EP1711204A1 - Monoparamunit tsinducer basierend auf attenuierten myxomavir en des kaninchens - Google Patents

Monoparamunit tsinducer basierend auf attenuierten myxomavir en des kaninchens

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EP1711204A1
EP1711204A1 EP05701103A EP05701103A EP1711204A1 EP 1711204 A1 EP1711204 A1 EP 1711204A1 EP 05701103 A EP05701103 A EP 05701103A EP 05701103 A EP05701103 A EP 05701103A EP 1711204 A1 EP1711204 A1 EP 1711204A1
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EP
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virus
passages
viruses
myxoma
attenuated
Prior art date
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Withdrawn
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EP05701103A
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Inventor
Anton Mayr
Barbara Mayr
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Bavarian Nordic AS
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Bavarian Nordic AS
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Publication date
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    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24032—Use of virus as therapeutic agent, other than vaccine, e.g. as cytolytic agent

Definitions

  • the invention relates to monoparamunity inducers based on paramunizing viruses or virus components, characterized in that the viruses or virus components originate from an attenuated myxomavirus strain of the rabbit, a method for producing the monoparamity inducers and their use as medicaments.
  • the body's immune system of highly developed organisms includes an antigen-specific and an antigen-unspecific part. Both parts of the immune system are networked and interact with each other.
  • the antigen-specific mechanisms are responsible for the build-up of immunity, the antigen-specific ones for the build-up of paramunity.
  • Paramunity refers to the state of a well-regulated and optimally functioning non-specific defense system, combined with a rapidly emerging, time-limited, increased protection against a large number of different pathogens, antigens and other noxious agents.
  • paramunity For historical and functional reasons, the basis for the emergence of paramunity is the so-called primitive, non-selective and conditionally selective, parasitic defense mechanisms that are old from a phylogenetic point of view.
  • the paraspecific activities of the antigen-unspecific immune system include non-selective protective elements, such as foreign material-eating organelles, and limited selective protective elements, such as micro- and macrophages, natural killer cells, dendritic cells and soluble factors such as cytokines, which react pathogen-unspecific or antigen-unspecific depending on their genesis.
  • non-selective protective elements such as foreign material-eating organelles
  • limited selective protective elements such as micro- and macrophages, natural killer cells, dendritic cells and soluble factors such as cytokines, which react pathogen-unspecific or antigen-unspecific depending on their genesis.
  • Paraspecific activities can be observed in the organism concerned immediately after antigen contact, while the effects of the antigen-specific immune system only take days or weeks.
  • the paraspecific immune defense is a physiological process and can be defined as "primary control" when dealing with the environment. It is irreplaceable not only for the lower organisms, but especially for the more highly and highly developed vertebrates. Primary congenital defects in this biological Defense systems lead to life-threatening situations.
  • One example is the "Chediak-Steinbrinck-Higashi syndrome” of humans, which is characterized by granulocyte defects and dysfunctions of the natural killer cells (NK cells) and in most cases until the 10th Leads to the death of the patient.
  • the state of paramunity is characterized by an increased phagocytosis rate, an increased function of spontaneous cell-mediated cytotoxicity (NK cells) and an increased activity of other lymphoreticular cells.
  • certain cytokines are released, which have a stimulating and / or inhibiting effect (for example via repressor mechanisms) both with the cellular elements and with one another.
  • This closely networked and gradually reacting biological system of paramunity with its different acceptor, effector and target cells as well as the signal-transmitting cytokines is also closely connected to the hormone and nervous system. It is an important part of the communication, interaction and regulation network. Paramunity is initiated by paramunization.
  • Paramunization inducers are used for paramunization, to which certain harmlessness and efficacy criteria are set, which distinguish them from immunostimulants.
  • the paramunity inducer per se is not comparable to a repellent, nor to a chemical, an antibiotic, vitamin or hormone. Rather, it activates the paraspecific immune system via a step-by-step mechanism, so that it mobilizes sufficient cellular and humoral defense mechanisms.
  • the paramunity inducer acts both regulating and repairing with regard to the immune defense. With regard to the mode of action of paramunity inducers, it is known that they are taken up by phagocytic cells (acceptor cells), which are thereby activated and release mediators, which in turn mobilize effector cells. These finally switch on the regulatory mechanisms of the parasitic defense.
  • the present invention is based on the paramunizing properties of attenuated myxoma viruses and / or their virus components.
  • Attenuation leads to loss of virulence and contagiosity, a reduction in the immunizing properties and the host spectrum and to minor changes in the pathogen genome with the appearance of deletions, preferably in the terminal areas. At the same time, there is usually an increase in the paramunizing activities of the modified pathogen.
  • Attenuation especially when attempting experimental attenuation through genetic engineering manipulations, can also lead to an increase in virulence and contagiosity.
  • Myxoma viruses are the causative agents of myxomatosis, a cyclical, contagious viral general disease of wild and domestic rabbits, which is characterized by generalized, partially hemorrhagic subcutaneous edema on the head and all over the body, with preference for the anal region, the vulva and the tube, like no other infectious disease is. If myxomatosis is newly introduced into a previously disease-free country, it is rapid and fatal. After the virus becomes sedentary, the epidemic character changes up to clinically unapparent infections (Mayr A .: Medical microbiology, infection and epidemics, 7th edition, Enke-Verlag, Stuttgart, 2002).
  • the disease is widespread among American cottontail rabbits of the genus Sylvilagus, which only colonize the new world. These wild rabbits are the only natural reservoir of the disease. The infection is mild. In contrast, the disease in European wild and domestic rabbits of the genus Oryctolagus, which are also native to Australia, has an almost 100% mortality rate when the pathogen is newly introduced.
  • Myxomavirus (genus Leporipoxvirus) is narrowly limited. In general, the virus only reproduces in American cottontail rabbits and in European domestic and wild rabbits. However, were also isolated Infections in European wild rabbits observed. Attempts to transfer it to other animal species and to humans were negative.
  • the present invention has for its object to provide new monoparamunity inducers for human medicine and veterinary medicine. Another object of the present invention is to provide a method for producing such monoparamity inducers. It is also an object of the present invention to provide pharmaceutical compositions for use as medicaments based on monoparamity inducers.
  • the present invention relates to monoparamunity inducers based on paramunizing viruses or virus components, characterized in that the viruses or virus components originate from an attenuated myxoma virus strain of the rabbit.
  • the virus components preferably comprise paramunizing virus envelopes or aberrant forms of virus envelopes of an attenuated myxoma virus strain.
  • Preferred strains which have the parameterizing properties according to the invention are the strains M-2, M-7, Lausanne, Aust / Uriarra / Verg-86 /.
  • the strains M-7, Lausanne, Aust / Uriarra / Verg-86/1 are also suitable for the production of live vaccines, since their virulence is only partially weakened in order to have a sufficiently immunizing effect.
  • a monoparamity inducer based on the myxomavirus strain M-2 is particularly preferred.
  • An attenuated myxoma virus strain, produced by the method according to the invention described below, is available at the depository of the Public Health Laboratory Service (PHLS), Center for Applied Microbiology & Research, European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC), Salisbury, Wiltshire, United Kingdom the deposit number 03121801.
  • PHLS Public Health Laboratory Service
  • ECACC European Collection of Animal Cell Cultures
  • Salisbury, Wiltshire United Kingdom the deposit number 03121801.
  • the invention further relates to a method for producing monoparamunity inducers based on an attenuated myxomavirus strain of the rabbit.
  • myxoma viruses are first isolated from infected tissue of a rabbit typically suffering from generalized myxomatosis. The virus is then adapted to a permissive cell system, ie to a cell material that allows the virus to multiply, such as cell cultures, incubated chicken eggs or experimental animals.
  • a permissive cell system ie to a cell material that allows the virus to multiply, such as cell cultures, incubated chicken eggs or experimental animals.
  • cells from the natural host or a species closely related to the host can be used for adaptation.
  • permissive cell systems for myxoma viruses For example, chicken embryo fibroblasts (FHE) are suitable, as are cell cultures made from rabbit kidneys or testicles.
  • Preferred according to the invention is the adaptation of the isolated myxoma virus to the chorioallantoic membrane (CAM) of incubated chicken eggs over one or more passages, preferably over 2 to 6 passages and particularly preferably over 3 passages.
  • the isolated viruses are vaccinated on the CAM and multiplied by passing through the CAM.
  • the myxoma viruses are preferably first isolated from infected tissue by multiplication in a permissive cell system.
  • a permissive cell system can be inoculated, for example, with infected tissue homogenate obtained by digestion.
  • the viruses obtained by first propagation are either further adapted to the same permissive cell system type that was already used for the isolation, or a different, further permissive cell system is used.
  • the adaptation of the virus to the same permissive cell system type that is also used for the isolation is preferred.
  • Myxoma viruses are thus preferably isolated from infected tissue by multiplication in a permissive cell system and then adapted to the permissive cell system by further passages.
  • a first cultivation or isolation of the myxoma viruses by multiplying chicken eggs incubated on the CAM and subsequent adaptation of the virus on the CAM over further passages, preferably over a further 2 passages.
  • the allantoic liquid of incubated chicken eggs can also be used for the cultivation and / or adaptation.
  • the actual attenuation then takes place through permanent passages on one or more permissive cell cultures until attenuation or the desired degree of attenuation of the virus is achieved.
  • various permissive cell systems can first be tried out to multiply the virus, and then one or more cell systems in which the highest infectivity titers are achieved can be selected for further passages.
  • Both primary and secondary cell cultures as well as permanent or continuous cell lines are suitable for attenuation through long-term passages.
  • attenuation can be achieved by multiplication in primary or secondary chicken embryo fibroblast (FHE) cultures or in cultures of permanent FHE cells.
  • FHE primary or secondary chicken embryo fibroblast
  • the virus is preferably passaged or propagated in a permanent cell culture, in particular a Vero cell culture, for attenuation of the myxoma virus, preferably over 80 to 150 passages and particularly preferably over 120 passages.
  • a permanent cell culture in particular a Vero cell culture
  • the virus is passaged according to the invention on a binary, permanent cell line, AVIVER cells preferably being used. This cell or cell culture was obtained by a cell fusion between chicken embry fibroblasts (FHE) and Vero monkey kidney cells.
  • the isolated and adapted viruses are preferably passaged in a first step in Vero cell cultures, the viruses are subsequently transferred into a binary AVIVER cell culture and in these preferably over 10 to 50 passages, in particular over 20 to 30 passages, and particularly preferably increased over 25 passages.
  • the attenuated myxoma virus can be multiplied by additional attenuation passages.
  • a further multiplication of the viruses takes place preferably via further passage in Vero monkey kidney cells, in particular over 100 to 200 passages.
  • a particularly preferred, further process step is an additional inactivation of the attenuated myxoma virus.
  • Inactivation can take place by chemical treatment, radiation, exposure to heat or pH, in particular by chemical treatment with beta-propiolactone.
  • beta-propiolactone By treating the attenuated myxoma viruses with beta-propiolactone, the paraspecific activities are increased, while the immunizing properties that may still be present after attenuation are lost.
  • a particularly preferred embodiment of the method according to the invention comprises the following steps: isolating myxoma viruses from infected tissue of a rabbit typically suffering from generalized myxomatosis by multiplying chicken eggs incubated on the chorioallantoic membrane (CAM) and subsequently adapting the virus to the CAM over a further 2 passages; - attenuation of the isolated viruses by passage in Vero cell cultures, preferably over 120 passages; Transfer of the viruses into a binary AVIVER cell culture, the AVIVER cells being obtained by a cell fusion between chicken embryo fibroblasts (FHE) and Vero monkey kidney cells, and attenuation of the virus in this cell culture over 10 to 50, preferably 25, passages. subsequent retransfer of the virus to Vero monkey kidney cells and multiplication of the viruses by further attenuation passages in the Vero cells, preferably over approximately 150 passages;
  • Attenuation through permanent passage is usually completed by 3 to 5 final plaque dilutions. After obtaining and testing different clones, those clones are selected for further propagation with which the highest infectivity titer is achieved and with which a high paramunizing effectiveness - e.g. in the VSV challenge test in the baby mouse. This procedure is intended in particular to provide genetically uniform virus material for further use.
