CN114058642A - 表达非洲猪瘟病毒ep153r-ep402r蛋白的重组腺病毒及构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种表达非洲猪瘟病毒EP153R‑EP402R蛋白的重组腺病毒及构建方法，属于基因工程技术领域，本发明利用重组腺病毒穿梭载体pENTRE‑EGFP‑TOPO，经过一系列中间过程，得到重组腺病毒载体pAD‑CMV‑EGFP‑EP153R‑EP402R；将其线性化后转染AD293细胞，根据腺病毒感染形成的细胞病变筛选重组病毒，实现腺病毒包装过程，获得表达非洲猪瘟病毒EP153R‑EP402R蛋白的重组腺病毒，为构建表达非洲猪瘟病毒EP153R‑EP402R蛋白的重组腺病毒疫苗奠定了基础。

Description

表达非洲猪瘟病毒EP153R-EP402R蛋白的重组腺病毒及构建 方法
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，特别是涉及一种表达非洲猪瘟病毒EP153R-EP402R蛋白的重组腺病毒及构建方法。
背景技术
非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fevervirus，ASFV)感染引起的一种急性、烈性、高度接触性传染病。临床表现为发热、皮肤发绀、淋巴结、肾、胃肠黏膜明显出血等。
非洲猪瘟病毒是非洲猪瘟病毒科、非洲猪瘟病毒属的唯一成员，也是目前唯一的DNA虫媒病毒，通常认为只有一个血清型，国际上根据ASFV B646L基因末端一段478bp的核酸序列，将ASFV分为24个基因型，我国多属于基因Ⅱ型。非洲猪瘟病毒可通过家猪、野猪和软蜱进行传播，主要攻击猪单核、巨噬细胞。病毒粒子直径为175-215纳米，呈20面体对称，有囊膜，结构由内到外分别是类壳、核壳、内膜、衣壳和外囊膜。基因组为双股线状DNA，大小170-193kb，有150-167个开放阅读框，编码50多种结构蛋白和100多种非结构蛋白。参与病毒粒子结构构成的主要物质包括结构蛋白、基因转录和RNA修饰酶类。作为病毒粒子的主要成分，结构蛋白在ASFV吸附、侵入和复制等感染过程中起着重要作用。编码的蛋白主要有p72、p49、p30、p54、EP153R、CD2v等。EP153R蛋白由位于ASFV EcoRI E9基因组片段的EP153R基因编码，大小约为18kDa，在病毒感染的早期和晚期均发生转录。将标记基因LacZ插入到EP153R中，虽不改变体外病毒生长速度以及病毒的敏感性、耐药性，但消除了ASFV感染细胞诱导的血吸附现象。EP153R会稳固EP402R与其他配体间的相互作用，并且参与调解细胞的凋亡。CD2v蛋白因为与T细胞表面的黏附分子CD2相似而被命名，由EP402R基因编码，大小约为45.3kDa，嵌入病毒囊膜的外表面，是由信号肽、跨膜区以及含有147个氨基酸的胞质尾组成的一种糖蛋白。CD2v蛋白能使病毒颗粒吸附于红细胞，作为必需蛋白作用于红细胞结合到感染细胞和胞外病毒粒子。CD2v的表达与ASFV在家猪间的传播有关，其会使淋巴细胞的功能受到破坏。目前还没有针对EP153R-EP402R的重组腺病毒以及制备该重组腺病毒的可行方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种表达非洲猪瘟病毒EP153R-EP402R蛋白的重组腺病毒及构建方法，以解决上述现有技术存在的问题，为研究非洲猪瘟候选疫苗奠定技术基础。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种表达非洲猪瘟病毒EP153R-EP402R蛋白的重组腺病毒载体，以pAD-CMV-3×FLAG腺病毒载体为基础，引入EP153R-EP402R基因以构建重组腺病毒载体pAD-CMV-EGFP-EP153R-EP402R；所述EP153R-EP402R基因具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。
本发明还提供一种上述的表达非洲猪瘟病毒EP153R-EP402R蛋白的重组腺病毒载体的构建方法，包括以下步骤：
(1)合成EP153R-EP402R基因，并在EP153R-EP402R基因的起始密码子前添加CACC四个碱基；
(2)将步骤(1)得到的EP153R-EP402R基因和pENTRE-EGFP-TOPO载体进行TOPO克隆，得到pENTR-EGFP-ASFV-EP153R-EP402R；
