CN1909923A - 基于减毒的兔粘液瘤病毒的单副免疫诱导物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基于致副免疫(paramunizing)病毒或病毒组分的单副免疫诱导物(monoparamunity inducers)，该病毒或病毒组分来自于显示粘液瘤一般症状的病兔的粘液瘤病毒株。本发明还涉及制备本发明的诱导物的方法，以及该诱导物作为调节性优化副免疫活性的药物在预防和治疗人和动物的多种机能障碍中的应用。

Description

基于减毒的兔粘液瘤病毒的单副免疫诱导物

本发明涉及基于致副免疫(paramunizing)病毒或病毒组分的单副免疫诱导物(monoparamunity inducers)，其特征在于该病毒或病毒组分来自于减毒的兔粘液瘤病毒(myxomavirus)株；还涉及制备所述单副免疫诱导物的方法和该单副免疫诱导物作为药物的用途。

高度进化的生物体尤其是哺乳动物和鸟类的内源性免疫系统包括抗原特异性部分和抗原非特异性部分。免疫系统的这两个部分互相联系并互相作用。抗原特异性机制负责建立免疫(immunity)，而抗原非特异性机制负责建立副免疫(paramunity)。副免疫是指一个受到良好调控并最优运作的非特异性防御系统的状态，与针对大量不同的病原体、抗原和其他病源的快速产生的、时限性的(time-limited)、增加的保护相关。由于历史上和功能上的原因，副免疫发展的基础是非选择性和条件选择性的副特异性防御机制(paraspecific defense mechanisms)。这些机制从系统发育的角度看是古老的，而且被称为原始的。

抗原非特异性免疫系统(又称：“先天免疫系统”)的副特异性活性包括非选择性的保护性元件，例如消耗外来物质的细胞器；和条件选择性保护元件，例如小噬细胞(microphage)和巨噬细胞、天然杀伤细胞、树突状细胞以及可溶性因子例如细胞因子；这些元件根据它们的来源不同显示病原体非特异性或抗原非特异性的反应。

接触抗原后的相关生物体中马上可以观察到副特异性活性，而抗原特异性的免疫系统的作用要在数天或数周后才会出现。

这样，在组织程度更高的生命形式中，就可以赢得更多的时间来建立特异性的防御系统，来抵抗那些目前不可能清除并具有抗原性质的病原。

自从副免疫(paramunization)方法的建立(Anton Mayr，“Paramunisierung：Empirie oder Wissenschaft”，Biol.Med.edition26(6)：256-261，1997)以来，其有益效果，即病人体内免疫系统的副特异性活性用于预防和治疗，已越来越为人们所清楚。副特异性防御使得机体在遇到多种外来物质、感染性病原体、毒素及转化的内源细胞时，能迅速地保护自己。

免疫系统的副特异性和特异性活性之间有密切的相互作用，信息通常从免疫系统中首先起反应的副特异性部分流向稍后启动的特异性部分(例如通过抗原介导)。当毒力特别强的病原体感染时，机体的副特异性防御可以通过这样的方式赢得足够的时间，直到特异性免疫(例如抗体，免疫细胞)建立为止。

副特异性免疫防御是一个生理过程，其可以定义为与环境相遇时的“初级控制”。它们不但对于低等生物，而且尤其对于高度进化的脊椎动物而言都是必不可少的。这种生物防御系统中发生的原发性先天性缺陷将威胁生命。值得一提的例子是人类中的“Chediak-Steinbrinck-Higashi综合征”，它的特征是粒细胞缺陷和天然杀伤细胞(NK细胞)机能障碍，在绝大多数情况下将造成病人在满10岁前死亡。

副免疫状态具有下面的特征：吞噬率增加，自发的细胞介导的细胞毒性(NK细胞)作用增强，其他淋巴网状细胞的活性增强。同时，有特定的细胞因子的释放，这些细胞因子与细胞元件之间，以及细胞因子相互之间，都存在刺激和/或抑制作用(例如通过阻遏物机制)。这种紧密联系、逐步反应的生物副免疫系统，连同它的各种受体、效应物、靶细胞和传递信号的细胞因子一起，进一步全面地与体液和神经系统相联系。由此，它代表了沟通、相互作用和调控网络中的重要的构成部分。

副免疫力是通过副免疫诱导的。其意义是免疫系统的副特异性部分的细胞元件的药物激活，及与之相关的细胞因子生成。其目的是消除功能障碍，快速提高个体的非病原体特异性防御和非抗原特异性防御(最优生物调节)，消除由应激或其他因素(例如药物)造成的免疫抑制或免疫缺陷，修复缺陷和/或充当免疫、体液和神经系统之间的调节物。这意味着，某些非特异性内源性防御过程可能被促进、补充或者被抑制，取决于致副免疫的种类和反应性，例如病人的健康状况。

副免疫诱导物(paramunity inducer)用于进行副免疫，它们必须符合一定的无害性和有效性标准，因此不同于免疫促进剂(immunostimulant)。副免疫诱导物本身并不类似于抗体或化学药品，或抗生素、维生素或荷尔蒙，相反，它通过逐步的机制激活副特异性免疫系统，使得后者可以充分地动员细胞和体液防御机制。在这种情况下，副免疫诱导物同时具有调节和修复免疫防御的作用。关于副免疫诱导物的作用方式，已知它们被吞噬细胞(受体细胞)所吸收，吞噬细胞因此被激活并释放介质，介质进而动员效应细胞。后者最终开启准免疫防御的调节机制。

欧洲专利EP 0 669 133 B1中描述了多种基于两种更多的痘苗病毒(poxvirus)组分的组合的副免疫诱导物，这些粘液瘤病毒组分来自不同的具有致副免疫性的痘苗病毒株。

本发明是基于减毒的粘液瘤病毒和/或其病毒组分的致副免疫性质。

减毒是指修饰感染性病原体的性质使得该病原体削弱(“减毒”＝削弱，减轻)。自然界中经常发生感染性病原体的自发改变，其经历的时间跨度可能达许多个世纪。

感染性病原体为适应环境变化而发生改变的能力可以应用于实验上，而且减毒所需的时间跨度可以例如通过在特定的宿主系统中长期传代而显著地缩短。目前，已经利用减毒得到了无毒的接种株和无害的副免疫诱导物。

