JP2009502172A - グルコース輸送関連遺伝子、ポリペプチド、およびそれらの使用方法 - Google Patents
グルコース輸送関連遺伝子、ポリペプチド、およびそれらの使用方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2009502172A JP2009502172A JP2008524123A JP2008524123A JP2009502172A JP 2009502172 A JP2009502172 A JP 2009502172A JP 2008524123 A JP2008524123 A JP 2008524123A JP 2008524123 A JP2008524123 A JP 2008524123A JP 2009502172 A JP2009502172 A JP 2009502172A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- glucose transport
- polypeptide
- activity
- expression
- glucose
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 230000006377 glucose transport Effects 0.000 title claims abstract description 140
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 112
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims description 222
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims description 212
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims description 210
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims description 198
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 19
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 106
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 98
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 93
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 89
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 88
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 87
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 87
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 83
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 72
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 claims description 59
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 37
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 claims description 36
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 claims description 36
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 claims description 36
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims description 36
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 claims description 36
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 claims description 30
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 claims description 30
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 25
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 22
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 21
- 230000004153 glucose metabolism Effects 0.000 claims description 20
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 claims description 18
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 17
- 230000004190 glucose uptake Effects 0.000 claims description 16
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 16
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims description 15
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 14
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 14
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 claims description 14
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 claims description 14
- 208000001072 type 2 diabetes mellitus Diseases 0.000 claims description 14
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 claims description 13
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 claims description 13
- 210000001789 adipocyte Anatomy 0.000 claims description 13
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 13
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 13
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 claims description 13
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 claims description 13
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims description 12
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 9
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 claims description 9
- 230000008685 targeting Effects 0.000 claims description 9
- 208000008589 Obesity Diseases 0.000 claims description 7
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 7
- 235000020824 obesity Nutrition 0.000 claims description 7
- 239000000074 antisense oligonucleotide Substances 0.000 claims description 6
- 238000012230 antisense oligonucleotides Methods 0.000 claims description 6
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 claims description 5
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 5
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 5
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 5
- 206010067584 Type 1 diabetes mellitus Diseases 0.000 claims description 4
- 239000013068 control sample Substances 0.000 claims description 4
- 230000007423 decrease Effects 0.000 claims description 4
- 108091032955 Bacterial small RNA Proteins 0.000 claims description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 2
- 230000026304 regulation of glucose transport Effects 0.000 claims 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 82
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 79
- 239000000047 product Substances 0.000 description 30
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 26
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 24
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 23
- 108091093037 Peptide nucleic acid Proteins 0.000 description 17
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 17
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 17
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 17
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 17
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 15
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 12
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 12
- 101150059448 cdk7 gene Proteins 0.000 description 12
- 239000000463 material Substances 0.000 description 12
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 12
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 11
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 11
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 11
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 11
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 11
- 101150019946 Gsk3b gene Proteins 0.000 description 9
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 9
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 9
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 9
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 9
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 9
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 8
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 8
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 8
- 238000012228 RNA interference-mediated gene silencing Methods 0.000 description 8
- 230000009471 action Effects 0.000 description 8
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 8
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 8
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 8
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 8
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 8
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 8
- -1 jun Proteins 0.000 description 8
- VRYALKFFQXWPIH-PBXRRBTRSA-N (3r,4s,5r)-3,4,5,6-tetrahydroxyhexanal Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CC=O VRYALKFFQXWPIH-PBXRRBTRSA-N 0.000 description 7
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 7
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 7
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 7
- 230000006870 function Effects 0.000 description 7
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 7
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 7
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 7
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 6
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 6
- 108091006300 SLC2A4 Proteins 0.000 description 6
- 102100033939 Solute carrier family 2, facilitated glucose transporter member 4 Human genes 0.000 description 6
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 6
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 6
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 6
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 6
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 6
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 6
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 6
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 6
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 6
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 6
- 102000004663 Calcium-Calmodulin-Dependent Protein Kinase Type 1 Human genes 0.000 description 5
- 108010003764 Calcium-Calmodulin-Dependent Protein Kinase Type 1 Proteins 0.000 description 5
- 102000001301 EGF receptor Human genes 0.000 description 5
- 108060006698 EGF receptor Proteins 0.000 description 5
- 101150086252 Eef2k gene Proteins 0.000 description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 5
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- PMMURAAUARKVCB-UHFFFAOYSA-N alpha-D-ara-dHexp Natural products OCC1OC(O)CC(O)C1O PMMURAAUARKVCB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 5
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 5
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 5
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 5
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 5
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 5
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 5
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 5
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 5
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 5
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 4
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 4
- 102100030011 Endoribonuclease Human genes 0.000 description 4
- 101150027621 Epha7 gene Proteins 0.000 description 4
- 101150093530 Fer gene Proteins 0.000 description 4
- 101001059454 Homo sapiens Serine/threonine-protein kinase MARK2 Proteins 0.000 description 4
- 102000000589 Interleukin-1 Human genes 0.000 description 4
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 4
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 4
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 4
- 102000009516 Protein Serine-Threonine Kinases Human genes 0.000 description 4
- 108010009341 Protein Serine-Threonine Kinases Proteins 0.000 description 4
- 102100028904 Serine/threonine-protein kinase MARK2 Human genes 0.000 description 4
- 101150051825 TESK2 gene Proteins 0.000 description 4
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 4
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 4
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 4
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 4
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 4
- 239000012707 chemical precursor Substances 0.000 description 4
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 4
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 4
- 201000001421 hyperglycemia Diseases 0.000 description 4
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 4
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 4
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 4
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 230000004044 response Effects 0.000 description 4
- 238000007423 screening assay Methods 0.000 description 4
- 235000004400 serine Nutrition 0.000 description 4
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 4
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 4
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 4
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 4
- OMZYUVOATZSGJY-UHFFFAOYSA-N 4,5,6,7-tetrabromo-2h-benzotriazole Chemical compound BrC1=C(Br)C(Br)=C(Br)C2=NNN=C21 OMZYUVOATZSGJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- XHSQDZXAVJRBMX-DDHJBXDOSA-N 5,6-dichloro-1-β-d-ribofuranosylbenzimidazole Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=CC(Cl)=C(Cl)C=C2N=C1 XHSQDZXAVJRBMX-DDHJBXDOSA-N 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000015693 Actin Depolymerizing Factors Human genes 0.000 description 3
- 108010038798 Actin Depolymerizing Factors Proteins 0.000 description 3
- 108010059616 Activins Proteins 0.000 description 3
- 102000005606 Activins Human genes 0.000 description 3
- WVDDGKGOMKODPV-UHFFFAOYSA-N Benzyl alcohol Chemical compound OCC1=CC=CC=C1 WVDDGKGOMKODPV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000000584 Calmodulin Human genes 0.000 description 3
- 108010041952 Calmodulin Proteins 0.000 description 3
- 101710199605 Endoribonuclease Proteins 0.000 description 3
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 3
- 102000042092 Glucose transporter family Human genes 0.000 description 3
- 108091052347 Glucose transporter family Proteins 0.000 description 3
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 3
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 3
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 3
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 3
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 3
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 3
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 3
- 102000004022 Protein-Tyrosine Kinases Human genes 0.000 description 3
- 108090000412 Protein-Tyrosine Kinases Proteins 0.000 description 3
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 3
- 102000034527 Retinoid X Receptors Human genes 0.000 description 3
- 108010038912 Retinoid X Receptors Proteins 0.000 description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101710113029 Serine/threonine-protein kinase Proteins 0.000 description 3
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 3
- 239000000488 activin Substances 0.000 description 3
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 3
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 3
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 3
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 3
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 3
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 3
- 230000002074 deregulated effect Effects 0.000 description 3
- SLPJGDQJLTYWCI-UHFFFAOYSA-N dimethyl-(4,5,6,7-tetrabromo-1h-benzoimidazol-2-yl)-amine Chemical compound BrC1=C(Br)C(Br)=C2NC(N(C)C)=NC2=C1Br SLPJGDQJLTYWCI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 3
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 3
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 3
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 3
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 3
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 3
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 3
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 3
- 238000000021 kinase assay Methods 0.000 description 3
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 3
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 3
- 230000000865 phosphorylative effect Effects 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 102000027426 receptor tyrosine kinases Human genes 0.000 description 3
- 108091008598 receptor tyrosine kinases Proteins 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 3
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 3
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 3
- RFLVMTUMFYRZCB-UHFFFAOYSA-N 1-methylguanine Chemical compound O=C1N(C)C(N)=NC2=C1N=CN2 RFLVMTUMFYRZCB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YSAJFXWTVFGPAX-UHFFFAOYSA-N 2-[(2,4-dioxo-1h-pyrimidin-5-yl)oxy]acetic acid Chemical compound OC(=O)COC1=CNC(=O)NC1=O YSAJFXWTVFGPAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FZWGECJQACGGTI-UHFFFAOYSA-N 2-amino-7-methyl-1,7-dihydro-6H-purin-6-one Chemical compound NC1=NC(O)=C2N(C)C=NC2=N1 FZWGECJQACGGTI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OIVLITBTBDPEFK-UHFFFAOYSA-N 5,6-dihydrouracil Chemical compound O=C1CCNC(=O)N1 OIVLITBTBDPEFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZLAQATDNGLKIEV-UHFFFAOYSA-N 5-methyl-2-sulfanylidene-1h-pyrimidin-4-one Chemical compound CC1=CNC(=S)NC1=O ZLAQATDNGLKIEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 9H-xanthine Chemical compound O=C1NC(=O)NC2=C1NC=N2 LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 2
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 2
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- 102000015735 Beta-catenin Human genes 0.000 description 2
- 108060000903 Beta-catenin Proteins 0.000 description 2
