CN103869064A - 利用lrp4针对神经传递障碍疾病的诊断组合物 - Google Patents
利用lrp4针对神经传递障碍疾病的诊断组合物 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103869064A CN103869064A CN201410075263.9A CN201410075263A CN103869064A CN 103869064 A CN103869064 A CN 103869064A CN 201410075263 A CN201410075263 A CN 201410075263A CN 103869064 A CN103869064 A CN 103869064A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- lrp4
- antibody
- collectin
- myasthenia gravis
- serum
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/564—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for pre-existing immune complex or autoimmune disease, i.e. systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, rheumatoid factors or complement components C1-C9
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
- G01N33/6896—Neurological disorders, e.g. Alzheimer's disease
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/28—Neurological disorders
- G01N2800/2835—Movement disorders, e.g. Parkinson, Huntington, Tourette
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Neurology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Rehabilitation Therapy (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明属于生物技术领域,公开了利用LRP4针对神经传递障碍疾病的诊断组合物,包括人低密度脂蛋白受体相关蛋白4LRP4或LRP4模拟表位。本发明组合物能对神经传递障碍疾病进行诊断,具有良好的效果,市场前景广阔。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,涉及诊断组合物。
背景技术
神经传递障碍疾病重症肌无力是一种自身免疫疾病,将导致神经肌肉接头的功能紊乱。70%患有重症肌无力的病人都携带乙酰胆碱受体的自身抗体,另外10%病人携带MuSK的自身抗体。但是,20%的病人在血清中检测不到乙酰胆碱受体或MuSK的自身抗体。因此,需要一种针对神经肌肉相关的疾病如重症肌无力的诊断组合物。
发明内容
本发明提供了一种针对神经传递障碍疾病的诊断组合物。
具体技术方案:
利用LRP4针对神经传递障碍疾病的诊断组合物,包括人低密度脂蛋白受体相关蛋白4 LRP4或LRP4模拟表位。
为了达到更好的效果,所述的诊断组合物,还进一步包括聚集蛋白、聚集蛋白模拟表位、乙酰胆碱受体、乙酰胆碱受体模拟表位、肌肉特异性酪氨酸激酶的任一种或几种。
所述神经传递障碍疾病包括重症肌无力,肌肉萎缩症,或者先天性肌无力综合征(CMS)。
本发明还涉及利用LRP4针对神经传递障碍疾病的诊断试剂盒,前述诊断组合物。
为了更好的达到检测的效果,诊断组合物中LRP4或LRP4模拟表位上有可检测的标签。这样检测结果会更加直观,便于观察。
所述标签可以为125I。
所述的诊断试剂盒,还可以通过有色颗粒免疫测定法检测抗原-抗体复合物。同样具有直观的结果呈现效果。
本发明还一种检测LRP4抗体的方法,所述方法包括检测由前述的诊断组合物与样品接触后所形成的抗原-抗体复合物。
这种检测LRP4抗体的方法,选自:BIACORE分析、FACS、免疫荧光、免疫细胞化学、免疫印记、放射性免疫分析、ELISA、免疫沉淀反应、沉淀素反应、胶扩散沉淀反应。
