WO2021210924A1 - 아프리카돼지열병 백신 조성물 - Google Patents

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swine fever
african swine
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김은진
엄태기
송경주
김민지
육근영
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(주)플럼라인생명과학
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    • C12N2710/12034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Definitions

  • the present invention relates to polypeptides, polynucleotides, plasmids and vaccine compositions containing them involved in generating an immune response against African swine fever.
  • the present invention also relates to a method of generating an immune response against African swine fever in a subject.
  • the present invention relates to polypeptides, polynucleotides, and plasmids involved in generating an immune response against African swine fever, and pharmaceutical compositions for treating or preventing African swine fever containing them.
  • the present invention also relates to a method for preventing or treating African swine fever in a subject.
  • African Swine Fever is a deadly viral hemorrhagic swine epidemic. Once onset, it is highly contagious, there is no cure, and the mortality rate of most infected pigs is very high. . Therefore, when African swine fever occurs, it must be reported immediately to the World Organization for Animal Health (OIE), and international trade related to pigs is immediately halted. African swine fever is classified as a very important disease by the World Organization for Animal Health (OIE), and in Korea, it has been designated and managed as a type 1 legal infectious disease under the Livestock Infectious Diseases Prevention Act.
  • OIE World Organization for Animal Health
  • African swine fever virus is a DNA virus with a diameter of about 200 nm, belonging to the genus Asfivirus of the Asfarviridae family. African swine fever virus does not infect humans or other animals, but is reported to infect only animals belonging to the Suidae family.
  • African swine fever virus is present in large quantities in saliva, respiratory secretions, urine, and feces from infected animals, and African swine fever is transmitted to normal animals that come into contact with these substances. Because the virus can persist in blood and tissues after pig death, feeding pigs with untreated remains containing tissues from infected animals can spread rapidly. Alternatively, the virus can be transmitted through blood spilled during a fight between pigs, or diarrhea mixed with blood. Alternatively, bloodsucking insects such as soft ticks, mosquitoes, and biting flies belonging to Ornithodoros spp. may carry the African swine fever virus and act as a medium for disease transmission when biting or sucking pigs. .
  • African swine fever can infect pigs of any age. Morbidity depends on the virus infected and the route of exposure, and the incubation period for natural infection varies from 4 to 19 days. The mortality rate is almost 100% when infected with highly pathogenic viruses.
  • African swine fever virus can be classified into high pathogenicity, moderate pathogenicity and low pathogenicity according to pathogenicity. Highly pathogenic African swine fever virus usually causes acute (pigs die 1-4 days after infection) and acute (pigs die 3-8 days after infection) diseases, while highly pathogenic African swine fever virus causes acute (infection 11-) Pigs die after 15 days) and subacute (pigs die after 20 days of infection) diseases. Low pathogenic ASF virus has been reported only in endemic areas and causes subclinical or chronic disease.
  • African swine fever Diagnosis of African swine fever is difficult at an early stage, especially when the number of affected pigs is small. The reason is that the clinical symptoms of African swine fever are confused with other hemorrhagic swine diseases such as septicaemic salmonellosis and porcine dermatitis nephropathy syndrome (PDNS). Accurate discrimination is possible only through laboratory diagnosis, such as the method of detecting the virus in blood and internal organs, and the method of detecting antibodies in the serum of infected pigs. many. For example, in China, ASF is so contagious that African swine fever has occurred in all administrative regions of China in less than nine months after the first ASF was identified in 2018.
  • PDNS porcine dermatitis nephropathy syndrome
  • African swine fever virus has 10 to 12 proteins, African swine fever virus has more than 150 proteins and the virus types (24 genotypes) are diverse. Therefore, experts have predicted that it will be difficult to commercialize a vaccine within the next 10 years.
  • One object of the present invention is to provide a polypeptide capable of generating an immune response against African swine fever and a polynucleotide encoding the same.
  • Another object of the present invention is to provide a plasmid capable of generating an immune response against African swine fever.
  • Another object of the present invention is to provide a vaccine composition for African swine fever.
  • Another object of the present invention is to provide a method for generating an immune response against African swine fever in a subject.
  • Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for the treatment or prevention of African swine fever in a subject.
  • Another object of the present invention is to provide a method for treating or preventing African swine fever in a subject.
  • one aspect of the present invention is a polypeptide comprising the amino acid sequence of one or more of the African swine fever virus genes p30, p54, C-type lectin, CD2v, p49, pp62, EP364R, F317L, A104R and K205R provides
  • Another aspect of the present invention provides a polypeptide comprising at least one of the amino acid sequence of SEQ ID NOs: 1 to 10 or an amino acid sequence having at least 90% homology thereto.
  • homology refers to the degree of correspondence with a given polypeptide sequence or polynucleotide sequence and can be expressed as a percentage.
  • homologous sequences having the same or similar activity to a given polypeptide sequence are expressed as "% homology".
  • the homology is, for example, using standard software that calculates parameters such as score, identity and similarity, for example, BLAST 2.0, or hybridization written under defined stringent conditions. It can be confirmed by comparing the sequences experimentally, and an appropriate hybridization condition defined can be determined by a method well known to those skilled in the art.
  • amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1 to 10 are, respectively, from various strains of African swine fever virus genes p30 (CP204L), p54 (E183L), C-type lectin (EP153R), CD2v (EP402R), p49 (B438L) , pp62 (CP530R), EP364R, F317L, A104R, is a consensus sequence derived by comparing the sequence homology of K205R.
  • polypeptide comprising at least one of the amino acid sequence of SEQ ID NOs: 1 to 10 or an amino acid sequence having 90% or more homology thereto can effectively act as an antigen capable of generating an immune response against African swine fever.
  • the polypeptide may include one of the above amino acid sequences, or may include two or more.
  • the polypeptide may further include a Kozak sequence, an IgE leader sequence, a ubiquitin sequence and/or a cleavage site sequence.
  • the polypeptide may consist of the amino acid sequence of Kozak sequence - IgE leader sequence - SEQ ID NO: 1.
  • the polypeptide may be composed of a Kozak sequence - an IgE leader sequence - a ubiquitin sequence - the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the polypeptide may consist of a Kozak sequence - an IgE leader sequence - a ubiquitin sequence - an amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 - a cleavage site sequence - an amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • the ubiquitin sequence may preferably be SEQ ID NO: 41
  • the cleavage site sequence may preferably be SEQ ID NO: 43.
  • One aspect of the present invention provides a polynucleotide comprising at least one nucleotide sequence of the African swine fever virus genes p30, p54, C-type lectin, CD2v, p49, pp62, EP364R, F317L, A104R and K205R.
  • Another aspect of the present invention provides a polynucleotide comprising at least one of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 11 to 20 or nucleotide sequences having 90% or more homology thereto.
  • another aspect of the present invention provides a polynucleotide encoding at least one of the amino acid sequence of SEQ ID NOs: 1 to 10 or an amino acid sequence having 90% or more homology thereto.
  • the polynucleotide encoding the amino acid sequence of SEQ ID NOs: 1 to 10 may be the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 11 to 20, respectively.
  • the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 11 to 20 are, respectively, from various strains of African swine fever virus, genes p30 (CP204L), p54 (E183L), C-type lectin (EP153R), CD2v (EP402R), p49 (B438L) , pp62 (CP530R), EP364R, F317L, A104R, is a consensus sequence derived by comparing the sequence homology of K205R.
  • the polynucleotide may be one in which the amino acid sequence of SEQ ID NOs: 1 to 10 or the nucleotide sequence of SEQ ID NOs: 11 to 20 is changed to a codon optimized for a subject to generate an immune response.
  • the subject is, for example, an animal.
  • the animal may be, for example, a mammal, including pigs, cattle, horses, sheep, goats, deer, humans, and the like.
  • the animal is a pig.
  • the polynucleotide may include one of the nucleotide sequences, or may include two or more.
  • the polynucleotide may further include a Kozak sequence, an IgE leader sequence, a ubiquitin sequence, and/or a cleavage site sequence.
  • the polynucleotide may be composed of a Kozak sequence - an IgE leader sequence - a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 11.
  • the polynucleotide may be composed of a Kozak sequence - an IgE leader sequence - a ubiquitin sequence - the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 11.
  • the polynucleotide may be composed of a Kozak sequence - an IgE leader sequence - a ubiquitin sequence - a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 11 - a cleavage site sequence - a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 12.
  • the ubiquitin sequence may preferably be SEQ ID NO: 42
  • the cleavage site sequence may preferably be SEQ ID NO: 44.
  • One aspect of the present invention provides a plasmid comprising a polynucleotide comprising at least one nucleotide sequence of the African swine fever virus genes p30, p54, C-type lectin, CD2v, p49, pp62, EP364R, F317L, A104R and K205R. do.
  • Another aspect of the present invention provides a plasmid comprising a polynucleotide comprising at least one of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 11 to 20 or nucleotide sequences having 90% or more homology thereto.
  • Another aspect of the present invention provides a plasmid comprising a polynucleotide encoding at least one of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or an amino acid sequence having 90% homology with the sequence of SEQ ID NO: 1.
  • plasmid refers to a DNA preparation containing a DNA sequence operably linked to suitable regulatory sequences capable of expressing the DNA in a suitable host or subject.
  • the plasmid may be a vector, a phage particle, or simply a potential genomic insert.
  • a plasmid may be used interchangeably herein with a vector (or viral vector).
  • the plasmid may be prepared according to a conventional method known in the art. For example, by inserting the polynucleotide into a plasmid vector through gene cloning, the plasmid according to the present invention can be prepared and used as a DNA vaccine.
  • the plasmid may contain one of the polynucleotides, or may contain two or more.
  • the polynucleotide may further include a Kozak sequence, an IgE leader sequence, a ubiquitin sequence, and/or a cleavage site sequence.
  • the plasmid may include the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 31, wherein SEQ ID NO: 31 is one in which the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 11 to 20 are sequentially linked.
  • the plasmid may include the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 36, wherein SEQ ID NO: 36 is a ubiquitin sequence and the nucleotide sequence of SEQ ID NOs: 11 to 20 are sequentially linked.
  • the plasmid may include the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 50, wherein SEQ ID NO: 50 is a ubiquitin sequence and the nucleotide sequence of SEQ ID NOs: 11 to 20 are sequentially linked, the SEQ ID NO: 11 Each of the nucleotide sequences of to 20 is sequentially linked with a cleavage site sequence.
  • the ubiquitin sequence may preferably be the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 42.
  • CD8 + T cells recognize MHC class I-associated peptides derived from endogenous antigens such as viral antigens or oncogene products located in the cytosol. Prior to antigen presentation of these MHC class I molecules, the antigen is ubiquitinated and processed into antigenic peptides by the proteasome. Therefore, ubiquitin-fused proteins enter the proteasome dependent degradation pathway and enhance the ability to present MHC class I peptides, thereby inducing a cellular immune response (CTL, Cytotoxic T Lymphocyte response). can increase
  • the cleavage site sequence may preferably be the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 44.
  • the cleavage site refers to a peptide that is recognized and cleaved by a protease.
  • the polypeptide expressed from the plasmid containing the polynucleotide can be cleaved by a degrading enzyme, and each cleaved polypeptide can effectively act as an antigen capable of generating an immune response against African swine fever.
  • the cleavage site may be cleaved by an endogenous enzyme present in a cell, and specifically cleaved by a furine protease, but is not limited thereto.
  • the plasmid may include the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 32, wherein SEQ ID NO: 32 is one in which the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 11 to 14 are sequentially linked.
  • the plasmid may include the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 37, wherein SEQ ID NO: 37 is a ubiquitin sequence and the nucleotide sequence of SEQ ID NOs: 11 to 14 are sequentially linked.
  • the plasmid may include the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 33, wherein SEQ ID NO: 33 is one in which the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 15 to 20 are sequentially linked.
  • the plasmid may include the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 38, wherein SEQ ID NO: 38 is a ubiquitin sequence and the nucleotide sequence of SEQ ID NOs: 15 to 20 are sequentially linked.
  • the plasmid may include the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 34, wherein the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 11, 12, 16, 13 and 14 is sequentially linked.
  • the plasmid may include the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 39, wherein SEQ ID NO: 39 is a ubiquitin sequence and the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 11, 12, 16, 13 and 14 are sequentially linked.
  • the plasmid may include the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 35, wherein the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 15, 17, 18, 19 and 20 is sequentially linked.
  • the plasmid may include the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 40, wherein SEQ ID NO: 40 is a ubiquitin sequence and the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 15, 17, 18, 19 and 20 are sequentially linked.
  • the plasmid may include the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 50, wherein SEQ ID NO: 50 is a ubiquitin sequence of SEQ ID NO: 42; and SEQ ID NO: 11, 44, 12, 44, 13, 44, 14, 44, 15, 44, 16, 44, 17, 44, 18, 44, 19, 44, 20 nucleotide sequences are sequentially linked.