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 108010069682 CSK Tyrosine-Protein Kinase Proteins 0.000 description 2
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710200183 Calcium/calmodulin-dependent protein kinase I Proteins 0.000 description 2
- 102100033086 Calcium/calmodulin-dependent protein kinase type 1 Human genes 0.000 description 2
- 102000052052 Casein Kinase II Human genes 0.000 description 2
- 108010010919 Casein Kinase II Proteins 0.000 description 2
- 102100034357 Casein kinase I isoform alpha Human genes 0.000 description 2
- 102100037402 Casein kinase I isoform delta Human genes 0.000 description 2
- 102100023060 Casein kinase I isoform gamma-2 Human genes 0.000 description 2
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 2
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 2
- 102000005636 Cyclic AMP Response Element-Binding Protein Human genes 0.000 description 2
- 108010045171 Cyclic AMP Response Element-Binding Protein Proteins 0.000 description 2
- 102100026810 Cyclin-dependent kinase 7 Human genes 0.000 description 2
- 101710106276 Cyclin-dependent kinase 7 Proteins 0.000 description 2
- 101710108348 Dual specificity testis-specific protein kinase 2 Proteins 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 102000000564 Elongation Factor 2 Kinase Human genes 0.000 description 2
- 108010016831 Elongation Factor 2 Kinase Proteins 0.000 description 2
- 241000714174 Feline sarcoma virus Species 0.000 description 2
- 102000018233 Fibroblast Growth Factor Human genes 0.000 description 2
- 108050007372 Fibroblast Growth Factor Proteins 0.000 description 2
- 102100023600 Fibroblast growth factor receptor 2 Human genes 0.000 description 2
- 101710182389 Fibroblast growth factor receptor 2 Proteins 0.000 description 2
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 2
- 102000005720 Glutathione transferase Human genes 0.000 description 2
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010051975 Glycogen Synthase Kinase 3 beta Proteins 0.000 description 2
- 102100038104 Glycogen synthase kinase-3 beta Human genes 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 101000994700 Homo sapiens Casein kinase I isoform alpha Proteins 0.000 description 2
- 101001049881 Homo sapiens Casein kinase I isoform gamma-2 Proteins 0.000 description 2
- 101000701401 Homo sapiens Serine/threonine-protein kinase 38 Proteins 0.000 description 2
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 description 2
- 102000004218 Insulin-Like Growth Factor I Human genes 0.000 description 2
- 102000045959 Interleukin-1 Receptor-Like 1 Human genes 0.000 description 2
- 108700003107 Interleukin-1 Receptor-Like 1 Proteins 0.000 description 2
- HYVABZIGRDEKCD-UHFFFAOYSA-N N(6)-dimethylallyladenine Chemical compound CC(C)=CCNC1=NC=NC2=C1N=CN2 HYVABZIGRDEKCD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 2
- 102100031166 Peripheral plasma membrane protein CASK Human genes 0.000 description 2
- 101710112366 Peripheral plasma membrane protein CASK Proteins 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 2
- 239000013614 RNA sample Substances 0.000 description 2
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 2
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 2
- 102100030514 Serine/threonine-protein kinase 38 Human genes 0.000 description 2
- 102100025554 Serine/threonine-protein kinase SBK1 Human genes 0.000 description 2
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 2
- 102100029355 Testis-specific serine/threonine-protein kinase 2 Human genes 0.000 description 2
- 101710116854 Testis-specific serine/threonine-protein kinase 2 Proteins 0.000 description 2
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N Thiophosphoric acid Chemical class OP(O)(S)=O RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 2
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 2
- 102100031167 Tyrosine-protein kinase CSK Human genes 0.000 description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N Uridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N 0.000 description 2
- 206010046865 Vaccinia virus infection Diseases 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 108010023082 activin A Proteins 0.000 description 2
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 2
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 description 2
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 2
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 2
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 2
- 230000035578 autophosphorylation Effects 0.000 description 2
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 239000002981 blocking agent Substances 0.000 description 2
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000000423 cell based assay Methods 0.000 description 2
- OSASVXMJTNOKOY-UHFFFAOYSA-N chlorobutanol Chemical compound CC(C)(O)C(Cl)(Cl)Cl OSASVXMJTNOKOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 230000009918 complex formation Effects 0.000 description 2
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 2
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 230000007783 downstream signaling Effects 0.000 description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 2
- 229940126864 fibroblast growth factor Drugs 0.000 description 2
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 2
- 230000002641 glycemic effect Effects 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 2
- KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M lithium chloride Chemical compound [Li+].[Cl-] KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- OSWPMRLSEDHDFF-UHFFFAOYSA-N methyl salicylate Chemical compound COC(=O)C1=CC=CC=C1O OSWPMRLSEDHDFF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N methylparaben Chemical compound COC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 239000006225 natural substrate Substances 0.000 description 2
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 2
- QNDVLZJODHBUFM-WFXQOWMNSA-N okadaic acid Chemical compound C([C@H](O1)[C@H](C)/C=C/[C@H]2CC[C@@]3(CC[C@H]4O[C@@H](C([C@@H](O)[C@@H]4O3)=C)[C@@H](O)C[C@H](C)[C@@H]3[C@@H](CC[C@@]4(OCCCC4)O3)C)O2)C(C)=C[C@]21O[C@H](C[C@@](C)(O)C(O)=O)CC[C@H]2O QNDVLZJODHBUFM-WFXQOWMNSA-N 0.000 description 2
- VEFJHAYOIAAXEU-UHFFFAOYSA-N okadaic acid Natural products CC(CC(O)C1OC2CCC3(CCC(O3)C=CC(C)C4CC(=CC5(OC(CC(C)(O)C(=O)O)CCC5O)O4)C)OC2C(O)C1C)C6OC7(CCCCO7)CCC6C VEFJHAYOIAAXEU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 2
- 229960001972 panitumumab Drugs 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 239000000816 peptidomimetic Substances 0.000 description 2
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 2
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 description 2
- 230000004850 protein–protein interaction Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 239000002213 purine nucleotide Substances 0.000 description 2
- 150000003212 purines Chemical class 0.000 description 2
- 239000002719 pyrimidine nucleotide Substances 0.000 description 2
- 150000003230 pyrimidines Chemical class 0.000 description 2
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 2
- 239000012857 radioactive material Substances 0.000 description 2
- 239000013074 reference sample Substances 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000003345 scintillation counting Methods 0.000 description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 2
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 2
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 2
- GXPHKUHSUJUWKP-UHFFFAOYSA-N troglitazone Chemical compound C1CC=2C(C)=C(O)C(C)=C(C)C=2OC1(C)COC(C=C1)=CC=C1CC1SC(=O)NC1=O GXPHKUHSUJUWKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960001641 troglitazone Drugs 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 2
- 208000007089 vaccinia Diseases 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- UBWXUGDQUBIEIZ-UHFFFAOYSA-N (13-methyl-3-oxo-2,6,7,8,9,10,11,12,14,15,16,17-dodecahydro-1h-cyclopenta[a]phenanthren-17-yl) 3-phenylpropanoate Chemical compound CC12CCC(C3CCC(=O)C=C3CC3)C3C1CCC2OC(=O)CCC1=CC=CC=C1 UBWXUGDQUBIEIZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YMXHPSHLTSZXKH-RVBZMBCESA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 5-[(3as,4s,6ar)-2-oxo-1,3,3a,4,6,6a-hexahydrothieno[3,4-d]imidazol-4-yl]pentanoate Chemical compound C([C@H]1[C@H]2NC(=O)N[C@H]2CS1)CCCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O YMXHPSHLTSZXKH-RVBZMBCESA-N 0.000 description 1
- VRYALKFFQXWPIH-XZAHOWHSSA-N (2R,3R,4S,5R)-3,4,5,6-tetrahydroxy-1,2-ditritiohexan-1-one Chemical compound O=C([C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO)[3H])[3H] VRYALKFFQXWPIH-XZAHOWHSSA-N 0.000 description 1
- WJNGQIYEQLPJMN-IOSLPCCCSA-N 1-methylinosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)N(C)C=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O WJNGQIYEQLPJMN-IOSLPCCCSA-N 0.000 description 1
- IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 1-palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCC IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-BIIVOSGPSA-N 2'-deoxythymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-BIIVOSGPSA-N 0.000 description 1
- 150000003923 2,5-pyrrolediones Chemical class 0.000 description 1
- HLYBTPMYFWWNJN-UHFFFAOYSA-N 2-(2,4-dioxo-1h-pyrimidin-5-yl)-2-hydroxyacetic acid Chemical compound OC(=O)C(O)C1=CNC(=O)NC1=O HLYBTPMYFWWNJN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SGAKLDIYNFXTCK-UHFFFAOYSA-N 2-[(2,4-dioxo-1h-pyrimidin-5-yl)methylamino]acetic acid Chemical compound OC(=O)CNCC1=CNC(=O)NC1=O SGAKLDIYNFXTCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IDOQDZANRZQBTP-UHFFFAOYSA-N 2-[2-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethanol Chemical compound CC(C)(C)CC(C)(C)C1=CC=CC=C1OCCO IDOQDZANRZQBTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XMSMHKMPBNTBOD-UHFFFAOYSA-N 2-dimethylamino-6-hydroxypurine Chemical compound N1C(N(C)C)=NC(=O)C2=C1N=CN2 XMSMHKMPBNTBOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SMADWRYCYBUIKH-UHFFFAOYSA-N 2-methyl-7h-purin-6-amine Chemical compound CC1=NC(N)=C2NC=NC2=N1 SMADWRYCYBUIKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UMCMPZBLKLEWAF-BCTGSCMUSA-N 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]propane-1-sulfonate Chemical compound C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(=O)NCCC[N+](C)(C)CCCS([O-])(=O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 UMCMPZBLKLEWAF-BCTGSCMUSA-N 0.000 description 1
- GUQQBLRVXOUDTN-XOHPMCGNSA-N 3-[dimethyl-[3-[[(4r)-4-[(3r,5s,7r,8r,9s,10s,12s,13r,14s,17r)-3,7,12-trihydroxy-10,13-dimethyl-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-tetradecahydro-1h-cyclopenta[a]phenanthren-17-yl]pentanoyl]amino]propyl]azaniumyl]-2-hydroxypropane-1-sulfonate Chemical compound C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(=O)NCCC[N+](C)(C)CC(O)CS([O-])(=O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 GUQQBLRVXOUDTN-XOHPMCGNSA-N 0.000 description 1
- KOLPWZCZXAMXKS-UHFFFAOYSA-N 3-methylcytosine Chemical compound CN1C(N)=CC=NC1=O KOLPWZCZXAMXKS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XRYJULCDUUATMC-CYBMUJFWSA-N 4-[4-[[(1r)-1-phenylethyl]amino]-7h-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-6-yl]phenol Chemical compound N([C@H](C)C=1C=CC=CC=1)C(C=1C=2)=NC=NC=1NC=2C1=CC=C(O)C=C1 XRYJULCDUUATMC-CYBMUJFWSA-N 0.000 description 1
- GJAKJCICANKRFD-UHFFFAOYSA-N 4-acetyl-4-amino-1,3-dihydropyrimidin-2-one Chemical compound CC(=O)C1(N)NC(=O)NC=C1 GJAKJCICANKRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OVONXEQGWXGFJD-UHFFFAOYSA-N 4-sulfanylidene-1h-pyrimidin-2-one Chemical compound SC=1C=CNC(=O)N=1 OVONXEQGWXGFJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MQJSSLBGAQJNER-UHFFFAOYSA-N 5-(methylaminomethyl)-1h-pyrimidine-2,4-dione Chemical compound CNCC1=CNC(=O)NC1=O MQJSSLBGAQJNER-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LQLQRFGHAALLLE-UHFFFAOYSA-N 5-bromouracil Chemical compound BrC1=CNC(=O)NC1=O LQLQRFGHAALLLE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VKLFQTYNHLDMDP-PNHWDRBUSA-N 5-carboxymethylaminomethyl-2-thiouridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=S)NC(=O)C(CNCC(O)=O)=C1 VKLFQTYNHLDMDP-PNHWDRBUSA-N 0.000 description 1
- ZFTBZKVVGZNMJR-UHFFFAOYSA-N 5-chlorouracil Chemical compound ClC1=CNC(=O)NC1=O ZFTBZKVVGZNMJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KSNXJLQDQOIRIP-UHFFFAOYSA-N 5-iodouracil Chemical compound IC1=CNC(=O)NC1=O KSNXJLQDQOIRIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KELXHQACBIUYSE-UHFFFAOYSA-N 5-methoxy-1h-pyrimidine-2,4-dione Chemical compound COC1=CNC(=O)NC1=O KELXHQACBIUYSE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LRSASMSXMSNRBT-UHFFFAOYSA-N 5-methylcytosine Chemical compound CC1=CNC(=O)N=C1N LRSASMSXMSNRBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UDZRZGNQQSUDNP-UHFFFAOYSA-N 6-(aminomethyl)-5-methoxy-2-sulfanylidene-1H-pyrimidin-4-one Chemical compound COC=1C(NC(NC=1CN)=S)=O UDZRZGNQQSUDNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DCPSTSVLRXOYGS-UHFFFAOYSA-N 6-amino-1h-pyrimidine-2-thione Chemical compound NC1=CC=NC(S)=N1 DCPSTSVLRXOYGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CJIJXIFQYOPWTF-UHFFFAOYSA-N 7-hydroxycoumarin Natural products O1C(=O)C=CC2=CC(O)=CC=C21 CJIJXIFQYOPWTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MSSXOMSJDRHRMC-UHFFFAOYSA-N 9H-purine-2,6-diamine Chemical compound NC1=NC(N)=C2NC=NC2=N1 MSSXOMSJDRHRMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150107888 AKT2 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010022752 Acetylcholinesterase Proteins 0.000 description 1
- 102000012440 Acetylcholinesterase Human genes 0.000 description 1
- 206010069754 Acquired gene mutation Diseases 0.000 description 1
- 102000018918 Activin Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010052946 Activin Receptors Proteins 0.000 description 1
- 108010000239 Aequorin Proteins 0.000 description 1
- 102100024321 Alkaline phosphatase, placental type Human genes 0.000 description 1
- 108020000948 Antisense Oligonucleotides Proteins 0.000 description 1
- 241000416162 Astragalus gummifer Species 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 1
- 108010059108 CD18 Antigens Proteins 0.000 description 1
- 102100030933 CDK-activating kinase assembly factor MAT1 Human genes 0.000 description 1
- 101710175583 CDK-activating kinase assembly factor MAT1 Proteins 0.000 description 1
- 108091007914 CDKs Proteins 0.000 description 1
- HIYAVKIYRIFSCZ-CVXKHCKVSA-N Calcimycin Chemical compound CC([C@H]1OC2([C@@H](C[C@H]1C)C)O[C@H]([C@H](CC2)C)CC=1OC2=CC=C(C(=C2N=1)C(O)=O)NC)C(=O)C1=CC=CN1 HIYAVKIYRIFSCZ-CVXKHCKVSA-N 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010047048 Casein Kinase Idelta Proteins 0.000 description 1
- 102100023067 Casein kinase I isoform gamma-3 Human genes 0.000 description 1
- 102000011632 Caseins Human genes 0.000 description 1
- 108010076119 Caseins Proteins 0.000 description 1
- VWDXGKUTGQJJHJ-UHFFFAOYSA-N Catenarin Natural products C1=C(O)C=C2C(=O)C3=C(O)C(C)=CC(O)=C3C(=O)C2=C1O VWDXGKUTGQJJHJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100028633 Cdc42-interacting protein 4 Human genes 0.000 description 1
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 1
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 108091033380 Coding strand Proteins 0.000 description 1
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 1
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 1
- 108020004394 Complementary RNA Proteins 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- 229920002261 Corn starch Polymers 0.000 description 1
- 108010058546 Cyclin D1 Proteins 0.000 description 1
- 102000002495 Cyclin H Human genes 0.000 description 1
- 108010068237 Cyclin H Proteins 0.000 description 1
- 108090000266 Cyclin-dependent kinases Proteins 0.000 description 1
- 102000003903 Cyclin-dependent kinases Human genes 0.000 description 1
- 201000003883 Cystic fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N D-Luciferin Chemical compound OC(=O)[C@H]1CSC(C=2SC3=CC=C(O)C=C3N=2)=N1 IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- 101710177611 DNA polymerase II large subunit Proteins 0.000 description 1
- 101710184669 DNA polymerase II small subunit Proteins 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- XPDXVDYUQZHFPV-UHFFFAOYSA-N Dansyl Chloride Chemical compound C1=CC=C2C(N(C)C)=CC=CC2=C1S(Cl)(=O)=O XPDXVDYUQZHFPV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000010170 Death domains Human genes 0.000 description 1