本发明的有益效果是:提供了一种效果良好的利用LRP4针对神经传递障碍疾病的诊断组合物,填补了目前研究及市场的空缺,具有广阔的市场前景。
附图说明
图1:采用ELISA 方法检测针对LRP4的自身抗体。
图2:重症肌无力的病人血清中检测不到抗乙酰胆碱受体/MuSK的抗体,但是能检测到LRP4的自身抗体。
图3:免疫LRP4胞外端重组蛋白诱发小鼠产生LRP4自身抗体,并引起小鼠重症肌无力症状,肌电图动物电位不能持续维持。
图4:注射LRP4胞外端重组蛋白的小鼠神经肌肉接头形态出现异常,包括乙酰胆碱受体染色呈碎片,突触前运动神经元退化,突触小泡密度下降。
图5:注射LRP4胞外端重组蛋白的小鼠血清能够抑制MuSK蛋白的酪氨酸磷酸化,减少LRP4细胞表面定位以及聚集蛋白诱导的乙酰胆碱受体聚集,并部分激活补体反应。
图6: 注射抗LRP4兔免疫球蛋白IgG的小鼠具有重症肌无力症状。
图7:采用ELISA 方法检测针对聚集蛋白的自身抗体。
图8:聚集蛋白自身抗体阳性的重症肌无力病人血清能够识别外源表达的聚集蛋白。
图9:聚集蛋白自身抗体阳性的重症肌无力病人血清能够抑制聚集蛋白引起的乙酰胆碱受体在肌肉细胞中的聚集。
具体实施方式
实施例1 LRP4自身抗体存在于重症肌无力病人血液,能够诱发重症肌无力
自发性免疫疾病重症肌无力是一种常见的神经突触疾病,10万人中约有10-20个患病者。其中约有80%的病人其体内的抗体能够结合肌肉的乙酰胆碱受体,这些抗体使乙酰胆碱受体数目减少或是失去功能,从而导致神经肌肉传递中的肌无力。尽管大部分的重症肌无力都是由于自身抗体结合乙酰胆碱受体引发的,但是约有20%的病人体内检测不到乙酰胆碱受体的抗体。2001年,在乙酰胆碱受体抗体阴性的病人中,有约4-50%的病人可以检测出MuSK抗体。用MuSK胞外区免疫兔后可导致重症肌无力,乙酰胆碱受体的数目减少。尽管一系列的实验证明了乙酰胆碱受体和MuSK的抗体导致了重症肌无力,但是还有10%的病人血清中鉴定不到这些抗体。
本实例证明在乙酰胆碱受体以及MuSK抗体双阴性的病人中,约有9.2%的病人检测出LRP4的抗体。LRP4胞外区域的抗体能明显的抑制LRP4的功能,是乙酰胆碱受体以及MuSK抗体阴性的重症肌无力病人致病原因。本实例证明免疫LRP4胞外端重组蛋白的小鼠,能够检测到血清中产生LRP4自身抗体。小鼠诱发重症肌无力症状,包括体重减轻,爪握力下降,神经递质传递出现障碍,肌肉复合动作电位 (CMAP)不能持续。形态学上发现神经肌肉接头聚集的乙酰胆碱受体下降并出现碎片,不能完全和神经末端重合。将免疫有LRP4胞外端重组蛋白的重症肌无力兔子血清注射到小鼠上,也能引发重症肌无力,证明了LRP4自身抗体的致病性。因此,检测LRP4抗体是临床上检测和诊断重症肌无力的一种新方法,制备LRP4自身抗体引起的自身免疫病动物模型是作为探索治疗重症肌无力的新模型。
实验步骤:
实验材料:Taq DNA聚合酶、T4 DNA连接酶以及各种限制性内切酶购自Promega公司。各种辣根过氧化物酶链接的羊抗鼠和羊抗兔抗体与用于WB的ECL试剂购自Amersham公司。R-BTX购自Molecular Probes公司。寡聚核苷酸由Operon Biotechnologies公司合成。除非个别提到的特例,其他所有试剂都购自Sigma-Aldrich公司。
各种抗体购置于Sigma公司(Flag M2,F3165);Upstate Biotechnology(4G10,05-1050);Novus(β-actin,NB600-501)。各种兔抗MuSK抗体在之前文献中有描述(Luo et al., 2002, Neuron; 35:489-505)。鼠抗乙酰胆碱α亚基抗体为mAb35。
构建材料:构建Flag-ecto-LRP4-His时,在含有LRP4胞外结构域的pFlag-ecto-LRP4-CMV 载体中的SalI和EcoRV 酶切位点之间,通过PCR技术引入His肽段标签 (Wu et al., 2012, Neuron;Shen et al. 2013, J. Clin. Invest )。
细胞培养与转染:HEK293细胞系和小鼠C2C12肌肉细胞系的维持和转染在之前的文献中有描述(Zhang et al., 2007, J Neurosci; 27:3968-3973)。在一些实验中,肌管是由lipofectamine 2000 (Invitrogen, 11668-019)转染的。转染过程中,细胞培养在DNA、脂质体和无血清培养基的混合物中,持续8小时后,换为融合培养基。在混合物中DNA与脂质体的比例为1μg:2μl。在10厘米培养皿中培养的优化条件为1ml转染混合物,其中含有10μg DNA质粒。
