CN111995674A - 抗COVID-19病毒中和抗体mhC3及其人源化抗体与应用 - Google Patents
抗COVID-19病毒中和抗体mhC3及其人源化抗体与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了抗COVID‑19病毒中和抗体mhC3及其人源化抗体与应用。本发明所提供的抗体的重链可变区中HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列依次如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3所示；所述抗体的轻链可变区中LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列依次如SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6所示。本发明抗体能够特异性结合新型冠状病毒RBD蛋白，能够中和新型冠状病毒(SARS‑CoV‑2)。本发明所提供的抗体可用于冠状病毒感染的防治，具有重要的生物学和医学意义。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及抗COVID-19病毒中和抗体mhC3及其人源化抗体与应用。
背景技术
新型冠状病毒(SARS-CoV-2)在自然界广泛分布于人类和其他哺乳动物中，可感染野生动物、宠物、畜群和人类，但是大多数可感染人类的冠状病毒仅引起轻度感染。新型冠状病毒SARS-CoV-2属于网巢病毒目冠状病毒科冠状病毒亚科。冠状病毒亚科分为α、β、γ、δ等4属，其中SARS-CoV-2为β属冠状病毒。本次疫情之前已知有六种冠状病毒能够导致人类呼吸系统疾病，其中四种病毒-229E、OC43、NL63和HKU1在自然界普遍存在，通常在健康人群中只引起普通感冒症状，只有2002年爆发的严重急性呼吸系统综合症冠状病毒(SARS-CoV)和2012年爆发的中东呼吸系统综合症冠状病毒(MERS-CoV)导致了大规模爆发，在过去的20年中累计造成了10000多例感染病例，且导致了非常高的死亡率(据统计这两种病毒感染引起的死亡率分别为10％和37％)。SARS-CoV-2是过去二十年来继SARS-CoV和MERS-CoV之后在人类中出现的第三种冠状病毒。
新型冠状病毒COVID-19基因组全长约30Kb,为带包膜的正链RNA，基因组不分节段,目前已知共编码29种蛋白质，其中包括16种非结构蛋白(nsp1-nsp16)、4种结构蛋白(S、E、M、N)和9种辅助蛋白(3a、3b、6、7a、7b、8、9b、9c和10)。病毒的包膜上面有三种蛋白：棘突糖蛋白(Spike，S)、包膜糖蛋白(Envelope，E)和膜糖蛋白(Membrane，M),其中S蛋白又分为S1和S2两个结构域，在识别并结合宿主细胞表面受体，并介导病毒包膜与细胞膜融合的过程中起关键作用。
病毒感染人体时，人体免疫系统接受病毒抗原刺激就会激发机体的体液免疫和细胞免疫反应，从而逐渐控制感染、清除病毒。现有临床资料表明，新冠肺炎康复者血清及其制品可以有效控制新冠肺炎患者疫情发展，其中起关键作用的就是康复者血液中的中和抗体。中和抗体在病毒感染康复中一直扮演者重要的角色，新冠病毒感染人体也可诱发较强的体液免疫反应，产生特异性针对新冠病毒的中和抗体。因此新冠病毒中和抗体被普遍认为可以作为一种有效而特异的抗新冠病毒的治疗手段，新冠病毒中和抗体的研制也是本次新冠疫情特异性治疗药物的主要发展方向之一。
目前世界上有多家机构正在开展针对新冠肺炎抗体研究，但尚没有针对新冠肺炎的特异性治疗药物获得批准。
发明内容
本发明的目的是提供抗COVID-19病毒中和抗体mhC3及其人源化抗体与应用。
第一方面，本发明要求保护一种抗体。
本发明所要求保护的抗体的重链可变区中HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列依次如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3所示；所述抗体的轻链可变区中LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列依次如SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6所示。
其中，HCDR1、HCDR2和HCDR3为重链可变区中的三个互补决定区，LCDR1、LCDR2和LHCDR3为轻链可变区中的三个互补决定区。互补决定区的序列根据Kabat定义。
在本发明保护范围内，所述抗体可为全长抗体、Fab片段、F(ab’)2片段或单链Fv片段等各种形式。优选的，所述抗体为人源化抗体。
进一步地，所述重链可变区的氨基酸序列可为SEQ ID No.7自N端起第1-122位，或者与SEQ ID No.7自N端起第1-122位具有至少90％的一致性(不一致处可在骨架区(FR))。所述轻链可变区的氨基酸序列可为SEQ ID No.8自N端起第1-112位，或者与SEQ ID No.8自N端起第1-112位具有至少90％的一致性(不一致处可在骨架区(FR))(对应实施例中的抗体mhC3)。
进一步地，所述重链可变区的氨基酸序列可为SEQ ID No.9自N端起第1-122位，或者与SEQ ID No.9自N端起第1-122位具有至少90％的一致性(不一致处可在骨架区(FR))。所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID No.10自N端起第1-112位，或者与SEQ ID No.10自N端起第1-112位具有至少90％的一致性(不一致处可在骨架区(FR))(对应实施例中的人源抗体SFC3)。
在本发明保护范围内，所述抗体还包括选自IgG1或IgG4的重链恒定区和包含选自kappa或Lambda亚型的轻链恒定区。
更进一步地，所述抗体的重链的氨基酸序列可为SEQ ID No.7，或者与SEQ IDNo.7具有至少90％的一致性(不一致处可在骨架区(FR))。所述抗体的轻链的氨基酸序列为SEQ ID No.8或者与SEQ ID No.8具有至少90％的一致性(不一致处可在骨架区(FR))(对应实施例中的抗体mhC3)。
更进一步地，所述抗体的重链的氨基酸序列为SEQ ID No.9，或者与SEQ ID No.9具有至少90％的一致性(不一致处可在骨架区(FR))。所述抗体的轻链的氨基酸序列为SEQID No.10或者与SEQ ID No.10具有至少90％的一致性(不一致处可在骨架区(FR))(对应实施例中的人源抗体SFC3)。
第二方面，本发明要求保护一种核酸分子。
本发明所要求保护的核酸分子为编码前文第一方面所述的抗体或所述抗体中的抗原结合部分的核酸分子。
进一步地，在所述核酸分子中，编码所述抗体的重链可变区中HCDR1、HCDR2和HCDR3的核苷酸序列可为如下(a1)或(a2)：
(a1)依次如SEQ ID No.11自5’端起第91-105位、第148-204位、第301-336位所示(对应实施例中的抗体mhC3)；
(a2)依次如SEQ ID No.13自5’端起第91-105位、第148-204位、第301-336位所示(对应实施例中的人源抗体SFC3)。
进一步地，在所述核酸分子中，编码所述抗体的轻链可变区中LCDR1、LCDR2和LHCDR3的核苷酸序列可为如下(b1)或(b2)：
(b1)依次如SEQ ID No.12自5’端起第70-117位、第163-183位、第280-306位所示(对应实施例中的抗体mhC3)；
(b2)依次如SEQ ID No.14自5’端起第70-117位、第163-183位、第280-306位所示(对应实施例中的人源抗体SFC3)。
更进一步地，在所述核酸分子中，编码所述抗体的所述重链可变区的核苷酸序列可为SEQ ID No.11自5’端起第1-366位或者与SEQ ID No.11自5’端起第1-366位具有至少90％的一致性(不一致处在骨架区(FR))。编码所述抗体的所述轻链可变区的核苷酸序列为SEQ ID No.12自5’端起第1-336位或者与SEQ ID No.12自5’端起第1-336位具有至少90％的一致性(不一致处在骨架区(FR))(对应实施例中的抗体mhC3)。
进一步地，在所述核酸分子中，编码所述抗体的所述重链可变区的核苷酸序列为SEQ ID No.13自5’端起第1-366位或者与SEQ ID No.13自5’端起第1-366位具有至少90％的一致性(不一致处在骨架区(FR))。编码所述抗体的所述轻链可变区的核苷酸序列为SEQID No.14自5’端起第1-336位或者与SEQ ID No.14自5’端起第1-336位具有至少90％的一致性(不一致处在骨架区(FR))(对应实施例中的人源抗体SFC3)。
