KR101209141B1

KR101209141B1 - 독성약화된 토끼 믹소마바이러스를 기본으로 한모노파라뮤니티 유발인자

Info

Publication number: KR101209141B1
Application number: KR1020067011956A
Authority: KR
Inventors: 안톤 메이어; 바르바라 메이어
Original assignee: 버베리안 노딕 에이/에스
Priority date: 2004-01-23
Filing date: 2006-06-16
Publication date: 2012-12-06
Also published as: EP2327420A3; US20080267920A1; US20120009217A1; AU2005205912B2; CA2547757A1; EP1711204A1; US8034356B2; UA91501C2; US7691391B2; WO2005070453A8; US20080213307A1; EA200601361A1; EA009937B1; JP2007534664A; DE102004003572A1; US20110014234A1; NO20063605L; US7494799B2; CN1909923B; US20100316671A1

Abstract

전형적으로 전신 질환에 걸린 토끼로부터 얻은 믹소마바이러스(Mysomaviruses) 균주의 바이러스 또는 바이러스 성분을 파라뮤니징(paramunizing)하는 것을 기본으로한 모노파라뮤니티(monoparamunity) 유발인자, 상기 모노파라뮤니티 유발인자의 제조 방법 및 사람 및 동물에서 다양한 기능장애르 예방 및 치료하기 위한 파라뮤니징 활성의 조절 최적화를 위한 의약으로서 상기 유발인자의 용도에 관한 것이다.

독성약화, 믹소마바이러스, 파라뮤니티, 모노파라뮤니티, 파라뮤니징, 유발인자

Description

독성약화된 토끼 믹소마바이러스를 기본으로 한 모노파라뮤니티 유발인자{MONOPARAMUNITY INDUCERS BASED ON ATTENUATED RABBIT MYXOMA VIRUSES}

본 발명은 독성약화(attenuated)된 토끼 믹소마바이러스(Mysomaviruses) 균주로부터 바이러스 또는 바이러스 성분이 유래된 것을 특징으로 하는 바이러스 또는 바이러스 성분을 파라뮤니징(paramunizing)하는 것을 기본으로 한 모노파라뮤니티(monoparamunity) 유발인자, 상기 모노파라뮤니티 유발인자의 제조 방법 및 상기유발인자의 약물로서의 용도에 관한 것이다.

고도로 발달된 생물체의 내인성 면역계, 특히 포유동물 및 조류의 내인성 면역계는 항원-특이적 부분 및 항원-비특이적 부분을 포함한다. 면역계의 양쪽 부분은 서로 연결되며 또한 서로 상호작용한다. 항원-특이적 메카니즘은 면역 형성에 관여하고, 항원-비특이적 메카니즘은 파라뮤니티 형성에 관여한다. 파라뮤니티는 급속하게 발달하고, 시간 제한되며, 증가된 다수의 상이한 병원체, 항원 및 기타 병독으로부터 보호와 결부된, 잘 조절되고 적합하게 작용하는 비특이적 방어계를 지칭한다. 파라뮤니티의 발달의 기본은 병력 및 기능적 이유로 인하여, 계통발생학적 관점에서 오래되고 원시적으로 불리는 비선택적이고 조건부로 선택적인 파라특이적 방어 메카니즘이다.

항원-비특이적 면역계의 파라특이적 활성("선천적 면역계")은 예컨대 외래 물질-소비 소기관(organelles)과 같은 비선택적 보호 요소, 및 예컨대 작은포식세포(microphage) 및 대식세포(macrophage)와 같은 조건부 선택적 보호 요소, 천연 킬러 세포, 수상 세포 및 사이토카인과 같은 가용성 인자를 포함하며, 이들의 기원에 따라 병원체-비특이적 또는 항원-비특이적 반응을 나타낸다.

파라특이적 활성은 항원 접촉한 직후에 관련 생물에서 관찰되는 반면에, 항원-특이적 면역계의 효과는 수일 또는 수주가 지나야 나타난다.

더욱 고도로 조직화된 생명형태에서는, 제거할 수 없었거나 항원 특성을 갖는 병독에 대하여 특이적 방어 계를 형성하기 위해서 시간이 더 소요될 수 있다.

파라뮤니제이션(paramunization), 즉 환자에서 예방 및 치료를 위한 면역계의 파라특이적 활성의 이점은 그 개발 이후 점점 분명해지고 있다(Anton Mayr, "Paramunisierung: Empirie oder Wissenschaft", Biol. Med. edition 26(6): 256-261, 1997). 파라특이적 방어는 생물이 다양한 외래 물질, 감염성 병원체, 독소 및 형질변형된 내인성 세포와 접촉 즉시 그 자신을 보호할 수 있도록 한다.

면역계의 파라특이적 활성과 특이적 활성 사이에는 밀접한 상호작용이 있으며, 정보의 흐름은 일반적으로 초기에 반응하는 파라특이적 부분으로부터, 면역계의 후기 개시로(예컨대, 항원 매개에 의해) 특이적 부분으로 진행된다. 특히 독성 병원체와의 감염의 경우, 생물의 파라특이적 방어는 특이적 면역(예컨대 항체, 면역 세포)이 생길 때 까지 걸리는 시간을 이러한 방식으로 커버할 수 있다.

파라특이적 면역 방어는 생리학적 과정이며 환경과 접촉에서 "일차 제어"로 정의할 수 있다. 이들은 하등 생물에 필수적일 뿐만 아니라 보다 더 발달된 생물 및 고등 척추생물에 필수적이다. 생물학적 방어 계에서 주요한 선천적인 결함은 생명을 위협하는 상황을 초래한다. 언급할 수 있는 일례는 인간에서 "세디아크-슈타인브링크-히가시 증후군"이며, 이것은 과립구 결핍 및 천연 킬러 세포(NK 세포)의 기능장애를 특징으로 하며, 대부분의 경우 수명 10년이 완료될 때 환자의 치사를 초래한다.

파라뮤니티 상태는 식균작용의 속도 증가, 자발적 세포-매개 세포독성(NK 세포)의 증가 및 다른 림프세망 세포의 활성증가를 특징으로 한다. 동시에 세포 요소에 대해 및 서로에 대하여 자극 및/또는 억제 효과(예컨대 리프레서 메카니즘을 통하여)를 갖는 특정 사이토카인의 방출도 존재한다. 자신의 다양한 수용체, 이팩터(effector)와 표적 세포 및 신호-전달 사이토카인과의 파라뮤니티의 밀접하게 연결되고 단계적으로 반응하는 생물학적 계는 또한 호르몬 및 신경계에 완전히 연결된다. 따라서 이것은 신호전달(communication), 상호작용 및 조절 네트워크의 중요한 요소를 나타낸다.

파라뮤니티는 파라뮤니제이션(paramunization)에 의해 유도된다. 이러한 파라뮤니티는 면역계의 파라특이적 부분의 세포 요소의 약리학적 활성화 및 그와 결부된 사이토카인의 생산을 의미하며, 이는 기능장애를 제거하고, 개인의 비-병원체 특이적 및 비-항원 특이적 보호를 급속히 증가시키며(최적 생체조절), 스트레스 등의 결과로 생기는 면역억제 또는 면역결핍을 제거하며(예컨대 약리적으로), 결핍을 수선하며 및/또는 면역계, 호르몬계 및 신경계 사이의 조절자로 작용하는 것을 목적으로 한다. 이것은 파라뮤니제이션의 유형 및 예컨대 환자의 건강 상태와 같은 반응에 따라서 특정의 비특이적 내생 방어 과정이 증강될 수 있거나, 보강되거나 또는 억제될 수 있음을 의미한다.

파라뮤니티 유발인자는 파라뮤니제이션에 이용되며 무해 및 효능에 관한 트정 기준을 충족해야하므로, 면역자극제와 다르다. 파라뮤니티 유발인자 그 자체는 항체 또는 화학물질, 항생물질, 비타민 또는 호르몬과 다르다. 그와 반대로, 파라뮤니티 유발인자는 단계적 메카니즘에 의하여 파라특이적 면역계를 활성화하여 면역계가 충분히 세포 및 호르몬 방어 계를 가동시키게 한다. 이러한 경우에서 파라뮤니티 유발인자는 면역 방어에 대해 조절 효과 및 보수 효과를 갖는다. 파라뮤니티유발인자의 작용 모드에 관해서는, 유발인자는 식균 세포(수용체 세포)에 의해 포획되어 활성화되어서 매개인자(mediator)를 방출하고 이것이 이팩터 세포를 이동시키는 것으로 알려져 있다. 이것은 결국 파라특이적 방어의 조절 메카니즘을 개시시킨다.