  • Attenuation denotes the experimental change of the originally virulent myxoma virus into the modified form, while simultaneously increasing the paramunizing properties. Attenuation can be demonstrated by one or more of the following properties: reduction or Weakening or loss of virulence for European domestic and wild rabbits (genus Oryctolagus caniculus csp.), Weakening or loss of contagiosity, narrowing of the host spectrum in cell cultures, change in the immunizing properties, acquisition of paramunizing, short-term protective activities. Attenuation can lead to deletions in the terminal Area of the myxoma virus genome, and with increasing degree of attenuation an increasing number of deletions in the viral genome is observed.
  • the degree of attenuation can be checked and checked in the course of the passages by appropriate, suitable effectiveness tests, as are known in the prior art (cf., for example, US Pat. No. 6,805,870, column 12, and the further literature references cited therein) and by cloning.
  • the present invention further relates to attenuated myxomaviruses which can be obtained by the process according to the invention, pharmaceutical compositions which comprise the attenuated myxomavirus or the myxomavirus monoparamunity inducer according to the invention, and the use of the myxomavirus monoparamunity inducer for activating the paraspecific immune system in a mammal or Use of the attenuated virus for the manufacture of a corresponding drug.
  • the myxomavirus monoparamunity inducers according to the invention are suitable for the treatment and / or prophylaxis of immune system dysfunctions, immunosuppression, immune deficiency disorders, dysfunctions of homeostasis between hormone, circulatory, metabolic and nervous systems, neonatal infection threats, tumor diseases, Viral diseases, bacterial diseases, therapy-resistant infectious factor diseases, viral and bacterial mixed infections, chronic manifestations of infectious processes, liver diseases of different origins, chronic skin diseases, herpes diseases, chronic hepatitis, flu infections, endotoxin damage.
  • the monoparamity inducers according to the invention are generally harmless to the environment and are effective in terms of paramunization for mammals, e.g. Human, horse, dog, cat, pig, for birds and also for reptiles, such as Lizards, snakes, turtles. They are therefore particularly well suited for use in human and veterinary medicine.
  • the monoparamunity inducers according to the invention have very good paramunizing activity with high potency. They can be produced in a suitable manner using the method according to the invention and are safe for use in the medical field. As a result of the attenuation of the myxoma viruses, the immunizing properties of the myxoma viruses decrease, while the paraspecific activities increase.
  • the monoparamity inducers according to the invention therefore have no immunizing, but rather paramunizing properties, which enables repeated and continuous use. These paramunizing properties of the rabbit myxoma virus or its paramunizing virus components are surprising and were not predictable.
  • paramunization denotes the medicinal activation of the cellular elements of the paraspecific immune system and the associated formation or release of cytokines with the aim of eliminating dysfunctions, the non-pathogen and non-antigen-specific protection of To increase the individual quickly and to act as a regulator between the immune, hormone, nervous and vascular systems: Paramunization leads to the protective state of the paramunity.
  • paramunity denotes the actively acquired state of an optimally regulated and functioning paraspecific defense system, combined with a rapidly emerging, time-limited protection against a large number of pathogens, antigens and other noxious substances.
  • the phagocytosis rate, the function of the NK cells (natural killer cells) and the activity of other lymphoreticular cells (e.g. dendritic cells) are increased to the physiological optimum.
  • paramunity inducer denotes a pyrogen-free, non-toxic medicament which is intended to be used in humans and animals for the production and regulation of the body's own defense and protection mechanisms in the sense of a paramunization.
  • myxomavirus monoparamity inducer refers to a medicament based on rabbit attenuated myxoma viruses or an attenuated myxoma virus strain, including the paramunizing virus components and the components thereof, which are preferred in an organism in a mammal (e.g. human) to produce the state of paramunity.
  • myxomavirus denotes the species of the myxomatosis virus of the genus Leponpoxvirus.
  • the myxomavirus belongs to the subfamily of the Chordopoxviridae and the family of the Poxvi dae (smallpox viruses).
  • paramunizing virus components encompasses a large number of viral structures which are derived from a myxoma virus with paramunizing properties, for example reproductive or inactivated freshly isolated myxoma viruses, reproductive or inactivated recombinant myxoma viruses, which derived from freshly isolated myxoma viruses, Virus envelopes, the separated envelopes, and cleavage products and aberrant forms of these envelopes, individual native or recombinant polypeptides or proteins, in particular membrane and surface receptors, which occur in freshly isolated myxoma viruses or are recombinantly expressed by a genetically modified myxoma virus or part of its genetic information.
  • Tables 1 to 4 summarize the clinical results with the myxoma virus monoparamunity inducer PIND-MYXO based on the attenuated myxomatosis cell culture virus, strain M-2, in humans.
  • Table 1 shows the clinical results in the prophylactic use of the myxomavirus monoparamity inducer PIND-MYXO in humans.
  • Table 2 shows the clinical results in the therapeutic use of the myxoma virus monoparamunity inducer PIND-MYXO in humans.
  • Table 3 shows the effect of paramunization with myxomavirus monoparamunity inducer (PIND-MYXO) in patients with low immune parameters (7 days after PIND-MYXO application)
  • Table 4 shows the effect of paramunization with myxomavirus monoparamunity inducer (PIND-MYXO) in patients with increased immune parameters (7 days after PIND-MYXO application)
  • the invention is based on the surprising finding that attenuated rabbit myxoma viruses or their paramunizing components are able to produce very good paramunizing properties in a recipient organism, which lead to the protective state of the paramunity.
  • the basis for this invention was the first successful attenuation of rabbit myxoma viruses in cell cultures.
  • the monoparamity inducers according to the invention are preferably based on lyophilized, attenuated and inactivated myxoma viruses of the rabbit or their paramunizing virus components.
  • the attenuated myxomaviruses according to the invention or their virus components preferably originate from one myxomavirus strain or from several different attenuated myxomavirus strains. It is preferred that the monoparamity inducer according to the invention combinations of one or more strains of myxoma virus or their paramunizing virus components.
  • the paramunizing properties caused by the application of myxomavirus monoparamunity inducer in a mammal, such as in humans, are particularly useful for eliminating dysfunctions, increasing non-antigen-specific protection of an individual, eliminating stress-related effects, or otherwise (e.g. drug-induced immunosuppression or immunodeficiency and to have a regulatory effect between the immune, hormone and vascular systems.
  • the invention is further based on successful attenuation of a myxomavirus strain by passage over cell cultures, the virulent and / or immunizing properties of the myxomavirus strain being reduced or lost. Additional inactivation of the myxoma viruses can also take place by irradiation, exposure to heat or pH or, particularly preferably, by chemical treatment with beta-propiolactone.
  • the monoparamity inducers are based on attenuated, lyophilized myxoma viruses, and individual virus components of a myxoma virus which are suitable for causing paramunizing activities in an organism are also included in the invention.
  • an embodiment of the manufacturing method according to the invention of the monoparamunity inducer based on an isolated and attenuated myxomavirus strain of the rabbit is to be presented via cell culture passage.
  • the production process is not limited to this preferred strain, but is equally applicable to other rabbit myxomavirus strains.
  • Also included in the present invention are recombinant forms of a myxoma virus strain which have been produced by means of genetic modification.
  • Recombinant myxoma virus strains are preferred in which one or more sections in the genome which code for cytokine receptors have been modified by a modification in the form of an addition, substitution or deletion, the receptor properties of the cytokine receptor being lost as a result of the modification ,
  • These are preferably the gene segments which code for the receptors for interferons (1FN), interleukins (IL) and tumor necrosis factors (TFN), in particular for IFN- ⁇ -R, IFN ⁇ -R, TNF-R, IL-1-R, IL - 2-R, IL-6-R and) L-12-R.
  • the numerical values given here with regard to the incubation period or the number of passengers over cell cultures should not be interpreted as limiting. Minor modifications of these parameters and modifications which are obvious to the person skilled in the art and which also lead to the preparation of attenuated myxoma viruses are equally encompassed by this invention.
  • a preferred embodiment of the present invention relates to the successful attenuation of the myxomavirus strain M-2.
  • the myxoma virus strain M-2 was isolated from European wild rabbits suffering from myxomatosis (Herrlich A., Mayr A. and Münz E .: "Die Pocken", 2nd edition, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, 1967)
  • the modified skin cells which have been obtained from the subcutaneous tissue of the sick rabbit, are inoculated with chickens' eggs, preferably incubated for 10-12 days, after disruption to the chorioallantoic membrane (CAM).
  • the myxoma viruses are inoculated over 2 to 6 passages, preferably over three passages.
  • the 2nd to 6th passage serves as the starting material for the further attenuation of the myxoma virus in cell cultures. Attenuation takes place after adaptation of the viruses in the chorioallantoic membrane (recognizable by typical foci on the chorioallantoic membrane) in 3 stages. In stage 1, 80 to 150, preferably 120, continuous so-called final dilution passages are run through in Vero cells (Nero cells, ATCC CCL-81). After going through these passages, the myxoma virus is weakened in its virulence.
  • AVIVER cells are obtained by cell fusion between chicken embryo fibroblasts (FHE) and Vero cells and are called binary permanent cell culture.
  • the last passage via AVIVER cells is transferred back to Vero cells and is continued in the 3rd stage of attenuation for a further 100 to 200 passages, preferably about 157 passages, in Vero cells.
  • the myxoma virus is propagated over a total of more than 300 cell culture passages.
  • the myxomavirus is sufficiently attenuated.
  • a fully synthetic medium is preferably used for culturing the VERO cell cultures and the AVIVER cells, the medium MEM (“minimal essential medium”) plus 5 to 20%, preferably 10% BMS (serum replacement medium) and 5 to 20, is particularly preferred.
  • Virus harvests with a titer of 10 50 to 10 7'5 , preferably of at least 10 6 ' 5 TCID 50 / ml (TCID 50 50% tissue culture infectious dose), are preferably suitable as starting material for the preparation of the monoparamunity inducer PIND-MYXO according to the invention.
  • cpE cytopathic effect
  • MOI multiplicity of infection
  • reticulated cell structures occur for about 3 days and the cells are lysed after about 5 days.
  • the 301st passage in VERO Cells had an infection titer of approximately 10 6.5 TCID 50 / ml.
  • beta-propiolactone is carried out at a concentration of 0.01-1% beta-propiolactone, preferably at a concentration of 0.05% beta-propiolactone. This inactivation leads to a complete loss of any immunizing properties that may still be present, the parasite-specific activities not only being retained but actually increasing significantly.
  • the virus starting material used for virus inactivation should have a virus titer of about 10 50 to 10 70 , preferably at least 10 6 5 TCID 50 / ml.
  • the cleaning is preferably carried out by centrifugation at a low speed (eg 1000 rpm). After centrifugation, 0.5-10% succinylated gelatin (for example polygeline, for example from Hausmann, St. Gallen / Switzerland), preferably 5% succinylated gelatin, is added.
  • the resulting mixture can then be lyophilized in portions of 1.5 ml in appropriate sterile glass vials or ampoules and, if necessary, dissolved with distilled water (distilled water).
  • a volume of 0.5-2 ml, preferably from 1.0 ml of aqua dest. dissolved lyophilisate corresponds to a vaccine dose for humans when administered intramuscularly (see also Mayr A. and Mayr. B .: "From Empiricism to Science", Veterinary Survey, Edition 57: 583-587, 2002).
  • the lyophilized preparation can be stored at temperatures of preferably about + 4 ° C or at lower temperatures, preferably about -60 ° C, stable for an unlimited period.
  • the myxoma virus genome consists of a single linear deoxyribonucleic acid (DNA) with a total length of about 160 kilobases (kB), which codes for several hundred proteins (Herrlich A., Mayr A. and Münz E .: “ Die Pocken ", 2nd ed., Georg Thieme Verlag, Stuttgart, 1967).
  • sequences of the terminally located inverted repeats "(TIR) are approximately 11 kB of the genome section (McFadden, G and Graham, K .: “Modulation of cytokine networks by poxvirus", Virology, Ed. 5: 421-429, 1994).
  • Interferon ⁇ and ⁇ IFN ⁇ , IFN ⁇
  • TNF tumor necrosis factor
  • IL- 1 1, 2, 6 and 12 has come.
