CN110093347B - 抑制小鼠NPFFR2基因表达的shRNA - Google Patents

抑制小鼠NPFFR2基因表达的shRNA Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种抑制小鼠NPFFR2基因表达的shRNA。技术方案是抑制小鼠NPFFR2基因表达的shRNA序列为：8810:5’‑GGTGGGAAATACTGTCGTTTG‑3’8811:5’‑GCTATTTGCCACCATCTATCT‑3’8812:5’‑GCAGTGTCAACCCTATTATTT‑3’8813:5’‑GGAATCCTTGATAGAGGAAAT‑3’将抑制小鼠NPFFR2基因表达的shRNA序列克隆至LV3(H1/GFP&Puro)慢病毒载体，获得含有上述shRNA序列的重组慢病毒质粒；将得到的重组慢病毒质粒转染小鼠细胞，实现抑制小鼠中NPFFR2基因表达的目的。

Description

抑制小鼠NPFFR2基因表达的shRNA
技术领域
本发明涉及一种shRNA序列，特别涉及一种抑制小鼠NPFFR2基因表达的shRNA。
背景技术
神经肽FF2受体(neuropeptide FF receptor 2，NPFFR2)，是一种属于G蛋白偶联受体家族的膜蛋白，定位于5-5E1，由417个氨基酸组成，具有多种生物学功能，包括参与痛觉传导、血压、摄食、内分泌、体温等。由于NPFFR2广泛分布于体内以及广泛参与体内多种生物学过程，因此，NPFFR2的研究具有重要意义。
RNA干扰(RNA interference,RNAi)发生于大多数真核细胞中，是基因转录后水平调节表达的一种方式，作用机制是双链RNA(double strands RNA,dsRNA)介导同源mRNA特异性降解并最终引起目的基因表达沉默。目前，该技术已广泛应用于特定基因表达的沉默，在基因表达调控研究及特定基因相关疾病的防治方面具有重要作用。短发夹RNA(shorthairpin RNA，shRNA)是一段具有紧密发夹环的RNA序列。利用基因工程方法将shRNA克隆至各类病毒载体中，并转染入宿主细胞后转录出shRNA，进而沉默特定基因。尽管目前发展出可部分拮抗NPFFR2功能的药理学拮抗剂(Proc Natl Acad Sci U S A.2006,103(2):466-471)，但是缺乏有效的遗传学手段沉默NPFFR2，目前尚未见到使用shRNA方法沉默小鼠NPFFR2基因的报道。
发明内容
本发明提供一种抑制小鼠NPFFR2基因表达的shRNA。抑制小鼠NPFFR2基因表达的shRNA序列为：
8810:5’-GGTGGGAAATACTGTCGTTTG-3’
8811:5’-GCTATTTGCCACCATCTATCT-3’
8812:5’-GCAGTGTCAACCCTATTATTT-3’
8813:5’-GGAATCCTTGATAGAGGAAAT-3’
将抑制小鼠NPFFR2基因表达的shRNA序列克隆至LV3(H1/GFP&Puro)慢病毒载体，获得含有上述shRNA序列的重组慢病毒质粒；将得到的重组慢病毒质粒转染小鼠细胞，实现抑制小鼠中NPFFR2基因表达的目的。以上所述shRNA序列可显著抑制小鼠巨噬细胞中NPFFR2基因在mRNA和蛋白水平的表达。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案：一种抑制小鼠NPFFR2基因表达的shRNA，其序列结构是：
8810:5’-GGTGGGAAATACTGTCGTTTG-3’
8811:5’-GCTATTTGCCACCATCTATCT-3’
8812:5’-GCAGTGTCAACCCTATTATTT-3’
8813:5’-GGAATCCTTGATAGAGGAAAT-3’。
一种上述抑制小鼠NPFFR2基因表达的shRNA序列的应用，其特点是：
步骤一、将抑制小鼠NPFFR2基因表达的shRNA序列克隆至LV3(H1/GFP&Puro)慢病毒载体，获得重组慢病毒质粒LV3(H1/GFP&Puro)-NPFFR2-shRNA：
合成相应的反义链及正义链序列，
NPFFR2-shRNA-8810正义链：
5’-GGTGGGAAATACTGTCGTTTG-3’
NPFFR2-shRNA-8810反义链：
5’-CAAACGACAGTATTTCCCACC-3’
NPFFR2-shRNA-8811正义链：
5’-GCTATTTGCCACCATCTATCT-3’
NPFFR2-shRNA-8811反义链：
5’-AGATAGATGGTGGCAAATAGC-3’
NPFFR2-shRNA-8812正义链：