减毒通常造成毒力和传染性丧失，免疫性降低，宿主范围减小，以及使病原体基因组中，优选地在末端区域中发生缺失而使病原体基因组发生微小的变化。通常被修饰的病原体的致副免疫活性会相应地提高。

在少数情况下，尤其是试图通过遗传操作用实验手段进行减毒时，减毒也可能造成毒力和传染性的增强。

粘液瘤病毒是多发性粘液瘤(myxomatosis)的病原体。粘液瘤是家兔和野兔的传染性全身性病毒性疾病，其进展具周期性，特征在于全身性的(generalized)，有时是头部及遍及全身的出血性皮下水肿，好发于肛门区，外阴，及阴道(the tube)，与其他任何感染性疾病都不同。如果先前没有粘液瘤的国家传入了粘液瘤，将导致快速的致死性的进展。当该病毒成为地方性以后，该病的特征会发生变化直至感染在临床上不明显(Mayr A.：Medizinische Mikrobiologie，Infections-und Seuchenlehre，7th edition，Enke-Verlag，Stuttgart，2002)。

该疾病广泛存在于美洲棉尾兔中，其属于棉尾兔属(Sylvilagus)，仅分布于西半球。这些野兔成为了该疾病唯一的储藏宿主。在它们中，该传染病是以温和的形式存在的。相反，在分布于欧洲并被引进到澳大利亚的穴兔属(Oryctolagus)的家兔和野生家兔(wild rabbit)中，当该病原体传入时，该病的致死率几乎是100％。

粘液瘤病毒(兔痘病毒属(Leporipoxvirus))的天然宿主范围较窄。一般来说，该病毒只能在美洲棉尾兔和欧洲家兔和野生家兔中复制。不过，在欧洲野兔(wild hare)中也观察到了少数感染的实例。传播到其他物种和人类的尝试，结果都是阴性的。

本发明的基本目的是提供用于人类医学和兽医学的新的单副免疫诱导物(monoparamunity inducer)。本发明进一步旨在提供一种制备这些单副免疫诱导物的方法。本发明还有一个目的是提供基于单副免疫诱导物的药物组合物用作药物。

由此，本发明涉及基于致副免疫性病毒和病毒组分的单副免疫诱导物，其特征在于这些致副免疫性病毒和病毒组分来自减毒的兔粘液瘤病毒株。上述病毒组分优选地包括减毒的粘液瘤病毒株的致副免疫性的病毒包膜或病毒包膜的异常形式。具有本发明的致副免疫性的毒株优选为M-2，M-7，Lausanne，Aust/Uriarra/Verg-86/1。毒株M-2、M-7、Lausanne和Aust/Uriarra/Verg-86/1也适用于制备活疫苗，因为它们的毒力只是被部分地减弱，以保有足够的致免疫作用。

具体优选基于粘液瘤病毒M-2株的单副免疫诱导物。有一株后文描述的通过本发明的方法制备的减毒的粘液瘤病毒株已经保藏于位于英国Wiltshire郡Salisbury的欧洲动物细胞培养物保藏中心的应用微生物学和研究中心公共卫生实验室的保藏部门(Public Health Laboratory Service(PHLS)，Centre for Applied Microbiology & Research，European Collection ofAnimals Cell Cultures(ECACC)，Salisbury，Wiltshire，United Kingdom)，保藏号为03121801。

本发明进一步涉及一种制备基于减毒的兔粘液瘤病毒株的单副免疫诱导物的方法。为此，首先从通常患有多发性粘液瘤的兔的感染组织中分离粘液瘤病毒，然后使病毒适应于允许性细胞系统，即允许病毒复制的细胞材料，例如细胞培养物，保温的鸡卵或者其他实验动物。特别地，可以将天然宿主或者与天然宿主有密切亲缘关系的物种的细胞用于适应过程。适用于粘液瘤病毒的允许性细胞系统有例如鸡胚成纤维细胞(CEF)以及兔肾和睾丸所产生的细胞培养物。

根据本发明，优选使分离的粘液瘤病毒经过一次和更多的传代适应保温的鸡卵的绒毛尿囊膜(CAM)，较优地，在2到6次传代中；特别优选地，在3次传代中。为了适应，将分离的病毒接种于CAM上并通过在CAM上传代而使其复制。

优选地，最开始通过在允许性细胞系统中复制来将粘液瘤病毒从感染组织中分离。为此，可以用例如破碎所得的感染组织匀浆来接种允许性细胞系统。然后，可以使最初复制得到的病毒进一步适应于分离步骤中已经用过的同样的允许性细胞系统中，也可以使用另外的允许性细胞系统。优选地，使病毒适应于分离步骤中已经用过的同一种允许性细胞系统。因此，优选地，通过在允许性细胞系统中复制随后通过更多的传代使病毒适应于该允许性细胞系统而使粘液瘤病毒从感染组织中分离。特别优选地，通过在保温的鸡卵的CAM上复制而进行粘液瘤病毒的初始培养和分离，随后经过进一步的传代使该病毒适应于CAM上，优选进一步经过2次传代。不过，也可以用保温的鸡卵的尿囊液来进行培养和/或适应。

然后进行实际的减毒，其通过在一种或多种允许细胞培养物上长期传代，直至发生减毒或达到期望的病毒减毒程度来进行。为此，可以首先检测多种用于复制该病毒的允许性细胞系统，然后选择在其中达到了最高感染滴度的允许性细胞系统用于进一步传代。原代细胞和次级细胞培养物，以及永久和连续细胞系都适用于通过长期传代的减毒。因此，通过在原代或次级鸡胚成纤维细胞(CEF)培养物中或永久性CEF细胞的培养物中复制可以发生减毒。

