CN110904152A

CN110904152A - 表达非洲猪瘟病毒p54蛋白的重组猪繁殖与呼吸综合征病毒的构建方法及其应用

Info

Publication number: CN110904152A
Application number: CN201911159887.8A
Authority: CN
Inventors: 童光志; 高飞; 童武; 李国新; 姜一峰; 郑浩; 周艳君; 虞凌雪; 李丽薇; 刘长龙
Original assignee: Shanghai Veteromaru Research Institute Caas China Animal Health And Epidemiology Center Shanghan Branch Center
Current assignee: Shanghai Veteromaru Research Institute Caas China Animal Health And Epidemiology Center Shanghan Branch Center; Shanghai Veterinary Research Institute CAAS
Priority date: 2019-11-23
Filing date: 2019-11-23
Publication date: 2020-03-24

Abstract

本发明提供了一种表达非洲猪瘟病毒（African Swine Fever Virus,ASFV）p54蛋白的猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）重组质粒的构建方法，以及根据该重组质粒构建的基因工程疫苗及构建方法。对rPRRSV‑p54感染孔进行间接免疫荧光，发现视野下出现了抗PRRSV N蛋白的特异性荧光及抗ASFV p54蛋白的特异性荧光。说明该表达非洲猪瘟病毒p54蛋白的重组PRRSV可以保证外源蛋白ASFV的p54蛋白得到良好的高效的稳定的表达。而有研究表明p54是重要的抗原蛋白，能够用于ASF的疫苗研制。

Description

表达非洲猪瘟病毒p54蛋白的重组猪繁殖与呼吸综合征病毒的构建方法及其应用

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体地说，涉及一种病毒的重组质粒和基因工程疫苗，更具体地说，涉及一种能够表达非洲猪瘟病毒 (ASFV) p54蛋白的PRRS病毒重组质粒和基因工程疫苗。

背景技术

ASFV是ASFV感染家猪或者野猪引起的一种急性、烈性、出血性，高度接触性传染病。其特征是病程短、高热和出血性病变，急性感染死亡率高达100%。严重威胁全球养猪业。目前尚没有有效的疫苗和治疗方法。自2018年8月中国辽宁沈阳首次发生ASF疫情，随后迅速蔓延至全国二十多个省份，给中国的养猪业造成了迄今最为惨重的经济损失。一年时间内，我国32个省、市、自治区均发生ASF疫情。ASF疫情使我国生猪存栏量和出栏量下降20%-50%，许多猪场因ASF疫情完全覆没，严重削弱了我国猪肉的有效供给，导致我国生猪和猪肉价格均出现翻番。从ASF在中国流行的总体情况来看，ASF疫情防控效果不容乐观，疫情仍然处于持续扩散的状态。因此疫苗研发刻不容缓。大量的ASFV疫苗研究结果表明，灭活疫苗对ASFV没有保护作用。被动免疫抗血清能抵抗ASFV感染，一些亚单位疫苗免疫也能提供部分免疫保护。细胞免疫，特别是病毒特异性细胞毒性T细胞反应，在抗ASFV感染中发挥重要作用。能诱导细胞免疫的疫苗，如DNA疫苗、病毒活载体疫苗和弱毒活疫苗，能取得部分或完全的免疫保护效果。其中，弱毒活疫苗株表现出较好的免疫保护效果，特别是一些弱毒株能对同源和异源强毒株完全免疫保护，显示出诱人的应用前景。但是弱毒株存在安全性的疑虑。一是副反应问题，二是弱毒株接种存在散毒风险，三是毒力返强。ASFV病毒活载体疫苗表现出较好的安全性，只需要对其免疫效率进行提高。已有研究表明：单纯依赖一种或几种病毒的抗原蛋白很难达到免疫预防效果。而多种保护性抗原协同免疫（“鸡尾酒”式混合免疫）可以提高疫苗的免疫保护水平。因此表达ASFV抗原蛋白的活病毒载体疫苗的研发将是今后的一个重要的研究方向。

