CN112980885B - 抗sars-cov-2中和抗体的表达载体 - Google Patents

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Abstract

本公开提供了表达针对SARS‑COV‑2的新型中和抗体或其抗原结合片段的重组表达载体。还提供了包含其的药物组合物和试剂盒及其用途。

Description

抗SARS-COV-2中和抗体的表达载体
技术领域
本公开大体上涉及表达抗SARS-COV-2中和抗体的表达载体。
背景技术
由新型冠状病毒，即严重急性呼吸综合征冠状病毒2（severe acute respiratorysyndrome coronavirus 2；SARS-CoV-2）引起的全球大流行的冠状病毒疾病2019（COVID-19）已严重恶化了公共卫生和经济。虽然大部分感染群体显示轻微症状，但一些进展成急性呼吸窘迫综合征，且现已报告超过2,000,000例死亡。
SARS-CoV-2感染宿主细胞是通过病毒包膜上表达的称为刺突（S）糖蛋白的糖蛋白介导，所述糖蛋白包含S1亚基和S2亚基。S1亚基含有与宿主细胞上的人血管收缩素转化酶2（angiotensin converting enzyme 2；ACE2）受体直接结合的受体结合结构域（receptor-binding domain；RBD），而S2亚基介导病毒包膜与宿主细胞膜融合以便促进病毒感染。
康复患者的血浆已用以治疗其它感染，且也已证明是有益于轻微和严重COVID-19患者的，这是由于血浆中产生的中和抗体。然而，由于血浆是由从COVID-19康复的人捐赠的且不能大规模生产，所以康复血浆治疗受到限制。
因此，迫切需要递送和制造针对SARS-COV-2具有高度强效的中和效果的中和抗体的大规模重组载体。
发明内容
在本公开通篇中，冠词“一个（种）（a/an）”和“所述（the）”在本文中用于指一个（种）或超过一个（种）（即，至少一个（种））所述冠词的语法对象。举例来说，“一种抗体”意味着一种抗体或超过一种抗体。
在一个方面中，本公开提供了一种重组表达载体，其包含含有编码抗SARS-COV-2中和抗体或其抗原结合片段的核酸序列的表达盒。
在一些实施例中，抗SARS-COV-2中和抗体或其抗原结合片段包含选自以下的氨基酸序列的重链CDR（HCDR）1、HCDR2和HCDR3：
a）SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2和SEQ ID NO: 3；
b）SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12和SEQ ID NO: 13；或
c）SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 22和SEQ ID NO: 23。
在一些实施例中，a）所述HCDR1由SEQ ID NO: 31的核酸序列编码，所述HCDR2由SEQ ID NO: 32的核酸序列编码，和所述HCDR3由SEQ ID NO: 33的核酸序列编码；b）所述HCDR1由SEQ ID NO: 39的核酸序列编码，所述HCDR2由SEQ ID NO: 40的核酸序列编码，和所述HCDR3由SEQ ID NO: 41的核酸序列编码；或c）所述HCDR1由SEQ ID NO: 47的核酸序列编码，所述HCDR2由SEQ ID NO: 48的核酸序列编码，和所述HCDR3由SEQ ID NO: 49的核酸序列编码。
在一些实施例中，所述抗SARS-COV-2中和抗体或其抗原结合片段进一步包含选自以下的氨基酸序列的轻链CDR（LCDR）1、LCDR2和LCDR3：
a）SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5和SEQ ID NO: 6；
b）SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15和SEQ ID NO: 16；或
c）SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 25和SEQ ID NO: 26。
在一些实施例中，a）所述LCDR1由SEQ ID NO: 34的核酸序列编码，所述LCDR2由SEQ ID NO: 35的核酸序列编码，和所述LCDR3由SEQ ID NO: 36的核酸序列编码；b）所述LCDR1由SEQ ID NO: 42的核酸序列编码，所述LCDR2由SEQ ID NO: 43的核酸序列编码，和所述LCDR3由SEQ ID NO: 44的核酸序列编码；或c）所述LCDR1由SEQ ID NO: 50的核酸序列编码，所述LCDR2由SEQ ID NO: 51的核酸序列编码，和所述LCDR3由SEQ ID NO: 52的核酸序列编码。
在一些实施例中，抗SARS-COV-2中和抗体或其抗原结合片段包含：
a）SEQ ID NO: 1的HCDR1、SEQ ID NO: 2的HCDR2和SEQ ID NO: 3的HCDR3，与SEQID NO: 4的LCDR1、SEQ ID NO: 5的LCDR2和SEQ ID NO: 6的LCDR3；
b）SEQ ID NO: 11的HCDR1、SEQ ID NO: 12的HCDR2和SEQ ID NO: 13的HCDR3，与SEQ ID NO: 14的LCDR1、SEQ ID NO: 15的LCDR2和SEQ ID NO: 16的LCDR3；或
c）SEQ ID NO: 21的HCDR1、SEQ ID NO: 22的HCDR2和SEQ ID NO: 23的HCDR3，与SEQ ID NO: 24的LCDR1、SEQ ID NO: 25的LCDR2和SEQ ID NO: 26的LCDR3。
在一些实施例中，a）所述HCDR1由SEQ ID NO: 31的核酸序列编码，所述HCDR2由SEQ ID NO: 32的核酸序列编码，所述HCDR3由SEQ ID NO: 33的核酸序列编码，所述LCDR1由SEQ ID NO: 34的核酸序列编码，所述LCDR2由SEQ ID NO: 35的核酸序列编码，且所述LCDR3由SEQ ID NO: 36的核酸序列编码；
b）所述HCDR1由SEQ ID NO: 39的核酸序列编码，所述HCDR2由SEQ ID NO: 40的核酸序列编码，所述HCDR3由SEQ ID NO: 41的核酸序列编码，所述LCDR1由SEQ ID NO: 42的核酸序列编码，所述LCDR2由SEQ ID NO: 43的核酸序列编码，且所述LCDR3由SEQ ID NO:44的核酸序列编码；或
c）所述HCDR1由SEQ ID NO: 47的核酸序列编码，所述HCDR2由SEQ ID NO: 48的核酸序列编码，所述HCDR3由SEQ ID NO: 49的核酸序列编码，所述LCDR1由SEQ ID NO: 50的核酸序列编码，所述LCDR2由SEQ ID NO: 51的核酸序列编码，且所述LCDR3由SEQ ID NO:52的核酸序列编码。
在一些实施例中，抗SARS-COV-2中和抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:7、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 27的氨基酸序列或与其具有至少80%（或至少85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%）序列一致性的序列的重链可变区（VH）。
在一些实施例中，a）所述VH包含SEQ ID NO: 7的氨基酸序列，其由SEQ ID NO: 9的核酸序列编码；b）所述VH包含SEQ ID NO: 17的氨基酸序列，其由SEQ ID NO: 19的核酸序列编码；和c）所述VH包含SEQ ID NO: 27的氨基酸序列，其由SEQ ID NO: 29的核酸序列编码。
在一些实施例中，抗SARS-COV-2中和抗体或其抗原结合片段进一步包含含有SEQID NO: 8、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 28的氨基酸序列或与其具有至少80%（或至少85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%）序列一致性的序列的轻链可变区（VL）。
在一些实施例中，a）所述VL包含SEQ ID NO: 8的氨基酸序列，其由SEQ ID NO: 10的核酸序列编码；b）所述VL包含SEQ ID NO: 18的氨基酸序列，其由SEQ ID NO: 20的核酸序列编码；和c）所述VL包含SEQ ID NO: 28的氨基酸序列，其由SEQ ID NO: 30的核酸序列编码。
在一些实施例中，抗SARS-COV-2中和抗体或其抗原结合片段包含：
a）包含SEQ ID NO: 7的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO: 8的氨基酸序列的VL，或与其具有至少80%（或至少85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%）序列一致性但保留对于SARS-CoV-2的特异性结合亲和力的同源序列；
b）包含SEQ ID NO: 17的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO: 18的氨基酸序列的VL，或与其具有至少80%（或至少85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%）序列一致性但保留对于SARS-CoV-2的特异性结合亲和力的同源序列；或
c）包含SEQ ID NO: 27的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO: 28的氨基酸序列的VL，或与其具有至少80%（或至少85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%）序列一致性但保留对于SARS-CoV-2的特异性结合亲和力的同源序列。
在一些实施例中，d）a）项中的VH和VL的氨基酸序列分别由SEQ ID NO: 9和SEQ IDNO: 10的核酸序列编码；e）b）项中的VH和VL的氨基酸序列分别由SEQ ID NO: 19和SEQ IDNO: 20的核酸序列编码；f）c）项中的VH和VL的氨基酸序列分别由SEQ ID NO: 29和SEQ IDNO: 30的核酸序列编码。
在一些实施例中，抗SARS-COV-2中和抗体或其抗原结合片段进一步包含一或多个氨基酸残基突变但保留与SARS-CoV-2特异性结合。
在一些实施例中，所述突变中的至少一者在CDR序列中的一或多个中，和/或在VH或VL序列中的一或多个中但不在任一个CDR序列中。
在一些实施例中，抗SARS-COV-2中和抗体或其抗原结合片段是双功能抗体、Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv片段、二硫键稳定的Fv片段（dsFv）、(dsFv)2、双特异性dsFv（dsFv-dsFv'）、二硫键稳定的双功能抗体（ds双功能抗体）、单链抗体分子（scFv）、scFv二聚体（二价双功能抗体）、多特异性抗体、骆驼化单结构域抗体、纳米抗体、结构域抗体或二价结构域抗体。
在一些实施例中，抗SARS-COV-2中和抗体或其抗原结合片段是双特异性的。
在一些实施例中，抗SARS-COV-2中和抗体或其抗原结合片段进一步包含重链恒定区和/或轻链恒定区。
在一些实施例中，重链恒定区来自人IgG1。在一些实施例中，重链恒定区包含SEQID NO: 37的氨基酸序列，任选地，重链恒定区由SEQ ID NO: 38的核酸序列编码。
在一些实施例中，轻链恒定区来自人λ轻链。在一些实施例中，轻链恒定区包含SEQID NO: 45的氨基酸序列，任选地，轻链恒定区由SEQ ID NO: 46的核酸序列编码。
在一些实施例中，第一信号肽与所述抗SARS-COV-2中和抗体VH在所述VH的N端处可操作地连接，且第二信号肽与所述抗SARS-COV-2中和抗体VL在所述VL所述N端处可操作地连接。
在一些实施例中，表达盒进一步包含转录调控元件。在一些实施例中，所述转录调控元件包含以下中的一或多者：启动子、增强子、内含子、2A自我裂解肽序列、土拔鼠肝炎病毒转录后调控元件（woodchuck hepatitis virus post-transcriptional regulatoryelement；WPRE）和/或聚腺苷酸化（polyA）信号序列。
在一些实施例中，重组表达载体是基于病毒的载体。在一些实施例中，重组表达载体是慢病毒载体。在一些实施例中，重组表达载体是逆转录病毒载体。在一些实施例中，重组表达载体是腺相关病毒（AAV）载体。
在一些实施例中，所述表达盒在有义链的5'至3'方向上包含：5' AAV反向末端重复序列（ITR）1-启动子-编码所述抗SARS-COV-2中和抗体的核酸序列-WPRE-polyA信号序列-3' AAV ITR2。在一些实施例中，编码抗SARS-COV-2中和抗体的核酸序列在有义链的5'至3'方向上包含以下的编码序列：第一信号肽-抗SARS-COV-2中和抗体重链可变区-人IgG1恒定区-2A自我裂解肽-第二信号肽-抗SARS-COV-2中和抗体轻链可变区-人λ轻链恒定区。
在一些实施例中，启动子是CASI启动子，且polyA信号序列是SV40 polyA。
在一些实施例中，AAV ITR1和AAV ITR2是AAV2 ITR。
在一些实施例中，AAV载体用突变AAV6衣壳假型化。
在一些实施例中，编码抗SARS-COV-2中和抗体或其抗原结合片段的核酸序列针对表达进行了密码子优化。
在一些实施例中，重组表达载体包含SEQ ID NO: 61-63中的任一者的核酸序列。
在另一方面中，本公开还提供了一种经基因修饰的宿主细胞，其包含本文提供的重组表达载体。在一些实施例中，所述细胞选自由以下组成的群组：古细菌细胞、细菌细胞和真核细胞。在一些实施例中，所述细胞是哺乳动物细胞。在一些实施例中，所述哺乳动物细胞是HEK293细胞。
在另一方面中，本公开还提供了一种药物组合物，其包含本文提供的重组表达载体和药学上可接受的载体。
在另一方面中，本公开还提供了一种制造表达抗SARS-COV-2中和抗体的重组表达载体的方法，其包含在适合于繁殖所述重组表达载体的条件下培养本文提供的经基因修饰的宿主细胞。
在另一方面中，本公开还提供了一种治疗或预防个体中的SARS-CoV-2感染的方法，其包含向所述个体给药有效量的本文提供的重组表达载体或上文提及的本文提供的药物组合物。
在一些实施例中，个体是人类或非人类动物。
在一些实施例中，个体已鉴定为被SARS-CoV-2感染，或怀疑被SARS-CoV-2感染，或处于暴露于SARS-CoV-2的风险下。
在一些实施例中，所述给药是经口、鼻、静脉内、皮下、舌下或肌肉内给药。
在一些实施例中，方法进一步包含给药有效量的第二治疗剂。
在一些实施例中，第二治疗剂选自抗病毒剂。抗病毒剂的实例可以是第二SARS-CoV-2中和抗体、表达第二SARS-CoV-2中和抗体的第二重组表达载体、RNA依赖性RNA聚合酶抑制剂、核苷类似物、抗病毒细胞因子（如干扰素）或免疫刺激剂。
在另一方面中，本公开还提供了一种中和个体中的SARS-CoV-2的方法，其包含向个体给药本文提供的重组表达载体。
在另一方面中，本公开还提供了一种预防或降低被SARS-CoV-2感染的个体传染SARS-CoV-2的方法，其包含向被SARS-CoV-2感染的个体给药有效量的本文提供的重组表达载体或本文提供的药物组合物。
在另一方面中，本公开还提供了一种降低被SARS-CoV-2感染的个体中的病毒负荷的方法，其包含向所述个体给药有效量的本文提供的重组表达载体或本文提供的药物组合物。
在另一方面中，本公开还提供了一种本文提供的重组表达载体或本文提供的药物组合物在制备用于治疗或预防个体的SARS-CoV-2感染的药物；或用于预防、抑制个体的SARS-CoV-2感染或SARS-CoV-2相关病状的进展和/或延迟其发作；或用于预防或降低被SARS-CoV-2感染的个体传染SARS-CoV-2；或用于降低被SARS-CoV-2感染的个体中的病毒负荷的用途。
附图说明
图1显示如通过ELISA所测定的本公开中提供的抗体与SARS-CoV-2病毒样颗粒（virus-like particle；VLP）的结合概况。
图2显示本公开中提供的抗体对于Vero-E6细胞中的真实SARS-CoV-2的中和。
图3显示如通过ELISA所测定的本公开中提供的抗体与S蛋白（3a）、S1亚基（3b）和RBD（3c）的结合概况。
图4显示在单次肌肉注射之后，BALB/c小鼠中AAV6.2FF介导的抗体15A7或FVM04的持续表达。
图5显示，AAV6.2FF介导的抗体15A7表达保护人ACE2转导的BALB/c小鼠免于SARS-Cov-2攻击。在用105个TCID50的SARS-CoV-2鼻内攻击8周之前，小鼠接受肌肉注射8×1011个VG的AAV6.2FF-15A7或AAV6.2FF-FVM04载体。感染4天后处死小鼠，且收集肺以通过TCID50定量SARS-CoV-2。
具体实施方式
以下对本公开的描述仅旨在说明本公开的各种实施例。因此，所讨论的具体修改不应被解释为对本公开范围的限制。对于所属领域的技术人员将显而易见的是，可在不脱离本公开的范围的情况下进行各种等效物、改变和修改，且应理解这类等效实施例包含在本文中。本文引用的所有参考文献，包括出版物、专利和专利申请，均以全文引用的方式并入本文中。
定义
如本文所用，术语“抗体”包括与特定抗原结合的任何免疫球蛋白、单克隆抗体、多克隆抗体、多价抗体、二价抗体、一价抗体、多特异性抗体或双特异性抗体。天然完整抗体包含两条重（H）链和两条轻（L）链。哺乳动物重链分类为α、δ、ε、γ和μ，每条重链由可变区（VH）以及第一、第二、第三和任选存在的第四恒定区（分别为CH1、CH2、CH3、CH4）组成；哺乳动物轻链分类为λ或κ，而每条轻链由可变区（VL）和恒定区组成。抗体呈“Y”形，其中Y的茎部由通过二硫键结合在一起的两条重链的第二和第三恒定区组成。Y的每个臂包括与单一轻链的可变区和恒定区结合的单一重链的可变区和第一恒定区。轻链和重链的可变区负责抗原结合。两条链中的可变区一般含有三个高度可变的环，称为互补决定区（complementaritydetermining region；CDR）（轻链CDR包括LCDR1、LCDR2和LCDR3，重链CDR包括HCDR1、HCDR2、HCDR3）。本文中所公开的抗体和抗原结合片段的CDR边界可通过Kabat、IMGT、Chothia或Al-Lazikani的约定来限定或鉴定（Al-Lazikani, B., Chothia, C., Lesk, A. M., 《分子生物学杂志（J. Mol. Biol.）》, 273(4), 927 (1997)；Chothia, C.等人, 《分子生物学杂志（J Mol Biol.）》12月5日;186(3):651-63 (1985)；Chothia, C.和Lesk, A.M., 《分子生物学杂志》196,901 (1987)；Chothia, C.等人, 《自然（Nature）》. 12月21-28日;342(6252):877-83 (1989)；Kabat E.A.等人, 免疫学相关蛋白质的序列（Sequences of Proteins ofimmunological Interest）, 第5版. 马里兰州贝塞斯达的美国国家卫生研究院公共卫生署（Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.）(1991)；Marie-Paule Lefranc等人, 《发育与比较免疫学（Developmental and Comparative Immunology）》, 27: 55-77 (2003)；Marie-Paule Lefranc等人, 《免疫组学研究（Immunome Research）》, 1(3), (2005)；Marie-Paule Lefranc, B细胞分子生物学（Molecular Biology of B cells）（第二版）, 第26章, 481-514, (2015)）。三个CDR插在被称为构架区（framework region；FR）（轻链FR包括LFR1、LFR2、LFR3和LFR4，重链FR包括HFR1、HFR2、HFR3和HFR4）的侧翼链段（stretch）之间，所述侧翼链段比CDR更高度保守且形成支撑高度可变环的支架。重链和轻链的恒定区不参与抗原结合，但呈现出各种效应功能。基于抗体重链恒定区的氨基酸序列来对抗体分类。抗体的五种主要类别或同型为大免疫球蛋白A（IgA）、IgD、IgE、IgG和IgM，其特征分别在于α、δ、ε、γ和μ重链的存在。若干主要抗体类别分为亚类，如IgG1（γ1重链）、IgG2（γ2重链）、IgG3（γ3重链）、IgG4（γ4重链）、IgA1（α1重链）或IgA2（α2重链）。