  • the plasmid may include the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 51, wherein SEQ ID NO: 51 is a ubiquitin sequence of SEQ ID NO: 42; And the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 11, 44, 12, 44, 13, 44, 14, including the cleavage site sequence of SEQ ID NO: 44, is sequentially linked.
  • the plasmid may include the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 52, wherein SEQ ID NO: 52 is a ubiquitin sequence of SEQ ID NO: 42; And the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 15, 44, 16, 44, 17, 44, 18, 44, 19, 44, 20, including the cleavage site sequence of SEQ ID NO: 44, is sequentially linked.
  • the plasmid may include the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 53, wherein SEQ ID NO: 53 is a ubiquitin sequence of SEQ ID NO: 42; And the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 11, 44, 12, 44, 16, 44, 13, 44, 14, including the cleavage site sequence of SEQ ID NO: 44, is sequentially linked.
  • the plasmid may include the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 54, wherein SEQ ID NO: 54 is a ubiquitin sequence of SEQ ID NO: 42; And the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 15, 44, 17, 44, 18, 44, 19, 44, 20, including the cleavage site sequence of SEQ ID NO: 44, is sequentially linked.
  • Another aspect of the present invention provides an African swine fever vaccine composition
  • a polypeptide of the present invention a polynucleotide of the present invention, or a plasmid of the present invention.
  • the polypeptide, the polynucleotide, and the plasmid are as described above unless otherwise specified.
  • vaccine refers to an immunogenic or antigenic substance that produces immunity by administering, for example, injecting or oral administration, to a human or animal for the prevention of a disease as a biological agent containing an antigen that gives immunity to an individual.
  • the vaccine may be a DNA vaccine.
  • DNA vaccine refers to a vaccine that induces an immune response by artificially replicating some of genes such as pathogens or viruses and then administering them. These DNA vaccines have various advantages compared to the existing protein vaccines: i) There is no need to directly handle dangerous pathogens because they can be synthesized only with the genetic information of the pure target pathogen antigen, ii) only some of the genes necessary for inducing toxicity Because it is used, there is no fear of showing any particular toxicity even when administered to an administration body, and iii) it is possible to develop a vaccine by responding quickly to various infectious diseases that occur suddenly because of its simplicity consisting of only plasmid DNA.
  • the African swine fever vaccine composition may preferably have protective immunity against the African swine fever virus.
  • the vaccine composition of the present invention may include a veterinarily acceptable carrier.
  • veterinary acceptable carrier includes any and all solvents, dispersion media, coatings, adjuvants, stabilizers, diluents, preservatives, antibacterial and antifungal agents, isotonic agents, adsorption delaying agents, and the like.
  • Carriers, excipients, and diluents that may be included in the vaccine composition include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, maltitol, starch, glycerin, starch, gum acacia, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose , methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil.
  • the vaccine composition of the present invention may be formulated in the form of oral dosage forms such as powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols, and the like and sterile injection solutions according to conventional methods, respectively.
  • oral dosage forms such as powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols, and the like and sterile injection solutions according to conventional methods, respectively.
  • it can be prepared using commonly used diluents or excipients such as fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrants, and surfactants.
  • poly-L-Glutamic acid can be used to help in stabilization.
  • the vaccine composition may be injected into a subject in various forms.
  • injection may be performed by any one method selected from the group consisting of subcutaneous injection, intramuscular injection, subcutaneous injection, intraperitoneal injection, nasal administration, oral administration, transdermal administration and oral administration.
  • the vaccine composition may include one or more adjuvants and the like to improve or enhance an immune response.
  • Suitable adjuvants include peptides, aluminum hydroxide, aluminum phosphate, aluminum oxide, and compositions consisting of mineral or vegetable oils such as Marcol 52 and one or more emulsifiers or surface active substances such as resorcecithin, polyvalent cations, polyanions, and the like.
  • One aspect of the present invention provides a method for generating an immune response against African swine fever virus in an individual, comprising administering the vaccine composition of the present invention to the individual.
  • the vaccine composition is as described above unless otherwise specified.
  • immune response refers to the activation of a host's immune system in response to introduction of an antigen.
  • the immune response may be in the form of a cellular response or a humoral response, or both.
  • the term “individual” refers to animals, including humans, and may be, for example, mammals, more specifically, pigs, cattle, horses, sheep, goats, deer, humans, and the like. Preferably, it is a pig.
  • the term “individual” may be used interchangeably with subject or host.
  • the vaccine composition of the present invention may include an effective amount of an active ingredient, ie, a whole recombinant polypeptide, a recombinant polynucleotide, or a plasmid comprising the same together with a pharmaceutically acceptable carrier and adjuvant.
  • an effective amount means that a component of a vaccine is in an amount sufficient to induce a specific immune response against the African swine fever virus in the vaccinated animal.
  • An effective amount can be readily determined by one skilled in the art, for example, through routine experimentation in animals.
  • the administration may be administered by any route suitable for administration of the DNA vaccine, for example, by subcutaneous, intramuscular, intraperitoneal or intravenous injection.
  • Another aspect of the present invention provides a method for treating or preventing African swine fever in a subject, comprising administering to the subject a vaccine composition, polypeptide, polynucleotide or plasmid of the present invention.
  • Another aspect of the present invention provides a pharmaceutical composition for treating or preventing African swine fever comprising the polypeptide, polynucleotide or plasmid according to the present invention.
  • each term has the same meaning as described above unless otherwise specified.
  • prevention refers to any action in which African swine fever is suppressed or delayed by administration of the composition according to the present invention.
  • treatment used in the present invention refers to any action in which symptoms of African swine fever are improved, cured, ameliorated, or partially treated by administration of the composition according to the present invention.
  • the vaccine composition according to the present invention is a DNA vaccine and has excellent protective immunity against African swine fever virus.
  • the vaccine composition according to the present invention is very effective in inducing a cellular immune response against African swine fever.
  • ASF 1 is a cleavage map of a vector containing an African Swine Fever (ASF) virus gene, a Kozak sequence, an IgE leader sequence, a ubiquitin sequence, and a furin cleavage site sequence. It relates to a vector comprising p30, p54, C-type lectin, CD2v, p49, pp62, EP364R, F317L, A104R and K205R as ASF virus genes.
  • ASF African Swine Fever
  • FIG. 2 is a cleavage map of a vector containing an ASF virus gene, including a Kozak sequence, an IgE leader sequence, a ubiquitin sequence, and a purine cleavage site sequence, and p30, p54, C-type lectin and CD2v as ASF virus genes. It's about vectors.
  • FIG. 3 is a cleavage map of a vector containing an ASF virus gene, including a Kozak sequence, an IgE leader sequence, a ubiquitin sequence and a purine cleavage site sequence, and p49, pp62, EP364R, F317L, A104R and K205R as ASF virus genes. It's about a vector.
  • cleavage map of a vector containing an ASF virus gene including a Kozak sequence, an IgE leader sequence, a ubiquitin sequence and a purine cleavage site sequence, and p30, p54, pp62, C-type lectin and CD2v as ASF virus genes. It relates to the containing vector.
  • FIG. 5 is a cleavage map of a vector containing an ASF virus gene, a vector containing a Kozak sequence, an IgE leader sequence, a ubiquitin sequence and a purine cleavage site sequence, and p49, EP364R, F317L, A104R and K205R as ASF virus genes. is about
  • FIG. 6 is a graph showing the number of cytotoxic T cells (CD8 + T cells) produced by ASF virus antigens (p30, p54 or CD2v) after DNA vaccination comprising an ASF virus gene, wherein the DNA vaccine Indicates the level of the induced cellular immune response.
  • 'Mock' is the control group administered with the DNA vaccine that does not contain the ASF virus gene
  • 'ASF_4G' is the experimental group that contains the ASF virus gene (p30, p54, C type lectin and CD2v) and is administered with the DNA vaccine that does not contain ubiquitin.
  • 1, 'ASF_Ubi_4G' refers to Experimental Group 2, which includes ASF virus genes (p30, p54, C type lectin and CD2v) and is administered with a DNA vaccine containing ubiquitin.
  • FIG. 7 is a graph showing the survival rate of pigs infected with ASF virus after DNA vaccination containing an ASF virus gene.
  • 'Mock' refers to the control group administered with the DNA vaccine that does not contain the ASF virus gene
  • 'ASF_Ubi_10G' refers to the ASF virus gene (p30, p54, C-type lectin, CD2v, p49, pp62, EP364R, F317L, A104R and K205R). and refers to the experimental group to which the DNA vaccine containing ubiquitin was administered.
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 11 are consensus sequences derived by comparing the sequence homology of the p30 (CP204L) gene from various strains of African swine fever virus.
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 11 are African swine fever virus strain ANG/70 (GenBank accession no. EU874271), Malawi/1978 (GenBank accession no. JQ744998), NAM/1/80 ( GenBank accession no. JQ745005), Dedza (GenBank accession no. JQ745028), BUR/90/1 (GenBank accession no.
  • KC867500 MOZ/1979 (GenBank accession no. EU874310), SPEC/154 (GenBank accession no. EU874291), SPEC/205 (GenBank accession no. KC867500). EU874305), SPEC/209 (GenBank accession no. EU874290), SPEC/257 (GenBank accession no. EU874265), MOZ/94/8 (GenBank accession no. EU874276), E70 (GenBank accession no. AF462272), ZAM/2017 /Mbala/1 (GenBank accession no. LC322014), CN201801 (GenBank accession no. MH735141), DB/HLJ/2018 (GenBank accession no. MK333184), M-78 (GenBank accession no.
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 12 are consensus sequences derived by comparing the sequence homology of the p54 (E183L) gene from various strains of African swine fever virus.
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 12 are African swine fever virus strains Tengani/60 (GenBank accession no. KF015886), ANG/70 (GenBank accession no. EU874327), BA71 (GenBank accession no. KP055815), Malawi/1978 (GenBank accession no. KC662380), Brazil/79 (GenBank accession no.
  • KF736414 LIL 90/1 (GenBank accession) No. KF736416), LIV 9/31 (GenBank accession no. KF015928), MAN 89/2 (GenBank accession no. KF015940), MOZ 2001/1 (GenBank accession no. KF736428), MPO 89/1 (GenBank accession no. KF015940). KF736418), Trench (GenBank accession no. KF736420), MOZ/1960 (GenBank accession no. KF736420). EU874371), Lillie (GenBank accession no. EU874341), Madagascar (GenBank accession no. KC662387), ZIM/92/1 (GenBank accession no.
  • EU874345 SPEC/205 (GenBank accession no. EU874329), Co62 (GenBank accession no. FJ174387), E70 (GenBank accession no. FJ174389), Ba71V (GenBank accession no. U18466), E75 (GenBank accession no. FN557520), Hu90 (GenBank accession no. FJ174399), SS81 (GenBank accession no. FJ174403), Ori90 (GenBank accession no. FJ174407), Nu98 .8B (GenBank accession no. FJ174418), OURT 88/3 (GenBank accession no. AM712240), Almodovar 99 (GenBank accession no.
  • HQ645949 TAN/08/Mazim bu* (GenBank accession no. GQ410767), TAN/08/Mabibo* (GenBank accession no. GQ410768), Arm07 (GenBank accession no. JX857494), Az08D (GenBank accession no. JX857501), Oren08 (GenBank accession no. JX857498), Rostov09 (GenBank accession no. JX857494). JX857504), Tver0312/Novo (GenBank accession no. KJ627190), Bel13/Grodno (GenBank accession no. KJ627192), LT14/1490 (GenBank accession no. KJ627193), ETH/1 (GenBank accession no.
  • MK333181 Pig/HLJ/2018 (GenBank accession no. MK333180), ASFV-SY18 (GenBank accession no. MH766894), CN201801 (GenBank accession no. MH735140), Estonia 2014 (GenBank) accession no. LS478113) and Nig6_JS10 (GenBank accession no. KT961344) were prepared by comparing the sequence homology of the p54 (E183L) gene.
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 and the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 13 are consensus sequences derived by comparing the sequence homology of the C-type lectin (EP153R) gene from various strains of African swine fever virus.
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 and the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 13 are African swine fever virus strain Katanga/63 (GenBank accession no. KM609340), Kenya (GenBank accession no. KM609361), BA71 (GenBank accession no. KP055815) , Davis (GenBank accession no. KM609336), Ba71V (GenBank accession no. U18466), E75 (GenBank accession no.