- 108050001718 Death domains Proteins 0.000 description 1
- CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N Dehydro-luciferin Natural products OC(=O)C1=CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001050985 Disco Species 0.000 description 1
- 102100036723 Discoidin domain-containing receptor 2 Human genes 0.000 description 1
- 101710127786 Discoidin domain-containing receptor 2 Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 239000010282 Emodin Substances 0.000 description 1
- RBLJKYCRSCQLRP-UHFFFAOYSA-N Emodin-dianthron Natural products O=C1C2=CC(C)=CC(O)=C2C(=O)C2=C1CC(=O)C=C2O RBLJKYCRSCQLRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100027723 Endogenous retrovirus group K member 6 Rec protein Human genes 0.000 description 1
- 108010093099 Endoribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 description 1
- 102000050554 Eph Family Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108091008815 Eph receptors Proteins 0.000 description 1
- 108010055153 EphA7 Receptor Proteins 0.000 description 1
- 108010007005 Estrogen Receptor alpha Proteins 0.000 description 1
- 102100038595 Estrogen receptor Human genes 0.000 description 1
- 102100021066 Fibroblast growth factor receptor substrate 2 Human genes 0.000 description 1
- BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N Fivefly Luciferin Natural products OC(=O)C1CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N Fluorouracil Chemical compound FC1=CNC(=O)NC1=O GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100024165 G1/S-specific cyclin-D1 Human genes 0.000 description 1
- 108010001483 Glycogen Synthase Proteins 0.000 description 1
- NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N Guanosine Chemical class C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 1
- 108020004202 Guanylate Kinase Proteins 0.000 description 1
- 108090001102 Hammerhead ribozyme Proteins 0.000 description 1
- YOOXNSPYGCZLAX-UHFFFAOYSA-N Helminthosporin Natural products C1=CC(O)=C2C(=O)C3=CC(C)=CC(O)=C3C(=O)C2=C1O YOOXNSPYGCZLAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101001026336 Homo sapiens Casein kinase I isoform delta Proteins 0.000 description 1
- 101001049879 Homo sapiens Casein kinase I isoform gamma-3 Proteins 0.000 description 1
- 101000766830 Homo sapiens Cdc42-interacting protein 4 Proteins 0.000 description 1
- 101000818410 Homo sapiens Fibroblast growth factor receptor substrate 2 Proteins 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010052341 Impaired insulin secretion Diseases 0.000 description 1
- 102100028288 Inactive serine/threonine-protein kinase VRK3 Human genes 0.000 description 1
- 101710123193 Inactive serine/threonine-protein kinase VRK3 Proteins 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N Inosine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=NC=NC(O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- 229930010555 Inosine Natural products 0.000 description 1
- 206010022489 Insulin Resistance Diseases 0.000 description 1
- 102000019223 Interleukin-1 receptor Human genes 0.000 description 1
- 108050006617 Interleukin-1 receptor Proteins 0.000 description 1
- 125000002842 L-seryl group Chemical group O=C([*])[C@](N([H])[H])([H])C([H])([H])O[H] 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 102000011257 L27 domains Human genes 0.000 description 1
- 108050001482 L27 domains Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 1
- DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N Luciferin Natural products CCc1c(C)c(CC2NC(=O)C(=C2C=C)C)[nH]c1Cc3[nH]c4C(=C5/NC(CC(=O)O)C(C)C5CC(=O)O)CC(=O)c4c3C DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710141347 Major envelope glycoprotein Proteins 0.000 description 1
- 206010064912 Malignant transformation Diseases 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 108010036176 Melitten Proteins 0.000 description 1
- 244000246386 Mentha pulegium Species 0.000 description 1
- 235000016257 Mentha pulegium Nutrition 0.000 description 1
- 235000004357 Mentha x piperita Nutrition 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 229920000168 Microcrystalline cellulose Polymers 0.000 description 1
- 108091022875 Microtubule Proteins 0.000 description 1
- 102000029749 Microtubule Human genes 0.000 description 1
- 102000056248 Mitogen-activated protein kinase 13 Human genes 0.000 description 1
- 108010008707 Mucin-1 Proteins 0.000 description 1
- 102000007298 Mucin-1 Human genes 0.000 description 1
- 102000007474 Multiprotein Complexes Human genes 0.000 description 1
- 108010085220 Multiprotein Complexes Proteins 0.000 description 1
- 108010077432 Myeloid Differentiation Factor 88 Proteins 0.000 description 1
- 102000010168 Myeloid Differentiation Factor 88 Human genes 0.000 description 1
- 102100025243 Myeloid cell surface antigen CD33 Human genes 0.000 description 1
- SGSSKEDGVONRGC-UHFFFAOYSA-N N(2)-methylguanine Chemical compound O=C1NC(NC)=NC2=C1N=CN2 SGSSKEDGVONRGC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BKAYIFDRRZZKNF-VIFPVBQESA-N N-acetylcarnosine Chemical compound CC(=O)NCCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CN=CN1 BKAYIFDRRZZKNF-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- IZWSFJTYBVKZNK-UHFFFAOYSA-O N-dodecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)CCCS(O)(=O)=O IZWSFJTYBVKZNK-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 108091092724 Noncoding DNA Proteins 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 101001092938 Oryza sativa subsp. japonica Serine/threonine-protein kinase SAPK4 Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 102000000470 PDZ domains Human genes 0.000 description 1
- 108050008994 PDZ domains Proteins 0.000 description 1
- 102000014160 PTEN Phosphohydrolase Human genes 0.000 description 1
- 108010011536 PTEN Phosphohydrolase Proteins 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 1
- 102000005877 Peptide Initiation Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010044843 Peptide Initiation Factors Proteins 0.000 description 1
- 108010067902 Peptide Library Proteins 0.000 description 1
- 108010043958 Peptoids Proteins 0.000 description 1
- 102000004422 Phospholipase C gamma Human genes 0.000 description 1
- 108010056751 Phospholipase C gamma Proteins 0.000 description 1
- 108010004729 Phycoerythrin Proteins 0.000 description 1
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 1
- 229920002732 Polyanhydride Polymers 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 229920000954 Polyglycolide Polymers 0.000 description 1
- 229920001710 Polyorthoester Polymers 0.000 description 1
- 102000012412 Presenilin-1 Human genes 0.000 description 1
- 108010036933 Presenilin-1 Proteins 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100021487 Protein S100-B Human genes 0.000 description 1
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 1
- 229940122454 Protein phosphatase 2A inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 101100084022 Pseudomonas aeruginosa (strain ATCC 15692 / DSM 22644 / CIP 104116 / JCM 14847 / LMG 12228 / 1C / PRS 101 / PAO1) lapA gene Proteins 0.000 description 1
- 102000009572 RNA Polymerase II Human genes 0.000 description 1
- 108010009460 RNA Polymerase II Proteins 0.000 description 1
- 102000000574 RNA-Induced Silencing Complex Human genes 0.000 description 1
- 108010016790 RNA-Induced Silencing Complex Proteins 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 230000010799 Receptor Interactions Effects 0.000 description 1
- 102000004278 Receptor Protein-Tyrosine Kinases Human genes 0.000 description 1
- 108090000873 Receptor Protein-Tyrosine Kinases Proteins 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- NTGIIKCGBNGQAR-UHFFFAOYSA-N Rheoemodin Natural products C1=C(O)C=C2C(=O)C3=CC(O)=CC(O)=C3C(=O)C2=C1O NTGIIKCGBNGQAR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000009738 Ribosomal Protein S6 Kinases Human genes 0.000 description 1
- 108010034782 Ribosomal Protein S6 Kinases Proteins 0.000 description 1
- 102000000395 SH3 domains Human genes 0.000 description 1
- 108050008861 SH3 domains Proteins 0.000 description 1
- 108091006298 SLC2A3 Proteins 0.000 description 1
- 108060006706 SRC Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 101710152812 Serine/threonine-protein kinase SBK1 Proteins 0.000 description 1
- 102100028235 Serine/threonine-protein kinase VRK1 Human genes 0.000 description 1
- 101710196244 Serine/threonine-protein kinase VRK1 Proteins 0.000 description 1
- 102100028234 Serine/threonine-protein kinase VRK2 Human genes 0.000 description 1
- 101710196279 Serine/threonine-protein kinase VRK2 Proteins 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DWAQJAXMDSEUJJ-UHFFFAOYSA-M Sodium bisulfite Chemical compound [Na+].OS([O-])=O DWAQJAXMDSEUJJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102100022722 Solute carrier family 2, facilitated glucose transporter member 3 Human genes 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 102000000551 Syk Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108010016672 Syk Kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000001435 Synapsin Human genes 0.000 description 1
- 108050009621 Synapsin Proteins 0.000 description 1
- 241000223892 Tetrahymena Species 0.000 description 1
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 101710182709 Toll-interacting protein Proteins 0.000 description 1
- 102100024652 Toll-interacting protein Human genes 0.000 description 1
- 229920001615 Tragacanth Polymers 0.000 description 1
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 229920004929 Triton X-114 Polymers 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- GBOGMAARMMDZGR-UHFFFAOYSA-N UNPD149280 Natural products N1C(=O)C23OC(=O)C=CC(O)CCCC(C)CC=CC3C(O)C(=C)C(C)C2C1CC1=CC=CC=C1 GBOGMAARMMDZGR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- 108010035430 X-Box Binding Protein 1 Proteins 0.000 description 1
- RJZZTNAWUTTWMJ-WYIOVZGUSA-N [(2r,3s,5s)-5-amino-2-[2-(4-methoxyphenyl)-2,2-diphenylethyl]-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-3-yl]oxyphosphonamidous acid Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C(C=1C=CC=CC=1)(C=1C=CC=CC=1)C[C@@H]1[C@@H](OP(N)O)C[C@](N)(N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)O1 RJZZTNAWUTTWMJ-WYIOVZGUSA-N 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 229940022698 acetylcholinesterase Drugs 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 1
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 description 1
- 101150045355 akt1 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000000783 alginic acid Substances 0.000 description 1
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 1
- 229960001126 alginic acid Drugs 0.000 description 1
- 150000004781 alginic acids Chemical class 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 210000000628 antibody-producing cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003429 antifungal agent Substances 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 1
- KZNIFHPLKGYRTM-UHFFFAOYSA-N apigenin Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1C1=CC(=O)C2=C(O)C=C(O)C=C2O1 KZNIFHPLKGYRTM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940117893 apigenin Drugs 0.000 description 1
- XADJWCRESPGUTB-UHFFFAOYSA-N apigenin Natural products C1=CC(O)=CC=C1C1=CC(=O)C2=CC(O)=C(O)C=C2O1 XADJWCRESPGUTB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000008714 apigenin Nutrition 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 230000009118 appropriate response Effects 0.000 description 1
- 235000019445 benzyl alcohol Nutrition 0.000 description 1
- 229960004217 benzyl alcohol Drugs 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N beta-L-uridine Natural products O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 229920000249 biocompatible polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 238000007413 biotinylation Methods 0.000 description 1
- 230000006287 biotinylation Effects 0.000 description 1
- 230000008499 blood brain barrier function Effects 0.000 description 1
- 210000001218 blood-brain barrier Anatomy 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- DQXBYHZEEUGOBF-UHFFFAOYSA-N but-3-enoic acid;ethene Chemical compound C=C.OC(=O)CC=C DQXBYHZEEUGOBF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HIYAVKIYRIFSCZ-UHFFFAOYSA-N calcium ionophore A23187 Natural products N=1C2=C(C(O)=O)C(NC)=CC=C2OC=1CC(C(CC1)C)OC1(C(CC1C)C)OC1C(C)C(=O)C1=CC=CN1 HIYAVKIYRIFSCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 1
- 230000006369 cell cycle progression Effects 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 230000012292 cell migration Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 1
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 description 1
- 230000004700 cellular uptake Effects 0.000 description 1
- 210000003793 centrosome Anatomy 0.000 description 1
- 229960005395 cetuximab Drugs 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 229960004926 chlorobutanol Drugs 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000008632 circadian clock Effects 0.000 description 1
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 1
- 229940075614 colloidal silicon dioxide Drugs 0.000 description 1
- 238000013270 controlled release Methods 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 239000008120 corn starch Substances 0.000 description 1
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 1
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- GBOGMAARMMDZGR-JREHFAHYSA-N cytochalasin B Natural products C[C@H]1CCC[C@@H](O)C=CC(=O)O[C@@]23[C@H](C=CC1)[C@H](O)C(=C)[C@@H](C)[C@@H]2[C@H](Cc4ccccc4)NC3=O GBOGMAARMMDZGR-JREHFAHYSA-N 0.000 description 1
- GBOGMAARMMDZGR-TYHYBEHESA-N cytochalasin B Chemical compound C([C@H]1[C@@H]2[C@@H](C([C@@H](O)[C@@H]3/C=C/C[C@H](C)CCC[C@@H](O)/C=C/C(=O)O[C@@]23C(=O)N1)=C)C)C1=CC=CC=C1 GBOGMAARMMDZGR-TYHYBEHESA-N 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001934 delay Effects 0.000 description 1
- 230000003831 deregulation Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 150000001982 diacylglycerols Chemical class 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- UGMCXQCYOVCMTB-UHFFFAOYSA-K dihydroxy(stearato)aluminium Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)O[Al](O)O UGMCXQCYOVCMTB-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 1
- 239000007884 disintegrant Substances 0.000 description 1
- 239000002612 dispersion medium Substances 0.000 description 1
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 1
- 239000003596 drug target Substances 0.000 description 1
- 229940121647 egfr inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 1
- RHMXXJGYXNZAPX-UHFFFAOYSA-N emodin Chemical compound C1=C(O)C=C2C(=O)C3=CC(C)=CC(O)=C3C(=O)C2=C1O RHMXXJGYXNZAPX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VASFLQKDXBAWEL-UHFFFAOYSA-N emodin Natural products OC1=C(OC2=C(C=CC(=C2C1=O)O)O)C1=CC=C(C=C1)O VASFLQKDXBAWEL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 229940082789 erbitux Drugs 0.000 description 1
- AAKJLRGGTJKAMG-UHFFFAOYSA-N erlotinib Chemical compound C=12C=C(OCCOC)C(OCCOC)=CC2=NC=NC=1NC1=CC=CC(C#C)=C1 AAKJLRGGTJKAMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N ether Substances CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005038 ethylene vinyl acetate Substances 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 102000013373 fibrillar collagen Human genes 0.000 description 1
- 108060002894 fibrillar collagen Proteins 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002949 fluorouracil Drugs 0.000 description 1
- 235000013355 food flavoring agent Nutrition 0.000 description 1
- 235000003599 food sweetener Nutrition 0.000 description 1
- XGALLCVXEZPNRQ-UHFFFAOYSA-N gefitinib Chemical compound C=12C=C(OCCCN3CCOCC3)C(OC)=CC2=NC=NC=1NC1=CC=C(F)C(Cl)=C1 XGALLCVXEZPNRQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000012226 gene silencing method Methods 0.000 description 1
- 229930182478 glucoside Natural products 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 208000035474 group of disease Diseases 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- RQFCJASXJCIDSX-UUOKFMHZSA-N guanosine 5'-monophosphate Chemical group C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O RQFCJASXJCIDSX-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 1
- 102000006638 guanylate kinase Human genes 0.000 description 1