(3)将步骤(2)得到的pENTR-EGFP-ASFV-EP153R-EP402R通过LR重组反应于腺病毒骨架载体pAD-CMV-3×FLAG进行重组，得到重组腺病毒载体pAD-CMV-EGFP-EP153R-EP402R。
本发明还提供一种重组腺病毒包装方法，将上述的重组腺病毒载体pAD-CMV-EGFP-EP153R-EP402R用PacⅠ进行单酶切，线性化后的质粒用于转染；转染293t细胞，实现重组腺病毒包装。
进一步地，包括以下步骤：
(1)将重组腺病毒载体pAD-CMV-EGFP-EP153R-EP402R用限制性内切酶PacⅠ进行单酶切，线性化后的质粒用于转染AD293细胞；
(2)转染后至细胞脱落、变圆且间隙变大时，收集细胞及上清，即为P1代重组腺病毒；
(3)P1代重组腺病毒感染293t细胞，观察细胞状态。
进一步地，所述转染AD293细胞采用的转染试剂为ietPRIME kit转染试剂。
进一步地，在步骤(2)中，收集细胞及上清后，置于-80℃反复冻融3次，12000×g离心10min，收集上清。
本发明还提供上述的重组腺病毒包装方法制备得到的重组腺病毒，包含上述的重组腺病毒的疫苗。
本发明公开了以下技术效果：
本发明利用重组腺病毒穿梭载体pENTRE-EGFP-TOPO，经过一系列中间过程，得到重组腺病毒载体pAD-CMV-EGFP-EP153R-EP402R；将其线性化后转染AD293细胞，根据腺病毒感染形成的细胞病变筛选重组病毒，实现腺病毒包装过程，获得表达非洲猪瘟病毒EP153R-EP402R蛋白的重组腺病毒，为构建表达非洲猪瘟病毒EP153R-EP402R蛋白的重组腺病毒疫苗奠定了基础。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为重组腺病毒载体pAD-CMV-EGFP-EP153R-EP402R包装图；
图2为过渡载体重组质粒pENTR-EGFP-ASFV-EP153R-EP402R的质粒结构图；
图3为重组腺病毒载体pAD-CMV-EGFP-EP153R-EP402R的质粒结构图。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
下列实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，如《精编分子生物学实验指南》(F.M.奥斯伯，R.E.金斯顿，J.G.塞德曼等主编，马学军，舒跃龙的译.北京：科学出版社，2004)中所述的方法进行。
本发明提供了一种表达非洲猪瘟病毒EP153R-EP402R蛋白的重组腺病毒的构建方法，包括以下步骤：
(1)查询NCBI网站收录的EP153R-EP402R基因(GeneID:59226985+59226986)，通过人工合成基因片段，并在起始密码子前添加CACC四个碱基，连接到过渡载体pENTRE-EGFP-TOPO上，得到过渡载体重组质粒pENTR-EGFP-ASFV-EP153R-EP402R，如图2所示。
(2)将步骤(1)得到的过渡载体重组质粒pENTR-EGFP-ASFV-EP153R-EP402R利用LR重组反应与腺病毒骨架载体pAD-CMV-3×FLAG进行重组，通过转化得到重组腺病毒载体pAD-CMV-EGFP-EP153R-EP402R，如图3所示。
(3)重组腺病毒载体pAD-CMV-EGFP-EP153R-EP402R经过PacⅠ酶切，线性化转染AD293细胞，获得重组腺病毒。
EP153R-EP402R基因的合成：
查询NCBI网站收录的EP153R-EP402R基因(GeneID:59226985+59226986)，通过人工合成基因片段，并在起始密码子前添加CACC四个碱基，最终序列如SEQ ID No.1所示。
SEQ ID No.1：
ATGTTTTCTAACAAAAAGTACATCGGTCTTATCAATAAGAAGGAGGGTTTGAAAAAAAAAATAGATGATTATAGTATATTAATAATTGGAATATTAATTGGAACTAACATCTTAAGCCTTATTATAAATATAATAGGAGAGATTAATAAACCAATATGTTACCAAAATGATGATAAGATATTTTATTGCCCTAAAGATTGGGTTGGATATAATAATGTTTGTTATTATTTTGGCAATGAAGAAAAAAATTATAATAATGCAAGTAATTATTGTAAGCAATTAAATAGTACGCTTACTAATAATAATACTATTTTAGTAAATCTTACTAAAACATTAAATCTTACTAAAACATATAATCACGAATCTAATTATTGGGTTAATTATTCTTTAATTAAAAATGAGTCAGTACTATTACGTGATAGTGGATATTACAAAAAACAAAAACATGTAAGTTTATTATATATTTGTAGTAAAGGAGGCGGAAGCGGCGGTGGAGGATCAATGATAATACTTATTTTTTTAATATTTTCTAACATAGTTTTAAGTATTGATTATTGGGTTAGTTTTAATAAAACAATAATTTTAGATAGTAATATTACTAATGATAATAATGATATAAATGGAGTATCATGGAATTTTTTTAATAATTCTTTTAATACACTAGCTACATGTGGAAAAGCAGGTAACTTTTGTGAATGTTCTAATTATAGTACATCAATATATAATATAACAAATAATTGTAGCTTAACTATTTTTCCTCATAATGATGTATTTGATACAACATATCAAGTAGTATGGAATCAAATAATTAATTATACAATAAAATTATTAACACCTGCTACTCCCCCAAATATCACATATAATTGTACTAATTTTTTAATAACATGTAAAAAAAATAATGGAACAAACACTAATATATATTTAAATATAAATGATACTTTTGTTAAATATACTAATGAAAGTATACTTGAATATAACTGGAATAATAGTAACATTAACAATTTTACAGCTACATGTATAATTAATAATACAATTAGTACATCTAATGAAACAACACTTATAAATTGTACTTATTTAACATTGTCATCTAACTATTTTTATACTTTTTTTAAATTATATTATATTCCATTAAGCATCATAATTGGGATAACAATAAGTATTCTTCTTATATCCATCATAACTTTTTTATCTTTACGAAAAAGAAAAAAACATGTTGAAGAAATAGAAAGTCCACCACCTGAATCTAATGAAGAAGAACAATGTCAGCATGATGACACCACTTCCATACATGAACCATCTCCCAGAGAACCATTACTTCCTAAGCCTTACAGTCGTTATCAGTATAATACACCTATTTACTACATGCGTCCCTCAACACAACCACTCAACCCATTTCCCTTACCTAAACCGTGTCCTCCACCCAAACCATGTCCGCCACCCAAACCATGTCCTCCACCTAAACCATGTCCTTCAGCTGAATCCTATTCTCCACCCAAACCACTACCTAGTATCCCGCTACTACCCAATATCCCGCCATTATCTACCCAAAATATTTCGCTTATTCACGTAGATAGAATTATT
重组腺病毒载体pAD-CMV-EGFP-EP153R-EP402R的构建：
(1)将构建的过渡载体重组质粒pENTR-EGFP-ASFV-EP153R-EP402R利用LR重组反应与腺病毒骨架载体pAD-CMV-3×FLAG进行重组，LR重组反应体系如表1。
表1 LR重组反应体系
组分 用量
pENTR-EGFP-ASFV-EP153R-EP402R 1μL
pAD-CMV-3×FLAG 2μL
5×LR Clonase<sup>TM</sup>reaction buffer 4μL
TE Buffer,pH 8.0 9μL
将4μL Vorte×LR ClonaseTM enzyme MiX加入到以上组份中，涡旋混合；25℃孵育1h；加入2μL的2μg/μL的蛋白酶K溶液，37℃孵育10min；
(2)DH5α大肠杆菌感受态细胞，氨苄霉素抗性LB平板筛选，挑取单克隆PCR鉴定，得到重组腺病毒载体pAD-CMV-EGFP-EP153R-EP402R。
重组腺病毒的包装：
(1)AD293细胞铺板：吸取2mL/孔的细胞液于6板中，置于37℃，5％CO2培养箱中继续培养，待6板中的293T细胞培养至汇合度为70％-80％时，进行转染；
(2)质粒准备：向200μL的
Figure BDA0003377985810000081
buffer中加入2μg线性化的pAD-CMV-EGFP-EP153R-EP402R，涡旋混匀10s后瞬时离心至管底，加入4μL
Figure BDA0003377985810000082