  • AF017034 K1 (GenBank accession no. AF017033), CR3 (GenBank accession no. AF017029), CR1 (GenBank accession no. AF017028), LC-PP (GenBank accession no. KM609345), Magadi (GenBank accession) no. kM609348), Bartlett (GenBank accession no. KM609335), Volgograd_2012/wb (GenBank accession no. KM609363), Volgograd_2012/dom (GenBank accession no. KM609) 362), Tver_2012/wb (GenBank accession no. KM609360), Rhodesia (GenBank accession no.
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 and the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 14 are consensus sequences derived by comparing the sequence homology of the CD2v (EP402R) gene from various strains of African swine fever virus. Specifically, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 and the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 14 are African swine fever virus strain China/2018/AnhuiXCGQ (GenBank accession no. MK128995), DB/LN/2018 (GenBank accession no. MK333181), Pig/ HLJ/2018 (GenBank accession no. MK333180), ASFV-SY18 (GenBank accession no. MH766894), Belgium 2018/1 (GenBank accession no.
  • KM609388 TSP80 (GenBank accessi) on no. KM609359), K-49 (GenBank accession no. KM609339), KK-262 (GenBank accession no. KM609341), Spencer (GenBank accession no. KM609357), MK-200 (GenBank accession no. KM609347), 691/88 (GenBank) accession no. KM609334), F-32 (GenBank accession no. KM609337), O-77 (GenBank accession no. KM609350), P-60 (GenBank accession no. KM609351), PPA (GenBank accession no. KM609352), STP- 1 (GenBank accession no.
  • KM609355 BA71 (GenBank accession no. KP055815), STP-1-79 (GenBank accession no. KM609384), Malta (GenBank accession no. KM609380), Yamba-74 (GenBank accession no. KM609391) , TKF (GenBank accession no. KM609387), Kimuele-6 (GenBank accession no. KM609375), E-70 (GenBank accession no. KM609369), Cuba-71 (GenBank accession no. KM609366), CU-80 (GenBank accession no. KM609365), Brazil-80 (GenBank accession no. KM609364), MNI-82 (GenBank accession no.
  • KM609378 K-73 (Le Bray) (GenBank accession no. KM609370), Madeira (GenBank accession no. KM609379), Diamang (GenBank accession no. KM609367), L-50 (GenBank accession no. KM609343), L-57 (GenBank accession no. KM609344), Kikasa-77 (GenBank accession no. KM609371), and VL (GenBank accession no. KM609390) were constructed by comparing the sequence homology of the CD2v (EP402R) gene.
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 and the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 15 are consensus sequences derived by comparing the sequence homology of the p49 (B438L) gene from various strains of African swine fever virus. Specifically, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 and the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 15 are African swine fever virus strain BA71 (GenBank accession no. KP055815), Ba71V (GenBank accession no. U18466), E75 (GenBank accession no. FN557520), OURT 88/3 (GenBank accession no. AM712240), Georgia 2007 (GenBank accession no. FR682468), Ken05/Tk1 (GenBank accession no.
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 and the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 16 are consensus sequences derived by comparing the sequence homology of the pp62 (CP530R) gene from various strains of African swine fever virus. Specifically, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 and the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 16 are African swine fever virus strain BA71 (GenBank accession no. KP055815), Ba71V (GenBank accession no. U18466), E75 (GenBank accession no. FN557520), OURT 88/3 (GenBank accession no. AM712240), Georgia 2007 (GenBank accession no. FR682468), Ken05/Tk1 (GenBank accession no.
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 and the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 17 are consensus sequences derived by comparing the sequence homology of the EP364R gene from various strains of African swine fever virus. Specifically, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 and the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 17 are African swine fever virus strain BA71 (GenBank accession no. KP055815), Ba71V (GenBank accession no. U18466), E75 (GenBank accession no. FN557520), OURT 88/3 (GenBank accession no. AM712240), Georgia 2007 (GenBank accession no. FR682468), Ken05/Tk1 (GenBank accession no.
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8 and the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 18 are consensus sequences derived by comparing the sequence homology of the F317L gene from various strains of African swine fever virus. Specifically, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8 and the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 18 are African swine fever virus strain BA71 (GenBank accession no. KP055815), Ba71V (GenBank accession no. U18466), E75 (GenBank accession no. FN557520), OURT 88/3 (GenBank accession no. AM712240), Georgia 2007 (GenBank accession no. FR682468), Ken05/Tk1 (GenBank accession no.
  • Pol16_20186_o7 (GenBank accession no. Pol_04461_o7 (GenBank accession no. Pol_04461_C) accession no. MG939588), Belgium 2018/1 (GenBank accession no. LR536725), China/2018/AnhuiXCGQ (GenBank accession no. MK128995), DB/LN/2018 (GenBank accession no. MK333181), Pig/HLJ/2018 ( Gen Bank access no. MK333180), ASFV-SY18 (GenBank accession no. MH766894) was prepared by comparing the sequence homology of the F317L gene.
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 and the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 19 are consensus sequences derived by comparing the sequence homology of the A104R gene from various strains of African swine fever virus. Specifically, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 and the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 19 are African swine fever virus strain BA71 (GenBank accession no. KP055815), Ba71V (GenBank accession no. U18466), E75 (GenBank accession no. FN557520), OURT 88/3 (GenBank accession no. AM712240), Georgia 2007 (GenBank accession no. FR682468), Ken05/Tk1 (GenBank accession no.
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10 and the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 20 are consensus sequences derived by comparing the sequence homology of the K205R gene from various strains of African swine fever virus.
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10 and the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 20 are African swine fever virus strain BA71 (GenBank accession no. KP055815), Ba71V (GenBank accession no. U18466), E75 (GenBank accession no. FN557520), OURT 88/3 (GenBank accession no. AM712240), Georgia 2007 (GenBank accession no. FR682468), Ken05/Tk1 (GenBank accession no.
  • a vaccine was prepared using the African swine fever virus gene of Example 1.
  • a DNA plasmid containing the gene, a Kozak sequence, an IgE leader sequence, a ubiquitin sequence, and/or a furin cleavage site sequence was prepared by a general method known in the art. Then, Escherichia coli having the DNA plasmid was inoculated into 2.5L of LB medium and cultured at 37°C, oil-in-water (O/W). A plasmid was extracted from the cultured E. coli using the EndoFree Plasmid Giga kit (QIAGEN, Cat#12391), and the extracted plasmid was used for subsequent inoculation as a vaccine.
  • FIGS. 1 to 5 Cleavage maps of the prepared DNA plasmid are shown in FIGS. 1 to 5 .
  • the spleen was extracted from the mouse a week later and splenocytes were isolated, and IFN-gamma ELISpot KIT (Cellular Technology Limited/USA) was used for the isolated splenocytes. and mouse IFN-gamma ELISpot analysis was performed. Specifically, by analyzing the number of cytotoxic T cells (CD8 + T cells) secreting IFN- ⁇ after treating the splenocytes administered with each vaccine with the polypeptide of each antigen gene, induced by virus infection after vaccination The degree of cellular immune response was confirmed.
  • IFN-gamma ELISpot KIT Cellular Technology Limited/USA
  • the DNA vaccine was administered to piglets a total of three times (week 0, week 2, week 4). After that, the African swine fever virus was challenged at the 7th week, and the survival rate for 28 days thereafter was investigated. At this time, the type of DNA vaccine administered to each control group and experimental group was set as follows.
  • DNA vaccine containing African swine fever virus gene and ubiquitin (ASF_Ubi_10G DNA vaccine; ubiquitin, p30, p54, C-type lectin, CD2v, p49, pp62, EP364R, F317L, A104R and K205R)
  • the DNA vaccine containing the African swine fever virus gene and ubiquitin when inoculated, it shows excellent viability even when infected with the African swine fever virus, so the DNA vaccine is useful as a vaccine composition for preventing African swine fever. found that it could be used.

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Abstract

본 발명은 아프리카돼지열병에 대한 면역 반응 생성에 관여하는 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 플라스미드 및 이들을 함유하는 백신 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 개체에서 아프리카돼지열병에 대한 면역 반응을 생성하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 아프리카돼지열병에 대한 면역 반응 생성에 관여하는 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 플라스미드 및 이들을 함유하는 아프리카돼지열병 치료 또는 예방용 약학 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 개체에서 아프리카돼지열병을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다.

Description

아프리카돼지열병 백신 조성물
본 발명은 아프리카돼지열병에 대한 면역 반응 생성에 관여하는 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 플라스미드 및 이들을 함유하는 백신 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 개체에서 아프리카돼지열병에 대한 면역 반응을 생성하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 아프리카돼지열병에 대한 면역 반응 생성에 관여하는 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 플라스미드 및 이들을 함유하는 아프리카돼지열병 치료 또는 예방용 약학 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 개체에서 아프리카돼지열병을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다.
아프리카돼지열병(African Swine Fever, ASF)은 치명적인 바이러스성 출혈성 돼지 전염병으로서, 일단 발병하게 되면 전파성이 매우 높으며 치료법이 없고 감염된 돼지들은 대부분 폐사하는 치사율이 매우 높기 때문에 양돈 산업에 엄청난 피해를 주는 질병이다. 따라서, 아프리카돼지열병이 발생하면 세계동물보건기구(OIE)에 발생 사실을 즉시 보고해야 하며, 돼지와 관련된 국제교역도 즉시 중단된다. 아프리카돼지열병은 세계동물보건기구(OIE)에서 매우 중요 질병으로 분류되어 있고, 우리나라에서는 가축전염병예방법상 제1종 법정전염병으로 지정하여 관리하고 있다.
아프리카돼지열병 바이러스(ASFV)는 아스파바이러스과(Asfarviridae) 아스피바이러스속(Asfivirus)에 속하는 약 200nm 정도의 DNA 바이러스이다. 아프리카돼지열병 바이러스는 사람이나 다른 동물에 감염되지 않고, 돼지과(Suidae)에 속하는 동물에만 감염되는 것으로 보고되고 있다.
감염된 동물로부터 나온 침, 호흡기 분비물, 오줌, 분변 등에는 아프리카돼지열병 바이러스가 대량 존재하며, 이러한 물질에 접촉한 정상 동물에게 아프리카돼지열병이 전파된다. 돼지가 죽은 후에도 혈액과 조직에 바이러스가 존속할 수 있기 때문에, 감염된 동물의 조직을 포함하고 있는 열처리하지 않은 잔반을 돼지에게 급여하면 급속하게 전파될 수 있다. 또는, 돼지들끼리 싸우는 동안 흘린 피, 혈액이 섞인 설사 등으로 인해 바이러스가 전파될 수도 있다. 또는, Ornithodoros spp.에 속하는 물렁 진드기(soft tick), 모기, 무는 파리 같은 흡혈 곤충 등이 아프리카돼지열병 바이러스를 보균하고 있다가 돼지를 물거나 흡혈할 때 질병을 전파하는 역할을 하는 매개체로 작용하기도 한다.
아프리카돼지열병은 모든 연령의 돼지가 감염될 수 있다. 이병률은 감염된 바이러스와 노출 경로에 따라 달라지며, 자연 감염 시 잠복기는 4일에서 19일까지 다양하다. 폐사율은 고병원성 바이러스에 감염된 경우 거의 100% 폐사된다.
아프리카돼지열병 바이러스는 병원성에 따라 고병원성, 중병원성 및 저병원성으로 분류될 수 있다. 고병원성 아프리카돼지열병 바이러스는 보통 심급성(감염 1-4일 후 돼지가 죽음) 및 급성형(감염 3-8일 후 돼지가 죽음) 질병을 일으키며, 중병원성 아프리카돼지열병 바이러스는 급성(감염 11-15일 후 돼지가 죽음) 및 아급성형(감염 20일 후 돼지가 죽음) 질병을 일으킨다. 저병원성 아프리카돼지열병 바이러스는 풍토병화된 지역에서만 보고되었으며 준임상형 또는 만성형 질병을 일으킨다.
아프리카돼지열병은 발생 초기에, 특히 이환된 돼지의 수가 적을 때에는 질환의 진단이 쉽지 않다. 그 이유는 아프리카돼지열병의 임상 증상은 폐혈증성 살모넬라증(Septicaemic salmonellosis), 돼지피부염신증증후군(porcine dermatitis nephropathy syndrome, PDNS) 등 다른 출혈성 돼지질병과 혼동되기 때문이다. 혈액 및 내부 장기에서 바이러스를 검출하는 방법, 감염돈의 혈청에서 항체를 검출하는 방법 등 실험실적 진단을 통해서만 정확한 구별이 가능하며, 아프리카돼지열병이라고 진단되는 경우에는 이미 질병이 널리 전염되어 있는 경우가 많다. 예를 들어, 중국에서는 2018년에 아프리카돼지열병이 최초로 확인된 이후 9개월이 채 안 되는 기간에 중국 전 행정구역에서 아프리카돼지열병이 발생할 정도로 아프리카돼지열병의 전염력은 매우 높다. 또한, 세계 최대 양돈국가인 중국에서 아프리카돼지열병으로 인해 2019년에 약 1억 3천만 마리의 돼지가 폐사되거나 살처분되었으며, 이는 아프리카돼지열병 발생 전 4억 3천 마리의 돼지에서 약 1/3 가량이 감소되었음을 의미한다.