在某些实施例中，本文提供的抗体涵盖其任何抗原结合片段。如本文所用，术语“抗原结合片段”是指由抗体的一部分形成的抗体片段，其包含一或多个CDR或与抗原结合但不包含完整天然抗体结构的任何其它抗体片段。抗原结合片段的实例包括但不限于双功能抗体、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、二硫键稳定的Fv片段（dsFv）、(dsFv)2、双特异性dsFv（dsFv-dsFv'）、二硫键稳定的双功能抗体（ds双功能抗体）、单链抗体分子（scFv）、scFv二聚体（二价双功能抗体）、双特异性抗体、多特异性抗体、骆驼化单结构域抗体、纳米抗体、结构域抗体和二价结构域抗体。抗原结合片段能够结合至与亲本抗体所结合相同的抗原。
关于抗体的“Fab”是指抗体的由通过二硫键与单一重链的可变区和第一恒定区结合的单一轻链（可变区和恒定区）组成的部分。
“Fab'”是指包括一部分铰链区的Fab片段。
“F(ab')2”是指Fab'的二聚体。
关于（例如IgG、IgA或IgD同型）抗体的“Fc”是指抗体的由通过二硫键与第二重链的第二和第三恒定结构域结合的第一重链的第二和第三恒定结构域组成的部分。关于IgM和IgE同型抗体的Fc进一步包含第四恒定结构域。抗体的Fc部分负责各种效应功能，如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity；ADCC）和补体依赖性细胞毒性（complement dependent cytotoxicity；CDC），但不在抗原结合中起作用。
关于抗体的“Fv”是指带有完整抗原结合位点的抗体的最小片段。Fv片段由与单一重链的可变区结合的单一轻链的可变区组成。
“单链Fv抗体”或“scFv”是指由轻链可变区和重链可变区直接或通过肽连接子序列彼此连接组成的工程改造的抗体（Huston JS等人《美国国家科学院院刊（Proc Natl Acad Sci USA）》, 85:5879(1988)）。
“单链Fv-Fc抗体”或“scFv-Fc”是指由与抗体Fc区连接的scFv组成的工程改造的抗体。
“骆驼化单结构域抗体”、“重链抗体”或“HCAb”是指含有两个VH结构域且不含轻链的抗体（Riechmann L.和Muyldermans S., 《免疫学方法杂志（J Immunol Methods.）》 12月10日;231(1-2):25-38 (1999)；Muyldermans S., 《生物技术杂志（J Biotechnol.）》 6月;74(4):277-302 (2001)；WO94/04678；WO94/25591；美国专利第6,005,079号）。重链抗体最初来源于骆驼科（Camelidae）（骆驼、单峰骆驼和羊驼）。尽管缺乏轻链，但骆驼化抗体具有真实的抗原结合谱系（Hamers-Casterman C.等人,《自然》. 6月3日; 363(6428):446-8(1993)；Nguyen VK.等人 《免疫遗传学（Immunogenetics）》. 4月; 54(1):39-47 (2002)；Nguyen VK.等人 《免疫学（Immunology）》 . 5月; 109(1):93-101 (2003)）。重链抗体的可变结构域（“VHH结构域”）代表由适应性免疫反应产生的已知的最小抗原结合单元（Koch-Nolte F.等人, 《美国实验生物学学会联合会杂志（FASEB J.）》 11月;21(13):3490-8. 电子版2007年6月15日 (2007)）。
“纳米抗体”是指由来自重链抗体的VHH结构域和两个恒定结构域CH2与CH3组成的抗体片段。
“双功能抗体”或“dAb”包括具有两个抗原结合位点的小抗体片段，其中所述片段包含与同一多肽链中的VL结构域连接的VH结构域（VH-VL或VL-VH）（参见例如HolligerP.等人, 《美国国家科学院院刊》7月15日;90(14):6444-8(1993)；EP404097；WO93/11161）。通过使用过短以使得同一链上的两个结构域之间不能配对的连接子，迫使结构域与另一条链的互补结构域配对，从而产生两个抗原结合位点。所述抗原结合位点可靶向相同或不同的抗原（或表位）。在某些实施例中，“双特异性ds双功能抗体”是靶向两种不同抗原（或表位）的双功能抗体。
“结构域抗体”是指仅含有重链的可变区或轻链的可变区的抗体片段。在某些情况下，两个或更多个VH结构域用肽连接子共价接合，产生二价或多价结构域抗体。二价结构域抗体的两个VH结构域可靶向相同或不同的抗原。
如本文所用，术语“价”是指在既定分子中存在指定数量的抗原结合位点。术语“一价（monovalent）”是指仅具有一个单一抗原结合位点的抗体或抗原结合片段；和术语“多价”是指具有多个抗原结合位点的抗体或抗原结合片段。因此，术语“二价”、“四价”和“六价”分别表示在抗原结合分子中存在两个结合位点、四个结合位点和六个结合位点。在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段是二价的。
如本文所用，“双特异性”抗体是指具有来源于两种不同单克隆抗体且能够与两种不同的表位结合的人工抗体。两种表位可存在于同一抗原上，或其可存在于两种不同抗原上。
在某些实施例中，“scFv二聚体”是一种二价双功能抗体或双特异性scFv（BsFv），其包含VH-VL（通过肽连接子连接）与另一个VH-VL部分二聚化，使得一个部分的VH与另一个部分的VL配位且形成可靶向相同抗原（或表位）或不同抗原（或表位）的两个结合位点。在其它实施例中，“scFv二聚体”是一种双特异性双功能抗体，其包含VH1-VL2（通过肽连接子连接）与VL1-VH2（也通过肽连接子连接）结合，使得VH1与VL1配位且VH2与VL2配位，且每个配位对具有不同抗原特异性。
“dsFv”是指在单一轻链的可变区与单一重链的可变区之间的键联是二硫键的二硫键稳定的Fv片段。在一些实施例中，“(dsFv)2”或“(dsFv-dsFv')”包含三条肽链：通过肽连接子（例如较长柔性连接子）连接且分别通过二硫桥键与两个VL部分结合的两个VH部分。在一些实施例中，dsFv-dsFv'是双特异性的，其中各二硫键配对的重链和轻链具有不同抗原特异性。
如本文所用，术语“嵌合”意思指重链和/或轻链的一部分来源于一个物种且重链和/或轻链的其余部分来源于不同物种的抗体或抗原结合片段。在一些实施例中，非人类动物是哺乳动物，例如小鼠、大鼠、兔、山羊、绵羊、豚鼠或仓鼠。
如本文所用，术语“亲和力”是指免疫球蛋白分子（即，抗体）或其片段与抗原之间的非共价相互作用的强度。
如本文所用，术语“特异性结合（specific binding/specifically binds）”是指两个分子之间，例如抗体与抗原之间的非随机结合反应。特异性结合的特征可在于结合亲和力，例如由KD值表示，即，当抗原与抗原结合分子之间的结合达到平衡时，解离速率与结合速率的比率（koff/kon）。KD可通过使用所属领域中已知的任何常规方法来测定，包括但不限于表面等离子共振法、Octet法、微型热泳法、HPLC-MS法和FACS分析法。≤10-6 M（例如≤5×10-7 M、≤2×10-7 M、≤10-7 M、≤5×10-8 M、≤2×10-8 M、≤10-8 M、≤5×10-9 M、≤4×10-9M、≤3×10-9M、≤2×10-9 M或≤10-9 M）的KD值可指示抗体或其抗原结合片段与SARS-CoV-2（例如SARS-CoV-2）之间的特异性结合。
如本文所用，术语“表位”是指抗体所结合的抗原上特定的一组原子或氨基酸。如果两个抗体对某个抗原呈现竞争性结合，那么其可以结合所述抗原内的相同或紧密相关的表位。表位可以是线性或构象的（即，包括间隔开的氨基酸残基）。举例来说，如果抗体或抗原结合片段阻断参考抗体与抗原的结合至少85%、或至少90%或至少95%，那么抗体或抗原结合片段可视为结合与参考抗体相同/紧密相关的表位。
如本文所用，术语“氨基酸”是指含有胺（-NH2）和羧基（-COOH）官能团以及对各氨基酸具有特异性的侧链的有机化合物。氨基酸的名称在本公开中也表示为标准单字母或三字母码，其如下概述。
Figure 77252DEST_PATH_IMAGE001
与氨基酸序列有关的“保守取代”是指氨基酸残基被含具有类似物理化学特性的侧链的不同氨基酸残基置换。举例来说，可在具有疏水性侧链的氨基酸残基（例如Met、Ala、Val、Leu和Ile）间、具有中性亲水性侧链的残基（例如Cys、Ser、Thr、Asn和Gln）间、具有酸性侧链的残基（例如Asp、Glu）间、具有碱性侧链的氨基酸（例如His、Lys和Arg）间、或具有芳香族侧链的残基（例如Trp、Tyr和Phe）间进行保守取代。如所属领域中所知，保守取代通常不会引起蛋白质构象结构的显著变化，且因此可保持蛋白质的生物活性。
与氨基酸序列（或核酸序列）有关的“序列一致性百分比（%）”定义为在对准序列且在必要时，引入间隙以使相同氨基酸（或核酸）达到最大数量之后，候选序列中与参考序列中的氨基酸（或核酸）残基相同的氨基酸（或核酸）残基的百分比。氨基酸残基的保守取代可视为或可不视为相同残基。出于确定氨基酸（或核酸）序列一致性百分比的目的进行的比对可例如使用可公开获得的工具，如BLASTN、BLASTp（可见于美国国家生物技术信息中心（U.S.National Center for Biotechnology Information；NCBI）的网站，另参见AltschulS.F.等人, 《分子生物学杂志》, 215:403-410(1990)；Stephen F.等人, 《核酸研究（Nucleic Acids Res.）》, 25:3389-3402(1997)）、ClustalW2（可见于欧洲生物信息研究所（European Bioinformatics Institute）网站，另参见Higgins D.G.等人, 《酶学方法（Methods in Enzymology）》, 266:383-402(1996)；Larkin M.A.等人, 《生物信息学（Bioinformatics）》（英格兰牛津（Oxford, England））, 23(21):2947-8(2007)））和ALIGN或Megalign（DNASTAR）软件实现。所属领域的技术人员可使用所述工具所提供的默认参数，或可视需要例如通过选择合适算法来自定义比对的参数。
“分离的”物质已通过人工方式从天然状态改变。如果“分离的”组合物或物质存在于自然界中，那么所述组合物或物质已经从其原始环境改变或从其原始环境移出，或这两种情况均有。举例来说，天然地存在于活动物体内的多核苷酸或多肽不是“分离”的，但如果所述多核苷酸或多肽与其天然状态的共存材料充分地分离，由此以大体上纯的状态存在，那么所述多核苷酸或多肽是“分离的”。“分离的核酸序列”是指分离的核酸分子的序列。在某些实施例中，“分离的抗体或其抗原结合片段”是指如通过电泳法（如，SDS-PAGE、等电点聚焦、毛细电泳法）或色谱法（如，离子交换色谱或反相HPLC）所测定，纯度为至少60%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%的抗体或其抗原结合片段。
如本文所用，术语“个体”是指人类或非人类动物。非人类动物包含所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物。“个体”也可以是家畜动物（例如牛、猪、山羊、鸡、兔或马）、或啮齿动物（例如大鼠或小鼠）、或灵长类（例如大猩猩或猴）或家养动物（例如狗或猫）。“个体”可以是雄性或雌性，且还可以处于不同年龄。在某些实施例中，个体是人类。人类“个体”可以是高加索人、非洲人、亚洲人、苏美尔人或其他种族，或不同种族的混血。人类“个体”可以是老年人、成年人、少年、儿童或婴儿。
如本文所用，术语“预防（prevent/preventing）”包括减缓疾病发作、降低发展疾病的风险、抑制或延迟表现或发展与疾病有关的症状、降低疾病随后收缩或发展的严重程度、改善相关症状和诱导预防疾病的免疫性，
关于抗体的术语“中和”意思指，抗体能够破坏所形成的病毒颗粒或抑制病毒颗粒的形成或预防易感的细胞与病毒颗粒结合或易感的细胞感染病毒颗粒。
如本文所用，疾病、病症或病状的“治疗（treating/treatment）”包括预防或缓解疾病、病症或病状；减缓疾病、病症或病状的发作或发展速率；降低发展疾病、病症或病状的风险；降低或终止与疾病、病症或病状有关的症状；产生疾病、病症或病状的完全或部分消退；治愈疾病、病症或病状；或其一些组合。
如本文所用，“宿主细胞”是指已引入外源多核苷酸和/或载体来表达一或多种外源蛋白质的细胞。其意欲指特定个体细胞和其后代。宿主细胞可以是原核生物、真核生物、植物细胞、动物细胞或融合瘤。其可以是除非将调控剂引入到细胞中或将调控序列引入到宿主细胞中使得其与核酸可操作地连接，否则不以所期望水平表达蛋白质但包含核酸的细胞。
术语“可操作地连接（operably link/operably linked）”是指两个或更多个所关注的生物序列在存在或不存在间隔子或连接子的情况下的并接，使得它们处于允许它们以预期方式起作用的关系中。当关于多肽使用时，其意指多肽序列以允许连接的产物具有预期的生物学功能的方式连接。关于多核苷酸也可以使用所述术语。举例来说，当编码多肽的多核苷酸与调控序列（例如启动子、增强子、沉默子序列等）可操作地连接时，其意指所述多核苷酸序列以允许调控由多核苷酸表达多肽的方式连接。在一个实施例中，可操作地连接的核苷酸序列是相邻的（例如在信号序列的情况下）。替代地，可操作地连接的核苷酸序列可以不相邻（例如在增强子的情况下）。
针对SARS-CoV-2的中和抗体
在一个方面中，本公开提供了一种重组表达载体，其表达抗SARS-CoV-2中和抗体或其抗原结合片段。
在某些实施例中，针对SARS-CoV-2的中和抗体和其抗原结合片段包含含有选自由以下组成的群组的序列的一或多个（例如1、2、3、4、5或6个）CDR：SYDIN（SEQ ID NO: 1）、WMNPNSANPGYAQKFQG（SEQ ID NO: 2）、ARVTIHYDILTGYYSNAFDI（SEQ ID NO: 3）、RASQTISSYLN（SEQ ID NO: 4）、AASSLQS（SEQ ID NO: 5）、QQSYTTFMYT（SEQ ID NO: 6）、SYAIS（SEQ ID NO: 11）、GIIPIFGTTNYAQKFQG（SEQ ID NO: 12）、RSAYGDKGYYFDY（SEQ IDNO: 13）、RASQSVSNFLA（SEQ ID NO: 14）、DASNRAT（SEQ ID NO: 15）、QQRSNWPPQET（SEQ IDNO: 16）、SYAIT（SEQ ID NO: 21）、GIIPIFGTANFAQKFQG（SEQ ID NO: 22）、LGGFADPFDY（SEQID NO: 23）、RASQSVSNYLA（SEQ ID NO: 24）、DAFNRAT（SEQ ID NO: 25）、QQRSNWPPRIT（SEQID NO: 26）。
如本文所用，抗体“15A7”是指具有含SEQ ID NO: 7的序列的重链可变区和含SEQID NO: 8的序列的轻链可变区的单克隆抗体。重链可变区由SEQ ID NO: 9的核酸序列编码，且轻链可变区由SEQ ID NO: 10的核酸序列编码。
如本文所用，抗体“31C2”是指具有含SEQ ID NO: 17的序列的重链可变区和含SEQID NO: 18的序列的轻链可变区的单克隆抗体。重链可变区由SEQ ID NO: 19的核酸序列编码，且轻链可变区由SEQ ID NO: 20的核酸序列编码。
如本文所用，抗体“37G2”是指具有含SEQ ID NO: 27的序列的重链可变区和含SEQID NO: 28的序列的轻链可变区的单克隆抗体。重链可变区由SEQ ID NO: 29的核酸序列编码，且轻链可变区由SEQ ID NO: 30的核酸序列编码。
在某些实施例中，本公开提供了针对SARS-CoV-2的中和抗体和其抗原结合片段，其包含一或多个（例如1、2、3、4、5或6个）抗体15A7、31C2或37G2的CDR序列。
在某些实施例中，本公开提供了针对SARS-CoV-2的中和抗体和其抗原结合片段，其包含：HCDR1，其包含选自由SEQ ID NO: 1、11和21组成的群组的氨基酸序列；HCDR2，其包含选自由SEQ ID NO: 2、12和22组成的群组的氨基酸序列；和HCDR3，其包含选自由SEQ IDNO: 3、13和23组成的群组的氨基酸序列；和/或LCDR1，其包含选自由SEQ ID NO: 4、14和24组成的群组的氨基酸序列；LCDR2，其包含选自由SEQ ID NO: 5、15和25组成的群组的氨基酸序列；和LCDR3，其包含选自由6、16和26组成的群组的氨基酸序列。
在某些实施例中，本公开提供了针对SARS-CoV-2的中和抗体和其抗原结合片段，其包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO: 1的序列；HCDR2，其包含SEQ ID NO: 2的序列；HCDR3，其包含SEQ ID NO: 3的序列；和/或LCDR1，其包含SEQ ID NO: 4的序列；LCDR2，其包含SEQ IDNO: 5的序列；和LCDR3，其包含SEQ ID NO: 6的序列。HCDR1由SEQ ID NO: 31的核酸序列编码，HCDR2由SEQ ID NO: 32的核酸序列编码，且HCDR3由SEQ ID NO: 33的核酸序列编码；LCDR1由SEQ ID NO: 34的核酸序列编码，LCDR2由SEQ ID NO: 35的核酸序列编码，且LCDR3由SEQ ID NO: 36的核酸序列编码。
在某些实施例中，本公开提供了针对SARS-CoV-2的中和抗体和其抗原结合片段，其包含含有SEQ ID NO: 11的序列的HCDR1、含有SEQ ID NO: 12的序列的HCDR2、含有SEQID NO: 13的序列的HCDR3，和/或含有SEQ ID NO: 14的序列的LCDR1、含有SEQ ID NO: 15的序列的LCDR2和含有SEQ ID NO: 16的序列的LCDR3。HCDR1由SEQ ID NO: 39的核酸序列编码，HCDR2由SEQ ID NO: 40的核酸序列编码，且HCDR3由SEQ ID NO: 41的核酸序列编码；LCDR1由SEQ ID NO: 42的核酸序列编码，LCDR2由SEQ ID NO: 43的核酸序列编码，且LCDR3由SEQ ID NO: 44的核酸序列编码。
在某些实施例中，本公开提供了针对SARS-CoV-2的中和抗体和其抗原结合片段，其包含含有SEQ ID NO: 21的序列的HCDR1、含有SEQ ID NO: 22的序列的HCDR2、含有SEQID NO: 23的序列的HCDR3，和/或含有SEQ ID NO: 24的序列的LCDR1、含有SEQ ID NO: 25的序列的LCDR2和含有SEQ ID NO: 26的序列的LCDR3。HCDR1由SEQ ID NO: 47的核酸序列编码，HCDR2由SEQ ID NO: 48的核酸序列编码，且HCDR3由SEQ ID NO: 49的核酸序列编码；LCDR1由SEQ ID NO: 50的核酸序列编码，LCDR2由SEQ ID NO: 51的核酸序列编码，且LCDR3由SEQ ID NO: 52的核酸序列编码。
下表1显示抗体15A7、31C2和37G2的CDR氨基酸序列和核酸编码序列。CDR边界由Kabat的约定来限定或鉴定。下表2显示抗体15A7、31C2和37G2的重链和轻链可变区氨基酸序列。下表3显示抗体15A7、31C2和37G2的重链和轻链可变区核酸序列。
表1. 3种单克隆抗体的CDR氨基酸序列和核酸序列.
Figure 525550DEST_PATH_IMAGE002
表2. 3种单克隆抗体的可变区氨基酸序列.
Figure 915075DEST_PATH_IMAGE003
表3. 3种单克隆抗体的可变区核酸序列.