更加具体地，在所述核酸分子中，编码所述抗体的重链的核苷酸序列为SEQ IDNo.11或者与SEQ ID No.11具有至少90％的一致性(不一致处在骨架区(FR))。编码所述抗体的轻链的核苷酸序列为SEQ ID No.12或者与SEQ ID No.12具有至少90％的一致性(不一致处在骨架区(FR))(对应实施例中的抗体mhC3)。
更加具体地，在所述核酸分子中，编码所述抗体的重链的核苷酸序列为SEQ IDNo.13或者与SEQ ID No.13具有至少90％的一致性(不一致处在骨架区(FR))。编码所述抗体的轻链的核苷酸序列为SEQ ID No.14或者与SEQ ID No.14具有至少90％的一致性(不一致处在骨架区(FR))(对应实施例中的人源抗体SFC3)。
第三方面，本发明要求保护含有前文第二方面所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组细胞或重组菌。
在本发明的一个实施例中，将SEQ ID No.11(抗体重链的编码基因)克隆到pcDNA3.1(+)载体的酶切位点Hind III和BamH I之间后得到表达所述抗体的重链的重组表达载体；将SEQ ID No.12(抗体轻链的编码基因)克隆到pcDNA3.1(+)载体的酶切位点HindIII和BamH I之间后得到表达所述抗体的轻链的重组表达载体。所述重组细胞为将上述分别表达所述抗体重链和轻链的两个重组表达载体共转染FreeStyleTM293F细胞后得到的重组细胞。
第四方面，本发明要求保护一种药物组合物。
本发明所要求保护的药物组合物包含前文第一方面中所述的抗体和药学可接受的赋形剂、稀释剂或载体。
第五方面，本发明要求保护如下任一所示应用：
(A1)前文所述的核酸分子或表达盒、重组载体、重组细胞或重组菌在制备前文所述抗体或前文所述药物组合物中的应用。
(A2)前文所述抗体在制备前文所述药物组合物中的应用。
(A3)前文所述抗体或核酸分子或表达盒、重组载体、重组细胞或重组菌或药物组合物在制备用于预防和/或治疗由SARS-CoV-2感染所致疾病的产品中的应用。
(A4)前文所述抗体或核酸分子或表达盒、重组载体、重组细胞或重组菌或药物组合物在制备用于抑制SARS-CoV-2感染的产品中的应用。
(A5)前文所述抗体或核酸分子或表达盒、重组载体、重组细胞或重组菌或药物组合物在制备用于检测SARS-CoV-2的产品中的应用。
(A6)前文所述抗体或核酸分子或表达盒、重组载体、重组细胞或重组菌或药物组合物在制备用于中和SARS-CoV-2的产品中的应用。
(A7)前文所述抗体或核酸分子或表达盒、重组载体、重组细胞或重组菌或药物组合物在制备用于检测SARS-CoV-2的RBD蛋白的产品中的应用。
(A8)前文所述抗体或核酸分子或表达盒、重组载体、重组细胞或重组菌或药物组合物在制备用于结合SARS-CoV-2的RBD蛋白的产品中的应用。
本发明制备了一种抗COVID-19病毒中和抗体mhC3及其人源化抗体SFC3。实验证明，该抗体能够特异性结合新型冠状病毒RBD蛋白，能够中和新型冠状病毒(SARS-CoV-2)。本发明所提供的抗体可用于冠状病毒感染的防治，具有重要的生物学和医学意义。
附图说明
图1为纯化的mhC3抗体SDS-PAGE检测结果。
图2为GJK0601-RBD阳性表达克隆筛选的SDS-PAGE图。1-8为不同克隆，阳性对照为商品化RBD(义翘神州，40592-V08H5)。
图3为纯化RBD蛋白的SDS-PAGE图。
图4为mhC3抗体特异性检测。其中R-G为狂犬病毒G蛋白。
图5为抗体mhC3与RBD的结合能力检测。图中C3即表示mhC3抗体。
图6为抗体mhC3中和新冠假病毒的活性检测。图中C3即表示mhC3抗体。
图7为利用www.abysis.org对鼠源抗体C3重、轻链可变区氨基酸分布及特性进行分析结果。A为鼠源抗体C3重链可变区氨基酸序列性质分析。B为鼠源抗体C3轻链可变区氨基酸序列性质分析。C为A和B中的相关图注说明。
图8为利用www.abysis.org对鼠源抗体C3重、轻链可变区人源化程度进行分析。A为鼠源抗体C3重链可变区人源化程度。B为鼠源抗体C3轻链可变区人源化程度。
图9为利用www.abysis.org对鼠源抗体C3重、轻链可变区氨基酸序列人源化情况进行分析。A为鼠源抗体C3重链可变区氨基酸序列人源化情况分析。B为鼠源抗体C3轻链可变区氨基酸序列人源化情况分析。
图10为利用SwissModel搭建的鼠源抗体C3重、轻链可变区空间结构主链碳原子走向示意图。A为鼠源抗体C3重链可变区空间结构；B为鼠源抗体C3轻链可变区空间结构。
图11为利用SwissModel搭建的人源化抗体SFC3重、轻链可变区空间结构主链碳原子走向示意图。A为人源化抗体SFC3重链可变区空间结构；B为人源化抗体SFC3轻链可变区空间结构。
图12为SFC3抗体亲和力检测。
图13为SFC3假病毒中和活性检测。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、抗体的发现
一、小鼠免疫及免疫抗体库的制备
取6-8周龄Balb/C小鼠，免疫之前小鼠尾静脉采血留本底血清。首次免疫取新冠病毒S蛋白RBD结构域重组蛋白(义翘神州，40592-V08H5)用弗氏完全佐剂乳化，每只小鼠腹腔注射100μg重组蛋白。间隔1周加强免疫，取重组RBD蛋白(义翘神州，40592-V08H5)以费氏不完全佐剂乳化，每只小鼠腹腔注射100μg重组蛋白，注射前断尾采血，共进行两次加强免疫。第四次免疫改用冲击免疫，以不加佐剂的重组RBD蛋白(实施例3步骤一制备)作为免疫原，每只小鼠腹腔注射100μg，冲击免疫后3天处死小鼠，收集脾细胞。
利用细胞总RNA提取试剂盒(天根，DP430)，将分离的脾细胞进行总RNA的提取。以提取的总RNA为模板，利用第一链cDNA合成试剂盒(Thermo scientific，K1621)分别合成重链可变区和轻链可变区，反转录引物采取基因特异性引物，引物配对区分别位于抗体重链恒定区和抗体轻链恒定区，具体序列分别为PmCGR：5’-TGCATTTGAACTCCTTGCC-3’和PmCKR：5’-CCATCAATCTTCCACTTGAC-3’。将合成好的cDNA立即存放于-70℃保存备用。然后以反转录得到的cDNA为模板，参考文献(Journal of Immunological Methods，201(1997)，35–55)合成引物，并利用PCR分别扩增鼠抗体重链可变区和轻链可变区，然后利用重叠延伸PCR技术，构建单链抗体(scFv)。最后将制备的小鼠单链抗体基因克隆至载体pADSCFV-S载体(参见发明专利201510097117.0)，构建scFv库。此抗体库的库容达到8×108，正确率为60％。
二、抗新型冠状病毒RBD小鼠单链抗体库的筛选
以RBD重组蛋白(实施例3步骤一制备)为抗原，利用固相筛选策略(实验方案参考噬菌体展示：通用实验指南/(美)克拉克森(Clackson,T),(美)洛曼(Lowman,H.B.)编；马岚等译。化学工业出版社，2008.5)筛选上述构建的小鼠单链抗体噬菌体库，共进行三轮筛选，最终获得能特异性结合人新冠病毒S蛋白RBD结构域的单链抗体克隆C3。其重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID No.7自N端起的第1-122位(对应的编码基因的核苷酸序列为SEQ IDNo.11自5’端起的第1-366位)，轻链可变区为SEQ ID No.8自N端起的第1-112位(对应的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID No.12自5’端起的第1-336位)。
实施例2、抗新冠病毒嵌合抗体的制备
挑取鼠单链抗体克隆C3制备人鼠嵌合的全抗体，命名为mhC3(重链恒定区为IgG1，轻链为Kappa)。制备过程如下：
一、重组质粒的构建
1、将SEQ ID No.11的序列利用常规的分子生物学技术克隆至pcDNA3.1(+)(Invitrogen，V79020)，插入至HindIII和BamH I两个酶切位点之间，所得重组质粒经测序验证正确后命名为pcDNA3.1-mhC3H，为抗体mhC3的重链表达载体。
2、将SEQ ID No.12的序列利用常规的分子生物学技术克隆至pcDNA3.1(+)(Invitrogen，V79020)，插入至Hind III和BamH I两个酶切位点之间，所得重组质粒经测序验证正确后命名为pcDNA3.1-mhC3K，为抗体mhC3的轻链表达载体。
人鼠嵌合全抗体mhC3，其重链氨基酸序列如SEQ ID No.7所示，轻链氨基酸序列如SEQ ID No.8所示。
SEQ ID No.7中，自N端第1-122位氨基酸残基组成重链可变区VH(其中，第31-35位氨基酸残基组成HCDR1(SEQ ID No.1)，第50-68位氨基酸残基组成HCDR2(SEQ ID No.2)，第101-112位氨基酸残基组成HCDR3(SEQ ID No.3))，第123-221位氨基酸残基组成重链恒定区CH1，第222-236位氨基酸残基组成重链铰链区Hinge，第237-346位氨基酸残基组成重链恒定区CH2，第347-453位氨基酸残基组成重链恒定区CH3。