아프리카돼지열병 백신의 연구는 1960년대 이후 꾸준히 진행되고 있다. 약독화 생백신, 불활화 백신, 재조합 단백질 백신, 바이러스 벡터 백신 등 현재까지 다양한 시도가 이루어졌으나, 상업적으로 적용될 수 있을 만큼 효과가 우수한 백신은 개발되지 못하고 있는 실정이다. 최근 불활화 백신(inactivated vaccine)을 접종하여 중화항체가 형성되어도 실제 공격접종 (challenge) 시에는 방어효과가 없거나 미미하였다는 연구 결과가 발표된바 있으며, 이를 통해 중화항체를 생성하는 것 이외에 세포성 면역 반응을 유도하는 것이 백신의 바이러스에 대한 방어능을 향상시키는데 중요한 메커니즘임을 알 수 있다(Takamatsu et al., Virus Res. 2013 Apr, 173(1):110-21.).
또한, 돼지에 치명적인 아프리카돼지열병에 효과적인 백신을 개발하기 어려운 이유 중 하나는 크고 복잡한 아프리카돼지열병 바이러스의 특성 때문이다. 일반적인 바이러스가 10~12개의 단백질을 가지고 있다면, 아프리카돼지열병 바이러스는 150개 이상의 단백질을 가지고 있고 바이러스 종류(24가지 유전형)도 다양하다. 따라서, 전문가들은 향후 최소한 10년 이내에는 백신의 상용화가 어려울 것이라고 전망해왔다.
따라서, 아프리카돼지열병에 대한 백신 또는 치료제가 절실하게 요구된다. 특히, 아프리카돼지열병은 안정적이고 효과적으로 미리 예방하는 것이 중요하며, 이를 위한 신규 백신의 미충족 수요가 매우 크다.
본 발명의 일 목적은 아프리카돼지열병에 대한 면역 반응을 생성할 수 있는 폴리펩티드 및 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 아프리카돼지열병에 대한 면역 반응을 생성할 수 있는 플라스미드를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 아프리카돼지열병에 대한 백신 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 개체에서 아프리카돼지열병에 대한 면역 반응을 생성하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 개체에서 아프리카돼지열병 치료 또는 예방용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 개체에서 아프리카돼지열병을 치료 또는 예방하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명의 일 양태는 아프리카돼지열병 바이러스의 유전자 p30, p54, C-type lectin, CD2v, p49, pp62, EP364R, F317L, A104R 및 K205R 중 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다.
본 발명의 또 다른 일 양태는 서열번호 1 내지 10의 아미노산 서열 또는 이와 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열 중 하나 이상을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "상동성"은 주어진 폴리펩티드 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열과 일치하는 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 본 명세서에서, 주어진 폴리펩티드 서열과 동일하거나 유사한 활성을 갖는 그의 상동성 서열이 "% 상동성"으로 표시된다. 상기 상동성은 예를 들면, 점수(score), 동일성(identity) 및 유사도(similarity) 등의 매개 변수(parameter)들을 계산하는 표준 소프트웨어, 예를 들어 BLAST 2.0을 이용하거나, 정의된 엄격한 조건하에서 썼던 혼성화 실험에 의해 서열을 비교함으로써 확인할 수 있으며, 정의되는 적절한 혼성화 조건은 당업자에게 잘 알려진 방법으로 결정될 수 있다.
서열번호 1 내지 10의 아미노산 서열은 순서대로 각각, 아프리카돼지열병 바이러스의 다양한 균주들로부터 유전자 p30 (CP204L), p54 (E183L), C-type lectin (EP153R), CD2v (EP402R), p49 (B438L), pp62 (CP530R), EP364R, F317L, A104R, K205R의 서열 상동성을 비교하여 도출해낸 컨센서스(consensus) 서열이다.
상기 서열번호 1 내지 10의 아미노산 서열 또는 이와 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열 중 하나 이상을 포함하는 폴리펩티드는 아프리카돼지열병에 대한 면역 반응을 생성할 수 있는 항원으로서 효과적으로 작용할 수 있다.
상기 폴리펩티드는 상기 아미노산 서열 중 하나를 포함할 수도 있고, 둘 이상을 포함할 수도 있다. 또한, 상기 폴리펩티드는 Kozak 서열, IgE leader 서열, 유비퀴틴(ubiquitin) 서열 및/또는 절단 부위(cleavage site) 서열을 더 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 폴리펩티드는 Kozak 서열 - IgE leader 서열 - 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성될 수 있다. 또다른 예로서, 상기 폴리펩티드는 Kozak 서열 - IgE leader 서열 - 유비퀴틴(ubiquitin) 서열 - 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성될 수 있다. 또다른 예로서, 상기 폴리펩티드는 Kozak 서열 - IgE leader 서열 - 유비퀴틴(ubiquitin) 서열 - 서열번호 1의 아미노산 서열 - 절단 부위(cleavage site) 서열 - 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성될 수 있다. 상기 유비퀴틴 서열은 바람직하게는 서열번호 41일 수 있고, 상기 절단 부위 서열은 바람직하게는 서열번호 43일 수 있다.
본 발명의 일 양태는 아프리카돼지열병 바이러스의 유전자 p30, p54, C-type lectin, CD2v, p49, pp62, EP364R, F317L, A104R 및 K205R 중 하나 이상의 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명의 또 다른 일 양태는 서열번호 11 내지 20의 염기 서열 또는 이와 90% 이상의 상동성을 갖는 염기 서열 중 하나 이상을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
또는, 본 발명의 또 다른 양태는 서열번호 1 내지 10의 아미노산 서열 또는 이와 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열 중 하나 이상을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 상기 서열번호 1 내지 10의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 각각 서열번호 11 내지 20의 염기 서열일 수 있다.
서열번호 11 내지 20의 염기 서열은 순서대로 각각, 아프리카돼지열병 바이러스의 다양한 균주들로부터 유전자 p30 (CP204L), p54 (E183L), C-type lectin (EP153R), CD2v (EP402R), p49 (B438L), pp62 (CP530R), EP364R, F317L, A104R, K205R의 서열 상동성을 비교하여 도출해낸 컨센서스(consensus) 서열이다.
또 다르게는, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1 내지 10의 아미노산 서열 또는 서열번호 11 내지 20의 염기 서열이 면역 반응을 생성하고자 하는 대상체에게 최적화된 코돈으로 변경된 것일 수 있다. 상기 대상체는 예를 들어 동물이다. 상기 동물은 예를 들어 돼지, 소, 말, 양, 염소, 사슴, 인간 등을 포함하는 포유류 동물일 수 있다. 바람직하게는, 상기 동물은 돼지이다.
상기 폴리뉴클레오티드는 상기 염기 서열 중 하나를 포함할 수도 있고, 둘 이상을 포함할 수도 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 Kozak 서열, IgE leader 서열, 유비퀴틴(ubiquitin) 서열 및/또는 절단 부위(cleavage site) 서열을 더 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드는 Kozak 서열 - IgE leader 서열 - 서열번호 11의 염기 서열로 구성될 수 있다. 또다른 예로서, 상기 폴리뉴클레오티드는 Kozak 서열 - IgE leader 서열 - 유비퀴틴(ubiquitin) 서열 - 서열번호 11의 염기 서열로 구성될 수 있다. 또다른 예로서, 상기 폴리뉴클레오티드는 Kozak 서열 - IgE leader 서열 - 유비퀴틴(ubiquitin) 서열 - 서열번호 11의 염기 서열 - 절단 부위(cleavage site) 서열 - 서열번호 12의 염기 서열로 구성될 수 있다. 상기 유비퀴틴 서열은 바람직하게는 서열번호 42일 수 있고, 상기 절단 부위 서열은 바람직하게는 서열번호 44일 수 있다.
본 발명의 일 양태는 아프리카돼지열병 바이러스의 유전자 p30, p54, C-type lectin, CD2v, p49, pp62, EP364R, F317L, A104R 및 K205R 중 하나 이상의 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 플라스미드를 제공한다.
본 발명의 또 다른 일 양태는 서열번호 11 내지 20의 염기 서열 또는 이와 90% 이상의 상동성을 갖는 염기 서열 중 하나 이상을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 플라스미드를 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태는 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 서열번호 1의 서열과 90%의 상동성을 갖는 아미노산 서열 중 하나 이상을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 플라스미드를 제공한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "플라스미드"는 적합한 숙주 또는 대상체 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 상기 플라스미드는 벡터, 파지 입자, 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 본 명세서에서 플라스미드는 벡터(또는 바이러스 벡터)와 상호 교환적으로 사용될 수 있다.
상기 플라스미드는 당업계에 알려져 있는 통상의 방법에 따라 제조될 수 있다. 예를 들어, 유전자 클로닝을 통해 상기 폴리뉴클레오티드를 플라스미드 벡터에 삽입하여, 본 발명에 따른 플라스미드를 제조하여 DNA 백신으로 사용할 수 있다.
상기 플라스미드는 상기 폴리뉴클레오티드 중 하나를 포함할 수도 있고, 둘 이상을 포함할 수도 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 Kozak 서열, IgE leader 서열, 유비퀴틴(ubiquitin) 서열 및/또는 절단 부위(cleavage site) 서열을 더 포함할 수 있다.
예를 들면, 상기 플라스미드는 서열번호 31의 염기 서열을 포함할 수 있으며, 여기서 서열번호 31은 서열번호 11 내지 20의 염기 서열이 순차적으로 연결된 것이다. 또다른 예로서, 상기 플라스미드는 서열번호 36의 염기 서열을 포함할 수 있으며, 여기서 서열번호 36은 유비퀴틴(ubiquitin) 서열과 서열번호 11 내지 20의 염기 서열이 순차적으로 연결된 것이다. 또다른 예를 들면, 상기 플라스미드는 서열번호 50의 염기 서열을 포함할 수 있으며, 여기서 서열번호 50은 유비퀴틴(ubiquitin) 서열과 서열번호 11 내지 20의 염기 서열이 순차적으로 연결된 것으로서, 상기 서열번호 11 내지 20의 염기 서열 각각은 절단 부위(cleavage site) 서열로 순차적으로 연결된 것이다.
상기 유비퀴틴 서열은 바람직하게는 서열번호 42의 염기 서열일 수 있다. CD8+ T 세포는 사이토졸(cytosol)에 위치한 종양 유전자 생성물 또는 바이러스 항원과 같은 내인성 항원(endogenous antigen)으로부터 유도된 MHC 클래스 I 관련 펩타이드(MHC class I-associated peptides)를 인식한다. 이러한 MHC 클래스 I 분자가 항원 제시(antigen presentation)하기 전에, 항원은 유비퀴틴화(ubiquitionation)되고 프로테아좀(proteasome)에 의해 항원성 펩티드로 처리된다. 따라서, 유비퀴틴 융합 단백질(ubiquitin-fused proteins)은 프로테아좀 의존성 분해 경로(proteasome dependent degradation pathway)로 들어가서 MHC 클래스 I 펩티드 제시 능력을 향상시켜, 세포성 면역반응(CTL, Cytotoxic T Lymphocyte response)의 유도를 증가시킬 수 있다.
상기 절단 부위 서열은 바람직하게는 서열번호 44의 염기 서열일 수 있다. 상기 절단 부위(cleavage site)는 프로테아제(protease)에 의해 인식되어 절단되는 펩타이드를 의미한다. 본 발명에서는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 플라스미드로부터 발현된 폴리펩티드가 분해효소에 의해 절단될 수 있도록 하며, 이를 통해 절단된 각각의 폴리펩티드가 아프리카돼지열병에 대한 면역 반응을 생성할 수 있는 항원으로서 효과적으로 작용할 수 있게 한다. 상기 절단 부위는 세포 내 존재하는 내인성 효소에 의해 절단될 수 있고, 구체적으로 퓨린 프로테아제(furine protease)에 의해 절단될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또다른 예로서, 상기 플라스미드는 서열번호 32의 염기 서열을 포함할 수 있으며, 여기서 서열번호 32는 서열번호 11 내지 14의 염기 서열이 순차적으로 연결된 것이다. 또는, 상기 플라스미드는 서열번호 37의 염기 서열을 포함할 수 있으며, 여기서 서열번호 37은 유비퀴틴(ubiquitin) 서열과 서열번호 11 내지 14의 염기 서열이 순차적으로 연결된 것이다.