重组蛋白的表达及其纯化:表达重组蛋白时,HEK293细胞由相应的质粒转染。转染24小时后,细胞培养基换为含有0.05%胎牛血清的DMEM培养基中。24小时后收集细胞培养基和细胞,利用Talon柱纯化LRP4胞外端重组蛋白,具体方法参见 (Shen et al. 2013, J. Clin. Invest; Zhang et al. 2011. JAMA Neuro)。
小鼠免疫实验:将100 ul 含有25ug的混有完全弗氏佐剂的LRP4抗原蛋白乳液注射到小鼠背部皮下,一个月后注射相同含量的的非完全弗氏佐剂/LRP4抗原蛋白乳液,两周后重复注射以提高抗体滴度。期间抽取小鼠血液用Elisa检测LRP4抗体是否阳性,具体方法参见(Shen et al. 2013, J Clin. Invest)。
酶联免疫吸附实验 (ELISA):具体方法参见文献(Shen et al. 2013, J Clin. Invest; Zhang et al. 2011. Arch Neuro)。纯化的Flag-LRP4过夜包被Maxi-Sorp Immunology Plates (Nunc),然后用含有1%BSA的PBS孵育以去除非特异结合。包被完毕的培养板中加入经LRP4免疫的小鼠血清以检测LRP4抗体,按照1:100稀释并重复三组。一抗采用辣根过氧化物酶连接的羊抗小鼠耳朵IgG检测,实验中的非特异性吸附被扣除。
免疫染色-小鼠膈肌经剥离后用4%的多聚甲醛固定1天以上,用0.1M Glycine处理1小时。1.0% Triton-x-100/PBS 穿孔过夜,加入含有1.0%胎牛血清,0.5% 羊血清的抗体封闭液2小时。 加入Neurofilament和synaptophysin抗体过夜。用1.0% Triton-x-100/PBS洗3以上,每次1小时。加入含有对应的荧光二抗和R-BTX (tetramethylrhodamine-conjugated a-bungarotoxin,以标记乙酰胆碱受体)。用1.0% Triton-x-100/PBS洗3以上,每次1小时,封片显微镜下观察。
电镜实验:具体染色参见以前报道(Shen et al. 2013, J Clin. Invest)。小鼠膈肌用2%戊二醛和2%多聚甲醛室温固定1小时,再在1%锇酸处理1小时。经 30%, 50%, 70%, 80%, 90% and 100%酒精脱水后包埋,切片成1-2 um。用3% uranyl acetate和2.6% lead citrate 显色,用JEOL 100CXII 拍照。
免疫共沉淀、免疫印迹和乙酰胆碱受体聚合实验:这些实验按照之前文献的描述进行操作(Luo et al., 2002, Neuron; 35:489-505; Zhang et al., 2007, J Neurosci; 27:3968-3973; Zhu et al., 2008, J Neurosci; 28:1688-1696)。除特别说明外,用于刺激肌肉细胞的重组神经聚集蛋白的终浓度都为1 nM。免疫印迹的条带亮度通过ImageJ software进行分析。
统计学分析:多组实验数据用ANOVA软件根据student-Newman-Keuls test进行分析。Two-tailed Student’s t test 用于比较分析两组数据。各组数据差异显著性的判别标准是P<0.05。 在图表中的数值和误差线分别表示平均值和标准误。
结果:
重症肌无力病人中约有10-15%为乙酰胆碱受体以及肌肉特异的酪氨酸激酶抗体阴性,由于病人不同的确诊方法和实际真实值无法估计。为了建立一种新的诊断方法和进行流行病学分析,病人的血浆和血清采用ELISA方法分析其和LRP4或聚集蛋白的结合。如图1所示,LRP4采用Elisa方法检测,在217个重症肌无力病人血清中,共有12个病人检测到LRP4抗体阳性。在120个血清为乙酰胆碱受体以及肌肉特异的酪氨酸激酶抗体双阴性的重症肌无力病人中,发现11个LRP4抗体阳性。通过比对发现鼠源和人源LRP4同源性为98%,在1905个氨基酸中只有68个不同。尽管目前检测LRP4的灵敏度较高,如果在将来的检测中采用人源的LRP4其灵敏度能得到进一步的提升。
乙酰胆碱受体以及MuSK抗体阴性的重症肌无力病人的血浆采用鼠源的LRP4检测。五个血清为乙酰胆碱受体以及MuSK抗体阴性的重症肌无力病人的血浆在稀释50倍后能结合到细胞膜上的LRP4,但是健康人血浆不能结合LRP4。如图10所示,乙酰胆碱受体以及MuSK抗体阴性病人的血浆结合LRP4。乙酰胆碱受体以及MuSK抗体阴性病人的血浆能够结合HEK293上表达的全长LRP4,健康人血浆抗体不能结合。图2:重症肌无力的病人血清中检测不到抗乙酰胆碱受体/MuSK的抗体,但是能检测到LRP4的自身抗体。
