RU2750882C1 - Гены, кодирующие открытые рамки считывания М и L-сегментов ККГЛ, и рекомбинантные конструкции, обеспечивающие экспрессию структурных гликопротеинов и РНК-зависимой РНК-полимеразы (L) вируса Крым-Конго геморрагической лихорадки - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к биотехнологии. Описан ген, кодирующий РНК-зависимую РНК-полимеразу вируса ККГЛ, имеющий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1 длиной 11838 п.н. Также описана рекомбинантная плазмида pSB3delta-RdRp, предназначенная для интеграции и экспрессии гена РНК-зависимой РНК-полимеразы вируса ККГЛ, имеет размер 18270 п.н. и содержит в соответствии с физической и генетической картой целевой ген, кодирующий РНК-зависимую РНК-полимеразу вируса ККГЛ, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2 длиной 3945 а.к.о., и состоит из следующих элементов: ген β-лактамазы (координаты с 17218 по 18078 п.н.) под контролем промотора (координаты с 18079 по 18183 п.н.), в качестве генетического маркера, определяющего устойчивость к ампициллину клеток бактерии E.coli; точка начала репликации ori плазмидного вектора pUC (координаты с 16459 по 17047 п.н.); 5'-ITR и 3'-ITR инвертированные повторы, имеющие координаты с 17 по 288 п.н. и с 15990 по 16214 п.н. соответственно, обеспечивают интеграцию участка плазмиды, заключенного между ними, в геном клеток млекопитающих при помощи транспозазы Sleeping Beauty (SB); промотор и энхансер CMV - обеспечивает экспрессию гена по п. 1 в клетках млекопитающих (координаты с 855 по 1438 п.н.); chimeric intron - химерный интрон, обеспечивающий эффективную транскрипцию, стабильность и транспорт транскрипта из ядра клетки (координаты с 1574 по 1706 п.н.); Т7 promoter - нуклеотидная последовательность промотора бактериофага Т7, необходимая для in vitro транскрипции (координаты с 1751 по 1769 п.н.); L protein (RdRp) - открытая рамка считывания гена РНК-зависимой РНК-полимеразы вируса ККГЛ по п. 1 (координаты с 1783 по 13620 п.н.); IRES2 - внутренний сайт посадки рибосом вируса энцефаломиелита, обеспечивающий экспрессию гена устойчивости к пуромицину (координаты с 13854 по 14240 п.н.); PuroR - ген устойчивости к пуромицину, кодирующий N-ацетил трансферазу (координаты с 14241 по 14843 п.н.); bGH poly(A) signal - сигнал полиаденелирования (координаты с 14874 по 15098 п.н.). Изобретение расширяет арсенал средств для борьбы с ККГЛ. 2 н.п. ф-лы, 8 ил., 4 табл., 3 пр.

Description

Изобретение относится к гену, кодирующему РНК-зависимую РНК-полимеразу (L) вируса Крым-Конго геморрагической лихорадки и рекомбинантной плазмиде, обеспечивающей экспрессию указанного гена за счет цитомегаловирусного (CMV) промотора, а также их интеграцию в геном клеток млекопитающих за счет инвертированных повторов, фланкирующих последовательность гена интереса, промоторных элементов и селективного маркера, и может быть использовано в биотехнологии, молекулярной биологии, генетической инженерии и медицине.

Геморрагическая лихорадка Крым-Конго - это особо опасное природно-очаговое трансмиссивное заболевание, вызываемое вирусом Крымско-Конго геморрагической лихорадки (ККГЛ), одно из широко распространенных в мире арбовирусных инфекций, также является рекуррентной инфекцией, эндемичной для юга Европейской части России. Вирус ККГЛ относится к семейству Nairoviridae, порядку Bunyavirales. Геном вируса ККГЛ состоит из трех сегментов: малого (S), среднего (М) и большого (L), представленных одноцепочечной РНК отрицательной полярности [1].

Переносчиками вируса являются иксодовые клещи рода Hyalomma, а хозяевами и резервуаром в природе дикие млекопитающие. Ареал распространения вируса ККГЛ, практически совпадает с ареалом распространения клещей рода Hyalomma и охватывает Африку и южную часть Евразии. Для более чем 30 стран была выявлена заболеваемость ККГЛ или же показано наличие вируса ККГЛ в клещах [10].

На данный момент не существует одобренной вакцины, однако имеется множество вакцинных препаратов, которые включают в себя субъединичные антигены, генетически модифицированные растения, вирусные векторы и ДНК-вакцины, экспрессирующие антигены ККГЛ, вирусоподобные частицы (VLP), препараты матричной РНК (мРНК) и инактивированные вирусные частицы [7].

Известно решение по патенту (WO 2020123989, МПК А61К 39/12, опубл. 18.06.2020 г.) [11], где был предложен вариант репликонных вирусных частиц, содержащих все вирусные белки, S- и L-сегменты генома, но не содержащих полноразмерного М-сегмента. Получение вирусных частиц на культуре клеток достигалось путем трансфекции плазмидами pCAGGS, содержащие все три рамки считывания, и минигеномными плазмидами рТ7, содержащие полноразмерные S- и L-сегменты. Для увеличения титра, авторы дополнительно размножали репликонные вирусные частицы, на клеточной культуре Huh7, трансфицированной также pCAGGS-GPC-Oman.

Наиболее близким аналогом (прототипом) является решение по патенту (US 9109199, МПК А61К 39/12, опубл. 18.08.2015 г.) [12], где описан способ получения репликонных частиц буньявирусов, включая вирус лихорадки долины Рифт и ККГЛ, путем транс-комплементации структурных гликопротеинов Gc и Gn как в присутствии, так и в отсутствии кодирующих областей NSm. Транс-комплементация достигалась путем транзиентной экспрессии полноценных вирусных гликопротеинов в клеточной культуре BHK-21 плазмидой pCAGGS, кодирующей открытую рамку считывания М-сегмента вируса ККГЛ или же путем использования вирусного вектора, кодирующего открытую рамку считывания М-сегмента вируса ККГЛ. В патенте раскрывается подход дизайна репликонных частиц буньявирусов с целью изучения иммунного ответа, разработки средств диагностики буньявирусных инфекций, а также изучения свойств вирусов за пределами помещений класса BSL-4.

Недостатками вышеперечисленных решений является использование дополнительных плазмид или вирусного вектора, которые бы обеспечивали продукцию вирусных гликопротеинов, что может повлечь снижение титра репликонных частиц, а также потерю способности клеточной линии к экспрессии гликопротеинов. Дополнительно, при исключении из вирусной частицы М-сегмента, происходит снижение Т-клеточного ответа, поскольку не обеспечивается внутриклеточный синтез основного структурного антигена. Кроме того, это решение не является технологичным для серийного производства вакцинных препаратов, поскольку при пассировании суспензионных клеточных культур необходима их постоянная трансфекция экспрессионной плазмидой, кодирующей вирусные гликопротеины.

Таким образом, в уровне техники существует потребность в разработке новых подходов, обеспечивающих более стабильную экспрессию вирусных генов и их использовании для разработки кандидатных вакцинных препаратов.

Раскрытие изобретения

Техническим результатом заявленного изобретения является создание рекомбинантной плазмиды, обеспечивающей интеграцию и стабильную экспрессию РНК-зависимой РНК-полимеразы вируса Крым-Конго геморрагической лихорадки и не имеющих недостатков выше приведенных аналогов и прототипа.

Указанный технический результат достигается путем создания гена, кодирующего открытую рамку считывания L-сегмента вируса ККГЛ, который представлен последовательностью SEQ ID NO: 1 длиной 11838 п. н.

Указанный технический результат также достигается созданием рекомбинантной плазмиды pSB3delta-RdRp, которая имеет размер 18270 п.н. и содержит в соответствии с физической и генетической картой, представленной на фиг. 4 целевой ген, кодирующий РНК-зависимую РНК-полимеразу вируса ККГЛ, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2 длиной 3945 а.к.о., и состоит из следующих элементов:

• ген β-лактамазы (координаты с 17218 по 18078 п.н.) под контролем промотора (координаты с 18079 по 18183 п.н.), в качестве генетического маркера, определяющего устойчивость к ампициллину клеток бактерии E. coli;

• точка начала репликации ori плазмидного вектора pUC (координаты с 16459 по 17047 п. н.);

• 5'-ITR и 3'-ITR инвертированные повторы, имеющие координаты с 17 по 241 п.н. и с 15990 по 16214 п.н. соответственно, обеспечивают интеграцию участка плазмиды, заключенного между ними, в геном клеток млекопитающих при помощи транспозазы Sleeping Beauty (SB);

• промотор и энхансер цитомегаловируса человека (CMV) -обеспечивает экспрессию гена по п. 1 в клетках млекопитающих (координаты с 855 по 1438 п.н.);

• chimeric intron - химерный интрон, обеспечивающий эффективную транскрипцию, стабильность и транспорт транскрипта из ядра клетки (координаты с 1574 по 1706 п.н.);

• Т7 promoter - нуклеотидная последовательность промотора бактериофага Т7, необходимая для in vitro транскрипции (координаты с 1751 по 1769 п.н.);

• L protein (RdRp) - открытая рамка считывания гена РНК-зависимой РНК-полимеразы вируса ККГЛ (координаты с 1783 по 13620 п.н.);

• IRES2 - внутренний сайт посадки рибосом вируса энцефаломиелита, обеспечивающий экспрессию гена устойчивости к пуромицину (координаты с 13854 по 14240 п. н.);

• PuroR - ген устойчивости к пуромицину, кодирующий N-ацетил трансферазу (координаты с 14241 по 14843 п. н.);

• bGH poly(A) signal - сигнал полиаденелирования (координаты с 14874 по 15098 п.н.).

