DE69432790T2

DE69432790T2 - Auf papillomaviren basierende pharmazeutische präparate

Info

Publication number: DE69432790T2
Application number: DE69432790T
Authority: DE
Inventors: Severia Maria CAMPO; William Fleming Hoggan Blanefield JARRETT
Original assignee: Cancer Research Campaign Technology Ltd
Current assignee: Cancer Research Campaign Technology Ltd
Priority date: 1993-03-31
Filing date: 1994-03-31
Publication date: 2004-04-22
Anticipated expiration: 2014-04-01
Also published as: US6020309A; DK0692028T3; EP0692028B1; WO1994023037A1; CA2158554A1; ES2199960T3; DE69432790D1; PT692028E; ATE242265T1; JPH08508728A; AU6381794A; GB9306731D0; EP0692028A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Pharmazeutika, die auf Papillomaviren basieren.
Papillomaviren rufen bei Menschen und Tieren eine Vielfalt an Läsionen hervor. Einige Papillome, obgleich gutartig, sind ihrerseits ein klinisches Problem, wie z. B. Kehlkopf-Papillom bei Kindern oder Penis-Papillom bei Stieren, und andere sind bekannt als Risikofaktor in der Pathogenese von Krebs, wie etwa im Fall der flachen Läsionen des Gebärmutterhalses oder des Kondyloms des Penises bei Menschen. Daher wären antivirale Pharmazeutika gegen Papillomaviren von großem Vorteil in der Human- und der Veterinärmedizin, z. B. für die prophylaktische Verwendung zum Schutz gegen die Etablierung einer ernsthaften Infektion.
Impfstudien bei Menschen zeigen mehrere Probleme auf. Erstens sind Experimente ethisch inakzeptabel. Zweitens sind nur geringe Mengen des Virus verfügbar, da einige Läsionen, im Speziellen die des Gebärmutterhalses, keine viralen Nachkommen erzeugen, und kein In-vitro-System ist bis jetzt verfügbar, welches eine vegetative Reproduzierung des Virus erlaubt.
Die Produktion von viralen Proteinen in Bakterien und die Verwendung von synthetischen Peptiden haben das letzte Problem umgangen und haben die weitergehende Analyse der Immunabwehr einer Papollomavirus-Infektion erlaubt (siehe z. B. Jenison et al., J. Virol. 62, 2115 (1998), und Tindle et al., J. Gen. Virol. 71, 1347 (1990)).
Effektive prophylaktische Impfstoffe, sowohl natürliche (Jarrett et al., The Vet. Record 126, 449 (1990)) als auch gentechnische (Pilachinski et al., Ciba Foundation Symposium 120, 136 (1986)), wurden bereits erzeugt gegen Rinder-Papillomaviren, und ein Rückgang des "Shope"-Papilloms wurde durch das Impfen von Kaninchen mit Tumorgewebeextrakten erzielt (Evans et al., J. Net. Cancer Inst. 29, 277 (1962)). Das Rindersystem ist ein exzellentes Modell für Krankheiten bei Menschen, die durch Papillomaviren hervorgerufen werden, und für Medikamente gegen diese Krankheiten bei Menschen durch mehrere Ähnlichkeiten zwischen der Krankheit bei Rindern und Menschen. Namentlich mehrere Virustypen mit hoher Spezifität für Läsionen (Jarrett et al., Virol. 136, 255 (1984)), Homologie der genetischen Struktur und die Entwicklung einiger Läsionen zu bösartigen Tumoren. Das Rinder-System zeigt auch mehrere Vorteile auf, indem Co-Faktoren in der Onkogenese bekannt sind (Cameo und Jarrett, "Papillomavirus", Ciba Foundation Symposium 120, John Wiley and Sons, S. 117 (1986)) und vor allem direktes Experimentieren möglich ist (Jarrett, "Advances in Viral Oncology" (Hrsg. G. Klein) 5, 83 (1985)).
Impfung wurde traditionellerweise als prophylaktische Maßnahme betrachtet. Wirte werden gegen ein Pathogen immunisiert, und bei weiterem Ausgesetztsein gegenüber demselben Organismus wird die Infektion auf einer vorklinischen Stufe abgebrochen. Dies wird normalerweise bei Virusinfektionen durch eine Neutralisation erreicht, die auf ein Oberflächenepitop an einem Strukturprotein gerichtet ist. Virusinduzierte Tumoren wie Papillome existieren für eine lange Zeitspanne und werden dann in einem Teil der Fälle abgestoßen. Der Wirt kann dann immun gegenüber einer neuerlichen Infektion sein (Jarrett, 1985, s. o.). Die Art des Abstoßungsmechanismus und seiner Vermittler ist unbekannt, aber es ist von Vorteil, den Abstoßungsmechanismus früh im Lebenszyklus des Tumors einzuführen. In der praktischen Veterinärmedizin war es seit langem bekannt, dass der Rohextrakt von Papillomen manchmal, keinesfalls aber immer, eine Abstoßung von homologen Papillomen verursacht (Olson et al., Am. J. Vet. Res. 21, 233 (1959), Evans et al., 1962, s. o.). Diese Experimente wurden ausgeführt, bevor bekannt war, dass verschiedene Arten von Papillomaviren in einer Spezies vorlagen (Jarrett et al., 1984, s. o.; de Villier, J. Virol. 63, 4898 (1989)) und dass diese wahrscheinlich alle immunologisch artspezifisch sind.