transfectionreagent，涡旋混匀1s后瞬时离心，室温静置10min；将混合液逐滴加入到培养基中，轻轻摇匀，37℃培养。
(3)72h观察荧光表达，7d左右时观察AD293细胞状态及出毒效率，当观察到细胞脱落、变圆且间隙变大时(如图1)，将上清及细胞全部收集置于-80℃反复冻融3次，12000×g，离心10min收集上清；
(4)将收集的重组腺病毒接种T25瓶中已长至单层的293T细胞，5-7d细胞脱落大致为50％时，收集上清及细胞置于-80℃反复冻融3次，12000xg，离心10min收集上清；
(5)重复感染T25瓶，收毒；
(6)浓缩纯化重组腺病毒。
重组腺病毒的滴度测定
将稀释10-6倍的重组腺病毒接种293T细胞，利用Adeno-×Rapid Titer Kit腺病毒滴度测定试剂盒测定重组腺病毒的滴度，选取阳性细胞数为5-50个的视野计数，计算重组腺病毒滴度，结果为1010PFU/mL。
腺病毒表达验证
1)细胞准备：吸取0.5mL/孔的细胞液于24孔板中，置于37℃，5％CO2培养箱中继续培养，待24孔板中的293T细胞培养至汇合度为80％时，进行感染；
2)取50μL上述的重组腺病毒上清感染细胞，72h观察荧光；
3)WB标签蛋白检测，检测结果显示，在约60kD处出现了特异性条带，与预期结果一致，，可知包装成功的重组腺病毒感染细胞，可表达EP153R-EP402R蛋白。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
序列表
<110> 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所
<120> 表达非洲猪瘟病毒EP153R-EP402R蛋白的重组腺病毒及构建方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1581
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgttttcta acaaaaagta catcggtctt atcaataaga aggagggttt gaaaaaaaaa 60
atagatgatt atagtatatt aataattgga atattaattg gaactaacat cttaagcctt 120
attataaata taataggaga gattaataaa ccaatatgtt accaaaatga tgataagata 180
ttttattgcc ctaaagattg ggttggatat aataatgttt gttattattt tggcaatgaa 240
gaaaaaaatt ataataatgc aagtaattat tgtaagcaat taaatagtac gcttactaat 300
aataatacta ttttagtaaa tcttactaaa acattaaatc ttactaaaac atataatcac 360
gaatctaatt attgggttaa ttattcttta attaaaaatg agtcagtact attacgtgat 420
agtggatatt acaaaaaaca aaaacatgta agtttattat atatttgtag taaaggaggc 480
ggaagcggcg gtggaggatc aatgataata cttatttttt taatattttc taacatagtt 540
ttaagtattg attattgggt tagttttaat aaaacaataa ttttagatag taatattact 600
aatgataata atgatataaa tggagtatca tggaattttt ttaataattc ttttaataca 660
ctagctacat gtggaaaagc aggtaacttt tgtgaatgtt ctaattatag tacatcaata 720
tataatataa caaataattg tagcttaact atttttcctc ataatgatgt atttgataca 780
acatatcaag tagtatggaa tcaaataatt aattatacaa taaaattatt aacacctgct 840
actcccccaa atatcacata taattgtact aattttttaa taacatgtaa aaaaaataat 900
