン2上でのスクレロスチンフォールディングによる、25%のNMR構造のみを示す。
これらの発見は、本発明の方法および組成物を生じ、それは、とりわけ、スクレロスチン関連障害および/または異常な骨塩密度障害を処置し、予防し、診断することができる。例えば、異常な低骨塩密度により特徴づけられる障害(例えば、骨粗鬆症)を、スクレロスチン:スクレロスチン結合パートナー相互作用を調節すること(例えば、破壊すること)により、予防するか、処置するか、または改善し得る。
スクレロスチン:フィブリリン2相互作用の破壊(例えば、抗フィブリリン2抗体または阻害ヌクレオチドの使用を介した)は、骨粗鬆症を予防するか、処置するか、または改善するために使用し得る。あるいは、異常な高骨塩密度により特徴づけられる障害(例えば、骨粗鬆症)は、スクレロスチン:スクレロスチン結合パートナー相互作用を調節する(例えば、促進するか、または作動させる)か、またはスクレロスチンに結合するフィブリリン2と同様の、または類似の機能的効果を有するフィブリリン2模倣剤を投与することにより、予防するか、処置するか、または改善し得る。スクレロスチン作用を促進するような方法で、スクレロスチン:フィブリリン2相互作用を作動させる(例えば、フィブリリン2模倣剤の供給を介して)ことは、硬結性骨化症を予防するか、処置するか、または改善するために使用し得る。
さらに、多くの場合に、スクレロスチンとスクレロスチン結合パートナー間の相互作用は、スクレロスチン結合パートナーとBMPシグナル伝達間の機能的相互作用を開始することができ、それにより、スクレロスチンとBMPシグナル伝達間の連結を形成できる。同様に、スクレロスチン:スクレロスチン結合パートナー相互作用は、スクレロスチン結合パートナーとWntシグナル伝達間の機能的相互作用を開始することができ、それにより、スクレロスチンとWntシグナル伝達間の連結を提供できる。
例えば、スクレロスチンとアグリン間の相互作用は、アグリンとBMPシグナル伝達間の機能的相互作用を開始することができ、それにより、スクレロスチンとBMPシグナル伝達間の連結を形成できる。同様に、スクレロスチン:アグリン間の相互作用は、アグリンとWntシグナル伝達間の機能的相互作用を開始することができ、それにより、スクレロスチンとWntシグナル伝達間の連結を提供できる。
スクレロスチン/SOST
SOST遺伝子によりコードされるタンパク質であるスクレロスチンは、骨細胞により分泌される骨形成の有力なネガティブレギュレーターである(Swiss-Prot受託番号Q9BQB4)。システイン-ノット構造における、TGF-βアンタゴニストのDANファミリーとスクレロスチンの類似性のために、スクレロスチンは、もともと、単に、骨形態形成タンパク質(BMP)アンタゴニストであると考えられていたが(Brunkow et al (2001)Am J Hum Genet, 68:577-589); インビボでBMPと直接相互作用する能力に関しては、推測に留まっていた。
スクレロスチンまたはSOST発現の欠損は、例えば、硬結性骨化症と同様に、制御されない骨形成を生じる(Brunkow et al. (2001) Am J Hum Genet.;68(3):577)。硬結性骨化症を患う患者は、生涯にわたって骨の過形成が持続し、その結果、増加した骨量および強度が生じる。この劣性疾患のヘテロ接合保因者はまた、増加した骨量を示す(Gardner et al. 2005 J Clin Endocrinol Metab. 90(12):6392)。この表現型は、SOST欠損マウスで繰り返され、その過剰発現は、骨減少症を生じ得る(Loots et al. 2005 (Genome Res. 2005 15(7):928)。さらに、Van Buchem疾患(硬結性骨化症の表現型コピー)は、広範囲にわたる骨エンハンサーのゲノム欠失によるSOST誤制御により引き起こされることが見出された(Loots et al. 2005 (Genome Res. 2005 15(7):928).)。最後に、SOSTは、骨形成の間、骨エンハンサーを介して、副甲状腺ホルモンによりダウンレギュレートされる(唯一の妥当な臨床上の骨形成原理)ことを、研究は示している(Keller, Kneissel 2005, Bone. 2005 37(2):148)。したがって、スクレロスチン作用の阻害は、骨粗鬆症の理想的な治療を生じ得る。
スクレロスチンが、どれくらい正確に、骨形成のネガティブレギュレーターとしてその作用を及ぼすかははっきりしていないが、スクレロスチンが、骨形成に重要な骨形態形成タンパク質(BMP)およびWingless/INT (WNT)シグナル伝達を阻害することを、研究は示している。スクレロスチンは、BMPシグナル伝達の状況依存性アンタゴニストとして機能することができる。さらに、スクレロスチンはまた、おそらく、まだ同定されていない補因子の存在下、Lrp5およびLrp6 Wnt共受容体に結合することにより、Wntシグナル伝達経路の阻害剤として機能し得る(Semenov MV, He X. J Biol Chem. 2006 ;281(50):3827)。スクレロスチンが、Wntシグナル伝達阻害により、成体の骨形成に影響を与え得るという仮説は、スクレロスチンの機能喪失型突然変異とLRP5の機能獲得型突然変異に関連するヒト骨過成長障害で、高度に表現型が重複することにより支持される。
スクレロスチンは、出生後、さらなる役割を果たし得る。硬結性骨化症の患者は、異常に背が高く(Van Hul et al. (2001) European Journal of Radiology 40 198)、それは、軟骨生物学におけるスクレロスチンの推定上の役割を示す。さらに、スクレロスチンは、腎臓で発現しており、それは、この器官で、まだ特徴づけられていない役割を果たし得ることを暗に意味する(Balemans et al. 2001 Hum Mol Genet.10(5):537, Balemans and Van Hul (2002) Developmental Biology 250, 231)。最後に、それは、少なくとも、胚発生の間、心血管系で発現していることが示された(van Bezooijen et al. (2006) Dev Dyn. 2006;236(2):606)。
バーシカン(CSPG2)
バーシカンは、アグリカン、ニューロカンおよびブレビカンを含む、レクチカンファミリーのメンバーである。それは、巨大なコンドロイチン硫酸プロテオグリカンである。そのN末端球状ドメイン(G1)は、グリコサミノグリカンヒアルロナンに結合し、そのC末端球状ドメイン(G3)は、2つのEGF様ドメイン、レクチン様ドメイン、および補体制御タンパク質様ドメインからなる。バーシカンの4つのスプライシングバリアント(V0-V4)が既知である(Wight, TN (2002) Curr.Opin.Cell Biol.; 14 (5):617-23)。バーシカンV0およびV1は、ADAMTS1および4により切断され(アグリカナーゼ1) (Sandy, et al. (2001) J.Biol.Chem.; 276 (16):13372-8)(Russell, et al. (2003) J. Biol. Chem.; 278 (43):42330-9)、バーシカンV2は、ADAMTS4により切断される(Westling, et al. (2004) Biochem.J.; 377 (Pt. 3):787-95)。
バーシカンは、広範囲の組織分布を有する。Nakamura et alは、発生中の下顎および後肢で、バーシカン発現を研究した。それらの結果に基づき、彼らは、下記を提案する。バーシカンは、骨芽細胞の分化前に発現し、膜内骨化の間、類骨に局在する。軟骨内骨化では、バーシカンは、石灰化軟骨の表面上の活性な骨形成領域を覆う骨膜細胞で発現する。その後、骨化のいずれかの型を受けた骨は、骨発生の通常の一連の過程を開始する。骨マトリクスが拡張し、バーシカンの線維性骨富化が形成される。バーシカンmRNAおよびタンパク質は、骨芽細胞、骨細胞の限定された集団および骨マトリクスで検出される。線維性骨が層板骨に変えられると、骨マトリクスでのバーシカンの発現は、減少する。ADAMTS1、4および5の時間的および空間的mRNA発現パターンは、バーシカンのそれと比較可能である。彼らは、骨芽細胞および骨細胞は、ADAMTSを分泌することにより、バーシカンの産生および分解の両方に関与し得るという仮説を立てた(Nakamura, et al. (2005) J. Histochem. Cytochem.; 53 (12):1553-62)。最後に、バーシカンおよびBMPシグナル伝達は、BMP-2が、ラット椎間板細胞で、バーシカン遺伝子発現を半分まで減少させるという事実により示されるとおり、連結している(Li, et al. (2004) J.Spinal Disord.Tech.; 17(5):423-8)。
本明細書でさらに詳述したとおり、バーシカン(CSPG, IPI00009802.1)は、Tandem Affinity Purification結合アッセイのHek293細胞培養上清フラクションで、スクレロスチンの結合パートナーとして同定された。バーシカンは、スクレロスチンの重要な結合パートナーであると考えられているか、または少なくとも、スクレロスチンからなる多複合体の一部であり、その間の相互作用は、スクレロスチンのより安定な構造へのリフォールディングを誘導できる(それにより、スクレロスチン作用を調節することが可能である)。スクレロスチン:バーシカン相互作用は、また、スクレロスチンとWntシグナル伝達間の連結として役立つ。
FREM 2
my遺伝子(髄脳ブレブ遺伝子)によりコードされるFrem2は、Fras1およびFrem1 (Fras1関連細胞外マトリクス)に関連する提案されたECM成分であり、ウニECM3タンパク質とオーソログであると考えられている。その予測されるタンパク質配列は、N末端シグナルペプチド、次いで、13個のタンデム配列コンドロイチン硫酸プロテオグリカンドメイン(CSPG)、5個のタンデム配列CALXβドメイン、膜貫通ヘリックスおよびコンセンサスPDZ相互作用モチーフを有する短い細胞内テールからなる。
Frem2のミスセンス突然変異は、通常潜在眼球症、皮膚性合指症、聴覚異常(ear abnormalities)、腎臓形成不全および先天性心臓欠陥を含む多臓器先天性異常である、ブレブ突然変異体(myUcI)およびフレーザー症候群を患う2例の個体で検出されている。興味深いことに、myUcIマウスは、ときどき、骨性合指症および多指症を伴う、皮膚性合指症を示す。アミノ酸置換E1972Kを生じる5914G -> Aのヌクレオチド遷移が、2つの非血縁ファミリーで同定された。この突然変異は、5個の連続したCALXβドメインの2番目で生じ、すべての既知のCALXβドメインで保存されている残基を置換する。配列相同性探索は、CALXβが、連続したドメイン間の負に荷電したポケットにカルシウムを挿入することが既知のカドヘリンドメインと関連することを示した。構造アライメントに対する配列は、Glu1972が、CALXβドメイン2および3の接合点で、Ca2+結合ポケットに位置し、Ca2+の配位に直接関与する保存された位置に相当することを示した。これは、CALXβ-カドヘリンモチーフにおけるカルシウム結合が、FREM2の正常な機能のために重要であることを示す(Jadeja S, et al. (2005) Nat.Genet.; 37 (5):520-5)。
本明細書でさらに詳述したとおり、Frem2 (IPI00180707.7)は、Tandem Affinity Purification結合アッセイのHek293細胞の膜精製フラクションで、スクレロスチンの結合パートナーとして同定された。Frem2は、スクレロスチンの重要な結合パートナーであると考えられているか、または少なくとも、スクレロスチンからなる多複合体の一部であり、その間の相互作用は、スクレロスチンのより安定な構造へのリフォールディングを誘導できる(それにより、スクレロスチン作用を調節することが可能である)。
フィブリリン2 (FBN2)
糖タンパク質フィブリリン1および2は、10 nmの平均直径を有する、細胞外カルシウム結合ミクロフィブリルの主要な構成成分である。フィブリリンは、高度のアミノ酸配列相同性を有する、保存されたマルチドメイン構造を共有する。フィブリリン2は、潜在的なTGF-β1結合タンパク質(LTBP)で見出される8個のシステイン含有モジュールで中断された、47個のEGF様ドメイン(そのうちの43個は、コンセンサスカルシウム結合配列を有する)、特有のCおよびN末端ドメインならびに短いグリシンリッチドメインからなる。フィブリリン2は、選択的に、弾性組織、例えば、弾性軟骨および大動脈の中膜層に局在する(Putnam, et al. (1995) Nat.Genet.; 11 (4):456-8)。骨では、フィブリリン1と共に、フィブリリン2 mRNAは、大腿近位部に由来するヒト骨梁および初代培養での成熟した骨由来ヒト骨芽細胞で豊富に発現している(Kitahama, et al. (2000) Bone; 27 (1):61-7)。
フィブリリン2突然変異は、クモ指症、クモ肢、脊柱側弯症、先天性多発性関節拘縮症および外耳の異常により特徴づけられる常染色体優性疾患である、先天性拘縮性蜘蛛状指(CCA)を生じる。CCAは、マルファン症候群と、表現型が類似しており、それは、フィブリリン1の突然変異から生じるが、大動脈および眼に影響を与えない。FBN2ミスセンス突然変異は、CCAを患う2人の患者のEGF様リピートにおける、異なるシステイン残基の置換を生じる(Putnam, et al 1995)。フィブリン2ヌルマウスは、主に、欠損間葉分化による両側性合指症の形態での肢パターニング欠損を示す。合指症は、解体マトリクスと関連し、正常なBMP遺伝子発現と関連する。ヌルFbn2およびBmp7アレルのためのマウス二重ヘテロ接合体は、両方のヌル接合体の合指の表現型(合指症および多指症)を示す(Arteaga-Solis, et al. (2001) J.Cell Biol.; 154 (2):275-81.)。多指症は、ヘテロ接合体ではなくホモ接合体BMP-7ヌルマウスの特徴であり、ヘテロ接合体フィブリリン2マウスは、正常であるので、二重ヘテロ接合体マウスの表現型は、四肢パターン形成の間、フィブリリン2-リッチ-ミクロフィブリルとBMP-7シグナル伝達間の機能的相互作用を示した。
フィブリリン2は、発生中の生物の細胞間空間で、形態的な手がかりを配列する構造的なスカホールドを提供し得る。この機能は、不活性な成長因子に直接結合することにより(例えば、潜在的なTGF-β複合体の場合には)、他のマトリクス成分(例えば、プロテオグリカン)との間接的な相互作用を介して、または両方の機構の組み合わせで、発揮され得る(上記のArteaga-Solis)。最近、BMP-7が、フィブリリン1ヌルマウスにおいて、フィブリリン2と共局在することが示された(Gregory, et al. (2005) J.Biol.Chem.; 280 (30): 27970-80)。
本明細書でさらに詳述したとおり、フィブリリン2前駆体(FBN2, IPI00019439.1)は、Tandem Affinity Purification結合アッセイのHek293細胞の膜精製フラクションで、スクレロスチンの結合パートナーとして同定された。フィブリリン2は、スクレロスチンの重要な結合パートナーであると考えられているか、または少なくともスクレロスチンからなる多複合体の一部である。この結合は、スクレロスチンのより安定な構造へのリフォールディングを誘導することを可能とし、フィブリリン2とBMPシグナル伝達間の機能的相互作用を開始することができ、それにより、スクレロスチンとBMPシグナル伝達間の連結を形成する。同様に、スクレロスチン:フィブリリン2相互作用は、フィブリリン2とWntシグナル伝達間の機能的相互作用を開始することができ、それにより、スクレロスチンとWntシグナル伝達間の連結を提供する。
C6orf93
C6orf93は、仮定上のタンパク質であり、また、LTV1ホモログ(S. cerevisiae)と呼ばれる。ヒトでは、最初、NIH MGC Programの枠組みで、2002年に記載された(Strausberg, et al. (2002) PNAS; 99(26): 16899-903)。出芽酵母では、低温生存タンパク質LTV1は、重要でない非リボソームタンパク質をコードする。LTV1およびYAR1を欠損した株は、浸透圧および酸化ストレス、低温および高温ならびにあるタンパク質合成阻害剤の存在のようなさまざまな環境ストレスに対して、過感受性を示し、これは、リボソーム生合成因子と環境ストレス感受性間の未知の関連を明らかにする(Loar, et al. (2004) Genetics.; 168 (4):1877-89)。Ltv1は、リボソーム小サブユニット輸送因子Yrb2の遺伝子と、遺伝学的に相互作用し、これは、Ltv1が、核外輸送機構を小サブユニットと連結させるいくつかの可能性のあるアダプタータンパク質の1つとして機能することを示す(Seiser, et al. (2006) Genetics.; 174(2):679-691)。
本明細書でさらに詳述したとおり、C6orf93 (IPI0053032.1)は、Tandem Affinity Purification結合アッセイのHek293およびUMR106膜精製フラクションで、スクレロスチンの結合パートナーとして同定された。C6orf93は、スクレロスチンの重要な結合パートナーであると考えられているか、または少なくともスクレロスチンからなる多複合体の一部である。スクレロスチン:C6orf93相互作用は、スクレロスチンのより安定な構造へのリフォールディングを誘導することを可能とし(それにより、スクレロスチン作用を調節する)、C6orf93とBMPもしくはWntシグナル伝達間の機能的相互作用を開始することができ、スクレロスチンとこれらの経路間の連結として役立つ。スクレロスチン:C6orf93相互作用はまた、環境ストレスに対する骨細胞の感受性に関与する。
シンデカン4 (Sdc4)
シンデカン1から4は、1回膜貫通統合膜成分であり、ヘパラン硫酸プロテオグリカンファミリーのメンバーである。各シンデカンは、短い細胞内ドメイン、1回膜貫通ドメインおよび3から5個のグリコサミノグリカン鎖のための結合サイトを有する細胞外ドメインを有し、それにより、細胞周囲の環境を細胞内部と直接結合することを可能にする。シンデカン4はまた、アンフィグリカンまたはリュウドカンと呼ばれ、ほ乳動物細胞で、細胞内シグナル伝達カスケードを活性化し、接着斑サイトを形成するその能力のために、特有のメンバーである。それは、そのグリコサミノグリカン鎖を介してフィブロネクチンに結合し、PKCαおよび低分子量GTPase RhoAを活性化し、インテグリンと共に、接着斑サイトを安定化する(Tkachenko E, et al. (2005) Circ.Res.; 96 (5):488-500)。アフリカツメガエルでは、フィブロネクチンは、Dshを細胞膜にトランスロケートするシンデカン4の能力を制御し、それは、非標準的Wntシグナル伝達の活性化の指標である(Munoz R, et al. (2006) Nat.Cell Biol.; 8 (5):492-500)。
シンデカン4は、ラット初代頭蓋冠骨芽細胞を含むいくつかの細胞型で、偏在的に発現しており、そのmRNA発現は、FGF2処理により、アップレギュレートされる。このアップレギュレーションは、シクロヘキシミド処理後のシンデカン4 mRNAの減少により示されるとおり、即時応答ではない。骨芽細胞増殖および石灰化、ならびにERK活性化は、また、FGF2により促進されるが、抗シンデカン4抗体による前処理により、特異的に減少する(Song SJ, et al. (2007) J.Cell Biochem.; 100(2):402-411)。C2C12細胞では、シンデカン2および3は、BMP-2によりアップレギュレートされるが(Gutierrez J, et al. (2006) J. Cell Physiol.; 206 (1):58-67)、シンデカン3は、軟骨形成の間、BMP-2シグナル伝達のネガティブモジュレーターである(Fisher MC, et al. (2006) Matrix Biol.; 25 (1):27-39)。ショウジョウバエでは、シンデカンは、発生中の軸索に局在し、遺伝学的および物理学的に、SLITおよびRoboと相互作用し、SLIT/Roboシグナル伝達による軸索および筋管ガイダンスを促進する(Johnson KG, et al. (2004) Curr.Biol.; 14 (6):499-504)(Steigemann P, et al. (2004) Curr.Biol.; 14 (3):225-30)。最後に、シンデカン4は、シンデカン4抗体上に播種されると、活性化Bリンパ球で、フィロポディア様構造を誘導できる(Yamashita Y, et al. (1999) J.Immunol.; 162 (10):5940-8)。
本明細書でさらに詳述したとおり、シンデカン4 (sdc4, IPI00199629.1)は、Tandem Affinity Purification結合アッセイのラット骨肉腫UMR106細胞培養上清フラクションで、スクレロスチンの結合パートナーとして同定された。シンデカンは、スクレロスチンの重要な結合パートナー(本明細書で、“スクレロスチン結合パートナー”と定義している)であると考えられているか、または少なくともスクレロスチン、SLIT、およびシンデカン4からなる多複合体の一部である。この結合は、骨細胞樹状突起様過程の開始を調節することができるか、またはスクレロスチンのより安定な構造へのリフォールディングを誘導することを可能とし、それにより、スクレロスチン作用を調節する。さらに、シンデカン4は、スクレロスチンとWntおよび/またはBMPシグナル伝達間の連結として役立ち得る。
SLIT2
SLLIT2は、細胞移動で、分子ガイダンスキューとして作用する分泌タンパク質であり、その機能は、迂回(roundabout)ホモログ受容体との相互作用により仲介される。それは、脊髄で発現しており、初期体軸形成および神経管の細胞パターニングに関与する。
構造的にスクレロスチンに関連するGremlinおよびDanは、物理学的および機能的に、Slit1およびSlit2 タンパク質と相互作用し、それにより、単球走化の阻害剤として作用する(Chen et al. (2004) J Immunol.;173(10):5914)。さらに、Slitタンパク質は、ヘパラン硫酸プロテオグリカングリピカン1の高親和性リガンドであり(Ronca et al. (2001) J Biol Chem. 276(31):29141)、それはまた、本明細書に記載した実験で、スクレロスチン相互作用パートナーとして同定された。さらに、本明細書に記載したシンデカンはまた、slit/roboシグナル伝達による軸索および筋管ガイダンスを促進する(Johnson KG, et al. (2004) Curr.Biol. 14 (6):499-504) (Steigemann P, et al. (2004) Curr.Biol. 14 (3):225-30)。
SLIT2 (IPI00006288.1)は、Tandem Affinity Purification結合アッセイのHEK293細胞培養膜フラクションで、スクレロスチンの結合パートナーとして同定された。SLIT2は、スクレロスチンの重要な結合パートナー(本明細書で、“スクレロスチン結合パートナー”と定義している)であると考えられているか、または少なくともスクレロスチン、SLIT、および所望により、シンデカン4およびグリピカン1からなる多複合体の一部である。この結合は、骨細胞樹状突起様過程の産生を調節することができるか、またはスクレロスチンのより安定な構造へのリフォールディングを誘導することを可能とし、それにより、スクレロスチン作用を制御する。さらに、SLIT2は、スクレロスチンとWntおよび/またはBMPシグナル伝達間の連結として役立ち得る。
グリピカン1 (Gpc1)
グリピカンは、細胞外タンパク質リガンドと共受容体として作用するそれらの受容体との接触を調節する。それらは、Wntシグナル伝達(Capurro et al. (2005), Cancer Res.;65(14):6245)およびBMPシグナル伝達を調節する[例えば、BMPアンタゴニストとの作用による、(Paine-Saunders et al. (2000) Dev Biol.;225(1):179)]ものとして、既知である。例えば、グリピカン3の突然変異は、骨の過成長と関連するさまざまな症候群を生じる。例えば、Simpson-Golabi-Behmel過成長症候群(Pilia et al. (1996), Nat Genet.12(3):241)は、Wntシグナル伝達における、Gpc3制御の欠失の結果である((Song et al. (2005) ;Biol Chem 280(3):2116))。
グリピカンは、骨芽細胞系統の細胞で発現しており、骨リモデリングの有力なモジュレーターとして示されている(Sheu et al. (2002) J Bone Miner Res.17 (5):915)。
さらに、グリピカン1は、SLITに結合し(Ronca et al. (2001) J Biol Chem. 276(31):29141)、それはまた、本明細書に、スクレロスチン相互作用パートナーとして記載されている。Gpc1 (IPI00137336.1)は、Tandem Affinity Purification結合アッセイの骨芽細胞UMR-106培養上清フラクションで、スクレロスチンの結合パートナーとして同定された。Gpc1は、スクレロスチンの重要な結合パートナー(本明細書で、“スクレロスチン結合パートナー”と定義している)であると考えられているか、または少なくともスクレロスチン、Gpc1、および所望により、シンデカン4およびSLIT2からなる多複合体の一部である。この結合は、骨細胞樹状突起様過程の産生を調節することができるか、またはスクレロスチンのより安定な構造へのリフォールディングを誘導することを可能とし、それにより、スクレロスチン作用を制御する。さらに、グリピカン1は、スクレロスチンとWntおよび/またはBMPシグナル伝達間の連結として役立ち得る。
アグリン(AGRN)
アグリカンは、約600 kDa(200 kDaのタンパク質コア)の分子量を有する、巨大な細胞外マトリクスヘパリン硫酸プロテオグリカンである。オルタナティブメッセンジャーRNAスプライシングは、アグリンの分泌型を生じる、切断シグナル配列、その後のアミノ末端アグリンドメインをコードするアイソフォーム(NtA-アグリン)および該タンパク質をII型膜貫通タンパク質に変換する、内部の非切断シグナルペプチドを有する短いアミノ末端を含むアイソフォーム(TM-アグリン)を産生する。両アイソフォームは、異なる発現をする: NtA-アグリンは、多くの基底層含有組織で、偏在的に発現し、TM-アグリンは、中枢神経系で、選択的に発現する(Burgess, et al. (2000) J.Cell Biol.; 151 (1):41-52)(Neumann, et al. (2001) Mol.Cell Neurosci.; 17 (1):208-25)。最近、アグリンが、マウス軟骨細胞で発現し、成長板に局在することが示された(Hausser et al. (2007) Histochem Cell Biol.; 127:363)。NtA-アグリン欠損マウスは、アグリンが、骨格筋の神経筋接合部で、シナプス後発生の間、アセチルコリン受容体の凝集のために必要とされることの証拠を提供した(Gautam, et al. (1996) Cell.; 85 (4):525-35)。この能力は、アグリン-およびMuSK-欠損マウスの表現型の類似性により証明されたとおり、筋肉特異的受容体チロシンキナーゼMuSKを必要とする(DeChiara, et al. (1996) Cell.; 85 (4):501-12)。ラット骨格筋細胞におけるアグリンの過剰発現は、フィロポディアの形成を誘導する(Uhm, et al. (2001) J.Neurosci.; 21 (24):9678-89)。内在性TM-アグリンの抗体誘導性クラスタリングは、中枢および末梢神経の軸索に沿って、フィロボディア様過程の増加した形成を生じる(Annies, et al. (2006) Mol.Cell Neurosci.; 31 (3):515-24)。海馬神経細胞培養で、TM-アグリンの過剰発現およびsiRNAによるダウンレギュレーションは、TM-アグリンが、フィロポディアの開始および安定におけるその効果により、発生中の神経におけるフィロポディアの数を正に制御することを示す(McCroskery, et al. (2006) Mol.Cell Neurosci.; 33(1):15-28).