Figure 841442DEST_PATH_IMAGE004
已知CDR负责抗原结合。然而，已发现并非全部6个CDR均为必不可少的或不可改变的。换句话说，有可能置换或改变或修改中和抗体15A7、31C2和37G2中的一或多个CDR，而大体上保留对于SARS-CoV-2的特异性结合亲和力。
本文提供的抗体和其抗原结合片段可包含来自任何物种，如小鼠、人类、大鼠或兔的合适的构架区（framework region；FR）序列，只要抗体和其抗原结合片段可与SARS-CoV-2特异性结合即可。在某些实施例中，上表1中提供的CDR序列获自人抗体。在某些实施例中，FR序列来源于人类。
在一些实施例中，本文提供的抗体和其抗原结合片段包含重链可变结构域的全部或一部分和/或轻链可变结构域的全部或一部分。在一个实施例中，本文提供的抗体和其抗原结合片段是由本文提供的重链可变结构域的全部或一部分组成的单结构域抗体。所属领域中可获得这种单结构域抗体的更多信息（参见例如美国专利第6,248,516号）。
在某些实施例中，本文提供的抗体和其抗原结合片段进一步包含免疫球蛋白（Ig）恒定区，其任选地进一步包含重链和/或轻链恒定区。在某些实施例中，重链恒定区包含CH1、铰链和/或CH2-CH3区（或任选地CH2-CH3-CH4区）。在某些实施例中，本文提供的抗体和其抗原结合片段包含人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2或IgM的重链恒定区。在某些实施例中，本文提供的抗体和其抗原结合片段包含人IgG1的重链恒定区。在某些实施例中，本文提供的抗体和其抗原结合片段包含人IgG4的重链恒定区。在某些实施例中，轻链恒定区包含Ckappa（Cκ）或Clambda（Cλ）。本文提供的抗体和其抗原结合片段的恒定区可与野生型恒定区序列一致或相差一或多个突变。在某些实施例中，重链恒定区来自人IgG1。在某些实施例中，轻链恒定区来自人λ轻链。
在某些实施例中，相较于由任何动物（例如人类）产生的抗体，本文提供的抗体或其抗原结合片段具有不同氨基酸序列。在某些实施例中，相较于由任何动物（例如人类）产生的抗体，本文提供的抗体或其抗原结合片段具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、30、40、50或60个不同氨基酸。在某些实施例中，相较于由任何动物（例如人类）产生的抗体，本文提供的抗体或其抗原结合片段在FR区或Fc区中具有不同氨基酸。在某些实施例中，本文提供的抗体或其抗原结合片段具有上表1中提供的六个CDR序列，且相较于由任何动物（例如人类）产生的抗体在FR区或Fc区中具有不同氨基酸。
在某些实施例中，本文提供的抗体或其抗原结合片段对于SARS-CoV-2具有足以提供预防和/或治疗用途的特异性结合亲和力。
本文提供的抗体或其抗原结合片段可为单克隆抗体、多克隆抗体、人源化抗体、嵌合抗体、重组的抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、标记的抗体、二价抗体、抗独特型抗体或融合蛋白。重组的抗体是一种使用重组方法在活体外而非在动物中制备的抗体。
在一个方面中，本公开提供了表达中和抗体或其抗原结合片段的表达载体，其与本文提供的抗体或其抗原结合片段竞争与SARS-CoV-2结合。在某些实施例中，本公开提供了表达中和抗体或其抗原结合片段的表达载体，其与包含以下的抗体竞争与SARS-CoV-2结合：a）包含SEQ ID NO: 7的序列的重链可变区和包含SEQ ID NO: 8的轻链可变区；b）包含SEQ ID NO: 17的序列的重链可变区和包含SEQ ID NO: 18的序列的轻链可变区；或c）包含SEQ ID NO: 27的序列的重链可变区和包含SEQ ID NO: 28的序列的轻链可变区。
抗体变体
本文提供的抗体和其抗原结合片段也涵盖本文提供的抗体序列的各种变体。
在某些实施例中，抗体变体在上表1中提供的一或多个CDR序列中、上表2中提供的重链可变区或轻链可变区的一或多个非CDR序列中和/或恒定区（例如Fc区）中，包含一或多个突变。这类变体保留其亲本抗体对于SARS-CoV-2的结合特异性，但具有由突变赋予的一或多种期望特性。举例来说，抗体变体可具有改进的抗原结合亲和力、改进的糖基化模式、降低的糖基化风险、降低的脱氨基作用、降低或耗竭的效应功能、改进的FcRn受体结合、增加的药代动力学半衰期、pH灵敏性和/或与结合的相容性。
可使用所属领域中已知的方法，例如“丙氨酸扫描诱变”（参见例如Cunningham和Wells (1989) 科学《Science》, 244:1081-1085），来筛选亲本抗体序列以鉴定进行修饰或取代的合适的或优选的残基。简单来说，可鉴定靶标残基（例如带电残基，如Arg、Asp、His、Lys和Glu），且所述靶标残基可被中性或带负电氨基酸（例如丙氨酸或聚丙氨酸）置换，且产生已修饰的抗体且针对所关注特性进行筛选。如果特定氨基酸位置处的取代展现所关注的功能变化，那么所述位置可鉴定为潜在的突变残基。潜在残基可通过用不同类型的残基（例如半胱氨酸残基、带正电残基等）取代来进一步评定。
亲和力变体
抗体的亲和力变体可在一或多个上表1中提供的CDR序列、表2中提供的重链或轻链可变区序列或一或多个FR序列中含有突变，其可容易地由所属领域的技术人员基于表1中提供的CDR序列和表2中提供的重链或轻链可变区序列鉴定，因为所属领域中众所周知CDR区在可变区中侧接两个FR区。亲和力变体保留亲本抗体对于SARS-CoV-2的特异性结合亲和力，或甚至具有优于亲本抗体改进的SARS-CoV-2特异性结合亲和力。在某些实施例中，CDR序列、FR序列或可变区序列中的至少一者（或所有）取代包含保守取代。
所属领域的技术人员应理解，在上表1中提供的CDR序列和上表2中提供的可变区序列中，一或多个氨基酸残基可被取代，而所得抗体或抗原结合片段仍保留对于SARS-CoV-2的结合亲和力或结合能力，或甚至具有改进的结合亲和力或能力。所属领域中已知的各种方法均可用于实现这个目的。举例来说，可使用噬菌体展示技术产生且表达抗体变体（如，Fab或scFv变体）的文库，且随后针对对于SARS-CoV-2的结合亲和力进行筛选。再例如可使用计算机软件虚拟地模拟抗体与SARS-CoV-2的结合，且鉴定抗体上形成结合界面的氨基酸残基。这类残基可避免进行取代，以便防止结合亲和力降低，或作为取代的目标以实现较强结合。
在某些实施例中，本文提供的抗体和其抗原结合片段在CDR序列中的一或多个和/或FR序列中的一或多个中包含一或多个氨基酸残基取代。在某些实施例中，亲和力变体在CDR序列和/或FR序列中包含总共不超过20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个取代。
在某些实施例中，本文提供的抗体和其抗原结合片段包含与上表1中列出的那种（或那些）CDR序列具有至少80%（例如至少85%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%）序列一致性但仍保持以类似于或甚至高于其亲本抗体的水平与SARS-CoV-2特异性结合的1、2或3个CDR序列。
在某些实施例中，本文提供的抗体和其抗原结合片段包含与上表2中列出的那种（或那些）可变区序列具有至少80%（例如至少85%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%）序列一致性但仍保持在类似于或甚至高于其亲本抗体对于SARS-CoV-2的特异性结合亲和力的水平的一或多个可变区序列。在一些实施例中，突变发生在CDR外的区域（中例如在FR中）。
糖基化变体
本文提供的抗体和其抗原结合片段也涵盖糖基化变体，可获得所述糖基化变体以增加或降低抗体或其抗原结合片段的糖基化程度。
抗体或其抗原结合片段可包含引入或去除糖基化位点的一或多个修饰。糖基化位点是侧链可与碳水化合物部分（例如寡糖结构）连接的氨基酸残基。抗体的糖基化通常是N-连接的或O-连接的。N-连接是指碳水化合物部分与天冬酰胺残基，例如三肽序列（如，天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸，其中X是除脯氨酸外的任何氨基酸）中的天冬酰胺残基的侧链连接。O-连接糖基化是指糖N-乙酰基半乳糖胺、半乳糖或木糖中的一种与羟基氨基酸，最常见地与丝氨酸或苏氨酸的连接。天然糖基化位点的去除可便利地实现，例如通过改变氨基酸序列以使得上文所描述的三肽序列（对于N-连接糖基化位点）中的一个或序列中存在的丝氨酸或苏氨酸残基（对于O-连接糖基化位点）被取代来实现。可以类似方式，通过引入这类三肽序列或丝氨酸或苏氨酸残基来产生新的糖基化位点。
半胱氨酸工程改造的变体
本文提供的抗体和其抗原结合片段也涵盖半胱氨酸工程改造的变体，其包含一或多个引入的游离半胱氨酸氨基酸残基。
游离半胱氨酸残基是不作为二硫桥键的一部分的半胱氨酸残基。半胱氨酸工程改造的变体适用于在工程改造的半胱氨酸位点处，通过例如顺丁烯二酰亚胺或卤代乙酰基与例如细胞毒性和/或成像化合物、标记、或放射性同位素等结合。用于工程改造抗体或其抗原结合片段以引入游离半胱氨酸残基的方法是所属领域中已知的，参见例如WO2006/034488。
Fc变体
本文提供的抗体和其抗原结合片段也涵盖Fc变体，其包含在Fc区和/或铰链区处例如用于提供改变的效应功能(如ADCC和CDC)的一或多个氨基酸残基突变。所属领域中已描述通过抗体工程改造改变ADCC活性的方法，参见例如，Shields RL.等人, 《生物化学杂志（J Biol Chem.）》 2001. 276(9): 6591-604；Idusogie EE.等人,《免疫学杂志（J Immunol.）》2000.164(8):4178-84；Steurer W.等人, 《免疫学杂志》 1995, 155(3):1165- 74；Idusogie EE.等人, 《免疫学杂志》 2001, 166(4): 2571-5；Lazar GA.等人,PNAS, 2006, 103(11): 4005-4010；Ryan MC.等人, 《分子癌症治疗学（Mol. Cancer Ther.）》, 2007, 6: 3009-3018；Richards JO.等人, 《分子癌症治疗学）》 2008, 7(8):2517-27；Shields R. L.等人, 《生物化学杂志（J. Biol. Chem）》, 2002, 277: 26733-26740；Shinkawa T.等人, 《生物化学杂志》, 2003, 278: 3466-3473。
也可例如通过改进或减弱C1q结合和/或CDC来改变本文提供的抗体或抗原结合片段的CDC活性（参见例如WO99/51642；Duncan & Winter 《自然》 322:738-40 (1988)；美国专利第5,648,260号；美国专利第5,624,821号）；和关于Fe区变体的其它实例，WO94/29351。
选自Fc区的氨基酸残基329、331和322的一或多个氨基酸可用不同氨基酸残基置换，以改变Clq结合和/或降低或消除的补体依赖性细胞毒性（CDC）（参见Idusogie等人的美国专利第6,194,551号）。也可引入一或多个氨基酸取代来改变抗体固定补体的能力（参见Bodmer等人的PCT公开案WO 94/29351）。
本文中也涵盖本文提供的抗体和其抗原结合片段，其具有在Fc区和/或铰链区处具有一或多个氨基酸残基突变的Fc变体，以提供降低或消除的SARS-CoV-2感染的抗体依赖性增强（antibody dependent enhancement；ADE）。这类Fc变体可具有降低的与Fc受体（FcR）的结合。这类突变的实例包括但不限于在CH2结构域的位置4、5或两个处的亮氨酸残基的突变（例如突变为丙氨酸，作为LALA变体），参见例如WO2010043977A2，其以其全文并入本文中。
抗原结合片段
本文还提供了表达针对SARS-CoV-2的中和抗原结合片段的表达载体。抗原结合片段的各种类型是所属领域中已知的，且可基于本文提供的针对SARS-CoV-2的中和抗体来开发，包含例如其CDR显示于上表1中且可变序列显示于表2中的示范性抗体和其不同变体（如，亲和力变体、糖基化变体、Fc变体、半胱氨酸工程改造的变体等）。
在某些实施例中，本文提供的针对SARS-CoV-2的中和抗原结合片段是双功能抗体、Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv片段、二硫键稳定的Fv片段（dsFv）、(dsFv)2、双特异性dsFv（dsFv-dsFv'）、二硫键稳定的双功能抗体（ds双功能抗体）、单链抗体分子（scFv）、scFv二聚体（二价双功能抗体）、多特异性抗体、骆驼化单结构域抗体、纳米抗体、结构域抗体和二价结构域抗体。
可将包含含有编码抗SARS-COV-2中和抗体的抗原结合片段（例如Fab、Fv和ScFv抗体片段）的核酸序列的多核苷酸的表达载体引入到如大肠杆菌的宿主细胞中以进行表达。
在某些实施例中，抗原结合片段是scFv。scFv的产生描述于例如WO 93/16185；美国专利第5,571 894号和第5,587,458号中。ScFv可在氨基或羧基端处与效应蛋白融合以提供融合蛋白（参见例如《抗体工程改造（Antibody Engineering）》, Borrebaeck编）。
在某些实施例中，本文提供的抗体和其抗原结合片段是二价、四价、六价或多价的。大于二价的任何分子视为多价的，涵盖例如三价、四价、六价等。
如果两个结合位点均对与相同抗原或相同表位的结合具有特异性，那么二价分子可为单特异性的。在某些实施例中，这提供比一价对应物（monovalent counterpart）更强的与抗原或表位的结合。类似地，多价分子也可是单特异性的。在某些实施例中，在二价或多价抗原结合部分中，结合位点的第一价和结合位点的第二价结构上相同（即，具有相同序列）或结构上不同（即，具有不同序列，即使具有相同特异性）。
如果两个结合位点对不同抗原或表位具有特异性，那么二价也可为双特异性。这也适用于多价分子。举例来说，当两个结合位点对于第一抗原（或表位）为单特异性的且第三结合位点对第二抗原（或表位）具有特异性时，三价分子可为双特异性的。
重组表达载体
如本文所用，术语“载体”是指可以将编码蛋白质的多核苷酸可操作地插入其中以引起所述蛋白质表达的媒介物。载体可用于转化、转导或转染宿主细胞，以使其在宿主细胞内表达携带的遗传元件。载体的实例包括质粒；噬菌粒；粘粒和人工染色体，如酵母人工染色体（YAC）、细菌人工染色体（BAC）或P1衍生的人工染色体（PAC）；噬菌体，如λ噬菌体或M13噬菌体；和动物病毒。用作载体的动物病毒的类别包括逆转录病毒（包括慢病毒）、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒（例如单纯疱疹病毒）、痘病毒、杆状病毒、乳头状瘤病毒和乳多空病毒（例如SV40）。载体可以含有多种用于控制表达的元件，包含启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件和报告基因。另外，载体可以含有复制起点。在一个实施例中，本公开的表达载体包含超过一个复制起点，因此载体不限于一种细胞类型。术语“复制起点”是指当在载体中存在时其起始复制的序列。复制起点可被复制起始因子或替代地被DNA解螺旋酶识别。载体还可以包括有助于其进入细胞的材料，包括但不限于病毒颗粒、脂质体或蛋白质包膜。
载体可以是重组表达载体或克隆载体。本公开提供了载体（例如表达载体），其含有编码抗SARS-COV-2中和抗体的本文提供的核酸序列、至少一个与核酸序列可操作地连接的启动子和/或至少一个选择标记。载体的实例包括但不限于逆转录病毒（包括慢病毒）、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒（例如单纯疱疹病毒）、痘病毒、杆状病毒、乳头状瘤病毒、乳多空病毒（例如SV40）、λ噬菌体和M13噬菌体、质粒，如pcDNA3.3、pMD18-T、pOptivec、pCMV、pEGFP、pIRES、pQD-Hyg-GSeu、pALTER、pBAD、pcDNA、pCal、pL、pET、pGEMEX、pGEX、pCI、pEGFT、pSV2、pFUSE、pVITRO、pVIVO、pMAL、pMONO、pSELECT、pUNO、pDUO、Psg5L、pBABE、pWPXL、pBI、p15TV-L、pPro18、pTD、pRS10、pLexA、pACT2.2、pCMV-SCRIPT.RTM.、pCDM8、pCDNA1.1/amp、pcDNA3.1、pRc/RSV、PCR 2.1、pEF-1、pFB、pSG5、pXT1、pCDEF3、pSVSPORT、pEF-Bos等。
“重组表达载体”是编码基因的核酸分子，其在宿主细胞中表达且此外含有控制所述基因的表达的必需元件。通常，表达载体包含转录启动子、所关注基因和转录终止子。
在某些实施例中，重组表达载体是基于病毒的载体。在某些实施例中，重组表达载体是慢病毒载体。在某些实施例中，重组表达载体是腺相关病毒（AAV）载体。
在某些实施例中，编码本文提供的抗SARS-COV-2中和抗体或其抗原结合片段的核酸序列进行了密码子优化。如本文所用，术语“密码子优化（codon optimized/optimizedcodon/codon optimization）”是指通过，用在所关注的脊椎动物（例如人）的基因中较频繁或最频繁使用的密码子置换至少一个、超过一个或大量天然序列的密码子，来改变核酸序列以增强在所述脊椎动物细胞中的表达，但核酸序列的改变不改变原始翻译蛋白质的氨基酸序列。各种物种对特定氨基酸的某些密码子呈现出特定的偏好。
在某些实施例中，编码抗SARS-COV-2中和抗体的核酸序列进行了密码子优化。在某些实施例中，编码抗SARS-COV-2中和抗体的重链可变区的核酸序列进行了密码子优化。在某些实施例中，编码抗SARS-COV-2中和抗体的轻链可变区的核酸序列进行了密码子优化。在某些实施例中，编码抗SARS-COV-2中和抗体的重链恒定区的核酸序列进行了密码子优化。在某些实施例中，编码抗SARS-COV-2中和抗体的轻链恒定区的核酸序列进行了密码子优化。
调控元件
本文中公开的重组表达载体可以包括将所关注基因（以及可选标记）转录与翻译成蛋白质所必需的调控元件。转录调控元件可包含转录起始位点和转录终止位点和聚腺苷酸化信号序列，包括启动子、增强子、内含子、2A自我裂解肽序列、土拔鼠肝炎病毒转录后调控元件（WPRE）和/或聚腺苷酸化（polyA）信号序列。
如本文所用，术语“启动子”是指可控制编码序列的转录的多核苷酸序列。启动子序列包括对于RNA聚合酶识别、结合和转录起始来说足够的特定序列。另外，启动子序列可以包括调节RNA聚合酶的这一识别、结合和转录起始活性的序列。启动子可影响位于与自身相同的核酸分子上的基因或位于与自身不同的核酸分子上的基因的转录。取决于调控的性质，启动子序列的功能可以是组成性或可被刺激诱导的。如本文所用，“组成性”启动子是指用于不断地激活宿主细胞中的基因表达的启动子。如本文所用，“诱导性”启动子是指在某些刺激或某种刺激存在下激活宿主细胞中的基因表达的启动子。
在某些实施例中，本公开的启动子是真核启动子，如来自CMV的启动子（例如CMV即刻早期启动子（CMV启动子））、埃-巴二氏病毒（epstein barr virus；EBV）启动子、人类免疫缺陷病毒（HIV）启动子（例如HIV长末端重复序列（LTR）启动子）、莫洛尼病毒（moloneyvirus）启动子、小鼠乳腺瘤病毒（MMTV）启动子、劳斯肉瘤病毒（rous sarcoma virus；RSV）启动子、SV40早期启动子、来自人基因的启动子（如人肌球蛋白启动子）、人血红素启动子、人肌肉肌酸启动子、人金属硫蛋白β-肌动蛋白启动子、人泛素C启动子（UBC）、小鼠磷酸甘油酸激酶1启动子（PGK）、人胸苷激酶启动子（TK）、人延伸因子1α启动子（EF1A）、花椰菜嵌纹病毒（CaMV）35S启动子、E2F-1启动子（E2F1转录因子1的启动子）、α-胎蛋白的启动子、胆囊收缩素的启动子、癌胚抗原的启动子、C-erbB2/neu致癌基因的启动子、环加氧酶的启动子、CXC-趋化因子受体4的启动子（CXCR4）、人附睾蛋白4的启动子（HE4）、II型己糖激酶的启动子、L-网素的启动子、粘蛋白样醣蛋白的启动子（MUC1）、前列腺特异性抗原的启动子（PSA）、存活素的启动子、酪氨酸酶相关蛋白的启动子（TRP1）和酪氨酸酶的启动子。
在某些实施例中，本公开中使用的启动子是肌肉特异性的，例如巨细胞病毒即刻早期启动子（CMV）、嵌合型鸡β-肌动蛋白（CAG）和泛素C（UBC）启动子。在某些实施例中，启动子是由以下组成的合成CASI启动子：巨细胞病毒即刻早期启动子（CMV），之后是含有转录起始位点的鸡β-肌动蛋白（CAG）启动子的片段。这一融合紧跟在以合成方式设计的内含子后，其利用侧接人泛素C（UBC）启动子的增强子区的共同剪接供体和剪接受体序列。
在某些实施例中，CASI启动子具有SEQ ID NO: 55的序列：
ggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtcgaggtgagccccacgttctgcttcactctccccatctcccccccctccccacccccaattttgtatttatttattttttaattattttgtgcagcgatgggggcgggggggggggggggcgcgcgccaggcggggcggggcggggcgaggggcggggcggggcgaggcggagaggtgcggcggcagccaatcagagcggcgcgctccgaaagtttccttttatggcgaggcggcggcggcggcggccctataaaaagcgaagcgcgcggcgggcgggagtcgctgcgcgctgccttcgccccgtgccccgctccgccgccgcctcgcgccgcccgccccggctctgactgaccgcgttactaaaacaggtaagtccggcctccgcgccgggttttggcgcctcccgcgggcgcccccctcctcacggcgagcgctgccacgtcagacgaagggcgcagcgagcgtcctgatccttccgcccggacgctcaggacagcggcccgctgctcataagactcggccttagaaccccagtatcagcagaaggacattttaggacgggacttgggtgactctagggcactggttttctttccagagagcggaacaggcgaggaaaagtagtcccttctcggcgattctgcggagggatctccgtggggcggtgaacgccgatgatgcctctactaaccatgttcatgttttctttttttttctacaggtcctgggtgacgaacag。
在某些实施例中，CASI启动子位于编码抗SARS-COV-2中和抗体的核酸序列的5'端处。
重组表达载体也可包含增强子。启动子和增强子在细胞中具有相同的一般活化转录功能。其通常是重叠和相邻的，通常似乎具有极其类似的模块组织。增强子与启动子之间的基本区别是操作性。作为整体，增强子区必须能够相隔一定距离刺激转录，而启动子必须具有一或多个导引在特定位点处且在特定方向上起始RNA合成的元件，但增强子缺乏这些特异性。
术语“转录起始位点”是指构筑体中对应于并入到一级转录产物（即，mRNA前体）中的第一核酸的核酸；转录起始位点可与启动子序列重叠。
术语“转录终止位点”是指通常位于所关注基因或待转录序列链段的3'端处的引起RNA聚合酶终止转录的核苷酸序列。在某些实施例中，转录终止位点位于转录后调控元件下游。转录终止位点包括但不限于聚腺苷酸化信号序列。聚腺苷酸化信号序列或poly-A添加信号为在真核mRNA的3'端处的特定位点处的裂解且在核中向已裂解的3'端转录后添加约100-200个腺嘌呤核苷酸的序列（polyA尾）提供信号。聚腺苷酸化信号序列包括位于距裂解位点上游约10-30个核苷酸处的序列AATAAA，加上下游序列。出于肌肉源性表达的目的，作为非限制性实例，polyA序列可来源于猴病毒40（SV40）polyA、兔β-球蛋白（RBG）polyA和牛生长激素（BGH）polyA。在某些实施例中，polyA序列是SV40 polyA。
在某些实施例中，SV40 polyA具有SEQ ID NO: 60的核酸序列：
aacttgtttattgcagcttataatggttacaaataaagcaatagcatcacaaatttcacaaataaagcatttttttcactgcattctagttgtggtttgtccaaactcatcaatgtatcttatcatgtctggatc。
表达载体中可另外包括转录后调控元件以增强转基因表达。在某些实施例中，转录后调控元件是病毒转录后调控元件，如B型肝炎病毒（HPRE）的转录后调控元件、RNA转运元件（RTE）和土拔鼠肝炎病毒转录后调控元件（WPRE）。WPRE是一种介导将RNA从细胞核有效转运到细胞质的RNA输出元件。其通过插入顺式作用核酸序列，使得所述元件和转基因含于单一转录物内而增强转基因的表达。这种调控元件位于载体内以便RNA转录物中包括转基因，但在转基因翻译单元的终止密码子外。
在某些实施例中，WPRE具有SEQ ID NO: 59的核酸序列：
aatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactggtattcttaactatgttgctccttttacgctatgtggatacgctgctttaatgcctttgtatcatgctattgcttcccgtatggctttcattttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttatgaggagttgtggcccgttgtcaggcaacgtggcgtggtgtgcactgtgtttgctgacgcaacccccactggttggggcattgccaccacctgtcagctcctttccgggactttcgctttccccctccctattgccacggcggaactcatcgccgcctgccttgcccgctgctggacaggggctcggctgttgggcactgacaattccgtggtgttgtcggggaaatcatcgtcctttccttggctgctcgcctgtgttgccacctggattctgcgcgggacgtccttctgctacgtcccttcggccctcaatccagcggaccttccttcccgcggcctgctgccggctctgcggcctcttccgcgtcttcgccttcgccctcagacgagtcggatctccctttgggccgcctccccgc。
编码抗体的多核苷酸和重组方法
本公开提供了一种重组表达载体，其包含含编码抗SARS-COV-2中和抗体或其抗原结合片段的核酸序列的表达盒。如本文所用，术语“多核苷酸”或“核酸”是指核糖核酸（RNA）、脱氧核糖核酸（DNA）或混合型核糖核酸-脱氧核糖核酸，如DNA-RNA杂合体。多核苷酸或核酸可以是单链或双链DNA或RNA或DNA-RNA杂合体。多核苷酸或核酸可以是线性或环形。在某些实施例中，其中当病毒是DNA病毒时，第一和第二异源多核苷酸均是DNA；或当病毒是RNA病毒时，第一和第二异源多核苷酸均是RNA。在某一实施例中，第一异源多核苷酸和第二异源多核苷酸均是双链DNA。本公开的多核苷酸是双链DNA，且呈现具有编码序列，如由SEQID NO: 9、10、19、20、29-36、38-44和46-63所示的那些编码序列的核酸序列。
可使用所属领域中已知的常规方法，例如通过聚合酶链式反应（PCR）合成和与具有相容性限制性末端的病毒基因组接合，将核酸序列引入到重组表达载体中。关于更多细节，参见例如Sambrook等人《分子克隆：实验指南（Molecular Cloning: A LaboratoryManual）》（纽约冷泉港实验室(1989)），其以全文引用的方式并入本文中。
在某些实施例中，引入编码本文提供的抗SARS-COV-2中和抗体或其抗原结合片段的核酸序列代替重组表达载体的多克隆位点（MCS）。
在某些实施例中，插入到重组表达载体中的表达盒包含本文提供的编码抗SARS-COV-2中和抗体的重链可变区和轻链可变区的核酸序列。在某些实施例中，插入到重组表达载体中的多核苷酸包含本文提供的编码抗SARS-COV-2中和抗体的重链可变区和轻链可变区的核酸序列，其中编码重链可变区的核酸序列与编码重链恒定区的核酸序列可操作地连接，且编码轻链可变区的核酸序列与编码轻链恒定区的核酸序列可操作地连接。
在某些实施例中，重链恒定区来自人IgG1。在某些实施例中，重链恒定区包含SEQID NO: 37的氨基酸序列。在某些实施例中，重链恒定区由SEQ ID NO: 38的核酸序列编码。
人IgG1恒定区的氨基酸序列包含SEQ ID NO: 37：
STKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK。
编码人IgG1恒定区的核酸序列包含SEQ ID NO: 38：
agcaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaa。
在某些实施例中，轻链恒定区来自人λ轻链。在某些实施例中，轻链恒定区包含SEQ ID NO: 45的氨基酸序列。在某些实施例中，轻链恒定区由SEQ ID NO: 46的核酸序列编码。
人λ轻链恒定区的氨基酸序列包含SEQ ID NO: 45：
GQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS。
编码人λ轻链恒定区的核酸序列包含SEQ ID NO: 46：
ggtcagcccaaggctgccccctcggtcactctgttcccgccctcctctgaggagcttcaagccaacaaggccacactggtgtgtctcataagtgacttctacccgggagccgtgacagtggcctggaaggcagatagcagccccgtcaaggcgggagtggagaccaccacaccctccaaacaaagcaacaacaagtacgcggccagcagctatctgagcctgacgcctgagcagtggaagtcccacagaagctacagctgccaggtcacgcatgaagggagcaccgtggagaagacagtggcccctacagaatgttcatag。