Существенными отличиями от прототипа, обеспечивающими достижение технического результата, являются:

1. Промоторный IE-элемент цитомегаловируса (CMV) человека необходим для получения стабильно экспрессирующих линий клеток;

2. Полученная рекомбинантная плазмида является интеграционным вектором, который содержит в своем составе ITRs, фланкирующую последовательность гена интереса, промоторных элементов и селективного маркера. Данная последовательность ITRs узнается транспозазой Sleeping Beauty (SB), с помощью которой происходит интеграция в геном клетки;

3. Ген устойчивости к антибиотику пуромицину позволяет проводить селекцию стабильно экспрессирующих клеточных трансформантов;

4. Вирусный ген РНК-зависимой РНК-полимеразы был получен из эпидемиологически значимого штамма вируса ККГЛ.

Сущность заявленного изобретения поясняется чертежами. На фиг. 1 обозначена схема амплификации открытой рамки считывания L-сегмента вируса ККГЛ. На фиг. 2 представлена электрофореграмма в 1.5% агарозном геле фрагментов открытых рамок считывания М- и L-сегментов вируса ККГЛ, амплифицированных на матрице кДНК. На фиг. 3 изображена электрофореграмма в 1.5% агарозном геле продуктов overlap extension ПЦР, полученных путем объединения ампликонов, где М - ДНК-маркер 1 Kb М12 (СибЭнзим, Россия), GPC - открытая рамка считывания М-сегмента, RdRp -открытая рамка считывания L-сегмента. На фиг. 4 изображена схема конструкции рекомбинантной плазмиды pSB3delta-RdRp. На фиг. 5 представлена электрофореграмма в 1% агарозном геле фрагментов ДНК после гидролиза плазмид pSB3delta-GPC и pSB3delta-RdRp эндонуклеазами рестрикции XhoI и MluI, где М - ДНК-маркер 1 Kb M12 (СибЭнзим, Россия), GPC - ДНК pSB3delta-GPC, гидролизованная ферментами XhoI - MluI, RdRp - ДНК pSB3delta-RdRp, гидролизованная ферментами XhoI - MluI. На фиг. 6 показаны монослои клеточной линии ВНК-21/13, не подвергавшиеся трансфекции, без добавления (А) и с добавлением (Б) пуромицина с концентрацией 4 мкг/мл. На фиг. 7 показаны популяции клеточных линий ВНК-21/13 через двое (А), через пять (Б) суток и через семь (В) суток после трансфекции плазмидами pSB100X и pSB3delta-RdRp. На фиг. 8 показано электрофоретическое разделение продуктов амплификации внутреннего участка L-сегмента вируса ККГЛ, где М - маркер длин ДНК 1 kb M12 (СибЭнзим, Россия); 1-6 - ампликоны, полученные с использованием раствора выделенных РНК/ДНК с концентрацией ДНК от 0,0625 нг до 50 нг; 7-12 - ампликоны, полученные с использованием образца после обратной транскрипции с концентрацией ДНК от 0,0625 нг до 50 нг; К- - образец отрицательного контроля, содержащий ПЦР-смесь без ДНК-матрицы.

Осуществление изобретения. Первым этапом создания целевых плазмид стал выбор способа экспрессии целевых генов в клеточных культурах. Для этого была выбрана система транспозонов Sleeping Beauty, которая позволяет высокоэффективно осуществляет встройку в геном фрагментов ДНК различной длины, ограниченных опознаваемыми особыми последовательностями - так называемыми инвертированными концевыми повторами (англ. ITR, inverted terminal repeats). Кассета, предназначенная для встройки в геном и ограниченная ITR, доставляется в клетку в составе плазмидного вектора. При одновременной доставке вектора и осуществляющейся в клетке экспрессии транспозазы, кассета вырезается из вектора и встраивается в произвольное место в геноме клетки-хозяина. Таким образом, высокоэффективно осуществляется стабильная трансфекция клеточных культур [8]. Использование клеточных линий, стабильно экспрессирующих вирусные белки, может стать преимуществом при разработке кандидатных ДНК-вакцин и VLP против вируса ККГЛ и других вирусов порядка Bunyavirales.

В качестве целевого гена были выбраны участки, кодирующие РНК-зависимую РНК-полимеразу вируса ККГЛ (открытая рамка считывания L-сегмента). Такой выбор обусловлен тем, что ген кодирует вирусную РНК-зависимую РНК-полимеразу, которая необходима для репликации вирусной РНК и обеспечения ее ассоциации в RNP-комплексы [6].

Таким образом, данное изобретение может быть использовано для создания принципиально новой системы репликонов, где транскомплементация будет осуществляться при помощи интеграционной плазмиды, кодирующей ген РНК-зависимой РНК-полимеразы.

Пример 1. Получение кДНК копий L-сегментов вируса ККГЛ

Подбор праймеров (Таблица 1) осуществляли с помощью ПО SnapGene v.3.2.1 и Oligo7, используя в качестве референса последовательности М- и L-сегмента вируса ККГЛ изолят Ast199 (последовательности GenBank: КХ056051, КХ056050). Синтез олигонуклеотидных праймеров был проведен биотехнологической компанией «Евроген» (г. Москва). Сайты рестрикции в олигонуклеотидах обозначены подчеркиванием и полужирным шрифтом.

1.1. Выделение вирусной РНК и постановка реакции обратной транскрипции

Выделение тотальной РНК проводили из вируссодержащего материала (инфицированный монослой культуры клеток Vero в лизирующем буфере AVL). Для выделения использовали коммерческий набор QIAamp Viral RNA Mini Kit (Qiagen, Германия) в соответствии рекомендациями производителя. Элюат хранили при минус 20°С; в следующем этапе работы использовали его для постановки обратной транскрипции.

Для получения первой цепи ДНК на матрице вирусной геномной РНК использовали набор RNAscribe RT (Biolabmix, Россия). Для проведения реакции пробирку с смесью необходимых компонентов помещали в амплификатор Thermal Cycler С1000 (BioRad, США) и использовали рекомендуемый производителем температурно-временной профиль.

1.2. Амплификация методом ПЦР кДНК фрагментов, кодирующих РНК-зависимую РНК-полимеразу вируса ККГЛ

Методом ПЦР с использованием специфических праймеров (Таблица 1) были амплифицированы участки, согласно Фиг. 1. Для амплификации использовали высокоточную полимеразу Phusion High-Fidelity (NEB, США), постановку реакции осуществляли согласно рекомендациям производителя. Реакцию для каждого фрагмента проводили в двух повторах с использованием амплификатора Thermal Cycler С1000 с заданным температурно-временным профилем (Таблица 2)

1.3. Выделение ДНК из агарозного геля

После проведения ПЦР, очистку продуктов амплификации ДНК проводили методом электрофореза в 1.5% агарозном геле в трис-ацетатном буфере (ТАЕ×1), окрашивали раствором бромистого этидия в течение 10 мин и проявляли с использованием УФ-трансиллюминатора «UV Transilluminator 2000» (Bio-Rad, США). После визуализации под УФ-излучением фрагменты ДНК необходимой длины, разделенные в агарозном геле (фиг. 2) вырезали и выделяли из геля при помощи набора QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, Германия) в соответствии с рекомендациями производителя.

1.4. Объединение фрагментов при помощи overlap-extension ПЦР

Концентрацию выделенных ДНК фрагментов измеряли при помощи NanoDrop One (Thermo Scientific, США). После чего, фрагменты смешивали в эквимолярных количествах и осуществляли первый этап (overlap) синтеза кДНК копий, кодирующих ORF L-сегментов с помощью полимеразы Phusion High-Fidelity (NEB, США), используя температурно-временной профиль, представленный в Таблице 3. Второй этап (extension) осуществляли при помощи концевых праймеров, содержащих сайты рестрикции SmaI и MluI (Таблица 1) с заданным температурно-временным профилем (Таблица 4).