如图3所示,本实例证明免疫LRP4胞外端重组蛋白的小鼠,能够检测到血清中产生LRP4自身抗体。小鼠诱发重症肌无力症状,包括体重减轻,爪握力下降。而且神经接头递质传递出现障碍,肌肉复合动作电位 (CMAP)不能持续。图4所示,形态学上发现注射LRP4胞外端重组蛋白的小鼠神经肌肉接头形态出现异常,神经肌肉接头聚集的乙酰胆碱受体下降并出现碎片,不能完全和神经末端重合, 突触前运动神经元退化,突触小泡密度下降。注射LRP4胞外端重组蛋白的小鼠血清能够抑制MuSK蛋白的酪氨酸磷酸化,减少LRP4细胞表面定位以及聚集蛋白诱导的乙酰胆碱受体聚集,并部分激活补体反应(如图5所示)。将免疫有LRP4胞外端重组蛋白的重症肌无力兔子血清注射到小鼠上,也能引发重症肌无力,证明了LRP4自身抗体的致病性(图6)。因此,检测LRP4抗体是临床上检测和诊断重症肌无力的一种新方法,制备LRP4自身抗体引起的自身免疫病动物模型是作为探索治疗重症肌无力的新模型。
实施例2 重症肌无力患者自身抗体结合聚集蛋白agrin
一部分重症肌无力患者病人的血清,呈现乙酰胆碱受体抗体/MuSK抗体/LRP4抗体阴性,这可能提示还有新的未知自身抗体存在。本发明证明了在这些病人血清中含有聚集蛋白agrin的抗体。本实例证明在93个重症肌无力病人中,7个血清为聚集蛋白抗体阳性(约为7~8%),而在健康人或其他病人对照中,并没有发现聚集蛋白抗体阳性。此发明说明聚集蛋白抗体是重症肌无力患者的新致病原。
实验证明聚集蛋白抗体血清能够识别聚集蛋白,而且能够抑制聚集蛋白诱导的MuSK蛋白磷酸化,并能够抑制聚集蛋白对乙酰胆碱受体的聚集。此发明证明聚集蛋白抗体和乙酰胆碱受体抗体,MuSK 抗体和LRP4 抗体一样,同样是引起重症肌无力的致病原因。因此,检测聚集蛋白抗体是临床上检测和诊断重症肌无力的一种新方法。
方法:
病人-样品来源于男性或是女性重症肌无力病人。病人都通过肌电图经一部证实了神经肌肉传递缺陷或是对抗胆碱酯酶的检测结构呈阳性。另外一些血清来自正常的志愿者,来源于他免疫相关的神经性疾病或正常人血清。
神经聚集蛋白的表达-构建方法在实例1中有详细描述。构建后的质粒瞬时转染到HEK293细胞中。为了获得可溶性的聚集蛋白,转染后的第二天将细胞转移至低血清培养基,含有聚集蛋白的培养基在24小时后收集并采用Western boltting方法检测蛋白表达。
免疫染色-COS7细胞在转染后的第二天转移到培养皿中。两天后细胞用4%的多聚甲醛固定染色。重症肌无力病人以及正常病的血浆按照稀释成不同的比例用来分析。一抗后连接FITC作为显色二抗。
Elisa方法检测聚集蛋白抗体-来自转染有聚集蛋白或空载体的HEK293细胞的条件培养基用PH9.5的NaHCO3(PH=9.5)溶液按照1:1稀释后加入ELISA板上过夜。血浆按照1:100稀释并重复三组。一抗采用碱性磷酸酶连接羊抗人的IgM+IgG+IgA检测,实验中的非特异性吸附被扣除。
结果
为了建立一种新的诊断方法和进行流行病学分析,病人的血浆和血清采用ELISA方法分析聚集蛋白抗体的存在。如图7所示,聚集蛋白采用Elisa方法检测。本实例证明在93个重症肌无力病人中,7个血清为聚集蛋白抗体阳性(约为7~8%),而在健康人或其他病人对照中,并没有发现聚集蛋白抗体阳性。在6个乙酰胆碱受体抗体阴性/MuSK抗体阳性/LRP4抗体阴性的病人血清中,没有检测到聚集蛋白抗体阳性,说明MuSK抗体阳性的病人很可能是聚集蛋白抗体阴性。在83个乙酰胆碱受体抗体阳性/MuSK抗体阴性/LRP4抗体阴性的病人血清中,5个呈现聚集蛋白抗体阳性,比例约为6%。而在4个乙酰胆碱受体抗体阴性/MuSK抗体阴性/LRP4抗体阴性的病人血清中,2个为聚集蛋白抗体阳性,比例高达50%。此发明说明聚集蛋白抗体很可能是乙酰胆碱受体/MuSK/LRP4抗体三阴性病人的新致病原。
如图8所示,聚集蛋白阳性的病人血清能够结合HEK293上表达的全长聚集蛋白,而健康人血浆抗体不能结合。而且如图9所示,聚集蛋白阳性的病人血清能够抑制聚集蛋白引起的MuSK 蛋白的磷酸化,和对乙酰胆碱受体的聚集。
实施例3 LRP4自身抗体检测试剂盒的制备方法和检测过程
自发性免疫疾病重症肌无力是一种常见的神经突触疾病,10万人中约有10-20个患病者。其中约有80%的病人其体内的抗体能够结合肌肉的乙酰胆碱受体,这些抗体使乙酰胆碱受体数目减少或是失去功能,从而导致神经肌肉传递中的肌无力。而在乙酰胆碱受体抗体阴性的病人中,有约4-50%的病人可以检测出MuSK抗体。尽管一系列的实验证明了乙酰胆碱受体和MuSK的抗体导致了重症肌无力,但仍有10%的病人血清中检测不到这些抗体。本实例描述了LRP4自身抗体酶联免疫吸附法(ELISA)检测试剂盒的制备方法,以及用该试剂盒在乙酰胆碱受体以及MuSK抗体双阴性的病人中检测LRP4抗体的过程。