Papillomaviren können infizieren und Tumoren in Haut- und Schleimepithelen verursachen. Bei Menschen und Tieren sind Schleimhaut-Papillome häufig ernsthafte Läsionen, die dazu tendieren, einen ausgedehnten Verlauf zu nehmen, wie in Geschlechts- und Gebärmutterhalspapillomen (Steinberg, "The Papovaviride", Bd. 2 (Hrsg. N. P. Salzman und P. M. Howley), S. 265 (1987); zur Hausen, Virol. 184, 9 (1991)). Dies mögen ursächliche Faktoren in der weiteren Entwicklung von bösartigen Tumoren sein, wie etwa im Fall des Human-Papillomavirus (HPV) vom Typ 16, zugeordnet dem Gebärmutterhalskarzinom bei Frauen (zur Hausen, 1991, s. o.), und des Rinder-Papillomavirus vom Typ 4, zugeordnet dem Magen-Darm-Krebs bei Rindern (Cameo und Jarrett, 1986, s. o.). Es ist eindeutig, dass eine dringende Notwendigkeit für Pharmazeutika gegen von Papillomaviren hervorgerufene Krankheiten besteht.
Trotz neulichen begrenzten Erfolgs (Kreider et al., J. Virol. 59, 369 (1986); Sterling et al., J. Virol. 64, 6305 (1990); Meyers et al., Science 257, 971 (1992); Dollard et al., Genes and Development 6, 1131 (1992)) sind Papillomaviren offenkundig beständig gegen Wachstum in Zellkulturen (Teichaman und LaPorta, "The Papovaviridae", Bd. 2 (Hrsg. N. P. Salzman und P. M. Howley), S. 109 (1987)), und das mittelbare Fehlen von viralen Reagentien verzögerte die Analyse der Immunantwort auf die Infektion. Die neue Verfügbarkeit von rekombinanten Technologien erlaubte die Herstellung von frühen und späten viralen Proteinen in großen Mengen in reiner Form (Tindle et al., 1990, s. o..; Jarrett et al., Virol. 184, 33 (1991); Ghim et al., Virology 190, 548 (1992); Stacey et al., J. Gen. Virol. 73, 2337 (1992)) und ermöglichte daher zum ersten Mal, das Immunisierungspotential zu studieren. Es wurde bereits gezeigt, dass es bei Rindern möglich ist, Viren- und Tumorextrakte zu verwenden, um Schutz gegen durch Papillomaviren hervorgerufene Hautläsionen hervorzurufen (Jarrett et al., The Vet Record 126, 473 (1990); The Vet Record 126, 449 (1990)), und rekombinante Proteine zu verwenden, um Schutz gegen und Abstoßung von PV-induzierten Hautläsionen hervorzurufen (Virology 184, 33 (1991)).
Die Herstellung von bestimmten Papollimavirus-Capsid-Proteinen und die potenzielle Verwendung in Impfformulierungen wurde in den folgenden Publikationen erwähnt:
WO 93/02184 (University of Queensland, Frazer et al.) offenbart Virus-ähnliche Partikel (VLPs), die aus dem Papillomavirus-L1-Protein oder einer Kombination aus L1-Protein und L2-Protein bestehen. Auch beschrieben ist ein Impfstoff, der diese VLPs in Kombination mit Freundschem vollständigem Adjuvans enthält.
WO 93/00436 (Cancer Research Campaign Technology Limited, Jarrett et al.) offenbart eine pharmazeutische Rezeptur für die Prophylaxe oder Therapie von durch Papillomaviren hervorgerufenen Tumoren unter der Verwendung von Papillomavirus-L2-Protein und erwähnt die Verwendung von Zusätzen wie Freundschem unvollständigem Adjuvans oder L1D1 oder DDA.
EP-A-0.133.123 (Molecular Genetics Inc., Pilacinski) offenbart die Herstellung von BPV-1-L1- und L2-Capsid-Proteinen und deren Potenzial für Impfstoffformulierungen.
Die Anmelder zeigen nun, dass man in einer praktischen, maßgeblichen Art und Weise gegen Papillomaviren, z. B. das Schleimhautvirus BPV-4, welches auf dem Gebiet ein ursächlicher Faktor von schuppenartigem Zellenkarzinom des oberen Verdauungstrakts ist (Campo und Jarrett, 1986 s. o.), impfen kann.
Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung weitere nützliche pharmazeutische Formulierungen, bestehend aus L2-Protein in Kombination mit Alaun, für eine Papillomavirus-Therapie bereit.
Die vorliegende Erfindung stellt eine pharmazeutische Formulierung bereit, die aus der Gruppe, bestehend aus: (i) einer Formulierung, die Papillomavirus- (PV-) L2-Protein oder ein therapeutisch wirksames Fragment davon und eine Aluminiumverbindung umfasst, (ii) einer Formulierung, die ein Rinder-Papillomavirus- (BPV-) L2-Protein oder ein therapeutisch wirksames Fragment davon und eine Aluminiumverbindung umfasst; (iii) einer Formulierung, die ein BPV-4-L2-Protein oder ein therapeu tisch wirksames Fragment davon und eine Aluminiumverbindung umfasst, ausgewählt ist.
Die pharmazeutische Formulierung kann ein PV-L2-Protein oder ein therapeutisch wirksames Fragment davon und eine Aluminiumverbindung umfassen. Das PV kann BPV sein. Das BPV kann BPV-4 sein.
Das Papillomavirus-Protein oder ein therapeutisch wirksames Fragment davon kann in Form eines Fusionsproteins mit einem anderen Co-Protein vorliegen. Das Co-Protein kann Glutathion-S-Transferase sein.
Das Papillomavirus oder ein therapeutisch wirksames Fragment davon kann mittels DNA-Rekombinationstechniken hergestellt werden.
Die Aluminiumverbindung kann ein Gemisch aus Aluminiumhydroxid und Aluminiumphosphat umfassen. Es können 3% Aluminiumhydroxid und 2% Aluminiunphosphat sein. Die Aluminiumverbindung kann ein Aluminiumgel sein.
