JPH08508728A

JPH08508728A - パピローマウィルスに基づく医薬品

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Publication number: JPH08508728A
Application number: JP6521838A
Authority: JP
Inventors: セベリアカンポ，マリア; フレミングホーガンジャレット，ウィリアム
Original assignee: キャンサーリサーチキャンペーンテクノロジーリミティド
Priority date: 1993-03-31
Filing date: 1994-03-31
Publication date: 1996-09-17
Also published as: CA2158554A1; AU6381794A; ATE242265T1; PT692028E; WO1994023037A1; EP0692028B1; DE69432790T2; EP0692028A1; GB9306731D0; DK0692028T3; US6020309A; ES2199960T3; DE69432790D1

Abstract

(57)【要約】本発明は、パピローマウィルス腫瘍又は病変の予防のための医薬配合品を提供する。配合品は、（ｉ）パピローマウィルス（PV）Ｌ２タンパク質又は予防的有効なその断片及びアルミニウム化合物を含んで成る配合品；（ii）ウシ・パピローマウィルス（BPV）Ｌ２タンパク質又は予防的有効なその断片及びアルミニウム化合物を含んで成る配合品；（iii）BPV−4 L2タンパク質又は予防的有効なその断片及びアルミニウム化合物を含んで成る配合品；（iv）BPV−４タンパク質又は予防的有効なその断片及びアジュバントを含んで成る配合品；（ｖ）BPV−4L2タンパク質又は予防的有効なその断片及びアジュバントを含んで成る配合品；及び（vi）BPV−４タンパク質又は予防的有効なその断片及びアルミニウム化合物を含んで成る配合品、から成る群から選ばれることができる。

Description

【発明の詳細な説明】パピローマウィルスに基づく医薬品本発明は、パピローマウィルスに基づく医薬品に関する。パピローマウィルスは、ヒトと動物の両方においてさまざまな病変を引き起こす。いくつかの乳頭腫（papillomα）は、たとえ良性でも、それ自体臨床的な問題であり、例えば、子供の喉頭乳頭腫又はウシその他のペニスの乳頭腫は、ヒトにおける子宮又はペニスのコンジロームの平らな病変の場合と同様に、癌の病因における危険因子として知られている。それ故、ヒト及び獣医医薬の両方において、例えば、重度感染の確立に対して保護するための予防用途のための、パピローマウィルスに対する抗ウィルス医薬品は、大きな利点をもつであろう。ヒトにおける種痘研究は、いくつかの問題を提示している。第１に、実験が倫理的に認められていない。第２に、非常に限定された量のウィルスが、いくつかの病変として利用可能であり、特に、子宮のものは、ウィルス子孫を作り出すことができず、そしてウィルスの生長複製を許容するインビトロ系が未だ全く利用できない。バクテリアにおけるウィルス・タンパク質の生産及び合成ペプチドの使用は、この最後の問題を回避し、そしてパピローマウィルス感染に対する免疫応答の進行中分析を可能にした（例えば、Jenison et al，1988 J.Virol，62 p.2115及び Tindle et al，1990 J.Gen.Virol，71 p.1347を参照のこと）。有効な予防ワクチン、天然（Jarrett et al，1990 The Vet.Record，126 p.44 9）及び遺伝子操作された（Pilachinski et al，1986Ciba Foundation Symposiu m Vol.120 p.136）の両方が、ウシ・パピローマウィルスに対して既に作られ、そしてShope乳頭腫の緩解が腫瘍組織抽出物によりウサギを種痘することにより達成された（Evans et al，1962 J.Nat.Ca ncer Inst.29 p.277）。このウシ系は、ヒトにおけるパピローマウィルス誘導疾患のための、そしてウシとヒトの疾患の間のいくつかの類似性を与えられたヒトにおけるこのような疾患に対する薬物のための、優れたモデルである。すなわち、高い病変特異性をもつ多数のウィルス型（Jarrett et al，1984Virol.136 p.2 55）。遣伝子構造の相同性、及びいくつかの病変の悪性への進行。このウシ系は、癌形成における補因子が知られており（Campo and Jarrett, 1986 In Papillo maviruses, Ciba Foundation Symposium 120，John Wiley and Sons p.117）、そしてとりわけ、直接実験が可能である（Jarrett，1985 In advances in Viral Oncology（Ed.G.Hein）5 p.83）といういくつかの利点をも提示する。種痘は、伝統的に、予防手段として認められている。宿主は、病原体に対して免疫感作され、そして同一生物にその後晒される間に、その感染は、前臨床段階において頓挫する。これは、普通には、構造タンパク質上の表在性エピトープに向けられた中和事件によるウィルス感染において達成される。ウィルス誘導腫瘍、例えば、乳頭腫はしばしば、長期間にわたり持続し、そしてその後、各ケースに比例して、拒絶される。次に、宿主は、再感染に対して免疫性であることができる（Jarrett，1985前記）。