试剂盒的制备:
构建材料:构建Flag-ecto-LRP4-His时,在含有LRP4胞外结构域的pFlag-ecto-LRP4-CMV 载体中的SalI和EcoRV 酶切位点之间,通过PCR技术引入His肽段标签 (Wu et al., 2012, Neuron;Shen et al. 2013, J. Clin. Invest )。
细胞培养与转染:HEK293细胞系的维持和转染在之前的文献中有描述(Zhang et al., 2007, J Neurosci; 27:3968-3973)。转染过程中,细胞培养在DNA、脂质体和无血清培养基的混合物中,持续8小时后,换为融合培养基。在混合物中DNA与脂质体的比例为1μg:2μl。在10厘米培养皿中培养的优化条件为1ml转染混合物,其中含有10μg DNA质粒。
重组蛋白的表达及其纯化:表达重组蛋白时,HEK293细胞由Flag-ecto-LRP4-His质粒转染。转染24小时后,细胞培养基换为含有0.05%胎牛血清的DMEM培养基中。24小时后收集细胞培养基和细胞,利用Talon柱纯化LRP4胞外端重组蛋白,具体方法参见 (Shen et al. 2013, J. Clin. Invest; Zhang et al. 2011. Arch Neurol)。
酶联免疫板的包被:纯化的Flag-LRP4用碳酸缓冲液(PH=9.5)稀释后加入ELISA板(Maxi-Sorp Immunology Plates (Nunc))上4°C孵育过夜。然后用含有1%BSA的PBS封闭以阻断非特异结合位点。包被好的酶联免疫板可以长期保存。
LRP4抗体的检测:
病人样品 患者血清来源于男性及女性重症肌无力病人。病人经肌电图确诊,或已检测出抗乙酰胆碱受体抗体。对照血清来自正常的志愿者以及其他免疫相关的神经性疾病患者。
ELISA检测:包被好的酶联免疫板中加入经1:100稀释的血清样品,每个样品重复三组。经孵育清洗后,向板中加入碱性磷酸酶标记的羊抗人IgM+IgG+IgA二抗检测,实验中的非特异性吸附被扣除。
统计学分析:多组实验数据用ANOVA软件根据student-Newman-Keuls test进行分析。Two-tailed Student’s t test 用于比较分析两组数据。各组数据差异显著性的判别标准是P<0.05。
结果:
重症肌无力病人中约有10-15%为乙酰胆碱受体以及肌肉特异的酪氨酸激酶抗体阴性。由于病人不同的确诊方法,实际真实值无法估计。为了建立一种新的诊断方法和进行流行病学分析,病人的血浆和血清采用ELISA方法分析其中LRP4抗体的存在。如图1所示,在217个重症肌无力病人中,我们用在此描述的方法共检测到12位LRP4抗体阳性的病人。如图2所示,120个乙酰胆碱受体以及肌肉特异的酪氨酸激酶抗体双阴性的重症肌无力病人中共发现11位LRP4抗体阳性。通过蛋白序列比对发现鼠源和人源LRP4同源性为98%,在1905个氨基酸中只有68个不同。尽管目前检测LRP4的灵敏度较高,如果在将来的检测中采用人源的LRP4其灵敏度能得到进一步的提升。
综上可见,检测LRP4抗体是临床上检测和诊断重症肌无力的一种新方法。
实施例4 聚集蛋白自身抗体检测试剂盒的制备方法和检测过程
在一部分重症肌无力患者病人的血清中,无法检测到乙酰胆碱受体抗体/MuSK抗体/LRP4抗体,这可能提示还有新的未知自身抗体存在。本实例描述了聚集蛋白自身抗体酶联免疫吸附法(ELISA)检测试剂盒的制备方法,以及用该试剂盒在乙酰胆碱受体/MuSK抗体/LRP4抗体三阴性的病人血清中检测LRP4抗体的过程,证明了在这部分病人血清中存在聚集蛋白的抗体。
试剂盒的制备:
构建材料 构建pFlag-agrin时,在Flag标签和聚集蛋白序列之间通过PCR技术引入His肽段标签 (Zhang et al., 2007, J Neurosci )。
细胞培养与转染 HEK293细胞系的维持和转染在之前的文献中有描述(Zhang et al., 2007, J Neurosci; 27:3968-3973)。转染过程中,细胞培养在DNA、脂质体和无血清培养基的混合物中,持续8小时后,换为融合培养基。在混合物中DNA与脂质体的比例为1μg:2μl。在10厘米培养皿中培养的优化条件为1ml转染混合物,其中含有10μg DNA质粒。
重组蛋白的表达及其纯化 表达重组蛋白时,HEK293细胞由pFlag-agrin质粒转染。转染24小时后,细胞培养基换为含有0.05%胎牛血清的DMEM培养基中。24小时后收集细胞培养基和细胞,利用Talon柱纯化agrin重组蛋白,具体方法参见 文献(Shen et al. 2013, J. Clin. Invest; Zhang et al. 2011. Arch Neurol)。