또다른 예로서, 상기 플라스미드는 서열번호 33의 염기 서열을 포함할 수 있으며, 여기서 서열번호 33은 서열번호 15 내지 20의 염기 서열이 순차적으로 연결된 것이다. 또는, 상기 플라스미드는 서열번호 38의 염기 서열을 포함할 수 있으며, 여기서 서열번호 38은 유비퀴틴(ubiquitin) 서열과 서열번호 15 내지 20의 염기 서열이 순차적으로 연결된 것이다.
또다른 예로서, 상기 플라스미드는 서열번호 34의 염기 서열을 포함할 수 있으며, 여기서 서열번호 34는 서열번호 11, 12, 16, 13 및 14의 염기 서열이 순차적으로 연결된 것이다. 또는, 상기 플라스미드는 서열번호 39의 염기 서열을 포함할 수 있으며, 여기서 서열번호 39는 유비퀴틴(ubiquitin) 서열과 서열번호 11, 12, 16, 13 및 14의 염기 서열이 순차적으로 연결된 것이다.
또다른 예로서, 상기 플라스미드는 서열번호 35의 염기 서열을 포함할 수 있으며, 여기서 서열번호 35는 서열번호 15, 17, 18, 19 및 20의 염기 서열이 순차적으로 연결된 것이다. 또는, 상기 플라스미드는 서열번호 40의 염기 서열을 포함할 수 있으며, 여기서 서열번호 40은 유비퀴틴(ubiquitin) 서열과 서열번호 15, 17, 18, 19 및 20의 염기 서열이 순차적으로 연결된 것이다.
또다른 예로서, 상기 플라스미드는 서열번호 50의 염기 서열을 포함할 수 있으며, 여기서 서열번호 50은 서열번호 42의 유비퀴틴(ubiquitin) 서열; 및 서열번호 44의 절단 부위 서열을 포함하는, 서열번호 11, 44, 12, 44, 13, 44, 14, 44, 15, 44, 16, 44, 17, 44, 18, 44, 19, 44, 20의 염기 서열이 순차적으로 연결된 것이다.
또다른 예로서, 상기 플라스미드는 서열번호 51의 염기 서열을 포함할 수 있으며, 여기서 서열번호 51은 서열번호 42의 유비퀴틴(ubiquitin) 서열; 및 서열번호 44의 절단 부위 서열을 포함하는, 서열번호 11, 44, 12, 44, 13, 44, 14의 염기 서열이 순차적으로 연결된 것이다.
또다른 예로서, 상기 플라스미드는 서열번호 52의 염기 서열을 포함할 수 있으며, 여기서 서열번호 52는 서열번호 42의 유비퀴틴(ubiquitin) 서열; 및 서열번호 44의 절단 부위 서열을 포함하는, 서열번호 15, 44, 16, 44, 17, 44, 18, 44, 19, 44, 20의 염기 서열이 순차적으로 연결된 것이다.
또다른 예로서, 상기 플라스미드는 서열번호 53의 염기 서열을 포함할 수 있으며, 여기서 서열번호 53은 서열번호 42의 유비퀴틴(ubiquitin) 서열; 및 서열번호 44의 절단 부위 서열을 포함하는, 서열번호 11, 44, 12, 44, 16, 44, 13, 44, 14의 염기 서열이 순차적으로 연결된 것이다.
또다른 예로서, 상기 플라스미드는 서열번호 54의 염기 서열을 포함할 수 있으며, 여기서 서열번호 54는 서열번호 42의 유비퀴틴(ubiquitin) 서열; 및 서열번호 44의 절단 부위 서열을 포함하는, 서열번호 15, 44, 17, 44, 18, 44, 19, 44, 20의 염기 서열이 순차적으로 연결된 것이다.
본 발명의 또 다른 양태는 본 발명의 폴리펩티드, 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 또는 본 발명의 플라스미드를 포함하는 아프리카돼지열병 백신 조성물을 제공한다.
상기 아프리카돼지열병 백신 조성물에서 상기 폴리펩티드, 상기 폴리뉴클레오티드, 상기 플라스미드는 달리 언급하지 않는 한 상기한 바와 같다.
용어 "백신"은 개체에 면역을 주는 항원을 함유한 생물학적인 제제로서, 질환 예방을 위하여 사람이나 동물에게 투여, 예컨대 주사하거나 경구 투여함으로써 면역이 생기게 하는 면역원성 또는 항원성 물질을 말한다.
상기 백신은 DNA 백신일 수 있다. 용어 "DNA 백신"이라 함은, 병원균이나 바이러스 등의 유전자들 중 일부를 인공적으로 복제한 후 이를 투여함으로써 면역 반응을 야기하는 백신을 의미한다. 이러한 DNA 백신은 기존 단백질 백신에 비해 다양한 장점을 갖는다: i) 순수한 표적 병원체 항원의 유전정보만으로 합성제작이 가능하므로 위험한 병원체를 직접 취급할 필요가 없으며, ii) 독성 유발에 필요한 유전자들 중 일부만을 사용하므로 투여체에 투여되더라도 별다른 독성을 나타낼 염려가 없고, iii) 플라스미드 DNA만으로 구성되는 단순함 때문에 갑자기 발생하는 다양한 감염병에 대해 신속하게 대응하여 백신을 개발하는 것이 가능하다.
상기 아프리카돼지열병 백신 조성물은 바람직하게는 아프리카돼지열병 바이러스에 대한 방어 면역능을 갖는 것일 수 있다.
본 발명의 백신 조성물은 수의학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 용어, "수의학적으로 허용 가능한 담체"란 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항원보강제, 안정제, 희석제, 보존제, 항균제 및 항진균제, 등장성 작용제, 흡착지연제 등을 포함한다. 백신 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제, 희석제로는 락토즈, 덱스트로스, 슈크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 말티톨, 전분, 글리세린, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘포스페이트, 칼슘실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한, 본 발명의 백신용 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용되는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제할 수 있다. 바람직하게는, Poly-L-Glutamic acid를 사용하여 안정화에 도움을 줄 수 있다.
상기 백신 조성물은 다양한 형태로 개체에 주입될 수 있다. "주입"은 피하주사, 근육내 주사, 피하내 주사, 복막내 주사, 비강투여, 구강투여, 경피투여 및 경구투여로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 방법으로 수행될 수 있다.
상기 백신 조성물은 면역 반응을 개선 또는 강화시키기 위하여 하나 이상의 보조제 등을 포함할 수 있다. 적절한 보조제에는 펩티드, 알루미늄 하이드록시드, 알루미늄 포스페이트, 알루미늄 옥시드 및 Marcol 52 같은 미네랄 오일 또는 식물성 오일 및 하나 이상의 유화제로 구성된 조성물 또는 리졸세시틴, 다가 양이온, 다가 음이온 같은 표면 활성물질 등이 포함된다.
본 발명의 일 양태는 본 발명의 백신 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 아프리카돼지열병 바이러스에 대한 면역 반응을 생성하는 방법을 제공한다.
상기 면역 반응 생성 방법에서, 상기 백신 조성물은 달리 언급하지 않는 한 상기한 바와 같다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "면역 반응"은 항원의 도입에 대한 반응으로의 숙주의 면역계의 활성화를 의미한다. 면역 반응은 세포 반응 또는 체액 반응, 또는 둘 모두의 형태일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "개체"는 인간을 포함한 동물을 의미하며, 예를 들어 포유류, 보다 구체적으로 돼지, 소, 말, 양, 염소, 사슴, 인간 등일 수 있다. 바람직하게는, 돼지이다. 상기 용어 "개체"는 대상체 또는 숙주와 상호교환적으로 사용될 수 있다.
상기 면역 반응 생성 방법에서 본 발명의 백신 조성물은 효과량의 유효 성분, 즉, 전체 재조합 폴리펩티드, 재조합 폴리뉴클레오티드 또는 이를 포함하는 플라스미드를 약학적으로 허용가능한 담체 및 보조제와 함께 포함할 수 있다. 용어 "효과량"은 백신의 성분이 백신접종되는 동물에서 아프리카돼지열병 바이러스에 대해 특이적 면역 반응을 유도하기에 충분한 양임을 의미한다. 효과량은 당 분야의 숙련자에 의해 쉽게 결정될 수 있고, 예를 들면 동물에서의 통상적인 실험을 통해 결정될 수 있다.
상기 투여는 DNA 백신의 투여에 적합한 임의의 경로로 투여될 수 있고, 예를 들면 피하, 근육내, 복강내 또는 정맥내 주사에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 또다른 일 양태는 본 발명의 백신 조성물, 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드 또는 플라스미드를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 아프리카돼지열병을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또다른 일 양태는 본 발명에 따른 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드 또는 플라스미드를 포함하는 아프리카돼지열병 치료 또는 예방용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 아프리카돼지열병 치료 또는 예방 방법과 아프리카돼지열병 치료 또는 예방용 약학 조성물에서, 각 용어들은 특별히 언급하지 않는 한 상기한 바와 동일한 의미를 갖는다.
본 발명에서 사용되는 용어 "예방"은 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 아프리카돼지열병이 억제 또는 지연되는 모든 행위를 의미한다. 또한, 본 발명에서 사용되는 용어 "치료"는 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 아프리카돼지열병의 증상 호전, 완치, 개선, 또는 일부 치료되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에 따른 백신 조성물은 DNA 백신으로서, 아프리카돼지열병 바이러스에 대해 우수한 방어 면역능을 갖는다. 특히, 본 발명에 따른 백신 조성물은 아프리카돼지열병에 대해 세포성 면역반응을 유도하는 효과가 매우 우수하다.
본 발명의 백신 조성물을 투여하는 경우, 접종된 개체에서 아프리카돼지열병에 대한 항체가 현저하게 높은 수준으로 생산되며, 이에 따라 면역 반응이 효과적으로 나타나고 아프리카돼지열병에 대해 우수한 예방 효과를 갖는다.
도 1은 아프리카돼지열병 (African Swine Fever, ASF) 바이러스 유전자를 포함하는 벡터의 개열 지도이며, Kozak 서열, IgE leader 서열, 유비퀴틴(ubiquitin) 서열 및 퓨린 절단 부위(Furin cleavage site) 서열을 포함하고, ASF 바이러스 유전자로서 p30, p54, C-type lectin, CD2v, p49, pp62, EP364R, F317L, A104R 및 K205R를 포함하는 벡터에 관한 것이다.
도 2는 ASF 바이러스 유전자를 포함하는 벡터의 개열 지도이며, Kozak 서열, IgE leader 서열, 유비퀴틴 서열 및 퓨린 절단 부위 서열을 포함하고, ASF 바이러스 유전자로서 p30, p54, C-type lectin 및 CD2v를 포함하는 벡터에 관한 것이다.
도 3은 ASF 바이러스 유전자를 포함하는 벡터의 개열 지도이며, Kozak 서열, IgE leader 서열, 유비퀴틴 서열 및 퓨린 절단 부위 서열을 포함하고, ASF 바이러스 유전자로서 p49, pp62, EP364R, F317L, A104R 및 K205R를 포함하는 벡터에 관한 것이다.
도 4는 ASF 바이러스 유전자를 포함하는 벡터의 개열 지도이며, Kozak 서열, IgE leader 서열, 유비퀴틴 서열 및 퓨린 절단 부위 서열을 포함하고, ASF 바이러스 유전자로서 p30, p54, pp62, C-type lectin 및 CD2v를 포함하는 벡터에 관한 것이다.
도 5는 ASF 바이러스 유전자를 포함하는 벡터의 개열 지도이며, Kozak 서열, IgE leader 서열, 유비퀴틴 서열 및 퓨린 절단 부위 서열을 포함하고, ASF 바이러스 유전자로서 p49, EP364R, F317L, A104R 및 K205R를 포함하는 벡터에 관한 것이다.
도 6은 ASF 바이러스 유전자를 포함하는 DNA 백신 접종 후, ASF 바이러스 항원(p30, p54 또는 CD2v)에 의해 생성된 세포독성 T 세포(CD8+ T 세포)의 수를 보여주는 그래프로서, 상기 DNA 백신에 의해 유도된 세포성 면역반응의 수준을 나타낸다. 'Mock'은 ASF 바이러스 유전자가 포함되지 않은 DNA 백신이 투여된 대조군, 'ASF_4G'는 ASF 바이러스 유전자(p30, p54, C type lectin 및 CD2v)를 포함하며 유비퀴틴을 포함하지 않는 DNA 백신이 투여된 실험군 1, 'ASF_Ubi_4G'는 ASF 바이러스 유전자(p30, p54, C type lectin 및 CD2v)를 포함하며 유비퀴틴을 포함하는 DNA 백신이 투여된 실험군 2를 의미한다.