ASF的病原ASFV是非洲猪瘟病毒科非洲猪瘟病毒属的唯一成员，为大型双链DNA病毒，主要在巨噬细胞中复制，其基因组约170-193kb，含有150-167个ORF，编码150-200种蛋白质。ASFV粒子直径约为200nm，呈20面体结构，由多层同心圆结构组成，由内到外依次是类核（Nucleoid）、核壳（Core shell）、内囊膜（Inner envelope）、衣壳（Capsid）和外囊膜（External envelope）。ASFV基因组是一种线性双链 DNA分子。

ASFV的p54蛋白的编码基因为E183L，共555nt，其蛋白分子量约为19.9kD。p54蛋白是ASFV表达的早期膜蛋白，含跨膜结构域，定位于内质网衍生的内膜前体，在病毒吸附易感细胞和入侵过程中发挥着重要作用。研究发现，ASFV结构蛋白p54过表达可以促进细胞凋亡。深入研究表明p54能与胞质动力蛋白轻链LC8特异性相互作用，实现病毒在胞质内的转运。p54是一种重要的结构蛋白，p54的缺失，将使病毒结构不稳定，有研究表明p54具有免疫原性，是病毒的主要的免疫原蛋白。能够刺激机体产生针对该蛋白的抗体，可能是理想的ASFV亚单位疫苗的抗原蛋白。

猪繁殖与呼吸综合征（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome，PRRS）是一种严重影响养猪业的接触性传染病，给世界各国造成的经济损失巨大。其病原PRRS病毒 (PRRSV)一直处于不断的变异及进化过程中。在中国，2006年爆发了高致病性PRRS（Highly-pathogenic PRRSV, HP-PRRSV），这就是PRRS的病毒变异株引起的急性高致死性的疫病。目前，反向遗传操作被广泛应用于研究PRRSV的生物学特性、致病机理、毒力决定因子以及不断变异的分子机制，而其基因组作为外源基因表达载体的研究也被广泛开展。PRRSV的基因组中除ORF1和ORF2以及ORF4和ORF5外，其结构蛋白编码框架之间有少则几个多则逾百的碱基重叠（overlap）。相关研究表明：ORF重叠区的影响会导致嵌合病毒失去感染性，因此可选择非重叠区或者将重叠区拉开作为外源基因的插入位点。需要注意的是外源基因的插入原则应以能在最小程度上改变病毒基因组为基础。但即便如此，插入外源基因也会在传代过程中逐渐丢失编码序列以致无法发挥其功能，呈现遗传不稳定性。Dr.Dongwan Yoo 2009年报道了其在ORF1b和ORF2之间插入了GFP基因，如果在其3’ 端下游插入一个二级结构简单的 (由其自身核心序列及周围序列形成) 转录调控序列6 (TRS6) 的拷贝，让外源基因的表达被一个独立的转录子所引导。所构建的突变体克隆能够在至少37代次的传达过程中保持遗传稳定。

众所周知，非洲猪瘟 (ASF)和高致病性猪繁殖与呼吸综合征 (HP-PRRS) 都是临床上非常重要的猪传染病，严重制约着全球养猪业，给养猪业造成的经济损失巨大。本发明旨在高致病性PRRSV弱毒疫苗株HuN4-F112的全长感染性克隆骨架上，插入ASFV的p54的编码基因E183L的核苷酸序列，获得能够稳定表达ASFV p54蛋白的重组PRRS病毒，对其进行一系列病毒特性分析及遗传稳定性检测；并在病毒复制、转录、翻译水平对其与亲本病毒进行比较分析。这是对非洲猪瘟病毒疫苗研发的一种全新的尝试。该疫苗的成功研制将会对非洲猪瘟的防控起到积极重要的作用。并且此重组病毒的骨架为高致病性PRRSV弱毒疫苗株，该疫苗已经在市场上使用多年。因此可以起到“一针防两病”的效果。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种表达非洲猪瘟病毒 (ASFV) p54蛋白的猪繁殖与呼吸综合征病毒重组质粒的构建方法。