파라뮤니징(paramunizing) 특성을 갖는 상이한 폭스바이러스(poxivirus) 균주로부터 유도된 2 이상의 폭스바이러스 성분의 조합물을 기본한 다수의 파라뮤니티 유발인자는 유럽특허 EP 0 669 133 B1호에 기재되어 있다.

본 발명은 독성약화된 믹소마바이러스 및/또는 이들의 바이러스 성분의 파라뮤니징 특성을 기본으로 한다.

독성약화(attenuation)는 감염성 병원체의 특성 조절로 병원체의 약화를 초래하는 것을 의미한다("독성화" = 약화, 감소화). 감염성 병원체의 변형은 자연적으로 흔히 생길 수 있으며, 수세기에 걸친 시간 동안에 가능할 수 있다.

환경적 변화에 적응하기 위해 감염성 병원체가 변화하는 능력은 실험적으로 이용될 수 있으며, 독성약화에 필요한 시간은 특정 계에서 장기간에 걸친 계대접종(passage)에 의해 현저하게 단축될 수 있다. 독성약화는 지금까지 비독성 접종 균주 및 무해한 파라뮤니티 유발인자를 얻기 위하여 이용되어 왔다.

독성약화는 보통 독성 및 감염성의 상실, 면역화 특성과 숙주 범위의 감소 및 바람직하게는 말단 영역에서 결실 발생에 따른 병원체 게놈에서의 간소한 변화를 초래한다. 변형된 병원체의 파라뮤니징 활성의 평행 증가도 존재한다.

드문 경우로, 독성약화는 유전자 조작에 의한 실험적 독성약화를 실시한 경우, 독성 및 전염성의 증가를 초래할 수 있다.

믹소마바이러스는 다른 감염 질환과는 달리, 머리와 몸 전체, 바람직하게는 항문 영역, 외음부 및 관에 출혈열 피하 부종을 갖고 주기적으로 진행되는 야생 토끼 및 집토끼의 전염성 전신적 바이러스 질환인 점액종증의 병원체이다. 점액종증이 이전에 없었던 나라에 점액종증이 도입되면 급속하고도 치명적인 진행이 초래된다. 이 바이러스가 유행한 후, 질병의 특징은 감염증이 임상적으로 사라질 때까지 변화된다(Mayr A.: Medizinische Mikrobiologie, Infections- und Seuchenlehre, 7th edition, Enke-Verlag, Stuttgart, 2002 참조).

상기 질병은 신세계에서만 존재하는 실비라구스(Sylvilagus) 속(genus)의 미국 흰꼬리 토끼에 만연되어 있다. 이들 야생 토끼는 이 질병의 유일한 천연 저장생물이다. 이들 중에서 감염은 경증상이다. 대조적으로, 상기 질병은 상기 병원체가 도입되었을 때 호주에 토착한 오릭토라구스(Oryctolagus) 속의 유럽 야생토끼 및 집토끼에서는 거의 100% 치사율을 갖는다.

믹소마바이러스(레포리폭스바이러스(Leporipoxvirus) 속)의 천연 숙주 범위는 좁다. 일반적으로, 이 바이러스는 미국 흰꼬리 토끼 및 유럽 집토끼와 야생토끼에서만 복제된다. 그러나, 유럽의 야생 산토끼(hare)에서도 일부 감염이 확인되었다. 다른 종 및 인간으로 감염시키려는 시도는 부정적인 결과를 나타내었다.

본 발명은 인간의 약물 및 수의과 약물용의 신규 모노파라뮤니티 유발인자를 제공하는 것을 목적으로 한다. 본 발명의 다른 목적은 이러한 모노파라뮤니티 유발인자의 제조방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 모노파라뮤니티 유발인자를 기본으로한 약물로 사용하기 위한 약학 조성물을 제공하는 것이다.

따라서, 본 발명은 바이러스 또는 바이러스 성분이 독성약화된 토끼 믹소마바이러스 균주로부터 유도된 것을 특징으로 하는 바이러스 또는 바이러스 성분을 파라뮤니징하는 것을 기본으로 한 모노파라뮤니티 유발인자에 관한 것이다. 바이러스 성분은 바람직하게는 파라뮤니징 바이러스 외피(envelope) 또는 독성약화된 믹소마바이러스 균주의 바이러스 외피의 변종 형태를 포함한다. 본 발명의 파라뮤니징 특성을 갖는 바람직한 균주는 M-2, M-7, 록산느(Lausanne), Aust/Uriarra/Verg-86/1 균주이다. M-2, M-7, 록산느(Lausanne), Aust/Uriarra/Verg-86/1 균주는 또한 적합한 면역 효과를 갖기 위하여 이들의 독성을 일부만 약화시켰기 때문에 생백신 생성에도 적합하다.

믹소마바이러스 균주 M-2를 기본으로한 모노파라뮤니티 유바인자가 특히 바람직하다. 이후에 기재된 본 발명에 따른 방법으로 제조된 독성약화된 믹소마바이러스 균주는 영국 윌트셔 살리스베리에 소재하는 퍼블릭 헬쓰 라보라토리 서비스(PHLS: Public Health Laboratory Service), Center for Applied Microbiology & Research, 유럽 동물 세포 배양물 기탁소(European Collection of Animals Cell Culture, ECACC)에 기탁번호 03121801호로 기탁되어 있다.

본 발명은 또한 독성약화된 토끼 믹소마바이러스 균주를 기본으로 한 모노파라뮤니티 유발인자의 제조방법에도 관한 것이다. 이를 위하여, 전신 점액종증에 전형적으로 걸린 토끼의 감염된 조직으로부터 먼저 믹소마바이러스를 분리한다. 이 바이러스를 허용성 세포계, 즉 바이러스의 복제를 허용하는 세포물질, 예컨대 세포 배양액, 배양된 계란 또는 기타 실험 동물에 순응(adapted)시킨다. 천연 숙주의 세포 또는 순응을 위한 숙주와 밀접하게 관련된 종의 세포를 이용할 수 있다. 믹소마바이러스에 대한 적합한 허용성 세포 계의 예는 닭 배아 섬유아세포(CEF) 뿐만 아니라 토끼 신장 또는 고환으로부터 생성된 세포 배양액이다.

본 발명에 따르면 분리한 믹소마바이러스는 2 내지 6회 계대배양하는 동안, 특히 바람직하게는 3회 계대배양되는 동안 배양된 계란의 장뇨막(chorioallantoic membrane, CAM)에 순응되는 것이 바람직하다. 이러한 순응화를 위하여, 분리한 바이러스를 CAM에 접종하고 CAM 상에서 계대배양에 의해 복제한다.

믹소마바이러스는 허용성 세포 계에서 복제에 의해 감염 조직으로부터 분리되는 것이 바람직하다. 이를 위하여, 허용성 세포 계를 예컨대 파쇄에 의해 얻은 감염된 조직 균질물로 접종시킬 수 있다. 이어, 초기 복제에 의해 얻은 바이러스는 분리에 이미 사용되었던 동일한 허용성 세포계에 순응되거나 다른 허용성 세포계를 이용하여 순응시킬 수 있다. 분리에 사용되었던 동일한 허용성 세포계에 바이러스를 순응시키는 것이 바람직하다. 따라서 바람직하게는 감염된 조직으로부터 얻은 믹소마바이러스는 허용성 세포계에서 복제에 의해 분리한 다음 다른 계대배양에 의해 허용성 세포계에 순응된다. 배양된 계란의 CAM 상에서 복제에 의해 믹소마바이러스를 초기 배양 및 분리한 이후에 추가의 계대 배양에 의해, 바람직하게는 2회의 계대배양에 의해 CAM상에서 바이러스의 순응화하는 것이 특히 바람직하다. 그러나, 배양 및/또는 순응화하기 위해 배양 계란의 요막액(allanotoic fluid)을 사용할 수도 있다.