SEQ ID No.8中，自N端第1-112位氨基酸残基组成轻链可变区VL(其中，第24-39位氨基酸残基组成LCDR1(SEQ ID No.4)，第55-61位氨基酸残基组成LCDR2(SEQ ID No.5)，第94-102位氨基酸残基组成LCDR3(SEQ ID No.6))，第113-219位氨基酸残基组成轻链恒定区CL。
SEQ ID No.11所示的DNA分子编码SEQ ID No.7所示的多肽(重链)。SEQ ID No.11中，自5’端第1-366位核苷酸编码VH(其中，第91-105位核苷酸编码HCDR1，第148-204位核苷酸编码HCDR2，第301-336位核苷酸编码HCDR3)，第367-663位核苷酸编码CH1，第664-708位核苷酸编码Hinge，第709-1038位核苷酸编码CH2，第1039-1359位核苷酸编码CH3，第1360-1362位核苷酸为终止密码子。
SEQ ID No.12所示的DNA分子编码SEQ ID No.8所示的多肽(轻链)。SEQ ID No.12中，自5’端第1-336位核苷酸编码VL(其中，第70-117位核苷酸编码LCDR1，第163-183位核苷酸编码LCDR2，第280-306位核苷酸编码LCDR3)，第337-657位核苷酸编码CL，第658-660位核苷酸为终止密码子。
其中，互补决定区的序列根据Kabat定义。抗体mhC3为IgG1，轻链类型为kappa(κ)型。
二、抗体的制备
1、抗体的表达
构建好的表达质粒pcDNA3.1-mhC3H和pcDNA3.1-mhC3K，利用转染试剂FectoPRODNA Transfection Reagent(Polyplus，116-001)共转染FreeStyleTM HEK293-F细胞(Invitrogen，R79007)。具体如下：转染前一天选取生长状态良好的，密度在2-3×106/mL左右的FreeStyleTMHEK293-F细胞，离心去除上清，用FreeStyle 293培养基(Gibco，12338-018)重悬，调整细胞密度为1.0×106/mL，按30mL细胞悬液/瓶进行分装，37℃，5％CO2，125rpm，细胞摇床中震荡培养；转染当天，转染复合物制备：24μL的FectoPRO转染试剂稀释于3mLFreeStyle 293培养基，轻轻混匀，加入轻重链质粒DNA各12μg，混匀后室温放置10min；然后将混合溶液加到准备好的FreeStyleTMHEK293-F细胞中，轻轻混匀，放回细胞摇床中；转染后48小时开始监测细胞活度，在细胞活度降到80-85％时8,000rpm离心10min收集培养上清进行纯化。
2、抗体的纯化
抗体表达上清用0.45μm滤膜过滤以去除杂质，加入10×PB调节离子浓度与1×PB结合缓冲液相近；将HiTrapTMMabSelectXtra预装柱安装到AKTA系统，先用1×PB结合缓冲液平衡5-10个柱体积，待基线平稳，开始上样；上样完毕后，用结合缓冲液冲洗掉杂蛋白，继续平衡5-10个柱体积，待基线水平后观察UV280是否接近零，如果不接近重新调零；用0.1M柠檬酸盐缓冲液(pH3.0)冲洗预装柱以洗脱抗体，UV280升到100时开始收集，UV280降到100时结束收集。
用HitrapTMDedalting层析柱将HiTrapTMMabSelectXtra亲和层析纯化样品置换缓冲液，流动相为0.01M的柠檬酸盐缓冲液(pH6.0)。首先用0.01M的柠檬酸盐缓冲液(pH6.0)冲洗整个体系，待基线平稳后再平衡3-5个柱体积，然后进行上样，(上样体积不大于层析柱总体积的五分之一)观察UV280值是否接近零，如不接近需要调零，进行置换，流速均为3mL/min，获得的洗脱峰即为纯化的mhC3抗体，取部分样品SDS-PAGE检测和浓度检测，其余的分装冻存于-80℃。
图1为纯化后的mhC3抗体SDS-PAGE检测结果。由图可见，纯化后的mhC3抗体还原性样品有两条清晰的条带，分子量较大的条带为重链，分子量较小的条带为轻链。
3、抗体的定量
将纯化并置换后的抗体溶液用滤膜过滤除菌，取样用NanoDrop紫外分光光度计(Thermo Scientific)测定蛋白浓度(300μg/mL)。
实施例3、mhC3抗体的特异性结合能力检测
一、RBD重组蛋白的制备
1、重组RBD糖蛋白的酵母表达与制备
1.1重组蛋白表达载体的构建
根据GENEBANK公布的SARS-CoV-2基因序列(NC_045512.2)，确定S蛋白RBD区(SEQID No.15)，委托上海生工生物工程公司进行全基因合成，上下两端分别添加酶切位点XhoI和NotI，合成基因酶切后插入同样酶切的酵母表达载体pPICZαA(Invitrogen)，命名为pPICZαA-RBD。
1.2酵母感受态细胞制备
挑取毕赤酵母GJK0601菌(本发明采用的基础菌株为前期构建的GJK0601菌株，保藏号为CGMCC No.1853，菌株授权专利号：ZL200610164912.8。该菌株为α-1,6-甘露糖转移酶缺失的毕赤酵母菌株)单克隆接种于2.5mL YPD培养基(配方：酵母提取物1g/100mL，蛋白胨2g/100mL，葡萄糖2g/100mL，琼脂1.5g/100mL)，置28℃摇床200rpm培养12h。取500μL菌液接于100mL YPD，200rpm过夜培养。待菌浓度吸光值达OD600＝1.2，4500rpm离心5min，取菌体用冰冷的去离子水重悬同样条件离心，重复一次然后1M冷山梨醇洗一次备用。
1.3目的基因转化毕赤酵母
采用电转化法将BglII线性化后的质粒pPICZαA-RBD转化入毕赤酵母GJK0601感受态细胞(发明专利ZL200610164912.8)，电转化的方法为本领域所共知的(如A.亚当斯等，《酵母遗传学方法实验指南》，科学出版社，2000)。电转化后，向电击后的菌液中加入900μL1M无菌的山梨醇溶液，转移至1.5mL离心管中，25℃放置2h，涂布于YPD/Zeocin平板(该平板为含100μg/mLZeocin的YPD固体培养基)上进行培养。将得到的重组菌命名为GJK0601-RBD。
平板放置于25℃，培养3-4d，培养结束后随机挑取克隆接种于YPD培养基，25℃培养3d后，以5％的接菌量接种于BMGY培养基(YNB 1.34g/100mL，生物素4×10-5g/100mL，1g/100mL酵母提取物，2g/100mL蛋白胨，1ml/100mL甘油，100mM PB pH6.0)，48h后加入0.5mL/100mL甲醇进行诱导表达，每12h补加一次甲醇，诱导72h后离心取上清液，得到GJK0601-RBD上清液。通过SDS-PAGE筛选RBD表达阳性克隆(图2)。
1.4GJK01-RBD重组酵母菌株的大量培养与纯化
取阳性克隆进行扩大培养，即挑取阳性克隆接种于100mL YPD培养基，25℃培养3d后，以5％的接菌量接种于200mL BMGY培养基(YNB 1.34g/100mL，生物素4×10-5g/100mL，1g/100mL酵母提取物，2g/100mL蛋白胨，1mL/100mL甘油，100mM PB pH6.0)，分10瓶装，共计2L培养基，48h后加入0.5mL/100mL甲醇进行诱导表达，每12h补加一次甲醇，诱导72h后离心取上清液，得到GJK0601-RBD上清液。上清用12000rpm的离心力离心20min收集，调上清pH至7.5，加入终浓度为0.2M NaCl和10mM咪唑，充分搅拌。
1.5用Chealating亲和层析柱纯化样品
用Chealating亲和层析柱(Φ2.6cm*15cm)初步纯化样品。首先用0.5M的NaOH冲洗柱床3个柱床体积，然后用去离子水平衡至pH中性，然后用0.5M的NiSO4平衡3个柱床体积，再用B1液(20mM pH7.5 Tris-HCl，0.5M NaCl，500mM咪唑)平衡一个柱床体积，最后用A1液(20mM pH7.5 Tris-HCl，0.5M NaCl，10mM咪唑)平衡三个柱床体积，以上流速均为4mL/min。从A管道将上述含有RBD的酵母上清上样，再用A液洗去未结合蛋白，最后用B1洗脱，收集洗脱液30mL；
1.6样品脱盐与保存
用G25 fine层析柱(Φ1.6cm*30cm)将Chealating亲和层析柱初步纯化样品除盐，流动相为A2液(20mM pH7.5磷酸盐缓冲液，150mM NaCl)。首先用0.5M的NaOH冲洗柱床3个柱床体积，然后用去离子水平衡至pH7.0，最后用A2液平衡三个柱床体积，流速均为4mL/min，从A管道上样，并收集样品40mL，获得的洗脱峰即为RBD蛋白，分装冻存于-80℃。
图3为纯化RBD蛋白的SDS-PAGE图。由图可见，纯化后RBD蛋白无杂带，预测分子量约为25KD，因表达蛋白有糖基化，分子量略大于25KD，大小约为30KD。
二、ELISA检测抗体mhC3与RBD的特异性结合