Очистку продуктов амплификации ДНК при помощи электрофореза в агарозном геле осуществляли способом, описанным ранее. После визуализации под УФ-излучением фрагменты ДНК необходимой длины, разделенные в агарозном геле (фиг. 3), вырезали и выделяли из геля аналогичным образом.

Пример 2 Получение интеграционной конструкции pSB3delta-RdRp, несущей открытую рамку считывания L-сегмента вируса ККГЛ 2.1. Клонирование ПЦР продуктов, несущих открытую рамку считывания L-сегмента вируса ККГЛ в плазмиду pSB3delta

Для клонирования гена РНК-зависимой РНК-полимеразы в вектор pSB3delta осуществляли ферментативный гидролиз плазмидного вектора и ПЦР продуктов с помощью эндонуклеаз рестрикции SmaI и MluI (NEB, США) с прилагаемыми к ним буферами. Реакционную смесь готовили в соответствии с активностью фермента и концентрацией ДНК. Условия реакции и длительность проведения ферментативного гидролиза ДНК подбирали в соответствии с инструкциями производителя.

Обработанные ферментами ПЦР продукты и вектор pSB3delta разделяли с помощью электрофореза в 1.5% агарозном геле с последующим выделением с помощью набора QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, Германия) в соответствии с рекомендациями производителя.

Реакцию лигирования проводили 30 минут при 22°С, используя смесь каждого из ПЦР продуктов, векторной плазмиды pSB3delta в эквимолярных количествах и ДНК-лигазы фага Т4 (ThermoFisher, США) в прилагаемом к коммерческому набору реакционном буфере. Полученную ДНК-конструкцию pSB3delta-RdRp (фиг. 4) использовали для трансформации культуры компетентных клеток E. coli штамм NEB Stable (NEB, США). Трансформанты были отобраны с помощью стандартной процедуры ПЦР-скрининга на внутренний участок каждой из вставок.

2.2. Получение плазмидной конструкции pSB3delta-RdRp и подтверждение их структуры при помощи рестрикционного анализа. С помощью бактериологической петли колонию с чашки Петри переносили в пробирку, содержащую 3,5 мл жидкой питательной среды SOB с селективным антибиотиком ампициллином (100 мкг/мл). Далее пробирки помещали в шейкер-инкубатор на 16-18 часов при 170 об/мин, 30°С. Полученную бактериальную суспензию использовали для выделения плазмидной ДНК при помощи набора QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen, Германия) в соответствии с рекомендациями производителя.

Для подтверждения структуры полученных плазмидных конструкций был проведен гидролиз плазмидной конструкции pSB3delta-RdRp с помощью эндонуклеаз рестрикции XhoI и MluI. Согласно теоретически рассчитанной последовательности при гидролизе плазмиды pSB3delta-RdRp должны появится фрагменты длиной 12799 п. н. и 5471 п. н.

На фиг. 5 представлена электрофореграмма фрагментов ДНК после гидролиза плазмид pSB3delta-GPC и pSB3delta-RdRp эндонуклеазами рестрикции XhoI и MluI в 1% агарозном геле, где:

М - ДНК-маркер 1 Kb М12 (СибЭнзим, Россия)

GPC - ДНК pSB3delta-GPC, гидролизованная ферментами XhoI - MluI

RdRp - ДНК pSB3delta-RdRp, гидролизованная ферментами XhoI - MluI

Из данных, представленных на фиг. 5 видно, что подвижность фрагментов гидролизата плазмид pSB3delta-GPC и pSB3delta-RdRp в 1% агарозном геле относительно маркеров молекулярной массы соответствует подвижности теоретически рассчитанных фрагментов.

2.3. Подтверждение структуры плазмид секвенированием по Сэнгеру Для подтверждения корректной нуклеотидной последовательности полученных образцов использовали метод секвенирования по Сэнгеру. Для постановки реакции использовали набор BrilliantDye Terminator (v3.1) Cycle Sequencing kit (Nimagen, Нидерланды), очищали образцы через Sephadex G-50 Superfine (Cytiva, Швеция) колоночным методом согласно рекомендациям производителя, после чего передавали для проведения капиллярного гель-электрофореза на автоматическом секвенаторе 3500x1 Applied Biosystems (США). Полученные хроматограммы анализировали с использованием программного обеспечения SnapGene 3.2.1.

Пример 3. Липофекция клеточной линии ВНК-21/13 плазмидой pSB100X/pSB3delta-RdRp и подтверждение экспрессии гена РНК-зависимой РНК-полимеразы. Для создания линий клеток, стабильно экспрессирующих ген РНК-зависимой РНК-полимеразы вируса ККГЛ, была выбрана перевиваемая клеточная линия ВНК-21/13. Для липофекции использовали набор Lipofectamine 3000 (Thermo Fisher Scientific, США). Количество взятой для трансфекции плазмидной ДНК в сумме составляло 3 мкг для одной лунки, с соотношением 1 часть плазмиды pSB100X к 9 частям плазмиды pSB3delta-RdRp. Смесь для липофекции готовили согласно рекомендациям производителя. Перед проведением трансфекции делали рассев клеток на культуральном 6-луночном планшете по 2 мл клеточной суспензии с концентрацией 100 тыс. клеток/мл на лунку в питательной ростовой среде DMEM/F-12 с 7%-содержанием фетальной бычьей сыворотки. Планшет инкубировали до получения монослоя клеток с конфлюентностью в 70-90%.

В культуральном 6-луночном планшете, содержащем монослой клеточной линии, делали замену питательной среды DMEM/F-12 на среду с пониженным содержанием сыворотки OptiMEM (2 мл на лунку), после чего вносили по 250 мкл полученной смеси ДНК-липидного комплекса в 3 лунки, распределяя смесь по всей поверхности. В качестве контроля оставляли 3 лунки с монослоем клеток без добавления ДНК-липидного комплекса. После инкубации в течение двух суток при 37°С в СО₂-инкубаторе заменяли кондиционированную питательную среду с пониженным содержанием сыворотки OptiMEM на среду DMEM/F-12 с добавлением селективного антибиотика пуромицина с концентрацией 5 мкг/мл. В одну из трех лунок с монослоем клеток, которые не подвергались трансфекции, вносили питательную среду без добавления антибиотика для наблюдения состояния клеточной популяции (фиг. 6). Далее проводили инкубацию при 37°С в CO₂-инкубаторе со сменой питательной среды каждые 2-3 дня до получения монослоя трансфицированных клеток с конфлюентностью 70-90% (фиг. 7).

Для подтверждения экспрессии гена РНК-зависимой РНК-полимеразы вируса ККГЛ проводили выделение РНК и ДНК из суспензии клеток трансгенной линии BHK-21/13 с помощью набор реагентов «РИБО-преп» (Helicon, Россия). Часть раствора очищенных РНК/ДНК гидролизовали ДНКазой I (NEB, США), свободной от РНКаз, и использовали для получения кДНК методом обратной транскрипции с олигонуклеотидными праймерами F-CCHFV_L_inner и R-CCHFV_L_inner (Таблица 1), соответствующими внутреннему участку L-сегмента (размер 2215 п. н.). Количество ДНК в растворе выделенных РНК/ДНК и образце после обратной транскрипции измеряли на спектрофотометре NanoDrop One (Thermo Scientific, США) и проводили ПЦР с 6 точками 10-кратного разбавления 50 нг ДНК, содержащейся в растворе очищенных РНК/ДНК и в образце с кДНК. По результатам электрофоретического разделения в агарозном геле продуктов амплификации фрагмента можно сделать вывод, что используемые для выделения РНК и ДНК клетки трансгенной линии BHK-21/13 содержали в геноме последовательность гена РНК-зависимой РНК-полимеразы вируса ККГЛ. Присутствие РНК в количестве, достаточном для успешной постановки обратной транскрипции со специфическими олигонуклеотидными праймерами, предполагает стабильную экспрессию данного гена в полученной линии клеток (фиг. 8), что подтверждает заявляемый технический результат.

Источники патентной и научно-технической информации:

1. Fields, Bernard N; Knipe, David M; Howley P.M. Fields virology 6th ed. (2013) // Book. 2013. C. 2664.

2. Goedhals D., Paweska J. Т., Burt F.J. Long-lived CD8+T cell responses following Crimean-Congo haemorrhagic fever virus infection // PLoS Neglected Tropical Diseases. 2017. №12 (11). C. e0006149.

