KR101393286B1

KR101393286B1 - 신규한 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 및 그의 용도

Info

Publication number: KR101393286B1
Application number: KR1020130070498A
Authority: KR
Inventors: 송대섭; 강보규; 문형준; 김혜권; 박봉균; 김종만
Original assignee: 녹십자수의약품(주)
Priority date: 2010-09-09
Filing date: 2013-06-19
Publication date: 2014-05-09
Also published as: KR101345786B1; KR101393287B1; KR20130092520A; KR20130092519A; KR20120026436A

Abstract

신규한 돼지생식기호흡기증후군 바이러스(PRRSV), 불활성화된 돼지생식기호흡기증후군 바이러스(PRRSV)를 포함하는 돼지생식기호흡기증후군의 예방 또는 치료용 면역원성 조성물 및 그를 이용한 포유동물의 돼지생식기호흡기증후군을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.

Description

신규한 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 및 그의 용도{Novel porcine reproductive respiratory syndrome virus and uses thereof}

본 발명은 신규한 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 (PRRSV), 불활성화된 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 (PRRSV)를 포함하는 돼지생식기호흡기증후군의 예방 또는 치료용 면역원성 조성물 및 그를 이용한 포유동물의 돼지생식기호흡기증후군을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다.

돼지생식기호흡기증후군 바이러스 (porcine reproductive respiratory syndrome virus: PRRSV)는 외피가 있는 단일가닥 양성 센스 RNA 바이러스로서, 니도비랄레스 (Nidovirales) 목, 아르테리비리다에 (Arteriviridae) 과, 아르테리바이러스 (Arterivirus) 속에 속한다. PRRSV는 최근 발생된 병원체로서, 모돈의 유산, 사산, 및 태아의 폐렴 및 형성 부전, 분만율 저하, 성장률 저하, 그 외 2차적인 세균 감염 및 모든 연령의 돼지에서 호흡기 질환을 유발하여, 국내 및 국외의 양돈 산업에 심각한 피해를 주고 있는 전염성 질병이다. 국내에서 1993년에 최초로 분리 및 보고된 PRRSV는 대식세포 내에서 선호적으로 증식한다. 그 발병 형태는 생식기형, 호흡기형, 및 혼합형으로서, 일차적으로 돼지에서 돼지로 전염되며, 분변, 요 (urine), 유 (milk)를 통해서 초유 항체가 수유되지 않은 새끼 돼지에게 전염될 수 있고, 또한 주사 바늘, 곤충 및 공기에 의한 전염될 수도 있다.

PRRSV는 동시대에 지정학적 위치에 따라서 유전학적으로 매우 다양한 스트레인이 존재한다. 두 종류의 주요 유전자형은 유럽형 (genotype 1)과 북미형 (genotype 2)이 있으며, 이들은 게놈 수준 측면에 있어서 40%의 뉴클레오티드 상이성을 나타낸다. 우리나라에 주로 발생하고 있는 스트레인은 VR2332로 밝혀진 바 있다. 연구 결과에 따르면, 북미형 PRRSV가 한국 양돈가에 퍼진 이후 계속 진화하고 있어, 지정학적인 영향에 의해 PRRSV의 유전자의 변성이 발생한 것으로 예측되고 있다.

PRRSV의 전체 게놈 크기는 15kb이며, 하부게놈 mRNA가 서로 오버랩되어있는 9개의 해독틀 (open reading frame:ORF) (ORF 1a, 1b, 2a, 2b, 3-7)을 갖는다. ORF 1a와 1b는 복제 관련 비구조 단백질이고 ORF 2-7은 GP2a, GP2b, GP3, GP4, GP5, 막/매트릭스 (M) 단백질 및 뉴클레오캡시드 (N) 단백질로서 구조 단백질을 구성한다. 이 중 주요 구조 단백질은 N 단백질, M 단백질 및 일차 외피 (envelope) 당단백질인 GP5이다. 이 중 GP5 (ORF 5) 단백질은 감염시 숙주 내에서 중화 항체를 유도할 수 있는 것으로 알려진 가장 풍부하게 존재하는 단백질이다.

PRRS를 예방 또는 치료하는 방법으로서, 약독화된 VR2332 균주를 이용한 생독 백신을 돼지에게 투여하는 방법이 제시되고 있다. 그러나, 이 방법은 그 효과가 다소 낮아, PRRSV의 감염은 성공적으로 제어되지 못할 수 있고, 백신주 VR2332에 의한 감염을 유발할 수 있다는 단점이 있다.