- 108010038082 heparin proteoglycan Proteins 0.000 description 1
- 238000013537 high throughput screening Methods 0.000 description 1
- 235000001050 hortel pimenta Nutrition 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 1
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 1
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 150000002484 inorganic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229910010272 inorganic material Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960003786 inosine Drugs 0.000 description 1
- 239000000138 intercalating agent Substances 0.000 description 1
- 230000031146 intracellular signal transduction Effects 0.000 description 1
- 210000003093 intracellular space Anatomy 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000007951 isotonicity adjuster Substances 0.000 description 1
- 229940043355 kinase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 239000000787 lecithin Substances 0.000 description 1
- 235000010445 lecithin Nutrition 0.000 description 1
- 229940067606 lecithin Drugs 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- XMGQYMWWDOXHJM-UHFFFAOYSA-N limonene Chemical compound CC(=C)C1CCC(C)=CC1 XMGQYMWWDOXHJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 239000007937 lozenge Substances 0.000 description 1
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 1
- HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N luminol Chemical compound O=C1NNC(=O)C2=C1C(N)=CC=C2 HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 1
- 230000036212 malign transformation Effects 0.000 description 1
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 229950008001 matuzumab Drugs 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- VDXZNPDIRNWWCW-JFTDCZMZSA-N melittin Chemical compound NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(N)=O)CC1=CNC2=CC=CC=C12 VDXZNPDIRNWWCW-JFTDCZMZSA-N 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- IZAGSTRIDUNNOY-UHFFFAOYSA-N methyl 2-[(2,4-dioxo-1h-pyrimidin-5-yl)oxy]acetate Chemical compound COC(=O)COC1=CNC(=O)NC1=O IZAGSTRIDUNNOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000010270 methyl p-hydroxybenzoate Nutrition 0.000 description 1
- 239000004292 methyl p-hydroxybenzoate Substances 0.000 description 1
- 229960001047 methyl salicylate Drugs 0.000 description 1
- 229960002216 methylparaben Drugs 0.000 description 1
- 229940016286 microcrystalline cellulose Drugs 0.000 description 1
- 235000019813 microcrystalline cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000008108 microcrystalline cellulose Substances 0.000 description 1
- 210000003632 microfilament Anatomy 0.000 description 1
- 210000004688 microtubule Anatomy 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000003032 molecular docking Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 125000000896 monocarboxylic acid group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000663 muscle cell Anatomy 0.000 description 1
- ZTLGJPIZUOVDMT-UHFFFAOYSA-N n,n-dichlorotriazin-4-amine Chemical compound ClN(Cl)C1=CC=NN=N1 ZTLGJPIZUOVDMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XJVXMWNLQRTRGH-UHFFFAOYSA-N n-(3-methylbut-3-enyl)-2-methylsulfanyl-7h-purin-6-amine Chemical compound CSC1=NC(NCCC(C)=C)=C2NC=NC2=N1 XJVXMWNLQRTRGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UMWKZHPREXJQGR-XOSAIJSUSA-N n-methyl-n-[(2s,3r,4r,5r)-2,3,4,5,6-pentahydroxyhexyl]decanamide Chemical compound CCCCCCCCCC(=O)N(C)C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO UMWKZHPREXJQGR-XOSAIJSUSA-N 0.000 description 1
- SBWGZAXBCCNRTM-CTHBEMJXSA-N n-methyl-n-[(2s,3r,4r,5r)-2,3,4,5,6-pentahydroxyhexyl]octanamide Chemical compound CCCCCCCC(=O)N(C)C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO SBWGZAXBCCNRTM-CTHBEMJXSA-N 0.000 description 1
- 229940097496 nasal spray Drugs 0.000 description 1
- 239000007922 nasal spray Substances 0.000 description 1
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 1
- 230000004766 neurogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 108091008046 non-receptor tyrosine kinases Proteins 0.000 description 1
- 102000037979 non-receptor tyrosine kinases Human genes 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000346 nonvolatile oil Substances 0.000 description 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 1
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 description 1
- HEGSGKPQLMEBJL-RKQHYHRCSA-N octyl beta-D-glucopyranoside Chemical compound CCCCCCCCO[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O HEGSGKPQLMEBJL-RKQHYHRCSA-N 0.000 description 1
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 description 1
- 239000007968 orange flavor Substances 0.000 description 1
- 150000002902 organometallic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 229940083251 peripheral vasodilators purine derivative Drugs 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 229960003742 phenol Drugs 0.000 description 1
- 101150009573 phoA gene Proteins 0.000 description 1
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 1
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 1
- 239000003757 phosphotransferase inhibitor Substances 0.000 description 1
- PKUBGLYEOAJPEG-UHFFFAOYSA-N physcion Natural products C1=C(C)C=C2C(=O)C3=CC(C)=CC(O)=C3C(=O)C2=C1O PKUBGLYEOAJPEG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 1
- 108010031345 placental alkaline phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 229920001200 poly(ethylene-vinyl acetate) Polymers 0.000 description 1
- 229920000747 poly(lactic acid) Polymers 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 239000004633 polyglycolic acid Substances 0.000 description 1
- 239000004626 polylactic acid Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 125000001500 prolyl group Chemical group [H]N1C([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 229940076372 protein antagonist Drugs 0.000 description 1
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 1
- 230000009822 protein phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 239000000941 radioactive substance Substances 0.000 description 1
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000013102 re-test Methods 0.000 description 1
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 238000010079 rubber tapping Methods 0.000 description 1
- CVHZOJJKTDOEJC-UHFFFAOYSA-N saccharin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)NS(=O)(=O)C2=C1 CVHZOJJKTDOEJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940081974 saccharin Drugs 0.000 description 1
- 235000019204 saccharin Nutrition 0.000 description 1
- 239000000901 saccharin and its Na,K and Ca salt Substances 0.000 description 1
- BTIHMVBBUGXLCJ-OAHLLOKOSA-N seliciclib Chemical compound C=12N=CN(C(C)C)C2=NC(N[C@@H](CO)CC)=NC=1NCC1=CC=CC=C1 BTIHMVBBUGXLCJ-OAHLLOKOSA-N 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 150000003355 serines Chemical class 0.000 description 1
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 210000000717 sertoli cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 108091006024 signal transducing proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000034285 signal transducing proteins Human genes 0.000 description 1
- 230000008054 signal transmission Effects 0.000 description 1
- 210000002027 skeletal muscle Anatomy 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 235000010267 sodium hydrogen sulphite Nutrition 0.000 description 1
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 description 1
- 230000037439 somatic mutation Effects 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 102000009076 src-Family Kinases Human genes 0.000 description 1
- 108010087686 src-Family Kinases Proteins 0.000 description 1
- 238000012289 standard assay Methods 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 230000004960 subcellular localization Effects 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 150000005846 sugar alcohols Polymers 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 239000003765 sweetening agent Substances 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000007910 systemic administration Methods 0.000 description 1
- 230000002381 testicular Effects 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 231100001274 therapeutic index Toxicity 0.000 description 1
- RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L thimerosal Chemical compound [Na+].CC[Hg]SC1=CC=CC=C1C([O-])=O RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229940033663 thimerosal Drugs 0.000 description 1
- ZEMGGZBWXRYJHK-UHFFFAOYSA-N thiouracil Chemical compound O=C1C=CNC(=S)N1 ZEMGGZBWXRYJHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003161 three-hybrid assay Methods 0.000 description 1
- 101150062121 tollip gene Proteins 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 1
- 102000035160 transmembrane proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005703 transmembrane proteins Proteins 0.000 description 1
- GXPHKUHSUJUWKP-NTKDMRAZSA-N troglitazone Natural products C([C@@]1(OC=2C(C)=C(C(=C(C)C=2CC1)O)C)C)OC(C=C1)=CC=C1C[C@H]1SC(=O)NC1=O GXPHKUHSUJUWKP-NTKDMRAZSA-N 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 238000003160 two-hybrid assay Methods 0.000 description 1
- ORHBXUUXSCNDEV-UHFFFAOYSA-N umbelliferone Chemical compound C1=CC(=O)OC2=CC(O)=CC=C21 ORHBXUUXSCNDEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HFTAFOQKODTIJY-UHFFFAOYSA-N umbelliferone Natural products Cc1cc2C=CC(=O)Oc2cc1OCC=CC(C)(C)O HFTAFOQKODTIJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004906 unfolded protein response Effects 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
- DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N uracil arabinoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940045145 uridine Drugs 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- WCNMEQDMUYVWMJ-JPZHCBQBSA-N wybutoxosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)N3C(CC([C@H](NC(=O)OC)C(=O)OC)OO)=C(C)N=C3N(C)C=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O WCNMEQDMUYVWMJ-JPZHCBQBSA-N 0.000 description 1
- 229940075420 xanthine Drugs 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6872—Intracellular protein regulatory factors and their receptors, e.g. including ion channels
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
- A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/111—General methods applicable to biologically active non-coding nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
- C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/48—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase
- C12Q1/485—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase involving kinase
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/66—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood sugars, e.g. galactose
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/11—Antisense
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/12—Type of nucleic acid catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2320/00—Applications; Uses
- C12N2320/10—Applications; Uses in screening processes
- C12N2320/12—Applications; Uses in screening processes in functional genomics, i.e. for the determination of gene function
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/04—Endocrine or metabolic disorders
- G01N2800/044—Hyperlipemia or hypolipemia, e.g. dyslipidaemia, obesity
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Virology (AREA)
- Obesity (AREA)
- Emergency Medicine (AREA)
Abstract
グルコース輸送を調節するための方法および組成物を本明細書において提供する。
Description
技術分野
本発明は、分子生物学、細胞生物学、グルコース輸送、および糖尿病に関する。
本発明は、分子生物学、細胞生物学、グルコース輸送、および糖尿病に関する。
関連出願の相互参照
本出願は、2005年7月28日に出願した米国仮特許出願第60/703,280号の優先権の恩典を主張し、その内容はその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
本出願は、2005年7月28日に出願した米国仮特許出願第60/703,280号の優先権の恩典を主張し、その内容はその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
背景
インスリンは、筋肉および脂肪におけるグルコース輸送を促進する。インスリンが活性化する最も重要な経路の1つは、筋肉および脂肪組織における循環からグルコースを迅速に取り込むことである。これらの組織におけるグルコース取り込みに及ぼすインスリンの効果の大部分は、インスリン感受性グルコース輸送体、GLUT4に依存している(Czech and Corvera, J. Biol. Chem., 274:1865-1868, 1999(非特許文献1)、Martin et al., Cell Biochem. Biophys., 30:89-113, 1999(非特許文献2)、Elmendorf et al. Exp. Cell Res., 253:55-62, 1999(非特許文献3)に概説されている)。糖尿病ではインスリン作用の機構が損なわれ、筋肉および脂肪へのグルコース輸送が減少する。これは、II型糖尿病の主要な欠陥であると考えられている。インスリン作用を強化することは、II型糖尿病に有益な効果をもたらす。これは、薬剤レズリン(Rezulin)(トログリタゾン)の作用機序であると考えられている。
インスリンは、筋肉および脂肪におけるグルコース輸送を促進する。インスリンが活性化する最も重要な経路の1つは、筋肉および脂肪組織における循環からグルコースを迅速に取り込むことである。これらの組織におけるグルコース取り込みに及ぼすインスリンの効果の大部分は、インスリン感受性グルコース輸送体、GLUT4に依存している(Czech and Corvera, J. Biol. Chem., 274:1865-1868, 1999(非特許文献1)、Martin et al., Cell Biochem. Biophys., 30:89-113, 1999(非特許文献2)、Elmendorf et al. Exp. Cell Res., 253:55-62, 1999(非特許文献3)に概説されている)。糖尿病ではインスリン作用の機構が損なわれ、筋肉および脂肪へのグルコース輸送が減少する。これは、II型糖尿病の主要な欠陥であると考えられている。インスリン作用を強化することは、II型糖尿病に有益な効果をもたらす。これは、薬剤レズリン(Rezulin)(トログリタゾン)の作用機序であると考えられている。
II型糖尿病(インスリン非依存性糖尿病)とは、グルコースに対するインスリン分泌反応障害およびインスリン抵抗性を含み得る高血糖を特徴とする障害群である。II型糖尿病で認められる1つの影響は、骨格筋によるグルコース取り込みの促進におけるインスリンの有効性の減少である。II型糖尿病は、全糖尿病症例の約85〜90%を占める。II型糖尿病の症例によっては、根底にある生理的欠陥は多因子性のようである。
Czech and Corvera, J. Biol. Chem., 274:1865-1868, 1999
Martin et al., Cell Biochem. Biophys., 30:89-113, 1999
Elmendorf et al. Exp. Cell Res., 253:55-62, 1999
概要
本発明は、少なくとも一部に、細胞におけるグルコース輸送を制御する遺伝子および遺伝子産物の発見に基づく。本明細書に記載する遺伝子および遺伝子産物は、糖尿病などの、グルコース代謝が脱制御される障害の治療を調節するための新規標的である。
本発明は、少なくとも一部に、細胞におけるグルコース輸送を制御する遺伝子および遺伝子産物の発見に基づく。本明細書に記載する遺伝子および遺伝子産物は、糖尿病などの、グルコース代謝が脱制御される障害の治療を調節するための新規標的である。
したがって、1つの局面において、本発明は、グルコース輸送関連ポリペプチドもしくはそのポリペプチドをコードする核酸の発現または活性を調節する候補薬剤を同定する方法を特徴とする。本方法は、例えば以下の段階を含む:(a) 表1もしくは表2記載の遺伝子の遺伝子産物またはその相同体であるグルコース輸送関連ポリペプチド、またはそのポリペプチドをコードする核酸を含む試料を提供する段階;(b) 試料を被験化合物と接触させる段階;(c) 試料中のグルコース輸送関連核酸もしくはポリペプチドの発現または活性を評価する段階;および(d) (c)のグルコース輸送関連核酸もしくはポリペプチドの発現または活性を、対照試料(例えば被験化合物を欠く試料または参照試料)中のグルコース輸送関連核酸もしくはポリペプチドの発現または活性と比較する段階であって、対照試料に対するグルコース輸送関連核酸もしくはポリペプチドの発現または活性の変化により、被験化合物がグルコース輸送関連核酸もしくはポリペプチドの発現または活性を調節することができる候補薬剤であることが示される、段階。
様々な態様において、グルコース輸送関連ポリペプチドは表1記載の遺伝子の遺伝子産物であり、例えば、サイクリン依存性キナーゼ7(Cdk7);カルシウム/カルモジュリン依存性プロテインキナーゼI(Camkl);c-Srcチロシンキナーゼ(Csk);カゼインキナーゼ1、α1(Csnklal);カゼインキナーゼ1、Δ(Csnkld);カゼインキナーゼ1、γ2(Csnklg2);カゼインキナーゼ1、γ3(Csnklg3);カゼインキナーゼII、α1(Csnk2al);ジスコイジンドメイン受容体ファミリー、メンバー2(Ddr2);真核生物伸長因子-2キナーゼ(Eef2k);上皮増殖因子受容体(EGFR);Ephrin受容体EphA7(キナーゼ1、Epha7);小胞体(ER)から核へのシグナル伝達1(Ernl);fps/fes関連チロシンキナーゼ(Fert2);線維芽細胞増殖因子受容体2(Fgfr2);Gardner-Rasheedネコ肉腫ウイルス(Fgr)癌遺伝子相同体(Fgr);グリコーゲン合成酵素キナーゼ3β(Gsk3b);インターロイキン-1受容体関連キナーゼ1(Irak1);SH3-結合キナーゼ1(SbK);精巣特異的キナーゼ2(Tesk2);ワクシニア関連キナーゼ1(Vrkl);ワクシニア関連キナーゼ2(Vrk2);またはワクシニア関連キナーゼ3(Vrk3)である。様々な態様において、グルコース輸送関連ポリペプチドは、表1記載の遺伝子の遺伝子産物と少なくとも50、60、70、80、90、95、96、99、または100%同一であるアミノ酸配列を含む。ポリペプチドは、ヒトポリペプチド(例えば、表1記載の遺伝子または表1記載の遺伝子のヒト相同体によってコードされるヒトポリペプチド)であってよい。
様々な態様において、グルコース輸送関連ポリペプチドは表2に記載の遺伝子の遺伝子産物であり、例えばThe Institute of Physical and Chemical Research(RIKEN)から得た以下のクローンの1つの遺伝子産物である:9130019I15Rik、5830417C01Rik、A430091O22Rik、またはそのヒト相同体;アクチビンA受容体、タイプ1(Acvrl);カルシウム/カルモジュリン依存性セリンプロテインキナーゼ(Cask)またはセリン/トレオニンキナーゼ38(Stk38)。様々な態様において、グルコース輸送関連ポリペプチドは、表2記載の遺伝子の遺伝子産物と少なくとも50、60、70、80、90、95、96、99、または100%同一であるアミノ酸配列を含む。様々な態様において、ポリペプチドはヒトポリペプチドである。
本方法で使用する試料は細胞(例えば、脂肪細胞)であるか、もしくは細胞を含み得、または無細胞試料であってもよい。グルコース輸送関連核酸もしくはポリペプチドの発現または活性は、例えば無細胞アッセイ法または細胞に基づくアッセイ法を用いて評価することができる。発現の調節は、抗体を用いて評価することができる。1つの態様において、評価段階は、例えばグルコース取り込みを測定することにより、グルコース輸送が被験化合物の存在下で調節されるかどうかを判定する段階を含む。
本方法において評価する被験化合物は、例えばポリヌクレオチド、ポリペプチド、非核酸有機小分子、無機小分子、または抗体であってよい。例えば、被験化合物は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、抑制性RNA、またはリボザイムであってよい。
グルコース輸送は、被験化合物の存在下で増加または減少し得る。
様々な態様において、グルコース輸送関連ポリペプチドはキナーゼである。そのような態様では、評価段階は、例えばキナーゼアッセイ法を用いて、キナーゼによる基質のリン酸化を測定する段階を含むことができる。
本方法は、被験化合物がグルコース輸送関連ポリペプチドの発現または活性に及ぼす影響を、例えば肥満または糖尿病の動物モデルなどの動物モデルを用いてインビボで評価する段階を含むことができる。
別の局面において、本発明は、細胞におけるグルコース輸送を調節する方法を特徴とする。これらの方法は、例えば、細胞を提供する段階;グルコース輸送関連ポリペプチドの発現または活性を調節する薬剤と細胞を接触させ(例えば、インビトロまたはインビボで)、それにより細胞におけるグルコース輸送を調節する段階を含む。
グルコース輸送関連核酸もしくはポリペプチドの発現または活性を調節する被験化合物は、例えば以下の段階を含む本明細書に記載の方法によって同定される薬剤であってよい:(a) グルコース輸送関連ポリペプチドまたはそのポリペプチドをコードする核酸を含む試料を提供する段階;(b) 試料を被験化合物と接触させる段階;(c) 試料中のグルコース輸送関連核酸もしくはポリペプチドの発現または活性を評価する段階;および(d) (c)のグルコース輸送関連核酸もしくはポリペプチドの発現または活性を、被験化合物を欠く対照試料中のグルコース輸送関連核酸もしくはポリペプチドの発現または活性と比較する段階であって、グルコース輸送関連核酸もしくはポリペプチドの発現または活性の変化により、被験化合物がグルコース輸送関連核酸もしくはポリペプチドの発現または活性を調節することができる候補薬剤であることが示される、段階。
細胞におけるグルコース輸送を調節する方法で用いられる被験化合物は、表1もしくは表2記載の遺伝子もしくは遺伝子産物の発現または活性を調節することができる。被験化合物は、表1記載の遺伝子もしく遺伝子産物の発現または活性を減少または増加させてもよい。被験化合物は、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、非核酸有機小分子、無機小分子、または抗体であってよい。例えば、被験化合物は抑制性低分子RNAであってよい。被験化合物はまた、アンチセンスオリゴヌクレオチド、抑制性RNA、またはリボザイムであってよい。