在某些实施例中，第一信号肽与抗SARS-COV-2中和抗体VH在VH的N端处可操作地连接。在某些实施例中，第二信号肽与抗SARS-COV-2中和抗体VL在VL的N端处可操作地连接。
如本文所用，“信号肽”是指导引转运并入其中的蛋白质的短肽序列，通常长度小于50个氨基酸。信号肽通常与蛋白质在N末端处连接，且编码信号肽的编码序列通常包括编码N端甲硫氨酸的起始密码子。信号肽靶向蛋白质以转运到细胞内的，且涉及其中通过分泌路径蛋白质上存在信号肽靶向蛋白质以进行转运而使得细胞分泌蛋白质或以其它方式被细胞作为目标释放到细胞外环境中的分泌路径。在某些实施例中，第一信号肽由SEQ IDNO: 56的核酸序列编码。在某些实施例中，第二信号肽由SEQ ID NO: 58的核酸序列编码。
第一信号肽的核酸序列包含SEQ ID NO: 56：
atggcgacgggttcaagaacttccctacttcttgcatttggcctgctttgtttgccgtggttacaggagggctcggca
编码第二信号肽的核酸序列包含SEQ ID NO: 58：
atggcaacagggagccgaacctctctgctccttgctttcgggctcctttgcctaccgtggctccaagagggctcggca。
在某些实施例中，独立地表达本文提供的抗SARS-COV-2中和抗体的重链可变区和轻链可变区。换句话说，其不表达为融合蛋白，且彼此不连接（无论是共价连接还是通过连接子）。
在某些实施例中，本文提供的抗SARS-COV-2中和抗体的重链可变区和轻链可变区的表达通过一个启动子驱动，且重链可变区和轻链可变区通过2A自我裂解肽序列连接。
如本文所用，术语“2A自我裂解肽”是指长度约为20个氨基酸的相对短的肽，其取决于病毒的来源。最初认为其介导较大聚合蛋白质的自身催化的蛋白质水解，但现在理解为通过预防在甘氨酸与最后的脯氨酸之间形成正常肽键而在翻译时起作用，从而导致核糖体跳跃到下一密码子和Gly与Pro之间的新生肽裂解。在裂解之后，短2A肽仍与‘上游’蛋白质的C端融合，而将脯氨酸添加到‘下游’蛋白质的N端。在小核糖核酸病毒中鉴定出2A肽，但在不同子群中，口疮病毒，其典型实例是口蹄疫病毒。在某些实施例中，2A自我裂解肽选自由以下组成的群组：F2A（口蹄疫病毒18）、E2A（马鼻炎A病毒）、T2A（明脉扁刺蛾病毒）和P2A（猪捷申病毒-1）。
在某些实施例中，2A自我裂解肽是F2A。在某些实施例中，2A自我裂解肽序列由以下的核酸序列编码：cgaaaaagaagatcaggttcgggtgcgccagtaaagcagacattaaactttgatttgctgaaacttgcag gtgatgtagagtcaaatccaggtcca（SEQ ID NO: 57）。
在某些实施例中，编码抗SARS-COV-2中和抗体的核酸序列在有义链的5'到3'方向上包含以下的编码序列：第一信号肽-抗SARS-COV-2中和抗体重链可变区-人IgG1恒定区-2A自我裂解肽-第二信号肽-抗SARS-COV-2中和抗体轻链可变区-人λ轻链恒定区。
用于制造重组载体的方法
可将包含编码抗体的多核苷酸序列的载体引入到宿主细胞中进行克隆或基因表达。适用于克隆或表达本文载体中的DNA的宿主细胞是原核生物、酵母或更高级真核生物细胞。用于此目的的适合原核生物包括真细菌，如革兰氏阴性（Gram-negative）或革兰氏阳性（Gram-positive）生物体，例如肠内菌科（Enterobacteriaceae），如埃希氏菌属（Escherichia），例如大肠杆菌；肠杆菌属（Enterobacter）；欧文氏菌属（Erwinia）；克雷伯氏菌属（Klebsiella）；变形杆菌属（Proteus）；沙门氏菌属（Salmonella），例如鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）；沙雷氏菌属（Serratia），例如粘质沙雷氏菌（Serratia marcescans）；和志贺杆菌属（Shigella），以及芽孢杆菌属（Bacilli），如枯草芽孢杆菌（B. subtilis）和地衣芽孢杆菌（B. licheniformis）；假单胞菌属（Pseudomonas），如绿脓杆菌（P. aeruginosa）；和链霉菌属（Streptomyces）。
除原核生物外，真核微生物，如丝状真菌或酵母，是适用于表达抗SARS-COV-2中和抗体的克隆或表达宿主。酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）或常见的烘焙酵母是低级真核宿主微生物中最常用的。然而，多种其它属、种和菌株通常可用且适用于本文中，如粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）；克鲁维酵母属（Kluyveromyces）宿主，例如乳酸克鲁维酵母（K. lactis）、脆壁克鲁维酵母（K. fragilis）（ATCC 12,424）、保加利亚克鲁维酵母（K. bulgaricus） （ATCC 16,045）、威克克鲁维酵母（K. wickeramii）（ATCC 24,178）、克鲁维雄酵母（K. waltii） (ATCC 56,500)、果蝇克鲁维酵母（K. drosophilarum）(ATCC 36,906)、耐热克鲁维酵母（K. thermotolerans）和马克斯克鲁维酵母（K. marxianus）；耶氏酵母属（yarrowia） (EP 402,226)；毕赤酵母（Pichia pastoris）(EP183,070)；假丝酵母属（Candida）；瑞氏木霉（Trichoderma reesia） (EP 244,234)；粗糙脉孢菌（Neurospora crassa）；许旺酵母属（Schwanniomyces），如西方许旺酵母（Schwanniomyces occidentalis）；和丝状真菌，例如脉孢菌属（Neurospora）、青霉菌属（Penicillium）、弯颈霉属（Tolypocladium）和曲霉属（Aspergillus）宿主，如构巢曲霉（A. nidulans）和黑曲霉（A. niger）。
适合表达本文提供的糖基化抗体或抗原片段的宿主细胞来源于多细胞生物体。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已经鉴定出多种杆状病毒株和变体以及来自如下宿主的对应容许的昆虫宿主细胞：草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda）（毛虫）、埃及伊蚊（Aedes aegypti）（蚊子）、白纹伊蚊（Aedes albopictus）（蚊子）、黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）（果蝇）和家蚕（Bombyx mori）。多种用于转染的病毒株公开可用，例如苜蓿银纹夜蛾（Autographa californica） NPV的L-1变异体和家蚕NPV的Bm-5病毒株，并且所述病毒可以根据根据本公开用作本文中的病毒，特定来说用于转染草地贪夜蛾细胞。棉花、玉米、马铃薯、大豆、矮牵牛、番茄和烟草的植物细胞培养物也可以用作宿主。
然而，脊椎动物细胞也已引起极大关注，且在培养物（组织培养物）中繁殖脊椎动物细胞已变成常规程序。适用的哺乳动物宿主细胞系的实例是经SV40转化的猴肾CV1株系（COS-7，ATCC CRL 1651）；人胚肾系(经亚克隆以便在悬浮培养物中生长的293或293细胞；Graham等人，《普通病毒学杂志（J. Gen Virol.）》36:59 (1977)）；幼小仓鼠肾细胞（BHK，ATCC CCL 10）；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR（CHO，Urlaub等人，《美国国家科学院院刊》77:4216 (1980)）；小鼠支持细胞（TM4，Mather，《生殖生物学(Biol. Reprod.）》23:243-251(1980)）；猴肾细胞（CV1 ATCC CCL 70）；非洲绿猴肾细胞（VERO-76，ATCC CRL-1587）；人宫颈癌细胞（HELA，ATCC CCL 2）；犬科动物肾细胞（MDCK，ATCC CCL 34）；布法罗大鼠（buffalorat）肝细胞（BRL 3A，ATCC CRL 1442）；人肺细胞（W138，ATCC CCL 75）；人肝细胞（Hep G2，HB 8065）；小鼠乳腺肿瘤（MMT 060562，ATCC CCL51）；TRI细胞（Mather等人，《纽约科学院年报（Annals N.Y. Acad. Sci.）》383:44-68 (1982)）；MRC 5细胞；FS4细胞；和人肝肿瘤系（Hep G2）。在一些优选实施例中，宿主细胞是293细胞。
用上文所描述的表达或克隆载体转化宿主细胞以制造抗SARS-COV-2中和抗体，且在适当时在改良的常规营养培养基中培养，以诱导启动子、选择转化体或扩增编码所需序列的基因。在另一实施例中，抗体可通过所属领域中已知的同源重组来制造。
用于制造本文提供的抗体的宿主细胞可以在多种培养基中培养。市售培养基，如Ham's F10（西格玛）、最小必需培养基（MEM）（西格玛）、RPMI-1640（西格玛）和杜尔贝科氏改良型伊格尔氏培养基（Dulbecco's Modified Eagle's Medium，DMEM，西格玛）适用于培养宿主细胞。另外，Ham等人, 《酶学方法（Meth. Enz.）》58:44(1979)；Barnes等人, 《分析生物化学（Anal. Biochem.）》 102:255 (1980)；美国专利第4,767,704号、第4,657,866号、第4,927,762号、第4,560,655号或第5,122,469号；WO90/03430；WO 87/00195；或美国再颁专利第30,985号中所描述的任何培养基均可以用作宿主细胞的培养基。这些培养基中的任一者可以视需要补充有激素和/或其它生长因子（如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子）、盐（如氯化钠、钙盐、镁盐和磷酸盐）、缓冲剂（如HEPES）、核苷酸（如腺苷和胸苷）、抗生素（如GENTAMYCIN™药物）、微量元素（定义为通常以微摩尔范围内的最终浓度存在的无机化合物）和葡萄糖或等效能量源。也可以按所属领域的技术人员已知的适当浓度包括任何其它必需的补充剂。培养条件（如温度、pH等）是先前用于选择用于表达的宿主细胞情况的培养条件，且对于所属领域的一般技术人员将显而易见。
当使用重组技术时，抗体可以在细胞内、周质空间中产生，或直接分泌到培养基中。如果在细胞内产生抗体，那么作为第一步骤，例如通过离心或超过滤去除宿主细胞或裂解片段的微粒碎片。Carter等人, 《生物技术（Bio/Technology）》10:163-167(1992)描述了用于分离被分泌到大肠杆菌的周质空间中的抗体的程序。简单来说，将细胞糊状物在乙酸钠（pH 3.5）、EDTA和苯甲基磺酰氟（PMSF）的存在下解冻约30 min。可以通过离心去除细胞碎片。在抗体被分泌至培养基中的情况下，一般先使用市售的蛋白质浓缩过滤器，例如艾米康（Amicon）或密理博（Millipore）Pellicon超滤单元浓缩来自这类表达系统的上清液。可在前述任一步骤中包括蛋白酶抑制剂，如PMSF，以抑制蛋白质水解，且可以包括抗生素以防止外来污染物的生长。
腺相关病毒（AAV）载体的制造
在某些实施例中，重组表达载体是重组AAV载体。
腺相关病毒（AAV）是腺病毒的卫星病毒，含有大致48,000个碱基的线性单链DNA（ssDNA）分子，复制缺陷型且非包膜的，属于细小病毒科（Parvoviridae）。转基因表达需要将ssDNA转化成双链（ds）基因组。
制造本文提供的重组表达AAV病毒的方法包含：提供具有AAV载体的包装细胞系，其包含5' AAV反向末端重复序列（ITR）和3' AAV ITR、用于产生富有成效的AAV感染的辅助功能和AAV cap基因，其中所述AAV载体包含编码抗SARS-COV-2中和抗体的核苷酸序列；和从包装细胞系的上清液回收重组AAV病毒。
术语“反向末端重复序列”、“末端重复序列”、“ITR”和“TR”是指存在于天然单链AAV基因组两端的顺式复制、病毒包装、整合和/或前病毒救援AAV病毒所需的那些序列，包括保留全长或野生型ITR的活性的ITR的任何片段或衍生物。ITR可以来自任何AAV血清型，例如血清型1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11；或来自非AAV序列，如犬科动物细小病毒、小鼠细小病毒、人细小病毒B-19或用作SV40复制起点的SV40发夹的那些序列，其可通过截短、取代、缺失、插入和/或添加而进行进一步修饰。ITR也可以通过合成获得。
在某些实施例中，ITR来自AAV血清型2（即，AAV2）。在某些实施例中，ITR具有SEQID NO: 53或54的核酸序列：
在某些实施例中，5' ITR具有SEQ ID NO: 53的核酸序列：
ctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgcccgggcaaagcccgggcgtcgggcgacctttggtcgcccggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaactccatcactaggggttcct。
在某些实施例中，3' ITR具有SEQ ID NO: 54的核酸序列：
aggaacccctagtgatggagttggccactccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgggcgaccaaaggtcgcccgacgcccgggctttgcccgggcggcctcagtgagcgagcgagcgcgc。
AAV是辅助依赖性病毒，且需要与如腺病毒（Ad）的辅助病毒一起共感染或共转染辅助病毒DNA以进行富有成效的感染（参见Ward和Berns, 《病毒学杂志（J. Virol.）》, 70:4495, 1996）。如本文所用，术语“辅助功能”或“辅助子”是指AAV的复制和/或包装所需但不编码在所述AAV内的活性。辅助功能可由表达适合辅助功能的宿主细胞或由例如辅助病毒提供。
在某些实施例中，辅助功能由一或多种包含腺病毒辅助基因的辅助质粒或辅助病毒提供。AAV的辅助病毒在所属领域中已知且非限制性实例包括来自腺病毒、疱疹病毒或痘病毒（如牛痘）的病毒。疱疹病毒的实例包括但不限于单纯疱疹病毒（HSV）、埃-巴二氏病毒（EBV）、巨细胞病毒（CMV）和假性狂犬病病毒（PRV）。辅助质粒包括pHELP（应用病毒学（Applied Viromics））。所属领域的技术人员应了解，本文可使用可为AAV提供适当辅助功能的任何AAV的辅助病毒或辅助质粒。
AAV辅助表达rep和cap基因产物。已显示rep表达产物具有许多功能，尤其包括：识别、结合AAV的DNA复制起点和使其切口；DNA解螺旋酶活性；和调节从AAV（或其它异源）启动子的转录。cap表达产物供应必需的包装功能。AAV辅助功能在本文中用于反式互补AAV载体缺少的AAV功能。
术语“Rep基因”是编码具有天然AAV Rep蛋白（例如Rep 40、52、68、78）的至少一个功能活性的复制蛋白质的基因。rep蛋白通过识别、结合AAV的DNA复制起点和使其切口以及DNA解螺旋酶活性而促进DNA的复制。rep蛋白的额外功能包括调节从AAV（或其它异源）启动子的转录和将AAV DNA位点特异性整合到宿主染色体中。“Cap基因”是编码具有天然AAVCap蛋白（例如VP1、VP2、VP3）的至少一个功能活性的衣壳蛋白的基因。Cap蛋白能够诱导衣壳形成、促进单链DNA累积、促进AAV DNA包装到衣壳中（即，包裹）、与细胞受体结合和促进病毒进入宿主细胞。
在某些实施例中，AAV cap基因可存在于质粒中。质粒可进一步包含AAV rep基因。cap基因和/或rep基因可来源于任何AAV血清型（包括但不限于AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9和其任何变体），其可在本文中用于制造本文中公开的重组表达AAV载体来表达一或多种所关注蛋白质。在某些实施例中，AAV cap基因选自血清型1、血清型2、血清型4、血清型5、血清型6、血清型7、血清型8、血清型9或其任何变体的衣壳。在某些实施例中，AAV cap基因来源于血清型6的衣壳，且rep基因来源于AAV2。
在某些实施例中，重组AAV（rAAV）载体包含包裹rAAV载体基因组的突变衣壳蛋白，其中突变衣壳蛋白包含在AAV6衣壳蛋白序列的第129、445和731位氨基酸处的氨基酸取代。在某些实施例中，突变衣壳蛋白包含如下的氨基酸取代：Phe129Leu（F129L）、Tyr445Phe（Y445F）和Tyr731Phe（Y731F），其中突变衣壳蛋白是突变AAV6衣壳蛋白。在某些实施例中，突变衣壳蛋白相较于野生型AAV具有更高的肌肉、气管、肝脏、中枢神经系统、视网膜或肺细胞转导。突变衣壳蛋白在US20190216949中详细描述，其以全文并入本文中。
在某些实施例中，对AAV载体进行假型化。术语“假型化”意思指来源于由含有至少一种第二血清型（即，不同于第一AAV血清型的血清型）的AAV Cap蛋白的AAV衣壳包裹或包装的第一AAV血清型的核酸或基因组。在某些实施例中，血清型2 Rep蛋白是优选的。构筑和使用不同血清型的AAV载体和AAV蛋白论述于Chao等人，《分子治疗（Mol. Ther.）》2:619-623, 2000；Davidson等人，PNAS 97:3428-3432, 2000；Xiao等人，《病毒学杂志》72:2224-2232, 1998；Halbert等人，《病毒学杂志》74:1524-1532, 2000；Halbert等人，《病毒学杂志》75:6615-6624, 2001；和Auricchio等人，《人类分子遗传学（Hum. Molec. Genet.）》10:3075-3081, 2001中。
在一些实施例中，可用辅助质粒或辅助病毒、AAV载体和编码AAV cap和/或rep基因的质粒转染包装细胞系；和可在共转染后的不同时间点处收集重组AAV病毒。举例来说，可在共转染后约12小时、约24小时、约36小时、约48小时、约72小时、约96小时、约120小时或任何两个这些时间点之间的某一时间处收集重组AAV病毒。
本文中公开的重组AAV病毒也可使用所属领域中已知适合于制造感染性重组AAV的任何常规方法来制造。举例来说，重组AAV可通过使用稳定表达AAV颗粒产生的一些必需组分的细胞系来制造。举例来说，可将包含AAV rep和cap基因和可选标记（例如新霉素抗性基因）的质粒（或多个质粒）整合到包装细胞系的基因组中。随后，包装细胞系可用提供辅助功能的辅助病毒（例如腺病毒）和本文提供的AAV载体共感染，所述AAV载体包含5'和3' AAVITR和编码所关注蛋白质的核苷酸序列。在另一实例中，腺病毒或杆状病毒而非质粒可用于将rep和cap基因引入到包装细胞中。在又另一实例中，可将含有5'和3'AAV ITR的AAV载体和rep-cap基因稳定地整合到包装细胞的DNA中，且辅助功能可由野生型腺病毒提供以制造重组AAV。
在某些实施例中，所述表达盒在有义链的5'至3'方向上包含：5' AAV反向末端重复序列（ITR）1-启动子-编码所述抗SARS-COV-2中和抗体的核酸序列-WPRE-polyA信号序列-3' AAV ITR2。
在某些实施例中，表达15A7抗体的重组AAV载体包含SEQ ID NO: 61的基因组核酸序列：
CAGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTTGTAGTTAATGATTAACCCGCCATGCTACTTATCTACGTAGCCATGCTCTAGGACATTGATTATTGACTAGTggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtcgaggtgagccccacgttctgcttcactctccccatctcccccccctccccacccccaattttgtatttatttattttttaattattttgtgcagcgatgggggcgggggggggggggggcgcgcgccaggcggggcggggcggggcgaggggcggggcggggcgaggcggagaggtgcggcggcagccaatcagagcggcgcgctccgaaagtttccttttatggcgaggcggcggcggcggcggccctataaaaagcgaagcgcgcggcgggcgggagtcgctgcgcgctgccttcgccccgtgccccgctccgccgccgcctcgcgccgcccgccccggctctgactgaccgcgttactaaaacaggtaagtccggcctccgcgccgggttttggcgcctcccgcgggcgcccccctcctcacggcgagcgctgccacgtcagacgaagggcgcagcgagcgtcctgatccttccgcccggacgctcaggacagcggcccgctgctcataagactcggccttagaaccccagtatcagcagaaggacattttaggacgggacttgggtgactctagggcactggttttctttccagagagcggaacaggcgaggaaaagtagtcccttctcggcgattctgcggagggatctccgtggggcggtgaacgccgatgatgcctctactaaccatgttcatgttttctttttttttctacaggtcctgggtgacgaacagGGTACCGCCACCatggcgacgggttcaagaacttccctacttcttgcatttggcctgctttgtttgccgtggttacaggagggctcggcaCAGGTGCAGcTGgTGcAGTcTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACCTTCACCAGTTATGATATCAACTGGGTGCGACAGGCCTCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGATGGATGAACCCTAACAGTGCTAACCCAGGCTATGCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACCATGACCAGGAACACCTCCATaagCACAGCCTTCATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGACGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGCCCGAGTAACTATACATTACGATATTTTGACTggTTATTATTCGAATGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCGCCGTCTCTTCAAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAAcgaaaaagaagatcaggttcgggtgcgccagtaaagcagacattaaactttgatttgctgaaacttgcaggtgatgtagagtcaaatccaggtccaatggcaacagggagccgaacctctctgctccttgctttcgggctcctttgcctaccgtggctccaagagggctcggcagacatccagatgacccagtctccatcCtCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGACCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGGCAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGAGTTACACTACCTTCATGTACACTTTTGGCCAGGGGACCATGCTGGAGATCAAAGGTCAGCCCAAGGCTGCCCCCTCGGTCACTCTGTTCCCGCCCTCCTCTGAGGAGCTTCAAGCCAACAAGGCCACACTGGTGTGTCTCATAAGTGACTTCTACCCGGGAGCCGTGACAGTGGCCTGGAAGGCAGATAGCAGCCCCGTCAAGGCGGGAGTGGAGACCACCACACCCTCCAAACAAAGCAACAACAAGTACGCGGCCAGCAGCTATCTGAGCCTGACGCCTGAGCAGTGGAAGTCCCACAGAAGCTACAGCTGCCAGGTCACGCATGAAGGGAGCACCGTGGAGAAGACAGTGGCCCCTACAGAATGTTCATAGCtctagaggAtaatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactggtattcttaactatgttgctccttttacgctatgtggatacgctgctttaatgcctttgtatcatgctattgcttcccgtatggctttcattttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttatgaggagttgtggcccgttgtcaggcaacgtggcgtggtgtgcactgtgtttgctgacgcaacccccactggttggggcattgccaccacctgtcagctcctttccgggactttcgctttccccctccctattgccacggcggaactcatcgccgcctgccttgcccgctgctggacaggggctcggctgttgggcactgacaattccgtggtgttgtcggggaaatcatcgtcctttccttggctgctcgcctgtgttgccacctggattctgcgcgggacgtccttctgctacgtcccttcggccctcaatccagcggaccttccttcccgcggcctgctgccggctctgcggcctcttccgcgtcttcgccttcgccctcagacgagtcggatctccctttgggccgcctccccgcctAAGCTTATCGATACCGTCGAGATCTAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGGATCTCGACCTCGACTAGAGCATGGCTACGTAGATAAGTAGCATGGCGGGTTAATCATTAACTACAAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGAATTCCAGACGATTGAGCGTCAAAATGTAGGTATTTCCATGAGCGTTTTTCCTGTTGCAATGGCTGGCGGTAATATTGTTCTGGATATTACCAGCAAGGCCGATAGTTTGAGTTCTTCTACTCAGGCAAGTGATGTTATTACTAATCAAAGAAGTATTGCGACAACGGTTAATTTGCGTGATGGACAGACTCTTTTACTCGGTGGCCTCACTGATTATAAAAACACTTCTCAGGATTCTGGCGTACCGTTCCTGTCTAAAATCCCTTTAATCGGCCTCCTGTTTAGCTCCCGCTCTGATTCTAACGAGGAAAGCACGTTATACGTGCTCGTCAAAGCAACCATAGTACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCG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在某些实施例中，表达31C2抗体的重组AAV载体包含SEQ ID NO: 62的基因组核酸序列：
CAGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTTGTAGTTAATGATTAACCCGCCATGCTACTTATCTACGTAGCCATGCTCTAGGACATTGATTATTGACTAGTggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtcgaggtgagccccacgttctgcttcactctccccatctcccccccctccccacccccaattttgtatttatttattttttaattattttgtgcagcgatgggggcgggggggggggggggcgcgcgccaggcggggcggggcggggcgaggggcggggcggggcgaggcggagaggtgcggcggcagccaatcagagcggcgcgctccgaaagtttccttttatggcgaggcggcggcggcggcggccctataaaaagcgaagcgcgcggcgggcgggagtcgctgcgcgctgccttcgccccgtgccccgctccgccgccgcctcgcgccgcccgccccggctctgactgaccgcgttactaaaacaggtaagtccggcctccgcgccgggttttggcgcctcccgcgggcgcccccctcctcacggcgagcgctgccacgtcagacgaagggcgcagcgagcgtcctgatccttccgcccggacgctcaggacagcggcccgctgctcataagactcggccttagaaccccagtatcagcagaaggacattttaggacgggacttgggtgactctagggcactggttttctttccagagagcggaacaggcgaggaaaagtagtcccttctcggcgattctgcggagggatctccgtggggcggtgaacgccgatgatgcctctactaaccatgttcatgttttctttttttttctacaggtcctgggtgacgaacagGGTACCGCCACCatggcgacgggttcaagaacttccctacttcttgcatttggcctgctttgtttgccgtggttacaggagggctcggcaCAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCGTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCtGGAGGCACCTTCAGCAGCTATGCTATCAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAGGGATCATCCCTATCTTTGGTACAACAAACTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACGATTACCGCGGACGAATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAACAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGGGACGTTCGGCCTACGGTGATAAAGGGTACTACTTTGATTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAAcgaaaaagaagatcaggttcgggtgcgccagtaaagcagacattaaactttgatttgctgaaacttgcaggtgatgtagagtcaaatccaggtccaatggcaacagggagccgaacctctctgctccttgctttcgggctcctttgcctaccgtggctccaagagggctcggcagaaattgtgttgacacagtctccagccaccCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAACTTCTTAGCCTGGTATCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGATGCATCCAACAGGGCCACTGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTACAGCCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAGCAGCGTAGCAACTGGCCTCCGCAAGAGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAAGGTCAGCCCAAGGCTGCCCCCTCGGTCACTCTGTTCCCGCCCTCCTCTGAGGAGCTTCAAGCCAACAAGGCCACACTGGTGTGTCTCATAAGTGACTTCTACCCGGGAGCCGTGACAGTGGCCTGGAAGGCAGATAGCAGCCCCGTCAAGGCGGGAGTGGAGACCACCACACCCTCCAAACAAAGCAACAACAAGTACGCGGCCAGCAGCTATCTGAGCCTGACGCCTGAGCAGTGGAAGTCCCACAGAAGCTACAGCTGCCAGGTCACGCATGAAGGGAGCACCGTGGAGAAGACAGTGGCCCCTACAGAATGTTCATAGCtctagaggAtaatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactggtattcttaactatgttgctccttttacgctatgtggatacgctgctttaatgcctttgtatcatgctattgcttcccgtatggctttcattttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttatgaggagttgtggcccgttgtcaggcaacgtggcgtggtgtgcactgtgtttgctgacgcaacccccactggttggggcattgccaccacctgtcagctcctttccgggactttcgctttccccctccctattgccacggcggaactcatcgccgcctgccttgcccgctgctggacaggggctcggctgttgggcactgacaattccgtggtgttgtcggggaaatcatcgtcctttccttggctgctcgcctgtgttgccacctggattctgcgcgggacgtccttctgctacgtcccttcggccctcaatccagcggaccttccttcccgcggcctgctgccggctctgcggcctcttccgcgtcttcgccttcgccctcagacgagtcggatctccctttgggccgcctccccgcctAAGCTTATCGATACCGTCGAGATCTAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGGATCTCGACCTCGACTAGAGCATGGCTACGTAGATAAGTAGCATGGCGGGTTAATCATTAACTACAAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGAATTCCAGACGATTGAGCGTCAAAATGTAGGTATTTCCATGAGCGTTTTTCCTGTTGCAATGGCTGGCGGTAATATTGTTCTGGATATTACCAGCAAGGCCGATAGTTTGAGTTCTTCTACTCAGGCAAGTGATGTTATTACTAATCAAAGAAGTATTGCGACAACGGTTAATTTGCGTGATGGACAGACTCTTTTACTCGGTGGCCTCACTGATTATAAAAACACTTCTCAGGATTCTGGCGTACCGTTCCTGTCTAAAATCCCTTTAATCGGCCTCCTGTTTAGCTCCCGCTCTGATTCTAACGAGGAAAGCACGTTATACGTGCTCGTCAAAGCAACCATAGTACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTC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在某些实施例中，表达37G2抗体的重组AAV载体包含SEQ ID NO: 63的基因组核酸序列：
CAGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTTGTAGTTAATGATTAACCCGCCATGCTACTTATCTACGTAGCCATGCTCTAGGACATTGATTATTGACTAGTggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtcgaggtgagccccacgttctgcttcactctccccatctcccccccctccccacccccaattttgtatttatttattttttaattattttgtgcagcgatgggggcgggggggggggggggcgcgcgccaggcggggcggggcggggcgaggggcggggcggggcgaggcggagaggtgcggcggcagccaatcagagcggcgcgctccgaaagtttccttttatggcgaggcggcggcggcggcggccctataaaaagcgaagcgcgcggcgggcgggagtcgctgcgcgctgccttcgccccgtgccccgctccgccgccgcctcgcgccgcccgccccggctctgactgaccgcgttactaaaacaggtaagtccggcctccgcgccgggttttggcgcctcccgcgggcgcccccctcctcacggcgagcgctgccacgtcagacgaagggcgcagcgagcgtcctgatccttccgcccggacgctcaggacagcggcccgctgctcataagactcggccttagaaccccagtatcagcagaaggacattttaggacgggacttgggtgactctagggcactggttttctttccagagagcggaacaggcgaggaaaagtagtcccttctcggcgattctgcggagggatctccgtggggcggtgaacgccgatgatgcctctactaaccatgttcatgttttctttttttttctacaggtcctgggtgacgaacagGGTACCGCCACCatggcgacgggttcaagaacttccctacttcttgcatttggcctgctttgtttgccgtggttacaggagggctcggcacAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGAGGCACCTTCAGCAGCTATGCTATCACCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAGGGATCATCCCTATCTTTGGTACAGCAAACTTCGCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACGATTACCGCGGACGAATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCCCACCTAGGGGGGTTCGCTGACCCCTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAAcgaaaaagaagatcaggttcgggtgcgccagtaaagcagacattaaactttgatttgctgaaacttgcaggtgatgtagagtcaaatccaggtccaatggcaacagggagccgaacctctctgctccttgctttcgggctcctttgcctaccgtggctccaagagggctcggcaGAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAACTACTTAGCCTGGTATCAACAGAAAGCTGGCCAGGCTCCCAGGGTCCTCATCTATGATGCATTCAACAGGGCCACTGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTAGAGCCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAGCAGCGTAGCAACTGGCCTCCGCGGATCACCTTCGGCCAAGGGACACGACTGGAGATTAAAGGTCAGCCCAAGGCTGCCCCCTCGGTCACTCTGTTCCCGCCCTCCTCTGAGGAGCTTCAAGCCAACAAGGCCACACTGGTGTGTCTCATAAGTGACTTCTACCCGGGAGCCGTGACAGTGGCCTGGAAGGCAGATAGCAGCCCCGTCAAGGCGGGAGTGGAGACCACCACACCCTCCAAACAAAGCAACAACAAGTACGCGGCCAGCAGCTATCTGAGCCTGACGCCTGAGCAGTGGAAGTCCCACAGAAGCTACAGCTGCCAGGTCACGCATGAAGGGAGCACCGTGGAGAAGACAGTGGCCCCTACAGAATGTTCATAGCtctagaAtaatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactggtattcttaactatgttgctccttttacgctatgtggatacgctgctttaatgcctttgtatcatgctattgcttcccgtatggctttcattttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttatgaggagttgtggcccgttgtcaggcaacgtggcgtggtgtgcactgtgtttgctgacgcaacccccactggttggggcattgccaccacctgtcagctcctttccgggactttcgctttccccctccctattgccacggcggaactcatcgccgcctgccttgcccgctgctggacaggggctcggctgttgggcactgacaattccgtggtgttgtcggggaaatcatcgtcctttccttggctgctcgcctgtgttgccacctggattctgcgcgggacgtccttctgctacgtcccttcggccctcaatccagcggaccttccttcccgcggcctgctgccggctctgcggcctcttccgcgtcttcgccttcgccctcagacgagtcggatctccctttgggccgcctccccgcctAAGCTTATCGATACCGTCGAGATCTAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGGATCTCGACCTCGACTAGAGCATGGCTACGTAGATAAGTAGCATGGCGGGTTAATCATTAACTACAAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGAATTCCAGACGATTGAGCGTCAAAATGTAGGTATTTCCATGAGCGTTTTTCCTGTTGCAATGGCTGGCGGTAATATTGTTCTGGATATTACCAGCAAGGCCGATAGTTTGAGTTCTTCTACTCAGGCAAGTGATGTTATTACTAATCAAAGAAGTATTGCGACAACGGTTAATTTGCGTGATGGACAGACTCTTTTACTCGGTGGCCTCACTGATTATAAAAACACTTCTCAGGATTCTGGCGTACCGTTCCTGTCTAAAATCCCTTTAATCGGCCTCCTGTTTAGCTCCCGCTCTGATTCTAACGAGGAAAGCACGTTATACGTGCTCGTCAAAGCAACCATAGTACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTT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可使用所属领域中已知的任何常规方法来纯化AAV。举例来说，可通过使用密度梯度离心（例如CsCl、碘克沙醇或蔗糖梯度）和/或色谱法（例如肝素柱、阴离子交换或羟基磷灰石色谱）的分离方法，从包装细胞和/或包装细胞的上清液纯化出AAV。
在某些实施例中，包装细胞是哺乳动物细胞。在某些实施例中，包装细胞是HEK293细胞。
药物组合物和给药方法
本公开进一步提供药物组合物，其包含表达本文提供的针对SARS-CoV-2的中和抗体或其抗原结合片段的重组表达载体和一或多种药学上可接受的载体。
术语“药学上可接受的”指示，指定载体、媒剂、稀释剂、赋形剂和/或盐一般在化学上和/或物理上与构成调配物的其它成分相容，且在生理上与其接受者相容。
用于本公开的药物组合物中的药学上可接受的载体可包括但不限于例如药学上可接受的液体、凝胶或固体载剂、水性媒剂（例如氯化钠注射液、林格氏注射液、等渗葡萄糖注射液、无菌水注射液或林格氏葡萄糖和乳酸盐注射液）、非水性媒剂（例如植物来源的非挥发性油、棉籽油、玉米油、芝麻油或花生油）、抗微生物剂、等渗剂（如氯化钠或右旋糖）、缓冲液（如磷酸盐或柠檬酸盐缓冲液）、抗氧化剂（如硫酸氢钠）、麻醉剂（如盐酸普鲁卡因）、悬浮/分散剂（如羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素或聚乙烯吡咯烷酮）、螯合剂（如EDTA（乙二胺四乙酸）或EGTA（乙二醇四乙酸））、乳化剂（如聚山梨醇酯80（Tween-80））、稀释剂、佐剂、赋形剂、或无毒辅助物质、所属领域中已知的其它组分，或其各种组合。适合的组分可包括例如填充剂、结合剂、崩解剂、缓冲剂、防腐剂、润滑剂、调味剂、增稠剂、着色剂或乳化剂。
在某些实施例中，药物组合物是口服调配物。口服调配物包括但不限于胶囊、扁囊剂、丸剂、锭剂、糖衣锭（对于味道基质，通常蔗糖和阿拉伯胶或黄蓍）、粉末、粒剂、或水性或非水性溶液或悬浮液、或油包水或水包油乳液、或酏剂或糖浆、或糖果口含锭（对于惰性基料，如明胶和甘油、或蔗糖或阿拉伯胶）和/或漱口水和其类似物。
在某些实施例中，药物组合物可以是可注射调配物，包括无菌水性溶液或分散液、悬浮液或乳液。在所有情况下，可注射调配物应是无菌且应是液体以便于注射。其在制备和存储条件下应是稳定的，且应对微生物（如细菌和真菌）感染具有抗性。载体可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇（例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等）和其适合的混合物和/或植物油。可注射调配物应维持适当流动性，所述流动性可通过多种方式维持，例如使用包衣（如卵磷脂）、使用表面活性剂等。可通过添加多种抗细菌和抗真菌药剂（例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等），来实现抗微生物污染。
在某些实施例中，单位剂量的肠胃外制剂被包装在安瓿、小瓶或带针注射器中。供肠胃外给药的所有制剂均应当是无菌且无热原质的，正如所属领域中所知和实践的那样。
治疗方法
可以任何手段，包括使重组表达载体与细胞接触，来向细胞给药本公开的重组表达载体。对于这类活体外方法，可通过标准转导方法向细胞给药载体（参见例如Sambrook，见上文）。 所转导的细胞可以来源于人和其它哺乳动物，如灵长类动物、马、绵羊、山羊、猪、狗、大鼠和小鼠。可靶向的细胞类型和组织包括但不限于脂肪细胞、腺细胞、肾上腺皮质、内胎膜细胞、主动脉细胞、腹水、星形胶质细胞、膀胱细胞、骨骼细胞、骨髓细胞、脑细胞、乳房细胞、支气管细胞、中枢神经系统（CNS）细胞、心肌细胞、盲肠细胞、子宫颈细胞、绒毛膜细胞、结肠细胞、结膜细胞、结缔组织细胞、角膜细胞、真皮细胞、十二指肠细胞、子宫内膜细胞、内皮细胞、上皮组织细胞、表皮细胞、室管膜细胞、食道细胞、眼睛细胞、筋膜细胞、成纤维细胞、包皮细胞、胃细胞、神经胶质细胞、成神经胶质细胞、生殖腺细胞、肝细胞、组织细胞、回肠细胞、肠细胞、小肠细胞、空肠（jejumim）细胞、角化细胞、肾脏细胞、喉细胞、白细胞、脂肪细胞、肝脏细胞、肺细胞、淋巴结、成淋巴细胞、淋巴细胞、巨噬细胞、乳腺肺泡节结细胞、乳腺细胞、肥大细胞、上颌骨细胞、黑色素细胞、单核细胞、口腔细胞、微神经胶质细胞、髓鞘细胞、神经组织细胞、神经细胞、成神经细胞、神经元、神经胶质细胞、少突细胞、成骨细胞、骨原细胞、卵巢细胞、腭细胞、胰脏细胞、乳头状瘤细胞、外周神经系统细胞、腹膜细胞、垂体细胞、咽细胞、胎盘细胞、浆细胞、胸膜细胞、前列腺细胞、直肠细胞、唾液腺细胞、骨骼肌细胞、皮肤细胞、平滑肌细胞、躯体细胞、脾细胞、鳞状细胞、胃细胞、颌下腺体细胞、下颚腺体细胞、滑膜细胞、睾丸细胞、胸腺细胞、甲状腺细胞、骨小梁细胞、气管细胞、鼻甲细胞、脐带细胞、输尿管细胞和子宫细胞。在一优选实施例中，细胞是肌肉细胞。
在一个方面中，本公开还提供了治疗或预防个体中的SARS-CoV-2感染的方法，其包含向个体给药有效量的本文提供的重组表达载体和/或本文提供的药物组合物。
在另一方面中，本公开还提供了用于中和个体中的SARS-CoV-2的方法，其包含向个体给药本文提供的重组表达载体或本文提供的药物组合物。
在另一方面中，本公开还提供了用于预防、抑制个体中的SARS-CoV-2感染或SARS-CoV-2-相关病状的进展和/或延迟其发作的方法，其包含向个体给药有效量的本文提供的重组表达载体和/或本文提供的药物组合物。
在另一方面中，本公开还提供了用于预防或降低被SARS-CoV-2感染的个体传染SARS-CoV-2的方法，其包含向个体给药有效量的本文提供的重组表达载体和/或本文提供的药物组合物。
在一些实施例中，本公开还提供了用于降低被SARS-CoV-2感染的个体中的病毒负荷的方法，其包含向个体给药有效量的本文提供的重组表达载体和/或本文提供的药物组合物。
在某些实施例中，所述个体是人类。
在某些实施例中，所述个体是被SARS-CoV-2感染或处于其风险下的人类。SARS-CoV-2感染可包括例如呼吸道处的SARS-CoV-2感染，包括鼻腔感染、下呼吸道感染或肺感染。
在某些实施例中，所述个体是暴露于或怀疑暴露于SARS-CoV-2的人类。术语“SARS-CoV-2暴露”意指正暴露于存在或已出现SARS-CoV-2载体的环境。“SARS-CoV-2载体”是指其上或其中具有可传染的SARS-CoV-2的任何活的或无生命个体。“可传染的SARS-CoV-2”是指能够从一个活的或无生命个体扩散到另一活的或无生命个体的SARS-CoV-2。
如本文所用，术语“有效量”是指药物可显著地消除、改善或改进与疾病或异常病状有关的症状或可产生预防与疾病或异常病状有关的症状发作或甚至预防疾病或异常病状发展的所需效果的剂量。疾病或异常病状可与病毒感染，如SARS-CoV-2感染有关。有效量的本公开的重组表达载体意指，其剂量可引起消除、改善或改进与SARS-CoV-2感染症状发作有关的症状，包括但不限于发热或发冷、咳嗽、呼吸急促或呼吸困难、疲乏、肌肉或身体疼痛、头痛、新的味觉或嗅觉丧失、喉咙痛、鼻塞或流鼻涕、恶心或呕吐，和腹泻；有效量的本公开的抗体或其抗原结合片段也意指，其剂量可有效地预防SARS-CoV-2感染或有效地预防SARS-CoV-2感染症状发作。
本文提供的重组表达载体的有效量将取决于所属领域中已知的各种因素，如个体的体重、年龄、既往病史、当前药品、健康状态以及发生交叉反应的可能性、过敏、敏感性和不良副作用，以及给药途径和疾病发展程度。如由这些和其它情况或要求所指示，所属领域的技术人员（例如医生或兽医）可按比例减少或增加剂量。
在某些实施例中，给药剂量可以在治疗过程中改变。举例来说，在某些实施例中，初始给药剂量可以高于后续给药剂量。在某些实施例中，取决于个体的反应，给药剂量可以在治疗过程中改变。
可以调整给药方案以提供最优的期望反应（例如治疗反应）。举例来说，可给药单次剂量，或可随时间推移给药若干分次剂量。
在某些实施例中，可以约104个载体基因组（VG）到约1014个VG（例如约104 VG、约2×104 VG、约5×104 VG、约105 VG、约2×105 VG、约5×105 VG、约106 VG、约2×106 VG、约5×106 VG、约107 VG、约2×107 VG、约5×107 VG、约108 VG、约2×108 VG、约5×108 VG、约109VG、约2×109 VG、约5×109 VG、约1010 VG、约2×1010 VG、约5×1010 VG、约1011 VG、约2×1011 VG、约5×1011 VG、约1012 VG、约2×1012 VG、约5×1012 VG、约1013 VG、约2×1013 VG、约5×1013 VG或约1014 VG）的治疗有效剂量，给药重组表达载体和药物组合物。在这些实施例的某些中，以约8×1011个VG或更小的剂量，给药重组表达载体和药物组合物。在这些实施例的某些中，剂量是5×1011个VG或更小、4×1011个VG或更小、3×1011个VG或更小、2×1011个VG或更小、1×1011个VG或更小、5×1010个VG或更小、4×1010个VG或更小、3×1010个VG或更小、2×1010个VG或更小、1010个VG或更小、5×109个VG或更小、4×109个VG或更小、3×109个VG或更小、2×109个VG或更小、109个VG或更小。特定剂量可进行分次且以一定间隔分开进行多次给药，所述间隔例如每天一次、每天两次或更多、每月两次或更多、每周一次、每两周一次、每三周一次、一月一次、每两个月一次、每三个月一次、每四个月一次、每五个月一次、每六个月或更久一次。在某些实施例中，给药剂量可以在治疗过程中改变。举例来说，在某些实施例中，最初给药剂量可高于随后给药剂量。在某些实施例中，取决于给药个体的反应，在治疗过程中调整给药剂量。
可以调整给药方案以提供最优的期望反应（例如治疗反应）。举例来说，可给药单次剂量，或可随着时间推移给药若干分次剂量。
本文提供的重组表达载体可以通过所属领域中已知的任何途径给药，例如肠胃外（例如，皮下、腹膜内、静脉内（包括静脉内输注）、肌肉内、阴道内、上表皮、经皮或皮内注射）或非肠胃外（例如口服、鼻内、经粘膜、眼内、舌下、经直肠或局部）途径。在某些实施例中，给药途径是肌肉内注射。
组合
在一些实施例中，可单独或与治疗有效量的第二治疗剂组合给药本文提供的重组表达载体。举例来说，本文中公开的重组表达载体可与第二治疗剂组合给药，所述第二治疗剂可以是例如抗病毒剂，如表达第二SARS-CoV-2中和抗体的第二重组表达载体、第二SARS-CoV-2中和抗体、RNA依赖性RNA聚合酶抑制剂、核苷类似物、抗病毒细胞因子（如干扰素）、免疫刺激剂和其它抗病毒剂。
在这些实施例的某些中，与一或多种额外治疗剂组合给药的本文提供的重组表达载体可与所述一或多种额外治疗剂同时给药，且在这些实施例的某些中，重组表达载体和所述额外治疗剂可作为同一药物组合物的一部分给药。然而，与另一治疗剂“组合”给药的重组表达载体不必与该治疗剂同时给药或与治疗剂在同一组合物中给药。在另一治疗剂之前或之后给药的重组表达载体被认为与所述治疗剂“组合”给药，如本文中所使用的短语，即使重组表达载体和第二治疗剂是通过不同途径给药的。当可能时，根据额外治疗剂的产品信息表中列出的时间表，或根据《医师案头参考2003（Physicians' Desk Reference2003）》（《医师案头参考（Physicians' Desk Reference）》，第57版；医学经济公司（MedicalEconomics Company）；ISBN：1563634457；第57版（2002年11月））或所属领域中熟知的方案，来给药与本文中公开的重组表达载体组合给药的额外治疗剂。
试剂盒
在某些实施例中，本公开提供了一种试剂盒，其包含本文提供的重组表达载体和/或本文提供的药物组合物。在某些实施例中，本公开提供了一种试剂盒，其包含本文提供的重组表达载体和第二治疗剂。第二治疗剂可以是抗病毒剂，如第二SARS-CoV-2中和抗体、表达第二SARS-CoV-2中和抗体的第二重组表达载体、RNA依赖性RNA聚合酶抑制剂、核苷类似物、抗病毒细胞因子（如干扰素）、免疫刺激剂，和其它抗病毒剂。
在某些实施例中，第二治疗剂选自由以下组成的群组：伊佛霉素（Ivermectin）、克拉瑞（Colcrys）（秋水仙碱）、阿韦甘（Avigan）（法匹拉韦（favipiravir））和其它抗病毒药物、特敏福（Tamiflu）（奥司他韦（oseltamivir））、卡乐翠（Kaletra）（洛匹那韦（lopinavir）/利托那韦（ritonavir））、安挺乐（Actemra）（托西利单抗（tocilizumab））、康复血浆、阿奇霉素（Azithromycin）、羟化氯喹和氯喹、地塞米松（Dexamethasone）、瑞美德韦（Remdesivir）、氟伏沙明（Fluvoxamine）、贝伐单抗（Bevacizumab）、赛瑞单抗（sarilumab）、托西利单抗（Tocilizumab）、皮质类固醇、硝唑尼特（Nitazoxanide）、优米弗韦（Umifenovir）、法莫替丁（Famotidine）、卡莫司他（camostat）和萘莫司他（Nafamostat）。
必要时，这类试剂盒可进一步包括一或多种各种常规药物试剂盒组分，例如具有一或多种药学上可接受的载体的容器、额外容器等，如将对所属领域的技术人员显而易见的。试剂盒中还可以包括作为插入物或标签的说明书，指示待给药的组分的量、给药指南和/或将组分混合的指南。
在另一方面中，本公开提供了试剂盒，其包含本文提供的重组表达载体和/或本文提供的药物组合物，任选地具有适用于检测SARS-CoV-2病毒的可检测实体。试剂盒可进一步包含使用说明书。
医学使用
在另一方面中，本公开还提供了一种本文提供的重组表达载体和/或本文提供的药物组合物在制备用于治疗或预防个体中的SARS-CoV-2感染；或用于预防、抑制个体中的SARS-CoV-2感染或SARS-CoV-2相关病状的进展和/或延迟其发作；或用于预防或降低感染SARS-CoV-2的个体传染SARS-CoV-2；或用于降低感染SARS-CoV-2的个体中的病毒负荷的药物的用途。
在另一方面中，本公开还提供了一种本文提供的重组表达载体和/或本文提供的药物组合物在制备用于诊断SARS-CoV-2感染的诊断试剂的用途。
提供以下实例是为了更好地说明所要求的发明，而不应理解为限制本发明的范围。以下描述的所有特定组合物、材料和方法完全或部分地在本发明的范围内。这些特定组合物、材料和方法不打算限制本发明，而仅说明在本发明的范围内的特定实施例。在不脱离本发明范围的情况下，所属领域的技术人员无需履行发明能力即可开发出等效组合物、材料和方法。应理解，可对本文所描述的程序作出许多变化，但仍在本发明的界限内。本发明人打算将这类变化形式包括在本发明的范围内。
实例
实例1：抗SARS-CoV-2中和抗体
材料和方法
人类样品
从拉瓦尔大学的大学医院中心（Centre Hospitalier Universitaire ofUniversité Laval；CHU-Université Laval），采集来自健康对照供体的外周血液单核细胞（Peripheral blood mononuclear cell；PBMC），而来自COVID-19存活者的PBMC获自多伦多（Toronto）的森尼布鲁克医院（SunnyBrook Hospital）。在样品采集之前从两个机构获得伦理委员会的伦理批准，且所有参与者签署个人知情同意书。
