WO2023113094A1 - 면역원성이 증가된 코로나바이러스감염증-19 백신 조성물 - Google Patents

면역원성이 증가된 코로나바이러스감염증-19 백신 조성물 Download PDF

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WO2023113094A1
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vaccine composition
covid
vaccine
present
increased immunogenicity
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PCT/KR2021/095130
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정호경
원용관
방석진
박정아
김민
김현석
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주식회사 씨티씨백
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/215—Coronaviridae, e.g. avian infectious bronchitis virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses

Definitions

  • the present invention relates to a coronavirus infection-19 (COVID-19) vaccine composition with increased immunogenicity, and more particularly, to a spike 1 recombinant antigen protein and a receptor binding domain (RBD) of the SARS-CoV-2 virus. ) an antigenic composition comprising a recombinant antigenic protein; And a COVID-19 vaccine composition with increased immunogenicity comprising Montanide Gel as an adjuvant.
  • COVID-19 coronavirus infection-19
  • RBD receptor binding domain
  • Coronavirus is an RNA virus that causes respiratory diseases. In December 2019, global attention increased as cases of respiratory disease infections amplified in Wuhan, China. As a result of genome analysis of the coronavirus, it is SARS-CoV-2 (Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2), a new virus that belongs to the beta corona virus and has never been found in humans or animals. was named Coronavirus Disease-2019 (COVID-19).
  • SARS-CoV-2 severe acute respiratory syndrome coronavirus 2
  • Main serious injuries that occur when infected with COVID-19 include symptoms such as lethargy, high fever of 37.5 degrees or higher, cough, sore throat, phlegm, muscle pain, headache, shortness of breath and pneumonia, respiratory failure due to lung damage, etc. However, it can lead to death in severe cases, so it is very urgent to develop a diagnosis, vaccine, and treatment for COVID-19.
  • 105 vaccines are in clinical trials, 35 are in final testing, and more than 75 vaccines are actively researched in preclinical animal studies. Currently, 8 vaccines have been approved, and 13 candidates have limited approval. It became.
  • Representative vaccines include mRNA vaccines produced by Pfizer and Moderna and adenovirus vaccines produced by AstraZeneca.
  • mRNA vaccines have proven to be very effective in immunity against COVID-19, but have reduced preventive effects against side effects and variants. and problems such as a decrease in preventive effect over time.
  • SARS-CoV-2 has a 30 kb nucleotide and has four important structural proteins as follows; Nucleocapsid (N), Spike (S), Membrane (M), and Envelope (E) proteins.
  • N Nucleocapsid
  • S Spike
  • M Membrane
  • E Envelope
  • the S protein spike protein is an important site as it binds to the receptor of the host cell, and replication takes place while transferring the viral nucleocapsid into the cell.
  • SARS-CoV-2 is known to be capable of viral replication by binding to the ACE2 (angiotensin converting enzyme 2) receptor of human cells.
  • the receptor-binding domain (RBD) included in the S protein (spike protein) of coronavirus is a key region that binds to the host cell's ACE2 receptor and induces strong neutralizing antibodies against SARS-CoV-2 infection. Because it contains multiple conformational-dependent epitopes, it can be a key target for COVID-19 treatment and vaccine development (J. Immunol., 2005;174:4908-4915).
  • an object of the present invention is an antigen composition
  • an antigen composition comprising Spike 1 recombinant antigen protein and RBD (receptor binding domain) recombinant antigen protein of SARS-CoV-2 virus; And to provide a COVID-19 vaccine composition with increased immunogenicity comprising Montanide Gel as an immune enhancer.
  • the present invention relates to an antigen composition
  • an antigen composition comprising spike 1 recombinant antigen protein and RBD (receptor binding domain) recombinant antigen protein of SARS-CoV-2 virus; and
  • COVID-19 vaccine composition with increased immunogenicity, comprising Montanide Gel as an adjuvant.
  • the Spike 1 recombinant antigen protein of the SARS-CoV-2 virus may be represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the RBD (receptor binding domain) recombinant antigen protein may be represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • amino acid of SEQ ID NO: 1 may be encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3
  • amino acid of SEQ ID NO: 2 may be encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4.
  • the immune enhancer may be included in 5 to 30% by weight of the total composition.
  • the Montanide gel may be Montanide Gel PR02.
  • the vaccine composition may be administered to a subject selected from the group consisting of mice, guinea pigs, cats and dogs.
  • a single dose of each antigen protein in the vaccine composition may be 5 ⁇ g to 100 ⁇ g.
  • the vaccine composition may be administered firstly to an individual and then secondly administered 10 to 30 days later.
  • the vaccine composition can be administered through subcutaneous injection, intraperitoneal injection or intramuscular injection.
  • the vaccine composition can activate CD4 + IL-5 + T cells (T helper 2) or CD4 + IL-17 + T cells (T helper 17).
  • the vaccine composition can activate IFN- ⁇ or IL-5 cytokines.
  • the vaccine composition may have cross-protective efficacy against the South African or British variant COVID-19 virus.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition for preventing or treating COVID-19 with increased immunogenicity comprising the above vaccine composition.
  • the present invention also provides a method for preventing COVID-19 comprising administering the vaccine composition to a non-human subject.
  • the COVID-19 vaccine composition of the present invention has increased antibody formation ability (immunogenicity) compared to the vaccine composition without Montanide gel, and by vaccination, CD4 + IL-5 + T It was confirmed that cells (T helper 2) and CD4 + IL-17 + T cells (T helper 17) were activated, and the production of IFN- ⁇ and IL-5 cytokines increased.
  • the vaccine composition of the present invention shows high immunogenicity in the South African and British strains of the COVID-19 virus, it can be used as a vaccine composition for preventing or treating COVID-19.
  • A S1 recombinant antigen protein
  • B RBD recombinant antigen protein
  • the present invention relates to an antigen composition
  • an antigen composition comprising a spike 1 (Spike 1) recombinant antigen protein and RBD (receptor binding domain) recombinant antigen protein of SARS-CoV-2 virus; and a COVID-19 vaccine composition with increased immunogenicity, comprising Montanide Gel as an adjuvant.
  • spike 1 spike 1
  • RBD receptor binding domain
  • the term "vaccine” is a biological preparation containing an antigen that induces an immune response in a living body, and is an immunogen that induces immunity in a living body by being injected or orally administered to humans or animals to prevent infections.
  • the animal is a human or non-human animal, and the non-human animal refers to pigs, cows, horses, dogs, goats, sheep, etc., but is not limited thereto.
  • the Spike 1 recombinant antigen protein of the SARS-CoV-2 virus may be represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the RBD (receptor binding domain) recombinant antigen protein may be represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • amino acid of SEQ ID NO: 1 may be encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3
  • amino acid of SEQ ID NO: 2 may be encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4.
  • the immune enhancer may be included in 5 to 30%, preferably 5 to 20% of the total composition, and the Montanide gel may be Montanide Gel PR02.
  • the vaccine composition comprises the Spike 1 recombinant antigen protein of SARS-CoV-2 virus comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and the receptor binding domain (RBD) comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 It can be prepared by a method comprising mixing the recombinant antigen protein and Montanide Gel as an immunostimulant.
  • the Spike 1 recombinant antigen protein of the SARS-CoV-2 virus comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 includes: (a) preparing a recombinant vector comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3; (b) transforming cells with the vector and culturing the transformed cells; and obtaining the Spike 1 recombinant antigen protein of the SARS-CoV-2 virus from the cell supernatant cultured in step (b).
  • the RBD recombinant antigen protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 comprises: (a) preparing a recombinant vector comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 4; (b) transforming cells with the vector and culturing the transformed cells; and obtaining the RBD recombinant antigen protein of the SARS-CoV-2 virus by disrupting the cells cultured in step (b).
  • the gene base sequence and amino acid sequence including Spike 1 (S1) and RBD (receptor binding domain) protein of SARS-CoV-2 isolated from Wuhan, China were obtained, which A vaccine composition containing the S1 recombinant antigen protein and the RBD recombinant antigen protein as antigen proteins was prepared using the vaccine composition.
  • a recombinant vector into which the S1 gene represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 of the present invention is inserted and a recombinant vector into which the RBD gene represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4 is inserted are prepared, and then transformed into CHO cells to produce antigenic proteins.
  • FIG. 1 it was confirmed that both the S1 recombinant antigen protein and the RBD recombinant antigen protein were normally expressed.
  • the term "expression vector” is a gene product containing essential regulatory elements such as a promoter so that a target gene can be expressed in an appropriate host cell.
  • Vectors may be selected from one or more of plasmids, retroviral vectors and lentiviral vectors. Once transformed into a suitable host, the vector can replicate and function independently of the host genome or, in some cases, can integrate into the genome itself.
  • vectors may contain expression control elements that allow for correct expression of the coding region in a suitable host.