細胞におけるグルコース輸送を調節する方法は、グルコース輸送関連ポリペプチド(もしくはそのポリペプチドをコードする核酸)の発現または活性を調節する第二の薬剤と細胞を接触させる段階をさらに含むことができる。
本発明はまた、対象においてインスリン刺激によるグルコース取り込みを増加させる方法を特徴とする。本方法は、対象の細胞におけるグルコース代謝を調節するのに十分な量で、表1記載の遺伝子もしくは遺伝子産物の発現または活性を減少させる薬剤を対象に投与し、それによって対象におけるインスリン刺激によるグルコース取り込みを増加させる段階を含む。例えば、対象は、I型糖尿病、II型糖尿病、もしくは肥満などの、グルコース代謝に関連した障害もしくは状態のリスクを有するか、またはこれらを患っている可能性がある。
本発明はまた、対象の細胞におけるグルコース代謝を調節するのに十分な量で、表2記載の遺伝子もしくは遺伝子産物の発現または活性を増加させる薬剤を対象に投与し、それによって対象におけるグルコース代謝を調節することにより、対象におけるグルコース代謝を調節する方法を提供する。
本明細書では、表1記載の遺伝子によってコードされるRNAを標的とする抑制性RNAをコードする核酸を含む組成物もまた特徴とする。1つの態様において、抑制性RNAは阻害的低分子RNA(small inhibitory RNA)である。
本発明は、表1記載の遺伝子産物の機能を阻害するアンチセンス核酸を含む組成物をさらに提供する。
本発明はまた、表1および2記載の1つもしくは複数の遺伝子もしくは遺伝子産物の発現または活性を評価することにより、グルコース代謝に関連した障害または状態を診断する方法を特徴とする。
特記する場合を除き、本明細書で用いるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されているのと同じ意味を有する。本明細書に記載したのと同様または同等の方法および材料を、本発明の実施または試験に用いることができるが、適切な方法および材料は以下に記載するものである。本明細書で言及されたすべての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は、その全文が参照により組み入れられる。矛盾が生じる場合は、定義を含め本明細書が優先する。さらに、材料、方法、および実施例は説明のみを目的としており、制限を意図するものではない。引用した特許、特許出願、および参考文献はすべて(公的配列データベースエントリーの参照も含む)、すべての目的のためにその全体が参照により組み入れられる。2005年7月28日に出願した米国仮特許出願第60/703,280号は、すべての目的のためにその全体が参照により組み入れられる。
本発明の一つまたは複数の態様の詳細を、以下の説明において述べる。本発明のその他の特徴、目的、および利点は、説明および特許請求の範囲から明らかとなる。
発明の詳細な説明
本発明者らは、そのポリペプチド産物が、インスリンシグナルに応答して脂肪細胞におけるグルコース輸送を制御する遺伝子を同定した。ここに、これらポリペプチドの発現を調節するための、およびそれらの発現を調節する薬剤を同定するための方法および組成物を提供する。本発明者らが同定したポリペプチドをコードする遺伝子を、以下の表1および2に列挙する。本発明者らが同定した遺伝子の第1サブセットは、グルコース輸送の負の制御因子であるポリペプチドをコードする(表1)。第2サブセットは、グルコース輸送の正の制御因子をコードする(表2)。グルコース輸送の負の制御因子の発現または活性を減少させると(例えば、アンチセンスもしくはsiRNAによる遺伝子発現の阻害を介して、または遺伝子産物の活性を阻害する薬剤を用いて)、グルコース取り込みが増加し得、それによって血糖値を低下させることができる。正の制御因子の発現または活性を増加させると(例えば、遺伝子産物の過剰発現によるか、または制御因子の活性を増加させる薬剤の使用による)、インスリン活性が増強され得、ひいてはグルコース取り込みが促進され得る。
本発明者らは、そのポリペプチド産物が、インスリンシグナルに応答して脂肪細胞におけるグルコース輸送を制御する遺伝子を同定した。ここに、これらポリペプチドの発現を調節するための、およびそれらの発現を調節する薬剤を同定するための方法および組成物を提供する。本発明者らが同定したポリペプチドをコードする遺伝子を、以下の表1および2に列挙する。本発明者らが同定した遺伝子の第1サブセットは、グルコース輸送の負の制御因子であるポリペプチドをコードする(表1)。第2サブセットは、グルコース輸送の正の制御因子をコードする(表2)。グルコース輸送の負の制御因子の発現または活性を減少させると(例えば、アンチセンスもしくはsiRNAによる遺伝子発現の阻害を介して、または遺伝子産物の活性を阻害する薬剤を用いて)、グルコース取り込みが増加し得、それによって血糖値を低下させることができる。正の制御因子の発現または活性を増加させると(例えば、遺伝子産物の過剰発現によるか、または制御因子の活性を増加させる薬剤の使用による)、インスリン活性が増強され得、ひいてはグルコース取り込みが促進され得る。
グルコース輸送の負の制御因子
本発明者らは、表1に列挙する遺伝子の1つまたは複数の発現を阻害すると、インスリン刺激によるグルコース取り込みが増加することにより、インスリン作用が強化されることを見出した。インスリン作用の強化は、例えば糖尿病患者における、例えばインビボでの血糖作用の調節において有益である。したがって、表1に記載の遺伝子産物の発現または活性を阻害することは、インスリン活性またはグルコース輸送が脱制御される状態の治療に有益であり得る。
本発明者らは、表1に列挙する遺伝子の1つまたは複数の発現を阻害すると、インスリン刺激によるグルコース取り込みが増加することにより、インスリン作用が強化されることを見出した。インスリン作用の強化は、例えば糖尿病患者における、例えばインビボでの血糖作用の調節において有益である。したがって、表1に記載の遺伝子産物の発現または活性を阻害することは、インスリン活性またはグルコース輸送が脱制御される状態の治療に有益であり得る。
サイクリン依存性キナーゼ7(Cdk7)
cdk7などのサイクリン依存性タンパク質キナーゼは、細胞周期の進行の重要な制御因子である。Cdk7は、サイクリンHおよびmenage a trois 1(MATl)と共に多サブユニット複合体を形成する。この複合体はCAK(cdk活性化キナーゼ)と呼ばれ、RNAポリメラーゼIIの最大サブユニットのカルボキシ末端ドメインをリン酸化することにより転写に関与し、同様に他のCDKもリン酸化する(Fisher and Morgan, Cell, 78(4):713-24, 1994; Shiekhattar et al., Nature, 374: 283-287, 1995)。Cdk7の阻害因子には、プリン誘導体、ロスコビチン、および5,6-ジクロロ-1-β-D-リボフラノシルベンズイミダゾール(DRB)が含まれる(Taylor et al., J. Virol., 78(6):2853-62, 2004; te Poele et al., Oncogene, 18(42):5765-72, 1999)。
cdk7などのサイクリン依存性タンパク質キナーゼは、細胞周期の進行の重要な制御因子である。Cdk7は、サイクリンHおよびmenage a trois 1(MATl)と共に多サブユニット複合体を形成する。この複合体はCAK(cdk活性化キナーゼ)と呼ばれ、RNAポリメラーゼIIの最大サブユニットのカルボキシ末端ドメインをリン酸化することにより転写に関与し、同様に他のCDKもリン酸化する(Fisher and Morgan, Cell, 78(4):713-24, 1994; Shiekhattar et al., Nature, 374: 283-287, 1995)。Cdk7の阻害因子には、プリン誘導体、ロスコビチン、および5,6-ジクロロ-1-β-D-リボフラノシルベンズイミダゾール(DRB)が含まれる(Taylor et al., J. Virol., 78(6):2853-62, 2004; te Poele et al., Oncogene, 18(42):5765-72, 1999)。
カルシウム/カルモジュリン依存性プロテインキナーゼI(CamkI)
CamkIは、シナプシンI、cAMP応答配列結合タンパク質、および嚢胞性線維症コンダクタンス制御因子など複数の基質を伴う、サイトゾルのセリン/トレオニンキナーゼである(Chin et al., J. Biol. Chem. 272: 31235-31240, 1997)。カルシウム/カルモジュリンは、酵素に結合することによって、およびCamkIキナーゼを活性化することによって、CamkIを活性化する。KN-93などの阻害因子によって、または例えばカルミダゾリウムを用いたカルモジュリンの阻害によって、CamkI活性を直接阻害することができる(Kahl and Means, Oncogene, 18(42):5765-72, 1999)。
CamkIは、シナプシンI、cAMP応答配列結合タンパク質、および嚢胞性線維症コンダクタンス制御因子など複数の基質を伴う、サイトゾルのセリン/トレオニンキナーゼである(Chin et al., J. Biol. Chem. 272: 31235-31240, 1997)。カルシウム/カルモジュリンは、酵素に結合することによって、およびCamkIキナーゼを活性化することによって、CamkIを活性化する。KN-93などの阻害因子によって、または例えばカルミダゾリウムを用いたカルモジュリンの阻害によって、CamkI活性を直接阻害することができる(Kahl and Means, Oncogene, 18(42):5765-72, 1999)。
C-Srcチロシンキナーゼ(Csk)
Cskは、SrcのC末端チロシンのリン酸化によりSrcファミリーキナーゼを負に調節するサイトゾルのチロシンキナーゼである(Wang et al., Biochemistry, 40:2004- 2010, 2001)。Cskは、脂肪細胞においてSrcを介してシグナル伝達するインスリン様成長因子I(IGF-I)を調節する(Sekimoto and Boney, Endocrinology, 144(6):2546-2552, 2003)。
Cskは、SrcのC末端チロシンのリン酸化によりSrcファミリーキナーゼを負に調節するサイトゾルのチロシンキナーゼである(Wang et al., Biochemistry, 40:2004- 2010, 2001)。Cskは、脂肪細胞においてSrcを介してシグナル伝達するインスリン様成長因子I(IGF-I)を調節する(Sekimoto and Boney, Endocrinology, 144(6):2546-2552, 2003)。
カゼインキナーゼ1 α1、δ、およびγ2(Csnklal、Csnkld、Csnklg2)
Cnsklポリペプチドは、酵母からヒトまで高度に保存されたセリン/トレオニンプロテインキナーゼのファミリーである。Cnsklポリペプチドは、哺乳動物において複数のアイソフォームで存在する。アイソフォームは別々の細胞成分に局在し、これはそれらの各機能にとって重要なことである(Gross and Anderson, Cell Signal., 10(10):699-711, 1998)。Csnklalは、サイトゾルの小胞、紡錘体、および核内の構造に関連する(Gross and Anderson、前記)。CsnklalはレチノイドX受容体(RXR)に結合し、活性化されたRXRによって誘導されるアポトーシスを阻害する(Zhao et al., J. Biol. Chem., 279(29):30844- 30849, 2004)。Liu et al., Cell, 108(6): 837-47, 2002によると、Csnklalはまた、Wnt/βカテニンシグナル伝達に関与する。
Cnsklポリペプチドは、酵母からヒトまで高度に保存されたセリン/トレオニンプロテインキナーゼのファミリーである。Cnsklポリペプチドは、哺乳動物において複数のアイソフォームで存在する。アイソフォームは別々の細胞成分に局在し、これはそれらの各機能にとって重要なことである(Gross and Anderson, Cell Signal., 10(10):699-711, 1998)。Csnklalは、サイトゾルの小胞、紡錘体、および核内の構造に関連する(Gross and Anderson、前記)。CsnklalはレチノイドX受容体(RXR)に結合し、活性化されたRXRによって誘導されるアポトーシスを阻害する(Zhao et al., J. Biol. Chem., 279(29):30844- 30849, 2004)。Liu et al., Cell, 108(6): 837-47, 2002によると、Csnklalはまた、Wnt/βカテニンシグナル伝達に関与する。
Cnskldは、微小管、中心体、および紡錘体装置に結合する(Behrend, et al., Eur. J. Cell Biol., 79, 240-251, 2000)。Cnskldは、別のCnsklアイソフォームであるCnskleと共に、哺乳動物の概日時計を調節する(Akashi et al., Mol Cell Biol, 22(6):1693-703, 2002)。
Cnsklg2は、乳癌細胞の細胞質内のエストロゲン受容体αを分離し、乳癌の悪性度に寄与すると考えられるポリペプチドである、転移関連タンパク質1短型(MTA1s)をリン酸化し、その機能を調節する(Mishra et al., Oncogene, 23(25):4422-9, 2004)。
カゼインキナーゼ2、α1(Csnk2al)
Csnk2は、α、αプライム、および2つのβサブユニットから構成される四量体キナーゼである。αサブユニットはセリン/トレオニンキナーゼ活性を含む。csnk2活性の上方制御は、ヒト細胞の悪性形質転換に関係している(Sarno et al., Pharmacol. Ther., 93(2-3):l59-68, 2002)。Csnk2の阻害因子には、アピゲニン、エモジン、DRB、ならびに4,5,6,7-テトラブロモベンゾトリアゾール(TBB)、およびPagano et al.,に記載されるTBB付加物、例えば4,5,6,7-テトラブロモ-2-(ジメチルアミノ)ベンズイミダゾール(2c)(Pagano et al., J. Med. Chem., 47(25):6239-47, 2004; Song et al., J. Biol. Chem., 275(31):23790-23797, 2000)が含まれる。
Csnk2は、α、αプライム、および2つのβサブユニットから構成される四量体キナーゼである。αサブユニットはセリン/トレオニンキナーゼ活性を含む。csnk2活性の上方制御は、ヒト細胞の悪性形質転換に関係している(Sarno et al., Pharmacol. Ther., 93(2-3):l59-68, 2002)。Csnk2の阻害因子には、アピゲニン、エモジン、DRB、ならびに4,5,6,7-テトラブロモベンゾトリアゾール(TBB)、およびPagano et al.,に記載されるTBB付加物、例えば4,5,6,7-テトラブロモ-2-(ジメチルアミノ)ベンズイミダゾール(2c)(Pagano et al., J. Med. Chem., 47(25):6239-47, 2004; Song et al., J. Biol. Chem., 275(31):23790-23797, 2000)が含まれる。
ジスコイジンドメイン受容体ファミリー、メンバー2(Ddr2)
Ddr2は、線維性コラーゲンと相互作用する受容体チロシンキナーゼである(Shrivastava et al., Mol. Cell, l(l):25-34, 1997; Vogel et al., Mol. Cell,(l):13-23, 1997)。コラーゲンのDdr2への結合は、Ddr2の自己リン酸化をもたらし、これは次に下流のシグナル伝達事象を引き起こす(Leitinger et al., J. Mol Biol, 344(4): 993 -1003, 2004)。
Ddr2は、線維性コラーゲンと相互作用する受容体チロシンキナーゼである(Shrivastava et al., Mol. Cell, l(l):25-34, 1997; Vogel et al., Mol. Cell,(l):13-23, 1997)。コラーゲンのDdr2への結合は、Ddr2の自己リン酸化をもたらし、これは次に下流のシグナル伝達事象を引き起こす(Leitinger et al., J. Mol Biol, 344(4): 993 -1003, 2004)。
伸長因子-2キナーゼ(Eef2k)
Eef2kは、サイトゾルのカルシウム/カルモジュリンセリン-トレオニンキナーゼである。ストレス活性化プロテインキナーゼ4およびリボソームプロテインS6キナーゼなどのタンパク質は、Eef2k上の特定のセリンをリン酸化することによって、Eef2k活性を阻害する(Knebel et al., EMBO J., 20:4360-4369, 2001; Wang et al., EMBO J., 20:4370-4379, 2001)。
Eef2kは、サイトゾルのカルシウム/カルモジュリンセリン-トレオニンキナーゼである。ストレス活性化プロテインキナーゼ4およびリボソームプロテインS6キナーゼなどのタンパク質は、Eef2k上の特定のセリンをリン酸化することによって、Eef2k活性を阻害する(Knebel et al., EMBO J., 20:4360-4369, 2001; Wang et al., EMBO J., 20:4370-4379, 2001)。
上皮細胞成長因子受容体(EGFR)
受容体チロシンキナーゼであるEGFRによって変換されるシグナルは、細胞の増殖、分化、および/または生存を刺激する。EGFR阻害因子には以下が含まれる:エルロチニブ(タルセバ);ゲフィチニブ(イレッサ);PKI166(Traxler et al., Clin. Cancer Res., 5: 3750s 1999);Woodburn, Pharmacol Ther, 82(2-3):241-50, 1999に記載の薬剤;およびBianco et al.,に記載のもの(Curr. Drug Targets, 6(3):275-87, 2005;例えばICR62、セツキシマブ(Erbitux(登録商標))、パニツムマブ(ABX- EGF)、EMD72000(matuzamab)、およびIMC-225)などEGFR阻止モノクローナル抗体。
受容体チロシンキナーゼであるEGFRによって変換されるシグナルは、細胞の増殖、分化、および/または生存を刺激する。EGFR阻害因子には以下が含まれる:エルロチニブ(タルセバ);ゲフィチニブ(イレッサ);PKI166(Traxler et al., Clin. Cancer Res., 5: 3750s 1999);Woodburn, Pharmacol Ther, 82(2-3):241-50, 1999に記載の薬剤;およびBianco et al.,に記載のもの(Curr. Drug Targets, 6(3):275-87, 2005;例えばICR62、セツキシマブ(Erbitux(登録商標))、パニツムマブ(ABX- EGF)、EMD72000(matuzamab)、およびIMC-225)などEGFR阻止モノクローナル抗体。
エフリン受容体Eph A7(Epha7;HEKIl)
Epha7は、3つの異なるスプライスバリアントを有する受容体チロシンキナーゼである。Epha7スプライスバリアントの差次的な発現は、胚発生における神経褶形成の間、細胞接着を調節する(Holmberg et al., Nature, 408(6809):203-6, 2000)。
Epha7は、3つの異なるスプライスバリアントを有する受容体チロシンキナーゼである。Epha7スプライスバリアントの差次的な発現は、胚発生における神経褶形成の間、細胞接着を調節する(Holmberg et al., Nature, 408(6809):203-6, 2000)。
小胞体(ER)から核へのシグナル伝達1(Ernl;IREl)
Ernlは、内因性のキナーゼ活性およびエンドリボヌクレアーゼ活性を有するER局在性膜貫通タンパク質である。Ern-1は、転写因子XBP-1のmRNAを切断し、哺乳動物細胞において折り畳まれていないタンパク質反応を調節する(Calfon et al., Nature, 420(6912):202, 2002)。
Ernlは、内因性のキナーゼ活性およびエンドリボヌクレアーゼ活性を有するER局在性膜貫通タンパク質である。Ern-1は、転写因子XBP-1のmRNAを切断し、哺乳動物細胞において折り畳まれていないタンパク質反応を調節する(Calfon et al., Nature, 420(6912):202, 2002)。
Fps/fes関連チロシンキナーゼ(Fert2;FER)
Fert2は、アミノ末端Fps/Fes/Fer/CIP4相同性(FCH)ドメインに続き、予測されるコイルドコイル(オリゴマー形成を調節する可能性がある)、中心のSrc相同性2(SH2)ドメイン(リン酸化チロシン含有ペプチドモチーフとの会合を媒介する)、およびカルボキシ末端触媒ドメインの3つの領域を有する非受容体タンパク質チロシンキナーゼである(Greer, Nature Rev. Mol. Cell Biol, 3:278 -289; 2002)。
Fert2は、アミノ末端Fps/Fes/Fer/CIP4相同性(FCH)ドメインに続き、予測されるコイルドコイル(オリゴマー形成を調節する可能性がある)、中心のSrc相同性2(SH2)ドメイン(リン酸化チロシン含有ペプチドモチーフとの会合を媒介する)、およびカルボキシ末端触媒ドメインの3つの領域を有する非受容体タンパク質チロシンキナーゼである(Greer, Nature Rev. Mol. Cell Biol, 3:278 -289; 2002)。
線維芽細胞増殖因子受容体2(Fgfr2)
Fgfrsを介したシグナル伝達は、主にマルチドッキングタンパク質複合体のアセンブリーによって媒介される(Schlessinger, Science, 306(5701):1506-7, 2004)。線維芽細胞増殖因子とヘパリン硫酸プロテオグリカンとの結合は、Fgfrの二量体化、活性化、および受容体分子の細胞質ドメイン内の多数のチロシン残基の自己リン酸化を引き起こす。線維芽細胞増殖因子の刺激に応答してリン酸化されるタンパク質には、Shc、ホスホリパーゼ-Cγ、STATl、Gabl、およびFRS2αが含まれる。これらのタンパク質のリン酸化は、細胞増殖、細胞分化、細胞遊走、細胞生存、および細胞形状を制御する細胞内シグナル伝達経路の刺激につながる(Eswarakumar, Cytokine Growth Factor Rev., 16(2): 139-49, 2005)。
Fgfrsを介したシグナル伝達は、主にマルチドッキングタンパク質複合体のアセンブリーによって媒介される(Schlessinger, Science, 306(5701):1506-7, 2004)。線維芽細胞増殖因子とヘパリン硫酸プロテオグリカンとの結合は、Fgfrの二量体化、活性化、および受容体分子の細胞質ドメイン内の多数のチロシン残基の自己リン酸化を引き起こす。線維芽細胞増殖因子の刺激に応答してリン酸化されるタンパク質には、Shc、ホスホリパーゼ-Cγ、STATl、Gabl、およびFRS2αが含まれる。これらのタンパク質のリン酸化は、細胞増殖、細胞分化、細胞遊走、細胞生存、および細胞形状を制御する細胞内シグナル伝達経路の刺激につながる(Eswarakumar, Cytokine Growth Factor Rev., 16(2): 139-49, 2005)。
Gardner-Rasheedネコ肉腫ウイルス癌遺伝子相同体(Fgr)
Fgrsは、c-Src遺伝子ファミリーのメンバーによってコードされる非受容体チロシンキナーゼである。Fgrは、単核細胞においてβ2インテグリンを介したシグナル伝達およびSykキナーゼ機能を阻害する。これらの阻害性効果は、ケモカインおよび他の炎症性媒介物質によって逆転する(Vines et al., Immunity, 15(4):507-519, 2001)。
Fgrsは、c-Src遺伝子ファミリーのメンバーによってコードされる非受容体チロシンキナーゼである。Fgrは、単核細胞においてβ2インテグリンを介したシグナル伝達およびSykキナーゼ機能を阻害する。これらの阻害性効果は、ケモカインおよび他の炎症性媒介物質によって逆転する(Vines et al., Immunity, 15(4):507-519, 2001)。
グリコーゲン合成酵素キナーゼ3β(Gsk3b)
Gsk3bは、リン酸化され、不活性化されたグリコーゲン合成酵素として最初は同定されたプロリン定方向性セリン-トレオニンキナーゼである。インスリンは、AktによるGsk3b上のN末端セリン残基のリン酸化を刺激することによって、Gsk3bを阻害する(Cross et al., Nature, 378:785-789, 1995)。Gsk3bはまた、真核生物タンパク質合成開始因子2B(eIF2B)をリン酸化し、それによってeIF2Bを阻害する(Welsh et al., Biochem. J., 294:625-629, 1993)。Gsk3bによるリン酸化の他の標的には、Axin、βカテニン、τ、プレセニリン1、サイクリンD1、ムチン1、jun、myc、CREB、およびその他が含まれる(例えばGsk3bのこれらのおよび他の標的を列挙するFrame and Cohen, Biochem. J., 385:1-16, 2001を参照されたい)。Gsk3bの阻害因子には、Coghlan et al.(Chem Biol., 7(10):793-803, 2000)に記載されるマレイミド化合物、SB-216763、およびSB-415286、ならびに塩化リチウムが含まれる。米国特許第 6,800,632号;第6,716,624号;第6,608,063号;第6,489,344号;第6,465,231号;第6,417,185号;および第6,057,117号も同様に参照されたい。
Gsk3bは、リン酸化され、不活性化されたグリコーゲン合成酵素として最初は同定されたプロリン定方向性セリン-トレオニンキナーゼである。インスリンは、AktによるGsk3b上のN末端セリン残基のリン酸化を刺激することによって、Gsk3bを阻害する(Cross et al., Nature, 378:785-789, 1995)。Gsk3bはまた、真核生物タンパク質合成開始因子2B(eIF2B)をリン酸化し、それによってeIF2Bを阻害する(Welsh et al., Biochem. J., 294:625-629, 1993)。Gsk3bによるリン酸化の他の標的には、Axin、βカテニン、τ、プレセニリン1、サイクリンD1、ムチン1、jun、myc、CREB、およびその他が含まれる(例えばGsk3bのこれらのおよび他の標的を列挙するFrame and Cohen, Biochem. J., 385:1-16, 2001を参照されたい)。Gsk3bの阻害因子には、Coghlan et al.(Chem Biol., 7(10):793-803, 2000)に記載されるマレイミド化合物、SB-216763、およびSB-415286、ならびに塩化リチウムが含まれる。米国特許第 6,800,632号;第6,716,624号;第6,608,063号;第6,489,344号;第6,465,231号;第6,417,185号;および第6,057,117号も同様に参照されたい。
インターロイキン-1受容体関連キナーゼ1(Irak1)
Irak1は、インターロイキン-1(IL-1)シグナル伝達に関与する膜に近接したセリン-トレオニンキナーゼであり、IL-1誘導に応答してリン酸化され、次第に分解される。Irak1は、IL-1への曝露による受容体の刺激の際、IL-1受容体と会合する(Cao et al., Science, 271(5252):1128-1131; 1996)。Irak1は2つの公知の機能性ドメインを有する:MyD88およびToll相互作用タンパク質(Tollip)によるタンパク質-タンパク質相互作用に関与するN末端デスドメイン、ならびに中心に位置するSer/Thrキナーゼドメイン(Jensen and Whitehead, J. Biol. Chem., 276(31):29037-29044, 2001;およびこれらに引用される参考文献を参照されたい)。
Irak1は、インターロイキン-1(IL-1)シグナル伝達に関与する膜に近接したセリン-トレオニンキナーゼであり、IL-1誘導に応答してリン酸化され、次第に分解される。Irak1は、IL-1への曝露による受容体の刺激の際、IL-1受容体と会合する(Cao et al., Science, 271(5252):1128-1131; 1996)。Irak1は2つの公知の機能性ドメインを有する:MyD88およびToll相互作用タンパク質(Tollip)によるタンパク質-タンパク質相互作用に関与するN末端デスドメイン、ならびに中心に位置するSer/Thrキナーゼドメイン(Jensen and Whitehead, J. Biol. Chem., 276(31):29037-29044, 2001;およびこれらに引用される参考文献を参照されたい)。
SH3結合キナーゼ1(Sbkl)
Sbklは、セリン/トレオニンプロテインキナーゼコンセンサス配列に続き、C末端プロリンリッチ領域を含む。ラットでは、Sbklの大半は脳に発現する(Nara et al., Eur. J. Biochem., 268:2642-2651, 2001)。
Sbklは、セリン/トレオニンプロテインキナーゼコンセンサス配列に続き、C末端プロリンリッチ領域を含む。ラットでは、Sbklの大半は脳に発現する(Nara et al., Eur. J. Biochem., 268:2642-2651, 2001)。
精巣特異的キナーゼ2(Tesk2)
Tesk2は、精巣のセルトリ細胞に多く発現するセリン/トレオニンキナーゼである。Tesk2は、コフィリンおよびアクチン脱重合因子(ADF)をリン酸化することができる(Toshima et al., J. Biol. Chem., 276(33):31449-31458, 2001)。コフィリンのリン酸化は、コフィリンのアクチン脱重合機能を不活性化し、アクチンフィラメントの蓄積をもたらす。
Tesk2は、精巣のセルトリ細胞に多く発現するセリン/トレオニンキナーゼである。Tesk2は、コフィリンおよびアクチン脱重合因子(ADF)をリン酸化することができる(Toshima et al., J. Biol. Chem., 276(33):31449-31458, 2001)。コフィリンのリン酸化は、コフィリンのアクチン脱重合機能を不活性化し、アクチンフィラメントの蓄積をもたらす。
ワクシニア関連キナーゼ(Vrkl、Vrk2、Vrk3)
ワクシニア関連キナーゼは、Blキナーゼをコードするワクシニアウイルスとの配列相同性を有するセリン-トレオニンキナーゼである(Nichols and Traktman, J. Biol. Chem., 279(9):7934-7946, 2004に概説される)。Vrklは、増殖組織において高度に発現し、核に局在し、p53のリン酸化を調節する。Vrk2は、小胞体の膜に会合する。VrklおよびVrk2の両方は、細胞内局在を媒介しカゼインをリン酸化するCOOH末端の余分な触媒配列を含む。Vrk3は、キナーゼ活性を欠くが、基質結合に重要なドメインは保持する。
ワクシニア関連キナーゼは、Blキナーゼをコードするワクシニアウイルスとの配列相同性を有するセリン-トレオニンキナーゼである(Nichols and Traktman, J. Biol. Chem., 279(9):7934-7946, 2004に概説される)。Vrklは、増殖組織において高度に発現し、核に局在し、p53のリン酸化を調節する。Vrk2は、小胞体の膜に会合する。VrklおよびVrk2の両方は、細胞内局在を媒介しカゼインをリン酸化するCOOH末端の余分な触媒配列を含む。Vrk3は、キナーゼ活性を欠くが、基質結合に重要なドメインは保持する。
グルコース輸送の正の制御因子
表2に列挙する遺伝子の1つもしくは複数の発現または活性を増加させることで、インスリン刺激によるグルコース取り込みが増加することにより、インスリン作用を強化することができる。上記で負の制御因子について考察したように、インスリン作用の強化は、例えばインビボでの血糖作用の制御において有益である。したがって、これら遺伝子産物の発現または活性を増加させることは、糖尿病などの、インスリン活性またはグルコース輸送が脱制御される状態の治療に有益であり得る。
表2に列挙する遺伝子の1つもしくは複数の発現または活性を増加させることで、インスリン刺激によるグルコース取り込みが増加することにより、インスリン作用を強化することができる。上記で負の制御因子について考察したように、インスリン作用の強化は、例えばインビボでの血糖作用の制御において有益である。したがって、これら遺伝子産物の発現または活性を増加させることは、糖尿病などの、インスリン活性またはグルコース輸送が脱制御される状態の治療に有益であり得る。
アクチビンA受容体、タイプ1(Acvrl)
アクチビンは二量体の増殖および分化因子であり、これは構造的に関連するシグナル伝達タンパク質の形質転換成長因子β(TGF-β)スーパーファミリーに属する(Massague, Annu. Rev. Biochem., 67:753-791, 1998)。アクチビンは、膜貫通セリン/トレオニンキナーゼであるアクチビンタイプIおよびタイプII受容体を含む受容体を介して、シグナルを伝達する。アクチビン受容体は、システインリッチ領域を有するリガンド結合細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および予測されるセリン/トレオニン特異性を有する細胞質ドメインから構成される。
アクチビンは二量体の増殖および分化因子であり、これは構造的に関連するシグナル伝達タンパク質の形質転換成長因子β(TGF-β)スーパーファミリーに属する(Massague, Annu. Rev. Biochem., 67:753-791, 1998)。アクチビンは、膜貫通セリン/トレオニンキナーゼであるアクチビンタイプIおよびタイプII受容体を含む受容体を介して、シグナルを伝達する。アクチビン受容体は、システインリッチ領域を有するリガンド結合細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および予測されるセリン/トレオニン特異性を有する細胞質ドメインから構成される。
カルシウム/カルモジュリン依存性セリンプロテインキナーゼ(Cask)
Caskは、膜結合型グアニル酸キナーゼ(MAGUK)タンパク質ファミリーのメンバーであり、これはタンパク質-タンパク質相互作用を媒介する多数のドメインを含む。Caskは、N末端CaMキナーゼ様(CKII)ドメイン、L27ドメイン、PDZドメイン、SH3ドメイン、Hookドメイン(4.1結合ドメインとしても公知である)、およびC末端グアニル酸キナーゼ様ドメインを含む(Lee et al., Mol. Cellular Biol, 22(6): 1778- 1791, 2002)。
Caskは、膜結合型グアニル酸キナーゼ(MAGUK)タンパク質ファミリーのメンバーであり、これはタンパク質-タンパク質相互作用を媒介する多数のドメインを含む。Caskは、N末端CaMキナーゼ様(CKII)ドメイン、L27ドメイン、PDZドメイン、SH3ドメイン、Hookドメイン(4.1結合ドメインとしても公知である)、およびC末端グアニル酸キナーゼ様ドメインを含む(Lee et al., Mol. Cellular Biol, 22(6): 1778- 1791, 2002)。
セリン/トレオニンキナーゼ38(Stk38)
Stk38(核のDbf2関連(NDR)キナーゼとしても公知)は、リン酸化によって、およびCa2+結合タンパク質であるS100Bによって制御される、高度に保存されたセリン/トレオニンプロテインキナーゼである(Millward et al., EMBO J., 17:5913-5922, 1998)。タンパク質ホスファターゼ2A阻害剤であるオカダ酸(OA)によって細胞を処理すると、Stk38は効率的に(20〜100倍)活性化される。Stk38活性はまた、Ca2+イオノフォアA23187による処理によって刺激される(Tamaskovic et al., J. Biol. Chem., 278(9):6710-6718, 2003)。
Stk38(核のDbf2関連(NDR)キナーゼとしても公知)は、リン酸化によって、およびCa2+結合タンパク質であるS100Bによって制御される、高度に保存されたセリン/トレオニンプロテインキナーゼである(Millward et al., EMBO J., 17:5913-5922, 1998)。タンパク質ホスファターゼ2A阻害剤であるオカダ酸(OA)によって細胞を処理すると、Stk38は効率的に(20〜100倍)活性化される。Stk38活性はまた、Ca2+イオノフォアA23187による処理によって刺激される(Tamaskovic et al., J. Biol. Chem., 278(9):6710-6718, 2003)。