1、取200ng RBD重组蛋白(实施例3步骤一制备)，补碳酸盐包被缓冲液(pH 9.6)至100μL，按每孔100μL加入到酶标板(Corning，9018)中，设置3个复孔，4℃包被过夜。
2、完成上述步骤后，取所述酶标板，PBST洗板3次，加入含有2％BSA的PBS封闭液，37℃孵育2h。
3、完成上述步骤后，取所述酶标板，弃去封闭液，每孔加入100μL的实施例2得到的mhC3抗体原液(浓度300μg/mL)，37℃孵育90min，然后PBST(PBS+0.1％Tween20)洗板3次。
4、完成上述步骤后，取上述酶标板，每孔加入100μL的1：4000倍稀释酶标抗体-山羊抗人IgG-HRP(中杉金桥，ZB-2304)，37℃孵育45min，然后PBST洗板3次。
5、完成上述步骤后，取所述酶标板，每孔加入50μL OPD底物显色液，室温下孵育10min。
6、完成上述步骤后，取所述酶标板，每孔加入50μL 1M硫酸溶液终止酶联反应。
7、酶标仪492nm/630nm双波长测定光密度值。
以上步骤同时设置采用55型腺病毒Fiber蛋白、肉毒毒素AHC片段和狂犬病毒G蛋白，作为抗原替代RBD重组蛋白的对照组。
结果如图4所示。结果表明，mhC3抗体可以特异性结合RBD重组蛋白，而不结合腺病毒Fiber蛋白，狂犬病毒G蛋白和肉毒毒素AHC这些无关抗原。
三、mhC3抗体与RBD结合能力的检测
1、取200ng RBD重组蛋白(实施例3步骤一制备)，补碳酸盐包被缓冲液(pH 9.6)至100μL，按每孔100μL加入到酶标板(Corning，9018)中，设置3个复孔，4℃包被过夜。
2、完成上述步骤后，取所述酶标板，PBST洗板6次，加入含有3％(质量百分含量)BSA的PBS封闭液，37℃孵育2h。
3、完成上述步骤后，取所述酶标板，弃去封闭液，每孔加入100μL按照2倍倍比稀释的mhC3抗体溶液(起始浓度1.2nM)，一共设置11个梯度，37℃孵育90min，然后PBST洗板6次。
4、完成上述步骤后，取所述酶标板，每孔加入100μL的1：4000倍稀释HRP标记的抗人IgG抗体(中杉金桥，ZB-2304)，37℃孵育45min，PBST洗板3次。
5、完成上述步骤后，取所述酶标板，每孔加入50μL OPD底物显色液，室温下孵育10min。
6、完成上述步骤后，取所述酶标板，每孔加入50μL 1M硫酸溶液终止酶联反应。
7、酶标仪492nm/630nm双波长测定光密度值。
结果如图5所示。图中，横坐标为蛋白摩尔浓度的对数值，纵坐标为光密度值。分析显示mhC3抗体与RBD重组蛋白的结合能力为EC50＝0.01286nM。
实施例4、mhC3抗体中和新冠病毒假病毒活性检测
一、假病毒的制备
1、S蛋白表达质粒的构建
根据GENEBANK公布SARS-CoV-2基因序列(NC_045512.2)，委托上海生工生物工程有限公司合成病毒Spike基因全长基因序列(去除末端19个氨基酸，序列如SEQ ID No.16所示)，利用常规的分子生物学技术将合成的基因克隆至pcDNA3.1(+)(Invitrogen，V79020)，插入至Kpn I和Xho I两个酶切位点之间，经测序验证正确后命名为pcDNA3.1-ST19。
2、假病毒包装
2.1假病毒包装前一天调整悬浮细胞FreeStyleTM HEK293-F(Invitrogen公司，R79007)浓度至1×106/mL，接种100mL至250mL细胞瓶，37℃，150rpm培养24h；
2.2假病毒包装当天，取60μg pNL4.3-Luc-E-R-(NTCC，3767994)和20μg pcDNA3.1-ST19混匀，冻融3次，加入3mL opti-MEM，80uL FectoPRO转染试剂，混匀后室温放置15min，缓慢加入步骤2.1的细胞中，37℃培养3-4d；
2.3培养结束，收集培养物：50mL离心管每支35mL，4℃，3000rpm离心30min；取35mL上清直接分装，1.2mL/支，-70℃保存；其余约70mL上清加入1/4体积5×PEG6000，混匀后4℃放置过夜；
2.4 4℃，3000rpm离心30min，弃上清，将沉淀悬至合适体积的IMDM中(可浓缩10-40倍)，分装(冰上操作)，-70℃保存。
3、粗测假病毒滴度
3.1 96孔板中第二行至第八行加入50μL DMEM，第1行加入50μL假病毒样品(每个样品做2-3个复孔)，第二行加入25μL假病毒样品，然后将第二行混匀，取25μL加入第三行，依次向下稀释，直至第八行混匀后吸弃25μL。
3.2 96孔板放入37℃孵箱，孵育1h。
3.3孵育至0.5h时，可开始消化Huh7细胞(NTCC，SCSP-526)，单细胞悬液密度调整至4×105/mL。
3.4 96孔板中每孔加入100μL Huh7细胞，37℃孵箱培养2d。
3.5弃96孔板中培养上清，在卫生纸上拍干残液，每孔加入40μL 1×PassiveLysis Buffer(Promega，E194A，用前用水稀释至1×)，摇床上避光震荡10-20min；轻拍96孔板使每孔细胞均脱落，将孔中所有裂解物对应转移到检测Luciferase的白板中。
3.6用MD公司的Spectra Max L检测单荧光素酶，每孔加入40μL LuciferaseAssay Substrate(Promega，E1501)；根据Reed-Muench法计算假病毒滴度。经计算假病毒滴度为：1×105TCID50。
4、利用假病毒检测抗体的中和活性
4.1稀释抗体：96孔板中第二行至第八行加入140μL DMEM，第1行加入210μLmhC3抗体(此为3个复孔的量)，然后从第一行取70μL加入第二行，依次向下稀释，直至第八行，转移至另一块96孔板，共做15个稀释度，最后一个稀释度混匀后吸弃70μL。
4.2每孔加入35μL假病毒，混匀后将每孔中的样品分至另一96孔板，1列分3列，每孔50μL，放入37℃孵箱，孵育1h。
4.3孵育至0.5h时，可开始消化Huh7细胞(NTCC，SCSP-526)，单细胞悬液密度调整至4×105/mL。
4.4 96孔板中每孔加入100μL Huh7细胞，37℃孵箱培养2d。
4.5弃96孔板中培养上清，在卫生纸上拍干残液，每孔加入40μL 1×PassiveLysis Buffer(Promega，E194A，用前用水稀释至1×)，摇床上避光震荡10-20min；轻拍96孔板使每孔细胞均脱落，将孔中所有裂解物对应转移到检测Luciferase的白板中。
4.6用MD公司的Spectra Max L检测单荧光素酶，每孔加入40μL LuciferaseAssay Substrate(Promega，E1501)；利用软件GraphPad Prism 5作图，并计算EC50。结果显示mhC3抗体可以有效中和新冠肺炎假病毒，EC50为0.2233μg/mL(图6)。
实施例5、鼠源单链抗体C3抗体的人源化改造及亲和力、中和活性检测
一、鼠源抗体C3可变区氨基酸序列分析及空间结构模拟
利用www.abysis.org对实施例1获得的鼠源抗体C3重、轻链可变区氨基酸序列进行特性分析(图7)，借助Z-score打分模式对鼠源抗体C3的人源化程度进行了预测(图8)，并分析其具有鼠源特征的潜在位点(图9)。
基于鼠源抗体C3重、轻链可变区的氨基酸序列，借助SwissModel(www.expasy.ch)搭建其空间结构(图10)，分析氨基酸残基溶液可及性表面积，对照氨基酸序列人源化情况(图9)，确定可以进行人源化的位置。进一步通过SwissModel搭建人源化后SFC3重、轻链可变区空间结构(图11)。从主链碳原子走线以及结构叠合分析可以看出，人源化抗体SFC3能够保持母本鼠源抗体的特性。
二、利用常规分子生物学方法制备重组人源化的SFC3全抗体
人源化抗体SFC3，其重链氨基酸序列如SEQ ID No.9所示，轻链氨基酸序列如SEQID No.10所示。
SEQ ID No.9中，自N端第1-122位氨基酸残基组成重链可变区VH(其中，第31-35位氨基酸残基组成HCDR1(SEQ ID No.1)，第50-68位氨基酸残基组成HCDR2(SEQ ID No.2)，第101-112位氨基酸残基组成HCDR3(SEQ ID No.3))，第123-221位氨基酸残基组成重链恒定区CH1，第222-236位氨基酸残基组成重链铰链区Hinge，第237-346位氨基酸残基组成重链恒定区CH2，第347-453位氨基酸残基组成重链恒定区CH3。
SEQ ID No.10中，自N端第1-112位氨基酸残基组成轻链可变区VL(其中，第24-39位氨基酸残基组成LCDR1(SEQ ID No.4)，第55-61位氨基酸残基组成LCDR2(SEQ ID No.5)，第94-102位氨基酸残基组成LCDR3(SEQ ID No.6))，第113-219位氨基酸残基组成轻链恒定区CL。
SEQ ID No.13所示的DNA分子编码SEQ ID No.9所示的多肽(重链)。SEQ ID No.13中，自5’端第1-366位核苷酸编码VH(其中，第91-105位核苷酸编码HCDR1，第148-204位核苷酸编码HCDR2，第301-336位核苷酸编码HCDR3)，第367-663位核苷酸编码CH1，第664-708位核苷酸编码Hinge，第709-1038位核苷酸编码CH2，第1039-1359位核苷酸编码CH3，第1360-1362位核苷酸为终止密码子。