3. Hinkula J. [и др.]. Immunization with DNA Plasmids Coding for Crimean-Congo Hemorrhagic Fever Virus Capsid and Envelope Proteins and/or Virus-Like Particles Induces Protection and Survival in Challenged Mice // Journal of Virology. 2017. №10 (91).

4. Rodriguez S. E. [и др.]. Vesicular Stomatitis Virus-Based Vaccine Protects Mice against Crimean-Congo Hemorrhagic Fever // Scientific Reports. 2019. №1 (9). C. 1-13.

5. Spengler J.R. [и др.]. Heterologous protection against Crimean-Congo hemorrhagic fever in mice after a single dose of replicon particle vaccine // Antiviral Research. 2019. (170). C. 104573.

6. Sun Y. [и др.]. Bunyavirales ribonucleoproteins: the viral replication and transcription machinery // Critical Reviews in Microbiology. 2018. №5 (44). C. 522-540.

7. Tipih Т., Burt F.J. Crimean-congo hemorrhagic fever virus: Advances in vaccine development // BioResearch Open Access. 2020. №1 (9). C. 137-150.

8. Tschorn N., Berg K., Stitz J. Transposon vector-mediated stable gene transfer for the accelerated establishment of recombinant mammalian cell pools allowing for high-yield production of biologies // Biotechnology Letters. 2020. №7 (42). C. 1103-1112.

9. Zhang J. [и др.]. Fine mapping epitope on glycoprotein Gc from Crimean-Congo hemorrhagic fever virus // Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases. 2019. (67). C. 24-31.

10. Куличенко A.H. [и др.]. Крымская геморрагическая лихорадка в Евразии в XXI веке: эпидемиологические аспекты // Эпидемиол. и инф. бол. Акт. вопр. 2012. (3). С. 42-53.

11. WO 2020123989, МПК А61К 39/12, опубл. 18.06.2020 г. (аналог).

12. US 9109199, МПК А61К 39/12, опубл. 18.08.2015 г. (прототип).

--->

Перечень последовательностей

<110> Федеральное бюджетное учреждение науки «Государственный научный

центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору

в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

(ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора)

<120> Ген, кодирующий открытую рамку считывания L-сегмента ККГЛ, и

рекомбинантная конструкция, обеспечивающая экспрессию

РНК-зависимой РНК-полимеразы (L) вируса Крым-Конго геморрагической лихорадки.

<160> 2

<210> SEQ ID NO:1

<211> 11838 п.н.

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Нуклеотидная последовательность искусственного гена, кодирующего

РНК-зависимую РНК-полимеразу вируса ККГЛ.