  • regulatory elements are well known to those skilled in the art and include, for example, promoters, ribosome-binding sites, enhancers and other regulatory elements for regulating gene transcription or mRNA translation. can do.
  • the specific structure of the expression control sequence may vary depending on the function of the species or cell type, but generally includes 5' ratios that participate in transcription initiation and translation initiation, such as TATA boxes, capped sequences, CAAT sequences, etc., respectively. -contains a transcribed sequence, and a 5' or 3' non-translated sequence.
  • a 5' non-transcribed expression control sequence can include a promoter region that can include promoter sequences for transcribing and regulating functionally linked nucleic acids.
  • promoter refers to a minimal sequence sufficient to direct transcription.
  • promoter constructs sufficient to allow expression of a regulatable promoter dependent gene induced by cell type specific or external signals or agents may be included, and such constructs may be located on the 5' or 3' portion of the gene. . Both conserved promoters and inducible promoters are included. Promoter sequences may be of prokaryotic, eukaryotic or viral origin.
  • the term "transformation” refers to introducing a vector having a polynucleotide encoding one or more target proteins into a host cell, to prepare a transformant (transformed cell) into which the expression vector is introduced into the host cell.
  • Methods for this include the calcium phosphate method or calcium chloride/rubidium chloride method described in the literature (Sambrook, J., et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2nd edition), Cold Spring Harbor Laboratory, 1. 74, 1989), Examples include electroporation, electroinjection, chemical treatment methods such as PEG, and methods using a gene gun.
  • antibody protein When the transformant expressing the vector is cultured in a nutrient medium, antibody protein can be produced and isolated in large quantities.
  • Media and culture conditions can be appropriately selected and used according to the host cell. Conditions such as temperature, medium pH, and incubation time should be appropriately adjusted so as to be suitable for cell growth and mass production of proteins during culture.
  • the vector according to the present invention can be transformed into a host cell, preferably a mammalian cell, for antibody production.
  • a host cell preferably a mammalian cell
  • suitable host cell lines capable of expressing fully glycosylated proteins have been developed in the art and include COS-1 (eg ATCC CRL 1650), COS-7 (eg ATCC CRL-1651), HEK293 , BHK21 (eg ATCC CRL-10), CHO (eg ATCC CRL 1610) and BSC-1 (eg ATCC CRL-26) cell lines, Cos-7 cells, CHO cells, hep G2 cells , P3X63Ag8653, SP2/0-Agl4, 293 cells, HeLa cells, etc., and these cells are readily available, for example, from the American Type Culture Collection (ATCC, USA).
  • the vaccine composition may be administered to a subject selected from the group consisting of mice, guinea pigs, cats and dogs.
  • a single dose of each antigen protein in the vaccine composition may be 5 ⁇ g to 100 ⁇ g.
  • the vaccine composition may be administered firstly to an individual and then secondly administered 10 to 30 days later.
  • the vaccine composition is administered parenterally, for example, rectal, transdermal, intravenous injection, intraarterial injection, intramuscular injection, intradermal injection, subcutaneous injection, intraperitoneal injection, intraventricular injection, etc. It may be administered, preferably via subcutaneous injection, intraperitoneal injection or intramuscular injection.
  • the vaccine composition can activate CD4 + IL-5 + T cells (T helper 2) or CD4 + IL-17 + T cells (T helper 17), IFN- ⁇ or IL-5 cyto Cain expression may be increased.
  • the vaccine composition may have cross-protective efficacy against the South African or British variant COVID-19 virus.
  • an antigen composition comprising SARS-CoV-2 virus spike 1 (Spike 1) recombinant antigen protein and RBD (receptor binding domain) recombinant antigen protein; And a COVID-19 vaccine composition with increased immunogenicity, including Montanide Gel as an adjuvant, was prepared, and the stability of the vaccine composition was confirmed in mice, guinea pigs, cats, and dogs.
  • Spike 1 SARS-CoV-2 virus spike 1
  • RBD receptor binding domain
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating COVID-19 with increased immunogenicity, including the vaccine composition of the present invention.
  • the present invention relates to a method for preventing COVID-19 comprising administering the vaccine composition of the present invention to a non-human subject.
  • the vaccine composition of the present invention may be a non-human subject, preferably a mouse, guinea pig, cat or dog, and can prevent or treat COVID-19 by administering the vaccine composition of the present invention.
  • the vaccine composition of the present invention can be prepared in any suitable, pharmaceutically acceptable formulation.
  • it may be in the form of a solution or suspension for extemporaneous administration, a concentrated stock solution suitable for dilution prior to administration, or prepared in a reconstitutable form such as a lyophilized, freeze-dried, or frozen formulation.
  • the vaccine composition of the present invention may be formulated by including a pharmaceutically acceptable carrier.
  • Pharmaceutically acceptable carriers that can be used for formulation of vaccine compositions are listed and regulated in the Korean Pharmacopoeia or other pharmacopeias, particularly in the US, Japan, and European pharmacopeias, and reference may be made to these pharmacopeias.
  • Such carriers will usually include diluents, excipients, stabilizers, preservatives, and the like.
  • Suitable diluents include propylene glycol, polyethylene glycol, non-aqueous solvents such as vegetable oils such as olive oil and peanut oil, saline (preferably 0.8% saline), water containing a buffer medium (preferably 0.05M phosphate buffer), etc.
  • suitable excipients include starch, glucose, lactose, sucrose, gelatin, malt, rice, wheat flour, chalk, silica gel, sodium stearate, glycerol monostearate, talc, sodium chloride, anhydrous skim milk , glycerol, propylene, glycol, water, ethanol, and the like, and suitable stabilizers include carbohydrates such as sorbitol, mannitol, starch, sucrose, dextran, glutamate, and glucose, or animal and vegetable substances such as milk powder, serum albumin, and casein. or proteins such as microbial proteins.
  • Suitable preservatives include thimerosal, merthiolate, gentamicin, neomycin, nystatin, amphotericin B, tetracycline, penicillin, streptomycin, polymyxin B and the like.
  • the vaccine composition of the present invention may further include an adjuvant other than Montanide gel.
  • An adjuvant may be composed of one or more substances that enhance an immune response to an antigen. Immunostimulants such as complete Freund's, incomplete Freund's, saponins, gelatinous aluminum adjuvants, surface active substances (e.g. lysolecithin, pluronic glycol, polyanions, peptides, oils or hydrocarbon emulsions, etc.), vegetable oils (cottonseed oil, peanut oil, corn oil, etc.), vitamin E acetate, and the like.
  • the vaccine composition of the present invention can be prepared in arbitrary unit doses.
  • a unit dose refers to the amount of an active ingredient and a pharmaceutically acceptable carrier contained in an individual product packaged for use at least once in humans, and the appropriate amount of such active ingredient and carrier is An amount capable of functioning as a vaccine when administered one or more times can be determined nonclinically and clinically within the ordinary skill of a person skilled in the art.
  • the pharmaceutical composition is administered in a pharmaceutically effective amount.
  • pharmaceutically effective amount means an amount sufficient to treat a disease at a reasonable benefit / risk ratio applicable to medical treatment, and the effective dose level is based on the type, severity, and activity of the drug in the patient. , sensitivity to the drug, time of administration, route of administration and excretion rate, duration of treatment, factors including drugs used concurrently, and other factors well known in the medical field.
  • the composition of the present invention may be administered as an individual therapeutic agent or in combination with other therapeutic agents, may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents, and may be administered single or multiple times. Considering all of the above factors, it is important to administer an amount that can obtain the maximum effect with the minimum amount without side effects, which can be easily determined by those skilled in the art.
  • Example 1 Preparation of SARS-CoV-2 S1 recombinant antigen protein and RBD recombinant antigen protein
  • spike 1 spike 1, S1
  • RBD receptor binding domain
  • the SARS-CoV-2 S1 recombinant antigen protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3, and the RBD recombinant antigen protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4. It was confirmed that it was encoded, and antigen proteins for vaccine production were prepared using these sequences. Positions 670 to 675 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and positions 224 to 229 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 correspond to the His-Tag portion.
  • the SARS-CoV-2 S1 recombinant antigen protein gene having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 and the RBD recombinant antigen protein having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4 were transferred to the pcDNATM® (Thermo Fisher) vector.
  • Recombinant vectors into which each gene was inserted were prepared, and as a result of sequence analysis of the gene products of the recombinant vectors, it was confirmed that they matched 100% with the template.
  • the S1 recombinant antigen protein-expressing recombinant vector and the RBD recombinant antigen protein-expressing recombinant vector prepared in Example 1-2 were each transformed into CHO cells using a method known in the art.
  • C-His S1 recombinant antigen protein
  • RBD recombinant antigen protein C-His
  • S1 (C-His) antigen protein and recombinant RBD (C-His) antigen protein expressed in cells transfected with a recombinant vector were purified, and then each antigen was 2 ⁇ g/8 ⁇ l/well by SDS After -PAGE was lowered, anti-COVID19 spike glycoprotein antibody (HRP) and anti-COVID19 RBD antibody (anti-COVID19 RBD antibody (HRP)) were treated and reacted as primary antibodies.