실제의 독성약화는 바이러스의 독성약화 또는 소망하는 정도의 독성약화에 도달할 때까지 1 이상의 허용성 세포 배양액 상에서 장기간 계대배양하는 것에 의해 실시된다. 이러한 목적으로 다양한 허용성 세포계를 바이러스 복제에 대해 시험한 다음 추가의 계대배양하는 동안 최고 감염 역가에 도달한 1 이상의 세포계를 선택할 수 있다. 1차 및 2차 세포 배양액뿐만 아니라 영구 및 연속적 세포주가 장기간 계대배양에 의한 독성약화에 적합하다. 따라서, 독성약화는 1차 또는 2차 닭 배아 섬유아세포(CEF) 배양액 또는 영구 CEF 세포의 배양액에서 복제에 의해 실시될 수 있다.

믹소마바이러스의 독성약화를 위해 본 발명에 따른 바람직한 것은 바이러스를 영구 세포 배양액, 특히 베로(Vero) 세포 배양액에서 바람직하게는 80 내지 150회 계대배양, 특히 바람직하게는 120회 계대배양하는 것에 의해 복제시키는 것이다. 다르게는 또는 부가적으로, 상기 바이러스는 바이너리 영구세포주에서 계대배양되며, AVIVER 세포가 바람직하게 사용된다. 이들 세포 또는 세포 배양액은 닭 배아 섬유아세포(CEF) 및 Vero 원숭이 신장 세포 사이의 세포 융합에 의한 얻은 것이다. 본 발명의 믹소마바이러스 독성약화를 위하여, 분리되고 순응화된 바이러스는 바람직하게는 첫 단계로 Vero 세포 배양액에서 계대배양된 다음 이들 바이러스를 바이너리 AVIVER 세포 배양액으로 전달한 다음 여기서 10 내지 50회, 특히 20 내지 30회, 특히 바람직하게는 25회에 걸쳐 계대배양하여 복제시킨다.

독성약화된 믹소마바이러스는 추가의 독성약화 계대배양에 의해 부가적으로 복제될 수 있다. 바이러스의 부가적 복제는 바람직하게는 Vero 원숭이 신장 세포에서 특히 100 내지 200회 계대배양에 의해 실시될 수 있다.

특히 바람직한 추가의 방법 단계는 독성약화된 믹소마바이러스의 부가적인 불활성화이다. 불활성화는 화학 처리, 조사, 열 또는 pH의 작용, 특히 베타-프로피오락톤에 의한 화학처리에 의해 실시할 수 있다. 독성약화된 믹소마바이러스를 베타-프로피오락톤으로 처리하면 파라특이적 활성을 향상시키는 한편, 독성약화 후에도 존재하는 면역특성은 상실된다.

본 발명의 방법의 특히 바람직한 구체예는 다음 단계를 포함한다:

- 배양된 계란의 장뇨막(CAM) 상에서 복제한 다음 바이러스를 2회의 추가 계대배양에 의해 CAM에 순응화시키는 것에 의해, 전신 점액종증에 걸린 토끼의 감염 조직으로부터 믹소마바이러스를 분리하고;

- 분리한 바이러스를 Vero 세포 배양액에서 계대배양에 의해, 바람직하게는 120회의 계대배양에 의해 독성약화시키며;

- 닭 배아 섬유아세포(CEF) 및 Vero 원숭이 신장 세포 사이의 세포 융합에 의해 얻은 바이너리 AVIVER 세포 배양액에 상기 바이러스를 전달하고, 상기 세포 배양액에서 10 내지 50회, 바람직하게는 25회의 계대배양에 의해 바이러스의 독성약화시키고;

- 상기 바이러스를 Vero 원숭이 신장세포로 다시 전달하고 Vero 세포에서 바람직하게는 약 150회 계대배양에 의한 독성약화시키는 것에 의해 바이러스를 복제시키며; 또 경우에 따라

- 독성약화된 믹소마바이러스를 베타-프로피오락톤 처리시키는 것에 의해 독성약화된 믹소마바이러스를 불활성화하며, 이에 의해 파라특이적 활성은 증가되는 반면에 독성약화 후에도 여전히 존재하는 면역특성은 상실됨.

장기간 계대배양에 의한 독성약화는 통상 3 내지 5 플라크 체외희석(end dilution)에 의해 종결된다. 다양한 클론을 얻어 시험한 후, 추가의 복제를 위해 선택한 클론은 최고의 감염 역가를 달성하고 예컨대 베이비 마우스에서 VSV 도전시험(challenge test)에서 높은 파라뮤니징 활성이 검출되는 클론이다. 이러한 과정은 유전적으로 균일한 바이러스 물질이 다른 용도를 위해서도 제공될 수 있음을 확실히 하기 위해서이다.

본 명세서에서 사용된 용어 "독성약화"는 원래는 독성인 믹소마바이러스를 변형태로 만드는 동시에 파라뮤니징 특성은 향상시키는 실험적 변형을 지칭한다. 독성약화는 1 이상의 하기 특성을 통하여 검출될 수 있다:

- 유럽 집토끼 및 야생토끼(오릭토라구스 카니쿨루스(Oryctolagus caniculus) csp 속)에 대한 독성의 감소 또는 약화 또는 상실,

- 전염성의 약화 또는 상실,

- 세포 배양액에서 숙주 범위의 제한,

- 면역 특성의 변화,

- 파라뮤니징, 단기 보호 활성의 습득.

독성약화는 믹소마바이러스 게놈의 말단 영역에서 결실을 초래할 수 있다. 독성약화 정도의 증가는 바이러스 게놈에서의 결실 갯수의 증가와 관련된 것으로 관찰된다.

독성약화의 정도는 당해 분야에 공지된 적합한 활성 시험(예컨대, 미국특허 6,805,870호, 칼럼 12, 및 본 문헌에 인용된 참고문헌 참조)에 의해 및 클로닝에 의해 계대배양하는 동안 확인되고 모니터링될 수 있다.

본 발명은 또한 본 발명의 방법에 의해 얻을 수 있는 독성약화된 믹소마바이러스, 독성약화된 믹소마바이러스 또는 본 발명의 믹소마바이러스 모노파라뮤니티 유발인자를 포함하는 약학 조성물, 및 포유동물에서 파라특이적 면역 계를 활성화시키기 위한 믹소마바이러스 모노파라뮤니티 유발인자의 용도 및 상응하는 의약을 제조하기 위한 독성약화된 바이러스의 용도에 관한 것이다.

놀랄만한 파라뮤니징 특성으로 인하여, 본 발명의 믹소마바이러스 모노파라뮤니티 유발인자는 면역계 기능장애, 면역억제, 면역결핍 장애, 호르몬, 순환, 대사 및 신경계의 항상성의 기능장애, 위협된 신생아 감염, 신생물 질환, 바이러스 질환, 세균성 질환, 요법 내성 감염성 인자 질환, 바이러스 및 세균성 혼재 감염, 감염성 과정의 만성적 감염, 다양한 병인에 의한 간 질환, 만성 피부 질환, 포진성 질환, 만성 간염, 인플루엔자 감염, 내독소 손상을 비경구적으로 치료하고 및/또는 예방하기에 적합하다.

본 발명의 모노파라뮤니티 유발인자는 일반적으로 환경에 대해 무해하고 예컨대 사람, 말, 개, 고양이, 돼지와 같은 포유동물, 조류 및 도마뱀, 뱀, 거북과 같은 파충류에 대한 파라뮤니징하는 의미에서 효과적이다. 따라서, 이들은 인간 및 수의과 의약으로 특히 적합하다.

또한 본 발명의 모노파라뮤니티 유발인자는 강력한 효력과 함께 아주 양호한 파라뮤니징 활성을 나타낸다. 이들은 본 발명의 방법에 의해 적합한 방식으로 제조될 수 있으며 의약 분야에서 사용하기에 안전하다. 믹소마바이러스의 독성약화는 믹소마바이러스의 면역 특성을 감소시키는 한편, 파라특이적 활성은 증가된다. 본 발명의 모노파라뮤니티 유발인자는 파라뮤니징 활성을 갖지만 면역활성은 갖지 않으며, 복수 및 연속 사용을 가능하게 한다. 토끼 믹소마바이러스 및 그의 파라뮤니징 바이러스 성분의 파라뮤니징 특성은 놀라운 것이며 예상할 수 없는 것이었다.