도 7은 ASF 바이러스 유전자를 포함하는 DNA 백신 접종 후, ASF 바이러스에 감염된 돼지의 생존율을 보여주는 그래프이다. 'Mock'은 ASF 바이러스 유전자가 포함되지 않은 DNA 백신이 투여된 대조군, 'ASF_Ubi_10G'는 ASF 바이러스 유전자(p30, p54, C-type lectin, CD2v, p49, pp62, EP364R, F317L, A104R 및 K205R)를 포함하며 유비퀴틴을 포함하는 DNA 백신이 투여된 실험군을 의미한다.
이하 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1. 아프리카돼지열병 바이러스 유전자
서열번호 1의 아미노산 서열 및 서열번호 11의 염기 서열은 아프리카돼지열병 바이러스의 다양한 균주들로부터 p30 (CP204L) 유전자의 서열 상동성을 비교하여 도출해낸 컨센서스(consensus) 서열이다. 구체적으로, 서열번호 1의 아미노산 서열 및 서열번호 11의 염기 서열은 아프리카돼지열병 바이러스 균주 ANG/70 (GenBank accession no. EU874271), Malawi/1978 (GenBank accession no. JQ744998), NAM/1/80 (GenBank accession no. JQ745005), Dedza (GenBank accession no. JQ745028), BUR/90/1 (GenBank accession no. EU874299), MOZ/94/1 (GenBank accession no. EU874263), DED 91/1 (GenBank accession no. KC867513), GUL 88/1 (GenBank accession no. KC867514), KAC 91/2 (GenBank accession no. KF736439), KANA 89/1 (GenBank accession no. KF736440), Killean I (GenBank accession no. JQ764860), Killean II (GenBank accession no. KC867521), Killean III (GenBank accession no. JQ764861), Kimakia I (GenBank accession no. JQ764954), Kimakia II (GenBank accession no. KC867515), KIRT 89/2 (GenBank accession no. JQ764858), KIRT 89/3 (GenBank accession no. JQ764856), KIRT 89/4 (GenBank accession no. JQ764857), KLI 88/2 (GenBank accession no. KC867516), LIL 89/1 (GenBank accession no. KC867517), LIL 90/1 (GenBank accession no. KF736437), LIV 5/40 (GenBank accession no. KC867518), LIV 9/31 (GenBank accession no. JQ764966), LIV 9/35 (GenBank accession no. JQ764965), LIV 10/11 (GenBank accession no. KC867519), LIV 12/17 (GenBank accession no. JQ764967), Mchinji 075 (GenBank accession no. JQ764880), MOZ 2001/1 (GenBank accession no. KC867524), MPO 89/1 (GenBank accession no. KC867520), NYA1/2 (GenBank accession no. EU874302), SAL 92/1 (GenBank accession no. KF736441), TEN 89/1 (GenBank accession no. KF736442), THY 90/1 (GenBank accession no. KF736438), Trench (GenBank accession no. JQ764859), MOZ/1960 (GenBank accession no. EU874309), Lillie (GenBank accession no. EU874306), 24823 (GenBank accession no. KC867500), MOZ/1979 (GenBank accession no. EU874310), SPEC/154 (GenBank accession no. EU874291), SPEC/205 (GenBank accession no. EU874305), SPEC/209 (GenBank accession no. EU874290), SPEC/257 (GenBank accession no. EU874265), MOZ/94/8 (GenBank accession no. EU874276), E70 (GenBank accession no. AF462272), ZAM/2017/Mbala/1 (GenBank accession no. LC322014), CN201801 (GenBank accession no. MH735141), DB/HLJ/2018 (GenBank accession no. MK333184), M-78 (GenBank accession no. MK211505), BA71 (GenBank accession no. KP055815), BA71V (GenBank accession no. U18466), E75 (GenBank accession no. FN557520), OURT 88/3 (GenBank accession no. AM712240), Georgia 2007 (GenBank accession no. FR682468), Ken06.Bus (GenBank accession no. KM111295), Estonia 2014 (GenBank accession no. LS478113), Benin 97/1 (GenBank accession no. AM712239), Italy/26544/OG10 (GenBank accession no. KM102979), Portugal/NHV/1968 (GenBank accession no. KM262845), Italy/47/SS/2008 (GenBank accession no. KX354450), Uganda/R35/2015 (GenBank accession no. MH025920), Uganda/R25/2015 (GenBank accession no. MH025918), Uganda/R8/2015 (GenBank accession no. MH025916), Pol16_20186_o7 (GenBank accession no. MG939583), Pol17_03029_C201 (GenBank accession no. MG939587), Belgium 2018/1 (GenBank accession no. LR536725), China/2018/AnhuiXCGQ (GenBank accession no. MK128995), DB/LN/2018 (GenBank accession no. MK333181), Pig/HLJ/2018 (GenBank accession no. MK333180), ASFV-SY18 (GenBank accession no. MH766894), Ken05/Tk1 (GenBank accession no. KM111294), Ken05/Tk6 (GenBank accession no. HM745363), Ken05.DPk2 (GenBank accession no. HM745368), Ken08WH/4 (GenBank accession no. HM745390), Ken08Tk.2/1 (GenBank accession no. HM745380), Ken09Tk.13/1 (GenBank accession no. HM745382), Ken09Tk.19/2 (GenBank accession no. HM745386), Ken09Tk.19/11 (GenBank accession no. HM745388)로부터 p30 (CP204L) 유전자의 서열 상동성을 비교하여 제작하였다.
서열번호 2의 아미노산 서열 및 서열번호 12의 염기 서열은 아프리카돼지열병 바이러스의 다양한 균주들로부터 p54 (E183L) 유전자의 서열 상동성을 비교하여 도출해낸 컨센서스(consensus) 서열이다. 구체적으로, 서열번호 2의 아미노산 서열 및 서열번호 12의 염기 서열은 아프리카돼지열병 바이러스 균주 Tengani/60 (GenBank accession no. KF015886), ANG/70 (GenBank accession no. EU874327), BA71 (GenBank accession no. KP055815), Malawi/1978 (GenBank accession no. KC662380), Brazil/79 (GenBank accession no. KC535549), DomRep/79 (GenBank accession no. FJ238534), KAV/89/1 (GenBank accession no. KF015902), BUR/90/1 (GenBank accession no. EU874363), MOZ/94/1 (GenBank accession no. EU874342), CHK 89/2 (GenBank accession no. KF015921), KAC 91/2 (GenBank accession no. KF736421), KANA 89/1 (GenBank accession no. KF736422), Killean III (GenBank accession no. KF736423), Kimakia I (GenBank accession no. KF015924), KIRT 89/4 (GenBank accession no. KF736414), LIL 90/1 (GenBank accession no. KF736416), LIV 9/31 (GenBank accession no. KF015928), MAN 89/2 (GenBank accession no. KF015940), MOZ 2001/1 (GenBank accession no. KF736428), MPO 89/1 (GenBank accession no. KF736418), Trench (GenBank accession no. KF736420), MOZ/1960 (GenBank accession no. EU874371), Lillie (GenBank accession no. EU874341), Madagascar (GenBank accession no. KC662387), ZIM/92/1 (GenBank accession no. EU874345), SPEC/205 (GenBank accession no. EU874329), Co62 (GenBank accession no. FJ174387), E70 (GenBank accession no. FJ174389), Ba71V (GenBank accession no. U18466), E75 (GenBank accession no. FN557520), Hu90 (GenBank accession no. FJ174399), SS81 (GenBank accession no. FJ174403), Ori90 (GenBank accession no. FJ174407), Nu98.8B (GenBank accession no. FJ174418), OURT 88/3 (GenBank accession no. AM712240), Almodovar 99 (GenBank accession no. DQ028315), Almodovar 99/NE1 (GenBank accession no. DQ028317), Georgia 2007 (GenBank accession no. FR682468), Angola (GenBank accession no. FJ174424), Nig01 (GenBank accession no. FJ174426), Ug03H.1 (GenBank accession no. FJ174431), Ug64 (GenBank accession no. FJ174430), Ken05.DPU1 (GenBank accession no. HM745354), Ken08WH/4 (GenBank accession no. HM745333), ken09Tk.20/5 (GenBank accession no. HM745344), Con09/PN003 (GenBank accession no. HQ645949), TAN/08/Mazimbu* (GenBank accession no. GQ410767), TAN/08/Mabibo* (GenBank accession no. GQ410768), Arm07 (GenBank accession no. JX857494), Az08D (GenBank accession no. JX857501), Oren08 (GenBank accession no. JX857498), Rostov09 (GenBank accession no. JX857504), Tver0312/Novo (GenBank accession no. KJ627190), Bel13/Grodno (GenBank accession no. KJ627192), LT14/1490 (GenBank accession no. KJ627193), ETH/1 (GenBank accession no. KT795366), ET13/1504 (GenBank accession no. KU291452), ETH/017 (GenBank accession no. KT795369), Ken06.Bus (GenBank accession no. KM111295), Ken07.Kia (GenBank accession no. FJ174437), CON09/Bzz020 (GenBank accession no. HQ645950), Ken10/KakFA1 (GenBank accession no. KC112568), Ug10.Kumi (GenBank accession no. KC990876), BUR/90/2 (GenBank accession no. KF015897), Ug12.Wakiso (GenBank accession no. KC990885), Benin 97/1 (GenBank accession no. AM712239), Italy/26544/OG10 (GenBank accession no. KM102979), Portugal/NHV/1968 (GenBank accession no. KM262845), Italy/47/SS/2008 (GenBank accession no. KX354450), Uganda/R35/2015 (GenBank accession no. MH025920), Uganda/R7/2015 (GenBank accession no. MH025917), Pol17_04461_C210 (GenBank accession no. MG939588), Belgium 2018/1 (GenBank accession no. LR536725), China/2018/AnhuiXCGQ (GenBank accession no. MK128995), DB/LN/2018 (GenBank accession no. MK333181), Pig/HLJ/2018 (GenBank accession no. MK333180), ASFV-SY18 (GenBank accession no. MH766894), CN201801 (GenBank accession no. MH735140), Estonia 2014 (GenBank accession no. LS478113), Nig6_JS10 (GenBank accession no. KT961344)으로부터 p54 (E183L) 유전자의 서열 상동성을 비교하여 제작하였다.
서열번호 3의 아미노산 서열 및 서열번호 13의 염기 서열은 아프리카돼지열병 바이러스의 다양한 균주들로부터 C-type lectin (EP153R) 유전자의 서열 상동성을 비교하여 도출해낸 컨센서스(consensus) 서열이다. 구체적으로, 서열번호 3의 아미노산 서열 및 서열번호 13의 염기 서열은 아프리카돼지열병 바이러스 균주 Katanga/63 (GenBank accession no. KM609340), Uganda (GenBank accession no. KM609361), BA71 (GenBank accession no. KP055815), Davis (GenBank accession no. KM609336), Ba71V (GenBank accession no. U18466), E75 (GenBank accession no. FN557520), NH/P68 (GenBank accession no. AF481875), Mafra 86 (GenBank accession no. DQ026269), Coimbra 87 (GenBank accession no. DQ026268), OURT 88/3 (GenBank accession no. AM712240), Portalegre 90 (GenBank accession no. DQ026270), Barrancos 93 (GenBank accession no. DQ026267), Almodovar 99 (GenBank accession no. DQ026265), Almodovar 99/NE1 (GenBank accession no. DQ026266), Georgia 2007 (GenBank accession no. FR682468), Ken05/Tk1 (GenBank accession no. KM111294), Ken06.Bus (GenBank accession no. KM111295), Estonia 2014 (GenBank accession no. LS478113), Benin 97/1 (GenBank accession no. AM712239), Italy/26544/OG10 (GenBank accession no. KM102979), Portugal/NHV/1968 (GenBank accession no. KM262845), Italy/47/SS/2008 (GenBank accession no. KX354450), Uganda/R35/2015 (GenBank accession no. MH025920), Uganda/R25/2015 (GenBank accession no. MH025918), Uganda/R8/2015 (GenBank accession no. MH025916), Pol16_20186_o7 (GenBank accession no. MG939583), Pol17_03029_C201 (GenBank accession no. MG939587), Pol17_04461_C210 (GenBank accession no. MG939588), Belgium 2018/1 (GenBank accession no. LR536725), China/2018/AnhuiXCGQ (GenBank accession no. MK128995), DB/LN/2018 (GenBank accession no. MK333181), Pig/HLJ/2018 (GenBank accession no. MK333180), ASFV-SY18 (GenBank accession no. MH766894), UGA (GenBank accession no. AF017039), PR5 (GenBank accession no. AF017037), M1 (GenBank accession no. AF017034), K1 (GenBank accession no. AF017033), CR3 (GenBank accession no. AF017029), CR1 (GenBank accession no. AF017028), LC-PP (GenBank accession no. KM609345), Magadi (GenBank accession no. kM609348), Bartlett (GenBank accession no. KM609335), Volgograd_2012/wb (GenBank accession no. KM609363), Volgograd_2012/dom (GenBank accession no. KM609362), Tver_2012/wb (GenBank accession no. KM609360), Rhodesia (GenBank accession no. KM609354), TSP80 (GenBank accession no. KM609359), STP-1 (GenBank accession no. KM609355), O-77 (GenBank accession no. KM609350), F-32 (GenBank accession no. KM609337), MK-200 (GenBank accession no. KM609347), Spencer (GenBank accession no. KM609357), Silva-1 (GenBank accession no. kM609356), Ndjassi-77 (GenBank accession no. kM609349), KK-262 (GenBank accession no. KM609341), K-49 (GenBank accession no. KM609339), L-57 (GenBank accession no. KM609344), L-50 (GenBank accession no. KM609343)으로부터 C-type lectin (EP153R) 유전자의 서열 상동성을 비교하여 제작하였다.