Es wird auch eine pharmazeutische Formulierung wie oben beschrieben für die Verwendung zur Therapie von durch Papillomaviren hervorgerufenen Tumoren und Läsionen bereitgestellt.
Auch wird die Verwendung von (i) einem PV-L2-Protein oder einem therapeutisch wirksamen Fragment davon und einer Aluminiumverbindung; oder (ii) einem BPV-L2-Protein oder einem therapeutisch wirksamen Fragment davon und einer Aluminiumverbindung; oder (iii) einem BPV-4-L2-Protein oder einem therapeutisch wirksamen Fragment davon und einer Aluminiumverbindung bei der Herstellung eines Impfstoffs zur Therapie von durch Papillomaviren hervorgerufenen Tumoren und Läsionen bereitgestellt.
Auch wird eine pharmazeutische Formulierung wie oben beschrieben in einer therapeutisch wirksamen Dosierung für die Immunisierung eines Säugetieres gegen durch Papillomaviren hervorgerufene Tumoren und Läsionen bereitgestellt.
Impfstoffe basierend auf den oben beschriebenen pharmazeutischen Formulierungen können mit bekannten Verfahren hergestellt werden. Gleichfalls können Dosierraten durch bekannte Verfahren bestimmt werden. Aufmerksamkeit sollte auf "New Trends and Developments in Vaccines", A. Voller und N. Friedman (Hrsg.), University Park Press, Bultimore (1978), und auf "Remington's Pharmaceutical Science" von E. W. Martin gelenkt werden.
Zum besseren Verständnis der Erfindung wird sie anhand von Beispielen, die nicht als Einschränkung zu verstehen sind, und unter Bezug auf die folgenden Figuren näher beschrieben. Beispiele betreffend den alleinigen Einsatz von (B)PV-E7-Protein sind lediglich zu Vergleichszwecken angeführt.
1 zeigt die Ergebnisse der Impfung mit frühen β-gal- (E1-, E2-, E4- und E7-) Fusionsproteinen. A, Tier Nr. 132 der Gruppe 3 (Kontrolle). B, Tier Nr. 146 der Gruppe 1 (Impfung vor der Exposition). C, Tier Nr. 139 der Gruppe 2 (Impfung nach der Exposition). Eine Balkenlegende ist in der Figur angegeben. D. pURE7. Die rekombinanten Plasmide, die E1-, E2- und E4-ORFs enthalten, sind nicht dargestellt.
2 zeigt die Ergebnisse der Impfung mit β-gal-E7. A1, mittlere Anzahl aller Tumoren in geimpften und Kontrolltieren. B, mittlere Anzahl an Stadium 1-Tumoren. C, mittlere Anzahl an Stadium 2-Tumoren. D, mittlere Anzahl an Stadium 3-Tumoren. Quadrate, geimpfte Tiere; Rhomben, Kontrolltiere. In wiederholten Messauswertungen, P = 0,02 in C und 0,04 in D.
3 zeigt die Ergebnisse der Impfung mit E7 + L2 und L2. A, rekombinante pGEX-Plasmide. B-D, Anzahl der Tumoren in Kälbern, elf Wochen nach Exposition; B, Gruppe 1 (E7 + L2-Impfstoff); C, Gruppe 2 (L2-Impfstoff); D, Gruppe 3 (Kontrolle).
Materialien und Verfahren
Alle genetischen Manipulationsverfahren werden durchgeführt gemäß Standardverfahren beschrieben in "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", Sambrook, Fritsch und Maniatis (Hrsg.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.
Im Folgenden wird beschrieben, wie die Anmelder die rekombinanten BPV-4-Peptide in Escherichia coli unter Verwendung von pAT153 als Quelle von E7 und L2 produzierten. Alternativ dazu kann die Erfindung unter Verwendung von L2- und E7-Sequenzinformationen, die bei der "EMBL Sequence Database" (Zugriffsnummer X59063) erhältlich sind, durchgeführt werden.
Kälber
Kälber aus gemischter Zucht, ungefähr 12 Wochen alt, wurden aus Papillom-freien Quellen erhalten. Sie wurden zufällig in Gruppen eingeteilt und in getrennten, sauberen, gut belüfteten Laufställen in einer Isolationseinheit gehalten. Allen Kälbern wurde Blut bei der Ankunft und in drei- bis vierwöchigen Intervallen danach für hämatologische Analysen abgenommen. Die Tiere wurden in vollständiger Übereinstimmung mit den Anweisungen des "Home Office of Great Britain" gepflegt.
Herstellung von rekombinanten BPV-4-Peptiden in Escherichia coli
(i) β-Galactosidase-E7-Fusionsproteine
Die offenen Leserahmen (ORFs) von E1, E2, E4 und E7 von BPV-4 wurden in der pUR-Plasmidreihe kloniert (Ruther und Muller-Hill, EMBO J. 2, 1791 (1983)). Das Klonieren von E1-, E2- und E4-ORFs ist nicht beschrieben.