본 발명과 관련하여 사용한 용어 "파라뮤니제이션"은 파라특이적 면역계의 세포 요소의 약리학적 활성 및 그와 관련한 사이토카인의 생산 또는 방출을 지칭하며, 이들의 목적은 기능장애의 제거, 개인의 비-병원체-특이적 및 비-항원-특이적 보호의 급속한 증가, 및 면역계, 호르몬계, 신경계 및 혈관계 사이의 조절 효과를 갖는 것이다. 파라뮤니제이션은 파라뮤니티의 보호된 상태를 초래한다.

본 발명과 관련하여 사용된 용어 "파라뮤니티"는 다수의 병원체, 항원 및 기타 병독으로부터 급속하게 생기는 시간제한된 보호와 관련된 파라특이적 방어계를 적절히 조절하고 작용화하는 활발하게 획득된 상태를 지칭한다. 식균작용율, NK 세포(천연 킬러 세포)의 작용 및 기타 림프세망 세포(예컨대 수상 세포)의 활성은 생리적 최적상태로 증가되었다.

본 발명과 관련하여 사용된 용어 "파라뮤니티 유발인자"는 인간 및 동물에서 내생 방어 및 보호 메카니즘을 파라뮤니제이션 방식으로 생성하고 조절하기 위해 사용되는 발열원을 갖지 않는 비독성 의약을 지칭한다.

본 발명과 관련하여 사용된 용어 "믹소마바이러스 모노파라뮤니티 유발인자"는 생물, 바람직하게는 포유동물(예컨대 인간)에서 파라뮤니티 상태를 유발하는 파라뮤니징 바이러스 성분 및 그의 요소를 비롯한, 독성약화된 토끼의 믹소마바이러스 또는 독성약화된 믹소마바이러스 균주를 기본으로 한 의약을 지칭한다.

본 발명과 관련하여 사용된 용어 "믹소마바이러스"는 레포리폭스바이러스(Leporipoxvirus) 속의 점액종증 바이러스 종을 지칭한다. 믹소마바이러스는 코르도폭스비리디아애(Chordopoxviridiae) 아과(subfamily) 및 폭스비리다애(Poxviridae)(폭스바이러스) 과에 속한다.

본 발명과 관련하여 사용된 용어 "파라뮤니징 바이러스 성분"은 파라뮤니징 특성을 갖는 믹소마바이러스로부터 유도된 다수의 바이러스 구조를 포함하며, 예컨대 생존성 또는 불활성화된 새롭게 분리한 믹소마바이러스, 새롭게 분리된 믹소마바이러스로부터 유도된 생존성 또는 불활성화된 재조합 믹소바이러스, 바이러스 외피, 제거된 외피 및 이들 외피의 절단 생성물 및 변종 형태, 개별적 천연 또는 재조합 폴리펩티드 또는 단백질, 특히 새롭게 분리되고 유전학적으로 변형된 믹소마바이러스에 의해 재조합적으로 발현된 믹소마바이러스에서 생기는 막 및 표면 수용체 또는 이들의 유전 정보의 일부를 포함한다.

표 1 내지 4는 인간에서 독성약화된 점액종증 세포 배양 바이러스, 균주 M-2를 기본으로한 믹소마바이러스 모노파라뮤니티 유발인자 PIND-MYXO에 의한 임상 결과를 요약한다.

표 1은 사람에서 믹소마바이러스 모노파라뮤니티 유발인자 PIND-MYXO의 예방적 용도에 대한 임상 결과를 나타낸다.

표 2는 사람에서 믹소마바이러스 모노파라뮤니티 유발인자 PIND-MYXO의 치료적 용도에 대한 임상 결과를 나타낸다.

표 3은 낮은 면역 변수(PIND-MYXO 투여한지 7일 후)를 갖는 환자에서 믹소마바이러스 모노파라뮤니티 유발인자(PIND-MYXO)에 의한 파라뮤니제이션의 효과를 나타낸다.

표 4는 증가된 면역 변수(PIND-MYXO 투여한지 7일 후)를 갖는 환자에서 믹소마바이러스 모노파라뮤니티 유발인자(PIND-MYXO)에 의한 파라뮤니제이션의 효과를 나타낸다.

본 발명은 독성약화된 토끼 믹소마바이러스 또는 이들의 파라뮤니징 요소가 수용체 생물에서 아주 우수한 파라뮤니징 특성을 유도할 수 있어 파라뮤니티 보호 상태를 초래한다는 놀라운 발견을 기초로 한다. 본 발명의 기초는 세포 배양액에서 믹소마바이러스의 최초의 성공적인 독성약화이었다.

본 발명의 모노파라뮤니티 유발인자는 바람직하게는 동결건조되고, 독성약화되며 불활성화된 토끼 믹소마바이러스 또는 이들의 파라뮤니징 바이러스 성분을 기본으로 한다. 본 발명의 독성약화된 믹소마바이러스 또는 이들의 바이러스 성분은 바람직하게는 1개 믹소마바이러스 균주 또는 복수의 상이한 독성약화된 믹소마바이러스 균주로부터 유도된다. 이와 관련하여 본 발명의 모노파라뮤니티 유발인자는 1 이상의 믹소마바이러스 또는 이들의 파라뮤니징 바이러스 성분의 조합물을 포함하는 것이 바람직하다.

믹소마바이러스 모노파라뮤니티 유발인자를 투여하는 것을 통하여 예컨대 인간과 같은 포유동물에서 유도된 파라뮤니징 특성은 기능장애의 제거, 개인의 비-항원-특이적 보호 향상, 스트레스 등의 결과(예컨대, 약물학적)로 생긴 면역억제 또는 면역결핍의 제거 및 면역계, 호르몬계 및 혈관계 사이의 조절 효과를 갖기 위하여 특히 유리하다.

본 발명은 또한 세포 배양액을 계대배양하는 것에 의해 믹소마바이러스 균주의 독성 및/또는 면역특성을 감소되거나 상실하게하는 믹소마바이러스 균주의 성공적인 독성약화를 기본으로 한다. 믹소마바이러스의 부가적인 불활성화는 또한 조사, 열 또는 pH의 작용 또는 특히 바람직하게는 베타-프로피오락톤을 사용한 화학적 처리에 의해 실시될 수 있다. 모노파라뮤니티 유발인자는 독성약화된 동결건조된 믹소마바이러스를 기본으로하며, 생물에서 파라뮤니징 활성을 유도하기에 적합한 믹소마바이러스의 개별 바이러스 성분도 본 발명에 포함된다.

이하는 세포 배양액 계대배양을 통하여 분리되고 독성약화된 토끼 믹소마바이러스 균주를 기본으로 한 모노파라뮤니티 유발인자에 대한 본 발명의 제조방법의 일개 구체예를 기재한다. 이 제조방법은 이하의 바람직한 균주에 한정되지 않으며, 다른 토끼 믹소마바이러스 균주에 대해서도 동일한 방식으로 적용될 수 있다. 유전자 변형에 의해 생성된 믹소마바이러스 균주의 재조합 형태도 본 발명에 포함된다. 이와 관련하여 사이토카인을 코딩하는 게놈에서 1 이상의 절편이 부가, 치환 또는 결실 형태로 변형되어 사이토카인 수용체의 수용체 특성이 상실되는 재조합 믹소마바이러스 균주가 바람직하다. 이들은 바람직하게는 인터페론(IFN), 인터루킨(IL) 및 종양 괴저 인자(TFN), 특히 IFN-α-R, IFNγ-R, TNF-R, IL-1-R, IL-2-R, IL-6-R 및 IL-12-R에 대한 수용체를 코딩하는 유전자 절편이다.

또한 세포 배양에 대한 배양시간 또는 계대배양 회수에 관하여 언급된 숫자는 제한을 의미하지 않는다. 당업자에게 분명하고 독성약화된 믹소마바이러스의 제조를 초래하는 이들 변수 및 변형의 약간의 변화는 본 발명의 범위에 동일하게 포함된다.