SEQ ID No.14所示的DNA分子编码SEQ ID No.10所示的多肽(轻链)。SEQ IDNo.14中，自5’端第1-336位核苷酸编码VL(其中，第70-117位核苷酸编码LCDR1，第163-183位核苷酸编码LCDR2，第280-306位核苷酸编码LCDR3)，第337-657位核苷酸编码CL，第658-660位核苷酸为终止密码子。
其中，互补决定区的序列根据Kabat定义。抗体SFC3为IgG1，轻链类型为kappa(κ)型。
SFC3抗体的具体制备方法参见实施例2。
三、SFC3抗体亲和力检测，方法同实施例3，同时设置亲本抗体C3作为对照，结果显示SFC3结合RBD的EC50为0.028nM(图12)。
四、SFC3中和新冠病毒假病毒的活性检测，方法同实施例4，同时设置亲本抗体C3作为对照，结果显示SFC3抗体较亲本抗体C3中和活性下降，但仍可以有效中和新冠肺炎假病毒，EC50为2.7μg/mL(图13)。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
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1 5
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<400> 6
Ser Gln Ser Thr His Val Pro Tyr Thr
1 5
<210> 7
<211> 453
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<400> 7
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Gln Ser Met
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Thr Pro Tyr Tyr Gly Asn Tyr Ala Asp Trp Phe Thr Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
195 200 205
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys
210 215 220
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
225 230 235 240
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
245 250 255
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
260 265 270
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
275 280 285
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
290 295 300
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
305 310 315 320
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
325 330 335
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
340 345 350
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
355 360 365
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
370 375 380
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
385 390 395 400
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
405 410 415
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
420 425 430
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
435 440 445
Leu Ser Pro Gly Lys
450
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<213> Artificial sequence
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Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
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Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser
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100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
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Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
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Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr
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Ala Arg Ile Arg Ser Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
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Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Thr Ser Ser
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85 90 95
Tyr Cys Val Thr Pro Tyr Tyr Gly Asn Tyr Ala Asp Trp Phe Thr Tyr
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Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120 125
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130 135 140
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Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
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Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
275 280 285
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Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
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Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
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Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
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Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