本明細書でさらに詳述したとおり、アグリン(IPI00374563.2)は、Tandem Affinity Purification結合アッセイのHek293細胞培養上清フラクションで、スクレロスチンの結合パートナーとして同定された。アグリンは、スクレロスチンの重要な結合パートナーであると考えられているか、または少なくともスクレロスチンからなる多複合体の一部であり、その間の相互作用は、骨細胞のフィロポディア様過程の開始および安定を調節することができるか、またはスクレロスチンのより安定な構造へのリフォールディングを誘導することができる(それにより、スクレロスチン作用を調節することが可能となる)。
セルピン2 (PN-1)
セルピン2は、プロテアーゼネキシンI (PN-1)またはグリア誘導ネキシン前駆体(PI7)と呼ばれる、セルピンペプチダーゼ阻害剤をコードする。それは、セリンプロテアーゼ阻害剤(SERPIN)スーパファミリーのメンバーである43 kDaの分泌タンパク質であり、アストロサイト、平滑筋、内皮細胞、および繊維芽細胞により合成されることが記載されている(Scott, et al. (1985) J.Biol.Chem.; 260 (11):7029-34)(Rosenblatt, et al. (1987) Brain Res.; 415 (1):40-8)(Festoff, et al. (1991) J.Cell Physiol.; 147 (1):76-86)(Bouton, et al. (2003) Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.; 23 (1):142-7)。それは、トロンビンおよび尿プラスミノーゲン活性化(uPA)の有力な阻害剤であり、あまり有力ではないが、また、プラスミンおよびトリプシンの有効な阻害剤である(Scott, et al. (1985) DNA Cell Biol.; 22 (2):95-105)。トロンビン-PN-1複合体の効率的な代謝は、LRP-1およびヘパリンの両方を必要とする相乗的な機構であり; 細胞により分解される前に、最初に、トロンビン-PN-1複合体を、ヘパリンにより細胞表面に濃縮し、次いで、LRP-1により内在化する(Knauer, et al. (1997) J. Biol. Chem.; 272 (46):29039-45, Scott, et al.(2003) DNA Cell Biol.; 22(2):95-105)。
マウス胚性繊維芽細胞では、PN-1複合体の二者択一の内在化は、シンデカン-1により仲介され、Ras-ERKシグナル伝達経路を活性化する。遊離PN-1はまた、内在化し得る(Li, et al. (2006) J.Cell Biochem.; 99 (3):936-51)。PN-1は、血管平滑筋細胞接着、伸長および移動を制御する(Richard, et al. (2006) J. Thromb. Haemost.; 4 (2):322-8)。PN-1発現は、TNFα、TGFβおよびIL-1のような損傷関連因子により、ヒト骨格筋でアップレギュレートされる(Mbebi, et al. (1999) J.Cell Physiol.; 179 (3):305-14)。PN-1はまた、トロンビンを阻害することにより、神経突起伸張に関与することが報告されている(Farmer, et al. (1990) Dev.Neurosci.; 12 (2):73-80)。最後に、NIH3T3細胞で、PN-1は、正確な骨格形成のために必要とされることが既知のPrx2の標的遺伝子であることが示された(Scott, et al.(2003) DNA Cell Biol.; 22(2):95-105)。
本明細書でさらに詳述したとおり、PN-1 (IPI00203479.3)は、Tandem Affinity Purification結合アッセイのUMR106細胞培養上清フラクションで、スクレロスチンの結合パートナーとして同定された。PN-1は、スクレロスチンの重要な結合パートナーであると考えられているか、または少なくともスクレロスチンからなる多複合体の一部であり、その間の相互作用は、スクレロスチンのより安定な構造へのリフォールディングを誘導することができる(それにより、スクレロスチン作用を調節することが可能となる)。スクレロスチン: PN-1相互作用はまた、骨細胞伸長またはスクレロスチン内在化および分解に関与する。
低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質2 (LRP2、メガリン)
低密度リポタンパク質受容体ファミリーは、積み荷輸送、細胞表面からの巨大分子の内在化および細胞内シグナル伝達において広い機能を有する、高度に保存された細胞表面受容体のクラスである。メガリンは、成体の腎臓および回腸で十分に特徴づけられたマルチリガンド上皮性エンドサイトーシス受容体であり、そこでは、それらは、タンパク質、脂質およびビタミン摂取のために重要な複合体を形成する。それはまた、雄および雌の生殖器官および精嚢(ラット)の特定の領域に対する上皮細胞の先端面に発現し、そこで、それは、精嚢のためのエンドサイトーシス受容体として作用する。メガリンノックアウトマウスは、糸球体濾液からDBP/25-(OH)D3複合体を捕捉する、腎臓における尿細管の不能性のために、ビタミンD欠乏症および骨疾患を生じる(Willnow et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 8460)。同様に、腎臓特異的メガリンノックアウトマウスは、完全なメガリンノックアウトマウスのように、重篤な血漿ビタミンD欠乏症、低カルシウム血症および重篤な骨疾患を有する(Leheste et al. (2003) FASEB J. 17(2):247。それらの骨は、骨塩量の減少、類骨面の増加、および硬化活性の欠如により特徴づけられる。これらの特徴は、ビタミンD欠乏症の結果として、骨軟化症と一致し、全身性カルシウムホメオスタシスおよび骨代謝に関するメガリン経路の決定的な重要性を証明する。
LRP2 (IPI00024292.1)は、Tandem Affinity Purification結合アッセイのヒト胚性腎臓Hek293膜精製および上清フラクションで、スクレロスチンの結合パートナーとして同定された。LRP2は、スクレロスチンの重要な結合パートナーであると考えられているか、または少なくともスクレロスチンからなる多複合体の一部である。スクレロスチンは、腎臓で発現する(Balemans and Van Hul (2002) Developmental Biology 250, 231)。その結果、LRP2は、腎臓で、スクレロスチンと相互作用し、そこで、まだ特徴づけられていないその作用を調節する。さらに、LRP2は、骨でのスクレロスチン内在化および次の分解に関与し、その作用を調節し得る。
低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質4 (また、Megf7として既知のLRP4)
Megf7は、低密度リポタンパク質受容体ファミリーのメンバーである。LRP4欠損マウスは、前および後肢の多合指症を示す。合指症はまた、典型的な、異常なスクレロスチンレベルの特徴である(硬結性骨化症患者におけるスクレロスチンの非存在およびマウスにおけるスクレロスチンの過剰発現は、合指症を生じる)。LRP4およびスクレロスチンタンパク質は、外胚葉性頂堤(AER)形成で役割を果たし、胚性9.5日で発現する。さらに、スクレロスチンおよびLRP4は、標準的なWntシグナル伝達を中和し得る(Johnson EB, et al. (2005) Hum Mol Genet. 14(22):3523)(Simon-Chazottes D, et al. (2006) Genomics 87(5):673)(Loots GG, et al. (2005) Genome Res. 15(7):928-35)。
本明細書でさらに詳述したとおり、LRP4 (IPI00306851.3)は、Tandem Affinity Purification結合アッセイのUMR-106およびHek293細胞の膜フラクションで、スクレロスチンの結合パートナーとして同定された。LRP4は、スクレロスチンの重要な結合パートナーであると考えられているか、または少なくともスクレロスチンからなる多複合体の一部であり、その間の相互作用は、スクレロスチンのより安定な構造へのリフォールディングを誘導することができる(それにより、スクレロスチン作用を調節することが可能となる)。さらに、LRP4は、Wntシグナル伝達阻害剤としての役割で、スクレロスチン作用のエンハンサーとして作用することが示されている。
低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質6 (LRP6)
LRP6は、Wntのために、Frizzledと共に共受容体として作用することにより、Wnt/βカテニンシグナル伝達経路において重要である。LRP6は、高い親和性をもって、DKK1に結合する。このDKK1との相互作用は、LRP6仲介Wnt/βカテニンシグナル伝達を妨害する。最近、DKK1のようなスクレロスチンが、インビトロで、結合パートナーとしてLRP6に作用し、それにより、Wntシグナル伝達を阻害することが示された(Semenov et al. (2005) J Biol Chem. 280(29):26770)。
LRP6 (IPI00000203.1)は、Tandem Affinity Purification結合アッセイのHek293および骨芽UMR106細胞培養膜フラクションで、スクレロスチンの結合パートナーとして同定された。これらの結果は、スクレロスチンが、LRP6相互作用により、インビボでその作用の一部を及ぼすことを示す。これはまた、Tandem Affinity Purification結合アッセイ実験からの発見の妥当性を強調し、したがって、ポジティブコントロールと見なされる。
テナシンC
テナシンCは、ヘプタドリピート、EGF様リピート、III型フィブロネクチンドメイン、およびフィブリノーゲンと共有されるC末端球状ドメインを含む、240 kDaの巨大な多量体細胞外マトリクスタンパク質である。テナシンは、主に、結合組織中の細胞で合成される(Chiquet-Ehrismann R (2004) Int.J.Biochem.Cell Biol.; 36 (6):986)。それらは、他の細胞外マトリクスタンパク質とは反対に、テナシンは弱い細胞接着のみを促進し、細胞拡大は制限されるので、接着調節タンパク質として分類される(Orend G and Chiquet-Ehrismann R (2000) Exp.Cell Res.; 261 (1):104)。
テナシンCは、FAK、RhoA、cGMP依存性タンパク質キナーゼおよび14-3-3tauの様ないくつかの細胞内シグナル伝達分子に影響を与え得る。それはまた、EGF受容体に直接結合し、活性化し得る(Chiquet-Ehrismann R and Tucker RP (2004) Int.J.Biochem.Cell Biol.; 36 (6):1085)。テナシンCは、培養骨芽細胞様細胞の分化を支持する(Mackie EJ and Ramsey S (1996) J.Cell Sci.; 109 (Pt 6):1597)。ラット尺骨において、免疫組織化学検出は、負荷に応答して形成された新骨内の骨細胞のみが、テナシンCに関して強く染色されることを示す。より最近に組み込まれた骨細胞、すなわち、骨膜表面近くの骨細胞は、染色されなかった(Webb CM, et al (1997) J.Bone Miner.Res.; 12 (1):52)。テナシンCは、インテグリンおよびシンデカンシグナル伝達に影響を与える(Huang W, et al (2001) Cancer Res.; 61 (23):8586)。
高血圧の患者では、テナシンCは、突然変異BMPR2に応答して誘導される(Ihida-Stansbury K, et al (2006) Am.J.Physiol Lung Cell Mol.Physiol.; 291 (4):L694)。テナシンCの発現は、高密度ニワトリ肢芽細胞培養では、Wnt7aにより抑制され(Stott NS, Jiang TX and Chuong CM (1999) J.Cell Physiol.; 180 (3):314)、ニワトリ胚線維芽細胞では、TGFbがテナシン発現を誘導する(Pearson CA, et al (1988) EMBO J.; 7 (10):2977)。テナシンCは、インテグリンα7β1との相互作用により、ラット小脳顆粒神経細胞からの神経突起伸長を増加させる(Mercado ML, et al (2004) J.Neurosci.; 24 (1):238)。
本明細書でさらに詳述したとおり、テナシンC (IPI00403938.1)は、Tandem Affinity Purification結合アッセイのUMR106細胞培養上清フラクションで、スクレロスチンの結合パートナーとして同定された。テナシンCは、スクレロスチンの重要な結合パートナーであるか、または少なくともスクレロスチンからなる多複合体の一部であると考えられている。この相互作用は、スクレロスチンのより安定な構造へのリフォールディングを誘導し、および/またはテナシンCとBMPシグナル伝達間の機能的相互作用を開始することができ、それにより、スクレロスチンとBMPシグナル伝達間の連結を提供できる。同様に、テナシンCとスクレロスチン間の相互作用は、テナシンCとWntシグナル伝達間の機能的相互作用を開始し、それにより、スクレロスチンとWntシグナル伝達間の連結を提供する。さらに、それは、骨細胞伸長またはこれらの機構の組み合わせに関与する。
トリパルタイトモチーフ(TRIM)タンパク質(TRIM26、TRIM41)
トリパルタイトモチーフ(TRIM)タンパク質ファミリーは、それらがRBCCモチーフを含んでいるので、また、RBCCタンパク質として既知であるRING (“実際に興味深い新規遺伝子”)タンパク質の拡大しているファミリーであり、RINGドメイン、1もしくは2つのB-ボックスおよび予測されるコイルド-コイル領域を含む。TRIM/RBCC タンパク質は、細胞増殖、分化、発生、ガン化およびアポトーシスを含む、生物学的過程に広く関与する。RINGドメインの存在およびユビキチン化に対するその強い関連は、ユビキチン化過程におけるこのタンパク質ファミリーの役割を示す(Meroni G, et al. (2005) Bioessays. 27 (11):1147)(Nisole S, et al. (2005) Nat.Rev.Microbiol. 3 (10):799)。
本明細書でさらに詳述したとおり、TRIM26 (IPI00010948.2)は、Tandem Affinity Purification結合アッセイのHek293膜フラクションで、TRIM41 (IPI00414021.1)は、Hek293およびUMR106膜フラクションで、スクレロスチンの結合パートナーとして同定された。TRIM26およびTRIM41は、スクレロスチンの重要な結合パートナーであると考えられているか、または少なくともスクレロスチンからなる多複合体の一部である(その間の相互作用は、スクレロスチン分解を誘導することができる)。LRP2と共にTRIMは、スクレロスチン内在化および次の分解に関与し得る。
IL-17受容体
IL-17A (IL17RA)のための受容体は、約130 kDaの1回膜貫通タンパク質であり、非常に大きな細胞質尾部を有する。IL-17Aサイトカインは、T細胞でのみ発現しているが、その受容体は、遍在的に発現している。結果として、IL-17は、さまざまな細胞で作用し、炎症性エフェクターの発現を誘導することができる。これらのエフェクターの多くは、破骨細胞形成を促進するか、または骨保護効果を働かせることにより、骨代謝に影響を与えることが示されている(Gaffen SL (2004) Arthritis Res.Ther.; 6 (6):240)。
たいていのIL-17誘導因子は、骨吸収傾向を示す。例えば、IL-6は、エストロゲン介在骨量減少に関与する因子であることが示されている(Jilka RL, et al (1992) Science.; 257 (5066):88)。IL-17を過剰発現するマウスで、骨侵食は、RANKLが介在する(Lubberts E, et al (2003) J.Immunol.; 170 (5):2655)。IL-17は、野生型同腹子と比較して、IL-17-/-マウスで、骨塩密度、骨発生ならびに骨吸収および骨形成パラメーターに関しての差異が存在しないので、骨ホメオスタシスの生理学的制御に関与していない。しかしながら、LPS誘導炎症性骨破壊モデルにおいて、骨吸収のレベルはほとんど顕著ではなく、破骨細胞形成は、野生型マウスと比較して、IL-17-/-マウスでかなり減少し、これは、Th17細胞が、T細胞仲介破骨細胞形成に関与することを示す。
RANKLおよび炎症性サイトカイン、例えば、TNFαおよびIL-1のIL-17仲介誘導は、その過程に関与することが示されている(Sato K, et al (2006) J.Exp.Med.; 203 (12):2673)。IL-17はまた、主に、ケモカイン分泌を促進するその能力のために、好中球動員および活性化の有力な誘導因子である。好中球は、慢性炎症の間、骨破壊に関与すると考えられている。しかしながら、好中球は、一般に、歯周病誘導性骨量減少の文脈で骨保護的であると考えられている(Kantarci A, Oyaizu Z and Van Dyke TE (2003) J.Periodontol.; 74 (1):66)。IL-17RAのシグナル伝達は、ほとんど明らかになっていない。関与する経路は、NF-κB経路、C/EBPファミリーならびにC/EBPリン酸化、ERK1および2、JNK、p38およびPI-3K/Aktに関与するMAPKおよびGSK3βを含み得る(Gaffen SL, et al (2006) Vitam.Horm.; 74:255-82.:255)。本明細書でさらに詳述したとおり、IL-17RA (IPI00304993.3)は、Tandem Affinity Purification結合アッセイのHek293膜フラクションで、スクレロスチンの結合パートナーとして同定された。IL-17RA、またはIL-17RB、IL-17RC、IL-17RDおよびIL-17REは、スクレロスチンの重要な結合パートナーであるか、または本明細書に記載したとおり、少なくともスクレロスチンからなる多複合体の一部であり、その間の相互作用は、スクレロスチンのより安定な複合体へのリフォールディングを誘導し、および/またはIL-17受容体とBMPシグナル伝達間の機能的相互作用を開始することができ、それにより、スクレロスチンとBMPシグナル伝達間の連結を提供できる。同様に、IL-17受容体とスクレロスチン間の相互作用は、IL-17受容体とWntシグナル伝達間の機能的相互作用を開始し、それにより、スクレロスチンとWntシグナル伝達間の連結を提供する。さらに、それは、骨細胞成長またはこれらの機構の組合せに関与する。
アルカリホスファターゼ (ALPL)
多くのほ乳動物で、下記の4つの異なるアイソザイムが存在する: 胎盤、胎盤様、腸管および組織非特異的(肝臓/骨/腎臓、ALPL)。アルカリホスファターゼ肝臓/骨/腎臓(ALPL)欠陥は、骨石灰化障害により特徴付けられる遺伝性代謝性骨疾患である小児型低ホスファターゼ血症の原因であり、ALPLが骨石灰化において役割を果たすことを示す(Fedde KN et al. (1999) JBMR 14(12):2015-2026)。
ALPLは、骨形成マーカーである。骨形成の間、アルカリホスファターゼは、骨幹細胞で検出されない。その発現は、前骨芽細胞コロニーの増殖能力が失われ、結節形成が開始されると、始まる。発現は、その時点以降(from that time point onwards)維持される(Liu et al. (1994) Devel Biol. 166:220-234)。いくつかのBMPは、骨芽様細胞で、アルカリホスファターゼを誘導することが記載されている(Cheng H et al. (2003) J Bone Joint Surg Am. 85:1544-1552)。さらに、Rawadi G et al. (2003)は、BMP-2が、Wnt自己分泌ループにより、アルカリホスファターゼの発現を制御することを示した(JBMR 18(10):1842-1853)。
本明細書でさらに詳述したとおり、ALPL (IPI00327143.1)は、Tandem Affinity Purification結合アッセイのUMR106細胞培養上清フラクションで、スクレロスチンの結合パートナーとして同定された。ALPLは、スクレロスチンの重要な結合パートナーであると考えられているか、または少なくともスクレロスチンからなる多複合体の一部である。さらに、SOSTは、無細胞に基づくアッセイで、ALPL酵素活性を直接阻害することが示されている。
スクリーニングアッセイ
本発明は、スクレロスチンもしくはスクレロスチン結合パートナー、または関連する複合体のタンパク質メンバーに結合し、例えば、スクレロスチン発現もしくは活性に対する刺激もしくは阻害効果を有する、モジュレーター、例えば、候補もしくは試験化合物または薬剤(抗体、抗体様スカホールド、小分子、融合タンパク質、ペプチド、模倣剤、または阻害ヌクレオチド(例えば、RNAi))を同定するための方法(また本明細書では、“スクリーニングアッセイ”と呼ぶ)を提供する。