荧光细胞分选
根据制造商的说明书，使用EZ-Link™磺基-NHS-生物素（加拿大伯林顿（Burlington, Canada）的赛默飞世尔科学（ThermoFisher scientific））将SARS-CoV-2病毒样颗粒（VLP）（加拿大魁北克（Quebec, Canada）的美的卡歌（Medicago））生物素化。
在使用1 μg生物素化的SARS-CoV-2 VLP染色之前，将来自COVID-19存活者的PBMC解冻且静置30分钟。随后，样品使用存活力染料（可固定的存活力染料eFluor，赛默飞世尔）、A488偶联的抗生蛋白链菌素（加利福尼亚州圣何塞（San Jose, CA）的百进生技（Biolegend））和针对CD14（M5E2）、CD3（SP34-2）、CD19（HIB19）、IgG（G18-145）和IgM（G20-127）的谱系标记（全部均来自BD生物科学（BD Biosciences）（加利福尼亚州圣何塞））的组合进行染色。在广泛洗涤样品之后，使用FACSARIA融合物（BD生物科学）分别分选SARS-CoV-2特异性B细胞。使用如先前所描述的饲养细胞，培养分选的B细胞2周（Cox等人 《单克隆抗体（mAbs）》 8:1, 129-140; 2016）。从SARS-CoV-2特异性B细胞培养物采集上清液和细胞用于进一步分析。
SARS-CoV-2特异性酶联免疫吸附分析（Enzyme-linked immunosorbent assay； ELISA）
用100 ng SARS-CoV-2 VLP（美的卡歌）涂布96孔板的各孔隔夜。在用PBS、5%牛奶广泛洗涤和阻断之后，将各孔与培养物上清液一起在37℃下培育1小时。在额外洗涤之后，将各孔与15 ng辣根过氧化酶（HRP）结合的山羊抗人IgG（加拿大圭尔夫（Guelph, Canada）的曼德尔科学（Mandel scientific））一起培育。在最后一组洗涤之后，将各孔与2,2'-连氮基双[3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸]-二铵盐（ABTS）底物（曼德尔科学）一起培育，且读取405nm下的吸光度。
抗体序列的回收
如先前所描述获得抗体序列（Cox等人《单克隆抗体》 8:1, 129-140; 2016）。按照制造商的说明书，用凯杰（Qiagen）RNeasy微小试剂盒（凯杰）从单细胞分选的B细胞培养物提取RNA。使用凯杰一步RT-PCR试剂盒（凯杰，目录号：210212）扩增人抗体基因。基于公开的集合（参见Smith等人, 快速产生对接种抗原具有特异性的完全人单克隆抗体（Rapidgeneration of fully human monoclonal antibodies specific to a vaccinatingantigen）. Nat Proto 2009; 4:372-84）设计RT-PCR引物。RT-PCR产物用作用于用英杰（Invitrogen）pfx50 DNA聚合酶扩增抗体可变区的嵌套式PCR中的模板，正向和反向嵌套式PCR引物的设计是基于如前所描述的在人IgG重链和轻链可变区的构架1区开始处的序列（参见Collarini等人, 用于治疗和预防来源于感染患者的B细胞的呼吸道合胞病毒的强效高亲和力抗体（Potent high-affinity antibodies for treatment and prophylaxis ofrespiratory syncytial virus derived from B cells of infected patients）. 《免疫学杂志》 2009; 183:6338-45）。随后，嵌套式PCR产物用作用于将抗体轻链和重链PCR产物与连接子序列连接的重叠PCR中的模板，且用输注HD克隆试剂盒（克隆科技公司（Clontech），目录号：639649）克隆到质粒载体中以用于测序。
SARS-CoV-2中和分析
使用HEK293瞬时表达系统（北京义翘神州生物科技有限公司（Sino Biological））以重组方式表达呈IgG1形式的测试抗体以用于进一步分析。将Vero-E6细胞接种在具有补充有10%胎牛血清的DMEM（吉毕科（Gibco））的96孔细胞培养板（20,000个细胞每孔）中，且在37℃下生长隔夜。将具有指示浓度的抗体与100 TCID50 SARS-CoV-2混合。将混合物移到含有Vero-E6细胞的孔中且在37℃下培育1小时。在去除上清液之后，添加200 μL细胞培养基且随后在37℃与5% CO2下培育培养板3天。用结晶紫对细胞进行染色，且测量570 nm/630nm下的吸光度。中和定义为与阳性对照相比的百分比降低。使用GraphPad Prism 7中的非线性回归分析，计算两个重复的中和效价。
S蛋白-特异性ELISA
用0.1或1 μg/mL的SARS-CoV-2 S、S1或RBD蛋白（北京义翘神州生物科技有限公司）涂布聚苯乙烯微板（康宁（Corning））隔夜。在用含有0.2% Tween 20的PBS洗涤之后，使用2% BSA（西格玛阿尔德里奇（Sigma Aldrich））在PBST中在37℃下阻断培养板1小时。在用PBST洗涤之后，将测试抗体（1 μg/mL）添加到各孔中且在37℃下培育1小时。在用PBST洗涤之后，添加以1:5000稀释的HRP结合的山羊抗人IgG抗体且在37℃下培育1小时。在洗涤之后，将3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB）底物溶液添加到微量板，且在室温下培育6 min，随后添加2M H2SO4以终止反应。检测450 nm下的吸光度。
实例2：抗体的表征
在通过SARS-CoV-2特异性结合分析（数据未显示）筛选所有获得的抗体之后，获得三种最好的抗体（即，37G2、31C2和15A7），这三种抗体在我们筛选的众多抗体中表现出了最为优异的结合亲和性。图1中显示三种抗体的SARS-CoV-2特异性结合活性。对抗体的CDR区进行测序且在表1中列出。据申请人所知，含有如表1中所列CDR的SARS-CoV-2抗体之前并未报道过，因此，本申请提供了全新的SARS-CoV-2抗体，为对抗SARS-CoV-2疫情提供了更多的选择。
以重组方式表达这3种抗体且使用活病毒在Vero-E6细胞中进行活体外中和分析。如图2中所示出，所有抗体呈现明显的针对SARS-CoV-2感染的中和能力。计算出的37G2、31C2和15A7的EC50分别是1.37、0.57和0.61 μg/mL。
我们测试抗体与刺突蛋白（S蛋白）、S1亚基和RBD结构域的结合特性。如图3中所示，15A7与S蛋白、S1亚基和RBD结构域结合，表明抗体15A7阻断SARS-CoV-2与ACE2之间的相互作用。另外两种抗体37G2和31C2与S蛋白结合，但不与S1亚基或RBD结构域结合，表明其结合位点可能在S蛋白的S2亚基上。
实例3：AAV介导的抗体基因递送
实验设计成测试AAV介导的抗体基因转移防止小鼠中发生SARS-CoV-2病毒攻击的效果。
AAV-mAb载体构筑
抗体表达盒制备：单克隆抗体表达盒通过金斯瑞（Genscript）合成且含有信号肽、可变重链结构域、人IgG1恒定结构域、之后2A自我裂解肽序列、信号肽、可变轻链结构域和人λ恒定结构域。抗体重链和轻链核酸序列通过金斯瑞进行了密码子优化。各抗体表达盒通过PCR，使用Taq聚合酶进行扩增，且PCR产物进行凝胶纯化，且使用凝胶提取试剂盒切下所关注的条带并进行纯化。
AAV载体制备：pAVA-00200质粒主链含有CASI启动子（Alejandro B. Balazs等人，通过载体化免疫防治针对HIV感染进行基于抗体的防护（Antibody-based ProtectionAgainst HIV Infection by Vectored ImmunoProphylaxis）. 《自然》. 2012年1月5日;481(7379): 81-84.）、多克隆位点（MCS）、土拔鼠肝炎病毒转录后调控元件（WPRE）、猴病毒40（SV40）聚腺苷酸化（polyA）序列，全部均侧接AAV2反向末端重复序列（ITR）。pAVA-00200用限制性内切酶KpnI和XbaI对MCS进行剪切且用1%琼脂糖凝胶分离。切下所关注的条带且使用凝胶提取试剂盒进行纯化。
AAV-mAb载体制备：除与线性化的pAVA-00200主链的末端对准的15个碱基对的5'和3'突出端外，这些PCR产物含有抗体表达盒。使用无缝克隆（in-fusion cloning）（AndreaL. Throop等人，使用门途径和无缝克隆方案进行重组克隆（Recombinational CloningUsing Gateway and In-Fusion Cloning Schemes）. 《当前分子生物学方案（Curr ProtocMol Biol.）》 2015; 110: 3.20.1-3.20.23.），通过同源重组将已扩增的抗体表达盒与pAVA-00200主链整合在一起。所得质粒含有以下：5' ITR、CASI启动子、单克隆抗体表达盒、WPRE、SV40 polyA和ITR 3'。
重组mAb表达AAV载体的繁殖、包装和纯化：如上文所描述制备编码15A7和FVM04的可变重链和轻链的AAV-mAb载体基因组。AAV基因组和包装质粒在SURE® 2（安捷伦）大肠杆菌菌株中繁殖。通过用基因组和包装质粒共转染HEK293细胞制造AAV载体。通过肝素柱来纯化用AAV6.2FF假型化的载体（参见已公开的美国申请US 20190216949）。通过定量PCR测定AAV载体效价。
在人hACE2转导的小鼠中AAV6.2FF-15A7针对真实的SARS-CoV-2的防护效果
对6-8周龄BALB/c小鼠鼻内给药1×1011个载体基因组（VG）的AAV6.2FF-人ACE2（其表达人ACE2），使动物容易发生SARS-CoV-2感染。同时，对动物肌肉内注射8×1011个VG的AAV6.2FF-15A7（SEQ ID NO: 61）或AAV6.2FF-FVM04载体（根据上文所描述的方法所制备）。值得注意的是，抗体15A7结合SARS-CoV-2 S蛋白（spike protein），而FVM04是一种埃博拉病毒（Ebola virus）抗体且用作阴性对照。通过在给药抗体AAV载体的第0、14、28和42天隐静脉采血收集血液样品，且使用市售试剂盒（艾博抗（Abcam）195215）针对人IgG表达进行分析（参见图4）。汇集在第42天来自各群组中的所有小鼠的血清，以用于测试与SARS-CoV-2 S蛋白（来自义翘神州生物技术有限公司（SinoBiological）的S蛋白S1+S2 ECD-His重组蛋白）的结合，和使用来自金斯瑞的SARS-CoV-2假病毒中和测试（sVNT）试剂盒（RUO）来测定中和效能。进行SARS-CoV-2特异性酶联免疫吸附分析（ELISA）（参见表4和表5）。
表4. 所汇集血清与SARS-Cov-2 S蛋白的结合亲和力
Figure 921394DEST_PATH_IMAGE005
表5. 所汇集血清的中和效能
Figure 275015DEST_PATH_IMAGE006
在载体给药八周之后，将小鼠运送到加拿大公共卫生机构（Public HealthAgency of Canada），且通过鼻内途径用体积为50 µL的105个TCID50的SARS-CoV-2（SARS-CoV-2；hCoV- 19/Canada/ON-VIDO-01/2020, GISAID登记号EPI_ISL_425177）刺激。在整个实验过程中，对小鼠称重且每天监测感染的临床症状。攻击4天后处死各组小鼠，且收集肺以通过TCID50定量SARS-CoV-2。
对于TCID50分析，将肺组织样品解冻，称重，随后浸没在1 ml补充有1%热灭活FBS、1× L-谷氨酰胺和2×青霉素-链霉素的MEM中。随后在Bead Ruptor Elite珠磨机均质器（奥美国际（Omni International））中用不锈钢珠以4 m/s持续30秒使样品均质化，随后通过以1500 x g离心6分钟澄清。将组织匀浆以10倍连续稀释于相同培养基中。将一百微升体积的已稀释样品添加到具有95%汇合猴肾细胞的96孔板中，三个重复，且在37℃与5% CO2下培育5天。在感染五天之后，针对细胞病变效应的存在，对各孔进行评分（参见图5）。
基于如上所述的抗体针对SARS-CoV-2特异性结合活性、针对SARS-CoV-2感染的中和能力以及能够表达上述抗体的载体的实验数据，申请人认为本申请的重组表达载体具有较优异的活性，具有开发成药品的潜力以及大规模生产的应用前景。
本文中所公开或所要求保护的所有组合物和方法均可根据本公开在无过度实验的情况下作出和执行。虽然本发明的组合物和方法已结合优选实施例描述，但是对于所属领域的技术人员显而易见的是，可以对方法和本文所描述的方法中的步骤或步骤顺序进行变更而这些变更不脱离本发明的概念、精神和范围。更具体地说，显而易见的是，在化学上和生理学上相关的某些药剂可以取代本文中所描述的药剂，同时实现相同或相似的结果。对所属领域的技术人员显而易见的是，所有这类类似取代和修改视为在由所附权利要求书限定的本发明的精神、范围和概念内。
序列表
<110> 恒翼生物医药科技（上海）有限公司
<120> 抗SARS-COV-2中和抗体的表达载体
<130> 072176-8025CN01
<160> 63
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Asp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Ser Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Met Asn Pro Asn Ser Ala Asn Pro Gly Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asn Thr Ser Ile Ser Thr Ala Phe
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Arg Val Thr Ile His Tyr Asp Ile Leu Thr Gly Tyr Tyr
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Ser Asn Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Ala Val Ser
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Ser
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<213> 智人
<220>
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Thr Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ala Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
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<213> 智人
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tcctgcaagg cttctggata caccttcacc agttatgata tcaactgggt gcgacaggcc 120
tctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atgaacccta acagtgctaa cccaggctat 180
gcacagaagt tccagggcag agtcaccatg accaggaaca cctccataag cacagccttc 240
atggagctga gcagcctgag atctgacgac acggccgtgt attactgtgc gagagcccga 300
gtaactatac attacgatat tttgactggt tattattcga atgcttttga tatctggggc 360
caagggacaa tggtcgccgt ctcttca 387
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aggttcagtg gcagtggatc tggggcagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240
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caggggacca tgctggagat caaa 324
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Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
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65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro
85 90 95
Gln Glu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 19
<211> 366
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> 31C2 VH
<222> (1)..(366)
<400> 19
caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcgtc ggtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc agctatgcta tcagctgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggaggg atcatcccta tctttggtac aacaaactac 180
gcacagaagt tccagggcag agtcacgatt accgcggacg aatccacgag cacagcctac 240
atggagctga acagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gggacgttcg 300
gcctacggtg ataaagggta ctactttgat tactggggcc agggaaccct ggtcaccgtc 360
tcctca 366
<210> 20
<211> 327
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> 31C2 VL
<222> (1)..(327)
<400> 20
gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc aacttcttag cctggtatca acagaaacct 120
ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccaaca gggccactgg catcccagcc 180
aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctacagcct 240
gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag cgtagcaact ggcctccgca agagacgttc 300
ggccaaggga ccaaggtgga aatcaaa 327
<210> 21
<211> 5
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 37G2 HCDR1
<222> (1)..(5)
<400> 21
Ser Tyr Ala Ile Thr
1 5
<210> 22
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 37G2 HCDR2
<222> (1)..(17)
<400> 22
Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Phe Ala Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 23
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 37G2 HCDR3
<222> (1)..(10)
<400> 23
Leu Gly Gly Phe Ala Asp Pro Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 24
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 37G2 LCDR1
<222> (1)..(11)
<400> 24
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 25
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 37G2 LCDR2
<222> (1)..(7)
<400> 25
Asp Ala Phe Asn Arg Ala Thr
1 5
<210> 26
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 37G2 LCDR3
<222> (1)..(11)
<400> 26
Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro Arg Ile Thr
1 5 10
<210> 27
<211> 119
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 37G2 VH
<222> (1)..(119)
<400> 27
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Phe Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala His Leu Gly Gly Phe Ala Asp Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 28
<211> 109
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 37G2 VL
<222> (1)..(109)
<400> 28
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Ala Gly Gln Ala Pro Arg Val Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Phe Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro
85 90 95
Arg Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 29
<211> 357
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> 37G2 VH
<222> (1)..(357)
<400> 29
caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc agctatgcta tcacctgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggaggg atcatcccta tctttggtac agcaaacttc 180
gcacagaagt tccagggcag agtcacgatt accgcggacg aatccacgag cacagcctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc ccacctaggg 300
gggttcgctg acccctttga ctactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctca 357
<210> 30
<211> 327
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> 37G2 VL
<222> (1)..(327)
<400> 30
gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc aactacttag cctggtatca acagaaagct 120
ggccaggctc ccagggtcct catctatgat gcattcaaca gggccactgg catcccagcc 180
aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 240
gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag cgtagcaact ggcctccgcg gatcaccttc 300
ggccaaggga cacgactgga gattaaa 327
<210> 31
<211> 15
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> 15A7 HCDR1
<222> (1)..(15)
<400> 31
agttatgata tcaac 15
<210> 32
<211> 51
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> 15A7 HCDR2
<222> (1)..(51)
<400> 32
tggatgaacc ctaacagtgc taacccaggc tatgcacaga agttccaggg c 51
<210> 33
<211> 60
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> 15A7 HCDR3
<222> (1)..(60)
<400> 33
gcccgagtaa ctatacatta cgatattttg actggttatt attcgaatgc ttttgatatc 60
<210> 34
<211> 33
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> 15A7 LCDR1
<222> (1)..(33)
<400> 34
cgggcaagtc agaccattag cagctattta aat 33
<210> 35
<211> 21
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> 15A7 LCDR2
<222> (1)..(21)
<400> 35
gctgcatcca gtttgcaaag t 21
<210> 36
<211> 30
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> 15A7 LCDR3
<222> (1)..(30)
<400> 36
caacagagtt acactacctt catgtacact 30
<210> 37
<211> 329
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 人IgG1恒定区
<222> (1)..(329)
<400> 37
Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser
1 5 10 15
Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe
20 25 30
Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly
35 40 45
Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu
50 55 60
Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr
65 70 75 80
Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys
85 90 95
Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
100 105 110
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
115 120 125
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
130 135 140
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
145 150 155 160
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
165 170 175
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