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Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Ser Val Ser Leu Gly
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Asp Ser Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
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Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser
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Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
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gaggtgcagc ttgttgagtc tgggggagac ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc 60
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ccctactatg gtaattacgc agactggttt acttactggg gccaaggaac ctcagtcacc 360
gtgtcctcag ctagcaccaa gggcccatcg gtcttccccc tggcaccctc ctccaagagc 420
acctctgggg gcacagcggc cctgggctgc ctggtcaagg actacttccc cgaaccggtg 480
acggtgtcgt ggaactcagg cgccctgacc agcggcgtgc acaccttccc ggctgtccta 540
cagtcctcag gactctactc cctcagcagc gtggtgaccg tgccctccag cagcttgggc 600
acccagacct acatctgcaa cgtgaatcac aagcccagca acaccaaggt ggacaagaga 660
gttgagccca aatcttgtga caaaactcac acatgcccac cgtgcccagc acctgaactc 720
ctggggggac cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc 780
cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag 840
ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag 900
cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg 960
aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa 1020
accatctcca aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc 1080
cgggaggaga tgaccaagaa ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc 1140
agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg 1200
cctcccgtgc tggactccga cggctccttc ttcctctata gcaagctcac cgtggacaag 1260
agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac 1320
cactacacgc agaagagcct ctccctgtcc ccgggtaaat ga 1362
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<211> 660
<212> DNA
<213> Artificial sequence
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gatgttgtga tgacccagac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc 60
atctcttgca gatctagtca gagccttgta cacagtaatg gaaacaccta tttacattgg 120
tacctgcaga agccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt 180
tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 240
agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tatttctgct ctcaaagtac acatgttccg 300
tacacgttcg gaggggggac caagttggaa ataaaacgta cggtggcggc gccatctgtc 360
ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggta ccgctagcgt tgtgtgcctg 420
ctgaataact tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga aggtggataa cgccctccaa 480
tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag caggacagca aggacagcac ctacagcctc 540
agcagcaccc tgacgctgag caaagcagac tacgagaaac acaaagtcta cgcctgcgaa 600
gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc acaaagagct tcaacagggg agagtgttag 660
<210> 13
<211> 1362
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 13
gaagtgcagc tggtggagag cggcggcggc ctggtgaagc ccggcggcag cctgaagctg 60
agctgcgccg ccagcggctt caccttcaac acctacgcca tgaactgggt gagacagagc 120
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gacatcgtga tgacacagtc cccacttagt ctgagcgtga gcctgggcga cagcgccagc 60
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agcagcaccc tgacgctgag caaagcagac tacgagaaac acaaagtcta cgcctgcgaa 600
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<211> 675
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 15
agagtacaac caactgaatc cattgttaga tttcctaata tcactaacct gtgcccattt 60
ggtgaagttt ttaacgctac tagatttgct tctgtttacg cctggaacag aaagagaatt 120
tctaactgtg ttgctgatta ctctgttctt tacaactctg cctctttttc tacttttaag 180
tgttatggtg tctctccaac caagttgaac gatttgtgtt ttaccaacgt ttacgctgat 240
tcttttgtta ttagaggtga tgaggttaga caaattgctc ctggtcaaac tggtaagatt 300