本发明的构建表达ASFV p54蛋白的猪繁殖与呼吸综合征病毒嵌合重组质粒的方法，为根据ASFV p54蛋白的编码基因E183L的核苷酸序列以及高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒疫苗株HuN4-F112的基因序列设计SOE PCR引物，在HuN4-F112基因组的ORF1b和ORF2之前插入ASFV p54蛋白的编码基因E183L的序列，并在外源基因3’端下游插入此病毒的转录调控序列6（TRS6）。将扩增出的嵌合p54片段通过AscI和EcoRV双酶切，然后回收PCR产物连接到HuN4-F112的Asc I和EcoR V双酶切载体上，从而获得了嵌合重组质粒pA-ASFV-p54（SEQ ID NO.7）。

本发明的嵌合ASFV p54的重组PRRSV是能够稳定表达ASFV p54的高致病性PRRSV弱毒疫苗株HuN4-F112重组病毒。

本发明的ASFV p54蛋白的重组PRRSV的构建方法包括以下步骤：首先通过SOE PCR的方法扩增出含有ASFV p54蛋白编码基因的PRRSV突变片段，然后将扩增出的PCR片段和高致病性PRRSV弱毒疫苗株HuN4-F112进行AscI和EcoRV酶切，最后将酶切后的突变PCR片段和HuN4-F112的双酶切片段进行连接，并转化TOP10感受态细胞，然后通过筛选获得重组全长感染性克隆质粒pA-ASFV-p54，从而提供了相应的构建方法。

使用本发明所构建的重组质粒pA-ASFV-p54，转染MARC-145细胞后所拯救出来的病毒具有和亲本病毒vHuN4-F112相似的病毒生物学特性。并且在至少连续20代次的细胞传代过程中能够保持遗传稳定性。同时，基于上述重组质粒，转染MARC-145细胞后拯救出的一株重组PRRS病毒：rPRRSV-p54。能与p54的鼠源多抗以及PRRSV的N蛋白的单抗发生抗原抗体反应，出现特异性的免疫荧光。说明该重组病毒rPRRSV-p54能够稳定高效的表达ASFV的p54蛋白。表达ASFV p54蛋白的重组PRRSV有望今后作为一种新型的基因工程活载体疫苗用于非洲猪瘟的免疫保护。

附图说明

图1是ASFV p54嵌合PRRSV重组质粒构建示意图

图2是SOE PCR引物扩增我国流行的II型ASFV基因组p54编码基因的不同PCR片段的电泳检测结果，其中，图2a为由pHuN4-F112为模板，引物HF11559和ASFV-p54-R1获得的长度约为450bp的PCR产物SOE-1；图2b为II型ASFV基因组p54编码基因E183L全长的质粒为模板，ASFV-p54-F2和ASFV-p54-R2/R3为上下游引物所获得的628bp的PCR产物SOE-2；图2c是以pHuN4-F112为模板，引物ASFV-p54-F4和HR13090获得的长度约为1182bp的PCR片段SOE-4；图2d是以SOE-1和SOE-2回收产物为模板，引物HF11559和ASFV-p54-R2/R3为引物扩增出的1022bp长度的PCR产物；图2e为由SOE-3和SOE-4的回收产物为模板，引物HF11559和HR13090扩增出的2126bp长度的PCR产物SOE-5，图中的Marker是DL2,000。

图3a是嵌合重组质粒pA-ASFV-p54与亲本质粒的全长鉴定电泳结果；其中泳道1,2是亲本质粒pHuN4-F112，泳道3-5是嵌合重组质粒pA-ASFV-p54。图3b构建好的嵌合重组质粒pA-ASFV-p54以及亲本质粒pHuN4-F112的EcoRV和AscI双酶切鉴定结果，其中泳道1是Marker 2,000，泳道2是pA-ASFV-p54的EcoRV和AscI双酶切鉴定结果，泳道3是pHuN4-F112的EcoRV和AscI双酶切鉴定结果。图3c是Hind III-HF酶切嵌合重组质粒pA-ASFV-p54和亲本质粒的电泳结果，其中，泳道1是Marker DL15,000，泳道2-4是Hind III-HF酶切的pA-ASFV-p54，泳道5是Hind III-HF酶切的亲本质粒pHuN4-F112。