  • HRP anti-COVID19 spike glycoprotein antibody
  • HRP anti-COVID19 RBD antibody
  • the secondary antibody (anti-mouse) is treated and reacted, and the reaction-completed membrane is developed with CN/DAB substrate to detect recombinant S1 (C-His) antigen protein and recombinant RBD (C-His) antigen protein. Expression was confirmed.
  • Example 2 Animal test evaluation on SARS-CoV-2 S1 recombinant antigen protein and RBD recombinant antigen protein
  • test vaccine was prepared as shown in Table 1 below using the recombinant S1 (C-His) antigen and the recombinant RBD (C-His) antigen prepared in Example 1, and as an immune enhancer, Montanide Gel ) was added.
  • Test vaccine composition division effective antigen content ( ⁇ g/dose) immune booster preservative test vaccine Furtherance S1 60 Montanide gel PR02 (10%) Thimerosal (0.01%) RBD 60
  • test vaccine by determining the presence or absence of pathogenicity of the test vaccine prepared in Example 2-1 using a mouse (7 weeks old, C57BL/6 female) and a guinea pig (300-350 g, Hlakoat: Ha, female) as experimental animals. confirmed.
  • As an experimental group it was divided into an inoculation group inoculated with the test vaccine prepared with the composition of the test vaccine in Table 1 and a negative control group that was not inoculated.
  • mice and guinea pigs which are experimental animals.
  • test vaccine The safety of the test vaccine was confirmed by determining the pathogenicity of the test vaccine prepared in Example 2-1 using a cat (3-5 months old, female). As an experimental group, it was divided into an inoculation group inoculated with the test vaccine prepared with the composition of the test vaccine in Table 1 and a negative control group that was not inoculated.
  • Target animal safety evaluation laboratory animal test group inoculation route Inoculation amount (ml) Injection site side effects and clinical symptoms dead head/ public announcement cat control group - - doesn't exist 0/2 Inoculation group abdominal cavity 2 (oligarch) doesn't exist 0/3
  • the test vaccine was administered to each individual, and boosting was performed 3 weeks after inoculation. Before vaccination, 3 weeks after vaccination (before Boosting), 5 weeks after vaccination (2 weeks after Boosting), 9 weeks after vaccination (6 weeks after Boosting), 13 weeks after vaccination (10 weeks after Boosting) and 21 weeks after vaccination (After 18 weeks of boosting) After blood was collected, serum was separated and tested for neutralizing antibodies against COVID-19 to evaluate long-term immunogenicity.
  • the COVID-19 vaccine composition to which Rehydra gel was added as an immune enhancer and the COVID-19 vaccine composition to which Montanide gel was added were administered to cats (3 to 5 months old, female). Inoculated subcutaneously twice at 3-week intervals, and blood was collected as shown in Table 6. Serum was separated from the collected blood samples, and neutralizing antibodies were tested using each mutant strain.
  • test vaccine was dosed subcutaneously according to the instructions, and additional vaccination was performed 3 weeks later (hair removal was administered to the vaccination area to observe abnormalities in the vaccination area) .
  • Weight gain was checked for 5 weeks after the first vaccination, and rectal body temperature was measured before vaccination, 1, 2, and 3 days after vaccination, and 2 weeks, 3 weeks, 4 weeks, and 5 weeks after vaccination.
  • side effects such as inflammatory reaction, granuloma or purulent formation at the injection site were checked for 5 weeks after the first inoculation.
  • Blood collection was performed while the dogs were safely calibrated, and 2 to 3 ml of blood was collected before vaccination, 3 weeks after the first vaccination, and 2 weeks after the second vaccination.
  • the neutralizing antibody test was performed with a virus titer of 3.5 TCID 50 / ml, and the detection limit was performed at a dilution factor of 10.
  • mice were used as the experimental animal, and the experiment was conducted by dividing the groups like Experimental Example 3 and the control group of Example 3 as shown in Table 13 below.
  • the COVID-19 vaccine and control group of Experimental Example 3 were administered to 7-week-old mice (C57BL/6 female) twice at 2-week intervals, and 2 weeks after the last vaccine administration, mouse spleen cells were isolated and SARS- CoV-2 S1 recombinant antigen protein and RBD recombinant antigen protein were reprocessed (10 ⁇ g/ml or 20 ⁇ g/ml antigen, respectively).
  • the isolated splenocytes were treated with fluorescently labeled CD4, IL-5, and IL-17 antibodies, and then the activity of CD4 + T cells was measured using a flow cytometer. As a result, as shown in FIG.
  • the COVID-19 vaccine composition in which the SARS-CoV-2 S1 recombinant antigen protein and RBD recombinant antigen protein of the present invention and Montanide gel as an immune enhancer were added showed CD4 + IL-5 + T It was confirmed that the cells (T helper 2) and CD4 + IL-17 + T cells (T helper 17) were effectively induced.
  • the vaccine composition of the present invention means that it can effectively increase the efficacy of immune activity against the COVID-19 virus.
  • Example 6-1 A supernatant of the mouse splenocytes isolated in Example 6-1 was obtained, and the levels of IFN- ⁇ and IL-5 production were confirmed through ELISA analysis.
  • the COVID-19 vaccine composition to which the SARS-CoV-2 S1 recombinant antigen protein and RBD recombinant antigen protein of the present invention and Montanide gel as an immune enhancer were added showed IFN- ⁇ and IL-5 It was confirmed that the production was effectively induced.
  • the COVID-19 vaccine composition of the present invention has increased antibody formation ability (immunogenicity) compared to the vaccine composition without Montanide gel, and T cell activity is induced by vaccination
  • the South African variant and the British variant of the COVID-19 virus show high immunogenicity, it can be used as a vaccine composition for the prevention or treatment of COVID-19.

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Abstract

본 발명은 면역원성이 증가된 코로나바이러스감염증-19(COVID-19) 백신 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 SARS-CoV-2 바이러스의 스파이크 1(Spike 1) 재조합 항원 단백질 및 RBD(receptor binding domain) 재조합 항원 단백질을 포함하는 항원 조성물; 및 면역증강제로서 몬타나이드 겔(Montanide Gel)을 포함하는 면역원성이 증가된 코로나바이러스감염증-19 백신 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 코로나바이러스감염증-19(COVID-19) 백신 조성물은 몬타나이드겔이 포함되지 않은 백신 조성물에 비해 항체형성능(면역원성)이 증가한 것을 확인하였으며, 백신 접종에 의해 CD4+IL-5+ T 세포 및 CD4+IL-17+ T 세포가 활성화되고, IFN-γ 및 IL-5 사이토카인 생성이 증가하는 것을 확인하였다. 또한, 본 발명의 백신 조성물은 COVID-19 바이러스의 남아공 변이 및 영국 변이에도 높은 면역원성을 보이는 것을 확인하였으므로, 코로나바이러스감염증-19 예방 또는 치료를 위한 백신 조성물로 활용될 수 있다.

Description

면역원성이 증가된 코로나바이러스감염증-19 백신 조성물
본 발명은 면역원성이 증가된 코로나바이러스감염증-19(COVID-19) 백신 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 SARS-CoV-2 바이러스의 스파이크 1(Spike 1) 재조합 항원 단백질 및 RBD(receptor binding domain) 재조합 항원 단백질을 포함하는 항원 조성물; 및 면역증강제로서 몬타나이드 겔(Montanide Gel)을 포함하는 면역원성이 증가된 코로나바이러스감염증-19 백신 조성물에 관한 것이다.
코로나 바이러스는 호흡기 질환을 일으키는 RNA 바이러스로, 2019년 12월 중국 우한에서 호흡기 질환 감염 사례가 증폭하면서 전 세계 관심이 높아졌다. 코로나바이러스의 게놈(genome) 분석 결과, 베타 코로나 바이러스에 속하며 인간이나 동물에서 발견된 적이 없는 새로운 바이러스인 SARS-CoV-2(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2)로, 세계보건기구는 이 바이러스에 의한 감염을 코로나바이러스 감염증-19(Coronavirus Disease-2019, COVID-19)로 명명하였다.
코로나바이러스 감염증-19에 감염되면 나타나는 주 중상으로는 무기력감, 37.5도 이상의 고열, 기침, 인후통, 가래, 근육통, 두통, 호흡곤란 및 폐렴 등의 증상이 발생하며, 폐 손상에 의한 호흡부전 등이 있으며, 심하면 사망에 이를 수 있으므로 코로나바이러스 감염증-19에 대한 진단, 백신 및 치료제의 개발이 매우 시급한 실정이다. 2021년 9월 기준 105개의 백신이 임상시험 테스트 중이며, 35개는 최종 테스트 단계, 75개 이상의 백신이 전임상 동물연구로 활발하게 연구되고 있으며 현재 8개의 백신이 승인되었고, 13개의 후보가 제한적으로 승인되었다.