Der für das E7-Peptid kodierende ORF wurde durch Verdau des BPV-4-Genoms isoliert, welches in pAT153 (Campo M. S. et al., J. Gen. Virol. 63, 255 (1982)) mit BAMHI kloniert worden war. Der für das E7-Peptid kodierende ORF wurde als Bsrl-Fragment, das die Nucleotide (nts) 652-1249 umspannt, isoliert und in pUR 278 (Ruther und Mullter-Hill 1983 s. o.) durch Zugabe von BamHI-Linkern geklont. Das rekombinante Plasmid wurde in Escherichia Coli JM109 (Promega Ltd, Southampton, UK) transfiziert. Die Bakterien wurden zu mittelstämmigen Stadien in L-Nährlösung, ergänzt mit 100 μg/ml Ampicillin, gezüchtet und dazu induziert, das β-gal-Fusionsprotein nach Zugabe von 100 μg/ml IPTG über 1–4 Stunden zu exprimieren. β-gal-E7 wurde hergestellt durch Suspendieren von Bakterien in einem Lysozym-Puffer (25 Saccharose, 10 mM MgCl₂, 50 mM Tris HCl pH 8,0, 1 mg/ml Lysozym), der 300 μg/ml DNase I enthielt. Die Fusionspeptide wurden nach Zell-Lyse in 0,25% NP40, 0,125% Deozycholat, 0,25 M NaCl, Tris HCl pH 7,2 und weiterem Waschen in 1,75 M Guanidin HCl, 1 M NaCl, 1% Triton X100, pelletiert.
(ii) Glutathion-S-Transferase-(GST-)Fusionsproteine
Die E7- und L2-ORFs wurden in pGEX (Smith und Johnson, 1988 Gene, 67 p. 31) kloniert.
Der für das E7 Peptid kodierende ORF wurde wie oben beschrieben isoliert und in pGEX 3X (Pharmacia Ltd, Milton Keynes MK9 3HP, UK) mittels Stumpfenden-Ligation kloniert (siehe 3).
Der für das durch Verdau des BPV-4-Genoms, welches in pAT 153 (Campo et al. 1982, s. o.) kloniert worden war, isolierte L2-Peptid kodierende ORF wurde als BamHI-EcoRi-Fragment, das die nt 3987-5585 umspannte, erhalten und in seiner Gesamtheit in pGEX 2T (Pharmacia Ltd, Milton Keynes MK9 3HP, UK) kloniert, und wurde auch in Form von drei Dde I-Fragmenten erhalten: (i) eines 5'-Endfragments (nt 4042-4610) in pGEX 2T; (ii) eines mittleren Fragments (nt 4610-4989) in pGEX 3X; und (iii) eines 3'-Endfragments (nt 4989-5629) in pGEX eX (siehe 3). Die GST-Fusionspeptide stellen das E7-Protein von Aminosäure –21 bis 98 (GST-E7); das L2 Protein von Aminosäure –8 bis 542 (GST-L2w); Aminosäure 11–200 (GST-L2a); Aminosäure 201–326 (GST L2b); und Aminosäure 327–542 (GST-L2c) dar. Transformation und Wachstum der Bakterien und Produktion von GST-Fusionsproteinen wurden durchgeführt wie schon für β-gal-E7 beschrieben. Die Peptide wurden in Massenproduktion durch Pelletieren der Einschlusskörper der Bakterien, suspendiert in einem Lysozym-Puffer, der DNase I mit 300 μg/ml und Desoxycholat mit 1 μg/ml enthielt, und folgendem Waschen in 0,5% Triton X100/10 mM EDTA, pH 8,0 hergestellt. In allen Fällen wurden die Fusionspeptide durch Kochen und Beschallen in 5% SDS, 5 mM β-Mercaptoethanol, 50 mM Tris HCl, pH 8,0 vor dem Impfen suspendiert. Die Ausbeuten lagen bei 2 bis 3 mg pro Gramm Nassgewicht der Bakterien, und 50 bis 70% Reinheit wurde routinemäßig erzielt.
Charakterisierung der Fusionsproteine
Die β-gal-E7-, GST-E7- und GST-L2-Peptide wurde durch SDS-PAGE-Elektrophorese charakterisiert. Die Molekulargewichte der Fusionspeptide stimmten mit der Vorhersage überein. β-gal-E7 und GST-E7 wurden immunologisch unter Verwendung von Kaninchen-, Rinder- oder Mäuse-Antiseren, die gegen β-gal-E7 und GST-E7 oder GST-E7 entwickelt worden waren, in ELISA- oder Western-Blot-Analysen charakterisiert, gefolgt von Absorption des entsprechenden bakteriellen Proteins. Die Immunseren reagierten positiv mit den homologen und den heterologen Antigenen, was zeigte, dass die Fusionsproteine immunologisch aktiv und die Seren spezifisch für E7 waren (siehe Tabelle 1). GST-L2-Antigene waren reaktiv in ELISA-Tests mit homologen Rinderseren, wie auch das β-gal-L2-Fusionsprotein, was zeigte, dass GST-L2 immunologisch aktiv und die Seren spezifisch für L2 waren (siehe Tabelle 1).
Versuchsplanung
(i) Impfung mit frühen E1-, E2-, E4- und E7-Fusionsproteinen
Achtzehn Tiere wurden in drei Gruppen zu je sechs Tieren aufgeteilt. Jedes Tier in Gruppe 1 wurde in die hintere linke Flanke mit 1 ml PBS, das 1 mg einer Mischung aus frühen β-gal- (E1-, E2-, E4- und E7-) Fusionsproteinen, emulgiert in 1 ml Freundschem unvollständigem Adjuvans (FIA), enthielt, geimpft; die Impfung (Auffrischung) wurde nach zwei Wochen in die hintere rechte Flanke wiederholt. Zwei Wochen nach der Auffrischung erfolgte bei allen Tiere jeder Gruppe eine Challenge bzw. Exposition mit 10¹² Teilchen von BPV-4 in den Gaumen (Jarrett et al., The Vet Record 126, 473 (1990)). Die Tiere in Gruppe 2 wurden ungefähr zwei Wochen nach der Challenge geimpft und nach weiteren zwei Wochen aufgefrischt. BPV-4 wurde aus Ösophagus-Papillomen gereinigt und wie vorher beschrieben typisiert (Campo et al., Nature 286, 180 (1980)), und die Konzentration an viralen Teilchen wurde durch Elektronenmikroskop-Untersuchung abgeschätzt (Jarrett et al., The Vet Record 126, 449 (1990)). Jedes Tier wurde alle drei bis vier Wochen untersucht, die Papillome wurden gezählt und deren Größe gemessen wie vorher beschrieben (Jarrett, 1985 s. o.).