서열번호 4의 아미노산 서열 및 서열번호 14의 염기 서열은 아프리카돼지열병 바이러스의 다양한 균주들로부터 CD2v (EP402R) 유전자의 서열 상동성을 비교하여 도출해낸 컨센서스(consensus) 서열이다. 구체적으로, 서열번호 4의 아미노산 서열 및 서열번호 14의 염기 서열은 아프리카돼지열병 바이러스 균주 China/2018/AnhuiXCGQ (GenBank accession no. MK128995), DB/LN/2018 (GenBank accession no. MK333181), Pig/HLJ/2018 (GenBank accession no. MK333180), ASFV-SY18 (GenBank accession no. MH766894), Belgium 2018/1 (GenBank accession no. LR536725), Pol17_03029_C201 (GenBank accession no. MG939587), Pol16_20186_o7 (GenBank accession no. MG939583), Uganda/R8/2015 (GenBank accession no. MH025916), Uganda/N10/2015 (GenBank accession no. MH025919), Estonia 2014 (GenBank accession no. LS478113), Davis (1959_Kenya) (GenBank accession no. KM609336), Killean II (1959_Kenya) (GenBank accession no. KM609372), Kimakia II (1961_Kenya) (GenBank accession no. KM609374), Ba71V (1971_Spain) (GenBank accession no. U18466), E75 (1975_Spain) (GenBank accession no. FN557520), Ca78 (Italy_1978) (GenBank accession no. KT718663), Ori85 (Italy_1985) (GenBank accession no. KT718668), Nu91.5 (Italy_1991) (GenBank accession no. KT718673), NH/P68 (Portugal_1968) (GenBank accession no. AF481875), Mafra 86 (Portugal_1986) (GenBank accession no. DQ026269), Coimbra 87 (Portugal_1987) (GenBank accession no. DQ026268), Portalegre 90 (GenBank accession no. DQ026270), Barrancos 93 (GenBank accession no. DQ026267), Almodovar 99/NE1 (GenBank accession no. DQ026266), OURT 88/3 (GenBank accession no. AM712240), FR682468 (GenBank accession no. Georgia 2007), Ken05/Tk1 (GenBank accession no. KM111294), Ken06.Bus (GenBank accession no. KM111295), Italy/47/SS/2008 (GenBank accession no. KX354450), Portugal/NHV/1968 (GenBank accession no. KM262845), Italy/26544/OG10 (GenBank accession no. KM102979), Benin 97/1 (GenBank accession no. AM712239), Bartlett (GenBank accession no. KM609335), Zavidovo-2012 (GenBank accession no. KM609392), Tver_2012/wb (GenBank accession no. KM609360), Rhodesia (GenBank accession no. KM609354), Nanyuki (GenBank accession no. KM609382), Krasnodar_2012/dom (GenBank accession no. KM609342), TS-7/27-230 (GenBank accession no. KM609388), TSP80 (GenBank accession no. KM609359), K-49 (GenBank accession no. KM609339), KK-262 (GenBank accession no. KM609341), Spencer (GenBank accession no. KM609357), MK-200 (GenBank accession no. KM609347), 691/88 (GenBank accession no. KM609334), F-32 (GenBank accession no. KM609337), O-77 (GenBank accession no. KM609350), P-60 (GenBank accession no. KM609351), PPA (GenBank accession no. KM609352), STP-1 (GenBank accession no. KM609355), BA71 (GenBank accession no. KP055815), STP-1-79 (GenBank accession no. KM609384), Malta (GenBank accession no. KM609380), Yamba-74 (GenBank accession no. KM609391), TKF (GenBank accession no. KM609387), Kimuele-6 (GenBank accession no. KM609375), E-70 (GenBank accession no. KM609369), Cuba-71 (GenBank accession no. KM609366), CU-80 (GenBank accession no. KM609365), Brazil-80 (GenBank accession no. KM609364), MNI-82 (GenBank accession no. KM609378), K-73 (Le Bray) (GenBank accession no. KM609370), Madeira (GenBank accession no. KM609379), Diamang (GenBank accession no. KM609367), L-50 (GenBank accession no. KM609343), L-57 (GenBank accession no. KM609344), Kikasa-77 (GenBank accession no. KM609371), VL (GenBank accession no. KM609390)로부터 CD2v (EP402R) 유전자의 서열 상동성을 비교하여 제작하였다.
서열번호 5의 아미노산 서열 및 서열번호 15의 염기 서열은 아프리카돼지열병 바이러스의 다양한 균주들로부터 p49 (B438L) 유전자의 서열 상동성을 비교하여 도출해낸 컨센서스(consensus) 서열이다. 구체적으로, 서열번호 5의 아미노산 서열 및 서열번호 15의 염기 서열은 아프리카돼지열병 바이러스 균주 BA71 (GenBank accession no. KP055815), Ba71V (GenBank accession no. U18466), E75 (GenBank accession no. FN557520), OURT 88/3 (GenBank accession no. AM712240), Georgia 2007 (GenBank accession no. FR682468), Ken05/Tk1 (GenBank accession no. KM111294), Ken06.BUS (GenBank accession no. KM111295), Estonia 2014 (GenBank accession no. LS478113), Benin 97/1 (GenBank accession no. AM712239), Italy/26544/OG10 (GenBank accession no. KM102979), Portugal/NHV/1968 (GenBank accession no. KM262845), Italy/47/SS/2008 (GenBank accession no. KX354450), Uganda/R35/2015 (GenBank accession no. MH025920), Uganda/N10/2015 (GenBank accession no. MH025919), Pol16_20186_o7 (GenBank accession no. MG939583), Pol17_04461_C210 (GenBank accession no. MG939588), Belgium 2018/1 (GenBank accession no. LR536725), China/2018/AnhuiXCGQ (GenBank accession no. MK128995), DB/LN/2018 (GenBank accession no. MK333181), Pig/HLJ/2018 (GenBank accession no. MK333180), ASFV-SY18 (GenBank accession no. MH766894)로부터 p49 (B438L) 유전자의 서열 상동성을 비교하여 제작하였다.
서열번호 6의 아미노산 서열 및 서열번호 16의 염기 서열은 아프리카돼지열병 바이러스의 다양한 균주들로부터 pp62 (CP530R) 유전자의 서열 상동성을 비교하여 도출해낸 컨센서스(consensus) 서열이다. 구체적으로, 서열번호 6의 아미노산 서열 및 서열번호 16의 염기 서열은 아프리카돼지열병 바이러스 균주 BA71 (GenBank accession no. KP055815), Ba71V (GenBank accession no. U18466), E75 (GenBank accession no. FN557520), OURT 88/3 (GenBank accession no. AM712240), Georgia 2007 (GenBank accession no. FR682468), Ken05/Tk1 (GenBank accession no. KM111294), Ken06.BUS (GenBank accession no. KM111295), Estonia 2014 (GenBank accession no. LS478113), Benin 97/1 (GenBank accession no. AM712239), Italy/26544/OG10 (GenBank accession no. KM102979), Portugal/NHV/1968 (GenBank accession no. KM262845), Italy/47/SS/2008 (GenBank accession no. KX354450), Uganda/R35/2015 (GenBank accession no. MH025920), Uganda/N10/2015 (GenBank accession no. MH025919), Pol16_20186_o7 (GenBank accession no. MG939583), Pol17_04461_C210 (GenBank accession no. MG939588), Belgium 2018/1 (GenBank accession no. LR536725), China/2018/AnhuiXCGQ (GenBank accession no. MK128995), DB/LN/2018 (GenBank accession no. MK333181), Pig/HLJ/2018 (GenBank accession no. MK333180), ASFV-SY18 (GenBank accession no. MH766894), Krasnodar (2012) (GenBank accession no. KJ380911)로부터 pp62 (CP530R) 유전자의 서열 상동성을 비교하여 제작하였다.
서열번호 7의 아미노산 서열 및 서열번호 17의 염기 서열은 아프리카돼지열병 바이러스의 다양한 균주들로부터 EP364R 유전자의 서열 상동성을 비교하여 도출해낸 컨센서스(consensus) 서열이다. 구체적으로, 서열번호 7의 아미노산 서열 및 서열번호 17의 염기 서열은 아프리카돼지열병 바이러스 균주 BA71 (GenBank accession no. KP055815), Ba71V (GenBank accession no. U18466), E75 (GenBank accession no. FN557520), OURT 88/3 (GenBank accession no. AM712240), Georgia 2007 (GenBank accession no. FR682468), Ken05/Tk1 (GenBank accession no. KM111294), Ken06.BUS (GenBank accession no. KM111295), Estonia 2014 (GenBank accession no. LS478113), Benin 97/1 (GenBank accession no. AM712239), Italy/26544/OG10 (GenBank accession no. KM102979), Portugal/NHV/1968 (GenBank accession no. KM262845), Italy/47/SS/2008 (GenBank accession no. KX354450), Uganda/R35/2015 (GenBank accession no. MH025920), Uganda/N10/2015 (GenBank accession no. MH025919), Pol16_20186_o7 (GenBank accession no. MG939583), Pol17_04461_C210 (GenBank accession no. MG939588), Belgium 2018/1 (GenBank accession no. LR536725), China/2018/AnhuiXCGQ (GenBank accession no. MK128995), DB/LN/2018 (GenBank accession no. MK333181), Pig/HLJ/2018 (GenBank accession no. MK333180), ASFV-SY18 (GenBank accession no. MH766894)로부터 EP364R 유전자의 서열 상동성을 비교하여 제작하였다.
서열번호 8의 아미노산 서열 및 서열번호 18의 염기 서열은 아프리카돼지열병 바이러스의 다양한 균주들로부터 F317L 유전자의 서열 상동성을 비교하여 도출해낸 컨센서스(consensus) 서열이다. 구체적으로, 서열번호 8의 아미노산 서열 및 서열번호 18의 염기 서열은 아프리카돼지열병 바이러스 균주 BA71 (GenBank accession no. KP055815), Ba71V (GenBank accession no. U18466), E75 (GenBank accession no. FN557520), OURT 88/3 (GenBank accession no. AM712240), Georgia 2007 (GenBank accession no. FR682468), Ken05/Tk1 (GenBank accession no. KM111294), Ken06.BUS (GenBank accession no. KM111295), Estonia 2014 F317L (GenBank accession no. LS478113), Benin 97/1 F317L (GenBank accession no. AM712239), Italy/26544/OG10 F317L (GenBank accession no. KM102979), Portugal/NHV/1968 F317L (GenBank accession no. KM262845), Italy/47/SS/2008 F317L (GenBank accession no. KX354450), Uganda/R35/2015 F317L (GenBank accession no. MH025920), Uganda/N10/2015 (GenBank accession no. MH025919), Pol16_20186_o7 (GenBank accession no. MG939583), Pol17_04461_C210 (GenBank accession no. MG939588), Belgium 2018/1 (GenBank accession no. LR536725), China/2018/AnhuiXCGQ (GenBank accession no. MK128995), DB/LN/2018 (GenBank accession no. MK333181), Pig/HLJ/2018 (GenBank accession no. MK333180), ASFV-SY18 (GenBank accession no. MH766894)로부터 F317L 유전자의 서열 상동성을 비교하여 제작하였다.