スクリーニングアッセイ法
グルコース輸送関連核酸もしくはポリペプチドの発現または活性の調節因子を同定する方法を、本明細書において提供する。調節因子には、本明細書に記載するように、1つまたは複数のグルコース輸送関連ポリペプチドもしくは核酸の発現(タンパク質またはmRNA)または活性を調節するポリペプチド、オリゴヌクレオチド、ペプチド模倣体、炭水化物、または有機小分子もしくは無機小分子などの小分子(例えば、非核酸有機小化合物)が含まれる。一般に、調節因子を同定するためのアッセイ法は、被験化合物が、被験試料(すなわち、グルコース輸送関連核酸またはポリペプチドを含む試料)中のグルコース輸送関連核酸もしくはポリペプチドの発現または活性に及ぼす影響を決定する段階を含む。被験化合物の存在下における発現または活性を、対照試料(例えば、被験化合物または参照試料を含めないこと以外は同条件下でインキュベートした、グルコース輸送関連ポリペプチドを含む試料)中の発現または活性と比較する。被験試料中のグルコース輸送関連核酸またはポリペプチドの発現または活性が、対照と比較して変化していることにより、被験化合物が、グルコース輸送関連核酸もしくはポリペプチドの発現または活性を調節することが示される。
グルコース輸送関連核酸もしくはポリペプチドの発現または活性の調節因子を同定する方法を、本明細書において提供する。調節因子には、本明細書に記載するように、1つまたは複数のグルコース輸送関連ポリペプチドもしくは核酸の発現(タンパク質またはmRNA)または活性を調節するポリペプチド、オリゴヌクレオチド、ペプチド模倣体、炭水化物、または有機小分子もしくは無機小分子などの小分子(例えば、非核酸有機小化合物)が含まれる。一般に、調節因子を同定するためのアッセイ法は、被験化合物が、被験試料(すなわち、グルコース輸送関連核酸またはポリペプチドを含む試料)中のグルコース輸送関連核酸もしくはポリペプチドの発現または活性に及ぼす影響を決定する段階を含む。被験化合物の存在下における発現または活性を、対照試料(例えば、被験化合物または参照試料を含めないこと以外は同条件下でインキュベートした、グルコース輸送関連ポリペプチドを含む試料)中の発現または活性と比較する。被験試料中のグルコース輸送関連核酸またはポリペプチドの発現または活性が、対照と比較して変化していることにより、被験化合物が、グルコース輸送関連核酸もしくはポリペプチドの発現または活性を調節することが示される。
様々な態様において、アッセイ法は、グルコース輸送関連ポリペプチドもしくはそのポリペプチドをコードする核酸、またはそれらの生物活性部分に結合するか、またはそれらの活性を調節する被験化合物をスクリーニングするために提供される。生物学的ライブラリー;空間的にアドレス可能な並列固相または液相ライブラリー;デコンボリューションを必要とする合成ライブラリー法;「1ビーズ1化合物」ライブラリー法;およびアフィニティークロマトグラフィー選択を用いる合成ライブラリー法を含む、当技術分野で公知のコンビナトリアルライブラリー法における多くのアプローチのいずれかを用いて、スクリーニングする被験化合物を得ることができる。生物学的ライブラリーアプローチはペプチドライブラリーに有用であり、他の4つのアプローチは、ペプチド、非ペプチドオリゴマー、または低分子化合物ライブラリーに有用である(Lam, Anticancer Drug Des., 12:145, 1997)。
分子ライブラリーを合成する方法の例は、文献中見出すことができ、例えば、DeWitt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6909, 1993;Erb et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:11422, 1994;Zuckermann et al., J. Med. Chem. 37:2678, 1994;Cho et al., Science 261:1303, 1993;Carrell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2059, 1994;Carell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 33:2061, 1994;およびGallop et al., J. Med. Chem., 37:1233, 1994に見出すことができる。
化合物のライブラリーは溶液中に提示してもよく(例えば、Houghten, Bio/Techniques, 13:412-421, 1992)、またはビーズ(Lam, Nature 354:82-84, 1991)、チップ(Fodor, Nature 364:555-556, 1993)、細菌(米国特許第5,223,409号)、胞子(米国特許第5,571,698号;同第5,403,484号;および同第5,223,409号)、プラスミド(Cull et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:1865-1869, 1992)、もしくはファージ(Scott and Smith, Science, 249:386-390, 1990;Devlin, Science, 249:404-406, 1990;Cwirla et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6378-6382, 1990;およびFelici, J. Mol. Biol., 222:301-310, 1991)上に提示してもよい。
1つの態様において、アッセイ法は、グルコース輸送関連ポリペプチド(例えば、表1または2の遺伝子の遺伝子産物)またはその生物活性部分を細胞表面上に発現している細胞を被験化合物と接触させる、細胞に基づくアッセイ法である。次いで、被験化合物がポリペプチドに結合する能力を決定する。細胞は例えば、酵母細胞または哺乳動物起源の細胞であってよい。被験化合物がポリペプチドに結合する能力は、例えば、複合体中の標識化合物を検出することでポリペプチドまたはその生物活性部分に対する被験化合物の結合が決定され得るように、被験化合物を放射性同位体または酵素標識と結合することによって、決定することができる。例えば、被験化合物は125I、35S、14C、または3Hで直接または間接的に標識することができ、放射線を直接カウントするかまたはシンチレーション計数によって、放射性同位体を検出することができる。
または被験化合物は、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、またはルシフェラーゼで酵素標識することもでき、酵素標識は、適切な基質の産物への変換を測定することにより検出することができる。1つの態様において、アッセイ法は、膜結合型のグルコース輸送関連ポリペプチドまたはその生物活性部分を細胞表面上に発現する細胞を、このポリペプチドに結合する公知化合物と接触させて、アッセイ混合物を形成する段階、アッセイ混合物を被験化合物と接触させる段階、および例えば公知化合物と比較して、被験化合物がポリペプチドまたはその生物活性部分に優先的に結合するかどうかを観察することにより、被験化合物がポリペプチドと相互作用する能力を決定する段階を含む。
別の態様において、本明細書に記載するようなアッセイ法は、膜結合型のグルコース輸送関連ポリペプチドまたはその生物活性部分を細胞表面上に発現している細胞を被験化合物と接触させる段階、および被験化合物がポリペプチドまたその生物活性部分の活性を調節する(例えば、促進するまたは阻害する)能力を決定する段階を含む、細胞に基づくアッセイ法である。被験化合物がポリペプチドまたはその生物活性部分の活性を調節する能力は、例えば、ポリペプチドが標的分子と結合するかまたは相互作用する能力をモニターすることにより決定することができる。
ポリペプチドもしくは核酸が標的分子と結合するかまたは相互作用する能力は、本明細書に記載の直接結合法の1つにより決定することができる。本明細書で使用する「標的分子」とは、選択されたポリペプチドまたは核酸(例えば、表1もしくは表2の遺伝子、またはその遺伝子によってコードされるポリペプチド、またはそれらの相同体)が天然で結合または相互作用する分子、例えば、選択されたタンパク質を発現する細胞の表面上の分子、第2の細胞の表面上の分子、細胞外環境にある分子、細胞膜の内面に結合した分子、または細胞質分子である。標的分子は、グルコース輸送関連ポリペプチドもしくは核酸、または他の何らかのポリペプチド、タンパク質、もしくは核酸であってよい。例えば、標的分子は、細胞外シグナル(例えば、グルコース輸送関連ポリペプチドに対する化合物の結合によって生じるシグナル)の細胞膜を介したおよび細胞内への伝達を促進するシグナル伝達経路の成分、または触媒活性を有する第2の細胞内タンパク質、または下流シグナル伝達分子とグルコース輸送関連ポリペプチドとの会合を促進するタンパク質であってよい。
様々な他の公知の方法によって、ポリペプチドが標的分子と結合するかまたは相互作用する能力を決定することもできる。例えば、標的分子の活性は、標的の細胞二次メッセンジャー(例えば、細胞内Ca2+、ジアシルグリセロール、またはIP3)の誘導を検出する、適切な基質に対する標的の触媒/酵素活性を検出する(例えば、グルコース輸送関連ポリペプチドがキナーゼである場合には、キナーゼ活性を検出する)、レポーター遺伝子(例えば、検出可能なマーカー、例えばルシフェラーゼをコードする核酸に機能的に連結された、グルコース輸送関連ポリペプチドに応答する制御エレメント)の誘導を検出する、または細胞応答、例えばグルコース取り込み、細胞分化、もしくは細胞増殖を検出することにより決定することができる。標的分子が核酸である場合には、化合物は例えばリボザイムまたはアンチセンス分子であってよい。
さらに別の態様において、本明細書に記載のアッセイ法は、グルコース輸送関連ポリペプチド(例えば、表1または2の遺伝子の遺伝子産物)もしくはそのポリペプチドをコードする核酸、またはそれらの生物活性部分を被験化合物と接触させる段階、および被験化合物がポリペプチドまたはその生物活性部分に結合する能力を決定する段階を含む。被験化合物のポリペプチドへの結合は、本明細書に記載するように直接的または間接的のいずれかで決定することができる。1つの態様において、アッセイ法は、ポリペプチドまたはその生物活性部分を、そのポリペプチドに特異的に結合する公知化合物と接触させて、アッセイ混合物を形成する段階、アッセイ混合物を被験化合物と接触させる段階、および被験化合物がポリペプチドと相互作用する能力(例えば、公知化合物の結合と競合する能力)を決定する段階を含む。公知化合物と比較して、被験化合物がポリペプチドまたはその生物活性部分に優先的に結合するかどうかを決定することにより、被験化合物がポリペプチドと相互作用する能力を評価することができる。被験化合物を核酸に標的とする場合、被験化合物の核酸への結合は、例えば、結合により、核酸の断片化により(被験化合物がリボザイムである場合)、または被験化合物の存在下における転写もしくは翻訳の阻害により試験することができる。
別の態様において、アッセイ法は、グルコース輸送関連ポリペプチドまたはその生物活性部分を被験化合物と接触させる段階、および被験化合物がポリペプチドまたはその生物活性部分の活性を調節する(例えば、促進するまたは阻害する)能力を決定する段階を含む無細胞アッセイ法である。例えば、被験化合物がポリペプチドの活性を調節する能力を決定する段階は、ポリペプチドが標的分子を修飾する能力を決定することにより達成され得る。またはそのような方法は、適切な基質に対する標的分子の触媒/酵素活性を測定することができる。
表1および2に記載の多くの遺伝子産物はキナーゼである。これらの遺伝子産物について、キナーゼアッセイ法を使用して、遺伝子産物の活性を調節する薬剤を同定することができる。一般に、ポリペプチド(またはその生物活性部分)の活性の調節は、キナーゼアッセイ法または別の形式のアッセイ法によって、被験化合物の非存在下における活性を、被験化合物の存在下における活性と比較することにより決定される。例えば、被験化合物の存在下におけるキナーゼ(例えば、表1または表2に列挙されるキナーゼ)の活性を決定するには、タンパク質リン酸化に関する任意の標準的なアッセイを行い得る。キナーゼの天然基質、またはキナーゼがリン酸化する別のタンパク質もしくはペプチドを使用することができる。キナーゼ活性のアッセイはまた、キナーゼの生物活性断片(例えば、触媒活性を保持する断片)で行うこともできる。
具体的には、キナーゼ阻害因子およびアゴニストについてのスクリーニング(例えばハイスループットスクリーニング)は、以下によって実施することができる:(a) 1つもしくは複数のタイプの基質タンパク質またはペプチドの、固体支持体(例えばマイクロタイタープレートのウェル)への結合;(b) 遮断剤(ウシ血清アルブミンまたはゼラチンなどの標準的な遮断剤が公知である)への基質の曝露;ならびに(c) キナーゼ、リン酸の供給源(例えば放射活性物質で標識したγリン酸を有するATP)、および被験化合物への基質の曝露。反応の構成要素(例えばキナーゼ、リン酸供給源、および被験化合物)は典型的に、緩衝液中に供給され、ある温度(温度は例えば室温(約23℃)から生理的温度(約37℃)まで変化し得る)で、アッセイの直線範囲内である時間、反応を進行させる。反応は、様々な方法で(例えば支持体を緩衝液で何回かリンスすることによって)終結させることができ、結合基質に取り込まれたリン酸の量を決定することができる(測定には標準的な技術、例えば放射性タグが利用可能である)。キナーゼが基質をリン酸化することが可能であった程度を低下させる物質として、阻害因子を同定する。キナーゼが基質をリン酸化することが可能であった程度を増加させる物質として、アゴニストを同定する。キナーゼの活性またはキナーゼが相互作用する分子の変化を測定するために用いることができる他のアッセイ法の記載について、米国特許第6,258,776号もまた参照されたい。
さらに別の態様において、無細胞アッセイ法は、グルコース輸送関連ポリペプチドもしくはそのポリペプチドをコードする核酸、またはそれらの生物活性部分を、ポリペプチドに結合する公知化合物と接触させて、アッセイ混合物を形成する段階、アッセイ混合物を被験化合物と接触させる段階、およびポリペプチドまたは核酸が標的分子(例えば、ポリペプチドの天然基質であるかまたは結合パートナーである標的分子)に優先的に結合するかまたはその活性を調節する能力をアッセイすることにより、被験化合物がポリペプチドまたは核酸と相互作用する能力を決定する段階を含む。
無細胞アッセイ法は、可溶型または膜結合型のポリペプチド(ポリペプチドが膜含有ポリペプチドである場合)の使用に適している。膜結合型のポリペプチドを含む無細胞アッセイ法の場合には、膜結合型のポリペプチドが溶液中で維持されるように、可溶化剤を使用することが望ましいと考えられる。このような可溶化剤の例には、n-オクチルグルコシド、n-ドデシルグルコシド、n-オクチルマルトシド、オクタノイル-N-メチルグルカミド、デカノイル-N-メチルグルカミド、Triton X-100(登録商標)、Triton X-114(登録商標)、テシット(Thesit)、イソトリデシポリ(エチレングリコールエーテル)n、3-[(3-コールアミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-1-プロパンスルホン酸(CHAPS)、3-[(3-コールアミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-2-ヒドロキシ-1-プロパンスルホン酸(CHAPSO)、およびN-ドデシル-N,N-ジメチル-3-アンモニオ-1-プロパンスルホン酸などの非イオン性界面活性剤が含まれる。
新規アッセイ法の特定の態様では、グルコース輸送関連ポリペプチドまたはその標的分子のいずれかを固定化して、これらタンパク質の一方または両方の非複合体型からの複合体型の分離を容易にすること、およびアッセイを自動化することが望ましいと考えられる。被験化合物のポリペプチドへの結合、または、被験薬剤の存在下および非存在下におけるポリペプチドと標的分子との相互作用は、反応物の収容に適した任意の容器中で行うことができる。このような容器の例には、マイクロタイタープレート、試験管、および微量遠心管が含まれる。1つの態様では、タンパク質の一方または両方の基質への結合を可能にするドメインを付加した融合タンパク質が提供され得る。例えば、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ融合タンパク質またはグルタチオン-S-トランスフェラーゼ融合タンパク質をグルタチオンセファロースビーズ(Sigma Chemical;ミズーリ州、セントルイス)またはグルタチオン誘導体化マイクロタイタープレートに吸着させ得、次いで被験化合物、または、被験化合物および吸着させていない標的タンパク質もしくはグルコース輸送関連タンパク質のいずれかと混合し、複合体形成を促す条件下で(例えば、塩およびpHの生理的条件で)インキュベートする。インキュベーション後、ビーズまたはマイクロタイタープレートウェルを洗浄して、非結合成分を除去し、複合体形成を例えば上記のように直接または間接的に測定する。または、複合体を基質から解離させてもよく、ポリペプチドの結合または活性のレベルを標準的な技法で決定することができる。
タンパク質を基質上に固定化する他の技術もまた、本スクリーニングアッセイ法において使用することができる。例えば、グルコース輸送関連ポリペプチドまたはその標的分子のいずれかを、ビオチンとストレプトアビジンの結合を用いて固定化することができる。当技術分野で周知の技法を使用して(例えば、ビオチン化キット、Pierce Chemicals;イリノイ州、ロックフォード)、ビオチン-NHS(N-ヒドロキシ-スクシンイミド)からビオチン化ポリペプチドまたは標的分子を調製し、ストレプトアビジンをコーティングした96ウェルプレート(Pierce Chemical)のウェルに固定することができる。または、ポリペプチドまたは標的分子と反応するが、グルコース輸送関連ポリペプチドのその標的分子への結合を妨げない抗体を、プレートのウェルに誘導体化し、非結合の標的またはポリペプチドを抗体結合によりウェルに捕捉することができる。GST固定化複合体などの複合体を検出する方法には、ポリペプチドまたは標的分子と反応する抗体を用いる複合体の免疫検出法、およびポリペプチドまたは標的分子に関連した酵素活性の検出に基づく酵素結合測定法が含まれる。
別の態様においては、細胞を被験化合物と接触させ、細胞内での選択されたmRNAまたはタンパク質(例えば、例えば表1または2記載のグルコース輸送関連ポリペプチドまたはそのポリペプチドをコードする遺伝子に対応するmRNAまたはタンパク質)の発現を決定する方法で、ポリペプチドの発現の調節因子を同定する。被験化合物の存在下における選択されたmRNAまたはタンパク質の発現レベルを、被験化合物の非存在下における選択されたmRNAまたはタンパク質の発現レベルと比較する。次いで、この比較に基づいて、被験化合物をポリペプチドの発現の調節因子(すなわち、候補化合物)として同定することができる。例えば、選択されたmRNAまたはタンパク質の発現が、被験化合物の非存在下よりもその存在下で高い(統計的に有意に高い)場合には、被験化合物は、選択されたmRNAまたはタンパク質の発現の促進因子である候補薬剤として同定される。または、選択されたmRNAまたはタンパク質の発現が、被験化合物の非存在下よりもその存在下で低い(統計的に有意に低い)場合には、被験化合物は、選択されたmRNAまたはタンパク質の発現の阻害因子である候補薬剤と同定される。細胞内での選択されたmRNAまたはタンパク質の発現レベルは、本明細書に記載する方法により決定することができる。
さらに別の局面においては、グルコース輸送関連ポリペプチドをツーハイブリッドアッセイ法またはスリーハイブリッドアッセイ法における「ベイトタンパク質」として用いて(例えば、米国特許第5,283,317号; Zervos et al., Cell, 72:223-232, 1993;Madura et al., J. Biol. Chem. 268:12046-12054, 1993;Bartel et al., Bio/Techniques 14:920-924, 1993;Iwabuchi et al., Oncogene 8:1693-1696, 1993;およびWO 94/10300を参照されたい)、グルコース輸送関連タンパク質と結合するもしくは相互作用する、またはポリペプチドの活性を調節する他のタンパク質を同定することができる。そのような結合タンパク質はまた、例えばグルコース輸送に関するシグナル伝達経路の下流エレメントとして、グルコース輸送関連ポリペプチドによるシグナルの伝播に関与している可能性が高い。
アンチセンス核酸
本明細書に記載のグルコース輸送関連ポリペプチドの発現を調節する薬剤には、アンチセンス核酸分子、すなわちそのヌクレオチド配列がグルコース輸送関連ポリペプチドをコードする遺伝子の配列に基づく(例えば、表1または表2に列挙した遺伝子の配列に基づく)mRNAの全体または一部と相補的である核酸分子が含まれる。アンチセンス核酸分子は、グルコース輸送関連ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列のコード鎖の非コード領域の全体または一部に対してアンチセンスであってよい。非コード領域(「5'および3'非翻訳領域」)とは、遺伝子内でコード領域に隣接し、かつアミノ酸に翻訳されない5'および3'配列である。
本明細書に記載のグルコース輸送関連ポリペプチドの発現を調節する薬剤には、アンチセンス核酸分子、すなわちそのヌクレオチド配列がグルコース輸送関連ポリペプチドをコードする遺伝子の配列に基づく(例えば、表1または表2に列挙した遺伝子の配列に基づく)mRNAの全体または一部と相補的である核酸分子が含まれる。アンチセンス核酸分子は、グルコース輸送関連ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列のコード鎖の非コード領域の全体または一部に対してアンチセンスであってよい。非コード領域(「5'および3'非翻訳領域」)とは、遺伝子内でコード領域に隣接し、かつアミノ酸に翻訳されない5'および3'配列である。
本明細書に開示する配列に基づき、当業者は、本明細書に記載の遺伝子を標的するための多くの適切なアンチセンス分子のうちのいずれかを容易に選択し、合成することができる。例えば、表1に記載する核酸の長さにわたる15〜30ヌクレオチドの一連のオリゴヌクレオチドを含む「遺伝子歩行」(gene walk)を調製し、続いて遺伝子発現の阻害に関して試験することができる。任意で、合成および試験するオリゴヌクレオチドの数を低減するために、5〜10ヌクレオチドのギャップをオリゴヌクレオチド間に残してもよい。
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、約5、10、15、20、25、30、35、40、45、もしくは50ヌクレオチド長またはそれ以上の長さであってよい。アンチセンス核酸は、当技術分野で公知の手順を使用して、化学合成および酵素による連結反応により構築することができる。例えば、アンチセンス核酸(例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド)は、天然ヌクレオチド、または分子の生物学的安定性を増すように、もしくはアンチセンス核酸とセンス核酸との間に形成される二重鎖の物理的安定性を増すように設計された様々な修飾ヌクレオチドを用いて化学合成することができ、例えば、ホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドを使用することができる。
アンチセンス核酸の作製に使用することのできる修飾ヌクレオチドの例には、5-フルオロウラシル、5-ブロモウラシル、5-クロロウラシル、5-ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、4-アセチルシトシン、5-(カルボキシヒドロキシメチル)ウラシル、5-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウリジン、5-カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β-D-ガラクトシルケオシン、イノシン、N6-イソペンテニルアデニン、1-メチルグアニン、1-メチルイノシン、2,2-ジメチルグアニン、2-メチルアデニン、2-メチルグアニン、3-メチルシトシン、5-メチルシトシン、N6-アデニン、7-メチルグアニン、5-メチルアミノメチルウラシル、5-メトキシアミノメチル-2-チオウラシル、β-D-マンノシルケオシン、5'-メトキシカルボキシメチルウラシル、5-メトキシウラシル、2-メチルチオ-N6-イソペンテニルアデニン、ウラシル-5-オキシ酢酸(v)、ワイブトキソシン(wybutoxosine)、シュードウラシル、ケオシン、2-チオシトシン、5-メチル-2-チオウラシル、2-チオウラシル、4-チオウラシル、5-メチルウラシル、ウラシル-5-オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル-5-オキシ酢酸(v)、5-メチル-2-チオウラシル、3-(3-アミノ-3-N-2-カルボキシプロピル)ウラシル、(acp3)w、および2,6-ジアミノプリンが含まれる。または、アンチセンス核酸は、核酸がアンチセンス方向にサブクローニングされた発現ベクターを使用して、生物学的に生成することもできる(すなわち、挿入された核酸から転写されるRNAは、以下の節でさらに説明するように、関心対象の標的核酸に対してアンチセンス方向となる)。
本明細書に記載のアンチセンス核酸分子は、インビトロで調製し、動物、例えば哺乳動物、例えばヒト患者に投与することができる。または、アンチセンス核酸分子は、本明細書に記載の選択されたポリペプチドをコードするmRNAおよび/またはゲノムDNAとハイブリダイズするかまたはそれに結合し、それによって例えば転写および/または翻訳を阻害することにより発現を阻害するように、インサイチューで作製することもできる。ハイブリダイゼーションは、安定な二重鎖を形成するための通常のヌクレオチド相補性によってもよいし、または例えば、DNA二重鎖に結合するアンチセンス核酸分子の場合には、二重らせんの主溝における特異的相互作用によってもよい。アンチセンス核酸分子の投与経路の例には、組織部位における直接注射が含まれる。または、アンチセンス核酸分子を選択された細胞を標的とするように修飾して、その後全身投与することもできる。例えば、全身投与のためには、選択された細胞表面上に発現される受容体または抗原にアンチセンス分子が特異的に結合するように、例えば細胞表面の受容体または抗原に結合するペプチドまたは抗体にアンチセンス核酸分子を連結することにより、アンチセンス分子を修飾することができる。アンチセンス核酸分子は、本明細書に記載のベクターを用いて細胞に送達することもできる。例えば、アンチセンス分子の十分な細胞内濃度を得るために、アンチセンス核酸分子を強力なpol IIまたはpol IIIプロモーターの調節下に置いたベクター構築物を使用することができる。
グルコース輸送関連ポリペプチドの発現または活性を調節するために用いるアンチセンス核酸分子は、α-アノマー核酸分子であってよい。α-アノマー核酸分子は、通常のβ-ユニットとは異なり鎖が相互に平行に走行する、相補的RNAとの特異的な二本鎖ハイブリッドを形成する(Gaultier et al., Nucleic Acids Res. 15:6625-6641, 1987)。アンチセンス核酸分子はまた、2'-o-メチルリボヌクレオチド(Inoue et al., Nucleic Acids Res., 15:6131-6148, 1987)またはキメラRNA-DNA類似体(Inoue et al., FEBS Lett., 215:327-330, 1987)を含み得る。
グルコース輸送関連遺伝子の全体または一部と相補的なアンチセンス分子はまた、当技術分野において公知のハイブリダイゼーション法を用いてそのような遺伝子の発現をアッセイするのに有用である。例えば、アンチセンス分子を標識し(例えば、放射性分子で)、過剰量の標識アンチセンス分子をRNA試料とハイブリダイズさせる。ハイブリダイズしなかった標識アンチセンス分子を除去し(例えば、洗浄により)、ハイブリダイズしたアンチセンス分子の量を測定する。ハイブリダイズした分子の量を測定し、これを用いて、グルコース輸送関連遺伝子の発現量を計算する。一般に、この目的のためのアンチセンス分子は、本明細書に記載するような高ストリンジェンシー条件下でグルコース輸送関連遺伝子の配列とハイブリダイズすることができる。最初にRNA試料を用いてcDNAを合成する場合には、センス分子を使用することができる。二本鎖分子をハイブリダイゼーション前に適切に変性させるのであれば、二本鎖分子をそのようなアッセイにおいて使用することも可能である。
リボザイム
本明細書に記載のグルコース輸送関連遺伝子をコードする配列に対して(例えば、表1または表2記載の遺伝子の配列に対して)特異性を有するリボザイムもまた提供する。リボザイムとは、それらが相補的な領域を有する、mRNAなどの一本鎖核酸を切断することのできる、リボヌクレアーゼ活性を有する触媒RNA分子である。したがって、リボザイム(例えば、ハンマーヘッドリボザイム(Haselhoff and Gerlach, Nature, 334:585-591, 1988に記載されている))を用いてmRNA転写産物を触媒切断して、それによりmRNAによってコードされるタンパク質の翻訳を阻害することができる。本発明の核酸分子に対して特異性を有するリボザイムは、本明細書に開示するcDNAのヌクレオチド配列に基づいて設計することができる。例えば、活性部位のヌクレオチド配列が、グルコース輸送関連mRNAにおいて切断されるべきヌクレオチド配列に対して相補的である、テトラヒメナL-19 IVS RNAの誘導体を構築することができる(Cech et al. 米国特許第4,987,071号;およびCech et al.、米国特許第5,116,742号)。または、グルコース輸送関連ポリペプチドをコードするmRNAを用いて、RNA分子のプールから特異的リボヌクレアーゼ活性を有する触媒RNAを選択することもできる。例えば、Bartel and Szostak, Science, 261:1411-1418, 1993を参照されたい。
本明細書に記載のグルコース輸送関連遺伝子をコードする配列に対して(例えば、表1または表2記載の遺伝子の配列に対して)特異性を有するリボザイムもまた提供する。リボザイムとは、それらが相補的な領域を有する、mRNAなどの一本鎖核酸を切断することのできる、リボヌクレアーゼ活性を有する触媒RNA分子である。したがって、リボザイム(例えば、ハンマーヘッドリボザイム(Haselhoff and Gerlach, Nature, 334:585-591, 1988に記載されている))を用いてmRNA転写産物を触媒切断して、それによりmRNAによってコードされるタンパク質の翻訳を阻害することができる。本発明の核酸分子に対して特異性を有するリボザイムは、本明細書に開示するcDNAのヌクレオチド配列に基づいて設計することができる。例えば、活性部位のヌクレオチド配列が、グルコース輸送関連mRNAにおいて切断されるべきヌクレオチド配列に対して相補的である、テトラヒメナL-19 IVS RNAの誘導体を構築することができる(Cech et al. 米国特許第4,987,071号;およびCech et al.、米国特許第5,116,742号)。または、グルコース輸送関連ポリペプチドをコードするmRNAを用いて、RNA分子のプールから特異的リボヌクレアーゼ活性を有する触媒RNAを選択することもできる。例えば、Bartel and Szostak, Science, 261:1411-1418, 1993を参照されたい。
三重らせん構造を形成する核酸分子もまた、本明細書において提供する。例えば、ポリペプチドをコードする遺伝子の制御領域(例えば、プロモーターおよび/またはエンハンサー)に相補的なヌクレオチド配列を標的として、標的細胞において遺伝子の転写を妨げる三重らせん構造を形成させることにより、グルコース輸送関連ポリペプチドの発現を阻害することができる。一般的には、Helene, Anticancer Drug Des. 6(6):569-84, 1991;Helene, Ann. N.Y. Acad. Sci., 660:27-36, 1992;およびMaher, Bioassays, 14(12):807-15, 1992を参照されたい。
様々な態様において、核酸分子(例えば、グルコース輸送関連ポリペプチドの発現を調節するために用いられる核酸分子)は、例えば分子の安定性、ハイブリダイゼーション、または溶解度を改善するために、塩基部分、糖部分、またはリン酸骨格において修飾することができる。例えば、核酸のデオキシリボースリン酸骨格を修飾して、ペプチド核酸を作製することができる(例えば、Hyrup et al., Bioorganic & Medicinal Chem., 4(1): 5-23, 1996を参照されたい)。ペプチド核酸(PNA)とは、デオキシリボースリン酸骨格が擬ペプチド骨格で置換され、4種類の天然核酸塩基のみが保持されている核酸模倣体、例えばDNA模倣体である。PNAの中性骨格は、低イオン強度の条件下におけるDNAおよびRNAへの特異的ハイブリダイゼーションを可能にする。PNAオリゴマーの合成は、例えば、Hyrup et al., 1996、前記; Perry-O'Keefe et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 14670-675, 1996に記載されている標準的な固相ペプチド合成手順を用いて行うことができる。
PNAは治療および診断用途に用いることができる。例えば、PNAは、例えば転写もしくは翻訳停止を誘導するか、または複製を阻害することによって、遺伝子発現を配列特異的に調節するためのアンチセンス剤またはアンチ遺伝子剤として用いることができる。PNAはまた、例えばPNA指向性PCRクランピングにより、例えば遺伝子における単一塩基対の変異の解析において;他の酵素、例えばS1ヌクレアーゼと組み合わせて使用する場合の人工制限酵素として(Hyrup, 1996、前記);またはDNA配列決定およびハイブリダイゼーションのためのプローブもしくはプライマーとして(Hyrup, 1996、前記;Perry-O'Keefe et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 14670-675, 1996)用いることもできる。
PNAは、例えばその安定性または細胞取り込みを増強するために、PNAに親油性基もしくは他の補助基を付加することにより、PNA-DNAキメラの形成により、またはリポソームもしくは当技術分野で公知の他の薬物送達技法の使用により修飾することができる。例えば、PNAとDNAの有利な特性を兼ね備え得るPNA-DNAキメラを作製することができる。このようなキメラにより、PNA部分が高い結合親和性および特異性を提供しつつ、例えばRNaseHおよびDNAポリメラーゼなどのDNA認識酵素がDNA部分と相互作用することが可能になる。PNA-DNAキメラは、塩基のスタッキング、核酸塩基間の結合数、および配向に関して選択される適切な長さのリンカーを用いて連結することができる(Hyrup, 1996、前記)。PNA-DNAキメラの合成は、Hyrup, 1996、前記、およびFinn et al., Nucleic Acids Res., 24:3357-63, 1996に記載されている通りに行うことができる。例えば、DNA鎖は、標準的なホスホラミダイトカップリング化学および修飾ヌクレオシド類似体を用いて固相支持体上で合成することができる。5'-(4-メトキシトリチル)アミノ-5'-デオキシ-チミジンホスホラミダイトなどの化合物を、PNAとDNAの5'末端との間の連結として使用することができる(Mag et al., Nucleic Acids Res., 17:5973-88, 1989)。次いでPNAモノマーを段階的様式で結合させ、5'PNA部分および3'DNA部分を有するキメラ分子を生成する(Finn et al., Nucleic Acids Res., 24:3357-63, 1996)。または、5'DNA部分および3'PNA部分を用いてキメラ分子を合成することもできる(Peterser et al., Bioorganic Med. Chem. Lett., 5:1119-11124, 1975)。