(ii) Impfung mit β-gal-E7
Neunzehn Tiere wurden in zwei Gruppen zu elf und acht Tieren geteilt. Jedem der elf Kälber in Gruppe 1 wurde eine 1 mg/1 ml Suspension von β-gal-E7-Fusionsprotein, emulgiert in 1 ml FIA in den rechten Quadriceps-Muskel gegeben. Die Impfung wurde vier Wochen später in den linken Quadriceps-Muskel wiederholt (Auffrischung). Vierzehn Tage nach der Auffrischung erfolgte bei allen Tieren der Gruppe 1 und 2 eine Challenge mit 10¹¹ BPV-4 Teilchen an zehn Stellen (10¹⁰ Teilchen pro Stelle) in den Gaumen. Die Tiere wurden untersucht und die Papillome wie oben beobachtet.
(iii) Impfung mit GST-E7 und GST-L2
Siebenundvierzig Tiere wurde in zwei Gruppen zu je fünfzehn Tieren (Gruppe 1 und 2) und eine Gruppe zu siebzehn Tieren (Gruppe 3) geteilt. Den Kälbern der Gruppe 1 wurden 2 ml einer Suspension, die 1 mg GST-E7-Fusionsprotein und 1 mg gesamt von GST-L2-Fusionspeptiden (das Verhältnis der GST-Fusionspeptide L2w : L2a : L2b : L2c war ungefähr 1 : 5 : 5 : 5) enthält, plus 2 ml FIA in den rechten Quadriceps-Muskel gegeben. Die Impfung wurde vier Wochen später in den linken Quadriceps-Muskel wiederholt. Jedem der Kälber der Gruppe 2 wurde 1 mg GST-L2-Fusionsprotein wie oben beschrieben gegeben. Zwei Wochen nach der Auffrischung wurden die Tiere aller drei Gruppen am Gaumen an zehn verschiedenen Stellen mit insgesamt 10¹¹ BPV-4-Teilchen (10¹⁰ Teilchen pro Stelle) beimpft. Die Tiere wurden untersucht und die Papillome wie oben beobachtet.
(iv) Impfung mit GST-L2 in Aluminium-Gel
Sechsunddreißig Tiere wurden in drei Gruppen zu je zwölf Tieren geteilt. Jedem der Kälber der Gruppe 1 wurden 3 ml einer Suspension, die 1 ml GST-L2-Fusionspeptid zu 1 mg/ml in demselben Verhältnis wie oben, 1 ml an 40 mM TRIS-HCl, 0,33% NaCl und 1 ml Aluminium Gel, das aus gleichen Volumina an 3% Aluminiumhydroxid und 2% Aluminiumphosphat (Intervet UK Ltd, Cambridge Science Park, Cambridge CB4, UK) enthielt, gegeben. Die Impfung wurde vier Wochen später wiederholt. Die Kälber der Gruppe 2 wurden wie oben geimpft, aber mit nur 100 μg L2-Fu sionspeptid pro Tier. Die Kälber der Gruppe 3 waren die Kontrolle. Die Challenge erfolgte wie oben.
Ergebnisse
Die Immunisierung mit E7-Protein hemmt die Entwicklung von Papillomen und bewirkt die Abstoßung der Papillome
E7 ist das Haupt-Transformationsprotein von BPV-4 in vitro (Jagger et al., J. Gen. Virol. 61, 3041) und wird während der verschiedenen Entwicklungsstadien der Verdauungskanal-Papillome exprimiert, was seine Bedeutung für die Erhaltung des Fortpflanzungsstadiums auch in vivo zeigt. Es ist homolog zum Oncoprotein E7 des Human-Papillomavirus vom Typ 16 (HPV-16) (Jagger et al., 1990, s. o.; Jackson et al., Molecular Carcinogenesis 4, 382 (1991)), das Virus ist am häufigsten assoziiert mit schuppenartigem Zellkarzinom des Gebärmutterhalses bei Frauen (zur Hausen, 1991, s. o.). Wegen seiner entscheidenden Funktion bei der Zelltransformation kann E7 als Target für zellvermittelte Immunreaktionen dienen, die zur Abstoßung von Tumoren, sowohl bei BPV-4 als auch bei HPV-16, führt.
Die Anmelder haben zwei Pilotversuche durchgeführt, welche kurz beschrieben werden, sowie einen dritten Versuch mit einer großen Anzahl an Tieren, der genauer beschrieben wird.