为了对粘液瘤病毒进行减毒，根据本发明，该病毒的传代或复制优选在永久性细胞培养物中，特别是在Vero细胞培养物中进行，优选经过80到150次传代，特别优选经过120次传代。或者/并且，根据本发明，在二元的(binary)永久细胞系中传代该病毒，此时优选使用AVIVER细胞。这些细胞或细胞培养物是通过鸡胚成纤维细胞(CEF)和Vero猴肾细胞之间发生细胞融合而得到的。对于本发明的粘液瘤病毒的减毒，优选在第一步将分离和适应后的病毒在Vero细胞培养物中传代，然后将病毒转移到二元的AVIVER细胞培养物中并在其中复制，优选经过10到50次传代，特别是20到30次传代，特别优选经过25次传代。

减毒的粘液瘤病毒还可以经过更多的减毒传代而进一步被复制。优选地经过在Vero猴肾细胞中的更多次传代来进一步复制该病毒，特别是经过100到200次传代。

方法中还有具体优选的步骤，即对减毒的粘液瘤病毒进一步灭活。灭活可以通过化学处理，辐射，热和pH作用，尤其是用β-丙内酯进行化学处理来实现。用β-丙内酯处理减毒的粘液瘤病毒可进一步提高副特异性的活性，而减毒后在合适的场合下仍然存在的致免疫性则丧失了。

本发明的方法的一个具体优选的实施方案包括下面的步骤：

-通过在保温的鸡卵的CAM上复制，从患有粘液瘤的兔的被感染组织中分离出粘液瘤病毒，然后再经过2次传代使分离的粘液瘤病毒适应于CAM；

-通过在Vero细胞培养物中传代优选经过120次传代使该分离的病毒减毒；

-将该病毒转移到二元AVIVER细胞培养物中，其中这些AVIVER细胞是通过鸡胚成纤维细胞(CEF)和Vero猴肾细胞之间发生细胞融合而得到的，经过10到50次，优选25次传代使该病毒减毒；

-然后将该病毒转移回Vero猴肾细胞，并经过在Vero细胞中的进一步的减毒传代来复制该减毒的粘液瘤病毒，优选经过大约150次传代。

和可选地

-用β-丙内酯处理使减毒的粘液瘤病毒灭活，这种处理进一步提高副特异性活性，而减毒后仍然存在的致免疫性则丧失了。

通过长期传代进行减毒通常以3到5个空斑终点稀释判断。对得到的各种克隆进行检测，选择满足下面条件的克隆进行进一步复制：利用该克隆能够达到最高的感染滴度；利用该克隆在例如新生小鼠的VSV攻击试验中能够检测到高致副免疫活性。这一步的目的是特别确保提供遗传上均一的病毒材料以供以后使用。

术语“减毒”用于与本发明相关的场合时，指用实验手段修饰原本具有毒力的粘液瘤病毒，使其变成被修饰的形式，同时增强其致副免疫性。可以通过下列特性中的一个或多个检测到减毒的发生：

-对于欧洲家兔和野生家兔(Oryctolagus caniculus csp.)的毒力降低或减弱或丧失，

-传染性减弱或丧失，

-在细胞培养物中的宿主范围受到限制，

-致免疫性发生改变，

-产生致副免疫性、短期保护性的活性。

减毒会在粘液瘤病毒基因组的末端区域中造成缺失。经常观察到减毒的程度的递增与病毒基因组中缺失的数量的递增相关联。

在传代过程中，可以使用合适的活性检测手段(cf.例如，US 6,805,870，第12列，及其中引用的更多的参考文献)和通过克隆来检测和监控减毒的程度。

本发明还涉及可以通过本发明的方法获得的减毒的粘液瘤病毒，包含本发明的减毒的粘液瘤病毒或粘液瘤病毒单副免疫诱导物的药物组合物，以及该单副免疫诱导物用于激活哺乳动物副特异性免疫系统的应用和减毒的病毒用于制备相应的药物的应用。

因为其令人惊异的致副免疫性，该单副免疫诱导物可以用于治疗和/或预防免疫系统机能障碍(dysfunction of the immune system)，免疫抑制(immunosuppression)，免疫缺陷性疾病(immunodeficiency disorders)，体液、循环、代谢和神经系统之间自动调节(homeostasis)的功能障碍，先兆性新生儿感染(threatened neonatal infection)，肿瘤性疾病，病毒性疾病，细菌性疾病，抗治疗性感染因子疾病(therapy-resistant infectious factor diseases)，病毒和细菌混合性感染，感染过程的慢性表现(chronic manifestations of infectiousprocesses)，多种病因引起的肝脏疾病，慢性皮肤疾病，疱疹性疾病，慢性肝炎(chronic hepatitides)，流感性感染，内毒素损伤。

本发明的单副免疫诱导物一般对环境无害，而且在对于哺乳动物例如人，马，狗，毛，猪；鸟类以及爬行动物例如蜥蜴，蛇，变色龙等的致副免疫作用的意义上，它们是有效的。因此它们特别适用于人类医学和兽医学。

另外，本发明的单副免疫诱导物显示出非常好的致副免疫活性，同时具有较高的效价。它们可以通过本发明的方法用适当的方式来制备，而且可以安全地用于医疗。粘液瘤病毒的减毒降低了该粘液瘤病毒的致免疫性，而副特异性的活性则增加。因此本发明的单副免疫诱导物具有致副免疫性而没有致免疫性，这样就使多次的、连续的使用成为可能。兔粘液瘤病毒和其致副免疫性的病毒组分所具有的这些致副免疫性质是令人惊异且不可预料到的。

本发明的相关术语“致副免疫”指免疫系统的副特异性部分的细胞元件的药物激活，及与之相关联的细胞因子生成或释放。其目的是消除功能障碍，快速提高个体的非病原体特异性和非抗原特异性防御，及在免疫、体液、神经和血管系统之间起调节作用。致副免疫造成副免疫的保护状态。

本发明的相关术语“副免疫”指一个处在最优化的调节和运作状态中的副特异性的防御系统的主动获得的状态，此状态与针对大量病原体、抗原和其他病源的、快速发展的、时限性的保护相关联。吞噬率，NK细胞的功能以及其他淋巴网状细胞(例如树突状细胞)的活性都被提升至生理最适度。