  • these cytokines are parasitic defense factors of the non-specific immune system.
  • the cytokines are neutralized by binding to the corresponding virus receptors, so that the virus can multiply uninhibitedly.
  • the deletions of gene segments that code for the cytokine receptors mentioned above mainly affect the terminal regions of the DNA.
  • Attenuated myxoma virus activities The immunizing epitopes and the paraspecific or non-specific epitopes are competing. A decrease in the first-mentioned peptides or proteins therefore leads to an increase in the effect of the paraspecific activities. Residues of immunizing and virulence-increasing proteins are eliminated in the preparation of monoparamity inducers by the method described above for inactivating the attenuated myxoma viruses.
  • the monoparamunity inducer according to the invention is based on the use of attenuated myxoma viruses or their paramunizing components and, due to its paramunizing properties, is suitable for the following prophylactic or therapeutic indications in a patient:
  • paramunity inducers according to the invention can be administered to mammals, including humans, birds and reptiles, parenterally or locally.
  • the local administration of paramunity inducers specifically stimulates the parasitic defense mechanisms in the mucous membranes and in the skin.
  • Parenterally applied paramunizations on the other hand, hardly influence the local defense mechanisms in the skin and mucous membrane, whereby they have a systemic effect.
  • One embodiment of the invention relates to the production of a pharmaceutical composition for local application for the induction of paramunity in the skin and mucous membranes.
  • the pharmaceutical composition preferably relates to a buccal or lozenge tablet based on components of an attenuated and inactivated Myxoma cell culture virus.
  • the Buccal tablets according to the invention are preferably produced with the addition of sorbitol, polyethylene glycol 6.00, potassium hydrogen phosphate, tyrospirol tablet essence, Kollidon 25 and magnesium stearate.
  • PIND-MYXO can also be administered nasally, rectally or vaginally with suitable carriers.
  • the myxomavirus from the edematous subcutis of a European wild rabbit (genus Oryctolagus), which typically has myxomatosis was isolated by incubation on the chorioallantoic membrane (CAM) for 10 days of incubated and broiled egg eggs three times according to the Herrlich et al. adapted to passages on the CAM (Herrlich A., Mayr A. and Münz E .: "Die Pocken", 2nd edition, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, 1967).
  • the third CAM passage was opened in a 1st stage VERO cells over 120 passages (ATCC CCL-81, WHO, American Type Culture Collection) adapted, in a second stage multiplied by 24 intermediate passages in AVIVER cell cultures and in the third phase cultivated in VERO cells.
  • a total of about 300 Passages were carried out with the aim of attenuation.
  • the originally virulent myxoma virus was attenuated.
  • the attenuated myxoma virus is propagated in Vero cells.
  • a fully synthetic medium consisting of MEM ("minimal essential medium") plus 10% BMS (serum replacement medium) and 10% lactalbumin hydrolyzate is used for the cultivation of the Vero cell cultures.
  • the lyophilized preparation keeps at room temperatures as well as at temperatures from approximately 4 ° C. to -80 ° C. and is preferably stable indefinitely at approximately 4 ° C. or also approximately -60 ° C.
  • a volume of 1 ml of the in sterile aqua dest. dissolved lyophilisate corresponds to a vaccine dose.
  • the application is deep intramuscular or local (see Examples 3, 4 and 5).
  • the PIND-MYXO inducer according to the invention in dry form is applied locally to the mucous membranes of the upper respiratory tract, preferably nasally, three times a day for prophylaxis or therapy (1 ml per application ) of multifactorial infections (e.g. flu infections).
  • the PIND-MYXO inducer produced in Example 1 in liquid form is rubbed in according to the invention cutaneously for better blood circulation to the skin, for faster healing of wounds and for the treatment of varicose veins or chronic venous insufficiency (leg ulcers) in humans.
  • the lyophilisate can be taken up, for example, in fat cream (eg Bepanthen, linola fat), whereby the pH should be slightly alkaline.
  • This preparation should be freshly made for every application. The application is carried out several times a day by manually rubbing the undamaged skin. Open wounds can be treated by dripping the freshly loosened preparation onto the wound areas. Treatment should be done daily until healing.
  • the monoparamunity inducer PIND-MYXO prepared as in Example 1, is administered parenterally one day before and at the same time as a vaccination with classic, specific vaccines in order to avoid side reactions and to improve the vaccination success.
  • the monoparamunity inducer PIND-MYXO produced as in Example 1, is processed into buccal or lozenges.
  • the production and use of the lozenges for the local paramunization of the ear, nose and throat and oral mucosa is new and part of the invention.
  • the activated oral mucous membranes not only cause a "homing" effect (migration of immune cells into mucous membranes of other organ systems), but also partial parenteral paramunization.
  • the following manufacturing process has proven itself for the production of buccal or lozenges:
  • 5% Kollidon 25 polyvinylpyrrolidone
  • Urea, sorbitol, polyethylene glycol 6000 and magnesium stearate are required to produce the finished tablet.
  • a recipe for a tablet weighing 500.5 mg the following is recommended:
  • the patient should take 4-6 tablets per day at regular intervals to achieve optimal paramunization.
  • the tablets slowly dissolve in the patient's mouth and can be swallowed after dissolution.
  • Table 1 Clinical results with a monoparamunity inducer from attenuated Myxoma cell culture virus in humans - prophylactic applications - (lyophilized inducer 1 OP (1 ml) intramuscularly)
  • Table 2 Clinical results with a monoparamunity inducer from attenuated Myxoma cell culture virus in humans - therapeutic use - (lyphilized inducer 1 OP (1 ml) intramuscularly)

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft Monoparamunitätsinducer auf der Basis von paramunisierenden Viren oder Viruskomponenten eines Myxomavirus-Stammes von typisch generalisierend erkrankten Kaninchen, ein Verfahren zur deren Herstellung und deren Verwendung als Arzneimittel zur regulativen Optimierung der paramunisierenden Aktivitäten für die Prophylaxe und Therapie von diversen Dysfunktionen bei Mensch und Tier.

Description

MONOPARAMUNITATSINDUCER BASIEREND AUF ATTENUIERTEN MYXOMAVIREN DES KANINCHENS
Die Erfindung betrifft Monoparamunitätsinducer auf der Basis von paramunisierenden Viren oder Viruskomponenten, dadurch gekennzeichnet, dass die Viren oder Viruskomponenten aus einem attenuierten Myxomavirus-Stamm des Kaninchens stammen, ein Verfahren zur Herstellung der Monoparamunitätsinducer und deren Verwendung als Arzneimittel.
Das körpereigene Immunsystem von hochentwickelten Organismen, insbesondere das der Säuger und Vögel, umfasst einen antigenspezifischen sowie einen antigenunspezifischen Teil. Beide Teile des Immunsystems sind miteinander vernetzt und stehen dabei in gegenseitiger Wechselwirkung. Die antigenspezifischen Mechanismen sind für den Aufbau der Immunität, die antigenunspezifischen für den Aufbau der Paramunität verantwortlich. Paramunität bezeichnet den Zustand eines gut regulierten und optimal funktionierenden unspezifischen Abwehrsystems, verbunden mit einem schnell entstandenen, zeitlich limitierten, erhöhten Schutz gegenüber einer Vielzahl unterschiedlicher Erreger, Antigene und anderer Noxen. Grundlage für die Entstehung von Paramunität sind aus historischen und funktioneilen Gründen die, aus phylogenetischer Sicht alten, sogenannten primitiven, nichtselektiven und bedingt selektiven paraspezifischen Abwehrmechanismen.
Die paraspezifischen Aktivitäten des antigenunspezifischen Immunsystems (engl.: „innate immune System") umfassen nichtselektive Schutzelemente, wie zum Beispiel fremdmaterialfressende Organellen, sowie bedingt selektive Schutzelemente, wie zum Beispiel Mikro- und Makrophagen, natürliche Killerzellen, dendritische Zellen und lösliche Faktoren wie Zytokine, die entsprechend ihrer Genese erregerunspezifisch bzw. antigenunspezifisch reagieren.
Paraspezifische Aktivitäten sind im betreffenden Organismus unmittelbar nach Antigenkontakt zu verzeichnen, während die Wirkungen des antigenspezifischen Immunsystems erst nach Tagen oder Wochen eintreten.
Bei den höher organisierten Lebewesen wird hierdurch zusätzlich Zeit gewonnen, um spezifische Abwehrsysteme gegenüber den Noxen aufzubauen, die noch nicht eliminiert werden konnten und antigene Eigenschaften besitzen. Der Nutzen der Paramunisierung, d.h. der paraspezifischen Aktivitäten des Immunsystems für die Prophylaxe und Therapie bei einem Patienten hat sich seit deren Entwicklung in immer deutlicher Weise gezeigt (Änton Mayr, „Paramunisierung: Empirie oder Wissenschaft", Biol. Med., Aufl. 26(6): 256-261 , 1997). Die paraspezifische Abwehr ermöglicht es dem Organismus, sich bei Konfrontation mit den unterschiedlichsten Fremdstoffen, Infektionserregern, Toxinen und transformierten körpereigenen Zellen sofort zur Wehr zu setzen.
Zwischen den paraspezifischen und den spezifischen Aktivitäten des Immunsystems bestehen enge Wechselwirkungen, wobei der Informationsfluss in der Regel vom zuerst reagierenden, paraspezifischen zum später einsetzenden, spezifischen Teil des Immunsystems verläuft (z.B. bei der Antigenvermittlung). Die paraspezifische Abwehr des Organismus kann auf diese Weise bei Infektionen mit besonders virulenten Pathogenen die Zeit bis zur Ausbildung der spezifischen Immunität (z.B. Antikörper, Immunzellen) überbrücken.
Die paraspezifische Immunabwehr ist ein physiologischer Vorgang und lässt sich als „primäre Kontrolle" bei der Auseinandersetzung mit der Umwelt definieren. Sie ist nicht nur für die niederen Organismen, sondern insbesondere auch für die höher- und hochentwickelten Wirbeltiere unersetzlich. Primäre kongenitale Defekte in diesem biologischen Abwehrsystem führen zu lebensbedrohenden Situationen. Als Beispiel ist das „Chediak-Steinbrinck-Higashi-Syndrom" des Menschen zu nennen, das durch Granulozytendefekte und Dysfunktionen der natürlichen Killerzellen (NK-Zellen) charakterisiert ist und in den meisten Fällen bis zur Vollendung des 10. Lebensjahrs zum Tode des Patienten führt.
Der Zustand der Paramunität ist durch eine erhöhte Phagozytoserate, eine erhöhte Funktion der spontanen zellvermittelten Zytotoxizität (NK-Zellen) und eine erhöhte Aktivität sonstiger lymphoretikulärer Zellen gekennzeichnet. Gleichzeitig kommt es zur Freisetzung bestimmter Zytokine, die sowohl mit den zellulären Elementen als auch untereinander stimulierend und/oder hemmend (z.B. über Repressormechanismen) wirken. Dieses eng vernetzte und stufenweise reagierende biologische System der Paramunität mit seinen unterschiedlichen Akzeptor-, Effektor- und Zielzellen sowie den signalübertragenden Zytokinen ist daneben intensiv mit dem Hormon- und Nervensystem verbunden. Es stellt dadurch einen wichtigen Bestandteil des Kommunikations-, Interaktions- und Regulationsnetzwerkes dar. Die Einleitung der Paramunität erfolgt durch Paramunisierung. Darunter versteht man die medikamentöse Aktivierung der zellulären Elemente des paraspezifischen Teils des Immunsystems und der damit verbundenen Bildung von Zytokinen, mit dem Ziel, Dysfunktionen zu beseitigen, den nichterreger- und nicht antigenspezifischen Schutz eines Individuums schnell zu erhöhen (optimale Bioregulation), eine durch Stressfolgen oder anderweitig (z.B. medikamentös) entstandene Immunsuppression oder Immunschwäche zu beseitigen, Defizite zu reparieren und/oder regulatorisch zwischen Immun-, Hormon- und Nervensystem zu wirken. Dies bedeutet, dass je nach Art der Paramunisierung und der Reaktionslage, wie zum Beispiel der Gesundheitslage des Patienten, bestimmte unspezifische, körpereigene Abwehrvorgänge gesteigert, ergänzt oder auch gedämpft werden können.