서열번호 9의 아미노산 서열 및 서열번호 19의 염기 서열은 아프리카돼지열병 바이러스의 다양한 균주들로부터 A104R 유전자의 서열 상동성을 비교하여 도출해낸 컨센서스(consensus) 서열이다. 구체적으로, 서열번호 9의 아미노산 서열 및 서열번호 19의 염기 서열은 아프리카돼지열병 바이러스 균주 BA71 (GenBank accession no. KP055815), Ba71V (GenBank accession no. U18466), E75 (GenBank accession no. FN557520), OURT 88/3 (GenBank accession no. AM712240), Georgia 2007 (GenBank accession no. FR682468), Ken05/Tk1 (GenBank accession no. KM111294), Ken06.BUS (GenBank accession no. KM111295), Estonia 2014 (GenBank accession no. LS478113), Benin 97/1 (GenBank accession no. AM712239), Italy/26544/OG10 (GenBank accession no. KM102979), Portugal/NHV/1968 (GenBank accession no. KM262845), Italy/47/SS/2008 (GenBank accession no. KX354450), Uganda/R35/2015 (GenBank accession no. MH025920), Uganda/N10/2015 (GenBank accession no. MH025919), Pol16_20186_o7 (GenBank accession no. MG939583), Pol17_04461_C210 (GenBank accession no. MG939588), Belgium 2018/1 (GenBank accession no. LR536725), China/2018/AnhuiXCGQ (GenBank accession no. MK128995), DB/LN/2018 (GenBank accession no. MK333181), Pig/HLJ/2018 (GenBank accession no. MK333180), ASFV-SY18 (GenBank accession no. MH766894)로부터 A104R 유전자의 서열 상동성을 비교하여 제작하였다.
서열번호 10의 아미노산 서열 및 서열번호 20의 염기 서열은 아프리카돼지열병 바이러스의 다양한 균주들로부터 K205R 유전자의 서열 상동성을 비교하여 도출해낸 컨센서스(consensus) 서열이다. 구체적으로, 서열번호 10의 아미노산 서열 및 서열번호 20의 염기 서열은 아프리카돼지열병 바이러스 균주 BA71 (GenBank accession no. KP055815), Ba71V (GenBank accession no. U18466), E75 (GenBank accession no. FN557520), OURT 88/3 (GenBank accession no. AM712240), Georgia 2007 (GenBank accession no. FR682468), Ken05/Tk1 (GenBank accession no. KM111294), Ken06.BUS (GenBank accession no. KM111295), Estonia 2014 (GenBank accession no. LS478113), Benin 97/1 (GenBank accession no. AM712239), Italy/26544/OG10 (GenBank accession no. KM102979), Portugal/NHV/1968 (GenBank accession no. KM262845), Italy/47/SS/2008 (GenBank accession no. KX354450), Uganda/R35/2015 (GenBank accession no. MH025920), Uganda/N10/2015 (GenBank accession no. MH025919), Pol16_20186_o7 (GenBank accession no. MG939583), Pol17_04461_C210 (GenBank accession no. MG939588), Belgium 2018/1 (GenBank accession no. LR536725), China/2018/AnhuiXCGQ (GenBank accession no. MK128995), DB/LN/2018 (GenBank accession no. MK333181), Pig/HLJ/2018 (GenBank accession no. MK333180)ASFV-SY18 (GenBank accession no. MH766894)로부터 K205R 유전자의 서열 상동성을 비교하여 제작하였다.
실시예 2. 아프리카돼지열병 백신 제작
상기 실시예 1의 아프리카돼지열병 바이러스 유전자를 사용하여 백신을 제조하였다.
구체적으로, 당업계에 알려진 일반적인 방법으로 상기 유전자, Kozak 서열, IgE leader 서열, 유비퀴틴(ubiquitin) 서열 및/또는 퓨린 절단 부위(Furin cleavage site) 서열을 포함하는 DNA 플라스미드를 제조하였다. 이후, 상기 DNA 플라스미드를 보유한 대장균을 LB 배지 2.5L에 접종하고 37℃, 수중유적형 (oil-in-water, O/W) 배양을 수행하였다. 배양된 대장균으로부터 EndoFree Plasmid Giga kit (QIAGEN, Cat#12391)를 이용하여 플라스미드를 추출하였으며, 추출한 플라스미드는 차후 백신으로서 접종에 사용하였다.
상기 제조한 DNA 플라스미드의 개열 지도는 도 1 내지 5에 나타내었다.
실시예 3. 아프리카돼지열병 백신의 세포성 면역반응 유도 효과
상기 실시예 2에서 제조한 DNA 백신의 아프리카돼지열병 예방 효과로서, 세포성 면역반응 (CTL, Cytotoxic T Lymphocyte response) 유도 효과를 확인하였다.
C57BL/6 마우스 (8주령, Female) 15마리를 그룹당 5마리씩 총 3 그룹으로 나눈 뒤 2주 간격으로 백신 접종을 3번 실시하였다. 투여한 DNA 백신의 농도는 30ug/마리이며, 전기천공(electroporation) 기기(cellectra 2000)를 이용하여 투여 및 접종을 실시하였다. 이때, 각 대조군 및 실험군에 투여한 DNA 백신의 종류는 아래와 같이 설정하였다.
- 대조군: 아프리카돼지열병 바이러스 유전자가 포함되지 않은 DNA 백신 (Mock Plasmid DNA vaccine)
- 실험군 1: 아프리카돼지열병 바이러스 유전자를 포함하며, 유비퀴틴을 포함하지 않는 DNA 백신 (ASF_4G DNA vaccine; p30, p54, C type lectin 및 CD2v)
- 실험군 2: 아프리카돼지열병 바이러스 유전자를 포함하며, 유비퀴틴을 포함하는 DNA 백신 (ASF_Ubi_4G DNA vaccine; 유비퀴틴, p30, p54, C type lectin 및 CD2v)
상기 DNA 백신을 3회 투여한 후, 일주일 뒤에 마우스에서 비장(spleen)을 적출하여 비장세포(splenocyte)를 분리하였고, 분리한 비장세포에 대하여 IFN-gamma ELISpot KIT(Cellular Technology Limited/미국)를 사용하여 mouse IFN-gamma ELISpot 분석을 수행하였다. 구체적으로, 각 백신이 투여된 상기 비장세포에 각 항원 유전자의 폴리펩티드를 처리한 후 IFN-γ를 분비하는 세포독성 T 세포(CD8+ T 세포)의 수를 분석함으로써 백신 접종 후 바이러스 감염에 의해 유도되는 세포성 면역반응의 정도를 확인하였다.
그 결과, 도 6 및 하기 표 1에서 볼 수 있듯이, 아프리카돼지열병 바이러스 유전자를 포함하는 DNA 백신이 투여된 실험군 1 및 2에서는 각 항원 유전자의 폴리펩티드가 처리되는 경우, IFN-γ를 분비하는 세포독성 T 세포(CD8+ T 세포)의 수가 현저하게 증가함을 확인하였다.
p30 p54 CD2v
대조군 (Mock) 0.0 0.0 8.5
실험군 1 (ASF_4G) 0.0 769.0 336.5
실험군 2 (ASF_Ubi_4G) 23 1223.5 764
(단위: SFU/106 세포)
특히, 유비퀴틴을 포함하지 않는 DNA 백신(실험군 1)이 투여된 경우에 비하여, 유비퀴틴을 포함하는 DNA 백신이 투여된 경우(실험군 2)에서는 IFN-γ를 분비하는 세포독성 T 세포(CD8+ T 세포)의 수가 약 약 1.6배 내지 2.2배 증가됨을 확인하였다. 또한, DNA 백신에 포함된 다양한 항원 유전자 중에서도 p54 또는 CD2v에 의해 IFN-γ를 분비하는 세포독성 T 세포(CD8+ T 세포)의 수가 특히 증가되며, p30에 의해서는 유비퀴틴을 포함하는 백신이 투여된 경우(실험군 2)에만 IFN-γ를 분비하는 세포독성 T 세포(CD8+ T 세포)의 수가 증가함을 확인하였다.
상기 결과를 통해, 아프리카돼지열병 바이러스 유전자와 유비퀴틴을 포함하는 DNA 백신을 접종한 경우, 아프리카돼지열병 바이러스에 감염되더라도 IFN-γ를 분비하는 세포독성 T 세포의 수를 현저히 증가시키는 등의 세포성 면역반응을 효율적으로 유도할 수 있으므로, 상기 DNA 백신은 아프리카돼지열병 예방을 위한 백신 조성물로서 유용하게 활용될 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 4. 아프리카돼지열병 백신의 생존율 증가 효과
상기 실시예 2에서 제조한 백신의 아프리카돼지열병 예방 효과로서, 아프리카돼지열병 바이러스 감염 이후의 생존율 증가 효과를 확인하였다.
구체적으로, 자돈 돼지에 상기 DNA 백신을 총 3회 (0주차, 2주차, 4주차) 투여하였다. 이후, 7주차에 아프리카돼지열병 바이러스를 공격접종(challenge)하였고, 이후 28일간의 생존율을 조사하였다. 이때, 각 대조군 및 실험군에 투여한 DNA 백신의 종류는 아래와 같이 설정하였다.
- 대조군: 아프리카돼지열병 바이러스 유전자가 포함되지 않은 DNA 백신 (Mock)
- 실험군: 아프리카돼지열병 바이러스 유전자를 포함하며, 유비퀴틴을 포함하는 DNA 백신 (ASF_Ubi_10G DNA vaccine; 유비퀴틴, p30, p54, C-type lectin, CD2v, p49, pp62, EP364R, F317L, A104R 및 K205R )
그 결과, 도 7에서 볼 수 있듯이, 대조군의 경우, 접종 28일차에는 3마리 중 1마리의 돼지만이 생존하여 약 33%의 낮은 생존율을 나타냄을 확인하였다. 반면에, 아프리카돼지열병 바이러스 유전자를 포함하는 DNA 백신이 투여된 실험군의 경우, 접종 28일차에는 6마리 중 4마리의 돼지가 생존하여 약 66%의 높은 생존율을 나타내며, 대조군에 비하여 생존율이 2배 이상 증가함을 확인하였다.
상기 결과를 통해, 아프리카돼지열병 바이러스 유전자와 유비퀴틴을 포함하는 DNA 백신을 접종한 경우, 아프리카돼지열병 바이러스에 감염되더라도 우수한 생존능을 나타내므로, 상기 DNA 백신은 아프리카돼지열병 예방을 위한 백신 조성물로서 유용하게 활용될 수 있음을 알 수 있었다.

Claims (18)

  1. 아프리카돼지열병 바이러스의 유전자 p30, p54, C-type lectin, CD2v, p49, pp62, EP364R, F317L, A104R 및 K205R 중 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드.
  2. 제1항에 있어서,
    서열번호 1 내지 10의 아미노산 서열 또는 이와 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열 중 하나 이상을 포함하는 폴리펩티드.
  3. 제1항에 있어서,
    Kozak 서열, IgE leader 서열, 유비퀴틴(ubiquitin) 서열 및 퓨린 절단 부위(Furin cleavage site) 서열 중 하나 이상을 더 포함하는 폴리펩티드.
  4. 제1항에 있어서,
    서열번호 41의 아미노산 서열을 더 포함하는 폴리펩티드.
  5. 제1항에 있어서,
    서열번호 43의 아미노산 서열을 더 포함하는 폴리펩티드.
  6. 아프리카돼지열병 바이러스의 유전자 p30, p54, C-type lectin, CD2v, p49, pp62, EP364R, F317L, A104R 및 K205R 중 하나 이상의 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
  7. 제6항에 있어서,
    서열번호 1 내지 10의 아미노산 서열 또는 이와 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열, 또는 서열번호 11 내지 20의 염기 서열 또는 이와 90% 이상의 상동성을 갖는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
  8. 제6항에 있어서,
    Kozak 서열, IgE leader 서열, 유비퀴틴(ubiquitin) 서열 및 절단 부위(cleavage site) 서열 중 하나 이상을 더 포함하는 폴리뉴클레오티드.
  9. 제6항에 있어서,
    서열번호 42의 염기 서열을 더 포함하는 폴리뉴클레오티드.
  10. 제6항에 있어서,
    서열번호 44의 염기 서열을 더 포함하는 폴리뉴클레오티드.
  11. 제6항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 플라스미드.
  12. 제11항에 있어서,
    서열번호 31 내지 40, 및 서열번호 50 내지 54의 염기 서열 중 어느 하나를 포함하는 플라스미드.
  13. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 폴리펩티드, 제6항 내지 제10항 중 어느 항의 폴리뉴클레오티드, 또는 제11항 및 제12항 중 어느 한 항의 플라스미드를 포함하는, 아프리카돼지열병 백신 조성물.
  14. 제13항의 백신 조성물을 인간을 제외한 동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 상기 동물에서 아프리카돼지열병 바이러스에 대한 면역 반응을 생성하는 방법.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 투여는 전기천공(electroporation)에 의한 투여인 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제13항의 백신 조성물을 인간을 제외한 동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 아프리카돼지열병을 치료 또는 예방하는 방법.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 투여는 전기천공(electroporation)에 의한 투여인 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 폴리펩티드, 제6항 내지 제10항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드, 또는 제11항 및 제12항 중 어느 한 항의 플라스미드를 포함하는, 아프리카돼지열병 치료 또는 예방용 약학 조성물.
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