본 발명의 바람직한 구체예는 믹소마바이러스 균주 M-2의 성공적인 독성약화에 관한 것이다. 믹소마바이러스 균주 M-2는 점액종증에 걸린 유럽 야생 토끼로부터 분리하였다(Herrlich A., Mayr A. and Munz E.: "Die Pocken", 2nd edition, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, 1967). 병든 토끼의 피하 조직으로부터 얻은 변형된 피부 세포는 분쇄후 바람직하게는 10 내지 12일간 배양된 계란의 장뇨막(CAM)에 접종하였다. 믹소마바이러스는 더 복제된 다음 2 내지 6회, 바람직하게는 3회의 계대배양에 걸쳐 장뇨막상에서 순응화된다(CAM 계대배양, 방법의 경우, Herrlich A., Mayr A. and Munz E.: "Die Pocken", 2nd edition, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, 1967 참조). 2 내지 6회 계대배양, 바람직하게는 3회 CAM 계대배양되면 세포 배양에서 믹소마바이러스의 추가의 독성약화를 위한 출발물질로 이용될 수 있다. 독성약화는 장뇨막에서 3단계의 바이러스 순응화 후에 생긴다(장뇨막 상의 전형적인 부위로부터 확실). 제1 단계에서, 80 내지 150회, 바람직하게는 120회의 연속적인 소위 체외희석 계대배양을 Vero 세포(Vero 세포, ATCC CCL-81)에서 실시한다. 이들 계대배양 처리 받은 믹소마바이러스의 독성은 약화된다.

Vero 세포에서 80 내지 150회 계대배양후, 바람직하게는 120회 계대배양후의 제2 단계에서, 바이러스 현탁액을 소위 AVIVER 세포로 전달하고 10회 내지 50회 계대배양, 바람직하게는 20 내지 30회, 특히 25회 계대배양을 계속하였다. AVIVER 세포는 닭 배아 섬유아세포(CEF) 및 Vero 세포 사이의 세포 융합에 의해 얻으며 이후 바이너리 영구 세포 배양액이라 칭한다.

AVIVER 세포 상에서 마지막 계대배양, 바람직하게는 25회 계대배양액을 다시 Vero 세포로 전달하고 Vero 세포에서 100 내지 200회 계대배양, 바람직하게는 약 157회 계대배양하도록 제3 단계 독성약화로 계속하였다. 이렇게하여, 총 300회 이상의 세포 배양액 계대배양에 걸쳐 믹소마바이러스를 복제하였다. 세포 배양에서 제3 단계의 믹소마바이러스 복제후, 믹소마바이러스는 충분히 독성약화된다.

Vero 세포 배양액 및 AVIVER 세포는 완전 합성 배지, 특히 바람직하게는 MEM 배지(최소 필수 배지) + 5 내지 20%, 바람직하게는 10% BMS(혈청 치환 배지) 및 5 내지 20%, 바람직하게는 10% 락트알라닌 가수분해물을 사용하여 배양된다. 배양 배지 교체후에 사용된 바이러스 배지는 바람직하게는 5 내지 20%, 바람직하게는 10%의 락트알부민 가수분해물을 갖고, BMS 또는 소태아 혈청 및 항생물질을 함유하지 않는 MEM 배지이다. 모든 제조 방법은 바람직하게는 pH 7.0 내지 8.0, 바람직하게는 pH 7.25에서 실시된다. 10^5.0 내지 10^7.5, 바람직하게는 10^6.5 이상의 TCID₅₀/ml (TCID₅₀ = 50% 조직 배양 감염성 투여량)의 역가를 갖는 바이러스 수집물은 본 발명의 모노파라뮤니티 유발인자 PIND-MYXO를 제조하기 위한 출발물질로서 적합하다.

Vero 세포에서 믹소마바이러스의 복제는 전형적인 세포독성 효과(cpE)를 초래하며, 이것은 궁극적으로 감염 세포의 파괴(용균)을 특징으로 한다. 약 10 MOI (감염 다중도)의 투여량으로 접종하면 짧은 라운딩 상(1-2일) 후에 약 3일 동안 그물홍반 세포 구조를 초래하며 약 5일 후에는 세포의 용균을 초래한다. Vero 세포에서 301회 계대배양하면 약 10^6.5 TCID₅₀/ml 의 감염 역가를 가졌다.

독성약화된 믹소마바이러스는 0.01 내지 1%의 베타-프로피오락톤, 바람직하게는 0.05% 베타-프로피오락톤 농도로 베타-프로피오락톤으로 화학처리함으로써 불활성화된다. 이러한 불활성화는 본 발명에 여전히 존재하는 면역특성의 완전한 손실을 초래하는 반면에, 파라특이적 활성은 보유될 뿐만아니라 사실상 현저히 증가한다.

독성약화되고 불활성화된 믹소마바이러스를 믹소마바이러스 모노파라뮤니티 유발인자(PIND-MYXO)에 더 처리시키기 위하여, 바이러스 불활성화에 사용된 바이러스 출발 물질은 약 10^5.0 내지 10^7.0 TCID₅₀/ml, 바람직하게는 10^6.5 이상의 TCID₅₀/ml의 바이러스 역가를 가져야 한다.

정제(Purification)는 바람직하게는 낮은 회전(예컨대, 1000 rpm)으로 원심분리함으로써 실시한다. 원심분리 후, 0.5 내지 10% 숙시닐화된 젤라틴(에컨대 폴리젤린, 예컨대 하우스만 제조, 에스 갈렌/스위스), 바람직하게는 5% 숙시닐화된 젤라틴을 부가한다. 생성한 혼합물을 적합한 멸균 유리 바이얼 앰플에서 1.5 ml 부분씩 동결건조될 수 있으며, 필요한 경우 증류수에 용해시켰다. 증류수에 용해된 0.5 내지 2 ml 부피, 바람직하게는 1.0 ml 부피의 동결건조물은 근육내 투여시 사람에 대한 접종 투여량에 상응한다(Mayr A. and Mayr B.: "Von der Empirie Zur Wissenschaft", Tieraerzl. Umschau, edition 56: 583-587, 2002 참조).

독성약화는 전염성 상실, 세포 배양시 숙주 범위의 실질적으로 완전한 제한 및 면역특성의 변경을 통하여 유럽 집토기 및 야생 토끼에 대한 독성 손실을 통하여 임상적으로 검출될 수 있다.

동결건조된 생성물은 바람직하게는 약 +4℃의 온도 또는 저온, 바람직하게는 약 -60℃에서 무제한적으로 안정하게 저장될 수 있다.

독성약화된 믹소마바이러스의 유전자 조사에 의하면 믹소마바이러스 게놈에서 복수의 결실이 생겼음이 밝혀졌다. 초기 균주 M-2의 경우, 믹소마바이러스 게놈은 단일한 직선의 데옥시리보핵산(DNA) 으로 구성되며 총 길이가 약 160 킬로베이스(Kb)로서 수백개의 단백질을 코딩한다(Herrlich A., Mayr A. and Munz E.: "Die Pocken", 2nd edition, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, 1967). 말단에 위치한 IR(inverted repeats)의 서열(말단 반전 반복부위, TIR)은 게놈 절편의 약 11 kb에 위치한다(McFadden, G. and Graham K.: "Modulation of cytokine networks by pox virus", Virology, edition 5: 421-429, 1994).

따라서, 연속적인 Vero 세포 계대배양 동안 믹소마바이러스의 독성약화는 인터페론 α 및 γ(IFN α, IFNγ)에 대한 수용체, 종양 괴저 인자(TNF) 및 인터루킨(IL) 1, 2 6 및 12에 대한 코딩 유전자 절편의 손실을 초래한다. 이들 사이토카인은 비특이적 면역계의 파라특이적 방어 인자에 속하는 것이 중요하다. 사이토카인은 상응하는 바이러스 수용체에 대한 결합을 통하여 중화되므로, 바이러스는 비제한적으로 복제될 수 있다. 상술한 사이토카인 수용체를 코딩하는 유전자 절편의 결실은 주로 DNA의 말단 영역에 관련된다. 그러나, DNA의 보존되는 부분에서 AVIVER 세포 계대배양 동안 생기는 결실을 부가적으로 검출할 수 있었다. 이들 결실은 면역 항원결정기 및 독성 유전자를 코딩하는 2개 유전자에 관련된다. 이러한 유전자 변형은 면역화, 즉 항원-특이적 활성의 감소 및 독성약화된 믹소마바이러스의 파라특이적 활성의 자연적 증가 중의 어느 하나이다.

면역화 항원결정기 및 파라특이적 및 비특이적 항원결정기는 경쟁관계에 있다. 처음에 언급한 펩티드 또는 단백질의 감소는 파라특이적 활성 효과의 증가를 초래한다. 면역화 및 독성 증가 단백질의 잔기는 독성약화된 믹소마바이러스를 불활성화하기 위해 상기 기재한 방법에 의해 모노파라뮤니티 유발인자의 제조시에 제거된다.