本发明的相关术语“副免疫诱导物”指不含热原且无毒的药物，其用于人和动物中，以在致副免疫的意义上产生和调节内源防御和保护机制。

本发明的相关术语“粘液瘤病毒单副免疫诱导物”指基于减毒的兔粘液瘤病毒或减毒的粘液瘤病毒株的药物，其包括可在生物体，优选哺乳动物(例如人)内造成副免疫状态的致副免疫性的病毒组分及其组成部分。

本发明的相关术语“粘液瘤病毒”指兔痘病毒属的粘液瘤病毒。粘液瘤病毒属于痘病毒科(Poxviridae)(痘病毒)的脊椎动物痘病毒亚科(Chordopoxviridiae)。

本发明的相关术语“致副免疫性病毒组分”是指来自具有致副免疫性质的粘液瘤病毒的大量病毒结构，例如活的或灭活的新鲜分离的粘液瘤病毒，来自于新鲜分离的粘液瘤病毒的活的或灭活的重组粘液瘤病毒，病毒包膜，除去的包膜和这些包膜的切割产物和异常形式，单个的天然或重组的多肽或者蛋白，特别是某些存在于新鲜分离的粘液瘤病毒中或者由遗传修饰的粘液瘤病毒或该病毒的部分遗传信息重组表达的膜和表面受体。

表1到4总结了在人类中使用粘液瘤病毒单副免疫诱导物PIND-MYXO的临床效果，其中PIND-MYXO基于减毒的粘液瘤细胞培养物病毒M-2株。

表1显示在人类中使用粘液瘤病毒单副免疫诱导物PIND-MYXO进行预防的临床效果。

表2显示在人类中使用粘液瘤病毒单副免疫诱导物PIND-MYXO进行治疗的临床效果。

表3显示在具有低免疫参数的病人中使用粘液瘤病毒单副免疫诱导物PIND-MYXO进行致副免疫的效果(PIND-MYXO给药后7天)。

表4显示在具有提高的免疫参数的病人中使用粘液瘤病毒单副免疫诱导物PIND-MYXO进行致副免疫的效果(PIND-MYXO给药后7天)。

本发明基于这样的惊人发现，即减毒的兔粘液瘤病毒或其致副免疫性的组成部分可以在受体生物体中诱导产生很好的致副免疫性质，从而造成副免疫这种受保护的状态。本发明的基础是首次在细胞培养物中成功地实现了兔粘液瘤病毒的减毒。

本发明的单副免疫诱导物优选地基于冻干的、减毒的并且灭活的兔粘液瘤病毒或其致副免疫性的病毒组分。这些减毒的粘液瘤病毒或其病毒组分优选地来自一种粘液瘤病毒株或者多种不同的减毒粘液瘤病毒株。在此条件下，本发明的单副免疫诱导物优选地包括一种或更多的粘液瘤病毒株或其致副免疫性病毒组分的组合。

在哺乳动物例如人类中，通过施用粘液瘤病毒副免疫诱导物而诱导产生的致副免疫性，对于消除功能障碍，提高个体的抗原非特异性保护，消除由于应激或其他原因(例如药物)免疫抑制或免疫缺陷，及在免疫、体液和血管系统之间起调节作用，都是特别有益的。

本发明进一步基于通过在细胞培养物中传代而成功地使粘液瘤病毒株减毒，同时该粘液瘤病毒株的毒力和/或致免疫性被降低或丧失。还可以通过辐射，热或pH作用，或特别优选地，通过β-丙内酯化学处理来进一步灭活。这些单副免疫诱导物基于减毒的冻干粘液瘤病毒。并且，适用于在生物体中诱导致副免疫活性的粘液瘤病毒单个组分也为本发明所涵盖。

下面将描述本发明的基于分离并减毒的兔粘液瘤病毒株，通过细胞培养物传代来制备单副免疫诱导物的方法的一个实施方式。此制备方式并不限于此优选的毒株，还可以应用于其他兔粘液瘤病毒株。本发明还包括通过遗传修饰产生的重组形式的粘液瘤病毒。在此条件下，优选这样的重组粘液瘤病毒株，在它们的基因组中，一个或多个编码细胞因子受体的片段发生了添加、取代或缺失形式的修饰，从而该细胞因子受体丧失了其受体活性。优选地，这些基因片段编码干扰素(IFN)、白介素(IL)或肿瘤坏死因子(TNF)的受体，特别是IFNα-R、IFNγ-R、TNF-R、IL-1-R、IL-2-R、IL-6-R或IL-12-R的受体。

另外，此处表述的关于孵育时间或者细胞培养物的传代次数的数值不应理解为限制性的。对于这些参数的微小更改，以及对于技术人员显而易见，且同样能制得减毒的粘液瘤病毒的变换，都同样包括在本发明的范围之内。

本发明的一个优选的实施方式涉及粘液瘤病毒M-2株的成功减毒。该粘液瘤病毒M-2株分离自患有粘液瘤的欧洲野生家兔(Herrlich A.，Mayr A.和Munz E.：“Die Pocken”，2nd edition，Georg Theime Verlag，Stuttgart，1967)。从病兔的皮下组织得到改变的皮肤细胞，将其破碎，然后接种到已经孵育过优选10到12天的鸡卵的绒毛尿囊膜(CAM)上。然后在绒毛尿囊膜上经过2到6次传代、优选3次传代，使粘液瘤病毒复制和适应(CAM传代的方法，请参考Herrlich A.，Mayr A.和Munz.E.：“Die Pocken”，2nd edition，GeorgTheime Verlag，Stuttgart，1967)。将第2代到第6代的任一代，优选第3代，作为粘液瘤病毒在细胞培养物中进一步减毒的起始材料。减毒在该病毒适应于绒毛尿囊膜(明显地表现为绒毛尿囊膜上的典型灶(typical foci)后发生，分为三个阶段。第一阶段中，在Vero细胞中(ATCC CCL-81)连续经过80到150次，优选120次的所谓最终稀释传代(end-dilution passages)。经过这些传代的粘液瘤病毒的毒力被减弱了。