<400> 1

ATGGACTTCT TGAGGAACCT TGATTGGACT CAGGTGATTG CTGGTCAATA TGTGACCAAC 60

CCTAGGTTCA ATATCTCCGA TTACTTCGAG ATTGTGCGGC AGCCTGGTGA TGGGAACTGC 120

TTCTACCACA GCATAGCTGA GCTAACCATG CCCAACAAAA CAGCCCACTC ATATCACAAC 180

ATCAAACATC TGACCGAGTT GGCAGCAAGG AAGTATTACC AAGAGGAGCC TGAGGCTAAG 240

CTTGTTGGCC TGAGTTTGGA AGATTACCTT AAGAGGATGC TGTCTGACAA CGAGTGGGGG 300

TCAACTCTTG AGGCATCCAT GCTGGCCAAA GAAATGGGCA TTACAATAAT CATTTGGACT 360

GTTGCTGCCA GTGATGAAGT GGAGGCAGGC ATAAAATTCG GAGACGGTGA TGTGTTTACA 420

GCTGTGAACC TTCTGCACTC TGGGCAAACA CATTTTGATG CTCTTAGAAT ACTGCCACAG 480

TTTGAAACAG ACACGAGGGA GGCCTTGAGT TTGGTAGATA AGGTTATAGC TGTGGATCAG 540

TTGACATCAT CCTCTAGTGA TGAGCTGCAA GACTATGAAG ATCTTGCTTT AGCACTCACA 600

AGTGTGGAAG AACCGTATAG GCGGTCAAGC TTGGATGAAG TCACTCTGTC CAGGAAACAA 660

GCAGAGCTAT TGAGGCAGAA GGCATCTCAG TTGTCTAAAT TGGTCAACAA AAGTCAGAAC 720

ATACCGACTA GAGTCGGCAG GGTCTTGGAC TGCATGTTTA ACTGCAAACT ATGTGTTGAG 780

ATATCAGCTG ACACTTTAAT TCTAAGACCA GAATCCAAAG AGAGAATTGG CGAAGTCATG 840

TCATTGCGGC AGCTAGGGCA CAAATTGCTG ACACGAGACA AACAAATCAA GCAGGAATTC 900

TCTAGAATGA AACTTTATGT TACCAAAGAT TTGCTGGACC ATCTAGATGT TGGTGGGCTG 960

TTGAGGGCTG CCTTCCCTGG AACAGGAATA GAAAGGCATA TACAGCTGCT ACACTCTGAG 1020

ATGATACTGG ACATCTGTAC TGTGTCACTT GGCATCATGT TGTCAACATT CTTGTACGGC 1080

TCTAACAATA AGAACAAGAA AAAGTTCATT ACTAACTGTC TGCTCAGTAC AGCTCTGTCT 1140

GGAAAGAAGG TGTACAAGGT TCTCGGCAAC CTAGGAAATG AACTGTTGTA TAAGGCACCC 1200

AGAAAGGCCT TAGCAACTGT CTGTAGTGCC TTATTTGGGA AGCAGATAAA CAAGCTTCAG 1260

AACTGCTTTA GAACCATAAG CCCTGTTAGC TTACTTGCAT TAAGAAATCT GGATTTTGAC 1320

TGTCTAAGTG TACAGGACTA TAGTGGCATG ATAGAAAGTA TGTCCAAATT GGATAACACT 1380

GATGTTGAAT TCAATCACAG GGAGATAGCT GATCTCAATC AATTAACTTC CCGGCTCATT 1440

ACATTAAGAA AAGAGAAAGA CACTGACCTC CTTAAACAAT GGTTTCCTGA GAGTGACCTC 1500

ACCCGCAGAA GCACCAGGAA TATCGCAAAC GCAGAGGAAT TTATCATATC TGAGTTCTTC 1560

AAAAAGAAGG ATATCATGAA ATTCATCAGC ACCTCAGGAA GGGCAATGAG TGCAGGCAAG 1620

ATTGGTAACG TCCTTTCCTA CGCACATAAC CTTTACTTGA GTAAGTCTAG TTTAAATATG 1680

ACCTCTGAGG ACATATCACA GCTTCTGATC GAGATCAAGA GATTGTATGC TCTTCAAGAA 1740

GATTCTGAAG TAGAGCCGAT AGCTATAATT TGTGATGGCA TAGAAAGCAA TATGAAACAG 1800

TTGTTTGCTA TACTGCCTCC TGACTGTGCA AGAGAGTGTG AGGTCCTCTT TGATGACATA 1860

AGAAACTCTC CAACGCACAG TACAGCCTGG AAACATGCCC TTCGGTTAAA AGGGACCGCA 1920

TATGAGGGTC TGTTTGCAAA CTGCTACGGA TGGCAATACA TTCCAGAAGA TATCAAACCA 1980

AGCCTGACCA TGTTGATACA GACTTTGTTT CCTGACAAGT TTGAAGATTT CTTAGATCGA 2040

ACCCAGTTGC ATCCAGAGTT CAGAGATTTA ACTCCTGACT TTTCGCTTAC ACAAAAGGTT 2100

CATTTCAAAA GAAATCAGAT ACCTAGTGTT GAAAATGTGC AAATCTCCAT TGATGTAACA 2160

CTGCCTGAAT CTGTGGAGGC AGTGCCGGTG ACAGAAAGAA AAATGTTCCC TCTGCCTGAA 2220

ACTCCACTGA GTGAGGTGCA TTCAATAGAG CGCATTATGG AAAATTTTTC CCGCCTTATG 2280

CATGGTGGAA GACTTTCAGC CAAGGAAAAA GATGGAGATC TTGCAGAACA AGGCAACCAG 2340

CAAAGCGCCG TTGAACACGA GAGTCCAAGC ATCTCGGCCT TCAGGGACTA TGGAGAGAGA 2400

GGAATAGTTG AGGAGAATCA CATGAGGCTT AGTGAAGAAG ATCAGCTGGA AACAAGGCAG 2460

CTGCTGTTGG TAGAAGTTGG TTTTCAAACT GATATCGATG GGAAAATAAG GACAGACCAC 2520

AAGAAATGGA AGGATATTTT AAAGCTGTTA GAGTTGCTAG GAATCAAATG CTCTTTTATC 2580

GCCTGTGCCG ACTGCTCGTC TACACCGCCA GATAGATGGT GGATTACGGA GGACAGAGTA 2640

CGAGTCTTAA AGAATTCAGT CAGTTTCCTC TTTAATAAAC TCTCTAGGAA CTCACCTACA 2700

GAGGTAACTG ACATAGTTGT TGGAGCTATA AGTACTCAAA AGGTTAGGAG TTACCTAAAG 2760

GCAGGAACTG CAACAAAAAC CCCTGTGTCG ACAAAAGACG TTCTGGAGAC TTGGGAAAAA 2820

ATGAAAGAGC ACATACTAAA TAGGCCAACA GGATTAACAC TGCCTGCCAG TTTGGAACAG 2880

GCTATGCGCA AAGGACTGGT TGAAGGTGTG GTTATCTCCA AGGAAGGTTC TGAATCATGC 2940

ATCAACATGT TGAAAGAAAA TTTGGATCGA ATAACTGATG AATTCGAGCG AACAAAATTT 3000

AAACATGAAC TAACTCAGAA TGTTACTACT AGTGAAAAAT TGCTGTTTAG CTGGTTGAGT 3060

GAAGATATCA AATCATCGAG ATGCACTGAG TGCCTCACCA ACATAAAGAA AGCCGTTGAC 3120

GAGACTGCCA ACTTGTCTGA GAAGATTGAG CTGCTTGCAT ATAATCTTCA ACTCGTTAGT 3180

CATTGCAGCA ACTGTCACCC CAATGGTGTG AGTATTAGCA ACACATCTAA TGTATGCAAG 3240

AGGTGCCCTA AAATAGAAGT AGTTAGTCAT TGCGAAAATA AAGGCTTTGA GGACAGCAAT 3300

GAATGCTTAA CAGATCTAGA CAGGCTTGTT AGGCTCACAT TACCAGGAAA AACTGAGAAG 3360

GAGAGAAGAG TCAAACGCAA TGTGGAATAC CTTATAAAAC TGATGATGAG CATGTCAGGC 3420

ATTGATTGCA TAAAATATCC CACAGGACAG CTCATCACCC ATGGAAGGGT GAGTGCAAAA 3480

CATAACGATG GAAATTTGAA AGACAGGAGT GAGGACGATC AAAGGCTAGC CGAGAAGATA 3540

GACACTGTTA GGAAGGAGCT CTCAGAATCC AAACTAAAAG ATTATTCAAC TTATGCAAGA 3600

GGGGTGATAA CAAATTCACT AAAAAACCTC TCAAAGCAGG GTAAGTCAAA GTGTTCTGTG 3660

CCGAGGTCTT GGCTTGAAAA GATATTGTTT GACTTAAAGG TGCCCACTAA AGACGAGGAA 3720

GTGCTTATAA ACATTAGAAA CTCATTGAAA GCTAGATCTG AGTTTGTTAG AAACAACGAT 3780

AAACTACTCA TAAGGTCAAA AGAAGAGTTA AAAAAATGTT TTGATGTGCA ATCATTTAAA 3840

CTAATGAAAA ACAAGCAACC TGTGCCTTTT CAAGTTGACT GTATACTGTT TAAAGAAGTG 3900

GCAGCTGAGT GCATGAAGAG GTACATCGGC ACACCTTATG AAGGAATTAT CGACACCTTA 3960

GTTTCTCTGA TTAATGTTCT GACAAGGTTC ACCTGGTTTC AAGAGGTGGT GCTATATGGT 4020