전 세계적으로 PRRSV 감염에 의한 농장의 피해는 많은 노력에도 불구하고 쉽사리 감소하지 않고 있는 실정이다. 한국 양돈 수의사 협회 발표 자료에 따르면 2008년 기준으로 PRRSV 감염에 의한 국내 총 손실은 531억원에 달하는 것으로 발표되고 있다. 문제는 이러한 막대한 피해가 PRRS 수입 백신의 엄청난 사용에도 불구하고 나타나고 있다는 점이다. 실제로 국내에서 사용되는 백신은 다국적 업체의 생독 백신과 국내업체의 사독 백신 두 종류만이 판매 중이다. 생독 백신의 경우 그 효과에 대한 많은 보고가 있지만, 바이러스 배출 등의 보고로 인하여, 안전성에 대한 의문이 있었고, 모체 이행 항체에 의한 간섭효과에 의해 자돈 구간에서의 적용에 제한이 있을 수밖에 없었다. 그리고, 사독 백신의 경우, 단 한가지의 북미형 바이러스를 백신주로 사용하였는데, 사독 백신이기에 그 안전성은 생독 백신에 비해 높다고 볼 수 있으나, PRRSV의 빈번한 유전적 변이가 방어능에 미치는 영향이 높기에 단 한 종류의 바이러스를 백신으로 사용하는 것은 효과적인 면역을 제공하는 데 한계가 있다. 더욱이, 이러한 백신의 사용이 증가함에도 불구하고 2008년부터 2009년까지의 월별 PRRS 양성 농가의 비율은 좀처럼 줄지 않고 높은 비율을 유지하고 있다.

PRRSV의 경우, 크게 북미주와 유럽주 두 개의 아형으로 나누어지며, 북미주와 유럽주 사이에는 40% 정도의 유전적 차이가 관찰되며, 교차 면역이 이루어지지 않아 진단과 백신에 의한 방어에 있어, 각각의 주(strain)에 대한 개별적인 전략이 필요한 실정이다. 2006년까지 우리나라 양돈장에는 북미주만이 감염되어 있는 것으로 알려져 왔고, 이에 맞추어 북미주 바이러스를 사용한 백신이 사용되어 왔다. 하지만 2006년 이후, 유럽주의 국내 감염이 확인되었다. 더욱이, 2006년 산발적인 소규모 감염 형태였던 유럽주 감염이 2010년 녹십자 수의약품과 서울대학교 수의과대학의 공동 연구 자료(Lee et al., Virus genes, 2010, 40)에서 보고되어진 바에 따르면 전체 PRRSV 감염의 절반을 차지할 정도로 그 감염 농가의 비율이 급격히 증가했다.

이상과 같은 선행기술에 의하더라도, 유럽형 PRRSV에 대하여 방어할 수 있고, 및/또는 국내에서 발견되는 다양한 북미형 PRRSV에 대하여도 방어할 수 있는 백신이 여전히 요구되고 있다.

일 구체예는 신규한 돼지생식기호흡기증후군 바이러스(PRRSV)를 제공한다.

다른 구체예는 불활성화된 상기 신규한 돼지생식기호흡기증후군 바이러스(PRRSV)를 포함하는 안전성이 높고 면역원성이 우수한 돼지생식기호흡기증후군(PRRS)의 예방 또는 치료용 면역원성 조성물을 제공한다.

다른 구체예는 상기 조성물을 이용하여 효율적으로 포유 동물의 PRRS를 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.

일 구체예는, PRRS-GC-6262, PRRS-GC-4019, PRRS-GC-DM, PRRS-GC-4172, PRRS-GC-EU0907 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 신규한 돼지생식기호흡기증후군 바이러스(PRRSV)를 제공한다.

이들 신규한 PRRSV는 모두 국내에 분리된 주로서 4개 주 즉, PRRS-GC-6262, PRRS-GC-4019, PRRS-GC-DM 및 PRRS-GC-4172는 북미형 유전자형을 갖는다. 반면, PRRS-GC-EU0907는 유럽형 유전자형을 갖는다.

이들 신규한 PRRSV의 GP5의 코딩 뉴클레오티드 서열은 서열번호 1 내지 5 [PRRS-GC-6262 GP5 코딩서열 (VR2332 GP5 기준 1-603): 서열번호 1, PRRS-GC-4019 GP5 코딩서열(VR2332 GP5 기준 1-603): 서열번호 2, PRRS-GC-DM GP5 코딩서열(VR2332 GP5 기준 44-540): 서열번호 3, PRRS-GC-4172 GP5 코딩서열(VR2332 GP5 기준 44-540): 서열번호 4 및 PRRS-GC-EU0907 GP5 코딩서열(Lelystad GP5 기준 1-605): 서열번호 5]에 나타낸 바와 같다. 또한, 이들 신규한 PRRSV의 GP5 코딩 서열과 북미형 표준 주 및 유럽형 표준 주인 VR2332와 Lelystad의 GP5 코딩 서열과의 뉴클레오티드 서열을 비교한 결과는 표 1과 같다.