第二阶段中，在Vero细胞中上述第80到150次的任一一次传代后，优选第120次传代后，将病毒悬液转移到所谓AVIVER细胞中，继续经过10到50次传代，优选经过20到30次传代，具体是经过25次传代。AVIVER细胞是通过将鸡胚成纤维细胞(CEF)和Vero细胞进行细胞融合得到的，称之为二元永久细胞培养物(binary permanent cell culture)。

在AVIVER细胞中的最后一代，优选第25代，被转移回Vero细胞，继续进行减毒的第三阶段，该阶段要在Vero细胞中进行100到200次传代，优选157次传代。这样，粘液瘤病毒就通过总共300次以上的细胞培养物传代而被复制。经过粘液瘤病毒在细胞培养物中复制的第三阶段以后，粘液瘤病毒得到了充分的减毒。

优选地，用完全合成培养基培养Vero细胞培养物和AVIVER细胞，具体优选MEM培养基(极限必需培养基(minimal essential medium))，其中添加5到20％，优选10％的BMS(血清替代培养基(serum substitute medium))，和5到20％，优选10％的水解乳白蛋白。与上述培养基交换后使用的病毒培养基优选为MEM培养基，其中添加5到20％，优选10％的水解乳白蛋白，不含BMS或不含胎牛血清，并不含抗生素。所有的制备方法都优选在pH值7.0到8.0，优选pH7.25进行。优选TCID₅₀/ml(TCID₅₀＝50％组织培养物感染剂量)为10^5.0到10^7.5，优选TCID₅₀/ml至少为10^6.5的病毒收获物作为制备本发明的单副免疫诱导物PIND-MYXO的适宜起始材料。

粘液瘤病毒在Vero细胞中的复制造成典型的细胞病变效应，其基本特征是被感染细胞的破坏(裂解)。接种10MOI(感染复数)的剂量后，经过一个短暂的细胞圆化期(rounding phase)，将出现持续约3天的网状细胞结构，经过约5天之后细胞裂解。Vero细胞中的第301代的感染滴度大约是10^6.5TCID₅₀/ml。

减毒后的粘液瘤病毒用0.01-1％，优选0.05％浓度的β-丙内酯进行化学处理而灭活。灭活使合适场合下仍然存在的致免疫性彻底丧失，而副特异性活性不但被保留，而且实际上显著地提高了。

为了进一步将减毒并灭活的粘液瘤病毒加工成粘液瘤病毒单副免疫诱导物(PIND-MYXO)，用于病毒灭活的病毒起始材料的病毒滴度为10^5.0到10^7.0，优选至少10^6.5TCID₅₀/ml。

纯化优选地通过低转速(例如1,000rpm)的离心来进行。离心后，加入0.5-10％，优选5％的琥珀酰明胶(例如来自Hausmann，St Gallen/Switzerland的聚明胶肽(polygeline)。然后可以将获得的混合物分成1.5ml的等份装入合适的无菌玻璃瓶或安瓿中冻干，必要时还可以溶于蒸馏水。0.5-2ml，优选1.0ml的溶于蒸馏水的冻干物相当于通过肌内给药对人进行接种的剂量(同时参见Mayr A.和Mayr.B.：Von der Empirie zur Wissenschaft，Tierrztl.Umschau，edition 56：583-587，2002)。

减毒可以通过下面的指征来进行临床检测：对于欧洲家兔和野生家兔(Oryctolagus caniculus csp.)的毒力丧失；传染性丧失；细胞培养物中宿主范围的实质上完全的限制；以及致免疫性的改变。

冻干的产品可以优选地在大约+4℃或更低温度优选在大约-60℃保存，其稳定性没有时间限制。

对所制备的减毒粘液瘤病毒进行基因技术研究显示，该粘液瘤病毒的基因组中发生了多个缺失。在起始的M-2毒株中，粘液瘤病毒基因组具有单独的线性脱氧核糖核酸(DNA)，其长度为大约160千碱基(kb)，编码数百个蛋白(Herrlich A.，Mayr A.和Munz.E.：“Die Pocken”，2nd edition，GeorgTheime Verlag，Stuttgart，1967)。在基因组片段的大约11kb处具有末端的反向重复序列(末端反向重复(terminal inverted repeats，TIR))。(McFadden，G.和Gramham K.：“Modulation of cytokine networks by pox virus”，Virology，edition 5：421-429，1994)。

由此，已经发现经过粘病毒在Vero细胞中连续传代的减毒导致编码干扰素α和γ(IFNα，IFNγ)受体、肿瘤坏死因子(TNF)受体和白介素(IL)1、2、6和12受体的基因片段的丢失。令人感兴趣的是上述细胞因子属于非特异性免疫系统的副特异性防御因子。这些细胞因子通过结合到相应的病毒受体上而被中和，这样病毒就可以不受阻碍地复制。编码上述细胞因子受体的基因片段的缺失主要涉及DNA的末端区域。还是，还有可能发现在AVIVER细胞中传代的过程中，在DNA的保守部分发生的缺失。这些缺失涉及到两个编码免疫表位的基因和毒力基因。可以想见，这些遗传修饰是造成减毒粘液瘤病毒中致免疫活性即抗原特异性活性的下降，以及同时副特异性活性的上升的原因之一。

致免疫性表位和副特异性及非特异性表位是相互竞争的。因此，前者的肽或者蛋白的减少可增强副特异性活性的作用。在单副免疫诱导物的制备中，利用前面描述的灭活减毒粘液瘤病毒的方法，清除掉残余的致免疫性及致毒力增强性的蛋白。

本发明的单副免疫诱导物，又称PIND-MYXO，是以减毒的粘液瘤病毒或其致副免疫性的组成部分的使用为基础的；基于其致副免疫性，其适用于病人中下列适应症的预防和治疗：