AAAATATGTG AGACCTTTCT GAGATGTTGT ACAGAATTTA ATAGGTCAGG GGTTAAACTA 4080

GTCAAGGTAA GGCACTGTGA CATTAACCTA TCAGTCAAAT TGCCATCGAA CAAAAAAGAG 4140

AACATGTTAT GTTGTATATA CAGTGGCAAC ATGGAGCTCT TGCAAGGACC TTTCTATTTG 4200

AACAGGAGAC AAGCTGTCCT CGGTTCTTCA TACCTTTACA TTGTTATTAC ACTTTACATA 4260

CAAGTAATGC AGCAGTATAG GTGTCTAGAA GTTATAAACA GTGTAAATGA AAAAACATTG 4320

CAAGACATTG AAAATCACTC CATGACTTTG CTAGAAGATG CATTCAAGGA ACTCACTTTT 4380

GCTCTTGAGG GTAGGTTTGA AGAATCTTAC AAAATACGGA CCTCTAGGTG TAAAGCTAGC 4440

GGGAACTTCT TAAACAGAAG CAGTAGAGAC CACTTTATAA GCATTGTCTC AGGCTTGAAC 4500

CTGGTTTATG GCTTCCTCAT AAAAGATAAC TTATTGGCTA ATTCTCAGCA ACAGAATAAA 4560

CAACTACAAA TGCTTCGTTT TGGCATGCTT GCGGGGCTTA GTAGGCTTGT TTGCCCTAAT 4620

GAGCTAGGGA AAAAGTTTTC GACAAGTTGT AGAAGGATTG AAGACAACAT TGCAAGACTT 4680

TACCTACAAA CATCCATATA TTGTTCAGTC AGAGACGTGG AAGACAATAT TAAGCACTGG 4740

AAGCAAAGAG ATCTATGCCC TGAAGTGACC ATTCCATGCT TTACAGTCTA TGGCACCTTC 4800

ATCAACAGCG ACAGACAGCT TATCTTTGAC ATTTACAATG TGCATATATA CAATAAAGAA 4860

ATGGATAATT TTGACGAAGG ATGTATCAGC GTCTTAGAAG AAACAGCAGA AAGACATATG 4920

CTTTGGGAAC TCGATCTGAT GAACTCACTT TGCTCTGACG AAAAAAGAGA TGCTAGAACC 4980

GCAAGATTAT TACTAGGTTG CCCAAATGTG AGGAAAGCTG CAAACAAAGA AGGGAAAAAG 5040

CTATTGAAGT CAAACAGCGA CACATCCACT GATACACAAA GCATTACTTC CGAGGTGTCA 5100

GACAGAAGGT CCTACAGCTC AAGCAAGAGT AGAATCCGTA GTATTTTTGG TAGGTACAAC 5160

TCTCAGAAAA AACCATTTGA ATTAAGGTCA GGTCTCGAAG TCTTTAATGA CCCTTTCAAT 5220

GATTATCAGC AAGCAATAAC AGACATTTGT CAATTTTCTG AGTATACACC AAACAAGGAG 5280

AGCATTTTGA AGGACTGTCT TCAAATCATA CGGAAAAACC CTAGCCACAC AATGGGTTCT 5340

TTTGAGCTGA TCCAGGCAAT TTCAGAGTTC GGCATGAGTA AATTTCCTCC AGAGAACATA 5400

GACAAGGCAA GGAGAGACCC AAAGAACTGG GTCAGCATCT CTGAAGTTAC TGAAACAACA 5460

AGTATAGTAG CATCACCCAA AACTCATATG ATGCTCAAAG ATTGTTTTAA AATTATACTA 5520

GGTACTGAGA ATAAGAAGAT AGTTAAAATG CTTCGAGGGA AGCTAAAAAA ACTCGGCGCT 5580

ATCTCTACAA ACATAGAGAT TGGGAAAAGG GATTGCTTGG ATTTACTCAG CACGGTAGAT 5640

GGTCTGACAG ACCAACAGAA AGAAAACATT GTGAATGGGA TATTTGAGCC TTCAAAGCTG 5700

TCCTTCTATC ACTGGAAAGA GTTGATCAGA AAGAATATTG ATGAAGTTTT ACTTACCGAA 5760

GATGGAAATC TGATCTTCTG CTGGCTAAAG ACAATCTCTT CTTCAGTCAA AGGAAGTTTG 5820

AAGAAGAAAC TCAAGTTCAT GAATGTAAAT TCCCCGGAAC TGATGCCAGA GAACTGTCTC 5880

TTTTCTAGTG AAGAATTCAA TGAGTTGATC AAACTGAAGA AGCTTCTCCT CAACGAGCAA 5940

CAAGATGAAC AGGAGCTGAA ACAGGACCTT TTGATATCTT CTTGGATTAA GTGCATAACA 6000

GCCTGTAAAG ATTTTGCAAG CATCAATGAC AAGGTTCAGA AATTCATTTA CCACCTTTCT 6060

GAAGAGCTGT ATGACATAAG GCTACAGCAC CTGGAACTGT CAAAGCTTAA GCAAGAACAC 6120

CCTAGTGTCA GCTTCACTAA GGAAGAGGTC TTAATAAAGC GACTAGAGAA AATTTTCCTA 6180

AAGCAGCACA ATCTGGAAAT TATGGAGACA GTAAATCTTA TATTCTTTGC CGCTCTTTCA 6240

GCTCCCTGGT GCTTACACTA CAAAGCACTA GAGTCTTATC TAGTGAGACA TCCAGAGATA 6300

CTCGACTGTG GATCTAAAGA GGACTGTAAG CTCACTTTGC TTGATCTGTC AGTTTCTAAG 6360

CTCTTAGTCT GTTTGTATCG AAAAGATGAC AATGAACTAA CAAATAGCTC AAGTCTGAAA 6420

CTTGGGTTTC TAGTAAAGTA TGCTGTTACC TTATTCACAT CCAATGGTGA ACCTTTTTCG 6480

CTTAGCCTAA ATGATGGGGG TTTAGATCTT GACCTGCACA AGACTACTGA CGAAAAGCTA 6540

CTACATCAGA CAAAGATAGT TTTTGCTAAA ATTGGTCTGT CTGGAAATAG TTATGATTTC 6600

ATCTGGACTA CTCAAATGAT AGCAAATAGC AACTTTAATG TATGCAAGAG ATTGACTGGA 6660

AGGAGTACCG GAGAGAGGCT TCCAAGAAGT GTCAGAAGCA AGGTCATTTA TGAGATGGTA 6720

AAACTTGTAG GTGAGACAGG CATGGCAATA CTACAACAGT TAGCTTTTGC ACAGGCACTA 6780

AATTACGAAC ACCGTTTCTA TGCAGTCTTA GCACCTAAGG CACAGCTAGG AGGAGCAAGA 6840

GATCTGTTGG TGCAAGAAAC TGGGACTAAG GTTATGCATG CAACAACTGA AATGTTCAGT 6900

AGAAACCTCT TAAAAACAAC ATCAGATGAT GGCCTTACCA ACCCGCATCT TAAAGAAACA 6960

ATCCTTAATG TTGGATTAGA CTGCCTTACC AACATGCGAA ATCTTGATGG AAAGCCCATA 7020

AGTGAAGGTA GCAACTTGGT CAATTTCTAC AAAGTCATAT GTATCTCAGG TGATAATACC 7080

AAATGGGGCC CAATACACTG CTGTTCCTTC TTTTCCGGCA TGATGCAGCA GGTCCTGAAA 7140

AATGTTCCAG ATTGGTGCTC ATTTTATAAA TTAACATTTA TTAAGAACTT GTGCAGGCAG 7200

GTAGAGATAC CTGCTGGTAG TATTAAGAAG ATCTTGAATG TCCTTAGATA CAAGCTGTGC 7260

AGCAAAGGAG GTGTAGAGCA ATATAGTGAA GAGGATCTAA GGAAACTGTT GGCAGATAAT 7320

TTAGACAGTT GGGACGGAAA TGACACAGTT AAGTTTTTAG TTACAACCTA TATAAGCAAA 7380

GGACTCATGG CGTTAAACAG TTACAACCAT ATGGGTCAGG GTATTCACCA TGCAACATCT 7440

TCAATATTAA CTTCTCTAGC TGCTGTGCTC TTTGAGGAGC TGGCAATTTT TTATCTTAAA 7500

AAAAGCCTAC CCCAGACAAC AGTACATGTT GAACATGCCG GCAGTTCAGA TGATTACGCA 7560

AAGTGCATAG TGGTAACTGG TATATTATCC AAAGAGCTCT ACTCTCAATA CGATGAAACA 7620

TTCTGGAAAC ATGCCTGTAG ACTTAAGAAC TTCACAGCTG CAGTACAAAG ATGTTGTCAA 7680

ATGAAAGATA GCGCCAAGAC TTTAGTGAGC GACTGTTTCC TTGAATTTTA TAGCGAATTT 7740

ATGATGGGCT ATAGAGTAAC GCCTGCTGTG ATCAAATTCA TGTTCACTGG ACTTATAAAC 7800

AGCTCTGTGA CCTCTCCTCA GAGTTTGATG CAGGCATGCC AAGTTTCGTC CCAACAAGCA 7860

ATGTATAATA GCGTTCCTCT TGTCACCAAT ACCACCTTCA CACTATTGAG GCAGCAAATT 7920

TTCTTTAACC ATGTTGAGGA TTTTATCAGA AGGTACGGCA TATTAACTCT TGGGACTTTG 7980