PIND-MYXO로 불리는 본 발명의 모노파라뮤니티 유발인자는 독성약화된 믹소마바이러스 또는 그의 파라뮤니징 요소의 사용을 기본으로 하며, 환자에서 이하의 예방적 또는 치료적 적용을 위한 파라뮤니징 특성에 적합하다:

- 감염성 인자 질병 및 혼합 감염, 감염성 과정의 만성 출현, 고질적인 재발성 감염 및 화학요법 내성 세균 및 바이러스 감염

- 생물의 방어 계에서 약화된 방어 및 조절장애

- 위협받은 신생아 감염

- 특정 신생물 질병에 대한 보조 요법, 예컨대 전이 방지, 화학요법 및 방사능요법에 의한 부작용의 감소

- 호르몬계, 순환계, 대사계 및 신경계 사이의 항상성의 조절.

본 발명의 파라뮤니티 유발인자는 사람을 비롯한 포유동물, 조류 및 파충류에 비경구적으로 또는 국소적으로 투여될 수 있다. 파라뮤니티 유발인자의 국소 투여는 점막 및 피부에서 파라특이적 방어 메카니즘을 특이적으로 자극한다. 그러나, 약간의 전신 효과도 있다. 이와 대조적으로, 비경구적으로 투여된 파라뮤니제이션은 피부 및 점막에서 국소 방어 메카니즘에 거의 영향을 주지 않고, 바람직하게는 전신 효과를 갖는다.

사람 및 동물에서 다수의 비경구적 투여를 연속적으로 실시하여도 부작용은 생기지 않는다. PIND-MYXO의 사용 증상은 동물 및 사람에 있어서 동일하다. 동시에, 어려운 수술의 경우, 특히 말, 돼지, 개 및 고양이의 처리시에 태어난 날 즉시, 바람직하게는 태어난지 이틀날에 하는 것이 바람직하다. 말 및 돼지에서 단일 투여는 약 0.5 내지 5 ml의 용해된 동결건조물이고 개 및 고양이에서 단일 투여는 바람직하게는 2 ml, 0.5 ml 비경구적 투여이다. 본 발명에 따르면, 2차 반응을 피하고 또 백신의 투여시 면역화를 보조하기 위하여 특정 보호성 접종 하루 전에 및/또는 그와 동시에 PIND-MYXO를 비경구적으로 투여하는 것이 바람직하다.

본 발명의 일개 구체예는 피부 및 점막에서 파라뮤니티를 유도하기 위하여 국소 투여용 약학 조성물을 제조하는 것에 관한 것이다. 약학 조성물은 바람직하게는 독성약화되고 불활성화된 믹소마 세포 배양액 바이러스의 요소를 기본으로 하는 구강정 또는 빨아먹을 수 있는 정제에도 관한 것이다. 본 발명의 구강정은 바람직하게는 소르비톨, 폴리에틸렌 글리콜 6.00, 인산수소 칼륨, 티로스피롤 정제 에센스, 콜리돈 25 및 스테아르산 마그네슘을 부가하여 제조한다. 그러나 PIND-MYXO는 적합한 담체를 사용하여 경비적으로, 직장으로 또는 질내로 투여될 수 있다.

이하의 실시예는 본 발명의 바람직한 구체예이며 본 발명의 주제를 설명하기 위한 것이다.

실시예 1

10일 동안 배양된 계란(Valo 계란)의 장뇨막(CAM) 상에서 배양하는 것에 의해 본 발명의 모노파라뮤니티 유발인자 PIND-MYXO를 제조하기 위한 출발물질로서 점액종증에 걸린 유럽 야생 토끼(오릭토라구스(Oryctolagus) 속)의 부종성 피하조직으로부터 얻은 믹소마바이러스를 분리하고 Herrlich et al.의 방법에 의해 CAM 상에서 3회 계대배양하여 순응화시켰다(Herrlich A., Mayr A. and Munz E.: "Die Pocken", 2nd edition, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, 1967). 세번의 CAM 계대배양은 Vero 세포에서 제1 단계에서는 120회(ATCC CCL-81, WHO, American Type Culture Collection) 실시하고, 제2 단계에서는 AVIVER 세포 배양에서 24회 중간 계대배양으로 복제하였고 Vero 세포에서 제3 상으로 배양하였다. 전체적으로, 독성약화를 목적으로 약 300회 계대배양을 실시하였다. 이들 연속적인 체외희석 계대배양후, 원래 독성인 믹소마바이러스는 독성약화되었다.

독성약화된 믹소마바이러스를 Vero 세포에서 복제시켰다. MEM(최소 필수 배지) + 10% BMS(혈청 치환 배지) 및 10% 락트알부민 가수분해물로 구성된 완전한 합성 배지를 사용하여 Vero 세포 배양액을 배양하였다. 배양 배지로 교환한 후 사용된 바이러스 배지는 BMS 또는 10% 락트알부민 가수분해물을 갖지 않는 MEM이다. 모든 제조 방법은 pH 7.25 이상에서 실시하였다. 10^6.5 TCID₅₀/ml 이상의 역가를 갖는 바이러스 수집물은 본 발명의 모노파라뮤니티 유발인자 PIND-MYXO를 생산하기 위한 출발물질로 이용하였다. 0.05% 베타-프로피오락톤 및 저속 원심분리에 의해 바이러스 수집물을 불활성화한 다음 동결건조시키기 전에 5% 숙시닐화된 젤라틴(폴리젤린)을 바이러스 물질에 부가하였다.

동결건조된 생성물은 실온 및 약 4℃ 내지 -80℃의 온도에서 안정하며 약 4℃ 또는 약 -60℃ 에서 시간 제한없이 유지될 수 있다. 멸균 증류수에 용해된 동결건조물 1 ml는 접종 투여량에 상응한다. 깊은 근육내 투여 또는 국소 투여를 실시한다(실시예 3, 4 및 5 참조).

실시예 2

다인자 감염(예컨대 인플루엔자 감염)의 예방 또는 치료를 위해 본 발명의 PIND-MYXO 유발인자를 실시예 1에 기재된 것과 유사한 방식으로 건조 형태(동결건조물, 용해되지 않음)로 상부 호흡관의 점막에, 바람직하게는 코에 하루에 3회 국소투여(1ml/적용)하였다.

실시예 3

사람에서 피부의 관류를 향상시키고, 상처의 치료를 빨리하며 또 다양한 정맥 및 만성 정맥 부전(다리 궤양)을 치료하기 위해, 실시예 1에서와 같이 제조된 액체 형태의 PIND-MYXO 유발인자를 유사한 방식으로 경피적으로 문질렀다. 예컨대 상기 목적으로 이용하는 동결건조물은 그리시 크림(베판텐, 리놀라 지방) 형태일 수 있고, 이 경우 pH는 약 알칼리성이어야한다. 이 제제는 매 사용시 마다 새로 제조해야 한다. 손상되지 않은 피부에 손으로 문지는 것에 의해 하루에 수차례 투여하였다. 열창은 새로이 용해된 생성물을 상처 영역에 적가하는 것에 의해 치료할 수 있다. 치료는 치유될 때 까지 매일 실시해야 한다.

실시예 4

부반응을 방지하고 또 접종 결과를 향상시키기 위하여, 통상의 특이적 백신으로 보호 접종하기 하루 전 및 그와 동시에 실시예 1에서 제조된 모노파라뮤니티 유발인자 PIND-MYXO를 비경구적으로 투여하였다.

실시예 5

실시예 1에서와 같이 제조한 모노파라뮤니티 유발인자 PIND-MYXO를 유사하게 구강정 또는 빨아먹을 수 있는 정제로 만들었다. 귀, 코, 목 및 입의 점막의 국소적 파라뮤니제이션을 위한 빨아먹을 수 있는 정제의 생산 및 사용은 신규하며 본 발명의 구성을 이룬다. 입의 활성화된 점막을 통하여, 호밍(homing) 효과(방어 세포가 다른 기관 계의 점막으로 이동하는 효과) 뿐만 아니라 부분적 비경구적 파라뮤니제이션이 존재한다. 이하의 제조 방법은 구강정 및 빨아먹을 수 있는 정제의 제조에 적합한 것으로 밝혀졌다.