-感染因子疾病和混合感染，感染过程的慢性表现，顽固性复发性感染，及抗化疗性细菌和病毒感染

-生物体防御削弱和防御系统失调

-先兆性新生儿感染

-某些肿瘤疾病的辅助治疗，例如防止转移，减轻化疗、放疗产生的副作用

-调节体液、循环、代谢和神经系统之间的平衡。

本发明的副免疫诱导物可以通过胃肠外给药或者局部给药施用于哺乳动物包括人类，鸟类，和爬行动物。局部施用副免疫诱导物可特异性地刺激粘膜和皮肤中的副特异性防御机制。但同时也有一定的全身性作用。相反，通过胃肠外方式施加的致副免疫作用很少影响到皮肤和粘膜中的局部防御机制，而倾向于产生全身性作用。

在人和动物中即使连续进行多次胃肠外给药也不会出现副作用。对于动物和人类，PIND-MYXO的适用症是相同的。同时，对于较困难的操作，特别是在马、猪、狗和猫的饲养管理中，适当的选择是出生后当天立即对新生幼仔实施致副免疫，更优地是在出生后第一天，也可以是第二天。单次剂量为上述溶解的冻干物0.5到5ml。通过胃肠外给药，在马和猪中单次剂量优选2ml，在狗和猫中单次剂量优选0.5ml。根据本发明，在特异性保护接种的前一天和/或同时通过胃肠外给药施用PIND-MYXO是比较合适的，以避免继发反应并在疫苗接种时协助产生免疫。

本发明的一个实施方案涉及用于局部给药以在皮肤和粘膜中诱导产生副免疫的药物组合物的制备。此药物组合物优选地涉及基于减毒并灭活的粘液瘤细胞培养物病毒组合的、含服或可吮吸的片剂。本发明的含服片剂在制备时优选地添加了山梨醇、聚乙二醇6.00，磷酸氢钾，Tyrospirol片精，Kollidon(聚乙烯吡咯酮)25和硬脂酸镁。PIND-MYXO还可以借助合适的载体通过鼻、直肠或阴道给药。

下面的实施例是本发明优选的实施方案，以进一步阐明本发明的主题。

实施例1

从患有典型的粘液瘤的欧洲野生家兔(Oryctolagus属)的水肿皮下组织中分离粘液瘤病毒，将其作为起始材料，通过在保温了10天的鸡卵的绒毛尿囊膜(CAM)(Valo细胞)上培养来制备本发明的单副免疫诱导物PIND-MYXO，然后根据Herrlich等的方法((Herrlich A.，Mayr A.和Munz E.：“Die Pocken”，2nd edition，Georg Theime Verlag，Stuttgart，1967)，在CAM上传代适应三次。然后进入第一阶段，即将CAM上的第三代经过120次传代适应到Vero细胞中(ATCC CCL-81，WHO，美国典型培养物保藏中心)；然后是第二阶段，即通过在AVIVER细胞培养物中经过24次中间传代使病毒复制；最后是第三阶段，即进一步在Vero细胞中培养。以减毒为目的，总共进行300次传代。经过这样连续的终点稀释传代，原本具有毒力的粘液瘤病毒就被减毒了。

在Vero细胞中复制减毒后的粘液瘤病毒。用由MEM(minimal essentialmedium，最小必需培养基)培养基加上10％的BMS(serum substitute medium，血清替代培养基)和10％的水解乳白蛋白组成的完全合成培养基培养Vero细胞培养物。与上述培养基交换后使用的病毒培养基只含MEM培养基加上10％的水解乳白蛋白，不含BMS或不含胎牛血清，并不含抗生素。所有制备方法在PH值7.25以上进行。滴度高于10^6.5TCID₅₀/ml的病毒收获物作为制备本发明的单副免疫诱导物PIND-MYXO的起始材料。在用0.05％β-丙内酯灭活病毒收获物并低速离心之后，在冻干之前，向病毒材料中加入5％的琥珀酰明胶(聚明胶肽)。

冻干的产品在室温以及在约4℃到-80℃的温度是稳定的，可以无时限地保存，优选在约4℃或-60℃。1ml溶于蒸馏水的冻干物相当于接种剂量。进行深肌内或局部给药(见实施例3，4和5)。

实施例2

通过与实施例1所描述的类似的方式，将干燥形式的(未溶解的冻干物)本发明的PIND-MYXO诱导物局部给药到上呼吸道的粘膜中，优选通过鼻内给药，每天3次，用于预防和治疗(每次用1ml)多因素感染(例如流感感染)。

实施例3

将如实施例1制备的液体形式的PIND-MYXO诱导物通过类似的方式擦入表皮，以促进皮肤的渗透，加速伤口愈合，及治疗人类静脉曲张和慢性静脉功能不全(小腿溃疡)。为此目的，可以将所述冻干物制成例如油膏(例如泛醇，Linola fat)以便吸收，此时pH应该为微碱性。这种制剂每次用时应该现制现用。每天给药数次，给药方式是用手擦入未破的皮肤。治疗开放性创伤时，可以将新鲜溶解的产品滴入创伤区域。治疗每天进行直至愈合。

实施例4

在使用常规的特异性疫苗进行保护性接种时，在保护性接种的前一天以及同时，将如实施例1制备的PIND-MYXO诱导物以类似的方式通过胃肠外给药，以防止继发反应和提高接种效果。

实施例5

将如实施例1制备的PIND-MYXO诱导物以类似的方式加工成含服或可吮吸的片剂。上述可吮吸的片剂的制备，及其用于耳、鼻、咽喉和口腔的粘膜的局部致旁免疫作用的应用，都是新的而且是本发明的组成部分。通过活化的口腔粘膜，不但存在归巢作用(homing effect，指防御细胞迁移到其他器官系统的粘膜中)，而且还有部分的胃肠外致旁免疫作用。下述的制备方法已经被证明适用于制备含服和可吮吸的片剂：

对于冻干，5％Kollidon 25(聚乙烯吡咯酮)而不是明胶被加入到液体的诱导物材料中。制备终产品片剂需要尿素，山梨醇，聚乙二醇6000和硬脂酸镁。下面是500.5mg重的片剂的推荐配方：