	VR2332	PRRSV-GC-6262	PRRSV-GC-4019	PRRSV-GC-DM	PRRSV-GC-4172	PRRSV-GC-EU0907	Lelystad
VR2332	-	0.844	0.996	0.877	0.883	0.64	0.637
PRRSV-GC-6262	0.844	-	0.844	0.851	0.85	0.616	0.612
PRRSV-GC-4019	0.996	0.844	-	0.874	0.879	0.64	0.637
PRRSV-GC-DM	0.877	0.851	0.874	-	0.931	0.638	0.635
PRRSV-GC-4172	0.883	0.85	0.879	0.931	-	0.627	0.624
PRRSV-GC-EU0907	0.64	0.616	0.64	0.638	0.627	-	0.988
Lelystad	0.637	0.612	0.637	0.635	0.624	0.988	-

표 1은 본 발명의 PRRSV와 북미형 및 유럽형 표준 주의 GP5 코딩 서열 비교를 나타낸다. 표 1에서, 수치는 Bioedit (North Carolina Univ. NC. USA) 소프트웨어를 사용하여 CLustal W를 사용하여 서열 정렬에 의하여 얻어진 상동성을 나타낸다. GP5 부분은 중화항체 형성에 중요한 역할을 하기 때문에 GP5의 서열 상동성은 교차 방어가 가능한 범위 내에 있는 것인지, 유전적 변이가 얼마나 진행되었는지를 나타내는 지표가 된다.

표 1에 나타낸 바와 같이, 북미형 표준 주 VR2332와 비교하여, PRRS-GC-4019가 99.6%의 상동성을 보이는 것을 제외하고, 나머지 4개 주 모두, 즉 PRRS-GC-6262, PRRS-GC-DM, PRRS-GC-4172 및 PRRS-GC-EU0907은 64.0% 내지 88.3%의 상동성을 보여, 북미형 표준 주와는 상당한 유전적 변이를 갖는 것을 확인하였다. 이들은 표준 주로부터 항원 변이가 진행된 주에 해당하는 것이며, 이들 항원 변이가 이루어진 주들을 불활성화 백신으로 사용함으로써 PRRSV에 대한 방어 범위를 넓힐 수 있다.

또한 유럽형 표준 주 Lelystad와 비교하여, PRRS-GC-EU0907이 98.8%의 상동성을 보이는 것을 제외하고, 나머지 4개 주 모두, 즉 PRRS-GC-6262, PRRS-GC-4019, PRRS-GC-DM 및 PRRS-GC-4172는 61.2% 내지 63.7%의 상동성을 보여, 유럽형 표준 주와는 상당한 유전적 변이를 갖는 것을 확인하였다.

또한, 5개 주 상호간에 비교하여, PRRS-GC-DM과 PRRS-GC-4172가 93.1%의 상동성을 갖는 것을 제외하고, 61.6% 내지 88.3%의 상동성을 보여, 상호간에 상당한 유전적 변이를 갖는 것을 확인하였다.

따라서, 이들 5개의 PRRSV 주는 상호간 및 표준 주 사이에서 항원 변이가 진행된 주에 해당하는 것이며, 이들 항원 변이가 이루어진 주들을 불활성화 백신으로 사용함으로써 PRRSV에 대한 방어 범위를 넓힐 수 있다.

상기 신규한 PRRSV 주, PRRS-GC-6262, PRRS-GC-4019, PRRS-GC-DM, PRRS-GC-4172 및 PRRS-GC-EU0907는 2011년 1월 21일자로 부다페스트조약 제7조의 규정에 의한 국제기탁기관인 한국생명공학원 산하 KCTC (Korean Collection for Type Cultures)에 기탁하였으며, 수탁번호는 각각 KCTC 11852BP, KCTC 11850BP,KCTC 11853BP, KCTC 11851BP 및 KCTC 11854BP이다.

도 1은 상기 신규한 PRRSV 주와 북미형 및 유럽형 PRRSV의 GP5 코딩 서열의 상동성에 근거한 발생계통도(phylogenetic tree)를 나타낸다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 상기 5개의 신규한 PRRSV는 각각 그 속한 그룹이 다른 것을 확인할 수 있다.

다른 구체예는 불활성화된 PRRS-GC-6262(수탁번호 KCTC 11852BP), 불활성화된 PRRS-GC-4019(수탁번호 KCTC 11850BP), 불활성화된 PRRS-GC-DM(수탁번호 KCTC 11853BP), 불활성화된 PRRS-GC-4172(수탁번호 KCTC 11851BP), 불활성화된 PRRS-GC-EU0907(수탁번호 KCTC 11854BP) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 돼지생식기호흡기증후군(PRRS)의 예방 또는 치료용 면역원성 조성물을 제공한다.

상기 조성물은 상기 불활성화된 5개의 PRRSV 주 각각 또는 모두를 포함하는 것일 수 있다. 즉, 5개 PRRSV를 포함하는 복합 백신일 수 있다. 본 명세서에 있어서, 용어 "면역원성 조성물"은 용어 "백신"과 상호교환가능하게 사용된다.