ggaacaaaca ctaatatata tttaaatata aatgatactt ttgttaaata tactaatgaa 960
agtatacttg aatataactg gaataatagt aacattaaca attttacagc tacatgtata 1020
attaataata caattagtac atctaatgaa acaacactta taaattgtac ttatttaaca 1080
ttgtcatcta actattttta tacttttttt aaattatatt atattccatt aagcatcata 1140
attgggataa caataagtat tcttcttata tccatcataa cttttttatc tttacgaaaa 1200
agaaaaaaac atgttgaaga aatagaaagt ccaccacctg aatctaatga agaagaacaa 1260
tgtcagcatg atgacaccac ttccatacat gaaccatctc ccagagaacc attacttcct 1320
aagccttaca gtcgttatca gtataataca cctatttact acatgcgtcc ctcaacacaa 1380
ccactcaacc catttccctt acctaaaccg tgtcctccac ccaaaccatg tccgccaccc 1440
aaaccatgtc ctccacctaa accatgtcct tcagctgaat cctattctcc acccaaacca 1500
ctacctagta tcccgctact acccaatatc ccgccattat ctacccaaaa tatttcgctt 1560
attcacgtag atagaattat t 1581

Claims (8)

1.一种表达非洲猪瘟病毒EP153R-EP402R蛋白的重组腺病毒载体，其特征在于，以pAD-CMV-3×FLAG腺病毒载体为基础，引入EP153R-EP402R基因以构建重组腺病毒载体pAD-CMV-EGFP-EP153R-EP402R；所述EP153R-EP402R基因具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。
2.一种权利要求1所述的表达非洲猪瘟病毒EP153R-EP402R蛋白的重组腺病毒载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)合成EP153R-EP402R基因，并在EP153R-EP402R基因的起始密码子前添加CACC四个碱基；
(2)将步骤(1)得到的EP153R-EP402R基因和pENTRE-EGFP-TOPO载体进行TOPO克隆，得到pENTR-EGFP-ASFV-EP153R-EP402R；
(3)将步骤(2)得到的pENTR-EGFP-ASFV-EP153R-EP402R通过LR重组反应于腺病毒骨架载体pAD-CMV-3×FLAG进行重组，得到重组腺病毒载体pAD-CMV-EGFP-EP153R-EP402R。
3.一种重组腺病毒包装方法，其特征在于，将权利要求1所述的重组腺病毒载体pAD-CMV-EGFP-EP153R-EP402R用PacⅠ进行单酶切，线性化后的质粒用于转染；转染293t细胞，实现重组腺病毒包装。
4.根据权利要求3所述的重组腺病毒包装方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将重组腺病毒载体pAD-CMV-EGFP-EP153R-EP402R用限制性内切酶PacⅠ进行单酶切，线性化后的质粒用于转染AD293细胞；
(2)转染后至细胞脱落、变圆且间隙变大时，收集细胞及上清，即为P1代重组腺病毒；
(3)P1代重组腺病毒感染293t细胞，观察细胞状态。
5.根据权利要求4所述的重组腺病毒包装方法，其特征在于，所述转染AD293细胞采用的转染试剂为ietPRIME kit转染试剂。
6.根据权利要求4所述的重组腺病毒包装方法，其特征在于，在步骤(2)中，收集细胞及上清后，置于-80℃反复冻融3次，12000×g离心10min，收集上清。
7.权利要求3-6所述的重组腺病毒包装方法制备得到的重组腺病毒。
8.包含权利要求7所述的重组腺病毒的疫苗。
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