180 185 190
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
195 200 205
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
210 215 220
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
225 230 235 240
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
245 250 255
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
260 265 270
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
275 280 285
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
290 295 300
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
305 310 315 320
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325
<210> 38
<211> 987
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> IgG1恒定区
<222> (1)..(987)
<400> 38
agcaccaagg gcccatcggt cttccccctg gcaccctcct ccaagagcac ctctgggggc 60
acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg 120
aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga 180
ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca gcttgggcac ccagacctac 240
atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagaaagt tgagcccaaa 300
tcttgtgaca aaactcacac atgcccaccg tgcccagcac ctgaactcct ggggggaccg 360
tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag 420
gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac 480
gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc 540
acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag 600
tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa 660
gccaaagggc agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatcccg ggaggagatg 720
accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc 780
gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 840
gactccgacg gctccttctt cctctacagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag 900
caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag 960
aagagcctct ccctgtctcc gggtaaa 987
<210> 39
<211> 15
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> 31C2 HCDR1
<222> (1)..(15)
<400> 39
agctatgcta tcagc 15
<210> 40
<211> 51
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> 31C2 HCDR2
<222> (1)..(51)
<400> 40
gggatcatcc ctatctttgg tacaacaaac tacgcacaga agttccaggg c 51
<210> 41
<211> 39
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> 31C2 HCDR3
<222> (1)..(39)
<400> 41
cgttcggcct acggtgataa agggtactac tttgattac 39
<210> 42
<211> 33
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> 31C2 LCDR1
<222> (1)..(33)
<400> 42
agggccagtc agagtgttag caacttctta gcc 33
<210> 43
<211> 21
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> 31C2 LCDR2
<222> (1)..(21)
<400> 43
gatgcatcca acagggccac t 21
<210> 44
<211> 33
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> 31C2 LCDR3
<222> (1)..(33)
<400> 44
cagcagcgta gcaactggcc tccgcaagag acg 33
<210> 45
<211> 106
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 人lambda链恒定区
<222> (1)..(106)
<400> 45
Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser
1 5 10 15
Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp
20 25 30
Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro
35 40 45
Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn
50 55 60
Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys
65 70 75 80
Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val
85 90 95
Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
100 105
<210> 46
<211> 321
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> 人Lambda恒定区
<222> (1)..(321)
<400> 46
ggtcagccca aggctgcccc ctcggtcact ctgttcccgc cctcctctga ggagcttcaa 60
gccaacaagg ccacactggt gtgtctcata agtgacttct acccgggagc cgtgacagtg 120
gcctggaagg cagatagcag ccccgtcaag gcgggagtgg agaccaccac accctccaaa 180
caaagcaaca acaagtacgc ggccagcagc tatctgagcc tgacgcctga gcagtggaag 240
tcccacagaa gctacagctg ccaggtcacg catgaaggga gcaccgtgga gaagacagtg 300
gcccctacag aatgttcata g 321
<210> 47
<211> 15
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> 37G2 HCDR1
<222> (1)..(15)
<400> 47
agctatgcta tcacc 15
<210> 48
<211> 51
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> 37G2 HCDR2
<222> (1)..(51)
<400> 48
gggatcatcc ctatctttgg tacagcaaac ttcgcacaga agttccaggg c 51
<210> 49
<211> 30
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> 37G2 HCDR3
<222> (1)..(30)
<400> 49
ctaggggggt tcgctgaccc ctttgactac 30
<210> 50
<211> 33
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> 37G2 LCDR1
<222> (1)..(33)
<400> 50
agggccagtc agagtgttag caactactta gcc 33
<210> 51
<211> 21
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> 37G2 LCDR2
<222> (1)..(21)
<400> 51
gatgcattca acagggccac t 21
<210> 52
<211> 33
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> 37G2 LCDR3
<222> (1)..(33)
<400> 52
cagcagcgta gcaactggcc tccgcggatc acc 33
<210> 53
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> ITR1
<222> (1)..(130)
<400> 53
ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60
ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact 120
aggggttcct 130
<210> 54
<211> 128
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> ITR2
<222> (1)..(128)
<400> 54
aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60
ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc 120
gagcgcgc 128
<210> 55
<211> 1055
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> CASI启动子
<222> (1)..(1055)
<400> 55
ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc ccaacgaccc 60
ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag ggactttcca 120
ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta aactgcccac ttggcagtac atcaagtgta 180
tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg cctggcatta 240
tgcccagtac atgaccttat gggactttcc tacttggcag tacatctacg tattagtcat 300
cgctattacc atggtcgagg tgagccccac gttctgcttc actctcccca tctccccccc 360
ctccccaccc ccaattttgt atttatttat tttttaatta ttttgtgcag cgatgggggc 420
gggggggggg gggggcgcgc gccaggcggg gcggggcggg gcgaggggcg gggcggggcg 480
aggcggagag gtgcggcggc agccaatcag agcggcgcgc tccgaaagtt tccttttatg 540
gcgaggcggc ggcggcggcg gccctataaa aagcgaagcg cgcggcgggc gggagtcgct 600
gcgcgctgcc ttcgccccgt gccccgctcc gccgccgcct cgcgccgccc gccccggctc 660
tgactgaccg cgttactaaa acaggtaagt ccggcctccg cgccgggttt tggcgcctcc 720
cgcgggcgcc cccctcctca cggcgagcgc tgccacgtca gacgaagggc gcagcgagcg 780
tcctgatcct tccgcccgga cgctcaggac agcggcccgc tgctcataag actcggcctt 840
agaaccccag tatcagcaga aggacatttt aggacgggac ttgggtgact ctagggcact 900
ggttttcttt ccagagagcg gaacaggcga ggaaaagtag tcccttctcg gcgattctgc 960
ggagggatct ccgtggggcg gtgaacgccg atgatgcctc tactaaccat gttcatgttt 1020
tctttttttt tctacaggtc ctgggtgacg aacag 1055
<210> 56
<211> 78
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> HGH信号肽
<222> (1)..(78)
<400> 56
atggcgacgg gttcaagaac ttccctactt cttgcatttg gcctgctttg tttgccgtgg 60
ttacaggagg gctcggca 78
<210> 57
<211> 96
<212> DNA
<213> 口蹄疫病毒
<220>
<221> F2A
<222> (1)..(96)
<400> 57
cgaaaaagaa gatcaggttc gggtgcgcca gtaaagcaga cattaaactt tgatttgctg 60
aaacttgcag gtgatgtaga gtcaaatcca ggtcca 96
<210> 58
<211> 78
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> HGH信号肽变体
<222> (1)..(78)
<400> 58
atggcaacag ggagccgaac ctctctgctc cttgctttcg ggctcctttg cctaccgtgg 60
ctccaagagg gctcggca 78
<210> 59
<211> 589
<212> DNA
<213> 乙肝病毒
<220>
<221> WPRE
<222> (1)..(589)
<400> 59
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaaatcat cgtcctttcc ttggctgctc 420
gcctgtgttg ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgc 589
<210> 60
<211> 135
<212> DNA
<213> SV40
<220>
<221> SV40 Poly A
<222> (1)..(135)
<400> 60
aacttgttta ttgcagctta taatggttac aaataaagca atagcatcac aaatttcaca 60
aataaagcat ttttttcact gcattctagt tgtggtttgt ccaaactcat caatgtatct 120
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<223> 合成的
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<212> DNA
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<223> 合成的
<220>
<221> pACASI-31C2 基因组
<222> (1)..(8116)
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ttgtttgctc cagactctca ggcaatgacc tgatagcctt tgtagagacc tctcaaaaat 5520
agctaccctc tccggcatga atttatcagc tagaacggtt gaatatcata ttgatggtga 5580
tttgactgtc tccggccttt ctcacccgtt tgaatcttta cctacacatt actcaggcat 5640
tgcatttaaa atatatgagg gttctaaaaa tttttatcct tgcgttgaaa taaaggcttc 5700
tcccgcaaaa gtattacagg gtcataatgt ttttggtaca accgatttag ctttatgctc 5760
tgaggcttta ttgcttaatt ttgctaattc tttgccttgc ctgtatgatt tattggatgt 5820
tggaattcct gatgcggtat tttctcctta cgcatctgtg cggtatttca caccgcatat 5880
ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg ccgcatagtt aagccagccc cgacacccgc 5940
caacacccgc tgacgcgccc tgacgggctt gtctgctccc ggcatccgct tacagacaag 6000
ctgtgaccgt ctccgggagc tgcatgtgtc agaggttttc accgtcatca ccgaaacgcg 6060
cgagacgaaa gggcctcgtg atacgcctat ttttataggt taatgtcatg ataataatgg 6120
tttcttagac gtcaggtggc acttttcggg gaaatgtgcg cggaacccct atttgtttat 6180
ttttctaaat acattcaaat atgtatccgc tcatgagaca ataaccctga taaatgcttc 6240
aataatattg aaaaaggaag agtatgagta ttcaacattt ccgtgtcgcc cttattccct 6300
tttttgcggc attttgcctt cctgtttttg ctcacccaga aacgctggtg aaagtaaaag 6360
atgctgaaga tcagttgggt gcacgagtgg gttacatcga actggatctc aacagcggta 6420
agatccttga gagttttcgc cccgaagaac gttttccaat gatgagcact tttaaagttc 6480
tgctatgtgg cgcggtatta tcccgtattg acgccgggca agagcaactc ggtcgccgca 6540
tacactattc tcagaatgac ttggttgagt actcaccagt cacagaaaag catcttacgg 6600
atggcatgac agtaagagaa ttatgcagtg ctgccataac catgagtgat aacactgcgg 6660
ccaacttact tctgacaacg atcggaggac cgaaggagct aaccgctttt ttgcacaaca 6720
tgggggatca tgtaactcgc cttgatcgtt gggaaccgga gctgaatgaa gccataccaa 6780
acgacgagcg tgacaccacg atgcctgtag caatggcaac aacgttgcgc aaactattaa 6840
ctggcgaact acttactcta gcttcccggc aacaattaat agactggatg gaggcggata 6900
aagttgcagg accacttctg cgctcggccc ttccggctgg ctggtttatt gctgataaat 6960
ctggagccgg tgagcgtggg tctcgcggta tcattgcagc actggggcca gatggtaagc 7020
cctcccgtat cgtagttatc tacacgacgg ggagtcaggc aactatggat gaacgaaata 7080
gacagatcgc tgagataggt gcctcactga ttaagcattg gtaactgtca gaccaagttt 7140
actcatatat actttagatt gatttaaaac ttcattttta atttaaaagg atctaggtga 7200
agatcctttt tgataatctc atgaccaaaa tcccttaacg tgagttttcg ttccactgag 7260
cgtcagaccc cgtagaaaag atcaaaggat cttcttgaga tccttttttt ctgcgcgtaa 7320
tctgctgctt gcaaacaaaa aaaccaccgc taccagcggt ggtttgtttg ccggatcaag 7380
agctaccaac tctttttccg aaggtaactg gcttcagcag agcgcagata ccaaatactg 7440
tccttctagt gtagccgtag ttaggccacc acttcaagaa ctctgtagca ccgcctacat 7500
acctcgctct gctaatcctg ttaccagtgg ctgctgccag tggcgataag tcgtgtctta 7560
ccgggttgga ctcaagacga tagttaccgg ataaggcgca gcggtcgggc tgaacggggg 7620
gttcgtgcac acagcccagc ttggagcgaa cgacctacac cgaactgaga tacctacagc 7680
gtgagctatg agaaagcgcc acgcttcccg aagggagaaa ggcggacagg tatccggtaa 7740
gcggcagggt cggaacagga gagcgcacga gggagcttcc agggggaaac gcctggtatc 7800
tttatagtcc tgtcgggttt cgccacctct gacttgagcg tcgatttttg tgatgctcgt 7860
caggggggcg gagcctatgg aaaaacgcca gcaacgcggc ctttttacgg ttcctggcct 7920
tttgctggcc ttttgctcac atgttctttc ctgcgttatc ccctgattct gtggataacc 7980
gtattaccgc ctttgagtga gctgataccg ctcgccgcag ccgaacgacc gagcgcagcg 8040
agtcagtgag cgaggaagcg gaagagcgcc caatacgcaa accgcctctc cccgcgcgtt 8100
ggccgattca ttaatg 8116
<210> 63
<211> 8105
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> pACASI-37G2 基因组
<222> (1)..(8105)
<400> 63
cagcagctgc gcgctcgctc gctcactgag gccgcccggg caaagcccgg gcgtcgggcg 60
acctttggtc gcccggcctc agtgagcgag cgagcgcgca gagagggagt ggccaactcc 120
atcactaggg gttccttgta gttaatgatt aacccgccat gctacttatc tacgtagcca 180
tgctctagga cattgattat tgactagtgg agttccgcgt tacataactt acggtaaatg 240
gcccgcctgg ctgaccgccc aacgaccccc gcccattgac gtcaataatg acgtatgttc 300
ccatagtaac gccaataggg actttccatt gacgtcaatg ggtggagtat ttacggtaaa 360
ctgcccactt ggcagtacat caagtgtatc atatgccaag tacgccccct attgacgtca 420
atgacggtaa atggcccgcc tggcattatg cccagtacat gaccttatgg gactttccta 480
cttggcagta catctacgta ttagtcatcg ctattaccat ggtcgaggtg agccccacgt 540
tctgcttcac tctccccatc tcccccccct ccccaccccc aattttgtat ttatttattt 600
tttaattatt ttgtgcagcg atgggggcgg gggggggggg gggcgcgcgc caggcggggc 660
ggggcggggc gaggggcggg gcggggcgag gcggagaggt gcggcggcag ccaatcagag 720
cggcgcgctc cgaaagtttc cttttatggc gaggcggcgg cggcggcggc cctataaaaa 780
gcgaagcgcg cggcgggcgg gagtcgctgc gcgctgcctt cgccccgtgc cccgctccgc 840
cgccgcctcg cgccgcccgc cccggctctg actgaccgcg ttactaaaac aggtaagtcc 900
ggcctccgcg ccgggttttg gcgcctcccg cgggcgcccc cctcctcacg gcgagcgctg 960
ccacgtcaga cgaagggcgc agcgagcgtc ctgatccttc cgcccggacg ctcaggacag 1020
cggcccgctg ctcataagac tcggccttag aaccccagta tcagcagaag gacattttag 1080
gacgggactt gggtgactct agggcactgg ttttctttcc agagagcgga acaggcgagg 1140
aaaagtagtc ccttctcggc gattctgcgg agggatctcc gtggggcggt gaacgccgat 1200
gatgcctcta ctaaccatgt tcatgttttc tttttttttc tacaggtcct gggtgacgaa 1260
cagggtaccg ccaccatggc gacgggttca agaacttccc tacttcttgc atttggcctg 1320
ctttgtttgc cgtggttaca ggagggctcg gcacaggtgc agctggtgca gtctggggct 1380
gaggtgaaga agcctgggtc ctcggtgaag gtctcctgca aggcttctgg aggcaccttc 1440
agcagctatg ctatcacctg ggtgcgacag gcccctggac aagggcttga gtggatggga 1500
gggatcatcc ctatctttgg tacagcaaac ttcgcacaga agttccaggg cagagtcacg 1560
attaccgcgg acgaatccac gagcacagcc tacatggagc tgagcagcct gagatctgag 1620