대표적인 백신으로는 화이자 및 모더나에서 생산하는 mRNA 백신, 아스트라제네카에서 생산하는 아데노바이러스 백신이 있으며, 특히 mRNA 백신은 COVID-19에 대한 면역력은 매우 효과적인 것으로 입증되었으나, 부작용, 변종에 대한 예방 효과 감소 및 시간이 지남에 따라 예방 효과가 감소되는 등의 문제점 등이 있다.
한편, SARS-CoV-2는 30kb의 핵산(nucleotide)을 가지며 다음과 같은 4개의 중요한 구조 단백질을 가지고 있다; Nucleocapsid(N), Spike (S), Membrane (M), Envelope (E) 단백질. 그 중 S 단백질(스파이크 단백질)은 숙주 세포의 수용체(receptor)와 결합하는 것으로 중요한 부위이며, 세포 내로 바이러스 뉴클레오캡시드(viral nucleocapsid)를 전달하며 복제(replication)가 이루어진다.
또한, SARS-CoV-2는 인간 세포(Human cell)의 ACE2(angiotensin converting enzyme 2) 수용체와 결합하여 바이러스 복제가 가능 한 것으로 알려졌다. 코로나 바이러스의 S 단백질(스파이크 단백질)에 포함된 수용체 결합 영역(receptor-binding domain; RBD)는 숙주 세포의 ACE2 수용체와 결합하는 핵심 영역이며, SARS-CoV-2 감염에 대한 강력한 중화 항체를 유도하는 다중형태 의존적 에피토프(multiple conformational-dependent epitopes)를 포함하고 있기 때문에 코로나19의 치료 및 백신 개발에 핵심 표적이 될 수 있다 (J. Immunol., 2005;174:4908-4915).
이에, 본 발명에서는 면역원성이 증가된 코로나바이러스감염증-19(COVID-19) 백신을 개발하기 위해 예의 노력한 결과, SARS-CoV-2 바이러스의 스파이크 1(Spike 1) 재조합 항원 단백질 및 RBD(receptor binding domain) 재조합 항원 단백질을 포함하는 항원 조성물에 면역증강제로서 몬타나이드 겔(Montanide Gel)을 추가하는 경우, COVID-19에 대한 면역원성이 현저하게 증가하는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 SARS-CoV-2 바이러스의 스파이크 1(Spike 1) 재조합 항원 단백질 및 RBD(receptor binding domain) 재조합 항원 단백질을 포함하는 항원 조성물; 및 면역증강제로서 몬타나이드 겔(Montanide Gel)을 포함하는 면역원성이 증가된 코로나바이러스감염증-19 백신 조성물을 제공하는 데 있다.
상술한 목적을 달성하기 위해,
본 발명은 SARS-CoV-2 바이러스의 스파이크 1(Spike 1) 재조합 항원 단백질 및 RBD(receptor binding domain) 재조합 항원 단백질을 포함하는 항원 조성물; 및
면역증강제로서 몬타나이드 겔(Montanide Gel)을 포함하는, 면역원성이 증가된 코로나바이러스감염증-19 백신 조성물을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서, 상기 SARS-CoV-2 바이러스의 스파이크 1(Spike 1) 재조합 항원 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시될 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 있어서, 상기 RBD(receptor binding domain) 재조합 항원 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시될 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 있어서, 상기 서열번호 1의 아미노산은 서열번호 3의 염기서열로 코딩될 수 있으며, 상기 서열번호 2의 아미노산은 서열번호 4의 염기서열로 코딩될 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 있어서, 상기 면역증강제는 전체 조성물에 5 ~ 30중량%로 포함될 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 있어서, 상기 몬타나이드 겔은 Montanide Gel PR02일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 있어서, 상기 백신 조성물은 마우스, 기니피그, 고양이 및 개로 이루어진 군으로부터 선택된 개체에 투여될 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 있어서, 상기 백신 조성물에서 항원 단백질 각각의 1회 투여 용량은 5 ㎍ ~ 100 ㎍일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 있어서, 상기 백신 조성물은 개체에 1차 투여하고, 10일 ~ 30일 후에 2차 투여할 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 있어서, 상기 백신 조성물은 피하주사, 복강주사 또는 근육 주사를 통해 투여할 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 있어서, 상기 백신 조성물은 CD4+IL-5+ T 세포(T helper 2) 또는 CD4+IL-17+ T 세포(T helper 17)를 활성화시킬 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 있어서, 상기 백신 조성물은 IFN-γ 또는 IL-5 사이토카인을 활성화시킬 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 있어서, 상기 백신 조성물은 남아공 또는 영국 변이 코로나바이러스감염증-19 바이러스에 교차 방어 효능을 가질 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 백신 조성물을 포함하는 면역원성이 증가된 코로나바이러스감염증-19의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 백신 조성물을 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는 코로나바이러스감염증-19의 예방방법을 제공한다.
본 발명의 코로나바이러스감염증-19(COVID-19) 백신 조성물은 몬타나이드겔이 포함되지 않은 백신 조성물에 비해 항체형성능(면역원성)이 증가한 것을 확인하였으며, 백신 접종에 의해 CD4+IL-5+ T 세포(T helper 2) 및 CD4+IL-17+ T 세포(T helper 17)가 활성화되고, IFN-γ 및 IL-5 사이토카인 생성이 증가하는 것을 확인하였다.
또한, 본 발명의 백신 조성물은 COVID-19 바이러스의 남아공 변이 및 영국 변이에도 높은 면역원성을 보이는 것을 확인하였으므로, 코로나바이러스감염증-19 예방 또는 치료를 위한 백신 조성물로 활용될 수 있다.
도 1은 CHO 세포주로부터 발현된 S1 재조합 항원 단백질(A) 및 RBD 재조합 항원 단백질(B)의 발현정도를 확인한 데이터이다.
도 2는 본 발명의 백신 조성물 투여에 따른 (A) CD4+IL-5+ T 세포 및 CD4+IL-17+ T 세포의 활성화정도를 확인한 데이터 및 (B) IFN-γ 또는 IL-5 생성정도를 확인한 데이터이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명은 일관점에서, SARS-CoV-2 바이러스의 스파이크 1(Spike 1) 재조합 항원 단백질 및 RBD(receptor binding domain) 재조합 항원 단백질을 포함하는 항원 조성물; 및 면역증강제로서 몬타나이드 겔(Montanide Gel)을 포함하는, 면역원성이 증가된 코로나바이러스감염증-19 백신 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서, 용어 "백신(vaccine)"은, 생체에 면역 반응을 일으키는 항원을 함유하는 생물학적인 제제로서, 감염증의 예방을 위하여 사람이나 동물에 주사하거나 경구 투여함으로써 생체에 면역이 생기게 하는 면역원을 말한다. 상기 동물은 인간 또는 비인간 동물로서, 상기 비인간 동물은 돼지, 소, 말, 개, 염소, 양 등을 지칭하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 SARS-CoV-2 바이러스의 스파이크 1(Spike 1) 재조합 항원 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 RBD(receptor binding domain) 재조합 항원 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 서열번호 1의 아미노산은 서열번호 3의 염기서열로 코딩될 수 있으며, 상기 서열번호 2의 아미노산은 서열번호 4의 염기서열로 코딩될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 면역증강제는 전체 조성물에 5 ~ 30%, 바람직하게는 5 ~ 20%로 포함될 수 있으며, 상기 몬타나이드 겔은 Montanide Gel PR02일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 백신 조성물은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 SARS-CoV-2 바이러스의 스파이크 1(Spike 1) 재조합 항원 단백질, 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 RBD(receptor binding domain) 재조합 항원 단백질 및 면역증강제로서 몬타나이드 겔(Montanide Gel)을 혼합하는 단계를 포함하는 방법으로 제조될 수 있다.
상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 SARS-CoV-2 바이러스의 스파이크 1(Spike 1) 재조합 항원 단백질은 (a) 서열번호 3으로 표시되는 염기서열을 포함하는 재조합 벡터를 제조하는 단계; (b) 상기 벡터로 세포를 형질전환시키고, 형질전환된 세포를 배양하는 단계; 및 상기 (b) 단계에서 배양된 세포 상등액에서 SARS-CoV-2 바이러스의 스파이크 1(Spike 1) 재조합 항원 단백질을 수득하는 단계를 포함하는 방법으로 제조될 수 있다.
상기 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 RBD 재조합 항원 단백질은 (a) 서열번호 4로 표시되는 염기서열을 포함하는 재조합 벡터를 제조하는 단계; (b) 상기 벡터로 세포를 형질전환시키고, 형질전환된 세포를 배양하는 단계; 및 상기 (b) 단계에서 배양된 세포를 파쇄하여 SARS-CoV-2 바이러스의 RBD 재조합 항원 단백질을 수득하는 단계를 포함하는 방법으로 제조될 수 있다.