この拒絶機構及びその仲介物質は、知られていないが、腫瘍のライフ・サイクル内の初期にその拒絶機構を誘導することが有利である。獣医慣行においては、乳頭腫の粗抽出物が、ときどきであるが決して常にではなく、同一源の乳頭腫の拒絶を引き起こすということが長い間知られてきた（Olson et al，1959 Am.J.Vet.Res.21 p.233，Evans et al，1962前掲）。これらの実験は、一の種内にさまざまなタイプのパピローマウィルスが存在し（Jarrett et al，1984前掲；de Villier，1989J.Virol.63 p.4898）、そしてこれらがおそらくすべて免疫学的にタイプ特異性である（Jarrett et al，199 0 The Vet.Record 126 p.473;Jenison et al，1988前掲）ということが知られる前に行われた。パピローマウィルスは、皮膚の及び粘液質の上皮の両方において感染し、そして腫瘍を引き起こすことができる。ヒト及び動物においては、粘膜乳頭腫は、ヒト喉頭の、生殖器の、及び子宮の乳頭腫の場合と同様に、延長された経過をたどる傾向があるしばしば重篤な病変である（Steinberg，1987 In the Papovavirid e Vol.2（ed.N.P.Salzman and P.M.Howley）P.265；zur Hausen，1981 Virol.18 4 p.9）。これらは、女性におけるヒト乳頭腫ウィルス（HPV）タイプ16関連子宮癌腫、及び子ウシにおけるウシ・パピローマウィルス（BPV）タイプ４関連栄養癌の場合と同様に、悪性腫瘍のその後の発達における原因であることができる。明らかに、パピローマウィルス疾患に対する医薬品についての緊急の必要性が存在する。最近の限定された成功にも拘らず（Kreider et al，1986 J.Virol.59 p.369： Sterling et al，1990 J.Virol.64 p.6305；Meyers et al，1992 Science 257 p .971；Dollord et al，1992 Genes andDevelopment 6 p.1131）、パピローマウィルスは、培養細胞内での成長に対して不応であることがよく知られており（Te ichaman andLaPorta，1987 In The Papovaviridae，Vol.2（ed.N.P.Salzmcn and P.M.Howley）p.109）、そしてウィルス試薬の必然の欠乏が、その感染に対する免疫応答の分析を遅らせている。組換え技術の最近の利用可能性は、大量に且つ精製された形態で初期及び後期ウィルス・タンパク質の両方の生産を可能にし（ Tindle et al，1990前掲； Jarrett et al，1991 Virol.184 p.33；Ghim et al，1992 Virology 190 p.548 ；Stacey et al，1992 J.Gen.Virol.73 p.2337）、そしてそれらの免疫感作能力についての研究を最初に可能にした。ウシにおいて、パピローマウィルス誘発皮膚病変に対する両保護を誘導するためにウィルス及び腫瘍抽出物を使用し、（Ja rrett et al，The Vet Record 1990 126 p.473；The Vet Record 1990 126 p.44 9）、そしてPV−誘発皮膚病変に対する両保護及びその拒絶を誘導するために組換えタンパク質を使用することができることが既に示されている。本出願人は、今般、ある者が本分野において、上消化管の扁平上皮細胞（squamous cell）癌腫の原因（causative factor）である粘膜ウィルスBPV−４のようなパピローマウィルスに対して実際に重要なやり方で種痘することができることを示した（Co mpoand Jarrett，1986前掲）。本発明は、以下の群から選ばれる、パピローマウィルス腫瘍又は病変の予防のための医薬配合品を提供する：（ｉ）パピローマウィルス（PV）Ｌ２タンパク質又は予防的有効なその断片及びアルミニウム化合物を含んで成る配合品；（ii）ウシ・パピローマウィルス（BPV）Ｌ２タンパク質又は予防的有効なその断片及びアルミニウム化合物を含んで成る配合品；（iv）BPV−４タンパク質又は予防的に有効なその断片及びアジュバントを含んで成る配合品；（ｖ）BPV−4 L2タンパク質又は予防的に有効なその断片及びアジュバントを含んで成る配合品；（ vi）BPV−４タンパク質又は予防的有効なその断片及びアルミニウム化合物を含んで成る配合品；（vii）PV L12タンパク質又は予防的有効なその断片及びアジュバントを含んで成る配合品；（viii）HPV L2タンパク質又は予防的有効なその断片及びアジュバントを含んで成る配合品；（ix）HPV L2タンバク質又は予防的有効なその断片及びアルミニウム化合物を含んで成る配合品；（ｘ）HPV L2タンパク質又は予防的有効なその断片及びアジュバントを含んで成る配合品；（xi）HPV−16 L2タンパク質又は予防的有効なその断片及びアルミニウム化合物を含んで成る配合品。本医薬配合品は、PV L2タンパク質又は予防的有効なその断片及びアルミニウム化合物を含んで成ることができる。上記PVは、BPVであることができる。上記B PVは、BPV−４であることができる。パピローマウィルス・タンパク質又は予防的有効なその断片は、異なる補助タンパク質（co-protein）との融合タンパク質の形態にあることができる。この補助タンパク質は、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼであることができる。このパピローマウィルス・タンパク質又は予防的有効なその断片は、組換えDN A技術により製造されることができる。アルミニウム化合物は、水酸化アルミニウム及びリン酸アルミニウムの混合物を含んで成ることができる。３％水酸化アルミニウム及び２％リン酸アルミニウムが存在することができる。このアルミニウム化合物は、アルミニウム・ゲルであることができる。パピローマウィルス腫瘍又は病変の予防のための医薬品中での上記医薬配合物の使用も提供される。パピローマウィルス腫瘍又は病変の予防のためのワクチンの製造における、（ｉ）PV L2タンパク質又は予防的有効なその断片及びアルミニウム化合物；又は（ii）BPV L2タンパク質又は予防的有効なその断片及びアルミニウム化合物；又は（iii）BPV−４ L2タンパク質又は予防的有効なその断片及びアルミニウム化合物；又は（iv）BPV−４タンパク質又は予防的有効なその断片及びアジュバント；又は（ｖ）BPV−４ L2タンパク質又は予防的有効なその断片及びアジュバント；又は（vi）BPV−４タンパク質又は予防的有効なその断片及びアルミニウム化合物；又は（vii）PV2 L2タンパク質又は予防的有効なその断片及びアジュバント；又は（viii）HPV L2タンパク質又は予防的有効なその断片及びアジュバント；又は（ix）HPV L2タンパク質又は予防的有効なその断片及びアルミニウム化合物；又は（ｘ）HPV−16 L2タンパク質又は予防的有効なその断片及びアジュバント；又は（xi）HPV−16 L2タンパク質又は予防的有効なその断片及びアルミニウム化合物、の使用も提供される。パピローマウィルス腫瘍又は病変に対して哺乳動物を免疫感作する方法であって、治療的有効投与量において上記の医薬配合品を投与することを含んで成る方法も提供される。先に記載したような予防用途のための医薬配合品に基づくワクチンは、本分野においてよく知られた方法に従って調製されることができる。同様に、投与量の割合は、公知の方法に従って決定されることができる。New Trends and Develop ments in Vaccines，Editors A.Voller and H.Friedman，University Park Pres s，Bultimore，1978及びRemington's Pharmacentical Science by E.W.Martinに留意のこと。本発明がより明確に理解されるようにするために、以下の図面を参照して、実施例により、そして限定によらず、本発明をさらに説明する。図１は、β−gal−初期（Ｅ１，Ｅ２，Ｅ４及びＥ７）融合タンパク質による種痘についての結果を示す。Ａ．グループ３（対照）からの動物番号132。Ｂ．グループ１（挑戦前種痘）からの動物番号146。Ｃ．グループ２（挑戦後種痘）からの動物番号139。バー凡例は、図Ｄ、pURE７中にある。Ｅ１，Ｅ２及びＥ４ ORF_sを含む組換えプラスミドは図示されていない。図２は、β−gal−Ｅ７により種痘の結果を示す。Ａ、種痘された動物及び対照動物における全腫瘍の平均数。Ｂ、段階１腫瘍の平均数。Ｃ、段階２腫瘍の平均数。Ｄ、段階３腫瘍の平均数。四角、種痘された動物；ひし形、対照動物。反復測定分析において、ＣにおいてＰ＝0.02、そしてＤにおいてＰ＝0.04である。図３は、Ｅ７＋Ｌ２及びＬ２による種痘についての結果を示す。Ａ、pGEX組換えプラスミド。Ｂ−Ｄ、挑戦11週間後のウシにおける腫瘍の数；Ｂ、グループ１（Ｅ７＋Ｌ２ワクチン）；Ｃ、グループ２（Ｌ２ワクチン）；Ｄ、グループ３（対照）。材料及び方法遺伝子操作手順のすべてを、“Mole cular Cloning”，A Laboratory Manual eds.Sambrook，Fritsh and Maniatis，Cold Spring Harbor Laboratory Press， 1989中に記載された標準的な方法に従って行う。以下、本出願人らが、Ｅ７及びＬ２の源としてpAT153を使用して大腸菌（Esch erichia coli ）内で組換えBPV−４ペプチドをどのように作り出したかを記載する。あるいは、本発明は、EMBL配列データベースから入手可能なＬ２及びＥ７配列情報（アクセス番号Ｘ59063）の使用により実施されることができる。ウシ（Calves）雑種、約12週齢の子ウシを、乳頭腫フリー源から得た。それらをランダムにグループ指定し、そして隔離区画内の、分かれた、清潔な、よく換気された畜舎内で飼育した。これらのウシの全てを、到着時に、そしてその後３〜４週間の間隔で、血液学的分析のために採血した。これらの動物を、英国内務省の指示に完全に従ってケアした。大腸菌（Escherichia coli）内での組換えBPV−４ペプチドの製造。（ｉ）β−ガラクトシダーゼＥ７融合タンパク質 BPV−４のＥ１，Ｅ２，Ｅ４及びＥ７のオープン・リーディング・フレーム（O RF_s）を、pURのプラスミド・シリーズ（Ruther andMuller-Hill，1983 EMBO J.2 p.1791）内にクローン化した。Ｅ１，Ｅ２及びＥ４ ORF_sのクローニングについては記載しない。Ｅ７ペプチドをコードするORFを、BAMHIによりpAT153（CampoM.S．et al，198 2 J.Gen.Virol．63，p.255）内にクローン化されたBPV−４ゲノムを消化することにより単離された。Ｅ７ペプチドをコードするORFを、ヌクレオチド（nts）65 2-1249を包含するBsrl断片として単離し、そしてBamHIリンカーの付加を介してp UR278（Ruther and Mullter-Hill 1983前掲）内でクローン化した。