PIND-MYXO冻干物                         60mg

尿素                                    50mg

山梨醇                                  267mg

聚乙二醇6000                            118mg

硬脂酸镁                                0.5mg

总重                                    500.5mg

病人每天应以固定的间隔服用4-6片以实现最佳的致副免疫。

下面这个药物组合物的配方以被证明适用于制备含服片剂：

PIND-MYXO冻干物                          155mg

山梨醇                                   360mg

聚乙二醇6000                             300mg

磷酸二氢钾(KH2PO4)，无水               2mg

磷酸氢二钠(Na2HPO4)，无水              8mg

Tyrospirol精片                           0.8mg

硬脂酸镁                                 20mg

总重                                     805.8mg

上述片剂在病人的口腔中缓慢地溶解，溶解后可以吞下。

表1到4汇集了利用基于粘液瘤病毒M-2株的冻干物的本发明的单副免疫诱导物的临床测试结果。该结果显示该粘液瘤病毒的冻干物在人类中有非常好的致副免疫活性。这些数据同样也可用于其他哺乳动物，以及鸟类和爬行动物。

                           表1

利用来自减毒粘液瘤细胞培养物病毒的单副免疫诱导物在人体中的临床结果

                          预防用途-

            (经肌内给予冻干的诱导物1OP(1ml))

适应症	合适的给药方法
		高感染期(period of high infection)压力应激旅行，检验和类似的应激保护性接种之前或同时	应激前注射2次，间隔24小时
化疗，放射(减少或降低继发性反应)手术(改进伤口愈合)	每天或每两天注射1次直到治疗完全或直到恢复
		保持最佳抵御和血液动力学预防癌症和hepatitides改善健康	每个月注射1-2次，间隔24小时

                          表2

用来自减毒的粘液瘤细胞培养物病毒的单副免疫诱导物在人体中的临床结果

                       -治疗用途-

            (经肌内给予冻干的诱导物1OP(1ml))

适应症	合适的给药方法
		疱疹性疾病(带状疱疹，传染性单核细胞增多症，单纯疱疹等)	每天注射1次，持续注射3-5天直到症状消失，然后每两天或三天一次直到完全康复
慢性肝炎	每月一个“疗程”：3次注射，每次间隔24小时
		流感性疾病病毒和细菌混合性感染(结合抗生素或化疗)	每天一次给药直到症状消失，然后每两天一次注射直到完全康复
免疫缺陷和防御系统失调(例如化疗中或化疗后)	1.5到10天的强化治疗：每天注射1次2.然后每周注射2次，每次间隔为24小时(可能要经历长期治疗)
		内毒素损伤	每天一次注射，持续7天或直到康复

                                  表3：

             在低免疫参数的病人中用粘液瘤诱导物(PIND-MYXO)进行

                  致副免疫作用的效果(PIND-MYXO给药后7天)

病人	病人资料诊断/治疗	参数(正常范围)	第0天	第7天
					S.女性52岁	免疫抑制	白细胞(4000-10000/μl)	4000	9400
D.B.女性54岁	溃疡性结肠炎可的松疗法	淋巴细胞(900-3000/μl)CD4细胞(500-1800/μl)CD8细胞(100-1000/μl)	62040080	1360920210
					U.S.男性38岁	免疫障碍(immonoligicalimpairment)	白细胞(4000-10000/μl)	3800	7400
S.C.男性	转移性前列腺癌放疗	白细胞(4000-10000/μl)	3800	9900
					M.女性56岁	感染易感性	细胞毒细胞(30-360/μl)	0	248

                             表4：

    在具有升高的免疫参数的病人中用粘液瘤诱导物(PIND-MYXO)进行

                副免疫的效果(PIND-MYXO给药后7天)

病人	诊断/治疗	参数(正常范围)	第0天	第7天
					G.P.女性59岁	宫颈癌、乳腺癌感染易感性	白细胞(4000-10000/μl)粒细胞(2400-6400/μl)	126008420	86005930
C.H.女性51岁	心身综合症(psychosomaticsyndrome)肥胖	白细胞(4000-10000/μl)粒细胞(2400-6400/μl)	127009270	60004760

Claims (48)

1.基于致副免疫性病毒或病毒组分的单副免疫诱导物，其特征在于所述病毒或病毒组分来自减毒的兔粘液瘤病毒株。

2.权利要求1的单副免疫诱导物，其特征在于所述减毒的粘液瘤病毒株在一个或多个编码产生细胞因子受体的基因片段中具有添加、取代或缺失形式的修饰，通过该修饰，所述细胞因子受体丧失其受体性质。

3.权利要求2的单副免疫诱导物，其特征在于所述细胞因子受体选自干扰素(IFN)受体、白介素(IL)受体或肿瘤坏死因子(TNF)受体。

4.权利要求3的单副免疫诱导物，其特征在于所述细胞因子受体选自IFNα-R受体、IFNγ-R受体、TNF-R受体、IL-1-R受体、IL-2-R受体、IL-6-R受体或IL-12-R受体。