본 발명의 구체적인 일구현예에서, 중국 우한에서 분리된 SARS-CoV-2 중 스파이크 1(Spike 1, S1), RBD(receptor binding domain) 단백질을 포함하는 유전자 염기서열 및 아미노산 서열을 확보하였으며, 이를 이용하여 S1 재조합 항원 단백질 및 RBD 재조합 항원 단백질을 항원 단백질로 포함하는 백신 조성물을 제조하였다.
본 발명의 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 S1 유전자가 삽입된 재조합 벡터 및 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 RBD 유전자가 삽입된 재조합 벡터를 제조한 다음, CHO 세포에 형질전환시켜 항원 단백질을 발현시킨 결과, 도 1에 나타난 바와 같이, S1 재조합 항원 단백질 및 RBD 재조합 항원 단백질 모두 정상적으로 발현되는 것을 확인하였다.
본 발명에서, 용어 "벡터(expression vector)"는 적당한 숙주세포 내에서 목적 유전자가 발현할 수 있도록 프로모터 등의 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 제조물이다. 벡터는 플라스미드, 레트로바이러스(retroviral) 벡터 및 렌티바이러스(lentiviral) 벡터 중 하나 이상으로부터 선택될 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.
또한, 벡터는 코딩 영역이 적합한 숙주에서 정확하게 발현될 수 있게 하는 발현 제어 요소를 포함할 수 있다. 이러한 조절 요소는 당업자에게 잘 알려져 있으며, 예를 들어 프로모터, 리보솜 결합 부위(ribosome-binding site), 인핸서(enhancer) 및 유전자 전사(transcription) 또는 mRNA 번역(translation)을 조절하기 위한 다른 조절 요소를 포함할 수 있다. 발현 조절 서열의 특정 구조는 종 또는 세포 유형의 기능에 따라 달라질 수 있으나, 일반적으로 TATA 박스(box), 캡핑된(capped) 서열, CAAT 서열 등과 같은 전사 개시 및 번역 개시에 각각 참여하는 5' 비-전사 서열, 및 5' 또는 3' 비-번역 서열을 함유한다. 예를 들어, 5' 비-전사 발현 조절 서열은 기능적으로 연결된 핵산을 전사 및 조절하기 위한 프로모터 서열을 포함할 수 있는 프로모터 영역을 포함할 수 있다.
본 발명에서, 용어 "프로모터"는 전사를 지시하기에 충분한 최소 서열을 의미한다. 또한, 세포 유형 특이적 또는 외부의 신호 또는 제제에 의해 유도되는 조절 가능한 프로모터 의존적 유전자를 발현하도록 하는 데 충분한 프로모터 구성이 포함될 수 있으며, 이러한 구성들은 유전자의 5' 또는 3' 부분에 위치할 수 있다. 보존적 프로모터 및 유도적 프로모터 둘 다 포함된다. 프로모터 서열은 원핵생물, 진핵생물 또는 바이러스로부터 유래될 수 있다.
본 발명에서, 용어 "형질전환"은 하나 이상의 목적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 갖는 벡터를 숙주세포에 도입시키는 것으로, 발현 벡터를 숙주세포에 도입된 형질전환체(형질전환된 세포)를 제조하기 위한 방법으로는 문헌(Sambrook, J., et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual(2판), Cold Spring Harbor Laboratory, 1. 74, 1989)에 기재된 인산칼슘법 또는 염화캄슘/염화루비듐법, 일렉트로포레이션법(electroporation), 전기주입법(electroinjection), PEG 등의 화학적 처리방법, 유전자 총(gene gun) 등을 이용하는 방법 등이 있다.
상기 벡터가 발현되는 형질전환체를 영양배지에서 배양하면 항체 단백질을 대량으로 제조, 분리 가능하다. 배지와 배양조건은 숙주 세포에 따라 관용되는 것을 적절히 선택하여 이용할 수 있다. 배양시 세포의 생육과 단백질의 대량 생산에 적합하도록 온도, 배지의 pH 및 배양시간 등의 조건들을 적절하게 조절하여야 한다.
본 발명에 따른 벡터는 항체의 생산을 위해 숙주세포, 바람직하게는 포유동물 세포에 형질전환 시킬 수 있다. 완벽한 글리코실화된 단백질을 발현할 수 있는 적합한 숙주 세포주의 수는 당해 분야에서 개발되어 왔으며 COS-1(예를 들면, ATCC CRL 1650), COS-7(예를 들면, ATCC CRL-1651), HEK293, BHK21(예를 들면, ATCC CRL-10), CHO(예를 들면, ATCC CRL 1610) 및 BSC-1(예를 들면, ATCC CRL-26) 세포주, Cos-7 세포, CHO 세포, hep G2 세포, P3X63Ag8653, SP2/0-Agl4, 293 세포, HeLa 세포 등을 포함하며, 이들 세포는 예를 들면, ATCC(American Type Culture Collection, 미국)으로부터 용이하게 이용가능하다.
본 발명에 있어서, 상기 백신 조성물은 마우스, 기니피그, 고양이 및 개로 이루어진 군으로부터 선택된 개체에 투여될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 백신 조성물에서 항원 단백질 각각의 1회 투여 용량은 5 ㎍ ~ 100 ㎍일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 백신 조성물은 개체에 1차 투여하고, 10일 ~ 30일 후에 2차 투여할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 백신 조성물은 비경구적으로, 예를 들면 직장, 경피, 정맥 내 주사, 동맥 내 주사, 근육 내 주사, 피 내 주사, 피하 주사, 복강 내 주사, 심실 내 주사 등을 통해 투여될 수 있으며, 바람직하게는 피하 주사, 복강 주사 또는 근육 주사를 통해 투여될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 백신 조성물은 CD4+IL-5+ T 세포(T helper 2) 또는 CD4+IL-17+ T 세포(T helper 17)를 활성화 시킬 수 있으며, IFN-γ 또는 IL-5 사이토카인 발현을 증가시킬 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 백신 조성물은 남아공 또는 영국 변이 코로나바이러스감염증-19 바이러스에 교차 방어 효능을 가질 수 있다.
본 발명의 구체적인 다른 일구현예에 있어서, SARS-CoV-2 바이러스의 스파이크 1(Spike 1) 재조합 항원 단백질 및 RBD(receptor binding domain) 재조합 항원 단백질을 포함하는 항원 조성물; 및 면역증강제로서 몬타나이드 겔(Montanide Gel)을 포함하는, 면역원성이 증가된 코로나바이러스감염증-19 백신 조성물을 제조하였으며, 상기 백신 조성물은 마우스, 기니피그, 고양이 및 개에서 안정성을 확인하였다.
면역 증가제로 몬타나이드 겔이 포함된 백신 조성물(실험예) 및 몬타나이드 겔이 포함되지 않은 백신 조성물(비교예) 간의 면역원성을 확인한 결과, 비교예에 비해 몬타나이드 겔이 포함된 백신 조성물의 면역원성이 현저하게 증가한 것을 확인하였다. 또한, 본 발명의 백신 조성물은 남아공 또는 영국 변이 코로나바이러스감염증-19 바이러스에 교차 방어 효능을 보이는 것을 확인하였다.
본 발명의 구체적인 또 다른 일구현예에 있어서, 본 발명의 백신 조성물을 투여하였을 때, 생체 내 T 세포 활성을 유도하는지 확인한 결과, 백신 조성물 투여에 의해 CD4+IL-5+ T 세포 또는 CD4+IL-17+ T 세포가 활성화되고, IFN-γ 또는 IL-5 사이토카인 생성이 증가하는 것을 확인하였다 (도 2).
본 발명은 다른 관점에서, 본 발명의 백신 조성물을 포함하는, 면역원성이 증가된 코로나바이러스감염증-19의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 본 발명의 백신 조성물을 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는 코로나바이러스감염증-19의 예방방법에 관한 것이다.
본 발명의 백신 조성물은 인간을 제외한 개체, 바람직하게는 마우스, 기니피그, 고양이 또는 개일 수 있으며, 본 발명의 백신 조성물 투여에 의해 코로나바이러스감염증-19를 예방 또는 치료할 수 있다.
본 발명의 백신 조성물은 임의의 적절한, 약학적으로 허용되는 제제로 제조될 수 있다. 예컨대 즉석 투여 용액 또는 현탁액 형태이거나, 투여 전 희석에 적절한 농축된 원액이거나, 또는 재구성 가능한 형태 예컨대 동결건조, 냉동-건조, 또는 냉동 제제 형태로 제조될 수 있다
본 발명의 백신 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 포함하여 제제화될 수 있다. 백신 조성물의 제제화를 위하여 사용될 수 있는 약학적으로 허용되는 담체는 대한민국 약전이나 제외국의 약전 특히 미국, 일본, 유럽의 약전에 열거·규정되어 있으며, 이들 약전을 참조할 수 있다.