該方法は、スクレロスチン:スクレロスチン結合パートナー相互作用を調節することができる候補もしくは試験化合物または薬剤を同定するための方法を含み、該方法は、該薬剤により引き起こされるスクレロスチン:スクレロスチン結合パートナー相互作用の変化を測定することを含む。好ましくは、該方法は、
a) スクレロスチンとスクレロスチン結合パートナーの相互作用を許容する条件下、試験薬剤の存在および非存在で、スクレロスチンをスクレロスチン結合パートナーと接触させ; そして
b) 該試験薬剤の存在および非存在で、スクレロスチンとスクレロスチン結合パートナーの相互作用を測定する工程を含み、
ここで、
(i) 試験薬剤の非存在下での相互作用と比較して、試験薬剤の存在下でのスクレロスチン:スクレロスチン結合パートナー相互作用の減少が、スクレロスチン:スクレロスチン結合パートナー相互作用のアゴニストとして試験薬剤を同定し、
(ii) 試験薬剤の非存在下での相互作用と比較して、試験薬剤の存在下でのスクレロスチン:スクレロスチン結合パートナー相互作用の増加が、スクレロスチン:スクレロスチン結合パートナー相互作用のアンタゴニストとして試験薬剤を同定する。
スクレロスチン:スクレロスチン結合パートナー相互作用の阻害は、スクレロスチンまたはスクレロスチン結合パートナーのアンタゴニスト、阻害剤、ネガティブモジュレーター、またはネガティブレギュレーターの場合に生じる。アンタゴニストは、スクレロスチン結合パートナーのスクレロスチンへの結合を減少させるか、または完全に妨害する効果を有する。アンタゴニストは、アンタゴニストの非存在下でのシグナル伝達と比較して、アンタゴニストの存在下、少なくとも、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、または上記の値のうち、任意の2つの間の範囲の量まで、スクレロスチンのスクレロスチン結合パートナーへの結合を減少させ得る。好ましくは、アンタゴニストは、少なくとも、10%まで、該結合を減少させ得る。結合は、例えば、本明細書に記載した生化学的および/または生物物理学的方法を用いて、結合定数を測定することにより、決定し得る。
1つの態様では、本発明は、スクレロスチン:Frem2相互作用を調節できる薬剤を同定するための方法であって、該薬剤により引き起こされるスクレロスチンのFrem2への結合変化を測定することを含む方法を提供する。他の態様では、本発明は、スクレロスチン:バーシカン(CSPG2)相互作用を調節できる薬剤を同定するための方法であって、該薬剤により引き起こされるスクレロスチンのバーシカンへの結合変化を測定することを含む方法を提供する。また他の態様では、本発明は、スクレロスチン:フィブリリン2 (FBN2)相互作用を調節できる薬剤を同定するための方法であって、該薬剤により引き起こされるスクレロスチンのフィブリリン2への結合変化を測定することを含む方法を提供する。また他の態様では、本発明は、スクレロスチン:C6orf93相互作用を調節できる薬剤を同定するための方法であって、該薬剤により引き起こされるスクレロスチンのC6orf93への結合変化を測定することを含む方法を提供する。他の態様では、本発明は、スクレロスチン:シンデカン4 (Sdc4)相互作用を調節できる薬剤を同定するための方法であって、該薬剤により引き起こされるスクレロスチンのシンデカン4への結合変化を測定することを含む方法を提供する。また他の態様では、本発明は、スクレロスチン:アグリン (AGRN)相互作用を調節できる薬剤を同定するための方法であって、該薬剤により引き起こされるスクレロスチンのアグリンへの結合変化を測定することを含む方法を提供する。また他の態様では、本発明は、スクレロスチン:セルピン2 (PN-1)相互作用を調節できる薬剤を同定するための方法であって、該薬剤により引き起こされるスクレロスチンのセルピン2への結合変化を測定することを含む方法を提供する。
また他の態様では、本発明は、スクレロスチン:SLIT2相互作用を調節できる薬剤を同定するための方法であって、該薬剤により引き起こされるスクレロスチンのSLIT2への結合変化を測定することを含む方法を提供する。また他の態様では、本発明は、スクレロスチン:グリピカン1相互作用を調節できる薬剤を同定するための方法であって、該薬剤により引き起こされるスクレロスチンのグリピカン1への結合変化を測定することを含む方法を提供する。また他の態様では、本発明は、スクレロスチン:LRP2相互作用を調節できる薬剤を同定するための方法であって、該薬剤により引き起こされるスクレロスチンのLRP2への結合変化を測定することを含む方法を提供する。また他の態様では、本発明は、スクレロスチン:LRP4相互作用を調節できる薬剤を同定するための方法であって、該薬剤により引き起こされるスクレロスチンのLRP4への結合変化を測定することを含む方法を提供する。また他の態様では、本発明は、スクレロスチン:LRP6相互作用を調節できる薬剤を同定するための方法であって、該薬剤により引き起こされるスクレロスチンのLRP6への結合変化を測定することを含む方法を提供する。また他の態様では、本発明は、スクレロスチン:テナシンC相互作用を調節できる薬剤を同定するための方法であって、該薬剤により引き起こされるスクレロスチンのテナシンCへの結合変化を測定することを含む方法を提供する。また他の態様では、本発明は、スクレロスチン:TRIM26相互作用を調節できる薬剤を同定するための方法であって、該薬剤により引き起こされるスクレロスチンのTRIM26への結合変化を測定することを含む方法を提供する。また他の態様では、本発明は、スクレロスチン:TRIM41相互作用を調節できる薬剤を同定するための方法であって、該薬剤により引き起こされるスクレロスチンのTRIM41への結合変化を測定することを含む方法を提供する。また他の態様では、本発明は、スクレロスチン:IL17-R相互作用を調節できる薬剤を同定するための方法であって、該薬剤により引き起こされるスクレロスチンのIL17-Rへの結合変化を測定することを含む方法を提供する。また他の態様では、本発明は、スクレロスチン:ALPL相互作用を調節できる薬剤を同定するための方法であって、該薬剤により引き起こされるスクレロスチンのALPLへの結合変化を測定することを含む方法を提供する。
候補もしくは試験化合物または薬剤は、(i) スクレロスチン; (ii) スクレロスチン結合パートナー; (iii) スクレロスチン:スクレロスチン結合パートナー相互作用により生み出された新規部位(例えば、新しく生み出された抗原決定基)、または(iv) 同様のもののいずれかを含むタンパク質複合体に対する抗体、抗体様スカホールド、小分子、融合タンパク質、ペプチド、模倣剤、または阻害ヌクレオチド(例えば、RNAi)であり得る。
スクレロスチン:スクレロスチン結合パートナー相互作用、スクレロスチンもしくはスクレロスチン結合パートナータンパク質活性、および/またはスクレロスチン経路活性の変化は、PCR、Taqman PCR、ファージディスプレイ系、ゲル電気泳動、レポーター遺伝子アッセイ、酵母ツーハイブリッドアッセイ、ノザンもしくはウエスタン解析、免疫組織化学、慣用的なシンチレーションカメラ、ガンマカメラ、直線スキャナー、PETスキャナー、SPECTスキャナー、MRIスキャナー、NMRスキャナー、またはX線装置により測定し得る。変更はまた、標識置換、表面プラズモン共鳴、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)または生物発光共鳴エネルギー移動(BRET)、蛍光クエンチング、および蛍光偏光から選択される方法を用いることにより、測定し得る。
スクレロスチンもしくはスクレロスチン結合パートナータンパク質活性、および/またはスクレロスチン経路活性の変化は、スクレロスチン:スクレロスチン結合パートナー間の相互作用の変化を検出することにより、スクレロスチンまたはスクレロスチン結合パートナーのレベルの変化を検出することにより、またはスクレロスチン経路における1個またはそれ以上のタンパク質のレベルの変化を検出することにより、検出し得る。上記したことが検出され得る細胞は、骨、間葉性、腎臓(例えば、HEK)、もしくは造血由来の細胞であり得るか、培養細胞であり得るか、またはトランスジェニック生物から得られた、もしくはその内部に存在する細胞であり得る。そのようなトランスジェニック生物は、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ウシまたは霊長類を含むが、これらに限定されない。
スクレロスチン:スクレロスチン結合パートナー相互作用の変化を含むスクリーニング実験のために、スクレロスチンまたはスクレロスチン結合パートナーを発現する細胞を、漸増濃度の候補薬剤の非存在下、もしくは存在下、標識化スクレロスチン結合パートナーを用いて、結合バッファー中でインキュベートし得る。アッセイを評価し、調整するために、増加した濃度の未標識スクレロスチン結合パートナーを用いた、コントロール競合反応を行い得る。インキュベーション後、洗浄工程を、非結合スクレロスチン結合パートナーを除去するために行う。結合した標識化スクレロスチン結合パートナーを、特定の標識に応じて測定する(例えば、シンチレーション計測、蛍光、抗体-染色など)。候補薬剤の存在下、結合した標識化スクレロスチン結合パートナーの量の少なくとも10%(例えば、20%、30%、40%、50%または60%)の減少は、候補薬剤による結合の置換を示す。
候補薬剤は、それらが、1 mMまたはそれ未満の濃度で、標識化スクレロスチン結合パートナー(準飽和(sub-saturating)スクレロスチン結合パートナー用量)の少なくとも10%、20%、30%、40%、50%または60%、好ましくは、少なくとも10%で置換されるとき、本明細書に記載したこのアッセイもしくは他のアッセイで、特異的に結合すると考えられる。当然に、スクレロスチン結合パートナーおよびスクレロスチンの役割は変換し得て; 当業者は、スクレロスチン:スクレロスチン結合パートナー相互作用の変化を決定するために、候補薬剤のさまざまな濃度の存在下、スクレロスチンがスクレロスチン結合パートナーに適用されるような方法を適用し得る。
スクレロスチン:スクレロスチン結合パートナー相互作用の変化は、表面プラズモン共鳴(SPR)によりモニターし得る。表面プラズモン共鳴アッセイは、スクレロスチン結合パートナーの水性相からセンサー上に固定したスクレロスチンへの結合または結合の欠陥により引き起こされる固定したセンサー近くの質量の変化により、2つの分子間の結合を測定する定量的な方法として使用することができる。質量のこの変化は、スクレロスチン結合パートナーまたは候補薬剤の注入もしくは除去後の共鳴ユニット対時間として測定され、Biacore Biosensor (Biacore AB)を用いて測定される。スクレロスチンは、Salamon et al. (Salamon et al., 1996, Biophys J. 71: 283-294; Salamon et al., 2001, Biophys. J. 80: 1557-1567; Salamon et al., 1999, Trends Biochem. Sci. 24: 213-219(その各々は、引用により本明細書の一部とする))に記載されたとおり、センサーチップ(例えば、チップ CM5 research grade; Biacore AB)に固定し得る。Sarrio et al.は、SPRが、チップ上の脂質層に固定したGPCR A(1)アデノシン受容体へのリガンド結合を検出するために使用し得ることを証明した(Sarrio et al., 2000, Mol. Cell. Biol. 20: 5164-5174(引用により本明細書の一部とする))。SPRアッセイで、スクレロスチン結合パートナーがスクレロスチンに結合するための条件は、出発点としてSarrio et al.により報告された条件を用いて、当業者により微調整され得る。
SPRは、少なくとも2つの方法で、結合の阻害剤に関して、アッセイし得る。最初に、スクレロスチン結合パートナーを、固定したスクレロスチンに前もって結合させ、その後、0.1 nMから1 μMの濃度で、候補薬剤を注入し得る。結合したスクレロスチン結合パートナーの置換を定量し、阻害剤結合の検出を可能にし得る。あるいは、チップに結合したスクレロスチンを、候補薬剤でプレインキュベートし、スクレロスチン結合パートナーでチャレンジし得る。阻害剤に前もって曝されていないチップ上のものと比較して、阻害剤に曝されたスクレロスチンに結合するスクレロスチン結合パートナーの差異は、阻害剤の存在下、スクレロスチン結合パートナーの結合もしくは置換を証明し得る。いずれかのアッセイで、候補薬剤の非存在下で結合したスクレロスチン結合パートナーの量と比較して、候補薬剤の存在下で結合したスクレロスチン結合パートナーの量の10%(例えば、20%、30%、40%、50%または60%)またはそれ以上の減少は、候補薬剤が、スクレロスチンとスクレロスチン結合パートナーの相互作用を阻害することを示す。上記では、スクレロスチンが固定されているが、当業者は、容易に、スクレロスチン結合パートナーが固定された成分であるような方法を適用し得る。
スクレロスチン結合パートナーのスクレロスチンへの結合の阻害を検出する他の方法は、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)を使用する。FRETは、蛍光ドナー(D)の放出スペクトルが、蛍光アクセプター(A)の励起スペクトルと重複するとき、互いに近接した状態で(通常は、＜ 100オングストロームの分離)、蛍光ドナー(D)および蛍光アクセプター(A)間で生じる量子力学的現象である。試験される分子、例えば、スクレロスチン結合パートナーおよびスクレロスチンは、ドナーおよびアクセプターのフルオロホアの相補的な対で標識される。スクレロスチン:スクレロスチン結合パートナー相互作用により、密接に、共に結合すると、ドナーフルオロホアの励起で放出される蛍光は、励起波長に応答して放出されたものとは異なる波長を有し、スクレロスチン結合パートナーとスクレロスチンが結合しないとき、各波長での放出強度の測定により、結合対非結合分子の定量を提供する。スクレロスチンを標識するドナーフルオロホアは、当分野で既知である。特に興味があるのは、シアンFP (CFP、ドナー(D))および黄色FP (YFP、アクセプター(A))として既知のA. victoria GFPの変異形である。例えば、YFP変異形を、スクレロスチンとの融合タンパク質として作製し得る。融合としてのGFP変異形の発現のためのベクター(Clontech)およびフルオロホア標識スクレロスチン結合パートナー化合物(Molecular Probes)は、当分野で既知である。
標識したスクレロスチン結合パートナーおよびYFP-スクレロスチンの混合物への候補薬剤の添加は、候補薬剤なしのサンプルと比較して、例えば、YFP蛍光の減少により証明されるエネルギー転移の阻害を生じる。スクレロスチン:スクレロスチン結合パートナー相互作用の検出のためにFRETを用いたアッセイで、候補薬剤なしのサンプルと比較して、候補薬剤を含むサンプル中のアクセプター波長における蛍光放出の強度の10%またはそれ以上(例えば、20%、30%、40%、50%、60%と等しいか、またはそれ以上)の減少は、候補薬剤が、スクレロスチンとスクレロスチン結合パートナーの相互作用を阻害することを示す。逆に、候補薬剤なしのサンプルと比較して、候補薬剤を含むサンプル中のアクセプター波長における蛍光放出の強度の10%またはそれ以上(例えば、20%、30%、40%、50%、60%と等しいか、またはそれ以上)の増加は、候補薬剤が、構造変化を誘導し、スクレロスチン:スクレロスチン結合パートナー相互作用を促進することを示す。
FRETのバリエーションは、分子相互作用をモニターするために、蛍光クエンチングを使用する。相互作用する対の1つの分子は、フルオロホアで標識され、他のものは、それと密接接合(close apposition)させると、フルオロホアの蛍光をクエンチする分子で標識され得る。励起における蛍光の変化は、フルオロホア:クエンチャー対でタグ化した分子の結合の変化の指標である。一般に、標識化スクレロスチンの蛍光の増加は、クエンチャーを有するスクレロスチン結合パートナー分子が置換されている指標である。当然に、類似の効果は、スクレロスチン結合パートナーが蛍光標識され、スクレロスチンがクエンチャーを有するときに生じ得る。クエンチングアッセイのために、候補薬剤なしのサンプルと比較して、候補薬剤を含むサンプル中の蛍光放出の強度の10%またはそれ以上(例えば、20%、30%、40%、50%、60%と等しいか、またはそれ以上)の増加は、候補薬剤が、スクレロスチンとスクレロスチン結合パートナーの相互作用を阻害することを示す。逆に、候補薬剤なしのサンプルと比較して、候補薬剤を含むサンプル中の蛍光放出の強度の10%またはそれ以上(例えば、20%、30%、40%、50%、60%と等しいか、またはそれ以上)の減少は、候補薬剤が、構造変化を誘導し、スクレロスチン:スクレロスチン結合パートナー相互作用を促進することを示す。
表面プラズモン共鳴およびFRET法に加えて、蛍光極性測定は、結合を定量するのに有用である。蛍光タグ化分子のための蛍光極性値は、回転相関時間または回転速度に依存する。複合体、例えば、蛍光標識化スクレロスチン結合パートナーと結合したスクレロスチンにより形成されたようなものは、複合体を形成していない標識化スクレロスチン結合パートナーより高い極性値を有する。スクレロスチン:スクレロスチン結合パートナー相互作用の候補薬剤の包含は、候補薬剤が、スクレロスチンとスクレロスチン結合パートナーの相互作用を破壊するか、または阻害するとき、候補薬剤なしの混合物と比較して、蛍光極性の減少を生じる。蛍光極性は、複合体の形成を破壊する小分子の同定のために、十分に適している。候補薬剤なしのサンプル中の蛍光極性と比較して、候補薬剤を含むサンプル中の蛍光極性の10%またはそれ以上(例えば、20%、30%、40%、50%、60%と等しいか、またはそれ以上)の減少は、候補薬剤が、スクレロスチン:スクレロスチン結合パートナー相互作用を阻害することを示す。
他の検出系は、生物発光ルシフェラーゼおよび蛍光アクセプターを含む融合タンパク質間の光移動を用いる、生物発光共鳴エネルギー移動(BRET)である。一般に、スクレロスチン:スクレロスチン結合パートナー相互作用対の1つの分子をルシフェラーゼ(例えば、ウミシイタケルシフェラーゼ(Rluc))と融合させ、それは、ルシフェラーゼ基質(例えば、DeepBlueC)の存在下、〜395 nmの波長で光を放出するドナーである。他の分子対を、ドナーからの光を吸収し、異なる波長で光を放出し得る、アクセプター蛍光タンパク質と融合させる。蛍光タンパク質の例は、GFP (緑色蛍光タンパク質)であり、それは、〜510 nmで光を放出する。ドナー融合スクレロスチン結合パートナーおよびアクセプター融合スクレロスチンの混合物への候補薬剤の添加は、例えば、候補薬剤なしのサンプルと比較して、アクセプター蛍光の減少により証明されるエネルギー遷移の阻害を生じる。スクレロスチン:スクレロスチン結合パートナー相互作用の検出のためにBRETを用いたアッセイで、候補薬剤なしのサンプルと比較して、候補薬剤を含むサンプル中のアクセプター波長における蛍光放出の強度の10%またはそれ以上(例えば、20%、30%、40%、50%、60%と等しいか、またはそれ以上)の減少は、候補薬剤が、スクレロスチンとスクレロスチン結合パートナーの相互作用を阻害することを示す。逆に、候補薬剤なしのサンプルと比較して、候補薬剤を含むサンプル中のアクセプター波長における蛍光放出の強度の10%またはそれ以上(例えば、20%、30%、40%、50%、60%と等しいか、またはそれ以上)の増加は、候補薬剤が、構造変化を誘導し、スクレロスチン:スクレロスチン結合パートナー相互作用を促進することを示す。
本明細書に記載した結合アッセイのすべては、スクレロスチンの非スクレロスチン結合パートナーリガンド(例えば、アゴニスト、アンタゴニストなど)、例えば、本明細書に記載したとおりの同定された小分子または天然もしくは合成ペプチドのいずれか、ポリペプチド、抗体またはその抗原結合断片、脂質、炭水化物、および有機小分子を含むが、これらに限定されないスクレロスチン結合パートナー模倣剤を用いて行い得るものと理解されるべきである。
本明細書に記載した結合アッセイのすべては、サンプル、例えば、組織サンプル中における、スクレロスチンに結合するか、またはスクレロスチン結合パートナーのスクレロスチンへの結合に影響を与える阻害剤の存在を決定するために使用し得る。そうするために、スクレロスチンを、サンプルの存在もしくは非存在下、スクレロスチン結合パートナーと反応させ、結合を、使用される結合アッセイに応じて測定する。スクレロスチン結合パートナーの結合の10%またはそれ以上(例えば、20%、30%、40%、50%、60%と等しいか、またはそれ以上)の減少は、サンプルが、スクレロスチンに結合するスクレロスチン結合パートナーを調節する阻害剤を含むことを示す。本明細書に記載したFRETおよびBRET結合アッセイは、サンプル、例えば、組織サンプル中における、スクレロスチンに結合するか、またはスクレロスチン結合パートナーのスクレロスチンへの結合に影響を与えるエンハンサーの存在を決定するために使用し得る。そうするために、スクレロスチンを、サンプルの存在もしくは非存在下、スクレロスチン結合パートナーと反応させ、結合を、使用される結合アッセイに応じて測定する。スクレロスチン結合パートナーの結合の10%またはそれ以上(例えば、20%、30%、40%、50%、60%と等しいか、またはそれ以上)の増加は、サンプルが、スクレロスチンに結合するスクレロスチン結合パートナーを調節するエンハンサーを含むことを示す。