5’-GCAGTGTCAACCCTATTATTT-3’
NPFFR2-shRNA-8812反义链：
5’-AAATAATAGGGTTGACACTGC-3’
NPFFR2-shRNA-8813正义链：
5’-GGAATCCTTGATAGAGGAAAT-3’
NPFFR2-shRNA-8813反义链：
5’-ATTTCCTCTATCAAGGATTCC-3’
上述正义链模板的N端添加了AATTC，与EcoR I内切酶后形成的粘性末端互补；反义链的C端添加了GATCC，与BamH I内切酶后形成的粘性末端互补；
将等量的反义链和正义链DNA混合，退火后获得shRNA；
将LV3(H1/GFP&Puro)慢病毒载体进行EcoR I和BamH I双酶切，获得线性化的LV3(H1/GFP&Puro)慢病毒载体；
将shRNA和线性化的LV3(H1/GFP&Puro)慢病毒载体进行连接，得到重组慢病毒质粒LV3(H1/GFP&Puro)-NPFFR2-shRNA。
步骤二、将获得的重组慢病毒质粒LV3(H1/GFP&Puro)-NPFFR2-shRNA作用于小鼠巨噬细胞或个体，达到抑制小鼠NPFFR2基因表达的目的。
本发明的有益效果是：本发明抑制小鼠NPFFR2基因表达的shRNA序列为：
8810:5’-GGTGGGAAATACTGTCGTTTG-3’
8811:5’-GCTATTTGCCACCATCTATCT-3’
8812:5’-GCAGTGTCAACCCTATTATTT-3’
8813:5’-GGAATCCTTGATAGAGGAAAT-3’
将抑制小鼠NPFFR2基因表达的shRNA序列克隆至LV3(H1/GFP&Puro)慢病毒载体，获得含有上述shRNA序列的重组慢病毒质粒；将获得的重组慢病毒质粒转染小鼠细胞，达到抑制细胞中NPFFR2基因表达的目的。以上shRNA序列可显著抑制小鼠巨噬细胞中NPFFR2基因在mRNA和蛋白水平的表达。本发明针对小鼠NPFFR2基因的shRNA序列能有效抑制小鼠巨噬细胞中NPFFR2基因的表达，其中在NPFFR2基因mRNA水平上的抑制率达到99％，在蛋白质水平上的抑制率达到82％。
下面结合附图和具体实施方式对本发明作详细说明。
附图说明
图1是本发明重组慢病毒质粒对小鼠巨噬细胞RAW264.7中NPFFR2基因表达的抑制效果图。V.S.Control,*P<0.05,**P<0.01,***p<0.001。
图2是本发明抑制小鼠NPFFR2基因表达的shRNA序列重组慢病毒质粒侵染小鼠巨噬细胞的侵染效率照片。Bar:100μm。
图3是本发明LV3(H1/GFP&Puro)-NPFFR2-shRNA对小鼠巨噬细胞中NPFFR2蛋白表达的抑制效果图。A：Western blot检测NPFFR2蛋白表达条带；B：NPFFR2蛋白表达的相对表达量分析。
图4是shRNA的靶向NPFFR2基因的靶序列位点图。
具体实施方式
以下实施例参照图1-4。
实施例1。shRNA序列的设计与合成。
1)通过GeneBank数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)获得小鼠NPFFR2基因的mRNA序列，根据shRNA设计原则，设计4条针对小鼠NPFFR2基因的NPFFR2-shRNA和1条对照shRNA序列(Negative control，NC)(参见图4)。上述shRNA序列由上海吉玛制药技术有限公司合成。4条shRNA分别靶向小鼠NPFFR2基因(NM_133192.3)的295位点、781位点、1089位点、以及1318位点，长为21碱基。
其中，本实施例所涉及的NPFFR2-shRNA-8810作用序列为：
5’-GGTGGGAAATACTGTCGTTTG-3’
NPFFR2-shRNA-8811作用序列为：
5’-GCTATTTGCCACCATCTATCT-3’
NPFFR2-shRNA-8812作用序列为：
5’-GCAGTGTCAACCCTATTATTT-3’
NPFFR2-shRNA-8813作用序列为：
5’-GGAATCCTTGATAGAGGAAAT-3’
对照shRNA序列(shRNA-NC)为：
5’-GTTCTCCGAACGTGTCACGT-3’
针对上述4种shRNA及shRNA-NC的作用位点设计合成对应的shRNA反义链与正义链序列：
NPFFR2-shRNA-8810正义链：
5’-GGTGGGAAATACTGTCGTTTG-3’
NPFFR2-shRNA-8810反义链：
5’-CAAACGACAGTATTTCCCACC-3’
NPFFR2-shRNA-8811正义链：
5’-GCTATTTGCCACCATCTATCT-3’