Für die Paramunisierung verwendet man Paramunitätsinducer, an die bestimmte Unschädlichkeits- und Wirksamkeitskriterien gestellt werden, wodurch sie sich von Immunstimulanzien unterscheiden. Der Paramunitätsinducer per se ist weder mit einem Abwehrstoff, noch mit einer Chemikalie, einem Antibiotikum, Vitamin oder Hormon vergleichbar. Vielmehr aktiviert er über einen stufenweisen Mechanismus das paraspezifische Immunsystem, so dass dieses ausreichend zelluläre und humorale Abwehrmechanismen mobilisiert. Der Paramunitätsinducer wirkt hierbei sowohl regulierend als auch reparierend hinsichtlich der Immunabwehr. Bezüglich der Wirkungsweise von Paramunitätsinducer ist bekannt, dass sie von phagozytierenden Zellen (Akzeptorzellen) aufgenommen werden, die dadurch aktiviert werden und Mediatoren entlassen, welche wiederum Effektorzellen mobilisieren. Diese schalten schließlich die Regulationsmechanismen der paraspezifischen Abwehr ein.
Multiple Paramunitätsinducer auf der Basis von Kombinationen zweier oder mehrerer Pockenviruskomponenten, die sich aus unterschiedlichen Pockenvirus-Stämmen mit paramunisierenden Eigenschaften ableiten, sind in der europäischen Patentschrift EP 0 669 133 B1 beschrieben.
Die vorliegende Erfindung basiert auf den paramunisierenden Eigenschaften von attenuierten Myxomaviren und/oder ihren Virusbestandteilen.
Eine Attenuierung bezeichnet die Umwandlung der Eigenschaften eines Infektionserregers, die zur Abschwächung des Erregers führen (engl. „attenuate" = abschwächen, mildern). Veränderungen von Infektionserregern treten in der Natur spontan häufig auf, wobei die Zeitspannen über viele Jahrhunderte reichen können. Experimentell kann man die Wandlungsfähigkeit von Infektionserregern, sich an Umweltveränderungen anzupassen, nutzen und die zur Attenuierung benötigte Zeitspanne, z.B. durch Dauerpassagen in bestimmten Wirtssystemen, drastisch verkürzen. Bisher nutzte man die Attenuierung zur Gewinnung von avirulenten Impfstämmen sowie von unschädlichen Paramunitätsinducern.
In der Regel führt eine Attenuierung zum Verlust der Virulenz und Kontagiosität, der Verminderung der immunisierenden Eigenschaften und des Wirtsspektrums sowie zu geringen Veränderungen im Erregergenom mit Auftreten von Deletionen, bevorzugt in den terminalen Bereichen. Parallel kommt es in der Regel zu einer Zunahme der paramunisierenden Aktivitäten des modifizierten Erregers.
In seltenen Fällen kann eine Attenuierung, vor allem beim Versuch einer experimentellen Attenuierung durch gentechnische Manipulationen, auch zu einer Erhöhung der Virulenz und Kontagiosität führen.
Myxomaviren sind die Erreger der Myxomatose, eine zyklisch verlaufende, kontagiöse Virusallgemeinkrankheit der Wild- und Hauskaninchen, die durch generalisierte, teilweise hämorrhagische Unterhautödeme am Kopf und über den ganzen Körper, mit Bevorzugung der Analgegend, der Vulva und des Schlauches, wie keine andere Infektionskrankheit charakterisiert ist. Wird die Myxomatose in ein bisher seuchenfreies Land neu eingeschleppt, verläuft sie rasch und tödlich. Nach Sesshaftwerden des Virus verändert sich der Seuchencharakter bis hin zu klinisch inapparenten Infektionen (Mayr A.: Medizinische Mikrobiologie, Infektions- und Seuchenlehre, 7. Aufl., Enke-Verlag, Stuttgart, 2002).
Die Krankheit ist unter amerikanischen Baumwollschwanzkaninchen der Gattung Sylvilagus, die ausschließlich die neue Welt besiedeln, weit verbreitet. Diese Wildkaninchen bilden das einzige natürliche Reservoir der Seuche. Die Infektion verläuft bei ihnen in einer milden Form. Dagegen besitzt die Erkrankung bei europäischen Wild- und Hauskaninchen der Gattung Oryctolagus, die auch in Australien heimisch sind, eine fast 100%ige Sterblichkeit bei Neueinschleppung des Erregers.
Das natürliche Wirtsspektrum des Myxomavirus (Genus Leporipoxvirus) ist eng begrenzt. Im Allgemeinen vermehrt sich das Virus nur in amerikaηischen Baumwollschwanzkaninchen und in europäischen Haus- und Wildkaninchen. Vereinzelt wurden allerdings auch Infektionen in europäischen Wildhasen beobachtet. Übertragungsversuche auf andere Tierarten und auf den Menschen verliefen negativ.
Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, neue Monoparamunitätsinducer für die Humanmedizin und Veterinärmedizin bereitzustellen. Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Verfahren zur Herstellung solcher Monoparamunitätsinducer bereitzustellen. Ferner ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, pharmazeutische Zusammensetzungen zur Verwendung als Arzneimittel auf der Basis von Monoparamunitätsinducem bereitzustellen.
Entsprechend betrifft die vorliegende Erfindung Monoparamunitätsinducer auf der Basis von paramunisierenden Viren oder Viruskomponenten, dadurch gekennzeichnet, dass die Viren oder Viruskomponenten von einem attenuierten Myxomavirus-Stamm des Kaninchens stammen. Vorzugsweise umfassen die Viruskomponenten paramunisierende Virushüllen oder aberrante Formen von Virushüllen eines attenuierten Myxomavirus-Stammes. Bevorzugte Stämme, welche die erfindungsgemäßen paramunisierenden Eigenschaften aufweisen, sind die Stämme M-2, M-7, Lausanne, Aust/Uriarra/Verg-86/ . Die Stämme M-7, Lausanne, Aust/Uriarra/Verg-86/1 sind auch für die Herstellung von Lebend-Vaccinen geeignet, da sie nur partiell in ihrer Virulenz abgeschwächt sind, um ausreichend immunisierend zu wirken.
Besonders bevorzugt ist ein Monoparamunitätsinducer der auf dem Myxomavirus-Stamm M- 2 basiert. Ein attenuierter Myxomavirus-Stamm, hergestellt nach dem unten beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren ist bei der Hinterlegungsstelle der Public Health Laboratory Service (PHLS), Centre for Applied Microbiology & Research, European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC), Salisbury, Wiltshire, United Kingdom mit der Hinterlegungsnummer 03121801 hinterlegt worden.
Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung von Monoparamunitätsinducem basierend auf einem attenuierten Myxomavirus-Stamm des Kaninchens. Dafür werden zunächst Myxomaviren aus infiziertem Gewebe eines typisch an einer generalisierten Myxomatose erkrankten Kaninchens isoliert. Anschließend erfolgt eine Adaptierung des Virus an ein permissives Zellsystem, d.h. an ein Zellmaterial, das die Vermehrung des Virus erlaubt, wie beispielsweise Zellkulturen, bebrütete Hühnereier oder auch Versuchstiere. Insbesondere können Zellen des natürlichen Wirts oder einer mit dem Wirt nahe verwandten Spezies für die Adaptierung verwendet werden. Als permissive Zellsysteme für Myxomaviren eignen sich beispielsweise Hühnerembryofibroblasten (FHE) wie auch aus Kaninchennieren oder-hoden hergestellte Zellkulturen.
Als erfindungsgemäß bevorzugt ist die Adaptierung des isolierten Myxomavirus auf die Chorioallantoismembran (CAM) bebrüteter Hühnereier über eine oder mehrere Passagen, bevorzugt über 2 bis 6 Passagen und besonders bevorzugt über 3 Passagen. Dafür werden zur Adaptierung die isolierten Viren auf die CAM geimpft und über Passagierung auf der CAM vermehrt.
Vorzugsweise werden die Myxomaviren aus infiziertem Gewebe durch Vermehrung in einem permissiven Zellsystem zunächst isoliert. Dafür kann ein permissives Zellsystem beispielsweise mit infiziertem, durch Aufschluß gewonnenem Gewebehomogenat beimpft werden. Anschließend werden die durch erste Vermehrung gewonnenen Viren entweder weiter an denselben, permissiven Zellsystemtypen, der auch bereits für die Isolierung verwendet wurde, adaptiert, oder es wird ein anderes, weiteres permissives Zellsystem verwendet. Bevorzugt ist die Adaptierung des Virus an denselben permissiven Zellsystemtypen, der auch für die Isolierung verwendet wird. Somit werden vorzugsweise Myxomaviren aus infiziertem Gewebe durch Vermehrung in einem permissiven Zellsystem isoliert und anschließend an das permissive Zellsystem durch weitere Passagen adaptiert. Besonders bevorzugt ist eine erste Anzucht bzw. Isolierung der Myxomaviren durch Vermehrung auf der CAM bebrüteter Hühnereier und nachfolgender Adaptierung des Virus auf der CAM über weitere Passagen, vorzugsweise über weitere 2 Passagen. Alternativ kann für die Anzucht und/oder Adaptierung aber auch die Allantoisflüssigkeit bebrüteter Hühnereier verwendet werden.
Die eigentliche Attenuierung erfolgt dann durch Dauerpassagen auf einer oder mehreren permissiven Zellkulturen, bis eine Attenuierung bzw. der gewünschte Attenunierunggrad des Virus erreicht ist. Dafür können zur Vermehrung des Virus zunächst verschiedene permissive Zellsysteme ausprobiert werden und anschließend ein oder mehrere Zellsysteme, in denen die höchsten Infektiös itätstiter erzielt werden, für weitere Passagierungen ausgewählt werden. Für eine Attenuierung durch Dauerpassagen eignen sich sowohl primäre als auch sekundäre Zellkulturen wie auch permanente bzw. kontinuierliche Zelllinien. So kann eine Attenuierung durch Vermehrung in primären oder sekundären Hühnerembryofibroblasten- (FHE-) Kulturen oder in Kulturen permanenter FHE-Zellen erfolgen.
Erfindungsgemäß bevorzugt wird für die Attenuierung des Myxomavirus das Virus in einer permanenten Zellkultur, insbesondere einer Vero-Zellkultur, passagiert bzw. vermehrt, bevorzugt über 80 bis 150 Passagen und besonders bevorzugt über 120 Passagen. Alternativ oder zusätzlich wird das Virus erfindungsgemäß auf einer binären, permanenten Zelllinie passagiert, wobei bevorzugt AVIVER-Zellen verwendet werden. Diese Zellen bzw. Zellkultur wurde durch eine Zellfusion zwischen Hühnerembryfibroblasten (FHE) und Vero- Affennierenzellen erhalten. Für die erfindungsgemäße Attenuierung des Myxomavirus werden vorzugsweise die isolierten und adaptierten Viren in einem ersten Schritt in Vero- Zellkulturen passagiert, die Viren anschließend in eine binäre AVIVER-Zellkultur überführt und in diesen vorzugsweise über 10 bis 50 Passagen, insbesondere über 20 bis 30 Passagen, und besonders bevorzugt über 25 Passagen vermehrt.
Anschließend kann das attenuierte Myxomavirus noch zusätzlich über weitere Attenuierungspassagen vermehrt werden. Eine Weitervermehrung der Viren erfolgt vorzugsweise über weitere Passagierung in Vero-Affennierenzellen, insbesondere über 100 bis 200 Passagen.
Ein besonders bevorzugter, weiterer Verfahrensschritt ist eine zusätzliche Inaktivierung des attenuierten Myxomavirus. Eine Inaktivierung kann durch chemische Behandlung, Bestrahlung, Hitze- oder pH-Einwirkung erfolgen, insbesondere durch eine chemische Behandlung mit Beta-Propiolacton. Durch die Behandlung der attenuierten Myxomaviren mit Beta-Propiolacton werden die paraspezifischen Aktivitäten noch gesteigert, während die nach der Attenuierung ggf. noch vorhandenen immunisierenden Eigenschaften verloren gehen.