本明細書に記載した結合アッセイのすべては、また、化合物ライブラリー中の阻害剤の存在を決定するために使用し得る。本明細書に記載したFRETおよびBRET結合アッセイは、また、化合物ライブラリー中のエンハンサーの存在を決定するために使用し得る。例えば、ハイスループットスクリーニングを用いたそのようなスクリーニング技術は、当分野で既知である。
本発明はまた、スクレロスチン:スクレロスチン結合パートナー相互作用を調節することができる薬剤を同定するための方法であって、該薬剤の存在下、スクレロスチン:スクレロスチン結合パートナー相互作用により誘導されるシグナル伝達応答を測定し、それを、該薬剤の非存在下、スクレロスチン:スクレロスチン結合パートナー相互作用により誘導されるシグナル伝達応答と比較することを含む方法を提供する。好ましくは、該方法は、
a) スクレロスチンとスクレロスチン結合パートナーの相互作用を許容する条件下、試験薬剤の存在および非存在で、スクレロスチンをスクレロスチン結合パートナーと接触させ; そして
b) スクレロスチン:スクレロスチン結合パートナー相互作用により誘導されるシグナル伝達応答を測定する
工程を含み、
ここで、試験薬剤の非存在下での応答と比較して、少なくとも10%の試験薬剤の存在下での応答の変化は、該試験薬剤がスクレロスチン:スクレロスチン結合パートナー相互作用を調節することができるものとして同定されることを示す。
試験薬剤の非存在下での応答と比較して、試験薬剤の存在下でのシグナル伝達応答の少なくとも10%の増加は、該試験薬剤を、スクレロスチン:スクレロスチン結合パートナー相互作用のアゴニストとして同定する。試験薬剤の非存在下での応答と比較して、試験薬剤の存在下でのシグナル伝達応答の少なくとも10%の減少は、該試験薬剤を、スクレロスチン:スクレロスチン結合パートナー相互作用のアンタゴニストとして同定する。
スクレロスチン:スクレロスチン結合パートナー相互作用のモジュレーター(例えば、本発明の方法により同定されたもの)は、モジュレーターの非存在下でのシグナル伝達と比較して、モジュレーターの存在下、少なくとも、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、または上記の値のうち、任意の2つの間の範囲の量まで、スクレロスチン:スクレロスチン結合パートナー相互作用により誘導されるシグナル伝達応答を変え得る。好ましくは、モジュレーターは、該シグナル伝達を、少なくとも10%まで変える。変化は、モニターされる活性に依存して、増加であるか、または減少であり得る。シグナル伝達は、例えば、下記のレポーター構築体を用いて、シグナル伝達レベルを測定することにより、当業者に既知の方法で決定し得る。
本発明は、スクレロスチン:Frem2相互作用を調節することができる薬剤を同定するための方法であって、該薬剤の存在下、スクレロスチン:Frem2相互作用により誘導されるシグナル伝達応答を測定し、それを、該薬剤の非存在下、スクレロスチン:Frem2相互作用により誘導されるシグナル伝達応答と比較することを含む方法を提供する。1つの態様では、本発明は、スクレロスチン:バーシカン相互作用を調節することができる薬剤を同定するための方法であって、該薬剤の存在下、スクレロスチン:バーシカン相互作用により誘導されるシグナル伝達応答を測定し、それを、該薬剤の非存在下、スクレロスチン:バーシカン相互作用により誘導されるシグナル伝達応答と比較することを含む方法を提供する。他の態様では、本発明は、スクレロスチン:フィブリリン2相互作用を調節することができる薬剤を同定するための方法であって、該薬剤の存在下、スクレロスチン:フィブリリン2相互作用により誘導されるシグナル伝達応答を測定し、それを、該薬剤の非存在下、スクレロスチン:フィブリリン2相互作用により誘導されるシグナル伝達応答と比較することを含む方法を提供する。また他の態様では、本発明は、スクレロスチン:C6orf93相互作用を調節することができる薬剤を同定するための方法であって、該薬剤の存在下、スクレロスチン:C6orf93相互作用により誘導されるシグナル伝達応答を測定し、それを、該薬剤の非存在下、スクレロスチン:C6orf93相互作用により誘導されるシグナル伝達応答と比較することを含む方法を提供する。また他の態様では、本発明は、スクレロスチン:シンデカン4相互作用を調節することができる薬剤を同定するための方法であって、該薬剤の存在下、スクレロスチン:シンデカン4相互作用により誘導されるシグナル伝達応答を測定し、それを、該薬剤の非存在下、スクレロスチン:シンデカン4相互作用により誘導されるシグナル伝達応答と比較することを含む方法を提供する。また他の態様では、本発明は、スクレロスチン:アグリン相互作用を調節することができる薬剤を同定するための方法であって、該薬剤の存在下、スクレロスチン:アグリン相互作用により誘導されるシグナル伝達応答を測定し、それを、該薬剤の非存在下、スクレロスチン:アグリン相互作用により誘導されるシグナル伝達応答と比較することを含む方法を提供する。また他の態様では、本発明は、スクレロスチン:セルピン2相互作用を調節することができる薬剤を同定するための方法であって、該薬剤の存在下、スクレロスチン:セルピン2相互作用により誘導されるシグナル伝達応答を測定し、それを、該薬剤の非存在下、スクレロスチン:セルピン2相互作用により誘導されるシグナル伝達応答と比較することを含む方法を提供する。
また他の態様では、本発明は、スクレロスチン:LRP2相互作用を調節することができる薬剤を同定するための方法であって、該薬剤の存在下、スクレロスチン:LRP2相互作用により誘導されるシグナル伝達応答を測定し、それを、該薬剤の非存在下、スクレロスチン:LRP2相互作用により誘導されるシグナル伝達応答と比較することを含む方法を提供する。また他の態様では、本発明は、スクレロスチン:LRP4相互作用を調節することができる薬剤を同定するための方法であって、該薬剤の存在下、スクレロスチン:LRP4相互作用により誘導されるシグナル伝達応答を測定し、それを、該薬剤の非存在下、スクレロスチン:LRP4相互作用により誘導されるシグナル伝達応答と比較することを含む方法を提供する。また他の態様では、本発明は、スクレロスチン:LRP6相互作用を調節することができる薬剤を同定するための方法であって、該薬剤の存在下、スクレロスチン:LRP6相互作用により誘導されるシグナル伝達応答を測定し、それを、該薬剤の非存在下、スクレロスチン:LRP6相互作用により誘導されるシグナル伝達応答と比較することを含む方法を提供する。また他の態様では、本発明は、スクレロスチン:グリピカン1相互作用を調節することができる薬剤を同定するための方法であって、該薬剤の存在下、スクレロスチン:グリピカン1相互作用により誘導されるシグナル伝達応答を測定し、それを、該薬剤の非存在下、スクレロスチン:グリピカン1相互作用により誘導されるシグナル伝達応答と比較することを含む方法を提供する。また他の態様では、本発明は、スクレロスチン:SLIT2相互作用を調節することができる薬剤を同定するための方法であって、該薬剤の存在下、スクレロスチン:SLIT2相互作用により誘導されるシグナル伝達応答を測定し、それを、該薬剤の非存在下、スクレロスチン:SLIT2相互作用により誘導されるシグナル伝達応答と比較することを含む方法を提供する。また他の態様では、本発明は、スクレロスチン:テナシンC相互作用を調節することができる薬剤を同定するための方法であって、該薬剤の存在下、スクレロスチン:テナシンC相互作用により誘導されるシグナル伝達応答を測定し、それを、該薬剤の非存在下、スクレロスチン:テナシンC相互作用により誘導されるシグナル伝達応答と比較することを含む方法を提供する。また他の態様では、本発明は、スクレロスチン:IL17-R相互作用を調節することができる薬剤を同定するための方法であって、該薬剤の存在下、スクレロスチン:IL17-R相互作用により誘導されるシグナル伝達応答を測定し、それを、該薬剤の非存在下、スクレロスチン:IL17-R相互作用により誘導されるシグナル伝達応答と比較することを含む方法を提供する。また他の態様では、本発明は、スクレロスチン:TRIM26相互作用を調節することができる薬剤を同定するための方法であって、該薬剤の存在下、スクレロスチン:TRIM26相互作用により誘導されるシグナル伝達応答を測定し、それを、該薬剤の非存在下、スクレロスチン:TRIM26相互作用により誘導されるシグナル伝達応答と比較することを含む方法を提供する。また他の態様では、本発明は、スクレロスチン:TRIM41相互作用を調節することができる薬剤を同定するための方法であって、該薬剤の存在下、スクレロスチン:TRIM41相互作用により誘導されるシグナル伝達応答を測定し、それを、該薬剤の非存在下、スクレロスチン:TRIM41相互作用により誘導されるシグナル伝達応答と比較することを含む方法を提供する。また他の態様では、本発明は、スクレロスチン:ALPL相互作用を調節することができる薬剤を同定するための方法であって、該薬剤の存在下、スクレロスチン:ALPL相互作用により誘導されるシグナル伝達応答を測定し、それを、該薬剤の非存在下、スクレロスチン:ALPL相互作用により誘導されるシグナル伝達応答と比較することを含む方法を提供する。
シグナル伝達応答は、好ましくは、Wntおよび/またはBMP経路の応答であり、その場合には、阻害剤は、Wntおよび/またはBMP経路活性を増加させ得る。シグナル伝達応答は、例えば、レポーター構築体を用いて、シグナル伝達レベルを測定することにより、決定し得る。例えば、スクレロスチン結合パートナーまたはスクレロスチンを提示する適当なほ乳動物細胞に、Wntおよび/またはBMPに応答するプロモーターを含むレポーター構築体を導入し得る。スクレロスチンがスクレロスチン結合パートナーに結合する(Wntおよび/またはBMP経路を阻害する)と、レポータータンパク質の発現は阻害され、減少が、レポータータンパク質の性質に依存して、例えば、イムノアッセイ、蛍光、光測定などにより測定され得る。発現は、候補薬剤の存在および非存在下、測定される。
Wntシグナル伝達を測定するための細胞に基づくアッセイの特定の例では、レポーター構築体は、10個のTCF結合サイトを含む、Wnt/β-カテニン依存性SuperTOPFlash (STF)ルシフェラーゼレポーターベクターであり得て、ホタルルシフェラーゼの発現を誘導する。Wnt発現ベクター(例えば、マウスWnt1のための発現構築体)およびウミシイタケ発現ベクター(標準化のために使用され、SV40により誘導される)と共に、これを、Hek293細胞またはすべての他の適当な細胞株に導入し得る。導入された細胞は、STFルシフェラーゼレポーターの活性を生じ、該活性は、スクレロスチンにより妨害され得る。
本発明は、スクレロスチン結合パートナーとスクレロスチンの相互作用と同様の、類似の、または改善された機能的効果を有するスクレロスチン結合パートナー模倣剤を同定するための方法であって、候補模倣剤によるスクレロスチンとの相互作用を測定することを含む方法を提供する。好ましくは、該方法は、
a) スクレロスチンと候補模倣剤の相互作用を許容する条件下、スクレロスチンを候補模倣剤と接触させ; そして
b) スクレロスチンと模倣剤の相互作用を測定すること
を含み、
ここで、相互作用が、本明細書に記載したさまざまなスクレロスチン:スクレロスチン結合パートナー相互作用のために観察されるものの少なくとも10%であり、それが、候補模倣剤を本発明のスクレロスチン結合パートナー模倣剤として特徴付ける。
さらに、本発明は、スクレロスチン結合パートナーとスクレロスチンの相互作用と同様の、類似の、または改善された機能的効果を有するスクレロスチン結合パートナー模倣剤を同定するための方法であって、スクレロスチン-模倣剤相互作用により誘導されるシグナル伝達応答を測定し、それを、スクレロスチン:スクレロスチン結合パートナー相互作用により誘導されるシグナル伝達応答と比較することを含む方法を提供する。好ましくは、該方法は、
a) スクレロスチンと候補模倣剤の相互作用を許容する条件下、スクレロスチンを候補模倣剤と接触させ; そして
b) スクレロスチン-模倣剤相互作用により誘導されるシグナル伝達応答を測定すること
を含み、
ここで、本明細書に記載したさまざまなスクレロスチン:スクレロスチン結合パートナー相互作用のために観察されるものの少なくとも10%であるシグナル伝達応答が、候補模倣剤を本発明のスクレロスチン結合パートナー模倣剤として特徴付ける。
例えば、本発明は、通常の生理学的な条件下で、Frem2またはLRP4とスクレロスチン間の相互作用のそれらと同様の、類似の、または改善された機能的効果を有する、Frem2もしくはLRP4模倣剤を同定するための方法を提供するが、これらに限定されない。
スクレロスチン結合パートナー模倣剤は、スクレロスチンに結合するスクレロスチン結合パートナーと同様の、類似の、または改善された機能的効果を有する化合物である。それは、天然のスクレロスチン結合パートナー構造の結合領域の活性な構造に似せるために、しばしば、追加の疎水基もしくは荷電基を有する官能基の配列を含む化合物であり得る。スクレロスチン結合パートナー模倣剤はまた、天然のスクレロスチン結合パートナーまたはその誘導体を含み得る。
本発明の1つの局面によると、模倣剤は、スクレロスチン結合パートナーのスクレロスチンへの少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%の結合、または上記の値のうち、任意の2つの間の範囲の値を示す。好ましくは、模倣剤は、スクレロスチン結合パートナーのスクレロスチンへの少なくとも20%の結合活性を示す。
本発明の1つの局面によると、模倣剤は、スクレロスチン結合パートナーの少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%のシグナル伝達活性、または上記の値のうち、任意の2つの間の範囲の値を示す。好ましくは、模倣剤は、スクレロスチン結合パートナーの少なくとも20%のシグナル伝達活性を示す。
スクレロスチンとの相互作用の模倣剤シグナル伝達活性の測定は、他のアッセイ、例えば、SPRおよびFRETに関して本明細書に記載した方法により、行い得る。
本発明の1つの態様によると、模倣剤は、
a) スクレロスチンを候補模倣剤と接触させ; そして
b) スクレロスチン-模倣剤相互作用により誘導されるシグナル伝達応答を測定する
工程を含み、
ここで、スクレロスチン:スクレロスチン結合パートナー相互作用のために測定されたシグナル伝達応答の少なくとも10% (例えば、20%、30%、40%、50%、60%と等しいか、またはそれ以上)であるシグナル伝達応答は、該候補模倣剤が本発明のスクレロスチン:スクレロスチン結合パートナー模倣剤として同定されることを示す
方法により同定し得る。
シグナル伝達応答は、好ましくは、Wntおよび/またはBMP経路の応答であり、その場合に、模倣剤は、非刺激状態と比較して、Wntおよび/またはBMP経路活性の減少を生じ得る。シグナル伝達応答は、例えば、すでに上記したレポーター構築体を用いて、シグナル伝達レベルを測定することにより決定し得る。スクレロスチンがスクレロスチン結合パートナー模倣剤に結合し、Wntおよび/またはBMP経路が阻害されると、レポータータンパク質の発現が阻害され、その減少は、レポータータンパク質の性質に依存して、例えば、イムノアッセイ、蛍光、光測定などにより測定し得る。発現はまた、スクレロスチン:スクレロスチン結合パートナー相互作用のために測定し得る。
記載した結合アッセイのすべては、サンプル、例えば、組織サンプル中のスクレロスチンに結合する模倣剤の存在を決定するために使用し得る。そうするために、スクレロスチンを、サンプルの存在または非存在下で反応させ、シグナル伝達を、使用するアッセイに応じて測定する。スクレロスチンのシグナル伝達の10%またはそれ以上(例えば、20%、30%、40%、50%、60%と等しいか、またはそれ以上)の増加は、サンプルがスクレロスチンに結合する模倣剤を含むことを示す。
記載したシグナル伝達アッセイのすべては、また、化合物のライブラリー中の模倣剤の存在を決定するために使用し得る。例えば、ハイスループットスクリーニングを用いたそのようなスクリーニング技術は、当分野で既知である。
本発明はさらに、対象のスクレロスチン関連障害および/または異常な骨塩密度障害またはそれらに対する素因を診断する方法であって、
a) 該対象内のスクレロスチン結合パートナー遺伝子のヌクレオチド配列を取得し、そして
b) それを、健常な対象のそれと比較する
工程を含み、
ここで、各スクレロスチン結合パートナー遺伝子における突然変異が、スクレロスチン関連障害またはスクレロスチン関連障害に対する素因を示す
方法を提供する。
対象内のSOSTまたはスクレロスチン結合パートナーをコードする遺伝子における突然変異は、異常な骨量に関連する障害を発症する予測因子であり得て、および/または診断するために使用し得る。そのような突然変異は、スクレロスチンとスクレロスチン結合パートナー間の相互作用を変化させ、例えば、健常な対象と比較して、結合およびシグナル伝達の増加もしくは減少を生じる。
本発明の1つの態様は、対象の異常な骨量に関連する障害または該障害に対する感受性を診断するための方法であって、該対象内のSOSTのDNAヌクレオチド配列またはスクレロスチン結合パートナーをコードする遺伝子を取得し、そしてそれを健常な対象のそれと比較する工程を含み、ここで、各スクレロスチンもしくはスクレロスチン結合パートナーをコードする遺伝子における突然変異が、異常な骨量に関連する障害またはそれに対する感受性を示す方法である。
本発明の他の態様は、対象の異常な骨量に関連する障害または該障害に対する感受性を診断するための方法であって、該対象内のSOSTのDNAヌクレオチド配列またはスクレロスチン結合パートナーをコードする遺伝子を取得し、そしてそれを健常な対象のそれと比較する工程を含み、ここで、健常な対象と比較して、スクレロスチンまたはスクレロスチン結合パートナーに対する各々の結合を変化させる突然変異の存在が、異常な骨量に関連する障害またはそれに対する感受性を示す方法である。
突然変異は、遺伝子の非翻訳部分に(例えば、イントロン、制御配列、プロモーターに)存在し得て、これらはまた、発現したタンパク質の機能障害を生じる。そのような突然変異は、一塩基多型(SNPs)であり得る。
あるいは、突然変異は、スクレロスチンとスクレロスチン結合パートナー間の相互作用を減少させる効果を有し得る。健常な対象と比較して、結合は、健常な対象で観察される結合よりも、少なくとも、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、および好ましくは、少なくとも、20%低いものであり得る。結合の減少が観察されるとき、スクレロスチン作用を増加させるスクレロスチン結合パートナーの場合には、低骨量に関連する障害が、診断されるか、または予測され得る。逆に、スクレロスチン作用を減少させるスクレロスチン結合パートナーの場合には、結合の減少が観察されるとき、高骨量に関連する障害が、診断されるか、または予測され得る。
突然変異は、Wntおよび/またはBMP経路のシグナル伝達応答を増加させる効果を有し得る。健常な対象と比較して、シグナル伝達応答は、健常な対象で観察される応答よりも、少なくとも、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、および好ましくは、少なくとも、20%高いものであり得る。応答の増加が観察されるとき、高骨量に関連する障害が、診断されるか、または予測され得る。
あるいは、突然変異は、スクレロスチン結合パートナーとスクレロスチン間の結合を増加させる効果を有し得る。健常な対象と比較して、結合は、健常な対象で観察される結合よりも、少なくとも、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、および好ましくは、少なくとも、20%高いものであり得る。結合の増加が観察されるとき、スクレロスチン作用を増加させるスクレロスチン結合パートナーの場合には、低骨量に関連する障害が、診断されるか、または予測され得る。逆に、スクレロスチン作用を減少させるスクレロスチン結合パートナーの場合には、結合の減少が観察されるとき、高骨量に関連する障害が、診断されるか、または予測され得る。
突然変異は、Wntおよび/またはBMP経路のシグナル伝達応答を減少させる効果を有し得る。健常な対象と比較して、シグナル伝達応答は、健常な対象で観察される応答よりも、少なくとも、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、好ましくは、少なくとも、20%低いものであり得る。応答の減少が観察されると、低骨量に関連する障害が、診断されるか、または予測され得る。
結合およびシグナル伝達アッセイは、当業者の通常の実施の範囲内であり、上記している。特定の遺伝子の塩基配列決定法は既知であり、例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1989)に記載されている。