Im ersten Versuch impften die Anmelder Kälber mit einer Mischung aus frühen BPV-4-Proteinen E1, E2, E4 und E7, welche in Bakterien als β-Galactosidase-Fusionsproteine produziert wurden (Ruther und Muller-Hill, 1983, s. o.; Jarrett et al., Virol. 184, 33 (1991)). Sechs Kälber der Gruppe 1 wurden geimpft, bevor eine Challenge mit BPV-4 im Maul erfolgte, und sechs Kälber der Gruppe 2 wurden nach der Challenge geimpft. Sechs Kontroll-Kälber in Gruppe 3 wurden nicht geimpft und wurden gegenüber BPV-4 exponiert (siehe Tabelle 2). Vier bis sechs Wochen nach der Challenge entwickelten alle Tiere plattenartige Läsionen, welche Stadium 1a der Verdauungskanal-Papillomentwicklung darstellen (Jarrett, 1985 s. o.). Während der nächsten zwanzig Wochen wuchsen die Läsionen der Kontrolltiere in Anzahl und Größe mit sekundärer Ausbreitung im Gaumen; und sie unterliefen die gut anerkannten Stadien des Papillomwachstums: erhobene Platten (Stadium 1b), Papillome bis zu 2 mm Länge (Stadium 2) und Papillome größer als 2 mm (Stadium 3). Stadium 2- und Stadium 3-Papillome sind voll entwickelte, Virus produzierende Tumoren. Tabelle 2 Impfstrategie
Die Anzahl der Tiere in den einzelnen Gruppen steht in Klammern. Die Tiere wurden zwei Mal mit 1 mg Protein beimpft, ausgenommen in Experiment 5 in Gruppe 2, wo sie zwei Impfungen zu je 100 μg erhielten (L2**). Das Adjuvans war FIA in allen Fällen, ausgenommen in Versuch 5 (L2* und L2**), wo es ein Aluminiumgel war (Intervet UK, LTD). Bei Versuch 1 kennzeichnet PR den Impfstoff vor der Exposition und PS den Impfstoff nach der Exposition; bei Versuch 2 bis 5 wurde der Impfstoff immer vor der Exposition verabreicht; nv bedeutet kein Impfstoff.
Details der Entwicklungsstadien der Papillome und deren Bedeutung im Lebenszyklus des Tumors wurden beschrieben (Jarrett, 1985 s. o.). Ungefähr dreißig Wochen nach der Exposition begann die natürliche Schrumpfung der Papillome mit Abnahme an Größe und Anzahl der Läsionen, und die Tiere waren im Wesentlichen Papillomatose-frei in Woche vierundvierzig. Die Entwicklung von Papillomen in einem repräsentativen Tier dieser Gruppe wird in 1A gezeigt. Alle geimpften Tiere, ob vor oder nach der Exposition geimpft, hatten ungefähr die gleiche Anzahl an Platten wie die Kontrolltiere, was darauf hinweist, dass das Virus gleich infektiös war und dass die Kälber in den drei Gruppen gleich empfänglich für die Infektion waren. Die meisten der Läsionen bei geimpften Tieren entwickelte sich nicht zu voller Größe, speziell in Gruppe 1, und wurden meist 40 bis 47 Wochen nach der Exposition abgestoßen, viel früher als bei Kontrolltieren. Die Entwicklung der Läsionen in repräsentativen Tieren der geimpften Gruppen sind in 1B und C gezeigt. Zwei Folgerungen können aus diesen Resultaten gezogen werden: dass therapeutische Impfung möglich ist und dass im Zeitintervall, das in dieser Studie verwendet wurde, die Zeit der Impfung relativ zur Exposition nicht entscheidend ist.
Um fest zu stellen, welches der vier frühen Proteine verantwortlich für die Tumorrückbildung war, impften die Antragssteller sechs Kälber mit β-gal-E7 und sechs mit β-gal-E2 vor der Exposition, sechs Tiere waren in der Kontrollgruppe (siehe Tabelle 2). Die mit E2 geimpften Tiere verhielten sich nicht anders als die der Kontrollgruppe, während bei Kälbern, die mit E7 geimpft wurden, die Läsionen nicht über Stadium 1A hinaus wuchsen und früher abgestoßen wurden als in der Kontrollgruppe oder bei mit E2 geimpften Tieren (Daten nicht gezeigt).
Im dritten, größer angelegten Experiment wurden elf Kälber mit β-gal-E7 vor der Exposition geimpft, und acht Kälber wurden als Kontrolle gehalten (siehe Tabelle 2). In diesem Experiment sind Platten und erhöhte Platten zusammen als Stadium 1-Läsionen zu betrachten. Wie vorher entwickelten alle Tiere die gleiche Anzahl an Platten vier Wochen nach der Exposition, was damit bestätigt, dass alle gleich anfällig für die Infektion waren (siehe 2A). Nach zehn Wochen fiel die Anzahl der Stadium 1-Läsionen scharf in beiden Gruppen ab, was von der Zunahme der Anzahl der Stadium 2-Läsionen begleitet wurde (siehe 2B und C). In der Kontrollgruppe schritten die Stadium 2-Läsionen zu Stadium 3-Läsionen in den folgenden zehn Wochen fort (siehe 2D), während die Anzahl der Stadium 1-Läsionen konstant blieb (siehe 2B). Es gab keine sekundäre Ausbreitung wegen der kleineren Dosis an Challenge- Virus (siehe Materialien und Verfahren). Nach fünf weiteren Wochen (fünfundzwanzig Wochen nach der Exposition) begannen sich die Stadium 3- und Stadium 2-Papillome zurückzuentwickeln (siehe 2C und D). Bei der mit E7 geimpften Gruppe war zehn Wochen nach der Infektion die Anzahl der Stadium 2-Läsionen geringer als in der Kontrollgruppe (siehe 2C und D). Dreizehn Wochen nach der Infektion nahm die Anzahl der Stadium 2-Papillome wesentlich ab ohne einhergehender Zunahme an Stadium 3-Papillomen (siehe 2C und D). In der mit E7 geimpften Gruppe aber war die Entwicklung von Stadium 2- zu Stadium 3-Läsionen drastisch reduziert, und Stadium 2-Papillome entwickelten sich zurück, bevor sie die volle Reife erreichten. Ein Unterschied zwischen der Kontroll- und der geimpften Gruppe wurde nicht nur, wenn die Anzahl der Stadium 2- und Stadium 3-Papillome pro Gruppe berücksichtigt wurde (wie in 2), sondern auch wenn der Prozentsatz der Stadium 3-Papillome oder der Prozentsatz der Tiere mit Stadium 3-Papillomen berücksichtigt wurde, bobachtet (siehe Tabelle 3).