Eine besonders bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens umfasst die folgenden Schritte: Isolieren von Myxomaviren aus infiziertem Gewebe eines typisch an einer generalisierten Myxomatose erkrankten Kaninchens durch Vermehrung auf der Chorioallantoismembran (CAM) bebrüteter Hühnereier und nachfolgender Adaptierung des Virus an die CAM über weitere 2 Passagen; - Attenuieren der isolierten Viren durch Passagierung in Vero-Zellkulturen, vorzugsweise über 120 Passagen; Überführung der Viren in eine binäre AVIVER-Zellkultur, wobei die AVIVER- Zellen durch eine Zellfusion zwischen Hühnerembryofibroblasten (FHE)- und Vero- Affennierenzellen erhalten wurden, und Attenuierung des Virus in dieser Zellkultur über 10 bis 50, vorzugsweise 25, Passagen, nachfolgende Rückübertragung des Virus auf Vero-Affennierenzellen und Vermehren der Viren durch weitere Attenuierungspassagen in den Vero-Zellen, vorzugsweise über etwa 150 Passagen;
und wahlweise
Inaktivieren der attenuierten Myxomaviren durch Behandlung mit Beta- Propiolacton, wobei durch diese Behandlung die paraspezifischen Aktivitäten gesteigert werden, während die nach der Attenuierung noch vorhandenen immunisierenden Eigenschaften verloren gehen.
Die Attenuierung durch Dauerpassage wird in der Regel durch 3 bis 5 Plaque- Endverdünnungen abgeschlossen. Nach Gewinnung und Austestung verschiedener Klone werden diejenigen Klone zur Weitervermehrung ausgewählt, mit denen die höchsten Infektiositätstiter erzielt und mit denen eine hohe paramunisierende Wirksamkeit - z.B. im VSV challenge Test in der Babymaus - nachgewiesen werden. Diese Vorgehensweise soll insbesondere für die Bereitstellung von genetisch einheitlichem Virusmaterial für die weitere Verwendung sorgen.
Der Ausdruck „Attenuierung", wie er im Zusammenhang mit dieser Erfindung verwendet wird, bezeichnet die experimentelle Veränderung des ursprünglich virulenten Myxomavirus in die modifizierte Form, bei gleichzeitiger Steigerung der paramunisierenden Eigenschaften. Nachweisbar ist die Attenuierung durch eine oder mehrere der folgenden Eigenschaften: Verminderung bzw. Abschwächung oder Verlust der Virulenz für europäische Haus- und Wildkaninchen (Gattung Oryctolagus caniculus csp.), Abschwächung oder Verlust der Kontagiosität, Einengung des Wirtsspektrums in Zellkulturen, Änderung der immunisierenden Eigenschaften Erwerb paramunisierender, kurzzeitig protektiver Aktivitäten. Eine Attenuierung kann zu Deletionen im terminalen Bereich des Myxomavirusgenoms führen. Häufig wird mit zunehmendem Attenuierungsgrad eine zunehmende Anzahl von Deletionen im viralen Genom beobachtet.
Der Attenuierungsgrad kann im Laufe der Passagierungen durch entsprechende, geeignete Wirksamkeitstests, wie sie im Stand der Technik bekannt sind (vgl. z.B. US 6,805,870, Spalte 12, sowie die weiteren, dort zitierten Literaturhinweise) und durch Klonierung überprüft und kontrolliert werden. Die vorliegende Erfindung betrifft ferner attenuierte Myxomaviren, die durch das erfindungsgemäße Verfahren erhältlich sind, pharmazeutische Zusammensetzungen, die das attenuierte Myxomavirus bzw. den erfindungsgemäßen Myxomavirus- Monoparamunitätsinducer umfassen, sowie die Verwendung der Myxomavirus- Monoparamunitätsinducer zur Aktivierung des paraspezifischen Immunsystems in einem Säugetier bzw. die Verwendung des attenuierten Virus zur Herstellung eines entsprechenden Arzneimittels.
Aufgrund der überraschenden paramunisierenden Eigenschaften eignen sich die erfindungsgemäßen Myxomavirus-Monoparamunitätsinducer zur Behandlung und/oder zur Prophylaxe von Immunsystem-Dysfunktionen, Immunsuppression, Immunschwäche- Erkrankungen, Dysfunktionen der Homöostase zwischen Hormon-, Kreislauf-, Stoffwechsel- und Nervensystem, neonataler Infektionsbedrohung, Tumorerkrankungen, Viruserkrankungen, bakteriellen Erkrankungen, therapieresistenten infektiösen Faktorenkrankheiten, viralen und bakteriellen Mischinfektionen, chronischen Manifestationen infektiöser Prozesse, Leberkrankheiten unterschiedlicher Genese, chronischen Hautkrankheiten, Herpeskrankheiten, chronischen Hepatitiden, grippalen Infekten, Endotoxinschäden.
Die erfindungsgemäßen Monoparamunitätsinducer sind generell unschädlich für die Umwelt und wirksam im Sinne einer Paramunisierung für Säugetiere, wie z.B. Mensch, Pferd, Hund, Katze, Schwein, für Vögel sowie auch für Reptilien, wie z.B. Echsen, Schlangen, Schildkröten. Sie sind daher für die Anwendung in der Human- und Veterinärmedizin besonders gut geeignet.
Darüberhinaus weisen die erfindungsgemäßen Monoparamunitätsinducer eine sehr gute paramunisierende Wirksamkeit mit hoher Potenz auf. Sie sind mit dem erfindungsgemäßen Verfahren in geeigneter Weise herstellbar und sicher für die Anwendung im medizinischen Bereich. Durch die Attenuierung der Myxomaviren nehmen die immunisierenden Eigenschaften der Myxomaviren ab, während die paraspezifischen Aktivitäten zunehmen. Die erfindungsgemäßen Monoparamunitätsinducer haben daher keine immunisierenden sondern paramunisierenden Eigenschaften, was eine mehrmalige und kontinuierliche Anwendung ermöglicht. Diese paramunisierenden Eigenschaften des Myxomavirus des Kaninchens bzw. seiner paramunisierenden Viruskomponenten sind überraschend und waren nicht vorhersehbar. Der Ausdruck „Paramunisierung" wie er im Zusammenhang mit dieser Erfindung verwendet wird, bezeichnet die medikamentöse Aktivierung der zellulären Elemente des paraspezifischen Immunsystems und die damit verbundene Bildung bzw. Freisetzung von Zytokinen mit dem Ziel, Dysfunktionen zu beheben, den nichterreger- und nichtantigenspezifischen Schutz eines Individuums schnell zu erhöhen und regulatorisch zwischen Immun-, Hormon-, Nerven- und Gefäßsystem zu wirken. Eine Paramunisierung führt zum Schutzzustand der Paramunität.
Der Ausdruck „Paramunität' wie er im Zusammenhang mit dieser Erfindung verwendet wird, bezeichnet den aktiv erworbenen Zustand eines optimal regulierten und funktionierenden paraspezifischen Abwehrsystems, verbunden mit einem schnell entstandenen, zeitlich limitierten Schutz gegenüber einer Vielzahl von Erregern, Antigenen und anderen Noxen. Die Phagozytoserate, die Funktion der NK-Zellen (natürliche Killerzellen) und die Aktivität sonstiger lymphoretikulärer Zellen (z.B. dendritischer Zellen) sind bis zum physiologischen Optimum erhöht.
Der Ausdruck „Paramunitätsinducer" wie er im Zusammenhang mit dieser Erfindung verwendet wird, bezeichnet ein pyrogenfreies, nicht toxisches Arzneimittel, das dazu bestimmt ist, bei Mensch und Tier zur Erzeugung und Regulierung körpereigener Abwehr- und Schutzmechanismen im Sinne einer Paramunisierung angewendet zu werden.
Der Ausdruck „Myxomavirus-Monoparamunitätsinducer" wie er im Zusammenhang mit dieser Erfindung verwendet wird, bezeichnet ein Arzneimittel das auf attenuierte Myxomaviren des Kaninchens bzw. einem attenuierten Myxomavirus-Stamm basiert, einschließlich der paramunisierenden Viruskompontenten und der Bestandteile davon, die in einem Organismus, bevorzugt in einem Säugetier (z.B. Mensch), den Zustand der Paramunität erzeugen.
Der Ausdruck „Myxomavirus" wie er im Zusammenhang mit dieser Erfindung verwendet wird, bezeichnet die Spezies des Myxomatosevirus des Genus Leponpoxvirus, Das Myxomavirus gehört zur Unterfamilie der Chordopoxviridae und zur Familie der Poxvi dae (Pockenviren).
Unter dem Begriff „paramunisierende Viruskomponenten" wie er im Zusammenhang mit dieser Erfindung verwendet wird, werden eine Vielzahl von viralen Strukturen, die von einem Myxomavirus mit paramunisierenden Eigenschaften abgeleitet sind umfasst, beispielsweise vermehrungsfähige oder inaktivierte frisch isolierte Myxomaviren, vermehrungsfähige oder inaktivierte rekombinante Myxomaviren, die sich von frisch isolierten Myxomaviren ableiten, Virushüllen, die abgetrennten Hüllen sowie Spaltprodukte und aberrante Formen dieser Hüllen, einzelne native oder rekombinante Polypeptide oder Proteine, insbesondere Membran- und Oberflächenrezeptoren, die in frisch isolierten Myxomaviren vorkommen oder von einem genetisch modifizierten Myxomavirus oder einem Teil seiner genetischen Information rekombinant exprimiert werden.
In den Tabellen 1 bis 4 sind die klinischen Ergebnisse mit dem Myxomavirus- Monoparamunitätsinducer PIND-MYXO basierend auf dem attenuierten Myxomatose- Zellkulturvirus, Stamm M-2, beim Menschen zusammengestellt.
Tabelle 1 zeigt die klinischen Ergebnisse bei der prophylaktischen Anwendung des Myxomavirus-Monoparamunitätsinducer PIND-MYXO beim Menschen.
Tabelle 2 zeigt die klinischen Ergebnisse bei der therapeutischen Anwendung des Myxomavirus-Monoparamunitätsinducer PIND-MYXO beim Menschen.
Tabelle 3 zeigt die Wirkung einer Paramunisierung mit Myxomavirus- Monoparamunitätsinducer (PIND-MYXO) bei Patienten mit niedrigen Immunparametern (7 Tage nach PIND-MYXO-Applikation)
Tabelle 4 zeigt die Wirkung einer Paramunisierung mit Myxomavirus- Monoparamunitätsinducer (PIND-MYXO) bei Patienten mit erhöhten Immunparametern (7 Tage nach PIND-MYXO-Applikation)
Die Erfindung basiert auf den überraschenden Befund, dass attenuierte Myxomaviren des Kaninchens oder deren paramunisierenden Bestandteile in der Lage sind, sehr gute paramunisierende Eigenschaften in einem Empfängerorganismus hervorzurufen, die zum Schutzzustand der Paramunität führen. Grundlage für diese Erfindung war die erstmals gelungene Attenuierung von Myxomaviren des Kaninchens in Zellkulturen.
Vorzugsweise basieren die erfindungsgemäßen Monoparamunitätsinducer auf lyophilisierten, attenuierten und inaktivierten Myxomaviren des Kaninchens oder deren paramunisierenden Viruskomponenten. Vorzugsweise stammen die erfindungsgemäßen attenuierten Myxomaviren oder deren Viruskomponenten von einem Myxomavirus-Stamm oder mehreren unterschiedlichen attenuierten Myxomavirus-Stämmen. Es ist dabei bevorzugt, dass die erfindungsgemäßen Monoparamunitätsinducer Kombinationen von einem oder mehreren Myxomavirusstämmen oder deren paramunisierenden Viruskomponenten umfassen.
Die paramunisierenden Eigenschaften, welche durch die Applikation von Myxomavirus- Monoparamunitätsinducer in einem Säugetier, wie zum Beispiel beim Menschen, hervorgerufen werden, sind besonders nützlich zur Beseitigung von Dysfunktionen, zur Erhöhung des nichtantigenspezifischen Schutzes eines Individuums, zur Beseitigung einer durch Stressfolgen oder anderweitig (z.B. medikamentös) entstandenen Immunsuppression oder Immunschwäche und um regulatorisch zwischen dem Immun-, Hormon- und Gefäßsystem zu wirken.