候補薬剤および化合物
本発明のまたは本発明で使用し得る候補もしくは試験化合物または薬剤は、生物学的ライブラリー; 空間的に接近可能な平行固相もしくは溶液相ライブラリー; デコンボルーションを必要とする合成ライブラリー法; “１ビーズ−１化合物”ライブラリー法; および親和性クロマトグラフィー選択を用いた合成ライブラリー法を含む、当分野で既知のコンビナトリアルライブラリーにおける多くの方法のいずれかを用いて得ることができる。生物学的ライブラリーは、ペプチドライブラリーに限定されるが、他の4つの方法は、ペプチド、非ペプチドオリゴマーもしくは化合物の低分子ライブラリーに適用可能である(Lam et al. (1997) Anticancer Drug Des. 12: 145)。
分子ライブラリーの合成法の例は、当分野で、例えば、DeWitt et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90: 6909; Erb et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 11422; Zuckermann et al. (1994). J. Med. Chem. 37: 2678; Cho et al. (1993) Science 261: 1303; Carrell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2059; Carell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2061; およびGallop et al. (1994) J. Med. Chem. 37: 1233で見出し得る。
化合物のライブラリーは、溶液(例えば、Houghten (1992) Biotechniques 13: 412 )で、またはオンビーズ(Lam (1991) Nature 354: 82 )、チップ(Fodor (1993) Nature 364: 555)、細菌(Ladner, 米国特許第5,223,409号)、胞子(Ladner ‘409)、プラスミド(Cull et al. (1992) Proc Natl Acad Sci USA 89: 1865)またはファージ(Scott and Smith (1990) Science 249: 386); (Devlin (1990) Science 249: 404); (Cwirla et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. 87: 6378); (Felici (1991) J. Mol. Biol. 222: 301); (上記のLadner)上で提供し得る。
1つの態様では、アッセイは、スクレロスチン結合パートナーを発現する細胞と候補もしくは試験化合物または薬剤を接触させ、該スクレロスチン結合パートナーの活性を調節する(例えば、刺激するか、または阻害する)試験化合物の能力を決定することを含む、細胞に基づくアッセイである。スクレロスチン結合パートナーを調節する試験化合物の能力の決定は、例えば、スクレロスチン:スクレロスチン結合パートナー相互作用を調節する候補もしくは試験化合物または薬剤の能力を決定することにより達成し得る。
スクレロスチン結合パートナーを調節する候補もしくは試験化合物または薬剤の能力の決定は、直接の結合を決定することにより、達成し得る。これらの決定は、例えば、スクレロスチン結合パートナータンパク質を、放射性同位体または酵素学的標識と結合させることにより達成し得て、その結果、該タンパク質の候補もしくは試験化合物または薬剤への結合は、複合体中の標識タンパク質を検出することにより決定し得る。例えば、タンパク質のような分子は、125I、35S、14C、または3Hで、直接または間接的に標識し得て、放射性同位体を、放射線放出の直接の計測またはシンチレーション計測により検出し得る。あるいは、分子を、酵素学的に、例えば、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、またはルシフェラーゼで標識し、酵素学的標識を、適当な物質の生成物への変換の決定により検出し得る。
反応物のいずれにも標識をすることなく、スクレロスチン結合パートナー(またはスクレロスチン:スクレロスチン結合パートナー相互作用)を調節する候補もしくは試験化合物または薬剤の能力を決定することは、また、本発明の範囲内である。例えば、マイクロフィジオメーターが、反応物のいずれにも標識をすることなく、試験化合物とスクレロスチン結合パートナーの相互作用を検出するために使用し得る(McConnell et al. (1992) Science 257: 1906)。本明細書で使用する“マイクロフィジオメーター”(例えば、Cytosensor)は、光電的にアドレス可能な電位差センサー(LAPS)を用いて、細胞がその環境を酸性化する速度を測定する、分析装置である。この酸性化速度の変化を、化合物と受容体間の相互作用の指標として使用し得る。
また他の態様では、本発明のアッセイは、タンパク質または生物学的に活性なその部分を、候補もしくは試験化合物または薬剤(例えば、またはスクレロスチン結合パートナーを調節するか、またはスクレロスチン:スクレロスチン結合パートナー相互作用から生じるシグナル伝達を調節する能力に関して試験する化合物)と接触させ、スクレロスチン結合パートナー、または生物学的に活性なその部分に結合する試験化合物の能力を決定する、無細胞アッセイである。試験化合物のスクレロスチン結合パートナータンパク質への結合は、上記したとおり、直接または間接的に、決定し得る。
そのような決定は、リアルタイム生体分子相互作用解析(BIA)のような技術を用いて、達成し得る。Sjolander et al., 1991 Anal. Chem. 63:2338-2345およびSzabo et al., 1995 Curr. Opin. Struct. Biol. 5:699-705。本明細書で使用する“BIA”は、反応物のいずれも標識することなく、リアルタイムで、生体特異的相互作用を研究するための技術である(例えば、BIAcore)。表面プラズモン共鳴(SPR)の光学的な現象の変化は、生物学的分子間のリアルタイム反応の指標として使用し得る。
本発明の上記アッセイ方法の1つ以上の態様では、スクレロスチンまたはスクレロスチン結合パートナーを、タンパク質の非複合体型から複合体型の分離を促進するために固定化し、アッセイの自動化を調整することが望ましい。試験化合物のスクレロスチンまたはスクレロスチン結合パートナーへの結合は、反応物を含むのに適当なすべての容器で達成し得る。そのような容器の例は、マイクロタイタープレート、試験管、および微小遠心管を含む。1つの態様では、タンパク質がマトリクスに結合することを可能にするドメインを加える、融合タンパク質を提供し得る。例えば、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ/キナーゼ融合タンパク質またはグルタチオン-S-トランスフェラーゼ/標的融合タンパク質を、グルタチオンセファロースビーズ(Sigma Chemical, St. Louis, Mo.)またはグルタチオン誘導体化マイクロタイタープレートに吸着させ、それを、次いで、試験化合物または試験化合物および非吸着スクレロスチンもしくはスクレロスチン結合パートナータンパク質と結合させ、混合物を、複合体形成をもたらす条件下で(例えば、塩およびpHに関して、生理学的な条件下で)インキュベートする。インキュベーション後、ビーズまたはマイクロタイタープレートウェルを洗浄して、すべての非結合成分を除去し、ビーズの場合には、マトリクスを固定し、複合体を、例えば、上記したとおり、直接または間接的に、決定する。あるいは、複合体をマトリクスから解離し、結合レベルを、標準的な技術を用いて、決定し得る。
タンパク質をマトリクスに固定する他の技術は、また、本発明のスクリーニングアッセイで使用し得る。例えば、スクレロスチンまたはスクレロスチン結合パートナーを、ビオチンおよびストレプトアビジンの共役を利用して、固定し得る。ビオチン化スクレロスチンもしくはスクレロスチン結合パートナータンパク質もしくは標的分子は、当分野で既知の技術(例えば、ビオチン化キット、Pierce Chemicals, Rockford, Ill.)を用いて、ビオチン-NHS (N-ヒドロキシ-スクシンイミド)から製造し、ストレプトアビジン被覆96ウェルプレート(Pierce Chemical)のウェルに固定し得る。あるいは、スクレロスチンまたはスクレロスチン結合パートナータンパク質または標的分子と反応する抗体を、プレートのウェルに誘導体化し、非結合スクレロスチンまたはスクレロスチン結合パートナータンパク質を、抗体抱合体により、ウェルに捕捉し得る。そのような複合体を検出する方法は、GST固定化複合体に関して上記したものに加えて、スクレロスチンまたはスクレロスチン結合パートナータンパク質または標的分子と反応する抗体を用いた複合体の免疫検出を含む。
また、本発明の他の局面では、スクレロスチンまたはスクレロスチン結合パートナータンパク質は、ツーハイブリッドアッセイまたはスリーハイブリッドアッセイで、“ベイトタンパク質”として使用して(例えば、米国特許第5,283,317号; Zervos et al., 1993 Cell 72:223-232; Madura et al., 1993 J. Biol. Chem. 268:12046-12054; Bartel et al., 1993 Biotechniques 14:920-924; Iwabuchi et al., 1993 Oncogene 8:1693-1696; およびBrent WO94/10300を参照のこと)、スクレロスチンまたはスクレロスチン結合パートナーに結合する他のタンパク質を同定し得る。そのようなスクレロスチンまたはスクレロスチン結合パートナー結合タンパク質は、また、スクレロスチンまたはスクレロスチン結合パートナー結合タンパク質によるシグナルの伝播に関与し得る。
ツーハイブリッドシステムは、分離可能なDNA結合および活性化ドメインからなる、たいていの転写因子のモジュール特性に基づく。簡潔には、アッセイは、2つの異なるDNA構築体を利用する。1つの構築体では、スクレロスチンまたはスクレロスチン結合パートナータンパク質をコードする遺伝子が、既知の転写因子(例えば、GAL-4)のDNA結合ドメインをコードする遺伝子と融合する。他方の構築体では、同定されていないタンパク質をコードする、DNA配列ライブラリーからのDNA配列(“プレイ”または“サンプル”)が、既知の転写因子の活性化ドメインをコードする遺伝子と融合する。“ベイト”および“プレイ”タンパク質が、インビボで相互作用して、キナーゼ依存性複合体を形成するとき、転写因子のDNA結合および活性化ドメインは、近接近する。この近接により、転写因子に応答する転写制御部位に操作可能に結合したレポーター遺伝子(例えば、LacZ)の転写を可能にする。レポーター遺伝子の発現を検出し、機能的な転写因子を含む細胞コロニーを単離し、該タンパク質と相互作用するスクレロスチンまたはスクレロスチン結合パートナータンパク質をコードするクローン遺伝子を得るために使用し得る。
本発明はさらに、上記スクリーニングアッセイにより同定された新規薬剤に関する。したがって、本明細書に記載したとおり同定した薬剤を、適当な動物モデルにおいてさらに使用することは、本発明の範囲内である。例えば、本明細書に記載したとおり同定した薬剤(例えば、スクレロスチン:スクレロスチン結合パートナー相互作用を調節することができる薬剤)は、該薬剤を用いた処置の有効性、毒性、または副作用を決定するために、動物モデルで使用し得る。あるいは、本明細書に記載したとおり同定した薬剤は、該薬剤の作用機序を決定するために、動物モデルで使用し得る。さらに、本発明は、本明細書に記載した処置のための、上記スクリーニングアッセイにより同定した新規薬剤の使用に関する。
医薬組成物
本明細書に記載した組成物は、医薬組成物であり得る。本発明は、生理学的に許容される担体と混合した、(i) スクレロスチン:スクレロスチン結合パートナー相互作用のモジュレーター(例えば、小分子モジュレーター)、または(ii) 本発明によるスクレロスチン結合パートナー模倣剤を含む、医薬組成物を提供する。有効成分に加えて、これらの医薬組成物は、かなりの量の1個もしくはそれ以上の無機もしくは有機の、固体もしくは液体の、薬学的に許容される担体、および生理学的に許容される希釈剤(例えば、水、リン酸緩衝生理食塩水、または生理食塩水)を含み得て、それは薬学的に使用し得る。
本発明による医薬組成物は、スクレロスチン関連障害および/または異常な骨塩密度障害の処置、改善、診断、または予防のために、温血ほ乳動物、とりわけ、ヒト(または、温血ほ乳動物、とりわけ、ヒトに由来する細胞もしくは細胞株、例えば、骨芽細胞または破骨細胞)に投与するのが適当である。
本発明による医薬組成物は、温血ほ乳動物(とりわけ、ヒト)への経腸、例えば、経鼻、直腸もしくは経口、または非経腸、例えば、筋肉内または静脈内投与のためのものである。有効成分の用量は、温血ほ乳動物の種、体重、年齢および個体の状態、個体の薬物動態データ、処置される疾患および投与形態に依存する。例えば、温血動物、例えば、約70 kgの体重のヒトに投与されるモジュレーター(例えば、小分子モジュレーター)または薬学的に許容されるその塩の用量は、好ましくは、約3 mgから約10 g、より好ましくは、約10 mgから約1.5 g、最も好ましくは、約100 mgから約1000 mg/ヒト/日であり、好ましくは、1-3回の単回投与に分割され、それは、例えば、同じ大きさであり得る。通常、小児は、成人用量の半分を受ける。
適当な用量はまた、最初に適当な動物モデルで、次いで処置される種での試験で、決定され得る。投与量および頻度は、当然に、処置される症状の性質および重篤度、望む応答、処置される個体の状態などのような因子に依存する。適当な用量は、単独で、または組み合わせて、約10 ng/kg/日から約100 μg/kg/日の範囲内である。好ましくは、1-20日間の100 ng/kg/日から約1000 ng/kg/日の用量が、適当な生物学的効果を誘導するのに期待され得る。あるいは、約1 μg/kg/日から約100 μg/kg/日のボーラス投与を、約4日間隔で与え、免疫の増強および/またはマクロファージ/単球が介在する炎症性応答による抗菌作用を働かせることができる。
医薬組成物は、約1%から約95%、好ましくは、約20%から約90%の有効成分を含む。本発明による医薬組成物は、例えば、単位用量形、例えば、アンプル、バイアル、坐薬、糖衣錠、錠剤またはカプセルの形態であり得る。
本発明の医薬組成物は、それ自体既知の方法で、例えば、慣用的な溶解、凍結乾燥、混合、造粒もしくは糖衣化工程の手段により、製造される。
有効成分の溶液、およびまた、懸濁液、ならびにとりわけ、等張水性溶液もしくは懸濁液が、好ましくは、使用され、例えば、有効成分を単独で、または担体、例えば、マンニトールと共に含む凍結乾燥組成物の場合には、そのような溶液もしくは懸濁液を使用前に調製することが可能である。医薬組成物は、滅菌することができ、および/または賦形剤、例えば、防腐剤、安定化剤、湿潤剤および/または乳化剤、可溶化剤、浸透圧を制御するための塩および/またはバッファーを含み得て、それ自体既知の方法で、例えば、慣用的な溶解または凍結乾燥工程の手段により製造される。該溶液または懸濁液は、増粘物質、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルピロリドンまたはゼラチンを含み得る。
油状懸濁液は、油状成分として、注射目的のために慣用的な、植物性の合成もしくは半合成油状物を含む。それ自体、とりわけ、酸成分として、8-22個、とりわけ、12-22個の炭素原子を含む長鎖脂肪酸、例えば、ラウリン酸、トリデシル酸、ミリスチン酸、ペンタデシル酸、パルミチン酸、マルガリン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸または相当する不飽和酸、例えば、オレイン酸、エライジン酸、エルカ酸、ブラシジン酸(brasidic acid)もしくはリノール酸を、所望により、抗酸化剤、例えば、ビタミンE、β-カロテンもしくは3,5-ジ-tert-ブチル-4-ヒドロキシトルエンの添加と共に含む、液体脂肪酸エステルとして言及し得る。それらの脂肪酸エステルのアルコール成分は、最大6個の炭素原子を有し、モノもしくはポリヒドロキシ、例えば、モノ、ジもしくはトリヒドロキシ、アルコール、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノールもしくはペンタノールまたはその異性体であるが、とりわけ、グリコールおよびグリセロールである。したがって、脂肪酸エステルの下記の例が言及し得る: オレイン酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル、パルミチン酸イソプロピル、“Labrafil M 2375”(ポリオキシエチレングリセリントリオレエート, Gattefosse, Paris)、“Miglyol 812”(C8からC12鎖長を有する飽和脂肪酸のトリグリセリド, Huels AG, Germany)、とりわけ、植物油、例えば、綿実油、アーモンド油、オリーブ油、ヒマシ油、ゴマ油、ダイズ油、およびより特には、落花生油。
注射用組成物は、滅菌条件下、慣用的な方法で製造され; 同様のことはまた、組成物をアンプルまたはバイアルに導入し、容器を密封するのに適用される。
経口投与のための医薬組成物は、有効成分を固体担体と組み合わせて、所望により、生じた混合物を造粒し、所望により、または必要により、適当な賦形剤の添加後、混合物を錠剤、糖衣錠またはカプセルへ加工することにより得ることができる。それらをプラスチック担体に組み込むことも可能であり、それにより、有効成分が一定量で拡散するか、または放出されることを可能にする。
適当な担体は、とりわけ、増量剤、例えば、糖、例えば、ラクトース、サッカロース、マンニトールもしくはソルビトール、セルロース調製物および/またはリン酸カルシウム、例えば、リン酸三カルシウムもしくはリン酸水素カルシウム、ならびに結合剤、例えば、デンプンペースト(例えば、トウモロコシ、小麦、米、ジャガイモデンプンを用いたもの)、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムおよび/もしくはポリビニルピロリドン、ならびに/または、所望により、崩壊剤、例えば、上記したデンプン、および/もしくはカルボキシメチルデンプン、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸もしくはその塩、例えば、アルギン酸ナトリウムである。賦形剤は、とりわけ、フローコンディショナーおよび滑剤、例えば、ケイ酸、タルク、ステアリン酸またはその塩、例えば、ステアリン酸マグネシウムもしくはカルシウム、および/またはポリエチレングリコールである。糖衣錠コアは、適当な、所望により、腸溶性被覆で提供され、そこでは、とりわけ、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコールおよび/またはチタンジオキシドを含み得る濃縮糖溶液、または適当な有機溶媒中の、もしくは腸溶性被覆の製造のための被覆溶液、適当なセルロース調製物（例えば、エチルセルロースフタレートもしくはヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート）の溶液で使用される。カプセルは、ゼラチンからなる乾燥充填カプセルならびにゼラチンおよび可塑剤、例えば、グリセロールもしくはソルビトールからなるソフトシールドカプセルである。乾燥充填カプセルは、顆粒の形態での有効成分を、例えば、増量剤、例えば、ラクトース、結合剤、例えば、デンプン、および/または流動促進剤、例えば、タルクもしくはステアリン酸マグネシウム、ならびに所望により、安定化剤と共に含み得る。ソフトカプセルでは、有効成分は、好ましくは、適当な油状賦形剤、例えば、脂肪油、パラフィン油もしくは液体ポリエチレングリコールに溶解または懸濁し、また、安定化剤および/または抗菌剤を加えることも可能である。染料または色素を、例えば、同定目的のために、または有効成分の異なる用量を示す目的で、錠剤もしくは糖衣錠コーティングまたはカプセルケーシングに加えることも可能である。
抗体
スクレロスチン結合パートナーを免疫原として使用し、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体製造のための標準的な技術を用いて、抗体を作製し得る。完全長ポリペプチドまたはタンパク質を使用し得るか、または本発明は、免疫原としての使用のための抗原性ペプチド断片を提供する。本発明のタンパク質の抗原性ペプチドは、スクレロスチン結合パートナーのアミノ酸配列のうち、少なくとも8個(好ましくは、10、15、20または30個)のアミノ酸残基を含み、タンパク質のエピトープを包含し、その結果、該ペプチドに対して作製された抗体は、タンパク質と特異的な免疫複合体を形成する。