gacacggccg tgtattactg tgcccaccta ggggggttcg ctgacccctt tgactactgg 1680
ggccagggaa ccctggtcac cgtctcctca agcaccaagg gcccatcggt cttccccctg 1740
gcaccctcct ccaagagcac ctctgggggc acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac 1800
tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac 1860
accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg 1920
ccctccagca gcttgggcac ccagacctac atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac 1980
accaaggtgg acaagaaagt tgagcccaaa tcttgtgaca aaactcacac atgcccaccg 2040
tgcccagcac ctgaactcct ggggggaccg tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag 2100
gacaccctca tgatctcccg gacccctgag gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac 2160
gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag 2220
acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc 2280
ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc 2340
ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa gccaaagggc agccccgaga accacaggtg 2400
tacaccctgc ccccatcccg ggaggagatg accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg 2460
gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag 2520
aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg gactccgacg gctccttctt cctctacagc 2580
aagctcaccg tggacaagag caggtggcag caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg 2640
catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag aagagcctct ccctgtctcc gggtaaacga 2700
aaaagaagat caggttcggg tgcgccagta aagcagacat taaactttga tttgctgaaa 2760
cttgcaggtg atgtagagtc aaatccaggt ccaatggcaa cagggagccg aacctctctg 2820
ctccttgctt tcgggctcct ttgcctaccg tggctccaag agggctcggc agaaattgtg 2880
ttgacacagt ctccagccac cctgtctttg tctccagggg aaagagccac cctctcctgc 2940
agggccagtc agagtgttag caactactta gcctggtatc aacagaaagc tggccaggct 3000
cccagggtcc tcatctatga tgcattcaac agggccactg gcatcccagc caggttcagt 3060
ggcagtgggt ctgggacaga cttcactctc accatcagca gcctagagcc tgaagatttt 3120
gcagtttatt actgtcagca gcgtagcaac tggcctccgc ggatcacctt cggccaaggg 3180
acacgactgg agattaaagg tcagcccaag gctgccccct cggtcactct gttcccgccc 3240
tcctctgagg agcttcaagc caacaaggcc acactggtgt gtctcataag tgacttctac 3300
ccgggagccg tgacagtggc ctggaaggca gatagcagcc ccgtcaaggc gggagtggag 3360
accaccacac cctccaaaca aagcaacaac aagtacgcgg ccagcagcta tctgagcctg 3420
acgcctgagc agtggaagtc ccacagaagc tacagctgcc aggtcacgca tgaagggagc 3480
accgtggaga agacagtggc ccctacagaa tgttcatagc tctagaataa tcaacctctg 3540
gattacaaaa tttgtgaaag attgactggt attcttaact atgttgctcc ttttacgcta 3600
tgtggatacg ctgctttaat gcctttgtat catgctattg cttcccgtat ggctttcatt 3660
ttctcctcct tgtataaatc ctggttgctg tctctttatg aggagttgtg gcccgttgtc 3720
aggcaacgtg gcgtggtgtg cactgtgttt gctgacgcaa cccccactgg ttggggcatt 3780
gccaccacct gtcagctcct ttccgggact ttcgctttcc ccctccctat tgccacggcg 3840
gaactcatcg ccgcctgcct tgcccgctgc tggacagggg ctcggctgtt gggcactgac 3900
aattccgtgg tgttgtcggg gaaatcatcg tcctttcctt ggctgctcgc ctgtgttgcc 3960
acctggattc tgcgcgggac gtccttctgc tacgtccctt cggccctcaa tccagcggac 4020
cttccttccc gcggcctgct gccggctctg cggcctcttc cgcgtcttcg ccttcgccct 4080
cagacgagtc ggatctccct ttgggccgcc tccccgccta agcttatcga taccgtcgag 4140
atctaacttg tttattgcag cttataatgg ttacaaataa agcaatagca tcacaaattt 4200
cacaaataaa gcattttttt cactgcattc tagttgtggt ttgtccaaac tcatcaatgt 4260
atcttatcat gtctggatct cgacctcgac tagagcatgg ctacgtagat aagtagcatg 4320
gcgggttaat cattaactac aaggaacccc tagtgatgga gttggccact ccctctctgc 4380
gcgctcgctc gctcactgag gccgggcgac caaaggtcgc ccgacgcccg ggctttgccc 4440
gggcggcctc agtgagcgag cgagcgcgcc agctggcgta atagcgaaga ggcccgcacc 4500
gatcgccctt cccaacagtt gcgcagcctg aatggcgaat ggaattccag acgattgagc 4560
gtcaaaatgt aggtatttcc atgagcgttt ttcctgttgc aatggctggc ggtaatattg 4620
ttctggatat taccagcaag gccgatagtt tgagttcttc tactcaggca agtgatgtta 4680
ttactaatca aagaagtatt gcgacaacgg ttaatttgcg tgatggacag actcttttac 4740
tcggtggcct cactgattat aaaaacactt ctcaggattc tggcgtaccg ttcctgtcta 4800
aaatcccttt aatcggcctc ctgtttagct cccgctctga ttctaacgag gaaagcacgt 4860
tatacgtgct cgtcaaagca accatagtac gcgccctgta gcggcgcatt aagcgcggcg 4920
ggtgtggtgg ttacgcgcag cgtgaccgct acacttgcca gcgccctagc gcccgctcct 4980
ttcgctttct tcccttcctt tctcgccacg ttcgccggct ttccccgtca agctctaaat 5040
cgggggctcc ctttagggtt ccgatttagt gctttacggc acctcgaccc caaaaaactt 5100
gattagggtg atggttcacg tagtgggcca tcgccctgat agacggtttt tcgccctttg 5160
acgttggagt ccacgttctt taatagtgga ctcttgttcc aaactggaac aacactcaac 5220
cctatctcgg tctattcttt tgatttataa gggattttgc cgatttcggc ctattggtta 5280
aaaaatgagc tgatttaaca aaaatttaac gcgaatttta acaaaatatt aacgtttaca 5340
atttaaatat ttgcttatac aatcttcctg tttttggggc ttttctgatt atcaaccggg 5400
gtacatatga ttgacatgct agttttacga ttaccgttca tcgattctct tgtttgctcc 5460
agactctcag gcaatgacct gatagccttt gtagagacct ctcaaaaata gctaccctct 5520
ccggcatgaa tttatcagct agaacggttg aatatcatat tgatggtgat ttgactgtct 5580
ccggcctttc tcacccgttt gaatctttac ctacacatta ctcaggcatt gcatttaaaa 5640
tatatgaggg ttctaaaaat ttttatcctt gcgttgaaat aaaggcttct cccgcaaaag 5700
tattacaggg tcataatgtt tttggtacaa ccgatttagc tttatgctct gaggctttat 5760
tgcttaattt tgctaattct ttgccttgcc tgtatgattt attggatgtt ggaattcctg 5820
atgcggtatt ttctccttac gcatctgtgc ggtatttcac accgcatatg gtgcactctc 5880
agtacaatct gctctgatgc cgcatagtta agccagcccc gacacccgcc aacacccgct 5940
gacgcgccct gacgggcttg tctgctcccg gcatccgctt acagacaagc tgtgaccgtc 6000
tccgggagct gcatgtgtca gaggttttca ccgtcatcac cgaaacgcgc gagacgaaag 6060
ggcctcgtga tacgcctatt tttataggtt aatgtcatga taataatggt ttcttagacg 6120
tcaggtggca cttttcgggg aaatgtgcgc ggaaccccta tttgtttatt tttctaaata 6180
cattcaaata tgtatccgct catgagacaa taaccctgat aaatgcttca ataatattga 6240
aaaaggaaga gtatgagtat tcaacatttc cgtgtcgccc ttattccctt ttttgcggca 6300
ttttgccttc ctgtttttgc tcacccagaa acgctggtga aagtaaaaga tgctgaagat 6360
cagttgggtg cacgagtggg ttacatcgaa ctggatctca acagcggtaa gatccttgag 6420
agttttcgcc ccgaagaacg ttttccaatg atgagcactt ttaaagttct gctatgtggc 6480
gcggtattat cccgtattga cgccgggcaa gagcaactcg gtcgccgcat acactattct 6540
cagaatgact tggttgagta ctcaccagtc acagaaaagc atcttacgga tggcatgaca 6600
gtaagagaat tatgcagtgc tgccataacc atgagtgata acactgcggc caacttactt 6660
ctgacaacga tcggaggacc gaaggagcta accgcttttt tgcacaacat gggggatcat 6720
gtaactcgcc ttgatcgttg ggaaccggag ctgaatgaag ccataccaaa cgacgagcgt 6780
gacaccacga tgcctgtagc aatggcaaca acgttgcgca aactattaac tggcgaacta 6840
cttactctag cttcccggca acaattaata gactggatgg aggcggataa agttgcagga 6900
ccacttctgc gctcggccct tccggctggc tggtttattg ctgataaatc tggagccggt 6960
gagcgtgggt ctcgcggtat cattgcagca ctggggccag atggtaagcc ctcccgtatc 7020
gtagttatct acacgacggg gagtcaggca actatggatg aacgaaatag acagatcgct 7080
gagataggtg cctcactgat taagcattgg taactgtcag accaagttta ctcatatata 7140
ctttagattg atttaaaact tcatttttaa tttaaaagga tctaggtgaa gatccttttt 7200
gataatctca tgaccaaaat cccttaacgt gagttttcgt tccactgagc gtcagacccc 7260
gtagaaaaga tcaaaggatc ttcttgagat cctttttttc tgcgcgtaat ctgctgcttg 7320
caaacaaaaa aaccaccgct accagcggtg gtttgtttgc cggatcaaga gctaccaact 7380
ctttttccga aggtaactgg cttcagcaga gcgcagatac caaatactgt ccttctagtg 7440
tagccgtagt taggccacca cttcaagaac tctgtagcac cgcctacata cctcgctctg 7500
ctaatcctgt taccagtggc tgctgccagt ggcgataagt cgtgtcttac cgggttggac 7560
tcaagacgat agttaccgga taaggcgcag cggtcgggct gaacgggggg ttcgtgcaca 7620
cagcccagct tggagcgaac gacctacacc gaactgagat acctacagcg tgagctatga 7680
gaaagcgcca cgcttcccga agggagaaag gcggacaggt atccggtaag cggcagggtc 7740
ggaacaggag agcgcacgag ggagcttcca gggggaaacg cctggtatct ttatagtcct 7800
gtcgggtttc gccacctctg acttgagcgt cgatttttgt gatgctcgtc aggggggcgg 7860
agcctatgga aaaacgccag caacgcggcc tttttacggt tcctggcctt ttgctggcct 7920
tttgctcaca tgttctttcc tgcgttatcc cctgattctg tggataaccg tattaccgcc 7980
tttgagtgag ctgataccgc tcgccgcagc cgaacgaccg agcgcagcga gtcagtgagc 8040
gaggaagcgg aagagcgccc aatacgcaaa ccgcctctcc ccgcgcgttg gccgattcat 8100
taatg 8105

Claims (40)

1.一种重组表达载体，其包含含有编码抗SARS-COV-2中和抗体或其抗原结合片段的核酸序列的表达盒，其中所述抗SARS-COV-2中和抗体或其抗原结合片段包含：
SEQ ID NO: 1的HCDR1、SEQ ID NO: 2的HCDR2和SEQ ID NO: 3的HCDR3，与SEQ ID NO:4的LCDR1、SEQ ID NO: 5的LCDR2和SEQ ID NO: 6的LCDR3；
并且其中，
所述HCDR1由SEQ ID NO: 31的核酸序列编码，所述HCDR2由SEQ ID NO: 32的核酸序列编码，所述HCDR3由SEQ ID NO: 33的核酸序列编码，所述LCDR1由SEQ ID NO: 34的核酸序列编码，所述LCDR2由SEQ ID NO: 35的核酸序列编码，且所述LCDR3由SEQ ID NO: 36的核酸序列编码。
2.根据前述权利要求1所述的重组表达载体，其中所述抗SARS-COV-2中和抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO: 7所示的重链可变区（VH）氨基酸序列，其由SEQ ID NO: 9的核酸序列编码。
3.根据前述权利要求中2所述的重组表达载体，其中所述抗SARS-COV-2中和抗体或其抗原结合片段进一步包含SEQ ID NO: 8所示的轻链可变区（VL）氨基酸序列，其由SEQ IDNO: 10的核酸序列编码。
4.根据前述权利要求1所述的重组表达载体，其中所述抗SARS-COV-2中和抗体进一步包含重链恒定区和轻链恒定区。
5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其中所述重链恒定区来自人IgG1。
6.根据权利要求5所述的重组表达载体，其中所述重链恒定区包含SEQ ID NO: 37的氨基酸序列。
7.根据权利要求5所述的重组表达载体，其中所述重链恒定区由SEQ ID NO: 38的核酸序列编码。
8.根据权利要求4所述的重组表达载体，其中所述轻链恒定区来自人λ轻链。
9.根据权利要求8所述的重组表达载体，其中所述轻链恒定区包含SEQ ID NO: 45的氨基酸序列。
10.根据权利要求8所述的重组表达载体，其中所述轻链恒定区由SEQ ID NO: 46的核酸序列编码。
11.根据权利要求1所述的重组表达载体，其中所述重组表达载体具有与所述抗SARS-COV-2中和抗体VH的N端处可操作地连接的第一信号肽，和与所述抗SARS-COV-2中和抗体VL的N端处可操作地连接的第二信号肽。
12.根据前述权利要求1所述的重组表达载体，其中所述表达盒进一步包含转录调控元件。
13.根据权利要求12所述的重组表达载体，其中所述转录调控元件包含以下中的一种或多种：启动子、增强子、内含子、2A自我裂解肽序列、土拔鼠肝炎病毒转录后调控元件（WPRE）、聚腺苷酸化（polyA）信号序列。
14.根据前述权利要求11所述的重组表达载体，其中所述重组表达载体是基于病毒的载体。
15.根据权利要求14所述的重组表达载体，其中所述重组表达载体是慢病毒载体。
16.根据权利要求14所述的重组表达载体，其中所述重组表达载体是逆转录病毒载体。
17.根据权利要求14所述的重组表达载体，其中所述重组表达载体是腺相关病毒（AAV）载体。
18. 根据权利要求17所述的重组表达载体，其中所述表达盒在有义链的5'至3'方向上包含：5' AAV反向末端重复序列（ITR）1-启动子-编码所述抗SARS-COV-2中和抗体的核酸序列-WPRE-polyA信号序列-3' AAV ITR2。
19.根据权利要求18所述的重组表达载体，其中编码所述抗SARS-COV-2中和抗体的核酸序列在有义链的5'至3'方向上包含以下的编码序列：所述第一信号肽-所述抗SARS-COV-2中和抗体重链可变区-人IgG1恒定区-2A自我裂解肽-所述第二信号肽-所述抗SARS-COV-2中和抗体轻链可变区-人λ轻链恒定区。
20. 根据权利要求18所述的重组表达载体，其中所述启动子是CASI启动子且所述polyA信号序列是SV40 polyA。
21. 根据权利要求18所述的重组表达载体，其中所述AAV ITR1和AAV ITR2是AAV2ITR。
22.根据权利要求17所述的重组表达载体，其中所述AAV载体用突变AAV6衣壳假型化。
23.根据权利要求1所述的重组表达载体，其中编码抗SARS-COV-2中和抗体或其抗原结合片段的核酸序列针对表达进行了密码子优化。
24. 根据权利要求1所述的重组表达载体，其包含SEQ ID NO: 61的核酸序列。
25.一种经基因修饰的宿主细胞，其包含根据权利要求1至24中任一项所述的重组表达载体。
26.根据权利要求25所述的经基因修饰的宿主细胞，其中所述细胞选自由以下组成的群组：古细菌细胞、细菌细胞和真核细胞。
27.根据权利要求25所述的经基因修饰的宿主细胞，其中所述细胞是哺乳动物细胞。
28.根据权利要求27所述的经基因修饰的宿主细胞，其中所述哺乳动物细胞是HEK293细胞。
29.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至24中任一项所述的重组表达载体和药学上可接受的载体。
30.一种制备表达抗SARS-COV-2中和抗体的重组表达载体的方法，其包含在适合于繁殖所述重组表达载体的条件下培养根据权利要求25至28中任一项所述的经基因修饰的宿主细胞。
31.根据权利要求1至24中任一项所述的重组表达载体或根据权利要求29所述的药物组合物在制备用于治疗或预防个体中的SARS-CoV-2感染的药物中的用途。
32.根据权利要求31所述的用途，其中所述个体是人类或非人类动物。
33.根据权利要求31或32所述的用途，其中所述个体已鉴定为被SARS-CoV-2感染，或怀疑被SARS-CoV-2感染，或处于暴露于SARS-CoV-2的风险下。
34.根据权利要求31或32所述的用途，其中给药是经口、鼻、静脉内、皮下、舌下或肌肉内给药。
35.根据权利要求31或32所述的用途，其进一步包含给药有效量的第二治疗剂。
36.根据权利要求35所述的用途，其中所述第二治疗剂选自抗病毒剂。
37.根据权利要求36所述的用途，其中所述抗病毒剂是第二SARS-CoV-2中和抗体、表达第二SARS-CoV-2中和抗体的第二重组表达载体、RNA依赖性RNA聚合酶抑制剂、抗病毒细胞因子或免疫刺激剂。
38.根据权利要求1至24中任一项所述的重组表达载体或根据权利要求29所述的药物组合物在制备用于中和个体中的SARS-CoV-2的药物中的用途。
39.根据权利要求1至24中任一项所述的重组表达载体或根据权利要求29所述的药物组合物在制备用于预防或降低感染SARS-CoV-2的个体传染SARS-CoV-2的药物中的用途。
40.根据权利要求1至24中任一项所述的重组表达载体或根据权利要求29所述的药物组合物在制备用于降低感染SARS-CoV-2的个体中的病毒负荷的药物中的用途。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SG11202103404PA (en) 2020-04-02 2021-04-29 Regeneron Pharma Anti-sars-cov-2-spike glycoprotein antibodies and antigen-binding fragments
AU2021209287B1 (en) * 2021-01-19 2022-03-24 Newsoara Biopharma Co., Ltd. Expression Vector for Anti-Sars-Cov-2 Neutralizing Antibodies

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005060520A2 (en) * 2003-11-25 2005-07-07 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. ANTIBODIES AGAINST SARS-CoV AND METHODS OF USE THEREOF
CN111592595A (zh) * 2020-04-27 2020-08-28 南京医科大学 抗新型冠状病毒SARS-Cov-2的中和性抗体及其应用
CN111825762A (zh) * 2020-06-17 2020-10-27 武汉华美生物工程有限公司 抗sars-cov-2病毒s蛋白rbd结构域的纳米抗体及其用途
CN111995674A (zh) * 2020-09-03 2020-11-27 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 抗COVID-19病毒中和抗体mhC3及其人源化抗体与应用
CN112010963A (zh) * 2020-07-20 2020-12-01 江苏集萃医学免疫技术研究所有限公司 Sars-cov-2抗体及其用途
CN112094340A (zh) * 2020-07-31 2020-12-18 王跃驹 植物作为宿主在表达新型冠状病毒肺炎中和抗体b38抗体和/或h4抗体中的应用
CN112442120A (zh) * 2020-11-25 2021-03-05 苏州大学 抗严重急性呼吸系统综合征ii型冠状病毒sars-cov-2的中和抗体
CN112552399A (zh) * 2021-02-24 2021-03-26 恒翼生物医药科技(上海)有限公司 抗sars-cov-2中和抗体

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111690058B (zh) * 2020-03-30 2021-02-05 三优生物医药(上海)有限公司 针对冠状病毒的具有中和活性的抗体及其用途

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005060520A2 (en) * 2003-11-25 2005-07-07 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. ANTIBODIES AGAINST SARS-CoV AND METHODS OF USE THEREOF
CN1914226A (zh) * 2003-11-25 2007-02-14 达纳-法伯癌症研究院有限公司 SARS－CoV抗体及其使用方法
CN111592595A (zh) * 2020-04-27 2020-08-28 南京医科大学 抗新型冠状病毒SARS-Cov-2的中和性抗体及其应用
CN111825762A (zh) * 2020-06-17 2020-10-27 武汉华美生物工程有限公司 抗sars-cov-2病毒s蛋白rbd结构域的纳米抗体及其用途
CN112010963A (zh) * 2020-07-20 2020-12-01 江苏集萃医学免疫技术研究所有限公司 Sars-cov-2抗体及其用途
CN112094340A (zh) * 2020-07-31 2020-12-18 王跃驹 植物作为宿主在表达新型冠状病毒肺炎中和抗体b38抗体和/或h4抗体中的应用
CN111995674A (zh) * 2020-09-03 2020-11-27 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 抗COVID-19病毒中和抗体mhC3及其人源化抗体与应用
CN112442120A (zh) * 2020-11-25 2021-03-05 苏州大学 抗严重急性呼吸系统综合征ii型冠状病毒sars-cov-2的中和抗体
CN112552399A (zh) * 2021-02-24 2021-03-26 恒翼生物医药科技(上海)有限公司 抗sars-cov-2中和抗体

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