Die Erfindung basiert ferner auf einer gelungenen Attenuierung eines Myxomavirus- Stammes durch Passagierung über Zellkulturen, wobei die virulenten und/oder immunisierenden Eigenschaften des Myxomavirus-Stammes vermindert werden bzw. verloren gehen. Eine zusätzliche Inaktivierung der Myxomaviren kann desweiteren durch Bestrahlung, Hitze- oder pH-Einwirkung erfolgen oder, besonders bevorzugt, durch eine chemische Behandlung mit Beta-Propiolacton. Die Monoparamunitätsinducer basieren auf attenuierten, lyophilisierten Myxomaviren, wobei auch einzelne Viruskomponenten eines Myxomavirus, die geeignet sind, paramunisierende Aktivitäten in einem Organismus hervorzurufen, von der Erfindung umfasst sind.
Im Folgenden soll eine Ausführungsform des erfindungsgemäßen Herstellungsverfahrens der Monoparamunitätsinducer auf der Basis eines isolierten und attenuierten Myxomavirus- Stammes des Kaninchens über Zellkulturpassagierung dargestellt werden. Das Herstellungsverfahren ist hierbei nicht auf diesen bevorzugten Stamm beschränkt, sondern gleichermaßen auf andere Myxomavirus-Stämme des Kaninchens übertragbar. Auch umfasst von der vorliegende Erfindung sind rekombinante Formen eines Myxomavirus- Stammes, die mittels genetischer Modifikation hergestellt worden sind. Bevorzugt sind hierbei rekombinante Myxomavirus-Stämme, bei denen ein oder mehrere Abschnitte im Genom, welche für Zytokin-Rezeptoren kodieren, durch eine Modifikation in Form einer Addition, Substitution oder Deletion modifiziert wurden, wobei durch die Modifikation die Rezeptoreigenschaften des Zytokin-Rezeptors verloren geht. Vorzugsweise sind dies die Genabschnitte, die für die Rezeptoren für Interferone (1FN), Interleukine (IL) und Tumomekrosefaktoren (TFN) kodieren, insbesondere für IFN-α-R, IFNγ-R, TNF-R, IL-1-R, IL- 2-R, IL-6-R und )L-12-R. Weiterhin sollen die hier angegebenen Zahlenwerte bezüglich der Inkubationsdauer oder der Passagierungszahl über Zellkulturen nicht als beschränkend aufgefasst werden. Geringfügige Modifikationen dieser Parameter und Modifikationen, die für den Fachmann ersichtlich sind und auch zur einer Präparation von attenuierten Myxomaviren führen, sind von dieser Erfindung gleichermaßen umfasst.
Eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft die gelungene Attenuierung des Myxomavirus-Stammes M-2. Der Myxomavirus-Stamm M-2 wurde aus europäischen Wildkaninchen, die an Myxomatose erkrankt waren, isoliert (Herrlich A., Mayr A. und Münz E.: „Die Pocken", 2. Aufl., Georg Thieme Verlag, Stuttgart, 1967). Die veränderten Hautzellen, die aus dem Unterhautgewebe des erkrankten Kaninchens gewonnen worden sind, werden nach Aufschluss auf die Chorioallantoismembran (CAM) von vorzugsweise 10-12 Tage lang bebrüteter Hühnereier geimpft. Die Myxomaviren werden über 2 bis 6 Passagen, vorzugsweise über drei Passagen, auf der Chorioallantoismembran weiter vermehrt bzw. adaptiert (CAM-Passagen; Verfahren siehe Herrlich A., Mayr A. und Münz E.: „Die Pocken", 2. Aufl., Georg Thieme Verlag, Stuttgart, 1967). Die 2. bis 6. Passage, vorzugsweise die dritte CAM-Passage, dient als Ausgangsmaterial für die weitere Attenuierung des Myxomavirus in Zellkulturen. Die Attenuierung erfolgt nach Adaptierung der Viren in der Chorioallantoismembran (erkennbar durch typische Herde auf der Chorioallantoismembran) in 3 Stufen. In Stufe 1 werden 80 bis 150, vorzugsweise 120 kontinuierliche sogenannte Endverdünnungs-Passagen in Vero-Zellen durchlaufen (Nero- Zellen, ATCC CCL-81). Nach Durchlaufen dieser Passagen ist das Myxomavirus in seiner Virulenz abgeschwächt.
In einer 2. Stufe wird nach der 80. bis 150. Passage, vorzugsweise nach der 120. Passage in Vero-Zellen, die Virussuspension auf sogenannte AVIVER-Zellen übertragen und über 10 bis 50 Passagen, vorzugsweise über 20 bis 30, insbesondere über 25 Passagen, weitergeführt. AVIVER-Zellen werden durch Zellfusion zwischen Hühnerembryofibroblasten (FHE)- und Vero-Zellen gewonnen und werden als binäre permanente Zellkultur bezeichnet.
Die letzte Passage über AVIVER-Zellen, vorzugsweise die 25. Passage, wird auf Vero-Zellen zurückübertragen und wird in der 3. Stufe der Attenuierung für weitere 100 bis 200 Passagen, vorzugsweise etwa 157 Passagen, in Vero-Zellen weitergeführt. Auf diese Weise wird das Myxomavirus über insgesamt mehr als 300 Zellkulturpassagen vermehrt. Nach der 3. Stufe der Vermehrung des Myxomavirus in Zellkulturen ist das Myxomavirus ausreichend attenuiert. Für die Anzucht der VERO-Zellkulturen und der AVIVER-Zellen wird vorzugsweise ein vollsynthetisches Medium verwendet, besonders bevorzugt ist das Medium MEM („minimal essential mediurm") plus 5 bis 20%, vorzugsweise 10% BMS (Serumersatzmedium) und 5 bis 20, vorzugsweise 10% Lactalbuminhydrolysat. Als Virusmedium wird nach dem Austausch mit dem Anzuchtmedium, vorzugsweise MEM-Medium, mit 5 bis 20%, vorzugsweise mit 10% Lactalalbuminhydrolysat, ohne BMS bzw. ohne fetalem Kälberserum und ohne Antibiotika verwendet. Sämtliche Herstellungsverfahren werden vorzugsweise bei pH-Werten von 7.0 bis 8.0, vorzugsweise bei einem pH-Wert von 7,25 durchgeführt. Virusernten mit Titer von 1050 bis 107'5, vorzugsweise von mindestens 106'5 TCID50/ml (TCID50 = 50% tissue culture infectious dose), sind bevorzugt als Ausgangsmaterial für die Herstellung des erfindungsgemäßen Monoparamunitätsinducers PIND-MYXO geeignet.
Die Vermehrung des Myxomavirus führt in VERO-Zellen zu einem typischen cytopathischen Effekt (cpE), der schließlich durch eine Zerstörung der infizierten Zellen (Lyse) charakterisiert ist. Bei einer Animpfdosis von ca. 10 MOI („multiplicity of infection") kommt es nach einer kurzen Abkugelungsphase (1-2 Tage) für etwa 3 Tage zu netzartigen Zellstrukturen und nach etwa 5 Tagen zur Lyse der Zellen. Die 301. Passage in VERO-Zellen hatte einen Infektionstiter von etwa 106,5 TCID50/ml.
Für die Inaktivierung des attenuiertem Myxomavirus wird eine chemische Behandlung mit Beta-Propiolacton bei einer Konzentration von 0,01-1% Beta-Propiolacton, vorzugsweise bei einer Konzentration von 0,05% Beta-Propiolacton durchgeführt. Diese Inaktivierung führt zu einem vollständigen Verlust der ggf. noch vorhandenen immunisierenden Eigenschaften, wobei die paraspezifischen Aktivitäten nicht nur erhalten bleiben, sondern sogar signifikant ansteigen.
Zur weiteren Verarbeitung der attenuierten und inaktivierten Myxomaviren zu einem Myxomavirus-Monoparamunitätsinducer (PIND-MYXO) sollte das zur Virusinaktivierung benutzte Virusausgangsmaterial einen Virustiter von etwa 1050 bis 1070, vorzugsweise von mindestens 106 5 TCID50/ml, haben.
Die Reinigung erfolgt vorzugsweise mittels Zentrifugation bei niedriger Umdrehungszahl (z.B. 1000 UpM). Nach der Zentrifugation wird 0,5-10% succinylierte Gelatine (z.B. Polygeline, z.B. Firma Hausmann, St. Gallen/Schweiz), vorzugsweise 5% succinylierte Gelatine zugesetzt. Das resultierende Gemisch kann anschließend in Portionen von 1.5 ml in entsprechenden sterilen Glasfläschchen oder Ampullen lyophilisiert und bei Bedarf mit destilliertem Wasser (Aqua dest.) aufgelöst werden. Ein Volumen von 0,5-2 ml, vorzugsweise von 1 ,0 ml des mit Aqua dest. aufgelösten Lyophilisats entspricht einer Impfdosis für den Menschen bei intramuskulärer Applikation (siehe auch Mayr A. und Mayr. B.: „Von der Empirie zur Wissenschaft", Tierärztl. Umschau, Aufl. 57: 583-587, 2002).
Klinisch kann die Attenuierung durch den Verlust der Virulenz für europäische Haus- und Wildkaninchen (Gattung Orydolagus caniculus csp.), durch einen Verlust der Kontagiosität, durch eine nahezu vollständige Einengung des Wirtsspektrums in Zellkulturen und durch die Änderung der immunisierenden Eigenschaften nachgewiesen werden.
Das lyophilisierte Präparat kann bei Temperaturen von vorzugsweise etwa +4°C oder bei geringeren Temperaturen, vorzugsweise etwa -60°C, zeitlich unbegrenzt stabil gelagert werden.
Durch gentechnologische Untersuchungen der präparierten attenuierten Myxomaviren wurde nachgewiesen, dass es im Myxomavirus-Genom zu multiplen Deletionen gekommen war. Im Falle des Ausgangsstammes M-2 besteht das Myxomavirusgenom aus einer einzelnen linearen Desoxyribonukleinsäure (DNA) mit einer Länge von insgesamt etwa 160 Kilobasen (kB), die für mehrere hundert Proteine kodiert (Herrlich A., Mayr A. und Münz E.: „Die Pocken", 2. Aufl., Georg Thieme Verlag, Stuttgart, 1967). Die Sequenzen der terminal gelegenen „Inverted Repeats" (engl.: "terminal inverted repeats", TIR) liegen bei etwa 11 kB des Genomabschnitts (McFadden, G. and Graham, K.: „Modulation of cytokine networks by poxvirus", Virology, Aufl. 5: 421-429, 1994).
So wurde festgestellt, dass es durch die Attenuierung der Myxomaviren über kontinuierliche Vero-Zell-Passagen zu einem Verlust der kodierenden Genabschnitte für die Rezeptoren für
Interferon α und γ (IFN α, IFNγ), für den Tumornekrosefaktor (TNF) und für die Interleukine
(IL-) 1 , 2, 6 und 12 gekommen ist. Interessanterweise zählen diese Zytokine zu den paraspezifischen Abwehrfaktoren des unspezifischen Immunsystems. Durch Bindung an die entsprechenden Virus-Rezeptoren werden die Zytokine neutralisiert, so dass sich das Virus ungehemmt vermehren kann. Die Deletionen von Genabschnitten, die für die oben genannten Zytokin-Rezeptoren kodieren, betreffen hauptsächlich die terminalen Bereiche der DNA. Daneben konnte man aber auch im konservierten Teil der DNA Deletionen nachweisen, die während den AVIVER-Zellpassagen entstanden sind. Diese Deletionen betreffen zwei Gene, die für ein Immunepitop und Virulenzgen kodieren. Vermutlich sind solche genetische Modifikationen mit ein Grund für die Abnahme der immunisierenden, d.h. antigenspezifischen Aktivitäten und die gleichzeitige Zunahme der paraspezifischen
Aktivitäten des attenuierten Myxomavirus. Die immunisierenden Epitope und die paraspezifischen bzw. unspezifischen Epitope sind konkurrierend. Deshalb führt eine Abnahme der erstgenannten Peptide oder Proteine zu einem Anstieg der Wirkung der paraspezifischen Aktivitäten. Reste immunisierender und virulenzsteigernder Proteine werden bei der Präparation von Monoparamunitätsinducem durch das oben beschriebene Verfahren zur Inaktivierung der attenuierten Myxomaviren beseitigt.