In den drei verschiedenen Experimenten wurden insgesamt neunundzwanzig Tiere mit E7 geimpft. Zweiundzwanzig (76%) entwickelten keine voll entwickelten Papillome oder stießen sie früher ab als Kontrolltiere. Es kann daher geschlossen werden, dass die Impfung mit E7 das Tumorwachstum reduziert und ein verfrühter Rückgang der Tumoren hervorgerufen wird und so eine wirkungsvolle Behandlung für Papillome bietet.
Impfstoff E7 wird dem Immunsystem wirkungsvoll dargeboten
Impfen mit E7 ist begleitet sowohl von einer humoralen als auch einer zellulären Immunreaktion auf den Impfstoff. Beide Reaktionen treten viel früher auf und haben einen größeren Umfang in den geimpften Tieren als in Kontrollkälbern. Während alle der geimpften Tiere Serum-Antikörper gegen E7 aufweisen, waren Serum-Antikörper gegen E7 nicht bei allen der Kontrolltiere vorhanden, und einige blieben während des ganzen Ablaufs des Experiments negativ. Impfstoff E7 wird daher beiden Effek torzweigen dargeboten, während virales E7 schlecht dargeboten wird. Dies kann die Wirkung des therapeutischen Impfstoffs erklären. Die humorale und zellvermittelte Immunreaktion auf E7 und die Kartierung der B- und T-Zellen-Epitope wird an anderer Stelle detaillierter beschrieben.
Immunisierung mit L2-Protein verhindert die Entstehung von Papillomen
L2 ist ein kleineres Capsid-Protein des Papillomavirus. Obwohl die detaillierte Molekülstruktur des Virions jetzt noch nicht bekannt ist, gibt es einen Indizienbeweis, dass (eine) Domäne(n) des Proteins auf der Oberfläche eines Virus freiliegt/-liegen (niedrige Titer der das Virus neutralisierenden L2-Antikörper wurden in Kaninchen gefunden, die mit rekombinantem L2-Protein immunisiert wurden (Christensen et al., Virology 181, 572 (1991); Lin et al., Virology 187, 612 (1992))). Die Anmelder haben gezeigt, dass die Impfung mit L2-Protein des kutanen Papillomavirus BPV-2 die frühe Abstoßung der fibrösen Papillome der Haut hervorgerufen hat, begleitet von der Infiltration der Immunzellen in den sich zurückentwickelnden Warzen (Jarrett et al., Virology 184, 33 (1991)).
L2 und E7 wurden in Bakterien als Gluthathion-S-Transferase- (GST-) Fusionsproteine produziert (Smith und Johnson, 1988 s. o.). Fünfzehn Tiere wurde mit GST-L2, fünfzehn mit GST-L2 und GST-E7 geimpft, und siebzehn wurden als Kontrolle gehalten (siehe Tabelle 2). Alle Tiere wurden mit der gleichen Menge an Virus desselben Stammmaterials exponiert. Die Tiere wurden vier, sieben und elf Wochen nach der Exposition untersucht. In Gruppe 3, welche keinen Impfstoff erhalten hatte, entwickelten 13 der 17 Kälber ungefähr vier Wochen nach der Virusinfektion Läsionen. Diese entwickelten sich über die normalen Stadien (siehe Tabelle 4). Elf Wochen nach der Exposition, wenn das Experiment beendet wurde, hatte eines der vier Tiere, die nach vier Wochen frei von Läsionen waren, nur eine Stadium 1-Läsion, und drei hatten überhaupt keine Läsion (siehe Tabelle 4 und 3). Von den fünfzehn Tieren in Gruppe 1 (L2 und E7) entwickelten zwei Stadium 1-Läsionen, welche an schließend verschwanden, eines entwickelte Stadium 2-Läsionen, welche am Ende des Experiments noch immer gegenwärtig waren, und zwölf entwickelten überhaupt keine Tumoren (siehe Tabelle 4 und 3). In Gruppe 2 (L2) hatte am Ende des Experiments ein Kalb fünf Stadium 1-Läsionen und ein Stadium 2-Läsion, die übrigen vierzehn waren vollständig tumorfrei (siehe Tabelle 4 und 3). Die 28 geimpften Tiere ohne Tumoren waren vierundvierzig Wochen nach der Exposition noch immer Papilloma-frei, während die Kontrolltiere noch immer Papillome hatten. Daher verliehen die L2- und L2 + E7-Impfstoffe einen hohen Grad an Schutz, ein Effekt, der mit hoher Wahrscheinlichkeit dem L2-Protein zuzuschreiben war, während der E7-Impfstoff keinen schützenden Effekt alleine hatte (siehe oben). Dies wurde durch ein zweites L2-Impfexperiment bestätigt, in welchem nur L2-Peptide verwendet wurden, die Menge des Antigens wurde auf 100 μg pro Impfung pro Tier reduziert, und das Adjuvans wurde in Aluminiumgel verändert (siehe Tabelle 2). Die meisten Tiere der Gruppe 1 (11 von 12) und alle Tiere in Gruppe 2 (12 von 12) waren vollständig geschützt vor der Exposition und tumorfrei, während 11 der 12 Kontrolltiere vier Wochen nach der Exposition Papillome entwickelten (Daten nicht gezeigt). Die L2-Peptide stellen daher einen wirkungsvollen prophylaktischen Impfstoff dar. Die Ergebnisse zeigen, dass es möglich ist, die Dosis an L2 zu reduzieren, wenn es in Aluminiumsalzen verabreicht wird, während ein starker prophylaktischer Effekt beibehalten wird.