酶联免疫板的包被 纯化的Flag-agrin用碳酸缓冲液(PH=9.5)稀释后加入ELISA板(Maxi-Sorp Immunology Plates (Nunc))上4°C孵育过夜。然后用含有1%BSA的PBS封闭以阻断非特异结合位点。包被好的酶联免疫板可以长期保存。
聚集蛋白抗体的检测:
病人样品 患者血清来源于男性及女性重症肌无力病人。病人经肌电图确诊,或已检测出抗乙酰胆碱受体抗体/MuSK抗体。对照血清来自正常的志愿者以及其他免疫相关的神经性疾病患者。
ELISA检测 包被好的酶联免疫板中加入经1:100稀释的血清样品,每个样品重复三组。经孵育清洗后,向板中加入碱性磷酸酶标记的羊抗人IgM+IgG+IgA二抗检测,实验中的非特异性吸附被扣除。
统计学分析 多组实验数据用ANOVA软件根据student-Newman-Keuls test进行分析。Two-tailed Student’s t test 用于比较分析两组数据。各组数据差异显著性的判别标准是P<0.05。
结果:
为了建立一种新的诊断方法和进行流行病学分析,病人的血浆和血清采用ELISA方法分析聚集蛋白抗体的存在。如图7所示,聚集蛋白采用ELISA方法检测。本实例证明在93个重症肌无力病人中,7个血清为聚集蛋白抗体阳性(约为7~8%),而在健康人或其他病人对照中,并没有发现聚集蛋白抗体阳性。在6个乙酰胆碱受体抗体阴性/MuSK抗体阳性/LRP4抗体阴性的病人血清中,没有检测到聚集蛋白抗体阳性,说明MuSK抗体阳性的病人很可能是聚集蛋白抗体阴性。在83个乙酰胆碱受体抗体阳性/MuSK抗体阴性/LRP4抗体阴性的病人血清中,5个呈现聚集蛋白抗体阳性,比例约为6%。而在4个乙酰胆碱受体抗体阴性/MuSK抗体阴性/LRP4抗体阴性的病人血清中,2个为聚集蛋白抗体阳性,比例高达50%。此发明说明聚集蛋白抗体很可能是乙酰胆碱受体/MuSK/LRP4抗体三阴性病人的新致病原,检测聚集蛋白抗体是临床上检测和诊断重症肌无力的一种新方法。
实施例5 含LRP4和/或聚集蛋白的多价抗体检测试剂盒
多数重症肌无力病人体内具有抗乙酰胆碱受体的抗体,而在乙酰胆碱受体抗体阴性的病人中,有约4-50%的病人可以检测出MuSK抗体。本发明提供了一种检测和治疗神经传递以及神经发育过程中相关疾病的新方法,这些疾病包括但不限于重症肌无力。本发明提供的检测方法可检测针对LRP4,聚集蛋白(agrin)或是相关的抗原的自身抗体。在上述实施例3和4中我们描述了约3%的乙酰胆碱受体抗体阴性/MuSK抗体阳性的病人血清呈现LRP4抗体阳性,而约6%的乙酰胆碱受体抗体阳性/MuSK抗体阴性/LRP4抗体阴性的病人血清呈现聚集蛋白抗体阳性。这些多价抗体阳性的病人可能具有与单价抗体阳性的病人不同的发病机理和病理特征,需要更有针对性的治疗方案。
因此我们要求涵盖含LRP4或LRP4模拟表位、聚集蛋白或聚集蛋白模拟表位以及乙酰胆碱受体、乙酰胆碱受体模拟表位、肌肉特异性酪氨酸激酶的任一种或几种的多价抗体检测试剂盒。该试剂盒可能在重症肌无力及其他神经传递障碍疾病的诊断分型和预后中有重要的应用。
实施例6
本发明利用:LRP4作为抗原检测LRP4抗体,利用聚集蛋白检测聚集蛋白抗体进而检测是否为重症肌无力患者。可以利用这个原理依照常规方法如ELISA,做成试剂盒。现举例如下:
试纸条的制备:用具有塑料背板的硝酸纤维素膜作为主要结构固定抗原,在硝酸纤维素膜较低的位置沉积有金偶联抗体的玻璃纤维素膜(偶联体垫),和位于硝酸纤维素膜两端,彼此相连,吸附有过量溶液的纤维素膜(样品垫和吸附垫)。玻璃纤维膜在系统较低的位置,由于其较高的吸附能力它不仅可以很快吸收样品,而且可以通过延长其向上不迁移的保留时间,诱导待测材料和溶解胶体金有效的反应。在免疫试纸条的中部,检测待测样品的抗原(检测线或捕捉线)和能检测胶体金的特定抗体(对照线)分别被固定,而且纤维素膜位于免疫试纸条的上不(吸附垫)以快速吸附过多的样品。
Claims (9)
1.利用LRP4针对神经传递障碍疾病的诊断组合物,包括人低密度脂蛋白受体相关蛋白4 LRP4或LRP4模拟表位。
2.根据权利要求1所述的诊断组合物,其特征在于还进一步包括聚集蛋白、聚集蛋白模拟表位、乙酰胆碱受体、乙酰胆碱受体模拟表位、肌肉特异性酪氨酸激酶的任一种或几种。
3.根据权利要求1所述的诊断组合物,其特征在于所述神经传递障碍疾病包括重症肌无力,肌肉萎缩症,或者先天性肌无力综合征CMS。
4.利用LRP4针对神经传递障碍疾病的诊断试剂盒,包括权利要求1所述的诊断组合物。
5.根据权利要求4所述的诊断试剂盒,其特征在于诊断组合物中LRP4或LRP4模拟表位上有可检测的标签。