Der erfindungsgemäße Monoparamunitätsinducer, auch PIND-MYXO genannt, basiert auf der Verwendung von attenuierten Myxomaviren oder deren paramunisierenden Bestandteilen und ist aufgrund seiner paramunisierenden Eigenschaften für folgende prophylaktische oder therapeutische Indikationen bei einem Patienten geeignet:
- Infektiöse Faktorenkrankheiten und Mischinfektionen, chronische Manifestationen infektiöser Prozesse, hartnäckig rezidivierende Infektionen und chemotherapieresistente, bakterielle und virale Infektionen
- Abwehrschwächen beziehungsweise Dysregulationen im Abwehrsystem eines Organismus
- neonatale Infektionsbedrohung
- adjuvante Therapie bei bestimmten Tumorkrankheiten, z.B. Verhütung der Metastasierung, Minderung von Nebenwirkungen durch Chemo- und Strahlentherapie
- Regulierung der Homöostase zwischen Hormon-, Kreislauf-, Stoffwechsel- und Nervensystem.
Die erfindungsgemäßen Paramunitätsinducer können Säugetieren, einschließlich dem Menschen, Vögeln und Reptilien parenteral oder lokal verabreicht werden. Die lokale Verabreichung von Paramunitätsinducern stimuliert speziell die paraspezifischen Abwehrmechanismen in den Schleimhäuten und in der Haut. Daneben kommt es aber auch zu einer gewissen systemischen Wirkung. Dagegen beeinflussen parenteral angewendete Paramunisierungen die lokalen Abwehrmechanismen in der Haut und der Schleimhaut kaum, wobei sie bevorzugt systemisch wirken.
Nebenwirkungen traten selbst bei zahlreichen, kontinuierlich durchgeführten, parenteralen Applikationen bei Mensch und Tier nicht auf. Für den Einsatz von PIND-MYXO gelten die gleichen Indikationen beim Tier wie beim Menschen. Zugleich empfiehlt 'es sich, in Problembetrieben, speziell bei Haltungen von Pferden, Schweinen, Hunden und Katzen, die Neugeborenen sofort am Tage der Geburt und vorzugsweise am 1. und eventuell auch 2. Tag nach der Geburt zu paramunisieren. Die Einzeldosis beträgt etwa 0,5 bis 5 ml des aufgelösten Lyphilisats, bei Pferd und Schwein beträgt die Einzeldosis vorzugsweise 2 ml und bei Hund und Katze vorzugsweise 0,5 ml bei parenteraler Applikation. Erfindungsgemäß empfiehlt es sich, zur Vermeidung von Nebenreaktionen und zur Unterstützung der Immunisierung bei der Verabreichung von Impfstoffen PIND-MYXO einen Tag vor und/oder gleichzeitig mit spezifischen Schutzimpfungen parenteral zu verabreichen.
Eine Ausführungsform der Erfindung betrifft die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur lokalen Applikation für die Induktion der Paramunität in Haut und Schleimhäuten. Vorzugsweise betrifft die pharmazeutische Zusammensetzung eine Buccal- oder Lutschtablette basierend auf Bestandteilen eines attenuierten und inaktivierten Myxoma-Zellkulturvirus. Die erfindungsgemäßen Buccal-Tabletten werden bevorzugt unter Zusatz von Sorbit, Polyethylenglykol 6,00, Kaliumhydrogenphosphat, Tyrospirol- Tablettenessenz, Kollidon 25 und Magnesiumstearat hergestellt. PIND-MYXO kann aber auch nasal, rektal oder vaginal mit geeigneten Trägern verabreicht werden.
Die nachfolgenden Beispiele sind bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung und dienen der weiteren Erläuterung des Erfindungsgegenstandes.
Beispiel 1
Als Ausgangsmaterial zur Herstellung des erfindungsgemäßen Monoparamunitätsinducers PIND-MYXO wurde aus der ödematösen Subkutis eines in typischer Weise an Myxomatose erkrankten europäischen Wildkaninchens (Gattung Oryctolagus) das Myxomavirus über die Anzüchtung auf der Chorioallantoismembran (CAM) 10 Tage bebrüteter Hühnereier (VALO- Eier) isoliert und dreimal nach dem Verfahren von Herrlich et al. auf der CAM in Passagen adaptiert (Herrlich A., Mayr A. und Münz E.: „Die Pocken", 2. Aufl., Georg Thieme Verlag, Stuttgart, 1967). Die dritte CAM-Passage wurde in einer 1. Stufe auf VERO-Zellen über 120 Passagen (ATCC CCL-81 , WHO, American Type Culture Collection) adaptiert, in einer 2. Stufe durch 24 Zwischenpassagen in AVIVER-Zellkulturen vermehrt und in der 3. Phase in VERO-Zellen weitergezüchtet. Insgesamt sind etwa 300 Passagen mit dem Ziel der Attenuierung durchgeführt worden. Nach diesen kontinuierlichen Endverdünnungspassagen war das ursprünglich virulente Myxomavirus attenuiert. Das attenuierte Myxomavirus wird in Vero-Zellen vermehrt. Für die Anzucht der Vero- Zellkulturen wird ein vollsynthetisches Medium, bestehend aus MEM („minimal essential medium") plus 10% BMS (Serumersatzmedium) und 10% Lactalbuminhydrolysat verwendet. Als Virusmedium wird nach dem Austausch mit dem Anzuchtmedium nur MEM mit 10% Lactalbuminhydrolysat ohne BMS bzw. ohne fetales Kälberserum und ohne Antibiotika verwendet. Sämtliche Herstellungsverfahren werden bei pH-Werten von über 7,25 durchgeführt. Virusernten mit Titer über 1065 TClD50/ml dienen als Ausgangsmaterial für die Herstellung des erfindungsgemäßen Monoparamunitätsinducers PIND-MYXO. Nach Inaktivierung der Virusernten mit 0,05% Beta-Propiolacton und grobtouriger Zentrifugation, wird dem Virusmaterial 5% succinylierte Gelatine (Polygeline) vor der Lyophilisierung zugesetzt.
Das lyophilisierte Präparat hält sich bei Zimmertemperaturen wie auch bei Temperaturen von etwa 4°C bis -80° C und ist vorzugsweise bei etwa 4°C oder auch etwa -60°C zeitlich unbeschränkt haltbar. Ein Volumen von 1 ml des in sterilem Aqua dest. aufgelösten Lyophilisats entspricht einer Impfdosis. Die Applikation erfolgt tief intramuskulär bzw. lokal (siehe Beispiele 3, 4 und 5).
Beispiel 2
In analoger Weise wie in Beispiel 1 beschrieben, wird der erfindungsgemäße PIND-MYXO- Inducer in trockener Form (Lyophilisat nicht aufgelöst) lokal auf die Schleimhäute des oberen Respirationstrakts, bevorzugt nasal, dreimal am Tag zur Prophylaxe bzw. Therapie (je 1 ml pro Applikation) von multifaktoriellen Infektionen (z.B. grippale Infekte) appliziert.
Beispiel 3
In analoger Weise wird der wie in Beispiel 1 hergestellte PIND-MYXO-Inducer in flüssiger Form erfindungsgemäß kutan zur besseren Durchblutung der Haut, zur schnelleren Abheilung von Wunden sowie zur Behandlung von Krampfadern bzw. chronisch-venösen Insuffizienzen (Ulcus cruris) beim Menschen eingerieben. Das Lyophilisat kann zu diesem Zweck zum Beispiel in Fettcreme (z.B. Bepanthen, Linola-Fett) aufgenommen werden, wobei der pH-Wert leicht alkalisch sein sollte. Diese Zubereitung sollte für jede Anwendung frisch hergestellt werden. Die Applikation wird mehrmals am Tage durch manuelles Einreiben der unverletzten Haut vorgenommen. Offene Wunden können durch Aufträufeln des frisch gelösten Präparates auf die Wundbereiche behandelt werden. Die Behandlung sollte täglich bis zur Heilung erfolgen. Beispiel 4
Analog wird der wie in Beispiel 1 hergestellte Monoparamunitätsinducer PIND-MYXO zur Vermeidung von Nebenreaktionen und zur Verbesserung des Impferfolges einen Tag vor und gleichzeitig bei einer Schutzimpfung mit klassischen, spezifischen Vaccinen parenteral verabreicht.
Beispiel 5
Analog wird der wie in Beispiel 1 hergestellte Monoparamunitätsinducer PIND-MYXO zu Buccal- bzw. Lutschtabletten verarbeitet. Die Herstellung und Verwendung der Lutschtabletten für die lokale Paramunisierung der Hals-Nasen-Ohren- und Mundschleimhäute ist neu und Bestandteil der Erfindung. Über die aktivierten Mundschleimhäute kommt es nicht nur zu einem "homing"-Effekt (Auswandern von Abwehrzellen in Schleimhäute anderer Organsysteme), sondern auch zu einer partiellen parenteralen Paramunisierung. Für die Herstellung der Buccal- bzw. Lutschtabletten hat sich folgendes Herstellungsverfahren bewährt:
Dem flüssigen Inducermaterial wird zur Lyophilisierung an Stelle von Gelatine, 5% Kollidon 25 (Polyvinylpyrrolidon) zugesetzt. Zur Herstellung der fertigen Tablette benötigt man Harnstoff, Sorbit, Polyethylenglykol 6000 und Magnesiumstearat. Als Rezeptur für eine Tablette mit einem Gewicht von 500,5 mg Gewicht wird empfohlen:
PIND-MYXO-Lyophilisat 65 mg
Harnstoff 50 mg
Sorbit 267 mg
Polyethylenglykol 6000 118 mg
Magnesiumstearat 0,5 mq
Tablettengewicht 500,5 i mg
Pro Tag sollten zur Erzielung einer optimalen Paramunisierung 4-6 Tabletten von dem Patienten in regelmäßigen Abständen eingenommen werden.
Folgende Rezeptur einer pharmazeutischen Zusammensetzung hat sich für die Herstellung von Buccal-Tabletten bewährt: PIND-MYXO-Lyophilisat 115 mg
Sorbit 360 mg
Polyethylenglykol 6000 300 mg
Kaliumdihydrogenphosphat (KH2P04), wasserfrei 2 mg
Dinatriumhydrogenphosphat (Na2HP0 ), wasserfrei 8 mg
Tyrospirol-Essenz-Tabletten 0,8 mg
Magnesiumstearat 20 mq
Tablettengewicht 805,8 mg
Die Tabletten lösen sich im Mund des Patienten langsam auf und können nach der Auflösung geschluckt werden.
Die in den Tabellen 1 bis 4 zusammengestellten klinischen Versuchsergebnisse mit dem erfindungsgemäßen Monoparamunitätsinducer, basierend auf dem Lyophilisat des Myxomavirus-Stammes M-2, demonstrieren die sehr guten paramunisierenden Aktivitäten von Myxomaviruslyophiüsaten beim Menschen. Diese Daten sind gleichermaßen auf andere Säugetiere wie auch auf Vögel und Reptilien übertragbar.