gctgattata actacaagtt gcctgatgat tttactggtt gcgtcattgc ttggaactct 360
aataatttgg attctaaggt tggtggaaat tacaactact tgtacagatt gtttagaaag 420
agtaacttga agccatttga aagagatatt tctactgaaa tctaccaagc tggatctact 480
ccttgtaacg gtgtcgaagg ttttaactgc tactttcctt tgcagtctta cggttttcaa 540
cccactaacg gtgttggtta ccagccctac agagttgttg ttttgtcttt tgagttgctt 600
catgctccag ctactgtttg tggtcctaag aagtctacta acttggttaa gaacaagtgt 660
gttaatttct aatag 675
<210> 16
<211> 3765
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 16
atgtttgttt ttcttgtttt attgccacta gtctctagtc agtgtgttaa tcttacaacc 60
agaactcaat taccccctgc atacactaat tctttcacac gtggtgttta ttaccctgac 120
aaagttttca gatcctcagt tttacattca actcaggact tgttcttacc tttcttttcc 180
aatgttactt ggttccatgc tatacatgtc tctgggacca atggtactaa gaggtttgat 240
aaccctgtcc taccatttaa tgatggtgtt tattttgctt ccactgagaa gtctaacata 300
ataagaggct ggatttttgg tactacttta gattcgaaga cccagtccct acttattgtt 360
aataacgcta ctaatgttgt tattaaagtc tgtgaatttc aattttgtaa tgatccattt 420
ttgggtgttt attaccacaa aaacaacaaa agttggatgg aaagtgagtt cagagtttat 480
tctagtgcga ataattgcac ttttgaatat gtctctcagc cttttcttat ggaccttgaa 540
ggaaaacagg gtaatttcaa aaatcttagg gaatttgtgt ttaagaatat tgatggttat 600
tttaaaatat attctaagca cacgcctatt aatttagtgc gtgatctccc tcagggtttt 660
tcggctttag aaccattggt agatttgcca ataggtatta acatcactag gtttcaaact 720
ttacttgctt tacatagaag ttatttgact cctggtgatt cttcttcagg ttggacagct 780
ggtgctgcag cttattatgt gggttatctt caacctagga cttttctatt aaaatataat 840
gaaaatggaa ccattacaga tgctgtagac tgtgcacttg accctctctc agaaacaaag 900
tgtacgttga aatccttcac tgtagaaaaa ggaatctatc aaacttctaa ctttagagtc 960
caaccaacag aatctattgt tagatttcct aatattacaa acttgtgccc ttttggtgaa 1020
gtttttaacg ccaccagatt tgcatctgtt tatgcttgga acaggaagag aatcagcaac 1080
tgtgttgctg attattctgt cctatataat tccgcatcat tttccacttt taagtgttat 1140
ggagtgtctc ctactaaatt aaatgatctc tgctttacta atgtctatgc agattcattt 1200
gtaattagag gtgatgaagt cagacaaatc gctccagggc aaactggaaa gattgctgat 1260
tataattata aattaccaga tgattttaca ggctgcgtta tagcttggaa ttctaacaat 1320
cttgattcta aggttggtgg taattataat tacctgtata gattgtttag gaagtctaat 1380
ctcaaacctt ttgagagaga tatttcaact gaaatctatc aggccggtag cacaccttgt 1440
aatggtgttg aaggttttaa ttgttacttt cctttacaat catatggttt ccaacccact 1500
aatggtgttg gttaccaacc atacagagta gtagtacttt cttttgaact tctacatgca 1560
ccagcaactg tttgtggacc taaaaagtct actaatttgg ttaaaaacaa atgtgtcaat 1620
ttcaacttca atggtttaac aggcacaggt gttcttactg agtctaacaa aaagtttctg 1680
cctttccaac aatttggcag agacattgct gacactactg atgctgtccg tgatccacag 1740
acacttgaga ttcttgacat tacaccatgt tcttttggtg gtgtcagtgt tataacacca 1800
ggaacaaata cttctaacca ggttgctgtt ctttatcagg atgttaactg cacagaagtc 1860
cctgttgcta ttcatgcaga tcaacttact cctacttggc gtgtttattc tacaggttct 1920
aatgtttttc aaacacgtgc aggctgttta ataggggctg aacatgtcaa caactcatat 1980
gagtgtgaca tacccattgg tgcaggtata tgcgctagtt atcagactca gactaattct 2040
cctcggcggg cacgtagtgt agctagtcaa tccatcattg cctacactat gtcacttggt 2100
gcagaaaatt cagttgctta ctctaataac tctattgcca tacccacaaa ttttactatt 2160
agtgttacca cagaaattct accagtgtct atgaccaaga catcagtaga ttgtacaatg 2220
tacatttgtg gtgattcaac tgaatgcagc aatcttttgt tgcaatatgg cagtttttgt 2280
acacaattaa accgtgcttt aactggaata gctgttgaac aagacaaaaa cacccaagaa 2340
gtttttgcac aagtcaaaca aatttacaaa acaccaccaa ttaaagattt tggtggtttt 2400
aatttttcac aaatattacc agatccatca aaaccaagca agaggtcatt tattgaagat 2460
ctacttttca acaaagtgac acttgcagat gctggcttca tcaaacaata tggtgattgc 2520
cttggtgata ttgctgctag agacctcatt tgtgcacaaa agtttaacgg ccttactgtt 2580
ttgccacctt tgctcacaga tgaaatgatt gctcaataca cttctgcact gttagcgggt 2640
acaatcactt ctggttggac ctttggtgca ggtgctgcat tacaaatacc atttgctatg 2700
caaatggctt ataggtttaa tggtattgga gttacacaga atgttctcta tgagaaccaa 2760
aaattgattg ccaaccaatt taatagtgct attggcaaaa ttcaagactc actttcttcc 2820
acagcaagtg cacttggaaa acttcaagat gtggtcaacc aaaatgcaca agctttaaac 2880