图4a是对嵌合重组质粒pA-ASFV-p54的SwaI线性化模板的电泳结果，图4b是对线性化模板的体外转录RNA的电泳鉴定。

图5是用重组质粒转染细胞后出现的细胞病变结果。

图6是拯救病毒的N蛋白和ASFV p54蛋白的免疫荧光照片，其中，A是被拯救病毒rPRRSV-p54 P20代的N蛋白、ASFV p54蛋白免疫荧光照片； B 是vHuN4-F112的N蛋白、ASFVp54蛋白免疫荧光照片；C为阴性对照。

图7是对拯救病毒株与亲本病毒的滴度比较结果，生长曲线的描绘。

具体实施方式

在本发明中，所述嵌合重组质粒指的是，利用反向遗传操作技术，将我国流行的II型ASFV基因组p54蛋白编码基因E183L的核苷酸序列插入HuN4-F112基因组骨架中所获得的pA-ASFV-p54。

在本发明中，所述嵌合重组病毒指的是，利用基因嵌合技术获得的全长重组质粒pA-ASFV-p54转染MARC-145细胞后拯救出的活病毒rPRRSV-p54。

在本发明中，所述的反向遗传操作指的是：相对于经典遗传学而言的，是在获得的高致病性PRRSV弱毒疫苗株HuN4-F112的感染性克隆骨架上，通过SOE PCR的方法或者定点突变的方法对病毒基因进行必要的加工和修饰，进行外源基因的插入，再按组成顺序构建全长病毒基因组，让其装配出具有生物活性的病毒粒子，研究突变病毒与亲本病毒在病毒生物学特性上的变化，以及外源基因插入可能对病毒的表型、性状有何种影响等方面的内容。

在本发明中，所述高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒HuN4的Genbank 登录号是EF635006。

在本发明中，所述高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒疫苗株的感染性克隆HuN4-F112指的是，参考文献Shanru Zhang, Yanjun Zhou, Yifeng Jiang, Guoxin Li,Liping Yan, Hai Yu, Guangzhi Tong. Generation of an infectious clone of HuN4-F112, an attenuated live vaccine strain of porcine reproductive andrespiratory syndrome virus的方法所构建的感染性克隆。

以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆：实验室手册》(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件进行。

在本发明的实施例中，使用的病毒和细胞：MARC-145细胞（非洲绿猴肾细胞系）。

在本发明的实施例中，使用的质粒与菌株：pBlueScript II SK(+)载体购自Invitrogen公司，pBS-T载体、TOP10感受态细胞购自TIANGENE公司。

在本发明的实施例中，使用的其他试剂：QIAamp Viral RNA Mini Kit购自QIAGENE公司，pfu II DNA Polymerase购自Strategene公司，T7 mMESSAGE High YieldCapped RNA Transcription Kit购自Ambion公司，胶回收试剂盒和Quant ReverseTranscriptase购自TIANGENE公司，rTaq DNA聚合酶，dNTP和限制性内切酶购自TaKaRa公司，质粒提取试剂盒购自北京博大泰克生物基因技术有限责任公司，DMRIE-C转染试剂购自Invitrogen公司，Opti-MEM购自Invitrogen公司。

在本发明的实施例中，MARC-145单层细胞采用以下方法制备：

MARC-145细胞在含有10％FBS的DMEM培养基的六孔板中贴壁长满单层后，弃培养基，PBS洗两遍后加入0.01MOI的病毒500微升吸附1小时后，弃吸附液，PBS洗两遍后加入维持液（含有2％FBS的DMEM）培养基，37℃5％CO₂培养箱中培养。

实施例1表达ASFV p54蛋白的重组PRRSV质粒的构建

根据GenBank登录号为EF635006和 MH766894的核苷酸序列，设计出6条引物，用来进行SOE PCR扩增，过程如图2所示，然后分别通过细胞转染实验，验证了获得的嵌合重组质粒的感染性，具体过程如下：