抗原性ペプチドに包含される好ましいエピトープは、タンパク質の表面に位置する領域、例えば、親水性領域である。疎水性プロットまたは同様の解析を、親水性領域を同定するために使用し得る。
免疫原は、典型的には、適当な対象を免役することにより、抗体を作製するために使用する(例えば、ウサギ、ヤギ、マウスまたは他のほ乳動物)。適当な免疫原の調製物は、例えば、組み換え的に発現させるか、もしくは化学的に合成したポリペプチドを含み得る。調製物はさらに、アジュバント、例えば、フロイント完全もしくは不完全アジュバント、または同様の免疫刺激剤を含む。
本明細書で使用する抗体なる用語は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち、抗原、例えば、スクレロスチン結合パートナーに特異的に結合する抗原結合部位を含む分子を意味する。抗体は、また、スクレロスチン結合パートナーおよび/またはスクレロスチンと特異的に反応する慣用的な免疫グロブリン分子、ならびにその断片を含む。抗体は、慣用的な技術を用いて断片化し、該断片は、全抗体のために、下記したものと同じ方法で、有用性に関してスクリーニングし得る。免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分の例は、酵素、例えば、ペプシンで抗体を処理することにより製造し得る、F(ab)およびF(ab')2断片を含む。本発明は、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体を提供する。本明細書で使用する“モノクローナル抗体”または“モノクローナル抗体組成物”なる用語は、特定のエピトープと免疫反応を生じることができる一種の抗原結合部位のみを含む抗体分子の集団を意味する。
ポリクローナル抗体は、免疫原として本発明のポリペプチドを用いて、適当な対象を免疫することにより、上記したとおり作成し得る。免疫した対象の抗体力価は、標準的な技術、例えば、固定したポリペプチドを用いた酵素結合免疫吸着法(ELISA)を使用することにより、長時間、モニターし得る。所望により、抗体分子は、ほ乳動物から(例えば、血液から)単離し、さらに既知の技術、例えば、IgGフラクションを得るためのプロテインAクロマトグラフィーにより精製し得る。免疫付与後、適当な時間で、例えば、特定の抗体力価が最も高いときに、抗体産生細胞を、対象から取得し、標準的な技術、例えば、Kohler and Milstein (1975) Nature 256:495 497に記載されたもともとのハイブリドーマ技術、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術(Kozbor et al. (1983) Immunol. Today 4:72)、EBVハイブリドーマ技術(Cole et al. (1985), Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77 96)またはトリオーマ技術により、モノクローナル抗体を作製するために使用し得る。ハイブリドーマを作製するための技術は、既知である(一般に、Current Protocols in Immunology (1994) Coligan et al. (eds.) John Wiley & Sons, Inc., New York, NYを参照のこと)。本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞は、ハイブリドーマ培養上清を、興味のあるポリペプチドに結合する抗体に関して、例えば、標準的なELISAアッセイを用いてスクリーニングすることにより検出される。
モノクローナル抗体分泌ハイブリドーマを作製する別の方法で、本発明のポリペプチドに対するモノクローナル抗体は、興味のあるポリペプチドを用いて、組み換えコンビナトリアル免疫グロブリンライブラリー(例えば、抗体ファージディスプレイライブラリー)をスクリーニングすることにより、同定および単離し得る。ファージディスプレイライブラリーを作製およびスクリーニングするためのキットは、市販で入手可能である(例えば、the Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, Catalog No. 27 9400 01; およびthe Stratagene SurfZAP(商標) Phage Display Kit, Catalog No. 240612)。さらに、抗体ディスプレイライブラリーを作製およびスクリーニングするのに使用可能な方法および試薬の例は、例えば、米国特許第5,223,409号; PCT国際公開WO 92/18619; PCT国際公開WO 91/17271; PCT国際公開WO 92/20791; PCT国際公開WO 92/15679; PCT国際公開WO 93/01288; PCT国際公開WO 92/01047; PCT国際公開WO 92/09690; PCT国際公開WO 90/02809; Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9:1370 1372; Hay et al. (1992) Hum. Antibod. Hybridomas 3:81 85; Huse et al. (1989) Science 246:1275 1281; Griffiths et al. (1993) EMBO J. 12:725 734に見出され得る。
さらに、組み換え抗体、例えば、標準的な組み換えDNA技術を用いて作製し得る、ヒトおよび非ヒト部分を含む、キメラおよびヒト化モノクローナル抗体は、本発明の範囲内である。キメラ抗体は、異なる部分が、異なる動物種に由来する分子であり、例えば、マウスmAbに由来する可変領域およびヒト免疫グロブリン定常領域を有する分子である(例えば、Cabilly et al., 米国特許第4,816,567号; およびBoss et al., 米国特許第4,816397号を参照のこと(引用によりそれらの全体を本明細書の一部とする))。ヒト化抗体は、非ヒト種に由来する1個またはそれ以上の相補性決定領域(CDR)およびヒト免疫グロブリン分子に由来するフレームワーク領域を有する非ヒト種由来の抗体分子である(例えば、Queen, 米国特許第5,585,089号を参照のこと(引用によりそれらの全体を本明細書の一部とする))。そのようなキメラおよびヒト化モノクローナル抗体は、例えば、PCT国際公開WO 87/02671; 欧州特許出願184,187; 欧州特許出願171,496; 欧州特許出願173,494; PCT国際公開WO 86/01533; 米国特許第4,816,567号; 欧州特許出願125,023; Better et al. (1988) Science 240:1041 1043; Liu et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3439 3443; Liu et al. (1987) J. Immunol. 139:3521 3526; Sun et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:214 218; Nishimura et al. (1987) Canc. Res. 47:999 1005; Wood et al. (1985) Nature 314:446 449; and Shaw et al. (1988) J. Natl. Cancer Inst. 80:1553 1559); Morrison (1985) Science 229:1202 1207; Oi et al. (1986) Bio/Techniques 4:214; 米国特許第5,225,539号; Jones et al. (1986) Nature 321:552 525; Verhoeyan et al. (1988) Science 239:1534; およびBeidler et al. (1988) J. Immunol. 141:4053 4060に記載の方法を用いて、当分野で既知の組み換えDNA技術により作製し得る。
完全ヒト化抗体は、特に、ヒト患者の治療処置のために望ましい。そのような抗体は、内因性の免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子を発現することはできないが、ヒト重鎖および軽鎖遺伝子を発現することができるトランスジェニックマウスを用いて作製することが可能である。トランスジェニックマウスを、選択した抗原、例えば、本発明のポリペプチドの全部または一部を用いて、通常の方法で免疫する。抗原に対するモノクローナル抗体は、慣用的なハイブリドーマ技術を用いて、得ることができる。トランスジェニックマウスに包含されるヒト免疫グロブリントランスジーンは、B細胞分化の間、再配置され、次いで、クラススイッチおよび体細胞突然変異を受ける。したがって、そのような技術を用いて、治療上有用なIgG、IgAおよびIgE抗体を作製することが可能である。ヒト抗体を作製するためのこの技術の概説は、Lonberg and Huszar (1995, Int. Rev. Immunol. 13:65-93)を参照のこと。ヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体を作製するためのこの技術および該抗体を作製するためのプロトコールに関する詳細な考察は、例えば、米国特許第5,625,126号; 米国特許第5,633,425号; 米国特許第5,569,825号; 米国特許第5,661,016号; および米国特許第5,545,806号を参照のこと。さらに、Abgenix, Inc. (Freemont, CA)のような企業が、上記と同様の技術を用いて、選択した抗原に対するヒト抗体を提供することに参加し得る。
選択したエピトープを認識する完全ヒト化抗体は、“手引き選択(guided selection)”と呼ばれる技術を用いて作製し得る。この方法で、選択した非ヒトモノクローナル抗体、例えば、マウス抗体は、同じエピトープを認識する完全ヒト化抗体の選択を手引きするために使用し得る(Jespers et al. (1994) Bio/technology 12:899 903)。
本発明のポリペプチドに対する抗体は、標準的な技術、例えば、親和性クロマトグラフィーまたは免疫沈降により、該ポリペプチドを単離するために使用し得る。さらに、そのような抗体は、ポリペプチドの豊富さおよび発現パターンを評価するために、タンパク質の検出(例えば、細胞ライセートまたは細胞上清)で用いることができる。抗体はまた、臨床試験手順の一部として、診断上、組織中のタンパク質レベルをモニターし、例えば、特定の処置レジメンの効果を決定するために使用し得る。検出は、抗体を検出可能な物質と結合させることにより、容易になり得る。検出可能な物質の例は、さまざまな酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、および放射性物質を含む。適当な酵素の例は、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼを含み; 適当な補欠分子族複合体の例は、ストレプトアビジン/ビオチンおよびアビジン/ビオチンを含み; 適当な蛍光物質の例は、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシルまたはフィコエリトリンを含み; 発光物質の例は、ルミノールを含み; 生物発光物質の例は、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンを含み、そして、適当な放射性物質の例は、125I、131I、35Sまたは3Hを含む。
抗体様(例えば、非免疫グロブリン)スカホールド
さまざまな抗体/免疫グロブリンフレームワークまたはスカホールドを、生じたポリペプチドが標的タンパク質に特異的な少なくとも1個の結合領域を含む限り、使用し得る。そのようなフレームワークまたはスカホールドは、ヒト免疫グロブリン、またはその断片(例えば、本明細書で開示されているもの)の5つの主要なイディオタイプを含み、好ましくは、ヒト化局面を有する他の動物種の免疫グロブリンを含む。ラクダで同定されたような一本鎖重鎖抗体は、この点に関して、特に興味がある。新規フレームワーク、スカホールドおよび断片は、当業者により、発見および開発され続けている。
1つの局面では、本発明は、スクレロスチン結合パートナーに対して、非免疫グロブリンスカホールドライブラリーをスクリーニングすることにより、非免疫グロブリンに基づくスカホールド分子を作製することに関する。非免疫グロブリンスカホールドライブラリーをスクリーニングするために、ファージディスプレイ、リボソームディスプレイ、RNAディスプレイまたは酵母ディスプレイを含むが、これらに限定されない、抗体ライブラリーのために使用される同様のディスプレイ技術を使用し得る。他の局面では、本発明は、本発明のCDRが移植され得る非免疫グロブリンスカホールドを用いて、非免疫グロブリンに基づく抗体を作製することに関する。既知の、または今後知られ得る非免疫グロブリンフレームワークおよびスカホールドは、それらが、標的タンパク質に特異的な結合領域を含む限り、使用し得る。そのような化合物は、本明細書で、“標的特異的結合領域を含むポリペプチド”または抗体様スカホールドとして既知である。既知の非免疫グロブリンフレームワークまたはスカホールドは、フィブロネクチンIIIに基づく分子、例えば、アドネクチン(フィブロネクチン) (Adnexus, Inc., Waltham, MA)、アンキリン(Molecular Partners AG, Zurich, Switzerland)、ドメイン抗体(Domantis, Ltd (Cambridge, MA)およびAblynx nv (Zwijnaarde, Belgium))、リポカリン(Anticalin) (Pieris Proteolab AG, Freising, Germany)、小モジュール免疫医薬(Trubion Pharmaceuticals Inc., Seattle, WA)、マキシボディー(Avidia, Inc. (Mountain View, CA))、プロテインA (Affibody AG, Sweden)およびアフィリン(γ-クリスタリンまたはユビキチン) (Scil Proteins GmbH, Halle, Germany)を含むが、これらに限定されない。
本発明によると、抗スクレロスチンもしくは抗スクレロスチン結合パートナータンパク質抗体もしくはその断片、またはスクレロスチン特異的もしくはスクレロスチン結合パートナー特異的結合領域を含むポリペプチドは、使用されるフレームワークまたはスキャホールドにかかわらず、さらなる部分に、共有結合的、または非共有結合的に、結合し得る。さらなる部分は、ポリペプチド、不活性ポリマー、例えば、PEG、小分子、放射性同位体、金属、イオン、核酸または生物学的関連分子の他の型であり得る。免疫抱合体、抗毒素などのような既知の構築体は、また、本明細書で使用するスクレロスチン特異的もしくはスクレロスチン結合パートナー特異的結合領域を含む、抗体、抗体断片またはポリペプチドの意味に含まれる。
(i) III型フィブロネクチンに基づくスカホールド
III型フィブロネクチンに基づくスカホールドは、III型フィブロネクチンドメイン(例えば、III型フィブロネクチンの10番目のモジュール(10 Fn3ドメイン))に基づく。III型フィブロネクチンドメインは、2つのβシート間に分布する7もしくは8個のβ鎖を有し、それ自身互いに密集してタンパク質のコアを形成し、さらに、β鎖を互いに連結させ、溶媒に曝されるループ(CDRに類似の)を含む。βシートサンドウィッチの各端に、少なくとも3つのそのようなループが存在し、各端は、β鎖の方向と垂直なタンパク質の境界である(米国特許第6,818,418号)。
これらのフィブロネクチンに基づくスカホールドは、全体のホールドが、最小の機能的抗体断片のそれ、すなわち、重鎖の可変領域に密接に関連しており、ラクダおよびラマIgGにおける全体の抗原認識ユニットを含むが、免疫グロブリンではない。この構造のために、非免疫グロブリン抗体は、抗体のそれらと性質および親和性が類似する抗原結合特性を模倣する。これらのスカホールドは、インビボでの抗体の親和性成熟の過程に類似する、インビトロでのループランダム化およびシャッフリング戦略で使用し得る。これらのフィブロネクチンに基づく分子は、分子のループ領域が、標準的なクローニング技術を用いて、本発明のCDRと置換され得るスカホールドとして使用し得る。
(ii) アンキリン-分子パートナー
該技術は、アンキリン誘導リピートモジュールを有するタンパク質を、異なる標的に結合するために使用し得る可変領域を保持するためのスカホールドとして用いることに基づく。アンキリンリピートモジュールは、2個の逆平行αヘリックスおよび1個のターンからなる33個のアミノ酸ポリペプチドである。可変領域の結合は、多くは、リボソームディスプレイを用いて、最適化される。
(iii) マキシボディ/アビマー-Avidia
アビマーは、天然のAドメイン含有タンパク質、例えば、LRP-1に由来する。これらのドメインは、もともと、タンパク質-タンパク質相互作用のために使用され、ヒトでは、250を超えるタンパク質が、構造的にAドメインに基づく。アビマーは、アミノ酸リンカーに結合した多くの異なる“Aドメイン”モノマー(2-10)からなる。標的抗原に結合し得るアビマーは、例えば、20040175756; 20050053973; 20050048512; および20060008844に記載された方法を用いて、作製し得る。
(vi) プロテインA-アフィボディ
アフィボディ(登録商標)親和性リガンドは、プロテインAのIgG結合ドメインのうちの1つのスカホールドに基づく3個のヘリックスバンドルからなる、小くて、単純なタンパク質である。プロテインAは、黄色ブドウ球菌由来の表面タンパク質である。このスカホールドドメインは、58個のアミノ酸からなり、そのうちの13個は、多数のリガンド変異形を有するアフィボディ(登録商標)ライブラリィを作製するためにランダム化されている(例えば、米国特許第5,831,012号を参照のこと)。アフィボディ(登録商標)分子は、抗体を模倣し、抗体の分子量が150 kDaであるのと比較して、それらの分子量は、6 kDaである。その小サイズに関わらず、アフィボディ(登録商標)分子の結合サイトは、抗体のそれと同様である。
(v) アンチカリン-Pieris
アンチカリン(登録商標)は、Pieris ProteoLab AG社により開発された製品である。それらは、低分子で強固なタンパク質の広く知られた集団であるリポカリンに由来し、それは、通常、化学的に感受性が高いか、または不可溶な化合物の生理学的輸送もしくは貯蔵に関与する。いくらかの天然のリポカリンは、ヒト組織もしくは体液で生じる。
タンパク質構造は、固定されたフレームワークの頂点に超可変ループを有する、免疫グロブリンを彷彿させるものである。しかしながら、抗体またはそれらの組み換え断片とは対照的に、リポカリンは、160から180アミノ酸残基を有する単一ポリペプチド鎖からなり、それは、単一免疫グロブリンドメインよりもわずかに大きい。
結合ポケットを形成する4つのループのセットは、顕著な構造的可塑性を示し、さまざまな側鎖を許容する。結合サイトは、したがって、高親和性および特異性をもって、所定の異なる形の標的分子を認識するために、特有の工程(proprietary process)で再形成され得る。
リポカリンファミリーの1つのタンパク質である、Pieris Brassicaeのビリン結合タンパク質(BBP)は、4つのループのセットに突然変異を引き起こすことにより、アンチカリンを開発するために使用されている。“アンチカリン”を記載する特許出願の1つの例は、PCT WO 199916873である。
(vi) アフィリン-Scil Proteins
アフィリン(商標)分子は、タンパク質および小分子に対する特定の親和性のために設計された、小さな非免疫グロブリンタンパク質である。新規アフィリン(商標)分子は、2つのライブラリーから非常に迅速に選択され、その各々は、異なるヒト誘導スカホールドタンパク質に基づくものであり得る。
アフィリン(商標)分子は、免疫グロブリンタンパク質と、すべての構造的な相同性を示さない。Scil Proteinsは、2つのアフィリン(商標)スカホールドを使用し、そのうちの1つは、ヒト構造接眼レンズタンパク質であるγクリスタリンであり、その他は、“ユビキチン”スーパーファミリータンパク質である。両方のヒトスカホールドは、非常に小さく、高温安定性を示し、pH変化および変性剤にほぼ耐性がある。この高い安定性は、主に、タンパク質の拡張されたβシート構造による。ガンマ結晶由来のタンパク質の例は、WO200104144に記載されており、“ユビキチン様”タンパク質の例は、WO2004106368に記載されている。
融合タンパク質
本発明は、キメラもしくは融合タンパク質を提供する。本明細書で使用する“キメラタンパク質”または“融合タンパク質”は、異種ポリペプチド(すなわち、本発明と同じポリペプチド以外のポリペプチド)に操作可能に結合した本発明のポリペプチドの全部または一部(好ましくは、生物学的に活性な部分)を含む。融合タンパク質内で、“操作可能に結合した”なる用語は、本発明のポリペプチドおよび異種ポリペプチドが、互いにインフレームで融合していることを示すことを意図する。異種ポリペプチドは、本発明のポリペプチドのN末端もしくはC末端に融合し得る。