6.根据权利要求4所述的诊断试剂盒,其特征在于所述标签为125I。
7.根据权利要求4所述的诊断试剂盒,其特征在于通过有色颗粒免疫测定法检测抗原-抗体复合物。
8.一种检测LRP4抗体的方法,所述方法包括检测由权利要求1所述的诊断组合物与样品接触后所形成的抗原-抗体复合物。
9.根据权利要求8所述的方法,其特征在于所述的方法选自:BIACORE分析、FACS、免疫荧光、免疫细胞化学、免疫印记、放射性免疫分析、ELISA、免疫沉淀反应、沉淀素反应、胶扩散沉淀反应。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201410075263.9A CN103869064A (zh) | 2014-03-04 | 2014-03-04 | 利用lrp4针对神经传递障碍疾病的诊断组合物 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201410075263.9A CN103869064A (zh) | 2014-03-04 | 2014-03-04 | 利用lrp4针对神经传递障碍疾病的诊断组合物 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN103869064A true CN103869064A (zh) | 2014-06-18 |
Family
ID=50907825
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201410075263.9A Pending CN103869064A (zh) | 2014-03-04 | 2014-03-04 | 利用lrp4针对神经传递障碍疾病的诊断组合物 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN103869064A (zh) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN108387723A (zh) * | 2018-01-18 | 2018-08-10 | 首都医科大学宣武医院 | 一种lrp4抗体细胞包被微孔板及制备方法和人lrp4抗体细胞免疫荧光检测试剂盒 |
CN109734795A (zh) * | 2019-01-17 | 2019-05-10 | 武汉明德生物科技股份有限公司 | 人Lrp4抗原、人Lrp4抗体检测试剂盒及其制备方法与应用 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2011050134A2 (en) * | 2009-10-21 | 2011-04-28 | Medical College Of Georgia Research Institute, Inc. | Detection and treatment of lrp4-associated neurotransmission disorders |
-
2014
- 2014-03-04 CN CN201410075263.9A patent/CN103869064A/zh active Pending
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2011050134A2 (en) * | 2009-10-21 | 2011-04-28 | Medical College Of Georgia Research Institute, Inc. | Detection and treatment of lrp4-associated neurotransmission disorders |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
ALEXANDRA PEVZNER,ET AL: "Anti-LRP4 autoantibodies in AChR- and MuSK-antibody-negative myasthenia gravis", 《J NEUROL》 * |
JUDITH COSSINS,ET AL: "The search for new antigenic targets in myasthenia gravis", 《ANN. N.Y. ACAD. SCI.》 * |
曾秋明和杨欢: "血清阴性重症肌无力研究进展", 《中国神经免疫学和神经病学杂志》 * |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN108387723A (zh) * | 2018-01-18 | 2018-08-10 | 首都医科大学宣武医院 | 一种lrp4抗体细胞包被微孔板及制备方法和人lrp4抗体细胞免疫荧光检测试剂盒 |