동결건조를 위하여, 젤라틴 대신에 5% 콜리돈 25(폴리비닐 피롤리돈)을 액체 유발물질에 부가하였다. 완성된 정제를 제조하기 위하여 우레아, 소르비톨, 폴리에틸렌 글리콜 6000 및 스테아르산 마그네슘이 필요하다. 500.5 mg 중량의 정제에 대한 바람직한 처방은 다음과 같다:

PIND-MYXO 동결건조물 65 mg

우레아 50 mg

소르비톨 267 mg

폴리에틸렌 글리콜 6000 118 mg

스테아르산 마그네슘 0.5 mg

정제 중량 500.5 mg

환자는 최적 파라뮤니제이션을 달성하기 위하여 매일 일정 간격으로 4-6개 정제를 취해야 한다.

다음 조성의 약학 조성물은 구강 정제를 제조하기에 적합한 것으로 밝혀졌다:

PIND-MYXO 동결건조물 155 mg

소르비톨 360 mg

폴리에틸렌 글리콜 6000 300 mg

인산이수소 칼륨 (KH₂PO₄), 무수 2 mg

인산수소 이나트륨 (Na₂HPO₄), 무수 8 mg

티로스피롤 에센스 정제 0.8 mg

스테아르산 마그네슘 20 mg

정제 중량 500.5 mg

정제를 환자의 입에 서서히 녹히고 용해후 삼킬 수 있다.

믹소마바이러스 균주 M-2의 동결건조물을 기본한 본 발명의 모노파라뮤니티 유발인자에 의한 임상적 시험 결과는 표 1 내지 4에 나타내며 이들은 인간에서 믹소마바이러스 동결건조물의 아주 양호한 파라뮤니징 활성을 나타내었다. 이들 데이터는 다른 포유동물 뿐만 아니라 조류 및 파충류에도 동일하게 적용될 수 있다.

표 1:

독성약화된 믹소마 세포 배양 바이러스로부터 얻은 모노파라뮤니티 유발인자를 사용한 사람에서 임상적 결과 - 예방적 용도 -

(동결건조된 유발인자 1 OP(1 ml) 근육내)

표시	적합한 투여 방법
고 감염 기간 압력 스트레스 보호 접종 전 또는 동시에 이동, 조사 및 유사 스트레스	24시간 간격으로 스트레스 전에 2회 주사
화학요법, 조사 (2차 반응의 감소 또는 예방) 작업 (상처 치유의 향상)	치료가 완료되기 전 또는 회복될 때 까지 매일 또는 이틀마다 1회 주사
최적 방어 및 헤모다이나믹스의 유지 암 및 간염의 예방 건강의 향상	24시간 간격으로 매달 1-2회 주사

표 2:

독성약화된 믹소마 세포 배양 바이러스로부터 얻은 모노파라뮤니티 유발인자를 사용한 사람에서 임상적 결과 - 치료적 용도 -

(동결건조된 유발인자 1 OP(1 ml) 근육내)

삭제

표시	적합한 투여방법
포진 질환 (대상포진, 전염성 단핵구증, 단순포진 등)	3-5일간 또는 증상이 사라질 때 까지 매일 1회 주사; 이어 완전히 회복될 때 까지 2일 마다 또는 3일 마다 1회 주사
만성 간염	매달 1 "코스" : 24시간 간격으로 3회 주사
인플루엔자 감염 바이러스 및 세균 혼합된 감염 (항생물질 또는 화학요법과 조합)	증상이 사라질 때 까지 매일 1회 투여한 다음 완전히 회복될 때 까지 이틀마다 1회 주사
면역결핍 및 방어계의 조절장애 (예컨대 화학요법 도중 또는 후에)	1. 5-10일간 강력한 치료: 매일 1회 주사 2. 이어 24시간 간격으로 매주 2회 주사 (더 긴 기간 동안에 걸친 치료)
내독소 손상	7일 동안 또는 회복될 때 까지 매일 1회 주사

표 3:

면역 변수가 낮은 환자에서 믹소마 유발인자(PIND-MYXO)를 사용한 파라뮤니징 효과(PIND-MYXO 투여한 지 7일 후)

환자	환자의 데이터 진단/요법	변수 (정상 범위)	0 일	7일
A.S. 여성 52세	면역억제	백혈구 (4000-10000/㎕)	4000	9400
D.B. 여성 54세	궤양대장염 코르티손 요법	림프구 (900-3000/㎕) CD4 세포 (500-1800/㎕) CD8 세포 (100-1000/㎕)	620 400 80	1360 920 210
U.S. 남성 38세	면역학적 손상	백혈구 (4000-10000/㎕)	3800	7400
S.C. 남성 43세	전이성 전립성암 방사능요법	백혈구 (4000-10000/㎕)	3800	9900
B.M. 여성 56세	감염에 대하 감수성	세포독성 세포 (30-360/㎕)	0	248

표 4:

면역 변수가 증가된 환자에서 믹소마 유발인자(PIND-MYXO)를 사용한 파라뮤니징 효과(PIND-MYXO 투여한 지 7일 후)

환자	진단/요법	변수 (정상 범위)	0일	7일
G.P. 여성 59세	경부암, 유방암, 감염에 대한 감수성	백혈구 (4000-10000/㎕) 과립구 (2400-6400/㎕)	12600 8420	8600 5930
C.H. 여성 51세	정신신체질환 증후군 비만	백혈구 (4000-10000/㎕) 과립구 (2400-6400/㎕)	12700 9270	6000 4760

Claims

독성약화된(Attenuated) 래빗 믹소마바이러스(Myxomaviruses) 균주에서 유래되는, 독성약화된 믹소마바이러스 또는 이들의 성분을 포함하는, 파라뮤니티를 유발하기 위한 조성물로서, 상기 독성약화된 래빗 믹소마바이러스 균주가 야생형 믹소마바이러스에 감염된 토끼로부터 수득된 야생형 균주로부터 유래된 것인, 파라뮤니티를 유발하기 위한 조성물.
제1항에 있어서, 상기 독성약화된 믹소마바이러스 균주가 사이토카인 수용체의 생산을 코딩하는 1개 이상의 유전자 절편에서 부가, 치환 또는 결실 형태의 변형을 가지며, 사이토카인 수용체의 수용체 특성은 상기와 같은 변형을 통하여 상실되는 것을 특징으로 하는, 조성물.
제2항에 있어서, 상기 사이토카인 수용체가 인터페론(IFN), 인터루킨(IL) 및 종양 괴저 인자(TFN)에 대한 수용체 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는, 조성물.
제3항에 있어서, 상기 사이토카인 수용체가 IFN-α-R, IFNγ-R, TNF-R, IL-1-R, IL-2-R, IL-6-R 및 IL-12-R에 대한 수용체 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는, 조성물.
제1항에 있어서, 상기 믹소마바이러스 성분이 독성약화된 믹소마바이러스 균주의 바이러스 외피 또는 바이러스 외피의 변종 형태를 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
제1항에 있어서, 상기 믹소마바이러스 균주가 M2, M7, 록산느(Lausanne) 및 Aust/Uriarra/Verg-86/1 균주로 이루어진 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는, 조성물.
제6항에 있어서, 상기 믹소마바이러스 균주가 기탁번호 ECACC 03121801호의 M-2 균주인 것을 특징으로 하는, 조성물.
제1항에 있어서, 상기 믹소마바이러스 균주가 세포 배양액(cultures)에서 독성약화된 것을 특징으로 하는, 조성물.
제8항에 있어서, 상기 세포 배양액이 Vero 원숭이 신장 세포 및/또는 AVIVER 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
제1항에 있어서, 상기 독성약화된 믹소마바이러스가 불활성화되는 것을 특징으로 하는, 조성물.
제10항에 있어서, 상기 독성약화된 믹소마바이러스가 베타-프로피오락톤에 의해 불활성화되는 것을 특징으로 하는, 조성물.
제11항에 있어서, 상기 베타-프로피오락톤의 농도가 0.01 내지 1%인 것을 특징으로 하는, 조성물.
제12항에 있어서, 상기 베타-프로피오락톤의 농도가 0.05%인 것을 특징으로 하는, 조성물.
제1항에 있어서, 상기 믹소마바이러스가 동결건조된 것인, 조성물.
제1항 내지 제14항중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는, 인간 및 동물에서 파라뮤니티를 활성화하기 위한 조성물.
제1항 내지 제14항중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는, 면역체계 기능장애, 면역억제, 면역결핍 장애, 바이러스 또는 미생물에 의해 야기되는 신생아의 감염성 질환, 바이러스 질환, 세균성 질환, 약물 내성을 지니거나 화학요법 또는 방사선요법 내성을 지닌 바이러스 또는 미생물에 의해 야기되는 감염성 질환, 바이러스 및 세균성 혼재 감염, 바이러스 또는 미생물에 의해 야기되는 만성적 감염 과정, 포진성 질환, 만성 간염, 인플루엔자 감염, 내독소 손상을 비경구적으로 치료 또는 예방하거나, 비경구적으로 치료하고 예방하기 위한 조성물.
제16항에 있어서, 상기 치료가 상기 조성물을 환자의 피부 또는 점막을 통하여 국소 투여함으로써 이루어지는, 조성물.
제15항에 있어서, 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함하는, 조성물.
제18항에 있어서, 국소투여 또는 비경구적 투여를 위한, 조성물.
제18항에 있어서, 상기 조성물이 구강정 또는 빨아먹을 수 있는 정제 형태인, 조성물.
(a) 전신 점액종증에 걸린 토끼의 감염 조직으로부터 믹소마바이러스를 분리하는 단계;