상기 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체 또는 아쥬반트(adjuvant)를 더 포함할 수 있다. 상기 담체는 희석제, 완충제, 보존제, 부형제, 붕해제, 결합제 및 활택제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 성분을 포함할 수 있다. 상기 아쥬반트는 항원의 면역원성을 증진시키기 위해 사용되는 물질로서, 미네랄 염, 예컨대 알룸(alum), 알루미늄 히드록시드, 알루미늄 포스페이트 및 칼슘 포스페이트; 계면활성제 및 미립자, 예컨대, 비이온성 블록 중합체 계면활성제(예컨대, 콜레스테롤), 비로솜(virosome), 사포닌(saponin)(예컨대, Quil A, QS-21 및 GPI-0100), 프로테오솜, 면역 자극 착체, 코클레이트, 4차 아민(디메틸 디옥타데실 암모늄 브로마이드(DDA)), 아브리딘, 비타민 A, 비타민 E; 박테리아 생성물, 예컨대 RIBI 아주반트 시스템(Ribi Inc.), 미코박테리룸 플레이(Mycobacterum phlei)의 세포벽 골격(Detox®, 무라밀 디펩티드(MDP) 및 트리펩티드(MTP), 모노포스포릴 지질 A, 바실러스 칼메테-구에린(Bacillus Calmete-Guerin, BCG), 열-불안정한 대장균 엔테로톡신(enterotoxin), 콜레라 독소, 트레할로스 디미콜레이트, CpG 올리고데옥시뉴클레오티드; 시토카인 및 호르몬, 예컨대, 인터류킨(IL-1, IL-2, IL-6, IL-12, IL-15, IL-18), 과립구집락자극인자, 데히드로에피안드로스테론, 1,25-디히드록시 비타민 D3; 폴리아니온, 예컨대 덱스트란; 폴리아크릴릭(예컨대, 폴리메틸메타크릴레이트, Carbopol 934P); 담체, 예컨대 파상풍 톡시드, 디프테리아 톡시드, 콜레라 독소 B 서브유닛, 내독소 생성 대장균의 돌연변이체 열-불안정한 엔테로톡신(rmLT), 열 쇼크 단백질; 수중유적형 유화액, 예컨대 AMPHIGEN®(Hydronics, 미국); Seppic 사(프랑스)의 IMS 시리즈 중에서 IMS1312N 또는 Montanide Gel, RehydraGel, 및 유중수적형 유화액, 예컨대 프로인트(Freund)의 완전 및 불완전 아주반트를 포함한다. 첨가되는 아주반트의 함량은 개체의 체중, 성별, 나이, 질병의 경중 및 바이러스의 역가 등에 따라 달라지지만, 예를 들면 10-15%(w/w)일 수 있다. 상기 조성물은 또한, 적당한 보존제 예를 들면, 티메로살, 포름 알데하이드 및/또는 겐타마이신을 포함할 수 있다.

상기 신규한 PRRSV의 불활성화는 당업계에 알려진 방법에 의하여 이루어질 수 있다. 상기 불활성화는 예를 들면, 숙주세포에서의 계대배양, 및 포름알데히드 (또는 포르말린) 또는 브로모에틸아민 히드로브로미드와 같은 화학물질을 처리함으로써 이루어지는 것일 수 있다. 상기 불활성화는 예를 들면, 브로모에틸아민 히드로브로미드(BEA:BrCH₂CH₂NH₂HBr: 분자량: 204.9 Da) 용액 중에 바이러스 벌크를 담금으로써 이루어지는 것일 수 있다. 여기서 바이러스 벌크란, 백신 제조를 위하여 제조된 바이러스 배양액으로부터 원심분리하여 얻어진 백신 제조전의 상태를 나타낸다. 상기 BEA 용액은 0.0001 내지 0.1M, 또는 0.0005 내지 0.01M BEA 용액일 수 있다. 상기 불활성화는 BEA 용액 중에 바이러스를 담그고 30 내지 45℃, 예를 들면, 37℃에서 교반과 함께 또는 교반 없이 방치하는 것일 수 있다. 상기 방치는 적절한 시간 예를 들면, 10시간 내지 24시간, 예를 들면, 18시간 동안 방치하는 것일 수 있다. 포르말린으로 불활화시킬 경우 예를 들면, 포르말린을 0.2-0.5% 농도로 첨가하여 이루어질 수 있다. 불활화를 수행하고 난 후에는 상기 사용된 불활화제를 중화시키기 위하여, 소듐 티오술페이트(sodium thiosulfate)를 첨가하여 중화시킬 수 있다. 예를 들면, 1M 소듐 티오술페이트를 첨가하여 37℃에서 1시간, 4℃에서 하룻밤 서서히 교반하여 감작시켜 중화시킬 수 있다.

상기 조성물이 2이상의 불활성화된 바이러스를 포함하는 혼합 백신인 경우, 상기 불활화된 바이러스의 용액을 혼합하는 과정을 포함한다. 배양액을 혼합하는 비율은 제한되지는 않지만, 불활성화된 PRRS-GC-6262(수탁번호 KCTC 11852BP), 불활성화된 PRRS-GC-4019(수탁번호 KCTC 11850BP), 불활성화된 PRRS-GC-DM(수탁번호 KCTC 11853BP), 불활성화된 PRRS-GC-4172(수탁번호 KCTC 11851BP) 및 불활성화된 PRRS-GC-EU0907(수탁번호 KCTC 11854BP)를 예를 들면, 부피 비율로 1:1.5-3.5:1.5-3.5:1.5-3.5:1.5-3.5:1.5-3.5, 예를 들면, 1:2:2:2:2로 혼합하는 것일 수 있다. 또한, 개체의 면역증강을 위하여 IMS1312N(Seppic, 프랑스)이나 RehydraGel과 같은 면역증강제를 추가할 수 있다.