この組換えプラスミドを、大腸菌（Escherichia coli）JM109（Promega Ltd，Southampton ，UK）内にトランスフェクトした。これらのバクテリアを、100μｇ／mlアンピシリンを補ったＬ−ブロス中の対数中期まで増殖させ、そして１〜４時間100μ ｇ／ml IPTGの添加によりβ−gal−融合タンパク質を発現するように誘導した。 β−gal−Ｅ７を、300μｇ／ml DNaseＩを含むリゾチーム・バッファー（25％スクロース、10mM MgCl₂、50mM Tris HCl pH8.0、１mg／mlリゾチーム）中にバクテリアを懸濁させることにより調製した。この融合ペプチドを、0.25％NP40、0. 125％デオジコレート（deozycholate）、0.25Ｍ NaCl 、Tris HCl pH7.2中での細胞溶解後にペレット化し、そしてその後、1.75Ｍ Guanidine HCl、１Ｍ NaCl 、１％ Triton X100中で洗浄した。（ii）グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（GST）融合タンパク質Ｅ７及びＬ２ ORFsを、pGEX（Smith and Johnson，1988 Gene，67 p.31）内にクローン化した。Ｅ７ペプチドをコードしているORFを、先に記載したように単離し、そしてブラント末端ライゲーションによりpGEX3X（PharmaciaLtd，Milton Keynes MK9 3H P，UK）内にクローン化した（図３参照）。 pAT153（Campo et al 1982前掲）内にクローン化されたBPV−４ゲノムを消化することにより単離されたＬ２ペプチドをコードしているORFを、nt 3987-5585 を包含し、そしてその全体をpGEX2T（Pharmocia Ltd，Milton Keynes MK9 3HP， UK）内にクローン化されたBamHI-EcoRI断片として、そしてまた、３つのDdel断片：（ｉ）pGEX2T内の５′末端断片（nt4042−4610）；（ii）pGEX3X内の中央断片（nt4610−4989）；及び（iii）pGEX3X内の３′末端断片（nt4989−5629）として得た（図３参照）。このGST融合ペプチドは、アミノ酸−21〜98のＥ７タンバク質（GST−E7）；アミノ酸−８〜542のＬ２タンパク質（GST−L2w）；アミノ酸11−200のＬ２タンパク質（GST−L2a）；アミノ酸201-326のＬ２タンパク質（ GST−L2b）；及びアミノ酸327-542のＬ２タンパク質（GST−L2c）を現わす。形質転換及びバクテリアの増殖及びGST融合ペぺプチドの製造を、β−gal Ｅ７について概説したように行った。これらのペプチドを、300μｇ／mlにおいてDNase Iを、そして１mg／mlにおいてデオキシコレートを含むリゾチーム・バッファー中に懸濁したバクテリアからの封入体をピペットで吸い上げ、その後0.5％ Trit on X100／10mM EDTA、pH8.0中で洗浄することによりバルクにおいて調製した。すべての場合において、融合ペプチドを、種痘に先立って、５％ SDS、５mM B-M ercaptoethanol、50mM Tris HCl、pH8.0中で沸騰させ、そして音波処理することにより懸濁した。収量は、バクテリアの湿重量１グラム当り２−３mgであり、50 −70％の純度を定常的に達成した。融合タンパク質の特徴付け β−gal−Ｅ７、GST−Ｅ７及びGST−Ｌ２ペプチドを、SDS−PAGE電気泳動により特徴付けした。これらの融合ペプチドの分子量は、全て予測と一致した。β− gal−Ｅ７及びGST−Ｅ７を、ELISA又は適当なバクテリア・タンパク質による吸収後のウェスタン・ブロット分析において、β−gal−Ｅ７又はGST−Ｅ７に対して作られたウサギ、ウシ又はネズミ抗血清を使用して免疫学的に特徴付けした。この免疫血清は、同一源（homologous）及び異種源（heterologous）抗原の両方と陽性反応し、これは、それらの融合タンパク質が免疫学的に活性であり、そしてこれらの血清がＥ７に特異的であったということを示している（表１参照）。 GST−Ｌ２抗原は、β−gal Ｌ２融合タンパク質と同様に、同一源ウシ血清とELI SAテストにおいて反応性であり、これは、GST−Ｌ２が免疫学的に活性であり、そしてこれらの血清がＬ２に特異的であったことを示している（表１参照）。実験デザイン（ｉ）Ｅ１，Ｅ２，Ｅ４，Ｅ７初期融合タンパク質による種痘 18動物を、各６動物の３グループに分けた。グループ１内の各動物に、１mlの Freund's不完全アジュバント（FIA）中に乳化させたβ−gal−初期（Ｅ１，Ｅ２，Ｅ４及びＥ７）融合タンパク質のカクテル１mgを含む１mlのPBSを後左わき腹内に接種し；種痘（ブースト）をその後右わき腹に２週間後に繰り返した。このブーストの２週間後、各グループ内の動物のすべてを、BPV−４の10¹²粒子を含むパレート（Jarrett et al，1990 The Vet Record，126 p.473）内で挑戦された。グループ２内の動物を、挑戦後２週間後に先に記載したように種痘し、そしてさらに２週間後にブーストした。BPV−４を、食道パピローマから精製し、そして先に記載したようにタイプ分けし（Campo et al，1980 Nature，286，p.180 ）、そしてウィルス粒子の濃度を電子顕微鏡検定により推定した（Jarrett et a l，1990 The Vet Record，126 p.449）。