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、ペプチド(例えば、インビボで宿主細胞受容体を標的とするための)、または細胞膜(例えば、Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:6553-6556, 1989;Lemaitre et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:648-652, 1989;WO 88/09810を参照されたい)もしくは血液脳関門(例えば、WO 89/10134を参照されたい)を介した輸送を促進する薬剤などの他の付属基を含む。さらに、オリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーション誘発性切断剤(例えば、Krol et al., Bio/Techniques, 6:958-976, 1988を参照されたい)または挿入剤(例えば、Zon, Pharm. Res., 5:539-549, 1988を参照されたい)で修飾することもできる。この目的のために、オリゴヌクレオチドを別の分子、例えば、ペプチド、ハイブリダイゼーション誘発性架橋剤、輸送剤、またはハイブリダイゼーション誘発性切断剤に結合することができる。
RNA干渉
グルコース輸送関連ポリペプチドの発現を調節することができる別の手段は、RNA干渉(RNAi)による。RNAiとは、mRNAが宿主細胞において特異的に分解され、それによってmRNAをコードする遺伝子の発現をサイレンシングする過程である。様々な方法、例えばRNAヘアピンの内因性発現を実行させることにより(Paddison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99:1443-1448, 2002を参照されたい)、または低分子(21〜23 nt)二本鎖(dsRNA)のトランスフェクションにより(例えばカチオン性リポソームトランスフェクションおよびエレクトロポレーションによる)、腔もしくは細胞内空間へのdsRNAの導入により、またはdsRNAをコードするDNAの導入により、RNAを介した遺伝子サイレンシングを哺乳動物細胞に導入することができる。例えばCaplen, Trends in Biotech., 20:49-51, 2002を参照されたい。遺伝子発現をRNAiによって調節する方法は、例えば米国特許第6,506,559号および米国特許出願公開第20030056235号に記載されている。
グルコース輸送関連ポリペプチドの発現を調節することができる別の手段は、RNA干渉(RNAi)による。RNAiとは、mRNAが宿主細胞において特異的に分解され、それによってmRNAをコードする遺伝子の発現をサイレンシングする過程である。様々な方法、例えばRNAヘアピンの内因性発現を実行させることにより(Paddison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99:1443-1448, 2002を参照されたい)、または低分子(21〜23 nt)二本鎖(dsRNA)のトランスフェクションにより(例えばカチオン性リポソームトランスフェクションおよびエレクトロポレーションによる)、腔もしくは細胞内空間へのdsRNAの導入により、またはdsRNAをコードするDNAの導入により、RNAを介した遺伝子サイレンシングを哺乳動物細胞に導入することができる。例えばCaplen, Trends in Biotech., 20:49-51, 2002を参照されたい。遺伝子発現をRNAiによって調節する方法は、例えば米国特許第6,506,559号および米国特許出願公開第20030056235号に記載されている。
様々な態様において、サイレンシングする遺伝子(例えばグルコース輸送関連ポリペプチドをコードする遺伝子、例えば表1記載の遺伝子;表1に列挙された遺伝子産物の発現もしくは活性を活性化するポリペプチドをコードする遺伝子;または表2に列挙された遺伝子産物を阻害するポリペプチドをコードする遺伝子)の一部に対応するdsRNA、またはそのdsRNAをコードするDNAを、細胞に導入する。dsRNAは低分子干渉RNA(すなわちsiRNA)と呼ばれる21〜23ヌクレオチド長の二重鎖へと消化され、これがヌクレアーゼ複合体に結合してRNA誘導型サイレンシング複合体(すなわちRISC)として公知のものを形成する。RISCは、siRNA鎖の一方と内因性mRNAとの間の塩基対形成相互作用により、相同的な転写産物を標的とする。これは次いで、siRNAの3'末端から約12ヌクレオチドでmRNAを切断する(Sharp et al., Genes Dev., 15:485-490, 2001、およびHammond et al., Nature Rev. Gen., 2:110-119, 2001を参照されたい)。
標準的な分子生物学技法を用いて、siRNAを作製することができる。低分子干渉RNAは、化学合成すること、例えばプラスミドなどの鋳型DNAからRNAを発現させて組換えにより生成すること、またはDharmaconなどの製造供給元から入手することができる。RNAiを媒介するために使用するRNAは、ホスホロチオエートヌクレオチドなどの合成または修飾ヌクレオチドを含み得る。siRNAまたはsiRNAを作製するように設計されたプラスミドを細胞にトランスフェクションする方法は、当技術分野において日常的である。
グルコース輸送関連ポリペプチドの発現を調節するために用いられるsiRNA分子は、多くの方法において異なってもよい。例えば、siRNA分子は、3'ヒドロキシ基および21、22、または23個の連続したヌクレオチドの鎖を含み得る。それらは平滑末端化されてもよく、または3'末端、5'末端、もしくは両末端のいずれかにおいて突出末端を含んでもよい。例えば、RNA分子の少なくとも一方の鎖は、約1〜約6ヌクレオチド(例えば、1〜5、1〜3、2〜4、または3〜5ヌクレオチド(ピリミジンヌクレオチドまたはプリンヌクレオチドのいずれであっても))長の3'突出部を有することができる。両鎖が突出部を含む場合には、突出部の長さは各鎖について同じであってもまたは異なってもよい。
遺伝子の発現を調節するために用いられるsiRNAは、遺伝子のmRNAにおける標的領域に対して同一であるか、または例えば少なくとも80%(またはそれ以上、例えば85%、90%、95%、もしくは100%)同一、例えば3、2、1、もしくは0個のミスマッチヌクレオチド有するなど、実質的に同一であってよく、他方の鎖は第一の鎖に相補的である。
陰性対照siRNA(「スクランブルされた」)は一般に、選択されたsiRNAと同じヌクレオチド組成物を有するが、適切なゲノムに対する有意な配列相補性は有さない。選択されたsiRNAのヌクレオチド配列をランダムにスクランブルすることによって、そのような陰性対照を設計することができる:相同性検索を実行して、この陰性対照が、適切なゲノムにおける他のいずれの遺伝子に対する相同性も持たないことを確認することができる。適切な数の塩基ミスマッチを、選択されたsiRNA配列に導入することによって、対照も同様に設計することができる
RNA二重鎖の安定性をさらに増強するために、3'突出部を分解に対して安定化することができる(例えば、アデノシンもしくはグアノシンヌクレオチドなどのプリンヌクレオチドを含めること、またはピリミジンヌクレオチドを修飾した類似体で置換することによって(例えば、2'-デオキシチミジンによるウリジン2ヌクレオチド3'突出部の置換は許容され、RNAiの効率に影響しない))。関心対象の標的と十分な相同性を有するのであれば、グルコース輸送関連ポリペプチドを調節する方法において任意のsiRNAを使用することができる。使用することができるsiRNAの長さに上限はない(例えば、siRNAは、遺伝子の約21塩基対から遺伝子の全長またはそれ以上の長さ(例えば、50〜100、100〜250、250〜500、500〜1000、または1000を超える塩基対)の範囲であってよい)。様々な態様において、siRNAは31、30、28、25、または23ヌクレオチド未満の長さを有する。
単離されたポリペプチド
本明細書に記載のグルコース輸送関連遺伝子によってコードされる単離されたポリペプチドもまた提供する。これらのポリペプチドは、例えば抗体を産生させるための免疫原として、スクリーニング法において、または例えばポリペプチドの投与により対象を治療する方法において使用することができる。核酸の翻訳産物を予測する方法は、当技術分野において周知である(例えば、予測されるポリペプチド配列、および3つの読み枠のうちどれが配列のオープンリーディングフレームであるかに関する指示を提供するコンピュータプログラムを用いる)。次いで、これらのポリペプチド配列を生物学的に(例えば、これらをコードする核酸配列を発現ベクター中にインフレームで配置し、適合する発現系にトランスフェクションすることにより)、または当技術分野で公知の方法を用いて化学的に生成することができる。ポリペプチド全体またはその断片を、治療方法において、または例えばスクリーニングアッセイにおいて有用である抗体を産生させるために使用することができる。
本明細書に記載のグルコース輸送関連遺伝子によってコードされる単離されたポリペプチドもまた提供する。これらのポリペプチドは、例えば抗体を産生させるための免疫原として、スクリーニング法において、または例えばポリペプチドの投与により対象を治療する方法において使用することができる。核酸の翻訳産物を予測する方法は、当技術分野において周知である(例えば、予測されるポリペプチド配列、および3つの読み枠のうちどれが配列のオープンリーディングフレームであるかに関する指示を提供するコンピュータプログラムを用いる)。次いで、これらのポリペプチド配列を生物学的に(例えば、これらをコードする核酸配列を発現ベクター中にインフレームで配置し、適合する発現系にトランスフェクションすることにより)、または当技術分野で公知の方法を用いて化学的に生成することができる。ポリペプチド全体またはその断片を、治療方法において、または例えばスクリーニングアッセイにおいて有用である抗体を産生させるために使用することができる。
「単離された」もしくは「精製された」タンパク質またはその生物活性部分は、そのタンパク質が由来する細胞または組織源からの細胞物質または他の混入タンパク質を実質的に含まず、または化学合成された場合には、化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まない。「細胞物質を実質的に含まない」という用語は、タンパク質が単離されたまたは組換えによって生成された細胞の細胞成分からタンパク質が分離されているタンパク質調製物を含む。したがって、細胞物質を実質的に含まないタンパク質には、(乾燥重量で)約30%、20%、10%、または5%未満の異種タンパク質(本明細書では「混入タンパク質」とも称する)を有するタンパク質調製物が含まれる。一般に、タンパク質およびその生物活性部分が組換えによって生成される場合には、これは同様に培養液を実質的に含まず、すなわち培養液はタンパク質調製物の容量の約20%、10%、または5%未満を表す。一般に、タンパク質が化学合成によって生成される場合には、これは化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まず、すなわちタンパク質の合成に関与する化学的前駆体または他の化学物質から分離されている。したがって、このようなタンパク質調製物は、化学的前駆体または関心対象のポリペプチド以外の化合物を(乾燥重量で)約30%、20%、10%、または5%未満有する。
タンパク質およびポリペプチドをアッセイして、関心対象の遺伝子産物の発現レベルを決定することができる。タンパク質発現をアッセイする方法は当技術分野で公知であり、これにはウェスタンブロット法、免疫沈降法、および放射性免疫測定法が含まれる。
グルコース輸送関連ポリペプチドの生物活性部分には、タンパク質のアミノ酸配列と十分に同一であるかまたはその配列に由来するアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、全長タンパク質よりも少数のアミノ酸を含み、かつ対応する全長タンパク質の少なくとも1つの活性を示すポリペプチドが含まれる。典型的に、生物活性部分は、対応するタンパク質の少なくとも1つの活性を有するドメインまたはモチーフを含む。ポリペプチドの生物活性部分は、例えば10、25、50、100アミノ酸長、またはそれ以上の長さであってよい。さらに、所与のタンパク質の他の領域が除去された生物活性部分を組換え技法によって調製し、天然型ポリペプチドの機能活性の1つまたは複数に関して評価することができる。これらの短いポリペプチドは、表1または表2に列挙される遺伝子の遺伝子産物の活性を競合的に阻害する(または表1もしくは表2に列挙される遺伝子の活性もしくは発現を制御する遺伝子産物の活性を阻害する)ための処置において使用することができる。
いくつかの態様において、グルコース輸送関連ポリペプチドは、表1および2記載の遺伝子から選択される遺伝子によってコードされる予測アミノ酸配列を有する。他の有用なタンパク質は、表1および2記載の遺伝子によってコードされるポリペプチドの予測アミノ酸配列と実質的に同一(例えば、少なくとも約45%、好ましくは55%、65%、75%、85%、95%、または99%)であって、(a) 対応する天然タンパク質のタンパク質の機能活性を保持しているが、天然の対立遺伝子変化もしくは変異誘発によってアミノ酸配列が異なるか、または(b) 必要に応じて変化した機能活性(例えば、ドミナントネガティブとして)を示す。
配列の比較および2つの配列間のパーセント同一性の決定は、数学的アルゴリズムを用いて達成される。2つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、GCGソフトウェアパッケージ(gcg.comのワールドワイドウェブで利用可能)中のGAPプログラムに組み込まれているNeedleman and Wunsch((1970) J. Mol. Biol. 48:444-453)アルゴリズムを用いて、Blossum 62行列またはPAM250行列のいずれか、ならびにギャップ加重16および長さ加重1を用いて決定される。2つのヌクレオチド配列間のパーセント同一性は、GCGソフトウェアパッケージ(gcg.comのワールドワイドウェブで利用可能)中のGAPプログラムを用いて、NWSgapdna.CMP行列ならびにギャップ加重40および長さ加重1を用いて決定される。
一般に、本明細書で参照するアミノ酸配列間のパーセント同一性は、ncbi.nlm.nih.gov/BLASTのワールドワイドウェブにおいて公的に利用可能なBLAST 2.0プログラムを用いて決定される。配列比較は、ギャップなしのアラインメントを用いて、および初期設定パラメータ(Blossum 62行列、ギャップ存在コスト11、残基あたりのギャップコスト1、およびラムダ比0.85)を用いて行われる。BLASTプログラムで盛りいられる数学的アルゴリズムは、Altschul et al., Nucleic Acids Research 25:3389-3402, 1997に記載されている。
キメラまたは融合タンパク質もまた、本明細書において提供する。本明細書で使用する「キメラタンパク質」または「融合タンパク質」は、異種ポリペプチド(すなわち、グルコース輸送関連ポリペプチド以外のポリペプチド)に機能的に連結されたグルコース輸送関連ポリペプチドの全体または一部(例えば、生物活性部分)を含む。融合タンパク質との関連において「機能的に連結した」という用語は、ポリペプチドと異種ポリペプチドが相互にインフレームで融合していることを意味するものとする。異種ポリペプチドは、グルコース輸送関連ポリペプチドのN末端またはC末端に融合させることができる。
1つの有用な融合タンパク質は、グルコース輸送関連ポリペプチドがGST配列のC末端に融合されているGST融合タンパク質である。そのような融合タンパク質は、組換え体グルコース輸送関連ポリペプチドの精製を容易にすることができる。
別の態様において、融合タンパク質は、そのN末端で異種シグナル配列を含む。例えば、グルコース輸送関連ポリペプチドの本来のシグナル配列を除去して、別のタンパク質のシグナル配列で置換することができる。例えば、バキュロウイルスエンベロープタンパク質のgp67分泌配列を異種シグナル配列として用いることができる(Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons, 1992)。真核生物異種シグナル配列の他の例には、メリチンおよびヒト胎盤アルカリホスファターゼの分泌配列が含まれる(Stratagene;カリフォルニア州、ラ・ホーヤ)。さらに別の例において、有用な原核生物異種シグナル配列には、phoA分泌シグナル(Sambrook et al., eds., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989)およびプロテインA分泌シグナル(Pharmacia Biotech:ニュージャージー州、ピスカタウェイ)が含まれる。
さらに別の態様において、融合タンパク質は、グルコース輸送関連ポリペプチドの全体または一部が、免疫グロブリンタンパク質ファミリーのメンバーに由来する配列に融合されている免疫グロブリン融合タンパク質である。免疫グロブリン融合タンパク質を薬学的組成物に組み入れ、リガンド(可溶性または膜結合型)と細胞表面上のタンパク質(受容体)との相互作用を阻害して、それによってインビボでのシグナル伝達を抑制するために、対象に投与することができる。免疫グロブリン融合タンパク質を用いて、グルコース輸送関連ポリペプチドの同族リガンドの生物学的利用能に影響を及ぼすことができる。リガンド/受容体相互作用の阻害は、増殖性および分化性の障害を治療するため、ならびに細胞生存を調節する(例えば、促進するまたは阻害する)ために、治療的に有用であり得る。さらに、免疫グロブリン融合タンパク質は、対象においてグルコース輸送関連ポリペプチドに対する抗体を産生させるための免疫原として、リガンドを精製するため、および受容体とリガンドの相互作用を阻害する分子を同定するためのスクリーニングアッセイにおいて用いることができる。
キメラおよび融合グルコース輸送関連ポリペプチドは、標準的な組換えDNA技法により生成することができる。別の態様において、融合遺伝子は、自動DNA合成機を含む従来の技法によって合成することができる。または、2つの連続した遺伝子断片間に相補的突出部を生じるアンカープライマーを用いて、遺伝子断片のPCR増幅を行い、その後これをアニーリングおよび再増幅してキメラ遺伝子配列を作製することができる。さらに、既に融合部分(例えば、GSTポリペプチド)を既にコードする多くの発現ベクターが市販されている。グルコース輸送関連ポリペプチドをコードする核酸を、融合部分がポリペプチドとインフレームで連結されるように、そのような発現ベクターにクローニングすることができる。
ポリペプチドのシグナル配列を用いて、関心対象の分泌タンパク質または他のタンパク質の分泌および単離を容易にすることができる。シグナル配列は典型的に、1つまたは複数の切断事象における分泌過程において成熟タンパク質から一般的に切断される疎水性アミノ酸のコアによって特徴づけられる。そのようなシグナルペプチドは、成熟タンパク質が分泌経路を通過する際にそのタンパク質からのシグナル配列の切断を可能にするプロセシング部位を含む。したがって、シグナル配列を有する記載のポリペプチド、ならびにシグナル配列自体およびシグナル配列の非存在下におけるポリペプチド(すなわち、切断産物)が本明細書において提供される。1つの態様においては、シグナル配列をコードする核酸配列を、発現ベクターにおいて、通常は分泌されないかまたはさもなくば単離が困難であるタンパク質などの関心対象のタンパク質に機能的に連結することができる。シグナル配列は、発現ベクターを形質転換する真核生物宿主からなどのタンパク質の分泌を指向し、シグナル配列はその後または同時に切断される。タンパク質は次いで、当技術分野において公知の方法により、細胞外培地から容易に精製され得る。または、シグナル配列は、GSTドメインのような精製を容易にする配列を用いて、関心対象のタンパク質に連結することができる。
グルコース輸送関連ポリペプチドの変種もまた提供する。そのような変種は、アゴニスト(模倣体)としてまたはアンタゴニストとして機能することができる変化したアミノ酸配列を有する。変種は、例えば不連続の点突然変異または切断などの突然変異誘発によって作製され得る。アゴニストは、天然型タンパク質の生物活性と実質的に同等であるかまたはその一部の活性を保持することができる。タンパク質のアンタゴニストは、例えば、関心対象のタンパク質を含む細胞シグナル伝達カスケードの下流または上流メンバーに競合的に結合することにより、天然型タンパク質の活性の1つまたは複数を阻害することができる。このように、限定された機能の変種で処置することにより、特定の生物学的効果を誘発することができる。天然型タンパク質の生物活性の一部を有する変種で対象を処置すると、天然型タンパク質で処置した場合と比較して、対象における副作用が少なくなり得る。
抗体
単離されたグルコース輸送関連ポリペプチドまたはその断片を免疫原として用いて、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の調製に関する標準的技法により抗体を作製することができる。全長ポリペプチドもしくはタンパク質を用いることができ、または抗原性ペプチド断片を免疫原として用いることもできる。タンパク質の抗原性ペプチドは、例えば表1または表2に列挙されたポリペプチドなど、グルコース輸送関連ポリペプチドのアミノ酸配列の少なくとも8個(例えば、10、15、20、または30個)のアミノ酸残基を含み、ペプチドに対して産生された抗体がタンパク質と特異的免疫複合体を形成するように、タンパク質のエピトープを含む。
単離されたグルコース輸送関連ポリペプチドまたはその断片を免疫原として用いて、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の調製に関する標準的技法により抗体を作製することができる。全長ポリペプチドもしくはタンパク質を用いることができ、または抗原性ペプチド断片を免疫原として用いることもできる。タンパク質の抗原性ペプチドは、例えば表1または表2に列挙されたポリペプチドなど、グルコース輸送関連ポリペプチドのアミノ酸配列の少なくとも8個(例えば、10、15、20、または30個)のアミノ酸残基を含み、ペプチドに対して産生された抗体がタンパク質と特異的免疫複合体を形成するように、タンパク質のエピトープを含む。
典型的には免疫原を用いて、適切な対象(例えば、ウサギ、ヤギ、マウス、または他の哺乳動物)を免疫化することにより抗体を調製する。適切な免疫原調製物は、例えば、組換えにより発現されたまたは化学合成されたポリペプチドを含み得る。調製物は、フロイントの完全もしくは不完全アジュバントなどのアジュバント、または同様の免疫刺激剤をさらに含み得る。
ポリクローナル抗体は、適切な対象を免疫原としてのグルコース輸送関連ポリペプチドで免疫化することにより、上記のように調製することができる。免疫化された対象における抗体力価は、固定化ポリペプチドを使用する酵素結合免疫吸着測定法(ELISA法)などの標準的な技法により、経時的にモニターすることができる。必要に応じて、哺乳動物から(例えば、血液から)抗体分子を単離し、プロテインAクロマトグラフィーなどの周知の技法によりさらに精製して、IgG画分を得ることができる。免疫化後の適切な時点で、例えば特異的抗体力価が最も高い時点で、抗体産生細胞を対象から得て、これを用いてKohler and Milstein, Nature 256:495-497, 1975により最初に記載されたハイブリドーマ技法、ヒトB細胞ハイブリドーマ技法(Kozbor et al., Immunol. Today 4: 72, 1983)、EBV-ハイブリドーマ技法(Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96, 1985)、またはトリオーマ技法などの標準的な技法によりモノクローナル抗体を調製することができる。ハイブリドーマを作製する技術は周知である(一般的には、Current Protocols in Immunology, 1994, Coligan et al. (eds.) John Wiley & Sons, Inc., New York, NYを参照されたい)。モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞は、例えば標準的なELISAアッセイ法を使用して、関心対象のポリペプチドと結合する抗体に関してハイブリドーマ培養上清をスクリーニングすることにより検出される。
モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを調製する別の方法として、組換えコンビナトリアル免疫グロブリンライブラリー(例えば、抗体ファージディスプレイライブラリー)を関心対象のポリペプチドでスクリーニングすることにより、ポリペプチドに対するモノクローナル抗体を同定および単離することができる。ファージディスプレイライブラリーを作製しスクリーニングするためのキットは、市販されている(例えば、Pharmacia組換えファージ抗体システム(Recombinant Phage Antibody System)、カタログ番号27-9400-01;およびStratagene SurfZAP(商標) ファージディスプレイキット(Phage Display Kit)、カタログ番号240612)。さらに、抗体ディスプレイライブラリーの作製およびスクリーニングにおける使用に特に適した方法および試薬の例は、例えば、米国特許第5,223,409号;WO 92/18619;WO91/17271;WO 92/20791;WO 92/15679;WO 93/01288;WO 92/01047;WO 92/09690;WO 90/02809;Fuchs et al., Bio/Technology 9:1370-1372, 1991;Hay et al., Hum. Antibod. Hybridomas 3:81-85, 1992;Huse et al., Science 246:1275-1281, 1989;Griffiths et al., EMBO J. 12:725-734, 1993に見出すことができる。
さらに、標準的な組換えDNA技法を用いて作製することのできる、ヒトおよび非ヒト部分を含むキメラおよびヒト化モノクローナル抗体などの組換え抗体も、本明細書において提供する。このようなキメラおよびヒト化モノクローナル抗体は、当技術分野で公知の組換えDNA技法により、例えば、WO 87/02671;欧州特許出願第184,187号;欧州特許出願第171,496号;欧州特許出願第173,494号;WO 86/01533;米国特許第4,816,567号;欧州特許出願第125,023号;Better et al., Science, 240:1041-1043, 1988;Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:3439-3443, 1987;Liu et al., J. Immunol., 139:3521-3526, 1987;Sun et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:214-218, 1987;Nishimura et al., Canc. Res., 47:999-1005, 1987;Wood et al., Nature, 314:446-449, 1985;およびShaw et al., J. Natl. Cancer Inst., 80:1553-1559, 1988);Morrison, Science, 229:1202-1207, 1985;Oi et al., Bio/Techniques, 4:214, 1986;米国特許第5,225,539号;Jones et al., Nature, 321:552-525, 1986;Verhoeyan et al., Science, 239:1534, 1988;およびBeidler et al., J. Immunol., 141:4053-4060, 1988に記載されている方法を用いて作製することができる。。
完全なヒト抗体が、ヒト患者の治療的処置にとって特に望ましい。そのような抗体は、内因性免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子を発現し得ないが、ヒト重鎖および軽鎖遺伝子を発現することができるトランスジェニックマウスを用いて作製することができる。トランスジェニックマウスを、選択した抗原、例えばポリペプチドの全体または一部で通常の様式により免疫化する。抗原に対するモノクローナル抗体は、従来のハイブリドーマ技術を用いて得ることができる。トランスジェニックマウスが所有するヒト免疫グロブリン導入遺伝子は、B細胞分化の過程で再編成し、次いでクラススイッチおよび体細胞変異を起こす。したがって、このような技法を用いて、治療上有用なIgG、IgA、およびIgE抗体を作製することが可能である。ヒト抗体を作製するための本技術の総説に関しては、Lonberg and Huszar (Int. Rev. Immunol., 13:65-93, 1995)を参照されたい。ヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体を作製するための本技術、ならびにそのような抗体を作製するための手順の詳細な考察に関しては、例えば、米国特許第5,625,126号;米国特許第5,633,425号;米国特許第5,569,825号;米国特許第5,661,016号;および米国特許第5,545,806号を参照されたい。さらに、Abgenix, Inc.(カリフォルニア州、フリーモント)などの企業が、上記と類似の技術を用いて、選択された抗原に対するヒト抗体の提供を請け負い得る。
選択されたエピトープを認識する完全なヒト抗体は、「誘導選択」("guided selection")と称される技法を用いて作製することができる。このアプローチでは、選択された非ヒトモノクローナル抗体、例えばマウス抗体を用いて、同じエピトープを認識する完全なヒト抗体の選択を誘導する。(Jespers et al., Biotechnology, 12:899-903, 1994)。
グルコース輸送関連ポリペプチドに対する抗体(例えば、モノクローナル抗体)を用いて、アフィニティークロマトグラフィーまたは免疫沈降法などの標準的技法によりポリペプチドを単離することができる。さらに、そのような抗体を用いて、ポリペプチドの発現の存在量およびパターンを評価するために、(例えば、細胞溶解物または細胞上清中で)タンパク質を検出することができる。抗体を診断において使用して、臨床試験法の一部として組織中のタンパク質レベルをモニターすること、例えば所与の治療計画の有効性を決定することもできる。検出は、抗体を検出可能な物質と結合させることにより容易になり得る。検出可能な物質の例には、様々な酵素、補欠分子団、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、および放射性物質が含まれる。適切な酵素の例には、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが含まれ;適切な補欠分子団複合体の例には、ストレプトアビジン/ビオチンおよびアビジン/ビオチンが含まれ;適切な蛍光物質の例には、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシル、またはフィコエリトリンが含まれ;発光物質の例にはルミノールが含まれ;生物発光物質の例には、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンが含まれ、ならびに適切な放射性物質の例には、125I、131I、35S、または3Hが含まれる。
治療方法および薬学的組成物
グルコース代謝に関連した障害を治療する方法を本明細書において提供する。「治療」は、障害、障害の症状、または障害の素因を治療する、緩和する、軽減する、改変する、緩解させる、和らげる、改善する、またはそれらに影響を及ぼす方法を含む。本方法は、インビボでまたは培養下の細胞において、例えばインビトロもしくはエクスビボで使用することができる。インビボにおける態様では、本方法は対象、例えばヒトまたは動物において実施され、薬剤が細胞におけるポリペプチドの発現または活性を調節するのに有効な条件下で薬剤を対象に投与する段階を含む。
グルコース代謝に関連した障害を治療する方法を本明細書において提供する。「治療」は、障害、障害の症状、または障害の素因を治療する、緩和する、軽減する、改変する、緩解させる、和らげる、改善する、またはそれらに影響を及ぼす方法を含む。本方法は、インビボでまたは培養下の細胞において、例えばインビトロもしくはエクスビボで使用することができる。インビボにおける態様では、本方法は対象、例えばヒトまたは動物において実施され、薬剤が細胞におけるポリペプチドの発現または活性を調節するのに有効な条件下で薬剤を対象に投与する段階を含む。
インビトロでグルコース輸送関連ポリペプチドの発現または活性を調節する薬剤は、動物モデルにおいてインビボでさらに試験する。例えば、グルコース輸送関連ポリペプチドの調節因子であると同定された被験化合物は、肥満または糖尿病の動物モデル(例えばII型糖尿病、例えばJackson Laboratoriesから入手されるob/obマウス(株名:B6.V-Lepob/J)、db/dbマウス;例えば、Sima AAF, Shafrir E. Animal Models in Diabetes: A Primer. Taylor and Francis, Publ Amsterdam, Netherlands, 2000を参照されたい)などの動物で試験する。被験薬剤の投与後の様々な時点において、グルコース輸送関連ポリペプチドの発現もしくは活性のレベル、またはグルコース、耐糖性、および血漿インスリンのレベルをモニターして、被験化合物が対照と比較してグルコース代謝に有益な効果を有するどうか、すなわち被験化合物が高血糖または血漿インスリンレベルの減少をもたらすかどうかを決定する。
細胞培養アッセイおよび動物試験から得られたデータは、ヒトに使用するために所与の薬剤の適切な投与量を製剤化する際に用いることができる。薬剤の治療有効量は、客観的徴候(例えば、血糖値)の改善により明らかになろうと、疾患の自覚症状の改善により明らかになろうと、所望の病態の1つもしくは複数の症状の進行を遅らせるか、またはその症状を改善する量である。特定の要因が、対象を有効に治療するために必要な投与量およびタイミングに影響し得る(例えば、疾患または障害の重症度、以前の治療、対象の全般的健康および/または年齢、ならびに存在する他の疾患)。
グルコース輸送関連ポリペプチドの発現または活性の調節に有用な組成物(公知であろうと、本明細書に記載のスクリーニングアッセイによって同定されたのであろうと)は、薬学的組成物に組み入れ、グルコース代謝に関連した(例えば、I型糖尿病、II型糖尿病、または肥満などの、グルコース代謝の脱制御に関連した)障害もしくは状態を有するか、またはそのような障害もしくは状態を発症するリスクがある対象に投与することができる。このような組成物は、グルコース輸送関連ポリペプチドの発現または活性を調節する1つまたは複数の薬剤、および薬学的に許容される担体(例えば、実質的に非毒性である溶媒、分散媒、コーティング、緩衝液、吸収遅延剤など)を含む。補足的な活性化合物を組成物に組み入れることも可能である。
薬学的組成物は、経口であろうと非経口(例えば、静脈内、皮内、皮下、経粘膜(例えば、吸入用に経鼻スプレーが製剤化される)、または経皮的(例えば、糖技術分野で一般的に知られている局所軟膏(ointment)、軟膏(salve)、ゲル、パッチ、またはクリーム))であろうと、その目的とする投与経路に適合するように製剤化する。組成物は、滅菌希釈剤(例えば、蒸留水または生理食塩水)、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の合成溶媒;ベンジルアルコールもしくはメチルパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどの抗菌剤または抗真菌剤;アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤;エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤;酢酸、クエン酸、またはリン酸などの緩衝剤;および糖(例えば、デキストロース)、多価アルコール(例えば、マンニトールまたはソルビトール)、または塩(例えば、塩化ナトリウム)などの等張剤を含み得る。リポソーム懸濁液(神経抗原に特異的なモノクローナル抗体により罹患細胞を標的とするリポソームを含む)もまた、薬学的に許容される担体として使用することができる(例えば、米国特許第4,522,811号を参照されたい)。組成物の調製物を製剤化し、アンプル、使い捨てシリンジ、または複数用量バイアル中に封入することができる。必要な場合には(例えば、注射製剤などの場合)、例えばレシチンなどのコーティングまたは界面活性剤を用いることにより、適切な流動性を維持することができる。有効成分の吸収は、吸収を遅延させる薬剤を含めることにより延長することができる(例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン)。または、生分解性の生体適合性ポリマー(例えば、エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸;Alza Corporation and Nova Pharmaceutical, Inc.)を含み得る植込錠およびマイクロカプセル化送達系により、制御放出が達成され得る。