돼지생식기호흡기증후군(PRRS)은 PRRSV에 의해 야기되는 돼지의 생식기 및 호흡기 질환과 관련된 각종 임의의 증상을 포함할 수 있고, 예를 들면 모돈의 유사산 및 태아의 폐청색증, 분만율 저하, 기타 2차적인 세균 감염으로 인한 증상이다.

본 발명의 면역원성 조성물은 당업계에 알려진 임의의 형태 예를 들면, 액제 및 주사제의 형태일 수 있다. 액제 또는 주사제의 경우, 필요시 10-40％의 프로필렌 글리콜, 및 용혈 현상을 방지하는데 충분한 양(예: 약 1％)의 염화나트륨을 함유할 수 있다. 상기 액제 또는 주사제는 당업계에 알려진 임의의 희석제 또는 완충제가 포함될 수 있다. 또한, 본 발명의 면역원성 조성물은, 동결 건조하여 바이알과 같은 용기에 보존하고, 사용하기 전에 주사제에 필요한 담체 또는 아쥬반트, 식염수 등을 부가함으로써 사용 직전에 조제될 수 있다.

본 발명의 면역원성 조성물은 당업계에 알려져 있는 임의의 투여 수단에 의해 투여될 수 있다. 예를 들면, 상기 투여는 정맥내, 근육내, 경구, 경피(transdermal), 점막, 코안(intranasal), 기관내(intratracheal) 또는 피하로 직접적으로 투여될 수 있다. 상기 면역원성 조성물은 전신으로 또는 국부로 투여될 수 있다.

본 발명의 면역원성 조성물에 있어서, 상기 포유 동물은 인간, 소, 돼지, 염소, 개, 양 등일 수 있다.

본 발명은 상기 면역원성 조성물을 사람을 제외한 포유동물에 투여하는 단계를 포함하는 포유 동물의 PRRS를 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명의 방법에서, 상기 포유 동물은 소, 돼지, 염소, 개, 양 등일 수 있다.

본 발명의 방법에 있어서, 본 발명의 면역원성 조성물은 당업계에 알려져 있는 임의의 투여 수단에 의해 투여될 수 있다. 예를 들면, 상기 투여는 정맥내, 근육내, 경구, 경피, 점막, 코안, 기관내 또는 피하로 직접적으로 투여될 수 있다. 상기 균주 또는 면역원성 조성물은 전신으로 또는 국부로 투여될 수 있다.

본 발명의 면역원성 조성물 또는 방법에 있어서, 본 발명의 면역원성 조성물은 유효량으로 투여될 수 있다. "유효량"은 치료 또는 예방하고자 하는 증상을 완화 또는 제거하는데 요구되는 양을 의미하며, 당업자라면 적절하게 선택할 수 있다. 예를 들면, 치료학적 또는 예방학적 유효량은 단위 용량당 상기 불활성화된 PRRSV를 1x10^4.5 내지 1x10^6.5 TCID₅₀/ml, 예를 들면 1x10^5.0 내지 1x10^6.0TCID₅₀/ml를 포함하는 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 조성물은 바이러스 역가가 각각 1x10^6.0TCID₅₀/ml인, 불활성화된 PRRS-GC-6262(수탁번호 KCTC 11854BP), 불활성화된 PRRS-GC-4019(수탁번호 KCTC 11850BP), 불활성화된 PRRS-GC-DM(수탁번호 KCTC 11853BP), 불활성화된 PRRS-GC-4172(수탁번호 KCTC 11851BP) 및 불활성화된 PRRS-GC-EU0907(수탁번호 KCTC 11854BP)를 10 부피%:20 부피%:20 부피%:20 부피%:20 부피%로 포함하고, 10 부피%는 montanide gel^TM (SEPPIC, Paris, France)인 것일 수 있다. montanide gel^TM (SEPPIC, Paris, France)은 합성폴리머와 수성겔로 이루어진 조성물이다.

본 발명에 따른 PRRSV 주에 의하면, 종래 알려진 북미형 표준 주 및 유럽형 표준 주에 비하여 GP5 코딩 서열이 다르기 때문에 면역원성 조성물을 제조하는데 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 돼지생식기호흡기증후군(PRRS)의 예방 또는 치료용 면역원성 조성물에 의하면, 개체에서 돼지생식기호흡기증후군(PRRS)을 예방 또는 치료할 수 있다. 특히, 표준 주에 비하여 항원 변이성을 보이는 주를 사용하였으므로, 넓은 범위의 PRRSV에 대하여 방어할 수 있다.

본 발명에 따른 포유 동물의 PRRS를 예방 또는 치료하는 방법에 의하면, 개체에서 돼지생식기호흡기증후군(PRRS)을 예방 또는 치료할 수 있다.

도 1은 상기 신규한 PRRSV 주와 북미형 및 유럽형 PRRSV의 GP5 코딩 서열의 상동성에 근거한 발생계통도(phylogenetic tree)를 나타낸다.
도 2는 백신군과 대조군에서 중화항체가를 측정한 결과를 나타내는 도면이다.