それぞれの動物を、３〜４週間毎に検査し、その乳頭腫をカウントし、そしてそれらのサイズを先に記載したように測定した（Jarrett，1985前掲）。（ii）β−gal−Ｅ７による種痘 19動物を、各11と８動物の２グループに分けた。グループ１内の11子ウシのそれぞれに、その右大腿四頭筋内へ、１mlのFIA中に乳化されたβ−gal−Ｅ７融合タンパク質の１mg／１ml懸濁液を与えた。この種痘を、左四頭筋内へ４週間後に繰り返した（ブースト）。このブーストの14日後、グループ１及びグループ２内の全動物を、10部位において10¹¹BPV−４粒子を含むパレート（部位当り10¹⁰粒子）中で挑戦させた。これらの動物を、先に記載したように検査し、そしてその乳頭腫をモニターした。（iii）GST−Ｅ７及びGST−Ｌ２による種痘 47動物を、各15動物の２グループ（グループ１及び２）及び17動物の１グループ（グループ３）に分けた。グループ１の子ウシのそれぞれに、１mgのGST−Ｅ７融合タンパク質及び全部で１mgのGST−Ｌ２融合ペプチド（GST融合ペプチドL2 w：L2a：L2b：L2cの比は約１：５：５：５であった。）を含む２ml懸濁液ブラス２mlのFIAを、その右四頭筋内に与えた。この種痘を、４週間後その左四頭筋内に繰り返した。グループ２の子ウシのそれぞれに、先に記載したように１mgのGS T−Ｌ２融合タンパク質を与えた。そのブーストの２週間後、全３グループ内の動物に、全部で10¹¹BPV−４粒子を含む10の異なる部位においてパレート内に接種した（部位当り10¹⁰粒子）。これらの動物を、先に記載したように検査し、そして乳頭腫をモニターした。（iv）アルミニウム・ゲル中のGST−Ｌ２による種痘 36動物を、各12動物の３グループに分けた。グループ１の子ウシのそれぞれに、上記と同様の比において１mg／mlにおいてGST−Ｌ２融合ペプチドの１ml、１m lの40mM TRIS-HCl-0.33％ NaCl、及び３％水酸化アルミニウムと２％リン酸アルミニウムの等容量から調製された１mlのアルミニウム・ゲル（Intervet UK Ltd ，Cambridge Science Park，Cambridge CB4，UK）を含む３mlの懸濁液を与えた。この種痘を、４週間後に繰り返した。グループ２の子ウシを、上記のように種痘したが、動物当りたった100μｇのＬ２融合ペプチドにより種痘した。グループ３の子ウシは、対照であった。この挑戦は、上記のようなものであった。結果Ｅ７タンパク質による免疫感作は、乳頭腫の達成を阻害し、そして乳頭腫拒絶を引き起こす。Ｅ７は、インビトロにおけるBPV−４の主要な形質転換タンパク質であり（Jagger，et al，J.Gen.Virol.71 p.3041）、そして消化管乳頭腫のさまざまな発達段階を通じて発現され、インビボにおいても増殖状態の維持についてその重要性を指摘されている。それは、ヒト・パピローマウィルス・タイプ16 （HPV−16）の癌タンパク質Ｅ７と相同であり（Jagger，et al，1990前掲；Jack son et al，1991 Molecular Carcinogenesis 4 pg.382）、このウイルスは、最もしばしば、女性における子宮頸の扁平上皮細胞癌腫と関連する（zur Hausen， 1991前掲）。細胞形質転換におけるその中心的役割のために、Ｅ７は、BPV−４とHPV−16の両方において、腫瘍拒絶を導びく細胞仲介免疫応答のための標的であることができる。本出願人は、簡単に記載されるであろう２つのパイロット実験、及びより深く記載されるであろう多数の動物による第３の実験を行った。第１の実験においては、本出願人は、β−ガラクトシダーゼ融合生成物としてバクテリア内で合成された、BPV−４初期タンパク質Ｅ１，Ｅ２，Ｅ４及びＥ７のカクテルにより子ウシを種痘した（Ruther and Muller-Hill 1983前掲；Jarre ttetal，1991 Virol.，184 p.33）。グループ１内の６の子ウシを、BPV−４によりその口内において挑戦される前に種痘し、そしてグループ２内の６の子ウシを、挑戦後に種痘した。グループ３内の６の対照子ウシを、種痘せず、そしてBPV −４により挑戦させた（表２参照）。挑戦４〜６週間後、これらの動物のすべてが、消化管乳頭腫発達の段階１ａである斑−様病変を顕出した（Jarrett，1985 前掲）。これらの病変は、その注射部位に限定された。次の２週間の間に、上記対照動物の病変は、数及びサイズにおいて成長し、第２に、そのパレート内に拡がり；そして乳頭腫成長の良好に認められた段階：斑の発生（段階１ｂ）、長さ２mmまでの乳頭腫（段階２）及び２mmより大きな乳頭腫（段階３）を経験した。段階２及び段階３の乳頭腫は、成熟したウィルス産生腫瘍である。各グループ内の動物の数は、カッコ内にある。これらの動物を、１mgのタンパクにより２回接種した。但し、実験５、グループ２においては、それらは、各10 0μｇの２つの接種物（Ｌ２^**）を受容した。アジュバントは、全ての場合においてFIAであった。但し、実験５（Ｌ２^*とＬ２^**）においては、それは、アルミニウム・ゲル（Intervet UK，Ltd）であった。実験１においては、PRは、挑戦前に与えられたワクチンを示し、そしてPSは、挑戦後に与えられたワクチンを示す；実験２−５においては、そのワクチンは常に挑戦前に投与され、nv．は、ワクチン無しである。乳頭腫の発達段階及び腫瘍のライフ・サイクルにおけるそれらの重要性の詳細は、記載されている（Jarrett，1985前掲）。