CN112656806B - 多配体蛋白聚糖4的siRNA序列在抑制犬瘟热病毒复制中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了多配体蛋白聚糖4的siRNA序列在抑制犬瘟热病毒复制中的应用。所述的多配体蛋白聚糖4的siRNA序列通过降低多配体蛋白聚糖4的表达水平进而达到抑制犬瘟热病毒复制的作用。实验证明，SDC4 siRNA转染对细胞毒性低，不会影响细胞正常存活与增殖，并且能够明显抑制SDC4的表达水平，病毒复制水平也明显下降。因此，本发明的提出为犬瘟热的防控提供了一种新的、有效的技术手段。

Description

多配体蛋白聚糖4的siRNA序列在抑制犬瘟热病毒复制中的 应用
技术领域
本发明涉及一种siRNA序列在抑制病毒复制中的应用，特别涉及多配体蛋白聚糖4siRNA序列在抑制犬瘟热病毒复制中的应用。本发明属于生物技术领域。
背景技术
犬瘟热(Canine distemper,CD)是由犬瘟热病毒(Canine distemper virus,CDV)感染犬所引起的急性、高度接触性传染病。自1809年首次报道以来,该病已呈世界性分布，给养犬业、毛皮动物养殖业和野生动物保护业造成巨大危害。CDV属于副粘病毒科(Paramyxoviridae)麻疹病毒属(Morbillivirus)。尽管CDV依据H 基因氨基酸序列相似度小于95％区分为亚洲1-4型(Asia-1-4)，美洲1-5型 (America-1-5)，南美1-3型(SouthAmerica-1-3),非洲1-2型(Africa-1-2)，欧洲野生动物型(European Wildlife)，北极型(Arctic-like)及岩石型(Rockborn-like) 17个不同基因亚型，但公认只有一个血清型。
CDV感染造成犬临床表现为高热、腹泻、免疫抑制及脑炎等症状，与麻疹病毒相似，可引起高致死率，CDV感染脑部形成亚急性硬化性泛脑炎(SSPE)，多灶性脱髓鞘病变等，犬星形胶质细胞是犬瘟热病毒感染中枢神经系统的靶细胞，但其具体机制不清楚。多配体蛋白聚糖4(syndecan-4，SDC4)是一种跨膜(I 型)硫酸乙酰肝素蛋白聚糖，是调节一系列信号转导的各种细胞因子和趋化因子的受体(Kaneider等，2005)。本发明发明人在前期对CDV感染星形胶质细胞转录组信息分析基础上，发现在感染细胞中SDC4表达升高，因此，本研究以SDC4 为研究对象，观察RNA干扰(RNA interfering，RNAi)抑制SDC4表达对CDV 感染星形胶质细胞的影响，并进一步研究其作用机制，以期为CDV的防控提供理论依据。
发明内容
本发明的目的在于提供一种犬瘟热病毒的抑制剂。
为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：
本发明发明人在前期对犬瘟热病毒(Canine distemper virus,CDV)感染星形胶质细胞转录组信息分析基础上，发现在CDV感染细胞中SDC4表达升高，因此，本发明以SDC4为研究对象，观察RNA干扰(RNA interfering，RNAi)抑制 SDC4表达对CDV感染星形胶质细胞的影响，通过Western Blot和qRT-PCR方法检测，结果显示，与对照组相比，si-SDC4组SDC4表达受到抑制，病毒复制水平也明显下降。
在上述研究的基础上，本发明提出了多配体蛋白聚糖4(syndecan-4，SDC4) 的siRNA序列在制备抑制犬瘟热病毒(Canine distemper virus,CDV)复制药物中的应用。
其中，优选的，所述的多配体蛋白聚糖4(syndecan-4，SDC4)的siRNA序列如下所示：
5’GCAACAUCUUUGAGAGGACTT3’；
5’GUCCUCUCAAAGAUGUUGCTT3’。
其中，优选的，所述的多配体蛋白聚糖4的siRNA序列能够抑制犬瘟热病毒在星形胶质细胞中的复制。
其中，优选的，所述的多配体蛋白聚糖4的siRNA序列通过降低多配体蛋白聚糖4的表达水平进而达到抑制犬瘟热病毒复制的作用。
相较于现有技术，本发明的有益效果是：
本发明提出了一种新的可用于抑制犬瘟热病毒(Canine distemper virus,CDV)复制的靶点——多配体蛋白聚糖4(syndecan-4，SDC4)，并针对该靶点设计了 siRNA序列，实验证明，SDC4 siRNA转染对细胞毒性低，不会影响细胞正常存活与增殖，并且能够明显抑制SDC4的表达水平，病毒复制水平也明显下降。因此，本发明的提出为犬瘟热的防控提供了一种新的、有效的技术手段。
附图说明
图1为星形胶质细胞转染后细胞活力检测；
图2为CDV感染星形胶质细胞si-SDC4抑制结果；
si-SDC4：1-60小时CDV感染SDC4抑制星形胶质细胞检测结果；si-NC： 1-60小时CDV感染对照星形胶质细胞检测结果；
图3为星形胶质细胞SDC4分子抑制后降低CDV复制水平；
图4A为RNAi抑制24h后，qRT-PCR检测SDC4/GAPDH结果；
图4B为干扰60h后qRT-PCR检测CDV结果(与阴性siRNA相比下降3.97 倍，*，p<0.05)。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随具体实施例的描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1