Tabelle 1 : Klinische Ergebnisse mit einem Monoparamunitätsinducer aus attenuiertem Myxoma- Zellkulturvirus beim Menschen - prophylaktische Anwendungen - (lyphiüsierter Inducer 1 OP (1 ml) intramuskulär)
Tabelle 2: Klinische Ergebnisse mit einem Monoparamunitätsinducer aus attenuiertem Myxoma- Zellkulturvirus beim Menschen - therapeutische Anwendung - (lyphilisierter Inducer 1 OP (1 ml) intramuskulär)
Tabelle 3: Wirkung einer Paramunisierung mit Myxoma-Inducer (PIND-MYXO) bei Patienten mit niedrigen Immunparametern (7 Tage nach PIND-Myxo- Applikation)
Tabelle 4: Wirkung einer Paramunisierung mit Myxo-Inducer (PIND-MYXO) bei Patienten mit erhöhten Immunparametern (7 Tage nach PIND-MYXO-Applikation)
ANGABEN ZU EINEM HINTERLEGTEN MIKROORGANISMUS ODER ANDEREM BIOLOGISCHEN MATERIAL (Regel 13 is PCT) Die nachstehenden Angaben betreffen den hinterlegten Mikroorganismus oder anderes biologisches Material, das in der Beschreibung genannt ist auf Seite 5 , Zeile 2ϊ~Z - B. KENNZEICHNUNG DER HINTERLEGUNG Weitere Hinterlegungen sind auf einem [~ zusätzlichen Blatt gekennzeichnet Name der Hinterlegungsstelle European Collection of Cell Cultures (ECACC)
Anschrift der Hinterlegungsstelle (einschließlich Postleitzahl und Land) Porton Down Salisbury SP4 OJG Wiltshire Great Britain Datum der Hinterlegung Eingangsnummer 18. Dezember 2003 03121801 WEITERE ANGABEN (falls nicht zutreffend, bitte frei lassen) Die Angaben werden auf einem [~ J gesonderten Blatt fortgesetzt In Bezug auf alle Bestimmungsstaaten, für die eine solche Erklärung möglich ist, wird beantragt, insoweit dies rechtlich nach den Gesetzen des Bestimmungsstaates möglich ist, dass eine Probe des hinterlegten Mikroorganismus nur an einen unabhängigen Sachverständigen ausgehändigt wird, in Übereinstimmung mit der jeweiligen Patentgesetzgebung, z.B. EPO Regel 28(4); UK Patent Rules 1995, Schedule 2, Parapraph 3, Australian Regulation 3.25 (3); Dänische Patentgesetz Abschnitte 22 und 33(3) und entsprechenden Regefungen anderer Bestimmungsstaaten. BESTIMMUNGSSTAATEN, FÜR DIE ANGABEN GEMACHT WERDEN (falls die Angaben nicht für alle Bestimmungsstaaten gelten)
E. NACHREICHUNG VON ANGABEN (falls nicht zutreffend, bitte, freilassen Die nachstehenden Angabe.n werden später beim Internationalen Büro eingereicht (bitte Art der Angaben nennen, z.B. „Eingangsnummer der Hinterlegung")
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Formblatt PCT/RO/134 (Juli 1998; Nachdruck Januar 2004) 25

Claims

PATENTANSPRÜCHE
1. Monoparamunitätsinducer auf der Basis von paramunisierenden Viren oder Viruskomponenten, dadurch gekennzeichnet, dass die Viren oder Viruskomponenten von einem attenuierten Myxomavirus-Stamm des Kaninchens stammen.
2. Monoparamunitätsinducer nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass der attenuierte Myxomavirus-Stamm eine Modifikation in Form einer Addition, Substitution oder Deletion in einem oder mehreren Genabschnitten, kodierend für die Bildung von Zytokin- Rezeptoren, aufweist, wobei durch die Modifikation die Rezeptoreigenschaften des Zytokin- Rezeptors verloren geht.
3. Monoparamunitätsinducer nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Zytokin-Rezeptoren ausgewählt sind aus der Gruppe von Rezeptoren für Interferone (IFN), Interleukine (IL) und Tumornekrosefaktor (TNF).
4. Monoparamunitätsinducer nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Zytokin-Rezeptoren ausgewählt sind aus der Gruppe von Rezeptoren für IFNα-R, IFNγ-R, TNF-R, 1L-1-R, 1L-2-R, 1L-6-R, IL-12-R.
5. Monoparamunitätsinducer nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Viruskomponenten Virushüllen oder aberrante Formen von Virushüllen eines attenuierten Myxomavirus-Stammes umfassen.
6. Monoparamunitätsinducer nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass der Myxomavirus-Stamm ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus M2, M7, Lausanne, Aust/Uriarra/Verg-86/1.
7. Monoparamunitätsinducer nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Myxomavirus-Stamm um den Stamm M-2 mit der Hinterlegungsnummer ECACC 03121801 handelt.
8. Monoparamunitätsinducer nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass der Myxomavirus-Stamm in Zellkulturen attenuiert wurde.
9. Monoparamunitätsinducer nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den Zellkulturen um Vero-Affennierenzellen und/oder AVIVER-Zellen handelt.
10. Monoparamunitätsinducer nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die attenuierten Myxomaviren inaktiviert wurden.
11. Monoparamunitätsinducer nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die attenuierten Myxomaviren mit Beta-Propiolacton inaktiviert wurden.
12. Monoparamunitätsinducer nach Anspruch 11 , dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration von Beta-Propiolacton 0,01-1 % beträgt.
13. Monoparamunitätsinducer nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration von Beta-Propiolacton 0,05% beträgt.
14. Monoparamunitätsinducer nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Myxomaviren lyophilisiert wurden.
15. Verwendung des Monoparamunitätsinducers nach einem der Ansprüche 1 bis 14 für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung.
16. Verwendung des Monoparamunitätsinducers nach einem der Ansprüche 1 bis 14 für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Aktivierung des paraspezifischen Immunsystems bei Mensch und Tier.
17. Verwendung des Monoparamunitätsinducers nach einem der Ansprüche 1 bis 14 für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur parenteralen Behandlung und/oder zur Prophylaxe von Dysfunktionen des Immunsystem, Immunsuppression, Immunschwäche-Erkfankungen, Dysfunktionen der Homöostase zwischen Hormon-, Kreislauf-, Stoffwechsel- und Nervensystem, neonataler Infektionsbedrohung, Tumorerkrankungen, Viruserkrankungen, bakteriellen Erkrankungen, therapieresistenten infektiösen Faktorenkrankheiten, viralen und bakteriellen Mischinfektionen, chronischen Manifestationen infektiöser Prozesse, Leberkrankheiten unterschiedlicher Genese, chronischen Hautkrankheiten, Herpeskrankheiten, chronischen Hepatitiden, grippalen Infekten, Endotoxinschäden.
18. Verwendung nach einem der Ansprüche 15 bis 17, wobei die Behandlung durch eine lokale Verabreichung der pharmazeutischen Zusammensetzung über die Haut oder Schleimhäute eines Patienten erfolgt.
19. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend einen Monoparamunitätsinducer nach einem der Ansprüche 1 bis 14 und einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
20. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 19, zur lokalen oder parenteralen Applikation.
21. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 19, wobei die Zusammensetzung in Form von Buccal- und Lutschtabletten vorliegt.
22. Verfahren zur Herstellung eines Monoparamunitätsinducers basierend auf einem attenuierten Myxomavirus-Stamm des Kaninchens, umfassend die Schritte: Isolieren von Myxomaviren aus infiziertem Gewebe eines typisch an einer generalisierten Myxomatose erkrankten Kaninchens; Adaptierung des Virus an ein permissives Zellsystem; Passagierung der isolierten Viren in einer permissiven Zellkultur, bis eine Attenuierung des Virus erreicht ist.
23. Verfahren nach Anspruch 22, wobei zur Adaptierung die isolierten Viren auf die Chorioallantoismembran (CAM) bebrüteter Hühnereier geimpft werden.
24. Verfahren nach Anspruch 23, wobei das Virus über 2 bis 6 Passagen, vorzugsweise über 3 Passagen, auf der CAM vermehrt wird.
25. Verfahren nach Anspruch 22, wobei zur Isolierung der im infizierten Gewebe enthaltenden Myxomaviren diese in einem permissiven Zellsystem vermehrt werden.
26. Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß das Virus durch Anzucht auf der Chorioallantoismembran (CAM) bebrüteter Hühnereier isoliert wird.
27. Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß das Virus anschließend an die CAM über weitere Passagen, vorzugsweise über 2 weitere Passagen, adaptiert wird.
28. Verfahren nach einem der Ansprüche 22 bis 27, wobei das Virus in einer permanenten Zellkultur passagiert wird.
29. Verfahren nach Anspruch 28, wobei das Virus in einer Vero-Zellkultur passagiert wird.
30. Verfahren nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, dass die Attenuierung der Myxomaviren über 80 bis 150 Passagen, vorzugsweise über 120 Passagen, in Vero- Zellkulturen erfolgt.
31. Verfahren nach einem der Ansprüche 28 bis 30, wobei das Virus in einer binären Zellkultur passagiert wird.
32. Verfahren nach Anspruch 31 , wobei das Virus in einer AVIVER-Zellkultur passagiert wird.
33. Verfahren nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, dass die Passagierung über 10 bis 50 Passagen, vorzugsweise über 25 Passagen, erfolgt.
34. Verfahren nach einem der Ansprüche 22 bis 33, wobei die attenuierten Myxomaviren zusätzlich über weitere Attenuierungspassagen vermehrt werden.
35. Verfahren nach Anspruch 34, wobei die Vermehrung in Vero-Affennierenzellen erfolgt.
36. Verfahren nach Anspruch 35, dadurch gekennzeichnet, dass die Weitermehrung in Vero-Zellen über 100 bis 200 Passagen erfolgt.
37. Verfahren nach einem der Ansprüche 34 bis 36, dadurch gekennzeichnet, dass die Virusernten der Zellkultur einen Infektionstiter von 105 bis 107,5, vorzugsweise von mindestens 106 5 , TCID50/ml haben.
38. Verfahren nach einem der Ansprüche 22 bis 37, wobei die attenuierten Myxomaviren zusätzlich inaktiviert werden.
39. Verfahren nach Anspruch 38, wobei die attenuierten Myxomaviren zur Inaktivierung mit Beta-Propiolacton behandelt werden.
40. Verfahren nach Anspruch 39, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration von Beta-Propiolacton 0,01-1% beträgt.
41. Verfahren nach Anspruch 40, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration von Beta-Propiolacton 0,05% beträgt.
42. Verfahren nach einem der Ansprüche 22 bis 41 , umfassend die Schritte: Isolieren von Myxomaviren aus dem infizierten Gewebe des an Myxomatose erkrankten Kaninchens durch Vermehrung auf der CAM bebrüteter Hühnereier und nachfolgender Adaptierung des isolierten Myxomavirus an die CAM über weitere 2 Passagen Attenuieren der isolierten Viren durch Passagierung in Vero-Zellkulturen, vorzugsweise über 120 Passagen, Überführung der Viren in die binäre AVIVER-Zellkultur mit weiterer Attenuierung des Virus, vorzugsweise über 24 Zwischenpassagen, in dieser Zellkultur, nachfolgende Rückübertragung des Virus auf Vero-Affennierenzellen, und Vermehren der attenuierten Myxomaviren durch weitere Attenuierungspassagen in den Vero-Zellen, vorzugsweise über etwa 150 Passagen.
43. Attenuiert.es Myxomavirus, erhältlich durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 22 bis 42.
44. Myxomavirus nach Anspruch 43, hinterlegt bei der European Collection of Cell Cultures (ECACC) unter der Hinterlegungsnummer 03121801.
45. Myxomavirus nach Anspruch 43 oder 44, dadurch gekennzeichnet, dass das Myxomavirus genetisch modifiziert ist.
46. Myxomavirus nach Anspruch 45, dadurch gekennzeichnet, dass das Myxomavirus eine Modifikation in Form einer Addition, Substitution oder Deletion in einem oder mehreren Genabschnitten, kodierend für die Bildung von Zytokin-Rezeptoren aufweisen, wobei durch die Modifikation die Rezeptoreigenschaften der Zytokin-Rezeptoren verloren gehen.
47. Myxomavirus nach Anspruch 46, dadurch gekennzeichnet, dass die Zytokin- Rezeptoren ausgewählt sind aus der Gruppe von Rezeptoren für Interferone (IFN), Interleukine (IL) und Tumomekrosefaktor (TNF).
48. Myxomavirus nach Anspruch 47, dadurch gekennzeichnet, dass die Zytokin- Rezeptoren ausgewählt sind aus der Gruppe von Rezeptoren für IFNα-R, IFNγ-R, TNF-R, IL- 1-R, IL-2-R, IL-6-R, IL-12-R.
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