1.1引物设计

根据GenBank上的HuN4的碱基序列和我国流行的II型ASFV基因组的碱基序列，设计SOEPCR引物，分别命名为：HF11559、HR13090、ASFV-p54-F2、ASFV-p54-R1、ASFV-p54-F4、ASFV-p54-R2/R3，其序列分别如下所示：

HF11559: 5’-TCATACATCCGAGTTCCTGTT-3’（SEQ ID NO.1）

HR13090: 5’-GAAATATTGTCATGGCGAGGC-3’（SEQ ID NO.2）

ASFV-p54-F2: 5’-TCATTGAACCAACTTTAGGCCTGAATTGAAatggattctgaattttttcaacc -3’（SEQ ID NO.3）

ASFV-p54-R1：5’-ggataaaccggttgaaaaaattcagaatccatTTCAATTCAGGCCTAAAGTT -3’（SEQ ID NO.4）

ASFV-p54-F4：5’-cctatacgcataaagacctagaaaactccttgtaaGTTCCGTGGCAACCCCTTTAACCAGAGT-3’（SEQ ID NO.5）

ASFV-p54-R2/R3：5’-CATTGTTCCGCTGAAACTCTGGTTAAAGGGGTTGCCACGGAACttacaaggagttttctaggtctttatg -3’（SEQ ID NO.6）

具体构建步骤如下：

1.1.1扩增SOE-1PCR产物

以pHuN4-F112作为模板，引物HF11559和ASFV-p54-R1分别作为上游引物和下游引物，PCR扩增突变片段SOE-1，具体如下：

PCR反应体系为：pHuN4-F112质粒模板1μL，上下游引物对(10μM)各1μL，10×pfuBuffer 5μL，2.5mM dNTP 4μL，pfuII Turbo DNA聚合酶5 units，加水至50μL。

PCR反应参数为：95℃预变性2min，95℃变性20s，60℃退火20s，72℃延伸15s，共进行35个循环，然后72℃延伸3min。

取PCR反应产物，用1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2a所示，根据检测结果，获得的目的片段大小为450bp。

1.1.2扩增SOE-2PCR产物

以含有我国流行的II型ASFV的p54编码基因E183L的质粒pUC-p54f为模板，引物 ASFV-p54-F2和ASFV-p54-R2/R3分别作为上游引物和下游引物，PCR扩增SOE-2，具体如下：

PCR反应体系为：含有我国流行的II型ASFV的p54编码基因E183L的质粒pUC-p54f为模板（1:1000稀释）1μL，上下游引物对（10μM）各1μL，10×pfu Buffer 5μL，2.5mM dNTP 2μL，pfu II Turbo DNA聚合酶5units，加水至50μL。

PCR反应参数为：95℃预变性2min，95℃变性20s，56℃退火20s，72℃延伸20s，进行35个循环，再72℃延伸3min。

取PCR反应产物，用1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2b所示，根据检测结果，获得的目的片段大小为628bp。

1.1.3扩增SOE-4PCR产物

PCR反应体系为：以pHuN4-F112作为模板，以ASFV-p54-F4和HR13090上下游引物对(10μM)各1μL，10×pfu Buffer 5μL，2.5mM dNTP 2μL，pfuII Turbo DNA聚合酶5units，加水至50μL。

PCR反应参数为：95℃预变性2min，95℃变性20s，60℃退火30s，72℃延伸20s，进行35个循环，再72℃延伸3min。

取PCR反应产物，用1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2a所示，根据检测结果，获得的目的片段大小为1182bp。

1.1.4扩增SOE-3PCR产物

PCR反应体系为：以SOE-1和SOE-2 PCR回收产物作为模板，以HF11559和ASFV-p54-R2/R3上下游引物对(10μM)各1μL，10×pfu Buffer 5μL，2.5mM dNTP 2μL，pfu II Turbo DNA聚合酶5units，加水至50μL。