이하, 본원 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 그러나, 본원 발명이 하기 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

실시예 : 혼합 백신의 제조 및 효과의 확인

본 실시예에서는 PRRS-GC-6262(수탁번호 KCTC 11852BP), PRRS-GC-4019(수탁번호 KCTC 11850BP), PRRS-GC-DM(수탁번호 KCTC 11853BP), PRRS-GC-4172(수탁번호 KCTC 11851BP) 및 PRRS-GC-EU0907(수탁번호 KCTC 11854BP)를 각각 배양하여 증식시키고 불활성화시킨 다음 불활성화된 5개 바이러스를 포함하는 면역원성 조성물을 제조하였다. 다음으로, 상기 조성물의 PRRS에 대한 효과를 확인하였다.

(1) 사용된 바이러스

혼합 백신에 사용된 바이러스는 국내 농장에서 분리된 PRRS-GC-6262(수탁번호 KCTC 11852BP), PRRS-GC-4019(수탁번호 KCTC 11850BP), PRRS-GC-DM(수탁번호 KCTC 11853BP), PRRS-GC-4172(수탁번호 KCTC 11851BP) 및 PRRS-GC-EU0907(수탁번호 KCTC 11854BP)를 사용하였다. 이들 주는 녹십자수의약품 주식회사 수의연구소에서PRRSV에 감수성이 있는 세포에 감염이 확인되는 조직의 유제액을 접종하여 분리하였다.

(2) 원종독주(master seed virus)의 계대 방법

(2.1) 숙주세포의 배양 및 유지

이들 PRRSV의 숙주세포인 MARC-15의 배양 및 유지는 다음과 같이 수행하였다. 트립신 용액(Trypsin EDTA, Gibco, Cat. No. 15400-054)으로 소화시켜 분산된 MARC-145 세포를 증식용 배지에 부유시켜, 배양용기에 소분한 후 37℃에서 2-3일 동안 배양하였으며, 3일 배양 후 계대 배양에 사용하였다. MARC-145 세포 증식용 배지는 α-MEM 900ml, FBS(fetal serum albumin) 100 ml, 항생제-항진균제(antibiotic-antimycotics) 1% (PAA, Cat.NO. p11-002), 비필수 아미노산(NEAA) 1%, L-글루타민 1% 및 7% 탄산수소나트륨 용액 1%로 구성되고 pH 7.0~7.4로 조정된 것이며, MARC-145 세포는 원숭이 신장세포인 MA-104 세포의 PRRSV에 대하여 높은 허용도를 갖는 군집(PRRSV high permissive subpopulation)으로부터 유래된 것이다.

(2.2) 바이러스 배양 및 계대

원종독은 녹십자수의약품 주식회사 수의연구소에서 분리한 바이러스를 약 80% 이상 단층이 형성된 세포에 종독을 접종하여 37℃에서 1 내지 2시간 감작 후 유지용 배지를 넣고 72시간 배양하였다. 세포변성효과(CPE)가 80% 이상 나타났을 때 배양액을 무균적으로 채독하여 동결건조하거나 -80℃에 냉동보관하였다. 종독 (seed virus)은 원종독과 동일한 방법으로 접종, 배양 및 채독하여 동결건조하거나 -80℃에 냉동보관하였다. 상기 유지용 배지는 α-MEM 1000ml, FBS 20ml, 항생제-항진균제(antibiotic-antimycotics) 1% (PAA, Cat. No. p11-002), 비필수 아미노산 (NEAA) 1%, L-글루타민 1% 및 7% 탄산수소나트륨 용액 1%로 구성된 것이다.

벌크로 생산되는 바이러스는 원종독에서 5대이상 계대되지 않도록 하였다. 원종독과 동일한 방법으로 접종, 배양, 및 채독하여 -80℃에 냉동보관한 후 백신 생산시 사용하였다.

바이러스의 배양은 다음과 같이 수행하였다. 단층이 형성된 세포 배양 용기에서 배지를 제거한 후, 각각의 바이러스를 10³ TCID₅₀/ml로 접종한 후 1시간 흡착시켰다. 1시간 후 세포 단층을 PBS로 세척한 후 유지 배지를 첨가하여, 37℃에서 3 내지 4일간 정치배양하였다.

바이러스의 수확은 다음과 같이 수행하였다. 바이러스를 접종한 세포를 3 내지 4일간 배양하여 감염세포를 수확하여 2,500rpm에서 15분간 원심분리하여 침전된 세포를 배양액의 1/10되게 PBS로 재부유한 다음 동결 및 융해를 3회 반복 실시하였다. 이들 세포가 완전히 파괴된 다음 2,500rpm에서 15분간 원심분리하여 상층액을 수확하였다. 바이러스 역가는 PRRS-GC-4019 10^6.0TCID₅₀/ml, PRRS-GC-6262 10^6.0TCID₅₀/ml, PRRS-GC-4172 10^6.0TCID₅₀/ml, PRRS-GC-DM 10^6.0TCID₅₀/ml, PRRS-GC-EU0907 10^6.0TCID₅₀/ml 이상의 양으로 확인하였다.