挑戦の約30週間後、乳頭腫の自然の衰退は、病変のサイズ及び数における減少に伴って起こり始め、そしてそれらの動物は、54週までに、本質的に乳頭腫フリーであった。このグループからの代表動物における乳頭腫の発達を、図１Ａに示す。種痘された動物のすべてが、挑戦前又は後に種痘されたかに拘らず、その対照動物と大体同じ数の斑（plaques ）をもっており、これは、そのウィルスが等しく感染性であり、そしてそれらの子ウシが等しく感染を受け易いということを示している。しかしながら、種痘された動物における病変のほとんどが、特にグループ１において十分なサイズまで発達せず、そしてその対照動物におけるよりもかなり早期、挑戦の40−47週後までにほとんどが拒絶された。種痘されたグループからの代表動物における病変の発達を、図１Ｂと１Ｃに示す。２つの結論：治療的種痘が可能であったこと、並びに本試験において使用された時間間隔において、挑戦に比べての種痘の時間が決定的ではなかったことを、これらの結果から導くことができるであろう。上記４つの初期タンパク質の中の１が種痘軽減の原因であることを確認するために、本出願人は、挑戦前にβ−gal−Ｅ７により６の子ウシを、そしてβ−gal −Ｅ２により６の子ウシを種痘した；６の動物が対照グループであった（表２参照）。これらのＥ２−種痘動物は、上記対照グループからいずれも異なって振舞わなかったが、このＥ７−種痘化子ウシの中で、それらの病変のほとんどが、段階１ａより先に発達せず、そして対照又はＥ２−種痘動物のいずれかにおけるよりも早期に拒絶された（データを示さず）。第３の大規模実験においては、11の子ウシを挑戦前にβ−gal−Ｅ７により種痘し、そして８の子ウシを対照として飼養した。（表２参照）。この実験において、斑及び盛り上がった斑は、共に段階１の病変と考えられるであろう。先の如く、全ての動物が、挑戦４週間後同数の斑を顕出し、これは、それらが全て等しく感染を受け易いということを確かにしている（図２Ａ参照）。10週間後、段階１病変の数は、両グループにおいて、段階２の病変の数の増加と同時に急激に降下した（図２ＢとＣ参照）。対照グループにおいては、段階２の病変は、次の10 週間以内に段階３の病変に進行し（図２Ｄ参照）、一方、段階１の病変の数は、一定のまま残った（図２Ｂ参照）。２次的な拡がりは、挑戦ウィルスのより少量の投与量のために、存在しなかった（材料及び方法参照）。５週間以上（挑戦後 25週）の後、段階３及び段階２の乳頭腫が進行を開始した（図２Ｃ及びＤ参照）。Ｅ７−種痘グループにおいて、感染後10週間目までは、段階２病変の数が、対照グループにおけるよりもより多く、そして段階３病変の数がより少なかった（図２ＣとＤ参照）。感染13週間後、段階２の乳頭腫の数は、段階３の乳頭腫における同時増加を伴わずに、かなり減少した（図２ＣとＤ参照）。それ故、Ｅ７− 種痘動物においては、段階２から段階３までの進行が劇的に減少し、そして段階２の乳頭腫は、十分な成熟に達する前に軽減していた。対照と種痘グループとの間の差異が、図２におけるように、グループ当りの段階２及び段階３の乳頭腫の数が考慮されるときのみならず、段階３の乳頭腫のパーセンテージ又は段階３の乳頭腫をもつ動物のパーセンテージが考慮されるときも観察された（表３参照）。これらの３つの実験において、２動物のすべてをＥ７により種痘した。22（76 ％）は、成熟乳頭腫を顕出しなかったし又は対照動物よりも早期にそれらを拒絶しなかった。それ故、Ｅ７による種痘は、腫瘍増殖を減少させ、そして未熟腫瘍軽減を誘導し、これ故に、乳頭腫のための治療を有効に提供する。ワクチンＥ７は、上記免疫系に有効に提示される。Ｅ７による種痘は、そのワクチンに対する体液性及び細胞性免疫応答の両方により達成される。両応答は、対照子ウシにおけるよりも種痘された動物においてより早期に現われ、そしてより大きな大きさをもつ。種痘された動物の全てがＥ７に対する血清抗体をもっていたが、Ｅ７に対する血清抗体は、対照動物の全てにおいては存在せず、そしていくつかは、この実験の経過を通じて陰性のままであった。それ故ワクチンＥ７は、この免疫系の両エフェクター・アームに提示され、一方、ウィルスＥ７は、ほとんど提示されない。これは、治療的ワクチンの効果を説明することができる。Ｅ７に対する体液性及び細胞−仲介免疫応答並びにＢ−及びＴ−細胞エピトープのマッピングは、他でより詳細に表されるであろう。Ｌ２タンパク質による免疫感作は乳頭腫形成を防止するＬ２は、パピローマウィルスの小さなキャプシド・タンパク質である。このビリオンの詳細な分子構造は、未だよく知られていないけれども、このタンパク質のドメイン（単数又は複数）がそのウィルスの表面上に露出されているという状況証拠がある（低力価のウィルス−中和性Ｌ２抗体は、組換えＬ２タンパク質により免疫感作されたウサギにおいて発見されている。）（Christensen et al，1 991 Virology 181 p.572；Lin et al，1992 Virology 187 p.612））。本出願人は、皮膚パピローマウィルスBPV−４のＬ２タンパク質による種痘が、この軽減するいぼにおける免疫細胞の浸潤を伴って皮膚の線維乳頭腫の初期拒絶を誘導したということも示した（Jarrett，et al，1991 Virology 184 p.33）。Ｌ２及びＥ７は、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（GST）融合タンパク質としてバクテリア内で製造された（Smith and Johnson，1988前掲）。