PCR反应参数为：95℃预变性2min，95℃变性20s，56℃退火20s，72℃延伸30s，进行35个循环，再72℃延伸3min。

取PCR反应产物，用1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2c所示，根据检测结果，获得的目的片段大小为1022bp。

1.1.5 扩增SOE-5PCR产物

PCR反应体系为：以SOE-3和SOE-4 PCR回收产物作为模板，以HF11559和HR13090上下游引物对(10μM)各1μL，10×pfu Buffer 5μL，2.5mM dNTP 2μL，pfu II Turbo DNA聚合酶5units，加水至50μL。

PCR反应参数为：95℃预变性2min，95℃变性20s，56℃退火20s，72℃延伸45s，进行35个循环，再72℃延伸3min。

取PCR反应产物，用1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2d所示，根据检测结果，获得的目的片段大小为2126bp。

2.2表达ASFV p54蛋白重组PRRSV质粒的构建

将上述SOE-5 的PCR产物使用Asc I/EcoR V进行双酶切，结果见图2e再与经过Asc I和EcoR V双酶切的亲本病毒全长质粒pHuN4-F112的大片段通过T4 DNA连接酶连接，经测序鉴定后筛选出阳性克隆，获得pA-ASFV-p54，构建策略如图3所示。

具体步骤如下：

于37℃水浴中，用Asc I/EcoR V分别对SOE-5 的PCR产物和亲本病毒全长质粒pHuN4-F112进行双酶切，反应体系为SOE-5突变片段41μL，Asc I 2μL，EcoR V 2μL，10×NEBBuffer4 5μL；pHuN4-F112 15μL，Asc I 2μL，EcoR V 2μL，10×NEB Buffer4 5μL，ddH₂O 26μL。

将SOE-5的PCR产物和相应的载体的Asc I/EcoR V双酶切片段以摩尔比3∶1的比例，以T4 DNA连接酶连接，转化TOP10，挑取独立的菌落进行纯培养，提取质粒DNA，1％凝胶电泳，挑取大小为18kb的质粒进行测序，筛选阳性克隆。

对所获得的待鉴定质粒进行全长质粒电泳鉴定，与亲本全长感染性克隆进行电泳图谱鉴定，结果见图3a所示；对全长突变质粒和亲本质粒进行Asc I/EcoR V双酶切电泳图谱比较，结果如图3b所示。

对嵌合重组质粒和亲本质粒进行Hind III-HF酶切检测是否有大片段的缺失，酶切体系为：突变质粒20μL，Hind III-HF 2.5μL，ddH2O 22.5μL，10×Cutsmart Buffer 5μL)，37℃水浴酶切过夜。对酶切产物进行电泳鉴定，结果见图3c所示，

1.3病毒RNA的制备

1.3.1质粒的Swa I线性化

于37℃水浴中，用SwaI分别对嵌合重组质粒pA-ASFV-p54以及亲本质粒pHuN4-F112进行线性化酶切(反应体系为：突变质粒41.5μL，Swa I 3μL，ddH2O 0μL，100×BSA 0.5μL，10×NEB Buffer3 5μL)，酶切过夜。参考说明书的方法，用QIAquick PCR Purification Kit纯化酶切产物，分别获得纯化的线性化质粒，见图4a。

1.3.2、体外转录

参考说明书的方法，使用T7 mMESSAGE High Yield Capped RNA Transcription Kit（购自Ambion公司）体外转录纯化后的线性化质粒，并采用RNA电泳鉴定，根据鉴定结果，见图4b，获得了pA-ASFV-p54的体外转录RNA。

1.4表达ASFV p54蛋白的PRRSV重组病毒的检测

1.4.1 RNA的转染

接种MARC-145细胞（非洲绿猴肾细胞系，购自美国ATCC）于六孔板中培养，待细胞密度为80-90％时，向每孔中分别加入pA-ASFV-p54的in vitro RNA和2μL DMRIE-C转染试剂，在1mL的Opti-MEM中振荡混匀，然后根据转染试剂说明书的方法，转染MARC-145细胞，并且逐日观察细胞病变。