이러한 담체는 통상 희석제, 부형제, 안정화제, 방부제 등을 포함할 것이다. 적절한 희석제로서는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브유, 땅콩유와 같은 식물성유 등의 비수성 용매나 염수(바람직하게는 0.8%의 염수), 완충 매질을 포함한 물(바람직하게는 0.05M의 인산염 완충액) 등의 수성 용매 등을 들 수 있고, 적절한 부형제로서는 전분, 글루코스, 락토스, 수크로스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 백악, 실리카 겔, 나트륨 스테아레이트, 글리세롤 모노스테아레이트, 활석, 나트륨 클로라이드, 무수 탈지유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등을 들 수 있으며, 적절한 안정화제로서는 소르비톨, 만니톨, 전분, 수크로스, 덱스트란, 글루타메이트, 글루코스 등의 탄수화물이나 분유, 혈청 알부민, 카제인 등의 동물성, 식물성 또는 미생물성 단백질 등의 단백질을 들 수 있다. 적절한 방부제로서는 티메로살, 메르티올레이트, 젠타마이신, 네오마이신, 니스타틴, 암포테리신 B, 테트라사이클린, 페니실린, 스트렙토마이신, 폴리믹신 B 등을 들 수 있다.
본 발명의 백신 조성물은 몬타나이드 겔 이외의 면역증강제(adjuvant)를 추가로 포함할 수 있다. 면역증강제는 항원에 대한 면역 반응을 증강시키는 하나 이상의 물질로 이루어진 것일 수 있다. 면역증강제는 예컨대 완전 프로인트(Freund), 불완전 프로인트, 사포닌, 겔 성상의 알루미늄 보조제, 표면 활성 물질(예:리소레시틴, 플루론 글리콜, 다중 음이온, 펩티드, 오일 또는 탄화수소 에멀젼 등), 식물성 오일(면실유, 땅콩유, 옥수수유 등), 비타민 E 아세테이트 등일 수 있다.
본 발명의 백신 조성물은 임의적 단위 용량으로 제조될 수 있다. 단위 용량은 사람에 1회 이상 투여되기 위한 용도로 포장된 낱개의 제품에 포함된 활성성분과 약학적으로 허용되는 담체의 양을 말하는 것으로, 이러한 활성 성분과 담체의 적절한 양은 본 발명의 백신 조성물이 1회 이상 접종될 때 백신으로서 기능할 수 있는 양으로 이러한 양은 당업자의 통상의 능력 범위 내에서 비임상적 및 임상적으로 결정될 수 있다.
본 발명에서 약학적 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 : SARS-CoV-2 S1 재조합 항원 단백질 및 RBD 재조합 항원 단백질 제조
1-1 : 염기서열 및 아미노산 서열 확보
본 발명에서는 중국 우한에서 분리된 SARS-CoV-2 중 스파이크 1(Spike 1, S1) 및 RBD(receptor binding domain) 단백질을 포함하는 유전자 염기서열을 확보하였다.
서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 SARS-CoV-2 S1 재조합 항원 단백질은 서열번호 3의 염기서열로 코딩되고, 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 RBD 재조합 항원 단백질은 서열번호 4의 염기서열로 코딩되는 것을 확인하였으며, 이들 서열을 이용하여 백신 제조를 위한 항원 단백질을 제조하였다. 상기 서열번호 1의 아미노산 서열에서 670 ~ 675 위치 및 상기 서열번호 2의 아미노산 서열에서 224 ~ 229 위치는 His-Tag 부분에 해당한다.
1-2 : S1 유전자 및 RBD 유전자가 삽입된 재조합 벡터 제조
당업계에 공지된 방법을 이용하여 pcDNA™®(써모피셔)벡터에 상기 서열번호 3의 염기서열을 가진 SARS-CoV-2 S1 재조합 항원 단백질 유전자 및 서열번호 4의 염기서열을 가진 RBD 재조합 항원 단백질 유전자가 각각 삽입된 재조합 벡터를 제조하였으며, 재조합 벡터의 유전자 산물을 시퀀스 분석한 결과 주형과 100% 일치함을 확인하였다.
1-3 : 재조합 벡터 형질전환
상기 실시예 1-2에서 제조한 S1 재조합 항원 단백질 발현 재조합 벡터 및 RBD 재조합 항원 단백질 발현 재조합 벡터는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 각각 CHO 세포에 형질전환 시켰다.
상기 형질전환된 CHO 세포를 배양한 다음, 배양 상층액으로 부터 S1 재조합 항원 단백질(C-His) 및 RBD 재조합 항원 단백질(C-His)을 각각 수득하였다.
SARS-CoV-2 재조합 S1(C-His) 항원 단백질 및 SARS-CoV-2 재조합 RBD(C-His) 항원 단백질의 발현 유무를 확인하기 위해 웨스턴 블랏을 진행하였다.
먼저, 재조합 벡터로 형질전횐된 세포에서 발현된 S1(C-His) 항원 단백질 및 재조합 RBD(C-His) 항원 단백질을 정제한 다음, 각각의 항원을 2 ㎍/8 ㎕/well의 용량으로 SDS-PAGE를 내린 후 1차 항체로 항-COVID19 스파이크 당단백질 항체(anti-COVID19 spike glycoprotein antibody(HRP)) 및 항-COVID19 RBD 항체(anti-COVID19 RBD antibody(HRP))를 처리하여 반응시켰다. 그 다음, 2차 항체(anti-mouse)를 처리하여 반응시킨 다음, 반응이 완료된 멤브레인을 CN/DAB 기질로 발색시켜 재조합 S1(C-His) 항원 단백질 및 재조합 RBD(C-His) 항원 단백질의 발현을 확인하였다.
그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이, 재조합 S1(C-His) 항원 단백질 및 재조합 RBD(C-His) 항원 단백질이 모두 정상적으로 발현되는 것을 확인하였다.
실시예 2 : SARS-CoV-2 S1 재조합 항원 단백질 및 RBD 재조합 항원 단백질에 대한 동물실험 평가
2-1 : 시험백신 제조
본 발명에서는 상기 실시예 1에서 제조된 재조합 S1(C-His) 항원 및 재조합 RBD(C-His) 항원을 이용하여 하기 표 1과 같이 시험 백신을 제조하였으며, 면역증강제로서 몬타나이드 겔(Montanide Gel)을 추가하였다.
시험백신 조성
구분 유효항원 함량
(㎍/dose)		 면역증강제 보존제
시험백신
조성		 S1 60 Montanide gel PR02(10%) Thimerosal
(0.01%)
RBD 60
2-2 : 실험동물에서의 시험백신 안정성 확인
실험동물인 마우스(7주령, C57BL/6 female) 및 기니피그(300~350g, Hlakoat:Ha, female)를 이용하여 상기 실시예 2-1에서 제조된 시험백신의 병원성 유무를 판단함으로써 시험백신의 안전성을 확인하였다. 실험군으로서는 표 1의 시험백신 조성으로 제조된 시험백신을 접종한 접종군과 접종하지 않은 음성대조군으로 나누었다.
실험동물 안전성 평가
실험동물 시험군 접종경로 접종량
(㎖)		 주사부위 부작용 및 임상증상 폐사두수/
공시두수
마우스 대조군 - - 없음 0/8
접종군 복강 0.5 없음 0/8
기니픽 대조군 - - 없음 0/2
접종군 근육 1 없음 0/2
그 결과, 본 발명의 백신 조성물은 실험 동물인 마우스 및 기니피그에서 안전성을 확인하였다.
2-3 : 대상동물에서의 시험백신 안정성 확인
고양이(3 ~ 5 개월령, female)를 이용하여 상기 실시예 2-1에서 제조된 시험백신의 병원성 유무를 판단함으로써 시험백신의 안전성을 확인하였다. 실험군으로서는 표 1의 시험백신 조성으로 제조된 시험백신을 접종한 접종군과 접종하지 않은 음성대조군으로 나누었다.
대상동물 안전성 평가
실험동물 시험군 접종경로 접종량
(㎖)		 주사부위 부작용 및 임상증상 폐사두수/
공시두수
고양이 대조군 - - 없음 0/2
접종군 복강 2(과두분) 없음 0/3
그 결과, 본 발명의 백신 조성물은 실험동물들과 마찬가지로 고양이에에서 안전성을 확인하였다.
실시예 3 : 고양이에서의 COVID-19 백신 조성물 투여에 따른 면역원성 평가
본 발명에서는 대상동물인 고양이에 본 발명의 면역증강제로 몬타나이드 겔이 추가로 포함된 COVID-19 백신 조성물을 투여하였을 때 면역원성 및 항원량 결정 정도를 확인하고자 하였다.