1材料和方法
1.1病毒、细胞及主要试剂和仪器
病毒Snyder Hill(ATCC：VR-1587TM)，星形胶质细胞为本发明人所在实验室制备。DMEM培养基和LipofectamineTM 2000均购自Invitrogen；CCK-8细胞活力检测试剂盒购自美伦生物公司；阴性对照NC、SDC4 siRNA购自吉玛基因公司。
1.2方法
1.2.1细胞培养及转染
星形胶质细胞常规使用含10％v/vFBS的DMEM培养液，在5％CO2、37℃培养箱培养。转染前1d，胰酶消化对数生长期的细胞，接种细胞于含10％FBS的 DMEM培养基的24孔板，每孔0.5mL(约7×104细胞)，使细胞在转染日约为 70％融合度。参照LipofectamineTM2000制备Lipo 2000-siRNA复合物，将复合物加入24孔板，轻柔来回摇晃培养板使之混匀，培养箱内常规孵育4-5h，更换为完全培养基培养，继续培养24h，进行转染后的其他检测步骤。实验分为阴性对照组(negative control(NC)，转染阴性对照siRNA，即si-NC)和si-SDC4组(转染SDC4的特异性siRNA，即si-SDC4)。si-SDC4序列(5’-3’)为： GCAACAUCUUUGAGAGGACTT；GUCCUCUCAAAGAUGUUGCTT。si-NC序列(5’-3’)为：GCGACGAUCUGCCUAAGAU；AUCUUAGGCAGAUCGUCGC。
1.2.2siRNA干扰SDC4表达效率的检测
采用Westernblot法检测转染si-SDC4后的星形胶质细胞的SDC4蛋白表达，简要步骤如下:适量RIPA(PMSF)裂解液提取细胞总蛋白，BCA法测定蛋白含量，蛋白样品加上样缓冲液，100℃煮沸变性10min，按照每孔50μg上样，经 10％SDS-PAGE，电泳后电转移蛋白至PVDF膜，室温条件将膜用5％脱脂奶粉封闭1h，洗膜3次，每次5min。将SDC4(1∶500，CellSignaling)和内参GAPDH(1∶ 2000，中杉金桥)，抗体孵育液加入至孵育盒，4℃孵育过夜，洗膜，IRDye 800CW 羊抗兔/鼠荧光二抗(1:8000，LI-COR)室温孵育1h，洗膜3次，每次5min。Image-ProPlus6.0软件进行灰度值扫描分析，实验重复3次。
1.2.3CCK-8法检测各组细胞活力
将转染siRNA后的星形胶质细胞以每孔1.75×104接种于96孔板，每组6 个复孔，于5％体积分数CO2、37℃培养箱培养0h、24h、48h、72h和96h，每孔中加入CCK-8试剂10μL，培养箱内孵育3h，酶标仪测定450nm波长处的吸光度(A)值。实验重复3次。
1.2.4siRNA干扰下调SDC4C表达对CDV复制的检测
使用反转录试剂盒，对样品提取总RNA进行反转录，反转录合成cDNA，针对CDV-N和SDC4进行qRT-PCR(荧光定量PCR引物由吉林省库美生物科技公司合成)。CDV-N引物序列(5’-3’)：上游引物CAACGGCCCTAAATTAACTG；下游引物：CCTCTACTAACTTGATGCTT。SDC4引物序列(5’-3’)：上游引物 ATCCATTATGGTGACCACTAGC；下游引物：TCCATCTGTGTGTTCCGTATAG
1.2.5统计学方法
所有实验数据采用SPSS 21.0软件进行分析，计量资料用均数±标准差 (mean±SD)表示，多组差异比较采用单因素方差分析，两两比较采SNK-q检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1CCK-8法检测各组细胞活力
对96孔板中的星形胶质细胞分别转染SDC4 siRNA和NC siRNA，转染后 24h，再以5MOI(病毒在Vero细胞上复制测定结果)的CDV感染，在感染后 1hpi-60hpi使用CCK-8试剂检测转染后细胞存活情况。如图1所示，转染后细胞存活率无明显降低，说明SDC4 siRNA和NC siRNA转染对细胞毒性低，不会影响细胞正常存活与增殖。
2.2干扰下调SDC4表达抑制CDV在星形胶质细胞中的复制
为了检测下调SDC4分子对CDV复制的影响，将SDC4 siRNA和NC siRNA 分别转染犬星形胶质细胞，转染后24h，再以5MOI的CDV感染，在感染后 1hpi-60hpi收取细胞RNA和细胞蛋白，进行Western Blot和qRT-PCR方法检测。 WesternBlot结果显示，与对照组相比，si-SDC4组SDC4表达受到抑制，病毒复制水平也明显下降，见图2。qRT-PCR检测结果显示，与对照组相比，在mRNA 水平检测结果也显示，si-SDC4组SDC4分子受到抑制，病毒复制水平也明显降低见图3。进一步检测发现，在60hpi时，与对照组相比，si-SDC4组CDV拷贝数下降高达3.97倍(见图4A、B)。

Claims (2)

1.多配体蛋白聚糖4的siRNA序列在制备抑制犬瘟热病毒复制药物中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的多配体蛋白聚糖4的siRNA序列如下所示：
5’GCAACAUCUUUGAGAGGACTT 3’；
5’GUCCUCUCAAAGAUGUUGCTT 3’。
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