1つの有用な融合タンパク質は、本発明のポリペプチドがGST配列のC末端に融合するGST融合タンパク質である。そのような融合タンパク質は、本発明の組み換えポリペプチドの精製を促進し得る。
他の態様では、融合タンパク質は、そのN末端に異種シグナル配列を含む。例えば、本発明のポリペプチドの天然のシグナル配列を除去し、他のタンパク質由来のシグナル配列で置換し得る。例えば、バキュロウイルスエンベロープタンパク質のgp67分泌配列を、異種シグナル配列として使用し得る(Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons, 1992)。真核性異種シグナル配列の他の例は、メリチンおよびヒト胎盤アルカリホスファターゼの分泌配列を含む(Stratagene; La Jolla, California)。また他の例では、有用な原核性異種シグナル配列は、phoA分泌シグナル(上記のSambrook et al.)およびプロテインA分泌シグナル(Pharmacia Biotech; Piscataway, New Jersey)を含む。
また他の態様では、融合タンパク質は、本発明のポリペプチドの全部または一部が、免疫グロブリンタンパク質ファミリーのメンバーに由来する配列に融合した免疫グロブリン融合タンパク質である。本発明の免疫グロブリン融合タンパク質は、医薬組成物中に組み込み得て、対象に投与し、リガンド(可溶性もしくは膜結合型)と細胞表面上のタンパク質(受容体)間の相互作用を阻害し、それにより、インビボでのシグナル伝達を抑制し得る。免疫グロブリン融合タンパク質は、本発明のポリペプチドの同種リガンドのバイオアベイラビリティに影響を与えるために使用し得る。リガンド/受容体相互作用の阻害は、増殖および分化障害を処置するために、および細胞生存を調節する(例えば、促進するか、または阻害する)ために、治療上、有用であり得る。さらに、本発明の免疫グロブリン融合タンパク質は、対象内で本発明のポリペプチドに対する抗体を産生し、リガンドを精製し、スクリーニングアッセイで、リガンドと受容体の相互作用を阻害する分子を同定するための免疫原として使用し得る。
本発明のキメラおよび融合タンパク質は、標準的な組み換えDNA技術により作製し得る。他の態様では、融合遺伝子は、自動DNA合成機を含む慣用的な技術により、合成し得る。あるいは、遺伝子断片のPCR増幅は、アンカープライマーを用いて行われ得て、それは、2つの連続した遺伝子断片間に、相補的なオーバーハングを生じ、次いで、アニールし、再増幅し、キメラ遺伝子配列を産生する(例えば、上記Ausubel et al.を参照のこと)。さらに、融合部分(例えば、GSTポリペプチド)をすでにコードしている多くの発現ベクターが、市販で入手可能である。本発明のポリペプチドをコードする核酸は、そのような発現ベクターにクローン化し得て、その結果、融合部分は、インフレームで、本発明のポリペプチドに結合する。
そのような融合タンパク質の例は、LRP4の細胞外部分、例えば、配列番号3からなる細胞外部分を含む融合タンパク質である。そのような融合タンパク質の例は、配列番号4のポリペプチドである。
RNAi
本発明は、低分子干渉リボ核酸配列(siRNA)、ならびに該siRNAを用いて、細胞またはほ乳動物中で、SOST遺伝子またはスクレロスチン結合パートナーをコードする遺伝子の発現を阻害するための組成物および方法を提供する。本発明はまた、SOST遺伝子またはスクレロスチン結合パートナーをコードする遺伝子の異常な発現によって引き起こされるか、または該遺伝子が統合メンバーである経路の異常なシグナル伝達によって引き起こされるほ乳動物の病的状態および疾患を、siRNAを用いて処置するための組成物および方法を提供する。siRNAは、RNA干渉(RNAi)として既知の工程を介して、mRNAの配列特異的分解に向けられる。
本発明のsiRNAは、30ヌクレオチド長未満、一般には、19-24ヌクレオチド長の領域を有するRNA鎖(アンチセンス鎖)を含み、実質的に、SOST遺伝子またはスクレロスチン結合パートナーをコードする遺伝子のmRNA転写産物の少なくとも一部と相補的である。これらのsiRNAの使用により、スクレロスチン、BMP、またはWntシグナル伝達経路に関与する遺伝子のmRNAの標的化分解を可能にする。
本発明によるsiRNA分子は、RNA干渉(“RNAi”)を仲介する。“RNAi”なる用語は、当分野で既知であり、通常は、標的遺伝子と相補的な領域を有するsiRNAにより、細胞内で、1個またはそれ以上の標的遺伝子の阻害を意味するものと理解される。RNAiを仲介する能力に関して、siRNAを試験するためのさまざまなアッセイは、当分野で既知である(例えば、Elbashir et al., Methods 26 (2002), 199-213を参照のこと)。遺伝子発現に関する本発明によるsiRNAの効果は、細胞を本発明によるRNA分子で処理しない場合と比較して、典型的には、標的遺伝子の発現が、少なくとも、10%、33%、50%、90%、95%または99%まで阻害される。
本発明による“siRNA”または“低分子干渉リボ核酸”は、下記の局面を含む当分野で既知の意味を有する。siRNAは、生理学的条件下で、相補領域に沿ってハイブリダイズする2つのリボヌクレオチド鎖からなる。鎖は分離するが、それらは、ある態様では、分子リンカーにより結合され得る。個々のリボヌクレオチドは、自然に生じた未修飾リボヌクレオチド、自然に生じた未修飾デオキシリボヌクレオチドであり得るか、またはそれらは、本明細書の他の場所に記載したとおり、化学的に修飾されているか、もしくは合成され得る。
本発明によるsiRNA分子は、標的遺伝子のmRNA領域と実質的に同一な二本鎖領域を含む。標的遺伝子の相当する配列と100%の同一性を有する領域が適当である。この状態を、“完全に相補的な”と呼ぶ。しかしながら、該領域はまた、標的遺伝子の相当する領域と比較して、標的とされるmRNAの領域の長さに依存して、1、2または3個のミスマッチを含み得て、それ自体は、完全に相補的ではない。1つの態様では、本発明のRNA分子は、1個の特定の遺伝子を特異的に標的とする。望むmRNAのみを標的とするために、siRNA試薬は、標的mRNAと100%の相同性を有し、細胞または生物中に存在するすべての他の遺伝子に対して、少なくとも2個のミスマッチヌクレオチドを有する。効率的に特定の標的配列の発現を阻害するために、十分な配列同一性を有するsiRNAを解析し、同定する方法は、当分野で既知である。配列同一性は、当分野で既知の配列比較およびアライメントアルゴリズムにより最適化し(Gribskov and Devereux, Sequence Analysis Primer, Stockton Press, 1991を参照のこと(それは、引用により本明細書の一部とする))、例えば、デフォルトパラメーターを用いて、BESTFITソフトウェアプログラムで実行されたとおりのSmith-Watermanアルゴリズム(例えば、University of Wisconsin Genetic Computing Group)により、ヌクレオチド配列間の百分率差異(percent difference)を計算し得る。
RNAi試薬の効率に影響を与える他の要因は、標的遺伝子の標的領域である。RNAi試薬による阻害のために有効な標的遺伝子の領域は、実験により決定し得る。適当なmRNA標的領域は、コード領域であり得る。また適当なのは、非翻訳領域、例えば、5'-UTR、3'-UTRおよびスプライス部位である。例えば、Elbashir S.M. et al, 2001 EMBO J., 20, 6877-6888に記載されたトランスフェクションアッセイは、この目的のために実施し得る。当業者に既知の多くの他の適当なアッセイおよび方法が、当分野に存在する。
本発明による標的に相補的なsiRNAの領域の長さは、10から100ヌクレオチド、12から25ヌクレオチド、14から22ヌクレオチドまたは15、16、17もしくは18ヌクレオチドであり得る。相当する標的領域にミスマッチが存在するとき、相補領域の長さは、一般に、いくらかより長いものが必要とされる。
siRNAは、オーバーハング末端(それは、標的に相補的であり得るか、または相補的ではない)、またはそれ自身に相補的ではあるが、標的遺伝子には相補的ではない追加のヌクレオチドを有しているので、各々別々のsiRNA鎖の全長は、10から100ヌクレオチド、15から49ヌクレオチド、17から30ヌクレオチドまたは19から25ヌクレオチドであり得る。
“各々の鎖は、49ヌクレオチドまたはそれ以下である”なる句は、鎖内の連続したヌクレオチドの全数を意味し、すべての修飾もしくは非修飾ヌクレオチドを含むが、鎖の3'または5'末端に加え得るすべての化学的部分は含まない。鎖に挿入された短い化学的部分は、数に含まれず、2つの別々の鎖に加わるように設計された化学的リンカーは、連続したヌクレオチドを生じさせるとは考えない。
“5'末端もしくは3'末端の少なくとも1つにおける1から6個のヌクレオチドオーバーハング”なる句は、生理学的な条件下で2つの別々の鎖から形成される、相補的siRNAの構造を意味する。末端ヌクレオチドがsiRNAの二本鎖領域の一部であるとき、siRNAは、平滑末端であると考えられる。1個またはそれ以上のヌクレオチドが、末端で対を形成しないとき、オーバーハングが生じる。オーバーハングの長さは、オーバーハングヌクレオチドの数により測定される。オーバーハングヌクレオチドは、鎖の5'末端もしくは3'末端であり得る。
本発明によるsiRNAは、少なくとも1つの鎖中に、少なくとも1個の修飾ヌクレオチドを含むことにより、経口送達のために適当なインビボでの高い安定性を与える。したがって、本発明によるsiRNAは、少なくとも1個の修飾もしくは非天然のリボヌクレオチドを含む。多くの化学的修飾についての詳細な記載が、公開PCT特許出願WO 200370918に開示されているので、本明細書では繰り返し記載しない。経口送達のための適当な修飾は、実施例および本願明細書中に、十分かつ具体的に開示されいてる。適当な修飾は、糖部分に対する修飾(すなわち、糖部分の2'位、例えば、2'-O-(2-メトキシエチル)または2'-MOE) (Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504)すなわち、アルコキシアルコキシ基)または塩基部分に対する修飾(すなわち、別のヌクレオチド鎖中の他の特定の塩基と対を形成する能力を維持する、非天然もしくは修飾塩基)を含むが、これらに限定されない。他の修飾は、ホスホエステル基を置換すること(例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエートまたはホスホロジチオエートで、隣接したリボヌクレオチドを結合すること)を含むが、これらに限定されない、いわゆる“骨格”修飾を含む。最後に、ときどき、本明細書で3'キャップまたは5'キャップと呼ばれる末端修飾は、重要であり得る。キャップは、当業者に既知のより複雑な化学構造からなり得る。
1つの態様では、本発明は、SOST遺伝子またはスクレロスチン結合パートナーをコードする遺伝子の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸(dsRNA)分子を提供する。dsRNAは、互いに相補的な少なくとも2つの配列を含む。dsRNAは、第1配列を含むセンス鎖および第2配列を含むアンチセンス鎖を含む。アンチセンス鎖は、SOST遺伝子またはスクレロスチン結合パートナーをコードする遺伝子をコードするmRNAの少なくとも一部と実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、相補性領域は、30ヌクレオチド長未満、一般には、19-24ヌクレオチド長である。SOST遺伝子またはスクレロスチン結合パートナーをコードする遺伝子を発現する細胞と接触させると、dsRNAは、少なくとも40%まで、該遺伝子の発現を阻害する。
1つの態様では、本発明は、本発明のdsRNAの1つを含む細胞を提供する。細胞は、一般には、ほ乳動物細胞、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ウシまたは霊長類に由来の細胞である。
他の態様では、本発明は、生物、一般には、ヒト対象内で、SOST遺伝子またはスクレロスチン結合パートナーをコードする遺伝子の発現を阻害するための医薬組成物を提供し、それは、1個またはそれ以上の本発明のdsRNAおよび薬学的に許容される担体または送達ビヒクルを含む。
他の態様では、本発明は、細胞内で、SOST遺伝子またはスクレロスチン結合パートナーをコードする遺伝子の発現を阻害するための方法を提供し、下記の工程を含む:
(a) 細胞に二本鎖リボ核酸(dsRNA)を導入すること(ここで、該dsRNAは、互いに相補的な少なくとも2つの配列を含む)。dsRNAは、第1配列を含むセンス鎖および第2配列を含むアンチセンス鎖を含む。アンチセンス鎖は、スクレロスチンまたはスクレロスチン結合パートナーをコードするmRNAの少なくとも一部と実質的に相補的な相補性領域を含み、ここで、相補性領域は、30ヌクレオチド長未満、一般には、19-24ヌクレオチド長であり、dsRNAは、SOST遺伝子またはスクレロスチン結合パートナーをコードする遺伝子を発現する細胞と接触させると、少なくとも40%まで該遺伝子の発現を阻害し; そして
(b) 工程(a)で産生した細胞を、SOST遺伝子またはスクレロスチン結合パートナーをコードする遺伝子のmRNA転写産物の分解を得るのに十分な時間、維持し、それにより、細胞内で、該遺伝子の発現を阻害すること。
他の態様では、本発明は、スクレロスチン、BMP、またはWntシグナル伝達が介在する病的過程、例えば、スクレロスチン関連障害および/または異常な骨塩密度障害を処置するか、予防するか、または管理するための方法であって、そのような処置、予防または管理を必要とする患者に、治療上もしくは予防上有効量の本発明の1個またはそれ以上のsiRNAを投与することを含む方法を提供する。
他の態様では、本発明は、細胞内で、SOST遺伝子またはスクレロスチン結合パートナーをコードする遺伝子の発現を阻害するためのベクターを提供し、該ベクターは、本発明のsiRNAのうちの1つの少なくとも1本の鎖をコードするヌクレオチド配列に、操作可能に結合した制御配列を含む。
本発明の阻害核酸化合物は、市販で利用可能な自動DNA合成機、例えば、Applied Biosystems (Foster City, CA)モデル380B、392もしくは394 DNA/RNA合成機、または同様の装置で、慣用的な手段により合成し得る。ホスホラミダイト化学を使用し得る。本発明の阻害核酸化合物は、また、修飾され得て、例えば、多くの参照で記載されたヌクレアーゼ耐性骨格、例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホルアミデートなどが使用され得る。阻害核酸の長さは、生物学的活性が阻害されることを保証するのに十分な長さでなければならない。したがって、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドの場合には、特異的結合が、望む標的ポリヌクレオチドでのみ生じ、他の偶発的な部位では生じないことを保証するのに十分な長さでなければならない。長さの上限は、約30-40ヌクレオチド長以上のオリゴマーを合成および精製する不便さおよび費用、ミスマッチに関する、より短いオリゴヌクレオチドよりも、より長いオリゴヌクレオチドのより強い耐容性などを含むいくつかの因子により決定される。好ましくは、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、約15から40ヌクレオチド長の範囲を有する。より好ましくは、オリゴヌクレオチド部分は、約18から25ヌクレオチド長の範囲を有する。
二本鎖RNA、すなわち、センス-アンチセンスRNA(また、低分子干渉RNA (siRNA)分子と呼ばれる)は、また、SOST遺伝子またはスクレロスチン結合パートナーをコードする遺伝子に関する核酸の発現を阻害するために使用し得る。RNA干渉は、外因性低分子二本鎖RNAを投与する方法であり、そこでは、一本の鎖は、標的mRNAのコード領域に相当する(Elbashir et al.(2001) Nature 411: 494)。細胞に導入されると、siRNA分子は、外因性二本鎖RNAの分解、および内因性メッセンジャーRNAを含む、同一の配列を有する一本鎖RNAの分解を生じる。したがって、siRNAは、該技術が触媒メカニズムを介して作用すると考えられているので、伝統的なアンチセンスRNA方法論よりも有力かつ有効であり得る。好ましいsiRNA分子は、典型的には、19から25ヌクレオチド長、好ましくは、約21ヌクレオチド長である。siRNAを標的細胞へ送達するための有効な戦略は、例えば、物理的もしくは化学的トランスフェクションを用いた導入を含む。
あるいは、siRNAは、例えば、機能的siRNAまたはその前駆体の転写を可能にする、さまざまなPolIIIプロモーター発現カセットを用いて、細胞内で発現させ得る。例えば、Scherr et al. (2003) Curr. Med. Chem. 10(3):245; Turki et al. (2002) Hum. Gene Ther. 13(18):2197; Cornell et al. (2003) Nat. Struct. Biol. 10(2):91を参照のこと。本発明はまた、RNA干渉(RNAi)を仲介することができる他の低分子RNA、例えば、マイクロ-RNA (miRNA)および短鎖ヘアピンRNA (shRNA)を包含する。
他に記載がなければ、本明細書で使用されるすべての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者に通常理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載したものと類似もしくは同等の方法および材料は、本発明の実施もしくは試験において使用し得るが、適当な方法および材料を下記する。本明細書に記載したすべての公開、特許出願、特許、および他の参照は、それらの全体を引用により本明細書の一部とする。矛盾する場合には、定義を含め本明細書が統制する。さらに、材料、方法、および実施例は、単なる例示であり、限定を意図するものではない。
下記の例は、単なる例示であって、いかなる方法でも、本発明の範囲を限定することを意味しない。
実施例1: スクレロスチンとスクレロスチン結合パートナー間の結合の発見
スクレロスチン、BMP、およびWnt経路の新規モジュレーターを同定するために、我々は、系統的タンデムアフィニティー精製(TAP)法をスクレロスチンに適用した。Rigaut et al. (Nat Biotechnol. (1999) 17(10): 1030), Seraphin and Rigaut WO 00/09716特許出願)に記載されたとおり(その内容は、引用により本明細書の一部とする)、TAP精製法は、興味のある標的タンパク質へのTAPタグの融合および同種宿主細胞もしくは生物への構築体の導入を含む。
TAPタグは、TEVプロテアーゼ切断サイトにより分離された、(i) 黄色ブドウ球菌に由来するプロテインAのIgG結合ユニット(ProtA); および(ii) カルモジュリン結合ペプチド(CBP)のタンデム融合物である。それにより、複合体組成物、活性、もしくは機能についての予備知識なしに、相対的に少数の細胞からの複合体の迅速な精製が可能となる。質量分析と組み合わせて、TAP戦略は、特定の標的タンパク質と相互作用するタンパク質の同定を可能とする。
NおよびC末端タグ化スクレロスチンを、50 ng/mlのBMP-2で、4および20時間処理した、または処理していない、HEK293Tおよび骨芽細胞UMR-106に発現させた。さらに、N末端TAPタグは、CD33タンパク質からの人工的なシグナル伝達配列を含む。我々は、以前に、UMR-106および関連するHEK293細胞が、内在性SOST mRNAを発現することを発見していたので(Keller, H. and Kneissel, M (2005) Bone 37:148)、UMR-106およびHEK293T細胞を選択した。
SOST TAPタグ化タンパク質両方の適当な細胞内局在を、間接的な免疫蛍光によりモニターした。予備試験は、十分な量のTAPタグ化スクレロスチンが、TAP法を開始する生化学的に調製された膜フラクション中に見出されることを証明した。さらに、スクレロスチンの両方のタグ化構築体が、いずれかの細胞型の培地中に分泌されることが見出された。UMR-106細胞からの膜フラクション中のC-TAPスクレロスチンの発現レベルは、TAP精製のために不十分であることが見出された。それらのサンプルのさらなる加工は、中断された。
細胞を、10% FCSを含むDMEM培地中で増殖させた。刺激のために、培地を、50 ng/ml BMP2を含む新鮮な培地または新鮮な培地のみで置換した。細胞を、機械的な剥離により集める前に、4時間および20時間、刺激し、氷上で、過剰なPBSで洗浄し、免疫沈降バッファーで溶解させた。
未加工のライセートは、膜結合タンパク質を濃縮させるために、細胞下分画を受けた。
膜分画を、TAP精製を行うために使用した。分泌TAPタグ化SOST複合体の精製のために、細胞培養上清を、いくつかの細胞培養プレートから集めた。