고양이에서 시험백신의 면역원성(장기면역원성) 평가 그룹
구분 공시두수 유효항원 함량
(㎍/dose)		 면역증강제 보존제
실험예 1 2 S1 10 Montanide gel PR02(10%) Thimerosal
(0.01%)
RBD 10
실험예 2 2 S1 30 Montanide gel PR02(10%) Thimerosal
(0.01%)
RBD 30
실험예 3 2 S1 60 Montanide gel PR02(10%) Thimerosal
(0.01%)
RBD 60
비교예 1 2 S1 30 Rehydra gel(10%) Thimerosal
(0.01%)
RBD 30
대조군 2 PBS - - -
상기 표 4와 같이 시험백신을 각 개체에 투여하였으며, 접종 3주 후 추가 접종(Boosting)을 실시하였다. 백신 접종전, 접종 3주 후(Boosting 전), 접종 5주 후(Boosting 2주 후), 접종 9주 후(Boosting 6주 후), 접종 13주 후(Boosting 10주 후) 및 접종 21주 후(Boosting 18주 후) 혈액을 채취한 다음, 혈청을 분리하여 COVID-19에 대한 중화항체가 시험을 실시하여 장기면역원성을 평가하였다.
장기면역원성 평가
Montanide gel PR02(10%) Rehydra gel(10%) No adjuvant
실험예 1 실험예 2 실험예 3 비교예 대조군
1 2 1 2 1 2 1 2 1 2
접종전 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
접종 3주 후
(Boosting 전)		 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
접종 5주 후
(Boosting 2주 후)		 20 80 640 80 160 640 80 10 0 0
접종 9주 후
(Boosting 6주 후)		 20 80 320 320 640 640 20 40 0 0
접종 13주 후
(Boosting 10주 후)		 10 80 340 320 640 160 10 80 0 0
접종 21주 후
(Boosting 18주 후)		 0 80 160 80 160 80 0 20 0 0
상기 표 5에 나타난 바와 같이, 면역증강제로 리하이드라 겔(Rehydra gel)을 첨가하는 비교예에 비해, 본 발명의 면역증가제로 몬타나이드 겔을 첨가한 백신 조성물, 특히 실험예 2 및 실험예 3의 경우 장기면역원성이 높이 유지되는 것을 확인하였다.
실시예 4 : COVID-19 바이러스 변이에 대한 COVID-19 백신 조성물의 교차방어능 확인
본 발명에서는 COVID-19 바이러스 변이에 대해서도 본 발명의 백신 조성물이 면역원성을 유지하는지 확인하고자 하였다.
면역증강제로 리하이드라 겔(Rehydra gel)을 첨가하는 COVID-19 백신조성물과 몬타나이드 겔을 첨가한 COVID-19 백신 조성물을 고양이(3 ~ 5개월령, female)에 투여하였다. 3주 간격 2회 피하로 접종하고 채혈은 표 6과 같이 실시하였다. 채혈된 샘플에서 혈청을 분리하고 각 변이주를 이용하여 중화항체가 시험을 실시하였다
고양이에서 공격접종을 통한 방어능 평가
Montanide gel PR02(10%) Rehydra gel(10%)
실험예 2(30㎍/dose) 실험예 3(60㎍/dose) 비교예(30㎍/dose)
1 2 1 2 1 2
우한 남아공 영국 우한 남아공 영국 우한 남아공 영국 우한 남아공 영국 우한 남아공 영국 우한 남아공 영국
접종전 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
접종 3주 후(Boosting 전) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
접종 5주 후(Boosting 2주 후) 1280 640 320 640 320 160 640 160 80 1280 160 320 160 80 80 10 20 10
접종 9주 후(Boosting 6주 후) 1280 640 320 640 320 160 1280 320 160 640 40 160 40 20 10 40 160 20
그 결과, 상기 표 6에 나타난 바와 같이, 면역증강제로 리하이드라 겔(Rehydra gel)을 첨가하는 비교예는 남아공 변이 바이러스 및 영국 변이 바이러스에도 낮은 면역원성을 보이는 것으로 나타났다. 반면, 본 발명의 면역증가제로 몬타나이드 겔을 첨가한 COVID-19 백신 조성물은 남아공 변이 바이러스 및 영국 변이 바이러스에 대해서도 높은 면역원성을 보이는 것을 확인하였다.
실시예 5 : 개에서의 COVID-19 백신 조성물 투여에 따른 면역원성 평가
5-1 : 백신 접종
본 발명의 COVID-19 백신 조성물에 의해 개(비글)에서 COVID-19 바이러스에 대한 면역원성이 형성되는지 확인하고자 하였다.
하기 표 7에 나타난 바와 같이, 상기 실시예 3의 실험예 3 및 대조군으로 그룹을 나누어서 실험을 진행하였다.
개에서 시험백신의 면역원성 평가 그룹
구분 공시두수 유효항원 함량
(㎍/dose)		 면역증강제 보존제
실험예 3 3 S1 60 Montanide gel PR02(10%) Thimerosal
(0.01%)
RBD 60
대조군 3 PBS - - -
먼저, COVID-19 항체 음성인 건강한 비글견 6 마리를 준비하여 공시백신을 사용법에 따라 피하로 정량 접종하고 3주 후 추가 접종을 실시하였다 (접종부 이상 관찰을 위해 백신 접종부에 대해 제모 관리함).
5-2 : 임상관찰
1차 접종 후 5주 동안 증체량을 확인하였으며, 백신 접종전, 접종 후 1, 2, 3일, 접종 후 2주, 3주, 4주, 5주에 직장 체온을 측정하였다. 또한, 주사부위 부작용 관찰을 위해 1차 접종 후 5주동안 접종 부위의 염증반응, 육아종 또는 화농 형성 유무, 등 부작용 여부를 확인하였다.
체중 변화 관찰
1차 백신 0일차 1차 백신 1일차 1차 백신 2일차 1차 백신 3일차 1차 백신 7일차 1차 백신 14일차 2차 백신 0일차
(21)		 2차 백신 1일차
(22)		 2차 백신 2일차
(23)		 2차 백신 3일차
(24)		 2차 백신 7일차
(28)		 2차백신 14일차
(35)
실험예 3 1 5.15 5.15 5.2 5.2 5.25 5.5 5.95 5.85 5.95 5.95 5.85 6.3
2 4.95 5.05 4.95 5.15 5.1 5.35 5.4 5.4 5.75 5.7 5.55 5.7
3 4.9 5.1 5.0 5.2 5.1 5.35 5.65 5.45 5.15 5.2 5.7 5.85
대조군 1 5.45 5.45 5.45 5.35 5.5 5.55 5.7 5.8 5.95 5.95 5.95 6.05
2 5.25 5.35 5.35 5.3 5.3 5.35 5.65 5.6 5.7 5.6 5.9 6.05
3 5.10 5.15 5.15 5.2 5.25 5.4 5.8 5.7 5.9 5.85 5.95 6.25
체온 변화 관찰
1차 백신 0일차 1차 백신 1일차 1차 백신 2일차 1차 백신 3일차 1차 백신 7일차 1차 백신 14일차 2차 백신 0일차
(21)		 2차 백신 1일차
(22)		 2차 백신 2일차
(23)		 2차 백신 3일차
(24)		 2차 백신 7일차
(28)		 2차백신 14일차
(35)
실험예 3 1 38.4 38.1 38.2 38.4 38.7 38.6 38.5 38.6 38.3 38.6 38.8 38.7
2 38.4 38.2 37.8 38.0 38.2 38.3 38.1 38.4 38.2 38.5 38.8 39.0
3 38.4 38.5 38.4 38.6 38.9 38.6 38.9 39.0 38.9 38.4 39.0 39.3
대조군 1 38.1 38.0 37.9 38.5 38.4 38.5 38.5 39.3 38.8 38.4 38.8 38.8
2 38.6 38.4 38.7 38.8 38.9 38.6 39.2 38.3 38.8 39.0 39.0 39.4
3 38.4 38.1 38.5 38.6 38.9 38.7 39.0 38.5 39.0 38.8 39.2 38.8
부작용 관찰 - 무기력증 및 아나필락시스 여부 확인
1차 백신 0일차 1차 백신 1일차 1차 백신 2일차 1차 백신 3일차 1차 백신 7일차 1차 백신 14일차 2차 백신 0일차
(21)		 2차 백신 1일차
(22)		 2차 백신 2일차
(23)		 2차 백신 3일차
(24)		 2차 백신 7일차
(28)		 2차백신 14일차
(35)
실험예 3 1 X X X X X X X X X X X X
2 X X X X X 식욕감소 식욕감소 식욕감소 식욕감소 X X X
3 X X X X X X X X X X X X
대조군 1 X X X X X X X X X X X X
2 X X 식욕감소 X X X X X X X X X
3 X X 식욕감소 X X X X X X X X X
부작용 관찰 - 주사부위 부종(swelling), 발적(redness), 육아종 여부 확인
1차 백신 0일차 1차 백신 1일차 1차 백신 2일차 1차 백신 3일차 1차 백신 7일차 1차 백신 14일차 2차 백신 0일차
(21)		 2차 백신 1일차
(22)		 2차 백신 2일차
(23)		 2차 백신 3일차
(24)		 2차 백신 7일차
(28)		 2차백신 14일차
(35)
실험예 3 1 X X X X X X X X X X X X
2 X X X X X X X X X X X X
3 swelling X swelling X X X X X X X X X
대조군 1 X X X X X X X X X X X X
2 X X X X X X X X X X X X
3 X X X X X X X X X X X X
실험예 3 투여군 및 대조군 모두 정상적인 체중 증가율을 보였으며(표 8), 부작용 없이 정상적인 체온이 유지되는 것을 확인하였다 (표 9). 또한, 식욕부진 정도의 미약한 무기력증이 관찰되었지만 일시적인 것으로 유의미하지 않은 정도로 평가되었으며, 주사부위 부종(swelling) 및 발적(redness)이 발견된 개체가 발생하였지만 일시적은 것으로 유의미하지 않은 정도로 평가되었다 (표 10 및 표 11).