経口投与を意図する場合、薬剤は丸剤、カプセル剤、トローチ剤などに含めることができ、以下の成分のいずれかまたは同様の性質の化合物を含み得る:微結晶セルロース、トラガカントゴム、もしくはゼラチンなどの結合剤;デンプンもしくはラクトースなどの賦形剤、アルギン酸、プリモゲル(Primogel)、もしくはコーンスターチなどの崩壊剤;ステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤;コロイド状二酸化ケイ素などの流動促進剤;スクロースもしくはサッカリンなどの甘味剤;またはペパーミント、サリチル酸メチル、もしくはオレンジフレーバーなどの香料添加剤。
グルコース輸送関連ポリペプチドを調節する薬剤を含む組成物は、投与単位形態(dosage unit form)(すなわち、投与の容易さおよび投与量の均一性のために、所定量の活性化合物を含む物理的に別個の単位)で経口投与または非経口投与用に製剤化することができる。化合物の毒性および治療有効性は、細胞培養または実験動物において標準的な薬学的手順により決定することができる。例えば、LD50(集団の50%に対して致死的である用量)およびED50(集団の50%において治療上有効な用量)、LD50:ED50比である治療指数を決定することができる。高い治療指数を示す化合物が好ましい。薬剤が望ましくない副作用を示す場合には、薬剤が罹患組織部位を標的とするよう注意すべきである(非罹患細胞に対して生じ得る損傷を最小限に抑えて、それにより副作用を軽減するためである)。毒性および治療有効性は、他の標準的な薬学的手順によって決定することもできる。
上記のように、本明細書に記載の方法に従って同定および投与される薬剤は、小分子(例えば、ペプチド、ペプチド模倣体(例えば、ペプトイド)、アミノ酸残基(またはその類似体)、ポリヌクレオチド(またはその類似体)、ヌクレオチド(またはその類似体)、または有機もしくは無機化合物(例えば、ヘテロ有機化合物または有機金属化合物))であってよい。典型的にそのような分子は、約10,000グラム/モル未満(例えば、約7,500、5,000、2,500、1,000、または500グラム/モル未満)の分子量を有する。これらの化合物のいずれかの塩、エステル、および他の薬学的に許容される形態をアッセイし、所望の活性が検出された場合に、本明細書に記載の治療法に従って投与することができる。例示的な用量には、対象または試料の重量1キログラム当たりミリグラム量またはマイクログラム量の小分子(例えば、約1μg〜500 mg/kg;約100μg〜500 mg/kg;約100μg〜50 mg/kg;10μg〜5 mg/kg;10μg〜0.5 mg/kg;または1μg〜50μg/kg)が含まれる。これらの用量は広範囲をカバーしているが、当業者は、小分子を含む治療剤は効力が異なり、有効量は当技術分野で公知の方法により決定され得ることを理解すると考えられる。典型的には、最初に比較的低用量を投与し、その後、主治医もしくは獣医(治療用途の場合)または研究者(まだ臨床開発段階で研究している場合)が、適切な応答が得られるまで用量を徐々に増加させ得る。さらに、特定の対象に対する明確な用量レベルは、使用する特定の化合物の活性、対象の年齢、体重、全般的健康、性別、および食事、投与時間、投与経路、排出速度、任意の薬物の組み合わせ、ならびに調節しようとする発現または活性の程度を含む様々な要因に依存することが理解される。
薬学的組成物は、投与のための説明書と共に、容器、パック、またはディスペンサー中に含めることができる。
本発明を以下の実施例においてさらに説明するが、この実施例は特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定するものではない。
実施例
実施例1. RNAiスクリーニングを使用した、グルコース輸送に対するインスリン作用を増強または阻害するポリペプチドの同定
3T3-L1脂肪細胞の細胞培養およびsiRNAオリゴヌクレオチドによるエレクトロポレーション
3T3-L1線維芽細胞を、10% FBS、50μg/mlストレプトマイシン、および50単位/mlペニシリンを添加したDMEMで培養し、記載される通りに脂肪細胞に分化させた(Jiang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100:7569-7574, 2003;Guilherme et al., J. Biol. Chem., 279:10593-10605, 2004)。エレクトロポレーションにより、3T3-L1脂肪細胞にsiRNA二重鎖をトランスフェクションした。簡潔に説明すると、分化を開始させてから4日または5日後に、脂肪細胞をPBS中の0.25%トリプシンおよび0.5 mgコラゲナーゼ/mlを用いて培養皿から剥がし、PBSで2回洗浄した。細胞を洗浄し、計数し、9 x 106細胞/mlの密度でPBSに再懸濁した。典型的には、1枚の150 mmディッシュを6種の異なるsiRNA二重鎖でトランスフェクションした。再懸濁した細胞(0.15 ml)を0.2 cmギャップキュベット(Bio-Rad(登録商標))に入れ、Dharmaconから購入した4ナノモルの各SMARTpool(登録商標) siRNA二重鎖と混合した。siRNAオリゴヌクレオチドは、0.09 kVおよび950μF容量に設定したBio-Rad(登録商標) ジーンパルサーIIシステムにより、エレクトロポレーションのパルスによって細胞に送達した。エレクトロポレーション後、細胞を直ちに新鮮な完全DMEM培地1 mlと混合した。次いで、細胞をキュベットから15 ml Falcon(商標)チューブ中のDMEM培地3 mlに移し、混合した。この細胞懸濁液の一定分量(125μl)を、96ウェルプレートのウェルに播種した。各エレクトロポレーションによる細胞を12個のそのようなウェルに拡大して、インキュベーター中に置き、72時間後に2-デオキシグルコースの取り込みを測定した。それぞれの2-デオキシグルコースアッセイについて、細胞にはまた、対照としてのscrambled(6ナノモル)、Akt1およびAkt2(4および6ナノモル)、ならびにPTEN(6ナノモル)のsiRNAをエレクトロポレーションした。各96ウェルプレートは、これら3つの対照のそれぞれを12ウェル分含んだ。
実施例1. RNAiスクリーニングを使用した、グルコース輸送に対するインスリン作用を増強または阻害するポリペプチドの同定
3T3-L1脂肪細胞の細胞培養およびsiRNAオリゴヌクレオチドによるエレクトロポレーション
3T3-L1線維芽細胞を、10% FBS、50μg/mlストレプトマイシン、および50単位/mlペニシリンを添加したDMEMで培養し、記載される通りに脂肪細胞に分化させた(Jiang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100:7569-7574, 2003;Guilherme et al., J. Biol. Chem., 279:10593-10605, 2004)。エレクトロポレーションにより、3T3-L1脂肪細胞にsiRNA二重鎖をトランスフェクションした。簡潔に説明すると、分化を開始させてから4日または5日後に、脂肪細胞をPBS中の0.25%トリプシンおよび0.5 mgコラゲナーゼ/mlを用いて培養皿から剥がし、PBSで2回洗浄した。細胞を洗浄し、計数し、9 x 106細胞/mlの密度でPBSに再懸濁した。典型的には、1枚の150 mmディッシュを6種の異なるsiRNA二重鎖でトランスフェクションした。再懸濁した細胞(0.15 ml)を0.2 cmギャップキュベット(Bio-Rad(登録商標))に入れ、Dharmaconから購入した4ナノモルの各SMARTpool(登録商標) siRNA二重鎖と混合した。siRNAオリゴヌクレオチドは、0.09 kVおよび950μF容量に設定したBio-Rad(登録商標) ジーンパルサーIIシステムにより、エレクトロポレーションのパルスによって細胞に送達した。エレクトロポレーション後、細胞を直ちに新鮮な完全DMEM培地1 mlと混合した。次いで、細胞をキュベットから15 ml Falcon(商標)チューブ中のDMEM培地3 mlに移し、混合した。この細胞懸濁液の一定分量(125μl)を、96ウェルプレートのウェルに播種した。各エレクトロポレーションによる細胞を12個のそのようなウェルに拡大して、インキュベーター中に置き、72時間後に2-デオキシグルコースの取り込みを測定した。それぞれの2-デオキシグルコースアッセイについて、細胞にはまた、対照としてのscrambled(6ナノモル)、Akt1およびAkt2(4および6ナノモル)、ならびにPTEN(6ナノモル)のsiRNAをエレクトロポレーションした。各96ウェルプレートは、これら3つの対照のそれぞれを12ウェル分含んだ。
2-デオキシグルコース取り込みアッセイ
3T3-L1脂肪細胞におけるインスリン刺激性グルコース輸送を、記載されている通りに2-デオキシグルコースの取り込みを測定することによって評価した(Guilherme et al., J Biol Chem, 279:10593-10605, 2004)。簡潔に説明すると、siRNAをトランスフェクションした細胞を96ウェルプレートに再播種して72時間培養し、2回洗浄して、0.5% BSAおよび2 mmピルビン酸ナトリウムを添加したクレブス・リンゲルHepes緩衝液(130 mM NaCl、5 mM KCl、1.3 mM CaCl2、1.3 mM MgSO4、25 mM Hepes、pH 7.4)で血清を2時間欠乏させた。次いで、細胞をインスリンで37℃で30分間刺激した。グルコースの取り込みは、[1,2-3H]2-デオキシ-D-グルコースを最終アッセイ濃度500μMになるように添加することによって開始させた。細胞を37℃で5分間インキュベートした。アッセイは、氷冷クレブス・リンゲルHepes緩衝液で3回洗浄することにより停止した。簡潔に説明すると、プレートを、氷冷クレブス・リンゲルHepes緩衝液600 mlを含む容器中に浸漬した。各浸漬後に、束にしたペーパータオル上でプレートを軽くたたくことにより、ウェル中の液体を除去した。次いで、ウェル当たり0.05 mlの1% SDSを添加することにより、細胞を可溶化した。[3H]の取り込みを、マイクロプレートシンチレーションカウント装置を用いて定量した。20μMサイトカラシンBの存在下でインキュベートした試料中の非特異的デオキシグルコース取り込みを決定し、この対照から得られた値を各実験測定値から減算することにより、特異的取り込みを測定した。
3T3-L1脂肪細胞におけるインスリン刺激性グルコース輸送を、記載されている通りに2-デオキシグルコースの取り込みを測定することによって評価した(Guilherme et al., J Biol Chem, 279:10593-10605, 2004)。簡潔に説明すると、siRNAをトランスフェクションした細胞を96ウェルプレートに再播種して72時間培養し、2回洗浄して、0.5% BSAおよび2 mmピルビン酸ナトリウムを添加したクレブス・リンゲルHepes緩衝液(130 mM NaCl、5 mM KCl、1.3 mM CaCl2、1.3 mM MgSO4、25 mM Hepes、pH 7.4)で血清を2時間欠乏させた。次いで、細胞をインスリンで37℃で30分間刺激した。グルコースの取り込みは、[1,2-3H]2-デオキシ-D-グルコースを最終アッセイ濃度500μMになるように添加することによって開始させた。細胞を37℃で5分間インキュベートした。アッセイは、氷冷クレブス・リンゲルHepes緩衝液で3回洗浄することにより停止した。簡潔に説明すると、プレートを、氷冷クレブス・リンゲルHepes緩衝液600 mlを含む容器中に浸漬した。各浸漬後に、束にしたペーパータオル上でプレートを軽くたたくことにより、ウェル中の液体を除去した。次いで、ウェル当たり0.05 mlの1% SDSを添加することにより、細胞を可溶化した。[3H]の取り込みを、マイクロプレートシンチレーションカウント装置を用いて定量した。20μMサイトカラシンBの存在下でインキュベートした試料中の非特異的デオキシグルコース取り込みを決定し、この対照から得られた値を各実験測定値から減算することにより、特異的取り込みを測定した。
約500種の異なる遺伝子に対する阻害的低分子RNAを取得し、脂肪細胞にトランスフェクションし、上記のデオキシグルコースの取り込みアッセイ法で試験した。siRNAのトランスフェクションによりノックダウンした場合、多くの遺伝子は、対照と比較してグルコースの取り込みの増加または減少をもたらした。上記表1に列挙した遺伝子を標的とするRNAは、グルコース取り込みを強く増加させた。表2に列挙した遺伝子を標的とするRNAは、グルコース取り込みを強く減少させた。
実施例2. グルコース輸送に対するインスリン作用を増強または阻害するポリペプチドの検証
siRNAに基づく遺伝子サイレンシングが脂肪細胞においてインスリン刺激性2-デオキシグルコース取り込みを増強したことを確認するため、さらなる実験を行い、インスリン誘導性Aktリン酸化に対する各siRNAの効果を判定するウェスタンブロットアッセイにおいて、スクリーニングによって同定された標的を独立して再試験する。Aktは、インスリンシグナル伝達を媒介することが示されている(Jiang et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 100:7569-7574, 2003;およびそこに引用されている参考文献を参照されたい)。セリン473におけるAktのリン酸化は、活性化の指標となる。
siRNAに基づく遺伝子サイレンシングが脂肪細胞においてインスリン刺激性2-デオキシグルコース取り込みを増強したことを確認するため、さらなる実験を行い、インスリン誘導性Aktリン酸化に対する各siRNAの効果を判定するウェスタンブロットアッセイにおいて、スクリーニングによって同定された標的を独立して再試験する。Aktは、インスリンシグナル伝達を媒介することが示されている(Jiang et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 100:7569-7574, 2003;およびそこに引用されている参考文献を参照されたい)。セリン473におけるAktのリン酸化は、活性化の指標となる。
siRNAをエレクトロポレーションした3T3-L1脂肪細胞を、無血清DMEM培地中で一晩枯渇させる。次いで、インスリンなしでまたは様々な濃度(1、10、100 nM)のインスリンと共に細胞を30分間インキュベートし、1%SDSを含む溶解緩衝液で回収する。タンパク質濃度を定量し、各溶解液試料からの同等量のタンパク質をSDS-PAGEにより分離し、ニトロセルロース膜に転写する。膜を抗体と共に4℃で一晩インキュベートし、次いで西洋ワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体と共に室温で45分間インキュベートする。次いで、高感度化学発光キットでタンパク質を検出する。
Aktのセリン473のリン酸化に対する(スクランブルされたsiRNAと比較した)各siRNAの効果を、ウェスタンブロットによって解析する。各siRNAの存在下でのGLUT4発現の調節もまた検討する。Aktリン酸化および/またはGLUT4発現の増加を引き起こすsiRNAは、siRNAが標的とする遺伝子がグルコース輸送の負の制御因子をコードすることを示す。グルコース輸送の負の制御因子の阻害は、例えばII型糖尿病などインスリンシグナル伝達が制御できない障害の治療において有益であり得る。Aktリン酸化および/またはGLUT4発現に対する効果の欠如は、特定のsiRNAが標的とする遺伝子がグルコース輸送を制御しないことを必ずしも示すものではない。グルコース輸送の制御因子はまた、GLUT4触媒活性、原形質膜へのGLUT4の移行に影響を及ぼす可能性もあり、またはGLUTlおよびGLUT3など他のグルコース輸送体に影響を及ぼす可能性もある。例えば脂肪細胞または筋肉細胞の細胞表面のグルコース輸送体タンパク質の量を測定するアッセイ法を実施することによって、これらの効果を判定することができる。
実施例3. 動物モデルにおける薬剤の評価
グルコース輸送関連ポリペプチドもしくはそのポリペプチドをコードする核酸の発現または活性をインビトロで調節する薬剤は、動物モデルにおいてインビボでさらに試験する。例えば、scrambled siRNAまたは表1に列挙される1つもしくは複数の遺伝子を標的とするsiRNAを、以前に記載されている通りにハイドロダイナミック注射によりob/obマウスに投与する(McCaffrey, Nature, 418:38-39, 2002;米国特許出願公開第20030153519号も参照されたい)。ob/obマウスは、Jackson Laboratoriesから入手することができる(株名:B6.V-Lepob/J)。siRNAの投与後の様々な時点で、表1の標的のmRNAレベルを測定する。さらに、siRNAを標識して、当技術分野で公知の方法により追跡することもできる。また、グルコース、耐糖性、および血漿インスリンのレベルをモニターして、siRNAが対照と比較してグルコース代謝に有益な効果を有するどうか、すなわちsiRNAが高血糖または血漿インスリンレベルの減少をもたらすかどうかを決定することができる。
グルコース輸送関連ポリペプチドもしくはそのポリペプチドをコードする核酸の発現または活性をインビトロで調節する薬剤は、動物モデルにおいてインビボでさらに試験する。例えば、scrambled siRNAまたは表1に列挙される1つもしくは複数の遺伝子を標的とするsiRNAを、以前に記載されている通りにハイドロダイナミック注射によりob/obマウスに投与する(McCaffrey, Nature, 418:38-39, 2002;米国特許出願公開第20030153519号も参照されたい)。ob/obマウスは、Jackson Laboratoriesから入手することができる(株名:B6.V-Lepob/J)。siRNAの投与後の様々な時点で、表1の標的のmRNAレベルを測定する。さらに、siRNAを標識して、当技術分野で公知の方法により追跡することもできる。また、グルコース、耐糖性、および血漿インスリンのレベルをモニターして、siRNAが対照と比較してグルコース代謝に有益な効果を有するどうか、すなわちsiRNAが高血糖または血漿インスリンレベルの減少をもたらすかどうかを決定することができる。
1つの態様においては、cdk7を標的とするsiRNAを設計し、作製する。簡潔に説明すると、例えば米国特許出願公開第20040198682号に記載されているように、cdk7遺伝子配列内の特定の長さ(例えば、23ヌクレオチド)の断片を同定する。40〜60%のGC含量およびより弱い内部折り畳み構造(コンピュータ解析によって決定される)を含む断片を含む断片が好ましい。強力なヘアピンおよび3つもしくはそれ以上のCまたはGの連続を含む断片は回避する。4つまたは5つの標的断片を選択し、siRNA二重鎖として合成し、インビトロでスクリーニングして最も活性の高いsiRNAを同定する。
次に、選択されたcdk7 siRNAをob/obマウスにおいてインビボで試験する。ハイドロダイナミック注射を行うため、各ob/obマウスに、PBS 1.8 mL中の選択されたcdk7 siRNA 40マイクログラムを投与する。siRNA/PBS溶液は、尾静脈から4〜5秒間かけて注射する。注射の24時間、48時間、72時間、または4日後に、組織におけるcdk7 RNAおよび/またはタンパク質レベルを調べることにより、cdk7の発現レベルを決定する。各動物における処置後1〜3日目の血漿グルコースレベルも測定し、対照と比較する(例えば、siRNA処置前のグルコースレベル、ならびにPBSおよびscrambled siRNAで処置した動物におけるグルコースレベル)。高血糖を減少させるcdk7 siRNAは、糖尿病および肥満などのグルコース輸送関連障害の治療において有用であり得る。
他の態様
本発明の多くの態様を説明してきた。しかしながら、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、様々な変更がなされ得ることが理解されよう。したがって、他の態様も特許請求の範囲の範囲内である。
本発明の多くの態様を説明してきた。しかしながら、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、様々な変更がなされ得ることが理解されよう。したがって、他の態様も特許請求の範囲の範囲内である。
Claims (34)
- 以下の段階を含む、グルコース輸送関連ポリペプチドの発現または活性を調節する候補薬剤を同定する方法:
(a) 表1もしくは表2記載の遺伝子の遺伝子産物であるグルコース輸送関連ポリペプチド、またはそのポリペプチドをコードする核酸を含む試料を提供する段階;
(b) 試料を被験化合物と接触させる段階;
(c) 試料中のグルコース輸送関連ポリペプチドの発現または活性を評価する段階;および
(d) (c)のグルコース輸送関連ポリペプチドの発現または活性を、被験化合物を欠く対照試料中のグルコース輸送関連ポリペプチドの発現または活性と比較する段階であって、グルコース輸送関連ポリペプチドの発現または活性の変化により、被験化合物がグルコース輸送関連ポリペプチドの発現または活性を調節することができる候補薬剤であることが示される、段階。 - グルコース輸送関連ポリペプチドが表1記載の遺伝子の遺伝子産物である、請求項1記載の方法。
- グルコース輸送関連ポリペプチドが表2記載の遺伝子の遺伝子産物である、請求項1記載の方法。
- 試料が細胞である、請求項1記載の方法。
- 細胞が脂肪細胞である、請求項4記載の方法。
- 試料が無細胞試料である、請求項1記載の方法。
- 評価する段階が、無細胞アッセイを実施する段階を含む、請求項1記載の方法。
- 評価する段階が、グルコース輸送が被験化合物の存在下で調節されるかどうかを判定する段階を含む、請求項1記載の方法。
- グルコース輸送関連ポリペプチドが、ヒトグルコース輸送関連ポリペプチドである、請求項1記載の方法。
- 評価する段階が、グルコース取り込みを測定する段階を含む、請求項1記載の方法。
- 被験化合物が、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、非核酸有機小分子、無機小分子、および抗体からなる群より選択される、請求項1記載の方法。
- 被験化合物が、アンチセンスオリゴヌクレオチド、低分子干渉RNA(siRNA)、siRNAをコードするDNA、およびリボザイムからなる群より選択される、請求項1記載の方法。
- グルコース輸送の調節が抗体を用いて評価される、請求項8記載の方法。
- グルコース輸送が被験化合物の存在下で増加する、請求項8記載の方法。
- グルコース輸送が被験化合物の存在下で減少する、請求項8記載の方法。
- グルコース輸送関連ポリペプチドがキナーゼである、請求項1記載の方法。
- 評価する段階が、キナーゼによる基質のリン酸化を測定する段階を含む、請求項16記載の方法。
- 以下の段階を含む、細胞におけるグルコース輸送を調節する方法:
細胞を提供する段階;
表1もしくは表2の遺伝子産物の発現または活性を調節する薬剤と細胞を接触させ、それにより細胞におけるグルコース輸送を調節する段階。 - 薬剤が、表1記載の遺伝子の遺伝子産物の発現または活性を減少させる、請求項18記載の方法。
- 薬剤が、表2記載の遺伝子の遺伝子産物の発現または活性を増加させる、請求項18記載の方法。
- 薬剤が、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、非核酸有機小分子、無機小分子、および抗体からなる群より選択される、請求項18記載の方法。
- 薬剤が阻害的低分子RNA(small inhibitory RNA)である、請求項21記載の方法。
- 薬剤が、アンチセンスオリゴヌクレオチド、siRNA、siRNAをコードするDNA、およびリボザイムからなる群より選択される、請求項21記載の方法。
- グルコース輸送関連ポリペプチドの発現または活性を調節する第二の薬剤と細胞を接触させる段階をさらに含む、請求項18記載の方法。
- 細胞をインビトロで接触させる、請求項18記載の方法。
- 細胞をインビボで接触させる、請求項18記載の方法。
- 以下の段階を含む、対象においてインスリン刺激によるグルコース取り込みを増加させる方法:
表1記載の遺伝子の遺伝子産物の発現または活性を減少させる薬剤を、対象の細胞におけるグルコース代謝を調節するのに十分な量で対象に投与し、それによって対象におけるインスリン刺激によるグルコース取り込みを増加させる段階。 - 対象がグルコース代謝に関連した障害もしくは状態のリスクを有するか、またはグルコース代謝に関連した障害もしくは状態を患っている、請求項27記載の方法。
- 障害または状態が、I型糖尿病、II型糖尿病、または肥満である、請求項28記載の方法。
- 以下の段階を含む、対象におけるグルコース代謝を調節する方法:
表2記載の遺伝子の遺伝子産物の発現または活性を増加させる薬剤を、対象の細胞におけるグルコース代謝を調節するのに十分な量で対象に投与し、それによって対象におけるグルコース代謝を調節する段階。 - 対象がグルコース代謝に関連した障害もしくは状態のリスクを有するか、またはグルコース代謝に関連した障害もしくは状態を患っている、請求項30記載の方法。
- 障害または状態が、I型糖尿病、II型糖尿病、または肥満である、請求項31記載の方法。
- siRNAまたは表1記載の遺伝子によってコードされるRNAを標的とするsiRNAをコードする核酸を含む組成物。
- 表1記載の遺伝子の遺伝子産物の機能を阻害するアンチセンス核酸を含む組成物。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US70328005P | 2005-07-28 | 2005-07-28 | |
PCT/US2006/029090 WO2007016189A2 (en) | 2005-07-28 | 2006-07-26 | Glucose transport-related genes, polypeptides, and methods of use thereof |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2009502172A true JP2009502172A (ja) | 2009-01-29 |
JP2009502172A5 JP2009502172A5 (ja) | 2009-09-10 |
Family
ID=37709148
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2008524123A Pending JP2009502172A (ja) | 2005-07-28 | 2006-07-26 | グルコース輸送関連遺伝子、ポリペプチド、およびそれらの使用方法 |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20070026436A1 (ja) |
EP (1) | EP1913153A4 (ja) |
JP (1) | JP2009502172A (ja) |
AU (1) | AU2006275810A1 (ja) |
CA (1) | CA2616353A1 (ja) |
WO (1) | WO2007016189A2 (ja) |
Family Cites Families (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR100711817B1 (ko) * | 1999-12-17 | 2007-05-02 | 노바티스 백신즈 앤드 다이아그노스틱스 인코포레이티드 | 글리코겐 신타아제 키나제 3의 2고리 저해제 |
US6323029B1 (en) * | 2000-01-19 | 2001-11-27 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Antisense modulation of glycogen synthase kinase 3 beta expression |
WO2002030410A2 (en) * | 2000-10-10 | 2002-04-18 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Suppression of cyclin kinase activity for prevention and treatment of infections |
AU2002229113A8 (en) * | 2000-10-20 | 2009-03-26 | Univ Massachusetts | Glucose transport-related genes and uses thereof |
AU2003249284A1 (en) * | 2002-07-12 | 2004-02-02 | Rigel Pharmaceuticals, Inc. | Modulators of cellular proliferation |
PT2284266E (pt) * | 2002-11-14 | 2013-12-17 | Thermo Fisher Scient Biosciences Inc | Siarn contra tp53 |
CA2509494A1 (en) * | 2002-12-11 | 2004-06-24 | University Of Massachusetts | Method of introducing sirna into adipocytes |
WO2004070062A2 (en) * | 2003-02-04 | 2004-08-19 | Wyeth | Compositions and methods for diagnosing and treating cancers |
WO2005051308A2 (en) * | 2003-11-19 | 2005-06-09 | Signal Pharmaceuticals, Llc | Methods of treating diseases and disorders by targeting multiple kinases |
-
2006
- 2006-07-26 US US11/460,102 patent/US20070026436A1/en not_active Abandoned
- 2006-07-26 AU AU2006275810A patent/AU2006275810A1/en not_active Abandoned
- 2006-07-26 EP EP06788597A patent/EP1913153A4/en not_active Withdrawn
- 2006-07-26 JP JP2008524123A patent/JP2009502172A/ja active Pending
- 2006-07-26 CA CA002616353A patent/CA2616353A1/en not_active Abandoned
- 2006-07-26 WO PCT/US2006/029090 patent/WO2007016189A2/en active Application Filing
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CA2616353A1 (en) | 2007-02-08 |
EP1913153A2 (en) | 2008-04-23 |
EP1913153A4 (en) | 2008-10-15 |
WO2007016189A2 (en) | 2007-02-08 |
US20070026436A1 (en) | 2007-02-01 |
WO2007016189A3 (en) | 2008-01-10 |
AU2006275810A1 (en) | 2007-02-08 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Gaidarov et al. | Embelin and its derivatives unravel the signaling, proinflammatory and antiatherogenic properties of GPR84 receptor | |
Geng et al. | Cloning and characterization of the human soluble adenylyl cyclase | |
AU2008209713B2 (en) | Modulators of sclerostin binding partners for treating bone-related disorders | |
US7790693B2 (en) | Glucose-transport related genes, polypeptides, and methods of use thereof | |
Alabed et al. | Identification of CRMP4 as a convergent regulator of axon outgrowth inhibition | |
Zhou et al. | GDF6-CD99 signaling regulates src and ewing sarcoma growth | |
Hwangpo et al. | G Protein-regulated inducer of neurite outgrowth (GRIN) modulates Sprouty protein repression of mitogen-activated protein kinase (MAPK) activation by growth factor stimulation | |
US20100003256A1 (en) | Use of TGF-Beta Antagonists in Treatment of Parathyroid-Related Disorders | |
DK2982982T3 (en) | Method of screening compounds using membrane STIM1 | |
US20050059007A1 (en) | Glucose transport-related genes and uses thereof | |
JP2008521436A (ja) | 細胞シグナル伝達経路に基づいた分析、試薬およびキット | |
WO2005121356A1 (ja) | 新規スクリーニング方法 | |
US20070026436A1 (en) | Glucose transport-related genes, polypeptides, and methods of use thereof | |
EP1294872B1 (en) | Human trp-like calcium channel protein-2 (tlcc-2) | |
EP1788390B1 (en) | Screening method | |
Flores | Implications of Transforming Growth Factor Beta Activating Kinase I (TAK1) Induced Phosphorylation on Organelle Remodeling in Human Pathologies | |
Loftus et al. | Research Article A Novel Interaction between Pyk2 and MAP4K4 Is Integrated with Glioma Cell Migration | |
Franco et al. | α 1D calcium channel expressed in atrium | |
WO2005001060A2 (en) | Novel calcium channel | |
JP2010059078A (ja) | 神経伝達及び/又はシナプス形成関連物質の転写調節用組成物 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20090727 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20090727 |
|
A072 | Dismissal of procedure [no reply to invitation to correct request for examination] |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A073 Effective date: 20101129 |