NPFFR2-shRNA-8811反义链：
5’-AGATAGATGGTGGCAAATAGC-3’
NPFFR2-shRNA-8812正义链：
5’-GCAGTGTCAACCCTATTATTT-3’
NPFFR2-shRNA-8812反义链：
5’-AAATAATAGGGTTGACACTGC-3’
NPFFR2-shRNA-8813正义链：
5’-GGAATCCTTGATAGAGGAAAT-3’
NPFFR2-shRNA-8813反义链：
5’-ATTTCCTCTATCAAGGATTCC-3’
上述正义链模板的N端(5’端)添加了AATTC，与EcoR I内切酶后形成的粘性末端互补；反义链的C端(3’端)添加了GATCC，与BamH I内切酶后形成的粘性末端互补；
2)制作shRNA模板。将反义链(50μM,5μL)和正义链(50μM,5μL)DNA混合，依次加入shRNA退火缓冲液双蒸水(35μL)，加至总反应体系50μL。PCR仪进行退火反应：95℃5min、85℃5min、75℃5min、70℃5min；结束后保存于4℃。获得shRNA(10μM,50μL)，将其稀释50倍至终浓度200nM。
3)制作双酶切后的线性化载体。将LV3(H1/GFP&Puro)慢病毒载体(上海吉玛制药技术有限公司)进行EcoR I和BamH I双酶切以进行线性化，双酶切条件：EcoR I(5μL)、BamHI(5μL)、LV3(H1/GFP&Puro)慢病毒载体(10μg)、酶切缓冲液(2×，10μL)，加水至100μL，混匀，酶切2小时(37℃)。将酶切产物进行琼脂糖核酸电泳，利用Agarose Gel DNAPurification Kit回收线性慢病毒载体片段。
4)连接并构建慢病毒重组质粒LV3(H1/GFP&Puro)-NPFFR2-shRNA。将shRNA模板(100nM,1μL)、线性化的慢病毒载体(50ng/μL,1μL)、T4DNA连接酶(5U/μL,1μL)、连接缓冲液(10×，2μL)，双蒸水(15μL)混匀，共计20μL，4℃连接16小时，获得连接产物。将连接产物(10μL)转化至大肠杆菌感受态(DH5α)，将感受态细胞均与涂于LB平板(Ampicillin,50μg/mL)，至于37℃培养箱16小时，从平板上挑斑(6个/板)，置于液体LB(Ampicillin,50μg/mL)中37℃震荡16小时。碱裂解提取质粒后，EcoR I和BamH I双酶切鉴定后送测序，鉴定无误后确定为阳性质粒LV3(H1/GFP&Puro)-NPFFR2-shRNA。无内毒素质粒大提质粒，置于-80℃保存。
5)包装慢病毒。将重组慢病毒质粒LV3(H1/GFP&Puro)-NPFFR2-shRNA、LV3(H1/GFP&Puro)-NC-shRNA分别与辅助质粒pGag/Pol、pRev、pVSV-G(上海吉玛制药技术有限公司)混合制备成DNA-Lipofectamine 2000混合物，将该复合物依次递加入293T细胞，轻轻混匀，置于5％CO2、37℃、饱和湿度细胞孵箱中培养6小时。更换新鲜的DMEM培液(含10％胎牛血清，10mL)，置于5％CO2、37℃、饱和湿度细胞孵箱中培养72小时，收集上清并浓缩，获得含有目的shRNA的成熟慢病毒颗粒。
实施例2。重组慢病毒感染小鼠巨噬细胞的效率。
将LV3(H1/GFP&Puro)-NC-shRNA和4种LV3(H1/GFP&Puro)-NPFFR2-shRNA的慢病毒质粒转染小鼠巨噬细胞RAW264.7，使用荧光显微镜检测不同shRNA的转染效率。
1)实验分组：实验分为空白对照组(Control-Blank)、阴性对照组(Control-NC)、NPFFR2-shRNA-8810转染组、NPFFR2-shRNA-8811转染组、NPFFR2-shRNA-8812转染组、NPFFR2-shRNA-8813转染组，共6组。各组细胞数量及培养条件一致。
2)细胞转染实验方法：将处于对数生长期的小鼠巨噬细胞RAW264.7接种于96孔板(1×106/孔)，混匀后于37℃5％CO2培养24小时。取慢病毒原液(10μL)，用DMEM培养基(含10％FBS)稀释5倍，并加入凝聚胺(Polybrene)至终浓度为5μg/mL。吸弃6孔板中培液，替换为慢病毒液(1mL/孔)，培养24小时。用新鲜的培液替换慢病毒液(2mL/孔)，在细胞孵箱中继续培养72小时。
3)采用荧光显微镜明场观察并记录细胞形态，荧光通道观察并拍照。参见图2，各组慢病毒转染效率均达90％以上，含有上述shRNA的慢病毒可高效率转染小鼠巨噬细胞。
实施例3。重组慢病毒对小鼠巨噬细胞中NPFFR2基因表达的抑制作用。