CN108387723B (zh) * | 2018-01-18 | 2019-06-25 | 首都医科大学宣武医院 | 一种lrp4抗体细胞包被微孔板制备方法 |
CN109734795A (zh) * | 2019-01-17 | 2019-05-10 | 武汉明德生物科技股份有限公司 | 人Lrp4抗原、人Lrp4抗体检测试剂盒及其制备方法与应用 |
CN109734795B (zh) * | 2019-01-17 | 2022-07-12 | 武汉明德生物科技股份有限公司 | 人Lrp4抗原、人Lrp4抗体检测试剂盒及其制备方法与应用 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Pascual-Goñi et al. | Antibodies to the Caspr1/contactin-1 complex in chronic inflammatory demyelinating polyradiculoneuropathy | |
DE202021100842U1 (de) | Methoden und Reagenzien zur Diagnose einer SARS-CoV-2-Infektion | |
CN105158462B (zh) | 神经系统疾病的诊断 | |
CN102253204A (zh) | 利用hbha来检测肺结核和由结核分枝杆菌引起的感染 | |
US20100267006A1 (en) | Method for detection of cirulent strain of influenza type-a virus | |
CN110218252A (zh) | 一种抗amh特异性抗体的制备方法以及该抗体在检测amh试剂盒中的应用 | |
DE202020105116U1 (de) | Reagenzien und Verwendungen zur Diagnose einer SARS-CoV-2-Infektion | |
CN105934673A (zh) | 神经学疾病的诊断 | |
US20230025108A1 (en) | RAPID ASSAY FOR DETECTION OF SARS-CoV-2 ANTIBODIES | |
BRPI1005176B1 (pt) | ensaio de insulina e reagente de ensaio de insulina | |
CN104792997A (zh) | 一种人降钙素原免疫检测试剂盒及其制备方法与应用 | |
CN104640877A (zh) | 用于检测自身免疫性疾病的诊断方法和相关主题 | |
CN107075557A (zh) | 使用嗜中性粒细胞弹性蛋白酶和蛋白酶3作为诊断生物标志物的方法和组合物 | |
CN102967704A (zh) | 一种用于糖尿病自身抗体6项联检试剂盒 | |
CN104764888A (zh) | 一种抗环瓜氨酸肽抗体检测试剂盒 | |
CN105473745A (zh) | 用于表征人膜蛋白的功能和相互作用的病毒体展示阵列 | |
CN103869078A (zh) | 利用聚集蛋白针对神经传递障碍疾病的诊断组合物 | |
KR20240022452A (ko) | SARS-CoV-2의 면역 측정 방법 및 면역 측정 키트 | |
CN109970851A (zh) | Ccv病毒m蛋白的单抗及其制备方法、免疫胶体金试纸条的制备方法 | |
CN101701959A (zh) | 新城疫病毒的快速检测免疫荧光试纸条及应用 | |
CN103869064A (zh) | 利用lrp4针对神经传递障碍疾病的诊断组合物 | |
WO2022109751A1 (en) | Point-of-care testing for sars-cov antibodies | |
CN103728454B (zh) | 基于表位抗原肽的抗内皮素受体a抗体酶联免疫试剂盒及其应用 | |
Ferrell et al. | Pathologic proteolytic processing of N-cadherin as a marker of human fibrotic disease | |
JP2009073783A (ja) | 魚類由来抗体の製造方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20140618 |