Daher haben die Antragssteller erfolgreich eine prophylaktische und therapeutische Immunisierung gegen das Rinderschleim-Papillomavirus erhalten.
Dies wurde in tierischen Wirten gegen deren eigene natürliche Pathogene erzielt. Rinder und deren Papillomaviren entwickelten sich gleichzeitig, und die immunologische Reaktion, die unter experimentellen Bedingungen beobachtet wurde, ahmt die in der Natur beobachtete nach und ist daher biologisch signifikant (Jarrett et al., Virology 184, 33 (1991); Campo, Cancer Cells 3, 421 (1991)).
Der Erfolg, der gegen das Schleimvirus BPV-4 angesichts der starken Exposition erzielt wurde, ist besonders beachtenswert und von außerordentlicher Bedeutung für die mögliche Verwendung von Impfstoffen gegen genitale Papillomaviren in menschlichen Patienten. Es existieren mehrere Ähnlichkeiten zwischen den BPV-4- und HPV-16-Systemen. Beide Viren infizieren die Schleimepithele, die Zunahme von Läsionen bedingen, die neoplastisch transformiert werden können. In beiden Viren wird für die Haupt-Transformationsfunktionen, wie sie in In-vitro-Systemen definiert werden, durch das E7-Gen kodiert. Weiters zeigen die zwei E7-Proteine Aminosäure-Homologie.
Praktisch kompletter Schutz gegen BPV-4-Infektion wurde durch Immunisierung mit L2-Protein erzielt. Impfung mit L2-Protein des Waldkaninchen-Papillomavirus (CPRV) zeigte auch den schützenden Effekt bei Kaninchen (Christensen et al., 1991, s. o.; Lin et al., 1992 s. o.), obgleich in beschränkterem Umfang wie bei Rindern. Zusammengenommen weisen die zwei Sätze von Ergebnissen darauf hin, dass L2 von HPV einen ähnlichen Effekt bei Menschen haben kann.
Immunisierung mit BPV-4-E7 ruft eine Abstoßung eines etablierten Tumors hervor, welche begleitet ist von einer starken zellulären Immunabwehr. Impfung von Ratten und Mäusen mit dem HPV-16-E7-Gen verursachte eine Verzögerung des Wachstums und teilweise Rückbildung des Tumors, welche durch HPV-16 transfomierte Zellen hervorgerufen wurde (Meneguzzi et al., Virology 191, 62–69 (1991); Chen et al., PNAS 88, 110 (1991)) und, noch kürzlicher, die Impfung von Mäusen mit HPV-16 E7 löste eine verzögerte Art-Hypersensitivätsreaktion, spezifisch gerichtet gegen das E7-Antigen, aus. Daher kann E7 von verschiedenen Papillomaviren die geeignete Immunreaktion auslösen, die eine Abstoßung des Tumors hervorruft.
Tabelle 4 (E7 + L2)- und L2-Impfstoffe

Claims

Pharmazeutische Formulierung zur Immunisierung eines Säugetiers gegen Papillomavirus-Tumoren oder -Läsionen mit einer therapeutisch wirksamen Dosis von: (i) einer Formulierung, die ein Papillomavirus- (PV-) L2-Protein oder ein therapeutisch wirksames Fragment davon und eine Aluminiumverbindung umfasst; oder (ii) einer Formulierung, die ein Rinder-Papillomavirus- (BPV-) L2-Protein oder ein therapeutisch wirksames Fragment davon und eine Aluminiumverbindung umfasst; oder (iii) einer Formulierung, die ein BPV-4-L2-Protein oder ein therapeutisch wirksames Fragment davon und eine Aluminiumverbindung umfasst.
Pharmazeutische Formulierung nach Anspruch 1, die ein PVL2-Protein oder ein therapeutisch wirksames Fragment davon und eine Aluminiumverbindung umfasst.
Pharmazeutische Formulierung nach Anspruch 1, worin das PV BPV ist.
Pharmazeutische Formulierung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin das Papillomavirus-Protein oder das therapeutisch wirksame Fragment davon in Form eines Fusionsproteins mit einem anderen Co-Protein vorliegt.
Pharmazeutische Formulierung nach Anspruch 4, worin das Co-Protein Glutathion-S-Transferase (GST) ist.
Pharmazeutische Formulierung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin das Papillomavirus-Protein oder therapeutisch wirksame Fragment davon durch DNA-Rekombinationstechniken hergestellt ist.
Verwendung (i) eines PV-L2-Proteins oder einer therpeutisch wirksamen Fragments davon und einer Aluminiumverbindung; oder (ii) eines BPV-L2-Proteins oder therapeutisch wirksamen Fragments davon und einer Aluminiumverbindung; oder (iii) eines BPV-4-L2-Proteins oder eines therapeutisch wirksamen Fragments davon und einer Aluminiumverbindung; zur Herstellung einer Vakzine zur Therapie von Papillomavirus-Tumoren oder -Läsionen.
Verwendung von PV-L2-Protein oder eines therapeutisch wirksamen Fragments davon und einer Aluminiumverbindung nach Anspruch 7.
Verwendung nach Anspruch 8, worin das PV BPV ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 7 bis 9, worin das Papillomavirus-Protein oder therapeutisch wirksame Fragment davon in Form eines Fusionsproteins mit einem anderen Co-Protein vorliegt.
Verwendung nach Anspruch 10, worin das Co-Protein GST ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 7 bis 11, worin das Papillomavirus-Protein oder therapeutisch wirksame Fragment davon durch DNA-Rekombinationstechniken hergestellt wird.