15動物が、GST−Ｌ２により種痘され、15がＧST−Ｌ２＋GST−Ｅ７により種痘され、そして17が対照として維持された（表２参照）。これらの動物のすべてを、同一ストックからの等量のウィルスにより挑戦させた。これらの動物を、挑戦の4.7 及び11週間後に検査した。ワクチンを全く受容していないグループ３においては、17子ウシの中からの13が、ウィルス感染の約４週間後に免疫を顕出した。これらは、普通の段階を通じて顕出した（表４参照）。挑戦11週間後本実験が完了するとき、４週間目において病変をもたない４動物の中の１が、たった１の段階１病変をもち、そして３が病変を全くもっていなかった（表４と図３参照）。グループ１（Ｌ２＋Ｅ７）における15動物の中で、２が、その後に消失した段階１の病変を顕出し、１が、この実験の終わりにおいて未だ存在した段階２の病変を顕出し、そして12が、腫瘍のいずれをも全く顕出しなかった（表４と図３参照）。グループ２（Ｌ２）においては、この実験の終わりまでに、１の子ウシが５の段階１をもち、そして１が段階２の病変をもっており、そして残りの14動物は、完全に腫瘍フリーであった（表４と図３参照）。腫瘍を全くもたない28の種痘された動物は、挑戦44週間後未だ乳頭腫フリーであり、一方、これらの対照動物は未だ乳頭腫をもっていた。従って、Ｌ２及びＬ２＋Ｅ７ワクチンは、高程度の保護、すなわち、ほとんど確実にＬ２タンパク質に因子効果を付与した。なぜなら、Ｅ７ワクチンがそれ自体、保護効果を全くもたなかったからである（前記参照）。これは、Ｌ２ペプチドだけが使用された第２のＬ２種痘実験により確認され、抗原の量は、動物当りの接種当り100μｇまで減少され、そしてアジュバントは、アルミニウム・ゲルに変更された（表２参照）。グループ１内のほとんどの動物（12の中の11）及びグループ２内のすべての動物が、挑戦から完全に保護され、そして腫瘍フリーであり、一方、12対照動物の中の11が、挑戦４週間後に乳頭腫を顕出した（データを図示せず）。それ故、Ｌ２ペプチドは、強力な予防ワクチンを提供する。これらの結果は、強力な予防効果を維持しながらアルミニウム塩中に投与されるときＬ２の投与量を減少させることができる。従って、本出願人は、粘膜性ウシ・パピローマウィルスに対する予防的及び治療的免疫感作を首尾よく達成した。これは、それ自体の自然の病原体に対して動物宿主において達成された。子ウシ及びそれらのパピローマウィルスは、同時に発達し、そして実験的条件において観察された免疫学的応答は、自然に観察されるものを真似ており、そしてそれ故生物学的に重要である（Jarrett et a l，1991 Virology，184 p.33；Campo，1991 Cancer Cells，3，p.421）。厳しい挑戦に向かい合う上記粘膜ウィルスBPV−４に対して得られた成功は、特に顕著であり、そしてヒト被験者における生殖パピローマウィルスに対するワクチンの可能性のある使用に特別な関連をもつ。BPV−４とHPV−16系との間にはいくつかの類似性が存在する。両ウィルスは、粘膜上皮に感染し、新形成形質転換することができる病変を生じさせる。両ウィルスにおいて、インビトロ系において定められるような、主要な形質転換機能は、Ｅ７遣伝子によりエンコードされている。さらに、この２つのＥ７タンパク質は、アミノ酸の相同性を示す。 BPV−４感染に対する事実上完全な保護は、Ｌ２タンパク質による免疫感作により達成された。ワタオウサギ・パピローマウィルス（cottontail rabbit papi llomavirus （CRPV））のＬ２タンパク質による種痘も、子ウシにおけるよりもなり限定された程度であるけれども、ウサギにおいて保護効果をもつことが示されている。併合して、これらの２セットの結果は、HPVのＬ２がヒトにおける類似の効果をもつことができるということを示唆している。 BPV−４ E7による免疫感作は、強力な免疫応答を伴う確立された腫瘍の拒絶を誘導する。HPV−16 E7遺伝子によるラット及びマウスの種痘は、成長遅延を引き起こし、そして腫瘍の部分的な軽減は、HPV−16形質転換細胞により誘導され（M aneguzzi et al，1991 Virology 191 p.62-69；Chen et al，1991 PNAS 88，p.1 10）、そしてさらに最近、HPV−16 E7によるマウスの種痘が、Ｅ７抗原に対して特異的に向けられた遅延型過敏性応答を顕出した。それ故、さまざまなパピローマウィルスのＥ７が、腫瘍拒絶を誘導するために適当な免疫応答を顕出することができる。

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９５年５月１８日【補正内容】請求の範囲１．パピローマウィルス腫瘍又は病変の予防のための医薬配合品であって、以下の、（ｉ）パピローマウィルス（PV）Ｌ２タンパク質又は予防的有効なその断片及びアルミニウム化合物を含んで成る配合品；（ii）ウシ・パピローマウィルス（BPV）Ｌ２タンパク質又は予防的有効なその断片及びアルミニウム化合物を含んで成る配合品；（iii）BPV−4 L2タンパク質又は予防的有効なその断片及びアルミニウム化合物を含んで成る配合品；及び（iv）BPV−４タンパク質又は予防的有効なその断片及びアルミニウム化合物を含んで成る配合品、から成る群から選ばれる医薬配合品。２．PV L2タンパク質又は予防的有効なその断片及びアルミニウム化合物を含んで成る、請求項１に記載の医薬配合品。３．PVがBPVである、請求項２に記載の医薬配合品。４．BPVがBPV−４である、請求項３に記載の医薬配合品。５．パピローマウィルス・タンパク質又は予防的有効なその断片が、異なる補助タンパク質との融合タンパク質の形態にある、先の請求項のいずれか１に記載の医薬配合品。