TCTCCCTTTG GTAGGCTGTT TGTACCAACC TACTCTGGGT TAGTTAGCTC GGCGGTTGCC 8040

TTGGAAGATG CTGAAGTCAT TGCTAGAGCA GCTCAGACAC TTCACATGAA CAGTGTGTCG 8100

ATACAGTCAA GCAGCTTGAC CACATTAGAC AGCTTAAGTA GCAGTAGGAC AAGTTCCACA 8160

GTTGAAGATA GCAGCAGTGT GAGCGACACC ACTGTTGCTT CTCATGATTC AGGATCGTCA 8220

TCCTCCAGCT TCTCTTTTGA GCTCAATAGG CCTCTGTCCG AAACTGAACT ACAATTCATC 8280

AAAGCATTAA GTAGCCTCAA ATCCACACAA GCTTGTGAAG TAATTCAGAA TAGAATTACA 8340

GGCCTTTATT GCAATAGCAA TGAGGGGCCT CTTGATAGGC ACAATGTTGT TTACAGCAGC 8400

AGGATGGCAG ATTCTTGCGA TTGGCTAAGA GATGGTAAGA GAAGAGGGAA TCTGGAACTA 8460

GCAAATAGGA TTCAGTCTGT GCTGTGTGTT TTGATAGCAG GGTACTACAG ATCATTTGGA 8520

GGTGAAGGAA CCGAAAAACA GGTAAAGGCA TCACTGAATA GAGATGACAA CAAAATCATC 8580

GAGGACCCCA TGATACAATT AATTCCAGAG AAGCTGAGGA GAGAGCTGGA GAGGTTAGGT 8640

GTCTCCAGAA TGGAAGTTGA TGAACTAATG CCGAGCATCA GCCCTGATGA CACCTTAGCC 8700

CAGCTTGTGG CAAAAAAGCT TATTAGCCTC AATGTTTCGA CGGAAGAGTA CTCGGCTGAA 8760

GTGTCTAGAC TTAAACAAAC GCTAACAGCC CGAAATGTTT TGCATGGGTT GGCTGGAGGA 8820

ATTAAGGAGC TATCGCTCCC AATATACACG ATATTCATGA AATCTTACTT CTTCAAAGAC 8880

AACGTCTTCT TATCACTAAC AGACAGATGG TCTACCAAGC ACAGTACAAA CTATCGTGAT 8940

AGTTGCGGCA AACAATTAAC CGGTAGAATA ATAACCAAGT ACACTCACTG GTTGGACACC 9000

TTTCTAGGCT GCTCGGTCTC CATTAACAGG CATACTACTG TTAAAGAACC CTCTTTATTT 9060

AATCCAAATA TCAGGTGTGT TAACCTAATC ACATTTGAAG ACGGTCTGAG AGAACTATCA 9120

GTAATACAGA GTCATCTCAA AGTCTTTGAG AATGAATTTA CCAACTTAAA CCTTCAGTTC 9180

TCCGACCCAA ACAGACAGAA ACTTAGAATA GTTGAGTCTA GACCTGCGGA ATCTGAGCTA 9240

GAGGCGAACC GTGCAGTAAT TGTTAAGACC AAATTGTTCT CAGCAACAGA ACAAGTACGA 9300

CTATCCAACA ATCCTGCAGT TGTCATGGGC TATTTATTGG ATGAATCAGC AATTTCTGAA 9360

GTCAAACCCA CCAAGGTTGA CTTCTCAAAT TTACTTAAAG ATCGCTTTAA AATAATGCAG 9420

TTTTTTCCCT CGGTGTTCAC TTTGATTAAG ATGTTGACAG ATGAATCATC GGACTCAGAA 9480

AGGAATGGCC TTAGTCCAGA CTTGCAACAA GTTGCAAGGT ACTCAAACCA TTTAACCCTG 9540

CTCAGCAGGA TGATACAGCA AGCAAAGCCA ACCGTGACGG TTTTCTACAT GCTGAAAGGT 9600

AACTTGATGA ACACAGAGCC GACAGTTGCT GAGCTTGTCA GCTATGGTAT AAAGGAAGGT 9660

AGGTTTTATA GGCTCTCAGA CACTGGAATT GATGCAAGCA CATATTCTGT GAAATACTGG 9720

AAAATTCTTC ACTGCATTTC TGCCATTGGA TGTTTGCCTT TGAGTCAAGC AGACAAGTCT 9780

TCACTACTTA TGAGTTTCTT GAACTGGAGG GTGAACATGG ACATTAGAAC TTCTGACTGT 9840

CCGCTATCTA GTCATGAGGC AAGCATACTG AGTGAGTTTG ATGGACAAGT TATCGCTAAT 9900

ATACTTGCAA GTGAATTGAG CTCTGTAAAA CGAGATTCTG AACGTGAAGG GTTAACTGAT 9960

CTCCTTGATT ATCTGAACTC ACCCACTGAA CTGTTGAAGA AGAAGCCCTA TTTAGGGACA 10020

ACTTGCAAGT TCAACACCTG GGGTGACTCA AATAGATCTG GGAAATTCAC ATACAGCAGC 10080

AGATCTGGAG AATCCATTGG AATCTTCATT GCAGGAAAAT TGCACATCCA TCTCTCATCT 10140

GAGTCCATTG CCTTATTGTG TGAAACTGAA AGACAAGTGC TATCTTGGAT GAGCAAAAGG 10200

AGAACTGAGG TGATGACCAA AGAACAGCAC CAATTGTTCC TGAGCCTCCT TCCCCAGTCA 10260

CATGAATGTT TACAAAAGCA CAAGGACGGC AGCGCACTAT CGGTCATACC TGACAGCAGC 10320

AACCCCCGAC TACTTAAATT TGTACCTCTC AAAAAAGGTC TAGCAGTGGT AAAAATCAAA 10380

AAACAAATTT TAACAGTGAA GAAACAGGTC GTGTTTGATG CTGAGAGCGA GCCTAGACTG 10440

CAGTGGGGAC ATGGTTGCTT GTCCATTGTT TACGATGAAA CTGACACTCA AACCACATAC 10500

CACGAAAATC TTTTGAAAGT GAAGCAGCTT GTTGACTGCT CTACAGATAG GAAGAAGCTT 10560

TTACCCCGGT CAGTGTTTTC TGATTCCAAA GTCGTTCTCT CAAGGATCAA GTTCAAGACA 10620

GAGCTTCTTC TTAATTCACT GACACTGCTC CACTGTTTTT TAAAACATGC TCCTAGTGAT 10680

GCCATAATGG AGGTAGAGAG TAAGAGCAGC TTGCTGCACA AGTACCTCAA ATCAGGAGGT 10740

GTCAGACAGC GAAACACTGA AGTACTCTTC AGAGAGAAGT TAAACAAGGT TGTTATAAAA 10800

GACAATCTCG AACAAGGTGT AGAAGAGGAA ATTGAGTTTT GCAATAACCT GACCAAGACC 10860

GTTTCAGAGA ACCCGCTACC ACTCAGCTGT TGGTCTGAAG TTCAAAACTA CATTGAAGAC 10920

ATAGGCTTCA ACAATGTGCT TGTTAACATT GACAGAAACA CAGTGAAAAG TGAACTTTTG 10980

TGGAAATTTA CGTTAGACAC TAATGTAAGC ACCACAAGCA CTATTAAAGA TATGAGGACA 11040

CTGGTATCCT ACGTCAGTAC TGAAACCATC CCTAAGTTCT TGCTTGCATT CCTTCTTTAC 11100

GAAGAAGTAT TGATGAACCT AGTCAACCAG TGTAAGGCAG TAAAGGAACT CATCAACAGT 11160

ACAGGACTTT CAGACTTGGA ACTAGAAAGC TTGCTTACTT TCTGCACTTT CTATTTCCAA 11220

AATGAATGCA GTAGGAGAGA TGGACCTAGA TGTTCCTTTG CAGCACTATT AAGCCTAGTT 11280

CATGAAGATT GGCAAAAGAT AGGGAGAAAT ATCCTTGTTC GTGCAAACAA TGAGCTAGGC 11340

GATGTGTCAC TGAAGGTTAA TATTGTCTTG GTACCCCTCA AGGACATGTC CAAACCAAAG 11400

CCTGAAAGAG TGGTTATAGC CAGGAGGTCG TTAAATCATG CACTATCCTT AATGTTTCTG 11460

GACGAGATGT CATTGCCTGA GCTGAAGTCT TTGTCAGTGA ACTGCAAAAT GGGGAACTTT 11520

GAGGGGCAGG AGTGCTTTGA GTTTACTATT CTAAAGGACA ACAGCACAAG GCTAGATTAC 11580

AATAAGTTGA TTGACCATTG TGTGGATATG GAAAAAAAGA GGGAAGCAGT TAGAGCAGTA 11640

GAGGATTTGA TTCTGATGTT AACAGGCAAG GCAGTCAAAC CTAGTACTGT GACACAAATT 11700

GAACACAAGG ATGAGCAGTG TCAGGAGCAA ATAAGCTTGG ATGACCTAAT GGCAAGTGAT 11760

ACAGCGATAG ACTTGCCTGA CAGGGAAGCA GAAGCCCTTA AAACAGGAAA CCTTGGCTTT 11820

AACTGGGATT CAGATTGA 11838

<210> SEQ ID NO:2

<211> 3945 а.к.о.

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Аминокислотная последовательность РНК-зависимой РНК-полимеразы