采用实时荧光PCR方法检测上述4种shRNA对小鼠巨噬细胞中NPFFR2基因表达的抑制作用。
1)实验分组：实验分为空白对照组(Control-Blank)、阴性对照组(Control-NC)、NPFFR2-shRNA-8810转染组、NPFFR2-shRNA-8811转染组、NPFFR2-shRNA-8812转染组、NPFFR2-shRNA-8813转染组，共6组。各组细胞数量及培养条件一致。
2)RNA提取：Trizol法裂解细胞，并提取细胞总RNA，将其中mRNA逆转录为cDNA，逆转录条件：42℃30min，85℃10min。取cDNA为模板，以ACTB为内参，Real-time PCR检测NPFFR2的基因表达。引物序列为：
NPFFR2 Forward primers:5’-CTGTCTCCTAACAAACTGCGTAT-3’
NPFFR2 Reverse primers:5’-ATCTTGGAAACCATTGCGA-3’
ACTB Forward primers:5’-AAGATCAAGATCATTGCTCCTCC-3’
ACTB Reverse primers:5’-GACTCATCGTACTCCTGCTTGC-3’
Real-time PCR反应条件：98℃15s,95℃,1min；55℃,40秒,30循环。参见图1，4种shRNA均可显著抑制小鼠巨噬细胞中NPFFR2基因表达。
实施例4。重组慢病毒对小鼠巨噬细胞中NPFFR2蛋白表达的抑制作用。
利用重组慢病毒转染细胞72小时后，采用细胞裂解法裂解细胞后，提取蛋白质。BCA(bicinchonininc acid)法测定蛋白浓度；每组取15μL蛋白样品(20μg/泳道)，加入15μL的电泳缓冲液(2×SDS-PAGE loading buffer)，100℃,5min，12000g离心10min，取上清，以6％SDS-PAGE进行蛋白电泳；电泳结束后，将蛋白转膜至PVDF膜，脱脂奶粉封闭2小时(5％)；TBST洗膜(10min×3次)，分别加入NPFFR2一抗、GAPDH一抗，4℃孵育过夜；TBST洗膜(10min×3次)；加入二抗，室温孵育2小时；TBS洗膜(15min×3次)；SuperSignalChemiluminescent Substrates进行化学发光检测，经X光片曝光、显影、定影后，采集图像并分析。
参见图3，重组慢病毒LV3(H1/GFP&Puro)-NPFFR2-shRNA对小鼠巨噬细胞中NPFFR2的蛋白表达具有显著抑制水平，说明本实施例所述shRNA有效抑制NPFFR2的蛋白水平的表达。
实施例5。注射液的制备。
配方：LV3(H1/GFP&Puro)-NPFFR2-shRNA(纯度大于99％) 1.32mg
Figure BDA0001893280720000071
工艺：按制备注射剂的常规工艺操作，共制成2ml的注射剂1000支，每支含LV3(H1/GFP&Puro)-NPFFR2-shRNA 1.32mg。
用法用量：一日1次，每次1支。
SEQUENCE LISTING
<110> 西北工业大学
<120> 抑制小鼠NPFFR2基因表达的shRNA
<130> 说明书，权利要求书
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列的描述: 人工合成的序列
<221> misc_feature
<223> 人工序列
<400> 1
GGTGGGAAATACTGTCGTTTG 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列的描述: 人工合成的序列
<221> misc_feature
<223> 人工序列
<400> 1
CAAACGACAGTATTTCCCACC 21
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列的描述: 人工合成的引物序列
<221> misc_feature
<223> 人工序列
<400> 2
GCTATTTGCCACCATCTATCT 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列的描述: 人工合成的引物序列
<221> misc_feature
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AGATAGATGGTGGCAAATAGC 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列的描述: 人工合成的引物序列