(b) 분리한 바이러스를 허용성 세포(permissive cell)에 순응화시키는 단계;

(c) 분리한 바이러스를 바이러스의 독성약화가 달성될 때 까지 Vero 및 바이너리(binary) 세포 배양액에서 계대배양하는 단계를 포함하는, 독성약화된 토끼 믹소마바이러스 균주에 기반한 파라뮤니티 유발 약물 또는 약학 조성물의 제조 방법.
제21항에 있어서, 상기 분리한 바이러스가 순응화를 위하여 배양된 계란의 장뇨막(CAM)에 접종됨을 특징으로 하는, 방법.
제22항에 있어서, 상기 바이러스가 CAM 상에서 2 내지 6회 계대배양을 거쳐 복제됨을 특징으로 하는, 방법.
제21항에 있어서, 감염된 조직에 존재하는 상기 믹소마바이러스가 허용성 세포에서의 복제에 의해 분리됨을 특징으로 하는, 방법.
제24항에 있어서, 상기 바이러스가 배양된 계란의 장뇨막(CAM) 상에서 배양하는 것에 의해 분리됨을 특징으로 하는, 방법.
제25항에 있어서, 상기 바이러스가 후속하여 추가의 독성약화 계대배양을 거쳐 CAM에 순응화됨을 특징으로 하는, 방법.
제21항에 있어서, 상기 믹소마바이러스의 독성약화가 Vero 세포 배양액에서 80 내지 150회 계대배양함으로써 일어남을 특징으로 하는, 방법.
제21항에 있어서, 상기 바이러스가 AVIVER 세포 배양액에서 계대배양됨을 특징으로 하는, 방법.
제28항에 있어서, 상기 계대배양이 10 내지 50회 실시됨을 특징으로 하는, 방법.
제26항에 있어서, 상기 독성약화된 믹소마바이러스가 추가의 독성약화 계대배양 동안 추가로 복제됨을 특징으로 하는, 방법.
제30항에 있어서, 상기 복제가 Vero 원숭이 신장 세포에서 일어남을 특징으로 하는, 방법.
제31항에 있어서, 상기 복제가 100 내지 200회 계대배양되는 동안 Vero 세포에서 일어남을 특징으로 하는, 방법.
제30항에 있어서, 상기 세포 배양액의 바이러스 수집물(harvests)이 10^5.0 내지 10^7.5 TCID₅₀/ml의 감염 역가를 가짐을 특징으로 하는, 모노파라뮤니티 유발인자의 제조 방법.
제21항에 있어서, 상기 독성약화된 믹소마바이러스가 추가적으로 불활성화됨을 특징으로 하는, 방법.
제34항에 있어서, 상기 독성약화된 믹소마바이러스가 불활성화되도록 베타-프로피오락톤으로 처리됨을 특징으로 하는, 방법.
제35항에 있어서, 상기 베타-프로피오락톤의 농도가 0.01 내지 1%임을 특징으로 하는, 방법.
제36항에 있어서, 상기 베타-프로피오락톤의 농도가 0.05%임을 특징으로 하는, 방법.
제21항에 있어서,

(a) 배양된 계란의 장뇨막(CAM) 상에서의 복제에 의해 점액종증에 걸린 토끼의 감염 조직으로부터 믹소마바이러스를 분리하는 단계;

(b) 분리한 바이러스를 추가 2회의 계대배양 동안 CAM에 순응화시키는 단계;

(c) 분리한 바이러스를 Vero 세포 배양액에서 120회의 계대배양에 의해 독성약화시키는 단계;

(d) 상기 바이러스를 바이너리 AVIVER 세포 배양액으로 전달하고, 이러한 세포 배양액에서 24회 중간 계대배양하여 더욱 독성약화시키는 단계;

(e) 이어서 상기 바이러스를 Vero 원숭이 신장 세포로 다시 전달하는 단계; 및

(f) Vero 세포에서 150회 독성약화 계대배양함으로써, 독성약화된 믹소마바이러스를 복제시키는 단계를 포함하는, 방법.
파라뮤니티를 유발하고 하나 이상의 믹소마바이러스 인터페론 수용체, 하나 이상의 믹소마바이러스 종양 괴저 인자 수용체, 및 하나 이상의 믹소마바이러스 인터루킨 수용체의 수용체 특성이 상실되어 있는, 독성약화된 믹소마바이러스로서, 이러한 독성약화된 믹소마바이러스가,

a) 전신 점액종증에 걸린 토끼의 감염 조직으로부터 야생형 믹소마바이러스를 분리하는 단계;

b) 분리한 바이러스를 허용성 세포에 순응화시키는 단계;

c) 분리된 바이러스를 Vero 및 바이너리 세포 배양액에서 계대배양하는 단계;

d) 파라뮤니티를 유발하고 하나 이상의 믹소마바이러스 인터페론 수용체, 하나 이상의 믹소마바이러스 종양 괴저 인자 수용체, 및 하나 이상의 믹소마바이러스 인터루킨 수용체의 수용체 특성이 상실되어 있는, 독성약화된 믹소마바이러스를 선택하는 단계에 의해 수득되는,

독성약화된 믹소마바이러스.
제39항에 있어서, 기탁번호 03121801로 유럽 동물 세포 배양물 기탁소(European Collection of Animals Cell Culture, ECACC)에 기탁된, 독성약화된 믹소마바이러스.
제39항에 있어서, 상기 믹소마바이러스가 유전자적으로(genetically) 변형됨을 특징으로 하는, 독성약화된 믹소마바이러스.
제41항에 있어서, 상기 믹소마바이러스가 사이토카인 수용체의 생산을 코딩하는 1개 이상의 유전자 절편에서 부가, 치환 또는 결실 형태의 변형을 가지며, 사이토카인 수용체의 수용체 특성은 상기와 같은 변형을 통하여 상실되는 것을 특징으로 하는, 독성약화된 믹소마바이러스.
제42항에 있어서, 상기 사이토카인 수용체가 인터페론(IFN), 인터루킨(IL) 및 종양 괴저 인자(TFN)에 대한 수용체 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는, 독성약화된 믹소마바이러스.
제43항에 있어서, 상기 사이토카인 수용체가 IFN-α-R, IFNγ-R, TNF-R, IL-1-R, IL-2-R, IL-6-R 및 IL-12-R에 대한 수용체 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는, 독성약화된 믹소마바이러스.
기탁번호 ECACC 03121801를 가진 독성약화된 믹소마바이러스 균주(M2).
제23항에 있어서, 상기 바이러스가 CAM 상에서 3회 계대배양을 거쳐 복제됨을 특징으로 하는, 방법.
제26항에 있어서, 상기 바이러스가 후속하여 추가 2회 독성약화 계대배양을 거쳐 CAM에 순응화됨을 특징으로 하는, 방법.
제27항에 있어서, 상기 믹소마바이러스의 독성약화가 Vero 세포 배양액에서 120회 계대배양에 의해 일어남을 특징으로 하는, 방법.
제29항에 있어서, 상기 계대배양이 25회 실시됨을 특징으로 하는, 방법.
제33항에 있어서, 상기 세포 배양액의 바이러스 수집물이 10^6.5 TCID₅₀/ml의 감염 역가를 가짐을 특징으로 하는, 방법.