待出现如图5所示的细胞病变（CPE）后，收取上清并传代，上清收取及传代过程具体如下：

MARC-145细胞在含有10％FBS的DMEM培养基的六孔板中贴壁长满单层后，弃培养基，PBS洗两遍，吸取转染过后五天的上清液，将其与维持液（含2％FBS的DMEM）按照1∶10的比例接种上清液200μL，置37℃继续培养并采用上述方法继续传代，并收取第五代的病毒上清，然后按照QIAGEN公司RNA提取试剂盒中的操作方法提取上清病毒RNA，获得病毒rPRRSV-p54。

根据上述结果，获得的重组质粒pA-ASFV-p54具有感染性，能够从单一的基因组序列成功转变为具有活性的病毒粒子并具有相应的病毒感染性。

1.4.2 间接免疫荧光检测

按照实施例1.4.1中的RNA转染步骤，分别以纯化后1000倍稀释的病毒rPRRSV-p54，感染单层MARC-145细胞，然后于感染36h后弃去培养基，用冰甲醇固定10min，1％BSA室温封闭30min，分别用PRRSV核衣壳蛋白的特异性单抗（1∶800稀释）和ASFV p54的特异性多抗（兔源，1:1000倍稀释）室温孵育2h，再加入FITC标记的羊抗鼠的二抗室温孵育1h，PBS洗五遍后，在荧光显微镜下观察，结果如图6所示。

根据图5的结果： pA-ASFV-p54于转染后第5天出现了明显的CPE，以无限稀释法传代纯化嵌合重组病毒rPRRSV-p54，并且以间接免疫荧光分别检测感染嵌合病毒rPRRSV-p5436h后的MARC-145细胞，结果出现了特异性荧光。

同时，利用RT-PCR技术检测原代（P0）和子代（P5、P10、P15、P20）病毒，结果显示，ASFV p54的编码基因能够稳定存在于PRRSV基因组中。

上述结果说明：利用反向遗传操作系统获得了和亲本毒vHuN4-F112具有相似生长特性的表达ASFV p54蛋白的嵌合重组PRRSV，同时证明外源基因ASFV p54蛋白基因的插入不影响整个病毒的生长，是可行的。

1.4.3病毒细胞半数感染量(TCID₅₀)测定

参照Pizzi，M.，Sampling variation of the fifty percent end-point，determinedby the Reed-Muench (Behrens) method，Hum Biol，1950. 22(3)：p151-90.中的方法，用96孔组织培养板方法进行感染性滴度的测定。将上述感染细胞后收取的病毒上清用维持液（含有2％FBS的DMEM）作10倍系列稀释后，将10^-1-10^-9连续稀释的病毒接种96孔细胞培养板上的MARC-145单层细胞，每稀释度接种8孔，每孔0.1mL，再设2列对照(即用维持液代替病毒液)，置37℃ 5％的二氧化碳培养箱中培养，6-7天后观察感染细胞，记录出现细胞病变的孔数，并按Reed-Muench法计算TCID₅₀。

1.4.4 病毒多步生长曲线的绘制

分别以低剂量（0.01MOI）病毒（rPRRSV-p54和vHuN4-F112）感染MARC-145细胞，分别在感染后不同的时间段（2h、10h、18h、26h、40h、56h、80h、96h）收取细胞培养上清，并进行病毒滴度的测定，收取的每个时间点病毒用TCID₅₀计算滴度，并根据不同时间点病毒的滴度，绘制病毒多步生长曲线，结果如图7所示，根据该图，在感染10h后病毒形成第一个复制高峰期，随后在第50h出现第二个复制高峰期；亲本病毒vHuN4-F112与嵌合重组病毒rPRRSV-p54之间的差异不显著。结果说明利用反向遗传操作技术，获得的嵌合我国流行的II型ASFV的p54蛋白编码基因E183L的全长重组质粒拯救出来的病毒和亲本毒株在病毒的增殖各个时间点的病毒滴度，指数增长期，平台期等生长曲线方面具有相似的生物学活性，只是病毒滴度在感染初期略低于亲本病毒vHuN4-F112。达到峰值之后，平台期等时间点两种病毒的病毒滴度无明显差异。见图7。