６．補助タンパク質が、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（GST）である、請求項５に記載の医薬配合品。７．パピローマウィルス・タンパク質又は予防的有効なその断片が組換えDNA 技術により製造される、先の請求項のいずれか１に記載の医薬配合品。８．パピローマウィルス腫瘍又は病変の予防のための獣医薬又はヒトの医薬における、先の請求項の中のいずれか１に記載の医薬配合品の使用。９．パピローマウィルス腫瘍又は病変の予防のためのワクチンの製造における、（ｉ）PV L2タンパク質又は予防的有効なその断片及びアルミニウム化合物；又は（ii）BPV L2タンパク質又は予防的有効なその断片及びアルミニウム化合物；又は（iii）BPV−4 L2タンパク質又は予防的有効なその断片及びアルミニウム化合物；又は（iv）BPV−４タンパク質又は予防的有効なその断片及びアルミニウム化合物、の使用。 10．請求項９に記載のPV L2タンパク質又は予防的有効なその断片及びアルミニウム化合物の使用。 11．PVがBPVである、請求項10に記載の使用。 12．BPVがBPV−４である請求項11に記載の使用。 13．パピローマウィルス・タンパク質又は予防的有効なその断片が、異なる補助タンパク質との融合タンパク質の形態にある、請求項９〜12の中のいずれか１に記載の使用。 14．補助タンパク質がGSTであり、請求項13に記載の使用。 15．パピローマウィルス・タンパク質又は予防的有効なその断片が組換えDNA 技術により製造される、請求項９〜14の中のいずれか１に記載の使用。 16．パピローマウィルス腫瘍又は病変に対して哺乳動物を免疫感作する方法であって、治療的有効投与量において請求項１〜７の中のいずれか１に記載の医薬品を投与することを含んで成る方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＫ，ＴＪ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ジャレット，ウィリアムフレミングホーガンイギリス国，グラスゴージー63 ９ジェイピー，ブレーンフィールド，ネザーブレーン 60

Claims

【特許請求の範囲】１．パピローマウィルス腫瘍又は病変の予防のための医薬配合品であって、以下の、（ｉ）パピローマウィルス（PV）Ｌ２タンパク質又は予防的有効なその断片及びアルミニウム化合物を含んで成る配合品；（ii）ウシ・パピローマウィルス（BPV）Ｌ２タンパク質又は予防的有効なその断片及びアルミニウム化合物を含んで成る配合品；（iii）BPV −４ L2タンパク質又は予防的有効なその断片及びアルミニウム化合物を含んで成る配合品；（iv）BPV−４タンパク質又は予防的有効なその断片及びアジュバントを含んで成る配合品；（ｖ）BPV −４ L2タンパク質又は予防的有効なその断片及びアジュバントを含んで成る配合品；及び（vi）BPV−４タンパク質又は予防的有効なその断片及びアルミニウム化合物を含んで成る配合品、から成る群から選ばれる医薬配合品。２．PV L2タンパク質又は予防的有効なその断片及びアルミニウム化合物を含んで成る、請求項１に記載の医薬配合品。３．PVがBPVである、請求項２に記載の医薬配合品。４．BPVがBPV−４である、請求項３に記載の医薬配合品。５．パピローマウィルス・タンパク質又は予防的有効なその断片が、異なる補助タンパク質との融合タンパク質の形態にある、先の請求項のいずれか１に記載の医薬配合品。６．補助タンパク質が、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（GST）である、請求項５に記載の医薬配合品。７．パピローマウィルス・タンパク質又は予防的有効なその断片が組換えDNA技術により製造される、先の請求項のいずれか１に記載の医薬配合品。８．パピローマウィルス腫瘍又は病変の予防のための獣医薬又はヒトの医薬における、先の請求項の中のいずれか１に記載の医薬配合品の使用。９．パピローマウィルス腫瘍又は病変の予防のためのワクチンの製造における、（ｉ）PV L2タンパク質又は予防的有効なその断片及びアルミニウム化合物；又は（ii）BPV L2タンパク質又は予防的有効なその断片及びアルミニウム化合物；又は（iii）BPV−４ L2タンパク質又は予防的有効なその断片及びアルミニウム化合物；又は（iv）BPV−４タンパク質又は予防的有効なその断片及びアジュバント；又は（ｖ）BPV−４ L2タンパク質又は予防的有効なその断片及びアジュバント；又は（vi）BPV−４タンパク質又は予防的有効なその断片及びアルミニウム化合物、の使用。 10．請求項９に記載のPV L2タンパク質又は予防的有効なその断片及びアルミニウム化合物の使用。 11．PVがBPVである、請求項10に記載の使用。 12．BPVがBPV−４である請求項11に記載の使用。 13．パピローマウィルス・タンパク質又は予防的有効なその断片が、異なる補助タンパク質との融合タンパク質の形態にある、請求項９〜12の中のいずれか１に記載の使用。 14．補助タンパク質がGSTであり、請求項13に記載の使用。 15．パピローマウィルス・タンパク質又は予防的有効なその断片が組換えDNA 技術により製造される、請求項９〜14の中のいずれか１に記載の使用。 16．パピローマウィルス腫瘍又は病変に対して哺乳動物を免疫感作する方法であって、治療的有効投与量において請求項１〜７の中のいずれか１に記載の医薬品を投与することを含んで成る方法。