(3) 백신 제조

바이러스 벌크의 불활성화는 다음과 같이 수행하였다. 먼저, BEA (bromoethylamine hydrobromide: BrCH₂CH₂NH₂HBr, 분자량 204.9 Da)(Sigma B 9258)를 불활화 재료로 사용하였다. 37℃로 가열한 0.2N NaOH 용액(8g/ℓ)에 0.1M 농도가 되도록 BEA를 용해시켰다 (BEA 20.49g을 1ℓ의 0.2N NaOH 용액에 넣었다). 37℃ 항온 수조에서 1시간 동안 잘 흔들어 BEI (Binary Ethylenimine) 용액을 완성하였다. 0.1M BEI 용액을 바이러스 벌크에 1%가 되게 첨가 (100배 희석)하여 최종적으로 0.001M (1mM)의 농도가 되게 하였다. 37℃에서 마그네틱 바로 교반하면서 약 18시간 정도 불활화시켰다. 4℃로 냉각시킨 다음 최종농도가 2mM이 되도록 소듐 티오술페이트 (sodium thiosulfate)를 첨가하여 BEI의 작용을 중화시켰다 (2M의 소듐 티오술페이트, 즉 31.62g의 소듐 티오술페이트를 100㎖의 증류수에 녹인 용액을 멸균시킨 후 1000배 희석하여 사용하였다). 1% 티메로살 (thimerosal) 용액을 최종농도가 0.01%가 되도록 첨가하였다. 이렇게 하여 상기한 5개 PRRSV를 각각 불활성화시켰다.

다음으로, 불활성화된 각 PRRSV와 어주반트를 혼합하여 혼합 백신을 제조하였다. 먼저, 불활성화된 PRRSV 항원을 3,000rpm에서 30분 동안 원심분리하여 상층액을 채취하였다. 얻어진 상층액 중의 바이러스는 역가는 모두 10^6.0TCID₅₀/ml 이상이었다. 역가가 모두 10^6.0TCID₅₀/ml 이상인, 불활성화된 PRRS-GC-4019, 불활성화된 PRRS-GC-6262, 불활성화된 PRRS-GC-DM, 불활성화된 PRRS-GC-4172, 불활성화된 PRRS-GC-EU0907를 10: 20: 20: 20의 부피 비율로 혼합하고 여기에 마그네틱 바를 이용하여 교반하면서 20분 동안 10% 부피의 합성 폴리머겔인 montanide gel^TM 을 첨가하였다. 1시간 정도 혼합하여 얻어진 혼합 백신은 적량의 용기에 분주하고 밀봉하였다.

(4) 백신의 안전성 시험

체중 15 내지 20g 마우스 8마리와 체중 300 내지 350g의 기니픽 4마리 및 돼지생식기호흡기증후군 바이러스에 대한 항체가 음성인, 건강한 이유자돈 2마리를 공시하였다. 마우스 8마리는 백신 0.5㎖을 피하접종하고, 기니픽 4마리는 2㎖씩 각각 피하 및 복강 접종하고 7일간 관찰하여 이상 없이 생존하는 경우 안전한 것으로 판정하였다. 이유자돈 2마리에는 2두분 (2ml)을 근육접종 후 21일간 관찰하여 주사부위의 화농, 괴사, 발열, 호흡기 증상 등의 이상 없이 생존하는 경우, 안전한 것으로 판정하였다. 표 2은 실험 동물에 대한 안전성 시험 결과를 나타낸다.

표 3은 돼지에 대한 안전성 시험 결과를 나타낸다.

표 3에서, *는 체온변화, 호흡곤란, 의기소침, 구토여부, 접종부위 종창, 접종부위 화농소 및 식욕부진을 나타낸다.

(5) 백신의 역가시험

역가 시험은 다음의 시험1 또는 시험2에 따라 실시하였다.

시험1 :

체중 300 내지 350 g의 기니픽 10마리를 사용하였다. 8마리의 기니픽에 백신의 1.0 ㎖를 근육주사하고 2주 후에 다시 1.0 ㎖씩 접종한 후 2주 후에 대조군 2마리와 함께 채혈하여 중화 항체가를 측정하였다. 시험방법은 다음과 같다. 먼저, 혈청을 분리하고 56℃, 30분간 비동화한 혈청을 배지(α-MEM 1000ml, FBS 20ml, 항생제-항진균제 1% (Antibiotic/Antimycotic, PAA, Cat. No. p11-002), 비필수 아미노산(NEAA) 1%, L-글루타민 1% 및 7% 탄산수소나트륨 용액 1%로 구성됨)로 2진 희석한 후 돼지 생식기호흡기증후군 바이러스 (300 TCID₅₀/0.1㎖)로 동량 혼합하여 4℃, 48시간 이상 중화시킨 다음 신선한 기니픽 혈청(3 내지 5%)을 포함한 배지 50 ㎕를 추가한 후 37℃, 60분간 반응시켰다. MARC-145 세포, MA-104 세포 또는 돼지 생식기호흡기증후군 바이러스에 감수성이 있는 세포를 함유하는 배지(3% FBS 포함) 50 ㎕를 추가하여 37℃에서 5일간 배양 후 세포변성효과를 관찰하거나 또는 세포를 80% 아세톤에 고정하여 간접 형광 항체법(IFA: indirect immunoflorescence assay)으로 항체가를 측정하였다.