3回の精製を、膜フラクションのために行い、細胞培養上清精製を、1回(unicates)だけ行った。
精製タンパク質複合体を、1D-SDS-PAGEで分離し、コロイド状クマシーブルーで染色した。全体のゲルレーンを、Shevchenko (Shevchenko, A., Wilm, M., Vorm, O. & Mann, M. Mass spectrometric sequencing of proteins silver-stained polyacrylamide gels. Anal. Chem. 68, 850-858 (1996))に記載されたとおり、体系的にスライスに切断し、トリプシンを用いて、タンパク質をゲル内で消化した。タンパク質同定は、LC-MS/MSで行い、MSデータを、EBI (Hinxton, UK)に管理されたInternational Protein Index (IPI)の社内監督版に対して検索をかけた。データベース検索の結果は、さらなるバイオインフォマティクス解析のために、データベースシステムに読み込まれた(ヒットをComputer Aided Target Selection (CATS)解析にかけることを含む)。
約100個のタンパク質を、E値≦10、R値≧0.67を用いて、両方の細胞株から、全体で同定する。
ヒットを、リボソームタンパク質およびRNA結合タンパク質、ならびに他の豊富な細胞質タンパク質に対してフィルターをかけた後、一覧表に選択する。スクレロスチンは、RNA結合タンパク質のための傾向を示しているように思われた(約60個の候補が、E値≦10である)。本明細書で使用される値は、下記のとおりである:
IPI= IPIデータベースからのタンパク質参照番号。
R= 一連の3回の精製内での同定の再現性。
E= タンパク質が、特定の参照データベースのために、Tandem Affinity Purificationsにより同定された、エントリーポイントの全数。
MS= 各タンパク質が、MSにより同定された、ペプチドの数。
Figure 2010526766
表Iおよび表IIで見られるとおり、下記のスクレロスチン相互作用パートナーを、この方法により同定した: バーシカン(CSPG2)、FREM2、フィブリリン2 (FBN2)、C6orf93、シンデカン4 (Sdc4)、アグリン(AGRN)、セルピン2 (PN-1)、LRP2、LRP4、LRP6、SLIT2、テナシンC、TRIM26、TRIM41、グリピカン1、アルカリホスファターゼ(ALPL)およびIL-17受容体。
Wnt1/STFアッセイにおけるスクレロスチンの作用に関して、相互作用パートナーダウンレギュレーション(siRNA)またはアップレギュレーション(過剰発現)の効果を、HEK293 (ヒト胚性腎細胞)、C28a2 (スクレロスチンが検出されないヒト軟骨細胞株)および/またはUMR106 (ラット骨肉腫細胞)細胞で試験し、生化学的アッセイを行った(例えば: ALPL)。
実施例2: LRP4データ
簡潔には、siRNAを、HEK293細胞を用いて、Wnt1誘導Wntシグナル伝達レポーターアッセイ(supertopflash (STF))で、LRP4に対してスクリーニングした。LRP4に対するすべてのsiRNAは、LRP4 mRNAをノックダウンすることができた(図1)。LRP4 mRNAノックダウンは、HEK293細胞で、STF活性を阻害するスクレロスチンの能力を減少させた(図2)。スクレロスチン用量応答曲線は、LRP4ノックダウンが、コントロールと比較して、STF/Wnt1アッセイで、SOSTのIC50の5倍の増加を生じることを示した(図3)。
HEK293細胞でのLRP4過剰発現は、STFアッセイで測定されたとおり、Wntシグナル伝達を減少させた(図4a)。HEK293細胞でのLRP4過剰発現は、SOSTのIC50の5倍の減少を生じ、Dkk1のIC50に影響を与えなかった(図4b)。HEK細胞でのLRP4とLRP5の共過剰発現は、Dkk1のIC50に影響を与えなかったが、LRP5のみを過剰発現するコントロール細胞と比較して、SOSTのIC50の35倍の減少を生じた(図4c)。HEK細胞でのLRP4とLRP6の共過剰発現は、Dkk1のIC50に影響を与えなかったが、LRP6のみを過剰発現するコントロール細胞と比較して、SOSTのIC50の20倍の減少を生じた(図4d)。これらのデータは、LRP4が、HEK細胞で、スクレロスチン作用の特異的な促進剤であることを証明する。
SOSTが存在しないC28a2細胞において、LRP4の過剰発現は、LRP5を一過的に導入した細胞で、STFアッセイにより測定されたとおり、標準的なWntシグナル伝達で、2.5倍の減少を誘導した(図5a)。C28a2細胞でのLRP4とLRP5の過剰発現は、Dkk1のIC50に影響を与えなかったが、LRP5のみを過剰発現するコントロール細胞と比較して、SOSTのIC50の16倍の減少を生じた(図5b)。600 nMでのSOST作用の効果は、52%から72%まで増加した。これらのデータは、したがって、LRP4が、C28a2細胞で、スクレロスチン作用の促進剤であるが、それは、DKK1活性に影響を与えないことを証明する。これらの発見に基づいて、LRP4は、スクレロスチンの重要な相互作用パートナーであり、スクレロスチン作用を促進するという仮説が立てられる。その結果、この相互作用の調節は、骨格組織で、スクレロスチン作用を阻害する新規の方法を提供し得る。
実施例3: アルカリホスファターゼデータ
アルカリホスファターゼに関するスクレロスチンの効果を、さらに、MC3T3細胞を用いて、細胞に基づくアルカリホスファターゼアッセイで試験した。このアッセイは、p-ニトロフェニルホスフェートの脱リン酸化を、分光学的に測定することによる、内在性アルカリホスファターゼの活性の検出に基づく。スクレロスチンが、BMP、WntおよびLRP5/6の下流のアルカリホスファターゼを阻害し得るか否かを試験するために、GK3β阻害剤誘導アルカリホスファターゼに関するスクレロスチンの効果を試験した(図6)。スクレロスチンは、LiCl誘導アルカリホスファターゼおよびGSK-3阻害剤IX (Calbiochem #361550)誘導アルカリホスファターゼを減少させた。我々は、次いで、4-メチルウンベリフェリルリン酸の脱リン酸化の蛍光検出に基づき、無細胞アッセイで、ALPL自身に関するスクレロスチンの効果を試験した(図7)。スクレロスチン用量応答曲線は、コントロールと比較して、高濃度のスクレロスチンがアルカリホスファターゼ活性を阻害することを示した。これらのデータは、アルカリホスファターゼ活性に関するSOSTの直接の阻害効果を示す。本発明は、本明細書に記載した特定の態様による範囲に限定されるべきではない。実際に、本明細書に記載したものに加えて、本発明のさまざまな修飾が、上記記載および添付の図面から、当業者に明らかになるであろう。そのような修飾は、添付した特許請求の範囲の範囲内にあるものと意図する。
さまざまな公開物が本明細書で引用されているが、その開示は、それらの全体を引用により本明細書の一部とする。

Claims (39)

  1. スクレロスチン(sclerostin)結合パートナーのモジュレーターを含む組成物を投与することを含む、スクレロスチンが介在するか、またはスクレロスチンの異常なレベルと関連する病的障害を処置する方法であって、スクレロスチン結合パートナーが、バーシカン(CSPG2)、FREM2、フィブリリン2 (FBN2)、C6orf93、シンデカン4 (Sdc4)、アグリン (AGRN)、セルピン2 (PN-1)、LRP2、LRP6、SLIT2、テナシンC、TRIM26、TRIM41、グリピカン1、IL-17受容体、アルカリホスファターゼ (ALPL)およびLRP4のうちの1つである、方法。
  2. モジュレーターが、該スクレロスチン結合パートナーに特異的に結合する薬剤である、請求項1に記載の方法。
  3. モジュレーターが、スクレロチンの該スクレロスチン結合パートナーへの結合を阻害する薬剤である、請求項1または2に記載の方法。
  4. モジュレーターが、細胞に基づくアッセイで測定したとおり、Wntシグナル伝達経路を調節する薬剤である、請求項1-3のいずれか1項に記載の方法。
  5. モジュレーターが、抗体または該抗体の抗原結合部分を含む機能性タンパク質である、請求項1-4のいずれか1項に記載の方法。
  6. 該病的障害が、異常な骨塩密度障害、例えば、骨粗鬆症または硬結性骨化症である、請求項1-5のいずれか1項に記載の方法。
  7. 該病的障害が、癌、例えば、溶骨性病変を伴う多発性骨髄腫である、請求項1-5のいずれか1項に記載の方法。
  8. スクレロスチン:スクレロスチン結合パートナー相互作用を調節することができる薬剤を同定するための方法であって、
    a) スクレロスチンとスクレロスチン結合パートナーの相互作用を許容する条件下、試験薬剤の存在および非存在で、スクレロスチンをスクレロスチン結合パートナーと接触させ; そして
    b) 該試験薬剤の存在および非存在で、スクレロスチンとスクレロスチン結合パートナーの相互作用を測定すること
    を含み、
    ここで、スクレロスチン結合パートナーが、バーシカン(CSPG2)、FREM2、フィブリリン2 (FBN2)、C6orf93、シンデカン4 (Sdc4)、アグリン(AGRN)、セルピン2 (PN-1)、LRP2、LRP6、SLIT2、テナシンC、TRIM26、TRIM41、グリピカン1、IL-17受容体、アルカリホスファターゼ(ALPL)およびLRP4のうちの1つであり、
    (i) 試験薬剤の非存在下での相互作用と比較して、試験薬剤の存在下でのスクレロスチン:スクレロスチン結合パートナー相互作用の減少が、(1) 結合したスクレロスチン結合パートナーがスクレロスチン作用を減少させるとき、スクレロスチン:スクレロスチン結合パートナー相互作用のアゴニストとして、(2) 結合したスクレロスチン結合パートナーがスクレロスチン作用を増加させるとき、スクレロスチン:スクレロスチン結合パートナー相互作用のアンタゴニストとして、試験薬剤を同定し、
    (ii) 試験薬剤の非存在下での相互作用と比較して、試験薬剤の存在下でのスクレロスチン:スクレロスチン結合パートナー相互作用の増加が、(1) 結合したスクレロスチン結合パートナーがスクレロスチン作用を減少させるとき、スクレロスチン:スクレロスチン結合パートナー相互作用のアンタゴニストとして、(2) 結合したスクレロスチン結合パートナーがスクレロスチン作用を増加させるとき、スクレロスチン:スクレロスチン結合パートナー相互作用のアゴニストとして、試験薬剤を同定する、方法。
  9. スクレロスチン:スクレロスチン結合パートナー相互作用を調節することができる薬剤を同定するための方法であって、
    a) スクレロスチンとスクレロスチン結合パートナーの相互作用を許容する条件下、試験薬剤の存在および非存在で、スクレロスチンをスクレロスチン結合パートナーと接触させ; そして
    b) スクレロスチン:スクレロスチン結合パートナー相互作用により誘導されるシグナル伝達応答もしくは酵素学的応答を測定すること
    を含み、
    ここで、スクレロスチン結合パートナーが、バーシカン(CSPG2)、FREM2、フィブリリン2 (FBN2)、C6orf93、シンデカン4 (Sdc4)、アグリン(AGRN)、セルピン2 (PN-1)、LRP2、LRP6、SLIT2、テナシンC、TRIM26、TRIM41、グリピカン1、IL-17受容体、アルカリホスファターゼ(ALPL)およびLRP4のうちの1つであり、
    試験薬剤の非存在下での応答と比較して、少なくとも10%、20%または30%の試験薬剤の存在下での応答の変化は、該試験薬剤がスクレロスチン:スクレロスチン結合パートナー相互作用を調節することができるものとして同定されることを示す、方法。
  10. wntシグナル伝達活性をシグナル伝達応答として測定する、請求項9に記載の方法。
  11. 抗体または該抗体の抗原結合部分を含む機能性タンパク質またはsiRNAである、請求項6-10のいずれか1項に記載の方法により同定したスクレロスチン結合パートナーのモジュレーター。
  12. 抗体または機能性タンパク質が、バーシカン(CSPG2)、FREM2、フィブリリン2 (FBN2)、C6orf93、シンデカン4 (Sdc4)、アグリン (AGRN)、セルピン2 (PN-1)、LRP2、LRP6、SLIT2、テナシンC、TRIM26、TRIM41、グリピカン1、IL-17受容体、アルカリホスファターゼ (ALPL)およびLRP4からなる群から選択されるスクレロスチン結合パートナーに特異的に結合する、抗体または該抗体の抗原結合部分を含む機能性タンパク質。
  13. スクレロスチンの該スクレロスチン結合パートナーへの結合を阻害する、請求項12に記載の抗体または機能性タンパク質。
  14. 細胞に基づくアッセイで測定したとおり、Wntシグナル伝達経路を調節する、請求項12または13に記載の抗体または機能性タンパク質。
  15. 該スクレロスチン結合パートナーがLRP4である、請求項12-14のいずれか1項に記載の抗体または機能性タンパク質。
  16. なし
  17. 該スクレロスチン結合パートナーがALPLである、請求項12-14のいずれか1項に記載の抗体または機能性タンパク質。
  18. 薬剤としての使用のための、請求項11-17のいずれか1項に記載のモジュレーターまたは抗体または機能性タンパク質。
  19. 異常な骨塩密度障害の処置における使用のための、請求項11-18のいずれか1項に記載のモジュレーターまたは抗体または機能性タンパク質。
  20. 該異常な骨塩密度障害が、骨粗鬆症または硬結性骨化症である、請求項19に記載のモジュレーターまたは抗体または機能性タンパク質。
  21. 癌の処置における使用のための、請求項11-18のいずれか1項に記載のモジュレーターまたは抗体または機能性タンパク質。
  22. 該癌が骨髄腫である、請求項21に記載のモジュレーターまたは抗体または機能性タンパク質。
  23. 該骨髄腫が、溶骨性病変を伴う多発性骨髄腫である、請求項22に記載のモジュレーターまたは抗体または機能性タンパク質。
  24. バーシカン(CSPG2)、FREM2、フィブリリン2 (FBN2)、C6orf93、シンデカン4 (Sdc4)、アグリン (AGRN)、セルピン2 (PN-1)、LRP2、LRP6、SLIT2、テナシンC、TRIM26、TRIM41、グリピカン1、IL-17受容体、アルカリホスファターゼ (ALPL)およびLRP4からなる群から選択されるスクレロスチン結合パートナーのほ乳動物細胞でのタンパク質発現を減少させることができるsiRNA。
  25. 該スクレロスチン結合パートナーがLRP4である、請求項24に記載のsiRNA。
  26. 薬剤としての使用のための、請求項24または25に記載のsiRNA。
  27. 異常な骨塩密度障害または癌の処置における使用のための、請求項24または25に記載のsiRNA。
  28. 対象の異常な骨塩密度または異常な骨塩密度障害に対する素因を診断する方法であって、
    a) 該対象内のスクレロスチン:スクレロスチン結合パートナー相互作用を測定し、そして
    b) 工程a)の該相互作用と健常な個体でのスクレロスチン:スクレロスチン結合パートナー相互作用を比較する工程を含み、
    対象と健常な個体間で観察される相互作用の差異が、該対象の異常な骨塩密度障害または異常な骨塩密度障害に対する素因を示し、ここで、スクレロスチン結合パートナーが、バーシカン(CSPG2)、FREM2、フィブリリン2 (FBN2)、C6orf93、シンデカン4 (Sdc4)、アグリン(AGRN)、セルピン2 (PN-1)、LRP2、LRP6、SLIT2、テナシンC、TRIM26、TRIM41、グリピカン1、IL-17受容体、アルカリホスファターゼ(ALPL)およびLRP4のうちの1つである、方法。
  29. スクレロスチンとスクレロスチン結合パートナー相互作用と同様の、類似の、または改善された機能的効果を有するスクレロスチン結合パートナー模倣剤を同定するための方法であって、
    a) スクレロスチンと候補模倣剤の相互作用を許容する条件下、試験薬剤の存在および非存在で、スクレロスチンを候補模倣剤と接触させ; そして
    b) スクレロスチンと模倣剤の相互作用を測定すること
    を含み、
    ここで、スクレロスチン結合パートナーが、バーシカン(CSPG2)、FREM2、フィブリリン2 (FBN2)、C6orf93、シンデカン4 (Sdc4)、アグリン(AGRN)、セルピン2 (PN-1)、LRP2、LRP6、SLIT2、テナシンC、TRIM26、TRIM41、グリピカン1、IL-17受容体、アルカリホスファターゼ(ALPL)およびLRP4のうちの1つであり、
    相互作用が、本明細書に記載したさまざまなスクレロスチン:スクレロスチン結合パートナー相互作用のために観察されるものの少なくとも10%であり、候補模倣剤を本発明のスクレロスチン結合パートナー模倣剤として特徴付ける、方法。
  30. 該相互作用が、スクレロスチン-模倣剤相互作用により誘導されるwntシグナル伝達応答により測定される、請求項29に記載の方法。
  31. スクレロスチン結合パートナーが、バーシカン(CSPG2)、FREM2、フィブリリン2 (FBN2)、C6orf93、シンデカン4 (Sdc4)、アグリン (AGRN)、セルピン2 (PN-1)、LRP2、LRP6、SLIT2、テナシンC、TRIM26、TRIM41、グリピカン1、IL-17受容体、アルカリホスファターゼ (ALPL)およびLRP4のうちの1つである、スクレロスチンに特異的に結合するスクレロスチン結合パートナーの断片を含む可溶性ポリペプチド。
  32. スクレロスチン結合パートナーのスクレロスチンへの結合を阻害する、請求項31に記載の可溶性ポリペプチド。
  33. LRP4のスクレロスチン結合断片を含む、請求項31または32に記載の可溶性ポリペプチド。
    （請求項３３）
    LRP4の細胞外部分からなるLRP4の断片、好ましくは、配列番号3からなるポリペプチドである、請求項32に記載の可溶性ポリペプチド。
  34. 請求項31-33のいずれか1項に記載の可溶性ポリペプチドを含む組成物を投与することを含む、異常な骨塩密度障害を処置する方法。
  35. 異常な骨塩密度障害が骨粗鬆症である、請求項34に記載の方法。
  36. 異常な骨塩密度障害が硬結性骨化症である、請求項34に記載の方法。
  37. 対象の異常な骨塩密度またはスクレロスチン関連障害に対する素因を診断する方法であって、
    a) 該対象内のスクレロスチン結合パートナー遺伝子のヌクレオチド配列を取得し、そして
    b) それを、健常な対象のそれと比較すること
    を含み、
    ここで、各スクレロスチン結合パートナー遺伝子における突然変異が、スクレロスチン関連障害またはスクレロスチン関連障害に対する素因を示し、
    スクレロスチン結合パートナーが、バーシカン(CSPG2)、FREM2、フィブリリン2 (FBN2)、C6orf93、シンデカン4 (Sdc4)、アグリン(AGRN)、セルピン2 (PN-1)、LRP2、LRP6、SLIT2、テナシンC、TRIM26、TRIM41、グリピカン1、IL-17受容体、アルカリホスファターゼ(ALPL)およびLRP4のうちの1つである、方法。
  38. 対象のスクレロスチン関連障害またはスクレロスチン関連障害に対する素因を診断する方法であって、
    a) 該対象内のスクレロスチン:スクレロスチン結合パートナー相互作用を測定し、そして
    b) 工程a)の該相互作用と健常な個体でのスクレロスチン:スクレロスチン結合パートナー相互作用を比較する工程
    を含み、
    ここで、対象と健常な個体間で観察される相互作用の差異が、該対象のスクレロスチン関連障害またはスクレロスチン関連障害に対する素因を示し、
    スクレロスチン結合パートナーが、バーシカン(CSPG2)、FREM2、フィブリリン2 (FBN2)、C6orf93、シンデカン4 (Sdc4)、アグリン(AGRN)、セルピン2 (PN-1)、LRP2、LRP6、SLIT2、テナシンC、TRIM26、TRIM41、グリピカン1、IL-17受容体、アルカリホスファターゼ(ALPL)およびLRP4のうちの1つである、方法。
  39. 対象のスクレロスチン関連障害またはスクレロスチン関連障害に対する素因を診断する方法であって、
    a) 該対象内のスクレロスチン結合パートナー遺伝子のヌクレオチド配列を取得し(ここで、スクレロスチン結合パートナーは、バーシカン(CSPG2)、FREM2、フィブリリン2 (FBN2)、C6orf93、シンデカン4 (Sdc4)、アグリン(AGRN)、セルピン2 (PN-1)、LRP2、LRP6、SLIT2、テナシンC、TRIM26、TRIM41、グリピカン1、IL-17受容体、アルカリホスファターゼ(ALPL)およびLRP4のうちの1つである)、そして
    b) それを、健常な対象のそれと比較すること
    を含み、
    ここで、各スクレロスチン結合パートナー遺伝子における突然変異が、スクレロスチン関連障害またはスクレロスチン関連障害に対する素因を示す、方法。
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