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GCAGTGTCAACCCTATTATTT 21
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<212> DNA
<213> 人工序列的描述: 人工合成的引物序列
<221> misc_feature
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AAATAATAGGGTTGACACTGC 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列的描述: 人工合成的引物序列
<221> misc_feature
<223> 人工序列
<400> 2
GGAATCCTTGATAGAGGAAAT 21
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列的描述: 人工合成的引物序列
<221> misc_feature
<223> 人工序列
<400> 2
ATTTCCTCTATCAAGGATTCC 21
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<212> DNA
<213> 人工序列的描述: 人工合成的引物序列
<221> misc_feature
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<400> 2
GTTCTCCGAACGTGTCACGT 20
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<212> DNA
<213> 人工序列的描述: 人工合成的引物序列
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<400> 2
CTGTCTCCTAACAAACTGCGTAT 23
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ATCTTGGAAACCATTGCGA 19
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<212> DNA
<213> 人工序列的描述: 人工合成的引物序列
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 2
AAGATCAAGATCATTGCTCCTCC 23
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列的描述: 人工合成的引物序列
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 2
GACTCATCGTACTCCTGCTTGC 22

Claims (1)

1.一种抑制小鼠NPFFR2基因表达的shRNA，其序列结构是：
8810: 5’-GGTGGGAAATACTGTCGTTTG-3’
8811: 5’-GCTATTTGCCACCATCTATCT-3’
8812: 5’-GCAGTGTCAACCCTATTATTT-3’
8813: 5’-GGAATCCTTGATAGAGGAAAT-3’。
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Title
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Chronic activation of NPFFR2 stimulates the stress-related depressive behaviors through HPA axis modulation;Ya-Tin Lin et al.;《Psychoneuroendocrinology》;20161231;第71卷;第78页第2.12节、第81页第3.5节、补充结果图S4A-S4B *
Mus musculus neuropeptide FF receptor 2 (Npffr2), mRNA, NM_133192.3;Lin YT, et al.;《GenBank》;20180915;第1-4页 *
靶向G蛋白偶联受体91的小发夹RNA慢病毒载体的构建及功能初步检测;李婷婷等;《眼科新进展》;20140831;第34卷(第8期);第705-709页 *

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