돼지 생식기호흡기증후군 바이러스에 대한 중화 항체가는 접종동물의 80% 이상이 8배 이상인 경우 역가가 양성인 것으로 판정하고, 대조군은 음성이어야 한다.

표 4은 시험1에 따라 실시한 시험동물에서의 역가시험 결과를 나타낸다.

표 4에서 대조군으로 사용된 5종은, 인산완충염수 (PBS: phosphate buffered saline) 용액을 나타낸다.

(6) 면역 접종 및 공격 접종에 대한 방어

공격 시험에 사용된 돼지군은 다음과 같이 배정하였다. 초유를 먹지 않거나, PRRS 바이러스에 대한 항체 음성인 3주령의 돼지를 백신-접종군과 백신 대조군 및 접종 대조군으로 각 3두씩 배정하였다.

백신의 접종은 다음과 같이 수행하였다. 3주령의 백신군에 1 ml의 본 발명의 5개 불활성화된 PRRSV를 포함하는 백신을 근육접종 하고 5주령에 2차 접종을 실시하였다. 이때, 접종 대조군은 바이러스가 함유되지 않은 배지를 같은 방식으로 접종하였다.

야외 바이러스 접종은 다음과 같이 수행하였다. 마지막 백신 접종 후 4주가 지난 후, 돼지가 9주령이 되었을 때, 야외 바이러스 분리주를 공격 접종하였다. 공격 접종 바이러스는 야외 분리주로서 불활성화되지 않은 PRRSV-GC-4019를 사용하며, 10⁴ TCID₅₀/ml의 역가가 되는 분리주를 비강으로 2ml씩 접종하였다. 백신군과 접종 대조군에 각각 공격 접종하였으며, 백신 대조군은 동량의 배지를 비강으로 접종하였다.

공격 접종된 돼지의 혈중 항체 농도를 측정하였다. 먼저, 백신 접종일 이후 2주 간격으로 채혈을 통해 혈액을 확보하였다. 3, 5, 7, 9 및 11주령의 전 두수에서 채혈하였으며 혈청중화시험법 (SN test: Serum Neutralization test))을 이용하여 중화 항체를 측정하였다.

도 2는 백신군과 대조군에서 중화항체가를 측정한 결과를 나타내는 도면이다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 백신군에서 중화항체가가 증가하는 것을 확인할 수 있었다.

또한, 공격 접종 후 돼지에 대하여 임상 증상을 관찰하고 바이러스가 배출되는지를 측정하였다. 구체적으로, 공격 접종 후, 2일 간격으로 체온 및 임상증상 등을 관찰하였다. 각 그룹의 개체별로 관찰하며 특이 사항이 있으면 바로 기록하였다. 바이러스 배출은 공격접종 후 14일 동안 RT-PCR을 이용해서 비강 분비물에서 바이러스의 항원을 검출하였다. RT-PCR은 비강 분비물로부터 분리된 총 RNA를 주형으로 하고, 랜덤 헥사머를 역전사 프라이머로 사용하여 역전사 반응을 수행하고, 얻어진 cDNA를 주형으로 하고, 포워드 프라이머(서열번호 6) 및 리버스 프라이머(서열번호 7)를 프라이머로 하여, PCR을 수행하였다.

표 5 및 표 6는 각각 백신군 및 대조군에 대한 임상 증상을 관찰한 결과를 나타낸다.

이상의 결과로부터 본 발명의 면역원성 조성물은 종래 알려진 백신에 비하여 더 넓은 범위의 PRRSV에 대하여 개체를 방어하는 효과가 있었다.

한국생명공학연구원

KCTC11852BP

20110121

한국생명공학연구원

KCTC11850BP

20110121

한국생명공학연구원

KCTC11853BP

20110121

한국생명공학연구원

KCTC11851BP

20110121

한국생명공학연구원

KCTC11854BP

20110121

서열목록 전자파일 첨부

Claims

신규한 돼지생식기호흡기증후군 바이러스(PRRSV)인 PRRS-GC-DM(수탁번호 KCTC 11853BP).
불활성화된 PRRS-GC-DM(수탁번호 KCTC 11853BP)을 포함하는, 돼지생식기호흡기증후군(PRRS)의 예방 또는 치료용 면역원성 조성물.
제2항에 있어서, 불활성화된 PRRS-GC-DM(수탁번호 KCTC 11853BP)은 브로모에틸아민 히드로브로미드에 의하여 불활화된 것인 조성물.
제2항 또는 제3항 중 어느 한 항에 따른 면역원성 조성물을 인간을 제외한 포유 동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 포유 동물의 PRRS를 예방 또는 치료하는 방법.