5-3 : 항체형성능 평가
본 발명의 COVID-19 백신 조성물에 의한 면역원성을 확인하기 위해, 채혈된 샘플에서 혈청을 분리하고 COVID-19에 대한 중화항체가 시험을 실시하여 면역원성을 평가하였다.
채혈은 개를 안전하게 보정한 상태에서 실시하였으며, 2 ~ 3 ㎖의 혈액을 백신 접종전, 1차 접종 3주후 채혈, 2차접종 2주후 채혈하였다.
중화항체 시험은 바이러스 역가(Virus titer) 3.5 TCID50/㎖로 진행하였으며, 검출한계(detection limit)는 희석배수 10배로 하여 수행하였다.
항체 형성능 확인
DAY
(2반복)		 0 0 0
평균		 21 21 21
평균		 35 35 35
평균
실험예 3 1 10 10 10 10 10 10 320 320 320
2 10 10 10 10 10 10 160 160 160
3 10 10 10 10 10 10 640 640 640
대조군 1 10 10 10 10 10 10 10 10 10
2 10 10 10 10 10 10 10 10 10
3 10 10 10 10 10 10 10 10 10
상기 표 12에 나타난 바와 같이, 대조군에서는 항체 형성이 관찰되지 않았으며, 본 발명의 면역증가제로 몬타나이드 겔을 첨가한 백신 조성물(실험예 3) 투여 그룹은 높은 항체 형성율을 보이는 것을 확인하였다.
실시예 6 : COVID-19 백신 조성물 투여에 따른 T 세포 활성 유도 확인
6-1 : T 세포 활성 유도 확인
본 발명에서는 COVID-19 백신 조성물 투여에 의해 실제 생체 내 T 세포 활성이 유도되는지 확인하고자 하였다.
실험동물로는 마우스를 이용하였으며, 하기 표 13과 같이 상기 실시예 3의 실험예 3 및 대조군과 같이 그룹을 나누어서 실험을 진행하였다.
마우스에서 시험백신의 T 세포 활성 유도 평가 그룹
구분 공시두수 유효항원 함량
(㎍/dose)		 면역증강제 보존제
실험예 3 10 S1 60 Montanide gel PR02(10%) Thimerosal
(0.01%)
RBD 60
대조군 4 PBS - - -
구체적으로, 7주령 마우스(C57BL/6 female)에 2주 간격으로 총 2회 실험예 3의 COVID-19 백신과 대조군을 투여하였으며, 마지막 백신 투여 기준 2주 뒤 마우스 비장 세포를 분리한 후 SARS-CoV-2 S1 재조합 항원 단백질 및 RBD 재조합 항원 단백질을 재처리하였다 (항원 각각 10 ㎍/㎖ 또는 20 ㎍/㎖). 그 다음, 분리된 비장세포에 형광물질로 표지된 CD4, IL-5, IL-17항체를 처리한 후 CD4+ T 세포의 활성도를 유세포분석기를 이용하여 측정하였다. 그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, 본 발명의 SARS-CoV-2 S1 재조합 항원 단백질 및 RBD 재조합 항원 단백질과 면역증가제로 몬타나이드 겔을 첨가한 COVID-19 백신 조성물은 CD4+IL-5+ T 세포(T helper 2) 및 CD4+IL-17+ T 세포(T helper 17)의 활성을 효과적으로 유도하는 것을 확인하였다.
CD4+ T 세포의 활성은 항원에 대한 특이 항체 생성과 점막 면역 강화에 관여되어 있으므로 본 발명의 백신 조성물은 COVID-19 바이러스에 대한 면역 활성 효능을 효과적으로 증가시킬 수 있는 것을 의미한다.
6-2 : 사이토카인 생성 유도 확인
본 발명에서는 COVID-19 백신 조성물 투여에 의해 생체 내 사이토카인 생성이 유도되는지 확인하고자 하였다.
상기 실시예 6-1에서 분리한 마우스 비장세포의 상층액을 수득한 다음, ELISA 분석을 통해 IFN-γ 및 IL-5 생성 정도를 확인하였다.
그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이, 본 발명의 SARS-CoV-2 S1 재조합 항원 단백질 및 RBD 재조합 항원 단백질과 면역증가제로 몬타나이드 겔을 첨가한 COVID-19 백신 조성물은 IFN-γ 및 IL-5 생성을 효과적으로 유도하는 것을 확인하였다.
본 발명의 코로나바이러스감염증-19(COVID-19) 백신 조성물은 몬타나이드겔이 포함되지 않은 백신 조성물에 비해 항체형성능(면역원성)이 증가한 것을 확인하였으며, 백신 접종에 의해 T 세포 활성이 유도될뿐만 아니라, COVID-19 바이러스의 남아공 변이 및 영국 변이에도 높은 면역원성을 보이는 것을 확인하였으므로, 코로나바이러스감염증-19 예방 또는 치료를 위한 백신 조성물로 활용될 수 있다.

Claims (13)

  1. SARS-CoV-2 바이러스의 스파이크 1(Spike 1) 재조합 항원 단백질 및 RBD(receptor binding domain) 재조합 항원 단백질을 포함하는 항원 조성물; 및
    면역증강제로서 몬타나이드 겔(Montanide Gel)을 포함하는, 면역원성이 증가된 코로나바이러스감염증-19 백신 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 SARS-CoV-2 바이러스의 스파이크 1(Spike 1) 재조합 항원 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열로,
    상기 RBD(receptor binding domain) 재조합 항원 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 하는, 면역원성이 증가된 코로나바이러스감염증-19 백신 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 서열번호 1의 아미노산은 서열번호 3의 염기서열로 코딩될 수 있으며, 상기 서열번호 2의 아미노산은 서열번호 4의 염기서열로 코딩되는 것을 특징으로 하는, 면역원성이 증가된 코로나바이러스감염증-19 백신 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 면역증강제는 전체 조성물에 5 ~ 30%, 바람직하게는 5 ~ 20%로 포함되는 것을 특징으로 하는, 면역원성이 증가된 코로나바이러스감염증-19 백신 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 몬타나이드 겔은 Montanide Gel PR02인 것을 특징으로 하는, 면역원성이 증가된 코로나바이러스감염증-19 백신 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 백신 조성물은 마우스, 기니피그, 고양이 및 개로 이루어진 군으로부터 선택된 개체에 투여되는 것을 특징으로 하는, 면역원성이 증가된 코로나바이러스감염증-19 백신 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 백신 조성물에서 항원 단백질 각각의 1회 투여 용량은 5 ~ 100 ㎍인 것을 특징으로 하는, 면역원성이 증가된 코로나바이러스감염증-19 백신 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 백신 조성물은 개체에 1차 투여하고, 10일 ~ 30일 후에 2차 투여하는 것을 특징으로 하는, 면역원성이 증가된 코로나바이러스감염증-19 백신 조성물.
  9. 제1항에 있어서, 상기 백신 조성물은 피하주사, 복강주사 또는 근육 주사를 통해 투여하는 것을 특징으로 하는, 면역원성이 증가된 코로나바이러스감염증-19 백신 조성물.
  10. 제1항에 있어서, 상기 백신 조성물은 CD4+IL-5+ T 세포 또는 CD4+IL-17+ T 세포를 활성화시키고, IFN-γ또는 IL-5 사이토카인 생성을 유도하는 것을 특징으로 하는, 면역원성이 증가된 코로나바이러스감염증-19 백신 조성물.
  11. 제1항에 있어서, 상기 백신 조성물은 남아공 또는 영국 변이 코로나바이러스감염증-19 바이러스에 대한 교차 방어 효능을 가지는 것을 특징으로 하는, 면역원성이 증가된 코로나바이러스감염증-19 백신 조성물.
  12. 제1항 내지 제 11항 중 어느 한 항의 면역원성이 증가된 코로나바이러스감염증-19 백신 조성물을 포함하는 코로나바이러스감염증-19의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  13. 제1항 내지 제 11항 중 어느 한 항의 면역원성이 증가된 코로나바이러스감염증-19 백신 조성물을 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는 코로나바이러스감염증-19의 예방방법.
PCT/KR2021/095130 2021-12-16 2021-12-21 면역원성이 증가된 코로나바이러스감염증-19 백신 조성물 WO2023113094A1 (ko)

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