acgcttgtta aacaacttag ctccaatttt ggtgcaattt caagtgtttt aaatgatatc 2940
ctttcacgtc ttgacaaagt tgaggctgaa gtgcaaattg ataggttgat cacaggcaga 3000
cttcaaagtt tgcagacata tgtgactcaa caattaatta gagctgcaga aatcagagct 3060
tctgctaatc ttgctgctac taaaatgtca gagtgtgtac ttggacaatc aaaaagagtt 3120
gatttttgtg gaaagggcta tcatcttatg tccttccctc agtcagcacc tcatggtgta 3180
gtcttcttgc atgtgactta tgtccctgca caagaaaaga acttcacaac tgctcctgcc 3240
atttgtcatg atggaaaagc acactttcct cgtgaaggtg tctttgtttc aaatggcaca 3300
cactggtttg taacacaaag gaatttttat gaaccacaaa tcattactac agacaacaca 3360
tttgtgtctg gtaactgtga tgttgtaata ggaattgtca acaacacagt ttatgatcct 3420
ttgcaacctg aattagactc attcaaggag gagttagata aatattttaa gaatcataca 3480
tcaccagatg ttgatttagg tgacatctct ggcattaatg cttcagttgt aaacattcaa 3540
aaagaaattg accgcctcaa tgaggttgcc aagaatttaa atgaatctct catcgatctc 3600
caagaacttg gaaagtatga gcagtatata aaatggccat ggtacatttg gctaggtttt 3660
atagctggct tgattgccat agtaatggtg acaattatgc tttgctgtat gaccagttgc 3720
tgtagttgtc tcaagggctg ttgttcttgt ggatcctgct gctaa 3765
Claims (10)
1.抗体，其特征在于：所述抗体的重链可变区中HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列依次如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3所示；所述抗体的轻链可变区中LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列依次如SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6所示。
2.根据权利要求1所述的抗体，其特征在于：所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ IDNo.7自N端起第1-122位，或者与SEQ ID No.7自N端起第1-122位具有至少90％的一致性；
所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID No.8自N端起第1-112位，或者与SEQ ID No.8自N端起第1-112位具有至少90％的一致性。
3.根据权利要求1所述的抗体，其特征在于：所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ IDNo.9自N端起第1-122位，或者与SEQ ID No.9自N端起第1-120位具有至少90％的一致性；
所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID No.10自N端起第1-112位，或者与SEQ IDNo.10自N端起第1-112位具有至少90％的一致性。
4.根据权利要求2所述的抗体，其特征在于：所述抗体的重链的氨基酸序列为SEQ IDNo.7，或者与SEQ ID No.7具有至少90％的一致性；
所述抗体的轻链的氨基酸序列为SEQ ID No.8或者与SEQ ID No.8具有至少90％的一致性。
5.根据权利要求3所述的抗体，其特征在于：所述抗体的重链的氨基酸序列为SEQ IDNo.9，或者与SEQ ID No.9具有至少90％的一致性；
所述抗体的轻链的氨基酸序列为SEQ ID No.10或者与SEQ ID No.10具有至少90％的一致性。
6.核酸分子，其特征在于：所述核酸分子编码权利要求1-5中任一所述的抗体或所述抗体中的抗原结合部分。
7.根据权利要求6所述的核酸分子，其特征在于：在所述核酸分子中，编码所述抗体的重链可变区中HCDR1、HCDR2和HCDR3的核苷酸序列为如下(a1)或(a2)：
(a1)依次如SEQ ID No.11自5’端起第91-105位、第148-204位、第301-336位所示；
(a2)依次如SEQ ID No.13自5’端起第91-105位、第148-204位、第301-336位所示；
和/或
在所述核酸分子中，编码所述抗体的轻链可变区中LCDR1、LCDR2和LHCDR3的核苷酸序列为如下(b1)或(b2)：
(b1)依次如SEQ ID No.12自5’端起第70-117位、第163-183位、第280-306位所示；
(b2)依次如SEQ ID No.14自5’端起第70-117位、第163-183位、第280-306位所示；
进一步地，在所述核酸分子中，编码所述抗体的所述重链可变区的核苷酸序列为SEQID No.11自5’端起第1-366位或者与SEQ ID No.11自5’端起第1-366位具有至少90％的一致性；编码所述抗体的所述轻链可变区的核苷酸序列为SEQ ID No.12自5’端起第1-336位或者与SEQ ID No.12自5’端起第1-336位具有至少90％的一致性；或
进一步地，在所述核酸分子中，编码所述抗体的所述重链可变区的核苷酸序列为SEQID No.13自5’端起第1-366位或者与SEQ ID No.13自5’端起第1-366位具有至少90％的一致性；编码所述抗体的所述轻链可变区的核苷酸序列为SEQ ID No.14自5’端起第1-336位或者与SEQ ID No.14自5’端起第1-336位具有至少90％的一致性；
或
更进一步地，在所述核酸分子中，编码所述抗体的重链的核苷酸序列为SEQ ID No.11或者与SEQ ID No.11具有至少90％的一致性；编码所述抗体的轻链的核苷酸序列为SEQ IDNo.12或者与SEQ ID No.12具有至少90％的一致性；或
更进一步地，在所述核酸分子中，编码所述抗体的重链的核苷酸序列为SEQ ID No.13或者与SEQ ID No.13具有至少90％的一致性；编码所述抗体的轻链的核苷酸序列为SEQ IDNo.14或者与SEQ ID No.14具有至少90％的一致性。
8.含有权利要求6或7所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组细胞或重组菌。
9.药物组合物，其特征在于：所述药物组合物包含权利要求1-5中任一所述的抗体和药学可接受的赋形剂、稀释剂或载体。
10.应用，为如下任一所示：
(A1)权利要求6-8中任一所述的核酸分子或表达盒、重组载体、重组细胞或重组菌在制备权利要求1-5中任一所述抗体或权利要求9所述药物组合物中的应用；
(A2)权利要求1-5中任一所述抗体在制备权利要求9所述药物组合物中的应用；
(A3)权利要求1-9中任一所述抗体或核酸分子或表达盒、重组载体、重组细胞或重组菌或药物组合物在制备用于预防和/或治疗由SARS-CoV-2感染所致疾病的产品中的应用；
(A4)权利要求1-9中任一所述抗体或核酸分子或表达盒、重组载体、重组细胞或重组菌或药物组合物在制备用于抑制SARS-CoV-2感染的产品中的应用；
(A5)权利要求1-9中任一所述抗体或核酸分子或表达盒、重组载体、重组细胞或重组菌或药物组合物在制备用于检测SARS-CoV-2的产品中的应用；
(A6)权利要求1-9中任一所述抗体或核酸分子或表达盒、重组载体、重组细胞或重组菌或药物组合物在制备用于中和SARS-CoV-2的产品中的应用；
(A7)权利要求1-9中任一所述抗体或核酸分子或表达盒、重组载体、重组细胞或重组菌或药物组合物在制备用于检测SARS-CoV-2的RBD蛋白的产品中的应用；
(A8)权利要求1-9中任一所述抗体或核酸分子或表达盒、重组载体、重组细胞或重组菌或药物组合物在制备用于结合SARS-CoV-2的RBD蛋白的产品中的应用。
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