5.权利要求1到4中任一项的单副免疫诱导物，其特征在于所述病毒组分包括减毒的粘液瘤病毒株的病毒包膜或病毒包膜的任何异常形式。

6.权利要求1到5中任一项的单副免疫诱导物，其特征在于所述粘液瘤病毒株选自：M2、M7、Lausanne或Aust/Uriarra/Verg-86/1。

7.权利要求6的单副免疫诱导物，其特征在于所述粘液瘤病毒株是保藏号为ECACC 03121801的M-2株。

8.权利要求1到7中任一项所述的单副免疫诱导物，其特征在于所述粘液瘤病毒株已在细胞培养物中减毒。

9.权利要求8的单副免疫诱导物，其特征在于所述细胞培养物包括Vero猴肾细胞和/或AVIVER细胞。

10.权利要求1到9中任一项的单副免疫诱导物，其特征在于所述减毒的粘液瘤病毒已被灭活。

11.权利要求10的单副免疫诱导物，其特征在于所述减毒的粘液瘤病毒已用β-丙内酯灭活。

12.权利要求11的单副免疫诱导物，其特征在于所述β-丙内酯的浓度是0.01-1％。

13.权利要求12的单副免疫诱导物，其特征在于所述β-丙内酯的浓度是0.05％。

14.权利要求1到13中任一项的单副免疫诱导物，其特征在于粘液瘤病毒已被冻干。

15.权利要求1到14中任一项的单副免疫诱导物用于制备药物组合物的用途。

16.权利要求1到14中任一项的单副免疫诱导物用于制备药物组合物的用途，该药物组合物用于激活人和动物中的副特异性免疫系统。

17.权利要求1到14中任一项的单副免疫诱导物用于制备药物组合物的用途，该药物组合物用于对下列疾病进行胃肠外治疗和/或进行预防：免疫系统机能障碍，免疫抑制，免疫缺陷性疾病，体液、循环、代谢和神经系统之间自动调节的功能障碍，先兆性新生儿感染，肿瘤性疾病，病毒性疾病，细菌性疾病，抗治疗性感染因子疾病，病毒和细菌混合性感染，感染过程的慢性表现，多种病因引起的肝脏疾病，慢性皮肤疾病，疱疹性疾病，慢性肝炎(chronic hepatitides)，流感性感染，内毒素损伤。

18.权利要求15到17中任一项所要求的用途，其中所述治疗是通过将所述药物组合物经由病人的皮肤或粘膜局部给药而进行的。

19.一种药物组合物，其含有权利要求1到14的任一项的单副免疫诱导物以及药学上可接受的载体。

20.权利要求19的药物组合物，其用于局部或胃肠外给药。

21.权利要求19的药物组合物，其中该组合物是含服和可吮吸的片剂的形式。

22.一种制备基于减毒的兔粘液瘤病毒株的单副免疫诱导物的方法，其包括下列步骤：

-从典型地患有全身性多发性粘液瘤的兔的被感染组织中分离粘液瘤病毒；

-使该病毒适应于允许性细胞系统；

-将分离的病毒在允许细胞培养物中传代直到实现该病毒的减毒。

23.权利要求22的方法，其中所述分离的病毒被接种到保温的鸡卵的绒毛尿囊膜(CAM)上以进行适应。

24.权利要求23的方法，其中所述病毒在CAM上在2到6次传代优选3次传代中进行复制。

25.权利要求22的方法，其中存在于被感染的组织中的粘液瘤病毒通过是在允许性细胞系统中复制而得以分离的。

26.权利要求25的方法，其特征在于所述病毒是通过在保温的鸡卵的绒毛尿囊膜(CAM)上进行培养而得以分离的。

27.权利要求26的方法，其特征在于随后在进一步的传代优选2次进一步的传代中使所述病毒适应于CAM。

28.权利要求22到27中任一项的方法，其中所述病毒在永久细胞培养物中传代。

29.权利要求28的方法，其中所述病毒在Vero细胞培养物中传代。

30.权利要求29的方法，其特征在于在Vero细胞培养物中所述粘液瘤病毒的减毒在80到150次，优选120次传代中发生。

31.权利要求28到30中任一项的方法，其中所述病毒在二元细胞培养物中传代。

32.权利要求31的方法，其中所述病毒在AVIVER细胞培养物中传代。

33.权利要求32的方法，其中所述传代在10到50次传代，优选25次传代中发生。

34.权利要求22到33中任一项的方法，其中所述减毒的粘液瘤病毒还在进一步的减毒传代中进行另外的复制。

35.权利要求34的方法，其中所述复制在Vero猴肾细胞中进行。

36.权利要求35的方法，其特征在于进一步的生长在Vero细胞中在100到200次传代中发生。

37.权利要求34到36中任一项的方法，其特征在于细胞培养物的病毒收获物的感染滴度为10⁵到10^7.5，优选为至少10^6.5TCID₅₀/ml。

38.权利要求22到37中任一项的方法，其中所述减毒的粘液瘤病毒被另外灭活。

39.权利要求38的方法，其中所述减毒的粘液瘤病毒经β-丙内酯处理而灭活。

40.权利要求39的方法，其特征在于所述β-丙内酯的浓度为0.01-1％。

41.权利要求40的方法，其特征在于所述β-丙内酯的浓度为0.05％。

42.权利要求22到41中任一项的方法，其包括下列步骤：

-通过在保温的鸡卵的CAM上复制，从患有多发性粘液瘤的兔的被感染组织中分离出粘液瘤病毒，然后

-在2次进一步的传代中使分离的粘液瘤病毒适应于CAM

-使该分离的病毒减毒，其经过下列步骤

-在Vero细胞培养物中传代，优选经过120次传代，

-将该病毒转移到二元AVIVER细胞培养物中，在此细胞培养物中该病毒被进一步减毒，优选经过24次中间传代而进一步减毒，

-然后将该病毒转移回Vero猴肾细胞，并

-通过在Vero细胞中进一步的减毒传代、优选在大约150次传代中复制该减毒的粘液瘤病毒。

43.可以通过权利要求22到42中任一项的方法而得到的减毒的粘液瘤病毒。

44.权利要求43的粘液瘤病毒，其保藏于欧洲细胞培养物保藏中心(ECACC)，保藏号为03121801。

45.权利要求43或44的粘液瘤病毒，其特征在于所述粘液瘤病毒经过了遗传修饰。

46.权利要求45的粘液瘤病毒，其特征在于所述粘液瘤病毒在编码产生细胞因子受体的一个或多个基因片段中具有添加、取代或缺失形式的修饰，通过该修饰，所述细胞因子受体丧失其受体性质。

47.权利要求46的粘液瘤病毒，其特征在于所述细胞因子受体选自干扰素(IFN)受体、白介素(IL)受体、或肿瘤坏死因子(TNF)受体。

48.权利要求47的粘液瘤病毒，其特征在于所述细胞因子受体选自IFNα-R受体、IFNγ-R受体、TNF-R受体、IL-1-R受体、IL-2-R受体、IL-6-R受体或IL-12-R受体。