本发明在高致病性PRRSV弱毒疫苗株的全长感染性克隆pHuN4-F112的骨架上，利用SOE PCR的方法，在ORF1b和ORF2之间插入我国流行的II型ASFV p54蛋白编码基因E183L的核苷酸序列，获得了重组的全长感染性克隆质粒pA-ASFV-p54，经病毒拯救，获得了活病毒rPRRSV-p54，经RT-PCR鉴定，嵌合重组病毒rPRRSV-p54能够稳定传代20次而不发生缺失及其他的突变，ASFV的p54蛋白是重要的抗原蛋白，当p54蛋白合成受阻时，则病毒粒子的形成受到抑制。因此，表达ASFV p54蛋白的重组猪繁殖与呼吸综合征病毒rPRRSV-p54能够可作为新型ASFV的PRRSV活载体疫苗“鸡尾酒疗法”的重要组分。再加上HP-PRRSV弱毒疫苗株的载体，有望同时防治ASFV和HP-PRRSV。

<110>中国农业科学院上海兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心上海分中心）

<120>表达非洲猪瘟病毒p54蛋白的重组猪繁殖与呼吸综合征病毒的构建方法及其应用

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<170> PatentIn version 3.3

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Claims

1.一种表达非洲猪瘟病毒p54蛋白的重组猪繁殖与呼吸综合征病毒的构建方法，所述方法为根据ASFV p54蛋白的编码基因E183L的核苷酸序列以及高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒疫苗株HuN4-F112的基因序列设计SOE PCR引物，在HuN4-F112的ORF1b和ORF2之前插入ASFV p54蛋白的编码基因E183L的序列，并在外源基因3’端下游插入此病毒的转录调控序列6（TRS6）；将扩增出的嵌合p54蛋白的编码基因片段通过Asc I和EcoR V双酶切，然后回收PCR产物连接到HuN4-F112的Asc I和EcoR V双酶切载体上，从而获得了嵌合重组质粒pA-ASFV-p54。

2.如权利要求1所述的一种表达非洲猪瘟病毒p54蛋白的重组猪繁殖与呼吸综合征病毒的构建方法，所述嵌合重组质粒pA-ASFV-p54是能够稳定表达ASFV p54蛋白的高致病性PRRSV弱毒疫苗株HuN4-F112重组病毒。

3.如权利要求1所述的一种表达非洲猪瘟病毒p54蛋白的重组猪繁殖与呼吸综合征病毒的构建方法，所述嵌合重组质粒pA-ASFV-p54的全长序列如SEQ ID NO.7所示。

4.一种利用权利要求1-3之一所述的一种表达非洲猪瘟病毒p54蛋白的重组猪繁殖与呼吸综合征病毒的构建方法获得的嵌合重组质粒。

5.一种权利要求4所述的嵌合重组质粒的应用，所述应用为作为一种新型的基因工程活载体疫苗用于非洲猪瘟的免疫保护。

6.一种包含非洲猪瘟病毒p54蛋白的重组猪繁殖与呼吸综合征病毒或其免疫原性衍生物的疫苗组合物，其中所述表达非洲猪瘟病毒p54蛋白的重组猪繁殖与呼吸综合征病毒的嵌合重组质粒pA-ASFV-p54的全长序列如SEQ ID NO.7所示。

7.根据权利要求6所述的疫苗组合物，其中所述组合物还包含佐剂。

8.根据权利要求6所述的疫苗组合物，其中所述佐剂选自水包油佐剂、聚合物和水佐剂、油包水佐剂、氢氧化铝佐剂、维生素E佐剂及其组合。

9.根据权利要求6所述的疫苗组合物，其中所述组合物还包含药学上可接受的载体。

10.根据权利要求6所述的疫苗组合物，其中所述组合物还包含至少一种额外的抗原。