вируса ККГЛ

<400> 2

MDFLRNLDWT QVIAGQYVTN PRFNISDYFE IVRQPGDGNC FYHSIAELTM PNKTAHSYHN 60

IKHLTELAAR KYYQEEPEAK LVGLSLEDYL KRMLSDNEWG STLEASMLAK EMGITIIIWT 120

VAASDEVEAG IKFGDGDVFT AVNLLHSGQT HFDALRILPQ FETDTREALS LVDKVIAVDQ 180

LTSSSSDELQ DYEDLALALT SVEEPYRRSS LDEVTLSRKQ AELLRQKASQ LSKLVNKSQN 240

IPTRVGRVLD CMFNCKLCVE ISADTLILRP ESKERIGEVM SLRQLGHKLL TRDKQIKQEF 300

SRMKLYVTKD LLDHLDVGGL LRAAFPGTGI ERHIQLLHSE MILDICTVSL GIMLSTFLYG 360

SNNKNKKKFI TNCLLSTALS GKKVYKVLGN LGNELLYKAP RKALATVCSA LFGKQINKLQ 420

NCFRTISPVS LLALRNLDFD CLSVQDYSGM IESMSKLDNT DVEFNHREIA DLNQLTSRLI 480

TLRKEKDTDL LKQWFPESDL TRRSTRNIAN AEEFIISEFF KKKDIMKFIS TSGRAMSAGK 540

IGNVLSYAHN LYLSKSSLNM TSEDISQLLI EIKRLYALQE DSEVEPIAII CDGIESNMKQ 600

LFAILPPDCA RECEVLFDDI RNSPTHSTAW KHALRLKGTA YEGLFANCYG WQYIPEDIKP 660

SLTMLIQTLF PDKFEDFLDR TQLHPEFRDL TPDFSLTQKV HFKRNQIPSV ENVQISIDVT 720

LPESVEAVPV TERKMFPLPE TPLSEVHSIE RIMENFSRLM HGGRLSAKEK DGDLAEQGNQ 780

QSAVEHESPS ISAFRDYGER GIVEENHMRL SEEDQLETRQ LLLVEVGFQT DIDGKIRTDH 840

KKWKDILKLL ELLGIKCSFI ACADCSSTPP DRWWITEDRV RVLKNSVSFL FNKLSRNSPT 900

EVTDIVVGAI STQKVRSYLK AGTATKTPVS TKDVLETWEK MKEHILNRPT GLTLPASLEQ 960

AMRKGLVEGV VISKEGSESC INMLKENLDR ITDEFERTKF KHELTQNVTT SEKLLFSWLS 1020

EDIKSSRCTE CLTNIKKAVD ETANLSEKIE LLAYNLQLVS HCSNCHPNGV SISNTSNVCK 1080

RCPKIEVVSH CENKGFEDSN ECLTDLDRLV RLTLPGKTEK ERRVKRNVEY LIKLMMSMSG 1140

IDCIKYPTGQ LITHGRVSAK HNDGNLKDRS EDDQRLAEKI DTVRKELSES KLKDYSTYAR 1200

GVITNSLKNL SKQGKSKCSV PRSWLEKILF DLKVPTKDEE VLINIRNSLK ARSEFVRNND 1260

KLLIRSKEEL KKCFDVQSFK LMKNKQPVPF QVDCILFKEV AAECMKRYIG TPYEGIIDTL 1320

VSLINVLTRF TWFQEVVLYG KICETFLRCC TEFNRSGVKL VKVRHCDINL SVKLPSNKKE 1380

NMLCCIYSGN MELLQGPFYL NRRQAVLGSS YLYIVITLYI QVMQQYRCLE VINSVNEKTL 1440

QDIENHSMTL LEDAFKELTF ALEGRFEESY KIRTSRCKAS GNFLNRSSRD HFISIVSGLN 1500

LVYGFLIKDN LLANSQQQNK QLQMLRFGML AGLSRLVCPN ELGKKFSTSC RRIEDNIARL 1560

YLQTSIYCSV RDVEDNIKHW KQRDLCPEVT IPCFTVYGTF INSDRQLIFD IYNVHIYNKE 1620

MDNFDEGCIS VLEETAERHM LWELDLMNSL CSDEKRDART ARLLLGCPNV RKAANKEGKK 1680

LLKSNSDTST DTQSITSEVS DRRSYSSSKS RIRSIFGRYN SQKKPFELRS GLEVFNDPFN 1740

DYQQAITDIC QFSEYTPNKE SILKDCLQII RKNPSHTMGS FELIQAISEF GMSKFPPENI 1800

DKARRDPKNW VSISEVTETT SIVASPKTHM MLKDCFKIIL GTENKKIVKM LRGKLKKLGA 1860

ISTNIEIGKR DCLDLLSTVD GLTDQQKENI VNGIFEPSKL SFYHWKELIR KNIDEVLLTE 1920

DGNLIFCWLK TISSSVKGSL KKKLKFMNVN SPELMPENCL FSSEEFNELI KLKKLLLNEQ 1980

QDEQELKQDL LISSWIKCIT ACKDFASIND KVQKFIYHLS EELYDIRLQH LELSKLKQEH 2040

PSVSFTKEEV LIKRLEKIFL KQHNLEIMET VNLIFFAALS APWCLHYKAL ESYLVRHPEI 2100

LDCGSKEDCK LTLLDLSVSK LLVCLYRKDD NELTNSSSLK LGFLVKYAVT LFTSNGEPFS 2160

LSLNDGGLDL DLHKTTDEKL LHQTKIVFAK IGLSGNSYDF IWTTQMIANS NFNVCKRLTG 2220

RSTGERLPRS VRSKVIYEMV KLVGETGMAI LQQLAFAQAL NYEHRFYAVL APKAQLGGAR 2280

DLLVQETGTK VMHATTEMFS RNLLKTTSDD GLTNPHLKET ILNVGLDCLT NMRNLDGKPI 2340

SEGSNLVNFY KVICISGDNT KWGPIHCCSF FSGMMQQVLK NVPDWCSFYK LTFIKNLCRQ 2400

VEIPAGSIKK ILNVLRYKLC SKGGVEQYSE EDLRKLLADN LDSWDGNDTV KFLVTTYISK 2460

GLMALNSYNH MGQGIHHATS SILTSLAAVL FEELAIFYLK KSLPQTTVHV EHAGSSDDYA 2520

KCIVVTGILS KELYSQYDET FWKHACRLKN FTAAVQRCCQ MKDSAKTLVS DCFLEFYSEF 2580

MMGYRVTPAV IKFMFTGLIN SSVTSPQSLM QACQVSSQQA MYNSVPLVTN TTFTLLRQQI 2640

FFNHVEDFIR RYGILTLGTL SPFGRLFVPT YSGLVSSAVA LEDAEVIARA AQTLHMNSVS 2700

IQSSSLTTLD SLSSSRTSST VEDSSSVSDT TVASHDSGSS SSSFSFELNR PLSETELQFI 2760

KALSSLKSTQ ACEVIQNRIT GLYCNSNEGP LDRHNVVYSS RMADSCDWLR DGKRRGNLEL 2820

ANRIQSVLCV LIAGYYRSFG GEGTEKQVKA SLNRDDNKII EDPMIQLIPE KLRRELERLG 2880

VSRMEVDELM PSISPDDTLA QLVAKKLISL NVSTEEYSAE VSRLKQTLTA RNVLHGLAGG 2940

IKELSLPIYT IFMKSYFFKD NVFLSLTDRW STKHSTNYRD SCGKQLTGRI ITKYTHWLDT 3000

FLGCSVSINR HTTVKEPSLF NPNIRCVNLI TFEDGLRELS VIQSHLKVFE NEFTNLNLQF 3060

SDPNRQKLRI VESRPAESEL EANRAVIVKT KLFSATEQVR LSNNPAVVMG YLLDESAISE 3120

VKPTKVDFSN LLKDRFKIMQ FFPSVFTLIK MLTDESSDSE RNGLSPDLQQ VARYSNHLTL 3180

LSRMIQQAKP TVTVFYMLKG NLMNTEPTVA ELVSYGIKEG RFYRLSDTGI DASTYSVKYW 3240

KILHCISAIG CLPLSQADKS SLLMSFLNWR VNMDIRTSDC PLSSHEASIL SEFDGQVIAN 3300

ILASELSSVK RDSEREGLTD LLDYLNSPTE LLKKKPYLGT TCKFNTWGDS NRSGKFTYSS 3360

RSGESIGIFI AGKLHIHLSS ESIALLCETE RQVLSWMSKR RTEVMTKEQH QLFLSLLPQS 3420

HECLQKHKDG SALSVIPDSS NPRLLKFVPL KKGLAVVKIK KQILTVKKQV VFDAESEPRL 3480

QWGHGCLSIV YDETDTQTTY HENLLKVKQL VDCSTDRKKL LPRSVFSDSK VVLSRIKFKT 3540

ELLLNSLTLL HCFLKHAPSD AIMEVESKSS LLHKYLKSGG VRQRNTEVLF REKLNKVVIK 3600

DNLEQGVEEE IEFCNNLTKT VSENPLPLSC WSEVQNYIED IGFNNVLVNI DRNTVKSELL 3660

WKFTLDTNVS TTSTIKDMRT LVSYVSTETI PKFLLAFLLY EEVLMNLVNQ CKAVKELINS 3720

TGLSDLELES LLTFCTFYFQ NECSRRDGPR CSFAALLSLV HEDWQKIGRN ILVRANNELG 3780

DVSLKVNIVL VPLKDMSKPK PERVVIARRS LNHALSLMFL DEMSLPELKS LSVNCKMGNF 3840

EGQECFEFTI LKDNSTRLDY NKLIDHCVDM EKKREAVRAV EDLILMLTGK AVKPSTVTQI 3900

EHKDEQCQEQ ISLDDLMASD TAIDLPDREA EALKTGNLGF NWDSD* 3945

<---

Claims (12)

1. Ген, кодирующий РНК-зависимую РНК-полимеразу вируса ККГЛ, имеющий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1 длиной 11838 п.н.

2. Рекомбинантная плазмида pSB3delta-RdRp, предназначенная для интеграции и экспрессии гена РНК-зависимой РНК-полимеразы вируса ККГЛ, имеет размер 18270 п.н. и содержит в соответствии с физической и генетической картой, представленной на Фиг. 4, целевой ген по п. 1, кодирующий РНК-зависимую РНК-полимеразу вируса ККГЛ, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2 длиной 3945 а.к.о., и состоит из следующих элементов:

• ген β-лактамазы (координаты с 17218 по 18078 п.н.) под контролем промотора (координаты с 18079 по 18183 п.н.), в качестве генетического маркера, определяющего устойчивость к ампициллину клеток бактерии E.coli;

• точка начала репликации ori плазмидного вектора pUC (координаты с 16459 по 17047 п.н.);

• 5'-ITR и 3'-ITR инвертированные повторы, имеющие координаты с 17 по 288 п.н. и с 15990 по 16214 п.н. соответственно, обеспечивают интеграцию участка плазмиды, заключенного между ними, в геном клеток млекопитающих при помощи транспозазы Sleeping Beauty (SB);

• промотор и энхансер CMV - обеспечивает экспрессию гена по п. 1 в клетках млекопитающих (координаты с 855 по 1438 п.н.);

• chimeric intron - химерный интрон, обеспечивающий эффективную транскрипцию, стабильность и транспорт транскрипта из ядра клетки (координаты с 1574 по 1706 п.н.);

• Т7 promoter - нуклеотидная последовательность промотора бактериофага Т7, необходимая для in vitro транскрипции (координаты с 1751 по 1769 п.н.);

• L protein (RdRp) - открытая рамка считывания гена РНК-зависимой РНК-полимеразы вируса ККГЛ по п. 1 (координаты с 1783 по 13620 п.н.);

• IRES2 - внутренний сайт посадки рибосом вируса энцефаломиелита, обеспечивающий экспрессию гена устойчивости к пуромицину (координаты с 13854 по 14240 п.н.);

• PuroR - ген устойчивости к пуромицину, кодирующий N-ацетил трансферазу (координаты с 14241 по 14843 п.н.);

• bGH poly(A) signal - сигнал полиаденелирования (координаты с 14874 по 15098 п.н.).

Images